KR20190139894A - 스타가르트 질환 치료를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의약 및 생명공학 분야에 관한 것이다. 특히 이는 스타가르트 질환 및/또는 ABCA4 관련 안과 질환의 치료, 예방 및/또는 지연에 사용될 수 있는 신규한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 엑손 39 스킵핑을 억제하거나 차단하는 데 사용되는 AON에 관한 것이다.

Description

스타가르트 질환 치료를 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드

본 발명은 의약 및 생명공학 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 안 질환, 바람직하게는 황반 이영양증, 보다 바람직하게는 스타가르트 질환의 치료, 예방 및/또는 지연에 적용 가능한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것이다.

스타가르트 질환(STGD 또는 STGD1)은 가장 흔한 유전성 황반 이영양증으로, 일반적으로 유년기 또는 청년기에 발병하나 그 후 성년이 되어 발병하는 경우에는 더 나은 예후를 나타내는 중앙 시력의 손상을 유발하는 황반 이영양증이다.

이 질환은 8,000-10,000명 중에서 1명의 유병률을 가지며, 광 수용체 세포-특이적 ATP-결합 카세트 운반체 ABCA4를 암호화하는 유전자에서 질환-유발 변이와 관련된 상염색체의 열성 유전 모드를 지닌다. 단백질은 2273개의 아미노산을 함유하고, 주로 망막에서 발현되며 림형 및 원뿔형 외주 세그먼트 디스크에 국소화 되어 있다. N-레티닐-이덴-포스파티딜에탄올아민을 관강으로부터 광 수용체 디스크의 세포질 표면으로 플립시키는 것으로 여겨진다

스타가르트 질환은 망막 색소 상피에서 리포푸신 함량의 대규모 침착, 독성 물질 제거의 실패 및 광 수용체 세포의 현저한 손실과 밀접하게 관련되어 있다. 리포푸신의 주요 성분인 디-레티노이드-피리디늄-에탄올아민은 ABCA4가 존재하지 않거나 기능 이상일 때 형성된다. 실제로 ABCA4가 스타가르트 질환의 근본적인 유전자임을 확인하는 여러 보고서가 발표되었으며 이는 다수(~1000)의 질병-유발 변이를 나타내고 그 중 절반 이상이 한 번만 기재되었다.

ABCA4의 이대립인자성 변이체는 약 75%의 스타가르트 질환에서 및 약 30%의 상염색체 열성 추체-간체 이영양증(CRD) 환자에서 확인되었다. 변이의 대부분은 미스센스이며, 그 후 넌센스 돌연변이, 작은 삽입/결실 및 RNA 스플라이싱에 영향을 미치는 변이가 연이어진다. 북유럽과 미국에서 비정상적으로 많은 스타가르트 질환 사례(~30 %)는 단 하나의 ABCA4 변이의 결과이다.

세 번째로 가장 빈번한 ABCA4 변이인 인트론 38에 존재하는 c.5461-10T>C는 ABCA4 mRNA 내의 엑손 39의 스킵핑 또는 엑손 39 + 엑손 40의 스킵핑으로 인해 중증도의 스타가르트 질환을 유발하는 것으로 최근 나타났다 (Aukrust 등, 스타가르트 질환 환자에서 흔히 볼 수 있는 인트론 ABCA4 c.5461-10T>C 변이체는 스플라이싱 결함을 일으키고 ABCA4 단백질 수준을 감소시킨다. Acta Ophthalmol 2016 Oct 24:1-7; Sangermano 등, 2016. 광수용체 전구체 mRNA 분석은 스타가르트 질환에서 ABCA4 c.5461-10T>C 변이로부터 생성된 엑손 스킵핑임을 규명하였다. Ophthtalmology 123(6):1375-1385).

엑손 39의 스킵핑은 124개 뉴클레오타이드의 프레임 이동 결실을 야기하는 반면에, 엑손 39 및 40의 이중 스킵핑은 254개 뉴클레오타이드의 프레임 이동 결실을 야기한다. 특히 단백질의 이러한 더 짧은 버전은 불안정하기 때문에 검출되지 않았다(Aukrust 등, 2016). 서양에서 약 7000명의 스타가르트 질환 환자가 이러한 특정 변이를 지니고 있는 것으로 추정된다.

스타가르트 질환을 치료하기 위한 3가지 주요 치료 경로는 줄기세포 요법, 유전자 대체 요법 및 다른 약제학적 접근법이다. 유전성 안 질환 치료를 위한 비교적 새로운 치료법 개발은 변이 유전자로부터 전사된 프리-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)의 사용에 관한 것이다. AON은 그의 서열이 표적 프리-mRNA 분자의 서열과 상보적이므로 스플라이싱을 저해할 수 있는 작은 폴리뉴클레오타이드 분자(16 내지 25-머)이다.

계획된 메커니즘은 AON이 표적 서열에 결합할 때, 그것이 상보적인 경우, 프리-mRNA 내의 표적화된 영역은 스플라이싱 인자를 저해하여 결국 변경된 스플라이싱을 야기한다. 치료학적으로 이러한 방법론은 다음 두 가지 방법으로 사용될 수 있다 : a) 변이가 크립틱(cryptic) 스플라이싱 부위를 활성화시키는 유전자의 정상적인 스플라이싱을 리디렉션하고 b) (단백질-트렁크화 절단) 변이를 보유하는 엑손을 스킵핑하여 mRNA의 판독 프레임은 손상되지 않고 (부분적으로) 기능성 단백질이 생성되는 것이다.

두 가지 방법 모두 이미 심각한 유전적 장애를 지닌 환자에게서 성공적으로 적용되었다(Scaffidi 및 Misteli, 2005. 조기 노화 질환인 Hutchinson-Gilford 조로증 증후군에서 세포 표현형의 역전. Nat.Med 11(4):440-445; Cirak 등, 2011. Duchenne 근이영양증에서 엑손 스킵핑 치료법 후 디스트로핀-관련 당 단백질 복합체의 복원. Mol Ther 20:462-467; Cirak 등, 2011. 전신 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 처리 후 Duchenne 근이영양증 환자에서 엑손 스킵핑 및 디스트로핀 회복: 공개 라벨, 2상, 용량-증가 연구. Lancet 378(9791):595-605; Goemans 등, 2011. Duchenne 근이영양증에서 PRO051의 전신 투여. N Engl J Med 364(16):1513-1522).

안 질환과 관련하여 AON은 레베르 선천성 흑암시 또는 LCA 치료에 유망한 것으로 나타났다(WO 2012/168435호, WO 2013/036105호, WO 2016/034680호 및 WO 2016/135334호). 또한 WO 2016/005514호에서는 Usher 증후군 유형 Ⅱ의 치료, 예방 또는 지연을 위해 엑손 13, 엑손 50 및 PE40의 스킵핑 및/또는 엑손 12 유지에 관한 USH2A 프리-mRNA를 표적화하기 위한 엑손 스킵핑 AON을 개시하고 있다.

WO 2015/004133호에서는 스타가르트 질환의 치료를 위해 ABCA4 프리-mRNA로부터의 엑손 10 스킵핑에서 AON의 사용을 개시하고 있다. 따라서 스타가르트 질환을 포함한 다양한 안 질환의 치료에서 엑손 스킵핑을 위한 AON이 설명되었으나 스타가르트 질환의 치료, 특히 엑손 보존과 관련하고 특히 엑손 39 스킵핑을 유도하는 c.5461-10T>C 변이에 의해 야기되는 스타가르트 질환의 치료에서 AON-기반 전략에 대한 강한 필요성이 나타난다.

본 발명은 스타가르트 질환의 치료, 지연 또는 예방에 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것이다. 보다 상세하게는 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 하나 이상의 엑손, 바람직하게는 엑손 39의 스킵핑을 억제할 수 있는 AON에 관한 것이다. 이는 엑손 스킵핑이 예를 들면 인트론 38 내에서 c.5461-10T>C 변이와 같은 ABCA4 유전자 내의 (인트론) 변이에 의한 것이다.

바람직하게는 AON은 엑손 39 스킵핑 및/또는 엑손 39/엑손 40 이중 스킵핑을 억제, 방지 또는 차단할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명의 AON은 서열번호: 1 내지 서열번호: 37 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 서열로 구성되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 이때 약제학적 조성물은 유리체 내 투여용이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 인간 안구 내의 표적 조직으로 AON의 효율적인 (및 바람직하게는 오래 지속되는) 방출을 위한 본 발명의 AON을 포함하는 나노 입자 또는 임의의 유형의 서방형 조성물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 스타가르트 질환의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 이를 필요로 하는 인간 개체의 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱 조절(예를 들면 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑 방지)을 요구하는 스타가르트 질환 또는 상태의 치료 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 본 발명에 따른 AON, 약제학적 조성물 또는 바이러스 벡터를 인간 개체의 세포와 접촉시키고, 이어서 상기 세포에 상기 AON의 진입을 허용하여 상기 세포에 존재하는 변이된 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 엑손 39 스킵핑의 저해를 허용하는 것이다.

도 1은 인간 ABCA4 유전자 내에서 엑손 38, 인트론 38, 엑손 39, 인트론 39 및 엑손 40에 대한 시험된 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)의 상보적인 위치의 개략도이다. 엑손 38과 엑손 39 사이의 인트론 38 내에서 c.5461-10T>C 변이의 상대적 위치가 표시되어 있다.
도 2는 인간 ABCA4 유전자의 엑손 39 및 엑손 40의 RNA 서열(5'에서 3'; 서열번호: 50)과 그 주변을 둘러싼 인트론 서열(굵게, 두 개의 엑손은 밑줄침)을 나타낸다. 초기에 설계된 37 개의 AON의 서열은 ABCA4 프리-mRNA에 대한 각각의 상보적인 위치와 함께 나타낸다. c.5461-10T>C 변이의 위치는 화살촉 아래 방향으로 나타낸다. 인트론 38 내에서 핫스팟을 나타내는 것으로 보이는 영역, 실시예에서 기술된 바와 같이 AON1 및 17이 결합하는 부위는 이탤릭체로 제공되며, 이는 서열번호: 65의 서열을 지닌다. AON 12, 31 및 32가 결합하는 인트론 39 내의 핫스팟에 대해서도 동일하며 핫스팟은 서열번호: 66의 서열을 지닌다.
도 3은 다음 순서를 지닌 인간 ABCA4 인트론 및 엑손으로 서열번호: 44를 나타낸 것이다. 인트론 38(소문자) - 엑손 39(대문자, 굵게 및 밑줄) - 인트론 39(소문자) - 엑손 40(대문자, 굵게 및 이탤릭체) - 인트론 40(소문자). 인트론 38(c.5461-10T>C 변이를 지님) = 서열번호 45, 엑손 39 = 서열번호: 46, 인트론 39 = 서열번호: 47, 엑손 40 = 서열번호: 48, 인트론 40 = 서열번호: 49이다.
도 4는 SalI 및 NotI 클로닝 부위 및 인트론 38 내에서 c.5461-10T>C 변이 (-10T>C) 부위를 나타내는 미니 유전자(MG) 컨스트럭트의 개략도이다. MG1 및 MG2는 Sangermano 등(2016)에 개시되어 있다. MG3(엑손 39를 지님) 및 MG4(엑손 39 및 엑손 40을 지님)은 본 명세서 내에 개시된 바와 같다.
도 5는 MG3 컨스트럭트(c.5461-10T>C 변이를 지님)가 HeLa 세포로 트랜스펙션된 후에'기능적'임을 나타내는 것으로 전사된 프리-mRNA는 엑손 39가 스플라이싱 아웃되고 엑손 1은 엑손 2로 연결되도록 진행되는 반면에 변이를 지니지 않는 경우(레인 WT, 야생형 미니 유전자 컨스트럭트를 지님) 엑손 39가 엑손 1과 엑손 2 사이에 존재하는 것을 나타낸 것이다. 삽입이 없는 레인은 미니 유전자 컨스트럭트에 삽입이 포함되지 않았을 때의 PCR 생성물을 나타내는 대조군이다.
도 6은 서로 다른 AON을 지니거나 지니지 않은 c.5461-10T 변이(+ MG3 변이)를 지닌 MG3 및 MG3 야생형(MG3 WT) 컨스트럭트로 HeLa 세포를 트랜스펙션시킨 후 바이오분석기에서 RT-PCR 결과를 나타낸 것이다.
처음에는 서열 번호: 1 내지 서열번호: 16의 16개의 AON을 변이체 버전 상에서 시험하였다. RT-PCR은 엑손 39 서열 내에서 프라이머로 어닐링 수행하였다. 하부 패널 내에서 "HeLa (NT)"(비형질 감염된 HeLa 세포)로 표시된 레인은 또한 예상 수준에서 밴드가 나타나도록 하였다. 이것은 HeLa 세포가 야생형 ABCA4 유전자를 보유하고 있으며 이로부터 명백히 PCR 산물이 생성되었기 때문이다.
음성 대조군( "ctrAON")은 변이와 관련없는 AON을 보유한 MG3 컨스트럭트에 의한 형질 감염이었다. 또 다른 음성 대조군은 컨스트럭트 또는 AON이 아닌 형질 감염 시약으로만 형질 감염된 세포를 나타내는 "Mock tr"레인이었다. "Rt-ctr"및 "H₂O"는 세포 물질이 없는 PCR 반응에 대한 2개의 추가적인 음성 대조군이었다.
생성물 밴드의 강도의 증가는 엑손 39를 포함하는 mRNA의 증가를 시사한다. 이는 배경으로서 HeLa 세포에서 이미 생성된 것을 기초로 평가되어야 하고, 실제로 AON이 형질 감염되지 않은 WT 신호와 관련하여 "WT-noAON"으로 표시된 레인을 100%로 취하고, 바이오 분석기 소프트웨어를 적용하여 그 100% 강도와 비교하여 다른 밴드의 강도를 측정하였다.
이는 해당 시그널의 약 1/3(29%)이 백그라운드 HeLa 단독 시그널에 의한 것일 수 있음을 나타낸다. 또한 AON 유무에 관계없이 형질 감염 자체가 AON과 무관하게 시그널을 70% 부근까지 높일 수 있음을 나타낸다. 그러나 AON1, AON3, AON4, AON5, AON6, AON12, AON13 및 AON14에서 탐지된 강도는 AON3, AON4, AON6 및 AON12의 최소한 80% 이상으로 증가하여 WT 시그널을 100%로 설정시 WT 시그널의 적어도 90% 강도를 나타내도록 증가하였다. 이는 이들 AON이 엑손 39가 스킵핑 되지 않은 야생형에 가까운 수준으로 MG3 변이 컨스트럭트로부터 엑손 39의 스킵핑을 차단할 수 있음을 나타낸다.
도 7은 지시된 바와 같이 MG3 컨스트럭트 및 다양한 AON으로 형질 감염된 HEK293 세포내에서 엑손 39 내포 백분율을 ddPCR 정량으로 나타낸 것이다. 3개의 패널 A, B 및 C는 서로 다른 3개의 날에 동일한 방식으로 시험하였다. 모의시험(Mock)은 AON이 형질 감염 되지 않은 경우 엑손 39 내포 백분율을 나타낸다.
도 8은 MG3_2 미니 유전자 컨스트럭트에서 삽입물의 5'에서 3' 서열(서열번호: 67)을 나타낸다. EcoRI 및 SalI 사이트는 각각 터미널 5'과 3' 말단에 있다. 인간 ABCA4 유전자의 엑손 39(서열번호: 46)는 대문자이다. 인트론 38(엑손 39의 5' 말단의 서열번호: 45)과 인트론 39(엑손 39의 3' 말단의 서열번호: 47)이 밑줄로 표시되었다. 삽입물의 5' 말단에 있는 EcoRI 부위와 인트론 38 사이의 나머지 서열과 삽입물의 3' 말단에 있는 인트론 39와 SalI 부위 사이의 서열은 백본 플라스미드에 이미 존재하는 것과 동일하다. 실시예에 기재된 바와 같이 RHO 엑손 3 및 RHO 엑손 5 서열(각각 서열번호: 68 및 서열번호: 69)은 각각 ABCA4 인트론 38의 5' 측 및 인트론 39의 3' 측에 굵게 표시되어 있다.
도 9는 (A)에서 MG3_2 미니-유전자 컨스트럭트의 개략적 개요를 나타낸다. 또한 (B)에서는 바이오 분석기에 포함되고 제외된 엑손 39를 지닌 HEK293 세포 내에서 MG3_2(플라스미드 단독)로부터의 증폭된 생성물의 위치를 나타낸다. c.5461-10T>C 변이로 인해 대부분의 전사체는 엑손 39(하부 밴드)가 결여되어 있고 엑손 39 내포물(상부 밴드)은 훨씬 낮은 수준으로 관찰되었다. c.5461-10T>C 변이와 상이한 AON을 운반하는 MG3_2 컨스트럭트로 형질 감염된 HEK293 세포내에서 엑손 39 내포 백분율을 ddPCR 정량화로 (C)에 나타내었다. AON 1, 3, 4, 9, 12, 17, 24, 25, 29, 31 또는 32의 연이은 트랜스펙션으로 엑손 39 내포 효과가 강하게 나타나고 있다.
도 10은 HEK293 세포내에서 당 모이어티를 2'-OMe 으로 완전히 변형시킨MG3_2 미니 유전자 및 AON1 및 AON32로 트랜스펙션 시킨 후 ddPCR을 사용한 엑손 39 내포 백분율을 나타낸 것이다. 2'-OMe 변형 대신 각 당 모이어티에서 2'-MOE 변형 및 AON을 사용하지 않은 모의(Mock) 트랜스펙션을 AON1 및 AON32에 수행하여 비교하였다. 동일한 올리고뉴클레오타이드에 2'-MOE 버전이 적용될 때 효과의 현저한 증가가 관찰된다.

본 발명은 인간 ABCA4 프리-mRNA 에서 엑손 39의 스킵핑을 방지, 억제 및/ 또는 차단하거나 엑손 39 + 엑손 40의 이중 스킵핑을 방지, 억제 및/또는 차단할 수 있는 특정 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)에 관한 것이다. 이러한 (이중) 스킵핑은 적어도 인트론 38에서 변이를 일으키는 비교적 일반적인 c.5461-10T>C 스타가르트 질환에 의해 야기될 수 있는 것으로 나타났다(Sangermano 등, 2016; Aukrust 등, 2016). 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 10의 스킵핑을 유도하는 AON이 당업계에 공지되어 있지만(WO 2015/004133), AON이 또한 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 엑손 보유에 사용될 수 있는지 여부는, 즉 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 엑손 스킵핑을 억제할 수 있는지 여부는 잘 알려지지 않았다.

본 발명의 발명자들은 엑손 39 주변의 인트론 및 엑손 내에 및 인트론/엑손 경계부에서 특정 서열을 확인함으로써, 이를 통해 이들 서열과 상보적인 정제된 합성 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 생리적 조건 하에서 이들에 결합하여 표적화될 수 있고, 비정상적인 스플라이스 부위를 마스킹하고 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39(단독으로 또는 엑손 40과 함께)의 스플라이싱을 차단하거나 (특정 수준으로) 억제할 수 있는 것이 잠재적으로 가능할 수 있을 것이라는 가설을 수립하였다.

엑손 39의 스킵핑(엑손 40과 함께 또는 단독)은 스타가르트 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 발명자들은 엑손 39의 스킵핑을 방지할 수 있는 (또는 어느 정도 억제할 수 있는) 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하면 엑손 39를 스킵핑(단독 또는 엑손 40과 함께) 시키는 변이를 지닌 인간 피험체에서 스타가르트 질환을 치료, 예방 또는 지연시킬 수 있을 것으로 생각하였다.

본 발명은 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 하나 이상의 엑손의 스킵핑을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 관한 것으로, 엑손 스킵핑은 ABCA4 유전자의 변이에 기인하는 것이다. 바람직한 실시형태에서 엑손 스킵핑을 유발하는 변이는 인트론에 있다. 보다 바람직하게는 상기 인트론 변이는 인간 ABCA4 유전자의 인트론 38에서의 c.5461-10T>C 변이이다. 바람직한 하나의 실시형태에서 본 발명의 AON은 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 엑손 39 스킵핑 및/또는 엑손 39/엑손 40 이중 스킵핑을 억제할 수 있는 것이다.

더욱 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 서열번호: 44 내에서 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 연속적 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 AON은 바람직하게는 서열 번호: 44의 서열 내에서 연속적 서열에 완전히 상보적인 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 최대 하나의 CpG 모티프를 추가로 포함하는 것이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 AON에는 CpG 모티프가 없는 것이다.

다른 바람직한 측면에서 본 발명에 따른 AON은 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 내에서 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하거나 이들로 구성되는 것이다. 더욱 바람직한 AON은 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 로 표시되는 영역에 충분히 상보적인 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드로 구성되는 것이다.

또한 본 발명의 AON에서 구아노신의 백분율을 가능한 낮게 하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만 또는 심지어 30% 미만으로 유지하는 것이 바람직하다. 또한 본 발명의 AON에서 구아노신의 스트레치를 최대 3개 이내로 유지하고 3개의 구아노신 스트레치를 많아야 하나 지닌 것이 바람직하다.

더욱 바람직한 측면에서, 본 발명의 AON은 서열번호: 1, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 13, 14, 17, 20, 24, 25, 29, 31 및 32 중에서, 더욱 바람직하게는 서열번호: 1, 3, 4, 6, 12, 17, 24, 25, 29, 31 및 32 중에서, 더욱 더 바람직하게는 서열번호: 1, 12, 17, 24, 29, 31 및 32 중에서 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것이다.

다른 바람직한 측면에서 본 발명에 따른 AON은 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형 당과 같은 하나 이상의 2'-O 알킬 변형을 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드(RNA 올리고뉴클레오타이드)이다. 더욱 바람직한 실시형태에서 상기 AON의 모든 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 변형된 것이다. 다른 바람직한 실시형태에서 AON은 하나 이상의 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE; 또는 2'-메톡시에톡시) 변형을 포함한다.

또 다른 측면에서 2'-OMe 및 2'-MOE 변형은 둘 모두 올리고뉴클레오타이드 내의 상이한 뉴클레오사이드에 존재할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 AON은 모두 2'-OMe 변형을 지닌 뉴클레오사이드로 구성되거나 또는 모두 2'-MOE 변형을 지닌 뉴클레오사이드로 구성될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고, 더욱 바람직하게는 AON 내의 모든 순차적 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 결합에 의해 상호 연결되는 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제학적 조성물은 유리 체내 투여용이며 바람직하게는 안구 당 총 AON 0.05 mg 내지 5 mg 범위의 양으로 투여된다. 본 발명은 또한 유리체내 투여용이고 안구 당 총 AON 0.1 내지 1 mg, 예를 들면 안구 당 총 AON 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg의 양으로 투여되는 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 바이러스 벡터에 관한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 인간 ABCA4 프리-mRNA내에서 엑손 39의 스킵핑을 억제하기 위한 용도로 스타가르트 질환의 치료, 예방 또는 지연에 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 바이러스 벡터에 관한 것이다.

본 발명은 또한 세포에서 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법에 관한 것으로 상기 방법은 상기 세포를 본 발명에 따른 AON, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터와 접촉시키는 단계를 포함하는 것이다.

바람직한 측면에서 본 발명은 이를 필요로 하는 개체의 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 것을 요구하는 스타가르트 질환 또는 상태의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 개체의 세포를 본 발명에 따른 AON과 접촉시키는 단계, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터를 포함 하는 것이다. 스플라이싱의 조절은 인간 ABCA4 유전자 내의 변이에 바람직하게는 인트론 38 내의 c.5461-10T>C 변이에 의해 야기되거나 그에 기인한 엑손 39 스킵핑의 억제를 포함하는 것이다.

ABCA4와 관련하여 세포에서 AON의 투여/도입의 결과인 '엑손 보유' 또는 '엑손 스킵핑의 억제, 차단 또는 예방'은 인간 ABCA4 프리-mRNA(및 연이어 생성된 인간 ABCA4 mRNA)내에서 엑손 39, 또는 엑손 39 + 엑손 40 둘 모두의 내포(또는 존재 유지)로 해석되어야 한다. 본 명세서 내에 상세히 기술된 바와 같이 이러한 엑손 보유는 스타가르트 질환을 유발할 수 있는 엑손 39의 스킵핑 또는 엑손 39의 스킵핑을 유도하는 ABCA4 유전자의 변이의 존재에도 불구하고 본 발명에 따른 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포에 투여한 후에 야기된다.

용어 "엑손 보유"는 또한 성숙 mRNA에 바람직하게 존재해야 하는 특정 엑손 또는 특정 엑손을 여전히 함유하는 성숙 mRNA의 세포 내에서 생성을 유도, 생산 또는 증가시키는 것을 지칭한다.

용어 '엑손 스킵핑'은 본 명세서 내에서 하나 이상의 특정 엑손(현재의 경우 엑손 39, 또는 ABCA4 유전자내의 엑손 39와 엑손 40을 함께 포함하는 '이중 스킵핑'으로 언급 되는)을 포함하지 않는 성숙한 mRNA의 출현으로 정의된다. 이들 엑손은 예를 들면 야생형과 같이 엑손 스킵핑이 발생하지 않을 때 일반적으로 성숙한 mRNA에 존재해야 하는 것이다. 이러한 엑손 스킵핑을 차단하는 것은 스타가르트 질환의 원인 변이체를 포함하는 프리-mRNA를 발현하는 세포에 효소 접합 과정을 허용하는 예를 들면 (크립틱) 스플라이스 공여자 또는 (크립틱) 스플라이스 수용체 서열과 같은 서열에 간섭할 수 있는 분자를 제공함으로써 달성될 수 있다.

"프리-mRNA"라는 용어는 핵에서와 같이 전사에 의해 세포의 DNA 주형으로부터 합성된 비처리 또는 부분적으로 처리된 전구체 mRNA를 의미한다.

용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드"(AON)는 프리-mRNA 분자, hnRNA(이종성 핵 RNA) 또는 mRNA 분자에서 표적 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 지칭하는 것으로 이해된다. 안티센스 서열의 상보성(또는 실질적인 상보성) 정도는 바람직하게는 안티센스 서열을 포함하는 분자가 생리학적 조건 하에서 RNA 분자에서 표적 뉴클레오타이드 서열과 안정한 이중 가닥 하이브리드를 형성할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 용어 "안티센스 올리고뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "올리고"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 표적 (프리-)mRNA 서열과 관련하여 안티센스 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭하는 것으로 이해된다.

본 명세서 및 그 청구 범위에서 "포함하는(comprise)" 동사 및 그 활용은 비제한적인 의미로 사용되어 단어 뒤의 항목이 포함됨을 의미하며 특별히 언급되지 않은 항목은 제외되지 않는다. 또한 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 엘레멘트에 대한 언급은 문맥 상 하나의 엘레멘드 만이 존재하도록 요구하지 않는 한, 하나 이상의 엘레멘드가 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 부정 관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.

숫자 값(예를 들어, 약 10)과 관련하여 사용될 때 "약" 또는 "대략"이라는 단어는 바람직하게는 주어진 값(10)의 0.1% 이내로 많거나 적은 값일 수 있음을 의미한다.

하나의 실시형태에서, 본 명세서 내에 정의된 엑손 39 보유 분자(또는 엑손 39/40 보유 분자)는 ABCA4 mRNA에서 엑손 39 또는 엑손 39 + 엑손 40의 보유를 야기 하는 특정 서열, 바람직하게는 서열번호: 44 내의 서열에 결합 및/또는 상보적인 AON이다. 바람직하게는 비정상적인 ABCA4와 관련하여 특정 표적 서열 중 하나에 결합하는 것으로 당업자에게 공지된 기술을 통해 평가될 수 있다.

바람직한 기술은 EP 1619249 내에 기재된 겔 유동성 이동 에세이이다. 바람직한 실시형태에서, 엑손 39 보유 AON(또는 엑손 39/40 보유 AON)은 표지된 표적 서열에 대한 상기 분자의 결합이 겔 이동성 이동 에세이에서 검출되는 즉시 특정 서열 중 하나에 결합한다고 여겨진다.

본 발명의 모든 실시형태에서 엑손 39 보유 분자(또는 엑손 39/40 보유 분자)는 바람직하게는 AON이다. 바람직하게는 본 발명에 따른 엑손 39 보유 AON(또는 엑손 39/40 보유 AON)은 인간 ABCA4 프리-mRNA 내의 인트론 38, 엑손 39, 인트론 39, 엑손 40 또는 인트론 40 내의 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적이거나, 인간 ABCA4 프리-mRNA의 인트론 38/엑손 39, 엑손 39/인트론 39, 인트론 39/엑손 40, 또는 엑손 40/인트론 40의 경계부와 중복되는 서열의 AON이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 AON은 서열 번호: 1 내지 37의 서열 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 '실질적으로 상보적인'은 기능, 즉 ABCA4 엑손 39의 스킵핑의 차단 또는 엑손 39 + 엑손 40의 스킵핑 차단이 여전히 허용 가능한 한, 안티센스 서열에서의 일부 불일치가 허용될 수 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 상보성 정도는 90% 내지 100%이다. 일반적으로 이것은 20개 뉴클레오타이드의 AON에서 1 또는 2개의 불일치, 또는 40개 뉴클레오타이드의 AON에서 1, 2, 3 또는 4개의 불일치, 또는 60개 뉴클레오타이드의 AON에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 불일치를 허용하는 것이다.

본 발명은 또한 ABCA4 엑손 39의 스킵핑을 억제 또는 차단할 수 있거나 엑손 40과 함께 ABCA4 엑손 39의 스킵핑을 억제 또는 차단할 수 있는 AON을 설계하는 방법을 제공하는 것이다. 먼저 상기 AON은 인간 ABCA4 프리-mRNA 내의 인트론 38, 엑손 39, 인트론 39, 엑손 40 또는 인트론 40 내의 서열에 상보적으로 또는 인간 ABCA4 프리-mRNA의 인트론 38/엑손 39, 엑손 39/인트론 39, 인트론 39/엑손 40, 또는 엑손 40/인트론 40의 경계부와 중복되는 서열에 (생리학적 조건 하에서) 결합하도록 선택된다.

연속적으로, 바람직한 방법에서 상기 엑손 보유 AON을 추가로 개선하려면 하기 측면 중 하나 이상을 설계에 고려해야 한다. 본 발명의 엑손 보유 AON은 바람직하게는 최대한 하나의 CpG 모티프를 함유하나 보다 바람직하게는 CpG 모티프를 전혀 포함하지 않는 것이다. AON 내에서의 CpG 모티프 또는 다수의 CpG 모티프(CpG 섬)의 존재는 일반적으로 상기 AON의 면역원성 증가와 관련이 있다 (Dorn 및 Kippenberger (2008) Curr Opin Mol Ther 10 (1) 10-20).

이러한 증가된 면역원성은 치료될 조직, 즉 눈의 손상을 유발할 수 있기 때문에 바람직하지 않다. CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ 세포 및/또는 염증성 단핵구 침윤의 존재를 평가함으로써 동물 모델에서 면역원성을 평가할 수 있다. 면역원성은 또한 당업자에게 공지된 표준 면역 에세이를 사용하여 중화 항체 및/또는 상기 AON을 인식하는 항체의 존재를 검출함으로써 본 발명의 AON으로 치료되는 동물 또는 인간의 혈액에서 평가할 수 있다. 염증 반응, I형 유사 인터페론 생성, IL-12 생성 및/또는 면역원성의 증가는 표준 면역에세이를 사용하여 상기 AON을 인식하는 항체 또는 중화 항체의 존재 또는 증가량을 검출함으로써 평가할 수 있다.

본 발명은 허용 가능한 RNA 결합 동역학 및/또는 열역학적 특성을 갖는 AON을 설계할 수 있게 한다. RNA 결합 동역학 및/또는 열역학적 특성은 적어도 부분적으로 AON의 용융 온도(Tm; 기본 Tm과 가장 인접한 모델을 사용하는 단일 가닥 RNA을 위한 당업자에게 공지된 올리고뉴클레오타이드 특성 계산기로 계산됨)에 의해 결정되며 또는 AON-표적 엑손 복합체의 자유 에너지도(RNA 구조 버전 4.5 사용) 계산될 수 있다.

Tm이 너무 높으면 AON이 낮은 특이성으로 예측된다. 허용 가능한 Tm 및 자유 에너지는 AON의 서열에 의존한다. 따라서 이들 파라미터 각각에 바람직한 범위를 부여하는 것은 어렵다. 허용 가능한 Tm은 35 ~ 70 ℃ 범위일 수 있고 허용 가능한 자유 에너지는 15 ~ 45 kcal/mol 범위일 수 있다.

본 발명의 AON은 바람직하게는 허용 가능한 수준의 기능적 활성을 나타낼 수있는 것이다. 상기 AON의 기능적 활성은 바람직하게는 ABCA4 프리-mRNA내의 엑손 39 또는 엑손 39 + 엑손 40의 스킵핑을 특정 수준까지 차단하고 개체에게 특정 검출 가능한 수준의 기능적 야생형 및 전체길이 ABCA4 단백질을 제공하는 것이다.

바람직한 실시형태에서 RT-PCR 및/또는 ddPCR 분석에 의해 측정된 엑손을 포함하는 전체길이 mRNA가 백그라운드 시그널 부재시, 대조군 RNA 생성물 중량 대비 적어도 20% 이상, 적어도 25% 이상, 적어도 30% 이상, 적어도 35% 이상, 적어도 40% 이상, 적어도 45% 이상, 적어도 50% 이상, 적어도 55% 이상, 적어도 60% 이상, 적어도 65% 이상, 적어도 70% 이상, 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상 또는 100% 이면 AON은 ABCA4 엑손 39 또는 ABCA4 엑손 39 + 엑손 40의 스킵핑을 차단하는 것으로 여겨진다.

도 6에 나타난 바와 같이, 보유의 백분율 범위(상기에서 기재한)는 백그라운드 시그날에 의존하며, 바람직하게는 부재 하는 것이다. 따라서 이러한 백분율은 바람직하게는 백그라운드 시그널을 제공하지 않는 PCR 프라이머를 사용하거나 시스템 내에서 측정하는 것이다. 본 발명의 목적은 ABCA4 프리-mRNA에서 엑손 39/40 스킵핑을 차단하거나 방지하는 AON을 제공하는 것이다. 엑손 스킵핑 및/또는 엑손 보유를 결정하기 위한 에세이는 본 명세서 내의 실시예에 기재되어 있으며, 증가된 엑손 보유가 발견되는지 여부를 판단하기 위한 당업자에게 공지된 기술로 보충될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 AON은 서열번호: 65, 서열번호: 66 에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열, 인간 ABCA4 프리-mRNA (서열번호: 44 내에 전체가 주어진 c.5461-10T>C 변이)의 인트론 38 (서열번호: 45), 엑손 39 (서열번호: 46), 인트론 39 (서열번호: 47), 엑손 40 (서열번호: 48) 또는 인트론 40 (서열번호: 49)의 뉴클레오타이드 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열을 포함한다. 또한 인트론 38/엑손 39, 엑손 39/인트론 39, 인트론 39/엑손 40, 또는 엑손 40/인트론 40의 경계부와 중복되는 서열을 포함하는 것이다.

또한 (실질적으로) 상보적인 부분은 본 발명에 따른 AON의 길이의 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 보다 더 바람직하게는 80% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 98% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 99% 이상, 또는 가장 바람직하게는 100%이다.

보다 바람직하게는 AON은 인트론 38과 엑손 39 사이의 경계부를 포함하는 서열에 상보적인 것이고 더욱 바람직하게는 c.5461-10T>C 돌연변이를 포함하는 것이다. 본 발명의 또 다른 측면에서 본 발명에 따른 AON은 서열번호: 1 내지 서열번호: 16의 서열을 포함하거나 이로 구성되어 있으며, 바람직하게는 서열번호: 1, 3, 4, 5, 6, 9, 12, 13, 14, 17, 20, 24, 25, 29, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 보다 바람직하게는 서열 번호 1, 12, 17, 24, 29, 31 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성되는 것이다.

또 다른 바람직한 실시형태에서 본 발명의 AON의 상보적인 부분의 길이는 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 또는 143개 뉴클레오타이드이다. 단백질의 AON에 대한 결합을 변형시키거나 AON의 열역학적 특성을 변화시키기 위해 보다 바람직하게는 표적 RNA 결합 친화도를 변형시키기 위해 추가적 인접 서열을 사용할 수 있다.

따라서 상보성 영역의 모든 염기가 대향하는 가닥의 염기와 짝지음 되는 것이 절대적으로 요구되지는 않는다. 예를 들면 AON을 설계할 때 상보적 가닥상의 염기와 염기쌍을 이루지 않는 잔기를 혼입시킬 수 있다. 세포의 환경 하에서 뉴클레오타이드의 스트레치가 상보적인 부분에 충분히 혼성화될 수 있다면 미스매치가 어느 정도 허용될 수 있다. 이와 관련하여 '충분히'는 바람직하게는 EP 1619249의 실시예 1에 기재된 바와 같은 겔 유동성 이동 에세이를 사용하여 AON의 결합이 검출될 수 있음을 의미한다.

선택적으로 상기 AON은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 스타가르트 질환 환자로부터 유래된 섬유 모세포로부터 생성된 옵틱 컵(또는 안구 컵)을 사용하여 추가로 시험될 수 있다. 엑손 39/40의 스킵핑을 차단하는 것은 RT-PCR에 의해 평가될 수 있다(Aukrust 등, 2016의 기술 사항 참조). 상보적 영역은 바람직하게는 결합될 때 이들은 프리-mRNA 내에서 엑손에 특이성을 지니도록 설계된다. 이러한 특이성은 시스템에서 다른 (프리-)mRNA 분자의 실제 서열에 의존하기 때문에 다양한 길이의 상보 영역으로 생성될 수 있다.

AON이 또한 하나 이상의 다른 프리-mRNA 분자에 혼성화될 수 있는 위험성은 AON의 크기가 증가함에 따라 감소한다. 상보성 영역에서 불일치를 포함하여도 프리-mRNA에서 표적화된 영역에 하이브리드화 및/또는 결합하는 능력을 보유하는 AON이 본 발명에서 사용될 수 있음은 명백하다. 그러나 바람직하게는 적어도 상보적인 부분은 하나 이상의 상보적 영역에서 이러한 미스매치를 지니는 AON 보다 상보적 영역에서 이러한 미스매치가 없는 AON이 전형적으로 더 높은 효율 및 높은 특이성을 나타냄으로 상보적인 부분은 적어도 그러한 미스매치를 포함하지 않는다.

높은 혼성화 강도(즉, 대향하는 가닥과의 상호 작용의 수의 증가)는 시스템의 스플라이싱 기구를 간섭하는 프로세스의 효율을 증가시키는 데 유리한 것으로 생각된다. 바람직하게는 상보성은 90% 내지 100%이다. 일반적으로 이것은 20개 뉴클레오타이드의 AON에서 1 또는 2개의 미스매치를 허용하거나, 40개 뉴클레오타이드의 AON에서 1, 2, 3 또는 4개의 미스매치를 허용하거나, 60개 뉴클레오타이드 AON에서 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 미스매치를 허용하는 것이다.

본 발명의 AON은 바람직하게는 (표적) 대응 서열이 부재시 분리된 단일 가닥 분자이고 자체적으로 하이브리드화 되지 않는다. 본 발명의 AON은 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 인간 ABCA4 프리-mRNA의 인트론 38, 엑손 39, 인트론 39, 엑손 40 또는 인트론 40의 서열에 상보적으로 결합하는 서열로 생리학적 조건하에 인간 ABCA4 프리-mRNA의 인트론 38/엑손 39, 엑손 39/인트론 39, 인트론 39/엑손 40 또는 엑손 40/인트론 40의 경계부와 중복되는 서열이다.

본 발명의 바람직한 AON은 8 내지 143개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10 내지 40개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 12 내지 30개의 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드로 구성된 것으로 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141, 142 또는 143개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드로 구성된 것이다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 AON은 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 뉴클레오타이드로 구성된 것이다.

특정 실시형태에서 본 발명은 서열번호: 1 내지 서열번호: 37로 이루어진 군으로부터 선택된 단일가닥 AON을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 AON은 이하 명세서에서 상세히 설명하는 바와 같은 하나 이상의 RNA 잔기, DNA 잔기 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물을 함유할 수 있다. 본 발명의 AON은 뉴클레아제 내성을 증가 및/또는 표적 서열에 대한 AON의 친화성을 증가시키도록 변형된 하나 이상의 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 바람직한 실시형태에서, AON 서열은 하나 이상의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물을 포함하고 여기서 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 변형된 염기 및/ 또는 변형된 골격 및/또는 비천연 뉴클레오사이드 간의 결합 또는 이들의 조합을 지닌 잔기로 정의된다.

바람직한 실시형태에서 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 변형된 백본을 포함한다. 이러한 백본의 예는 모르폴리노 백본, 카바메이트 백본, 실록산 백본, 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 포름아세틸 백본, 리보아세틸 백본, 알켄함유 백본, 설파메이트, 설포네이트 및 설폰아미드 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노, 및 아미드 백본을 들 수 있다.

포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머는 안티센스 제제로서 종래에 연구된 변형된 백본 올리고 뉴클레오타이드이다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 DNA의 데옥시리보스 당이 6 원 고리로 대체되고 포스포디에스테르 결합이 포스포로 디아미데이트 결합으로 대체된 하전되지 않은 백본을 지닌다. 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 효소 분해에 내성을 지니고 RNase H를 활성화시키는 것이 아니라 번역을 정지시키거나 프리-mRNA 스플라이싱을 간섭함으로써 안티센스 작용제로 작용하는 것으로 판단된다.

모르폴리노 올리고뉴클레오타이드는 세포막을 물리적으로 파괴하는 방법으로 조직 배양 세포에 성공적으로 전달되었으며, 스크랩 로딩이 몇 가지 방법을 비교 한 연구에서 가장 효율적인 전달 방법이라는 것을 확인한 바 있다. 그러나 모르폴리노 골격이 하전되지 않기 때문에 양이온성 지질은 세포에서 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드 흡수의 효과적인 매개체가될 수 없다. 최근의 보고서는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드에 의한 삼중체 형성을 입증하였으며 비이온성 백본으로 인해 이들 연구는 모르폴리노 올리고뉴클레오타이드가 마그네슘 부재 하에서 삼중체 형성이 가능함을 보여주었다.

백본 내 잔기 사이의 연결은 인 원자를 포함하지 않는다. 예컨대 짧은 사슬 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합, 혼합 헤테로원자와 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오사이드 간의 결합, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로 사이클릭뉴클레오사이드 간의 결합을 들 수 있다.

바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 변형된 폴리아미드 백본을 지닌 펩타이드 핵산(PNA)을 포함한다(Nielsen 등, (1991) Science 254, 1497-1500). PNA 기반 분자는 염기쌍 인식 측면에서 DNA 분자의 진정한 모방체이다. PNA의 골격은 펩티드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성되며, 핵 염기는 메틸렌 카르보닐 결합에 의해 백본에 연결된다.

대안적인 백본은 1-탄소 연장된 피롤리딘 PNA 단량체를 포함한다(Govindaraju 및 Kumar (2005) Chem Commun 495-497). PNA 분자의 백본은 하전된 인산염을 함유하지 않기 때문에, PNA-RNA 하이브리드는 일반적으로 각각 RNA-RNA 또는 RNA-DNA 하이브리드보다 더 안정적이다 (Egholm 등, (1993) Nature 365 : 566-568).

추가로 바람직한 백본은 모르폴리노 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물을 포함하며, 여기서 리보스 또는 데옥시리보스 당은 6-원 모르폴리노 고리로 대체된다. 가장 바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 포함하며, 여기서 리보스 또는 데옥시리보스 당은 6-원 모르폴리노 고리로 대체되고 인접한 모르폴리노 고리 사이의 음이온성 포스포디에스테르 결합은 비이온성 포스포로디아데이트로 대체된다.

또 다른 실시형태에서에서 본 발명의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 포스포디에스테르 결합에서 비-가교 산소 중 하나의 치환을 포함한다. 이 변형은 염기쌍을 약간 불안정하게 하지만 뉴클레아제 분해에 상당한 저항성을 부여한다.

바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, H-포스포네이트, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예를 들면 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노알킬포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트을 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 셀레노포스페이트 또는 보라노포스페이트 등이다.

본 발명의 추가적으로 바람직한 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 2', 3' 및/또는 5' 위치에서 단일- 또는 이중 치환된 하나 이상의 당 모이어티, 예를 들면 -OH; -F; 하나 이상의 헤테로 원자에 의해 방해될 수 있는 치환 또는 비치환된 선형 또는 분지형 저급 (C1-C10) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 알릴 또는 아르알킬; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; O-, S- 또는 N-알릴; O-알킬-O-알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; 메톡시에톡시; 디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시에톡시 등이다.

당 모아어티는 피라노스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시피라노스 또는 이의 유도체, 바람직하게는 리보스 또는 이의 유도체, 또는 데옥시리보스 또는 이의 유도체 일 수 있다. 바람직한 유도체화된 당 모이어티는 2'-탄소 원자가 당 고리의 3 '또는 4' 탄소 원자에 연결되어 바이사이클릭 당 모이어티를 형성하는 잠금 핵산(LNA : Locked Nucleic Acid)를 포함한다. 바람직한 LNA는 2'-O, 4'-C-에틸렌 가교 핵산을 포함한다 (Morita 등, 2001. Nucleic Acid Res Supplement No.1 : 241-242). 이러한 치환은 뉴클레오타이드 동족체 또는 동등한 RNase H 및 뉴클레아 제를 내성을 부여하고 표적 RNA에 대한 친화성을 증가시킨다.

또 다른 실시형태에서 본 발명의 뉴클레오타이드 동족체 또는 균등물은 하나 이상의 염기 변형 또는 치환을 포함한다. 변형된 염기는 이노신, 크산틴, 하이포크 산틴 및 다른 -아자, 데아자, -하이드시, -할로, -티오, 티올, -알킬, -알케닐, -알키닐, 피리미딘의 티오알킬 유도체 및 퓨린 염기와 같은 합성 및 천연 염기를 포함하며 당업계에 공지되어 있다.

당업자는 AON의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없음을 이해한다. 또한 하나 이상의 상기 언급된 동족체 또는 균등물은 단일 AON에 또는 심지어 AON 내의 단일 위치에 통합될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 AON은 2 가지 이상의 상이한 유형의 동족체 또는 균등물을 지닌다.

본 발명에 따른 바람직한 엑손 스킵핑 AON은 2'-O-메틸 변형 리보스(RNA), 2'-O-에틸 변형 리보스, 2'-O-프로필 변형과 같은 2'-O 알킬 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오타이드 및/또는 할로겐화 유도체와 같은 이들 변형의 치환된 유도체를 포함한다. 본 발명에 따른 효과적인 AON은 바람직하게는 포스포로티오 에이트 백본을 지니는 2'-O-메틸 리보스를 포함한다.

ABCA4 프리-mRNA 내에서 엑손 39 및 40의 스킵핑을 효율적으로 차단하기 위해 상이한 AON이 조합될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 바람직한 실시형태에서 2개 이상의 AON의 조합, 예를 들면 2, 3, 4 또는 5 개의 상이한 AON이 본 발명의 방법에 사용된다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 하나 이상의 AON을 포함하는 AON 세트에 관한 것이다.

상기한 바와 같이 ABCA4 유전자의 인트론 38에서 c.5461-10T>C 변이의 존재는 엑손 39의 스킵핑 종종 엑손 40 와의 공동 스킵핑을 유도한다. 따라서 엑손 40을 유지하면서 엑손 39의 스킵핑을 효율적으로 차단하는 AON을 사용하는 것이 바람직하다.

AON은 세포, 바람직하게는 망막 세포에서 AON의 흡수를 향상시키는 모이어 티에 연결될 수 있다. 이러한 모이어티의 예는 콜레스테롤, 탄수화물, 비타민, 비오틴, 지질, 인지질, 안테나 내피를 포함하는 세포 투과 펩타이드, TAT, 트랜스포손 및 올리고아르기닌, 폴리-아르기닌, 올리고리신 또는 폴리리신과 같은 양으로 하전된 아미노산, 항체에 의해 제공되는 항원 결합 도메인, 항체의 Fab 단편, 또는 카멜로이드 단일 도메인 항원-결합 도메인과 같은 단일 사슬 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 AON은 당업계에 공지된 적합한 수단을 사용하여 간접적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터의 형태로 상기 개체의 개체 또는 세포, 조직 또는 기관에 제공될 수 있으며, 여기서 상기 발현 벡터는 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 전사체를 암호화한다. 발현 벡터는 바람직하게는 유전자 전달 비히클을 통해 세포, 조직, 기관 또는 개체에 도입된다. 바람직한 실시형태에서 본 명세서 내에서 확인된 바와 같은 AON의 발현 또는 전사를 구동하는 발현 카세트 또는 전사 카세트를 포함하는 바이러스 기반 발현 벡터가 제공된다.

따라서 본 발명은 AON의 발현이 유도되는 조건하에 있을 때 본 발명에 따른 AON을 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다. 발현은 U7 프로모터와 같은 폴리머라제 Ⅱ-프로모터(Pol Ⅱ) 또는 U6 RNA 프로모터와 같은 폴리머라제 Ⅲ (Pol Ⅲ) 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 바람직한 전달 비히클은 아데노 관련 바이러스 벡터 (AAV)와 같은 바이러스 벡터, 또는 렌티 바이러스 벡터 등과 같은 레트로 바이러스 벡터 등이다. 또한 플라스미드, 인공 염색체, 세포의 인간 게놈에서 표적화된 상동 재조합 및 통합에 사용될 수 있는 플라스미드는 본 명세서 내에 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합하게 적용될 수 있다.

본 발명에서 바람직한 것은 전사가 Pol Ⅲ 프로모터로부터 유도 및/또는 전사체가 U1 또는 U7 전사체와 융합된 형태인 벡터이며, 이는 작은 전사체를 전달하기 위한 양호한 결과를 생성한다. 적합한 전사체를 설계하는 것은 당업자의 기술 범위내에 있다. 바람직하게는 U1 또는 U7 전사체와의 융합 전사체 형태의 Pol Ⅲ 구동 전사체가 바람직하다. 이러한 융합은 기술된 바와 같이 생성될 수 있다 (Gorman 등, 1998. 변형된 U7 소형 핵 RNA에 의한 프리-mRNA 스플라이싱 패턴의 안정적인 변경 Proc Natl Acad Sci USA 95 (9) : 4929-34; Suter 등, 1999. 이중-표적 안티센스 U7 snRNA는 3종의 인간 베타-탈라세미아 변이에서 비정상 엑손의 효율적인 스킵핑을 촉진한다. Hum Mol Genet 8 (13) : 2415-23).

본 발명의 AON은 그 자체로 전달될 수 있다. 그러나 본 발명의 AON은 바이러스 벡터에 의해 인코딩될 수도 있다. 전형적으로 이것은 전사체의 일부에서 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 RNA 전사체의 형태이다. 본 발명에 따른 AAV 벡터는 재조합 AAV 벡터이며, 본 명세서내의 다른 곳에 도시된 바와 같이 AAV 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질의 단백질 껍질에 캡슐화된 본 발명에 따른 인코딩된 AON을 포함하는 AAV 게놈의 일부를 포함하는 AAV 벡터를 지칭한다.

AAV 게놈의 일부는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9 등과 다른 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유도된 역 말단 반복(ITR)을 함유할 수 있다. 캡시드 단백질로 구성된 단백질 쉘은 AAV1, 2, 3, 4, 5, 8, 9 등과 다른 AAV 혈청형으로부터 유래될 수 있다. 단백질 껍질은 또한 캡시드 단백질 껍질로 지칭될 수 있다. AAV 벡터는 하나 또는 바람직하게는 모든 야생형 AAV 유전자가 결실될 수 있지만, 여전히 기능성 ITR 핵산 서열을 포함할 수 있다. 기능성 ITR 서열은 AAV 비리온의 복제, 복구 및 패키지에 필요하다.

ITR 서열은 야생형 서열 또는 야생형 서열과 적어도 80 %, 85 %, 90 %, 95 또는 100 % 서열 동일성을 가질 수 있으며, 뉴클레오타이드의 기능을 유지하는 한 예를 들면 삽입, 변이, 결실 또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 이와 관련하여 기능성은 캡시드 쉘 내로 게놈을 직접 패키징하여, 감염된 숙주 세포 또는 표적 세포내에서의 발현이 허용 되도록 하는 능력을 지칭한다.

본 발명의 맥락에서 캡시드 단백질 쉘은 AAV 벡터 게놈 ITR과 상이한 혈청형일 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 AAV 벡터는 예를 들면, AAV 혈청형 2 와 같은 하나의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질 (VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함하는 캡시드 단백질 쉘, 즉 정 20면체 캡시드로 구성될 수 있다. 반면 그 AAV5 벡터에 함유된 ITR 서열은 AAV2 벡터를 포함하여 상기 기재된 AAV 혈청형 중 임의의 것일 수 있다. "AAV2 벡터"는 따라서 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하지만, 예를 들어 "AAV5 벡터"는 AAV 혈청형 5의 캡시드 단백질 쉘을 포함하며 이를 통해 본 발명에 따른 임의의 AAV 벡터 게놈 ITR을 캡슐화할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV 혈청형 9의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고, 여기서 상기 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2, 5, 8 또는 AAV로부터 유래함을 특징으로 하고, 혈청형 9; 이러한 AAV 벡터는 AAV 2/2, AAV 2/5, AAV 2/8, AAV 2/9, AAV 5/2, AAV 5/5, AAV 5/8, AAV 5/9, AAV 8/2, AAV 8/5, AAV 8/8, AAV 8/9, AAV 9/2, AAV 9/5, AAV 9/8 또는 AAV 9/9 벡터로 언급된다.

보다 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 5로부터 유래되는 것으로 이러한 벡터를 AAV 2/5 벡터라고 칭한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 8로부터 유래되는 것으로 이러한 벡터를 AAV 2/8 벡터라고 칭한다.

보다 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고, 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 9로부터 유래되는 것으로 이러한 벡터를 AAV 2/9 벡터라고 칭한다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터는 AAV 혈청형 2의 캡시드 단백질 쉘을 포함하고 상기 벡터에 존재하는 AAV 게놈 또는 ITR은 AAV 혈청형 2로부터 유래되는 것으로 이러한 벡터를 AAV 2/2 벡터라고 칭한다.

선택된 핵산 서열로 표시되는 본 발명에 따른 엑손 39 보유 AON (또는 엑손 39/엑손 40 보유 AON)을 암호화하는 핵산 분자는 바람직하게는 상기 확인 된 바와 같이 AAV 게놈 또는 ITR 서열 사이에 삽입되는 것이며, 예를 들면 발현 코딩 서열 및 3' 종결 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 엘레멘트를 포함하는 발현 컨스트럭트일 수 있다. "AAV 헬퍼 기능"은 일반적으로 AAV 벡터에 공급되는 AAV 복제 및 패키징에 필요한 상응하는 AAV 기능을 지칭한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터에서 누락된 AAV 기능을 보완하지만 AAV ITR (AAV 벡터 게놈에 의해 제공됨)이 결여되어 있다.

AAV 헬퍼 기능은 AAV의 2 가지 주요 오픈 리딩 프레임, 즉 rep 코딩 영역 및 cap 코딩 영역 또는 이들의 기능적으로 실질적으로 동일한 서열을 포함한다. Rep 및 Cap 영역은 당업계에 잘 알려져 있다. AAV 헬퍼 기능은 플라스미드일 수 있는 AAV 헬퍼 컨스트럭트 상에 제공될 수 있다.

헬퍼 컨스트럭트의 숙주 세포 내로의 도입은 본 명세서 내에서 확인된 바와 같이 AAV 벡터 내에 존재하는 AAV 게놈의 도입으로 예를 들면 형질 전환, 형질 감염 또는 형질 도입에 의해 이전에 또는 동시에 진행할 수 있다. 따라서 본 발명의 AAV 헬퍼 컨스트럭트는 한편으로는 AAV 벡터의 캡시드 단백질 쉘 및 상기 AAV 벡터 복제 및 패키징에 존재하는 AAV 게놈에 대한 혈청형의 바람직한 조합을 생성하도록 선택될 수있다. "AAV 헬퍼 바이러스"는 AAV 복제 및 패키징에 필요한 추가 기능을 제공한다.

적합한 AAV 헬퍼 바이러스는 아데노바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV 유형 1 및 2와 같은) 및 백시니아 바이러스를 포함한다. 헬퍼 바이러스에 의해 제공되는 추가 기능은 또한 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제6,531,456호에 기재된 바와 같이 벡터를 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 재조합 AAV 벡터에 존재하는 AAV 게놈은 예를 들어 AAV의 rep(복제) 또는 cap(캡시드) 유전자와 같은 바이러스 단백질을 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 것이다.

AAV 게놈은 예를 들어 항생제 내성 유전자를 코딩하는 마커 또는 리포터 유전자, 형광 단백질(예 : gfp) 또는 화학적, 효소적 또는 달리 검출 가능한 및/또는 당업자에게 공지된 선택 가능한 생성물 (예를 들면 lacZ, aph )을 암호화하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 따른 AAV 벡터는 본 명세서 내의 실시예의 방법에 따라 구축되고 생산된다. 본 발명에 따른 바람직한 AAV 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV 2/5, AAV 2/8, AAV 2/9 또는 AAV 2/2 벡터이며 본 발명에 따른 AON을 발현하는 서열을 포함하거나 서열로 구성되어 있으며, 바람직하게는 인간 ABCA4 프리-mRNA의 인트론 38, 엑손 39, 인트론 39, 엑손 40 또는 인트론 40의 뉴클레오타이드 서열, 또는 인트론 38/엑손 39, 엑손 39/인트론 39, 인트론 39/엑손 40 또는 엑손 40/인트론 40의 경계부와 중복되는 서열에 상보적이거나 실질적으로 상보적인 서열이다.

본 발명에 따른 추가의 바람직한 AAV 벡터는 AAV 벡터, 바람직하게는 AAV 2 /5, AAV 2/8, AAV 2/9 또는 AAV 2/2 벡터이며, 본 발명에 따른 AON은 바람직하게는 서열번호: 1 내지 서열번호: 37 의 서열 중 어느 하나를 포함하거나 서열로 구성된 것이다.

본 발명에 따른 AON을 지닌 상기 개체 또는 세포, 조직, 기관에 제공하기 위한 수단의 개선은 이미 지금까지 달성된 진전을 고려하여 예측할 수 있다. 이러한 미래의 개선은 물론 본 발명의 방법을 사용하여 언급된 mRNA의 재구성에 대한 효과를 달성하기 위해 통합될 수 있다. 본 발명에 따른 AON은 상기 개체의 개체, 세포, 조직 또는 기관에 그대로 전달될 수 있다. 본 발명에 따른 AON을 투여할 때 AON은 전달 방법에 적합한 용액에 용해시키는 것이 바람직하다.

수용액 내에 플라스미드를 제공함으로써 망막 세포에 AON 발현용 플라스미드를 제공할 수 있다. 대안적으로, AON 또는 AON 발현을 위한 플라스미드에 바람직한 전달 방법은 바이러스 벡터 또는 나노 입자이다. 바람직하게는 바이러스 벡터 또는 나노 입자는 망막 세포로 전달된다. 망막 세포 또는 다른 관련 세포로의 이러한 전달은 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외일 수 있다. 생체 내 AON 전달에 사용될 수 있는 나노 입자 및 미세 입자는 당업계에 잘 알려져 있다.

대안적으로, 플라스미드는 공지된 형질 감염 시약을 사용한 형질 감염시킴으로써 제공될 수 있다. 정맥 내, 피하, 근육 내, 척수강 내 및/또는 심실 내 투여의 경우 용액은 생리 식염수인 것이 바람직하다. 본 발명에서 특히 바람직한 것은 본 명세서에서 정의된 각각의 성분을 세포 및/또는 세포(바람직하게는 망막 세포)로 전달하는 것을 돕는 부형제 또는 형질 감염 시약의 사용이다.

세포막을 통해 비시클 또는 리포좀에 복합화 되거나 포획된 본 명세서 내에 정의된 각각의 성분을 전달하는 복합체, 나노 입자, 마이셀, 소포 및/또는 리포좀을 형성할 수 있는 부형제 또는 형질 감염 시약이 바람직하다. 이들 부형제 중 다수는 당업계에 공지되어 있다. 적합한 부형제 또는 형질 감염 시약은 폴리에틸렌이민 (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas)), LipofectAMINE ™ 2000 (Invitrogen) 또는 이의 유도체, 또는 폴리프로필렌이민 또는 폴리에틸렌이민 공중합체 (PEC) 및 유도체와 같은 양이온성 중합체, 합성 양친매성 물질 (SAINT-18),리포펙틴^TM, DOTAP 및/또는 본 명세서 내에 정의된 바와 같이 각각의 성분을 세포, 바람직하게는 망막 세포에 전달할 수 있는 입자로 자가 조립될 수 있는 바이러스 캡시드 단백질을 포함한다.

이러한 부형제는 망막 세포를 포함하여 다양한 배양 세포에 AON을 효과적으로 전달하는 것으로 나타났다. 이들의 높은 형질 감염 잠재력은 전반적인 세포 생존 측면에서 예외적으로 낮거나 중간 정도의 독성도와 결합된다. 구조적 변형의 용이성은 추가의 변형 및 추가의 (생체 내) 핵산 전달 특성 및 독성의 분석을 허용하기 위해 사용될 수 있다. 리포펙틴은 리포좀 형질 감염제의 예를 나타낸다. 양이온성 지질 성분인 N-[1-(2,3 디올레오일옥시)프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) (메틸설페이트 염인 DOTAP)와 중성 지질 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE) 의 두 가지 지질 성분으로 구성된다.

중성 성분은 세포 내 분비를 매개한다. 다른 전달 시스템 그룹은 중합체 나노 입자이다. DNA 형질 감염 시약으로 잘 알려진 디에틸아미노 에틸아미노에틸 (DEAE)-덱스트란과 같은 다중 양이온은 부틸시아노아크릴레이트(PBCA) 및 헥실시 아노아크릴레이트(PHCA)와 결합하여 세포막을 가로 질러 AON을 세포 내로 전달할 수 있는 양이온성 나노 입자를 제형화할 수 있다.

이러한 일반적인 나노 입자 물질 외에, 양이온성 펩타이드 프로타민은 콜로이드와 올리고뉴클레오타이드를 제형화하기 위한 대안적인 접근법을 제공한다. 이 콜로이드성 나노 입자 시스템은 소위 프로티클(proticles)을 형성할 수 있으며, 이는 AON의 세포내 방출을 패키징하고 매개하기 위한 간단한 자가-조립 공정에 의해 제조될 수 있다.

당업자는 ABCA4 변이체 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연을 위해 AON을 전달하기 위해 본 발명에서 사용하기 위해 AON을 패키징 및 전달하기 위해 상기 또는 다른 상업적으로 이용 가능한 선택적 부형제 및 전달 시스템 중 사용 가능한 것을 선택하고 적용할 수 있다. "ABCA4 변이체 관련 질환 또는 상태의 예방, 치료 또는 지연"은 본 명세서에서 ABCA4 유전자의 유전적 결함에 의해 야기되는 부분적 또는 완전한 시각 장애 또는 실명을 예방, 정지, 진행 중지 또는 역전시키는 것으로 바람직하게 정의된다.

또한 본 발명에 따른 AON은 세포, 세포질 및/또는 그의 핵으로의 흡수를 촉진하도록 특별히 설계된 표적 리간드에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 이러한 리간드는 (ⅰ) 세포 흡수를 촉진하는 세포, 조직 또는 기관 특이적 요소를 인식하는 화합물 (펩티드 (유사) 구조를 포함하나 이에 한정되지는 않음) 및/또는 (ⅱ) 엔도좀 또는 리소좀과 같은 비시클로부터 올리고뉴클레오타이드의 세포 내 분비 및/또는 세포 흡수를 촉진할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다.

따라서 바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 AON은 조성물 또는 약제 또는 조성물로 제제화되며 이는 적어도 하나의 부형제 및/또는 전달하기 위한 표적화 리간드 및/또는 세포 내 전달 기구 및/또는 그의 세포 내 전달 강화를 위한 것이다.

조성물이 본 명세서 내에서 후술하는 보조제 화합물과 같은 추가 성분을 포함하는 경우, 조성물의 각 성분은 하나의 단일 조합 또는 조성물 또는 제제로 제형 화되지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 그 성분에 따라 당업자는 본 명세서 내에 정의된 바와 같이 각각의 성분에 가장 적합한 유형의 제제을 판단하게될 것이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 AON 및 본 명세서에서 후술하는 추가 보조제 화합물을 포함하는 부분의 키트 형태인 조성물 또는 제제를 제공한다.

필요한 경우 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 AON을 발현하는 벡터, 바람직하게는 바이러스 벡터는 약제학적으로 허용되는 담체를 첨가함으로써 약제 학적 활성 혼합물에 혼입될 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 약제학적 조성물은 담체, 충전제, 보존제, 보조제, 가용화제 및/또는 희석제를 포함하는 임의의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체, 충전제, 보존제, 보조제, 가용화제 및 /또는 희석제는 예를 들어 Remington(Remington. 2000. Science and Practice of Pharmacy, 20 판, Baltimore, MD : Lippincott Williams Wilkins)에 예시 되어 있다. 상기 조성물의 각각의 특징은 앞서 본 명세서에서 정의되었다.

바람직한 투여 경로는 수용액의 유리체내 주입 또는 안구내 투여용으로 특별히 적합화된 제형이다. EP 2425814 호에서는 펩티드 또는 핵산 약물의 안구내(유리체내) 투여에 특히 적합한 수중유 에멀젼이 개시되어 있다. 이 에멀젼은 유리질 유체보다 밀도가 낮기 때문에 에멀젼이 유리질 상부에 유제가 부유되어 주입 된 약물이 시력을 손상시키지 않도록 한다.

본 발명에 따른 다수의 별개의 AON이 사용되는 경우, 본 명세서 내에 정의 된 농도 또는 용량은 사용된 모든 AON의 총 농도 또는 용량 또는 사용되거나 첨가 된 각각의 AON의 농도 또는 용량을 지칭할 수 있다. 따라서 하나의 실시형태에서 사용된 본 발명에 따른 AON의 각각 또는 총량은 0.01 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 20 mg/kg의 양으로 투여되는 조성물이 제공된다. 적합한 유리체내 용량은 눈 안구 약 0.05mg 내지 5mg, 바람직하게는 0.1 내지 1mg, 예컨대 안구당 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0mg 일 것이다.

본 발명에 따른 바람직한 AON은 개체의 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 것이다. 바람직하게는 상기 ABCA4 변이체는 c.5461-10T>C 변이체이지만, 다른 ABCA4 변이체가 또한 엑손 39 또는 엑손 39/40의 스킵핑을 야기할 수 있다는 것을 배제할 수는 없으며 따라서 본 발명의 AON에 의해 차단될 수도 있다.

따라서, 본 발명의 AON은 바람직하게는 알려진 c.5461-10T>C 변이에 의해 야기된 스타가르트 질환에 사용되지만, ABCA4 프리-mRNA의 엑손 39 또는 엑손 39/40의 스킵핑에 의해 야기되는 임의의 질환에 사용될 수도 있다. 이는 (기능적) ABCA4 단백질의 감소를 초래한다. 이러한 변이가 그 스플라이싱 효과를 유발한다는 것이 이제 명백해졌지만 광범위한 ABCA4 변이의 범위를 고려할 때 다른 변이가 동일한 스플라이싱 변경을 야기한다는 것을 배제할 수 없으며 이는 또한 본 발명의 AON에 의해 예방될 수 있다. 따라서 본 발명은 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑을 차단 또는 방지하는 AON에 관한 것으로 스킵핑은 c.5461-10T>C 변이 또는 ABCA4 유전자의 다른 (아직 알려지지 않은) 변이에 의해 야기될 수 있다.

본 발명의 모든 실시형태에서 용어 "치료"는 ABCA4 변이체 관련 질병 또는 상태의 예방 및/또는 지연을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명에 따라 AON을 사용하여 치료될 수 있는 개체는 이미 ABCA4 변이 관련 질병 또는 상태를 지닌 것으로 진단되었을 수 있다. 대안적으로 본 발명에 따른 AON을 사용하여 치료될 수 있는 개체는 아직 스타가르트 질환과 같은 ABCA4 변이 관련 질환 또는 상태를 지니는 것으로 진단되지 않았지만, 자신의 유전적 배경을 고려할 때 미래에 그러한 질환 또는 상태의 발병 위험성이 증가된 개체 일 수 있다.

바람직한 개체는 인간 개인이다. 바람직한 실시형태에서 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태는 스타가르트 질환이다. 따라서 본 발명은 ABCA4의 스플라이싱 조절을 필요로 하는 ABCA4 변이체 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다. 상기 사용의 각각의 특징은 본 명세서에서 앞서 정의 되어 있다.

본 발명은 또한 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 요구하는 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태의 치료를 위한 본 발명에 따른 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 것이다. 바람직한 실시형태에서 본 발명의 모든 측면에서 ABCA4-변이체 관련 장애, 질환 또는 상태는 인간 ABCA4 유전자의 엑손 38에서 c.5461-10T>C 변이에 의해 야기되는 것이다.

본 발명은 또한 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 요하는 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 및 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태의 예방 처치 또는 지연을 위한 본 발명에 따른 AON의 용도 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 의약 제조를 위한 조성물을 제공한다.

따라서 추가의 측면에서 의약의 제조, ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱의 조절을 필요로 하는 상태의 치료를 위한 의약의 제조 및 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태의 예방 처치 또는 지연을 위한 본 발명에 의약의 제조를 위한 본 명세서에 정의된 AON, 바이러스 벡터 또는 조성물의 용도가 제공된다.

본 발명에 따른 치료 용도 또는 치료법은 평생 적어도 1회 이상, 1주일, 1개월, 수개월, 1, 2, 3, 4, 5, 6년 이상 지속된다. 본 발명에 따라 사용하기 위해 본 명세서에 정의된 바와 같은 각각의 AON 또는 그의 균등물은 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태에 이미 영향을 받거나 발병할 위험성이 있는 개체의 생체 내 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 투여하기에 적합할 수 있고; 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 직접 투여될 수도 있다.

본 발명의 AON, 조성물, 화합물 또는 보조제 화합물 또는 보조 화합물의 투여 빈도는 질환의 중증도, 환자의 연령, 환자의 변이, AON의 수(즉 용량), 상기 AON의 제형, 투여 경로 등과 같은 몇몇 파라미터에 의존할 수 있다. 빈도는 매일, 매주, 적어도 2주일에 한 번 또는 3주 또는 4주 또는 5주 또는 더 긴 기간으로 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 AON의 용량 범위는 바람직하게는 엄격한 프로토콜 요건이 존재하는 임상 시험(생체 내 사용)에서의 용량 증가 연구에 기초하여 설계된다. 본 명세서 내에 정의된 AON은 0.01 내지 20 mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 20 mg/kg 범위의 용량으로 사용될 수 있다. 적합한 유리체내 용량은 안구 당 0.05mg 내지 5mg, 바람직하게는 0.1 내지 1mg, 예컨대 안구 당 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0mg 일 것이다. 바람직한 실시형태에서 0.1 nM 내지 1 μM 범위의 본 명세서 내에서 정의된 AON의 농도가 사용된다.

d.

바람직하게는, 이 범위는 망막 세포 또는 망막 조직과 같은 세포 모델에서 시험관내 사용을 위한 것이다. 더욱 바람직하게는 사용되는 농도는 1 내지 400 nM, 더욱 바람직하게는 10 내지 200 nM, 더욱 더 바람직하게는 50 내지 100 nM의 범위이다. 다수의 AON이 사용되는 경우 이 농도 또는 용량은 AON의 총 농도 또는 용량 또는 첨가된 각각의 AON의 농도 또는 용량을 지칭할 수 있다.

바람직한 실시형태에서 본 발명에 따른 분자의 전달 비히클로서 바이러스 벡터, 바람직하게는 본 명세서 내에 전술한 바와 같은 AAV 벡터는 주사 당 1×10⁹ 내지 1×10¹⁷ 바이러스 입자, 보다 바람직하게는 주사 당 1×10¹⁰ 내지 1×10¹² 바이러스 입자 범위의 용량으로 투여된다. 상기 주어진 바와 같은 AON의 농도 또는 용량의 범위는 생체 내, 시험관 내 또는 생체 외 용도에 바람직한 농도 또는 용량이다.

당업자는 사용된 AON, 치료될 표적 세포, 유전자 표적 및 그의 발현 수준, 사용된 배지 및 형질 감염 및 배양 조건에 따라 사용된 AON의 농도 또는 용량이 더 욱 최적화될 수 있도록 추가로 변경될 필요가 있음을 이해할 것이다.

본 발명에 따른 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따라 사용하기 위한 본 발명에 따른 조성물은 이미 영향을 받은 개체 또는 ABCA4- 변이체 관련 질환 또는 상태가 발생할 위험성이 증가되는 생체 내 세포, 조직 및/또는 기관에 투여하기에 적합할 수 있도록 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 조성물은 이미 영향을 받거나 질환 또는 상태의 위험성이 있는 개체의 생체 내 세포, 조직 및/또는 기관에 직접 또는 간접적으로 투여될 수 있다. 스타가르트 질환은 망막에서 현저한 표현형을 지니므로, 세포가 망막 세포인 것이 바람직하고 상기 조직이 망막인 것이 더욱 바람직하고 상기 기관은 눈인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 또한 세포, 바람직하게는 망막 세포를 본 발명에 따른 AON(따라서 엑손 39의 스킵핑을 차단하는 AON) 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 세포에서 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법을 제공한다. 이러한 태의 특징은 바람직하게는 본 명세서에서 앞서 정의된 특징이다.

세포를 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 본 명세서 내에 기재된 AON, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달 방법의 용도가 포함된다. 접촉 단계는 직접적 또는 간접적일 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내일 수 있다.

본 발명은 추가로 이를 필요로 하는 개체의 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절해야 하는 ABCA4-변이체 관련 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 개체의 세포, 바람직하게는 망막 세포를 상기 개체의 상기 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스플라이싱을 방지 또는 차단하기 위해 본 발명에 따른 AON, 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터, 또는 본 발명에 따른 조성물을 포함한다.

이 실시형태의 특징은 바람직하게는 본 명세서에서 앞서 정의된 특징이다. 세포, 바람직하게는 망막 세포를 본 발명에 따른 AON 또는 본 발명에 따른 바이러스 벡터 또는 본 발명에 따른 조성물과 접촉시키는 단계는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 AON, 바이러스 벡터 및 조성물의 전달 방법의 용도가 포함된다. 접촉은 직접적 또는 간접적 일 수 있으며 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내 일 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서 내에 기술된 각각의 실시형태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 실시형태와 조합될 수 있다.

본 명세서 내에 제공된 서열 정보는 잘못 식별된 염기의 포함에 관해 너무 좁게 해석되어서는 안된다. 당업자는 잘못 식별된 염기를 식별할 수 있고 이러한 오류를 정정하는 방법을 알고 있다. 본 명세서에 인용된 모든 특허 및 참고 문헌은 그 전문이 본원에 참조용 문헌으로 포함된다.

실시예

(실시예 1) 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39 스킵핑을 차단하기 위한

안티센스 올리고뉴클레오타이드 (AON)의 생성 및 시험.

인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑을 저해하는 능력에 대해 테스트된 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 엑손 38과 엑손 39 사이의 인트론 38 내에, 엑손 39 내에, 엑손 39와 엑손 40 사이의 인트론 39 내에 및 인트론과 엑손의 경계부에 존재하는 엑손 또는 인트론 스플라이싱 부위(ESS 및 ISS)를 표적으로 하여 설계되었다. 너무 길지 않은 (제조 목적, 관리 효율성 및 자체 어닐링을 제한하기 위한 ) 최대한 하나의 CpG 모티프를 포함하고 너무 높은 비율의 구아노신을 포함하지 않은 AON을 설계하는 것이 목적이었다. 초기에 디자인된 모든 AON은 표 1에 제공된다. 모든 AON의 길이는 20 내지 25 개 뉴클레오타이드 범위이고 모든 AON은 완전히 2'-O-메틸 변형된다. 모든 뉴클레오사이드 간 연결은 포스포로티오에이트 결합이다. 제조 후 AON을 물에서 최종 농도 100 μM로 재구성하였다.

미니 유전자의 구축

인간 망막아세포종 WERI-Rb-1 (ATCC^ㄾ HTB-169 ™) 세포를 10 % 소태아 혈청 (Biowest; CatNo. S181) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신(Sigma-Aldrich, P4333-100ML)을 지닌 RPMI-1640 배지(Thermo Scientific; 11875-085)에서 성장시켰다. DNA 분리를 위해 WERI-Rb-1 세포의 하나의 T75 플라스크를 수집하고 300 xg에서 5분 동안 원심분리 하여 세포 펠레트를 수집하였다. 제조업체의 지침에 따라 DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여 DNA를 추출하였다. 키트에 의해 제공된 200㎕ 완충액 AE에서 DNA를 용출시켰다. 수율을 증가시키기 위해 용출액을 동일한 칼럼에 2회 통과시켰다. DNA 농도는 Nanodrop 2000 분광 광도계(Nanodrop Technology)를 사용하여 측정되었으며 샘플은 추후 사용을 위해 -20℃에서 보관되었다.

5' 및 3' 말단에 각각 SalI 및 NotI 제한 부위를 함유하는 야생형 삽입물 (WT)을 생성하기 위해, 300ng WERI-Rb-1 DNA를 주형으로 사용하고 표적 서열의 증폭을 다음 프라이머 세트 포함하는 Phusion^ㄾ 고-충실도 DNA 폴리머라제를 사용하여 수행하였다 (Thermo Scientific; Cat No. F530L).

MG1 WT (Sangermano 등, 2016):

MG1-F 5'- AAAAAAGTCGACGTGTTAACAAATGCCTTGAGG-3' (서열번호: 51)

MG1-R 5'- AAAAAAGCGGCCGCAGCTCACCCCACAGACCT-3' (서열번호: 52)

MG2 WT (Sangermano 등, 2016):

MG2-F 5'- AAAAAAGTCGACCCTTGAGGCACTGCTTGTAA-3' (서열번호: 38)

MG2-R 5'- AAAAAAGCGGCCGCCTGCCACAGTCTGATGCAG-3' (서열번호: 39)

MG3 WT (본 명세서에 개시됨 엑손 39 단독):

MG3-F 5'- AAAAAAGTCGACAAATCCCTCCAGTGGCCAGT-3' (서열번호: 53)

MG3-R 5'- AAAAAAGCGGCCGCCCTAATCCTCTCCAGCTGG-3' (서열번호: 54)

MG4 WT (본 명세서에 개시됨 엑손 39 및 엑손 40):

MG4-F 5'- AAAAAAGTCGACAAATCCCTCCAGTGGCCAGT-3' (서열번호: 53)

MG4-R 5'- AAAAAAGCGGCCGCATATCAGCAATTGAAATT-3' (서열번호: 55)

MG3 삽입물은 인트론 38 내의 -150 위치에서 시작하여 인트론 39 내의 +152에서 끝나는 반면, MG4 인서트는 인트론 38 내의 -150 위치에서 시작하고 (MG3과 동일하게) 인트론 40 내의 +246 위치에서 종료한다. 얻어진 PCR 생성물은 제조사의 프로토콜에 따라 NucleoSpin Gel 및 PCR cleanup 키트(Machery-Nagel; Cat No. 740609.250)로 겔 정제되었다. 상이한 길이의 인트론 인접 부위을 지닌 변이체 삽입물은 각각 5' 및 3' 말단에 SalI 및 NotI 제한부위를 함유하는 gBlocks로서 Integrated DNA Technologies에서 주문하였다.

DNA 삽입물 (상기 개략된 야생형 및 돌연변이 gBlock 단편) 및 숙주 벡터 pET01 엑손트랩 벡터 (MoBiTec GmbH; Cat No. K2010)를 SalI 및 NotI에 의해 절단시키고, 당업계에 공지된 일반적인 절차를 사용하여 독립적으로 함께 라이게이트시켰다. 엑손 1 정방향 : 5'- CCAGGCTTTTGTCAACAGCA -3'(서열번호: 40) 및 엑손 2 역방향 : 5'-ATTGCAGAGGGGTGGACAG -3'(서열번호: 41)을 사용하여 벡터에 삽입물의 존재 여부를 PCR로 확인하였다. 인트론 38의 일부 (변이를 지니거나 지니지 않은) 및 엑손 39의 전체를 보유하는 얻어진 컨스트럭트 및 인트론 39의 일부(MG1, MG2 및 MG3)를 도 4에 개략적으로 도시하였다(상부 패널).

유사한 접근법을 사용하여 단일 벡터에서 인트론 38의 일부 (변이를 지니거나 지니지 않은), 엑손 39의 전체, 인트론 39의 전체, 엑손 40의 전체 및 인트론 40의 일부를 포함하는 컨스트럭트를 수득하였다. 본 발명의 AON을 사용하여 엑손 39/엑손 40 이중 스킵핑의 블록을 조사한다. 엑손 39 및 엑손 40을 함유하는 컨스트럭트는 엑손 39 상부의 인트론 38에서의 변이 위치 (MG4)와 함께 도 4에 도시되어있다(하부 패널).

세포 배양, 형질 감염, RNA 분리 및 cDNA 합성

HeLa 세포를 10% FBS 및 1% 펜/스트렙이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 24 웰 플레이트에 2×10⁵ 세포/웰로 접종하였다. 순차적 형질감염을 위해, 접종 후 1일에 세포를 10% FBS가 보충된 1ml DMEM 중의 리포펙타민 2000 (ThermoScientific, 11668019)을 사용하여 200- 500 ng 플라스미드로 형질 감염시키고 6시간 동안 배양한 후, 배지를 새로 교환하였다. 24시간 후 세포를 500㎕ 배지에서 100- 250 nM AON으로 형질감염 시켰다. RNA는 AON 형질감염 24시간 후에 분리하였다.

이중 형질감염의 경우 접종 후 1일에 세포를 리포펙타민 3000 (ThermoScientific, L3000015)을 사용하여 10% FBS와 함께 500μL DMEM에서 200-500ng 플라스미드 + 250nM AON으로 동시 형질 감염시켰다. 6시간 인큐베이션 후, 배지를 새로 교환하였다. 24-48 시간 후에 RNA를 분리하였다. 이를 위해 세포를 PBS로 세척하고 350㎕ RLT 완충액(Qiagen, RNeasy Plus Mini 키트, # 74136)으로 용해시켰다.

제조사의 지침에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen, # 74136)를 사용하여 RNA를 분리하였다. 키트와 함께 제공된 gDNA 엘리미네이터 컬럼을 사용하여 게놈 DNA를 제거하였다. RNA를 30㎕의 RNAse-free water에서 용출시켰다. 수율을 증가시키기 위해, 용출액을 동일한 칼럼에 2회 통과시켰다. RNA 농도는 Nanodrop 2000 분광 광도계(Nanodrop Technology)를 사용하여 측정되었고 샘플은 추후 사용을 위해 -80℃에서 저장되었다.

cDNA 합성을 위해 1000ng RNA를 랜덤 헥사머 프라이머와 함께 Maxima Reverse Transcriptase(Thermo Scientific; Cat No. EP0742)의 주형으로 사용하고 제조업체의 지침에 따라 처리했다. 비-RT 샘플 (효소없이)을 대조군으로서 포함시키고 다른 샘플과 함께 분석하였다.

PCR, 바이오 분석기 및 ddPCR

원칙적으로 ABCA4 mRNA의 단편 (여전히 엑손 39를 함유하는 경우)은 PCR 프라이머 중 하나 또는 둘 모두가 그 엑손 내에 있을 때 PCR을 사용하여 증폭될 수있다. 엑손 39가 mRNA에 여전히 존재하는지 확인하기 위해, 100ng cDNA가 생성되어 표적 서열의 주형 및 증폭에 사용되었다. 이는 엑손 39 정방향 : 5'-CTGCTCATTGTCTTCCCCCA-3'(서열번호: 42) 및 엑손 39 역방향 : 5'-CAAACCGGGCATAGACATCTG -3'(서열번호: 43) 프라이머를 사용하여 이를 수행하였다.

이들 프라이머 둘 모두를 엑손 39 서열 내에서 어닐링하여 (HeLa 세포에서) 엑손 39를 함유하는 백그라운드 mRNA을 공동 증폭시킨다. PCR 반응은 Phusion^ㄾ 고-충실도 DNA 폴리머라제 (Thermo Scientific; Cat No. F530L)를 사용하여 수행하였다. Bioanalyzer 2100 소프트웨어를 사용하여 Bioanalyzer 2100 (DNA 1000 키트, Agilent Technologies)으로 PCR 단편을 분석하였다.

ddPCR 분석을 위해 QX200TM Droplet Digital^TM PCR 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 샘플을 분석한다. 플라스미드의 엑손 1 및 2를 증폭시키는 프라이머와 ABCA4 엑손 39 및 플라스미드 엑손 1을 표적으로 하는 2개의 프로브로 구성된 맞춤형 에세이(IDT, Integrated DNA Technologies)가 가능하다. 실험 설정 및 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행된다(Bio-Rad, QX200 시스템).

결과

도 6은 c.5461-10T>C 변이 (+ MG3 변이) 또는 MG3 야생형 컨스트럭트 (+ MG3 WT)을 지닌 다른 AON를 지니거나 지니지 않은 MG3 컨스트럭트로 HeLa 세포를 형질 감염시킨 후의 바이오 분석기의 RT-PCR 결과를 나타낸다. 처음에 서열번호: 1 내지 서열번호: 16의 16 개의 AON을 시험하였다(도 2 및 표 1 참조). RT-PCR은 엑손 39 서열 내에서 프라이머 어닐링으로 수행되었으며, 이는 하부 패널에서 "HeLa (NT)"(비형질 감염된 HeLa 세포)로 표시된 레인이 또한 예상 수준에서 밴드를 나타낸다. 이는 HeLa 세포가 야생형 ABCA4 유전자를 보유하고 있기 때문에, 그로부터 명백하게 mRNA가 생성되고 또한 이로부터 양성 PCR 생성물이 생성된다는 사실에 기인한다.

음성 대조군("ctrAON")은 변이 및 관련되지 않은 비 ABCA4 어닐링 AON을 지닌 MG3 컨스트럭트에 의한 형질 감염이었다. 또 다른 음성 대조군은 컨스트럭트 또는 AON이 없이 형질 감염 시약으로만 형질 감염된 세포를 나타내는 "Mock tr"레인이다. "Rt-ctr"및 "H₂O"는 세포 물질 없이 PCR 반응에 대한 2개의 추가 음성 대조군으로 아무런 신호도 나타내지 않았다.

생성물 밴드의 강도의 증가는 엑손 39를 포함하는 mRNA 카피의 증가를 시사한다. 이는 배경으로 HeLa 세포에서 이미 생성된 것을 기초로 평가되어야 하고 실제로 AON이 형질 감염되지 않은 WT 신호와 관련하여 평가되어야하기 때문에, "WT-no AON"으로 표시된 레인을 100%로 취하고 바이오 분석기 소프트웨어를 적용하여 100 % 강도와 비교하여 다른 밴드의 강도를 측정하였다.

이것은 약 1/3 (29%)이 적어도 배경 HeLa 단독 신호에 의한 것이지만 PCR 반응이기 때문에 발현 수준의 차이를 나타내는 최고의 측정 방법은 아니다. 데이터는 AON의 유무에 관계없이 형질 감염 자체가 이 설정을 사용하여 AON과 무관하게 신호를 약 70%까지 증가시킬 수 있음을 나타낸다.

그러나 AON1, AON3, AON4, AON5, AON6, AON12, AON13 및 AON14에서 감지된 강도는 최소 80% 이상 증가 하였고 AON3, AON4, AON6 및 AON12 의 가장 높게 나타났으며 그 강도는 WT 신호를 100 %로 설정시 적어도 90% 이상 이었다. 이는 이들 AON이 엑손 39가 스킵핑 되지 않는 야생형 상황에 가까운 수준으로 c.5461-10T>C 변이를 지닌 MG3 컨스트럭트로부터 엑손 39의 스킵핑을 억제할 수 있음을 나타낸다.

(실시예 2) ddPCR 분석을 사용하여 HEK293 세포 내에서 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39 스킵핑을 차단하기 위한 AON의 추가 시험

실시예 1에서 기술되고 초기에 테스트된 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 정량적 및 이소형-특이적 ddPCR 분석을 사용하여 HEK293 세포에서 추가로 평가되었다. 요약하면, c.5461-10T>C 변이(MG3)를 함유하는 ABCA4 엑손 39 미니-유전자를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고 상이한 AON으로 처리하였다. AON 처리되지 않은 (모의) 샘플을 참조 대조군으로 사용하였다. ddPCR 분석을 사용하여 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑을 차단하는 AON의 능력을 정량화 하였다.

세포 배양 조건, 형질 감염, RNA 분리

MG3은 실시예 1에 기재되어 있다. HEK293 세포를 10% FBS 및 1% 펜/스트렙이 보충된 DMEM에서 배양하였다. 세포를 12 웰 플레이트 상에 0.2×10⁶ 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 처리 조건마다 2개의 샘플(전사체)을 사용하였다. 이중 형질 감염의 경우, 접종 후 1일, 세포를 10% FBS가 보충된 1mL DMEM에서 LipofectAMINE™ 2000(Invitrogen), 1:2 비율 w/v를 사용하여 75ng MG3 플라스미드 및 250nM AON으로 형질 감염시켰다.

RNA는 제조사의 지침에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen, # 74136)를 사용하여 형질 감염 24 시간 후 분리되었다. RNA 농도는 Nanodrop 2000 분광 광도계 (Nanodrop Technology)를 사용하여 측정되었고, 샘플은 추후 사용을 위해 -80℃에서 저장하였다.

ddPCR 정량분석

ddPCR은 QX200 시스템(Bio-Rad)의 공급업체 프로토콜에 따라 프로브용 1 단계 RT-ddPCR 고급 키트(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 분석은 각각 900 nM 정방 및 역방 프라이머 및 250 nM 표지된 프로브를 함유하였다. AON 7, 8, 9, 10, 11, 26, 27, 28 및 29 엑손 39의 정방 프라이머로서 5'-AGCTCTCTACCTGGTGTGT-3'(서열번호: 56) 및 역방 프라이머로서 5'-AACCTGAGCAGCGTCTTG-3'(서열번호: 57) 및 프로브로서 5'-TTCTTCTACACACCCATGTCCCGC-3'(서열번호: 58)를 사용하여 엑손 39의 내포를 평가하였다.

나머지 AON의 경우, 정방 프라이머로서 5'-GTCAACAGCACCTTTGTGGT-3'(서열번호: 59), 역방 프라이머로서 5'-TGTGCCACCCAAACCGGG-3'(서열번호: 60) 및 프로브로서 5'-GGTCAATGAGGCCCCGGCCCAGGCA-3'(서열번호: 61)를 사용하여 엑손 39의 내포를 평가하였다. 정방 프라이머로서 5'-GTCAACAGCACCTTTGTGGT-3'(서열번호: 62), 역방 프라이머로서 5'-CAAGGTCTGAAGGTCACGGG-3'(서열번호: 63) 및 프로브로서 5'-AGGACCCACAAGGTGGCACAA-3'(서열번호: 64)를 사용하여 엑손 39의 배제를 평가하였다. 엑손 39 내포 비율은 (엑손 39 내포 × 100) / (엑손 39 내포 + 엑손 39 배제) 공식을 사용하여 계산하였다.

결과

각각의 AON에 따른 c.5461-10T>C 변이를 보유하는 MG3 컨스트럭트로 형질 감염된 HEK293 세포 내의 엑손 39 내포 백분율의 ddPCR 정량분석을 도 7에 나타내었다. AON을 상이한 날짜에 배치로 평가하여 그 결과를 상응하는 비-AON 처리 (모의체) 대조군으로 실험 별로 나타내었다. 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 처리되지 않은 "모의" 조건에서 엑손 39의 내포는 대략 10%의 전사체에서 관찰되었다.

다수의 AON은 모의체와 비교하여 엑손 39가 내포된 전사체의 비율을 증가시킬 수 있었다. 도 7a에 나타난 바와 같이, AON31은 가장 높은 내포 백분율(즉, 62%)을 나타내었으며 이어서 AON32, AON12 및 AON1가 각각 49%, 43% 및 41%의 백분율을 나타내었다. 또한 AON17, AON20 및 AON35도 낮은 정도로 엑손 내포를 증가시켰다.

중요하게는, AON12, AON31 및 AON32는 ABCA4 프리-mRNA의 인트론 39에서 중복 영역에 결합하여, 5'-UGGUAGCCGAGGCCCAUGGAGCAUGGGCCCUGGG-3'(서열번호: 65) 서열을 지니는 핫스팟의 존재를 나타낸다. 또한 AON1과 AON17은 중복되는 영역에 바인딩되어 인트론 38(5'-UUGCCCUGUGCUGUCCUGUGAGAGCAUCUGG-3'(서열번호: 66) 내에 핫스팟이 있음을 나타낸다. 두 핫스팟은 도 2에서 이탤릭체로 표시한다.

(실시예 3) 대안적 (MG3_2) 미니-유전자 컨스트럭트를 사용하여 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39 스킵핑을 차단하기 위한 AON 시험

실시예 1 및 실시예 2에 나타낸 바와 같이 설명되고 시험된 다양한 AON을 새로운 미니-유전자 컨스트럭트를 사용하여 추가로 평가하였다. 요약하면, c.5461-10T>C 변이 (본 명세서에서 MG3_2로 지칭됨)를 함유하는 새로운 ABCA4 엑손 39 미니-유전자를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고 상이한 AON으로 처리하였다. AON 처리되지 않은 (모의체) 샘플을 참조 대조군으로 사용하였다. 또한 ABCA4 프리-mRNA에 상보성을 지니지 않은 스크램블된 AON을 대조군으로 사용하였다. 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑을 차단하는 AON의 능력을 정량화하기 위해 정량적 및 이소형 특이적 ddPCR 분석을 사용하였다.

미니-유전자 MG3_2의 구축

c.5461-10T>C 변이를 포함하여 ABCA4 엑손 39 서열 및 이의 인접 인트론 영역을 포함하는 DNA 삽입물을 각각 5' 및 3' 말단에서 EcoR1 및 SalI 부위(통합 DNA 기술)를 운반하는 gBlock으로서 화학적으로 합성하였다. pCI-네오-포유동물 스플라이싱 벡터(WO 2016/005514; WO 2017/186739에 개시됨)에 삽입되어 인간 ABCA4 인트론 38-엑손 39-인트론 39 서열을 제외한 모든 서열을 그대로 두었다. 도 8은 MG3_2 컨스트럭트의 서열 및 ABCA4 서열의 위치를 나타낸다.

세포 배양, 형질 감염, RNA 분리

HEK293 세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 배양하고 접종하였다. 순차적 형질 감염을 위해, 접종 후 1일째에, 세포를 10%로 FEB로 보충된 1 mL 내에서 1:3 w/w의 DNA:PEI 비율로 maxPEI(Polysciences)를 사용하여 50 ng 플라스미드로 형질 감염시켰다. 24시간 후 세포를 1mL 배지 내에서 1:2 w/v 비율로 LipofectAMINE™ 2000(Invitrogen)를 사용하여 250 nM AON으로 형질 감염시켰다. 제조사의 지침에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen)를 사용하여 AON 형질 감염 24시간 후에 RNA를 분리하였다. RNA 농도는 Nanodrop 2000 분광 광도계(Nanodrop Technology)를 사용하여 측정하였으며 추가 사용을 위해 샘플을 -80℃에서 저장하였다.

ddPCR 정량분석

ddPCR을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정방 프라이머로서 5'-TACATGTTCGTGGTCCACTTC-3'(서열번호: 70), 역방 프라이머로서 5'-GAAGACAATGAGCAGCTTCCT-3'(서열번호: 71) 및 프로브로서 5'-AACGCTGCTCAGGTTCAACGC-3'(서열번호: 72)을 사용하여 엑손 39의 내포를 평가하였다. 정방 프라이머로서 서열번호: 70의 프라이머, 역방 프라이머로서 5'-GCAGATGGTGGTGAGCAT-3'(서열번호: 73) 및 프로브로서 5'-ACCGTCAAGGAGTTCCGGAACTG-3'(서열번호: 74)를 사용하여 엑손 39의 배제를 평가 하였다. 엑손 39 내포의 비율은 실시예 2와 같이 계산하였다.

결과

도 9a는 MG3_2 미니-유전자 컨스트럭트의 개략도를 나타낸다. 처음에는 HEK293 세포를 플라스미드 단독 만으로 형질 감염시키고 RNA를 RHO 엑손 3 및 5 영역으로부터의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 생성물을 바이오 분석기에서 분석하였다(도 9b). c.5461-10T>C 변이로 인해, 대부분의 컨스트럭트는 엑손 39가 결여(하부 밴드)되었으며, 실제로 엑손 39 내포(상부 밴드)는 훨씬 낮은 수준에서 관찰되었다.

c.5461-10T>C 변이 및 AON(들)을 보유하는 MG3_2 컨스트럭트로 형질 감염된 HEK293 세포 내의 엑손 39 내포 백분율의 ddPCR 정량분석을 도 9c에 나타내었다. 데이터는 평균±표준 편차로 나타내었다. 스크램블된 대조군(Scr. Cont로 나타냄)은 MG3_2 컨스트럭트 및 관련되지 않은 비-상보적 AON을 사용한 형질 감염을 의미한다. "모의체"는 AON 처리가 없음 (음성 대조군)을 의미한다. 모의 조건에서, 엑손 39 내포가 전사체의 11%에서 관찰되었다. 많은 AON이 이러한 백그라운드 백분율을 높일 수 있었다.

AON32는 실시예 2에서 나타난 결과와 일치하는 가장 높은 백분율의 엑손 39 내포(49%)를 나타내었다. 다시 한번, AON32는 AON31 및 AON12와 중첩되어 엑손 39 내포의 양을 증가시켰다. 이는 서열번호: 65의 서열이 실제로 AON 어닐링 및 엑손 39 보유의 유도를 위한 핫스팟임을 확인한 것이다.

실시예 2 내에서 엑손 39 내포의 증가를 초래한 AON1 및 AON17 또한 본 발명에서 긍정적인 효과를 나타내었으며 이는 서열번호: 66의 서열 또한 AON 어닐링 및 엑손 39 보유의 유도를 위한 핫스팟임을 확인한 것이다. 증가된 엑손 39의 내포를 나타내는 다른 AON은 AON3, 4, 9, 24, 25 및 29 이었다.

(실시예 4) 인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39 스킵핑을 차단하기 위한 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형을 지니는 AON

엑손 39의 내포에 대한 AON의 효과를 추가로 평가하기 위해 AON1 및 AON32를 각각의 뉴클레오사이드 내의 2'-O-메톡시에틸(2'-MOE) 변형으로 생성하고, 각각의 뉴클레오사이드 내에 2'-OMe 변형을 포함하는 AON1 및 AON32와 비교하였다(상기 실시예에 사용된 바와 동일함).

인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑을 차단하는 AON1-MOE 및 AON32-MOE의 능력을 평가하고 AON1 및 AON32와 비교하였다. 요약하면 c.5461-10T>C 변이를 함유하는 ABCA4 엑손 39 미니-유전자(MG3_2, 실시예 3 참조)를 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시키고 상이한 AON으로 처리하였다. AON으로 처리되지 않은 샘플을 참조 대조군으로 사용하였다.

인간 ABCA4 프리-mRNA로부터 엑손 39의 스킵핑을 차단하는 AON의 능력을 정량분석하기 위해 정량적 및 이소형 특이 ddPCR 분석을 사용하였다. HEK293 세포를 배양하고 상기한 바와 같이 접종하고, 50 ng 플라스미드에 대해 250 nM AON을 형질 감염시켰다. ddPCR을 수행하고 엑손 내포 백분율 계산은 실시예 3에 기재된 바와 같다.

결과는 평균±표준 편차로 도 10에 나타내었다. "모의체"는 AON 처리가 없음(즉, 음성 대조군)을 의미한다. 처리되지 않은 "모의" 조건에서 엑손 39의 내포는 전사체의 약 14%에서 관찰되었으며 이는 실시예 3에서 관찰된 것과 일치하여 AON1 및 AON32(2'-OMe로 모두 변형됨)로 처리한 후에 상당히 증가하였다.

AON1 효과(전사체의 약 24%가 엑손 39를 보유함)는 AON1 MOE를 사용하여 약 40% 증가하였고 2'-MOE 변형된 올리고뉴클레오타이드(대부분 더 안정적인)를 사용할 때 더 개선되고 보다 효율적인 엑손 39 보유를 나타내었다. AON32에서도 비슷한 경향이 나타난다. AON32 (2'-O-메틸화) 처리된 샘플에서 약 45%의 전사체가 엑손 39를 보유하는 반면에 AON32 MOE(2'-O-메톡시에틸화) 처리된 샘플에서는 약 58%의 전사체가 엑손 39를 보유하였다.

<110> ProQR Therapeutics II B.V. Yilmaz-Elis, Aliye Seda Adamson, Peter Dulla, Kalyana Chakravarthi Schulkens, Iris Antoinette Ernestine <120> Antisense oligonucleotides for the treatment of Stargardt disease <130> P3049PC00 <140> PCT/EP2018/059542 <141> 2018-04-13 <150> GB1706009.6 <151> 2017-04-13 <160> 74 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AON1 <400> 1 cucacaggac agcacagggc aa 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AON2 <400> 2 cagcaggugg ggcccagaug cu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AON3 <400> 3 caaaccccac ccccccucuc uu 22 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AON4 <400> 4 guaggacugu uggaaacggg g 21 <210> 5 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AON5 <400> 5 agcgucugaa acagggaa 18 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AON6 <400> 6 gaaccugagc agcgucugaa a 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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agcuaugcug gccucguacg ccucgauguc 2460 ccuucuauuu ucucagggga ggcucugccc aacaugccaa guccgaccac uugaaaacaa 2520 gucccuggcu uaacacagac cccagagaga gucuccaacc cuccucuccc uagacaaugg 2580 uaguugcccu gugaggggcu gaaaagcaga gcuggagaug gcucagggcc ugguguuaac 2640 aaaugccuug agggcuccug uuguuucaaa gugagucugc agggagagcu cccuaagugg 2700 acagcaggag ggcugcagcu ucucugcaca uuccugcugu cacccccaga gucaccuagg 2760 ggagggguaa ggacaguaau gcagguuccu cacaguuagc cucggugccc acaugguacu 2820 gagcauagua aauguuuaga agaugcugcc uggcuagaca aaggggaagc ucccgcccac 2880 uagaaacuug cagggagccc caguccuuga uuggucauuu aauugauuag cuccuuggcc 2940 uggccuugag gcacugcuug uaaguacuuc augaccucca uugcaaaccc augaugcucu 3000 gcuggacaaa ucccuccagu ggccagucug gcugcaagga cucucugucu gcaggccuug 3060 cccugugcug uccugugaga gcaucugggc cccaccugcu gaagagaggg gggguggggu 3120 uugccccguu uccaacaguc cuacuucccu guuucagacg cugcucaggu ucaacgccgu 3180 gcugaggaag cugcucauug ucuuccccca cuucugccug ggccggggcc ucauugaccu 3240 ugcacugagc caggcuguga cagaugucua ugcccgguuu gguggguggu agccgaggcc 3300 cauggagcau gggcccuggg uccaaagcug ggaggguuac cgggggggcu ccugcaucag 3360 acuguggcag gggcuggugc uaggagggga ccuuguuggg cuggaggugu ccugccagcu 3420 ggagaggauu agggugccuc uguuuccaug gcuggggagc cacaggaggg auggagggca 3480 gcccuuauga ggcggguguu uggcucuugc ucaguuccca cauaaggccu ggucuagugg 3540 gcccugugcu guggccaggu cuguggggug agcuggggcg gcugaagugg acucaauucc 3600 uguugaugcc caggugagga gcacucugca aauccguucc acugggaccu gauugggaag 3660 aaccuguuug ccaugguggu ggaaggggug guguacuucc uccugacccu gcugguccag 3720 cgccacuucu uccucuccca augguacguc caugccacac ccugggccag ugggcagcuc 3780 agggcaucca gaacuggacc uuauacccac auggucauuu cuuuccucag gagccccacu 3840 ccacaauguu uuuucuacau ucucaaagcc uggcuuuucu ccaauaauac aaguagagga 3900 ucggguuaaa auaggcacau ucaaauaugu gaagagcauc cacuuuaaaa uauuuaaaau 3960 gcagugcuau uaauuucaau ugcugauauu uaauccuucu cauuuaauua ccaaaugugu 4020 auuuugauua gaugauagua uugcaaauaa caaugguuac aggguaucca aaguacuagg 4080 aaauagacua auguauuuau gagagaaagg acacagcagg ccccuuugcu aauuagagau 4140 uugggagcau gggaguaaua ugggagccau guggaggggu gcgggcagug aucacgaccc 4200 cccacuccug gaggaaggug gguagcugcc aacccugacu uuugaccagg gcuucucaaa 4260 ugccagguua gcuggcaauu gccauucuuc cgcaggcucu uccugaagcu gggugggccc 4320 cugccucacu ccccucugca auccaguccu accuuuauug uccucaccca ggggccugaa 4380 uugccaagca gcagcccuuc cuagcaagcu uuccccaaua guguuuuguu ucuuaacuuu 4440 uccuccucuc aggcugagug uggucaccug uaaauagauu ccaaggacuu gguuuuaugu 4500 uuugauccac agggaauuga uuuauuggaa augaaucugc cuuucuacuc acaggacugu 4560 gagaggugaa ugagaucaca ggugucaaca cacgccugau gaaacaggau acacaagcag 4620 uucuaguuau gggagacagu gucaggaauu guuguccuug gcacccucag ccccugcaga 4680 cccuuucugc agccuuggcc auaccuuuua gaggcuuuug ugugggagag agcaggucag 4740 gagguugacu acccaaauug acucauuagc uucaaacucu gaugucaaca cauuugaaug 4800 aguccugccu gcuuuagggc cuaaagagga ccagagaagu acaccauagu cccuggcuuc 4860 cagaagguca gggaggguuu caaagaagag gcugugucuu uaagaauggg gaagauucca 4920 uuuggugggg caggaggagg agaacauuga gggacuggaa acacaugcgg aggcugggag 4980 acgggaauga ccaauaggac ugggaaccag ggggagaugc caauugcuga cagaggaguu 5040 agugcaagag guaagugaga aggguaggug gggcuggauu gcagggcugu aacuacagcu 5100 gcagagggag ggcuucaacc uacagcugau ggggaacaac agaagguuuu gaggcaugag 5160 guggccugau gacaacucug uuuuggaaag guggaguugg cagggcagac uggaggaagu 5220 gggaggcucg gagguuagua acuaccccuu acugagugcu ugcuguagag gaagcauuuu 5280 aguccugacg gugaucccag gcccugaguc uuuacucugu gccaggcacu gugcugaguu 5340 caucuucagc acaauccuau gagacaggua uuguuacccu ccuccucauc acaugguuga 5400 aguaggcaag guucagagag guccaaugcc caagaucaca caugaggagg ccaggacugg 5460 aacccaaggc ugacucugga caugagcacc ugaccucucu accuaaugcc uaaugccucu 5520 ccugcuggga gcccuuuuua gaauuuaagu cuuaaaggau ggaagcccag aaggaagcag 5580 aagcaaggaa guggaagaga ggucccaugg aaaggacagu gccaaggaca cuguacagcc 5640 agcccaaucc ugaccccuuu ucuucaucua g 5671 <210> 45 <211> 3157 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 gugagcauaa cuuucuuggc uuuuuuguuu gauuaguagg auaguagagu auguguuggu 60 cgagcagagc caggggcaag caucguacau guagcagcug uaugcggaug agugccacuu 120 ucuuccuccc uacccccgac ccugccuccu uuccuuccuu ccuuccuccc auccuuccuu 180 ccucuuuccu ucuucuccuc ccuccucccu ccuucccccg ucccuccuuc cuuccuuuuu 240 cauugcuucc uuccuuccuu cgucccuccu ucccuuccuc uuuccuucug cccucucucc 300 cuuuuuccuu ucauccuccc uccaucccuc ccuccauccu uccuucuuuc uuccuucuuu 360 ccuuccuaua agcaccuuuu ucauuucugu gcucugaaug aaaugguuuu cuguguuuau 420 ucugcaagca aaacuugauu cuugcaauaa acuuuaagcu uugcuuacuc uuucagaaag 480 guuuucucag ggacuuuggg uguuggguuu uacacacaca cacaucaaua cauuugggua 540 auuucaaaau cuaaaaggaa caaaaaggca uacaaugaaa aaaucuccuu ccuaccccug 600 uuucccacuc augcaguucu cuucuccaga ggcaaacucu uacuugaguu uccugugugc 660 ucuggagaca caucagcaga ucccuauacg gucuuucucc cgcuuucuua uggaaauugu 720 aacacucuga cauauacuau uccuugggca aguuaaucuu gaugaagaga cuggguguuc 780 uccaugcuga augccucacu uuuaugagcu gccaagccca guugucccuu ccaccugacc 840 ucccccuguc cagagacaga uggccaaacu gaaucauaaa aagaggggga aaaaaagaag 900 gcagucgcug cagggcuguc uuuacuccac acuccacacu cccagucccc accgcugugu 960 cugaguccug gcuguggcug uccuuggaac auuugccuca ccacgugccu guguccccag 1020 gcgccucaac cuuuccucuc cucauuagcu cuucccaguu cagagggugg gaccggccag 1080 cacaucugca cugcugcccu gccacaccca ccuccaccug ccucugggcc ccacugggga 1140 acacaggaca aaucugugcg gaggccccac caugaaccgc ccagacccgu ggaccccuga 1200 gacugacucu uuccagaucu uguuaggguu ucguggcugc uaggcaagua acgaagccuc 1260 aucuguccca ugaaugauaa gaaauucagc augucagagu cagacucugg aaaggcgggg 1320 ggauaagaac acagccccag cagauggcca gagcacccag gugacugaaa gugcugcuuu 1380 gcagagcugu guuugccaca ggcucacagc ccacuaaguc uuaagacagu uuuccuucag 1440 aauaauuaaa uagccagcuu aaagcaacuc agaacauuuu ccccucugag gcugcaccca 1500 uuuagccaac auuugcuaag cacccgccuu caaaaaccug guauuuucau guaaauuauc 1560 cgauacacag cugcuaugga aacccccagu aucccacagg aagcucccca gcucccagca 1620 gcugccggcc cgugugagau caggaggucu uuaccagcug aacaccacgu gccgggugug 1680 ugcugauaua aacaagcgug gcccacucgu ccugcccucc agaggcuccc guuccagucg 1740 gaaaaggacc ugcccacgaa guuugcaacg auauaagcca caguguauga uccuccauaa 1800 uacagcgugu gacagagcag cagaggagcg aggcagauaa caugcugcag gccagaggca 1860 gcgggaagag ccaggcugca ggggcugggg gagccguggu ggaggaaguu caauuucagc 1920 cuguagauuu cuauuagccc auuuaauaaa uaaugaagug ccuacucuga gcuaaucauu 1980 gugcagguau uuaggaagga caaaaaaaua auuaggacuc agugcccacc cuccaggggc 2040 ccacugacua guagagaaag uaggcagauu uuuaaaaaau uaaucauggg aaugugauaa 2100 gugcugggag agaggaaugg auacuuucuc augggaaucu uggaaggcuu guaagggaag 2160 gcacucucug agccagcugu cuaaagaaga acaggaaucu uuaagaaagc agaagggaaa 2220 agagcauucu uuccugcuug gagcaauagg uaacagccug cacaugccca ggccuagagg 2280 ccaaagagca cagugauucc agaaagagug gggagaaagg guaggcaggg aaggaugagg 2340 uaaugugggc gcaggugugg aggcuggaga gggaggaggu ugugggacug ggaggagcca 2400 gauggaaugg acagcagugg cccagccagg agcuaugcug gccucguacg ccucgauguc 2460 ccuucuauuu ucucagggga ggcucugccc aacaugccaa guccgaccac uugaaaacaa 2520 gucccuggcu uaacacagac cccagagaga gucuccaacc cuccucuccc uagacaaugg 2580 uaguugcccu gugaggggcu gaaaagcaga gcuggagaug gcucagggcc ugguguuaac 2640 aaaugccuug agggcuccug uuguuucaaa gugagucugc agggagagcu cccuaagugg 2700 acagcaggag ggcugcagcu ucucugcaca uuccugcugu cacccccaga gucaccuagg 2760 ggagggguaa ggacaguaau gcagguuccu cacaguuagc cucggugccc acaugguacu 2820 gagcauagua aauguuuaga agaugcugcc uggcuagaca aaggggaagc ucccgcccac 2880 uagaaacuug cagggagccc caguccuuga uuggucauuu aauugauuag cuccuuggcc 2940 uggccuugag gcacugcuug uaaguacuuc augaccucca uugcaaaccc augaugcucu 3000 gcuggacaaa ucccuccagu ggccagucug gcugcaagga cucucugucu gcaggccuug 3060 cccugugcug uccugugaga gcaucugggc cccaccugcu gaagagaggg gggguggggu 3120 uugccccguu uccaacaguc cuacuucccu guuucag 3157 <210> 46 <211> 124 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 acgcugcuca gguucaacgc cgugcugagg aagcugcuca uugucuuccc ccacuucugc 60 cugggccggg gccucauuga ccuugcacug agccaggcug ugacagaugu cuaugcccgg 120 uuug 124 <210> 47 <211> 332 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 guggguggua gccgaggccc auggagcaug ggcccugggu ccaaagcugg gaggguuacc 60 gggggggcuc cugcaucaga cuguggcagg ggcuggugcu aggaggggac cuuguugggc 120 uggagguguc cugccagcug gagaggauua gggugccucu guuuccaugg cuggggagcc 180 acaggaggga uggagggcag cccuuaugag gcggguguuu ggcucuugcu caguucccac 240 auaaggccug gucuaguggg cccugugcug uggccagguc ugugggguga gcuggggcgg 300 cugaagugga cucaauuccu guugaugccc ag 332 <210> 48 <211> 130 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 gugaggagca cucugcaaau ccguuccacu gggaccugau ugggaagaac cuguuugcca 60 ugguggugga agggguggug uacuuccucc ugacccugcu gguccagcgc cacuucuucc 120 ucucccaaug 130 <210> 49 <211> 1928 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 guacguccau gccacacccu gggccagugg gcagcucagg gcauccagaa cuggaccuua 60 uacccacaug gucauuucuu uccucaggag ccccacucca caauguuuuu ucuacauucu 120 caaagccugg cuuuucucca auaauacaag uagaggaucg gguuaaaaua ggcacauuca 180 aauaugugaa gagcauccac uuuaaaauau uuaaaaugca gugcuauuaa uuucaauugc 240 ugauauuuaa uccuucucau uuaauuacca aauguguauu uugauuagau gauaguauug 300 caaauaacaa ugguuacagg guauccaaag uacuaggaaa uagacuaaug uauuuaugag 360 agaaaggaca cagcaggccc cuuugcuaau uagagauuug ggagcauggg aguaauaugg 420 gagccaugug gaggggugcg ggcagugauc acgacccccc acuccuggag gaaggugggu 480 agcugccaac ccugacuuuu gaccagggcu ucucaaaugc cagguuagcu ggcaauugcc 540 auucuuccgc aggcucuucc ugaagcuggg ugggccccug ccucacuccc cucugcaauc 600 caguccuacc uuuauugucc ucacccaggg gccugaauug ccaagcagca gcccuuccua 660 gcaagcuuuc cccaauagug uuuuguuucu uaacuuuucc uccucucagg cugagugugg 720 ucaccuguaa auagauucca aggacuuggu uuuauguuuu gauccacagg gaauugauuu 780 auuggaaaug aaucugccuu ucuacucaca ggacugugag aggugaauga gaucacaggu 840 gucaacacac gccugaugaa acaggauaca caagcaguuc uaguuauggg agacaguguc 900 aggaauuguu guccuuggca cccucagccc cugcagaccc uuucugcagc cuuggccaua 960 ccuuuuagag gcuuuugugu gggagagagc aggucaggag guugacuacc caaauugacu 1020 cauuagcuuc aaacucugau gucaacacau uugaaugagu ccugccugcu uuagggccua 1080 aagaggacca gagaaguaca ccauaguccc uggcuuccag aaggucaggg aggguuucaa 1140 agaagaggcu gugucuuuaa gaauggggaa gauuccauuu gguggggcag gaggaggaga 1200 acauugaggg acuggaaaca caugcggagg cugggagacg ggaaugacca auaggacugg 1260 gaaccagggg gagaugccaa uugcugacag aggaguuagu gcaagaggua agugagaagg 1320 guaggugggg cuggauugca gggcuguaac uacagcugca gagggagggc uucaaccuac 1380 agcugauggg gaacaacaga agguuuugag gcaugaggug gccugaugac aacucuguuu 1440 uggaaaggug gaguuggcag ggcagacugg aggaaguggg aggcucggag guuaguaacu 1500 accccuuacu gagugcuugc uguagaggaa gcauuuuagu ccugacggug aucccaggcc 1560 cugagucuuu acucugugcc aggcacugug cugaguucau cuucagcaca auccuaugag 1620 acagguauug uuacccuccu ccucaucaca ugguugaagu aggcaagguu cagagagguc 1680 caaugcccaa gaucacacau gaggaggcca ggacuggaac ccaaggcuga cucuggacau 1740 gagcaccuga ccucucuacc uaaugccuaa ugccucuccu gcugggagcc cuuuuuagaa 1800 uuuaagucuu aaaggaugga agcccagaag gaagcagaag caaggaagug gaagagaggu 1860 cccauggaaa ggacagugcc aaggacacug uacagccagc ccaauccuga ccccuuuucu 1920 ucaucuag 1928 <210> 50 <211> 784 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 gccuugcccu gugcuguccu gugagagcau cugggcccca ccugcugaag agaggggggg 60 ugggguuugc cccguuucca acaguccuac uucccuguuu cagacgcugc ucagguucaa 120 cgccgugcug aggaagcugc ucauugucuu cccccacuuc ugccugggcc ggggccucau 180 ugaccuugca cugagccagg cugugacaga ugucuaugcc cgguuuggug ggugguagcc 240 gaggcccaug gagcaugggc ccugggucca aagcugggag gguuaccggg ggggcuccug 300 caucagacug uggcaggggc uggugcuagg aggggaccuu guugggcugg agguguccug 360 ccagcuggag aggauuaggg ugccucuguu uccauggcug gggagccaca ggagggaugg 420 agggcagccc uuaugaggcg gguguuuggc ucuugcucag uucccacaua aggccugguc 480 uagugggccc ugugcugugg ccaggucugu ggggugagcu ggggcggcug aaguggacuc 540 aauuccuguu gaugcccagg ugaggagcac ucugcaaauc cguuccacug ggaccugauu 600 gggaagaacc uguuugccau ggugguggaa gggguggugu acuuccuccu gacccugcug 660 guccagcgcc acuucuuccu cucccaaugg uacguccaug ccacacccug ggccaguggg 720 cagcucaggg cauccagaac uggaccuuau acccacaugg ucauuucuuu ccucaggagc 780 ccca 784 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MG1-F primer <400> 51 aaaaaagtcg acgtgttaac aaatgccttg agg 33 <210> 52 <211> 32 <212> 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gtgggcggcc tcacggctct gagggtccag cccccagcat gcatctgcgg 180 ctcctgctcc ctggaggagc catatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc ttcgtgttaa 240 caaatgcctt gagggctcct gttgtttcaa agtgagtctg cagggagagc tccctaagtg 300 gacagcagga gggctgcagc ttctctgcac attcctgctg tcacccccag agtcacctag 360 gggaggggta aggacagtaa tgcaggttcc tcacagttag cctcggtgcc cacatggtac 420 tgagcatagt aaatgtttag aagatgctgc ctggctagac aaaggggaag ctcccgccca 480 ctagaaactt gcagggagcc ccagtccttg attggtcatt taattgatta gctccttggc 540 ctggccttga ggcactgctt gtaagtactt catgacctcc attgcaaacc catgatgctc 600 tgctggacaa atccctccag tggccagtct ggctgcaagg actctctgtc tgcaggcctt 660 gccctgtgct gtcctgtgag agcatctggg ccccacctgc tgaagagagg gggggtgggg 720 tttgccccgt ttccaacagt cctacttccc tgtttcagac gctgctcagg ttcaacgccg 780 tgctgaggaa gctgctcatt gtcttccccc acttctgcct gggccggggc ctcattgacc 840 ttgcactgag ccaggctgtg acagatgtct atgcccggtt tggtgggtgg tagccgaggc 900 ccatggagca tgggccctgg gtccaaagct gggagggtta ccgggggggc tcctgcatca 960 gactgtggca ggggctggtg ctaggagggg accttgttgg gctggaggtg tcctgccagc 1020 tggagaggat tagggtgcct ctgtttccat ggctggggag ccacaggagg gatggagggc 1080 agcccttatg aggcgggtgt ttggctcttg ctcagttccc acataaggcc tggtctagtg 1140 ggccctgtgc tgtggccagg tctgtggggt gagctgaccc agctttcttg tacaaagtgg 1200 tgatgagagg tacctccgag gggtaaacag ttgggtaaac agtctctgaa gtcagctctg 1260 ccattttcta gctgtatggc cctgggcaag tcaatttcct tctctgtgct ttggtttcct 1320 catccataga aaggtagaaa gggcaaaaca ccaaactctt ggattacaag agataattta 1380 cagaacaccc ttggcacaca gagggcacca tgaaatgtca cgggtgacac agcccccttg 1440 tgctcagtcc ctggcatctc taggggtgag gagcgtctgc ctagcaggtt cccaccagga 1500 agctggattt gagtggatgg ggcgctggaa tcgtgagggg cagaagcagg caaagggtcg 1560 gggcgaacct cactaacgtg ccagttccaa gcacactgtg ggcagccctg gccctgactc 1620 aagcctcttg ccttccagtt ccggaactgc atgctcacca ccatctgctg cggcaagaac 1680 ccactgggtg acgatgaggc ctctgctacc gtgtccaaga cggagacgag ccaggtggcc 1740 ccggcctaag acctgcctag gactctgtgg ccgactatag gcgtctccca tcccctacac 1800 ctgtcgac 1808 <210> 68 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 68 cggaggtcaa caacgagtct tttgtcatct acatgttcgt ggtccacttc accatcccca 60 tgattatcat ctttttctgc tatgggcagc tcgtcttcac cgtcaaggag 110 <210> 69 <211> 111 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 69 ttccggaact gcatgctcac caccatctgc tgcggcaaga acccactggg tgacgatgag 60 gcctctgcta ccgtgtccaa gacggagacg agccaggtgg ccccggccta a 111 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ddPCR forward primer <400> 70 tacatgttcg tggtccactt c 21 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ddPCR reverse primer <400> 71 gaagacaatg agcagcttcc t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ddPCR probe <400> 72 aacgctgctc aggttcaacg c 21 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ddPCR reverse primer <400> 73 gcagatggtg gtgagcat 18 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ddPCR probe <400> 74 accgtcaagg agttccggaa ctg 23

Claims (22)

1. 인간 ABCA4 프리-mRNA에서 하나 이상의 엑손 스킵핑을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(AON)에 있어서, 상기 엑손 스킵핑은 ABCA4 유전자 내의 변이에 근거함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
2. 제 1항에 있어서, 엑손 스킵핑을 야기하는 변이는 인트론 내에 존재함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
3. 제 2항에 있어서, 상기 변이는 인간 ABCA4 유전자 내의 인트론 38 내에 c.5461-10T>C 변이임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 엑손 39의 스킵핑 및/또는 엑손 39/엑손 40의 이중 스킵핑을 저해할 수 있음을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
5. 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49, 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 또는 이들의 일부의 뉴클레오타이드 서열; 또는 인간 ABCA4 프리-mRNA 내의 인트론 38/엑손 39, 엑손 39/인트론 39, 인트론 39/엑손 40 또는 엑손 40/인트론 40의 경계부와 중복되는 서열;에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
6. 제 5항에 있어서, 상보적인 서열은 인트론 38 및 엑손 39 사이의 경계부를 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
7. 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 상보적인 서열은 인간 ABCA4 유전자의 인트론 38 내에 c.5461-10T>C 변이를 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 서열번호: 44 내의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연속적 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하거나 서열로 구성됨을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 AON은 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오타이드를 포함하고 최대 하나의 CpG 모티프를 더욱 포함함을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
   
10. 제 8항에 있어서, 상기 AON은 서열번호: 65 또는 서열번호: 66 내의 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 연속적 뉴클레오타이드에 상보적인 서열을 포함하거나 서열로 구성됨을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
    
11. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 상기 AON은 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 9, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 17, 서열번호: 20, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 29, 서열번호: 31 및 서열번호: 32 중 하나의 서열을 포함하거나 서열로 구성됨을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
    
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 2'-O-메틸(2'-OMe) 변형 당과 같은 적어도 하나의 2'-O 알킬 변형을 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드(RNA 올리고뉴클레오타이드)임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
    
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 적어도 하나의 2'-메톡시에톡시(2'-MOE) 변형을 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드(RNA 올리고뉴클레오타이드)임을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
    
14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AON은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 지니고 바람직하게는 모든 연속적인 뉴클레오타이드가 포스포로티오에이트 결합으로 상호 연결됨을 특징으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드.
    
15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 AON과 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유리체내 투여를 위한 것임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
16. 제 15항에 있어서, 상기 조성물은 안구 당 총 0.05 내지 5 mg의 AON 범위의 용량을 지니고, 바람직하게는 안구 당 총 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0 mg의 AON과 같은 안구 당 총 0.1 내지 1 mg의 AON 범위임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
    
17. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 AON을 발현시키는 바이러스 벡터.
    
18. 약제에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 15항 또는 제 16항에 따른 약제학적 조성물 또는 제 17항에 따른 바이러스 벡터.
    
19. 스타가르트 질환의 치료, 예방 또는 지연을 위해 사용하는 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 15항 또는 제 16항에 따른 약제학적 조성물 또는 제 17항에 따른 바이러스 벡터.
    
20. 스타가르트 질환의 치료, 예방 또는 지연을 위해 사용하는 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 15항 또는 제 16항에 따른 약제학적 조성물 또는 제 17항에 따른 바이러스 벡터의 용도.
    
21. 세포 내의 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱 조절 방법에 있어서, 상기 방법은 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 15항 또는 제 16항에 따른 약제학적 조성물 또는 제 17항에 따른 바이러스 벡터를 상기 세포와 접촉하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
    
22. 필요로 하는 개체의 ABCA4 프리-mRNA의 스플라이싱 조절을 요구하는 스타가르트 질환 또는 상태의 치료 방법에 있어서, 상기 방법은 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 AON, 제 15항 또는 제 16항에 따른 약제학적 조성물 또는 제 17항에 따른 바이러스 벡터를 상기 개체의 세포와 접촉하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.

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