CN110997916A - 用于治疗斯达加特氏病的反义寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学和生物技术领域。特别地，本发明涉及可用于治疗、预防和/或延缓斯达加特氏病和/或与ABCA4相关的眼部疾病的新的反义寡核苷酸(AON)。更优选地，本发明涉及用于抑制或阻断人ABCA4前体‑mRNA中的外显子39跳读的AON。

Description

用于治疗斯达加特氏病的反义寡核苷酸
发明领域
本发明涉及医学和生物技术领域。特别地，本发明涉及可用于治疗、预防和/或延缓眼部疾病、优选黄斑营养不良、更优选斯达加特氏病(Stargardt disease)的反义寡核苷酸(AON)。
背景技术
斯达加特氏病(STGD或STGD1)是最常见的遗传性黄斑营养不良引起的中心视觉的渐进性损害。通常在儿童或成年早期发作，而在成年晚期最不常见，通常发病越晚，预后越好。该疾病的患病率为8,000-10,000分之1，并且，该疾病具有常染色体隐性遗传方式，与疾病引起的编码感光细胞特异性ATP结合盒转运蛋白ABCA4的基因中的突变有关。该蛋白质包含2273个氨基酸，主要表达在视网膜中，并位于边缘和椎体外节片(cone outer segmentsdisks)。据信它将N-亚视黄基(retinyl-idene)-磷脂酰乙醇胺从细胞腔(luminal)翻转到感光盘(photoreceptor disks)的胞质面。斯达加特氏病与视网膜色素上皮中脂褐素内容物的大量沉积、有毒物质清除失败以及感光细胞的大量损失紧密相关。当ABCA4缺失或功能异常时，形成脂褐素的主要成分二-维甲酸(retinoid)-吡啶鎓-乙醇胺。实际上，已经公开有许多报告，其证实了ABCA4是斯达加特氏病潜在的基因，显示出大量(～1000)致病的变体，其中一半以上仅被描述过一次。已在大约75％的斯达加特氏病病例和大约30％的常染色体隐性锥杆营养不良(come-rod dysrophy，CRD)患者中识别出ABCA4中的双等位基因变体。大多数突变是错义的，其次是无义突变，少量的插入/缺失和影响RNA剪接的突变。来自北欧和美国的斯达加特氏病病例中异常高的比例(约30％)是仅一种ABCA4变体的结果。最近显示，存在于内含子38中的第三常见的ABCA4变体c.5461-10T＞C，由于ABCA4的mRNA中外显子39的跳读或外显子39+外显子40的跳读而导致严重形式的斯达加特氏病(Aukrust等人.The intronic ABCA4 c.5461-10T＞C variant，frequently seen in patients withStargardt disease，causes splice defects and reduced ABCA4 protein level.ActaOphthalmol 2016 Oct 24：1-7；Sangermano等人.2016.Photoreceptor progenitor mRNAanalysis reveals exon skipping resulting from the ABCA4 c.5461-10T＞Cmutation in Stargardt disease.Ophthtalmology 123(6)：1375-1385)。外显子39的跳读导致124个核苷酸的移码缺失，而外显子39和40的双跳读这则导致254个核苷酸的移码缺失。值得注意的是，未检测到这种较短版本的蛋白质，可能是因为它们不稳定(Aukrust等人，2016)。据估计，在西方世界大约有7000名斯达加特氏病患者患有这种特殊的突变。
目前，治疗斯达加特氏病的三种主要干预途径是干细胞治疗、基因替代治疗和不同的药物方法。用于治疗遗传性眼部疾病的相对较新的治疗进展是使用反义寡核苷酸(AON)，其靶向从突变基因转录的前体-mRNA(pre-mRNA)。AON通常是小的多核苷酸分子(16-至25-聚体)，由于其序列与靶标前体-mRNA分子的序列互补，因此能够干扰剪接。预期的机制是，在AON结合与其互补的靶序列时，前体-mRNA内的靶向区域干扰剪接因子，其继而导致剪接改变。从治疗上讲，该方法学可以两种方式使用：a)重新指导(redirect)其中突变激活隐蔽的剪接位点的基因的正常剪接；b)跳过携带(蛋白质-截短)突变的外显子，使得mRNA保持完整，并产生(部分)功能性蛋白。两种方法都已成功应用于患有严重遗传疾病的患者(Scaffidi和Misteli.2005.Reversal of the cellular phenotype in the prematureaging disease Hutchinson-Gilford progeria syndrome.Nat.Med 11(4)：440-445；Cirak等人.2011.Restoration of the Dystrophin-associated Glycoprotein Complexafter Exon Skipping Therapy in Duchenne Muscular Dystrophy.Mol Ther 20：462-467；Cirak等人.2011.Exon skipping and dystrophin restoration in patients withDuchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholinooligomer treatment：an open-label，phase 2，dose-escalation study.Lancet 378(9791)：595-605；Goemans等人.2011.Systemic administration of PRO051 inDuchenne’s muscular dystrophy.N Engl J Med 364(16)：1513-1522)。关于眼部疾病，已经显示AON有望用于治疗雷伯氏先天性黑内障或LCA(WO 2012/168435；WO 2013/036105；WO2016/034680；WO 2016/135334)。而且，WO 2016/005514公开了用于治疗、预防或延缓II型Usher综合征的靶向USH2A前体-mRNA的外显子跳读AON，其导向外显子13、外显子50和PE40的跳读和/或保留外显子12。WO 2015/004133公开了AON用于治疗斯达加特氏病在外显子10从ABCA4前体-mRNA的跳读中的用途。因此，尽管已有描述AON用于在包括斯达加特氏病的若干种遗传性眼部疾病的治疗中的外显子跳读，但在斯达加特氏病的治疗中，特别是当其涉及外显子保留时，更具体地，用于治疗由诱导外显子39跳读的c.5461-10T＞C突变引起的斯达加特氏病，对于基于AON的策略似乎存在非常强烈的需求。
发明内容
本发明涉及用于治疗、预防或延缓斯达加特氏病的反义寡核苷酸(AON)。更具体地，本发明涉及能够抑制人ABCA4前体-mRNA中至少一个外显子、优选外显子39的跳读的AON，其中外显子跳读由ABCA4基因中的(内含子)突变引起，例如内含子38中的c.5461-10T＞C突变。优选地，AON能够抑制、防止或阻断外显子39跳读和/或外显子39/外显子40双重跳读(double skipping)。在优选的实施方式中，本发明的AON包括SEQ ID NO：1至37中任一个的序列或由其组成。本发明还涉及包括根据本发明的AON和药学上可接受的载体的药物组合物，其中药物组合物用于玻璃体内给药。在另一方面，本发明涉及表达根据本发明的AON的病毒载体。在另一方面，本发明涉及包括本发明的AON的纳米颗粒或任何类型的缓释(slow-release)组合物，用于将AON有效(并且优选持久)释放至人眼内的靶组织。在另一方面，本发明涉及用于治疗、预防或延缓斯达加特氏病的根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或根据本发明的病毒载体。在另一方面，本发明涉及治疗斯达加特氏病或病症的方法，其要求调节对其有需要的人个体的ABCA4前体-mRNA的剪接(例如防止外显子39从ABCA4前体-mRNA的跳读)，所述方法包括使人个体的细胞与根据本发明的AON、药物组合物或病毒载体接触，随后允许所述AON进入所述细胞，然后允许抑制外显子39从所述细胞中存在的突变的人ABCA4前体-mRNA的跳读。
附图说明
图1是所测试的反义寡核苷酸(AON)相对于人ABCA4基因中的外显子38、内含子38、外显子39、内含子39和外显子40的互补位置的示意图。示出外显子38和外显子39之间的内含子38中的c.5461-10T＞C突变的相对位置。
图2显示人ABCA4基因外显子39和外显子40的RNA序列(从5′到3′；SEQ ID NO：50)(粗体，两个外显子都加以下划线)以及围绕它们的内含子序列(粗体，没有下划线)。另外还示出最初设计的37个AON的序列及其对于ABCA4前体-mRNA的各个互补位置。c.5461-10T＞C突变的位置标有向下的箭头。在内含子38内显示代表AON1和17所结合的热点(hotspot)的区域如实施例中所概述以斜体给出，其序列为SEQ ID NO：65。内含子39中AON12、31和32所结合的热点同样适用，该热点序列为SEQ ID NO：66。
图3显示SEQ ID NO：44序列，具有以下顺序的人ABCA4内含子和外显子：内含子38(小写)-外显子39(大写，粗体并加下划线)-内含子39(小写)-外显子40(大写，粗体和斜体)-内含子40(小写)。内含子38(携带c.5461-10T＞C突变)＝SEQ ID NO：45；外显子39＝SEQ ID NO：46；内含子39＝SEQ ID NO：47；外显子40＝SEQ ID NO：48；内含子40＝SEQ IDNO：49。
图4是微基因(MG)构建体的示意图，示出SalI和NotI克隆位点以及内含子38中c.5461-10T＞C突变(-10T＞C)的位置。MG1和MG2已经在Sangermano等人(2016)中描述。MG3(具有外显子39)和MG4(具有外显子39和外显子40)如本文所公开。
图5显示MG3构建体(携带c.5461-10T＞C突变时)具有以下意义上的“功能性”：转染到HeLa细胞中之后，转录的前体-mRNA加工成外显子39被剪接出，外显子1与外显子2连接，而在没有突变的情况下(泳道WT，具有野生型微基因构建体)，外显子39保留存在于外显子1和外显子2之间。无插入泳道是对照，显示微基因构建体中没有插入物时的PCR产物。
图6显示在具有和没有不同AON的情况下将HeLa细胞用携带c.5461-10T突变(+MG3mut.)的MG3和野生型MG3(MG3WT)构建体转染后在生物分析仪上的RT-PCR结果。最初，在突变体版本上测试了SEQ ID NO：1-16的16个AON。RT-PCR用在外显子39序列内退火的引物进行，这使得下图中标有“HeLa(NT)”(未转染的HeLa细胞)的泳道也显示出预期水平的条带。这是由于HeLa细胞携带野生型ABCA4基因，显然还从中产生了PCR产物。阴性对照(“ctrAON”)是用携带突变的MG3构建体和无关的AON转染。另一阴性对照是“Mock tr”泳道，其代表仅用转染试剂而不用构建体或AON转染的细胞。“Rt-ctr”和“H2O”是PCR反应的两个额外地阴性对照，无细胞物质。产物带强度的增加表明包括外显子39的mRNA增加。因为评估应基于HeLa细胞中已经产生的作为背景(实际上是相对于其中没有转染AON的WT信号)来进行，因此将以“WT-no AON”表示的泳道作为100％，并应用生物分析软件测量其他条带与该100％强度相比的强度。这表明该信号的大约1/3(29％)可能归因于单独的背景HeLa信号。它还表明，具有或不具有AON的转染本身能够使AON无关的信号增强到70％左右。但是，用AON1、AON3、AON4、AON5、AON6、AON12、AON13和AON14检测到的强度增加到至少80％，其中AON3、AON4、AON6和AON12表现最好，强度为WT信号的至少90％(WT为100％)。这表明这些AON能够将外显子39从MG3突变构建体的跳读阻断至接近其中外显子39不跳读的野生型的水平。
图7显示用MG3构建体和多种所示的AON转染的HEK293细胞中外显子39内含物百分比的ddPCR定量。三个小图A、B和C代表在不同的三天进行的实验，但这些实验以相同的方式进行。模拟(Mock)代表未转染AON的外显子39内含物的百分比。
图8显示MG3_2微基因构建体中的插入物的5′至3′序列(SEQ ID NO：67)。EcoRI和SalI位点分别位于5′端和3′端。人ABCA4基因的外显子39(SEQ ID NO：46)为大写。内含子38(SEQ ID NO：45，在外显子39的5′端)和内含子39(SEQ ID NO：47，在外显子39的3′端)加以下划线。插入物5′端上的EcoRI位点和内含子38之间的其余序列以及插入物3′端上的内含子39和SalI位点之间的序列与主链质粒中已经存在的序列相同，如实施例中所述。RHO外显子3和RHO外显子5序列(分别为SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69)分别在ABCA4内含子38的5′侧和内含子39的3′侧，以粗体示出。
图9在(A)中显示MG3_2微基因构建体的示意图。它还在(B)中显示了在生物分析仪上来自MG3_2(单独的质粒)的扩增产物在包括和不包括外显子39的HEK293细胞中的位置。由于c.5461-10T＞C突变，大多数转录物缺少外显子39(下部的条带)，并且以低得多的水平观察到外显子39内含物(上部的条带)。用携带c.5461-10T＞C突变的MG3_2构建体和不同AON转染的HEK293细胞中外显子39内含物的百分比的ddPCR定量显示于(C)中，揭示了随后用AON1、3、4、9、12、17、24、25、29、31或32转染对外显子39内含物的强烈效果。
图10显示在HEK293细胞中用MG3_2微基因和糖部分中用2′-OMe修饰完全修饰的AON1和AON32转染之后外显子39内含物的百分比(使用ddPCR)，及其相比较的使用在每个糖部分带有2′-MOE修饰(而不是2′-OMe修饰)的AON1和AON32转染之后外显子39内含物的百分比，以及在不使用AON的情况下进行模拟转染之后外显子39内含物的百分比。应用相同寡核苷酸的2′-MOE版本时，观察到效果的显著增加。
具体实施方式
本发明涉及特定的反义寡核苷酸(AON)，其能够预防、抑制和/或阻断人ABCA4前体-mRNA中外显子39的跳读，或者预防、抑制和/或阻断外显子39+外显子40的双重跳读(double skipping)。已经显示，这种(双重)跳读可能至少由相对常见的引起斯达加特氏病的内含子38中的c.5461-10T＞C突变引起(Sangermano等人.2016；Aukrust等人.2016)。尽管本领域已知有诱导外显子10从人ABCA4前体-mRNA跳读的AON(WO 2015/004133)，但迄今尚不清楚AON是否也可用于在人ABCA4前体-mRNA中保留外显子，或者换句话说，用于抑制人ABCA4前体-mRNA中的外显子跳读。本发明的发明人假设，这些可以通过识别外显子39周围的内含子和外显子内以及内含子/外显子边界处的特定序列而潜在地成为可能，然后通过可以与这些序列互补并在生理条件下与其结合的提纯的合成反义寡核苷酸进行靶向，并将可以掩蔽异常的剪接位点并阻断(至一定水平)或抑制外显子39(单独或与外显子40一起)从人ABCA4前体-mRNA的剪接。已知外显子39的跳读(无论是否与外显子40一起)导致斯达加特氏病。本发明的发明人预见到，使用可以预防(或在一定程度上抑制)外显子39(单独或与外显子40一起)跳读的反义寡核苷酸将使人能够治疗、预防或延缓携带导致外显子39跳读的突变的人受试者中的斯达加特氏病。
本发明涉及一种反义寡核苷酸(AON)，其能够抑制人ABCA4前体-mRNA中至少一个外显子的跳读，其中外显子跳读由ABCA4基因中的突变引起。在优选的实施方式中，引起外显子跳读的突变是在内含子中。更优选地，所述突变是人ABCA4基因的内含子38中的c.5461-10T＞C突变。在一优选的实施方式中，本发明的AON能够抑制人ABCA4前体-mRNA中外显子39的跳读和/或外显子39/外显子40的双重跳读。在再优选的实施方式中，根据本发明的AON包括与SEQ ID NO：44内的至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸互补的序列。优选地，本发明的AON包括20、21、22、23、24或25个核苷酸，其优选地与序列SEQ ID NO：44内的连续序列完全互补，并且还包括至多一个CpG基序。更优选地，本发明的AON中不存在CpG基序。在另一优选的方面，本发明的AON包括与SEQ ID NO：65或SEQ IDNO：66内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸互补的序列或由其组成。最优选由22、23、24或25个核苷酸组成并且与SEQ ID NO：65或66表示的区域完全互补的AON。而且，优选地，在本发明的AON中，保持鸟苷的百分比尽可能低，优选低于60％、低于50％、低于40％或甚至低于30％。另外优选地，在本发明的AON中，鸟苷段保持最多三个鸟苷，并且至多具有一个三鸟苷段。在高度优选的方面，本发明的AON包括SEQ IDNO：1、3、4、5、6、9、12、13、14、17、20、24、25、29、31和32中任意一个的序列或由其组成，更优选地，包括SEQ ID NO：1、3、4、6、12、17、24、25、29、31和32中任意一个的序列或由其组成，再更优选地，包括SEQ ID NO：1、12、17、24、29、31和32中任意一个的序列或由其组成。
在另一优选的方面，根据本发明的AON是包括至少一个2′-O烷基修饰的寡核糖核苷酸(RNA寡核苷酸)，例如2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的糖。在进一步优选的实施方式中，所述AON中所有的核苷酸都是2′-O-甲基修饰的。在另一优选的方面，AON包括至少一个2′-O-甲氧基乙氧基(2′-MOE；或2′-甲氧基乙氧基)修饰。在另一方面，2′-OMe和2′-MOE修饰二者可以存在于寡核苷酸内的不同核苷处。另外，根据本发明的AON可以由全部带有2′-OMe修饰的核苷组成，或者可以由全部带有2′-MOE修饰的核苷组成。在再另一优选的实施方式中，根据本发明的AON包括至少一个硫代磷酸酯键，更优选地，AON内的所有连续核苷酸通过硫代磷酸酯键相互连接。
本发明还涉及药物组合物，其包括根据本发明的AON和药学上可接受的载体。优选地，所述药物组合物用于玻璃体内给药，优选地，剂量在每眼0.05mg至5mg总AON的范围内。本发明还涉及根据本发明的药物组合物，其中药物组合物用于玻璃体内给药，并且剂量在每眼0.1-1mg总AON的范围内，例如，每眼约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg总AON。本发明还涉及表达根据本发明的AON的病毒载体。在另一方面，本发明涉及用作药物的根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或根据本发明的病毒载体。在另一方面，本发明涉及用于治疗、预防或延缓斯达加特氏病或用于抑制人ABCA4前体-mRNA中外显子39跳读的根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或根据本发明的病毒载体。在再另一实施方式中，本发明涉及根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或根据本发明的病毒载体用于治疗、预防或延缓斯达加特氏病或者用于抑制人ABCA4前体-mRNA中外显子39跳读的用途。本发明进一步涉及用于调节细胞中ABCA4前体-mRNA的剪接的方法，所述方法包括使所述细胞与根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或根据本发明的病毒载体接触。在优选的方面，本发明涉及用于治疗斯达加特氏病或病症的方法，其要求调节对其有需要的个体的ABCA4前体-mRNA的剪接，所述方法包括使所述个体的细胞与根据本发明的AON、根据本发明的药物组合物或根据本发明的病毒载体接触。剪接的调节优选地涉及抑制外显子39跳读，该外显子39跳读由人ABCA4基因内的突变、优选由内含子38中的c.5461-10T＞C突变引起或造成。
对于ABCA4，“外显子保留”或“抑制、阻断或防止外显子跳读”(作为在细胞中施用/引入AON的结果)应当理解成在人ABCA4前体-mRNA(和随后产生的人ABCA4 mRNA)中包含外显子39或外显子39+外显子40(或维持其存在)。尽管在ABCA4基因中存在突变，该突变通常会诱导外显子39的跳读或外显子39和外显子40的跳读，并且可以引起斯达加特氏病，但是如本文所详述，在向细胞施用根据本发明的反义寡核苷酸之后，这种外显子保留将会发生。术语“外显子保留”还指诱导、产生或增加细胞内成熟mRNA的产生，上述成熟mRNA仍含有成熟mRNA中优选地应当存在的特定外显子或特定内含子。
术语“外显子跳读”在本文中定义为出现有不含一个或多个特定外显子(在当前情况下，ABCA4基因中的外显子39，或者外显子39与外显子40一起，也称作“双重跳读”)的成熟mRNA。当不发生外显子跳读时，例如在野生型情况下，这些外显子通常将存在于成熟mRNA中。通过为表达包括引起斯达加特氏病的变体的前体-mRNA的细胞提供能够干扰允许酶促剪接过程所要求的序列(例如，如(隐蔽)剪接供体或(隐蔽)剪接受体序列)的分子，实现对这些外显子跳读的阻断。
术语“前体-mRNA”是指未经加工或部分加工的前体mRNA，其通过转录(例如在细胞核中)从细胞的DNA模板合成。
术语“反义寡核苷酸”(AON)应理解成是指与前体-mRNA分子、hnRNA(异源性核RNA)或mRNA分子中的靶核苷酸序列基本互补的核苷酸序列。反义序列的互补程度(或基本互补性)优选为使得包括反义序列的分子可以在生理条件下与RNA分子中的靶核苷酸序列形成稳定的双链杂交体。术语“反义寡核苷酸”、“寡核苷酸”和“寡核苷(oligo)”在本文中可互换使用，并且应理解成是指包括相对于靶(前体-)mRNA序列的反义序列的寡核苷酸。
在本文件及其权利要求书中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，不定冠词“一”或“一个”所指的要素不排除存在一个以上要素的可能性，除非上下文明确要求存在有且只有一个要素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常表示“至少一个”。
措辞“大约”或“约”在与数值(例如约10)结合使用时优选表示该数值可以比指定数值(为10)多或少0.1％。
在一实施方式中，如本文所定义，外显子39保留分子(或外显子39/40保留分子)是与指定序列(优选SEQ ID NO：44内的序列)结合和/或互补、并使外显子39或外显子39+外显子40保留在ABCA4 mRNA中的AON。与指定的靶序列之一的结合，优选在异常ABCA4的情形中，可以通过本领域技术人员已知的技术进行评价。优选的技术是如EP1619249中所述的凝胶迁移率变动(gel mobility shift)检验。在优选的实施方式中，一旦在凝胶迁移率变动检验中可检测到所述分子与标记的靶序列的结合，就称外显子39保留AON(或外显子39/40保留AON)与指定的序列之一结合。
在本发明的所有实施方式中，外显子39保留分子(或外显子39/40保留分子)优选为AON。优选地，根据本发明的外显子39保留AON(或外显子39/40保留AON)与以下序列互补或基本上互补：人ABCA4前体-mRNA的内含子38、外显子39、内含子39、外显子40或内含子40内的序列；或者人ABCA4前体-mRNA的内含子38/外显子39、外显子39/内含子39、内含子39/外显子40或外显子40/内含子40的边界重叠的序列。更优选地，本发明的AON包括序列SEQID NO：1至37中的任意一个的核苷酸序列。
在本发明的上下文中使用的术语“基本上互补”表示，只要功能性仍可接受，即，阻断ABCA4外显子39的跳读，或者阻断外显子39+外显子40的跳读，反义序列中的一些错配是允许的。优选地，互补率为90％至100％。通常，允许20个核苷酸的AON中有1或2个错配，或者允许40个核苷酸的AON中有1、2、3或4个错配，或者允许60个核苷酸的AON中有1、2、3、4、5或6个错配等。
本发明还提供了一种用于设计AON的方法，该AON能够抑制或阻断ABCA4外显子39的跳读，或者能够抑制或阻断ABCA4外显子39与外显子40一起的跳读。首先，选择所述AON选择成与以下序列结合(在生理条件下)结合和/或互补：人ABCA4前体-mRNA的内含子38、外显子39、内含子39、外显子40或内含子40内的序列；或者人ABCA4前体-mRNA的内含子38/外显子39、外显子39/内含子39、内含子39/外显子40或外显子40/内含子40的边界重叠的序列。随后，在优选的方法中，在设计、进一步改善所述外显子保留AON时必须考虑以下方面中的至少一个：本发明的外显子保留AON优选地含有至多一个CpG基序，更优选根本不含CpG基序。AON中存在CpG基序或多个CpG基序(CpG岛)通常与所述AON的免疫原性增加相关(Dorn和Kippenberger(2008)Curr Opin Mol Ther 10(1)10-20)。这种免疫原性增加是不希望的，因为它可以引起要治疗的组织即眼睛的损伤。免疫原性可以在动物模型中通过评价CD4+和/或CD8+细胞的存在和/或炎性单核细胞浸润来评估。通过使用本领域技术人员已知的标准免疫检验来检测中和抗体和/或识别所述AON的抗体的存在，也可以在用本发明的AON治疗的动物或人的血液中评价免疫原性。通过使用标准免疫检验来检测中和抗体或识别所述AON的抗体的存在或增加量，可以评价炎症反应、I型样干扰素产生、IL-12产生和/或免疫原性增加。
本发明允许设计具有可接受的RNA结合动力学和/或热力学性质的AON。RNA结合动力学和/或热力学性质至少部分地通过AON的解链温度(Tm；使用本领域技术人员已知的寡核苷酸性质计算器计算，对于单链RNA，使用碱性Tm和最近邻模型)和/或AON-靶外显子复合物的自由能(使用RNA结构版本4.5)确定。如果Tm太高，则预期AON的特异性较低。可接受的Tm和自由能取决于AON的序列。因此，很难给出这些参数中每一个的优选范围。可接受的Tm可以在35至70℃的范围内，可接受的自由能可以在15-45 kcal/mol的范围内。
本发明的AON优选是能够表现出可接受水平的功能活性的AON。所述AON的功能活性优选地将ABCA4前体-mRNA的外显子39或外显子39+外显子40的跳读阻断至一定的可接受水平，以便为个体提供一定可检测水平的功能性野生型和全长ABCA4蛋白质。在优选的实施方式中，如通过RT-PCR和/或ddPCR分析所测量，在没有背景信号的情况下，与对照wt RNA产物相比，当包括外显子的全长mRNA为至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％或100％时，AON被称作阻断ABCA4外显子39或ABCA4外显子39+外显子40的跳读。如图6所示，保留百分比范围(如上所述)取决于背景信号，背景信号应当优选不存在。因此，优选地在不给出背景信号的系统中或者通过使用不给出背景信号的PCR引物测量这些百分比。本发明的目的是提供阻断或防止ABCA4前体-mRNA中的外显子39/40跳读的AON。确定外显子跳读和/或外显子保留的检验在本文的实施例中加以描述，并可以补充以本领域技术人员已知的技术，以判断是否发现增加的外显子39保留。
优选地，根据本发明的AON包括与以下序列互补或基本上互补的序列：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、人ABCA4前体-mRNA(如SEQ ID NO：44中完整给出，携带c.5461-10T＞C突变)的内含子38(SEQ ID NO：45)、外显子39(SEQ ID NO：46)、内含子39(SEQ ID NO：47)、外显子40(SEQ ID NO：48)或内含子40(SEQ ID NO：49)的核苷酸序列；或者与人ABCA4前体-mRNA的内含子38/外显子39、外显子39/内含子39、内含子39/外显子40或外显子40/内含子40的边界重叠的序列；并且使得(基本上)互补的部分为根据本发明的AON的长度的50％、更优选至少60％、再更优选至少70％、再更优选至少80％、再更优选至少90％或再更优选至少95％、或者再更优选98％或再更优选至少99％或者在更优选100％。更优选地，AON与包括内含子38和外显子39之间的边界、再更优选包括c.5461-10T＞C突变的序列互补。在本发明的另一方面，根据本发明的AON包括SEQ ID NO：1-16的序列或由其组成，更优选地包括选自SEQ ID NO：1、3、4、5、6、9、12、13、14、17、20、24、25、29、31和32；优选SEQ ID NO：1、12、17、24、29、31和32的序列或由其组成。
在另一优选实施方式中，本发明的AON的互补部分的长度为至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸。额外的侧翼序列可以用于修饰蛋白质与AON的结合，或者修饰AON的热力学性质，更优选地修饰靶RNA结合亲和力。
因此，并非绝对要求互补区中的所有碱基都能够与相对链中的碱基配对。例如，当设计AON时，可能想要并入例如不与互补链上的碱基碱基配对的残基。如果在细胞中的环境下核苷酸段足以能够与互补部分杂交，则在一些程度上可以允许错配。在本文中，“足以”优选是指使用如EP1619249的实施例1中所述的凝胶迁移率变动检验，可检测到AON的结合。
任选地，可以使用本领域技术人员已知的方法，通过使用源自斯达加特氏病患者的成纤维细胞产生的视杯(或眼杯)来进一步测试所述AON。外显子39/40的跳读的阻断可以通过RT-PCR评价(如Aukrust等人2016年所述的路线)。优选地，互补区设计成，当被组合时，它们对前体-mRNA中的外显子具有特异性。这种特异性可以用各种长度的互补区来产生，因为这取决于系统中其他(前体-)mRNA分子中的实际序列。随着AON大小的增加，AON也将能够与一种或多种其他前体-mRNA分子杂交的风险降低。清楚的是，在互补区中包括错配、但保留了与前体-mRNA中的(多个)靶区域杂交和/或结合的能力的AON可以用于本发明中。然而，优选地，至少互补部分不包括这样的错配，因为比起在一个或多个互补区中具有这样的错配的AON，在互补部分中缺少错配的AON通常具有更高的效率和更高的特异性。据信较高的杂交强度(即增加与相对链的相互作用的数量)有利于增加干扰系统的剪接机制过程的效率。优选地，互补性为90％至100％。通常，允许20个核苷酸的AON中有1个或2个错配，或者允许40个核苷酸的AON中有1个、2个、3个或4个错配，或者允许60个核苷酸的AON中有1个、2个、3个、4个、5个或6个错配等。
本发明的AON优选地是在不存在其(靶)对应序列的情况下的分离的单链分子，并且其不会自杂交。本发明的AON优选地与以下序列互补或者在生理条件下结合：人ABCA4前体-mRNA的内含子38、外显子39、内含子39、外显子40或内含子40的序列；或者与人ABCA4前体-mRNA的内含子38/外显子39、外显子39/内含子39、内含子39/外显子40或外显子40/内含子40的边界重叠的序列。
本发明优选的AON包括8-143个核苷酸或由其组成，更优选地，包括10-40个核苷酸或由其组成，更优选地，包括12-30个核苷酸或由其组成，更优选地，包括20-30个核苷酸或由其组成，优选地，包括8、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、115、120、125、130、135、140、141、142或143个核苷酸或由其组成；更优选地，根据本发明的AON包括20、21、22、23、24或25个核苷酸或由其组成。
在某些实施方式中，本发明提供选自SEQ ID NO：1-37的单链AON。根据本发明的AON可以含有一个或多个RNA残基、或一个或多个DNA残基、和/或一个或多个如下文将进一步详述的核苷酸类似物或等同物。优选地，本发明的AON包括一个或多个被修饰成增加核酸酶抗性和/或增加AON对靶序列的亲和力的残基。因此，在优选的实施方式中，AON序列包括至少一个核苷酸类似物或等同物，其中核苷酸类似物或等同物被定义成具有修饰的碱基和/或修饰的主链和/或非天然核苷间键或这些修饰的组合的残基。
在优选的实施方式中，核苷酸类似物或等同物包括修饰的主链。这些主链的例子有吗啉代主链、氨基甲酸酯主链、硅氧烷主链、硫化物、亚砜和砜主链、甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基主链、亚甲基甲酰基主链、核糖乙酰基(riboacetyl)主链、含烯烃的主链、氨基磺酸酯、磺酸酯和磺酰胺主链、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链和酰胺主链。磷酸二酰胺(phosphorodiamidate)吗啉代寡聚物是之前已作为反义剂考察的主链修饰寡核苷酸。吗啉代寡核苷酸具有不带电荷的主链，其中DNA的脱氧核糖被六元环取代，磷酸二酯键被磷酸二酰胺键取代。吗啉代寡核苷酸对酶降解具有抗性，并且似乎通过阻止翻译或干扰前体-mRNA剪接而不是通过激活RNase H发挥反义剂的功能。吗啉代寡核苷酸已经通过物理破坏细胞膜的方法成功地递送至组织培养细胞。一项比较若干这些方法的研究发现，划痕负载(scrape loading)是最有效的递送方法。但是，由于吗啉代主链不带电荷，因此阳离子脂质不是细胞中吗啉代寡核苷酸摄取的有效介质。最近的报道证明，由于其具有非离子性主链，吗啉代寡核苷酸形成三链体(triplex)，这些研究表明，吗啉代寡核苷酸能够在不存在镁的情况下形成三链体。
进一步优选地，主链中的残基之间的键不包括磷原子，例如，由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的键。
优选的核苷酸类似物或等同物包括具有修饰的聚酰胺主链的肽核酸(PNA)(Nielsen等人.(1991)Science 254，1497-1500)。就碱基对识别而言，基于PNA的分子是DNA分子的真实模拟物。PNA的主链由通过肽键连接的N-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元组成，其中碱基通过亚甲基羰基键与主链连接。另外可选的主链包括单碳延伸的吡咯烷PNA单体(Govindaraju和Kumar(2005)Chem Commun 495-497)。由于PNA分子的主链不含带电的磷酸基团，因此PNA-RNA杂交通常分别比RNA-RNA或RNA-DNA杂交更稳定(Egholm等人.(1993)Nature 365：566-568)。另一优选的主链包括吗啉代核苷酸类似物或等同物，其中核糖或脱氧核糖被6元吗啉代环取代。最优选的核苷酸类似物或等同物包括磷酸二酰胺吗啉代寡聚物(PMO)，其中核糖或脱氧核糖被6-元吗啉代环取代，并且相邻的吗啉代环之间的阴离子磷酸二酯键被非离子磷酸二酰胺键取代。
在再另一实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物在磷酸二酯键中包括一个非桥接氧的取代。这种修饰略微使碱基配对不稳定，但增加对核酸酶降解的显著抵抗力。优选的核苷酸类似物或等同物包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、H-膦酸酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯、5′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯，氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒化磷酸酯或硼酸磷酸酯(boranophosphate)。
本发明另一优选的核苷酸类似物或等同物包括一个或多个在2′、3′和/或5′位被单取代或二取代的糖部分，例如-OH；-F；可被一个或多个杂原子中断的取代或未取代的、直链或支链的低级(C1-C10)烷基、烯基、炔基、烷芳基、烯丙基或芳烷基；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；O-、S-或N-烯丙基；O-烷基-O-烷基、-甲氧基、-氨基丙氧基；甲氧基乙氧基；二甲基氨基氧基乙氧基；和-二甲基氨基乙氧基乙氧基。糖部分可以是吡喃糖或其衍生物或者脱氧吡喃糖或其衍生物，优选核糖或其衍生物或者脱氧核糖或其衍生物。优选的衍生化糖部分包括锁核酸(LNA)，其中2′-碳原子与糖环的3′或4′碳原子连接，从而形成二环糖部分。优选的LNA包括2′-O，4′-C-亚乙基桥接的核酸(Morita等人.2001.Nucleic Acid Res Supplement No.1：241-242)。这些取代使核苷酸类似物或等同物对RNase H和核酸酶具有抗性，并增加了对靶RNA的亲和力。
在另一实施方式中，本发明的核苷酸类似物或等同物包括一个或多个碱基修饰或取代。修饰的碱基包括合成的和天然的碱基，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤和其他的嘧啶和嘌呤碱基的-氮杂、去氮、-羟基、-卤代、-硫代、硫醇、-烷基、-烯基、-炔基、硫代烷基衍生物，这些修饰的碱基是本领域已知的或将要已知的。
技术人员应理解，AON中的全部位置不必一致地进行修饰。另外，可以在单个AON中或者甚至在AON内的单个位置处并入多于一个的上述类似物或等同物。在某些实施方式中，本发明的AON具有至少两种不同类型的类似物或等同物。根据本发明的优选的外显子跳读AON包括2′-O烷基硫代磷酸酯反义寡核苷酸，例如2′-O-甲基修饰的核糖(RNA)、2′-O-乙基修饰的核糖、2′-O-丙基修饰的核糖和/或这些修饰的取代衍生物例如卤代衍生物。根据本发明的有效的AON包括具有(优选完整的)硫代磷酸酯主链的2′-O-甲基核糖。
技术人员还将理解，可以将不同的AON组合，以有效地阻断ABCA4前体-mRNA中外显子39和40的跳读。在优选的实施方式中，在本发明的方法中使用至少两种AON的组合，例如2、3、4或5种不同的AON。因此，本发明还涉及包括至少一种根据本发明的AON的一组AON。
如上所述，ABCA4基因的内含子38中存在有c.5461-10T＞C突变诱导外显子39的跳读，并且常常是和外显子40的共跳读。因此，优选地，使用有效阻止外显子39跳读、同时保留外显子40的AON。
AON可以与增强细胞、优选为视网膜细胞中的AON摄取的部分连接。这种部分的例子是胆固醇、碳水化合物、维生素、生物素、脂质、磷脂、可穿透细胞的肽，其包括但不限于触足肽(antennapedia)、TAT、transportan，和带正电荷的氨基酸，例如寡聚精氨酸、聚精氨酸、寡聚赖氨酸或聚赖氨酸，抗原结合结构域，例如由抗体提供的结合结构域、抗体的Fab片段或单链抗原结合结构域，例如骆驼状(cameloid)单结构域抗原结合结构域。
根据本发明的AON可以使用本领域已知的合适方法间接施用。例如，可以以表达载体的形式将其提供给个体或所述个体的细胞、组织或器官，其中表达载体编码包括所述寡核苷酸的转录物。优选将表达载体经由基因递送载体引入细胞、组织、器官或个体。在优选的实施方式中，提供了基于病毒的表达载体，该表达载体包括驱动如本文所识别的AON的表达或转录的表达盒或转录盒。因此，本发明提供了当置于有利于AON表达的条件下时表达根据本发明的AON的病毒载体。表达可以通过例如U7启动子的聚合酶II-启动子(Pol II)或例如U6RNA启动子的聚合酶III(Pol III)启动子驱动。优选的递送载体是病毒载体例如腺相关病毒载体(AAV)，或者逆转录病毒载体例如慢病毒载体等。另外，质粒、人工染色体、可用于细胞的人基因组中的靶向同源重组和整合的质粒可以适用于递送如本文定义的寡核苷酸。对于本发明而言优选其中那些由Pol III启动子驱动的载体和/或其中转录物的形式为与U1或U7转录物的融合物的载体，上述载体对于递送小的转录物产生良好的结果。设计合适的转录物在技术人员的能力范围内。优选Pol III驱动的转录物，优选形式为与U1或U7转录物的融合物的转录物。这些融合物可以如文中所述(Gorman等人.1998.Stablealteration of pre-mRNA splicing patterns by modified U7 small nuclearRNAs.Proc Natl Acad Sci U S A 95(9)：4929-34；Suter等人.1999.Double-targetantisense U7 snRNAs promote efficient skipping of an aberrant exon in threehuman beta-thalassemic mutations.Hum Mol Genet 8(13)：2415-23)。
本发明的AON可以原样(裸(naked))递送。但是，本发明的AON也可以由病毒载体编码。通常，这是RNA转录物的形式，该转录物在转录物的一部分中包括根据本发明的寡核苷酸的序列。根据本发明的AAV载体是重组AAV载体，是指包括AAV基因组的一部分的AAV载体，上述AAV基因组包括在源自AAV血清型的衣壳蛋白的蛋白壳(protein shell)中衣壳化(encapsidated)的根据本发明的编码的AON，如本文别处所述。AAV基因组的一部分可以含有源自腺相关病毒血清型的末端反向重复序列(ITR)，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9等。由衣壳蛋白组成的蛋白壳可以源自AAV血清型，例如AAV1、2、3、4、5、8、9等。蛋白壳也可以被称为衣壳蛋白壳。AAV载体可以有一个或优选所有的野生型AAV基因缺失，但仍可以包括功能性ITR核酸序列。功能性ITR序列对于AAV病毒体的复制、挽救和包装是必需的。ITR序列可以是野生型序列，或者与野生型序列的序列同一性为可以至少80％、85％、90％、95％或100％，或者可以通过例如核苷酸的插入、突变、缺失或取代改变，只要它们保持功能。在本文中，功能性是指将基因组包装到衣壳中、然后允许在要感染的宿主细胞或靶细胞中进行表达的能力。在本发明的上下文中，衣壳蛋白壳可以具有与AAV载体基因组ITR不同的血清型。因此，根据本发明的AAV载体可以由衣壳蛋白壳即二十面体衣壳组成，其包括一种AAV血清型例如AAV血清型2的衣壳蛋白(VP1、VP2和/或VP3)，而该AAV5载体中含有的ITR序列可以是上述的任何AAV血清型，包括AAV2载体。因此，“AAV2载体”包含AAV血清型2的衣壳蛋白壳，而例如“AAV5载体”包含AAV血清型5的衣壳蛋白壳，其中任一个都可以将根据本发明的任何AAV载体基因组ITR衣壳化。优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2、5、8或AAV血清型9的衣壳蛋白壳，其中所述AAV载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型2、5、8或AAV血清型9；这样的AAV载体被称为AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9、AAV5/2、AAV5/5、AAV5/8、AAV5/9、AAV8/2、AAV8/5、AAV8/8、AAV8/9、AAV9/2、AAV9/5、AAV9/8或AAV9/9载体。
更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型5；这样的载体被称作AAV 2/5载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型8；这样的载体被称作AAV 2/8载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型9；这样的载体被称作AAV 2/9载体。更优选地，根据本发明的重组AAV载体包括AAV血清型2的衣壳蛋白壳，并且所述载体中存在的AAV基因组或ITR源自AAV血清型2；这种载体被称作AAV 2/2载体。优选地将根据本发明的编码外显子39保留AON(或外显子39/外显子40保留AON)的核酸分子(由选择的核酸序列代表)插入上述AAV基因组或ITR序列之间，例如包括与编码序列和3′终止序列可操作连接的表达调节元件的表达构建体。“AAV辅助功能”通常是指提供给运输中的AAV载体的复制和包装所要求的相应AAV功能。AAV辅助功能补充了AAV载体中缺少的AAV功能，但它们缺少AAV ITR(由AAV载体基因组提供)。AAV辅助功能包括AAV的两个主要ORF，即rep编码区和cap编码区或其功能上基本相同的序列。Rep和Cap区是本领域公知的。AAV辅助功能可以在AAV辅助构建体上，该构建体可以是质粒。
例如，将辅助构建体引入宿主细胞中可以通过在引入AAV载体中存在的AAV基因组之前或同时通过转化、转染或转导而实现，如本文所述。因此，可以选择本发明的AAV辅助构建体，使得它们一方面产生用于AAV载体的衣壳蛋白壳的所需的血清型组合，另一方面产生在所述AAV载体复制和包装中存在的AAV基因组的所需的血清型组合。“AAV辅助病毒”提供AAV复制和包装所需的额外的功能。
合适的AAV辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(例如HSV 1型和2型)和牛痘病毒。辅助病毒提供的额外功能也可以经由载体引入宿主细胞，如美国专利6,531,456中所述在此将其并入作为参考。优选地，根据本发明的重组AAV载体中存在的AAV基因组不包括任何编码病毒蛋白质的核苷酸序列，例如AAV的rep(复制)或cap(衣壳)基因。AAV基因组还可以包括标志物或报告基因，例如，如编码抗生素抗性基因、荧光蛋白(例如gfp)的基因或者编码本领域已知的在化学上、酶促或以其他方式可检测和/或可选择的产物的基因(例如lacZ、aph等)。优选地，根据本文实施例中的方法构建和产生根据本发明的AAV载体。根据本发明优选的AAV载体是表达根据本发明的AON的AAV载体，优选AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9或AAV2/2载体，所述AON包括与以下序列互补或基本上互补的序列，或者优选地由其组成：人ABCA4前体-mRNA的内含子38、外显子39、内含子39、外显子40或内含子40；或者与人ABCA4前体-mRNA的内含子38/外显子39、外显子39/内显子39、内含子39/外显子40或外显子40/内含子40的边界重叠的序列。根据本发明进一步优选的AAV载体是表达根据本发明的包括SEQID NO：1-37中任一个或优选由其组成的AON的AAV载体，优选为AAV 2/5、AAV 2/8、AAV 2/9或AAV 2/2载体。
考虑到迄今已取得的进展，预期为个体或所述个体的细胞、组织、器官提供根据本发明的AON的方式将有改进。当然，可并入这些未来的改进，以使用本发明的方法实现对于重构(restructuring)mRNA的效果。根据本发明的AON可以原样递送至个体、所述个体的细胞、组织或器官。当施用根据本发明的AON时，优选将AON溶解在与递送方法相适应的溶液中。通过在水溶液中提供质粒，可以为视网膜细胞提供用于AON表达的质粒。另外可选地，用于AON或AON表达质粒的递送方法是病毒载体或纳米颗粒。优选地，病毒载体或纳米颗粒被递送至视网膜细胞。这种递送至视网膜细胞或其他相关细胞可以是体内、体外或离体的。可以用于体内AON递送的纳米颗粒和微粒是本领域公知的。另外可选地，质粒可以通过使用已知的转染试剂进行转染来提供。对于静脉内、皮下、肌内、鞘内和/或心室内(intraventricular)给药，优选地，溶液是生理盐溶液。在本发明中特别优选地，使用赋形剂或转染试剂，其将有助于将本文中定义的每种成分递送至细胞和/或细胞内(优选视网膜细胞)。优选的赋形剂或转染试剂能够形成复合物、纳米颗粒、胶束、囊泡和/或脂质体，其将复合或捕获在囊泡或脂质体中的本文定义的每种成分通过细胞膜递送。这些赋形剂中有许多是本领域已知的。合适的赋形剂或转染试剂包括聚乙烯亚胺(PEI；ExGen500(MBIFermentas))、LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)或其衍生物或类似的阳离子聚合物，包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(PECs)及其衍生物，合成的两亲分子(amphiphils)(SAINT-18)、lipofectinTM、DOTAP和/或病毒衣壳蛋白，其能够自组装成可以将本文定义的每种成分递送至细胞、优选视网膜细胞的颗粒。这些赋形剂已经显示将AON有效地递送至许多种培养的细胞，包括视网膜细胞。就整体细胞存活而言，它们的高转染潜能与预期的中低毒性结合。结构修饰的简易性可以用于允许进一步的修饰以及对其进一步的(体内)核酸转移特性和毒性的分析。Lipofectin试剂代表了脂质体转染试剂的实例。它由两个脂质组分组成：阳离子脂质N-[1-(2，3二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)(cp.DOTAP是甲基硫酸盐)和中性脂质二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。中性组分介导细胞内释放。另一组递送系统是聚合纳米颗粒。可以将公知的作为DNA转染试剂的聚阳离子例如二乙基氨基乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖(dextran)与氰基丙烯酸丁酯(PBCA)和氰基丙烯酸己酯(PHCA)组合，配制可以将AON跨细胞膜递送至细胞中的阳离子纳米颗粒。除这些常见的纳米颗粒材料以外，阳离子肽鱼精蛋白还提供了另外可选的与胶体一起配制寡核苷酸的方法。该胶体纳米颗粒系统可以形成所谓的proticle，其可以通过简单的自组装过程制备，以包装和介导AON的细胞内释放。技术人员可以选择和改编任何以上或其他的另外可选的市售赋形剂和递送系统，以包装和递送用于本发明的AON，将其递送，用于预防、治疗或延缓ABCA4-变体相关的疾病或病状。“预防、治疗或延缓ABCA4-变体相关的疾病或病状”在本文中优选地定义为预防、停止、中断由ABCA4基因遗传缺陷引起的部分或全部视力障碍或失明，或逆转其发展。
此外，根据本发明的AON可以与靶向配体共价或非共价连接，该靶向配体特别地设计成有利于摄取到细胞、细胞质和/或其核中。这样的配体可以包括(i)识别有利于细胞摄取的细胞、组织或器官特异性元件的化合物(包括但不限于肽(样)结构)和/或(ii)能够有利于摄取到细胞中和/或寡核苷酸从囊泡例如胞内体(endosomes)或溶酶体的细胞内释放的化合物。因此，在优选的实施方式中，将根据本发明的AON配制成组合物或药物或组合物，其至少具有用于递送至细胞和/或增强其细胞内递送的赋形剂和/或靶向配体和/或其递送装置。
应该理解的是，如果组合物包括额外的成分，例如本文稍后定义的辅助(adjunct)化合物，则该组合物的各个成分可以不配制在一个单一的组合、组合物或制剂中。取决于他们的身份，技术人员将知晓哪种制剂类型最适合本文定义的每种成分。在优选的实施方式中，本发明提供多个部分的试剂盒形式的组合物或制剂，其包括根据本发明的AON和本文稍后定义的另外的辅助化合物。如果需要，可以通过添加药学上可接受的载体，将根据本发明的AON或者表达根据本发明的AON的载体、优选病毒载体掺入药物活性混合物中。因此，本发明还提供了一种组合物，优选药物组合物，其包括根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体，和药学上可接受的赋形剂。这样的药物组合物可以包括任何药学上可接受的赋形剂，包括载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂。这样的药学上可接受的载体、填充剂、防腐剂、佐剂、增溶剂和/或稀释剂可以例如见于Remington(Remington.2000.The Scienceand Practice of Pharmacy，20th Edition.Baltimore，MD：Lippincott WilliamsWilkins)。所述组合物的每个特征已在本文前面定义。
优选的给药途径是通过玻璃体内注射用于眼内给药的水溶液或专门适应的制剂。EP 2425814公开了一种水包油乳剂，其专门适合于肽或核酸药物的眼内(玻璃体内)施用。该乳剂的密度低于玻璃体液的密度，因此该乳剂漂浮在玻璃体的顶部，避免注入的药物损害视力。
如果使用根据本发明的多种不同的AON，则本文定义的浓度或剂量可以指所使用的所有AON的总浓度或剂量或者所使用或添加的每种AON的浓度或剂量。因此，在一实施方式中，提供一种组合物，其中使用的根据本发明的AON各自的量或总量的剂量在0.01-20mg/kg、优选0.05-20mg/kg的范围内。合适的玻璃体内剂量可以为每眼0.05mg至5mg，优选0.1mg至1mg，例如，大约每眼0.1，0.2，0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg。
根据本发明优选的AON用于治疗个体的与ABCA4-变体有关的疾病或病状。优选地，所述ABCA4变体是c.5461-10T＞C变体，但也不能排除其他ABCA4突变也可以引起外显子39或外显子39/40的跳读，其因此也可以被本发明的AON阻断。因此，尽管本发明的AON优选用于由已知的c.5461-10T＞C突变引起的斯达加特氏病，但是它也可以用于任何由ABCA4前体-mRNA的外显子39或外显子39/40的跳读引起的疾病，该跳读导致(功能性)ABCA4蛋白质的减少。现已阐明该特定的突变引起剪接作用，但是鉴于ABCA4突变的范围很广，不能排除其他突变也引起相同的剪接改变，这些其他突变也可以通过本发明的AON来预防。因此，本发明涉及一种AON，其阻断或防止外显子39从ABCA4前体-mRNA的跳读，该跳读可以由ABCA4基因中的c.5461-10T＞C突变或另一(尚未知晓的)突变引起。
在本发明的所有实施方式中，术语“治疗”应理解为还包括预防和/或延缓与ABCA4-变体相关的疾病或病状。可以使用本发明的AON治疗的个体可能已经被诊断为患有与ABCA4-变体相关的疾病或病状。另外可选地，可以使用根据本发明的AON治疗的个体可以尚未诊断为患有与ABCA4-变体相关的疾病或病状例如斯达加特氏病，但是，考虑到他或她的遗传背景，可能是将来发展出该病或病状的风险增加的个体。优选的个体是人个体。在优选的实施方式中，与ABCA4-变体相关疾病或病状是斯达加特氏病。因此，本发明进一步提供根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物，其用作用于治疗需要调节ABCA4的剪接的与ABCA4-变体相关的疾病或病状的药物，并用作用于预防、治疗或延缓与ABCA4-变体相关的疾病或病状的药物。所述用途的每个特征已在本文前面定义。
本发明进一步提供根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物在治疗需要调节ABCA4前体-mRNA的剪接的与ABCA4-变体相关的疾病或病状中的用途。在优选的实施方式中，并且对于本发明的所有方面，与ABCA4-变体相关的病症、疾病或病状由人ABCA4基因的外显子38中的c.5461-10T＞C突变引起。
本发明进一步提供根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物用于制备药物的用途，用于制备用于治疗需要调节ABCA4前体-mRNA的剪接的与ABCA4变体相关的疾病或病状的药物，并且用于制备用于预防、治疗或延缓与ABCA4-变体相关的疾病和病状的药物。因此，在另一方面，提供了本文定义的AON、病毒载体或组合物用于制备药物的用途，用于制备用于治疗需要调节ABCA4前体-mRNA的剪接的病状的药物，并且用于制备用于预防、治疗或延缓与ABCA4-变体相关的疾病或病状的药物。
根据本发明的用途或方法中的治疗是至少一次，持续一周、一个月、数月，1、2、3、4、5、6年或更久，例如终身。根据本发明使用的如本文所定义的每个AON或其等同物可以适合于直接施用于已经感染与ABCA4-变体相关的疾病或病状或处于发展上述疾病或病状的风险中的个体的体内细胞、组织和/或器官，也可以间接地体内、离体或体外施用。本发明的AON、组合物、化合物或辅助化合物的施用频率可以取决于若干参数，例如疾病的严重程度、患者的年龄、患者的突变、AON的数量(即剂量)、上述AON的配方、给药途径等。频率可以在每天、每周、两周或三周或四周或五周或更长时间至少一次之间变化。根据本发明的AON的剂量范围优选地基于存在严格方案要求的临床试验(体内使用)中的剂量增加研究来设计。本文所定义的AON可以以范围0.01-20mg/kg、优选0.05-20mg/kg的剂量使用。合适的玻璃体内剂量可以是每眼0.05mg至5mg，优选0.1mg至1mg，例如约每眼0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg。在优选的实施方式中，使用本文定义的AON的浓度范围为0.1nM至1μM。优选地，该范围用于诸如视网膜细胞或视网膜组织的细胞模型中的体外使用。更优选地，所使用的浓度为1-400nM，再更优选10-200nM，再更优选50-100nM。如果使用数种AON，则该浓度或剂量可以指AON的总浓度或剂量，或者加入的各个AON的浓度或剂量。在优选的实施方式中，作为根据本发明的分子的递送载体的病毒载体，优选如本文前面所述的AAV载体，以每次注射1×109至1×1017病毒颗粒、更优选每次注射1×1010至1×1012病毒颗粒的剂量给药。如上所述的AON的浓度或剂量范围是用于体内、体外或离体使用的优选的浓度或剂量。技术人员将会理解，取决于所用的AON、要治疗的靶细胞、基因靶标及其表达水平、所用的培养基以及转染和孵育条件，所用的AON的浓度或剂量可以进一步变化，并可能需要有待进一步优化。
根据本发明的AON或者根据本发明的病毒载体或者根据本发明使用的根据本发明的组合物，可以适用于施用于已经感染与ABCA4-变体相关的疾病或病状或处于发展上述疾病或病状的风险中的个体的体内细胞、组织和/或器官，可以体内、离体或体外施用。根据本发明的所述AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物，可以直接或间接地施用于已经感染疾病或病状或处于发展上述疾病或病状的风险中的个体的体内细胞、组织和/或器官，可以直接或间接地体内、离体或体外施用。由于斯达加特氏病在视网膜中具有明显的表型，因此优选细胞是视网膜细胞；进一步优选地，所述组织是视网膜和/或进一步优选地，所述器官是眼睛。
本发明进一步提供用于调节细胞中ABCA4前体-mRNA的剪接的方法，该方法包括使细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的AON(因此，阻断外显子39的跳读的AON)或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物接触。该方面的特征优选地是本文前面定义的那些。使细胞与根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物接触可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。包括了用于递送本文所述的AON、病毒载体和组合物的方法的用途。接触可以是直接的或间接的，并且可以是体内的、离体的或体外的。
本发明进一步提供用于治疗需要调节对其有需求的个体的ABCA4前体-mRNA的剪接的与ABCA4-变体相关的疾病或病症的方法，所述方法包括使所述个体的细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物接触，以防止或阻断外显子39从所述前体-mRNA的剪接。该方面的特征优选地如本文前面所定义。使细胞、优选视网膜细胞与根据本发明的AON或根据本发明的病毒载体或根据本发明的组合物接触，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。包括了用于递送本文所述的AON、病毒载体和组合物的方法的用途。接触可以是直接的或间接的，并且可以是体内的、离体的或体外的。除非另外指出，否则本文描述的各个实施方式均可以与本文描述的另一实施方式组合。
本文所提供的序列信息不应狭义地解释成要求包括错误识别的碱基。技术人员能够鉴别出这种错误识别的碱基，并且知道如何纠正这些错误。本说明书中引用的所有专利和文献参考文献在此均全文并入作为引证。
实施例
实施例1.用于阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读的反义寡核苷酸(AON)的生成和测试
设计靶向外显子或内含子剪接位点(ESS和ISS)的反义寡核苷酸，测试其阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读的能力，上述剪接位点存在于人ABCA4前体-mRNA的外显子38和外显子39之间的内含子38中，外显子39中，和外显子39和外显子40之间的内含子39中，以及内含子和外显子的边界处。目的在于设计的AON长度不要太长(出于制造目的，出于给药效率，并且限制自退火)，含有至多一个CpG基序，并且不含有太高的鸟苷百分比。所有最初设计的AON提供于表1。所有AON的长度在20-25个核苷酸的范围内，并且所有AON是完全2′-O-甲基修饰的。所有核苷间键都是硫代磷酸酯键。制备后，将AON在水中重构至最终浓度为100μM。
微基因的构建
将人成视网膜细胞瘤WERI-Rb-1(
Figure BPA0000281774210000262
HTB-169TM)细胞在具有10％胎牛血清(Biowest；Cat No.S181)和1％青霉素/链霉素(Sigma-Aldrich，P4333-100ML)的RPMI-1640培养基(Thermo Scientific；11875-085)中生长。为了分离DNA，收集一T75烧瓶的WERI-Rb-1细胞，并以300×g离心5分钟，收集细胞沉淀。根据制造商的说明，使用DNeasy血液和组织(Blood&Tissue)试剂盒提取DNA。将DNA用试剂盒提供的200μl Buffer AE洗脱。为了增加收率，使洗脱液两次通过同一柱。使用Nanodrop 2000分光光度计(Nanodrop Technology)测量DNA浓度，并将样品存储在-20℃下以便进一步使用。
表1.反义寡核苷酸序列
Figure BPA0000281774210000261
Figure BPA0000281774210000271
为了产生分别在5′和3′端含有SalI和NotI限制性位点的野生型插入物(WT)，使用300ng WERI-Rb-1 DNA作为模板，使用以下引物组，使用
Figure BPA0000281774210000272
高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific；Cat No.F530L)进行靶序列的扩增：
MG1 WT(Sangermano等人.2016)：
MG1-F 5’-AAAAAAGTCGACGTGTTAACAAATGCCTTGAGG-3’(SEQ ID NO：51)
MG1-R 5’-AAAAAAGCGGCCGCAGCTCACCCCACAGACCT-3’(SEQ ID NO：52)
MG2 WT(Sangermano等人.2016)：
MG2-F 5’-AAAAAAGTCGACCCTTGAGGCACTGCTTGTAA-3’(SEQ ID NO：38)
MG2-R 5’-AAAAAAGCGGCCGCCTGCCACAGTCTGATGCAG-3’(SEQ ID NO：39)
MG3 WT(如本文公开，仅外显子39)：
MG3-F 5’-AAAAAAGTCGACAAATCCCTCCAGTGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：53)
MG3-R 5’-AAAAAAGCGGCCGCCCTAATCCTCTCCAGCTGG-3’(SEQ ID NO：54)
MG4 WT(如本文公开，仅外显子39和外显子40)：
MG4-F 5’-AAAAAAGTCGACAAATCCCTCCAGTGGCCAGT-3’(SEQ ID NO：53)
MG4-R 5’-AAAAAAGCGGCCGCATATCAGCAATTGAAATT-3’(SEQ ID NO：55)
MG3插入物在内含子38中的位置-150处开始，在内含子39中的+152处结束，而MG4插入物在内含子38中的位置-150处开始(与MG3相同)，在内含子40中的位置+246处结束。根据制造商的方案，使用NucleoSpin Gel and PGR清洁试剂盒(Machery-Nagel；CatNo.740609.250)对得到的PCR产品进行凝胶纯化。具有不同长度的侧翼内含子的突变体插入物从Integrated DNA Technologies订购，作为分别在5′和3′端含有SalI和NotI限制性位点的gBlocks。
DNA插入物(如上所述的野生型和突变体gBlock片段)和宿主载体pET01 Exontrap载体(MoBiTec GmbH；Cat No.K2010)通过SalI和NotI消化，并使用本领域已知的常规方法独立地连接在一起。使用以下引物通过PCR检查载体中插入物的存在：外显子1正向：5′-CCAGGCTTTTGTCAACAGCA-3′(SEQ ID NO：40)和外显子2反向：5′-ATTGCAGAGGGGTGGACAG-3′(SEQ ID ID：41)。所得的构建体带有内含子38的一部分(具有和不具有突变)和整个外显子39，以及内含子39的一部分(MG1、MG2和MG3)，在图4(上图)中示意性地示出。
使用类似的方法在单个载体中获得包括内含子38的一部分(具有和不具有突变)、整个外显子39、整个内含子39、整个外显子40和内含子40的一部分的构建体，以研究使用本发明的AON的对外显子39/外显子40双重跳读的阻断。含有外显子39和外显子40连同外显子39上游的内含子38中的突变位置的构建体(MG4)在图4(下图)示出。
细胞培养、转染、RNA分离和cDNA合成
在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中培养HeLa细胞。将细胞以2×105细胞/孔接种到24孔板上。为进行连续转染，接种次日，使用Lipofectamin 2000(ThermoScientific，11668019)在补充有10％FBS的1ml DMEM中用200-500ng质粒转染细胞，并孵育6h，然后更新培养基。24小时后，将细胞在500μl培养基中用100-250nM AON转染。在AON转染后24小时，分离RNA。为了进行双重转染，接种次日，使用Lipofectamin 3000(ThermoScientific，L3000015)，将细胞在具有10％FBS的500μL DMEM中用200-500ng质粒+250nMAON共转染。孵育6小时后，更新培养基。24-48小时后分离RNA。为此，将细胞用PBS洗涤并用350μl RLT缓冲液(Qiagen，RNeasy Plus Mini kit，#74136)裂解。根据制造商的说明，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，#74136)分离RNA。使用试剂盒随附的gDNA Eliminator柱去除基因组DNA。将RNA在30μl无RNA酶的水中洗脱。为了增加收率，使洗脱液两次通过同一柱。使用Nanodrop 2000分光光度计(Nanodrop Technology)测量RNA浓度，并将样品存储在-80℃下以便进一步使用。对于cDNA合成，使用1000ng RNA作为具有六聚体随机引物的Maxima逆转录酶(Thermo Scientific；EP0742)的模板，并根据制造商的说明进行处理。包括非RT样品(不含酶)作为对照，并与其他样品一起进行分析。
PCR、生物分析仪和ddPCR
原则上，ABCA4 mRNA的片段(当其仍含有外显子39时)在一个或两个PCR引物在该外显子内时，可以使用PCR进行特异性扩增。为了考察外显子39是否仍存在于mRNA中，生成100ng cDNA，并将其用作模板，进行靶序列的扩增。这使用以下引物完成：外显子39正向：5′-CTGCTCATTGTCTTCCCCCA-3′(SEQ ID NO：42)，外显子39反向：5′-CAAACCGGGCATAGACATCTG-3′(SEQ ID NO：43)。这两个引物均在外显子39序列中退火，这使得含有外显子39的背景mRNA(在HeLa细胞中)将被共同扩增。使用
Figure BPA0000281774210000301
高保真DNA聚合酶(Thermo Scientific；Cat No.F530L)进行PCR反应。使用Bioanalyzer 2100软件，使用Bioanalyzer 2100(DNA 1000试剂盒，Agilent Technologies)对PCR片段进行分析。
对于ddPCR分析，使用QX200TM Droplet DigitalTM PCR系统(Bio-Rad)对样品进行分析。生成定制的检验(IDT，Integrated DNA Technologies)，其由扩增质粒外显子1和2的引物和靶向ABCA4外显子39和质粒外显子1的2个探针组成。根据制造商的方案(Bio-Rad，QX200系统)进行实验设置和分析。
结果
图6显示了将HeLa细胞在具有和没有不同AON的情况下用携带c.5461-10T＞C突变的MG3构建体(+MG3mut.)或MG3野生型构建体(+MG3WT)转染后、在生物分析仪上的RT-PCR结果。最初测试了SEQ ID NO：1-16的16种AON(参见图2和表1)。RT-PCR通过在外显子39序列内退火的引物进行，这使得下图中标有“HeLa(NT)”的泳道(未转染的HeLa细胞)也显示出预期水平的条带。这是由于以下事实：HeLa细胞携带野生型ABCA4基因，由其显然产生了mRNA，然后由其还产生了阳性PCR产物。阴性对照(“ctrAON”)是具有突变和不相关的非-ABCA4退火AON的MG3构建体的转染物。另一阴性对照是“Mock tr”泳道，其代表仅用转染试剂而不用构建体或AON转染的细胞。“Rt-ctr”和“H2O”是PCR反应的另外两个阴性对照，无细胞物质，不显示信号。
产物条带强度的增加表明了含有外显子39的mRNA拷贝的增加。因为评估应基于HeLa细胞中已经产生的作为背景(实际上是相对于其中没有转染AON的WT信号)来进行，因此将以“WT-无AON”表示的泳道作为100％，并应用生物分析软件测量其他条带与该100％强度相比的强度。这表明该信号的大约1/3(29％)至少归因于单独的背景HeLa信号，但是由于它是PCR反应，并非是指示表达水平差异的最终的最佳度量。数据表明，使用该设定，具有或不具有AON的转染本身能够使AON无关的信号增强到70％左右。但是，用AON1、AON3、AON4、AON5、AON6、AON12、AON13和AON14检测到的强度增加到至少80％，其中AON3、AON4、AON6和AON12表现最好，强度为设定成100％的WT信号的至少90％。这表明这些AON能够将外显子39从MG3突变构建体(其携带c.5461-10T＞C突变)的跳读阻断至接近其中外显子39不跳读的野生型的水平。
实施例2.使用ddPCR分析在HEK293细胞中进行AON用于阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读的其他测试
使用定量和同种型特异性ddPCR检验在HEK293细胞中进一步评价实施例1中描述和最初测试的反义寡核苷酸。简而言之，将含有c.5461-10T＞C突变的ABCA4外显子39微基因(MG3)在HEK293细胞中瞬时表达，并用不同的AON处理。未经AON处理(模拟)的样品用作参考对照。ddPCR检验用于对AON阻断外显子39从人ABCA4前体-mRNA跳读的能力进行定量。
细胞培养条件、转染、RNA分离
在实施例1中描述了MG3。HEK293细胞在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的DMEM中培养。将细胞以0.2×106细胞/孔的密度接种到12孔板上。每个治疗条件使用两个样本(重复样本)。对于双重转染，在接种次日，使用LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)，以1∶2的w/v比，在补充有10％FBS的1mL DMEM中，用75ng MG3质粒和250nm AON转染细胞。转染后24小时，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen，#74136)根据制造商的说明分离RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Nanodrop Technology)测量RNA浓度，并将样品存储在-80℃下以便进一步使用。
ddPCR定量
根据供应商关于QX200系统(Bio-Rad)的方案，使用一步式RT-ddPCR探针高级试剂盒(Bio-Rad)进行ddPCR。检验含有各900nM的正向和反向引物和250nM标记探针。对于AON7、8、9、10、11、26、27、28和29，使用5′-AGCTCTCTACCTGGTGTGT-3′(SEQ ID NO：56)作为正向引物和5′-AACCTGAGCAGCGTCTTG-3′(SEQ ID NO：57)作为反向引物以及5′-TTCTTCTACACACCCATGTCCCGC-3′(SEQ ID NO：58)作为探针，对外显子39的内含物(inclusion)进行评价。对于其余的AON，使用5′-GTCAACAGCACCTTTGTGGT-3′(SEQ ID NO：59)作为正向引物、5′-TGTGCCACCCAAACCGGG-3′(SEQ ID NO：60)作为反向引物以及5′-GGTCAATGAGGCCCCGGCCCAGGCA-3′(SEQ ID NO：61)作为探针，对外显子39的内含物进行评价。使用5′-GTCAACAGCACCTTTGTGGT-3′(SEQ ID NO：62)作为正向引物、5′-CAAGGTCTGAAGGTCACGGG-3′(SEQ ID NO：63)作为反向引物以及5′-AGGACCCACAAGGTGGCACAA-3′(SEQ ID NO：64)作为探针，对外显子39的排除物(exclusion)进行评价。使用以下公式计算外显子39内含物的百分比：(外显子39内含物*100)/(外显子39内含物+外显子39排除物)。
结果
图7显示用携带c.5461-10T＞C突变的MG3构建体和AON转染的HEK293细胞中外显子39内含物的百分比的ddPCR定量结果。AON在不同的日期分批评价，因此每个实验均以匹配的非AON处理(模拟)对照描述结果。数据显示为平均值±标准偏差。在未经处理的“模拟”条件下，大约10％的转录物中观察到外显子39内含物。与模拟相比，许多AON能够增加具有外显子39内含物的转录物的百分比。如从图7A中可以观察到，AON31表现出出最高的内含物百分比(即62％)，其次是AON32、AON12和AON 1，其分别表现出49％、43％和41％的百分比。AON17、AON20和AON35也导致外显子内含物的增加，尽管程度较低。
重要的是，AON12、AON31和AON32与ABCA4前体-mRNA的内含子39中的重叠区域结合，表明存在具有以下序列的热点：5′-UGGUAGCCGAGGCCCAUGGAGCAUGGGCCCUGGG-3′(SEQ IDNO：65)。AON1和AON17也与重叠区域结合，表明内含子38中存在热点(5′-UUGCCCUGUGCUGUCCUGUGAGAGCAUCUGG-3′(SEQ ID NO：66))。两个热点在图2中用斜体表示。
实施例3.使用另外可选的(MG3_2)微基因构建体测试AON阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读
如实施例1和实施例2所示描述和测试的多种AON使用新的微基因构建体进行进一步评价。简而言之，将新的含有c.5461-10T＞C突变的ABCA4外显子39微基因(本文称作MG3_2)在HEK293细胞中瞬时表达，并用不同的AON处理。未经AON处理(模拟)的样品用作参考对照。另外，使用与ABCA4前体-mRNA不互补的扰码(scrambled)AON作为对照。使用定量的同种型特异性ddPCR检验对AON阻断外显子39从人ABCA4前体-mRNA跳读的能力进行定量。
微基因MG3_2的构建
化学合成包括ABCA4外显子39序列及其侧翼内含子区域(包括c.5461-10T＞C突变)的DNA插入物，作为分别在5′和3′端带有EcoR1和SalI位点的gBlock(Integrated DNATechnologies)，并将其插入pCI-neo-哺乳动物剪接载体(描述于WO 2016/005514；WO2017/186739中)，使所有序列(除人ABCA4内含子38-外显子39-内含子39序列以外)保持完整。图8显示MG3_2构建体的序列以及ABCA4序列在其中的位置。
细胞培养、转染、RNA分离
如实施例2所述培养HEK293细胞并接种。为进行连续转染，接种次日，使用DNA∶PEI比例为1∶3 w/w的maxPEI(Polysciences)将细胞在补充有10％FBS的1mL DMEM中用50ng质粒转染。24小时后，使用LipofectAMINETM 2000(Invitrogen)(1∶2w/v比例)将细胞以在1mL培养基中用250nM AON转染。AON转染后24小时，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书分离RNA。使用Nanodrop 2000分光光度计(Nanodrop Technology)测量RNA浓度，并将样品存储在-80℃下以便进一步使用。
ddPCR定量
如实施例2所述进行ddPCR。使用5′-TACATGTTCGTGGTCCACTTC-3′(SEQ ID NO：70)作为正向引物、5′-GAAGACAATGAGCAGCTICCT-3′(SEQ ID NO：71)作为反向引物以及5′-AACGCTGCTCAGGTTCAACGC-3′(SEQ ID NO：72)作为探针，对外显子39内含物进行评价。使用SEQ ID NO：70的引物作为正向引物、5′-GCAGATGGTGGTGAGCAT-3′(SEQ ID NO：73)作为反向引物以及5′-ACCGTCAAGGAGTTCCGGAACTG-3′(SEQ ID NO：74)作为探针，对外显子39的排斥体进行评价。如实施例2中计算外显子39内含物的百分比。
结果
图9A显示MG3_2微基因构建体的示意图。最初，HEK293细胞用单独的质粒转染，使用来自RHO外显子3和5区域的引物对RNA进行PCR扩增。PCR产物在生物分析仪上进行分析(图9B)。由于c.5461-10T＞C突变，大多数转录物缺少外显子39(下部的条带)，并且以低得多的水平观察到外显子39内含物(上部的条带)。
用携带c.5461-10T＞C突变的MG3_2构建体和AON转染的HEK293细胞中外显子39内含物的百分比的ddPCR定量显示于图9C。数据显示为平均值±标准偏差。扰码对照(称为Scr.Cont.)是指用MG3_2构建体和不相关的非互补AON转染。“模拟”是指没有AON处理(阴性对照)。在模拟条件下，在11％的转录物中观察到外显子39内含物。许多AON能够增加该背景百分比。AON32给出了最高的外显子39内含物的含量(49％)，与实施例2中讨论的结果一致。再一次，AON32与AON31和AON12重叠，这也增加了外显子39内含物的含量。这证实了序列SEQID NO：65确实代着用于AON退火和诱导外显子39保留的热点。在实施例2中导致外显子39内含物增加的AON 1和AON17在本研究中也显示出积极作用，这证实了序列SEQ ID NO：66也代表着AON退火和诱导外显子39保留的热点。其他表现出外显子39内含物增加的AON是AON 3、4、9、24、25和29。
实施例4.用于阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读的具有2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)修饰的AON
为了进一步研究AON对外显子39内含物的影响，生成在每个核苷上都具有2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)修饰的AON1和AON32，并与每个核苷上都包括2′-OMe修饰的AON 1和AON32(如以上实施例中所使用)进行比较。对AON1-MOE和AON32-MOE阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读的能力进行评价，并将其与AON1和AON32进行比较。简言之，将含有c.5461-10T＞C突变的ABCA4外显子39微基因(MG3_2，参见实施例3)在HEK293细胞中瞬时表达并用不同的AON对其进行处理。使用未经AON处理的样品作为参考对照。使用定量的同种型特异性ddPCR检验对AON阻断从人ABCA4前体-mRNA的外显子39跳读的能力进行定量。如上所述培养HEK293细胞，接种，并在50ng质粒的情况下转染250nM AON。进行ddPCR，外显子内含物百分比的计算如实施例3中所述。结果示于图10中，表示成平均值±标准偏差。“模拟”是指没有AON处理(即阴性对照)。在未经处理的“模拟”条件下，在约14％的转录物中观察到外显子39内含物，其在用AON1和AON32(二者均具有2′-OMe修饰)处理之后显著增加，与实施例3中观察的相符。使用AON1 MOE，AON1效果(约24％的转录物保留外显子39)增加至约40％，表明当使用(最可能更加稳定的)2′-MOE修饰的寡核苷酸时，外显子39保留得以改善，并更加有效。对于AON32，也观察到类似的趋势。在AON32(2′-O-甲基化学)处理的样品中，约45％的转录物保留了外显子39，而在AON32 MOE(2′-O-甲氧基乙基化学)处理的样品中，约58％的转录物保留了外显子39。
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Claims (22)

1.一种反义寡核苷酸(AON)，其能够抑制人ABCA4前体-mRNA中至少一个外显子的跳读，其中外显子跳读由ABCA4基因中的突变引起。
2.根据权利要求1所述的AON，其中引起外显子跳读的突变是在内含子中。
3.根据权利要求2所述的AON，其中所述突变是人ABCA4基因的内含子38中的c.5461-10T＞C突变。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的AON，其中所述AON能够抑制外显子39的跳读和/或外显子39/外显子40的双重跳读。
5.一种AON，其包括与以下序列互补的核苷酸序列：SEQ ID NO：45、46、47、48、49、65或66或其部分的核苷酸序列；或者与人ABCA4前体-mRNA的内含子38/外显子39、外显子39/内含子39、内含子39/外显子40或外显子40/内含子40的边界重叠的序列。
6.根据权利要求5所述的AON，其中互补序列包括内含子38和外显子39之间的边界。
7.根据权利要求5或6所述的AON，其中互补序列包括人ABCA4基因的内含子38中的c.5461-10T＞C突变。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的AON，其中，所述AON包括与SEQ ID NO：44内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸互补的序列或由其组成。
9.根据权利要求8所述的AON，其中所述AON包括20、21、22、23、24或25个核苷酸，并且还包括至多一个CpG基序。
10.根据权利要求8所述的AON，其中所述AON包括与SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66内的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续核苷酸互补的序列或由其组成。
11.根据权利要求9或10所述的AON，其中所述AON包括SEQ ID NO：1、3、4、5、6、9、12、13、14、17、20、24、25、29、31和32中任意一个的序列或由其组成。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的AON，其中所述AON是包括至少一个2′-O烷基修饰的寡核糖核苷酸(RNA寡核苷酸)，例如2′-O-甲基(2′-OMe)修饰的糖。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的AON，其中所述AON是包括至少一个2′-甲氧基乙氧基(2′-MOE)修饰的寡核糖核苷酸(RNA寡核苷酸)。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的AON，其中所述AON具有至少一个硫代磷酸酯键，优选地，其中所有连续核苷酸通过硫代磷酸酯键相互连接。
15.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-14中任一项所述的AON和药学上可接受的载体，其中所述药物组合物用于玻璃体内给药。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中组合物的剂量在每眼0.05-5mg总AON的范围内，优选在每眼0.1-1mg总AON的范围内，例如，每眼约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0mg总AON。
17.一种病毒载体，其表达根据权利要求1-11中任一项所述的AON。
18.根据权利要求1-14中任一项所述的AON，根据权利要求15或16所述的药物组合物，或根据权利要求17所述的病毒载体，其用作药物。
19.根据权利要求1-14中任一项所述的AON，根据权利要求15或16所述的药物组合物，或根据权利要求17所述的病毒载体，其用于治疗、预防或延缓斯达加特氏病。
20.根据权利要求1-14中任一项所述的AON、根据权利要求15或16所述的药物组合物或根据权利要求17所述的病毒载体用于治疗、预防或延缓斯达加特氏病的用途。
21.一种用于调节细胞中ABCA4前体-mRNA的剪接的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1-14中任一项所述的AON、根据权利要求15或16所述的药物组合物或根据权利要求17所述的病毒载体接触。
22.一种用于治疗斯达加特氏病或病状的方法，其要求调节对其有需要的个体的ABCA4前体-mRNA的剪接，所述方法包括使所述个体的细胞与根据权利要求1-14中任一项所述的AON、根据权利要求15或16所述的药物组合物或根据权利要求17所述的病毒载体接触。
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