ES2646716T3 - Oligonucleótidos antisentido para el tratamiento de amaurosis congénita de Leber - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido antisentido de salto del exón que se enlaza y/o es complementario a un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID N.º: 8, en el que dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID N.º: 10, SEQ ID N.º: 11 y SEQ ID N.º: 12, y en el que un nucleótido en el oligonucleótido antisentido puede ser un residuo de RNA, un residuo de DNA, o un análogo de nucleótido o equivalente.

Description

Otigonucleótidos antisentido para el tratamiento de amaurosis congénita de Leber

5 CAMPO DE LA INVENCiÓN

[0001) La presente invención se refiere a los campos de la medicina y la inmunología. En particular, se refiere a oligonucleótidos antisentido nuevos que se pueden utilizar en el tratamiento, prevención yfo retraso de la amaurosis congénita de Leber.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

[0002) La amaurosis congénita de Leber (LCA) es la forma más severa de distrofia retinal hereditaria, con una aparición de síntomas de la enfermedad en los primeros años de vida (Leber, T., 1869) Y una prevalencia 15 estimada de aproximadamente 1 en 50 000 a nivel mundial (Koenekoop et al, 2007; Stone, 2007). Genéticamente, LCA es una enfermedad heterogénea, con quince genes identificados hasta la fecha donde las mutaciones son causantes de la LCA (den Hollander et al, 2008; Estrada-Cuzcano et al, 2011). El gen de la LCA más frecuentemente mutado es CEP290, contando con -15% de todos casos (Stone, 2007; den Hollander, 2008; den Hollander, 2006; Perraull et al, 2007). Se han proporcionado mutaciones severas en CEP290 para causar un espectro de enfermedades sistémicas que, además de distrofia retinal, se caracteriza por defectos cerebrales, malformaciones renales, polidactilia yfo obesidad (Baal et al, 2007; den Hollander et al, 2008; Helou et al, 2007; Valente et al, 2006). No hay correlación de genotipo-fenotipo bien definida entre la combinación de mutaciones de CEP290 y los fenotipos asociados, pero los pacientes con distrofia retinal de apa rición temprana y LCA muy a menudo llevan alelos hipomórficos (Stone, 2007; den

25 Hollander et al, 2006; Perrault et al, 2007; Coppieters et al, 2010; Liitink et al 2010). La mutación de CEP290 hipomórfica que ocurre con más frecuencia con diferencia, especialmente en países europeos y en los Estados Unidos, es un cambio en el íntrón 26 de CEP290 (c.2991+1655A>G) (Stone, 2007; den Hollander et al, 2006; Perraull et al, 2007; Liitink et al, 2010). Esta mutación crea un sitio donante de empalme críptico en el intrón 26 que resulta en la inclusión de un exón aberrante de 128 bp en el mRNA de CEP290 mutante, e inserta un codón de terminación prematuro (p.C998X) (véase figura 1A y 1B). Además el mRNA de CEP290 mutante, también el transcrito tipo salvaje que carece del exón aberrante sigue siendo producido, explicando la naturaleza hipomórfica de esta mutación (Estrada-Cuzcano et al , 2011 ). LCA, y otras distrofias retinales, durante mucho tiempo han sido consideradas enfermedades incurables. Sin embargo, las primeras pruebas clínicas de fase 1111 que usan terapia de aumento de genes han llevado a

35 resultados prometedores en un grupo seleccionado de pacientes adultos de LCNRP con mutaciones en el gen RPE65 (Bainbridge et al, 2008; Cideciyan et al, 2008; Hauswirth et al, 2008; Maguire et al, 2008). Inyecciones subretinales unilaterales de partículas de virus adeno-asociados que llevan constructos que codifican el cDNA de RPE65 de tipo salvaje demostraron ser seguras y moderadamente eficaces en algunos pacientes, sin causar ningún efecto adverso. En un estudio de seguimiento usando adultos y niños, las mejoras visuales fueron más prolongadas, especialmente en los niños que adquirieron todos visión ambulatoria (Maguire et al, 2009). Juntos, estos estudios han mostrado el potencial para tratar LCA, y así estimularon enormemente el desarrollo de estrategias terapéuticas para otros subtipos genéticos de distrofias retinales (den Hol1ander et al, 2010). Sin embargo, debido a la tremenda variedad de tamaño de los genes, y limitaciones técnicas de los vehículos que se utilizan para entregar constructos terapéuticos, la terapia de

45 aumento de genes no puede ser aplicable a todos los genes. El cDNA de RPE65 es por ejemplo solo 1.6 kb , mientras que el cDNA de CEP290 equivale a aproximadamente 7.4kb, así excediendo el tamaño de carga de muchos vectores disponibles, con los vectores adeno-asociados usados actualmente (AAV). Además, con el uso de terapia de sustitución de genes, resulta dificil controlar los niveles de expresión del gen terapéutico que para algunos genes necesitan ser bien regulados. Oligonucleótidos antisentido dirigidos contra una mutación intrónica en CEP290, constructos víricos que expresan tales otigonucleótidos, y un método de modulación del empalme de CEP290 usando dichos oligonucle6tidos o dichos constructos víricos fueron descritos (Collin et al. 3 Mayo 2011 . Antisense oligonucleotide (AON}-based therapy for CEP290-associated LCA. ARVO 2011 l. También, oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la mutación patógena más común situada en el intrón 26 del gen CEP290 (c.2991+1655 A>Gl y un método para modular el empalme de

55 CEP290 usando dichos ollgonucleótidos fueron descritos (Gerard et al. 31 agosto 2011. El salto del exón mediado por otigonucleótidos antisentido restaura el conjunto de cilios primarios en los fibroblastos que albergan la mutación c.2991+1655GA de CEP290de LCA común. ICHG2011). Es por lo tanto un objetivo de la presente invención proporcionar una estrategia terapéutica conveniente para la prevención, tratamiento o retraso de la amaurosis congénita de Leber como se provoca por una mutación intrón ica en CEP290.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

[0003) Sorprendentemente, se ha demostrado ahora que los oligonucleótidos antisentido específicos (AON) son capaces de bloquear el empalme aberrante de CEP290 provocado por la mutación de LCA intrÓnica. La 65 presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido de salto del exón que se enlaza yfo es complementario a un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos como se muestra en SEQ ID N.O: 8, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEO ID N.o: 10, SEO ID N.o: 11 y SEO ID N.o: 12, y donde un nucleótido en el oligonucleótido antisentido puede ser un residuo de RNA, un residuo de DNA, o un análogo de nucleótido o equivalente. En todas las formas de realización de la presente invención, los términos "modulación del empalme" y "salto de exones" 5 son sinónimos. Respecto a CEP290, "modulación del empalme" o "sallo de exones" se deben interpretar como la exclusión del exón de 128 nucleótidos aberrante (SEO ID N.o: 4) desde el mRNA de CEP290 (véase figura 1A y 19). El término salto del exón es aquí definido como la inducción dentro de una célula de un mRNA maduro que no contiene un exón particular Que estaría presente en el mRNA maduro sin sallo del exón. El salto del exón se consigue mediante una célula que expresa el pre-mRNA de dicho mRNA maduro con una molécula capaz de intelferir con secuencias tales como, por ejemplo, el donador de empalme (criptico) o secuencia de aceptor de empalme (críptico) requerido para permitir el proceso enzimálico del empalme, o con una molécula que es capaz de interferir con una señal de inclusión del exón requerida para el reconocimiento de una extensión de nucleótidos como un exón para incluirse en el mRNA maduro; tales moléculas son aquí referidas como moléculas de salto del exón El término pre-mRNA se refiere a un mRNA

15 precursor no procesado o procesado parcialmente que se sintetiza a partir de un molde de DNA en el núcleo de una célula por transcripción .

[0004) El término "oligonucleótido antisentido" se entiende para referirse a una secuencia de nucleótidos que es complementaria sustancialmente a una secuencia de nucleótidos objetivo en una molécula de pre-mRNA, hrRNA (RNA nuclear heterogéneo) o molécula de mRNA. El grado de complementariedad (o complementariedad sustancial) de la secuencia antisentido es preferiblemente de manera que una molécula que comprende la secuencia antisentido puede formar un híbrido estable con la secuencia de nucleótidos objetivo en la molécula de RNA bajo condiciones fisiológicas.

25 [0005) Los términos "oligonucleótido antisentido" y "oligonucleótido" se usan de forma intercambiable aquí y se entienden para referirse a un oligonucleótido que comprende una secuencia antisentido. En la presente especificación, molécula de salto del exón tal y como se define aquí puede ser una molécula compuesta que se enlaza y/o es complementaria a la secuencia específica, o una proteína tal como una proteína de unión a RNA o una proteina de dedo de cinc no natural que ha sido modificada para poder enlazarse con la secuencia de nucle6tidos indicada en una molécula de RNA. Los métodos para la selección de las moléculas compuestas que enlazan secuencias de nucle6tidos específicas son, por ejemplo, descritos en WOO2/24906 y Patente de EE.UU. 6,875,736. Los métodos para diseñar proteínas de dedo de cinc de enlace a RNA que enlazan secuencias de nucleótidos especificas se describen por friesen y Darby, Nature Structural Biology 5: 543-546 (1998). La unión a una de las secuencias especificas SEO ID N.O: 6,7 o 8, preferiblemente en el

35 contexto del exón de CEP290 aberrante de 128 nucle6tidos (SEO ID N.O: 4) se puede evaluar por medio de técnicas conocidas por la persona experta. Una técnica preferida es el ensayo de desvío de movilidad de gel como se describe en EP 1 619249. En un ejemplo, una molécula de sallo del exón se dice que se enlaza a una de las secuencias específicas tan pronto como un enlace de dicha molécula a una secuencia marcada SEO ID N.O: 6, 7 o 8 es detectable en un ensayo de desvío de movilidad de gel.

[0006) En todas las formas de realización de la invención, una molécula de salto del exón es un oligonucleótido antisentido que se enlaza y/o es complementaria a un polinucleótido con la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEO ID N.O: 8, donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEO ID N.O: 10, SEO ID N.O: 11 y SEO ID N.O: 12, y donde

45 un nucleótido en el oligonucleótido antisentido puede ser un residuo de RNA, un residuo de DNA, o un analogo de nucleótido o equivalente.

[0007) El término "sustancialmente complementario" usado en el contexto de la presente invención indica que algunos malapareamientos en la secuencia antisentido son permitidos siempre y cuando la funcionalidad, es decir, la inducción del sallo del exón de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos (SEO ID N.O: 4), sigue siendo aceptable. Preferiblemente, la complementariedad es de 90% a 100%. En general esto permite 1 o 2 malapareamiento{s) en un oligonucleótido de 20 nucleótidos o 1, 2, 3 o 4 malapareamientos en un oligonucleótido de 40 nucleótidos, o 1, 2, 3, 4,5 o 6 malapareamientos en un oligonucleótido de 60 nucleótidos, etc. También se describe un método para el diseñaruna molécula de salto del exón,

55 preferiblemente un oligonucleólido capaz de inducir salto del exón de CEP290 aberrante de 128 nucleólidos (SEO ID N.O: 4). Primero, dicho oligonucleótido se selecciona para enlazarse a uno de SEO ID N.O: 6, 7 o 8 o una parte de la misma tal y como se define aquí posteriormente. Posteriormente, en un método preferido al menos uno de los siguientes aspectos tiene que ser tenido en cuenta para diseñar, mejorar dicha molécula de salto del exón ad icionalmente:

•

la molécula de sallo del exón preferiblemente no contiene un CpG o una extensión de CpG,

•

la molécula de sallo del exón tiene cinética de enlace de RNA yfo propiedades termodinámicas aceptables.

[0008) La presencia de un CpG o una extensión de CpG en un oligonucleótido es normalmente asociada a una inmunogenicidad aumentada de dicho oligonucleótido (Dorn y Kippenberger, 2008). Esta 65 inmunogenicidad aumentada no es deseada puesto que puede inducir daño del tejido por tratar, es decir el ojo. La inmunogenicidad se puede evaluar en un modelo animal por la evaluación de la presencia de células

C04+ ylo C08+ ylo infiltración de mononucleocitos inflamatorios. La inmunogenicidad también se puede evaluar en la sangre de un animal o de un ser humano tratado con un oligonucleótido de la invención por la detección de la presencia de un anticuerpo neutralizante ylo un anticuerpo que reconoce dicho oligonucleótido utilizando un inmunoensayo estándar conocido por la persona experta.

[0009) Un aumento en la inmunogenicidad se puede evaluar por la detección de la presencia o una cantidad en aumento de un anticuerpo neutralizante o un anticuerpo que reconoce dicho oligonucleótido utilizando un inmunoensayo estándar.

10 [0010) La presente divulgación permite diseñar de un oligonucle6tido con cinética de enlace de RNA ylo propiedades termodinámicas aceptables. La cinética de enlace de RNA ylo propiedades termodinámicas son al menos en parte determinadas por la temperatura de fusión de un oligonucleótido (Tm; calculada con la calculadora de propiedades oligonudeótidas (www.unc.eduf?cailfbiotoolloligonucleótidosfindice.HTLM) para RNA monocatenario que utiliza la Tm básica y el modelo vecino más cercano), ylo la energía libre del

15 complejo de exón objetivo de AON (usando la versión de estructura de RNA 4.5). Si una Tm es demasiado alta, se prevé que el oligonucleótido sea menos específico. Una Tm aceptable y energía libre dependen de la secuencia del oligonucleótido. Por lo tanto, resulta dificil dar rangos preferidos para cada uno de estos parámetros. Una Tm aceptable puede oscilar entre 35 y 70"C y una energía libre aceptable puede oscilar entre 15 y 45 kcallmol.

[0011) La persona experta puede por lo tanto primero elegir un oligonucleótido como un compuesto terapéutico potencial como enlazándose ylo siendo complementario a la SEO ID N.o: 6, 7, o 8 o una parte de la misma tal y como se define en la presente posteriormente. La persona experta puede controlar que dicho oligonucleótido sea capaz de enlazarse con dichas secuencias como se ha definido en la presente 25 anteriormente. Opcionalmente en un segundo paso, la persona experta puede usar la divulgación para optimizar adicionalmente dicho oligonucleótido controlando la ausencia de CpG ylo optimizando su Tm ylo energía libre del complejo objetivo de AON. La persona experta puede tratar de diseñar un oligonucleótido donde preferiblemente ningún CpG y/o donde una Tm más aceptable y/o energía libre se obtienen por la elección de una secuencia diferente de CEP290 (con SEO ID N.O: 6,7 o 8) con la que el oligonucleótido es

30 complementario. Alternativamente, si un oligonucle6tido complementa rio a una extensión dada dentro de SEO ID N.o: 6.7 o 8, comprende un CpG, ylo no tiene una Tm aceptable y/o energía libre, la persona experta puede mejorar cualquiera de estos parámetros disminuyendo la longitud del oligonucleótido, ylo elig iendo una extensión diferente dentro de cualquiera de SEO ID N.O: 6, 7 o 8 con la que el oligonucleótido es complementaria ylo alterando la quimica del oligonucleótido.

35 [0012) En cualquier etapa del método, el oligonucieótido es preferiblemente un oligonucleótido, que es todavia capaz de mostrar un nivel aceptable de actividad funcional. Una actividad funcional de dicho oligonucleótido es preferiblemente inducir el salto del exón de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos (SEO ID

N.o: 4) con un determinado alcance, para proporcionar a un individuo una proteína funcional de CEP290 ylo

40 mRNA y/o al menos en parte Que disminuye la producción de una proteína ylo mRNA de CEP290 aberrante. En un caso, se dice Que un oligonucleótido es induce el salto del exón de CEP290 aberrante de 128 nucleótido (SEO ID N.o: 4), cuando el porcentaje de salto del exón de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos (SEO ID N.O: 4) según se mide por análisis cuantitativo RT-PCR en tiempo real (es al menos 30%, o al menos 35%, o al menos 400!o, o al menos 45%, o al menos 50%, o al menos 55%, o al menos 60%, o al menos 65%,

45 o al menos 70%, o al menos 75%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95%, o 100%.

[0013) Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico de la divulgación, preferiblemente un olígonucleótido, que comprende una secuencia que es complementaria o sustancialmente complementaria a una secuencia 50 de nucleótidos como se muestra en SEO ID N.o: 6, preferiblemente SEO ID N.o: 7, más preferiblemente SEO ID N.o: 8, o parte de la misma de CEP290 es tal que la parte (sustancialmente) complementaria es al menos 50% de la longitud del oligonucleótido de la divulgación, más preferiblemente al menos 60%, aún más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90% o aún más preferiblemente al menos 95%, o aún más preferiblemente 98% o aún más preferiblemente al 55 menos 99%, o aún más preferiblemente 100%. Un oligonucleótido según la invención comprende o consiste en una secuencia Que es complementaria a parte de la SEO ID N.O: 8 donde dicho oligonucleótido comprende

o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEO ID N.O: 10, SEO ID N.O: 11 y SEO ID N.O: 12. En una forma de realización más preferida, la longitud de dicha parte complementaria de dicho oligonucleótido es de al menos 16, 17, 18, 19,20,21,22,23, 24,25,26, 27,28,29,30,31,32,33,34, 35, 36,

60 37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, 48,49,50,51,52,53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141,142 o 143 nucleótidos. Secuencias flanqueantes adicionales se pueden utilizar para modificar la unión de una proteina al oligonucleótido, o para modificar una propiedad termodinamica del oligonucleótido, mas preferiblemente para modificar la afinidad de enlace de RNA objetivo.

[0014) No es absolutamente requerido que todas las bases en la región de complementariedad sean capaces del apareamiento con bases en la cadena opuesta. Por ejemplo, al diseñar el oligonucle6tido uno puede querer incorporar por ejemplo un residuo que no aparea las bases con la base en la cadena complementaria. Malapareamientos pueden, hasta cierto punto, ser permitidos, si dadas las circunstancias en la célula, la 5 extensi6n de nucle6tidos es suficientemente capaz de hibridarse con la parte complementaria. En este contexto, "suficientemente" preferiblemente significa que utilizando un ensayo de desvío de movilidad de gel como se describe en el ejemplo 1 de EP1619249, el enlace de un oligonucleótido es detectable. Opcionalmente, dicho oligonudeótido puede ser además evaluado por transfecci6n en las células de retina de pacientes. El salto de un exón previsto se puede evaluar por RT-PCR (como se describe en EP1619249). Las regiones complementarias son preferiblemente diseñadas de manera que, cuando se combinan, son especificas para el exón en el pre-mRNA. Tal especificidad se puede crear con varias longitudes de regiones complementarias ya que depende de las secuencias reales en otras moléculas (pre-)mRNA en el sistema. El riesgo de que el oligonucleótido también sea capaz de hibridarse a una u otras moléculas adicionales de premRNA se reduce al aumentar el tamaño del oligonucle6tido. Esta claro que los oligonucleótidos que

15 comprenden malapareamientos en la región de complementariedad pero que retienen la capacidad para hibridarse y/o enlazarse con la(s) región(es) prevista(s) en el pre-mRNA, se pueden usar en la presente invenci6n. Sin embargo, preferiblemente al menos las partes complementarias no comprenden tales malapareamientos ya que estas tipicamente tienen una eficiencia más alta y una especificidad más alta, estos oligonucleótidos tienen tales malapareamientos en una o más regiones complementarias. Se considera, que fuerzas de hibridaci6n más altas, (es decir número en aumento de interacciones con la cadena opuesta) son favorables para aumentar la eficiencia del proceso de interterir con la maquinaria de empalme del sistema. Preferiblemente, la complementariedad es de 900!o a 100%. En general esto permite 1 o 2 malapareamiento(s) en un oligonucleótido de 20 nucleótidos o 1, 2, 3 o 4 malapareamientos en un oligonucle6tido de 40 nucle6tidos, o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 malapareamientos en un oligonucleótido de 60

25 nucleótidos, etc.

[0015) Una molécula de salto del exón de la invención es preferiblemente una molécula aislada.

[0016) Una molécula de salto del ex6n de la invención es un oligonucleótido antisentido, que es complementario a la SEa ID N.O: 8 donde dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia seleccionada del gn.Jpo que consiste en: SEO ID N.O: 10, SEO ID N.O: 11 y SEO ID N.O: 12. Una molécula de salto del exón, según la divulgación es una molécula de ácido nucleico que incluye un oligonucleótido antisentido cuyo oligonucleótido antisentido tiene una longitud de aproximadamente 8 a aproximadamente 143 nucle6tidos, más preferido de aproximadamente 8 a 60, más preferido 10 a aproximadamente 40 35 nucleótidos, más preferido de aproximadamente 12 a aproximadamente 30 nucle6lidos, más preferido de aproximadamente 14 a aproximadamente 28 nucleólidos, nucleótidos, lo más preferido aproximadamente 20 nucleótidos, tal como 15 nucle6tidos, 16 nucle6tidos, 17 nucleótidos, 18 nucleótidos, 19 nucleótidos, 20 nucleótidos, 21 nucle6tidos, 22 nucleótidos, 23 nucleótidos, 24 nucleólidos o 25 nucle6tidos. Una molécula de salto del exón de la divulgación es un oligonucleótido antisentido que comprende o consiste en de 8 a 143 nucleótidos, más preferido de 10 a 40 nucle6tidos, más preferido de 12 a 30 nucle6tidos, más preferido de 14 a 20 nucle6tidos, o preferiblemente comprende o consiste en 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24,25, 26,27,28,29, 30,31,32, 33,34,35,36, 37, 38,39, 40, 41,42, 43, 44,45,46, 47, 48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141 ,142 o 143 nucleótidos. La invención proporciona una molécula de salto del exón que comprende o preferiblemente 45 consiste en un oligonucleótido antisentido seleccionado del grupo que consiste en: SEQ ID N.O: 10, SEQ ID

N.O: 11, Y SEQ ID N.O: 12.

[0017) En una forma de realización preferida, la invención proporciona una molécula de salto del exón que comprende o preferiblemente consiste en la SEQ ID N.O: 10 del oligonucleótido antisentido. Se ha observado que esta molécula es muy eficaz en la modulaci6n del empalme del ex6n de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos. Esta molécula de salto del exón preferida de la invención que comprende SEa ID N.O: 10 preferiblemente comprende de 16 a 143 nudeótidos, más preferido de 16 a 40 nucle6tidos, más preferido de 16 a 30 nudeótidos, más preferido de 16 a 20 nucle6tidos, más preferiblemente de 16 a 18 o preferiblemente comprende o consiste en 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, 36, 37,

55 38,39,40, 41,42,43,44, 45,46,47,48, 49,50,51,52,53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141 ,1420 143 nucleótidos.

[0018) En otra forma de realización preferida, la invención proporciona una molécula de salto del exón que comprende o preferiblemente consiste en la SEO ID N,o: 11 del oligonucleótido antisentido. Se ha observado que esta molécula es muy eficaz en la modulación del empalme del exón de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos. Esta molécula de salto del exón preferida de la invención que comprende SEa ID N.O: 11 preferiblemente comprende de 17 a 143 nudeótidos, más preferido de 17 a 40 nucle6tidos, más preferido de 17 a 30 nucleótidos, más preferido de 17 a 20 nucle6lidos, más preferiblemente de 17 a 18, o preferiblemente comprende o consiste en 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

65 39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49, 50,51,52,53,54,55, 56, 57, 58, 59,60,65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141 ,1420 143 nucle6tidos.

[0019) En otra forma de realización preferida, la invención proporciona una molécula de salto del exón que comprende o preferiblemente consiste en la SEO ID N.o: 12 del oligonucleótido antisentido. Se ha observado que esta molécula es muy eficaz en la modulación del empalme del exón de CEP290 aberrante de 128

5 nucleótidos. Esta molécula de salto del exón preferida de la invención que comprende SEa ID N.o: 12 preferiblemente comprende de 18 a 143 nucleótidos, mas preferido de 18 a 40 nucleótidos, mas preferido de 18 a 30 nucleótidos, mas preferido de 18 a 20 nucleótidos, mas preferiblemente 18, o preferiblemente comprende o consiste en 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42,43,44,45, 46,47,48, 49,50,51,52,53,54, 55, 56,57, 58, 59,60,65, 70, 75, 80,85, 90, 95, 100, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 141,1420143 nucleótidos.

[0020) Una molécula de salto del exón según la invención puede contener uno o mas residuos de RNA, o uno

o mas residuos de DNA, ylo uno o mas analogos de nucleótidos o equivalentes, como sera adicionalmente detallado aquí abajo.

[0021 ) Se prefiere que una molécula de salto del exón de la invención comprenda uno o mas residuos que se modifican para aumentar la resistencia de la nucleasa, ylo para aumentar la afinidad del oligonucleótido antisentido con la secuencia objetivo. Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la secuencia de nucleótidos antisentido comprende al menos un analogo de nucleótido o equivalente, donde un analogo de nucleótido o equivalente se define como un residuo con una base modificada, ylo un esqueleto modificado, ylo un enlace de internucleósidos no natural, o una combinación de estas modificaciones.

[0022) En una forma de realización preferida, el analogo de nucleótido o equivalente comprende un esqueleto modificado. Ejemplos de tales esqueletos se proporcionan por esqueletos de morfolino, esqueletos de 25 carbamato, esqueletos de siloxano, sulfuro, sulfóxido y esqueletos de sulfona, formacetilo y esqueletos de tioformacetilo, esqueletos de metilenformacetilo, esqueletos de riboacetilo, esqueletos que contienen alqueno, sulfamato, esqueletos de sulfonato y sulfonamida, esqueletos de metilenimino y metilenhidrazino, y esqueletos amídicos. Oligómeros de morfolino de fosforodiamidato son oligonucleótidos de esqueletos modificados que han sido previamente investigados como agentes antisentido. Los oligonucleótidos de morfolino tienen un esqueleto sin carga donde el azúcar de desoxiribosa de DNA se sustituye por un anillo dividido en 6 miembros y el enlace de fosfodiéster se sustituye por un enlace de fosforodiamidato. Oligonucleótidos de morfolino son resistentes a la degradación enzimatica y parecen funcionar como agentesantisentido por detención de la traducción o interferencia con el empalme de pre-mRNA antes que por la activación de la RNasa H. Oligonucleótidos de morfolino han sido entregados exitosamente a células

35 de cultivo de tejido por métodos que físicamente interrumpen la membrana celular, y un estudio que compara varios de estos métodos descubrió que la carga de raspaduras fue el método mas eficaz de administración; sin embargo, debido a que el esqueleto de morfolino no tiene carga, los lípidos catiónicos no son mediadores eficaces de la absorción de oligonucleótidos de morfolino en las células. Un informe reciente demostró la formación de triples por un oligonucleótido de morfolino y, debido al esqueleto no ión ico, estos estudios mostraron que el oligonucleótido de morfolino fue capaz de formación de triples en ausencia de magnesio.

[0023) Es ademas preferido que el enlace entre los residuos en un esqueleto no incluya un atomo de fósforo, tal como un enlace que se forma por enlaces intemucleósidos de alquilo o de cicloalquilo de cadena corta, heteroatomo mezclado y enlaces de intemucleósido de alquilo o de cicloalqu ilo, o uno o mas enlaces de

45 intemucleósidos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta.

[0024) Un analogo de nucleótido preferido o equivalente comprende un acido nucleico peptídico (pNA), con un esqueleto de poli amida modificada (Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500). Moléculas basadas en pNA son simuladores reales de moléculas de ONA en cuanto a reconocimiento de pares de bases. El esqueleto del PNA esta compuesto de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina enlazadas por enlaces peptídicos, donde las nucleobases se enlazan al esqueleto por enlaces de carbonilo y metileno. Un esqueleto alternativo comprende un monómero de PNA de pirrolidina extendida de mono-carbono (Govindaraju y Kumar (2005) Chem. Commun, 495-497). Ya que el esqueleto de una molécula de PNA contiene grupos de fosfato no cargados, híbridos de PNA-RNA son normalmente mas estables que los hibridos de RNA-RNA o RNA-ONA,

55 respectivamente (Egholm el al (1993) Nature 365,566-568).

[0025) Otro esqueleto preferido comprende un analogo de nucleótido de morfolino o equivalente, donde la ribosa o azúcar de desoxiribosa se sustituye por un anillo de morfolino dividido en 6 miembros. Un analogo de nucle6tido o equivalente mas preferido comprende un olig6mero de morfolino y fosforodiamidato (PMO), donde la ribosa o azúcar de desoxirribosa se sustituye por un anillo de morfolino dividido en 6 miembros, y el enlace de fosfodiéster aniónico entre anillos de morfolino adyacentes se sustituye por un enlace de fosforodiamidato no iónico.

[0026) En otra forma de realización adicional, un análogo de nucleótido o equivalente de la invención

65 comprende una sustitución de uno de los oxígenos sin puente en el enlace de fosfodiéster. Esta modificación desestabiliza ligeramente el apareamiento de bases pero añade resistencia significativa a la degradación de nucleasa. Un análogo de nuc1eótido o equivalente preferido comprende fosforotioato, fosforotioato quiral, fosforoditioato, fosfotriéster, aminoalquilfosfotriéster, fosfonato de H, metilo y otro fosfonato de alquilo con fosfonato 3'-alquileno, fosfonato S'-alquileno y fosfonato quiral, fosfinato, fosforamidato con 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidato, tionofosforamidato, tionoalquilfosfonato, tionoalquilfosfotriéster,

5 selenofosfato o boranofosfato.

[0027) Otro análogo de nucleótido o equivalente preferido de la invención comprende una o más fracciones de azúcar que son mono-o disustitufdas en la posición 2', 3' ylo 5' tal como un -OH; -F; inferior sustituido o no sustituido lineal o ramificado (C1-C10) alquilo, alquenilo, alquinilo, alcarilo, alilo, o aralquilo, que se puede interrumpir por uno o más heteroátomos; 0-, S-, o N-alquilo; 0-, S-, o N-alquenilo; 0-, S-o N-alquinilo; 0-, S-,

o N-atilo; O-alquil-O-alquilo, -metoxi, -aminopropoxi; metoxietoxi; dimetilaminooxietoxi; y dimetilaminoetoxietoxi. La fracción de azúcar puede ser una piranosa o derivado, o una desoxipiranosa o derivado de la misma, preferiblemente ribosa o derivado de la misma, o deoxirribosa o derivado de la misma. Una fracción de azúcar derivada preferida comprende un ácido nucleico bloqueado (LNA), donde el átomo de

15 carbono 2' se enlaza al átomo de carbono 3' o 4' del anillo de azúcar formando asi una fracción de azúcar bicíclica. Un LNA preferido comprende ácido nucleico con puente 2'-0,4'-C-etileno (Morita et al. 2001. Nucleic Acid Res Supplement No. 1: 241-242). Estas sustituciones vuelven resistente al análogo de nucle6tido o Rnase H y nucleasa equivalentes y aumentan la afinidad para el RNA objetivo.

[0028) En otra forma de realización, un análogo de nucleótido o equivalente de la invención comprende una o más modificaciones o sustituciones de bases. Bases modificadas comprenden bases sintéticas y naturales tal como inosina, xantina, hipoxantina y otra -aza, deaza, -hidroxi, halo it, -tio, tiol, -alquilo, -alquenilo, -alquinilo, derivados de tioalquilo de bases de pirimidina y de purina que son o serán conocidos en la técnica.

25 [0029) Una persona experta entiende que no es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido antisentido sean modificadas uniformemente. Además, más de uno de los análogos anteriormente mencionados o equivalentes se pueden incorporar en un oligonucleótido antisentido único o incluso a una posición única dentro de un oligonucleótido antisentido. En formas de realización determinadas, un oligonucleótido antisentido de la invención tiene al menos dos diferentes tipos de análogos o equivalentes.

[0030) Una molécula de salto del ex6n preferida según la invención comprende un oligonucle6tido antisentido de 2'-0 alquil fosforotioato, tal como ribosa modificada por 2'-0-metilo (RNA), ribosa modificada por 2'-0-etilo, ribosa modificada por 2'-0-propilo, ylo derivados sustituidos de estas modificaciones tales como derivados halogenados.

35 [0031) Un oligonucleótido antisentido eficaz según la invención comprende una 2'-0-mteil ribosa con un esqueleto de fosforotioato.

[0032) También una persona experta se entenderá que diferentes oligonucleótidos antisentido se pueden combinar para saltar de forma eficaz el exón aberrante de 128 nucleótidos de CEP290. En una forma de realización preferida, una combinación de al menos dos oligonucleótidos antisentido se usan en un método de la invención, tal como dos oligonucleótidos antisentido diferentes, tres oligonucleótidos antisentido diferentes, cuatro oligonucleótidos antisentido diferentes, o cinco oligonucleótidos antisentido diferentes.

45 [0033) Un oligonucleótido antisentido se puede enlazar a una fracción que mejora la absorción del oligonucleótido antisentido en células, preferiblemente células de retina. Ejemplos de tales fracciones son colesteroles, carbohidratos, vitaminas, biotina, lípidos, fosfolípidos, péptidos que penetran en la célula que incluyen pero no se limitan a antennapedia, TAT, transportan y aminoácidos cargados positivamente tal como oligoarginina, poliarginina, oligolisina o polilisina, dominios de unión del antígeno tal como se proporciona por un anticuerpo, un fragmento Fab de un anticuerpo, o un dominio de unión de antígeno monocatenario tal como un dominio de unión del antígeno de dominio único camélido.

[0034) Una molécula de salto del exón según la invención se puede administrar indirectamente usando medios adecuados conocidos en la técnica. Cuando la molécula de salto del exón es un oligonuc1eótido, 55 puede por ejemplo ser proporcionada a un individuo o una célula, tejido u órgano de didlO individuo en forma de un vector de expresión donde el vector de expresión codifica una transcripción que comprende dicho oligonucleótido. El vector de expresión es preferiblemente introducido en una célula, tejido, órgano o individuo por medio de un vehículo de entrega de genes. En una forma de realización preferida, se proporciona un vector de expresión basado en virus que incluye un casete de expresión o un casete de transcripción que conduce la expresión o transcripción de una molécula de salto del exón como se identifica aqu í. Por consiguiente, la presente invención proporciona un vector vírico que expresa una molécula de salto del exón según la invención cuando se somete a condiciones favorables para la expresión de la molécula de salto del exón. Una célula puede ser provista de una molécula de salto del exón capaz de interferir con secuencias esenciales que resultan en un salto altamente eficaz del exón aberrante de 128 nuc1eótidos de CEP290 por 65 expresión de oligonudeótidos antisentido derivados de plásmido o expresión vírica proporcionada por vectores basados en virus asociados a adenovirus o adeno-asociados. La expresión se puede conducir por

un promotor de polimerasa 111, tal como un promotor de RNA U1 , U6, o U7. Un vehículo de administración preferido es un vector vírico tal como un vector de virus adeno-asociados (AAV), o un vector retrovírico tal como un vector de lentivirus y similar. También, plásmidos, cromosomas artificiales, plasmidos utilizables para recombinación homóloga dirigida e integración en el genoma humano de células pueden ser

5 adecuadamente aplicados para la entrega de un oligonucleótido tal y como se define aquí. Para la invención presente se prefieren aquellos vectores donde la transcripción es conducida por promototres PollIl, y/o donde los transcritos están en forma de fusiones con transcritos U1 o U7, que producen resultados buenos para la entrega de transcritos pequeños. El experto tendrá la habilidad para diseñar transcritos adecuados. Se prefieren los transcritos conducidos por PolI ll. Preferiblemente, en forma de un transcrito de fusión con un transcrito UI o U7. Tales fusiones se pueden generar como se describe (Gorman L et al, 1998 o Suter D et al, 1999).

[0035) La molécula de salto del exón según la invención, se puede entregar como tal. Sin embargo, la molécula de salto del exón también se puede codificar por el vector vírico. Típicamente, esta está en forma 15 de un transcrito de RNA que comprende la secuencia de un oligonucleótido según la invención en una parte del transcrito.

[0036) Un sistema de expresión de oligonucleótido antisentido preferido es un vector basado en virus asociado a adenovirus (AAV). Vectores basados en AAV de cadena monocatenaria y bicatenaria han sido desarrollados que se pueden usar para la expresión prolongada de secuencias de nucleótidos antisentido pequeños para saltar de forma muy eficaz el exón aberrante de 128 nucleótidos de CEP290.

[0037) Un vector basado en AAV preferido por ejemplo comprende un casete de expresión que se conduce por un promotor de la polimerasa 111 (Poi 111). Un promotor PolIlI preferido es, por ejemplo, un promotor de 25 RNAU1,U6,oU7.

[0038) La invención por lo tanto también proporciona un vector basado en virus, que comprende un casete de expresión conducido por el promotor de Poi 111 para la expresión de un oligonucleótido antisentido de la invención para inducir el salto del exón aberrante de 128 nucleótidos de CEP290.

[0039) Mejoras en medios para suministrar a un individuo o una célula, tejido, órgano de dicho individuo con una molécula de salto del exón según la invención, se anticipan considerando el progreso que ya ha sido consegu ida. Tales mejoras futuras pueden por supuesto ser incorporadas para conseguir el efecto mencionado en la reestructuración de mRNA usando un método de la invención. Una molécula de salto del 35 exón según la invención se puede entregar como está a un individuo, una célula, tejido u órgano de dicho individuo. Cuando se administra una molécula de salto del exón según la invención, se prefiere que la molécula se disuelva en una solución que es compatible con el método de entrega. Células de retina pueden ser provistas de un plásmido para la expresión de oligonucleótido antisentido proporcionando el plásmido en una solución acuosa. Alternativamente, un plásmido se puede proporcionar por transfección usando un agente de transfección conocido. Para la administración intravenosa, subcutanea, intramuscular, intratecal y/o intraventricular se prefiere que la solución sea una solución salina fisiológica. En la invención se prefiere particularmente el uso de un excipiente o agente de transfección que ayudará en la entrega de cada uno de los constituyentes tal y como se define aquí a una célula ylo en una célula, preferiblemente una célula de retina. Se prefieren excipientes o agentes de transfección capaces de formar complejos, nanopart.ículas, 45 micelas, vesículas y/o liposomas que entregan cada constituyente tal y como se define aquí, en complejo o retenidos en una vesícula o liposoma a través de una membrana celular. Muchos de estos excipientes se conocen en la técnica. Excipientes adecuados o agentes de transfección comprenden polietilenimina (PEI; ExGen500 (MBI Fermentas», LipofectAMINE TIoI 2000 (Invitrogen) o derivados del mismo, o polímeros catiónicos similares, con polipropilenimina o copolímeros de polietilenimina (PECs) y derivados, anfifilos sintéticos (SAINT-18), lipofectinTM, proteinas cápsidas DOTAP y/o víricas que son capaces de autoensamblaje en partículas que pueden entregar cada constituyente tal y como se define aquí a una célula , preferiblemente una célula de retina. Tales excipientes han mostrado que entregan eficazmente un oligonucleótido tal como ácidos nucleicos antisentido a una amplia variedad de células cultivadas, incluidas las células de la retina. Su alto potencial de transfección se combina con una toxicidad exceptuada baja a

55 moderada en cuanto a supervivencia celular en general. La facilidad de modificación estructural puede utilizarse para permitir otras modificaciones y el análisis de sus otras características de transferencia de ácidos nucleicos (in vivo) y toxicidad.

[0040) Lipofectina representa un ejemplo de un agente de transfección liposómica. Consiste en dos componentes lipidicos, un lipido catiónico cloruro N-[1-(2,3 dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) (cp. DOTAP que es la sal de metilsulfato) y un lipido neutro dioleoilfosfatidilelanolamina (DOPE). El componente neutro media la liberación intracelular. Otro grupo de sistemas de administración son nanopartículas poliméricas.

65 [0041) Policationes tales como dietilaminoetilaminoetilo (DEAE}-dextrano, que son bien conocidos como reactivo de transfección de DNA se pueden combinar con butilcianoacrilato (PBCA) y hexilcianoacrilato (PHCA) para formular nanopartículas catiónicas que pueden entregar cada constituyente tal y como se define aquí, preferiblemente un oligonucleótido, a través de membranas celulares en las células.

[0042) Además de estos materiales de nanopartículas comunes, la protamina de péptido catiónico ofrece un

5 método alternativo para formular un oligonucleótido con coloides. Este sistema de nanoparticulas coloidal puede formar los así llamados proticles, que se pueden preparar por un proceso de autoensamblaje simple para envolver y mediar la liberación intracelular de un oligonucleótido. La persona experta puede seleccionar y adaptar cualquiera de los anteriores u otros excipientes alternativos y sistemas de administración disponibles comercialmente para envolver y entregar una molécula de salto del exón para usar en la invención presente para entregarla para la prevención, tratamiento o retraso de una enfermedad o condición relacionada con CEP290. "Prevención, tratamiento o retraso de una enfermedad o condición relacionada con CEP29(J' se define aquí preferiblemente como prevención, detención, cese de la progresión de, o inversión de la degradación visual parcial o completa o ceguera provocada por un defecto genético en el gen CEP290.

15 [0043) Ademas, una molécula de sallo del exón según la invención podría ser enlazada de manera covalente

o de manera no covalente a un ligando objetivo específicamente diseñado para facilitar la absorción en la célula, citoplasma yfo su núcleo. Tal ligando podria comprender (i) un compuesto (incluidas estructuras (tipo) péptido pero sin limitarse a estas) que reconoce elementos especificos de células, tejidos o de los órganos que facilitan la absorción celular ylo (ii) un compuesto quimico capaz de facilitar la absorción en células ylo la liberación intracelular de un oligonucleótido de vesículas, por ejemplo endosomas o lisosomas.

[0044) Por lo tanto, en una forma de realización preferida, una molécula de salto del exón según la invención se formula en una composición o un medicamento o una composición, que está provista de al menos un excipiente ylo un ligando objetivo para la entrega ylo un dispositivo de entrega del mismo a una célula ylo

25 que aumenta su entrega intracelular.

[0045) Debe entenderse que si una composición comprende un constituyente adicional tal como un compuesto complementario como se define aqui posteriormente, cada constituyente de la composición no se puede formular en una combinación única o composición o preparación. Dependiendo de su identidad, la persona experta sabrá qué tipo de formulación es el más apropiado para cada constituyente tal y como se define aquí. En una forma de realización preferida, la invención proporciona una composición o una preparación que está en forma de un equipo de partes que incluye una molécula de salto del exón según la invención y otro compuesto complementario como se define más tarde aquí.

35 [0046) Si es necesario, una molécula de salto del exón según la invención o un vector vírico, que expresa una molécula de salto del exón según la invención se puede incorporar en una mezcla farmacéuticamente activa añadiendo un portador farmacéuticamente aceptable.

[0047) Por consiguiente, la invención también proporciona una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que incluye una molécula de salto del exón según la invención, o un vector vírico según la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal composición puede comprender una molécula de salto del exón única según la invención, pero también puede comprender moléculas de salto del exón múltiples diferentes según la invención. Tal composición farmacéutica puede comprender cualquier excipiente farmacéuticamente aceptable, incluido un portador, relleno, conservante, adyuvante, solubilizador

45 ylo diluyente. Tal portador farmacéuticamente aceptable, relleno, conservante, adyuvante, solubilizador ylo diluyente puede por ejemplo encontrarse en Remington, 2000. Cada caracteristica de dicha composición ha sido definida anteriormente aquí.

[0048) Si se usan diferentes moléculas de salto del exón múltiples según la invención, la concentración o dosis definida aqui puede referirse a la concentración total o dosis de todos oligonucleótidos usados o la concentración o dosis de cada molécula de salto del exón usada o adicionada. Por lo tanto, en una forma de realización, se proporciona una composición donde cada o la cantidad total de moléculas de salto del exón usadas según la invención se dosifica en una cantidad que oscila entre 0,1 Y 20 mgfkg preferiblemente entre 0,5 y 20 mglkg.

55 [0049) Una molécula de salto del exón preferida según la invención. es para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con CEP290 de un individuo. En lodas las formas de realización de la presente invención, el término "tratamiento" se entiende que incluye la prevención ylo retraso de la enfermedad o condición relacionada con CEP290. Un individuo, que se puede tratar utilizando una molécula de salto del exón según la invención puede ya haber sido diagnosticado como teniendo una enfermedad o cond ición relacionada con CEP290. Alternativamente, un individuo que se puede tratar utilizando una molécula de salto del exón según la invención puede no haber sido diagnosticado como teniendo una enfermedad o condición relacionada con CEP290 pero puede ser un ind ividuo con un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad o condición relacionada con CEP290 en el futuro dados sus antecedentes

65 genéticos. Un individuo preferido es un ser humano. En una forma de realización preferida la enfermedad o condición relacionada con CEP290 es amaurosis congénita de Leber.

[0050) Por consiguiente, la presente invención además proporciona una molécula de salto del exón según la invención, o un vector virico según la invención, o una composición según la invención para uso como un medicamento, para tratar una enfermedad o condición relacionada con CEP290 que requiere una modulación

5 del empalme de CEP290 y para uso como un medicamento para la prevención, tratamiento o retraso de una enfermedad o condición relacionada con CEP290. Una enfermedad o condición relacionada con CEP290 preferida es amaurosis congénita de Leber. Cada caracteristica de dicho uso ha sido definida anteriormente aquí. También se describe el uso de una molécula de salto del exón según la invención, o de un vector vírico según la invención, o una composición según la invención para el tratamiento de una enfermedad o condición relacionada con CEP290 que requiere una modulación del empalme de CEP290. En un caso preferido la enfermedad o condición relacionada con CEP290 es amaurosis congénita de Leber.

[0051 ) La presente invención además proporciona el uso de una molécula de salto del exón según la invención, o de un vector vírico según la invención, o una composición según la invención para la preparación

15 de un medicamento, para la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad o condición relacionada con CEP290 que requiere una modulación del empalme de CEP290 y para la preparación de un medicamento para la prevención, tratamiento o retraso de una enfermedad o condición relacionada con CEP290. Una enfermedad o cond ición relacionada con CEP290 preferida es amaurosis congén ita de Leber. Por lo tanto, en otro aspecto, se proporciona el uso de una molécula de salto del exón, vector virico o composición tal y como se define aquí para la preparación de un medicamento, para la preparación de un medicamento para tratar una condición que requiere una modulación del empalme de CEP290 y para la preparación de un medicamento para la prevención, tratamiento o retraso de una enfermedad o condición relacionada con CEP290. Una enfermedad o condición relacionada con CEP290 preferida es la amaurosis congénita de Leber. Cada característica de dicho uso ha sido definida anteriormente aquí.

25 [0052) Un tratamiento es al menos una semana, al menos un mes, al menos varios meses, al menos un año, al menos 2, 3, 4, S, 6 años o más. Cada molécula de salto del exón u oligonucieótido de salto del exón o equivalente del mismo tal y como se define aquí para el uso según la invención se puede adecuar para la administración directa a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de individuos ya afectados o en riesgo de desarrollar la enfermedad o condición relacionada con CEP290, y se puede administrar directamente in vivo, ex vivo o in vitro. La frecuencia de administración de un oligonucieótido, composición, compuesto o compuesto complementario de la invención puede depender de diferentes parámetros como la edad del paciente, la mutación del paciente, el número de moléculas de salto del exón (es decir dosis), la formulación de dicha molécula. La frecuencia puede oscilar entre al menos una \lez en dos semanas, o tres semanas o

35 cuatro semanas o cinco semanas o un periodo de tiempo más largo.

[0053) Los rangos de dosis de una molécula de salto del exón, preferiblemente un oligonucleótido según la invención se diseña preferiblemente basándose en estudios de dosis en desarrollo en pruebas clínicas (uso in vivo) para las que existen requisitos de protocolo rigurosos. Una molécula de salto del exón o un oligonucleótido Ial y como se definen aquí se pueden usar a una dosis que oscila entre 0,1 y 20 mg/kg, preferiblemente de 0,5 y 20 mg/kg.

[0054) En un caso preferido, se usa una concentración de un oligonucleótido tal y como se define aqu í, que oscila entre 0.1 nM y 1 j.JM. Preferiblemente, este rango es para uso in vitre en un modelo celular tal como

45 células de retina o tejido retina!. Más preferiblemente, la concentración usada oscila entre 1 y 400 nM, aún más preferiblemente entre 10 y 200 nM , aún más preferiblemente entre 50 y 100nm. Si se usan varios oligonucleótidos, esta concentración o dosis puede referirse a la concentración total o dosis de oligonucieótidos o la concentración o dosis de cada oligonucieótido adicionado.

[0055) En un caso preferido, un vector vírico, preferiblemente un vector AAV como se describe anteriormente aqui, como vehículo de administración para una molécula según la invención, se administra en una dosis que varía de 1x109-1x1017 partículas de virus por inyección, más preferiblemente de 1x1010 -1x1012 partículas de virus por inyección.

55 [0056) Los rangos de concentración o dosis de oligonucleÓlido(s) como se dan arriba son concentraciones o dosis preferidas para usos in vitro o ex vivo. La persona experta entenderá que dependiendo del oligonucieótido(s) usado, la célula objetivo por tratar, el gen objetivo y sus niveles de expresión, el medio usado y las condiciones de transfección y de incubación, la concentración o dosis de oligonucieótido(s) usado(s) puede variar aún más y puede necesitar ser optimizada algo más.

[0057] Una molécula de salto del exón según la invención, o un vector virico segun la invención, o una composición según la invención para uso según la invención se puede adecuar para la administración a una célula, tejido y/o un órgano in vivo de individuos ya afectados o en riesgo de desarrollar una enfermedad o cond ición relacionada con CEP290, y se puede administrar in vivo, ex vivo o in vitro. Dicha molécula de salto 65 del exón según la invención, o un \lector vírico según la invención, o una composición según la invención puede ser directa o indirectamente administrada a una célula, tejido yfo un 6rgano in vivo de un individuo ya

afectado por o en riesgo de desarrollar una enfermedad o cond ición relacionada con CEP290, y se puede administrar directa o indirectamente in vivo, ex vivo o in vitro. Como la amaurosis congénita de Leber tiene un fenotipo pronunciado en las células de retina, se prefiere que dichas células sean células de retina, es ademas preferido que dicho tejido sea la retina yfo es ademas preferido que dicho órgano comprenda o

5 consista en el ojo.

[0058) Se describe también un método para la modulación del empalme de CEP290 en una célula que comprende contactar la célula, preferiblemente una célula de retina, con una molécula de salto del exón según la invención, o un vector vírico segun la invención, o una composición segun la invención. Las características de este aspecto son preferiblemente aquellas definidas anteriormente aquí. El contacto de la célula con una molécula de salto del exón según la invención, o un vector vírico segun la invención, o una composición según la invención se puede realizar por cualquier método conocido por el experto en la materia. El contacto puede ser directa o indirectamente y puede ser in vivo, ex vivo o in vitro.

15 [0059) Una enfermedad o condición relacionada con CEP290 preferida es la amaurosis congénita de Leber.

[0060) A menos que se indique lo contrario cada forma de realización como se describe en este caso se puede combinar con otra forma de realización como se describe en este caso.

[0061) Como se puede observar en la sección experimental aquí, a nivel de RNA, la adición de varios AúN que se dirigen al exón aberrante de CEP290 de hecho resultó en una conversión de mRNA de CEP290 empalmado aberrantemente a mRNA de CEP290 empalmado correctamente. Esta conversión coincidira con una síntesis aumentada de la proteína de CEP290 tipo salvaje.

25 [0062) En fibroblastos (que se pueden derivar de células de la piel), CEP290 se expresa de forma abundante. Por lo tanto, se pre\ié que la adición de AúN a fibroblastos cultivados de pacientes de LeA dará lugar a una cantidad aumentada de proteína de CEP290 tipo salvaje que es detectable en Westem blol. y como tal demostrará que la terapia basada en AON no solo volverá a dirigir el empalme normal de mRNA de CEP290 sino que también resultará en la restauración de la función de la proteína de CEP290. Este experimento está actualmente en desarrollo.

[0063) En este documento y en sus reivindicaciones, la palabra "comprender" y sus conjugaciones se usan en su sentido no limitativo para significar que los articulas después de la palabra esta n incluidos, pero los articulas no específicamente mencionados no esta n excluidos. Además, la referencia a un elemento por el

35 artículo indefinido "un" no excluye la posibilidad de que mas de uno del elemento esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que allí haya uno y solo uno de los elementos. El artículo indefinido "un" así normalmente significa "al menos un". La palabra "acerca de" o "aproximadamente" cuando se usa en la asociación con un valor numérico (por ejemplo, aproximadamente 10) preferiblemente significa que el valor puede ser el valor dado (de 10) más o menos 0.1% del valor.

[0064) La información de secuencia como se proporciona aquí deberia no ser interpretada tan estrechamente en cuanto a requerir inclusión de bases identificadas erróneamente. La persona experta es capaz de identificar tales bases identificadas erróneamente y sabe cómocorreg ir este tipo de errores. En caso de errores de secuencia, la secuencia del polipéptido obtenible por expresión del gen presente en SEO ID N.O: 1

45 con la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para el polipéptido debería prevalecer.

LEYENDAS DE LAS FIGURAS

[OO6S[

Figura 1 empalme de CEP290 y función de AON A) empalme de mRNA de CEP290 normal de exones 26 y 27 , dando como resultado proteína de CEP290 de tipo salvaje. B) la mutación que causa LCA más frecuente es una transición A a G (subrayada e indicada con un asterisco) en el intrón 26 de CEP290. Esta mutación crea un sitio donante de empalme, que resulta en la

55 inclusión de un exón aberrante para 50% del mRNA de CEP290 y terminación prematura posterior de la proteina de CEP290. C) Tras la unión de AON específicos de secuencia, los factores implicados en el empalme no reconocerán el sitio donante de empalme aberrante en el intrón 26, dando como resultado la redirección del empalme de CEP290 normal y síntesis de una proteína de CEP290 correcta.

Figura 2 rescate basado en AON de empalme aberrante de CEP290 A) Análisis de RT-PCR de mRNA de CEP290 aislado de células linfoblastoides de un ind ividuo de control y dos individuos afectados por LCA, que fueron cultivados en ausencia o presencia de un AúN seleccionado (AON-3) directo contra la exonina aberrante de CEP290 a una concentración final de 1.0 jJM. La banda

65 superior representa el producto de empalme aberrante de CEP290, mientras que la banda inferior representa el producto de empalme de CEP290 tipo salvaje. M: marcador de 100-bp. MQ: control de agua negativo.

B) Especificidad de rescate basado en AON. Similar a A), las células fueron transfectadas con AON-3, o un oligonucleótido sentido dirigido al mismo sitio objetivo (SON-3). Panel izquierdo: reacción RT-PCR usando cebadores situados en el exón 26 y exón 27. Panel derecho: reacción RT-PCR usando cebadores situados en el exón 26 y exón 31.

5 C) Rescate dependiente de la dosis de empalme de mRNA de CEP290. Similar a A), células fueron transfectadas con concentraciones diferentes del AON seleccionado, que varia de 0.01 a 1.0 IJM.

Figura 3 Especificidad de secuencias en el rescate basado en AON de empalme de CEP290 aberrante A) visión de conjunto del exón aberrante de CEP290, y las posiciones relativas de los AON que fueron

10 seleccionados. El extremo 5' del exón aberrante es parte de una repetición Alu. B) análisis RT-PCR de mRNA de CEP290 aislado de células de linfoblastoide de un paciente de LCA que fue cultivado en ausencia o presencia de diferentes AON dirigidos contra el exón de CEP290 aberrante (AON-1 a -5), o un oligonucleótido sentido (SON-3). Los AON y SON fueron transfectados en una concentración final de

0.1 IJM. La banda superior representa el producto de empalme de CEP290 aberrante, mientras que la banda 15 inferior representa el producto de empalme de CEP290 tipo salvaje. M: marcador de 100-bp.

SECUENCIAS

[0066) Todas las secuencias aquí están representadas de S' -7 3'

Tabla 1. secuenclas como se ex one en el rIstado de secuencias SEQ ID N.o:

Tipo de SEC Descripción

DNA genómico

CEP290

cDNA

CEP290

PRT

Proteína de CEP290

DNA

exón aberrante de CEP290 de 128 nucleótidos

PRT

Proteína aberrante de CEP290

Polinucleótido Motivo de 143 nucleótidos

Polinucleótido Motivo de 42 nucleótidos

Polinucleótido Motivo de 24 nucleótidos

AON-1

taatccca cacllta a 10

AON-2

oca t o t 11

AON-3 aactggggccaggtgcg

AON-4

tacaact ooa t 13

AON-5 actcacaattacaact

cgcacctggccccagtt

SON-3

Cebador PCR

t ctaa taca acatctt o 16

cebador PCR a actccactt ttcttttaa a

[0067] La presente invención es posteriormente descrita por los ejemplos siguientes que no deberían ser 25 interpretados como timitadores del ámbito de la invención.

[0068) A menos que se indique de otro modo, la práctica de la invención empleará métodos convencionales

estándares de biologia molecular, virologia, microbiología o bioquimica. Tales técnicas son descritas en

Sambrook et al. (1989) Molecular Clon ing, A Laboratory Manual (23 edición), Cold Spring Harbor Laboratory,

30 Cold Spring Harbor Laboratory Press ; in Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; en volumenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA; y en Volúmenes I y 11 de Brown (1998) Molecular Biology Labfax, Second Edition, Academic Press (UK); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait editor); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins, eds.).

EJEMPLOS

MATERIALES Y MÉTODOS

40 Diseño de oligonucleótidos antisentído

[0069J La secuencia de 128-bp del exón de CEP290 aberrante que se incluye en el mRNA mutante de CEP290 fue analizado para la presencia de motivos intensificadores del empalme exónico usando el programa ESE finder 3.0 (http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?process=home).

45 Otigonucleótidos antisentido de RNA fueron comprados de Eurogentec, y diseñados con una T m de 58Q C, y modificados con un grupo 2'-O-metilo en la cadena de azúcar y un esqueleto de fosfotiorato, y disuelto en solución salina tamponada con fosfato.

Cultivo celular

[0070) Células de linfoblastos B humanas de pacientes de LCA que llevan homocigÓticamente la mutaciÓn intrónica en CEP290 fueron inmortalizadas por transformación con el virus Eppstein-Barr, como se ha

5 descrito anteriormente.{Wall FE, 1995). Células fueron cullivadas en medio RPMI1640 (Gibco) conteniendo 10% (vfv) suero de temera fetal (Sigma), 1% 10 U/¡JI penicilina y 10 ¡Jgf¡JI estreptomicina (Gibco), y 1% GlutaMAX (Gibco), a una densidad de 0.5x106 células/mi. Las células fueron transferidas dos veces por sema na.

Transfección de AON

[0071 ) Un día antes de la transfecciÓn , 1.0x106 células fueron sembradas en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, en un volumen total de 2 mi de medio completo. Mezclas de transfección fueron preparadas combinando 2,5 ¡JI de AON en una concentración deseada, o agua destilada, 5 ¡JI de reactivo de transfección

15 (ExGen in vitro 500, Fermentas) y 92,5 ¡JI 150 mM de NaCI, e íncubadas a temperatura ambiente durante 10 minutos, antes de adición a las células. Seis horas después de la transfección, 8 mi de medio bajo en suero (medio completo con solo 1% de suero de temera fetal) fueron añadidos. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células fueron recogidas y lavadas con 1x PBS, antes de proceder directamente al aislamiento de RNA.

Aislamiento de RNA y RT-PCR

[0072) RNA total fue aislado de células linfoblastoides transfectadas usando el equ ipo de aislam iento Nucleospin RNA 11 (Machery Nagel), según el protocolo del fabricante . Posteriormente , 1 ¡Jg de RNA total fue

25 usado para síntesis de cONA usando el equipo de síntesis iScript cONA (Bio-Rad). El cinco por ciento del cONA fue usado para cada reacción de PCR. Parte del cONA de CEP290 fue amplificado bajo condiciones de PCR estándar suplementada con 5% de Q-solution (Qiagen), y usando un cebador sentido tgctaagtacagggacatcltgc (SEQ ID N.O: 15) y un cebador antisentido agactccacttgltcttltaaggag (SEQ ID N.O: 16) que se sitúan en el exón 26 y exón 27 del gen CEP290 humano, respectivamente. Los productos de la PCR fueron redisueltos en un gel de agarosa al 1,5% . Bandas que representan supuestamente CEP290 empalmado correctamente y aberrantemente fueron eliminadas del gel, purificadas usando el equipo de aislamiento Nucleospin Extract 11 y secuenciadas de ambas cadenas con ABI PRISM Big Oye Terminator Cycle Sequencing V2 .0 Ready Reaction kit y el ABI PRISM 3730 ONA analyzer (Applied Biosystems).

35 INTRODUCCiÓN

[0073) Aqu í, describimos el uso de AON para volver a dirigir el empalme normal de CEP290 en células de linfoblastos derivadas de paciente, y muestran una reducción específica de secuencia y reducción dependiente de la dosis en niveles de CEP290 empalmados aberrantemente, así revelando el potencial de terapia basada en AON para tratar LeA asociada a CEP290.

RESULTADOS

[0074) La mutación de CEP290 intrónica (c.2991+1655A>G) crea un sitio donante de empalme críptico que

45 produce la inclusión de un exón aberrante en el mRNA de CEP290 (figura 1A y -B). Adición de AON dirigida contra el exón aberrante prevendrá la inserción de este exón evitando la unión de factores que son esenciales para el empalme tal como los complejos U1-y U2snRNP, y proteínas ricas en serina-arginina, así restaurando el empalme y la síntesis de proteína de CEP290 normal (figura 1C). AON puede dírigirse a sitios de empalme al igual que secuencias exónicas, aunque en el caso peculiar del gen DMD de distrofia muscular de Ouchenne, AON dirigidos a regiones exónicas tienden a superar aquellos que se dirigen a sitios de empalme (Aartsma-Rus et al, 2010). Además, estudios precedentes han sugerido una correlación positiva entre la capacidad de AON para inducir sallo del exón y la presencia de sitios de unión de factor de empalme predichos de SC35 en la secuencia objetivo (Aartsma-Rus et al, 2008). Para diseñar un AON con allo potencial de sallo de exón, el exón aberrante de CEP290 (secuencia exónica de 128 nucleótidos mas 15

55 nucleótidos de secuencia inlrónica a cada lado) fue esculrinado por motivos de unión intensificadores de empalme exónico, utilizando el programa ESE finder 3.0 (Smith et al, 2006). En el extremo 3' del exón aberrante, dos motivos de unión de SC35 fueron predichos (datos no mostrados). Por lo tanto, el primer AON fue diseñado de manera que comprendió estos dos motivos (designados AON-3, SEQ ID N.O: 11), y siendo

complementario al mRNA de CEP290.

[0075) Para determinar si AON-3 tiene potencial de salto de exón in vitro, células linfoblastoides inmortalizadas de dos individuos no relacionados con LCA que llevan homocigólicamente la mutación fundadora intrónica de CEP290 c.2991 +1655A>G, al igual que de un individuo de control fueron cullivadas en ausencia o presencia de 1 ¡JM de AON-3. Como se esperaba, en el individuo de control, solo una banda que 65 representa CEP290 correctamente empalmada fue observada, mientras que en ambos individuos afectados dos productos estaban presentes, uno que representaba mRNA de CEP290 empalmado correctamente, y uno que representaba mRNA de CEP290 empalmado aberrantemente. Tras la adición de AON-3, una reducción fuerte en CEP290 aberrantemente empalmado fue notada, en ambos individuos con LCA (figura 2A). Después, la especificidad de AON-3 fue evaluada transfectando un oligonucle6tido sentido dirigido al mismo sitio objetivo (SON-3, SEO ID N.o: 14). El análisis RT-PCR mostró que en las células transfectadas 5 con SON-3, ambas moléculas de mRNA de CEP290 aberrantemente empalmadas y correctamente empalmadas están todavia presentes (figura 28, panel izquierdo), lo que demuestra la especificidad de la secuencia antisentido. Utilizando un par adicional de cebadores que amplifica productos mayores, se obtuvieron resultados similares (figura 28, panel derecho). De manera interesante, la reducción en CEP290 aberrantemente empalmado parece coincidir con una intensidad aumentada del producto que representa 10 mRNA de CEP290 empalmado correctamente. Estos datos indican que el producto aberrante no es degradado, pero que la transfección de AON realmente induce el salto del exón, dando como resultado la síntesis de mRNA de tipo salvaje empalmado más correctamente. Para determinar la dosis efectiva de AON3, las células fueron transfectadas con varias concentraciones de AON-3, que varían de 0.01 a 1.0 IJM. Incluso en la concentración mínima de 0.01 IJM, se observó una reducción marcada en CEP290

15 aberrantemente empalmado. La cantidad máxima del salto del exón fue observada a 0.05 o 0.1 IJM de AON, indicando que estas concentraciones son suficientes para convertir casi todos los CEP290 aberrantemente empalmados (figura 2C).

[0076) Se considera que la eficacia de AON en la modulación de empalme depende meramente de la

20 accesibilidad de la molécula de mRNA objetivo, y por lo tanto puede diferir en gran medida entre secuencias limítrofes. Para determinar si esta especificidad de secuencias también se aplica a CEP290, diferentes AON fueron diseñados que se dirigen al exón de CEP290 aberrante (tabla 1). Este exón consiste en 128 pares de bases, la mayoría siendo parte de una repetición de Alu, uno de los elementos repetitivos más frecuentes en el genoma humano (Schmidt et al, 1982), cubriendo el extremo 5' entero del exón aberrante (figura 3A). Por

25 lo tanto, la mayoría de AON fueron diseñados para ser complementarios al extremo 3' del exón aberrante o el sitio donante de empalme (figura 3A). En total, cinco AON fueron transfectados a una concentración final de

0.1 IJM, que fue mostrada ser óptima para AON-3. De manera interesante, además de AON-3, también AON2 (SEO ID N.O: 10) y AON-4 (SEO ID N.O: 12) resultaron en niveles altos del salto del exón. En cambio, AON1 (SEO ID N.O: 9) que se dirige a la región de repetición de Alu, y AON-S (SEO ID N.O: 13) que se dirige

30 contra el sitio donante de empalme, difícilmente mostraron cualquier salto del exón potencial (figura 3B). Estos datos demuestran la especificidad de secuencia en el sallo del exón basado en AON de CEP290 y subrayan una región pequeña del exón de CEP290 aberrante como un objetivo terapéutico potencial.

DISCUSiÓN

35 [0077) En este estudio, exploramos el potencial terapéutico de AON para corregir un defecto de empalme pro....ocado por una mutación intrónica en CEP290. En las células de linfoblastos inmortalizadas de pacientes de LCA que lIe....an homocigóticamente la mutación c.2991+16SSA>G de CEP290 intrónico, la transfección de algunos pero no todos los AON resultó en el salto del exón aberrante, restaurando así casi completamente el

40 empalme de CEP290 normal.

[0078) AON han sido el foco de investigación terapéutica desde hace más de una década, para el tratamiento de una ....ariedad de enfermedades genéticas (Hammond et al, 2011). Estas estrategias incluyen el uso de AON para bloquear el reconocimiento de sitios de empalme aberrante, para alterar la proporción entre dos 45 isoformas de empalme de origen natural, para inducir el salto de exones que contienen mutaciones truncadoras de proteínas, o para inducir el salto de exones para devolver el marco de lectura de un gen que se interrumpe por una deleción genómica, permitiendo la síntesis de una proteína (parcialmente) funcional (Hammond et al, 2011). Este último método está ya siendo aplicado en las pruebas clínicas de fase 1/11 para el tratamiento de pacientes con distrofia muscular de Duchenne, con resultados prometedores (Kinali et al,

50 2009; van Deutekom et al, 2007).

[0079) La mutación de CEP290 intrónico es un objeti ....o ideal para terapia basada en AON, ya que esta mutación produce la inclusión de un exón aberrante en el mRNA de CEP290 que es normalmente no transcrito. La inducción del salto de este exón aberrante por AON restaura completamente el mRNA de 55 CEP290 normal, que permite ni .... eles normales de proteína de CEP290 por sintetizar. Una segunda .... entaja principal es que aunque este método de AON es una estrategia terapéutica específica de la mutación, la mutación de CEP290 intrónico es con diferencia la mutación que causa LCA más frecuente.4 Basado en la pre.... alencia estimada de LCA (1 :50000), y la frecuencia observada de la mutación de CEP290 intrónico en Europa del norte (26%) (Coppieters et al, 2010) y en los EEUU (10%) (Stone; 2007), al menos mil y, 60 dependiendo de la frecuencia de la mutación en otras poblaciones, quizás muchos más individuos a nivel mundial tienen LCA debido a esta mutación. Finalmente, aunque el fenotipo de LCA asociado a mutaciones de CEP290 es severo, resulta que la integridad fotorreceptora, especialmente en la mácula, al igual que la estructura anatómica de las conexiones ....isuales al cerebro, están relati ....amente intactas en pacientes de LCA con mutaciones de CEP290, lo que permitiría una ventana de oportunidades para la intervención

65 terapéutica (Cideciyan et al, 2007).

[0080) El estudio descrito aquí proporciona una prueba de principio de terapia basada en AON para LCA asociada a CEP290 in vitre, utilizando células de linfoblastos inmortalizadas del paciente. Para determinar el potencial terapéutico real de este método para tratar LeA, se necesitan estudios adicionales que incluyen el desarrollo de vectores terapéuticos, y evaluación de eficacia y seguridad en modelos animales. Aunque AON 5 desnudos, o conjugados con péptidos que penetran en la célula, se pueden entregar a la retina por inyecciones intraoculares, la estabilidad limitada de los AON requeriria inyecciones múltiples en cada individuo. En cambio, usando vectores virales, una inyección subretinal única bastaría para permitir una expresión a largo plazo de la construcción terapéutica. Previamente, otros han usado vectores víricos adenoasociados recombinantes (rAAV) que llevan constructos de U1-o U7snRNA modificados para entregar eficazmente secuencias de AON, en el modelo de ratón mdx para mioblastos de pacientes de DMD, o de pacientes de DMD, respectivamente (Geib et al, 2009; Goyenhalle et al, 2004). De acuerdo con esto, AON que lleva el exón de CEP290 aberrante podría ser clonado dentro de tales constructos, y entregado a la retina por inyecciones subretinales de rAAV-5 o -8 serotipos que eficazmente transducen células fotorreceptoras donde se expresa el gen de CEP290 endógeno (Alloca et al, 2007; Lebherz et al, 2008). Con 15 el uso de vectores rAAV-2, ninguna respuesta inmune de larga duración fue evocada tras las inyecciones subretinales de estos vectores en pacientes con mutaciones RPE65 (Simonella et al, 2009), y también para rAAV-5 y rAAV-8, respuestas inmunológicas parecen estar ausentes o limitadas, al menos en modelos animales (Li et al, 2009; Vandenberghe et al, 2011). Un aspecto de seguridad final concieme la especificidad de la secuencia que se usa para bloquear el empalme del exón aberrante de CEP290. Como se ha declarado antes, la mayoría de este exón es parte de una repetición de Alu, y AON dirigido contra esta repetición podrá enlazarse a sitios múltiples en el genoma humano, aumentando la oportunidad para inducir los efectos fuera de objetivo. Los AON que demostraron ser eficaces en este estudio no se dirigen completamente a la secuencia de repetición de Alu, pero tampoco son completamente únicos en el genoma humano. Sin embargo, cuando se compara con la base de datos EST, no se encuentra ningún acierto exacto, lo que indica

25 que a nivel de los genes expresados, es improbable que estas secuencias induzcan efectos fuera de objetivo y desregulen el empalme normal de otros genes. Para estudiar adicionalmente la eficacia y seguridad de terapia basada en AON para LCA asociada en CEP290 in vivo, estamos actualmente generando un modelo de ratón knock-in transgénico que lleva parte del gen CEP290 humano (exón 26 a exón 27, con y sin la mutación intrónica) que se intercambia por su homólogo de ratón.

[0081) En comparación con la terapia de aumento de genes, la terapia basada en AON tiene un número de ventajas. Primero, en la terapia de aumento de genes, un promotor ubicuo o específico tisular se utiliza para conducir la expresión del cONA tipo salvaje que codifica la proteína que se muta en un paciente determinado. Por ejemplo en una prueba clínica para terapia con genes RPE65, se usó el promotor de beta-actina de pollo 35 (Maguire et al, 2008). Usando estos pero también fragmentos de los promotores endógenos, resulta difícil controlar los niveles de expresión del gen terapéutico. En algunos casos, como para la proteína RPE65 que tiene una función enzimática, los niveles de expresión más allá de aquellos del gen endógeno pueden no ser nocivos para la retina. Para otros genes sin embargo. incluidos aquellos que codifican proteínas estructurales como CEP290, niveles de expresión bien regulados pueden ser cruciales para supervivencia celular, y la sobreexpresión de la proteína terapéutica puede ejercer efectos tóxicos. Usando AON, la intervención terapéutica ocurre a nivel de pre-mRNA, y por lo tanto no interfiere con los niveles de expresión endógenos del gen objetivo. Una segunda cuestión es el uso del vector vírico. De una variedad de diferentes vectores virales recombinantes, rAAVs se consideran los más adecuados para tratar distrofias retinales, debido a su relativamente alta eficiencia de transducción alta de células retinales, y su inmunogenicidad limitada. El 45 inconveniente principal de rAAVs sin embargo es su tamaño de carga limitada de 4.8 kb. Nuevamente, para algunos genes como RPE65, este no es un problema. Para muchos otros genes retinales sin embargo, como CEP290 (con un marco de lectura abierto de 7.4 kb), pero también ABCA4 y USH2A , el tamaño de sus cONA en toda su longitud excede el tamaño de carga del grupo disponible actualmente de rAAV. Una forma para superar este problema es expresar los cONA que expresan proteínas parciales solo con actividad residual, como ha sido sugerido para CEP290 por la expresión de la región N-terminal de CEP290 en un modelo de pez cebra (Baye et al, 2011). Otros vectores virales, como lentivirus o adenovirus tienen una capacidad de carga más alta que rAAVs (-8 kb), pero son menos eficaces en la transducción de las células retinales, y los adenovirus tienen un potencial inmunogénico más alto (den Hollander et al, 2010) . Para terapia basada en AON, las limitaciones de tamaño de AAV no son un problema, ya que el tamaño pequeño de los AON y los

55 constructos de acampana miento fácilmente encajan dentro de los AAV disponibles.

[0082) En conclusión, este estudio muestra que la administración de AON a las células cultivadas de un paciente casi completamente corrige un defecto de empalme provocado por una mutación intrónica frecuente en GEP290 que causa LCA. Estos datos garantizan otra investigación para determinar el potencial terapéutico de terapia basada en AON para LCA asociada a CEP290 , para retardar o cesar la progresión de esta enfermedad cegadora devastadora.

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<130> P6037013PCT

<160> 16

<170> Patentln version 3.3

<210>1

<211> 93203

<212> DNA

<213> Homo sapiens

65 <220>

<221> 5'UTR

<222> (1 )..(909)

<223> Inlrón de 318 a 882

<220>

<221> exón

<222> (910) ..(1011)

<220>

<221> Inlrón

<222> (1012)..(1183)

<220>

<221> exón

<222> (1184)..(1261)

<220>

<221> Inlrón

<222> (1262)..(2652)

<220>

<221> exón

<222> (2653) .. (2722)

<220>

<221> Inlrón

<222> (2723)..(3025)

<220>

<221> exón

<222> (3026) .. (3072)

<220>

<221> Inlrón

<222> (3073)..(5430)

<220>

<221> exón

<222> (5431)..(5574)

<220>

<221> Inlrón

<222> (5575)..(10998)

<220>

<221> exón

<222> (10999) .. (11052)

<220>

<221> Inlrón

<222> (11053) .. ( 11651)

<220>

<221> exón

<222> (11652) .. (11672)

<220>

<221> Inlrón

<222> (11673) .. (11796)

<220>

<221> exón

<222> (11797)..( 11949)

<220>

<221> Inlrón

<222> (11950)..(12340)

<220>

<221> exón

<222> (12341 ) ..(12523)

<220>

<221> Inlrón

<222> (12524) .. (13181)

<220>

<221> exón

<222> (13182) .. (13271)

<220>

<221> Intrón

<222> (13272) .. (15778)

<220>

<221> exón

<222> (15779)..(15901)

<220>

<221> Inlrón

<222> (15902)..(16847)

<220>

<221> exón

<222> (16848) .(16971 )

<220>

<221> Inlrón

<222> (16972)..(21050)

<220>

<221> exón

<222> (21051 ) ..(21220)

<220>

<221> Inlrón

<222> (21221 ) .. (21940)

<220>

<221> exón

<222> (21941 ) .. (221 03)

<220>

<221> Inlrón

<222> (22104)..(23473)

<220>

<221> exón

<222> (23474)..(23574)

<220>

<221> Inlrón

<222> (23575)..(23646)

<220>

<221> exón

<222> (23647) .(23734)

<220>

<221> Inlrón

<222> (23735) .. (25071)

<220>

<221> exón

<222> (25072)..(25184)

<220>

<221> Inlrón

<222> (25185)..(27034)

<220>

<221> exón

<222> (27035)..(27119)

<220>

<221> Inlrón

<222> (27120)..(27654)

<220>

<221> exón

<222> (27655)..(27797)

<220>

<221> Inlrón

<222> (27798)..(30358)

<220>

<221> exón

<222> (30359)..(30523)

<220>

<221> Inlrón

<222> (30524)..(30865)

<220>

<221> exón

<222> (30866)..(31015)

<220>

<221> Inlrón

<222> (31016)..(33035)

<220>

<221> exón

<222> (33036)..(33151)

<220>

<221> Inlrón

<222> (33152)..(35118)

<220>

<221> exón

<222> (35119)..(35221)

<220>

<221> Inlrón

<222> (35222)..(35311)

<220>

<221> exón

<222> (35312)..(35542)

<220>

<221> Inlrón

<222> (35543)..(39205)

<220>

<221> exón

<222> (39206)..(39379)

<220>

<221> Intrón

<222> (39380)..(45217)

5 <223> Exón aberrante incluido en la posición 40902-41209 de mRNA de CEP290 mutante del nucleótido mutado A>G en pacientes de LCA en la posición 41034

<220>

<221> exón

<222> (45218)..(45329)

<220>

<221> Intrón

<222> (45330)..(48241)

<220>

<221> exón

<222> (48242)..(48447)

<220>

<221> Intrón

<222> (48448)..(49384)

<220>

25 <221> exón

<222> (49385)..(49536)

<220>

<221> Intrón

<222> (49537)..(51377)

<220>

<221> exón

<222> (51378)..(51489)

<220>

<221> Intrón

<222> (51490)..(52729)

<220>

<221> exón

<222> (52730)..(53185)

<220>

45 <221> Intrón

<222> (53186)..(54272)

<220>

<221> exón

<222> (54273)..(54437)

<220>

<221> Intrón

<222> (54438)..(55718)

<220>

<221> exón

<222> (55719)..(55826)

<220>

<221> Intrón

<222> (55827)..(56043)

<220> 65 <221> exón

<222> (56044)..(56178)

<220>

<221> Inlrón

<222> (56179)..(57364)

<220>

<221> exón

<222> (57365)..(57631)

<220>

<221> Inlrón

<222> (57632)..(58262)

<220>

<221> exón

<222> (58263)..(58370)

<220>

<221> Inlrón

<222> (58371 ) ..(58986)

<220>

<221> exón

<222> (58987)..(59186)

<220>

<221> Inlrón

<222> (59187) .(61821 )

<220>

<221> exón

<222> (61822)..(62035)

<220>

<221> Inlrón

<222> (62036)..(62987)

<220>

<221> exón

<222> (62988)..(63125)

<220>

<221> Inlrón

<222> (63126)..(64298)

<220>

<221> exón

<222> (64299)..(64520)

<220>

<221> Inlrón

<222> (64521 ) ..(64872)

<220>

<221> exón

<222> (64873)..(64995)

<220>

<221> Intr6n

<222> (64996) .(70290)

<220>

<221> exón

<222> (70291 ) ..(70436)

<220>

<221> Inlrón

<222> (70437)..(70767)

<220>

<221> ex6n

<222> (70768)..(70923)

<220>

<221> Inlrón

<222> (70924)..(73571)

<220>

<221> exón

<222> (73572)..(73695)

<220>

<221> Inlr6n

<222> (73696)..(78101)

<220>

<221> ex6n

<222> (78102) .. (78236)

<220>

<221> Inlrón

<222> (78237) .. (79438)

<220>

<221> ex6n

<222> (79439) .. (79525)

<220>

<221> Inlr6n

<222> (79526)..(81222)

<220>

<221> ex6n

<222> (81223)..(81387)

<220>

<221> Inlr6n

<222> (81388)..(82196)

<220>

<221> ex6n

<222> (82197) .. (82319)

<220>

<221> Inlrón

<222> (82320) .. (83196)

<220>

<221> ex6n

<222> (83197) .. (83369)

<220>

<221> Inlrón

<222> (83370) .. (86499)

<220>

<221> exón

<222> (86500)..(86641)

<220>

<221> Inlrón

<222> (86642)..(87803)

5

<220> <221> ex6n <222> (87804) ..(87877) <220> <221> Inlrón <222> (87878) .. (88470)

10

<220> <221> exón <222> (88471 ) ..(88565)

15

<220> <221> Inlrón <222> (88566) ..(91783)

20

<220> <221> exón <222> (91784) ..(91863)

25

<220> <221> Intrón <222> (91864) .. (92802) <220> <221> exón <222> (92803) ..(93033)

30

<220> <221> 3'UTR <222> (93034) .. (93203)

<400> 1

atttgaagtc ctcgttccac gccttctcat catcctgaac accgagctct gqgactccgg cqgagaatct aaacgtaaag catcacccac gqtcgtgaac tgtagqctct cctggcatcc 120 gqgatcttat tctggccttg gcggagttgg gqatggtgtc gcctagcagc cqctgccgct 180 ttggcttgct cqggaccatt tggctggacc cagagtccgc gtggaaccgc gatagggatc 240 tgtcagggcc cqcggccggg tccagcttgg tqgttgcggt agtgagaggc ctccgctggt 300 tqccaggctt ggtctaggtg ggtggatcct tgtaagcagg attagcgagt cactccacgc 360 tcaggttctt tagcctgagg gcccgtgtgc cacagcatag ctaccccgcc cttccagcct 420 cqggtcccta atactgcctt gcttcggttc cagtttccgc cgcacaactt cactcattcc 480 aaatgttaat ttctgcgttt tttttcagcc ccaattctgt ttctccaaat cagggatgat 540 tgteggectt ccacagaece tcgegettgc caggattagg gtgttegege geattgtggg 600 taggggtgtg gaggaaggga tceagaaatc ttaagtatta acttagatta gtgttagcaa 660 gqaageegte aeattttatt tageegggae aetetgaeag tttgtgeega etgetatttt 720 tqateaagge tattttgeee aettgtetat tttgtggeee aattgtetgt tttgetaaea 780 teagaaagtt ataatgaaat aatetgcaaa aaatgtaagg tgetagaaaa eeaataatac 840 tqtgtacctt gaaaatgcta atatacacct gttttgttac agagqtggag cacagtgaaa 900 gaatteaag atg cea eet aat ata aae tgg aaa gaa ata atg aaa gtt gae 951 Met Pro Pro Asn Ile Asn Trp Lys Glu Ile Met Lys Val Asp 1 5 10 cea gat gae ctg cee c~ eaa gaa gaa etg gca gat aat tta ttg att 999 Pro Asp Asp Leu Pro Arg Gln Glu Glu Leu Ala Asp Asn Leu Leu Ile 15 20 25 30 tec tta tce aag gtgcttaatt ggtcaataat aatagatata taeattaact 1051 Ser Leu Ser Lys

tatgattaat ttattaataa aatatgaatt tatttttttc agggaeaact ataattgtea 1111 eaatctggaa gtgttcttat attttgcttg aaggttataa aatataaaae agttgetttt 1171

~~a c~_~~_

etgtttactt aq gtg caa gaa aat 1222 Val Glu Val Asn Glu Leu Lys Ser Glu Lys G1n Glu Asn 35 40 45

gtg ata cae ett tte aga att aet eaq tea cta atg aag gtttgtatgt 1271 Val Ile His Leu Phe Arg Ile Thr Gln Ser Leu Met Lys

50 55 60 agtaggtttt aactataggt ttggctatta gtggaactat aaaaatctgt tcttatataa gqtaatcttt qtgaaaatac ctggtaatat ctacatcacc actaaaaaat qcaatatatt taaatgtgaa ttaaqtattt tagtgtataa aacattqcta gtttctactt aaagtttcta aaagggtqtg tagqqgaaat agaatgagta tgttgaaaaq taacataagg aaatatatct tgaggtccaa atgacaaatg cagacaatga ctgctatagg gatttgttaa gaqqgqaaat gatttaagag atgtcagaag acttcacaaa ggatcaatac tgaggagtag tgttagataa gtggaaggca atgcagtggt aagatagtaa gggaattcta gagctgttgg ttaccataaa taaatactga gaacaggaaa tatgtttatt ctttatattt gaggaaacaa ggtgcagcaa gtttgtagca gactgtagag aaaacaaatc ttgqgtaagt actttgagat aggttgttga gggccttaaa qgtgtatttt atgctatcag caattgagaa ggcagtaaag gttttcgaaa cacaattgat aggtacaaaa atacacctta agaaggcaaa actgagtata ttatgtagga caaactgaag gaaattggag ctttgtagac atcacattat agcggagttt aaacctgaaa ttatggatta gaataatagc aattggaaca gaaaaaaagt agtggaaaga cattacaaag ggagatgttg cattactgga tataagactt gaggacttga ggtaaaaagg agaatcaaaa atgtttcatg ctattaaaaa tctagaaatt gtagtcttaa gtaagaaaat tgcctggcat gqtggctcac gtctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggcaggagga ttqcttgagc ctgggagttc aagactagcc tggataatat agtgagtcct tgcctgtacg aaaaaatttg ccgagcatga tggcacacca agcatgatgg cacgccaagc atqatggcat gcacctgtag tcccagctac tcaggagact gagatgggaa gattgcttga gcccaggagg caqgaggttg cagtgagctg agattgtgcc actgcactcc agcctgggtg acaaagtgag gccctatctc aaaagcaaaa aaaacaaaaa caaaaaccaa aaactattta ttcagcaaat atttactgaa cgtctccatg tgccagccat tgctggcact aaggatcata acaaataaaa cagaattttt attttcagtg cttacattcc agtataaagg catattgaaa taaccttttt ttaatgttta

9 atg aaa gct caa gaa gtg gag ctg gct ttg gaa qaa gta gaa aaa qct Met Lys Ala Gln Glu Val Glu Leu Ala Leu Glu Glu Val Glu Lys Al. 65 70 75 gga gaa gaa caa gca aaa ttt 9 gtaagcacct tggaaaaagt ttattatggt Gly Glu Glu Gln Ala Lys Phe 80 attaaataat gaattccatt tgttcattaa actgtagaaa attaaattat attctataaa atatatatat tcagtttatt tttaatatat aacatttaat aataaatatt tctagactcc tattttatgg atctgccata taatactttt tgttacctta taatcatgat ggactctttt aaaagaatta attttgttat tgaaatttat ttaaaagttt gttttgtggt aactaatcaa 26

1331 1391 1451 1511 1571 1631 1691 1751 1811 1871 1931 1991 2051 2111 2171 2231 2291 2351 2411 2471 2531 2591 2651 2700

2812 2872 2932 2992

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ttagatgacc aaatgatttg atgttcttgg ccatgacctg aattaacaag actgtgaggt 4772 aaaatggatt taatcggcta caaatcttaa gataaccaaa acctgagctg tttaatatgg 4832 tagcactagc actaaccact tgtagctatt tatatttaca ttqgttaaaa ttaaaatgaa 4892 aaatttagtt cttcagttgc actagccaca cttcaaatgc ccqaacatag ctacatgtag 4952 cgagtggcta ttgaactgga cagcactgac agcatgtcca ttatgctaga aagtcctatg 5012 ggacagcact gqtctaaaca gtgcatggta tgagagaaag ggcaggttaa ggcactcagc 5072 ttcactgact ggggtggaga ttctgatggt ttgtactcag gttccagatc cctgaggctc 5132 aqgaaccttt gcagtttagt ctggttacct gtggcccagt ggttacaaca gaatgattaa 5192 cagtcaattc tttgcatctc tgggtggctc aggaaaaatt taaggagtta ttagctgtga 5252 actaacctta agtaagttaa attaaaaaaa aaaaagttct taagctaata tgattttaaa 5312 tatctgcact gaagtataat gcaaatttaa attcagcata attatttgct tgttgttgac 5372 tcatttgaac ctcaaaatat aatgggatta atttatactt tgggtttatt actttaag 5430

atg gct cag cag tct gca ggt gga cga gat act cgq ttt tta cgt aat 5478 Met Ala G1n G1n Ser Ala G1y G1y Arg Asp Thr Arg Phe Leu Arg Asn 100 105 110 115 gaa att tgc caa ctt gaa aaa caa tta gaa caa aaa gat aga gaa ttg 5526 G1u I1e Cys G1n Leu G1u Lys G1n Leu G1u G1n Lys Asp Arg G1u Leu 120 125 130 gag gac atg gaa aag gag ttg gag aaa gag aag aaa gtt aat gag caa 5574 G1u Asp Met Glu Lys Glu Leu Glu Lys Glu Lys Lys Val Asn Glu Gln 135 140 145 gtaaagcact ttttttttcc atgaatcttc actgttcaag ttacctggct ttttattatt 5634 attggtaaca atatcaattt ttatattgta tgttatattt gaaaaatgat gtacacttat 5694 ctctaaggtt ttatatcact gttcattttg tcatcaccaa ttttaaaata taatggtact 5754 tctagtgaat atgacttgaa gattaattct ttatatttgg aagtacattt ttctcaggac 5814 atcaaacttg ttacctaaaa ttaatgcttt tgtctggaag attggtatca agtaactaat 5874 agattttcat aaagaagtga tctttctagt gccatagttt attttgggta aaagttatat 5934 ttgttcattt caatgtattt atatgattag tagattcgca aatgaatctt tcgatatatt 5994 caataatggt taattaaata tcttgttttt ggttgtacct tattttatgt gagatatata 6054 tatatatgta tagtttttga aaagttgtgt tcatgtcagc agtttataaa tcacatattt 6114 aaaataacat ttttaatgca tagtttttat tacctcgtta ttccttgtta taaactaata 6174 attcttgcag tgttcacttg aatttagttt taggaaaaaa gttttttgca gatcaacttg 6234 tatttcctgg aagaaaattt cctattttac ctcagcttcc tatttaatgt attatttatt 6294 tatttactta acatttattt gttttttatt tcacctgaac tgttagtaaa cttagtaaaa 6354 tttggtgcct acatgtggta actgtcctgt cccttatact cagaaacgtt ttccaccttt 6414 28

gtgtccttta gqtcattgtt gtgttatatt ccatttattt cagaaattga gggtcataca ttttaagaaa acaatgatat ataaattgat ttqtaagqaa aaqtatcccc attcttcatg gttgaagaat catatagaag ttagctatga aaacaatqtg tgccacttaa atqttagqaa gaagctctta gagcattatc atagcagaca tqtggatttt ttaataqtca tcaaggatct agaattgctt agggggatqt ctqtgqtttt ctggactttt atcaqttgac ttatcattca taccacacac ccttagctaa tatatcttag actattqtct tttttcatag tcacacacag ctgtgttcct ttttggctgc tcaattcctt gagatgaaat caattacttc tttgccqtta accaqtcatt caqttttatt aggctgctag ttactaqtga tataqtgggc aactatgttc aqtcaataat aagcataaca taqtgataat atgatactta ttctggcata ctctggagag agataccgta atcagccttg aaactgagac ctgaagtata gttagactgg taagaggaat ataaaagaac attctgggta gaagatatag catttgctaa tatggagtat ttaggaaact acagttattc attttgactg ttcatagaqt ccttactatg tgccaggcac ttcatatgca tgatacttqt catatgagat agttqtcatt tctgccatga cacagaaaga gtaattgccc atggttgcac agcttataaa aacagtctta ctcaagagtc tgtgctatct tgccttccca ctggagagat aagcaagggc cagttcctaa tgaatttggt gtgaagagtt ttgagcacag gatatcatga tcagatctat tttgtagaga gtggattgaa aagggccaag actagtaagg ggaagtgcta atgatggcat ttgcctgaga aagacaagtg qqatqtqqtq aatqtaattq qttqttqqaq qaqaqqqaqq tgtggqttgg gccactaaat agqtagatag tgccattcat atttggaaag cttgagatta tttcagtttt gtagatgttg atattcaaaa agggtatctg tggatatgga attcacaaga gatttatgaa tcatcaatqt agacattatt gaagccagag tctgagaaat gtctaataaa gcaatgaaat aggaagagtg

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Leu I1e Leu Ser Ser Lys Asp Asp Glu

315 320

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aat gct cag ctt gat gct gat aaa agt aat gtt atg gct cta cag cag 15901 Asn Ala Gln Leu Asp Ala Asp Lys Ser Asn Val Met Ala Leu Gln Gln 340 345 350 355

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qcacagagca aaacagaaac atacaaaatg gtaaaaaggt ggaattgaat gqaggatgag 16561 qaaagtaaca tataaggaag tatagaagcc ataaacatta gggagttctg gaaatcctat 16621 tttccagagt gttagccatt atatccatct ttcagtattg gagtaacagc agtgtaccta 16681 tcattgtgta ttacagttga agtgtacaaa atggtaaaag gcatacttgt acccacaaga 16741 aaatatgttc tacagtcttg ttgaaaaaaa tcagacgtac ttttttcctt acctttttag 16801 gttaatattc atgaagggat atatattgtt ttaaaatatt ttataq ggt ata caq 16856 Gly Ile Gln

qaa cga gac agt caa att aag atg etc acc gaa caa gta gaa caa tat 16904 Glu Arg Asp Ser Gln Ile Lys Met Leu Thr Glu Gln Val Glu Gln Tyr 360 365 370 aca aaa gaa atg gaa aag aat act tgt att att gaa gat ttg aaa aat 16952 Thr Lys Glu Met Glu Lys Asn Thr Cys Ile Ile Glu Asp Leu Lys Asn 375 380 385 390 qag etc caa aga aac aaa 9 gtatttttat aaatatatag ttattttata 17001 Glu Leu Gln Arg Asn Lys 395 tacaattatg tttttaacga ctttattttt attaaaataa aatgtcaagt caatattgag 17061 ttttctccat ttgaatttta tattttcaaa aaattgtaca agatatttat tattatactt 17121 atattactag tqcttacatt tgtaaatgat ggatgcattt tctattattt ttctcctctg 17181 gtgaaaatta cattaacgtt tattaccagg tcactggtat gaaagaaatg aaaaattgtg 17241 atacaattat ttttatttaa ctttttataa ttaacaaaga atggaagata ataaaatttt 17301 qaccagtgta acagcattgc agatagtttt cagaggtaat ttcacattaa tcttacccaa 17361 attaatgttt catcatattc tccttaccct gagccatatt acctttttta acacatcaaa 17421 ttctatgaat ataagttctt acaatatctg tgttgttata tttccatagc actacatact 17481 atagttatgc cagggcacac tagtgcgaac tgttcatggg aaattcatgg acatgtttat 17541 tataattggt gactatgtat atatgtatac actacattta tacacacgcg catggaatca 17601 ctatttcttc ttcatgtcat atatatatac atatatacac atatatatac atgtcatatg 17661 tgtgtgtgta tatatatata tttgtatata tgacatgaag aagaaatagt gattccgtgc 17721 acatatgtgt gtgtaagtgt agtgatgtgt ttgcaggtac ggttgtaatt tcaaaaatga 17781 agcaaaagcc ttgctcagga gataattgaa ccaatactta aaggaagtaa aqgagtqaaa 17841 catgcagatg gctctaagca gtgggaataa gttcaaaggc agtaaagcag gagtgtacca 17901 atcatgtctg agaacaacaa agaagtcttt ttggctggag tagagtcagc aagtgaqgca 17961 gtgataagac cagagaggta aacagaggcc atatcatatg gggccttata gttcattgtg 18021 cagacttggc ttttaagtga gaagggacac cggggaaagt ttctgaagat agaaatqata 18081

taatttgact taggctgtgt ttgcagtaga ctgtaggagt acctgttaga agactattgc aataatctgg agaaaagtga gtagcagtgg agttactgqa tqcagcagtt ctgqatgtat aatttgctaa cagatcagat gtaqgatgtg agagaqagag agttttggtc atggtggqgt tgtgqgaaga gcaggttgaq ttagacatgt taggtttgag atgcttatta gacattcaaq ttgtatataa aagtttaagg tttaggacaa caatctaggc gtctctgtaa aagtaattga aataatgagg ctggctaaga ggttaagaag aaaaatctaa agagcttcta ctttagcagc accaaaggag actgaaaagg aaagcccaga gagctaggag gccctgaaaa ccacatgagg aatgtaacca aggaagaaga tgttcattgc tgctgatagg tcaagatgat cactaaaagt ggtcattttt gqttcaaqag aaaatgggta gagaggaaat cccttttcca ggactgtttc tataaagaga aqgagaaaac aagagggatt aagaaaacat ttttctcttt aagatggaag ttaataggag agctccatta aagaagaaac attaatgaat acttctggaa caataatatt tttaagaatg caatgggatg agaggttggc cttaactagg aacacagagt tcatccataa tgtatagata tcgatgtagg tggcttggta gacatcctgg tctaaactgg ttgctgcttt tttctcagtg aacaagggag gaggatagga gaagatgttt cataagtttg aggagaaaga tggtcatctg aaagattgaa gacgtggaga atgtggtatq gcccacgata tatatatgta tttctattta tgtgtttatt tgaaagtagt ttaaactgct ttaaaaggat gactaatagt ttactaggag aaaaagtqgc aattqatctc tqctgtcaaa ataacacttt aqtcagtccg tagttatata atccctaaaq tagactgtac tctacatctt gaacttaact tqtaaaacgt cttcataaga ttaggattag gtttagttat caggaacaga aatcaagata gacatttatt tctcatctat gtaatggcct gttgccttca tctgccccat ccaaaatgga tggaatgcag ccaaacagca agacagagga agaggggcaa gagttaaaag ggtaaatata gtgtttattg tqtagggcca tgtggaagaa ggtaaataag aatcagggag tgqtggtttg ggqcatggtg tttqaaagtg ataaaaatqq aactcttggt ctgaaccaaa agataatcag gtacttaatt tgaaggtgtt aagtaggcac taaagatatg tttggtaact tcaccaaggg agtaaatgta tgqggagata aaaaggagct gaaaagcagg agtatggaga aacaactgct ttcagagctg tgactattgg acttagcaat gtaataaaga aatataggaa aaggtggtag cttqagggga aaataactca tgattttagg caatgaagtq gagagagaga ggatcctagt gtgccagtga ttgtagaaaa gaaggtagag taatgggaat ttgtggaaqt caaggttctt agctgaaggt agagaagtga aagtataaaa actqttgagt aacttcaaga atatttgtat cagaacactt atqgattgtg cgtattctaa taaggaaaag gacttatctg ctcacaqaag gtgtgtgtac aatggctaat ggtattcttc gaqctgaaga ataatggcaa agaattaagc attccagggt ctttatctca tgtctgtgtc catqtgctga aggataggca tgatagqaga atagatatgt

18141 18201 18261 18321 18381 18441 18501 18561 18621 18681 18741 18801 18861 18921 18981 19041 19101 19161 19221 19281 19341 19401 19461 19521 19581 19641 19701 19761 19821 19881 19941 20001

ggatggaagg gagaatagat aetgggggae aaeteageet gtgteatgtt ceaeagetta 20061 gatgttaget eeagaeaget gtgeteattt ettaaaaaet tttgtgatet caaaegtaet 20121 agttttatge etaagtecaa tattaaatat ataaeetata tattagtaaa tqettataat 20181 gaatgagtgt gagaatgate tgteaateaa ttttggaatg atageaatat tatgttttgg 20241 tettttaaea atttagtaag atattaeaag taggeattta ggaagttttt aqettagttt 20301 ggattaaatt tagetgeaag tgaeagaaaa ateaageata ataeaataat ttaaaeaaga 20361 tagaaattta tttetetata atatagaeaa agttgaagea aetagggeag gatttgtgtg 20421 aeagatgete aaatatecee tateaggaae eetgtetett gttgetgtge ctateteaae 20481 atgtggtttc taactcatgt gaagttqeca cecteatatc eatgtqqatt tcaqetaqca 20541 ggaaggagga aagagaagag agattaetee tttattttaa aaaeattttt tttttttttt 20601 ttgaaattea eatatgaaet ttgegtttat atteeattae tgaeatgaee aeaeataget 20661 gettgtgtgt aagtggaaat ttagttettt attteaaatg geeaegtgte aagetaaaaa 20721 teeatagttt tagtaeagtg gaeaaaaggg aggttaaata ttaggaaeag ctageagtet 20781 gtateacaat gateattttt tgtaaageag tattttgeaa eettttaaaa teeataeeee 20841 ttcaqetaaq aaqgttttae tqaactteaq ttttttagta aattgtatta gtaaaaeeaa 20901 aaeaaaaett teatettaea aatataaaat gaeaaettta aaggattttt ttttaatgge 20961 ataecacttt tcttgceace atgttgggat cactgatttg aaggaataag tagteaatte 21021 aatteatgat ttttqttttt aetetgtag qt get tea aee ett tet eaa eag 21073 G1y Ala Ser Thr Leu Ser G1n Gln 400 aet eat atg aaa att eag tea aeg tta gae att tta aaa gag aaa aet 21121 Thr His Met Lys Ile Gln Ser Thr Leu Asp Ile Leu Lys Glu Lys Thr 405 410 415 420 aaa gag get gag aga aea get gaa etg gct gag get gat get agg gaa 21169 Lys Glu Ala Glu Arg Thr Ala Glu Leu Ala Glu Ala Asp Ala Arg Glu 425 430 435 aag gat aaa qaa tta qtt gag get etg aag agg tta aaa gat tat gaa 21217 Lys Asp Lys Glu Leu Val Glu Ala Leu Lys Arg Leu Lys Asp Tyr Glu 440 445 450 teg qtatgtattt ttatettgte atteaaggag ettagaatta ttettgccat 21270 Ser

teacagaeta ttctgtgcta tttaetgcat aeeatttaaa aaaeattcea taagtatett 21330 ttgataaaga ttateetcat taatttatae taaactattg aaaeetttga geatttaett 21390 tttgeeagaa ttgttttcaa aettttgate aeagtgattt gteeaaataa teagttttgg 21450 tgaageagea gqattaettt tttttattat etgtgtteat tgggecaeea tgtagatgtg 21510

acaccactgg ccaatttgac agaatttatg acaggaacat actgtgtcaa tacaacctgc 21570 tctccacttt ttatactttt tcattggtta caactaattc aagcaactaa tgacttactt 21630 attctactgg tattgctgat ttgcttttac taattctttt agtattttgg taagtgtttt 21690 ttatatgtaa tgcatattca gagteaettt gectttagga tattataetg gaaagtttta 21750 aetgttgeat attaeateat tattattaet ggatttggtt tataaaagea eaataaaaaa 21810 eeagtgtaat gatataaatt ataggeatat gtaeatttte etttagaett agtaaaaaaa 21870 aaateatgaa ettgataaat ttatteaagt aaaceatgtt atattttaaa ttaaattgga 21930 tatttttcag gga gta tat ggt tta gaa gat get gte gtt gaa ata aag 21979 Gly Val Tyr Gly Leu Glu Asp Ala Val Val Glu Ile Lys 455 460 465 aat tgt aaa aae eaa att aaa ata aga gat ega gag att gaa ata tta 22027 Asn Cys Lys Asn Gln I1e Lys I1e Arg Asp Arg G1u Ile Glu Ile Leu 470 475 480 aea aag gaa ate aat aaa ctt gaa ttg aag ate agt gat tte ett gat 22075 Thr Lys Glu Ile Asn Lys Leu Glu Leu Lys Ile Ser Asp Phe Leu Asp 485 490 495 gaa aat gag gca ett aga gag egt gtg 9 gtaageeatg ttttaagtta 22123 Glu Asn Glu Ala Leu Arg Glu Arg Val 500 505 eatagtttge geaaeetgat ttaeaagtet ttttttttaa tttaaatttt gtttattatt 22183 atttattaag tagtttaatg etttttteaa atgettttat aaaaeattta ataeaaataa 22243 aagtggaget aacetgattg aagtggaate agattttatg ggqttggagt ggtgggtggg 22303 eagggetgga acattgettt atttggtcta gcatctcctc agtaatagct gcttgtttaa 22363 aaagatgaaa gtttattaat accacatatc agagattaac cttttttttt cccaacaaaa 22423 gtagggtctg tattacccat gtttgtttgc aaaatgctct tgtaacagat gaqatattta 22483 aacttcttgc tctgtgttgt gattctcctg cctctgccte ctgagtagct ggqattacag 22543 gtgtgcacca ctatgcccgg ctaatttttg tatttttggt agagatggga tttcaccatg 22603 ttggctaggc tggtctccaa ctcctgacct taagtgatcc acccgccttg gcctcccaaa 22663 gtgctgggat aataggcatg agccaccgcg cetggcetgt taaaatettt taaagatttt 22723 taagtacttg atttttataa tttagaetae ttaegtttta etttgttcga gtattttaag 22783 gagtaattag taatatagct tgagagttta tatatttatt ttaataaata gcctattagt 22843 taatattact aatttgagtg ttatgatagt gcagactaag ttgctgcttt aaaatgaaaa 22903 taaatateta aatateaatt teattattge taaattteat ttaatgettt ettagttaaa 22963 aatgatcatt tqtaaaaact attatctaaa gaaaagacaa atagacaaat aaqtatttta 23023 tacagatata tatgtgtgaa aagtatctaa cttggatccg tagttgtgct agqaccccaa 23083 attagacttc tgatcaactt ggactatcag atcacagcct tctgatcaac ttqgactatc 23143

aqatcaeaqc caagaatetg gaagttccta aagatgactt ctggcecgtc taggtagctg 23203 tcatagacat catattttct gtgcttaaaa aqctccaaat cttggtttat aatttcattt 23263 aqgtttttgt taggatttcc attaataatt gtgataaaat tttaaettgg gttacagttt 23323 aaatatetgg aaaattcttt cacagaaagt tacctcattc ttcagtgata ctggctaagt 23383 gaattataac cagttgcttg atggtatatg aeatttttgc aqcttatttg aatgttttta 23443 agtttttaat tatattgett tctattgtag ge ctt gaa cea aag aca atg att 23496 Gly Leu Glu Pro Lys Thr Met Ile 510 515 gat tta act gaa ttt aga aat age aaa cae tta aaa cag cag eag tae 23544 Asp Leu Thr Glu Phe Arg Asn Ser Lys His Leu Lys Gln Gln G1n Tyr 520 525 530 aqa gct gaa aac cag att ctt ttg aaa gag gcaagtgtgg tagtcagttg 23594 Arg Ala Glu Asn Gln rle Leu Leu Lys Glu 535 540 attattttct tggctgaact atagagaaat actaataatt tatactttgc ag att gaa 23652 rle Glu

agt cta gag qaa gaa cga ctt gat ctq aaa aaa aaa att cgt eaa atg 23700 Ser Leu Glu Glu Glu Arg Leu Asp Leu Lys Lys Lys rle Arg Gln Met 545 550 555 get caa gaa aga gga aaa aga agt gca act tea 9 gtatactcag 23744 Ala Gln Glu Arg Gly Lys Arg Ser Ala Thr Ser 560 565 570 ttattctaaa cetttaaaaa gaattattga taagtgagtt gtctggatat gaaattattt 23804 gtgtcttagc tgtttttgct gttctattgt ggatctgcta caaatttaat aaatgaeaat 23864 aataacetga aggagataag tqagtgtcag tqggttcagt cctgaatctg aaatagacaa 23924 aaacaaaaca aaacaaaata acaaaaacea aqcaaacaaa aaagaaaaaa aecttagaat 23984 tatggaattt ttgaaaagtt ttatagtata gtattttaat ttctagacag caccaatatg 24044 ttgttattaa taataataaa acttagtagt ttttatgtta atatatgtta ctcaacattt 24104 tccctttcct taaggactat gcattgaaaa gcttttcttg taagttatta ttattattat 24164 tattattaat atttgagatg gagtctgtet tgttctattg cccaggctgg agtgcaetgg 24224 tqcgatettg ctcattgeaa cctccgcctc cegggttcta gtgattcttg tqcttcagcc 24284 tcctgagtag ttgagactac aggcgtgagc caccacgcct gacttatttt tgtattttta 24344 gtagaaacag ggtttcaeca tgttggccea gqctggtctt gaactectga cetcaagtga 24404 tecatceact ttggctcecc aaagtgctgg aattataggc gtgagecacc atgcctggcc 24464 ttaaattatt cttttctaag tgaaagtaat gttttattga atataaatta acatctttct 24524 tqggtttatt ttacttgagc taaagagaac agttggttaa gttttataat aqccattgca 24584

gtgctttttt gtaagaagac cacacagaag gactgtcttt ttcacttgcc ccaaatcccc 24644 aagcacgtat atgagtaata gcagagtggt tctttttagc attatgattt ctataataca 24704 tccaaaactt tctcaagaaa aaacttcatg atttattagt acaataatca gtttactcat 24764 tactcatcat ttatatttac tttatatgtc ttttaactgg tgcttattaa gtagcacttt 24824 aatatagaat aggcaaagaa tggtagagaa gatgaaattc aaaaattagg ttctcacatt 24884 attaatagtt cattaaaagt gagctaaatg agaagcttgt attggctatg tagaattttg 24944 gagggatttt ggaaacaatt attctacctt tgcattaaaa cttgattgta ggttttaaga 25004 attaaagtgt tgqaatagta ggagggttat tttaatgttt ttagtttgtt aattctctta 25064 tatatag ga tta acc act gag gac ctg aac cta act gaa aac att tct 25112 Gly Leu Thr Thr Glu Asp Leu Asn Leu Thr Glu Asn Ile Ser 575 580 caa gga gat aqa ata agt gaa aga aaa ttg oat tta ttg agc etc aaa 25160 Gln Gly Asp Arg Ile Ser Glu Arg Lys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Lys 585 590 595 600 aat atg agt gaa gca eaa tea aag gtaatagtaa agtattgeaa agagagtaaa 25214 Asn Met Ser Glu Ala Gln Ser Lys 605 gqaaaatatt tttttttttt tttttttttg agacggagtc tcgctctgtc tcccaggctg 25274 gagtgcagtg gcgegatctc ggctcactgc aagctccgcc tcccgggttc atqccattct 25334 cctgcctcag cctcccaagt agctgggact acaggcgccc gccaccacgc ccggctaatt 25394 ttttgtattt ttagtagaga cggggtttca ccgttttagc cgqgatggtc tcgatcttct 25454 gacctcgtga tccgcccgcc tcggcctccc aaagtgctgg gattacaggc gtqagccacc 25514 gcgcccggcc agqaaaatat ttttattgtg ttttcatttc ttcccccttt atctcattct 25574 tgaacatcta atcttattat tqttgttaaa taagtagagg gaaatatttg cttatttaac 25634 ctgttgattc aaagattgat taatgagaca ttatttactc tgaatacaga ttaggagttc 25694 agataaagca gagctgctgc ataggagatc atcattcaat accccacagt cagatcagaa 25754 tgagacagaa gaqaatatga ccataggatc attatcaaga atqttatctg aaattcacca 25814 tagtgtagaa agtggaatgc atccttttgt ccctttaact agactttctt catccatgca 25874 agttaaagag aattcaacte cagaaactat tacaataaga gaqattttta aagcaccatg 25934 tctgcagtct tcaagaaatc tagaatcgtt agtcagcacc tttagtaggg aaagccatga 25994 aqaaataaat gacatatgcc ttttttctga tgactgtatg aagaaggtgt caagaagcca 26054 tcaagcacta qagaagacta gttttgtaca aaaaagcaat tcatcttttc atqgcttatc 26114 aacagcttca gacataatgc agaagttatc acttaggcaa aaatctgcaa tattttgtca 26174 acaaattcat gaaaatagag ctgacatgga taaatcacaa gtagcaacat taqaagaaga 26234 acaggttcat tcccaagtaa aqtatgctga tatcaatttg aaagaagata taataaaaag 26294

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670 675 680

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6B5

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690 695 700

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705 710 715

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775 780 785

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31055 Leu Leu Gln

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tcaaggcaga tactttagag ttattctgta gtcattcttt ccaaatgtaa tttatgtgtg tcttcttcat cctcgcagct catcatcact catctggagt tccacaatgt ctttctggct tgaccccttt attctccaca gtgcagccag aatgattgtt ctttaaattg ttttctttta tacgttaagt taaattccag tgccctgcct ggtgtggccc ctgatggtct ctccaacttc cttatttttg cttactctgc ttgggtgctc cagtcctcca atttcaatca ttttttcctc tcagatctta tagtattcca catctgggtt tactaataaa tacttcgtac ctcacagttc ggtggttaag acatccttca accgctctat ctaaatgttc caqtactctg tttttatttt ctttctaaat gtcaactttt cactqttgcc caggctcgag tgcaqttgca caatcatagc tgggatcaag taattctccc acctcagcct ccaaaatagc accatgctca gctaattttt tqtgtttttt tqtagagatg ggctgqtctc aaactcctgg actcaaqtga ttctcccacc gqttacaggt gtgagccact gcacctggtc gatactgact aqttttgctc tgttgcccag gctagagcgc agtqgtgtqa cacctcccag gttaaaggga ttcttctgcc tcagtctcct aaqtgccatc atgactggct aatttttgta tttttagcac ccaggcttgt ctcgaactcc tgacctcaag tqatccaccc tgqgattaca ggtqtgagcc accgtaatcg gccaacattg gtttgtttac ttgcttatta tctgctgcct tccacactct ccacacacac ataggcactg aatgggcaga actctgaagg tcactgtaaa catcatcatc tgtcactgat ggcacactag atgaaggaag taagcactag tttgtgaagg ctgcaaaact tggccaaaat gaatgtacag ctttagtggc aqaagctaat tattggataa cacaggattt ggatgattat tttaaaataa tgtgtgtgtq tgtgtgtgtg tgtgtgtatg tgtgtgtgtg tqtgtattag tccqttctca tgctgctatg aagaaatacc aggaaagagg tttaattgac tcacagttcc acagagctgg caqttatggc agaaggggaa gcaaacacat ttttcttcac

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ttagaacaca ttttagatcc tattgagtta aataaatcag agtcaagacc aaacaataaa 74455 taaagtcaat ttacgtcaac aaatggtaag ttggcagatt ttaactccct ttttgaaaat 74515 gaaccatgat cctaaggttg gtaaaattaa tcaagaatgt tgtcaaaatg ataaagataa 74575 aaatgaggaa gagaataaga taggcaagag tgagaaagga aagagacaca tagctgaaaa 74635 tgtgagtcac aacaactaca tagatccgta gaatctgcta tggaggactg tgattatgtg 74695 acagttgctg atgccgtggc ttagtgagct gagggtgatg cacaggcagg cgatgtaact 74755 gatgcgtcag tccagccaag aaaggacgcg tccctggttt ggctacgtgg ccgtccttta 74815 tttctttgtt aactgaattt tcttatagta aqtagcttac gtacatatat aqtgcaaatg 74875 ggaaagtgtg taagatttag aaaaagcatt aactattagt aaactttatc ttaagctcta 74935 acttttgatt aqttcctaca aaaattagtg aatatgcatt ttctaattta gtgctttttt 74995 tttttttaca attggtgttc acttaatgtt atattagata aatgaatagc aaaaataagg 75055 tactttagag ttgattgttt tgccttacaa acttctaatc catccagctg tatttagaag 75115 taagatctca ctacagcgaa ttatatcagt aaaattttgt tacagtgttg tgcagtgtcc 75175 taagatgtat actaagttcc ttcagtggct ttttttgcca tgttttataa cagataattt 75235 tgttataatg aqaaaaggaa acttggatgt gttgctgtct atattgtgtt aqgctcaggc 75295 aggatgctgt gqcttactca tttaatcact ttgggaggca ggggcaggaa gattgcttga 75355 ggccaagagt ttgagatcag cttgggcagc atagccagac cctgtctcta caaaaaattt 75415 agacagatgt gqtggaacac atttgtagtc ctagctatta gggaggctgt gqtgggagga 75475 tcatttgagc ccaggagttt gatgttacat tgccctattg cactccagac tgggcaacag 75535 agtgagacct gtctctaaaa taataataat gataatgata aatggtgtta gqctctgtgc 75595 ctaagtatat ttttcacata gqctqggtaa aqtqqctcat qcctqcaatc ccaqcacttt 75655 gggaggccaa gqcagcagga gcatttgagg ccaggagtca aagaccagcc ttgagagacc 75715 ccatctctac cagaaaaaaa aaaaaaaaga aacaattagc tgggtgtgat tqtgcacacc 75775 tgtagtccta gctactcggg aggcagaggt gggcagatca cttgagccca ggagtttgag 75835 gttatagtga gctaagattg tgccactgca ctccagactg ggcaacagag caagactgtc 75895 tcaaacaaaa acaaacaaac aaaaagcact ttgcagaata tcagtctaac tctacagttt 75955 atggactttt tatqtacgta ctacttttgg ctagcttaca ttgagataca gaataaaagt 76015 ttgttcataq catttatcgt ttttttcttt atactgtcca cctgagatat tccagtcacc 76075 taagtcatgq aaacatcaac taaaattaaa tatctatgtt aaqaqaaaat gqctgaaagt 76135 gatttaattc ataacacttt ttttcacatg ctaataaata agagtttgag acttccacta 76195 ggcattatct ctaactccta tccactaaga atttgatttt aaqtagttga tggcttttaa 76255 ccggattatt cttctgtaag agtttggaag tctcgtgaag ttcgttatac aagaattctg 16315 tttacaagag agcattacat tagaatttgt ttttcagaaa tttggactat ctcaacgaat 16315 acctttagtt ttattatttc aaaatgcaag ggaaaaaatg agccataatc actaatagta 16435 actgcatcat attttagtga gaaatgtgtt aaaaatatcc tcatgtgaga tcttccttag 16495 atagaattac cctctactct aatatttaat atattttata tctaccaatc agtgatatta 16555 ataggtgttt atcatttgct gaatcaaata ggtacaacag aagacaggaa gtttgggaga 16615 tagaagagct cagggacagg aaatcacaga tgtccatatc tgaaataacc ttaaaagtta 16615 tcctgtctaa tgccttcact tataaactgt agtggtagaa tttgcctagt attaacctaa 16135 tagtggtaga tttgaatgta tacttgggct ttcttattaa gtggaaatgt attcctgtga 16195 tttacatata tcaacaaaaa tgtttgtctt cttttttttg ctacgacata tgtgcatgtg 16855 cacacacatc tcctcaaaca aaaatcagat ggacacatgc agtcattgga tctaaaagat 16915 gttataaagt tgtgtataat aggtatttta taataatata ttttaagacc cataatgtcg 16915 gtggagtaac tgactttaca gcccatcaag ccaatagaga gagaaaggag aaaaaaatga 11035 aagttgtgct gaataattaa aaaaaattat ttcctatgat gcttataaca gtcctatgag 11095 gtaqgtqgta ttctaattta taqaaaaaat qcataqaaaa atataattaa qcacaqttaa 11155 aaaaaataaa gtttagaatg agaagtaaca acataaataa tgacccaatg tagattcagg 11215 tcaaaagaaa tgaaaatata atattaatgg ttttcaaaga gggaaccatt actttagctc 11215 aaagaatgaa ggagggcttt ccgaaggagt aaagaattat ggcagttctt ttgtagccta 11335 gtgtattcat ttgctaaggt ggctgtaaca gactactaca gatttggtgg cttaaacaat 11395 agaaatttat ggtcttagtt ctggagacct agaagtccaa aatcaagaca tcagcagggt 11455 tgatttcctc tgcacaatca gagggaaaga tctttcccaa tcctctctcc ttggcttata 11515 aatgtccatg ttttccctgt ttctttttat catcttcctt ctgtacatgt ctctgtgtct 11515 aaatccccaa attttctctt ttcataagga taccagtcac agtcgaatag ggtttaccct 11635 gaaatctcat tttaacttga atacctctgt aaaqacccaq tctccaaata aagtcacatt 11695 ctqaqgtact qqaaattatq actttaatat ataaatgtqq aqggtaaggg gaacacagtt 11155 caacccataa cggttagata acaatcgtgc tttattttgg actagtaaaa ccaccataga 11815 tcagtttaac cattatgaaa ttatacatga aggcattata tgtatggaca ttattaagtc 11815 atacttgctt tgcttccatt gtaattaaaa caaaccatac tacctttgtt ctgcaagttt 11935 tgtattctaa cttatttatt tttggctttc accagaacac tccgattttc tcatattcct 11995 ttgaggaaaa aaagttacct tttgacagta ttttcttatc cagtatgtct tttatggctt 18055 ttatttatta aactttaaaa atattcctaa tttcatttcc ctgaag att tea gqa 18110

Ile Ser Gly

ata gag tea gat gat eat tgt eag a.ga gaa eag gag ett eag aag 78155 Ile Glu Ser Asp Asp His Cys Gln ~~g Glu Gln Glu Leu Gln Lys 2050 2055 2060 gaa aae ttg aag ttg tea tet gaa a.at att gaa ctg aaa ttt eag 78200 Glu Asn Leu Lys Leu Ser Ser Glu ~,sn Ile Glu Leu Lys Phe Gln 2065 2070 2075 ett gaa eaa gea aat aaa gat ttg c:ea aga tta aag gtgaatttaa 78246 Leu Glu Gln Ala Asn Lys Asp Leu Pro Arg Leu Lys 2080 2085 2090 tgttttttat taggaaatet aatgeetaaa ac:teetteet tagttgttat gtttaetttt 78306 attagettat taagaagtea aaaatgeata tt.eetaatat ateatggtga tggtataett 78366 tatacatttg ctctttagca tttatttgtt ga.aggcctac tttatattaa acactcctcc 78426 agatgctggg aaacagcagt caaaaaattc ct.tatactca taggaettac gttctagtgg 78486 agaagactga caataaacaa gteactaaat ag~atgtcat ctgatgttag tgctaaggag 78546 agaaataaag catgattggt gtaaagagta tgrgggagaga gaaggggtgt aactgaaaat 78606 agagtagtaa gggaggtctt ccttaataag at.gatatatg aacagagagc taaggagggg 78666 taaaggaagt gagtcataca gatactagaa aa.ataattac agacaacaga aatageaagt 78726 tcagatgtcc taaggtggga ggatgcgtgg ta.tatttcat taaaaattat eacactgtaa 78786 aatataagaa taatttgttt cttttagaaa tt.ttacttta ttctgatatt aataatgatt 78846 ttttaatctt tggttttcca agtcttaccc ta.tttatggg aatctttttt ttcttttggc 78906 tagctaattg cttcagtttt gttttctaat ct.agaatgtt agcaatctgt taattccact 78966 ggtaatgata tagttaagct atgtcttgct tc:tcacactt tatttattta tttactcagg 79026 gcactaatct gccatttttt cgcacttttt tt.cctttttt ttttttttgg tactgcttct 79086 tattctggtt tttacattga tagaaccaat gt.tagacgtt catttgcctt ttgctgtgta 79146 tatttgggta aggatctata tgtgcaatat at.gggacagt taaaatcaga at tctaaatt 79206 tgtattattg catcaggcaa taatgtggga aa.taccttga catttcatat acacaatatt 79266 cttgtattaa tttaacgtct tagttcaaaa tc:ttccttgt taatatagag accctattat 79326 ttggtttggc aatacagttg aagagattga tgrgttcttat gaattgtttg ccttttcttt 79386 tcaatggctg tagctatgtt aaattattac at.gtttgctt gttatctttc ag aat caa 79444 Asn Gln

gtc aga gat ttg aag gaa atg tgt graa t t t ctt aag aaa gaa aaa 79489 Val Arg Asp Leu Lys Glu Met Cys c:au Phe Leu Lys Lys Glu Lys 2095 2100 2105

gca gaa gtt cag cgg aaa ctt ggc c:at gtt aga ggg gtatgtgaga 79535 Ala Glu Val Gln Arg Lys Leu Gly His Val Arg Gly 2110 2115

atttaccata catttgtttt gqtttcagca gtgataagcc agaaatgaaa agtttagata 79595 tgttgtaaaa gtactqatat qcctctacaa gtgccctgta qtttcagtgt ttattctqca 79655 tctgtaatat aaaacagtaa gcatttctat gtgtctcaaa gtattttatc atctgttata 79715 ccttacatac tttcatctct ctttttattg aatatgcctc cataccttga aaacatttaa 79775 cttccaggaa tccttttgtt tatggagqta actgctaact gqtccttggt ccaatgctgc 79835 cattttgtaa ccatttgtta tgatatcttc ccagcttggt ataatgtttt ataattacat 79895 tgttcctccc cctctttttt tgtgttcttg taattttctc cctatqttat tttgtattca 79955 ttttatataa tgaataaatg ttgcttatga ggtcaaggcc aaagacttaa gctcctgttg 80015 atttcatgtt gctgagtgtc ataaatggaa gcaatcataa tgcagagtca ttctggtagt 80075 aatattaaat atatgatgga ttcaqtgaaa atattatgtg ttattagaaa aatattcaga 80135 acaggccggg ggcagtggct cacacctgta atcccagcaa tttgggaggc cgaggcgggc 80195 agatcactgg aagtcaggag ttcaagacca gcctggccga catggtgaaa ccccatctct 80255 actaaaaata tgaaaattag ctgggcatgg tggctcatgc ctgtaatcct agctactcag 80315 gaggttgagg caggagaatt gcttgaacct ggcaggcgga gqttacagtg agccatgqtc 80375 acacaactgt actccaqcct gggcgacaga gcgagactcc atcttttaaa acaaaaaaaa 80435 aaaaggaaaa atattcagaa caqtatcttg ctgqcagcaa catttgtttc atcaatgaaa 80495 atatgtgtta atttgacctt ttctatctaa gttaattatg aaagtgcata ctaaaatgat 80555 qtaaaagttt atatttcagg attattctta ttcatggatg attaactaaa atgcaaaaag 80615 aaattaagca tactgtttgg ctaaactgtt aaaaattatt tttattttaa atgataagca 80675 qttaaactta ttaagtgatg actcatctct gctgatatat ttatgcaagg ttttttattt 80735 cagataactc ttctatttat attaaacaga aactgtattt ctaagcaata gcatttctta 80795 gagaaaattg cctctattat qttgcaatta aaatttaatt actcatgagc tctttaaaga 80855 cacaatttct cttgtgtggt tttatttcat ataaagaaaa actctgatat actggagaga 80915 acattagcta aatagactat ttagacttaa tcattttgat caqacatcaa ggctagacta 80975 tttaagctgt tacttattag ctqcatgatt ttaggaatgt caaatttcct aagtcttggt 81035 tttcttgtat ttaaaatgga aattataatt cctatctcat agaattgttt taaggatgaa 81095 ttgaattaat acagttttga cttcaaatat taggaattat tgagtataat aagcctgttg 81155 tattqttggt acttcqtatt atacttacta aaatatttga ttaaagattt aacatattct 81215

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Ser Gly Arg Ser Gly Lys Thr Ile Pro Glu Leu Glu Lys

2120 2125 2130

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2150 2155 2160

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2165 2170 ttaatgtgat catttttagg ggaatatttt acqttttgtt actatttagg aaaatttcaa 81457 atatgctcat tactatataa aatggcttta atgaatacaa tacatatttt ataaatatag 81517 aaaaaaactt atgagaggca aggctaaggg ttatagagta ggtctacctg atctttcttg 81577 ttatttcaag accaatactt ttcacttttc tctctgacag catagattaa ttacctqtgt 81637 ctctcttttt tttttctttt gagatggagt actgctttgt cacccaggct gqaatgcagt 81697 ggtgcaatct tgactcactg caagctctgc ctcccgggtt catgccattc tcctgcctca 81757 gcctccccca qtagctqqga ctacagqtqc ccaccaccac gcctgqctaa cttttcqtat 81817 ttttagtaga gatggggttt caccatgtta accaggactg tctcgatctc ctgacctcgt 81877 gatccgccca ctgcggcctc tgtgtctctt tgtgaaaata cagatgccca aqctcccatc 81937 cctgaaattg atttaattat tttagggtgg gtcctgacac agatatgtat gttgttgtta 81997 ttttaagtca tcaatttatt ctaatatgta gccaacgttg ggaacttcgt tctcactaat 82057 attcaaatga aqactttaat tctaatcata tcaaatatgg tttctaaaac tactttgaag 82117 atttatgagt ttataagatt atcttttatt tccttgtttt gataatgtat actttttatt 82177 ttgtttgttt ttttactag get gaa tta gaa aaa ett aaa get eat ett 82226 Ala Glu Leu Glu Lys Leu Lys Ala His Leu 2175 2180 ggg eat eag ttg age atg cae tat gaa tee aag aee aaa gge aea 82271 Gly His Gln Leu Ser Met His Tyr Glu Ser Lys Thr Lys Gly Thr 2185 2190 2195 gaa aaa att att get gaa aat gaa agg ett egt aaa gaa ett aaa 82316 Glu Lys Ile Ile Ala Glu Asn Glu Arg Leu Arg Lys Glu Leu Lys

2200 2205 2210

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ggt Gly 650 atg aaa gaa ata Met Lys Glu Ile ttg Leu 655 eaa gea att aag Gln Ala Ile Lys gaa Glu 660 2324

atg eag aaa gat eet gat gtt aaa gga Met Gln Lys ASp Pro ASp Val Lys Gly 665

gga Gly 670 gaa Glu aea tet eta att ate Thr Ser Leu Ile Ile 675 2372

ect age ctt gaa aga cta gtt aat Pro Ser Leu Glu Arg Leu Val Asn 680

get Ala 685 ata gaa Ile Glu tea aag aat Ser Lys Asn 690 gea gaa Ala Glu 2420

gga ate ttt gat gcg agt ctg eat Gly Ile Phe Asp Ala Ser Leu His 695 700

ttg aaa gce caa gtt gat cag ctt Leu Lys Ala Gln Val Asp Gln Leu 705 2468

aee Thr

gga Gly 710 aga aat gaa gaa Arg Asn Glu Glu tta aga eag gag etc Leu Arg Gln Glu Leu 715 agg Arg 720 gaa Glu tet egg aaa Ser Arg Lys 2516

gag Glu 725

gct Ala ata aat tat tea cag eag ttg gca Ile Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Ala 730 aaa Lys 735 get aat tta aag Ala Asn Leu Lys ata Ile 740 2564

gae eat ctt gaa Asp His Leu Glu

aaa Lys 745 gaa Glu act Thr agt ctt tta ega caa tea gaa Ser Leu Leu Arg Gln Ser Glu 750 gga Gly 755 teg Ser 2612

aat gtt gtt ttt aaa gga Asn Val Val Phe Lys Gly 760

att gae tta cct gat ggg Ile Asp Leu Pro Asp Gly 765 ata Ile ge. Ala 770 cea tet Pro Ser 2660

agt gce agt

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Ser Ala Ser Ile Ile Asn

Ser Gln Asn Glu Tyr Leu Ile His Leu Leu

775

780 785

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790 795 800

ett qaa gat tae aae aga aaa ttt gct qta att cqt cat caa eaa agt 2804 Leu Glu Asp Tyr Asn Arg Lys Phe Ala Val Ile Arg His Gln Gln Ser 805 810 815 820

ttq ttg tat aaa qaa tae eta agt gaa aaq qag ace tgq aaa aca qaa 2852 Leu Leu Tyr Lys Glu Tyr Leu Ser Glu Lys Glu Thr Trp Lys Thr Glu

B25 B30 B35

tct aaa aca ata aaa gaq gaa aag aqa aaa ctt gag qat caa gtc caa 2900 Ser Lys Thr Ile Lys Glu Glu Lys Arq Lys Leu Glu Asp Gln Val Gln

840 845 850

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eaq atg gat tcq qat gaa atq aaa aaa ata ctt gea qaa aat aqt agq 2996 Gln Met Asp Ser Asp Glu Met Lys Lys Ile Leu Ala Glu Asn Ser Arq 870 B75 880

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aca acc tta gta gaa ttg gag cga caa ett aga aaa gaa aat gag aag 3092 Thr Thr Leu Val G1u Leu Glu Arg Gln Leu Arg Lys Glu Asn G1u Lys 905 910 915

eaa aag aat gaa ttg ttg tea atg gag get gaa gtt tgt gaa aaa att 3140 Gln Lys Asn Glu Leu Leu Ser Met Glu Ala Glu Val Cys G1u Lys Ile 920 925 930

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etc caa aaa qtt qta gat aat aqt gtt tct ttg tct qaa cta gaa ctq 3236 Leu Gln Lys Val Val Asp Asn Ser Val Ser Leu Ser Glu Leu Glu Leu 950 955 960

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965 970 975 980

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gag tgt gaa aac ate tee tta aaa gaa eaa gtg gag tet ata aat 3377 Glu Cys Glu Asn Ile Ser Leu Lys Glu Gln Val Glu Ser rle Asn 1000 1005 1010

aaa gaa etg gag att aee aag gaa aaa ett cae aet att gaa eaa 3422 Lys Glu Leu Glu Ile Thr Lys Glu Lys Leu His Thr Ile Glu G1n 1015 1020 1025

qcc tqg qaa eaq qaa act aaa tta ggt aat gaa tct aqe atg gat 3467 Ala Trp Glu Gln Glu Thr Lys Leu G1y Asn Glu Ser Ser Met Asp 1030 1035 1040

aag gea aag aaa

tea ata aee aae agt gae att gtt tee att tea 3512

Lys Ala Lys Lys

Ser r1e Thr Asn Ser Asp rle Val Ser rle Ser

1045

1050 1055

aa,a aaa ata aet

atg etg gaa atg aag gaa tta aat gaa agq eag 3557

Lys Lys rle Thr

Met Leu Glu Met Lys Glu Leu Asn Glu Arq Gln

1060

1065 1070

egg get gaa cat

tgt eaa aaa atg tat gaa cae tta egg act teg 3602

Arg Ala Glu His

Cys Gln Lys Met Tyr Glu His Leu Arg Thr Ser

1075

1080 1085

tta aag eaa atg

gag gaa eqt aat ttt gaa ttg gaa aee aaa ttt 3647

Leu Lys Gln Met

Glu Glu Arg Asn Phe Glu Leu Glu Thr Lys Phe

1090

1095 1100

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aaa ate aat ttg gat gca eag aag qtg gaa eag 3692

Ala Glu Leu Thr

Lys rle Asn Leu Asp Ala Gln Lys Val Glu Gln

1105

1110 1115

atg tta aga gat

gaa tta get gat agt qtg age aag gea qta aqt 3737

Met Leu Arg Asp

Glu Leu Ala Asp Ser Val Ser Lys Ala Val Ser

1120

1125 1130

gat get gat agg

eaa egq att eta gaa tta gag aag aat gaa atg 3782

Asp Ala Asp Arg

Gln Arq rle Leu Glu Leu Glu Lys Asn Glu Met

1135

1140 1145

gaa eta aaa gtt

gaa qtg tea aaa etg aga gag att tct qat att 3827

Glu Leu Lys Val

Glu Val Ser Lys Leu Arg Glu rle Ser Asp Ile

1150

1155 1160

gee aga aga caa

gtt gaa att ttg aat gca eaa caa eaa tct agg 3872

Ala Arg Arg Gln

Val Glu rle Leu Asn Ala Gln Gln Gln Ser Arg

1165

1170 1175

gae aag gaa gta

gag tce etc aga atg eaa etg cta gae tat eag 3917

Asp Lys Glu Val

Glu Ser Leu Arg Met Gln Leu Leu Asp Tyr Gln

1180

1185 1190

gea eag tet gat

gaa aaq teg etc att gee aag t tg cae eaa eat 3962

Ala G1n Ser Asp

Glu Lys Ser Leu rle Ala Lys Leu His Gln His

1195

1200 1205

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caa etg aqt gag get aet get ett ggt aag ttg 4007

Asn Val Ser Leu

Gln Leu Ser Glu Ala Thr Ala Leu Gly Lys Leu

1210

1215 1220

gag tea att aea

tet aaa ctg eag aag atg gag gee tae aae ttg 4052

Glu Ser Ile Thr

Ser Lys Leu Gln Lys Met Glu Ala Tyr Asn Leu

1225

1230 1235

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aaa ett gat gaa aaa gaa eag get etc tat tat 4097

Arg Leu Glu Gln

Lys Leu Asp Glu Lys Glu Gln Ala Leu Tyr Tyr

1240

1245 1250

gct eqt ttg gag

gga aga aac aga gea aaa eat etg ege eaa aca 4142

Ala Arg Leu G1u

Gly Arg Asn Arg Ala Lys His Leu Arg Gln Thr

1255

1260 1265

att eag tet cta

cga ega eag ttt agt gga get tta cee ttg gca 4187

rle Gln Ser Leu

Arg Arg Gln Phe Ser Gly Ala Leu Pro Leu Ala

1270 1275 1280

eaa eag gaa aag

tte tee aaa aea atg att eaa cta eaa aat gac 4232

G1n G1n G1u Lys

Phe Ser Lys Thr Met Ile Gln Leu Gln Asn Aop

1285

1290 1295

aaa ctt aag ata

atg caa gaa atg aaa aat tct eaa caa gaa cat 4277

Lys Leu Lys Ile

Met Gln Glu Met Lys Asn Ser Gln Gln Glu Bis

1300

1305 1310

aga aat atg gag

aac aaa aca ttg gag atg gaa tta aaa tta aag 4322

Arg Asn Met Glu

Asn Lys Thr Leu Glu Met Glu Leu Lys Leu Lyo

1315

1320 1325

gqc ctg gaa gag

tta ata age aet tta aag gat aee aaa gga gcc 4367

G1y Leu G1u Glu

Leu I1e Ser Thr Leu Lys Asp Thr Lys Gly Ala

1330

1335 1340

caa aag gta atc

aae tgg eat atg aaa ata gaa gaa ett cqt ctt 4412

G1n Lys Val Ile

Asn Trp His Met Lys Ile Glu Glu Leu Arg Leu

1345

1350 1355

caa gaa ctt aaa

eta aat egg gaa tta gte aag gat aaa gaa gaa 4457

Gln Glu Leu Lys

Leu Asn Arg Glu Leu Val Lys Asp Lys Glu Glu

1360

1365 1370

ata aaa tat ttg

aat aac ata att tct gaa tat gaa cgt aca ate 4502

Ile Lys Tyr Leu

Asn Asn Ile Ile Ser Glu Tyr Glu Arg Thr Ile

1375

1380 1385

agc agt ctt gaa

gaa gaa att gtg caa cag aac aag ttt cat gaa 4547

Ser Ser Leu Glu

Glu Glu Ile Val Gln Gln Asn Lys Phe His Glu

1390

1395 1400

gaa aga caa atg

gce tgg gat caa aga gaa gtt qac ctg gaa cgc 4592

Gl u Arg Gl n Met

Ala Trp Asp Gln Arq Glu Val Asp Leu Glu Arg

1405

1410 1415

eaa eta gae att

ttt gae egt eag eaa aat gaa ata eta aat gcg 4637

Gl n Leu Asp Ile

Phe Asp Arq Gln Gln Asn Glu rle Leu Asn Ala

1420

1425 1430

gca caa aag ttt

gaa gaa get aea gga tea atc cet gae eet aqt 4682

Ala Gln Lys Phe

Glu Glu Ala Thr Gly Ser Ile Pro Asp Pro Ser

1435

1440 1445

ttg ccc ctt cea

aat eaa ett gag ate get eta agg aaa att aag 4727

Leu Pro Leu Pro

Asn Gln Leu Glu Ile Ala Leu Arg Lys Ile Lyo

1450

1455 1460

gag aac att cga

ata att cta gaa aca cgg gca act tgc aaa tea 4772

G1u Asn I1e Arg

Ile I1e Leu G1u Thr Arg Ala Thr Cys Lyo Ser

1465

1470 1475

cta gaa gag aaa

eta aaa gag aaa gaa tet get tta agg tta gca 4817

Leu Glu Gl u Lys

Leu Lys Glu Lys Glu Ser Ala Leu Arg Leu Ala

1480

1485 1490

gaa caa aat ata

ctg tea aga gae aaa gta ate aat gaa etg agg 4862

Glu Gln Asn Ile

Leu Ser Arg Asp Lys Val Ile Asn Glu Leu Arg

1495

1500 1505

Leu Arg Leu Pro 1510

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att gct cat caa Ile Ala His Gln 1540

aaa gaa gaa gta Lys Glu Glu Val 1555

aga gag gag caa Arg Glu Glu Gln 1570

cat att ctt cat His Ile Leu His 1585

aat aaa ttc aaa Asn Lys Phe Lys 1600

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gte aaa cta aag val Lys Leu Lys 1645

ate act gaa tta Ile Thr Glu Leu 1660

ett eaa gaa aae Leu Gln Glu Asn 1675

gta gag gat tta Val Glu Asp Leu 1690

cag tgt tta aaa Gln Cys Leu Lys 1705

aga gct cea aca Arg Ala Pro Thr 1720

age eaa tta qce Ser Gln Leu Ala 1735

Ala Thr Ala Glu Arg

Glu Lys Leu Ile Ala Glu

1515

1520

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tct cae cae aca ttq aaa 4952

Glu Met Glu Pro Lys

Ser His His Thr Leu Ly.

1530

1535

aee att gea aae atg

eaa qea aqg tta aat caa 4997

Thr Ile Ala Asn Met

Gln Ala Arg Leu Asn Gln

1545

1550

tta aag aag tat eaa

egt ett cta gaa aaa gcc 5042

Leu Lys Lys Tyr Gln

Arg Leu Leu Glu Lys Ala

1560

1565

aga gaa att gtg aag

aaa eat gag gaa gae ctt 5087

Arg Glu Ile Val Lys

Lys His Glu Glu Asp Leu

1575

1580

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eag get gat agt tea cta 5132

His Arg Leu Glu Leu

Gln Ala Asp Ser Ser Leu

1590

1595

caa acg get tgg gat

tta atg aaa eag tet ccc 5177

Gln Thr Ala Trp Asp

Leu Met Lys Gln Ser Pro

1605

1610

aee aae aag cat ttt

att egt etg get gag atg 5222

Thr Asn Lys His Phe

Ile Arg Leu Ala Glu Met

1620

1625

gea gaa caa gat gae

tet ett tee tea etc ttg 5267

Ala Glu Gln Asp Asp

Ser Leu Ser Ser Leu Leu

1635

1640

aaa gta tea caa gat

ttg gag aga eaa aga gaa 5312

Lys val Ser Gln Asp

Leu Glu Arg Gln Arq Glu

1650

1655

aaa gta aaa gaa ttt

gaa aat ate aaa tta cag 5357

Lys Val Lys Glu Phe

Glu Asn Ile Lys Leu Gln

1665

1670

cat gaa gat gaa gtg

aaa aaa gta aaa geg gaa 5402

His Glu Asp Glu Val

Lys Lys Val Lys Ala Glu

1680

1685

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eag tea caa aag gaq tca 5447

Lys Tyr Leu Leu Asp

Gln Ser Gln Lys Glu Ser

1695

1700

tet gaa ctt cag gct

eaa aaa gaa gca aat tca 5492

Ser Glu Leu Gln Ala

Gln Lys Glu Ala Asn Ser

1710

1715

aet aea atg aga aat

eta gta gaa egg eta ••g 5537

Thr Thr Met Arg Asn

Leu Val Glu Arg Leu Lys

1725

1730

ttg aaq gag aaa eaa

eag aaa gea ett agt cgg 5582

Leu Lys Glu Lys Gln

Gln Lys Ala Leu Ser Arg

1740

1745

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etc cgg gca gaa atq aca gea gct gct gaa gaa 5627

Ala Leu Leu Glu

Leu Arg Ala Glu Met Thr Ala Ala Ala Glu Glu

1750

1755 1760

cqt att att tct

gea act tct caa aaa gag gec cat etc aat qtt 5672

Arg Ile Ile Ser

Ala Thr Ser Gln Lys Glu Ala His Leu Asn Val

1765

1770 1775

caa caa ate qtt

gat ega eat aet aga gag eta aag aca eaa qtt 5717

Gln Gln Ile Val

ASp Arg His Thr Arq Glu Leu Lys Thr Gln Val

1780

1785 1790

gaa gat tta aat

gaa aat ctt tta aaa ttg aaa gaa gca ctt aaa 5762

Glu Asp Leu Asn

Glu Asn Leu Leu Lys Leu Lys Glu Ala Leu Lys

1795

1800 1805

aea aqt aaa aae

aga gaa aae tea eta aet gat aat ttg aat gae 5807

Thr Ser Lys Asn

Arg Glu Asn Ser Leu Thr Asp Asn Leu Asn Asp

1810

1815 1820

tta aat aat gaa

ctg eaa aag aaa eaa aaa gec tat aat aaa ata 5852

Leu Asn Asn Glu

Leu Gln Lys Lys Gln Lys Ala Tyr Asn Lys Ile

1825

1830 1835

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gag gaa att gat eaa gag aat gat gaa etg aaa 5897

Leu Arg Glu Lys

Glu Glu Ile Asp Gln Glu Asn Asp Glu Leu Lys

1840

1845 1850

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aga eta aec agt gga tta cag 99c aaa cee etg 5942

Arg Gln Ile Lys

Arg Leu Thr Ser Gly Leu Gl n Gly Lys Pro Leu

1855

1860 1865

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caa agt cta att gaa gaa etc caa agg aaa qtt 5987

Thr Asp Asn Lys

Gln Ser Leu Ile Glu Glu Leu Gln Arg Lys Val

1870

1875 1880

aaa aaa cta gag

aac caa tta gag gga aag gtg gag gaa qta gae 6032

Lys Lys Leu Glu

Asn Gln Leu Glu Gly Lys Val Glu Glu Val Asp

1885

1890 1895

cta aaa cct atg

aaa gaa aag aat gct aaa gaa gaa tta att agg 6077

Leu Lys Pro Met

Lys Glu Lys Asn Ala Lys Glu Glu Leu Ile Arg

1900

1905 1910

tgg gaa gaa gqt

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Trp Glu G1u Gly

Lys Lys Trp Gln Ala Lys I l e Glu Gly I l e Arg

1915

1920 1925

aac aag tta aaa

gag aaa gag ggg gaa qte ttt act tta aea aag 6167

Asn Lys Leu Lys

Glu Lys Glu Gly Glu Val Phe Thr Leu Thr Lys

1930

1935 1940

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ttg aag gat ctt ttt gcc aaa gcc gat aaa gag 6212

Gln Leu Asn Thr

Leu Lys Asp Leu Phe Ala Lys Ala Asp Lys Glu

1945

1950 1955

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cag agg aaa cta aaa aca act ggc atg act qtt 6257

Lys Leu Thr Leu

Gln Arg Lys Leu Lys Thr Thr Gly Met Thr Val

1960

1965 1970

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gga ata cga gct ttq gag tea gaa aaa gaa ttg 6302

Asp Gln Val Leu

Gly Ile Arg Ala Leu Glu Ser Glu Lys Gl u Leu

1975

1980 1985

90

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Lys Arg Asn Leu Asp Leu Glu Asn Asp Ile Leu

1990

1995 2000

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Tyr Met Arg Ala

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2005

2010 2015

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Asp Leu His Leu

Gln Asn Arg Tyr Leu Gln Glu Lys Leu His Ala

2020

2025 2030

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Leu Glu Lys Gln

Phe Ser Lys Asp Thr Tyr Ser Lys Pro Ser Ile

2035

2040 2045

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tea gat gat eat tgt eag aga gaa eag gag ett 6527

Ser Gly Ile Glu

Ser Asp Asp His Cys Gln Arg Glu Gln Glu Leu

2050

2055 2060

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ttq aaq ttg tea tet qaa aat att qaa etg aaa 6572

Gln Lys Glu Asn

Leu Lys Leu Ser Ser Glu Asn Ile Glu Leu Lys

2065

2070 2075

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eaa gea aat aaa gat ttg cea aga tta aag aat 6617

Phe Gln Leu Glu

Gln Ala Asn Lys Asp Leu Pro Arg Leu Lys Asn

2080

2085 2090

eaa qtc aqa gat

ttq aaq qaa atq tgt qaa ttt ctt aaq aaa gaa 6662

Gln Val Arg Asp

Leu Lys Glu Met Cys Glu Phe Leu Lys Lys Glu

2095

2100 2105

aaa gea gaa gtt

eag egg aaa ett gge eat gtt aga ggg tet ggt 6707

Lys Ala Glu Val

Gln Arq Lys Leu Gly His Val Arg Gly Ser Gly

2110

2115 2120

aga aqt gga aag

aea ate cea gaa etg gaa aaa aee att ggt tta 6752

Arq Ser Gly Lys

Thr Ile Pro Glu Leu Glu Lys Thr Ile Gly Leu

2125

2130 2135

atg aaa aaa gta

gtt gaa aaa gte eag aga gaa aat gaa eag ttg 6797

Met Lys Lys Val

Val Glu Lys Val Gln Arg Glu Asn Glu Gln Leu

2140

2145 2150

aaa aaa gea tea

gga ata ttg aet agt gaa aaa atg get aat att 6842

Lys Lys Ala Ser

Gly Ile Leu Thr Ser Glu Lys Met Ala Asn Ile

2155

2160 2165

gag eag gaa aat

gaa aaa ttg aag get gaa tta gaa aaa ett aaa 6887

Glu Gln Glu Asn

Glu Lys Leu Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Lys

2170

2175 2180

get eat ett ggg

eat eag ttg age atg cae tat gaa tee aag aee 6932

Ala His Leu Gly

His Gln Leu Ser Met His Tyr Glu Ser Lys Thr

2185

2190 2195

aaa gge aea gaa

aaa att att get gaa aat gaa agg ett egt aaa 6977

Lys Gly Thr Glu

Lys Ile Ile Ala Glu Asn Glu Arg Leu Arg Lys

2200

2205 2210

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gaa aet gat get gea gag aaa tta egg ata gea 7022

Glu Leu Lys Lys

Glu Thr Asp Ala Ala Glu Lys Leu Arg Ile Ala

2215

2220 2225

aag

aat aat t t a gag ata tta aat gag aag atg aea gtt eaa eta 7067

Lys Asn Asn Leu

Glu Ile Leu Asn Glu Lys Met Thr Val Gln Leu

2230

2235 2240

gaa gag act gqt

aag aga ttg eag ttt gea gaa age aga ggt cea 7112

Gl u

Gl u

Thr Gl y Lys Arg Leu Gln Phe Ala Glu Ser Arg Gly Pro

2245

2250 2255

cag c t t

gaa gqt get gae agt aag agc tgg aaa tee att gtg qtt 7157

Gl n

Leu Gl u Gly Ala Asp Ser Lys Ser Trp Lys Ser Ile Val Val

2260

2265 2270

aca

aqa atq tat gaa acc aag tta aaa gaa ttg qaa act gat att 7202

Thr Arg Met

Tyr Glu Thr Lys Leu Lys Glu Leu Glu Thr Asp I1e

2275

2280 2285

gce

aaa aaa aat caa age att aet gac ett aaa cag ett gta aaa 7247

Al a

Lys Lys Asn Gln Ser I le Thr Asp Leu Lys Gln Leu Val Lys

2290

2295 2300

gaa gea

aca gag aga gaa caa aaa qtt aae aaa tae aat gaa gae 7292

Gl u

Ala Thr Glu Arg Gl u Gln Lys Val Asn Lys Tyr Asn Glu Asp

2305

2310 2315

ett

gaa eaa cag att aag att ett aaa eat gtt cet gaa gqt get 7337

Leu Glu Gl n

Gln Ile Lys Ile Leu Ly. His Val Pro Glu Gly Ala

2320

2325 2330

gag

aea gag caa gge ett aaa egg gag ett eaa qtt ett aga tta 7382

Gl u

Thr Gl u Gln Gly Leu Lys Arg Glu Leu Gln Val Leu Arg Leu

2335

2340 2345

gct

aat eat eag ctg gat aaa gag aaa gea gaa tta ate eat eag 7427

Al a

Asn His Gln Leu Asp Lys Glu Lys Ala Glu Leu Ile His Gln

2350

2355 2360

ata gaa gct

aac aag qac caa agt gga gct gaa agc acc ata eet 7472

I l e

Glu Al a Asn Lys Asp Gln Ser Gly Ala Glu Ser Thr Ile Pro

2365

2370 2375

qat gct gat

caa eta aag gaa aaa ata aaa qat cta gag aca eag 7517

Asp Ala Asp Gln

Leu Lys Glu Lys I le Lys Asp Leu Glu Thr Gln

2380

2385 2390

etc

aaa atg tea gat eta gaa aag eag eat ttg aag gag gaa ata 7562

Leu Lys Met

Ser Asp Leu Glu Lys Gln His Leu Lys Glu Glu I1e

2395

2400 2405

aag aag etg

aaa aaa gaa ctg gaa aat ttt gat cet tea ttt ttt 7607

Lys Lys

Leu Lys Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Pro Ser Phe Phe

2410

2415 2420

qaa gaa

att gaa gat ett aag tat aat tac aag gaa gaa gtg aag 7652

Gl u

Glu I l e Glu ASp Leu Lys Tyr Aso Tyr Lys Glu Glu Val Lys

2425

2430 2435

aag

aat att e t c tta gaa gag aag gta aaa aaa ctt tea gaa eaa 7697

Lys Asn

I l e Leu Leu Glu Glu Lys Val Lys Lys Leu Ser Glu Gl n

2440

2445 2450

Leu Gly Val Glu Leu Thr Ser Pro 2455

qaa qat qaa qaa qaa aqt eet qtt Glu Asp Glu Glu Glu Ser Pro Val

2410 aQqtcaccta taaactttqt ttcatttaac tggaaataag cagttctccg aactgtagta ttaQattqQa attcttaata aataaaatta aaaaaaaa

<210> 3

<211> 2479

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<400> 3

Val 2460

Ala Ala Ser Glu Glu 2465 Phe

aat Asn 2415

tte cee att tae taa Phe Pro !le Tyr 1184

tatttattaa ctttataaqt

taaatatact 1844

tttccttctc actaccttgt

acctttatac 1904

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tcaacttatt aaaaaaaaaa 1964

1912

Met Pro Pro Asn Ile Asn Trp Lys Glu Ile Met Lys Val Asp Pro Asp 1 5 10 15

ASp Leu Pro Arq Gln Glu Glu Leu Ala ASp Asn Leu Leu Ile Ser Leu 20 25 3D

Ser Lys Val Glu Val Asn Glu Leu Lys Ser Glu Lys Gln Glu Asn Val

35 40 45

Ile His Leu Phe Arq Ile Thr Gln Ser Leu Met Lys Met Lys Ala Gln

50 55 60

Glu Val Glu Leu Ala Leu Glu Glu Val Glu Lys Ala Gly Glu Glu Gln 65 70 75 80

Ala Lys Phe Glu Asn Gln Leu Lyl:J Thr Lys Val Met Lys Leu Glu Asn 85 90 95

Glu Leu Glu Met Ala Gln Gln Sel:." Ala Gly Gly Arg Asp Thr Arg Phe

100 105 110

Leu Arg Asn Glu Ile Cys Gln Leu Glu Lys Gln Leu G1u Gln Lys Asp 115 121l 125

Arg Glu Leu Glu Asp Met Glu Lys Glu Leu Glu Lys Glu Lys Lys Val 130 135 140

Asn Glu Gln Leu Ala Leu Arg Asn Glu Glu Ala Glu Asn Glu Asn Ser 145 150 155 160

Lys Leu Arg Arg Glu Asn Lys Arg Leu Lys Lys Lys Asn Glu Gln Leu 165 170 175

Cys Gln Asp Ile Ile Asp Tyr Gln Lys Gln Ile Asp Ser Gln Lys Glu 1 80 185 190

Thr Leu Leu Ser Arg Arg Gly Glu Asp Ser Asp Tyr Arg Ser Gln Leu 195 200 205

Ser Lys Lys Asn Tyr Glu Leu Ile Gln Tyr Leu Asp Glu Ile Gln Thr 210 215 220

Leu Thr Glu Ala Asn Glu Lys Ile Glu Val Gln Asn Gln Glu Met Arg 225 230 235 240

Lys Asn Leu Glu Glu Ser Val Gln Glu Met Glu Lys Met Thr Asp Glu 245 250 255

Tyr Asn Arg Met Lys Ala Ile Val His Gln Thr Asp Asn Val rle Asp 260 265 270

Gln Leu Lys Lys Glu Asn Asp His Tyr Gln Leu Gln Val Gln Glu Leu 275 280 285

Thr ASp Leu Leu Lys Ser Lys Asn Glu Glu ASp ASp Pro Ile Met Val 290 295 300

Ala Val Asn Ala Lys Val 305 310

Asp Asp Glu Ile Ile Glu 325

Lys Leu Lys Asn Ala Gln 340

Leu Gln Gln Gly rle Gln 355

Glu Gln Val Glu Gln Tyr 370

rle Glu Asp Leu Lys Asn 385 390

Glu Glu Trp Lys Leu Ile Leu Ser Ser Lys 315 320

Tyr Gln Gln Met Leu His Asn Leu Arg Glu 330 335

Leu Asp Ala Asp Lys Ser Asn Val Met Ala 345 350

Glu Arg Asp Ser Gln Ile Lys Met Leu Thr 360 365

Thr Lys Glu Met Glu Lys Asn Thr Cys Ile 375 380

Glu Leu Gln Arg Asn Lys Gly Ala Ser Thr 395 400

Leu

Ser Gln Gln Thr His Met Lys Ile Gln Ser Thr Leu Asp rle Leu

405

410 415

95

Lys Glu Lys Thr Lys Glu Ala Glu Arg Thr Ala Glu Leu Ala Glu Ala 420 425 430

Asp Ala Arg Glu Lys Asp Lys Glu Leu Val Glu Ala Leu Lys Arg Leu 435 440 445

Lys Asp Tyr Glu Ser Gly Val Tyr Gly Leu Glu Asp Ala Val Val Glu 450 455 460

Ile Lys Asn Cys Lys Asn Gln Ile Lys Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu 465 470 475 480

Ile Leu Thr Lys Glu Ile Asn Lys Leu Glu Leu Lys Ile Ser Asp Phe 485 490 495

Leu Asp Glu Asn Glu Ala Leu Arg Glu Arg Val Gly Leu Glu Pro Lys 500 505 510

Thr Met Ile Asp Leu Thr Glu Phe Arg Asn Ser Lys His Leu Lys Gln 515 520 525

Gln Gln Tyr Arq Ala Glu Asn Gln Ile LeU Leu Lys Glu Ile Glu Ser 530 535 540

Leu Glu Glu Glu Arg Leu ASp Leu Lys Lys Lys Ile Arg Gln Met Ala 545 550 555 560

Gln Glu Arg Gly Lys Arg Ser Ala Thr Ser Gly Leu Thr Thr Glu Asp 565 570 575

Leu Asn Leu Thr Glu Asn Ile Ser Gln Gly Asp Arg Ile Ser Glu Arg 580 585 590

Lys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Lys Asn Met Ser Glu Ala Gln Ser Lys 595 600 605

Asn Glu Phe Leu Ser Arg Glu Leu Ile Glu Lys Glu Arg Asp Leu Glu 610 615 620

Arg Ser Arg Thr Val Ile Ala Lys Phe Gln Asn Lys Leu Lys Glu Leu 625 630 635 640

Val Glu Glu Asn Lys Gln Leu Glu Glu Gly Met Lys Glu Ile Leu Gln 645 650 655

Ala Ile Lys Glu Met Gln Lys Asp Pro Asp Val Lys Gly Gly Glu Thr 660 665 670

Ser Leu Ile Ile Pro Ser Leu Glu Arg Leu Val Asn Ala Ile Glu Ser 675 680 685

Lys Asn Ala Glu Gly Ile Phe Asp Ala Ser Leu His Leu Lys Ala Gln 690 695 700

Val Asp Gln Leu Thr Gly Arg Asn Glu Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg 705 710 715 720

Glu Ser Arg Lys Glu Ala Ile Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Ala Lys Ala 725 730 735

Asn Leu Lys Ile Asp His Leu Glu Lys Glu Thr Ser Leu Leu Arg Gln 740 745 750

Ser Glu Gly Ser Asn Val Val Phe Lys Gly Ile Asp Leu Pro Asp Gly 755 760 765

Ile Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ile Ile Asn Ser Gln Asn Glu Tyr Leu 770 775 780

Ile His Leu Leu Gln Glu Leu Glu Asn Lys Glu Lys Lys Leu Lys Asn 785 790 795 800

Leu Glu Asp Ser Leu Glu Asp Tyr Asn Arg Lys Phe Ala Val Ile Arg 805 810 815

His Gln Gln Ser Leu Leu Tyr Lys Glu Tyr Leu Ser Glu Lys Glu Thr 820 825 830

Trp Lys Thr Glu Ser Lys Thr Ile Lys Glu Glu Lys Arg Lys Leu Glu 835 840 845

ASp Gln Val Gln Gln Asp Ala Ile Lys Val Lys Glu Tyr Asn Asn Leu 850 855 860

Leu Asn Ala Leu Gln Met Asp Ser Asp G1u Met Lys Lys Ile Leu Ala 865 870 875 880

Glu Asn Ser Arg Lys Ile Thr Val Leu Gln Val Asn Glu Lys Ser Leu 885 890 895

Ile Arg Gln Tyr Thr Thr Leu Val Glu Leu Glu Arg Gln Leu Arg Lys 900 905 910

Glu Asn Glu Lys Gln Lys Asn Glu Leu Leu Ser Met Glu Ala Glu Val

920 925

Cys Glu Lys Ile Gly Cys Leu Gln Arg Phe Lys Glu Met Ala Ile Phe 930 935 940

Lys Ile Ala Ala Leu Gln Lys Val Val Asp Asn Ser Val Ser Leu Ser 945 950 955 960

Glu Leu Glu Leu Ala Asn Lys Gln Tyr Asn Glu Leu Thr Ala Lys Tyr 965 970 975

Arg Asp Ile Leu Gln Lys Asp Asn Met Leu Val Gln Arq Thr Ser Aso 980 985 990

Leu Glu Ria Leu Glu Cys Glu Asn Ile Ser Leu Lys Glu Gln Val Glu 995 1000 1005

Ser Ile 1010

Ile Glu 1025

Ser Met 1040

Ser Ile 1055

Glu Arq 1070

Arq Thr

Thr Lys

Val Glu 1115

Ala Val 1130

Asn Lys Glu Leu Glu 1015

Gln Ala Trp Glu Gln 1030

ASp Lys Ala Lys Lys 1045

Ser Lys Lys Ile Thr 1060

Gln Arq Ala Glu Ris 1075

Ser Leu Lys Gln Met 1090

Phe Ala Glu Leu Thr 1105

Gln Met Leu Arg Asp 1120

Ser Asp Ala Asp Arg 1135

Ile Thr Lys Glu

Glu Thr Lys Leu

Ser Ile Thr Asn

Met Leu Glu Met

Cys Gln Lys Met

Glu Glu Arq Asn

Lys Ile Asn Leu

Glu Leu Ala Asp

Gln Arq Ile Leu Lys 1020

Gly 1035

Ser 1050

Lys 1065

Tyr 1080

Phe 1095

Asp 1110

Ser 1125

Glu 1140

Leu His Thr

Asn Glu Ser

ASp Ile Val

Glu Leu Asn

Glu His Leu

Glu Leu Glu

Ala Gln Lys

Val Ser Lys

Leu Glu Lys

Asn Glu Met Glu Leu Lys Val Glu Val Ser Lys Leu Arg Glu Ile 1145 1150 1155

Ser Asp Ile Ala Arg Arg Gln Val Glu Ile Leu Asn Ala Gln Gln

1160

1165 1170

Gln

Ser 1175 Arq Asp Lys Glu Val 1180 Glu Ser Leu Arg Met 1185 Gln Leu Leu

Asp Tyr 1190

Gln Ala Gln Ser Asp 1195 Glu Lys Ser Leu Ile 1200 Ala Lys Leu

His

Gln 1205 His Asn Val Ser Leu 1210 Gln Leu Ser Glu Ala 1215 Thr Ala Leu

Gly Lys 1220

Leu Glu Ser Ile Thr 1225 Ser Lys Leu Gln Lys 1230 Met Glu Ala

Tyr Asn 1235

Leu Arg Leu Glu Gln 1240 Lys Leu Asp Glu Lys 1245 Glu Gln Ala

Leu Tyr 1250

Tyr Ala Arg Leu Glu 1255 Gly Arq Asn Arq Ala 1260 Lys His Leu

Arg Gln 1265

Thr Ile Gln Ser Leu 1270 Arg Arg Gln Phe Ser 1275 Gly Ala Leu

Pro Leu 1280

Ala Gln Gln Glu Lys 1285 Phe Ser Lys Thr Met 1290 Ile Gln Leu

Gln Asn 1295

Asp Lys Leu Lys Ile 1300 Met Gln Glu Met Lys 1305 Asn Ser Gln

Gln Glu 1310

His Arq Asn Met Glu Asn 1315 Lys Thr Leu Glu 1320 Met Glu Leu

Lys

Leu 1325 Lys Gly Leu Glu Glu 1330 Leu rle Ser Thr Leu 1335 Lys Asp Thr

Lys Gly 1340

Ala Gln Lys Val Ile Asn 1345 Trp His Met Lys 1350 rle Glu Glu

Leu Arg 1355

Leu Gln Glu Leu Lys 1360 Leu Asn Arg Glu Leu 1365 Yal Lys Asp

Lys

Glu 1370 Glu rle Lys Tyr Leu Asn Asn 1375 rle rle Ser 1380 Glu Tyr Glu

Arg Thr 1385

rle Ser Ser Leu Glu 1390 Glu Glu 99 rle Yal Gln 1395 Gln Asn Lys

Phe His Glu Glu Arg Gln Met Ala Trp Asp Gln Arg Glu Val Asp 1400 1405 1410

Leu Glu Arq Gln Leu Asp Ile Phe Asp Arg Gln Gln Asn Glu Ile 1415 1420 1425

Leu Asn Ala Ala Gln Lys Phe Glu Glu Ala Thr Gly Ser Ile Pro 1430 1435 1440

Asp Pro Ser Leu Pro Leu Pro Asn Gln Leu Glu Ile Ala Leu Arg 1445 1450 1455

Lys Ile Lys Glu Asn rle Arg rle rle Leu Glu Thr Arq Ala Thr 1460 1465 1470

Cys Lys Ser Leu Glu Glu Lys Leu Lys Glu Lys Glu Ser Ala Leu 1475 1480 1485

Arg Leu Ala Glu Gln Asn Ile Leu Ser Arg Asp Lys Val Ile Asn 1490 1495 1500

Glu Leu Arq Leu Arq Leu Pro Ala Thr Ala Glu Arg Glu Lys Leu 1505 1510 1515

Ile Ala Glu Leu Gly Arq Lys Glu Met Glu Pro Lys Ser His His 1520 1525 1530

Thr Leu Lys rle Ala Ris Gln Thr rle Ala Asn Met Gln Ala Arg 1535 1540 1545

Leu Asn Gln Lys Glu Glu Val Leu Lys Lys Tyr Gln Arg Leu Leu 1550 1555 1560

Glu Lys Ala Arq Glu Glu Gln Arg Glu rle Val Lys Lys His Glu 1565 1570 1575

Glu Asp Leu His rle Leu His His Arg Leu Glu Leu Gln Ala Asp 1580 1585 1590

Ser Ser Leu Asn Lys Phe Lys Gln Thr Ala Trp Asp Leu Met Lys

1595 1600 1605

Gln Ser Pro Thr Pro Val Pro Thr Asn Lys His Phe Ile Arg Leu

1610 1615 1620

Ala Glu Met Glu Gln Thr Val Ala Glu Gln Asp Asp Ser Leu Ser

1625 1630 1635

Ser Leu 1640

Leu Val Lys Leu Lys 1645 Lys Val Ser Gln Asp 1650 Leu Glu Arg

Gln Arg 1655

Glu Ile Thr Glu Leu 1660 Lys Val Lys Glu Phe 1665 Glu Aso Ile

Lys

Leu 1670 Gln Leu Gln Glu Asn 1675 Ris Glu Asp Glu Val 1680 Lys Lys Val

Lys Ala 1685

Glu Val Glu Asp Leu 1690 Lys Tyr Leu Leu Asp 1695 Gln Ser Gln

Lys

Glu 1700 Ser Gln Cys Leu Lys 1705 Ser Glu Leu Gln Ala 1710 Gln Lys Glu

Al. Asn 1715

Ser Arg Ala Pro Thr 1720 Thr Thr Met Arg Asn 1725 Leu Val Glu

Arg Leu 1730

Lys Ser Gln Leu Ala 1735 Leu Lys Glu Lys Gln 1740 Gln Lys Ala

Leu

Ser 1745 Arg Ala Leu Leu Glu 1750 Leu Arg Ala Glu Met 1755 Thr Ala Ala

Al. Glu 1760

Glu Arg Ile ¡le Ser 1765 Ala Thr Ser Gln Lys 1770 Glu Ala Ris

Leu Asn 1775

Val Gln Gln Ile Val 1780 Asp Arg Bis Thr Arg 1785 Glu Leu Lys

Thr Gln 1790

Val Glu Asp Leu Asn 1795 Glu Asn Leu Leu Lys 1800 Leu Lys Glu

Al. Leu 1805

Lys Thr Ser Lys Asn 1810 Arg Glu Asn Ser Leu 1815 Thr Asp Asn

Leu Asn 1820

Asp Leu Asn Asn Glu 1825 Leu Gln Lys Lys Gln 1830 Lys Ala Tyr

Asn Lys 1835

Ile Leu Arg Glu Lys 1840 Glu Glu Ile ASp Gln 1845 Glu Asn ASp

Glu Leu 1850

Lys Arq Gln Ile Lys 1855 Arq Leu Thr Ser Gly 1860 Leu Gln Gly

Lys

Pro Leu Thr Asp Asn Lys Gln Ser Leu 101 Ile Glu G1u Leu G1n

1865 1870

Arg Lys Val Lys Lys Leu Glu 1880 1885

Glu Val Asp Leu Lys Pro Met 1895 1900

Leu ne Arq Trp Glu Glu Gly 1910 1915

Gly ne Arq Asn Lys Leu Lys 1925 1930

Leu Thr Lys Gln Leu Asn Thr 1940 1945

Asp Lys Glu Lys Leu Thr Leu 1955 1960

Met Thr Val Asp Gln Val Leu 1970 1975

Lys Glu Leu Glu Glu Leu Lys 1985 1990

Asp ne Leu Tyr Met Arq Ala 2000 2005

Val Val Glu ASp Leu His Leu 2015 2020

Leu His Ala Leu Glu Lys Gln 2030 2035

Pro Ser Ile Ser Gly Ile Glu 2045 2050

Gln Glu Leu Gln Lys Glu Asn 2060 2065

Asn Gln Leu Glu

Lys Glu Lys Asn

Lys Lys Trp Gln

Glu Lys Glu Gly

Leu Lys Asp Leu

Gln Arq Lys Leu

Gly Ile Arq Ala

Lys Arq Asn Leu

His Gln Ala Leu

Gln Asn Arq Tyr

Phe Ser Lys ASp

Ser Asp Asp His

Leu Lys Leu Ser

Gly Lys Val Glu 1890

Ala Lys Glu Glu 1905

Ala Lys Ile Glu 1920

Glu Val Phe Thr 1935

Phe Ala Lys Ala 1950

Lys Thr Thr Gly 1965

Leu Glu Ser Glu 1980

ASp Leu Glu Asn 1995

Pro Arq Asp Ser 2010

Leu Gln Glu Lys 2025

Thr Tyr Ser Lys 2040

Cys Gln Arq Glu 2055

Ser Glu Asn Ile 2070

Glu Leu Lys Phe Gln Leu Glu Gln Ala Asn Lys Asp Leu Pro Arq 2075 2080 2085

Leu Lys Asn Gln Val Arg Asp Leu Lys Glu Met Cys Glu Phe Leu 2090 2095 2100

Lys Lys Glu Lys Ala Glu Val Gln Arg Lys Leu Gly His Val Arg 2105 2110 2115

Gly Ser Gly Arg Ser Gly Lys Thr Ile Pro Glu Leu Glu Lys Thr 2120 2125 2130

Ile Gly Leu Met Lys Lys Val Val Glu Lys Val Gln Arg Glu Asn 2135 2140 2145

Glu Gln Leu Lys Lys Ala Ser Gly Ile Leu Thr Ser Glu Lys Met 2150 2155 2160

Ala Asn Ile Glu Gln Glu Asn Glu Lys Leu Lys Ala Glu Leu Glu 2165 2170 2175

Lys Leu Lys Ala His Leu Gly His Gln Leu Ser Met His Tyr Glu 2180 2185 2190

Ser Lys Thr Lys Gly Thr Glu Lys rle rle Ala Glu Asn Glu Arg 2195 2200 2205

Leu Arg Lys Glu Leu Lys Lys Glu Thr Asp Ala Ala Glu Lys Leu 2210 2215 2220

Arg Ile Ala Lys Asn Asn Leu Glu Ile Leu Asn Glu Lys Met Thr 2225 2230 2235

Val Gln Leu Glu Glu Thr Gly Lys Arg Leu Gln Phe Ala Glu Ser 2240 2245 2250

Arg Gly Pro Gln Leu Glu Gly Ala Asp Ser Lys Ser Trp Lys Ser 2255 2260 2265

Ile Val Val Thr Arq Met Tyr Glu Thr Lys Leu Lys Glu Leu Glu 2270 2275 2280

Thr Asp rle Ala Lys Lys Asn Gln Ser rle Thr Asp Leu Lys Gln 2285 2290 2295

Leu Val Lys Glu Ala Thr Glu Arg Glu Gln Lys Val Asn Lys Tyr 2300 2305 2310

Asn Glu Asp Leu Glu Gln Gln Ile Lys Ile Leu Lys His Val Pro 2315 2320 2325

Glu Gly Ala Glu Thr Glu Gln Gly Leu Lys Arg Glu Leu Gln Val 2330 2335 2340

Leu Arq Leu Ala Asn Bis Gln Leu Asp Lys Glu Lys Ala Glu Leu 2345 2350 2355

Ile Bis Gln Ile Glu Ala Asn Lys Asp Gln Ser Gly Ala Glu Ser 2360 2365 2370

Thr Ile Pro Asp Ala Asp Gln Leu Lys Glu Lys Ile Lys Asp Leu 2375 2380 2385

Glu Thr Gln Leu Lys Met Ser Asp Leu Glu Lys Gln Bis Leu Lys 2390 2395 2400

Glu Glu Ile Lys Lys Leu Lys Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Pro 2405 2410 2415

Ser Phe Phe Glu Glu Ile Glu Asp Leu Lys Tyr Asn Tyr Lys Glu 2420 2425 2430

Glu Val Lys Lys Asn Ile Leu Leu Glu Glu Lys Val Lys Lys Leu 2435 2440 2445

Ser Glu Gln Leu Gly Val Glu Leu Thr Ser Pro Val Ala Ala Ser 2450 2455 2460

G1u G1u Phe Glu Asp Glu Glu Glu Ser Pro Val Asn Phe Pro Ile 2465 2470 2475

Tyr

<210> 4

<211> 128 5 <212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> misc_feature 10 <223> exoo de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos

<220>

<221> misc fealure

<223> exoo -de CEP290 aberrante de 128 nucleótidos

<400> 4

taqaqatqqq qtttcacctt qttaqccaqq atqqtgtcqa tctcctqaac tcgtqatcca 60

cccqcctcqq cctcctaaaq tqctqqqatt acaqat gtqa qccaccgcac ctqqccccaq 120

ttgtaatt 128

<210> 5

<211>997

<212> PRT

<213> Horno sapiens

5

<220>

<221> característica de VARIOS

<222> (1 )..(997)

<223> aberrante CEP290 polipéptido

10

<400> 5

Met Pro Pro Asn Ile Asn Trp Lys Glu Ile Met Lys Val Asp Pro Asp 1 5 10 15

ASp Leu Pro Arg Gln GIu

GIu Leu Ala ASp Asn Leu Leu Ile Ser Leu

20

25 30

Ser Lys

Val GIu Val Asn GIu Leu Lys Ser GIu Lys Gln GIu Asn Val

35

40 45

Ile His

Leu Phe Arq rle Thr Gln Ser Leu Met Lys Met Lys Ala Gln

50

55 60

GIu Val Glu Leu Ala Leu GIu Glu Val GIu Lys Ala Gly GIu GIu Gln 65 70 75 80

Ala Lys Phe GIu Asn Gln Leu Lys Thr Lys Val Met Lys Leu GIu Asn 85 90 95

GIu Leu GIu Met Ala Gln Gln Sel::' Ala Gly Gly Arg Asp Thr Arg Phe

100 105 110

Leu Arg Asn GIu Ile Cys Gln Leu GIu Lys Gln Leu Glu Gln Lys ASp 115 121l 125

Arg GIu Leu GIu Asp Met GIu Lys GIu Leu GIu Lys GIu Lys Lys Val 130 135 140

Asn GIu Gln Leu Ala Leu Arq Asn GIu GIu Ala GIu Asn GIu Asn Ser 145 150 155 160

Lys Leu Arg Arg GIu Asn Lys Arq Leu Lys Lys Lys Asn GIu Gln Leu 165 170 175

Cys Gln ASp Ile Ile ASp Tyr Gln Lys Gln I1e Asp Ser Gln Lys GIu 180 185 190

Thr Leu Leu Ser Arq Arg Gly GIu Asp Ser Asp Tyr Arg Ser Gln Leu 195 201l 205

Ser Lys Lys Asn Tyr Glu Leu Ile Gln Tyr Leu Asp Glu Ile Gln Thr 210 215 220

Leu Thr Glu Ala Asn Glu Lys Ile Glu val Gln Asn Gln Glu Met Arq 225 230 235 240

Lys Asn Leu Glu Glu Ser Val Gln Glu Met Glu Lys Met Thr Asp Glu 245 250 255

Tyr Asn Arq Met Lys Ala Ile Val His Gln Thr Asp Asn Val Ile Asp 260 265 270

Gln Leu Lys Lys Glu Asn Asp His Tyr Gln Leu Gln Val Gln Glu Leu 275 280 285

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Ala Val Asn Ala Lys Val Glu Glu Trp Lys Leu Ile Leu Ser Ser Lys 305 310 315 320

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Lys Leu Lys Asn Ala Gln Leu Asp Ala Asp Lys Ser Asn Val Met Ala 340 345 350

Leu Gln Gln Gly Ile Gln Glu Arq Asp Ser Gl n Ile Lys Met Leu Thr 355 360 365

Glu Gln Val Glu Gln Tyr Thr Lys Glu Met Glu Lys Asn Thr Cys Ile 370 375 380

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Leu Ser Gln Gln Thr Ris Met Lys Ile Gln Ser Thr Leu Asp Ile Leu 405 410 415

Lys Glu Lys Thr Lys Glu Ala Glu Arg Thr Ala Glu Leu Ala Glu Ala 420 425 430

ASp Ala Arq Glu Lys ASp Lys Glu Leu Val Glu Ala Leu Lys Arq Leu 435 440 445

Lys Asp Tyr Glu Ser Gly Val Tyr Gly Leu Glu Asp Ala Val val Glu

450 455 460

Ile Lys Asn Cys Lys Asn Gln Ile Lys Ile Arg Asp Arg Glu Ile Glu

465 470 475 480

Ile Leu Thr Lys Glu Ile Asn Lys Leu Glu Leu Lys Ile Ser Asp Phe 485 490 495

Leu ASp Glu Asn Glu Ala Leu Arq Glu Arq Val Gly Leu Glu Pro Lys 500 505 510

Thr Met Ile Asp Leu Thr Glu Phe Arq Asn Ser Lys His Leu Lys Gln 515 520 525

Gln Gln Tyr Arg Ala Glu Asn Gln Ile Leu Leu Lys Glu Ile Glu Ser 530 535 540

Leu Glu Glu Glu Arg Leu Asp Leu Lys Lys Lys Ile Arg Gln Met Ala 545 550 555 560

Gln Glu Arg Gly Lys Arg Ser Ala Thr Ser Gly Leu Thr Thr Glu Asp 565 570 575

Leu Asn Leu Thr Glu Asn Ile Ser Gln Gly ASp Arg Ile Ser Glu Arg 580 585 590

Lys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Lys Asn Met Ser Glu Ala Gln Ser Lys

595 600 605

Asn Glu Phe Leu Ser Arg Glu Leu Ile Glu Lys Glu Arq ASp Leu Glu 610 615 620

Arq

Ser Arg Thr Val Ile Ala Lys Phe Gln Asn Lys Leu Lys Glu Leu

625

630 635 640

Val Glu Glu Asn Lys

Gln Leu Glu Glu Gly Met Lys Glu Ile Leu Gln

645

650 655

Ala Ile Lys

Glu Met Gln Lys Asp Pro Asp Val Lys Gly Gly Glu Thr

660

665 670

Ser Leu Ile Ile Pro Ser Leu Glu Arg Leu Val Asn Ala Ile Glu Ser 675 680 685

Lys Asn Ala Glu Gly Ile Phe Asp Ala Ser Leu His Leu Lys Ala Gln 690 695 700

Val Asp Gln Leu Thr Gly Arg Asn Glu Glu Leu Arg Gln Glu Leu Arg 705 710 715 720

Glu

Ser Arg Lys Glu Ala Ile Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Ala Lys Ala

725

730 735

Asn Leu

Lys Ile Asp His Leu Glu Lys Glu Thr Ser Leu Leu Arg Gln

740

745 750

Ser Glu Gly Ser Asn Val Val Phe Lys Gly Ile Asp Leu Pro Asp Gly 755 760 765

Ile Ala Pro Ser Ser Ala Ser Ile Ile Asn Ser Gln Asn Glu Tyr Leu 770 775 780

Ile His Leu Leu Gln Glu Leu Glu Asn Lys Glu Lys Lys Leu Lys Asn 785 790 795 800

Leu Glu Asp Ser Leu Glu Asp Tyr Asn Arg Lys Phe Ala Val Ile Arg 805 810 815

His Gln Gln Ser Leu Leu Tyr Lys Glu Tyr Leu Ser Glu Lys Glu Thr 820 825 830

Trp Lys Thr Glu Ser Lys Thr Ile Lys Glu Glu Lys Arg Lys Leu Glu 835 840 845

Asp Gln Val Gln Gln Asp Ala Ile Lys Val Lys Glu Tyr Asn Asn Leu 850 855 860

Leu Asn Ala Leu Gln Met Asp Ser Asp Glu Met Lys Lys Ile Leu Ala 865 870 875 880

Glu Asn Ser Arg Lys Ile Thr Val Leu Gln Val Asn Glu Lys Ser Leu 885 890 895

Ile Arg Gln Tyr Thr Thr Leu Val Glu Leu Glu Arg Gln Leu Arg Lys 900 905 910

Glu Asn Glu Lys Gln Lys Asn Glu Leu Leu Ser Met Glu Ala Glu Val 915 920 925

Cys Glu Lys Ile G1y Cys Leu Gln Arg Phe Lys Glu Met Ala I1e Phe 930 935 940

Lys Ile Ala Ala Leu Gln Lys Val Val Asp Asn Ser Val Ser Leu Ser 945 950 955 960

Glu Leu Glu Leu Ala Asn Lys Gln Tyr Asn Glu Leu Thr Ala Lys Tyr 965 970 975

Arq Asp Ile Leu Gln Lys Asp Asn Met Leu Val Gln Arq Thr Ser Asn 980 985 990

Leu Glu His Leu Glu 995

<210> 6

<211> 143

<212> DNA

<213> Hamo sapiens

<220>

<221> misc_fealure

<222> (1).. (143)

<223> motivo de 143 nucle6tido

<400> 6 taqaqatqqq gtttcacctt gttaqccaqq atqgtgtcqa tctcctqaac tcgtqatcca 60

cccqcctcqq cctcctaaaq tqctqqqatt acaqatgtqa qccaccqcac ctqqccccaq 120

ttgtaattgt qaatatctca tac 143

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Hamo sapiens

<220>

<221> misc_feature

<222> (1 ) .. (42)

<223> motivo de 42 nucle6tidos

<400> 7 acagatgtga gccaccgcac ctggccccag ttgtaattgt ga 42

<210> 8 <211>24

<212> DNA

<213> Hamo sapiens

<220>

<221> misc_fealure

<222> (1) .. (24)

<223> motivo de 24 nucle61idos

<400> 8 ccaccgcacc Iggccccagl tgla 4

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AON-1

<400> 9 taatcccagc actttaggag 20 <210>10

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AON-2

<400> 10 gggccaggtg cggtgg 16

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AON-3

<400> 11 aactggggcc aggtgcg 17

<210>12

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> AON-4

<400> 12 tacaactggg gccaggtg 18

<210>13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220> <:223> AON-5

<400> 13 actcacaatt acaactgggg 20

<210>14

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SON-3

<400> 14 cgcacctggc cccagtt 17

<210>15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cebador PCR

<400> 15 tgctaagtac agggacatct tgc 23

<210>16

<211>25

<212> DNA

<213> Artificial

5

<220>

<223> cebador PCR

<400> 16

10

agactccact tgttctttta aggag 25

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Oligonucleótido antisentido de salto del exón que se enlaza ylo es complementario a un polinucleótido con la secuencia de nuc1eótidos como se muestra en SEO ID N.o: 8, en el que dicho oligonucleótido comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEa ID N.o: 10, SEa ID N.o: 11 y SEa ID

   N.o: 12, y en el que un nucleótido en el oligonucleótido antisentido puede ser un residuo de RNA, un residuo de DNA, o un análogo de nucleótido o equivalente.

2. 2.

   Oligonucleótido antisentido de salto del exón según la reivindicación 1, que comprende un oligonuc1eótido antisentido de 2'-0 alquilo fosforotioato, tal como ribosa modificada por 2'-0-metilo (RNA), ribosa modificada por 2'-0-etilo, ribosa modificada por 2'-0-propilo, ylo derivados sustituidos de estas modificaciones tales como derivados halogenados.

3. 3.

   Vector virico que expresa un oligonucleótido antisentido de salto del exón tal y como se define en la reivindicación 1 cuando se coloca bajo las condiciones propicias para la expresión del oligonucleótido antisentido.

4. 4.

   Composición farmacéutica que incluye un oligonucleótido antisentido de salto del exón según la reivindicación 1 o 2 o un vector vírico según la reivindicación 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. 5.

   Oligonucleótido antisentido de salto del exón según la reivindicación 1 o 2, el vector según la reivindicación 3 o la composición según la reivindicación 4 para uso como un medicamento.

6. 6.

   Oligonucleótido antisentido de salto del exón según la reivindicación 1 o 2, el vector según la reivindicación 3 o la composición según la reivindicación 4 para usar en el tratamiento de la amaurosis congénita de Leber.

7. 7.

   Método in vitro y/o ex vivo para modular el empalme de CEP290 en una célula, dicho método comprendiendo el contacto de dicha célula con un oligonucleótido antisentido de salto del exón tal y como se define en la reivindicación 1 o 2, el vector según la reivindicación 3 o la composición según la reivindicación

8. 4.