CN110951731A - 用于调节c9orf72表达的组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用C90RF72特异性抑制剂减少动物体内C90RF72mRNA和蛋白质的表达的组合物和方法。所述方法可用于治疗、预防或改善有需要的个体的神经退化性疾病。所述C90RF72特异性抑制剂包括反义化合物。可以通过施用C90RF72特异性抑制剂进行治疗、预防及改善的神经退化性疾病的实例包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型性帕金森样综合征及橄榄体脑桥小脑退化(OPCD)。

Description

用于调节C9ORF72表达的组合物
本申请是申请号为201380053819.8的中国发明专利申请(其申请日为2013年10月15日，发明名称为“用于调节C9ORF72表达的组合物”)的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2013/065073的中国国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2012年10月15日，申请号为61/714,132的美国临时申请的优先权。
序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交。序列表是以题为BIOL0211WOSEQ.txt的文件提供，该文件于2013年10月14日创建，大小是184Kb。该电子格式的序列表中的信息是通过引用的方式整体并入本文中。
领域
本发明提供了用于减少动物体内C9ORF72 mRNA和蛋白质的表达的组合物和方法。这些方法可用于治疗、预防或改善神经退化性疾病，包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型性帕金森样综合征及橄榄体脑桥小脑退化(OPCD)。
背景
肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种致死性神经退化性疾病，临床特征是进行性麻痹，从而因呼吸衰竭而导致死亡，此典型地在症状发作的两年到三年内发生(Rowland和Shneider,N.Engl.J.Med.,2001,344,1688-1700)。ALS是西方国家第三大最常见的神经退化性疾病(Hirtz等人,Neurology,2007,68,326-337)，并且目前尚无有效的疗法。约10％的病例本质上是家族性的，而大多数诊断患有该疾病的患者被归类为散发的，因为他们看来是在群体中随机发生的(Chio等人,Neurology,2008,70,533-537)。基于临床、遗传和流行病学数据，人们逐渐认识到，ALS和额颞叶痴呆(FTD代表了疾病的重叠连续过程，在病理学上以整个中枢神经系统中TDP-43阳性包涵体的存在为特征(Lillo和Hodges,J.Clin.Neurosci.,2009,16,1131-1135；Neumann等人,Science,2006,314,130-133)。
截至目前，已经发现多个基因会引起典型家族性ALS，例如，SOD1、TARDBP、FUS、OPTN及VCP(Johnson等人,Neuron,2010,68,857-864；Kwiatkowski等人,Science,2009,323,1205-1208；Maruyama等人,Nature,2010,465,223-226；Rosen等人,Nature,1993,362,59-62；Sreedharan等人,Science,2008,319,1668-1672；Vance等人,Brain,2009,129,868-876)。近来，针对涉及多例ALS、FTD及ALS-FTD的家族的连锁分析表明，在第9号染色体的短臂上存在一个重要的疾病基因座(Boxer等人,J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry,2011,82,196-203；Morita等人,Neurology,2006,66,839-844；Pearson等人,J.Nerol.,2011,258,647-655；Vance等人,Brain,2006,129,868-876)。染色体9p21ALS-FTD基因座位于突变会引起ALS的最主要常染色体显性基因中。引起ALS-FTD的突变是在C9ORF72基因的第一个内含子中的一个较长的六核苷酸(GGGGCC)重复扩增中(Renton等人,Neuron,2011,72,257-268；DeJesus-Hernandez等人,Neuron,2011,72,245-256)。在大多数与这一区域相关的病例中都存在涵盖C9ORF72基因的祖先单倍型(founder haplotype)(Renton等人,Neuron,2011,72,257-268)。在一组405位芬兰患者中，在染色体9p21上的这一基因座引起近半数的家族性ALS并且在所有ALS病例中占近四分之一(Laaksovirta等人,Lancet Neurol.,2010,9,978-985)。
在与该区域相关的大多数病例中都存在涵盖C9ORF72基因的祖先单倍型。
目前尚无治疗此类神经退化性疾病的有效疗法。因此，目的是提供用于治疗此类神经退化性疾病的组合物和方法。
概述
本文提供了用于调节细胞、组织及动物中C9ORF72 mRNA和蛋白质含量的组合物和方法。在某些实施方案中，C9ORF72特异性抑制剂调节C9ORF72 mRNA和蛋白质的表达。在某些实施方案中，C9ORF72特异性抑制剂是核酸、蛋白质或小分子。
在某些实施方案中，调节可以在细胞或组织中发生。在某些实施方案中，所述细胞或组织是在动物体内。在一些实施例中，所述动物是人类。在某些实施方案中，C9ORF72mRNA的含量降低。在某些实施方案中，C9ORF72蛋白质的含量降低。在某些实施方案中，优先减少某些C9ORF72 mRNA变体。在某些实施方案中，优先减少的C9ORF72 mRNA变体是含内含子1的变体。在某些实施方案中，内含子1含有六核苷酸重复扩增。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增与C9ORF72相关疾病有关。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增与C9ORF72六核苷酸重复扩增相关疾病有关。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增包含至少30个GGGGCC重复序列。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增与核灶相关。在某些实施方案中，本文所描述的组合物和方法可用于减少C9ORF72 mRNA含量、C9ORF72蛋白质含量及核灶。此类减少可以按时间依赖性方式或按剂量依赖性方式发生。
还提供了可用于预防、治疗及改善C9ORF72相关疾病、病症及疾患的方法。在某些实施方案中，此类C9ORF72相关疾病、病症及疾患是神经退化性疾病。在某些实施方案中，神经退化性疾病是肌萎缩侧索硬化(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)、皮质基底变性综合征(CBD)、非典型性帕金森样综合征及橄榄体脑桥小脑退化(OPCD)。
此类疾病、病症及疾患可以共有一种或多种风险因素、成因或结果。有关神经退化性疾病，特别是ALS和FTD发展的某些风险因素和成因包括遗传倾向性和高龄。
在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用C9ORF72特异性抑制剂。在某些实施方案中，C9ORF72特异性抑制剂是核酸。在某些实施例中，该核酸是一种反义化合物。在某些实施方案中，该反义化合物是单链反义寡核苷酸。在某些实施方案中，该单链反义寡核苷酸与C9ORF72核酸互补。
详述
应了解，前述总述和以下详细说明都仅是示例性和解释性的，并且不是对所要求保护的发明的限制。在本文中，除非另作具体规定，否则单数形式的使用包括复数形式。除非另作规定，否则如本文所使用，使用“或”意指“和/或”。另外，除非另作规定，否则如本文所使用，使用“和”意指“和/或”。此外，使用术语“包括(including)”以及其它形式，如“包括(includes)”和“包括(included)”并非限制性的。另外，除非另作具体规定，否则术语诸如“成分”或“组分”涵盖了包含一个单元的成分和组分以及包含超过一个亚单元的成分和组分。
本文使用的任何章节标题都只是出于组织的目的，而不应解释为限制所描述的主题内容。本公开中引用的所有文献或文献的部分，包括但不限于，专利、专利申请、公布的专利申请、文章、书籍、论文以及GENBANK登录号和通过数据库(诸如美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))获得的相关序列信息及在本文的整个公开内容中所提到的其它数据都通过引用本文所论述的文献部分以及其全文清楚地并入本文中。
定义
除非提供具体定义，否则结合本文中所描述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学的程序和技术使用的命名法及是本领域中众所周知并且常用的那些。化学合成和化学分析可以使用标准技术。
除非另作指示，否则以下术语具有以下含义：
“2’-O-甲氧基乙基”(又称2’-MOE和2’-OCH2CH2-OCH3及MOE)是指呋喃糖基环2’位的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是一种修饰的糖。
“2’-MOE核苷”(又称2’-O-甲氧基乙基核苷)意指包含2’-O-甲氧基乙基的核苷。
“5-甲基胞嘧啶”意指通过在5’位附接甲基进行修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是修饰的核碱基。
“约”意指在值的±7％范围内。举例来说，如果规定“化合物实现了对C9ORF72至少约70％的抑制”，则暗示C9ORF72含量被抑制在63％与77％的范围内。
“伴随施用”是指以任何方式共施用两种药剂，其中两种药剂的药理学作用同时在患者体内表现。伴随施用不需要以单一药物组合物、以相同剂型或通过相同施用途径施用两种药剂。两种药剂的作用本身无需同时表现。这些作用只需要重叠一段时间并且无需延伸相同时间。
“施用”意指将药剂提供给动物，并且包括但不限于，由医学专业人员施用及自行施用。
“改善(Amelioration/ameliorate/ameliorating)”是指疾病、病症或疾患的至少一种指标、病征或症状的减轻。指标的严重性可以通过本领域技术人员已知的主观或客观措施测定。
“动物”是指人类或非人类动物，包括但不限于，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪，及非人类灵长类动物，包括但不限于，猴和黑猩猩。
“抗体”是指以通过某种方式与抗原特异性反应为特征的一种分子，其中抗体和抗原各自相对于彼此定义。抗体可以指完整抗体分子或者其任何片段或区域，诸如重链、轻链、Fab区及Fc区。
“反义活性”意指可归于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性是靶核酸或由此类靶核酸编码的蛋白质的量或表达的减少。
“反义化合物”意指能够通过氢键合与靶核酸杂交的寡聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA及基于占位的化合物。反义机制包括但不限于，RNA酶H介导的反义；RNAi机制，这些机制利用了RISC通路并且包括但不限于，siRNA、ssRNA及微小RNA机制；以及基于占位的机制，包括但不限于，均一修饰的寡核苷酸。某些反义化合物可以通过超过一种此类机制和/或通过另外的机制起作用。
“反义抑制”意指相较于在反义化合物不存在下的靶核酸含量或靶蛋白含量，在与靶核酸互补的反义化合物存在下靶核酸的含量或靶蛋白的含量降低。抑制可以是包括RNA酶H降解(诸如用间隙聚体(gapmer))以及空间阻碍(诸如用均一修饰的寡核苷酸)在内的任何手段。
“反义寡核苷酸”意指具有容许与靶核酸的相应区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。
“双环糖”意指通过两个原子桥接进行修饰的呋喃糖基环。双环糖是一种修饰的糖。
“双环核苷”(又称BNA)意指糖部分包含连接糖环两个碳原子，从而形成双环系统的桥的核苷。在某些实施方案中，该桥连接了糖环的4’-碳和2’-碳。
“C9ORF72相关疾病”意指与任何C9ORF72核酸或其表达产物相关的任何疾病。此类疾病可以包括神经退化性疾病。此类神经退化性疾病可以包括ALS和FTD。
“C9ORF72六核苷酸重复扩增相关疾病”意指与含有六核苷酸重复扩增的C9ORF72核酸相关的任何疾病。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增可以包含重复至少30次的GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG。此类疾病可以包括神经退化性疾病。此类神经退化性疾病可以包括ALS和FTD。
“C9ORF72核酸”意指编码C9ORF72的任何核酸。举例来说，在某些实施方案中，C9ORF72核酸包括编码C9ORF72的DNA序列、由编码C9ORF72的DNA(包括了含内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列，以及编码C9ORF72的mRNA序列。“C9ORF72mRNA”意指编码C9ORF72蛋白质的mRNA。
“C9ORF72特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性抑制C9ORF72 mRNA和/或C9ORF72蛋白质的表达的任何试剂。举例来说，C9ORF72特异性抑制剂包括核酸(包括反义化合物)、siRNA、适体、抗体、肽、小分子，及能够抑制C9ORF72 mRNA和/或C9ORF72蛋白质的表达的其它试剂。类似地，在某些实施方案中，C9ORF72特异性抑制剂可能影响动物体内的其它分子过程。
“帽结构”或“末端帽部分”意指已经在反义化合物任一末端处掺入的化学修饰。
“cEt”或“约束的乙基(constrained ethyl)”意指具有包含连接4’-碳和2’-碳的桥的糖部分的双环核苷，其中该桥具有式：4’-CH(CH3)-O-2’。
“约束的乙基核苷”(又称cEt核苷)意指包括了含4’-CH(CH3)-O-2’桥的双环糖部分的核苷。
“化学上不同的区域”是指反义化合物中以某种方式在化学上不同于同一反义化合物的另一区域的区域。举例来说，具有2’-O-甲氧基乙基核苷的区域在化学上不同于具有不含2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷的区域。
“嵌合反义化合物”意指具有至少两个化学上不同的区域的反义化合物。
“共施用”意指向个体施用两种或更多种药剂。这两种或更多种药剂可以是在单一药物组合物中，或者可以在分开的药物组合物中。这两种或更多种药剂的每一种可以通过相同或不同的施用途径施用。共施用涵盖并行或依序施用。
“互补性”意指第一核酸和第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“连续核碱基”意指彼此直接相邻的核碱基。
“稀释剂”意指组合物中缺乏药理学活性，但是药学上必要或需要的成分。举例来说，注射用组合物中的稀释剂可以是一种液体，例如生理盐水溶液。
“剂量”意指通过单次施用或以指定时间段提供的药剂的指定量。在某些实施方案中，剂量可以通过一次、两次或更多次大剂量、片剂或注射剂施用。举例来说，在希望皮下施用的某些实施方案中，希望的剂量需要不易于通过单次注射供应的体积，因此，可以使用两次或更多次注射来达到希望的剂量。在某些实施方案中，药剂是通过输注，经一段较长时间或连续施用的。剂量可以规定为每小时、每天、每周或每个月的药剂量。
“有效量”意指足以在需要药剂的个体中实现希望的生理结果的药剂量。有效量可以取决于有待治疗的个体的健康和生理状况、有待治疗的个体的分类群、组合物的配方、个体的医学疾患的评估以及其它相关因素而在个体间变化。
“表达”意指信息从C9ORF72基因经由转录而转化成mRNA，然后经由翻译而转化成蛋白质。表达可以引起C9ORF72基因的表型表现。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的每个核碱基都在第二核酸中具有互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸是反义化合物并且靶核酸是第二核酸。
“间隙聚体”意指具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间的嵌合反义化合物，其中构成该内部区域的核苷在化学上不同于构成这些外部区域的一个或多个核苷。内部区域可以称为“间隙”，并且外部区域可以称为“翼”。
“间隙变窄”意指9个或更少连续2’-脱氧核糖核苷的间隙区段位于具有1到6个核苷的5’翼区段与3’翼区段之间并且与其直接相邻的嵌合反义化合物。
“间隙变宽”意指12个或更多连续2’-脱氧核糖核苷的间隙区段位于具有1到6个核苷的5’翼区段与3’翼区段之间并且与其直接相邻的嵌合反义化合物。
“六核苷酸重复扩增”意指重复至少两次的一系列六个碱基(例如GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC)。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增可以位于C9ORF72核酸的内含子1中。在某些实施方案中，致病性六核苷酸重复扩增包括C9ORF72核酸中至少重复30次的GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC并且与疾病相关。在某些实施方案中，这些重复序列是连续的。在某些实施方案中，这些重复序列间杂1个或多个核碱基。在某些实施方案中，野生型六核苷酸重复扩增包括C9ORF72核酸中GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG或GGGGGC的23次或更少重复。在某些实施方案中，这些重复序列是连续的。在某些实施方案中，这些重复序列间杂1个或多个核碱基。
“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括反义化合物与靶核酸。
“鉴别患有C9ORF72相关疾病的动物”意指鉴别已经诊断患有C9ORF72相关疾病或易于发展C9ORF72相关疾病的动物。于发展C9ORF72相关疾病的个体包括了具有发展C9ORF72相关疾病的一个或多个风险因素的那些个体，包括具有一种或多种C9ORF72相关疾病的个人或家族史或者遗传倾向的那些个体。此类鉴别可以通过任何方法实现，所述方法包括评价个体的医疗史和标准临床测试或评估，诸如遗传测试。
“直接相邻”意指在直接相邻的元件之间没有插入元件。
“个体”意指选择用于治疗或疗法的人类或非人类动物。
“抑制C9ORF72”意指相较于在C9ORF72特异性抑制剂(诸如C9ORF72反义寡核苷酸)不存在下C9ORF72 mRNA的表达和/或蛋白质含量，在C9ORF72特异性抑制剂(包括C9ORF72反义寡核苷酸)存在下C9ORF72 mRNA的表达和/或蛋白质含量降低。
“核苷间键”是指核苷之间的化学键。
“相连的核苷”意指键结在一起的相邻核苷。
“错配”或“不互补核碱基”是指第一核酸的核碱基不能与第二核酸或靶核酸的相应核碱基配对的情形。
“修饰的核苷间键”是指相对于天然存在的核苷间键(即，磷酸二酯核苷间键)的取代或任何变化。
“修饰的核碱基”是指除腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷或尿嘧啶外的任何核碱基。“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“修饰的核苷酸”意指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷间键或修饰的核碱基的核苷酸。“修饰的核苷”意指独立地具有修饰的糖部分或修饰的核碱基的核苷。
“修饰的寡核苷酸”意指包含修饰的核苷间键、修饰的糖或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“修饰的糖”是指相对于天然糖的取代或改变。
“基序”意指反义化合物中化学上不同的区域的形式。
“天然存在的核苷间键”意指3'到5'磷酸二酯键。
“天然糖部分”意指DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中所见的糖。
“核酸”是指由单体核苷酸构成的分子。核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)及微小RNA(miRNA)。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基序列”意指任何与糖、键或核碱基修饰无关的连续核碱基的次序。
“核苷”意指与糖相连的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于替代糖或糖和碱基并且未必替代在寡聚化合物的一个或多个位置处的键的那些结构，诸如例如具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、双环糖模拟物或三环糖模拟物(例如非呋喃糖的糖单元)的核苷模拟物。核苷酸模拟物包括用于替代核苷以及在寡聚化合物的一个或多个位置处的键的那些结构，诸如例如肽核酸或吗啉代(由-N(H)-C(＝O)-O-连接的吗啉代或其它非磷酸二酯键)。糖替代物与略微更宽的术语核苷模拟物重叠，但只是意在指明糖单元(呋喃糖环)的替代。本文提供的四氢吡喃环是对糖替代物的一个实例的说明，其中呋喃糖基已经被四氢吡喃基环系统替代。
“核苷酸”意指磷酸酯基共价连接到核苷的糖部分的核苷。
“寡聚化合物”或“寡聚物”意指由相连的单体亚单元形成的一种聚合物，该聚合物能够与核酸分子的至少一个区域杂交。
“寡核苷酸”意指相连的核苷的一种聚合物，这些核苷中的每一个可以彼此独立地修饰或未修饰。
“肠胃外施用”意指通过注射或输注施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌肉内施用、动脉内施用、腹膜内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“肽”意指通过用酰胺键连接至少两个氨基酸所形成的分子。肽是指多肽和蛋白质。
“药剂”意指当施用给个体时，药物组合物中提供治疗益处的一种或多种物质。举例来说，在某些实施方案中，靶向C9ORF72的反义寡核苷酸是药剂。
“药物组合物”意指适合施用给个体的物质的混合物。举例来说，药物组合物可以包含一种或多种药剂及无菌水溶液。
“药学上可接受的衍生物”涵盖本文所描述的化合物的药学上可接受的盐、缀合物(conjugate)、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”意指反义化合物的生理学上和药学上可接受的盐，即，保留母体寡核苷酸的希望的生物活性并且不会赋予其非所希望的毒理作用的盐。
“硫代磷酸酯键”意指通过用硫原子替代一个非桥接氧原子来修饰磷酸二酯键的核苷之间的键。硫代磷酸酯键(P＝S)是修饰的核苷间键。
“部分”意指核酸中指定数量的连续(即，相连)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸中指定数量的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物中指定数量的连续核碱基。
“预防(Prevent/preventing)”是指延迟或阻止疾病、病症或疾患的发作或发展一段从数分钟到无限长的时间。预防还指降低疾病、病症或疾患发生的风险。
“前药”意指以无活性形式制备并且通过内源酶或其它化学品或条件的作用而在身体或其细胞内转化成活性形式的治疗剂。
“副作用”意指可归于治疗的除希望的作用外的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌病及不适。
“单链寡核苷酸”意指未与互补链杂交的寡核苷酸。
“可特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸与靶核酸之间具有足够的互补性程度以诱导希望的作用，同时在希望特异性结合的条件下，即，在生理条件(在体内测定和治疗性治疗的情况下)下对非靶核酸展现极少作用或不展现作用。
“靶向(Targeting，targeted)”意指反义化合物的设计和选择将与靶核酸特异性杂交并且诱导希望的作用的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”及“靶RNA转录物”都是指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶区段”意指靶核酸中被反义化合物靶向的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段中5’最末端核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段中3’最末端核苷酸。
“治疗有效量”意指向个体提供治疗益处的药剂的量。
“治疗/处理(Treat/treating)”是指施用药物组合物以实现疾病、病症或疾患的改变或改良。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分及核苷间键构成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸是RNA核苷酸(即，β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即，β-D-脱氧核糖核苷)。
某些实施方案
某些实施方案提供了用于减少C9ORF72 mRNA和蛋白质表达的方法。
某些实施方案提供了用于治疗、预防或改善有需要的个体的C9ORF72相关疾病、病症及疾患的方法。还涵盖用于制备供治疗、预防或改善C9ORF72相关疾病、病症或疾患用的药物的方法。C9ORF72相关疾病、病症及疾患包括神经退化性疾病。在某些实施方案中，神经退化性疾病可以是ALS或FTD。在某些实施方案中，神经退化性疾病可以是家族性或偶发性的。
某些实施方案提供了C9ORF72特异性抑制剂在治疗、预防或改善C9ORF72相关疾病中的用途。某些实施方案提供了C9ORF72特异性抑制剂在治疗、预防或改善C9ORF72六核苷酸重复扩增相关疾病中的用途。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增可以包含GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG。在某些实施方案中，C9ORF72特异性抑制剂是核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子，及其它能够抑制C9ORF72 mRNA和/或C9ORF72蛋白质表达的试剂。
本文描述了包含与C9ORF72核酸或C9ORF72同系物核酸互补的单链反义寡核苷酸的化合物。
在某些实施方案中，C9ORF72核酸是人C9ORF72核酸。
在某些实施方案中，C9ORF72核酸含有六核苷酸重复扩增。
在某些实施方案中，C9ORF72核酸不含六核苷酸重复扩增。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸与人C9ORF72核酸可特异性杂交。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸与人C9ORF72核酸的相等长度部分至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸与人C9ORF72核酸中的以下任一种互补：外显子、内含子、5’UTR、3’UTR、重复序列区、剪接点、外显子:外显子剪接点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10。
本文描述了包含单链反义寡核苷酸的化合物，所述单链反义寡核苷酸由12到30个相连的核苷组成并且包含核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:30-369的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸的每个核苷间键是修饰的核苷间键。
在某些实施方案中，修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含至少一个具有修饰的糖的修饰的核苷。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含至少一个包含双环糖的修饰的核苷。
在某些实施方案中，双环糖包含4’至2’桥，其选自：4’-(CH2)n-O-2’桥，其中n是1或2；及4’-CH2-O-CH2-2’。
在某些实施方案中，双环糖包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。
在某些实施方案中，至少一个具有修饰的糖的修饰的核苷包含非双环的2’-修饰的糖部分。
在某些实施方案中，2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲氧基乙基。
在某些实施方案中，2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲基。
在某些实施方案中，至少一个具有修饰的糖的修饰的核苷包含糖替代物。
在某些实施方案中，糖替代物是吗啉代。
在某些实施方案中，糖替代物是肽核酸
在某些实施方案中，每个核苷被修饰。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核碱基
在某些实施方案中，修饰的核碱基是5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含：
由相连的脱氧核苷组成的间隙区段；
由相连的核苷组成的5’翼区段；
由相连的核苷组成的3’翼区段；
其中间隙区段的位置与5’翼区段和3’翼区段直接相邻并且在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸包含：
由十个相连的脱氧核苷组成的间隙区段；
由五个相连的核苷组成的5’翼区段；
由五个相连的核苷组成的3’翼区段；
其中间隙区段与5’翼区段和3’翼区段直接相邻并且在5’翼区段与3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；并且其中每个核苷间键是硫代磷酸酯键。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由15个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由16个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由17个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由18个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由19个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由20个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由21个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由22个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由23个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由24个相连的核苷组成。
在某些实施方案中，单链反义寡核苷酸由25个相连的核苷组成。
本文描述了化合物用于生产用于治疗神经退化性疾病的药剂的用途。
本文提供了通过使细胞与靶向外显子1B上游的反义寡核苷酸接触而优先抑制含六核苷酸重复扩增的mRNA转录物的表达的方法。
反义化合物
寡聚化合物包括但不限于，寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸及siRNA。寡聚化合物对于靶核酸来说可以是“反义”的，意指它能够通过氢键合与靶核酸进行杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有一种核碱基序列，当以5’到3’方向书写时，该核碱基序列包含靶核酸中靶向该核碱基序列的靶区段的反向补体。在某些此类实施方案中，反义寡核苷酸具有一种核碱基序列，当以5’到3’方向书写时，该核碱基序列包含靶核酸中靶向该核碱基序列的靶区段的反向补体。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物是12到30个亚单元长。换句话说，此类反义化合物是12到30个相连的亚单元。在某些实施方案中，反义化合物是8到80个、12到50个、15到30个、18到24个、19到22个或20个相连的亚单元。在某些实施方案中，反义化合物是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个相连的亚单元长，或由上述值中任何两个所界定的范围。在一些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸，并且相连的亚单元是核苷。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义寡核苷酸可以缩短或截短。举例来说，单一亚单元可以缺失5’端(5’截短)或者可替代地缺失3’端(3’截短)。靶向C9ORF72核酸的缩短或截短的反义化合物可以使反义化合物的两个亚单元从5’端缺失，或者可替代地可以使两个亚单元从3’端缺失。可替代地，缺失的核苷可以分散于整个反义化合物中，例如在一个核苷从5’端缺失和一个核苷从3’端缺失的反义化合物中。
当在延长的反义化合物中存在单一另外的亚单元时，该另外的亚单元可以位于反义化合物的5’端或3’端。当存在两个或更多个另外的亚单元时，添加的亚单元可以彼此相邻，例如在两个亚单元添加到反义化合物的5’端(5’添加)或者可替代的3’端(3’添加)的反义化合物中。可替代地，添加的亚单元可以分散于整个反义化合物中，例如在一个亚单元添加到5’端并且一个亚单元添加到3’端的反义化合物中。
有可能增加或减小反义化合物(诸如反义寡核苷酸)的长度，和/或在不消除活性情况下引入错配碱基。举例来说，在Woolf等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7305-7309,1992)中，在卵母细胞注射模型中测试了一系列13-25个核碱基长度的反义寡核苷酸诱导靶RNA裂解的能力。在反义寡核苷酸末端附近具有8或11个错配碱基的25个核碱基长的反义寡核苷酸能够引导靶mRNA的特异性裂解，不过裂解程度比不含错配的反义寡核苷酸低。类似地，使用13个核碱基的反义寡核苷酸(包括具有1或3个错配的那些)也实现了靶特异性裂解。
Gautschi等人(J.Natl.Cancer Inst.93:463-471，2001年3月)证实，与bcl-2mRNA具有100％互补性并且与bcl-xL mRNA具有3个错配的寡核苷酸能够在体外和体内降低bcl-2和bcl-xL的表达。此外，这一寡核苷酸在体内展示出有效的抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358,1988)在兔网织红细胞测定中分别测试了一系列串联14个核碱基反义寡核苷酸，以及组成两条或三条串联反义寡核苷酸序列的28个和42个核碱基反义寡核苷酸停滞人DHFR翻译的能力。这三种各具有14个核碱基的反义寡核苷酸各自能够抑制翻译，不过抑制水平比28或42个核碱基反义寡核苷酸更适度。
反义化合物基序
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有按一定模式或基序排列的化学修饰的亚单元，由此赋予反义化合物诸如增强的抑制活性、对靶核酸增加的结合亲和力或对体内核酸酶降解的耐受性等特性。
嵌合反义化合物典型地含有至少一个修饰的区域，以赋予对核酸酶降解增加的耐受性、增加的细胞吸收、对靶核酸增加的结合亲和力和/或增加的抑制活性。嵌合反义化合物的第二区域可以任选地用作细胞核酸内切酶RNA酶H的底物，该酶裂解RNA:DNA双链体中的RNA链。
具有间隙聚体基序的反义化合物被认为是嵌合反义化合物。在间隙聚体中，具有支持RNaseH裂解的多个核苷酸的内部区域位于具有在化学上不同于内部区域核苷的多个核苷酸的外部区域之间。在具有间隙聚体基序的反义寡核苷酸的情况下，间隙区段一般用作核酸内切酶裂解的底物，而翼区段包含修饰的核苷。在某些实施方案中，间隙聚体的这些区域是通过构成每一不同区域的糖部分的类型进行区分。在一些实施方案中，用于区别间隙聚体各区域的糖部分的类型可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2'-修饰的核苷(此类2’-修饰的核苷可以包括2’-MOE和2’-O-CH3等)以及双环糖修饰的核苷(此类双环糖修饰的核苷可以包括具有4’-(CH2)n-O-2’桥(其中n＝1或n＝2)和4’-CH2-O-CH2-2’的那些)。优选地，每个不同的区域包含均一的糖部分。翼-间隙-翼基序常常被描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5’翼区的长度，“Y”表示间隙区的长度，并且“Z”表示3’翼区的长度。如本文中所使用，描述为“X-Y-Z”的间隙聚体的构型使得间隙区段与5’翼区段和3’翼区段中的每一个直接相邻。因此，在5’翼区段与间隙区段之间，或在间隙区段与3’翼区段之间不存在插入核苷酸。本文所描述的反义化合物中任一种都可以具有间隙聚体基序。在一些实施方案中，X与Z相同，在其它实施方案中，其不同。在一个优选的实施方案中，Y介于8与15个核苷酸之间。X、Y或Z可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多个核苷酸中任一种。因此，本文所描述的间隙聚体包括但不限于，例如5-10-5、5-10-4、4-10-4、4-10-3、3-10-3、2-10-2、5-9-5、5-9-4、4-9-5、5-8-5、5-8-4、4-8-5、5-7-5、4-7-5、5-7-4或4-7-4。
在某些实施方案中，反义化合物具有“翼聚体(wingmer)”基序，该基序具有翼-间隙或间隙-翼构型，即，如以上关于间隙聚体构型所描述的X-Y或Y-Z构型。因此，本文所描述的翼聚体构型包括但不限于，例如5-10、8-4、4-12、12-4、3-14、16-2、18-1、10-3、2-10、1-10、8-2、2-13、5-13、5-8或6-8。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有5-10-5间隙聚体基序。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有5-10-4间隙聚体基序。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有4-10-4间隙聚体基序。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有4-10-3间隙聚体基序。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有5-9-5间隙聚体基序。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物具有间隙变窄的基序。在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的间隙变窄的反义寡核苷酸具有9、8、7或6个2’-脱氧核苷酸的间隙区段，该间隙区段与5、4、3、2或1个化学修饰的核苷的翼区段直接相邻并且位于这些翼区段之间。在某些实施方案中，化学修饰包含双环糖。在某些实施方案中，双环糖包含4’至2’桥，其选自：4’-(CH2)n-O-2’桥，其中n是1或2；及4’-CH2-O-CH2-2’。在某些实施方案中，双环糖包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。在某些实施方案中，化学修饰包括非双环的2’-修饰的糖部分。在某些实施方案中，非双环的2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲基乙基或2’-O-甲基。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物是均一修饰的。在某些实施方案中，反义化合物包含12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷。在某些实施方案中，每个核苷被化学修饰。在某些实施方案中，化学修饰包含非双环的2’-修饰的糖部分。在某些实施方案中，2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲氧基乙基。在某些实施方案中，2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲基。在某些实施方案中，均一修饰的反义化合物可以靶向C9ORF72，或其任何部分，诸如六核苷酸重复扩增。在某些实施方案中，用均一修饰的反义化合物靶向六核苷酸重复扩增通过阻断与RNA结合蛋白的相互作用来减少重复RNA。在某些实施方案中，这使得有毒RNA不存在于灶点中而是被降解。
靶核酸、靶区及核苷酸序列
编码C9ORF72的核苷酸序列包括但不限于，以下各序列的补体：GENBANK登录号NM_001256054.1(作为SEQ ID NO:1并入本文中)、截短核碱基27535000到27565000的GENBANK登录号NT_008413.18(作为SEQ ID NO:2并入本文中)、GENBANK登录号BQ068108.1(作为SEQID NO:3并入本文中)、GENBANK登录号NM_018325.3(作为SEQ ID NO:4并入本文中)、GENBANK登录号DN993522.1(作为SEQ ID NO:5并入本文中)、GENBANK登录号NM_145005.5(作为SEQ ID NO:6并入本文中)、GENBANK登录号DB079375.1(作为SEQ ID NO:7并入本文中)、GENBANK登录号BU194591.1(作为SEQ ID NO:8并入本文中)、序列标识符4141_014_A(作为SEQ ID NO:9并入本文中)及序列标识符4008_73_A(作为SEQ ID NO:10并入本文中)。
应了解，本文所含实施例中的每一SEQ ID NO中所陈述的序列都与糖部分、核苷间键或核碱基的任何修饰无关。因此，通过SEQ IDNO定义的反义化合物可以独立地包含糖部分、核苷间键或核碱基的一种或多种修饰。由Isis编号(Isis No)描述的反义化合物指示核碱基序列和基序的组合。
在某些实施方案中，靶区是靶核酸中结构确定的区域。举例来说，靶区可以涵盖3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接点、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其它确定的核酸区域。C9ORF72的结构确定的区域可以通过诸如NCBI的序列数据库中的登录号获得，并且此类信息是通过引用的方式并入本文中。在某些实施方案中，靶区可以涵盖从靶区内一个靶区段的5’靶位点到相同靶区内另一个靶区段的3’靶位点的序列。
靶向包括确定与反义化合物杂交以便发生所希望的作用的至少一个靶区段。在某些实施方案中，所希望的作用是mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所希望的作用是由靶核酸编码的蛋白质水平降低或与靶核酸相关的表型变化。
靶区可以含有一个或多个靶区段。一个靶区内的多个靶区段可以重叠。可替代地，它们可以不重叠。在某些实施方案中，一个靶区内的靶区段是通过不超过约300个核苷酸隔开的。在某些实施方案中，一个靶区内的靶区段是通过靶核酸上的多个核苷酸隔开的，这些核苷酸是、是约、不超过、不超过约250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸，或由前述值中任何两个界定的范围。在某些实施方案中，一个靶区内的靶区段是通过靶核酸上的不超过或不超过约5个核苷酸隔开的。在某些实施方案中，靶区段是连续的。涵盖由具有起始核酸的范围界定的靶区，该起始核酸是本文所列的5’靶位点或3’靶位点中的任一个。
适合的靶区段可以见于5’UTR、编码区、3’UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接点内。含有起始密码子或终止密码子的靶区段也是适合的靶区段。适合的靶区段可以特定地排除某一结构确定的区域，诸如起始密码子或终止密码子。
适合靶区段的确定可以包括将靶核酸的序列与整个基因组内的其它序列相比较。举例来说，可以使用BLAST算法来鉴别不同核酸间具有相似性的区域。这一比较可以防止选出能以非特异性方式与除所选靶核酸外的序列(即，非靶序列或脱靶序列)杂交的反义化合物序列。
反义化合物在靶区内的活性可能存在变化(例如，如通过靶核酸含量的降低百分比确定)。在某些实施方案中，C9ORF72 mRNA含量降低指示了C9ORF72表达的抑制。C9ORF72蛋白质含量降低也指示靶mRNA表达的抑制。扩增的C9ORF72 RNA灶的存在减少指示了C9ORF72表达的抑制。另外，表型变化指示了C9ORF72表达的抑制。举例来说，运动功能和呼吸作用改良可以指示C9ORF72表达的抑制。
杂交
在一些实施方案中，杂交是在本文所公开的反义化合物与C9ORF72核酸之间发生的。最常见的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键结)。
杂交可以在不同条件下发生。严格条件是序列依赖性的并且由有待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法是本领域中众所周知的。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物与C9ORF72可特异性杂交。
互补性
当反义化合物中足够数量的核碱基可以与靶核酸中的相应核碱基形成氢键时，反义化合物和靶核酸彼此互补，由此将发生所希望的作用(例如，靶核酸，诸如C9ORF72核酸的反义抑制)。
反义化合物与C9ORF72核酸之间的不互补核碱基可以是容许的，只要该反义化合物保持能够与靶核酸特异性杂交。此外，反义化合物可以在C9ORF72核酸的一个或多个区段内进行杂交，因此在杂交事件中不涉及插入区段或相邻区段(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物，或其指定部分与C9ORF72核酸、靶区、靶区段或其指定部分是或是至少70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。反义化合物与靶核酸的互补性百分比可以使用常规方法测定。
举例来说，反义化合物中的20个核碱基中有18个与靶区互补并因此将与其特异性杂交的反义化合物将表示90％互补性。在这一实例中，其余的不互补核碱基可以群集或散布于互补核碱基中，而无需彼此邻接或与互补核碱基邻接。因此，有4(四)个不互补核碱基并且这些核碱基侧接两个与靶核酸完全互补的区域的18个核碱基长的反义化合物将与靶核酸具有77.8％的总体互补性，并因此将落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸区域的互补性百分比可以常规地使用本领域中已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序测定(Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403 410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649 656)。同源性、序列同一性或互补性百分比可以通过例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，第8版，Unix,Genetics Computer Group,University ResearchPark,Madison Wis.)，使用默认设置测定，该程序使用了Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482 489)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其指定部分与靶核酸或其指定部分完全互补(即，100％互补)。举例来说，反义化合物可以与C9ORF72核酸，或其靶区、或靶区段或靶序列完全互补。如本文所使用，“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基都能够与靶核酸的相应核碱基精确碱基配对。举例来说，20个核碱基的反义化合物与400个核碱基长的靶序列完全互补，只要靶核酸中存在与反义化合物完全互补的相应20个核碱基部分即可。完全互补还可以关于第一核酸和/或第二核酸的指定部分使用。举例来说，30个核碱基反义化合物中的20个核碱基的部分可以与400个核碱基长的靶序列“完全互补”。如果靶序列具有相应的20个核碱基的部分，其中每个核碱基都与反义化合物的该20个核碱基的部分互补，则该30个核碱基的寡核苷酸中的20个核碱基部分与靶序列完全互补。同时，整个30个核碱基反义化合物根据反义化合物的其余10个核碱基是否也与靶序列互补而可以与或可以不与靶序列完全互补。
不互补核碱基的位置可以在反义化合物的5’端或3’端处。可替代地，一个或多个不互补的核碱基可以在反义化合物的内部位置。当存在两个或更多个不互补核碱基时，它们可以是连续(即，相连)或不连续的。在一个实施方案中，不互补的核碱基是位于间隙聚体反义寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施方案中，长度是或多达12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基的反义化合物包含不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个相对于靶核酸(诸如C9ORF72核酸)或其指定部分不互补的核碱基。
在某些实施方案中，长度是或多达12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的反义化合物包含不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个相对于靶核酸(诸如C9ORF72核酸)或其指定部分不互补的核碱基。
本文提供的反义化合物还包括与一部分靶核酸互补的那些化合物。如本文所使用，“部分”是指靶核酸的一个区域或区段内的指定数量的连续(即，相连)核碱基。“部分”还可以指反义化合物中指定数量的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段中至少15个核碱基的部分互补。还涵盖与靶区段中至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核碱基部分或由这些值中任何两个所界定的范围互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物还可以与特定核苷酸序列、SEQ ID NO或由特定Isis编号表示的化合物，或其部分具有确定的同一性百分比。如本文所使用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，则该反义化合物与本文所公开的序列相同。举例来说，在所公开的DNA序列中含有尿嘧啶代替胸腺嘧啶的RNA将被认为与该DNA序列相同，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶都与腺嘌呤配对。也涵盖缩短和延长型的本文所描述的反义化合物以及具有与本文提供的反义化合物不相同的碱基的化合物。不相同碱基可以彼此相邻或分散于整个反义化合物中。反义化合物的同一性百分比是根据与其所比较的序列具有相同碱基配对的碱基的数量计算。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文所公开的一种或多种反义化合物或SEQ ID NO，或其部分至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与靶核酸中的相等长度的部分相比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基的部分与靶核酸中相等长度的部分相比较。
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与靶核酸中的相等长度的部分相比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基部分与靶核酸中相等长度部分相比较。
修饰
核苷是碱基-糖组合。核苷的核碱基(又称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。核苷酸是另外包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸酯基的核苷。对于包括呋喃戊糖基糖的那些核苷，磷酸酯基可以连接到该糖的2'、3'或5'羟基部分。寡核苷酸是通过相邻核苷彼此共价连接形成线性聚合的寡核苷酸来形成。在寡核苷酸结构内，常认为磷酸酯基形成寡核苷酸的核苷间键。
反义化合物的修饰涵盖核苷间键、糖部分或核碱基的取代或改变。修饰的反义化合物因为具有希望的特性通常优于天然形式，这些特性诸如例如增强的细胞吸收、对核酸靶增强的亲和力、在核酸酶存在下增加的稳定性，或增加的抑制活性。
化学修饰的核苷还可以用于增加缩短或截短的反义寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，用具有此类化学修饰的核苷的较短反义化合物通常可以获得相当的结果。
修饰的核苷间键
RNA和DNA的天然存在的核苷间键是3'到5'磷酸二酯键。相对于具有天然存在的核苷间键的反义化合物，通常选择具有一个或多个修饰(即，非天然存在)的核苷间键的反义化合物，因为其具有希望的特性，诸如例如增强的细胞吸收、对靶核酸增强的亲和力及在核酸酶存在下增加的稳定性。
具有修饰的核苷间键的寡核苷酸包括了保留磷原子的核苷间键以及不具有磷原子的核苷间键。代表性含磷核苷间键包括但不限于，磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯及硫代磷酸酯。制备含磷和不含磷键的方法是众所周知的。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物包含一个或多个修饰的核苷间键。在某些实施方案中，修饰的核苷间键散布于整个反义化合物内。在某些实施方案中，修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。在某些实施方案中，反义化合物中的每个核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。
修饰的糖部分
反义化合物可以任选含有一个或多个其中糖基已经被修饰的核苷。此类糖修饰的核苷可以赋予反义化合物增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其它的有益生物特性。在某些实施方案中，核苷包含化学修饰的呋喃核糖环部分。化学修饰的呋喃核糖环的实例包括但不限于，添加取代基(包括5'和2'取代基)；桥接非偕位环原子以形成双环核酸(BNA)；用S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1及R2各自独立地是H、C1-C12烷基或保护基)置换核糖基环氧原子；及其组合。化学修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(有关其它公开的5',2'-双取代的核苷，参见2008年8月21日公开的PCT国际申请WO2008/101157)；或用S置换核糖基环氧原子，其中在2'-位具有进一步取代(参见公开的美国专利申请US2005-0130923，于2005年6月16日公开)；或者可替代地BNA的5'-取代(参见2007年11月22日公开的PCT国际申请WO 2007/134181，其中LNA被例如5'-甲基或5'-乙烯基取代)。
具有修饰的糖部分的核苷的实例包括但不限于，包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F及2'-O(CH2)2OCH3取代基的核苷。2’位处的取代基也可以选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)及O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中每个Rl、Rm及Rn独立地是H，或取代或未取代的C1-C10烷基。
如本文所使用，“双环核苷”是指包含双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷的实例包括但不限于，在4'与2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括一个或多个包含4’到2’桥的双环核苷。此类4’到2’桥连的双环核苷的实例包括但不限于，下式之一：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其类似物，参见2008年7月15日颁布的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其类似物，参见公开的国际申请WO/2009/006478，2009年1月8日公开)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其类似物，参见公开的国际申请WO/2008/150729，2008年12月11日公开)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见公开的美国专利申请US2004-0171570，2004年9月2日公开)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基(参见美国专利7,427,672，2008年9月23日颁布)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等人,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；以及4'-CH2-C-(＝CH2)-2'(及其类似物，参见公开的国际申请WO2008/154401，2008年12月8日公开)。
有关双环核苷的其它报导也可以见于公开的文献中(参见例如：Singh等人,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等人,Curr.Opinion Invest.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol.,2001,8,1-7；及Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利No.6,268,490、6,525,191、6,670,461、6,770,748、6,794,499、7,034,133、7,053,207、7,399,845、7,547,684以及7,696,345；美国专利公开No.US2008-0039618、US2009-0012281；美国专利序列No.60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787以及61/099,844；公开的PCT国际申请WO 1994/014226、WO 2004/106356、WO 2005/021570、WO 2007/134181、WO2008/150729、WO 2008/154401以及WO 2009/006478)。可以将前述双环核苷的每一个制备为具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见PCT国际申请PCT/DK98/00393，1999年3月25日以WO 99/14226公开)。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于，在呋喃戊糖基糖部分的4'位与2’位之间具有至少一个桥的化合物，其中此类桥独立地包含1个或2到4个相连的基团，这些基团独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝O)-、-C(＝NRa)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-及-N(Ra)-；
其中：
x是0、1或2；
n是1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚砜基(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基或保护基。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥是-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或–C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，该桥是4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'及4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地是H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷另外由异构体构型定义。举例来说，包含4’-2’亚甲基氧基桥的核苷可以呈α-L构型或呈β-D构型。先前已经将α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA掺入显示出反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等人,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于，如以下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA、(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA、(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA、(E)氧基氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA，以及(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA、(G)亚甲基-硫基(4’-CH2-S-2’)BNA、(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA、(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA，及(J)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA。
Figure BDA0002268156430000331
其中Bx是碱基部分，并且R独立地是H、保护基或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，提供了具有式I的双环核苷：
Figure BDA0002268156430000332
其中：
Bx是杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-是-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc是C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与载体介质的共价连接。
在某些实施方案中，提供了具有式II的双环核苷：
Figure BDA0002268156430000341
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与载体介质的共价连接；
Za是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基、酰基、取代的酰基、取代的酰胺、硫醇或取代的硫代。
在一个实施方案中，取代的基团的每个独立地被取代基单取代或多取代，这些取代基独立地选自卤素、氧代、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc及NJeC(＝X)NJcJd，其中每个Jc、Jd及Je独立地是H、C1-C6烷基或取代的C1-C6烷基，并且X是O或NJc。
在某些实施方案中，提供了具有式III的双环核苷：
Figure BDA0002268156430000351
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与载体介质的共价连接；
Zb是C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、取代的C1-C6烷基、取代的C2-C6烯基、取代的C2-C6炔基或取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，提供了具有式IV的双环核苷：
Figure BDA0002268156430000352
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与载体介质的共价连接；
Rd是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；
每个qa、qb、qc及qd独立地是H、卤素、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、酰基、取代的酰基、C1-C6氨基烷基或取代的C1-C6氨基烷基。
在某些实施方案中，提供了具有式V的双环核苷：
Figure BDA0002268156430000361
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与载体介质的共价连接；
qa、qb、qe及qf各自独立地是氢、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe和qf一起是＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘌呤及尿嘧啶的合成和制备，以及其寡聚反应和核酸识别特性已经得到描述(Koshkin等人,Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。BNA和其制备也描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。
也已经制备出亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA的类似物和2'-硫代BNA(Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。包含寡聚脱氧核糖核苷酸双链体作为核酸聚合酶的底物的锁核苷类似物的制备也已经得到描述(Wengel等人,WO 99/14226)。另外，本领域中已经描述了2'-氨基-BNA(一种新颖的构象限制性高亲和力寡核苷酸类似物)的合成(Singh等人,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。此外，已经制备出2'-氨基-BNA和2'-甲基氨基-BNA并且先前已经报导其与互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
在某些实施方案中，提供了具有式VI的双环核苷：
Figure BDA0002268156430000371
其中：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与载体介质的共价连接；
每个qi、qj、qk及ql独立地是H、卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk同时是＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地是H、卤素、C1-C12烷基或取代的C1-C12烷基。
具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的一种碳环双环核苷已经得到描述(Freier等人,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443；及Albaek等人,J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。碳环双环核苷的合成和制备以及其寡聚反应和生物化学研究也已经得到描述(Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26),8362-8379)。
如本文所使用，“4’-2’双环核苷”或“4’到2’双环核苷”是指包含呋喃糖环并且包含连接呋喃糖环的两个碳原子的桥的一种双环核苷，该桥连接了该糖环的2’碳原子和4’碳原子。
如本文所使用，“单环核苷”是指包含修饰的糖部分并且这些糖部分不是双环糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可以在任何位置进行修饰或取代。
如本文所使用，“2’-修饰的糖”意指在2’位进行修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，此类修饰包括了选自以下各项的取代：卤代物，包括但不限于，取代和未取代的烷氧基、取代和未取代的硫烷基、取代和未取代的氨基烷基、取代和未取代的烷基、取代和未取代的烯丙基，以及取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下各物的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3及O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m是1到约10。其它2'-取代基也可以选自：C1-C12烷基、取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团(reporter group)、嵌入剂(intercalator)、用于改良药物动力学特性的基团，或用于改良反义化合物的药效学特性的基团，以及具有类似特性的其它取代基。在某些实施方案中，修饰的核苷包含2’-MOE侧链(Baker等人,J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。此类2'-MOE取代已经被描述为具有相较于未修饰的核苷和其它修饰的核苷(诸如2’-O-甲基、O-丙基及O-氨基丙基)有所改良的结合亲和力。也已经显示，具有2'-MOE取代基的寡核苷酸是基因表达的反义抑制剂，对于体内使用具有颇具前景的特征(Martin,Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等人,Chimia,1996,50,168-176；Altmann等人,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；以及Altmann等人,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926)。
如本文所使用，“修饰的四氢吡喃核苷”或“修饰的THP核苷”意指正常核苷中的呋喃戊糖基残基被六元四氢吡喃“糖”(一种糖替代物)取代的核苷。修饰的THP核苷包括但不限于，本领域中称为己糖醇核酸(HNA)、安尼妥核酸(anitol nucleic acid，ANA)、甘露醇核酸(MAN)(参见Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)、氟代HNA(F-HNA)或具有式VII的那些化合物：
Figure BDA0002268156430000391
其中式VII的所述至少一种四氢吡喃核苷类似物各自独立地：
Bx是杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地是将四氢吡喃核苷类似物连接到反义化合物的核苷间连接基团，或Ta和Tb之一是将四氢吡喃核苷类似物连接到反义化合物的核苷间连接基团并且Ta和Tb中另一个是H、羟基保护基、连接的缀合基团或者5'末端或3'末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2的每一个选自氢、羟基、卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2以及CN，其中X是O、S或NJ1，并且每个J1、J2及J3独立地是H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供了式VII的修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7各自是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7中至少一个不是H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6及q7中至少一个是甲基。在某些实施方案中，提供了式VII的THP核苷，其中R1和R2之一是氟。在某些实施方案中，R1是氟并且R2是H；R1是甲氧基并且R2是H；以及R1是H并且R2是甲氧基乙氧基。
如本文所使用，“2’-修饰的”或“2’-取代的”是指包含糖的核苷，所述糖在2’位包含除H或OH外的取代基。2’-修饰的核苷包括但不限于，连接糖环两个碳原子的桥连接了该糖环的2’碳和另一个碳的双环核苷；以及具有非桥接的2’取代基的核苷，所述取代基诸如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H，或取代或未取代的C1-C10烷基。2’-修饰的核苷可以另外例如在糖的其它位置和/或在核碱基处包含其它修饰。
如本文所使用，“2’-F”是指包含糖的核苷，其在2’位包含氟基。
如本文所使用，“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”各自是指包含糖的核苷，其在糖环的2’位包含-OCH3基团。
如本文所使用，“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”各自是指包含糖的核苷，其在糖环的2’位包含-OCH2CH2OCH3基团。
如本文所使用，“寡核苷酸”是指包含多个相连的核苷的化合物。在某些实施方案中，该多个核苷中的一个或多个被修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
本领域中也已知可以用于修饰用于掺入反义化合物中的核苷的许多其它双环和三环糖替代物环系统(参见例如评述文章：Leumann,Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)。
此类环系统可以经历各种另外的取代以增强活性。
用于制备修饰的糖的方法是本领域技术人员众所周知的。
在具有修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然核碱基部分、修饰的核碱基部分或其组合)保持与适当核酸靶杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，修饰的糖部分是2’-MOE。在某些实施方案中，2’-MOE修饰的核苷是以间隙聚体基序排列。在某些实施方案中，修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥接基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷排列在整个间隙聚体基序的翼中。
用于配制药物组合物的组合物和方法
可以将反义寡核苷酸与药学上可接受活性物质或惰性物质混合以制备药物组合物或制剂。用于配制药物组合物的组合物和方法取决于多个标准，包括但不限于，施用途径、疾病程度或待施用的剂量。
可以通过将靶向C9ORF72核酸的反义化合物与适合的药学上可接受的稀释剂或载剂组合，以药物组合物形式利用该反义化合物。药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)。PBS是适用于肠胃外递送的组合物的一种稀释剂。因此，在一个实施方案中，本文所描述的方法中使用的是包含了靶向C9ORF72核酸的反义化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施方案中，药学上可接受的稀释剂是PBS。在某些实施方案中，反义化合物是反义寡核苷酸。
包含反义化合物的药物组合物涵盖了在施用给动物(包括人类)时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残基的任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或任何其它寡核苷酸。因此，例如，本公开还涉及反义化合物的药学上可接受的盐、前药、此类前药的药学上可接受的盐，及其它生物等效物。适合的药学上可接受的盐包括但不限于，钠盐和钾盐。
前药可以包括在反义化合物的一端或两端掺入在体内被内源核酸酶裂解形成活性反义化合物的另外的核苷。
缀合的反义化合物
反义化合物可以共价连接到增强所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一个或多个部分或缀合物。典型的缀合基团包括胆固醇部分和脂质部分。另外的缀合基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素及染料。
反义化合物还可以被修饰成具有一个或多个稳定基团，这些稳定基团一般附接到反义化合物的一个或两个末端以增强诸如例如核酸酶稳定性等特性。稳定基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免于被核酸外切酶降解，并且能帮助在细胞内进行递送和/或定位。所述帽可以存在于5'末端(5'-帽)或3'末端(3'-帽)，或者可以存在于两个末端上。帽结构是本领域中众所周知的并且包括例如倒置的脱氧脱碱基帽。可以用于对反义化合物的一端或两端戴帽以赋予核酸酶稳定性的其它3'-稳定基团和5'-稳定基团包括2003年1月16日公开的WO 03/004602中所公开的那些。
细胞培养和反义化合物处理
反义化合物对C9ORF72核酸的含量、活性或表达的影响可以在体外于多种细胞类型中进行测试。用于此类分析的细胞类型可得自商业供应商(例如American Type CultureCollection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,Research Triangle Park,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD)并且将其根据供应商的说明书，使用可商购获得的试剂(例如Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)培养。说明性细胞类型包括但不限于，HepG2细胞、Hep3B细胞及原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外测试
本文描述了用反义寡核苷酸处理细胞的方法，该方法可以适当修改以用其它反义化合物进行处理。
一般来说，当细胞在培养中达到约60％-80％汇合时，用反义寡核苷酸处理细胞。
常用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的一种试剂包括阳离子脂质转染试剂LIPOFECTIN(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTIN在OPTI-MEM 1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的希望的最终浓度以及LIPOFECTIN浓度(典型地在每100nM反义寡核苷酸2到12ug/mL范围内)。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一种试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与LIPOFECTAMINE在OPTI-MEM 1低血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中混合以达到反义寡核苷酸的希望的浓度以及LIPOFECTAMINE浓度(典型地在每100nM反义寡核苷酸2到12ug/mL范围内)。
用于将反义寡核苷酸引入培养的细胞中的另一种技术包括电穿孔。
用反义寡核苷酸，通过常规方法处理细胞。典型地在反义寡核苷酸处理之后16-24小时采集细胞，此时通过本领域中已知以及本文中描述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质含量。一般来说，当以一式多份进行处理时，呈现的数据是重复处理的平均值。
所用反义寡核苷酸的浓度随细胞系而变化。确定特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法是本领域中众所周知的。当用LIPOFECTAMINE转染时，所用反义寡核苷酸的浓度典型地在1nM到300nM范围内。当使用电穿孔进行转染时，所用反义寡核苷酸的浓度较高，在625nM到20,000nM范围内。
RNA分离
可以对总细胞RNA或多聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离方法是本领域众所周知的。RNA是使用本领域中众所周知的方法，例如使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)，根据制造商推荐的方案制备。
靶含量或表达抑制的分析
可以通过本领域中已知的多种方式测定C9ORF72核酸的含量或表达的抑制。举例来说，可以通过例如RNA印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR来对靶核酸含量进行定量。可以对总细胞RNA或多聚(A)+mRNA进行RNA分析。分离RNA的方法是本领域众所周知的。RNA印迹分析也是本领域中的常规分析。定量实时PCR可以便利地使用可从PE-Applied Biosystems(Foster City,CA)商购获得的的ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统实现，并且根据制造商的说明书使用。
靶RNA含量的定量实时PCR分析
可以根据制造商的说明书，使用ABI PRISM 7600、7700或7900序列检测系统(PE-Applied Biosystems,Foster City,CA)通过定量实时PCR实现靶RNA含量的定量。定量实时PCR的方法是本领域中众所周知的。
在实时PCR之前，使分离的RNA进行逆转录酶(RT)反应，产生互补DNA(cDNA)，然后将其用作实时PCR扩增的底物。RT和实时PCR反应是在相同样品孔中依序进行的。RT和实时PCR试剂是从Invitrogen(Carlsbad,CA)获得的。RT实时PCR反应是通过本领域技术人员众所周知的方法进行的。
使用表达恒定的基因(诸如亲环蛋白A(cyclophilin A))的表达水平，或通过使用RIBOGREEN(Invitrogen,Inc.Carlsbad,CA)对总RNA定量，对由实时PCR获得的基因(或RNA)靶的数量进行归一化。亲环蛋白A的表达是通过实时PCR、通过与靶同时执行、多路分析或分开定量的。总RNA是使用RIBOGREEN RNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)定量的。Jones,L.J.等人(Analytical Biochemistry,1998,265,368-374)中传授了通过RIBOGREEN进行的RNA定量方法。使用CYTOFLUOR 4000仪器(PE Applied Biosystems)来测量RIBOGREEN荧光。
探针和引物被设计成与C9ORF72核酸杂交。用于设计实时PCR探针和引物的方法是本领域中众所周知的，并且可以包括使用诸如PRIMER EXPRESS软件(Applied Biosystems,Foster City,CA)的软件。
蛋白质含量的分析
C9ORF72核酸的反义抑制可以通过测量C9ORF72蛋白质含量来评估。可以通过本领域中众所周知的多种方式对C9ORF72的蛋白质含量进行评价或定量，诸如免疫沉淀法、蛋白质印迹分析(免疫印迹法)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如胱天蛋白酶活性测定)、免疫组织化学分析、免疫细胞化学分析或荧光活化的细胞分选术(FACS)。针对靶的抗体可以从诸如MSRS抗体目录(Aerie Corporation,Birmingham,MI)的多种来源鉴别并获得，或者可以经由本领域中众所周知的常规单克隆或多克隆抗体产生方法制备。用于检测小鼠、大鼠、猴及人C9ORF72的抗体是可商购获得的。
反义化合物的体内测试
在动物体内测试反义化合物，例如反义寡核苷酸，以评估其抑制C9ORF72表达并产生表型变化(诸如运动功能和呼吸作用改良)的能力。在某些实施方案中，运动功能是通过在动物中进行转棒(rotarod)、握力、爬杆、开放领域表现、平衡木、后爪足印测试来测量。在某些实施方案中，呼吸作用是通过在动物中进行全身体积描记法、创伤阻力(invasiveresistance)及顺应性测量来测量的。测试可以在正常动物中或在实验疾病模型中进行。对于施用给动物，在药学上可接受的稀释剂(诸如磷酸盐缓冲盐水)中配制反义寡核苷酸。施用包括肠胃外施用途径，诸如腹膜内、静脉内及皮下施用。反义寡核苷酸剂量和给药频率的计算是在本领域技术人员的能力范围内，并且取决于如施用途径及动物体重的因素。在用反义寡核苷酸治疗一段时间之后，从CNS组织或CSF中分离出RNA，并测量C9ORF72核酸表达的变化。
靶向C9ORF72
本文所描述的反义寡核苷酸可以在RNA加工的任何阶段中与C9ORF72核酸杂交。举例来说，本文描述了与前体mRNA或成熟mRNA互补的反义寡核苷酸。另外地，本文所描述的反义寡核苷酸可以与C9ORF72核酸的任何成分杂交。举例来说，本文描述了与C9ORF72核酸中的外显子、内含子、5’UTR、3’UTR、重复序列区、六核苷酸重复扩增、剪接点、外显子:外显子剪接点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10互补的反义寡核苷酸。
在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸与C9ORF72的所有变体杂交。在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸与C9ORF72的某些变体选择性杂交。在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸与含有六核苷酸重复扩增的C9ORF72变体选择性杂交。在某些实施方案中，此类含有六核苷酸重复扩增的C9ORF72变体包括SEQ ID NO:1-3及6-10。在某些实施方案中，此类六核苷酸重复扩增包含GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG中任一种的至少30次重复。
在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸抑制C9ORF72的所有变体的表达。在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸同等地抑制C9ORF72的所有变体的表达。在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸优先抑制C9ORF72的某些变体的表达。在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸优先抑制含有六核苷酸重复扩增的C9ORF72变体的表达。在某些实施方案中，此类含有六核苷酸重复扩增的C9ORF72变体包括SEQ ID NO:1-3及6-10。在某些实施方案中，此类六核苷酸重复扩增包含GGGGCC、GGGGGG、GGGGGC或GGGGCG中任一种的至少30次重复。在某些实施方案中，六核苷酸重复扩增形成核灶。在某些实施方案中，本文所描述的反义寡核苷酸可用于减少核灶。就具有核灶的细胞百分比以及每个细胞中核灶的数量来说，可以减少核灶。
基于早先针对重复扩增的研究，出于两个原因，不太可能预测在六核苷酸重复扩增之外靶向C9ORF72的反义寡核苷酸是否会成功地C9ORF72的表达。第一，C9ORF72重复扩增是位于内含子中并且不了解核灶中的RNA是否仅含这些重复序列，还是另外含有侧接的内含子序列。举例来说，早先关于2型肌强直性营养不良(DM2；该疾病是由ZNF9基因内含子1中的CCTG扩增突变引起)的研究确定了较大的DM2扩增不能防止等位基因特异性前体mRNA剪接、转录物的核输出，或稳态mRNA或蛋白质含量。该研究进一步证实，所发现的与该疾病有关的核糖核包涵体富集CCUG扩增，但不含侧接的内含子序列。这些数据表明，DM2突变的下游分子效应可以仅由CCUG重复区域的积累触发。因此，这一研究暗示，仅靶向CCUG重复扩增将引起疾病的改善，因为靶向侧接序列，尤其是该重复扩增的下游区域，将不会影响核糖核包涵体的形成(Margolis等人,Hum.Mol.Genet.,2006,15:1808-1815)。第二，尚不了解含有这些重复序列的C9ORF72内含子1在核灶中切除和积累有多快。因此，不太可能预测靶向前体mRNA是否会引起重复RNA和核灶的消除。
C9OFF72特征
本文所描述的反义寡核苷酸可以在任何加工阶段，在C9ORF72基因的任何成分内与任何C9ORF72变体杂交。举例来说，本文描述的反义寡核苷酸可以与外显子、内含子、5’UTR、3’UTR、重复序列区、六核苷酸重复扩增、剪接点、外显子:外显子剪接点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10杂交。举例来说，反义寡核苷酸可以靶向下表1-5中关于以下描述的各种C9ORF72变体所表征的任何外显子。本文所描述的反义寡核苷酸还可以靶向下表中未表征的变体并且这些变体表征于GENBANK中。此外，本文所描述的反义寡核苷酸还可以靶向除外显子外的成分并且这些成分表征于GENBANK中。
表1
NM_001256054.1(SEQ ID NO:1)的功能区段
Figure BDA0002268156430000491
表2
NM_018325.3(SEQ ID NO:4)的功能区段
Figure BDA0002268156430000492
表3
NM_145005.5(SEQ ID NO:6)的功能区段
Figure BDA0002268156430000501
表4
DB079375.1(SEQ ID NO:7)的功能区段
Figure BDA0002268156430000502
表5
BU194591.1(SEQ ID NO:8)的功能区段
Figure BDA0002268156430000503
Figure BDA0002268156430000511
某些适应症
在某些实施方案中，本文提供了治疗个体的方法，所述方法包括施用一种或多种本文所描述的药物组合物。在某些实施方案中，个体患有神经退化性疾病。在某些实施方案中，个体有发展神经退化性疾病(包括但不限于，ALS或FTD)的风险。在某些实施方案中，个体已经鉴别为患有C9ORF72相关疾病。在某些实施方案中，个体已经鉴别为患有C9ORF72六核苷酸重复扩增相关疾病。在某些实施方案中，本文提供了用于预防性减少个体中C9ORF72表达的方法。某些实施方案包括通过向个体施用治疗有效量的靶向C9ORF72核酸的反义化合物来靶向有需要的个体。
在一个实施方案中，施用治疗有效量的靶向C9ORF72核酸的反义化合物是通过监测个体中的C9ORF72含量以确定个体对反义化合物施用的反应来确定的。个体对反义化合物施用的反应可以由医师用于确定治疗干预的量和持续时间。
在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物的施用使C9ORF72表达减少至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或由这些值中任何两个界定的范围。在某些实施方案中，靶向C9ORF72核酸的反义化合物的施用使动物的运动功能和呼吸作用改良。在某些实施方案中，C9ORF72反义化合物的施用使运动功能和呼吸作用改良至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或由这些值中任何两个界定的范围。
在某些实施方案中，使用了包含靶向C9ORF72的反义化合物的药物组合物来制备供治疗患有或易患神经退化性疾病(包括ALS和FTD)的患者用的药物。
某些组合疗法
在某些实施方案中，将本文所描述的一种或多种药物组合物与一种或多种其它药剂共施用。在某些实施方案中，这一种或多种其它药剂被设计用于治疗与本文所描述的一种或多种药物组合物所治疗的相同的疾病、病症或疾患。在某些实施方案中，这一种或多种其它药剂被设计用于治疗与本文所描述的该一种或多种的药物组合物所治疗的不同的疾病、病症或疾患。在某些实施方案中，这一种或多种其它药剂被设计用于治疗本文所描述的一种或多种药物组合物的不希望的副作用。在某些实施方案中，将本文所描述的一种或多种药物组合物与另一种药剂共施用以治疗所述其它药剂的不希望的作用。在某些实施方案中，将本文所描述的一种或多种药物组合物与另一种其它药剂共施用以产生组合作用。在某些实施方案中，将本文所描述的一种或多种药物组合物与另一种其它药剂共施用以产生协同作用。
在某些实施方案中，本文所描述的一种或多种药物组合物与一种或多种其它药剂是同时施用的。在某些实施方案中，本文所描述的一种或多种药物组合物与一种或多种其它药剂是在不同时间施用的。在某些实施方案中，本文所描述的一种或多种药物组合物与一种或多种其它药剂一起制备成单一制剂。在某些实施方案中，本文所描述的一种或多种药物组合物与一种或多种其它药剂是分开制备的。
在某些实施方案中，可以与本文所描述的药物组合物共施用的药剂包括利鲁唑(Riluzole)(力如太(Rilutek))、力奥来素(Lioresal)及Dexpramipexole。
在某些实施方案中，可以与本文所描述的C9ORF72特异性抑制剂共施用的药剂包括但不限于，另外的C9ORF72抑制剂。在某些实施方案中，共施用的药剂是在施用本文所描述的药物组合物之前施用。在某些实施方案中，共施用的药剂是在施用本文所描述的药物组合物之后施用。在某些实施方案中，共施用的药剂是与本文所描述的药物组合物同时施用。在某些实施方案中，共施用的药剂的剂量与单独施用该共施用的药剂时将施用的剂量相同。在某些实施方案中，共施用的药剂的剂量低于单独施用该共施用的药剂时将施用的剂量。在某些实施方案中，共施用的药剂的剂量高于单独施用该共施用的药剂时将施用的剂量。
在某些实施方案中，第二化合物的共施用使第一化合物的作用增强，由此这些化合物的共施用引起的作用比仅施用第一化合物的作用强。在其它实施方案中，共施用引起的作用是这些化合物在单独施用时的作用的加和。在某些实施方案中，共施用引起的作用是这些化合物在单独施用时的作用的超加和。在某些实施方案中，第一化合物是反义化合物。在某些实施方案中，第二化合物是反义化合物。
本文还包括以下实施方案：
实施方案1.一种化合物，其包含与C9ORF72核酸或C9ORF72同系物核酸互补的单链反义寡核苷酸。
实施方案2.如实施方案1所述的化合物，其中所述C9ORF72核酸是人C9ORF72核酸。
实施方案3.如实施方案1-2所述的化合物，其中所述C9ORF72核酸含有六核苷酸重复扩增。
实施方案4.如实施方案1-2所述的化合物，其中所述C9ORF72核酸不含六核苷酸重复扩增。
实施方案5.如实施方案1-4所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸是可与人C9ORF72核酸特异性杂交的
实施方案6.如实施方案1-5所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸与人C9ORF72核酸的相等长度部分至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％互补。
实施方案7.如实施方案1-6所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸与人C9ORF72核酸中的以下任一种互补：外显子、内含子、5’UTR、3’UTR、重复序列区、剪接点、外显子:外显子剪接点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10。
实施方案8.一种包含单链反义寡核苷酸的化合物，所述单链反义寡核苷酸由12到30个相连的核苷组成并且包含核碱基序列，所述核碱基序列包含SEQ ID NO:30-369的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
实施方案9.如前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰。
实施方案10.如实施方案9所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
实施方案11.如实施方案10所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸的每个核苷间键都是修饰的核苷间键。
实施方案12.如实施方案10-11所述的化合物，其中所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
实施方案13.如实施方案9-12所述的化合物，所述化合物包含至少一个修饰的核苷。
实施方案14.如实施方案9-13所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含至少一个具有修饰的糖的修饰的核苷。
实施方案15.如实施方案14所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含至少一个含双环糖的修饰的核苷。
实施方案16.如实施方案15所述的化合物，其中所述双环糖包含4’至2’桥，选自：4’-(CH2)n-O-2’桥，其中n是1或2；及4’-CH2-O-CH2-2’。
实施方案17.如实施方案16所述的化合物，其中所述双环糖包含4’-CH(CH3)-O-2’桥。
实施方案18.如实施方案14所述的化合物，其中所述至少一个具有修饰的糖的修饰的核苷包含非双环的2’-修饰的修饰的糖部分。
实施方案19.如实施方案18所述的化合物，其中所述2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲氧基乙基。
实施方案20.如实施方案18所述的化合物，其中所述2’-修饰的糖部分包含2’-O-甲基。
实施方案21.如实施方案14所述的化合物，其中所述至少一个具有修饰的糖的修饰的核苷包含糖替代物。
实施方案22.如实施方案21所述的化合物，其中所述糖替代物是吗啉代。
实施方案23.如实施方案21所述的化合物，其中所述糖替代物是肽核酸。
实施方案24.如实施方案13-23所述的化合物，其中每个核苷均被修饰。
实施方案25.如实施方案9-24所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含至少一个修饰的核碱基。
实施方案26.如实施方案25所述的化合物，其中所述修饰的核碱基是5’-甲基胞嘧啶。
实施方案27.如实施方案9-26所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含：
由相连的脱氧核苷组成的间隙区段；
由相连的核苷组成的5’翼区段；
由相连的核苷组成的3’翼区段；
其中所述间隙区段与所述5’翼区段和所述3’翼区段直接相邻并且在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷包含修饰的糖。
实施方案28.如实施方案37所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸包含：
由十个相连的脱氧核苷组成的间隙区段；
由五个相连的核苷组成的5’翼区段；
由五个相连的核苷组成的3’翼区段；
其中所述间隙区段与所述5’翼区段和所述3’翼区段直接相邻并且在所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，其中每个翼区段的每个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖；并且其中每个核苷间键是硫代磷酸酯键。
实施方案29.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由15个相连的核苷组成。
实施方案30.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由16个相连的核苷组成。
实施方案31.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由17个相连的核苷组成。
实施方案32.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由18个相连的核苷组成。
实施方案33.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由19个相连的核苷组成。
实施方案34.如实施方案1-28所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由20个相连的核苷组成。
实施方案35.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由21个相连的核苷组成。
实施方案36.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由22个相连的核苷组成。
实施方案37.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由23个相连的核苷组成。
实施方案38.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由24个相连的核苷组成。
实施方案39.如实施方案1-27所述的化合物，其中所述单链反义寡核苷酸由25个相连的核苷组成。
实施方案40.前述实施方案中任一项所述的化合物在生产用于治疗神经退化性疾病的药剂中的用途。
实施方案41.一种通过使细胞与靶向外显子1B上游的反义寡核苷酸接触而优先抑制含六核苷酸重复扩增的mRNA转录物的表达的方法。
实施例
非限制性公开内容以及通过引用并入
尽管已经根据某些实施方案具体地描述了本文所描述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本文所描述的化合物并且不打算限制这些化合物。本申请中陈述的每一参考文献都通过引用的方式整体并入本文中。
实施例1：HepG2细胞中人C9ORF72的反义抑制
设计出靶向C9ORF72核酸的反义寡核苷酸并且在体外测试其对C9ORF72 mRNA的影响。在一系列具有类似培养条件的实验中测试这些反义寡核苷酸。每一实验的结果呈现于以下所示各表中。使用电穿孔法，用7,000nM的反义寡核苷酸转染按每孔20,000个细胞的密度培养的HepG2细胞。在处理约24小时时间之后，从细胞中分离出RNA，并通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA含量。使用人引物探针集RTS3750(正向序列TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA，在本文中指定为SEQ ID NO:15；反向序列GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG，在本文中指定为SEQ ID NO:16；探针序列TCGACTCTTTGCCCACCGCCA，在本文中指定为SEQ ID NO:17)测量mRNA含量。根据通过
Figure BDA0002268156430000581
测量的总RNA含量，调整C9ORF72 mRNA含量。结果是相对于未处理的对照细胞以C9ORF72的抑制百分比呈现。
表6-10中的反义寡核苷酸被指定为5-10-5MOE间隙聚体。间隙聚体是20个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接各自包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷以及3’翼区段中的每个核苷都具有MOE修饰。在每个间隙聚体中的核苷间键都是硫代磷酸酯键。每个间隙聚体中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人基因序列中反义寡核苷酸靶向的5’-最末端核苷。“终止位点”指示人基因序列中反义寡核苷酸靶向的3’-最末端核苷。表6-9中所列的每个反义寡核苷酸都靶向人C9ORF72 mRNA序列(在本文中指定为SEQ ID NO:1；GENBANK登录号NM_001256054.1)或人C9ORF72基因组序列(在本文中指定为SEQ ID NO:2；截短了核苷27535000到27565000的GENBANK登录号NT_008413.18的补体)或两者。‘n/a’指示反义寡核苷酸不靶向所述特定基因序列。表10的反义寡核苷酸靶向SEQ ID NO:3(GENBANK登录号BQ068108.1)或SEQ ID NO:4(GENBANK登录号NM_018325.3)。
如下表6-10中所示，靶向SEQ ID NO:1的若干寡核苷酸，包括靶向SEQ ID NO:1中核碱基90-647、728-1541、1598-1863、1935-2146、2232-2251、2429-2576、2632-2743、2788-2807、2860-2879、2949-2968、3062-3081、3132-3151及3250-3269的那些寡核苷酸，展现至少50％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、46、47、50、51、53、55、56、57、61、62、64、66、67、72、73、75、76、81、82、85、89、90、91、92、93、94、96、97、100、102、103、109、111、112、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、130、131、132、133、137、139、140、141、145、146、149、150、151、152、153、154、165、166、168、169、170、171、174、179、181、182、183、185、186、187、188、190、192、195、197、199、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331及332。若干寡核苷酸，包括靶向SEQ IDNO 1中核碱基90-359、430-479、550-569、617-647、940-959、1013-1033、1446-1465、1687-1706、1844-1863、1935-2007及2679-2698的那些寡核苷酸，展现至少70％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:32、33、34、35、36、40、41、42、43、44、47、66、67、85、96、103、117、119、154、165、168、186、320、321、324、327、328及331。若干寡核苷酸，包括靶向核碱基90-265和310-329的那些寡核苷酸，展现至少80％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:32、33、35、40、42及321。若干寡核苷酸，包括靶向SEQ ID NO 1中核碱基190-209和310-329的那些寡核苷酸，展现至少90％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:40和321。
如下表6-20中所示，靶向SEQ ID NO:2的若干寡核苷酸，包括靶向SEQ ID NO 2中核碱基1552-1572、2187-2238、2728-2779、3452-2471、3752-3771、5025-5044、5656-5675、6200-6219、7594-7613、7840-8328、9415-9434、12526-12545、13357-13524、13642-13661、13790-14130、14243-14335、14699-14777、15587-15606、16395-16488、18233-18373、24306-24340、24472-24491、24565-24676、26400-26424、26606-26982、27054-27265、27351-27370、27548-27998、28068-28087、28181-28270及28369-28388的那些寡核苷酸，展现至少50％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:32、33、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、46、47、50、51、53、55、56、57、64、67、72、73、75、76、81、82、85、89、90、91、92、93、94、96、97、100、102、103、111、112、115、117、118、119、121、122、123、124、125、126、130、131、132、133、137、139、140、141、145、146、149、150、151、152、153、154、165、166、168、169、170、171、174、179、181、182、183、185、186、187、188、190、192、195、197、199、205、206、208、211、212、224、226、230、231、250、251、252、256、300、301、304、306、307、310、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331及332。若干寡核苷酸，包括靶向SEQ ID NO 2中核碱基3452-2471、7840-8159、8230-8249、12526-12545、13642-13661、14075-14094、14316-14335、14758-14777、16395-16414、16469、16488、24655-24674、26963、26982、27054-27126及27798-27817的那些寡核苷酸，展现至少70％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:32、33、34、35、36、40、41、42、43、44、47、67、85、96、103、117、119、154、165、168、186、251、306、320、321、324、327、328及331。若干寡核苷酸，包括靶向SEQ ID NO 2中核碱基7848-8023的那些寡核苷酸，展现至少80％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:32、33、35、40、42及321。若干寡核苷酸，包括靶向SEQ ID NO 2中核碱基7870-7889和7990-8009的那些寡核苷酸，展现至少90％的抑制作用。这些包括SEQ ID NO:40和321。
表6
Figure BDA0002268156430000611
Figure BDA0002268156430000621
Figure BDA0002268156430000631
表7
Figure BDA0002268156430000632
Figure BDA0002268156430000641
Figure BDA0002268156430000651
表8
Figure BDA0002268156430000652
Figure BDA0002268156430000661
Figure BDA0002268156430000671
表9
Figure BDA0002268156430000672
Figure BDA0002268156430000681
Figure BDA0002268156430000691
表10
Figure BDA0002268156430000692
实施例2：HepG2细胞中人C9ORF72的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中选出以上描述的研究中在体外展现显著C9ORF72 mRNA抑制的反义寡核苷酸并以各种剂量进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中测试这些反义寡核苷酸。每一实验的结果呈现于以下所示各表中。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂布，并使用电穿孔法，用82.3nM、246.9nM、740.7nM、2,222.2nM、6,666.7nM或20,000nM浓度的反义寡核苷酸转染。在处理约16小时时间之后，从细胞中分离出RNA，并通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA含量。使用人C9ORF72引物探针集RTS3750测量mRNA含量。根据通过
Figure BDA0002268156430000693
测量的总RNA含量，调整C9ORF72 mRNA含量。结果是相对于未处理的对照细胞以C9ORF72抑制百分比呈现。
表11-13中还呈现了每种寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。如所说明的，反义寡核苷酸处理的细胞中C9ORF72 mRNA含量以剂量依赖性方式降低。
表11
Figure BDA0002268156430000701
表12
Figure BDA0002268156430000702
表13
Figure BDA0002268156430000711
实施例3：HepG2细胞中人C9ORF72的剂量依赖性反义抑制
在HepG2细胞中选出以上描述的研究中在体外展现显著C9ORF72mRNA抑制的反义寡核苷酸并以各种剂量进行测试。在一系列具有类似培养条件的实验中测试这些反义寡核苷酸。每一实验的结果呈现于以下所示各表中。将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂布，并使用电穿孔法，用246.9nM、740.7nM、2,222.2nM、6,666.7nM或20,000nM浓度的反义寡核苷酸转染。在处理约16小时时间之后，从细胞中分离出RNA，并通过定量实时PCR测量C9ORF72总mRNA含量以及外显子1转录物的mRNA含量。使用人C9ORF72引物探针集RTS3750测量总C9ORF72 mRNA含量。使用引物探针集RTS3905(正向引物GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG，在本文中指定为SEQ ID NO:18；反向序列GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT，在本文中指定为SEQ ID NO:19；探针序列TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC，在本文中指定为SEQ ID NO:20)测量外显子1信使转录物。根据通过
Figure BDA0002268156430000712
测量的总RNA含量，调整C9ORF72 mRNA含量。结果是相对于未处理的对照细胞以C9ORF72抑制百分比呈现。
表14和15中还呈现了每种寡核苷酸的半数最大抑制浓度(IC50)。如所说明的，反义寡核苷酸处理的细胞中C9ORF72 mRNA含量以剂量依赖性方式降低。‘n.d.’指示没有关于所述特定剂量的数据。
表14
总C9ORF72 mRNA含量的抑制％
Figure BDA0002268156430000721
表15
C9ORF72外显子1mRNA含量的抑制％
Figure BDA0002268156430000722
实施例4：HepG2细胞中人C9ORF72的反义抑制
设计出靶向C9ORF72核酸的六核苷酸重复扩增的反义寡核苷酸并且在体外测试其对C9ORF72 mRNA的影响。在一系列具有类似培养条件的实验中测试这些反义寡核苷酸。每一实验的结果呈现于以下所示各表中。这些比较检验中包括了ISIS 576816和ISIS577065。使用电穿孔法，用7,000nM的反义寡核苷酸转染按每孔35,000个细胞的密度培养的C9ORF72成纤维细胞。在处理约24小时时间之后，从细胞中分离出RNA，并通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA含量。使用人引物探针集RTS3750、RTS 3905或RTS4097(正向序列CAAGCCACCGTCTCACTCAA，在本文中指定为SEQ ID NO:24；反向引物GTAGTGCTGTCTACTCCAGAGAGTTACC，在本文中指定为SEQ ID NO:25；探针序列CTTGGCTTCCCTCAAAAGACTGGCTAATGT，在本文中指定为SEQ ID NO:26)测量mRNA含量。RTS3750靶向mRNA转录物的外显子2，并因此测量总mRNA转录物。RTS3905靶向含有六核苷酸重复扩增的转录物，并因此仅测量含有该六核苷酸重复扩增的mRNA转录物。RTS4097靶向在六核苷酸重复扩增3’位点处的基因序列。根据通过
Figure BDA0002268156430000731
测量的总RNA含量，调整mRNA含量。结果是相对于未处理的对照细胞以C9ORF72抑制百分比呈现。‘n.d.’指示没有关于所述特定反义寡核苷酸的数据。
表16中的反义寡核苷酸被设计为均一的MOE寡核苷酸，或3-10-3MOE、4-10-3MOE、4-10-4MOE、5-10-4MOE或5-10-5MOE间隙聚体。均一的MOE寡核苷酸是20个核苷长，其中每个核苷包含2’-MOE基团。3-10-3MOE间隙聚体是16个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接各自包含三个核苷的翼区段。4-10-3间隙聚体是17个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接分别包含四个核苷和三个核苷的翼区段。4-10-4间隙聚体是18个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接各自包含四个核苷的翼区段。5-10-4间隙聚体是19个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接分别包含五个核苷和四个核苷的翼区段。5-10-5间隙聚体是20个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接各自包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷以及3’翼区段中的每个核苷都包含2’-MOE基团。在每个寡核苷酸中的核苷间键都是硫代磷酸酯键。每个寡核苷酸中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示人基因序列中反义寡核苷酸靶向的5’-最末端核苷。“终止位点”指示人基因序列中反义寡核苷酸靶向的3’-最末端核苷。表16中所列的每个反义寡核苷酸都靶向人C9ORF72基因组序列(在本文中指定为SEQ ID NO:2；截短核苷27535000到27565000的GENBANK登录号NT_008413.18的补体)或SEQ ID NO:13(C9ORF72基因内含子1中六核苷酸重复的扩增型)。
数据指示，某些反义寡核苷酸优先抑制含有六核苷酸重复的C9ORF72 mRNA转录物的含量。
表16
Figure BDA0002268156430000741
Figure BDA0002268156430000751
Figure BDA0002268156430000761
Figure BDA0002268156430000771
Figure BDA0002268156430000772
实施例5：用C9ORF72反义寡核苷酸处理的体内啮齿类动物抑制作用和耐受性
为了评估在体内对C9ORF72表达抑制的耐受性，设计出靶向鼠科动物C9ORF72核酸的反义寡核苷酸并在小鼠和大鼠模型中进行评估。
ISIS 571883被设计为5-10-5MOE间隙聚体，20个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接各自包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷以及3’翼区段中的每个核苷都具有MOE修饰。核苷间键是硫代磷酸酯键。整个间隙聚体中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。ISIS 571883在鼠科动物C9ORF72基因组序列上具有起始位点核苷33704，在本文中指定为SEQ ID NO:11(截短核苷3587000到3625000的GENBANK登录号NT_166289.1的补体)。
ISIS 603538被设计为5-10-5MOE间隙聚体，20个核苷长，其中中心间隙区段包含十个2’-脱氧核苷，并且在5’端上和3’端上侧接各自包含五个核苷的翼区段。5’翼区段中的每个核苷以及3’翼区段中的每个核苷都具有MOE修饰。核苷间键是硫代磷酸酯键或磷酸酯键(GsAo Co Co Gs Cs Ts Ts Gs As Gs Ts Ts Ts Gs Co Co Ao Cs A；其中‘s’表示硫代磷酸酯核苷间键；‘o’表示磷酸酯键；且A、G、C、T表示相关核苷)。整个间隙聚体中的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。ISIS603538在大鼠C9ORF72 mRNA序列上具有靶起始位点核苷2872，其在本文中指定为SEQ ID NO:12(GENBANK登录号NM_001007702.1)。
小鼠实验1
经脑室内大剂量注射分别向一组4只C57BL/6小鼠各自注射50μg、100μg、300μg、500μg或700μg的ISIS 571883。对照组的四只C57/BL6小鼠类似地用PBS进行处理。用3％异氟烷使动物麻醉，并将其放入立体定位架中。在对手术部位灭菌之后，使用Hamilton注射器，在前囟前后-0.2mm及颅骨平面向下距前囟3mm处向每只小鼠注射以上提到的剂量的ISIS 571883。用缝合线闭合切口。使小鼠恢复14天，之后根据实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)推荐的人道方案对动物实施安乐死。采集脑组织和脊髓组织并在液氮中速冻。在冷冻前，使用小鼠脑切片模具将脑组织横向切割成五个切片。
RNA分析
从注射部位后部的2-3mm脑切片、额皮质及腰椎脊髓组织切片提取RNA以分析C9ORF72 mRNA的表达。通过RT-PCR测量C9ORF72 mRNA的表达。数据示于表17中。结果指示，用递增剂量的ISIS 571883处理引起C9ORF72 mRNA表达的剂量依赖性抑制。
还评估微神经胶质细胞标记物AIF-1的诱导作为CNS毒性的量度。数据示于表18中。结果指示，用递增剂量的ISIS 571883处理不会引起AIF-1mRNA表达的显著增加。因此，认为在此模型中注射ISIS 571883是可耐受的。
表17
相较于PBS对照组C9ORF72 mRNA表达的抑制百分比
剂量(μg) 后脑 皮质 脊髓
50 22 8 46
100 22 12 47
300 55 47 67
500 61 56 78
700 65 65 79
表18
相较于PBS对照组AIF-1mRNA表达的表达百分比
Figure BDA0002268156430000791
Figure BDA0002268156430000801
小鼠实验2
以与以上所描述程序类似的程序，经脑室内大剂量注射分别向一组4只C57BL/6小鼠注射500μg的ISIS 571883。对照组的四只C57/BL6小鼠类似地用PBS进行处理。ICV施用之后，在有规律的时间点测试小鼠。
行为分析
采用了评估运动行为的两项标准测定：转棒测定和握力测定。在转棒测定的情况下，测量掉落的等待时间(latency)。这些测定的数据呈现于表19和表20中。结果指示，由于ISIS 571883的反义抑制或由于ICV注射，小鼠的运动行为无显著改变。因此，认为在此模型中C9ORF72的反义抑制是可耐受的。
表19
在转棒测定中掉落的等待时间(秒)
Figure BDA0002268156430000802
表20
在握力测定中的平均后肢握力(g)
Figure BDA0002268156430000803
Figure BDA0002268156430000811
大鼠实验
经鞘内大剂量注射分别向一组4只Sprague-Dawley大鼠注射700μg、1,000μg或3,000μg的ISIS 603538。对照组的四只Sprague-Dawley大鼠类似地用PBS进行处理。用3％异氟烷使动物麻醉，并将其放入立体定位架中。对手术部位灭菌之后，在50μL冲洗液下经由伸入椎管中2cm的8cm鞘内导管向每只大鼠注射30μL的ASO溶液。使大鼠恢复4周，之后根据实验动物管理和使用委员会推荐的人道方案对动物实施安乐死。
RNA分析
从注射部位后部的2-3mm脑切片、脑额皮质以及脊髓组织的颈椎和腰椎切片提取RNA以分析C9ORF72 mRNA的表达。通过RT-PCR测量C9ORF72 mRNA的表达。数据示于表21中。结果指示，用递增剂量的ISIS 603538治疗引起C9ORF72 mRNA表达的剂量依赖性抑制。
还评估微神经胶质细胞标记物AIF-1的诱导作为CNS毒性的量度。数据示于表22中。结果指示，用递增剂量的ISIS 603538处理不会引起AIF-1mRNA表达的显著增加。因此，认为在此模型中注射ISIS 603538是可耐受的。
表21
相较于PBS对照组C9ORF72 mRNA表达的抑制百分比
Figure BDA0002268156430000821
表22
相较于PBS对照组AIF-1mRNA表达的表达百分比
Figure BDA0002268156430000822
体重分析
以有规律的时间点间隔测量大鼠的体重。数据示于表23中。结果指示，用递增剂量的ISIS 603538处理不会引起大鼠体重的任何显著变化。
表23
大鼠的体重(％初始体重)
Figure BDA0002268156430000823
实施例6：在两个患者成纤维细胞系中人C9ORF72表达的优先抑制
用靶向外显子1B之前的C9ORF72前体mRNA序列的反义寡核苷酸，即，靶向含六核苷酸重复扩增的转录物的反义寡核苷酸及靶向外显子1下游的反义寡核苷酸分析来自人类患者的两个不同的成纤维细胞细胞系(F09-152和F09-229)。表24中就SEQ ID NO:1和2提供了每个寡核苷酸的靶起始位点和终止位点以及靶区。ISIS 577061和ISIS 577065靶向在外显子1B上游并且刚好在六核苷酸重复的上游的C9ORF72。表24中的其余ISIS寡核苷酸靶向外显子1B下游的C9ORF72及六核苷酸重复。
表24
用于C9ORF72患者成纤维细胞的剂量反应测定中的ISIS寡核苷酸的靶起始位点和终止位点
Figure BDA0002268156430000831
将细胞以每孔20,000个细胞的密度涂布，并使用电穿孔法，用246.9nM、740.7nM、2,222.2nM、6,666.7nM及20,000.0nM浓度的反义寡核苷酸转染。在处理约16小时时间之后，从细胞中分离出RNA，并通过定量实时PCR测量C9ORF72 mRNA含量。使用两个引物探针集：(1)人C9ORF72引物探针集RTS3750，用于测量总mRNA含量；及(2)RTS3905，用于靶向含六核苷酸重复扩增的转录物，仅测量含有六核苷酸重复扩增的mRNA转录物。根据通过
Figure BDA0002268156430000842
测量的总RNA含量，调整C9ORF72 mRNA含量。结果是相对于未处理的对照细胞以C9ORF72抑制百分比呈现。
如下表25中所说明，靶向外显子1B上游并因此靶向含有六核苷酸重复扩增的mRNA转录物的两个寡核苷酸(ISIS 577061和ISIS577065)，以及靶向外显子1B下游并因此不靶向含有六核苷酸重复扩增的mRNA转录物的ISIS 576974、ISIS 576816及ISIS 577083不抑制C9ORF72的总mRNA含量(如通过RTS3750测量)。如下表25所示，含有六核苷酸重复扩增的C9ORF72 mRNA转录物的表达水平较低(占总C9ORF72表达产物约10％)，因此，靶向含有六核苷酸重复扩增的mRNA转录物的寡核苷酸不能有力地抑制总C9ORF72mRNA(如通过RTS3905测量)。因此，ISIS 577061和ISIS 577065优先抑制含有六核苷酸重复扩增的mRNA转录物的表达。
表25
如用RTS3750测量的在剂量反应测定中F09-152患者成纤维细胞中C9ORF72总mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002268156430000841
表26
如用RTS3905测量的在剂量反应测定中F09-152患者成纤维细胞中含六核苷酸重复扩增的C9ORF72 mRNA转录物的抑制百分比
Figure BDA0002268156430000851
表27
如用RTS3750测量的在剂量反应测定中F09-229患者成纤维细胞中C9ORF72总mRNA的抑制百分比
Figure BDA0002268156430000852
表28
如用RTS3905测量的在剂量反应测定中F09-229患者成纤维细胞中含六核苷酸重复扩增的C9ORF72 mRNA转录物的抑制百分比
Figure BDA0002268156430000853
序列表
<110> IONIS制药公司
<120> 用于调节C9ORF72表达的组合物
<130> BIOL0211WO
<140> PCT/US2013/065073
<141> 2013-10-15
<150> 61/714,132
<151> 2012-10-15
<160> 369
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 3339
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (203)..(1648)
<400> 1
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120
ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180
atgtgacagt tggaatgcag tg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca 232
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro
1 5 10
gct gtt gcc aag aca gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta 280
Ala Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu
15 20 25
gca gct act ttt gct tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg 328
Ala Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg
30 35 40
cac att tgg gct cca aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa 376
His Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu
45 50 55
ata act ttt ctt gcc aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat 424
Ile Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn
60 65 70
gca gag agt ggt gct ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag 472
Ala Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys
75 80 85 90
gga gtg att att gtt tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat 520
Gly Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp
95 100 105
cgc agc aca tat gga cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt 568
Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser
110 115 120
ttc tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata 616
Phe Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile
125 130 135
atc cgg aaa gga aga ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc 664
Ile Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val
140 145 150
cag aag att atc tta gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag 712
Gln Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln
155 160 165 170
agt att att cca atg ctt act gga gaa gtg att cct gta atg gaa ctg 760
Ser Ile Ile Pro Met Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu
175 180 185
ctt tca tct atg aaa tca cac agt gtt cct gaa gaa ata gat ata gct 808
Leu Ser Ser Met Lys Ser His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala
190 195 200
gat aca gta ctc aat gat gat gat att ggt gac agc tgt cat gaa ggc 856
Asp Thr Val Leu Asn Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly
205 210 215
ttt ctt ctc aat gcc atc agc tca cac ttg caa acc tgt ggc tgt tcc 904
Phe Leu Leu Asn Ala Ile Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser
220 225 230
gtt gta gta ggt agc agt gca gag aaa gta aat aag ata gtc aga aca 952
Val Val Val Gly Ser Ser Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr
235 240 245 250
tta tgc ctt ttt ctg act cca gca gag aga aaa tgc tcc agg tta tgt 1000
Leu Cys Leu Phe Leu Thr Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys
255 260 265
gaa gca gaa tca tca ttt aaa tat gag tca ggg ctc ttt gta caa ggc 1048
Glu Ala Glu Ser Ser Phe Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly
270 275 280
ctg cta aag gat tca act gga agc ttt gtg ctg cct ttc cgg caa gtc 1096
Leu Leu Lys Asp Ser Thr Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val
285 290 295
atg tat gct cca tat ccc acc aca cac ata gat gtg gat gtc aat act 1144
Met Tyr Ala Pro Tyr Pro Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr
300 305 310
gtg aag cag atg cca ccc tgt cat gaa cat att tat aat cag cgt aga 1192
Val Lys Gln Met Pro Pro Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg
315 320 325 330
tac atg aga tcc gag ctg aca gcc ttc tgg aga gcc act tca gaa gaa 1240
Tyr Met Arg Ser Glu Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu
335 340 345
gac atg gct cag gat acg atc atc tac act gac gaa agc ttt act cct 1288
Asp Met Ala Gln Asp Thr Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro
350 355 360
gat ttg aat att ttt caa gat gtc tta cac aga gac act cta gtg aaa 1336
Asp Leu Asn Ile Phe Gln Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys
365 370 375
gcc ttc ctg gat cag gtc ttt cag ctg aaa cct ggc tta tct ctc aga 1384
Ala Phe Leu Asp Gln Val Phe Gln Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg
380 385 390
agt act ttc ctt gca cag ttt cta ctt gtc ctt cac aga aaa gcc ttg 1432
Ser Thr Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu Val Leu His Arg Lys Ala Leu
395 400 405 410
aca cta ata aaa tat ata gaa gac gat acg cag aag gga aaa aag ccc 1480
Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro
415 420 425
ttt aaa tct ctt cgg aac ctg aag ata gac ctt gat tta aca gca gag 1528
Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu
430 435 440
ggc gat ctt aac ata ata atg gct ctg gct gag aaa att aaa cca ggc 1576
Gly Asp Leu Asn Ile Ile Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly
445 450 455
cta cac tct ttt atc ttt gga aga cct ttc tac act agt gtg caa gaa 1624
Leu His Ser Phe Ile Phe Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu
460 465 470
cga gat gtt cta atg act ttt taa atgtgtaact taataagcct attccatcac 1678
Arg Asp Val Leu Met Thr Phe
475 480
aatcatgatc gctggtaaag tagctcagtg gtgtggggaa acgttcccct ggatcatact 1738
ccagaattct gctctcagca attgcagtta agtaagttac actacagttc tcacaagagc 1798
ctgtgagggg atgtcaggtg catcattaca ttgggtgtct cttttcctag atttatgctt 1858
ttgggataca gacctatgtt tacaatataa taaatattat tgctatcttt taaagatata 1918
ataataggat gtaaacttga ccacaactac tgtttttttg aaatacatga ttcatggttt 1978
acatgtgtca aggtgaaatc tgagttggct tttacagata gttgactttc tatcttttgg 2038
cattctttgg tgtgtagaat tactgtaata cttctgcaat caactgaaaa ctagagcctt 2098
taaatgattt caattccaca gaaagaaagt gagcttgaac ataggatgag ctttagaaag 2158
aaaattgatc aagcagatgt ttaattggaa ttgattatta gatcctactt tgtggattta 2218
gtccctggga ttcagtctgt agaaatgtct aatagttctc tatagtcctt gttcctggtg 2278
aaccacagtt agggtgtttt gtttatttta ttgttcttgc tattgttgat attctatgta 2338
gttgagctct gtaaaaggaa attgtatttt atgttttagt aattgttgcc aactttttaa 2398
attaattttc attatttttg agccaaattg aaatgtgcac ctcctgtgcc ttttttctcc 2458
ttagaaaatc taattacttg gaacaagttc agatttcact ggtcagtcat tttcatcttg 2518
ttttcttctt gctaagtctt accatgtacc tgctttggca atcattgcaa ctctgagatt 2578
ataaaatgcc ttagagaata tactaactaa taagatcttt ttttcagaaa cagaaaatag 2638
ttccttgagt acttccttct tgcatttctg cctatgtttt tgaagttgtt gctgtttgcc 2698
tgcaataggc tataaggaat agcaggagaa attttactga agtgctgttt tcctaggtgc 2758
tactttggca gagctaagtt atcttttgtt ttcttaatgc gtttggacca ttttgctggc 2818
tataaaataa ctgattaata taattctaac acaatgttga cattgtagtt acacaaacac 2878
aaataaatat tttatttaaa attctggaag taatataaaa gggaaaatat atttataaga 2938
aagggataaa ggtaatagag cccttctgcc ccccacccac caaatttaca caacaaaatg 2998
acatgttcga atgtgaaagg tcataatagc tttcccatca tgaatcagaa agatgtggac 3058
agcttgatgt tttagacaac cactgaacta gatgactgtt gtactgtagc tcagtcattt 3118
aaaaaatata taaatactac cttgtagtgt cccatactgt gttttttaca tggtagattc 3178
ttatttaagt gctaactggt tattttcttt ggctggttta ttgtactgtt atacagaatg 3238
taagttgtac agtgaaataa gttattaaag catgtgtaaa cattgttata tatcttttct 3298
cctaaatgga gaattttgaa taaaatatat ttgaaatttt g 3339
<210> 2
<211> 30001
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
caaagaaaag ggggaggttt tgttaaaaaa gagaaatgtt acatagtgct ctttgagaaa 60
attcattggc actattaagg atctgaggag ctggtgagtt tcaactggtg agtgatggtg 120
gtagataaaa ttagagctgc agcaggtcat tttagcaact attagataaa actggtctca 180
ggtcacaacg ggcagttgca gcagctggac ttggagagaa ttacactgtg ggagcagtgt 240
catttgtcct aagtgctttt ctacccccta cccccactat tttagttggg tataaaaaga 300
atgacccaat ttgtatgatc aactttcaca aagcatagaa cagtaggaaa agggtctgtt 360
tctgcagaag gtgtagacgt tgagagccat tttgtgtatt tattcctccc tttcttcctc 420
ggtgaatgat taaaacgttc tgtgtgattt ttagtgatga aaaagattaa atgctactca 480
ctgtagtaag tgccatctca cacttgcaga tcaaaaggca cacagtttaa aaaacctttg 540
tttttttaca catctgagtg gtgtaaatgc tactcatctg tagtaagtgg aatctataca 600
cctgcagacc aaaagacgca aggtttcaaa aatctttgtg ttttttacac atcaaacaga 660
atggtacgtt tttcaaaagt taaaaaaaaa caactcatcc acatattgca actagcaaaa 720
atgacattcc ccagtgtgaa aatcatgctt gagagaattc ttacatgtaa aggcaaaatt 780
gcgatgactt tgcaggggac cgtgggattc ccgcccgcag tgccggagct gtcccctacc 840
agggtttgca gtggagtttt gaatgcactt aacagtgtct tacggtaaaa acaaaatttc 900
atccaccaat tatgtgttga gcgcccactg cctaccaagc acaaacaaaa ccattcaaaa 960
ccacgaaatc gtcttcactt tctccagatc cagcagcctc ccctattaag gttcgcacac 1020
gctattgcgc caacgctcct ccagagcggg tcttaagata aaagaacagg acaagttgcc 1080
ccgccccatt tcgctagcct cgtgagaaaa cgtcatcgca catagaaaac agacagacgt 1140
aacctacggt gtcccgctag gaaagagagg tgcgtcaaac agcgacaagt tccgcccacg 1200
taaaagatga cgcttggtgt gtcagccgtc cctgctgccc ggttgcttct cttttggggg 1260
cggggtctag caagagcagg tgtgggttta ggaggtgtgt gtttttgttt ttcccaccct 1320
ctctccccac tacttgctct cacagtactc gctgagggtg aacaagaaaa gacctgataa 1380
agattaacca gaagaaaaca aggagggaaa caaccgcagc ctgtagcaag ctctggaact 1440
caggagtcgc gcgctagggg ccggggccgg ggccggggcg tggtcggggc gggcccgggg 1500
gcgggcccgg ggcggggctg cggttgcggt gcctgcgccc gcggcggcgg aggcgcaggc 1560
ggtggcgagt gggtgagtga ggaggcggca tcctggcggg tggctgtttg gggttcggct 1620
gccgggaaga ggcgcgggta gaagcggggg ctctcctcag agctcgacgc atttttactt 1680
tccctctcat ttctctgacc gaagctgggt gtcgggcttt cgcctctagc gactggtgga 1740
attgcctgca tccgggcccc gggcttcccg gcggcggcgg cggcggcggc ggcgcaggga 1800
caagggatgg ggatctggcc tcttccttgc tttcccgccc tcagtacccg agctgtctcc 1860
ttcccgggga cccgctggga gcgctgccgc tgcgggctcg agaaaaggga gcctcgggta 1920
ctgagaggcc tcgcctgggg gaaggccgga gggtgggcgg cgcgcggctt ctgcggacca 1980
agtcggggtt cgctaggaac ccgagacggt ccctgccggc gaggagatca tgcgggatga 2040
gatgggggtg tggagacgcc tgcacaattt cagcccaagc ttctagagag tggtgatgac 2100
ttgcatatga gggcagcaat gcaagtcggt gtgctcccca ttctgtggga catgacctgg 2160
ttgcttcaca gctccgagat gacacagact tgcttaaagg aagtgactat tgtgacttgg 2220
gcatcacttg actgatggta atcagttgtc taaagaagtg cacagattac atgtccgtgt 2280
gctcattggg tctatctggc cgcgttgaac accaccaggc tttgtattca gaaacaggag 2340
ggaggtcctg cactttccca ggaggggtgg ccctttcaga tgcaatcgag attgttaggc 2400
tctgggagag tagttgcctg gttgtggcag ttggtaaatt tctattcaaa cagttgccat 2460
gcaccagttg ttcacaacaa gggtacgtaa tctgtctggc attacttcta cttttgtaca 2520
aaggatcaaa aaaaaaaaag atactgttaa gatatgattt ttctcagact ttgggaaact 2580
tttaacataa tctgtgaata tcacagaaac aagactatca tataggggat attaataacc 2640
tggagtcaga atacttgaaa tacggtgtca tttgacacgg gcattgttgt caccacctct 2700
gccaaggcct gccactttag gaaaaccctg aatcagttgg aaactgctac atgctgatag 2760
tacatctgaa acaagaacga gagtaattac cacattccag attgttcact aagccagcat 2820
ttacctgctc caggaaaaaa ttacaagcac cttatgaagt tgataaaata ttttgtttgg 2880
ctatgttggc actccacaat ttgctttcag agaaacaaag taaaccaagg aggacttctg 2940
tttttcaagt ctgccctcgg gttctattct acgttaatta gatagttccc aggaggacta 3000
ggttagccta cctattgtct gagaaacttg gaactgtgag aaatggccag atagtgatat 3060
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gtactgtaaa cagttcactg tccttgaagt ggtcctgggc agctcctgtt gtggaaagtg 3180
gacggtttag gatcctgctt ctctttgggc tgggagaaaa taaacagcat ggttacaagt 3240
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actatgatct aatgaaaaaa tatttaatag ttctccatgc aaatacaaat catatagttt 17520
tccagaaaat acctttgaca ttatacaaag atgattatca cagcattata atagtaaaaa 17580
aatggaaata gcctctttct tctgttctgt tcatagcaca gtgcctcata cgcagtaggt 17640
tattattaca tggtaactgg ctaccccaac tgattaggaa agaagtaaat ttgttttata 17700
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t 30001
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<213> 智人
<220>
<221> CDS
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<400> 4
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tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtg atg tcg act 116
Met Ser Thr
1
ctt tgc cca ccg cca tct cca gct gtt gcc aag aca gag att gct tta 164
Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu
5 10 15
agt ggc aaa tca cct tta tta gca gct act ttt gct tac tgg gac aat 212
Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn
20 25 30 35
att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct cca aag aca gaa cag 260
Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln
40 45 50
gta ctt ctc agt gat gga gaa ata act ttt ctt gcc aac cac act cta 308
Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu
55 60 65
aat gga gaa atc ctt cga aat gca gag agt ggt gct ata gat gta aag 356
Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys
70 75 80
ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga gtg att att gtt tca tta atc ttt 404
Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe
85 90 95
gat gga aac tgg aat ggg gat cgc agc aca tat gga cta tca att ata 452
Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile
100 105 110 115
ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt 500
Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys
120 125 130
gtt gat aga tta aca cat ata atc cgg aaa gga aga ata tgg atg cat 548
Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His
135 140 145
aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aag att atc tta gaa ggc aca gag 596
Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu
150 155 160
aga atg gaa gat cag ggt cag agt att att cca atg ctt act gga gaa 644
Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu Thr Gly Glu
165 170 175
gtg att cct gta atg gaa ctg ctt tca tct atg aaa tca cac agt gtt 692
Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser His Ser Val
180 185 190 195
cct gaa gaa ata gat ata gct gat aca gta ctc aat gat gat gat att 740
Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp Asp Asp Ile
200 205 210
ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aat gcc atc agc tca cac 788
Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile Ser Ser His
215 220 225
ttg caa acc tgt ggc tgt tcc gtt gta gta ggt agc agt gca gag aaa 836
Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser Ala Glu Lys
230 235 240
gta aat aag ata gtc aga aca tta tgc ctt ttt ctg act cca gca gag 884
Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr Pro Ala Glu
245 250 255
aga aaa tgc tcc agg tta tgt gaa gca gaa tca tca ttt aaa tat gag 932
Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe Lys Tyr Glu
260 265 270 275
tca ggg ctc ttt gta caa ggc ctg cta aag gat tca act gga agc ttt 980
Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ser Thr Gly Ser Phe
280 285 290
gtg ctg cct ttc cgg caa gtc atg tat gct cca tat ccc acc aca cac 1028
Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro Thr Thr His
295 300 305
ata gat gtg gat gtc aat act gtg aag cag atg cca ccc tgt cat gaa 1076
Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro Cys His Glu
310 315 320
cat att tat aat cag cgt aga tac atg aga tcc gag ctg aca gcc ttc 1124
His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu Thr Ala Phe
325 330 335
tgg aga gcc act tca gaa gaa gac atg gct cag gat acg atc atc tac 1172
Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr Ile Ile Tyr
340 345 350 355
act gac gaa agc ttt act cct gat ttg aat att ttt caa gat gtc tta 1220
Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln Asp Val Leu
360 365 370
cac aga gac act cta gtg aaa gcc ttc ctg gat cag gtc ttt cag ctg 1268
His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val Phe Gln Leu
375 380 385
aaa cct ggc tta tct ctc aga agt act ttc ctt gca cag ttt cta ctt 1316
Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu
390 395 400
gtc ctt cac aga aaa gcc ttg aca cta ata aaa tat ata gaa gac gat 1364
Val Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Asp Asp
405 410 415
acg cag aag gga aaa aag ccc ttt aaa tct ctt cgg aac ctg aag ata 1412
Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Lys Ile
420 425 430 435
gac ctt gat tta aca gca gag ggc gat ctt aac ata ata atg gct ctg 1460
Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile Met Ala Leu
440 445 450
gct gag aaa att aaa cca ggc cta cac tct ttt atc ttt gga aga cct 1508
Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe Gly Arg Pro
455 460 465
ttc tac act agt gtg caa gaa cga gat gtt cta atg act ttt taa 1553
Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr Phe
470 475 480
atgtgtaact taataagcct attccatcac aatcatgatc gctggtaaag tagctcagtg 1613
gtgtggggaa acgttcccct ggatcatact ccagaattct gctctcagca attgcagtta 1673
agtaagttac actacagttc tcacaagagc ctgtgagggg atgtcaggtg catcattaca 1733
ttgggtgtct cttttcctag atttatgctt ttgggataca gacctatgtt tacaatataa 1793
taaatattat tgctatcttt taaagatata ataataggat gtaaacttga ccacaactac 1853
tgtttttttg aaatacatga ttcatggttt acatgtgtca aggtgaaatc tgagttggct 1913
tttacagata gttgactttc tatcttttgg cattctttgg tgtgtagaat tactgtaata 1973
cttctgcaat caactgaaaa ctagagcctt taaatgattt caattccaca gaaagaaagt 2033
gagcttgaac ataggatgag ctttagaaag aaaattgatc aagcagatgt ttaattggaa 2093
ttgattatta gatcctactt tgtggattta gtccctggga ttcagtctgt agaaatgtct 2153
aatagttctc tatagtcctt gttcctggtg aaccacagtt agggtgtttt gtttatttta 2213
ttgttcttgc tattgttgat attctatgta gttgagctct gtaaaaggaa attgtatttt 2273
atgttttagt aattgttgcc aactttttaa attaattttc attatttttg agccaaattg 2333
aaatgtgcac ctcctgtgcc ttttttctcc ttagaaaatc taattacttg gaacaagttc 2393
agatttcact ggtcagtcat tttcatcttg ttttcttctt gctaagtctt accatgtacc 2453
tgctttggca atcattgcaa ctctgagatt ataaaatgcc ttagagaata tactaactaa 2513
taagatcttt ttttcagaaa cagaaaatag ttccttgagt acttccttct tgcatttctg 2573
cctatgtttt tgaagttgtt gctgtttgcc tgcaataggc tataaggaat agcaggagaa 2633
attttactga agtgctgttt tcctaggtgc tactttggca gagctaagtt atcttttgtt 2693
ttcttaatgc gtttggacca ttttgctggc tataaaataa ctgattaata taattctaac 2753
acaatgttga cattgtagtt acacaaacac aaataaatat tttatttaaa attctggaag 2813
taatataaaa gggaaaatat atttataaga aagggataaa ggtaatagag cccttctgcc 2873
ccccacccac caaatttaca caacaaaatg acatgttcga atgtgaaagg tcataatagc 2933
tttcccatca tgaatcagaa agatgtggac agcttgatgt tttagacaac cactgaacta 2993
gatgactgtt gtactgtagc tcagtcattt aaaaaatata taaatactac cttgtagtgt 3053
cccatactgt gttttttaca tggtagattc ttatttaagt gctaactggt tattttcttt 3113
ggctggttta ttgtactgtt atacagaatg taagttgtac agtgaaataa gttattaaag 3173
catgtgtaaa cattgttata tatcttttct cctaaatgga gaattttgaa taaaatatat 3233
ttgaaatttt g 3244
<210> 5
<211> 761
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_特征
<222> (693)..(693)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_特征
<222> (722)..(722)
<223> n是a、c、g或t
<400> 5
cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta 60
taaaagttgc atggtcaaat aagtctgaga aagtctgcag atgatataat tcacctgaag 120
agtcacagta tgtagccaaa tgttaaaggt tttgagatgc catacagtaa atttaccaag 180
cattttctaa atttatttga ccacagaatc cctattttaa gcaacaactg ttacatccca 240
tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa 300
ttaaaatttc agatatcttt cataagcaaa tcagtggtct ttttacttca tgttttaatg 360
ctaaaatatt ttcttttata gatagtcaga acattatgcc tttttctgac tccagcagag 420
agaaaatgct ccaggttatg tgaagcagaa tcatcattta aatatgagtc agggctcttt 480
gtacaaggcc tgctaaagga ttcaactgga agctttgtgc tgcctttccg gcaagtcatg 540
tatgctccat atcccaccac acacatagat gtggatgtca atactgtgaa gcagatgcca 600
ccctgtcatg aacatattta taatcagcgt agatacatga gatccgagct gacagccttc 660
tggagagcca cttcagaaga agacatggct cangatacga tcatctacac tgacgaaagc 720
tntactcctg atttgaatat ttttcaagat gtcttacaca g 761
<210> 6
<211> 1901
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (125)..(793)
<400> 6
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc 120
agtg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca gct gtt gcc aag aca 169
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr
1 5 10 15
gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta gca gct act ttt gct 217
Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala
20 25 30
tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct cca 265
Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro
35 40 45
aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa ata act ttt ctt gcc 313
Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala
50 55 60
aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat gca gag agt ggt gct 361
Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala
65 70 75
ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga gtg att att gtt 409
Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val
80 85 90 95
tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat cgc agc aca tat gga 457
Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly
100 105 110
cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc tac ctc cca ctt 505
Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu
115 120 125
cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata atc cgg aaa gga aga 553
His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg
130 135 140
ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aag att atc tta 601
Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu
145 150 155
gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag agt att att cca atg 649
Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met
160 165 170 175
ctt act gga gaa gtg att cct gta atg gaa ctg ctt tca tct atg aaa 697
Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys
180 185 190
tca cac agt gtt cct gaa gaa ata gat ata gct gat aca gta ctc aat 745
Ser His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn
195 200 205
gat gat gat att ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aag taa 793
Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Lys
210 215 220
gaatttttct tttcataaaa gctggatgaa gcagatacca tcttatgctc acctatgaca 853
agatttggaa gaaagaaaat aacagactgt ctacttagat tgttctaggg acattacgta 913
tttgaactgt tgcttaaatt tgtgttattt ttcactcatt atatttctat atatatttgg 973
tgttattcca tttgctattt aaagaaaccg agtttccatc ccagacaaga aatcatggcc 1033
ccttgcttga ttctggtttc ttgttttact tctcattaaa gctaacagaa tcctttcata 1093
ttaagttgta ctgtagatga acttaagtta tttaggcgta gaacaaaatt attcatattt 1153
atactgatct ttttccatcc agcagtggag tttagtactt aagagtttgt gcccttaaac 1213
cagactccct ggattaatgc tgtgtacccg tgggcaaggt gcctgaattc tctatacacc 1273
tatttcctca tctgtaaaat ggcaataata gtaatagtac ctaatgtgta gggttgttat 1333
aagcattgag taagataaat aatataaagc acttagaaca gtgcctggaa cataaaaaca 1393
cttaataata gctcatagct aacatttcct atttacattt cttctagaaa tagccagtat 1453
ttgttgagtg cctacatgtt agttccttta ctagttgctt tacatgtatt atcttatatt 1513
ctgttttaaa gtttcttcac agttacagat tttcatgaaa ttttactttt aataaaagag 1573
aagtaaaagt ataaagtatt cacttttatg ttcacagtct tttcctttag gctcatgatg 1633
gagtatcaga ggcatgagtg tgtttaacct aagagcctta atggcttgaa tcagaagcac 1693
tttagtcctg tatctgttca gtgtcagcct ttcatacatc attttaaatc ccatttgact 1753
ttaagtaagt cacttaatct ctctacatgt caatttcttc agctataaaa tgatggtatt 1813
tcaataaata aatacattaa ttaaatgata ttatactgac taattgggct gttttaaggc 1873
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1901
<210> 7
<211> 562
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> misc_特征
<222> (166)..(166)
<223> n是a、c、g或t
<400> 7
agacgtaacc tacggtgtcc cgctaggaaa gagagatatc tccggagcat ttggataatg 60
tgacagttgg aatgcagtga tgtcgactct ttgcccaccg ccatctccag ctgttgccaa 120
gacagagatt gctttaagtg gcaaatcacc tttattagca gctacntttt gcttactggg 180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540
tccagaagat tatcttagaa gg 562
<210> 8
<211> 798
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (81)..(590)
<400> 8
gggctctctt ttgggggcgg ggtctagcaa gagcagatat ctccggagca tttggataat 60
gtgacagttg gaatgcagtg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca gct 113
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala
1 5 10
gtt gcc aag aca gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta gca 161
Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala
15 20 25
gct act ttt gct tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg cac 209
Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His
30 35 40
att tgg gct cca aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa ata 257
Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile
45 50 55
act ttt ctt gcc aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat gca 305
Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala
60 65 70 75
gag agt ggt gct ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga 353
Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly
80 85 90
gtg att att gtt tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat cgc 401
Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg
95 100 105
agc aca tat gga cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc 449
Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe
110 115 120
tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata atc 497
Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile
125 130 135
cgg aaa gga aga ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc cag 545
Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln
140 145 150 155
aag att atc tta gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag 590
Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln
160 165 170
agtattattc caatgcttac tggagaagtg attcctgtaa tgggactgct ttcatctatg 650
aaatcacaca gtgttcctga agaaatagat atagctgata cagtactcca tgatgatgat 710
atttggtgac agctgtcatg aaaggctttc ttctcaagta ggaatttttt cttttcataa 770
aagctgggat gaagccagat tcccatct 798
<210> 9
<211> 169
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgatgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct 60
gcccggttgc ttctcttttg ggggcggggt ctagcaagag cagatatctc cggagcattt 120
ggataatgtg acagttggaa tgcggtgatg tcgactcttt gcccaccgc 169
<210> 10
<211> 176
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
aaaacgtcat cgcacataga aaacagacag acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga 60
gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg 120
agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc 176
<210> 11
<211> 38001
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 11
caaacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacactgg 60
catatcaagt ctctgttagg ctaggcgcat cctctcccac tgaggtcaga caagactgcc 120
cagctagaag aacatatccc acggacaggc aacagctttt gggacagcca cgctccagtt 180
gtttgggact cataaaagac taaactcaca cctgctacaa aagtgcaggg aggcctaggt 240
ccagcctgtg tgtgctcttt gcttagtggt gtctctgaga gccctaagga tcaaagtttg 300
ttgactctgt tggtcttcct gtggagttcc tatccccttc gtccccctcc ccaccctgca 360
atctttccct caactcttct ttaggcctgg tggtggtggt gtggtggcat ggaggaggtg 420
gtggaggggg tgggggtctt taatcccggt tcttgtgaga ccgaagcagg gacgatttcg 480
gagctctgtg agtttgaggc cagcctggtc tatagatcta gttccaggac agtcagagct 540
acatagagaa accctgcccc gagggggggg gggcgcgggg aatggttaaa gattattgca 600
ggacccagct gatctgtgga agaggtaacg ggtgtttatg tttttcgaaa ctcattgaac 660
aatgcacttc aattgtgcgc actttagaaa tataaagcca ccacgcgaaa agctgcgccc 720
caacttaaag gcaatttcca aggtacttct gggtccttgc ggttcagtgg ctgtctaggt 780
tcagaaacga aactggatcc ccgccccgcc cccccgcccc ccccctcccc agcgccctga 840
ggcagtttcg atttcctatg gccagccggc taggcagctt tttcatcggg actccttgga 900
aagtccccac ttcgttcatc tctggcggat ttgcgggagc cagggcgctc atcgatcgcc 960
tggagccaca gaatgacagc ggagcagcgg cagaatctgc aagcattcag agactatatc 1020
aagaagattc tggaccccac ctacatcctc agctacatga gttcctggct cgaggatggt 1080
gagtggtccc caactggggc tctcaggctc tccaccttag cgaggggaaa acatcactca 1140
gatcagaaac aattgaaggc tctgcccccc cccctccccc gcgctgtcct taagttaatt 1200
tgtgtaaccc ggtgtatgtg agactcccag gccatattag agtagacagc atagggattt 1260
gatggtcagg aacaaaattc ctgcaagctg tagtaacttg cataaggatg ccactctttt 1320
ctttctttca atgctgggga aatagtttgt ttctcttatt tacaccttct agactgctgt 1380
gtgcctccct ttgtcctgtc atgagaaact gagaaatcag aatgcgcccg cccctcctta 1440
gattcctgta cagagcaaag agcaaggctt tgggctcggg ccaaaggtgg aggtgggggc 1500
cgcaggaagc aagaggactg actgacacgc acatttctgt caaaggatgt tgctcacagg 1560
aagtccgtgg aagaaaactt tctccagact ccgtgtgttc agagtttaac acagttgttc 1620
atatctagct ttggggattt gattggtgga taatagactc tttgtaaatt gcactgggtg 1680
tttccacctg agcaaacaga cctccccacc tcacccccac ccccagggag aagggagagg 1740
gcgtttgaag gggtgaccga gggcgtgcgg cagctacttt tcattttgcc agttaaagcc 1800
tagatgtctt tcctggcgtt ggacgacggt ggcaactgca ggttaattct gactctcttg 1860
agttccgaag cctaacaggc tatgcagaga ggagtaaaag agcactaccc agggctaccc 1920
acatcccggt tgtgttagag agaagcagca aaaaagccct aatgattggg ggcggggtct 1980
gaggagagga aacccaccca agaggtttct taacaccagg gtcacttgcc tttcaatcct 2040
ttaatctgat ctttagtcat ttacattagc atacaaagta actagtttca atactgaaac 2100
aaagtaacta gtttgttcag ccattcctgc cattgctctt tgttcttatt taattgcctc 2160
ttctgtggct cttccacccc ctttacctgt ccctctctgg atgccctccc ccccaaatgg 2220
taccccgttc tgctttctta taacatgagg ttcatcacac tccctccctc cctccctccc 2280
ccatttaaag tatcatcctt tcctctcagg gtgcctgttt tagtttcatg aattttaggg 2340
ttttggtttt ttgtctgttt agttatgaga tttttttaaa aatgtggatt atgttgaatt 2400
tgtagattgt tcttggtgct agaggccttt ttatagtatt atttccaccc atcttgggag 2460
atctttctga aatcttccag tgtcttcaag aatttttttt tcccactgcc ttagaagttt 2520
gcattgtagc tatcgttcac ctctttggtt agggtttgtt gttatttgtt tgtttgaggc 2580
tattgtgaat agaactccct ccttccccca tatctttctg ggccaggttg ttcttagtat 2640
gtaagtaagc tactggtttc tgtatgttta tttagaaccc tgcctcttgg ttgacttttt 2700
atgagggctg agagtttgtg gtagtctttg gggggtcttt ataggattat ataagaatca 2760
tttgactcat tcctttccta tttgtctaac ttttgtttgt ttgtttgttt gtttttttga 2820
gacagggttt ctctgtatag ccctggcagt cctggaactc actttgtaga ccaggctggc 2880
ctcgaactca gaaatctgcc tgcctctgcc tcccgagtgc tgggattaaa ggcgtgcacc 2940
accacacccg gccatcattt ccaagttaaa gatttgatct acattagacg ccgccacgca 3000
gaaaaccttg agacttggtg gaaaggccaa aggccattaa aataaatttt cttttttctt 3060
tcttccattc tttcctttat tccttccttc ctttcttttt gttttctttc ttttcttttt 3120
cctttttcct gagacagggt ttctctgtat agccctggca tcctggaact cactctgtag 3180
accaggctgg cctcgaactc agaaatccac cagcctttgc ctcccaagtg ttgggattaa 3240
aggcattcgc caccactgcc caaatatttt atttatttat ttatttattt atttttatat 3300
atgtgatgag tacactggaa attccatcaa aaagagcagg tttgactggt gtcactagat 3360
ttactattga tagggatccc taaaggagag ctaaggtaaa gggctctccc tctcctaggt 3420
cttctgcata ccttccttga gtgttctggg ccagatctcc taagctctaa gaatgtgctg 3480
aaaacacact gggaactggc tccctccttg ggaatttgta ctccctctgc tgtgggaaac 3540
ttggatataa gaggctacag gaggacagtg agttataccc caggcacaga gttagcgtgt 3600
acattcaaaa cgcataccat tttgaaagta gcagctgcta gcatttcctg tcacctggtc 3660
aacctggtct ctttagctgc cccacccctt ccacttttct gctgtgtttc ttttactctc 3720
ttagcaaaaa ttggaatgaa agaccacaaa tgtatttgta attcaaaatg cttgctgcat 3780
cagctatact cgttactgtt gccatagggc gttcattccc acccaccccc aaccccttag 3840
tccagcagtt gcttcagagt tttgaagaag aggaggaagc ctttcttctt ccatgtgaca 3900
ccctccactg cgacttctgc ttactgtggg gaacttgagt ggaggacggg agtgtgcata 3960
gatgaaagag tggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga gtggaggacg ggagtgtgca 4020
tacatgaagg agtggaggac gggagtgtgc atacatgaag gagtggagga cgggagtgtg 4080
catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga aggagtggag gatgggagtg 4140
tgcatacatg aaggagtgga ggacgggagt gtgcatacat gaaggagtgg aggacgggag 4200
tgtgcataca tgaaggagag gaggacggga gtgtgcatag atgaaggaga ggaggacggg 4260
agtgtgcata gatgaaggag aggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga gaggaggacg 4320
ggagtgtgca tagatgaagg agaggaggac gggagtgtgc atagatgaag gagtggagga 4380
cgggagtgtg catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga aggagtggag 4440
gacgggagtg tgcatacatg aaggagtgga ggacgggagt gtgcatacat gaaggagtgg 4500
aggacgggag tgtgcataca tgaaggagag gaggacggga gtgtgcatag atgaaggaga 4560
ggaggacggg agtgtgcata gatgaaggag aggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga 4620
gaggaggacg ggagtgtgca tacatgaagg aaaggaggac gggagtgtgc atagatgaag 4680
gagtggagga cgggagtgtg catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga 4740
aggagtggag gacgggagtg tgcatatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga 4800
aggagtggag gacgggagtg tgcatagatg aaggagagga ggacgggagt gtgcatagat 4860
gaaggagagg aggacgggag agtgcataga tgaaggagtg gaggacggga gtgtgcatac 4920
atgaaggagt ggaggacggg agtgtgcata catgaaggag tggaggacgg gagtgtgcat 4980
agatgaagga gaggaggacg ggagtgtgca tagatgaagg agaggaggac gggagagtgc 5040
atagatgaag gagtggagga cgggagtgtg catagatgaa ggagtggagg acgagagtgt 5100
gcatacatga aggagtggag gacgggagtg tgcgaggatg gatgagtgga gtctgctgcc 5160
tctcaaaggt cttctggttc catgagttgt tatgactccc agacccacat gggaaggtct 5220
ggtctgttat cttccagtga ctagtgcttc tgcaggctac tcacttgccc ttgcttctgt 5280
ttgcagagga ggtgcagtac attcaggctg agaagaacaa caagggccca atggaagctg 5340
cctcactctt cctccagtac ctgttgaagc tgcagtcaga gggctggttc caggcctttt 5400
tggatgccct gtaccatgca ggttggttcc ttcttcttcc tcacagttca gagtacttca 5460
ctctgctgcc tcagaaggct gaggggagaa aagtgactcg ttctgtgaca tctgtgtgtg 5520
gcttctgcct caggcgggaa atgtaaagac tattttgaat cagataagag aatggtttat 5580
accagaaata tccaaagcaa tctacagagt tgtaactact aggagaggtg acaatattag 5640
tagcatgccg gtatctttca agaggagaac gagtaaataa atcggtttta taatgtttac 5700
agtgctccat tatactgcaa tgaagcgtgt ggacatgtct gtaaatgaca acccagctga 5760
actgtaggca cgcagcattt aaatttgaat atcataaact ataatagcta taaagttcca 5820
catgagtcaa actaaacata tagggaagga aactggatct tgggcgaccc tggctgacca 5880
gtcctgggga gtaagcttaa taaactctcc ctgtctgact gagatcggtg tcctgtggtt 5940
tgtgaggcaa ttcctggact ctaacactta ggcaattaca tttcttgccc ctctgccact 6000
ctagcttatt cactggtgaa agaaggagaa tactttagtg ttaccaacaa tggggggggg 6060
ggggcggggg atgggaaatg ggaaaaagca ggcccggccc agtgtagtaa gaaagaaaca 6120
ccaaagaaag ccaagggctc ctgttgcttt cattgtattg gagtgtttgt cagtcggctg 6180
ggggatgggg tggggggtgg ggaagcacac ctttaatccc agctctgggg aggcagaggc 6240
aggcagatcc ctgtgagctc caccagtcat ggctggcctc agcaagaact gtatccatca 6300
catcctaaca caggtgtgtt gaattaacat ggtactgtta aagcaaacac gctgccttcc 6360
tcgggtgctg cggtccctag gaagccacac attggcagca tgttggcagc agttgtataa 6420
aaactaatgc ttttttttcc ttttcttttt aattcggtaa aagggtttaa atgtcatttg 6480
ttataaaact tggtttcctg ctatttccag gattaacaat tgacttattc tttctatttc 6540
ctgctttata gaccatcatt ttgatacatt atctatttgc atctcagtga tacatgctta 6600
tcttaccctt ttatttcgtt ttaagaattg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6660
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtctgagag tgggcatgca tttatgagtg cattgcctag 6720
aggtcagaca ttcccctgga gctggagtta atggcagttg tgagggactg acgtgggtgc 6780
tgggatctga ccccagtccc ctgcaagaac acgatgaacc ttacttgcta agccatctcc 6840
ccagccctta gctgttgcag ttactctcca ttccaaataa gccctggcaa tgaaaacaag 6900
acttaattca tatgaataca tgctgtgcac ctagattggg cagatctacc gctacactac 6960
catcttctcc atctatgaga ctcccccttt tttttttctt tttttctttt ttgtggtttt 7020
ggttttttga gacagggttt ctctgtatag ccctggctgt cctggaactc actttgtaga 7080
ccaggctggc ctcgaactca gaaatccgcc tgcctctgcc tcccaagtgc tgggaattaa 7140
ggcgtgcgcc accaggcggt ttctccaggc tgtgtgcttc tgctccactt ttcttcctcc 7200
tcctctgtgg tatcctctcc ctcttcctct ttctccttct ctcttcccac cttcctctcc 7260
aacttccctt tatcagccca atcaccagct ctcctttatt ttactaattg aggtgggaag 7320
caggtttaca ggaaatcacc ggagtgctga ctcattcctt gttcgcagcc actcaatgca 7380
gaatggaatt accatcaaat ataattagcc ccagggctat ccacaacact tacctagcac 7440
atcaaatggc ccagcagggg atcaagagaa aaggaaactc aacttctgct tattttcctc 7500
atctcttatg tagccccatc agagaagctg ttgttttcct tttgtgggct ctaactaatt 7560
tgaatattat atttaagatc tattctctta agtaaaaatg gcacagctaa ctttaactgt 7620
aaaattatat gaggtttact aggaaaagtc ttgagtttaa gcaagaaagg gaattttaaa 7680
acatttgtat tggaacataa gtgctggaac atctctcttt gcaagtgagg tgctttgtgt 7740
gtacaaccct aagagtttct tttttttttt tttttaattt atttacttca tatttcagac 7800
agatctcatt tcaggtggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggatttga actcaggacc 7860
tctggaagag cagtcagtgc tcctctgcgc tgagccatct ctccagcccc cctaagagtt 7920
tcataaagga atagtctgca ttaataaatt cagaaaaggc tcagaatata aagccaatat 7980
catcaagtag gtttccagtt tatgtattaa caaataatgc aaaaaagatt ttaagcaagc 8040
gattcctttt ataacagcac caagaacaat aaagttagga atgccagtgc tcctaactgc 8100
tgaaccacct cagcaatgca aacttttaca tcttagcact aagtccagct cctaattcgt 8160
gaatgtaaga tgtcattcat gtccgtgtcc ctatggttcg tttcagaagt ggtttatggt 8220
cttcgggtca taggtctttc ccctgctcag ctttgcttat tcctaacttt atttaaagtt 8280
ctcactgttg ttataaaagg aatcacttgg ggctggcgag atggctcagt gggtaagagc 8340
acccgactgc tcttccgaag gtcctgagtt caaatcccag caaccacatg gtggctcaca 8400
accatccgta acgagatctg actccctctt ctggagtgtc ggaagacagc tacagtgtat 8460
ttacatataa taaataaata aataaataaa tcttcaaaaa aattctaaaa aaatatggaa 8520
aaaaaaggaa tcacttagtt aaaaatctca ttcctagccg gttgtggtgg cacatacctt 8580
taatcccagc acttgggtgg cagaggcagg cggatttcta agtttgaggt ctacaaagtg 8640
agttccaggt ctctgaaaac cacaaaaaaa aaaaaaaaaa atagcactgg ctgctcttcc 8700
gaaggttctg agttcaaatc cctccaacca catagtggct cacaaccata tgtaatggga 8760
tctgatgccc tcttctggtg tgtctgaaga cagtaacagt gtacttacat ataataaata 8820
aataaatctt tgggtgggag tgagcggggc tggagagaga aggaaaagta tctgaagaca 8880
actacagtgt acttacatat aatagataaa taaatcttta aaaaaatcaa taaatgaaag 8940
atgccaatat tacccagagt tggcacagtg atacctttca taatgccaaa ttttggtggc 9000
aggattgttt gtttattaaa caggaataga aaaatttact ctcaaatttg tatgaaatct 9060
taaatggtca aaatattgga aagagaaact cacttggaaa ccttggggga cttatacttc 9120
ctggtgtcaa aacagtacag aacctccata aagccagata attagaccat tagcccagaa 9180
gtaaactctg aaggatatgg ccaaaggttc ttcaacaagg gtaccatgac cacccaaaag 9240
ggggaaaaaa aacccagtcc ctttaatatg aaaatacatt ggggtaagtg ggtatacata 9300
tgggaatgag aggtatcagg cataatcttg tgctatgatg tgaatttgaa atgttctcat 9360
cacattcatg ttttgagtgc ttggtcccca gcttgtgggg ttttaggagg tagagcctag 9420
ctagccaaag taacacgtgt atacgttcat gcatgtgtgc acacaggtat gagggtactt 9480
gtgtgtagcc cagaggctga cattcagtgt cttccttagg agctctccac cgtatgtttt 9540
tgggaatgga tctctcatta gacccagaat ttaccctctc gggctcgact ggctgggatt 9600
atagggtcat gctgctacac ttggcttttt acatgatagc tggggacagg aactcaggtc 9660
ccagccttgt gtggtgagca cttttctact aagcaccttc ttggtcctgg agctattttg 9720
attgttttag ttttttgggt ctataggggg gagaaaaaaa aaaaaaccac attgtcttcc 9780
cagggccttg aatgaagtaa atgagggtct gagaggcagg cacgcctggt ggatctgtcc 9840
aaaaacccca gagtacggca ttcttggatt cttttagtca gaagtcattt tccttctcca 9900
tttgcccatt gacttaatct tttcttggaa tggtgtggaa ggaaacactt ttcaagggca 9960
ggatgtaaga tttgtatttc ctctggtctt ctttactgtt tcctcttgag aagataaaca 10020
tgatgaattt gactaattta aaagtaaatt gagatgacaa agagatggct ctgtgattaa 10080
gagcacttgc tgatcttgca gaggacccag gtttggttcc tagacttaca tggtagctca 10140
caaccatctg taacttcagt tccaggaatc tgaccctctc ttctgctctc caaagatacc 10200
agacacactc acgatacaca gacacatgca aagtaaaata gaaataaata ttaaaaaaaa 10260
atatattgtg ggttgttgtt aaagtgcgtg aggggcattt tgaagatttt attctaaggt 10320
caaatacaag gcctcatatc tgtccttagg acttgaccct gaaagataat gaattttagg 10380
agacctaaac tgttgggtac caaaaatgag tattactccc attttggaaa atcatgaata 10440
gctgtattag ttgactttaa ctactgtgag taaatgcccg aggaaataaa aagcagaaaa 10500
atgagagcca agaggatctg tagcttctgc acccgtgcgt ggtgaggcag ggcaccatgg 10560
cgggagcatg tgggaaaagc cgcactttct ggtagacagg tggcaaaggg tgccgggcag 10620
gggccctgga caagatgcat tcttcaaagc acatctccag tgactcactt ctcccagaga 10680
gggtacagtt ctcagttgct ccttctgtat gaactcaatg tgctgccagt ggtgacgcca 10740
ggactcgaag gatgtggtca ccaggtcccg cagggtgtgg tcacctctaa agactgtcac 10800
cagctggtgt ccaagcctgc aacctgtcag cctcatggtc tggctcccca gactgtccag 10860
tgactgaggc catttgcaga tggttttcag ttcccttgcc actgatttga acaggattcc 10920
catgattttg acttcaaagc atttttatgt tggatttgct taagaaatcc ccatttctct 10980
tttctttttc aggttactgt ggactttgtg aagccatcga aagttgggac tttcaaaaaa 11040
ttgaaaagtt agaggaacac agattacttt taagacgttt agaaccagaa tttaaggcca 11100
cagttgatcc aaatgatatc ctttctgaac tatccgaatg tttgattaat caggaatgtg 11160
aagaaatcag acaggtaaac caatgccagg tactaaattt gaagaaaaat gcagagacat 11220
tggaaatgcc catttttctg tcttgtttta ggcccaagga taattgaaac ccataaaagc 11280
tctcatctag cagatataat gactagaata gaatttttaa agtgaatggg gtaatttttg 11340
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aaaaaatagt ggtttatgca taatgcaaat cacaccaaac agtgcaacaa ttaaaaggaa 11460
aaatatgtca ggctcttggg catagataca tttattacag tctcgcagtc acttaactag 11520
tgatgtgatg ccaggcagtt ctctaagcat ctgtggggtt tttgttgttg ttgttgttgt 11580
tgtttgtttg tttgtttttc atgtctaaag taagaaaatt tatcttttgt tttttgtttt 11640
tttgtttttt tagatttctt tattttattt tattatatgt gagtacactg tagctgtctt 11700
cagacactcc agaagagggc gtcagatctt gttacggatg gttgtgagcc actatgtggt 11760
tgctgggatt tgaactcagg accttcggaa gaacagtcgg tgctctcaac ccctgagcca 11820
tctctccagc ccccttttgt ttttgttttt gtttttgttt ttgttttttt gtttgtttgg 11880
tttttttgtc gttgttgttg tttgtttgtt ttgttttttc gagatagggt ttctctgtgt 11940
agccctggct gtcctggaac tcactctgta gaccaggctg gccttgaact cagaaatccg 12000
cctgcctctg cctcccgagt actgggatta aaggcatgca ccaccacgcc cgacgaaaat 12060
gtaccttatt agcactcttt tagggctaaa tgagaggtca tgcacaaaat gtgtatgtca 12120
gcttgatgca tagcagtcta tgcacaatgc atttcagtta tcattagaaa gaaaagtcat 12180
agaacatctg cttagaaaag agacctgctg ctgtgctgtt aggcatttcc aaatggctct 12240
gtgtgccgat acatccttag ggtgaatggt tagcgtctgg gttaacgctt ttaccccagg 12300
attgctcttg gtcagggata taaggattca gaagatgaga acatttgcct tggcatattg 12360
ataacacatt ataaaggaca aaggtgaaga aaggaatatc ttaaaagcta gtgctggaca 12420
gggcaaaaag atgatgctaa ctaagcccta ctcaactata cttcacagtg atttcaatca 12480
gataccgctt ccacaaaagc ttgccagagg aaaggctgag ctgcctgatc agtgtgctgc 12540
atttgtctcc cccagatccg agacactaaa gggagaatgg caggtgcgga gaagatggcc 12600
gaatgtctta tcagatccga caaggaaaac tggccaaagg tcttgcaact tgctttggag 12660
aaagacaaca gcaagtttag tgaattgtgg attgttgata aaggtggggt gctccaagaa 12720
agaaccctgg accctgctgc gctcctccca gttctcccca ctttactttc catcagaggc 12780
gctgttcact tcagatacca aaggctatat ccctaggata caagcagtgg aaagctgaat 12840
tctgggagga agggaactac atggcatgga attaacccga ccaggtcaaa gaatctaggg 12900
aaggcttcca gccccaattt gttatcagag aaatagcttg agaattctag acctaaaggt 12960
tcaaactgca agacttacct ccctatcaga gcagaggctg agtgttgggg gtgatagcta 13020
tggactggtg ctcttgcccg gaagccatct ggactccgac agagcaagag taaacgaaga 13080
ttttctgtgt ttaagccaac ctcatttggc ttccggaaac tcacttcttg ctttaaacag 13140
accttgataa atacctgagt ttctagtttc ctttctcacc tagatttcct tagaacataa 13200
attattccag aaactctcta catcgttggt cagagatgga atcctgtctc tttagtgtgc 13260
tcaggaatga cgcccctgcg ttattggcgt gagttccgga gtggggaggg gctccggatg 13320
caaactgctg agagccccgg gttccacact tggagtcgcg tagttccaga tgaaactgga 13380
attcaattgc caagttgagc ttcaaactca gaataatcct tgcagttgtt ttaagccgtc 13440
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aaattcaacg tccagggcct acatgataga accaatcccc aaacagtgtc ctcatccctc 13560
ggcacactca ctgtgtcgtg tgtgacacac acagtaaaca aatccatttc aaaaataaat 13620
aaaatgttaa gaaagtgcaa gaccgtgatt gtaagagctc aacggaaatt tagatgttta 13680
gtgttagtgt taggactttt tgggacttcc ccaaccaaaa ccataatcac attgcgcatg 13740
cttttaatcc cagcactcag gaggcagagg caggtggatt tctgagttcg aggccagcct 13800
ggtctacaga gtgagttcca ggacagccag ggctatacag agaaaccctg cctcgaccac 13860
cacccccttc caaaaaaaaa aaaaaaagat tctaagctgt aagctgttat ttgtgtttat 13920
gattgtttgc ttgcctgttt atcacaaagg tttcaaaagg gctgaaagca aggctgatga 13980
ggatgatgga gcggaggcgt ccagcatcca gattttcatt caggaagagc cagagtgtca 14040
gaatctcagt cagaatcccg ggcctccttc aggtaccaag catcgtttgc tctcatccat 14100
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gaaaagaaag aatttgtggg gcaataggga cttcataatt agaatccctg ctcctgtctt 14220
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cagtatgtat gccttcatct gtaccgtgtt cccagaactt cagtgtccat gacttctcaa 14340
agcagccttg ctctctaaag aacacttctg ctcactaagc aatggctttg agaatctggg 14400
ctgacagctg gttttcctcg gctgtttttg atgatctgtt cttactttgt tccaagtggc 14460
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tttgggggct ttgttgtgtc tggttttggg ggctttgttg tgtctggttt tgggggcttt 15780
gttgtgtctg gttttggggg ctttgttgtg tgttttctga gacagtgtat cacgtagcct 15840
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tctacaagtg ctgagattac agtgtgcact ggcatgcctg gctgttctct gattttcttt 15960
cttttttttt tttttaagat ttatttattt attatatgta agtacactgt agctgtcttc 16020
agacactcca gaagagggca tcagatctca ttatgggtgg ttgtgagcca ccatgtggtt 16080
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ttgcgagcat ttctggggca acatctgata gcgtctcagt gcagcacatc attgaagaca 16680
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gttgctcttt tgtagccaca tttgagcttg ccctcctcgg ggtctcagtc catcggtaca 16980
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agatgccctt cacaaaaaac aaaatctagg ctgcttaagt ctcttgtatg agatgacatt 17100
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aataaaggtg ggaaattcat acatgtttag tacttatgaa gttttaaaaa atatttttga 17280
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ctgccttggt caggattggg tggttatagg tttacccata atactccatt gcaactctcc 30960
acaatggtac tgcaatttta cccagcgttc aatggcatag tcgtgaaaat atcatatcca 31020
ctaggccaga ggctttgcca gtcggcaagt agacctttga tgggtgtggt gagtagctct 31080
ctgtactcca gagtctggtc ccacctgaac cagagtctga cttcctttcc ctttcttgtt 31140
tccccaagaa cagcccccac attccctttc cggaataacg tctctgtgcc tgtcactcat 31200
cagtcacatc catttttcgt cctcctccac cgcttactgt gcggttcagc cagccagact 31260
ccgcttcctg ctcgtccagt ttctcagata ctgtcgctct acatgttagg tcctatctct 31320
gtctctgcca cacacaacct aattcttcta cctagaacaa gcactccttt aaatgcccac 31380
taccgtttat atctgtctct gcaagagcat gacaattgca ttcctttctc cgcattgcag 31440
aagggtcagg tgcgcgtgca cggtgccact gctgcgggct catgccagat tatctgtaaa 31500
ttagtgttgc tggcagtgca gagcaatcag actatgccat tggagacccc atgaaaactg 31560
ccagagatgg cttatctgtg tgctgagcac actggctaga acctgcattt gagtctactc 31620
ttcggttcag cttccctaga aagtaggatg cagtgaatca aagttgaact cgagaaatac 31680
tcctcacatc tctttccagt aacctcagag tttgacatta acacacaaag aaaacgtttt 31740
ctgcaggccg aggaagagca cgagatagca agtgcttcct cctgaccagc agcgctgacg 31800
tgattgaaaa agaaaaggcg aacatgatca aggaaaaaat aatgaatgaa tccatcttaa 31860
gactgcagac atgggatgaa atgaaatttg gaaagacggt aagtctcttt ttctgtgcta 31920
ctcttatgga atctgactag aaataacaaa tgaccatggt tggtcctgag tgtgtgtgtg 31980
tgtgtgtgtg tggtatgtgt ttgtggccat gtgcatttat ttatctttgt gtgctagttt 32040
tggccattca aataaccttt ctgttcgcat gtaggttcac cgcatacagg tgaatgaaaa 32100
actcctcaga gacagtcagc acaaaccaca acctgttcct gacaaagaaa acaagaaact 32160
gctgtgtgga aagtgcaaga attttgcgtg ctacacagct gacattcgag tggttgaggt 32220
gagtggccct ggtgatttag caccggttaa atcttaccat cttccggaga aatggttgta 32280
gcaagaacac tatgttgtgg ggtttcgagt gttgaccatg gtcctgtatt aagaaataaa 32340
atcctgctag gtggtggtgg cacacgcctt taatcccagt acttgggagg cagaggcagg 32400
cggatttctg agttcgaggc cagcctggtc tacagggtga gttccaggac agccagggct 32460
acacagagaa accctgtctt ggaaaaacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaataaaatc 32520
ctgcttctat gtgggaacca gaaaggctga tgttatttaa gtccaaaaca gaaaatggtg 32580
cttaacggcg agaagaggag gggggtctaa ttgtagctgc cccagacagt caggcaggat 32640
ggataaggtt tcccgttcca ctgcacagca gggtgaatac tgcttatagt ttctgattca 32700
ttacaactct tacaaagaat tagacgagag gaattcatag cttcagacat aaagagatga 32760
aaactgtcca ggcagaaggg aatgctaatt actctggcga gatcattaga tacttagaaa 32820
ttatcacact gcacacccta agtgaggaca actgtgtgct ttgaaagaca gtctcactca 32880
gaccaggctg gcttcaactt gagattcttc tgtgactcag cctccccagt gcagggactc 32940
taggcatgca ccaccactct ctccaaagag atagtttttc ccagtgcagg gatagaaaat 33000
gaaggctctg ctagatacag tgttatgtcc ttggttagtt ccagggagga ggaagggcta 33060
ggcataaaaa tctgtcattg atttcttagt tttaacaaat gtgcaactgc attcaaaatg 33120
gaactgggct aaaggcattt gcaaatcttc tgaggcatct ctgtaacttt actgtatgtc 33180
aaagattatg ccaaagaaat gttaaggctc tgattttgaa gtgtacatgg ttctagtata 33240
aacctgccag caaatgaatg gtaaagtggg aaaatactat gaatatgaaa ttataaagat 33300
gcttttgtta tggctacata caacatgagc agtgatatct ttgtcatgac caatgtgggt 33360
ccacctttcc taaaggggaa aaaaggctaa tatataaaaa tgacatattc tgctagtgaa 33420
ttctctcttc ctgttttgtt ttctaaactt ccttattgga acagagaatg cttttataat 33480
gaaaacaaaa cacctcattt taaaaaatat aacacttgta ggttagcttt ctactttttc 33540
accccttaaa cttttttttt ttttttttga gacaggatct ctctctatag cactgggtat 33600
cttgaaactc attatatgga gattcccttg tccctgcctc ccaaacgctg ggacgtaaag 33660
gcatgtacca ttacacaagg tcttcttaaa acttttaact aaggcaaaaa acctccagag 33720
acgaatcttg cagtcatcat tcctgctacc gatggcgggg gcagatggct gtgctagcta 33780
ggggaggggt acagtcctta ttatgagtga catccacttt ctgagtctga ttctttagat 33840
gcagaaggtc ctttcagctc caaattcaag gcttctcctt cccagtggcc tggagaacga 33900
gatgcttggt ctgcgcttgc gtctgtaggg tacactcttt tttttttaat tggatatttt 33960
ctttatttac ataaagaaca ccttcagttc ccctacactg gggcatctaa gccttcatag 34020
gaccaaggac ctctcttccc attgatgcat gacaaggcca tcctctgcaa cgcacgcagc 34080
tggagccatg tgtactcctt tgtggatggc ttagtcgctg ggagctcttg ggggactggt 34140
tggttgatat tgtttttctc cctgtggggt tccttcagtt gtagggtact ctcttaagtc 34200
aagtctaagt ggggtctgtg gacagcatgg ctcctgagcc tgttcacaca cataccctgt 34260
gacccctggg tgtcaccagc cctgtgcttt ggtgccttcc tggcctctgg tgaacttgaa 34320
ctttgtatgt gaactcctct ttgcttctga gttggaaagc tgggtttcct cctttctcag 34380
gtgccagacg cccaggaaat gggtcctaat cggcctgggg aagactgtct atatagtttt 34440
tttttcttcc aacttgtaaa ataaatggga tcccactcat tcctgacttt tagctactga 34500
gtggcttcta agtcattttc agacccgttt ctaacattgt gcgctccatc tcttcctcct 34560
agacgtccca ctacactgtc cttggagacg cttttaagga gcgctttgtg tgtaagccac 34620
accctaaacc aaagatctat gacaattttg agaagaaagc aaagatattc tgcgccaaac 34680
agaactgtag ccacgactgg ggaatttttg tgagatacaa gacgttcgag attccagtca 34740
taaaaattga aagtttcgtc gtggaagata ttgtgagcgg agttcagaac cggcactcaa 34800
agtggaagga ctttcatttt gaaaggatac agttcgatcc tgcagaaatg tccgtatgac 34860
ctcaggcttc tccgtctcgt gccgcaggga gccgtgcctt aagcatggag ttgatgagcc 34920
aatgctttct tacccaagct tgcacaatcc tttcttacac aagcctgcac tgtgttgaat 34980
gccagataac ctgactggtt ggtttcaagc tggtgctgtc cacacaaagc acacacgcct 35040
gaactgcggc gccgaatagt ttcttcacca ataactcata gcgtagccct tggccatggt 35100
ggggaggggt taaacttgtc ccttttacac ttttcagaac tgcccgacag ggaacgtgca 35160
gccactcggt acaccgagac gcatgatggc tggcgtgctg gaagggttcc cgttctctgt 35220
ctgctcgatc tgctgtaagc tgcctttgcc cttaatgaca gtgcccttaa gaacagtgac 35280
ttagttcttt ttcaggccac cagactgact gccagatccc ttctgtccct tctgtccctt 35340
gcactgattc ctttccggat ttgaccctgc caccctgtca ccctctgcag agtctcctgg 35400
tttctgtctc ttccttggtt tctttgctga ctcaaatttg gtagttgcaa ggttcagtat 35460
gcacacatat atatttaaaa tgacatataa tttaaaatgt aaaagactat agttgacagc 35520
tatgcttact gagatggtat ttctgttctg ttcattacta tacatcttac ccttgctctc 35580
atctgttctt ttaacttggg ccatttcccg tctttgaata gacatctcaa accctgtctg 35640
tatgtctgtc tgtttcccac ctgtttgaga cagggtctct ctgtagacca gaaactccat 35700
atgtagacta tgctggcctt gaactcacag atccccctgc ctctcaagtg ttgaaattaa 35760
aatctttcac catgcctggc tctagctatt ttcaataaag gctcatgttt aaagtttgaa 35820
ctacttccaa ttcattccct gacgtggctt gttgttgttg tttacttttg gagacactgt 35880
tcctctctgt agccctggct gtgtagacca ggctgccctt ggtcacagag atctgccagc 35940
ttctgcctcc ggagcactga gattgaaggc ctgcatcacc atgcctggct tgccctttct 36000
tcttaaacat tatatattca aatggcattt ccgtgtttct tctcaaggtg tgccagtgct 36060
tcagagagct tagtttgggg ttcttcagat caagagacaa gtgtctgagc gctgttactg 36120
ccaacagagc aaagtactct tcagttcagg gaaggaacag tgctggtttt gtaggcagta 36180
cagtggtttt aacaccttcc tagaacttac ttgtaattca tcagttgtag accatcaatg 36240
gcctaaacca aactgcagag atcatctgac cacataactc cccttccagg acatttacat 36300
ttgaagacta tcccaagccc acccagagca cagtgggtta cccaaactcc ccaggtcaac 36360
cctggaggtc aacagtatga catgggatag cacaccactt ctcacagatg cctagagaaa 36420
ttacccagca acataactct ttggggaaaa aacacctata gggattaggc ttttaattga 36480
tagaataggt agaaaaaaag atatgtagta gttcttgata gtggttactg gtaaaattct 36540
tagtgcaata aaatgaattt gccgagagct gactttcttt tttttcttgt ttttttgaga 36600
cagggtttct ctgtatagct ttggctgtcc tggaatgcac tctgtagtcc aggctggcct 36660
tcgaactcag aaatccgcct tcctctgcct cccaagtgtt gggattaaag gcgtgcgcca 36720
ccacgcctgg ctgagagctg actttcattt atgtctttta gtctatgttg cctttctttg 36780
ctgctacagt ttaagaactc tacagcttgt ataagatacc tactggaaat tatttgagaa 36840
aaaaaacttg taaacattac aataatttaa ttaattaaaa atttatgtat tttatgtata 36900
tgggtgtttt tttctgcaag tctgtgtgca cattagaaga gggcattgga tcctctctat 36960
tgttatagtt ttatgctgct gctgttgttg ctgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgctatg 37020
aattgaactc aggacctctg gaagagcagt cagtgctctt aactgctgag ctatctctcc 37080
agtcctggca atgataaatc agttgaagtg aaatagtcct cccccccctt tttttttttt 37140
gccaatgggg aaaagcagac taaatctgag accaaatgaa gttttgagtt gtacactgac 37200
ttaagccact gccaagcata ccctggaatg gagcaaaccc tgggttacta agtactgaat 37260
gaatacaaca ggaaggtttt gagagatggg aaaatgcttg tctttggact tccctgatgg 37320
aagttgcatc tggactctcc catgagcaca tcaccagtcc ccactagagt cctcacaggt 37380
tgccatccat gtgtcctttt tgaggctgag atacaacttg ttctgcaacc acagaccttg 37440
ctgttttgtg gtcagtattg gtatcatagc attttcatcc tgacctggag ccttcagtca 37500
aaggcctcat tgtgcagtaa ggacgctgga ctcctgactc ctatacttaa aacagacttg 37560
gtaatttcaa acaagtcaac cagatgccag tatttctgca tgcatgtctt gtgggatggt 37620
gttgtgaggt cccctgacag atgcactgag tggccaggga gacttttgta cccttttcca 37680
ttttaacagc ccacgggtca ctgtgttgct tccatcatat taacatcaac ttgaaccagt 37740
ggttcctgaa acacttcagt tcattggacc ttgctaatta gcatcctgta aaaacccacc 37800
aacaaatatc aactagacag gtagaatcca agtgaactgt acactcctgg atcatgccag 37860
taactgtttt aataatacac cataaaatat aactacgact tcattttaca aatctgtgtt 37920
taataaacag gtacaggctt gttgggtgcg aacttttaaa actcctaata aaaatgccag 37980
ctatgattat ctttgtttat g 38001
<210> 12
<211> 3435
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<220>
<221> CDS
<222> (370)..(1815)
<400> 12
cgtttgtagt gtcagccatc ccaattgcct gttccttctc tgtgggagtg gtgtctagac 60
agtccaggca gggtatgcta ggcaggtgcg ttttggttgc ctcagatcgc aacttgactc 120
cataacggtg accaaagaca aaagaaggaa accagattaa aaagaaccgg acacagaccc 180
ctgcagaatc tggagcggcc gtggttgggg gcggggctac gacggggcgg actcgggggc 240
gtgggagggc ggggccgggg cggggcccgg agccggctgc ggttgcggtc cctgcgccgg 300
cggtgaaggc gcagcggcgg cgagtggcta ttgcaagcgt ttggataatg tgagacctgg 360
gatgcaggg atg tcg act atc tgc ccc cca cca tct cct gct gtt gcc aag 411
Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys
1 5 10
aca gag att gct tta agt ggt gaa tca ccc ttg ttg gcg gct acc ttt 459
Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe
15 20 25 30
gct tac tgg gat aat att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct 507
Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala
35 40 45
cca aag aca gac caa gta ctc ctc agt gat gga gaa atc act ttt ctt 555
Pro Lys Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu
50 55 60
gcc aac cac act ctg aat gga gaa att ctt cgg aat gcg gag agt ggg 603
Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly
65 70 75
gca ata gat gta aag ttt ttt gtc tta tct gaa aag ggc gtc att att 651
Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile
80 85 90
gtt tca tta atc ttc gac ggg aac tgg aac gga gat cgg agc act tac 699
Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr
95 100 105 110
gga cta tca att ata ctg ccg cag acg gag ctg agt ttc tac ctc cca 747
Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro
115 120 125
ctg cac aga gtg tgt gtt gac agg cta acg cac atc att cga aaa gga 795
Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly
130 135 140
agg ata tgg atg cac aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aaa att gtc 843
Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val
145 150 155
ttg gaa ggc acc gag agg atg gaa gat cag ggt cag agt atc atc cct 891
Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro
160 165 170
atg ctt act ggg gag gtc atc cct gtg atg gag ctg ctt gcg tct atg 939
Met Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met
175 180 185 190
aga tca cac agt gtt cct gaa gac ctc gat ata gct gat aca gta ctc 987
Arg Ser His Ser Val Pro Glu Asp Leu Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu
195 200 205
aat gat gat gac att ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aat 1035
Asn Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn
210 215 220
gcc atc agc tca cat ctg cag acc tgc ggc tgt tct gtg gtg gta ggc 1083
Ala Ile Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly
225 230 235
agc agt gca gag aaa gta aat aag ata gta aga aca ctg tgc ctt ttt 1131
Ser Ser Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe
240 245 250
ctg aca cca gca gag agg aag tgc tcc agg ctg tgt gaa gcc gaa tcg 1179
Leu Thr Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser
255 260 265 270
tcc ttt aaa tac gaa tct gga ctc ttt gta caa ggc ttg cta aag gat 1227
Ser Phe Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp
275 280 285
gcg act ggc agt ttt gta cta cct ttc cgg caa gtt atg tat gcc cct 1275
Ala Thr Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro
290 295 300
tat ccc acc aca cac atc gat gtg gat gtc aac act gtc aag cag atg 1323
Tyr Pro Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met
305 310 315
cca ccg tgt cat gaa cat att tat aat caa cgc aga tac atg agg tca 1371
Pro Pro Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser
320 325 330
gag ctg aca gcc ttc tgg agg gca act tca gaa gag gac atg gct cag 1419
Glu Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln
335 340 345 350
gac acc atc atc tac aca gat gag agc ttc act cct gat ttg aat att 1467
Asp Thr Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile
355 360 365
ttc caa gat gtc tta cac aga gac act cta gtg aaa gcc ttt ctg gat 1515
Phe Gln Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp
370 375 380
cag gtc ttc cat ttg aag cct ggc ctg tct ctc agg agt act ttc ctt 1563
Gln Val Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu
385 390 395
gca cag ttc ctc ctc att ctt cac aga aaa gcc ttg aca cta atc aag 1611
Ala Gln Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys
400 405 410
tac ata gag gat gac acg cag aag ggg aaa aag ccc ttt aag tct ctt 1659
Tyr Ile Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu
415 420 425 430
cgg aac ctg aag ata gat ctt gat tta aca gca gag ggc gac ctt aac 1707
Arg Asn Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn
435 440 445
ata ata atg gct cta gct gag aaa att aag cca ggc cta cac tct ttc 1755
Ile Ile Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe
450 455 460
atc ttc ggg aga cct ttc tac act agt gtc caa gaa cgt gat gtt cta 1803
Ile Phe Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu
465 470 475
atg act ttt taa acatgtggtt tgctccgtgt gtctcatgac agtcacactt 1855
Met Thr Phe
480
gctgttacag tgtctcagcg ctttggacac atccttcctc cagggtcctg ccgcaggaca 1915
cgttacacta cacttgtcag tagaggtctg taccagatgt caggtacatc gttgtagtga 1975
atgtctcttt tcctagacta gatgtaccct cgtagggact tatgtttaca accctcctaa 2035
gtactagtgc tgtcttgtaa ggatacgaat gaagggatgt aaacttcacc acaactgctg 2095
gttggttttg ttgtttttgt tttttgaaac ttataattca tggtttacat gcatcacact 2155
gaaaccctag ttagcttttt acaggtaagc tgtgagttga ctgcctgtcc ctgtgttctc 2215
tggcctgtac gatctgtggc gtgtaggatc acttttgcaa caactaaaaa ctaaagcact 2275
ttgtttgcag ttctacagaa agcaacttag tctgtctgca gattcgtttt tgaaagaaga 2335
catgagaaag cggagtttta ggtgaagtca gttgttggat cttcctttat agacttagtc 2395
ctttagatgt ggtctgtata gacatgccca accatcatgc atgggcactg aatatcgtga 2455
actgtggtat gctttttgtt ggtttattgt acttctgtca aagaaagtgg cattggtttt 2515
tataattgtt gccaagtttt aaggttaatt ttcattattt ttgagccaaa ttaaaatgtg 2575
cacctcctgt gcctttccca atcttggaaa atataatttc ttggcagaag gtcagatttc 2635
agggcccagt cactttcgtc tgacttccct ttgcacagtc cgccatgggc ctggcttaga 2695
agttcttgta aactatgcca gagagtacat tcgctgataa aatcttcttt gcagagcagg 2755
agagcttctt gcctctttcc tttcatttct gcctggactt tggtgttctc cacgttccct 2815
gcatcctaag gacagcagga gaactctgac cccagtgcta tttctctagg tgctattgtg 2875
gcaaactcaa gcggtccgtc tctgtccctg taacgttcgt accttgctgg ctgtgaagta 2935
ctgactggta aagctccgtg ctacagcagt gtagggtata cacaaacaca agtaagtgtt 2995
ttatttaaaa ctgtggactt agcataaaaa gggagactat atttattttt tacaaaaggg 3055
ataaaaatgg aaccctttcc tcacccacca gatttagtca gaaaaaaaca ttctattctg 3115
aaaggtcaca gtggttttga catgacacat cagaacaacg cacactgtcc atgatggctt 3175
atgaactcca agtcactcca tcatggtaaa tgggtagatc cctccttcta gtgtgccaca 3235
ccattgcttc ccacagtaga atcttattta agtgctaagt gttgtctctg ctggtttact 3295
ctgttgtttt agagaatgta agttgtatag tgaataagtt attgaagcat gtgtaaacac 3355
tgttatacat cttttctcct agatggggaa tttggaataa aataccttta aaattcaaaa 3415
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3435
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggcc 36
<210> 14
<400> 14
000
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
tgtgacagtt ggaatgcagt ga 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
gccacttaaa gcaatctctg tcttg 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 17
tcgactcttt gcccaccgcc a 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
gggtctagca agagcaggtg 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
gtcttggcaa cagctggaga t 21
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 20
tgatgtcgac tctttgccca ccgc 24
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
tcctgtaatg gaactgcttt ca 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
ggtatctgct tcatccagct tt 22
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 23
ccccggcccc ggcccc 16
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
caagccaccg tctcactcaa 20
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gtagtgctgt ctactccaga gagttacc 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 26
gtagtgctgt ctactccaga gagttacc 28
<210> 27
<400> 27
000
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
agcgggacac cgtaggttac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
gtgggcggaa cttgtcgctg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
gtcacattat ccaaatgctc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
ggtgggcaaa gagtcgacat 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
atctctgtct tggcaacagc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
aagcaatctc tgtcttggca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
acttaaagca atctctgtct 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
ttgccactta aagcaatctc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
cccagtaagc aaaagtagct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
actctaggac caagaatatt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
gccttactct aggaccaaga 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 41
ccaaatgtgc cttactctag 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 42
tggagcccaa atgtgcctta 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 43
tctgtctttg gagcccaaat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 44
ccatcactga gaagtacctg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 45
atttctccat cactgagaag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 46
aaaagttatt tctccatcac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 47
tggcaagaaa agttatttct 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 48
gtgtggttgg caagaaaagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 49
ctccatttag agtgtggttg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 50
tgcatttcga aggatttctc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 51
ccactctctg catttcgaag 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 52
acaaaaaact ttacatctat 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 53
ccttttcaga caagacaaaa 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 54
aagattaatg aaacaataat 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 55
gtttccatca aagattaatg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 56
attgatagtc catatgtgct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 57
agtataattg atagtccata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 58
ggaggtagaa actaagttct 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 59
atgtgttaat ctatcaacac 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 60
tgcatccata ttcttccttt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 61
ttccttatgc atccatattc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 62
cttgtctttc cttatgcatc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 63
acattttctt gtctttcctt 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 64
tctggacatt ttcttgtctt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 65
ataatcttct ggacattttc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 66
ctctgaccct gatcttccat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 67
ttggaataat actctgaccc 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 68
cagttccatt acaggaatca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 69
cttcaggaac actgtgtgat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 70
atctatttct tcaggaacac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 71
agtactgtat cagctatatc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 72
tcattgagta ctgtatcagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 73
tcatcatcat tgagtactgt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 74
ccaatatcat catcattgag 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 75
tcatgacagc tgtcaccaat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 76
aagccttcat gacagctgtc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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agaagaaagc cttcatgaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 78
tacttgagaa gaaagccttc 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 79
attcttactt gagaagaaag 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 80
aaaaattctt acttgagaag 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 81
agatggtatc tgcttcatcc 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 82
caatctaagt agacagtctg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 83
ttaagcaaca gttcaaatac 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 84
ctttaaatag caaatggaat 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 85
gccatgattt cttgtctggg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 86
gctttaatga gaagtaaaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 87
tctacagtac aacttaatat 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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ataattttgt tctacgccta 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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cactgctgga tggaaaaaga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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ttgcccacgg gtacacagca 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 92
cagatgagga aataggtgta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 93
acacattagg tactattact 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 94
tttttatgtt ccaggcactg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 95
aataggaaat gttagctatg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 96
ggcactcaac aaatactggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 97
tacatgtaaa gcaactagta 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 98
taaaatttca tgaaaatctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 99
aagtgaatac tttatacttt 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
catcatgagc ctaaaggaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 101
ggctcttagg ttaaacacac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 102
tgcttctgat tcaagccatt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 103
atacaggact aaagtgcttc 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 104
caaatgggat ttaaaatgat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 105
tgacatgtag agagattaag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 106
ttattgaaat accatcattt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 107
tagtcagtat aatatcattt 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 108
gcattgagaa gaaagccttc 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 109
aagacctgat ccaggaaggc 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 110
tgagctgatg gcattgagaa 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 111
acaacggaac agccacaggt 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 112
ttagtgtcaa ggcttttctg 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 113
gacggctgac acaccaagcg 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 114
tgatggcatt gagaagaaag 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 115
tttactttct ctgcactgct 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 116
tcttatttac tttctctgca 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 117
ggcataatgt tctgactatc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 118
ataacctgga gcattttctc 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 119
ccctgactca tatttaaatg 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
ccagttgaat cctttagcag 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
catacatgac ttgccggaaa 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 122
gacatccaca tctatgtgtg 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
tgttcatgac agggtggcat 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 124
ttataaatat gttcatgaca 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
cagctcggat ctcatgtatc 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 209
gattaccatc agtcaagtga 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 210
caactgatta ccatcagtca 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 211
gcagtttcca actgattcag 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 212
cgttcttgtt tcagatgtac 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 213
gccaaacaaa atattttatc 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 214
taggtaggct aacctagtcc 20
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 215
tcccagccca aagagaagca 20
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<212> DNA
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ggatcatagc tctcggtaac 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 217
aatcataaag ccctcacttc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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<400> 218
ctgattggta tttagaaagg 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 219
atgcagacat gattacatta 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 220
ttcatcatta aactgaaaat 20
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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cttttaggtt aaaaaggtgg 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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atacagagcc tggcaaaaca 20
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 223
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 224
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 225
tgtgttattg cccctaaaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 226
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 230
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 299
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 300
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 301
ccactcgcca ccgcctgcgc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ggtccccggg aaggagacag 20
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 304
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 305
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<210> 306
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 307
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 308
tactgaattg cttagtttta 20
<210> 309
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 309
ctaacagaat aagaaaaaaa 20
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 310
gagcattaga tgagtgcttt 20
<210> 311
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 311
tgcattccta agcaatgtgt 20
<210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 312
tctaggcctt cacattaatt 20
<210> 313
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 313
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 314
tagcacatac aattattaca 20
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 315
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<210> 316
<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 316
taccacaagt ctggagccat 20
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 317
gatactggat tgttgaaact 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 318
tagtatgact ggagatttgg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 319
atcaaaaccc caaatgattt 20
<210> 320
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 320
atccaaatgc tccggagata 20
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 321
tcgacatcac tgcattccaa 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 322
caacagctgg agatggcggt 20
<210> 323
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 323
atttgccact taaagcaatc 20
<210> 324
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 324
gtacctgttc tgtctttgga 20
<210> 325
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 325
caagaaaagt tatttctcca 20
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 326
gaaggatttc tccatttaga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ttacatctat agcaccactc 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 328
tcactccctt ttcagacaag 20
<210> 329
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 329
agtttccatc aaagattaat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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atagtccata tgtgctgcga 20
<210> 331
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 331
aactaagttc tgtctgtgga 20
<210> 332
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 332
caacacacac tctatgaagt 20
<210> 333
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 333
ttcctttccg gattatatgt 20
<210> 334
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tttccattac aggaatcact 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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atcagcctat atctatttcc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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tcaatgacca ggcggtcccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ctttttatgg aaaaggaaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 338
tgtttcccca aaaatttctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 339
agatatccac tcgccaccgc 20
<210> 340
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 340
ccggccccgg ccccggcccc 20
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<211> 20
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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cccggccccg gccccggccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 342
ccccggcccc ggccccggcc 20
<210> 343
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 343
gccccggccc cggccccggc 20
<210> 344
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 344
ggccccggcc ccggccccgg 20
<210> 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 345
cggccccggc cccggccccg 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ccggccccgg ccccggccc 19
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 348
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<210> 349
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 349
ccccggcccc ggccccggc 19
<210> 350
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 350
gccccggccc cggccccgg 19
<210> 351
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 351
ggccccggcc ccggccccg 19
<210> 352
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 352
ggccccggcc ccggcccc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 353
cggccccggc cccggccc 18
<210> 354
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ccggccccgg ccccggcc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 355
cccggccccg gccccggc 18
<210> 356
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 356
ccccggcccc ggccccgg 18
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<211> 18
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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gccccggccc cggccccg 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 358
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 359
ggccccggcc ccggccc 17
<210> 360
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 360
cggccccggc cccggcc 17
<210> 361
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 361
ccggccccgg ccccggc 17
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 362
cccggccccg gccccgg 17
<210> 363
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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ccccggcccc ggccccg 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 365
gccccggccc cggccc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 366
ggccccggcc ccggcc 16
<210> 367
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 367
cggccccggc cccggc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 368
ccggccccgg ccccgg 16
<210> 369
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 369
cccggccccg gccccg 16

Claims (27)

1.一种化合物，其包含由12至50个相连的核苷组成的修饰寡核苷酸，其中所述修饰寡核苷酸的核碱基序列与C9ORF72核酸的相等长度部分至少90％互补，且其中所述修饰寡核苷酸包含至少一个选自修饰的糖和修饰的核苷间键联的修饰。
2.如权利要求1所述的化合物，其中所述C9ORF72核酸是SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8中的任一个。
3.如权利要求1所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸与人C9ORF72核酸中的以下任一种互补：外显子、内含子、5’UTR、3’UTR、重复序列区、剪接点、外显子:外显子剪接点、外显子剪接沉默子(ESS)、外显子剪接增强子(ESE)、外显子1、外显子1a、外显子1b、外显子1c、外显子1d、外显子1e、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子5a、外显子5b、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9或内含子10。
4.一种化合物，其包含由12至50个相连的核苷组成的修饰寡核苷酸且具有包含SEQ IDNO:30-369的核碱基序列中任一个的至少12个连续核碱基。
5.一种化合物，其包含由12至50个相连的核苷组成的修饰寡核苷酸且具有核碱基序列，所述核碱基序列包含与以下核碱基的等长部分100％互补的至少12个连续核碱基：
(i)SEQ ID NO:2的1446-1479；
(ii)SEQ ID NO:2的2209-2238；
(iii)SEQ ID NO:2的7870-7949；
(iv)SEQ ID NO:2的7990-8072；
(v)SEQ ID NO:2的8080-8129；
(vi)SEQ ID NO:2的8200-8258；
(vii)SEQ ID NO:2的13357-13409；
(viii)SEQ ID NO:2的24306-24340；
(ix)SEQ ID NO:2的26630-26649；或
(x)SEQ ID NO:2的27037-27075。
6.如权利要求3所述的化合物，其中:
(i)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:288、340-343、346、348、349、352、354-356、358-361和365-368的至少12个连续核碱基；
(ii)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:206-208的至少12个连续核碱基；
(iii)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:33-37和321-323的至少12个连续核碱基；
(iv)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:40-47、324和325的至少12个连续核碱基；
(v)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:50、51、326和327的至少12个连续核碱基；
(vi)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:56、57、58、330和331的至少12个连续核碱基；
(vii)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:72-76的至少12个连续核碱基；
(viii)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:130-133的至少12个连续核碱基；
(ix)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:140-142的至少12个连续核碱基；或
(x)所述修饰寡核苷酸的核碱基序列包含SEQ ID NO:164-166的至少12个连续核碱基。
7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸由12至30个相连的核苷组成。
8.如权利要求3-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核碱基序列：
a.与SEQ ID NO:2的相等长度部分至少90％互补；或
b.与SEQ ID NO:2的相等长度部分100％互补。
9.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸是单链修饰寡核苷酸。
10.如权利要求9所述的化合物，其中所述单链修饰寡核苷酸是间隙聚体。
11.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的至少一个核苷间键是修饰的核苷间键，任选地其中所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的每个核苷间键都是修饰的核苷间键，任选地其中所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
13.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰的寡核苷酸的至少一个核碱基是修饰的核碱基，任选地其中所述修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
14.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中
a.所述修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的糖；或
b.所述修饰的寡核苷酸的每个核苷包含修饰的糖。
15.如权利要求14所述的化合物，其中所述修饰的糖是双环糖。
16.如权利要求15所述的化合物，其中所述双环糖在所述糖的4’和2’位间包含化学桥，其中所述化学桥选自4’-CH(R)-O-2’和4’-(CH2)2-O-2’，其中R独立的是H、C1-C6烷基或C1-C6烷氧基。
17.如权利要求16所述的化合物，其中所述化学桥是4’-CH(R)-O-2’且其中R是：
a.甲基；
b.H；或
c.-CH2-O-CH3。
18.如权利要求14所述的化合物，其中所述修饰的糖包含2’-O-甲氧基乙基或2’-O-甲基。
19.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的至少一个核苷包含糖替代物，任选地其中所述糖替代物是吗啉代或肽核酸。
20.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸具有与C9ORF72的六核苷酸重复扩增以外的区域互补的核碱基序列，其中所述六核苷酸重复扩增包含任意的GGGGCC、GGGGGG、GGGGCG和GGGGGC。
21.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述修饰寡核苷酸是双链的修饰寡核苷酸。
22.一种缀合的反义化合物，包含如权利要求1-6中任一项所述的化合物。
23.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其由所述寡核苷酸组成。
24.一种双链化合物，包含如权利要求1-6中任一项所述的化合物。
25.一种缀合的反义化合物，包含如权利要求24所述的双链化合物。
26.一种组合物，包含如权利要求1-6中任一项所述的化合物、如权利要求22或25所述的缀合的反义化合物或如权利要求24所述的双链化合物，和药学上可接受的载体或稀释剂。
27.如权利要求26所述的化合物，其中所述药学上可接受的稀释剂是磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和/或其中所述化合物的寡核苷酸是钠盐。
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