KR20150070278A - C9orf72 발현 조절용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에서는 동물에서 C9ORF72 mRNA와 단백질의 발현을 C9ORF72 특이적 저해제들을 이용하여 감소시키는 조성물 및 그 방법이 설명된다. 이러한 방법은 신경퇴행성 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 신경퇴행성 질환을 치료, 예방, 경감시키는데 유용하다. 이러한 C9ORF72 특이적 저해제들은 안티센스 화합물들을 포함한다. C9ORF72 특이적 저해제들의 투여로 치료, 예방, 그리고 경감될 수 있는 신경퇴행성 질환의 예로는 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비전형적 파킨슨 증후군, 및 이리브교소뇌변성 (OPCD)을 포함한다.
Description
서열 목록
본 출원은 전자 형식의 서열 목록과 함께 제출된다. 서열 목록은 2013년 10월 14일자로 만들어진, 184 Kb 크기의 BIOL0211WOSEQ.txt의 화일로 제공된다. 전자 형태의 서열 목록 정보의 전체 내용은 참고자료에 편입된다.
분야
동물에서 C9ORF72 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 조성물 및 방법들이 제공된다. 이러한 방법들은 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비전형적 파킨슨 증후군, 그리고 이리브교소뇌변성 (OPCD)이 포함된 신경퇴생성 질환을 치료, 예방 또는 개선시키는데 유용하다.
배경기술
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 진행성 마비로 인하여, 증상의 개시후 2 내지 3년 이내 일반적으로 호흡부전에 의해 사망에 이르는 임상적 특징을 가진 치명적인 신경퇴행성 질환이다(Rowland 및 Shneider, N. Engl. J. Med., 2001, 344, 1688-1700). ALS는 서방 국가에서 3번째로 가장 흔한 신경퇴행성 질환이며 (Hirtz et al., Neurology, 2007, 68, 326-337), 그리고 현재까지 효과적인 치료법이 없다. 질환의 대략 10%는 사실상 가족력이며, 이 질환으로 진단을 받은 환자들의 대부분은 집단을 통하여 무작위로 발생되는 것으로 보이기 때문에 특발성으로 분류된다(Chio et al., Neurology, 2008, 70, 533-537). 임상적, 유전적, 그리고 역학적 데이타에 근거하여, ALS와 전두측두엽 치매 (FTD)는 중추신경계를 통하여 TDP-43 양성 봉입체의 존재에 의해 병리학적으로 특징화된 중첩되는 질병 연속체를 나타낸다는 인식이 증가된다 (Lillo 및 Hodges, J. Clin. Neurosci., 2009, 16, 1131-1135; Neumann et al., Science, 2006, 314, 130-133).
현재까지, 다수의 유전자들, 예를 들면, SOD1, TARDBP, FUS, OPTN, 및 VCP는 전통적인 가족성 ALS의 원인으로 밝혀졌다 (Johnson et al., Neuron, 2010, 68, 857-864; Kwiatkowski et al., Science, 2009, 323, 1205-1208; Maruyama et al., Nature, 2010, 465, 223-226; Rosen et al., Nature, 1993, 362, 59-62; Sreedharan et al., Science, 2008, 319, 1668-1672; Vance et al., Brain, 2009, 129, 868-876). 최근, ALS, FTD, 및 ALS-FTD의 다수 경우가 관련된 혈연 계통 분석에서 염색체 9의 짧은 암(arm) 상에 이 질환의 중요한 좌(locus)가 있다고 제시되었다 (Boxer et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2011, 82, 196-203; Morita et al., Neurology, 2006, 66, 839-844; Pearson et al. J. Nerol., 2011, 258, 647-655; Vance et al., Brain, 2006, 129, 868-876). 마지막 주요 상염색체-우성 유전자에서 염색체 9p21ALS-FTD 좌는 이의 돌연변이가 ALS의 원인이다. ALS-FTD 원인 돌연변이는 C9ORF72 유전자의 첫 인트론에서 큰 헥사뉴클레오티드 (GGGGCC) 반복 확장부다(Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268; DeJesus-Hernandez et al., Neuron, 2011, 72, 245-256). C9ORF72 유전자를 덮고 있는 파운더(founder) 하플로타입(haplotype)은 이 지역에 연계된 대부분의 경우에 존재한다 (Renton et al., Neuron, 2011, 72, 257-268). 염색체 9p21상의 이 좌는 405개 핀란드 특허의 코허트에서 가족성 ALS의 거의 절반과 모든 ALS 경우 1/4의 원인이 된다 (Laaksovirta et al, Lancet Neurol., 2010, 9, 978-985).
C9ORF72 유전자를 덮고 있는 파운더(founder) 하플로타입(haplotype)은 이 지역에 연계된 대부분의 경우에 존재한다
이러한 신경퇴행성 질환을 치료하기 위한 효과적인 치료법은 현재 없다. 따라서, 이러한 신경퇴행성 질환 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이 목적이다.
요약
세포, 조직 및 동물에서 C9ORF72 mRNA 및 단백질 수준 조절용 조성물 및 방법이 본 명세서에서 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 특이적 저해제들은 C9ORF72 mRNA 및 단백질의 발현을 조정한다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 특이적 저해제들은 핵산, 단백질, 또는 소분자들이다.
특정 구체예들에 있어서, 조절(modulation)은 세포 또는 조직에서 일어날 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 세포 또는 조직은 동물 안에 있다. 특정 구체예들에 있어서, 동물은 인간이다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 mRNA 수준은 감소된다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 단백질 수준은 감소된다. 특정 구체예들에 있어서, 특정 C9ORF72 mRNA 변이체들이 선호적으로 감소된다. 특정 구체예들에 있어서, 선호적으로 감소된 C9ORF72 mRNA 변이체들은 인트론 1이 포함된 변이체들이다. 특정 구체예들에 있어서, 인트론 1은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 연합된 질환과 연관된다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 헥사뉴클레오티드 반복 확장부 연합된 질환과 연관된다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 최소한 30개의 GGGGCC 반복를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 핵 좌(foci)에 연합된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 조성물 및 방법들은 C9ORF72 mRNA 수준, C9ORF72 단백질 수준, 그리고 핵 좌를 감소시키는데 유용하다. 시간-의존적 방식 또는 투여분량(dose)-의존적 방식으로 이러한 감소가 일어날 수 있다.
C9ORF72와 연합된 질환, 장애 및 상태를 방지, 치료 및 개선시키는데 유용한 방법들이 또한 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 C9ORF72와 연합된 질환, 장애 및 상태는 신경퇴행성 질환이다. 특정 구체예들에 있어서, 신경퇴행성 질환은 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 전두측두엽 치매 (FTD), 피질기저 퇴행 증후군 (CBD), 비전형적 파킨슨 증후군, 및 이리브교소뇌변성 (OPCD)이다.
이러한 질환, 장애 및 상태는 공통으로 하나 또는 그 이상의 위험 인자, 원인, 또는 결과를 보유할 수 있다. 신경퇴행성 질환, 그리고 특히, ALS 및 FTD의 발병에 대한 특정 위험 인자 및 원인은 유전적 소인(predisition) 및 고령화를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 치료 방법들은 C9ORF72 특이적 저해제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 특이적 저해제는 핵산이다. 특정 구체예들에 있어서, 핵산은 안티센스(antisense) 화합물이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물은 단일-가닥으로 된(single-stranded) 안티센스 올리고뉴클레오티드다. 특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 핵산에 상보적이다.
전술한 전반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 예시적이며 설명을 위함이고, 청구되는 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아님을 인지할 것이다. 본 명세서에서, 단수는 다른 명시적 언급이 없는 한, 복수를 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "또는"이란 명시적으로 다른 언급이 없는 한, "및/또는"을 말한다. 추가적으로, 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "그리고"란 명시적으로 다른 언급이 없는 한, "및/또는"을 말한다. 더욱이, 용어 "포함하는(including)" 뿐만 아니라, 다른 형태, 이를 테면 "포함하다("includes" 및 "included")의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 용어 이를 테면 "요소(element)" 또는 "성분(component)"은 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 하나 이상의 하위단위를 포함하는 한 개 단위, 요소들, 성분들이 포함된 요소 및 성분을 포괄한다.
본 명세서에서 이용된 단락 머릿글은 정리 목적을 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하고자 하는 의도로 사용된 것이 아니다. 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 문헌, 책, 협정 및 GENBANK 기탁 번호 및 데이터베이스, 이를 테면 National Center for Biotechnology Information (NCBI)를 통한 연관된 서열 정보 및 본 명세서를 통하여 언급된 다른 데이터들이 포함되나, 이에 국한되지 않은 본 명세서에서 언급된 모든 서류, 또는 서류의 일부는 본 명세서에서 논의된 일부 뿐만 아니라 이의 전문은 본 명세서의 참고자료에 명시적으로 편입된다.
정의
특정 다른 정의가 제공되지 않는 한, 본 명세서에서 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의학 및 약학의 과정 및 기술과 연관되어 이용된 명명법은 당업계 공지된 것이며 흔히 이용되는 것들이다. 화학 합성 및 화학 분석용으로 표준 기술이 이용될 수 있다.
명시적으로 다른 언급이 없는 한, 다음의 용어들은 다음의 의미를 가진다:
"2'-O-메톡시에틸 기(group)" (또는 2'-MOE 및 2'-OCH2CH2-OCH3 및 MOE)는 퓨라노실 링의 2' 위치의 O-메톡시-에틸 변형을 지칭한다. 2'-O-메톡시에틸 변형된 당(sugar)은 변형된 당이다.
"2'-MOE 뉴클레오시드" (또는 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드)는 2'-O-메톡시에틸 기가 포함된 뉴클레오시드를 말한다.
"5-메틸시토신"은 5' 위치에 부착된 메틸기에 의해 변형된 시토신을 말한다. 5-메틸시토신은 변형된 핵염기다.
"약(about)"이란 한 값의 ±7% 를 말한다. 예를 들면, "화합물들은 C9ORF72의 최소한 약 70% 저해에 영향을 주었다"라고 명시되어 있다면, C9ORF72 수준은 63% 내지 77% 범위내에서 저해됨을 의미한다.
"공동 투여된(administered concomitantly)"이란 두 가지 약력학적 효과가 환자에게서 동시에 나타나도록 하는 임의의 방식으로 2가지 약학 물질이 공동-투여됨을 말한다. 공동 투여는 두 약학 물질이 단일 약학 조성물 안에, 동일한 투약형(dosage form) 안에 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되어야 하는 것은 아니다. 두 가지 약학 물질의 효과는 동시에 나타나야 할 필요도 없다. 이 효과는 특정 기간 동안 중첩되어야 하지만, 동일한 시간에 걸쳐있을 필요는 없다.
"투여(administering)"란 동물에게 약학 물질이 제공됨을 의미하며, 의료 전문인과 자가-투여에 의해 투여되지만 이에 국한되지 않는다.
"개선(amelioration)" 또는 "개선되다" 또는 "개선되는"이란 질환, 장애, 또는 상태의 최소한 한 가지 지표, 신호, 또는 증상의 감소를 지칭한다. 지표의 심각성은 당업자에게 공지된 객관적 또는 주관적 측정에 의해 결정될 수 있다.
"동물"은 인간 또는 비-인간 동물, 가령, 마우스, 렛(rat), 토끼, 개, 고양이, 돼지 그리고 인간이 아닌 영장류 이를 테면 원숭이 및 침팬지가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
"항체"는 일부 방식으로 항원에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분자를 말하며, 이때 항체와 항원은 다른 견지에서 각각 특징화된다. 항체는 완전한 항체 분자 또는 이의 임의의 단편 또는 영역, 이를 테면 중쇄, 경쇄, Fab 영역, 그리고 Fc 영역을 말할 수 있다.
"안티센스 활성"이란 안티센스 화합물이 이의 표적 핵산에 혼성화되는 것에 기여할 수 있는 임의의 탐지가능한 또는 측정가능한 활성을 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 이러한 표적 핵산에 의해 인코드된 단백질의 양 또는 발현의 감소가 된다.
"안티센스 화합물"이란 수소 결합을 통하여 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 올리고머 화합물을 말한다. 안티센스 화합물의 예로는 단일-가닥으로 된 그리고 이중 가닥으로 된 화합물, 이를 테면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNAs, shRNAs, ssRNAs, 그리고 사용-기반(occupancy-based) 화합물들을 포함한다. 안티센스 기전은 RNase H 중재된 안티센스; RNAi 기전, 이는 RISC 경로를 이용하고, siRNA, ssRNA 및 microRNA 기전을 포함하나 이에 한정되지 않으며; 그리고 균일(uniform) 변형된 올리고뉴클레오티드가 포함되니 이에 한정되지 않는 사용-기반 기전을 포함한다. 특정 안티센스 화합물은 이러한 기전 하나 이상 및/또는 추가 기전을 통하여 작용할 수 있다.
"안티센스 저해(inhibition)"는 안티센스 화합물 없는 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준과 비교하였을 때, 표적 핵산에 상보적인 안티센스 화합물 존재하에 표적 핵산 수준 또눈 표적 단백질 수준의 감소를 의미한다. 저해는 이를 테면 갭머(gapmer), 및 공간적 차단(steric blockage), 이를 테면 균일하게 변형된 올리고뉴클레오티드를 이용한 Rnase H 분해가 포함된 임의의 수단일 수 있다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산의 대응하는 세그먼트(segment)에 혼성화를 허용하는 핵염기 서열을 보유한 단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"이환(bicyclic) 당"은 2개 원자를 연결시킴으로써 변형된 퓨라노실 링이다. 이환 당은 변형된 당이다.
"이환 뉴클레오시드" (또는 BNA)는 당 링의 2개 탄소 원자를 연결시키는 다리를 포함하여, 이환 링 시스템이 형성되는 당 모이어티(moiety)를 보유한 뉴클레오시드를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 이 다리는 당 링의 4'-탄소와 2'-탄소를 연결시킨다.
"C9ORF72 연합된 질환"이란 임의의 C9ORF72 핵산 또는 이의 발현 산물과 연관된 임의의 질환을 말한다. 이러한 질환은 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 이러한 신경퇴행성 질환은 ALS 및 FTD를 포함할 수 있다.
"C9ORF72 헥사뉴클레오티드 반복 확장부 연합된 질환"이란 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 C9ORF72 핵산과 연관된 임의의 질환을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 최소한 30회 반복된 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG를 포함할 수 있다. 이러한 질환은 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 이러한 신경퇴행성 질환은 ALS 및 FTD를 포함할 수 있다.
"C9ORF72 핵산"이란 C9ORF72를 인코드하는 임의의 핵산을 말한다. 예를 들면, 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산은 C9ORF72를 인코드하는 DNA, C9ORF72를 인코드하는 DNA(인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA 포함)로부터 전사된 RNA 서열, 그리고 C9ORF72를 인코드하는 mRNA 서열을 포함한다. "C9ORF72 mRNA"는 C9ORF72 단백질을 인코드하는 mRNA를 포함한다.
"C9ORF72 특이적 저해제"는 C9ORF72 mRNA 및/또는 C9ORF72 단백질의 발현을 분자 수준에서 특이적으로 저해할 수 있는 임의의 물질을 말한다. 예를 들면, C9ORF72 특이적 저해제들은 핵산 (안티센스 화합물 포함), siRNAs, 압타머(aptamers), 항체, 펩티드, 소분자, 그리고 C9ORF72 mRNA 및/또는 C9ORF72 단백질의 발현을 저해시킬 수 있는 다른 물질들을 포함한다. 유사하게, 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 특이적 저해제들은 동물의 다른 분자 프로세스에 영향을 줄 수 있다.
"캡(cap) 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"란 안티센스 화합물의 어느 한 쪽 단부에 통합된 화학적 변형을 말한다.
"cEt" 또는 "속박된(constrained) 에틸"이란 4'-탄소와 2'-탄소를 연결시키는 다리가 포함된 당 모이어티를 보유한 이환 뉴클레오시드를 말하며, 이때 상기 다리는 다음의 구조식를 가진다: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"속박된 에틸 뉴클레오시드" (또는 cEt 뉴클레오시드)란 4'-CH(CH3)-O-2' 다리가 포함된 이환 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드를 말한다.
"화학적으로 구별되는(distinct) 영역 "이란 동일한 안티센스 화합물의 또다른 영역과는 일정 방식에서 화학적으로 상이한 안티센스 화합물의 영역을 말한다. 예를 들면, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오시드를 보유한 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형 없는, 뉴클레오시드를 보유한 영역과는 화학적으로 구별된다.
"키메라(chimeric) 안티센스 화합물"이란 최소한 화학적으로 구별되는 두 영역을 보유한 안티센스 화합물을 말한다.
"공동-투여(co-administration)"는 개체에게 2개 또는 그 이상의 약학 물질의 투여를 말한다. 2개 또는 그 이상의 약학 물질은 단일 약학 조성물 내에 있거나, 또는 별개 약학 조성물에 존재할 수 있다. 2개 또는 그 이상의 약학 물질 각각은 동일한 또는 상이한 투여 경로를 통하여 투여될 수 있다. 공동-투여는 동시(parallel) 또는 연속적 투여를 포함한다.
"상보성(complementarity)"이란 제 1 핵산과 제 2 핵산의 핵염기 사이에 쌍을 형성하는(pairing) 능력을 말한다.
"인접(contiguous) 핵염기"란 서로 바로 접해있는 핵염기들을 말한다.
"희석제(diluent)"란 조성물내에서 약리학적 활성은 없지만, 제약학적으로 필요한 또는 바람직한 성분을 말한다. 예를 들면, 주사된 조성물 안에 희석제는 액체, 가령, 염수 용액일 수 있다.
"투여분량(dose)"이란 단일 투여, 또는 명시된 기간에 제공되는 약학 물질의 명시된 양을 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 투여분량은 1개, 2개 또는 그 이상의 볼루스, 테블릿, 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들면, 특정 구체예들에 있어서 피하 투여가 바람직할 경우, 바람직한 투여분량은 단일 주사에 의해 용이하게 수용되지 않은 용적을 요구하며, 따라서, 2개 또는 그 이상의 주사는 원하는 투여분량을 획득하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 약학 물질은 연장된 기간에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 투여된다. 투여분량은 시간당, 일당, 주당 또는 한 달 단위의 약학 물질의 양으로 명시될 수 있다.
"유효량(effective amount)"이란 약학 물질을 필요로 하는 개체에서 약학 물질이 원하는 생리학적 결과를 유발시키는데 충분한 양을 말한다. 유효량은 치료되는 개체의 건강 및 신체 조건, 치료되는 개체의 분류학적 집단(taxonomic group), 조성물의 제형, 개체의 의학적 상태 평가, 그리고 관련 인자들에 따라 개체별로 변화될 수 있다.
"발현(expression)"이란 C9ORF72 유전자의 정보가 전사를 통하여 mRNA로 전환되고, 그 다음 해독을 통하여 단백질로 전환되는 것을 의미한다. 발현으로 C9ORF72 유전자의 표현형적 현시를 초래할 수 있다.
"완전한 상보적(fully complementary)" 또는 "100% 상보적"이란 제 1 핵산의 각 핵염기가 제 2 핵산에 상보적 핵염기를 보유함을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 제 1 핵산은 안티센스 화합물이며, 표적 핵산은 제 2 핵산이다.
"갭머(gapmer)"는 키메라 안티센스 화합물을 말하는데, 이때 RNase H 절단을 지원하는 다수의 뉴클레오시드를 보유하는 내부 영역이 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드를 보유한 외부 영역 사이에 위치하고, 이때 내부 영역이 포함된 뉴클레오시드는 외부 영역이 포함된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드와는 화학적으로 구별된다. 내부 영역은 "갭(gap)"으로 불릴 수 있으며, 외부 영역은 "윙(wings)"으로 불릴 수 있다.
"좁아진 갭(gap-narrowed)"이란 1 내지 6개 뉴클레오시드를 보유한 5' 및 3' 윙 세그먼트 사이에 그리고 바로 접해 있는 9개 또는 그 미만의 인접 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 갭 세그먼트를 보유한 키메라 안티센스 화합물을 말한다.
"확장된 갭(gap-widened)"이란 1 내지 6개 뉴클레오시드를 보유한 5' 및 3' 윙 세그먼트 사이에 그리고 바로 접해 있는 12개 또는 그 이상의 인접 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 갭 세그먼트를 보유한 키메라 안티센스 화합물을 말한다.
"헥사뉴클레오티드 반복 확장부"는 최소한 2회 반복된 6개 염기 시리즈 (예를 들면, GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC)를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 핵산의 인트론 1에 위치될 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 병원성 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 핵산 안에 최소한 30회 반복되는 GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC를 포함하며, 이는 질환과 연관된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 반복은 연속된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 반복은 1개 또는 그 이상의 핵염기에 의해 중단된다. 특정 구체예들에 있어서, 야생형 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 C9ORF72 핵산 안에 23개 또는 이 미만의 GGGGCC, GGGGGG, GGGGCG, 또는 GGGGGC 반복을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 반복은 연속된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 반복은 1개 또는 그 이상의 핵염기에 의해 중단된다.
"혼성화(hybridization)"는 상보적 핵산 분자의 어닐링(annealing)을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 상보적 핵산 분자는 안티센스 화합물과 표적 핵산을 포함한다.
"C9ORF72 연합된 질환을 보유한 동물의 식별"이란 C9ORF72 연합된 질환을 가진 것으로 진단을 받은 또는 C9ORF72 연합된 질환이 발생할 성향을 가진 동물을 식별한다는 것을 의미한다. C9ORF72 연합된 질환이 발생할 성향을 가진 개체는 하나 또는 그 이상의 C9ORF72 연합된 질환의 개인 또는 가족력 또는 유전적 소인이 포함된, C9ORF72 연합된 질환의 발생에 대한 하나 또는 그 이상의 위험 인자를 보유한 개체를 포함한다. 이러한 식별은 개인의 의료 기록을 평가 및 표준 임상 테스트 또는 평가, 이를 테면 유전적 테스트가 포함된, 임의의 방법에 의해 이루어질 수 있다.
"바로 인접된(immediately adjacent)"이란 바로 인접된 요소들 사이에 끼어든 요소가 없다는 것을 말한다.
"개체(individual)"는 치료 또는 치료법을 받기 위하여 선택된 인간 또는 인간이 아닌 동물을 말한다.
"C9ORF72를 저해하는"것이란 C9ORF72 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된 C9ORF72 특이적 저해제 존재하에 C9ORF72 mRNA 및/또는 단백질 수준의 발현이 C9ORF72 특이적 저해제, 이를 테면 C9ORF72 안티센스 올리고뉴클레오티드가 없을 때 C9ORF72 mRNA 및/또는 단백질 수준의 발현과 비교하여, 감소되었음을 말한다.
"뉴클레오시드간(internucleoside) 링키지(linkage)"란 뉴클레오시드 간에 화학 결합을 지칭한다.
"연계된 뉴클레오시드"란 함께 결합된 인접해있는 뉴클레오시드들을 말한다.
"부정합(mismatch)" 또는 "비-상보적 핵염기"란 제 1 핵산의 핵염기가 제 2 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 쌍을 이룰 수 없는 경우를 말한다.
"변형된 뉴클레오시드간 링키지"란 자연 발생적 뉴클레오시드간 결합 (이를 테면, 포스포디에스테르뉴클레오시드간 결합)으로부터 치환 또는 임의의 변화를 지칭한다.
"변형된 핵염기"란 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 또는 우라실이외의 임의의 핵염기를 말한다. "변형안된 핵염기"란 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 그리고 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 말한다.
"변형된 뉴클레오티드"란 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 링키지, 또는 변형된 핵염기를 보유한 뉴클레오티드를 말한다. "변형된 뉴클레오시드"는 독립적으로 변형된 당 모이어티 또는 변형된 핵염기를 보유한 뉴클레오시드를 말한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 변형된 뉴클레오시드간 링키지, 변형된 당, 또는 변형된 핵염기가 포함된 올리고뉴클레오티드를 말한다.
"변형된 당"은 천연 당으로부터 치환 또는 변화된 것을 말한다.
"모티프(motif)"는 안티센스 화합물에서 화학적으로 구별되는 영역의 패턴을 말한다.
"자연 발생적 뉴클레오시드간 링키지"는 3' 에서 5'로의 포스포디에스테르 링키지를 말한다.
"자연적 당 모이어티"는 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH)에서 발현되는 당을 말한다.
"핵산"은 단량체 뉴클레오티드들로 구성된 분자를 말한다. 핵산은 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일-가닥으로 된 핵산, 이중-가닥으로 된 핵산, 작은 간섭 리보핵산 (siRNA), 및 microRNAs (miRNA)를 포함한다.
"핵염기"는 또다른 핵산의 염기와 쌍을 이룰 수 있는 헤테로사이클(heterocyclic) 모이어티를 말한다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 링키지, 또는 핵염기 변형과는 독립적인 인접 핵염기의 순서를 말한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연계된 핵염기를 말한다.
"뉴클레오시드 모방체(mimetic)"는 올리고머 화합물 이를 테면 몰포리노, 시클로헥세닐, 시클로헥실, 테트라히드로피라닐, 바이시클로, 또는 트리시클로 당 모방체, 가령, 비-퓨라노스 당 단위를 보유한 뉴클레오시드 모방체의 하나 또는 그 이상의 위치에 있는 당 또는 당과 염기 그리고 필연적인 것은 아니지만 링키지를 대체하기 위하여 이용된 구조들을 포함한다. 뉴클레오티드 모방체는 올리고머 화합물, 이를 테면, 예를 들면 펩티드 핵산 또는 몰포리노 (-N(H)-C(=O)-O- 또는 기타 비-포스포디에스테르 링키지에 의해 연계된 몰포리노)의 하나 또는 그 이상의 위치에서 뉴클레오시드와 링키지를 대체하기 위하여 이용된 구조들을 포함한다. 당 대용물(surrogate)은 약간 더 광범위한 용어 뉴클레오시드 모방체와 중첩되지만, 당 단위 (퓨라노즈 링) 만을 대체한다는 것을 나타내는 의도를 가진다. 본 명세서에서 제공되는 테트라히드로피라닐 링들은 당 대용물의 예시적인 사례일 뿐이며 이때 퓨라노즈 당 기는 테트라히드로피라닐 링 체계로 대체되었다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 연계된 포스페이트 기를 보유한 뉴클레오시드를 말한다.
"올리고머형(oligomeric) 화합물" 또는 "올리고머(oligomer)"는 핵산 분자의 최소한 한 영역에 혼성화될 수 있는 연계된 단량체 하위단위들의 고분자를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"란 뉴클레오시드 각각 독립적으로 변형된 또는 변형안 될 수 있는 각 뉴클레오시드가 연계된 고분자다.
"비경구(parenteral) 투여"란 주사 또는 주입을 통하여 투여된다는 것을 의미한다. 비경구 투여는 피하 투여, 정맥 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복막내 투여, 또는 두개내(intracranial)투여, 가령, 척수관내(intrathecal) 또는 뇌실내투여(intracerebroventricular)를 포함한다.
"펩티드"란 아미드 결합에 의해 최소한 2개의 아미노산이 연결되어 형성된 분자를 말한다. 펩티드는 폴리펩티드와 단백질을 지칭한다.
"약학 물질"이란 개체에게 투여되었을 때, 치료요법적 장점을 제공하는 약학 조성물 안에 있는 물질 또는 물질들을 의미한다. 예를 들면, 특정 구체예들에 있어서 C9ORF72를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약학 물질이다.
"약학 조성물"은 개체에게 투여하기에 적합한 물질의 혼합물을 의미한다. 예를 들면, 약학 조성물은 하나 또는 그 이상의 약학 물질과 멸균 수성 용액을 포함할 수 있다.
"약학적으로 수용가능한 유도체(derivative)"는 본 명세서에서 기술하고 있는 화합물들의 약학적으로 수용가능한 염, 공액체(conjugates), 프로드럭(prodrugs) 또는 이성질체를 포괄한다.
"약학적으로 수용가능한 염"이란 안티센스 화합물들의 생리학적으로 그리고 약학적으로 수용가능한 염, 이를 테면, 모체(parent) 올리고뉴클레오티드의 바람직한 생물학적 활성은 유지하고, 모체 올리고뉴클레오티드에게 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트(phosphorothioate) 링키지"란 포스포디에스테르 결합은 다리에 의해 연계되지 않은 산소 원자들중 하나가 황 원자로 대체되어 변형된, 뉴클레오시드 사이의 링키지를 말한다. 포스포로티오에이트 링키지 (P=S)는 변형된 뉴클레오시드간 링키지다.
"일부분(portion)"이란 핵산에서 한정된 수의 인접(이를 테면, 연계된) 핵염기를 말한다 특정 구체예들에 있어서, 일부분은 표적 핵산에서 한정된 수의 인접 핵염기들이다. 특정 구체예들에 있어서, 일부분은 안티센스 화합물에서 한정된 수의 인접 핵염기다.
"방지하다(prevent)" 또는 "방지하는(preventing)" 이란 질환, 장애, 또는 상태의 개시 또는 발생을 몇 분에서 부터 무기한으로 지연 또는 미연에 방지함을 말한다. 방지란 질환, 장애, 또는 상태의 발생 위험을 감소시킨다는 것을 또한 의미한다.
"프로드럭(prodrug)"이란 비활성 형태로 제조된 치료 물질로써 내생 효소 또는 다른 화학물질의 작용 또는 조건들에 의해 신체내 또는 신체의 세포 안에서 활성 형태로 전환되는 치료 물질을 말한다.
"부작용(side effects)"이란 바람직한 효과이외에 치료에 의한 생리학적 반응을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 부작용에는 주사 부위 반응, 간 기능 테스트 비정상, 신장 기능 비정상, 간 독성, 신장 독성, 중추신경계 비정상, 근병증, 그리고 불만감(malaise)이 포함된다.
"단일-가닥으로 된 올리고뉴클레오티드"란 상보적 가닥에 혼성화되지 않는 올리고뉴클레오티드를 말한다.
"특이적으로 혼성화가능한(hybridizable)"이란 특이적 결합이 바람직한 조건, 이를 테면, 생체내 분석 및 치료요법적 처리의 경우에 생리학적 조건에서 비-표적 핵산에는 최소한의 효과 또는 효과를 나타내지 않으면서, 원하는 효과를 유도하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 사이에 충분한 상보성 수준을 보유한 안티센스 화합물을 말한다.
"표적화하는(targeting)" 또는 "표적화된"이란 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하고, 원하는 효과를 유도하는 안티센스 화합물의 기획 및 선별 과정을 말한다.
"표적 핵산", "표적 RNA", 및 "표적 RNA 전사체(transcript)"는 모두 안티센스 화합물들에 의해 표적화될 수 있는 핵산을 지칭한다.
"표적 세그먼트"란 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드 서열을 말한다. "5' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 5'-가장 멀리 있는(most) 뉴클레오티드를 지칭한다. "3' 표적 부위"는 표적 세그먼트의 3'-가장 멀리 있는 뉴클레오티드를 지칭한다..
"치료요법적으로 유효량"이란 개체에게 치료요법적으로 이점을 제공하는 약물 물질의 양을 말한다.
"치료하다(treat)" 또는 "치료하는(treating)"이란 질환, 장애, 또는 상태의 변경 또는 개선에 영향을 주기 위하여 약물 조성물을 투여하는 것을 말한다.
"변형안된 뉴클레오티드"란 자연 발생적 핵염기, 당 모이어티, 및 뉴클레오시드간 링키지로 구성된 뉴클레오티드를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 변형안된 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드 (이를 테면, β-D-리보뉴클레오시드) 또는 DNA 뉴클레오티드 (이를 테면, β-D-데옥시리보뉴클레오시드)다.
특정 구체예들
특정 구체예들은 C9ORF72 mRNA와 단백질 발현을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 구체예들은 C9ORF72와 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료, 방지 또는 개선을 필요로 하는 개체에서 이를 치료, 방지 또는 개선시키는 방법을 제공한다. C9ORF72와 연관된 질환, 장애 및 상태의 치료, 방지 또는 개선을 위한 약물의 제조 방법이 또한 고려된다. C9ORF72 연합된 질환, 장애 및 상태는 신경퇴행성 질환을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 신경퇴행성 질환은 ALS 또는 FTD일 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 신경퇴행성 질환은 가족성 또는 특발성(sporadic)일 수 있다.
특정 구체예들은 C9ORF72 연합된 질환을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 C9ORF72 특이적 저해제의 용도를 제공한다. 특정 구체예들은 C9ORF72 헥사뉴클레오티드 반복 확장부 연합된 질환을 치료, 방지 또는 개선시키기 위한 C9ORF72 특이적 저해제의 용도를 제공한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG를 포함할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 특이적 저해제들은 C9ORF72 mRNA 및/또는 C9ORF72 단백질의 발현을 저해시킬 수 있는 핵산 (안티센스 화합물들을 포함), 펩티드, 항체, 소분자, 그리고 기타 물질들이다.
C9ORF72 핵산 또는 C9ORF72 동족체(homolog) 핵산에 상보적인 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물들이 본 명세서에서 설명된다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산은 인간 C9ORF72 핵산이다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 포함하지 않는다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 핵산에 특이적으로 혼성화가능하다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 핵산의 대등한 길이 부분에 대해 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 100% 상보적이다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 핵산의 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 반복 영역, 스플라이스 연접부(splice junction), 엑손:엑손 스플라이스 연접부, 엑손의 스플라이싱 사일런서 (ESS), 엑손의 스플라이싱 인헨서 (ESE), 엑손 1a, 엑손 1b, 엑손 1c, 엑손 1d, 엑손 1e, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 또는 인트론 10중 임의의 것에 상보적이다.
12 내지 30개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함되고, 그리고 서열 번호: 30-369의 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 인접 핵염기가 포함된 화합물들이 본 명세서에서 설명된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드간 링키지를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 뉴클레오시드간 링키지는 변형된 뉴클레오시드간 링키지다.
특정 구체예들에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 링키지다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당을 보유한 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이환 당이 포함된 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 이 이환 당은 4'-(CH2)n-O-2' 다리 (이때 n은 1 또는 2임); 그리고 4'-CH2-O-CH2-2'에서 선택된 4' 에서 2'로의 다리를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 이 이환 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 변형된 당을 보유한 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드는 비-이환 2'-변형된 변형된 당 모이어티를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 기를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸 기를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 변형된 당을 보유한 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드는 당 대용물을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 당 대용물은 몰포리노다.
특정 구체예들에 있어서, 당 대용물은 펩티드 핵산이다.
특정 구체예들에 있어서, 각 뉴클레오시드는 변형된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형된 핵염기를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 변형된 핵염기는 5'-메틸시토신이다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함한다:
연계된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 세그먼트;
연계된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 세그먼트;
연계된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 세그먼트;
이때 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 이때 각 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 변형된 당을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음을 포함한다:
10개의 연계된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 세그먼트;
5개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 세그먼트;
5개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 세그먼트;
이때 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트에 바로 인접하고, 이들 사이에 위치하며, 이때 각 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고; 그리고 이때 각 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 16개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 17개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 19개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 21개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 22개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 23개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 24개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 구체예들에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 25개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된다.
신경퇴행성 질환을 치료하는 약물 제조용 화합물의 용도가 본 명세서에서 기술된다.
헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA 전사체의 발현을 선호적으로 저해시키는 방법들이 본 명세서에서 제공되는데, 이 방법은 엑손 1B의 상류를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 접촉시키는 것이다.
안티센스 화합물들
올리고머 화합물들은 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체들, 올리고뉴클레오티드 모방체들, 안티센스 화합물들, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 siRNAs를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 올리고머 화합물은 표적 핵산에 대해 "안티센스"일 수 있고, 이는 수소 결합을 통하여 표적 핵산에 혼성화될 수 있다는 것을 의미한다.
특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물은 표적이 되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역 보체(reverse complement)를 포함하는 핵 염기 서열(5'에서 3' 방향으로 기재될 때)을 가진다. 이러한 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적이 되는 표적 핵산의 표적 세그먼트의 역 보체를 포함하는 핵 염기 서열(5'에서 3' 방향으로 기재될 때)을 가진다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 길이가 12 내지 30개의 하위단위다. 환언하면, 이러한 안티센스 화합물들은 12 내지 30개의 연계된 하위단위다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물은 8 내지 80, 12 내지 50, 15 내지 30, 18 내지 24, 19 내지 22, 또는 20개의 연계된 하위단위다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개의 연계된 하위단위, 또는 상기 임의의 두 값에 의해 특정되는 범위안의 하위단위다. 일부 구체예들에 있어서 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 그리고 연계된 하위단위는 뉴클레오시드다.
특정 구체예들에 있어서 C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 짧아지거나 또는 절두될 수 있다(truncated). 예를 들면, 하나의 하위단위가 5' 단부로부터 삭제되거나 (5' 절두), 또는 대안으로 3' 단부로부터 삭제될 수 있다 (3' 절두). 짧아진 또는 절두된 C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 5' 단부로부터 삭제된 2개의 하위단위를 보유할 수 있거나, 또는 대안으로 안티센스 화합물의 3' 단부로부터 삭제된 2개의 하위단위를 보유할 수 있다. 대안으로, 삭제된 뉴클레오시드는 안티센스 화합물을 통하여 분산될 수 있는데, 예를 들면, 안티센스 화합물은 5' 단부에서 삭제된 한 개의 뉴클레오시드와 3' 단부에서 삭제된 한 개의 뉴클레오시드를 보유한다.
연장된 안티센스 화합물에 한 개의 추가 하위단위가 존재할 때, 이 추가 하위단위는 안티센스 화합물의 5' 또는 3' 단부에 위치할 수 있다. 2개 또는 그 이상의 추가 하위단위가 존재할 때, 추가된 하위단위는 안티센스 화합물의 5' 단부 (5' 추가)에 추가된, 또는 대안으로 3' 단부에 추가된 (3' 추가) 2개의 하위단위를 보유하는 안티센스 화합물에서 서로 인접해 있을 수 있다. 대안으로, 추가된 하위단위는 안티센스 화합물을 통하여 분산될 수 있는데, 예를 들면, 안티센스 화합물은 5' 단부에 추가한 하나의 하위단위와 3' 단부에 추가된 하나의 하위단위를 보유한다.
이를 테면 안티센스 올리고뉴클레오티드와 같이 안티센스 화합물의 길이가 증가 또는 감소되는 가능성이 있고, 및/또는 활성의 감소없이 부정합 염기가 도입될 수 있다. 예를 들면, Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992)에서 길이가 13-25개 핵염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드 시리즈는 난모세포(oocyte) 주사 모델에서 표적 RNA의 절단을 유도하는 능력에 대하여 테스트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단부 부근에 8개 또는 11개의 부정합 염기를 가진, 길이가 25개 핵염기인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 부정합이 포함되지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드보다는 다소 그 정도가 낮지만, 표적 mRNA의 특이적 절단을 유도할 수 있었다. 유사하게, 1 또는 3개 부정합을 가진 것들을 포함하여 13개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적 특이적 절단이 이루어졌다.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001)는 시험관 및 생체내에서 bcl-2와 bcl-xL의 발현을 모두 감소시키기 위하여 bcl-xL mRNA에 대하여 3개의 부정합을 보유하고, bcl-2 mRNA에 대하여 100% 상보성을 가진 올리고뉴클레오티드의 능력을 입증하였다. 더욱이, 이 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 강력한 항-종양 활성을 보여주었다.
Maher 및 Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988)는 토끼 망상적혈구 분석에서 인간 DHFR 해독을 중지(arrest) 시키는 능력에 대하여 텐덤 14개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 텐덤 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2개와 3개의 서열로 각각 구성된 28개 핵염기와 42개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 테스트하였다. 28개 또는 42개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드와 비교하여 그다지 높지 않은 수준이지만, 3개의 각 14개 핵염기 안티센스 올리고뉴클레오티드 만이 해독을 저해시킬 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 안티센스 화합물들 성질, 이를 테면 저해 활성의 강화, 표적 핵산에 대한 결합 친화력의 증가, 또는 생체내 뉴클레아제에 의한 분해에 저항성을 부여하기 위하여 패턴 또는 모티프로 배열된 화학적으로 변형된 하위단위를 가진다.
키메라 안티센스 화합물들은 뉴클레아제 분해에 대한 저항성 증가, 세포 취입의 증가, 표적 핵산에 대한 결합 친화력 증가, 및/또는 저해 활성의 증가를 부여하기 위하여 변형된 최소한 한 개 영역이 전형적으로 포함된다. 키메라 안티센스 화합물의 제 2 영역은 RNA:DNA 듀플렉스에서 RNA 가닥을 절단하는 세포의 엔도뉴클레아제 RNase H에 대한 기질로 작용할 수 있다.
갭머 모티프를 보유한 안티센스 화합물들이 키메라 안티센스 화합물로 간주된다. 갭머에서 RNaseH 절단을 지원하는 다수의 뉴클레오티드를 보유한 내부 영역은 내부 영역의 뉴클레오시드와 화학적으로 구별되는 다수의 뉴클레오티드를 보유한 외부 영역 사이에 위치한다. 갭머 모티프를 보유한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우, 상기 갭 세그먼트는 일반적으로 엔도뉴클레아제 절단에 대한 기질로 작용하며, 윙 세그먼트는 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 갭머의 영역들은 각 별개 영역이 포함된 당 모이어티 유형에 의해 차별된다. 일부 구체예들에 있어서, 갭머의 영역들을 구별하는데 이용되는 당 모이어티의 유형은 β-D-리보뉴클레오시드,β-D-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-변형된 뉴클레오시드 (이러한 2'-변형된 뉴클레오시드는 다른것들 중에서 2'-MOE, 그리고 2'-O-CH3를 포함한다), 그리고 이환 당 변형된 뉴클레오시드 (이러한 이환 당 변형된 뉴클레오시드는 4'-(CH2)n-O-2' 다리, 이때 n=1 또는 n=2, 그리고 4'-CH2-O-CH2-2'를 보유한 것들을 포함할 수 있다)를 포함한다. 바람직하게는, 각 별개 영역은 균일한 당 모이어티를 포함한다. 윙-갭-윙 모티프는 흔히 "X-Y-Z"로 표현되는데, 여기에서 "X"는 5' 윙 영역의 길이를 나타내며, "Y"는 상기 갭 영역의 길이를 나타내며, 그리고 "Z"는 3' 윙 영역의 길이를 나타낸다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "X-Y-Z"로 표시된 갭머는 각 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트에 바로 인접하여 위치되도록 배열을 가진다. 따라서, 5' 윙 세그먼트와 갭 세그먼트, 또는 상기 갭 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 끼여드는 뉴클레오티드는 존재하지 않는다. 본 명세서에서 설명된 임의의 안티센스 화합물들은 갭머 모티프를 보유할 수 있다. 일부 구체예들에 있어서, X와 Z는 동일하며, 다른 구체예들에서, X와 Z는 상이하다. 바람직한 구체예에 있어서, Y는 8 내지 15개의 뉴클레오티드다. X, Y 또는 Z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오티드중 임의의 것일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 설명된 갭머는 예를 들면 5-10-5, 5-10-4, 4-10-4, 4-10-3, 3-10-3, 2-10-2, 5-9-5, 5-9-4, 4-9-5, 5-8-5, 5-8-4, 4-8-5, 5-7-5, 4-7-5, 5-7-4, 또는 4-7-4를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물은 윙-갭 또는 갭-윙 배열을 가지는 "윙머(wingmer)" 모티프, 이를 테면 갭머 배열에 대하여 상기에서 설명된 것과 같이 X-Y 또는 Y-Z 배열을 보유한다. 따라서, 본 명세서에서 설명된 윙머 배열은 예를 들면 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8, 또는 6-8을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 5-10-5 갭머 모티프를 소유한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 5-10-4 갭머 모티프를 소유한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 4-10-4 갭머 모티프를 소유한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 4-10-3 갭머 모티프를 소유한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 5-9-5 갭머 모티프를 소유한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 좁아진-갭 모티프를 가진다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 좁아진-갭 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드의 윙 세그먼트에 바로 접하여 이들 사이에 위치되는 9, 8, 7, 또는 6개의 2'-데옥시뉴클레오티드의 갭 세그먼트를 보유한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 화학적 변형은 이환 당을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 이환 당은 다음에서 선택된 4' 에서 2'로의 다리를 포함한다: 4'-(CH2)n-O-2' 다리, 이때 n은 1 또는 2임; 그리고 4'-CH2-O-CH2-2'. 특정 구체예들에 있어서, 상기 이환 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 화학적 변형은 비-이환 2'-변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 비-이환 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸에틸 기 또는 2'-O-메틸 기를 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 균일하게 변형된다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물은 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 각 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 화학적 변형은 비-이환 2'-변형된 당 모이어티를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 기를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸 기를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 균일하게 변형된 안티센스 화합물들은 C9ORF72, 또는 이의 임의의 일부분, 이를 테면 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 표적으로 할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 균일하게 변형된 안티센스 화합물로 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 표적하면 RNA 결합 단백질과의 상호작용을 차단시킴으로써 반복 RNA를 감소시킨다. 특정 구체예들에 있어서, 이로써 독성 RNA는 좌(foci)로부터 존재하지 않게 되고, 대신 분해된다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오티드 서열
C9ORF72를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하나 이에 국한되지 않는다: GENBANK 수탁 번호. NM_001256054.1의 보체 (본 명세서에서 서열 번호: 1로 편입됨), 염기 27535000에서 27565000가 절두된 GENBANK 수탁 번호. NT_008413.18 (본 명세서에서 서열 번호: 2로 편입됨), GENBANK 수탁 번호. BQ068108.1 (본 명세서에서 서열 번호: 3으로 편입됨), GENBANK 수탁 번호. NM_018325.3 (본 명세서에서 서열 번호: 4로 편입됨), GENBANK 수탁 번호. DN993522.1 (본 명세서에서 서열 번호: 5로 편입됨), GENBANK 수탁 번호. NM_145005.5 (본 명세서에서 서열 번호: 6으로 편입됨), GENBANK 수탁 번호. DB079375.1 (본 명세서에서 서열 번호: 7로 편입됨), GENBANK 수탁 번호. BU194591.1 (본 명세서에서 서열 번호: 8로 편입됨), 서열 식별자(Sequence Identifier) 4141_014_A (본 명세서에서 서열 번호: 9로 편입됨), 그리고 서열 식별자 4008_73_A (본 명세서에서 서열 번호: 10으로 편입됨).
본 명세서에서 포함된 실시예들 안에 각 서열 번호로 제시된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 링키지, 또는 핵염기에 대하여 임의의 변형에 독립적임을 인지해야 한다. 그와 같이, 서열 번호에 의해 특정된 안티센스 화합물들은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 링키지, 또는 핵염기에 대해 독립적으로 하나 또는 그 이상의 변형을 포함할 수 있다. Isis 번호 (Isis No)로 설명된 안티센스 화합물들은 핵염기 서열과 모티프의 조합을 나타낸다.
특정 구체예들에 있어서, 표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 특정된 영역이다. 예를 들면, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합부, 코딩 영역, 해독 개시 영역, 해독 종료 영역, 또는 다른 특정된 핵산 영역을 포괄할 수 있다. C9ORF72에 대한 구조적으로 특정된 영역은 서열 데이터베이스 이를 테면 NCBI에서 수탁번호에 의해 획득될 수 있고, 이러한 정보는 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 특정 구체예들에 있어서, 표적 영역은 표적 영역 내 하나의 표적 세그먼트의 5' 표적 부위에서 동일한 표적 영역의 또다른 표적 세그먼트의 3' 표적 부위까지의 서열을 포괄할 수 있다.
표적화는 원하는 효과가 발생되도록 안티센스 화합물이 혼성화되는 최소한 하나의 표적 세그먼트의 결정을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 바람직한 효과는 mRNA 표적 핵산 수준의 감소다. 특정 구체예들에 있어서, 바람직한 효과는 표적 핵산에 의해 인코드된 단백질 수준의 감소 또는 표적 핵산과 연합된 표현형 변화다.
표적 영역은 하나 또는 그 이상의 표적 세그먼트를 포함할 수 있다. 표적 영역내 다수의 표적 세그먼트가 중첩될 수 있다. 대안으로, 이들은 중첩되지 않을 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 표적 영역내 표적 세그먼트들은 단지 약 300개 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 구체예들에 있어서, 표적 영역내 표적 세그먼트는 임의의 숫자의 뉴클레오티드, 표적 핵산 상에서 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개, 대략 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 또는 10개 이상은 아닌, 약 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10개의 뉴클레오티드에 의해 분리되거나, 또는 전술한 값중 임의의 2개 값에 의해 특정되는 범위에 의해 분리된다. 특정 구체예들에 있어서, 표적 영역 안에서 표적 세그먼트들은 표적 핵산 상에서 5개 이상은 아닌, 또는 약 5개 이상은 아닌, 5개의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 구체예들에 있어서, 표적 세그먼트들은 연속적이다. 본 명세서에서 열거된 5' 표적 부위 또는 3' 표적 부위중 임의의 것인 출발 핵산을 보유한 범위로 특정된 표적 영역이 고려된다.
적합한 표적 세그먼트들은 5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR, 인트론, 엑손, 또는 엑손/인트론 접합부 안에서도 발견될 수 있다. 시작 코돈 또는 정지 코돈이 포함된 표적 세그먼트들이 또한 적합한 표적 세그먼트들이다. 적합한 표적 세그먼트는 구조적으로 특정하게 한정된 영역 이를 테면 시작 코돈 또는 정지 코돈을 특별히 배제할 수 있다.
적합한 표적 세그먼트의 결정은 게놈을 통하여 표적 핵산을 다른 서열에 비교하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, BLAST 알고리즘을 이용하여 상이한 핵산들중에서 유사한 영역을 식별할 수 있다. 이러한 비교는 선택된 표적 핵산이외의 서열 (이를 테면, 비-표적 또는 표적을 벗어난(off-target) 서열)에 비-특이적 방식으로 혼성화될 수 있는 안티센스 화합물 서열의 선별을 방지할 수 있다.
표적 영역내 안티센스 화합물들의 활성에서의 변이 (가령, 표적 핵산 수준의 감소 비율로 정의된)가 있을 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 mRNA 수준의 감소는 C9ORF72 발현이 저해됨을 나타낸다. C9ORF72 단백질 수준의 감소는 또한 표적 mRNA 발현의 저해를 나타낸다. 확장된(expanded) C9ORF72 RNA 좌 존재의 감소는 C9ORF72 발현의 저해를 나타낸다. 더욱이, 표현형의 변화는 C9ORF72 발현 저해를 나타낸다. 예를 들면, 개선된 운동 기능 및 호흡은 C9ORF72 발현 저해를 나타낼 수 있다.
혼성화(Hybridization)
일부 구체예들에 있어서, 혼성화는 본 명세서에서 공개된 안티센스 화합물과 C9ORF72 핵산 사이에서 발생된다. 혼성화의 가장 흔한 기전은 핵산 분자의 상보적 핵염기들간에 수소 결합 (가령, Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역전된 Hoogsteen 수소 결합)이 관련된다.
혼성화는 다양한 조건하에서 발생될 수 있다. 엄중한(stringent) 조건은 서열-의존적이며, 혼성화되는 핵산 분자의 성질 및 조성에 의해 결정된다.
표적 핵산에 특이적으로 혼성화가능한지를 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 안티센스 화합물들은 C9ORF72 핵산에 특이적으로 혼성화가능하다.
상보성(Complementarity)
안티센스 화합물의 충분한 수의 핵염기가 표적 핵산의 대응하는 핵염기와 수소결합하여, 원하는 효과가 발생될 때 안티센스화합물과 표적 핵산은 서로 상보적이다 (가령, 표적 핵산, 이를 테면 C9ORF72 핵산의 저해).
안티센스 화합물이 표적 핵산에 여전히 특이적으로 혼성화될 수 있다면, 안티센스 화합물과 C9ORF72 핵산 사이에 비-상보적 핵염기가 용인될 수 있다. 더욱이, 안티센스 화합물은 C9ORF72 핵산의 하나 또는 그 이상의 세그먼트에 걸쳐 혼성화될 수 있고, 끼어있는 또는 인접 세그먼트는 혼성화 과정에 관여하지 않는다 (가령, 루프 구조, 부정합 또는 헤어핀 구조).
특정 구체예들에 있어서, 본원 명세서에서 제공된 안티센스 화합물들, 또는 이의 특정 일부분은 C9ORF72 핵산, 표적 영역, 표적 세그먼트, 또는 명시된 일부분에 대하여 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 또는 최소한 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보적이다. 표적 핵산과 안티센스 화합물의 상보성 비율은 통상적인 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
예를 들면, 안티센스 화합물의 20개 핵염기중 18개가 표적 영역에 상보적이며, 따라서 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90 % 상보성을 나타낼 것이다. 이 실시예에서, 남아있는 비-상보적 핵염기들은 군집화되거나 또는 상보적 핵염기들과 섞여 있을 수 있고, 그리고 서로 또는 상보적 핵염기에 인접해 있을 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전한 상보성인 2개 영역의 측면에 있는 4개의 비상보적 핵염기들을 보유하는 18개 핵염기인 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8%의 전반적인 상보성을 보유할 것이며, 따라서 본 발명의 범위내에 속한다. 표적 핵산의 영역과 안티센스 화합물의 상보성 비율은 당분야에 공지된 BLAST 프로그램 (기본적인 로컬 얼라먼트 서치 툴)과 PowerBLAST 프로그램 (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang 및 Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656)을 이용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 상동성 비율, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들면, Smith 및 Waterman의 알고리즘을 이용한(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489) 디폴트 세팅을 이용하여 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공되는 안티센스 화합물들, 또는 명시된 이의 일부분은 표적 핵산, 또는 명시된 이의 일부분에 충분히 상보적이다 (이를 테면, 100% 상보성). 예를 들면, 안티센스 화합물은 C9ORF72 핵산, 또는 표적 영역, 또는 표적 세그먼트 또는 이의 표적 서열에 충분히 상보적일 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "충분한(fully) 상보성"이란 안티센스 화합물의 각 핵염기가 표적 핵산의 대응하는 핵염기와 정확하게 염기쌍을 형성할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, 표적 핵산의 20개 핵염기 일부분이 안티센스 화합물에 충분히 상보적이라면, 20개의 핵염기 안티센스 화합물은 400개 길이의 표적 서열에 충분히 상보적이다. 충분한 상보성은 제 1 및/또는 제 2 핵산의 명시된 일부분을 언급할 때 이용될 수 있다. 예를 들면, 30개 핵염기 안티센스 화합물의 20개 핵염기 일부분은 길이가 400개 핵염기인 표적 서열에 "충분히 상보성"이 될 수 있다. 30개 핵염기 올리고뉴클레오티드의 20개 핵염기 일부분은 표적 서열이 상응하는 20개 핵염기 일부분을 보유한다면, 표적 서열에 충분히 상보적이며, 이때 각 핵염기는 안티센스 화합물의 20개 핵염기 일부분에 상보적이다. 동시에, 전체 30개 핵염기 안티센스 화합물은 안티센스 화합물의 나머지 10개 핵염기가 표적 서열에 또한 상보적인지에 따라, 표적 서열에 충분히 상보적이거나 또는 상보적이지 않을 수 있다.
비-상보적 핵염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 단부 또는 3' 단부일 수 있다. 대안으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들은 안티센스 화합물의 내부 위치에 있을 수 있다. 2개 또는 그 이상의 비-상보적 핵염기들이 존재할 때, 이들은 인접되거나(이를 테면, 연계된) 또는 비-인접될 수 있다. 한 구체예에 있어서, 비-상보적 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드의 윙 세그먼트에 위치될 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 핵염기들이거나, 또는 최대 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 핵염기들인 안티센스 화합물들은 표적 핵산, 이를 테면 C9ORF72 핵산, 또는 명시된 이의 일부분에 관련된 4개를 넘지않는, 3개를 넘지않는, 2개를 넘지 않는 또는 1개를 넘지않는 비-상보적 핵염기(들)을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 핵염기들이거나, 또는 최대 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 개 핵염기들인 안티센스 화합물들은 표적 핵산, 이를 테면 C9ORF72 핵산, 또는 명시된 이의 일부분에 관련된 6개를 넘지않는, 5개를 넘지 않는 4개를 넘지않는, 3개를 넘지않는, 2개를 넘지 않는 또는 1개를 넘지않는 비-상보적 핵염기(들)을 포함한다.
본 명세서에서 제공된 안티센스 화합물들은 표적 핵산의 일부분에 상보적인 것들을 또한 포함한다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "일부분"이라 함은 표적 핵산의 영역 또는 세그먼트 안에 명시된 수의 인접(이를 테면 연계된) 핵염기들을 지칭한다. "일부분"은 안티센스 화합물의 명시된 수의 인접 핵염기들을 또한 지칭할 수 있다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 8개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 9개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 10개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 11개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 12개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 13개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 14개 핵염기 일부분에 상보적이다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 표적 세그먼트의 최소한 15개 핵염기 일부분에 상보적이다. 표적 세그먼트의 최소한 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 핵염기 일부분, 또는 이들 값중 임의의 2개 값에 의해 한정된 범위의 핵염기에 상보적인 안티센스 화합물 또한 고려된다.
동일성(Identity)
본 명세서에서 제공된 안티센스 화합물들은 특정 뉴클레오티드 서열, 서열 번호, 또는 특정된 Isis 번호, 또는 이의 일부분에 의해 대표되는 화합물에 명시된 동일성 % 비율을 또한 보유할 수 있다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 안티센스 화합물은 이 화합물이 동일한 핵염기 쌍형성(pairing) 능력을 보유한다면, 본 명세서에서 공개된 서열에 동일하다. 예를 들면, 공개된 DNA 서열에서 티미딘을 대신하여 우라실을 포함하는 RNA는 우라실과 티미딘 모두다 아데닌과 쌍을 형성하기 때문에, DNA 서열과 동일한 것으로 간주될 것이다. 본 명세서에서 공개된 안티센스 화합물들의 짧아진 형태와 연장된 형태 뿐만 아니라 본 명세서에서 제공된 안티센스 화합물들과 비교하여 비-동일 염기를 보유하는 화합물 또한 고려된다. 비-동일 염기는 서로 인접될 수 있고, 또는 안티센스 화합물내 분산될 수 있다. 안티센스 화합물의 동일성 비율은 비교되는 서열에 있어서 동일한 염기 쌍형성을 보유한 염기의 수에 따라 산출된다.
특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들, 또는 이의 일부분은 본 명세서에서 공개된 하나 또는 그 이상의 안티센스 화합물들 또는 서열 번호, 또는 이의 일부분에 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물의 일부분은 표적 핵산의 동일한 길이 부분과 비교된다. 특정 구체예들에 있어서, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 핵염기 일부분은 표적 핵산의 대등한 길이 부분과 비교된다.
특정 구체예들에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일부분은 표적 핵산의 동일한 길이 부분과 비교된다. 특정 구체예들에 있어서, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 핵염기 일부분은 표적 핵산의 대등한 길이 부분과 비교된다.
변형(Modifications)
뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 핵염기 (또는 염기로도 알려짐) 일부분은 보통 헤테로사이클 염기 모이어티다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 일부분에 공유적으로 연계된 인산염 기를 더 포함하는 뉴클레오시드다. 펜토퓨라노실 당이 포함된 뉴클레오시드의 경우, 인산염 기는 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티에 연계될 수 있다. 선형 고분자 올리고뉴클레오티드를 형성하기 위하여 올리고뉴클레오티드는 서로 인접된 뉴클레오시드의 공유 링키지를 통하여 형성된다. 올리고뉴클레오티드 구조 내 인산염 기는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 링키지를 형성하는 것으로 흔히 언급된다.
안티센스 화합물들에 대한 변형은 뉴클레오시드간 링키지, 당 모이어티, 또는 핵염기들에 대한 치환 또는 변화를 포괄한다. 변형된 안티센스 화합물들은 바람직한 성질 이를 테면, 예를 들면, 세포 취입의 강화, 핵산 표적에 대한 친화력 강화, 뉴클레아제 존재 하에서 안정성 증가, 또는 저해 활성의 증가로 인하여 고유 형태보다 대개 더 바람직하다.
화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 이의 표적 핵산에 대하여 짧아진 또는 절두된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화력을 증가시키기 위하여 또한 이용될 수 있다. 결과적으로, 이러한 화학적으로 변형된 뉴클레오시드를 보유한 더 짧은 안티센스 화합물들에 의해 필적할 수준의 결과가 대개 획득될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 링키지
RNA와 DNA의 자연 발생적 뉴클레오시드간 링키지는 3'에서 5'로의 포스포디에스테르 링키지다. 하나 또는 그 이상의 변형된, 이를 테면 비-자연 발생적, 뉴클레오시드간 링키지를 가진 안티센스 화합물들은 바람직한 성질 이를 테면, 예를 들면, 세포 취입의 강화, 표적 핵산에 대한 친화력의 강화, 그리고 뉴클레아제 존재하에서 안정성의 증가로 인하여 자연 발생적 뉴클레오시드간 링키지를 보유한 안티센스 화합물에 우선되어 선택된다.
변형된 뉴클레오시드간 링키지를 보유한 올리고뉴클레오티드는 인 원자를 보유한 뉴클레오시드간 링키지 뿐만 아니라 인 원자를 보유하지 않은 뉴클레오시드간 링키지를 포함한다. 뉴클레오시드간 링키지가 포함된 대표적인 인은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 그리고 포스포로티오에이트를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 인-함유 그리고 인-비함유 링키지를 만드는 방법은 공지되어 있다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물들은 하나 또는 그 이상의 변형된 뉴클레오시드간 링키지를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 링키지는 안티센스 화합물에 삽입된다. 특정 구체예들에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물의 각 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 링키지다.
변형된 당 모이어티
안티센스 화합물들은 임의선택적으로 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있으며 이때 당 기는 변형되었다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드는 안티센스 화합물들에게 뉴클레아제 안정성의 증가, 결합 친화력의 증가, 또는 일부 다른 유익한 생물학적 성질을 부여한다. 특정 구체예들에 있어서, 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된 리보퓨라노즈 링 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보퓨라노즈 링의 예로는 치환기의 추가 (5' 및 2' 치환기, 이환 핵산 (BNA)을 형성하기 위하여 비-같은자리(geminal) 링 원자의 다리연결, 리보실 링 산소 원자가 S, N(R), 또는 C(R1)(R2) (R, R1 및 R2 는 각각 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 보호기)로 치환 및 이의 조합이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 화학적으로 변형된 당의 예로는 2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드 (PCT 국제 출원 WO 2008/101157 2008년 8월 21일자 공개, 기타 공개된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오시드) 또는 리보실 링 산소 원자는 S로 치환되고, 2' 위치에 추가 치환을 가진 것이 포함된다 (공개된 U.S. 특허 출원 US2005-0130923, 2005년 6월 16일자 공개 참고) 또는 대안으로 BNA의 5'-치환 (PCT 국제 출원 WO 2007/134181 2007년 11월 22일자 공개됨 이때 LNA는 예를 들면 5'-메틸 또는 5'-비닐 기로 치환된다).
변형된 당 모이어티를 보유한 뉴클레오시드의 예로는 5'-비닐, 5'-메틸 (R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2'-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F 그리고 2'-O(CH2)2OCH3 치환기가 포함된 뉴클레오시드를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 2' 위치의 치환체는 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)로부터 또한 선택될 수 있는데, 이때 각 Rl, Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환된 또는 치환안된 C1-C10 알킬이다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "이환 뉴클레오시드"란 이환 당 모이어티가 포함된 변형된 뉴클레오시드를 말한다. 이환 뉴클레오시드의 예로는 4'와 2' 리보실 링 원자 사이에 다리가 포함된 뉴클레오시드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 제공된 안티센스 화합물들은 4'에서 2'로의 다리가 포함된 하나 또는 그 이상의 이환 뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 4'에서 2'로 다리연결된 이환 뉴클레오시드의 예로는 다음 식 중 하나를 포함하나 이에 국한되지 않는다: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' 그리고 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (그리고 이의 유사체들, U.S. 특허 7,399,845, 2008년 7월 15일 등록 참고); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (그리고 이의 유사체들, 공개된 국제 출원 WO/2009/006478, 2009년 1월 8일자 공개 참고); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (그리고 이의 유사체들, 공개된 국제 출원 WO/2008/150729, 2008년 12월 11자 공개 참고); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (공개된 U.S. 특허 출원 US2004-0171570 참고, 2004년 9월 2일 공개); 4'-CH2-N(R)-O-2', 이때 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기임 (U.S. 특허 7,427,672, 2008년 9월 23일 등록); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참고); 그리고 4'-CH2-C(=CH2)-2' (그리고 이의 유사체들, 공개된 국제 출원 WO 2008/154401, 2008년 12월 8일 공개 참고).
이환 뉴클레오시드와 관련된 추가 보고서는 공개 문헌에서 또한 찾아볼 수 있다 (예를 들면: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; 그리고 Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; U.S. 특허 번호 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; 그리고 7,696,345; U.S. 특허 공개 번호. US2008-0039618; US2009-0012281; U.S. 특허 일련 번호 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; 그리고 61/099,844; 공개된 PCT 국제 출원 WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; 그리고 WO 2009/006478. 예를 들면 α-L-리보퓨라노즈 및 β-D-리보퓨라노즈가 포함된 하나 또는 그 이상의 입체화학적 당 배열을 보유하도록 전술한 각 이환 뉴클레오시드가 만들어질 수 있다 (PCT 국제 출원 PCT/DK98/00393, 1999년 3월 25일자로 공개 WO 99/14226).
특정 구체예들에 있어서, BNA 뉴클레오시드의 이환 당 모이어티는 펜토퓨라노실 당 모이어티의 4'와 2' 위치 사이에 최소한 한개의 다리를 보유한 화합물들을 포함하나 이에 한정되지 않으며 이때 이러한 다리는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, 그리고 -N(Ra)-로부터 독립적으로 선택된 1 또는 2 내지 4개의 연계된 기를 포함하며;
이때:
x는 0, 1, 또는 2이며;
n은 1, 2, 3, 또는 4이며;
각 Ra 및 Rb는 독립적으로 H, 보호기, 히드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환(alicyclic) 라디칼, 치환된 C5-C7 지환 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 술포닐 (S(=O)2-J1), 또는 술폭실 (S(=O)-J1)이며; 그리고
각 J1 및 J2은 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기다.
특정 구체예들에 있어서, 이환 당 모이어티의 다리는 -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- 또는 -C(RaRb)-O-N(R)-이다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 다리는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' 및 4'-CH2-N(R)-O-2'-이며, 이때 각 R은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예들에 있어서, 이환 뉴클레오시드는 이성체 배열에 의해 추가 특정된다. 예를 들면, 4'-2' 메틸렌-옥시 다리가 포함된 뉴클레오시드는 α-L 배열 또는 β-D 배열에 존재할 수 있다. 이미, α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA's는 안티센스 활성을 보였던 안티센스 올리고뉴클레오티드에 혼입되었다 (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
특정 구체예들에 있어서, 이환 뉴클레오시드는 하기에서 도시된 바와 같이 (A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA, (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, 그리고 (F) 메틸(메틸렌옥시) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) 메틸렌-티오 (4'-CH2-S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노 (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카르보사이클 (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, 그리고 (J) 프로필렌 카르보사이클 (4'-(CH2)3-2') BNA를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
여기에서 Bx는 염기 모이어티이며, R은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
특정 구체예들에 있어서, 식 I을 보유한 이환 뉴클레오시드가 제공된다:
이때:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
-Qa-Qb-Qc-는 -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- 또는 -N(Rc)-O-CH2이고;
Rc 는 C1-C12 알킬 또는 아미노 보호기이며; 그리고
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 히드록실 보호기, 접합 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지(support) 매질에 공유 부착물(covalent attachment)이다.
특정 구체예들에 있어서, 식 II을 보유한 이환 뉴클레오시드가 제공된다:
이때:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 히드록실 보호기, 접합 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지 매질에 공유 부착물이다;
Za는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐, 아실, 치환된 아실, 치환된 아미드, 티올 또는 치환된 티오다.
한 구체예에 있어서, 각 치환된 기는 할로겐, 옥소(oxo), 히드록실, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, 및 NJeC(=X)NJcJd,로부터 독립적으로 선택된 치환기들로 단일 또는 다중 치환되며, 이때 각 Jc, Jd 및 Je는 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 또는 치환된 C1-C6 알킬이며, X는 O 또는 NJc이다.
특정 구체예들에 있어서, 식 III을 보유한 이환 뉴클레오시드가 제공된다:
이때:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 히드록실 보호기, 접합 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지 매질에 공유 부착물이다;
Zb 는 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 치환된 C1-C6 알킬, 치환된 C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알키닐 또는 치환된 아실 (C(=O)-)이다.
특정 구체예들에 있어서, 식 IV를 보유한 이환 뉴클레오시드가 제공된다:
이때:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 히드록실 보호기, 접합 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지 매질에 공유 부착물이다;
Rd는 C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이며;
각 qa, qb, qc 및 qd 는 독립적으로 H, 할로겐, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐, C1-C6 알콕실, 치환된 C1-C6 알콕실, 아실, 치환된 아실, C1-C6 아미노알킬 또는 치환된 C1-C6 아미노알킬이다;
특정 구체예들에 있어서, 식 V를 보유한 이환 뉴클레오시드가 제공된다:
이때:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 히드록실 보호기, 접합 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지 매질에 공유 부착물이다;
qa, qb, qe 및 qf 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕시, 치환된 C1-C12 알콕시, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는 N(H)C(=S)NJjJk이거나;
또는 qe 와 qf 는 함께 =C(qg)(qh)이며;
qg와 qh 는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실의 합성 및 제조, 그리고 이들의 올리고머화, 핵산 인지 성질이 설명되었다 (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNAs 및 이의 제조 또한 WO 98/39352와 WO 99/14226에서 설명된다.
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') BNA 및 2'-티오-BNAs의 유사체들 또한 제조되었다 (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 중합효소의 기질로써 올리고데옥시리보뉴클레오티드 듀플렉스가 포함된 잠김(locked) 뉴클레오시드 유사체들의 제조에 대해서 또한 설명되었다 (Wengel et al., WO 99/14226). 더욱이, 2'-아미노-BNA, 신규한 형태학적으로 제한된 고-친화력 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성이 당분야에 설명되었다 (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-BNA's가 준비되었고, 이들의 듀플렉스와 상보적 RNA 및 DNA 가닥의 열적 안정성은 이미 보고되었다.
특정 구체예들에 있어서, 식 VI를 보유한 이환 뉴클레오시드가 제공된다:
이때:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
Ta 및 Tb는 각각 독립적으로 H, 히드록실 보호기, 접합 기, 반응성 인 기, 인 모이어티 또는 지지 매질에 공유 부착물이다;
각 qi, qj, qk 및 ql 은 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C1-C12 알콕실, 치환된 C1-C12 알콕실, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk 또는N(H)C(=S)NJjJk이며; 그리고
qi 와 qj 또는 ql 와 qk 는 함께 =C(qg)(qh)이며, 이때 qg와 qh는 각각 독립적으로 H, 할로겐, C1-C12 알킬 또는 치환된 C1-C12 알킬이다.
4'-(CH2)3-2' 다리와 알케닐 유사체 다리 4'-CH=CH-CH2-2'를 보유한 한 가지 카르보사이클 이환 뉴클레오시드가 설명되었다 (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 그리고 Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). 카르보사이클 이환 뉴클레오시드의 합성 및 제조 그리고 이들의 올리고머와 그리고 생화학 연구 또한 설명되었다(Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "4'-2' 이환 뉴클레오시드" 또는 "4' 에서 2' 이환 뉴클레오시드"란 당링의 2' 탄소와 4' 탄소 원자에 퓨라노즈 링의 2개 탄소를 연결시키는 다리가 포함된 이환 뉴클레오시드를 말한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "단환(monocylic) 뉴클레오시드"란 이환 당 모이어티가 아닌 변형된 당 모이어티가 포함된 뉴클레오시드를 말한다. 특정 구체예들에 있어서, 뉴클레오시드의 당 모이어티, 또는 당 모이어티 유사체는 임의의 위치에서 변형되거나 또는 치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "2'-변형된 당"이란 2' 위치에서 변형된 퓨라노실 당을 의미한다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 변형은 치환된 그리고 치환안된 알콕시, 치환된 그리고 치환안된 티오알킬, 치환된 그리고 치환안된 아미노 알킬, 치환된 그리고 치환안된 알킬, 치환된 그리고 치환안된 알릴, 및 치환된 그리고 치환안된 알키닐이 포함되나, 이에 국한되지 않은 할로겐화물(halide)로부터 선택된 치환체들을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 2' 변형은 다음의 치환체로부터 선택되나, 이에 한정되지 않는다: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3, 그리고 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, 이때 n과 m은 1 내지 약 10이다. 다른 2'- 치환기는 또한 다음에서 선택될 수 있다: C1-C12 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 절단기, 리포터 기, 삽입제(intercalator), 안티센스 화합물의 약동학 성질을 개신시키는 기, 또는 약력학 성질을 개선시키는 기, 그리고 유사한 성질을 보유한 다른 치환기. 특정 구체예들에 있어서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-MOE 측쇄를 포함한다(Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). 변형안된 뉴클레오시드와 다른 변형된 뉴클레오시드, 이를 테면 2'- O-메틸, O-프로필, 그리고 O-아미노프로필과 비교하였을 때 개선된 결합 친화력을 보유한 이러한 2'-MOE 치환이 설명되었다. 2'-MOE 치환기를 보유한 올리고뉴클레오티드는 또한 생체내 사용에 대한 전망있는 특징을 가진 유전자 발현의 안티센스 저해제가 될 수 있음이 확인되었다 (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; 그리고 Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "변형된 테트라히드로피란 뉴클레오시드" 또는 "변형된 THP 뉴클레오시드"란 보통의 뉴클레오시드에 펜토퓨라노실 잔기를 대신하여 치환된 6-원(membered) 테트라히드로피란 당(당 대용물)을 보유한 뉴클레오시드를 말한다 . 변형된 THP 뉴클레오시드는 당업계에서 헥시톨 핵산 (HNA), 아니톨 핵산 (ANA), 만니톨 핵산 (MNA) (Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854 참고), 플루오르 HNA (F-HNA) 또는 식 VII을 보유한 이들 화합물들로 지칭되는 것들이 포함되나 이에 국한되지 않는다:
이때 독립적으로 식 VII의 전술한 최소한 한 가지 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체:
Bx는 헤테로사이클 염기 모이어티이며;
Ta 및 Tb 는 각각, 독립적으로 안티센스 화합물에 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 연계시키는 뉴클레오시드간 연계기이거나 또는 Ta 와 Tb 중 하나는 안티센스 화합물에 테트라히드로피란 뉴클레오시드 유사체를 연계시키는 뉴클레오시드간 연계기이며, 그리고 Ta 와 Tb 중 다른 하나는 H, 히드록실 보호기, 연계된 접합체기 또는 5' 또는 3'-말단 기이며;
q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 은 각각 독립적으로 H, C1-C6 알킬, 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 치환된 C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐 또는 치환된 C2-C6 알키닐이며; 그리고 R1 과 R2 는 각각 수소, 히드록실, 할로겐, 치환된 또는 치환안된 알콕시, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJ1J2 그리고 CN으로부터 선택되며, 이때 X는 O, S 또는 NJ1이며, 그리고 J1, J2 및 J3 은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬이다.
특정 구체예들에 있어서, 식 VII의 변형된 THP 뉴클레오시드가 제공되는데, 이때 q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7은 각각 H다. 특정 구체예들에 있어서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 최소한 하나는 H가 아니다. 특정 구체예들에 있어서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7중 최소한 하나는 메틸이다. 특정 구체예들에 있어서, 식 VII의 THP 뉴클레오시드가 제공되며, 이때 R1 및 R2 중 하나는 플루오르다. 특정 구체예들에 있어서, R1은 플루오르이며, R2는 H이고; R1은 메톡시이며, R2는 H이고, 그리고 R1은 H이고, R2는 메톡시에톡시다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "2'-변형된" 또는 "2'-치환된"이란 2' 위치에서 H 또는 OH가 아닌 다른 치환기가 포함된 당을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다. 2'-변형된 뉴클레오시드는 이환 뉴클레오시드를 포함하나 이에 한정되지 않으며 이때 다리는 당 링의 2개 탄소원자를 연결하는 다리는 당링의 2' 탄소와 또다른 탄소를 연결시키고, 그리고 다리가 아닌 2'치환기, 이를 테면 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 또는 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)를 가진 뉴클레오시드, 여기에서 Rm 및 Rn은 각각 독립적으로 H 또는 치환된 또는 치환안된 C1-C10 알킬이다. 2'-변형된 뉴클레오시드는 당의 다른 위치 및/또는 핵염기에서 다른 변형을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "2'-F"는 2' 위치에서 플루오르기가 포함된 당을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "2'-OMe" 또는 "2'-OCH3" 또는 "2'-O-메틸"은 당 링의 2' 위치에 -OCH3 기가 포함된 당을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "MOE" 또는 "2'-MOE" 또는 "2'-OCH2CH2OCH3" 또는 "2'-O-메톡시에틸"은 각각 당 링의 2' 위치에 -OCH2CH2OCH3 기가 포함된 당을 포함하는 뉴클레오시드를 말한다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드"란 연계된 뉴클레오시드가 다수 포함된 화합물을 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 다수의 뉴클레오시드중 하나 또는 그 이상이 변형된다. 특정 구체예들에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 리보뉴클레오시드 (RNA) 및/또는 데옥시리보뉴클레오시드 (DNA)를 포함한다.
안티센스 화합물에 혼입시키기 위하여 뉴클레오시드를 변형시키는데 이용될 수 있는 많은 기타 바이시클로와 트리시클로 당 대용물 링 체계가 또한 당업계에 공지되어 있다(예를 들면 검토 문헌: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854 참고).
이러한 링 체계는 활성을 강화시키기 위하여 다양한 추가 치환을 겪을 수 있다.
변형된 당을 준비하는 방법은 당업계 숙련자들에게 잘 알려져 있다.
변형된 당 모이어티를 보유한 뉴클레오티드에서, 핵염기 모이어티 (자연적, 변형된 또는 이의 조합)는 적합한 핵산 표적과 혼성화를 위하여 유지된다.
특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물들은 변형된 당 모이어티를 보유한 하나 또는 그 이상의 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 구체예들에 있어서, 2'-MOE 변형된 뉴클레오시드는 갭머 모티프로 배열된다. 특정 구체예들에 있어서, 변형된 당 모이어티는 (4'-CH(CH3)-O-2') 다리 기를 가진 이환 뉴클레오시드다. 특정 구체예들에 있어서, (4'-CH(CH3)-O-2') 변형된 뉴클레오시드는 갭머 모티프의 윙에 배열된다.
조성물 및 약학 조성물을 제형화시키는 방법
안티센스 올리고뉴클레오티드는 약학 조성물 또는 제제(formulations)를 만들기 위한 약학적으로 수용가능한 활성 또는 비활성 물질과 혼합될 수 있다. 조성물과 약학 조성물의 제제 방법은 투여 경로, 질환의 정도, 또는 투여되는 투여분량을 포함하나 이에 한정되지 않은 다수의 기준에 따라 달라진다.
C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물에 적합한 약학적으로 수용가능한 희석제 또는 운반체를 복합시킴으로써 약학 조성물에 이용될 수 있다. 약학적으로 수용가능한 희석제는 인산염-완충된 염수 (PBS)를 포함한다. PBS는 조성물이 비경구로 전달되도록 하는데 적합한 희석제다. 따라서, 한 구체예에서 본 명세서에서 설명된 방법에 C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물과 약학적으로 수용가능한 희석제가 포함된 약학 조성물이 이용된다. 특정 구체예들에 있어서, 약학적으로 수용가능한 희석제는 PBS다. 특정 구체예들에 있어서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드다.
안티센스 화합물들이 포함된 약학 조성물은 인간을 포함한 동물에 투여될 때 생물학적으로 활성인 대사물질 또는 이의 잔류물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 수용가능한 염, 에스테르, 또는 이러한 에스테르의 염, 또는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드를 포괄한다. 따라서, 예를 들면, 본 내용은 안티센스 화합물들의 약학적으로 수용가능한 염, 프로드럭, 이러한 프로드럭의 약학적으로 수용가능한 염, 그리고 기타 생물등가체(bioequivalents)에 접근한다 적합한 약학적으로 수용가능한 염은 나트륨염 및 칼륨염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
프로드럭은 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 단부에 추가 뉴클레오시드의 혼입을 포함할 수 있는데, 이들은 활성 안티센스 화합물을 만들기 위하여 신체 내에서 내생 뉴클레아제에 의해 절단된다.
접합된 안티센스 화합물들
안티센스 화합물들은 생성된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포의 분포 또는 세포 취입을 강화시키기 위하여 하나 또는 그 이상의 모이어티 또는 공액체에 공유적으로 연계될 수 있다. 전형적인 공액 기는 콜레스테롤 모이어티와 지질 모이어티를 포함한다. 추가 공액 기는 탄수화물, 인지질, 바이오틴, 페나진, 엽산염, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플로오레신, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다.
안티센스 화합물들은 성질 이를 테면, 예를 들면, 뉴클레아제 안정성을 개선시키기 위하여 안티센스 화합물의 하나의 말단 또는 양쪽 말단에 일반적으로 부착된 하나 또는 그 이상의 안정화기를 보유하도록 또한 변형될 수 있다. 안정화기에는 캡 구조가 포함된다. 이러한 말단 변형은 엑소뉴클레아제 분해로부터 말단 핵산을 보유한 안티센스 화합물을 보유하고, 그리고 세포내 운반 및/또는 국소화(localization)를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡), 또는 3'-말단 (3'-캡), 또는 양쪽 말단 모두에 존재할 수 있다. 캡 구조는 당업계 공재되어 있고, 그리고 예를 들면, 역전된(inverted) 데옥시 무염기(abasic) 캡을 포함한다. 뉴클레아제 안정성을 부여하기 위하여 안티센스 화합물의 한쪽 단부 또는 양쪽 단부를 모두 덮는데 이용될 수 있는 추가 3' 및 5' 안정화기는 2003년 1월 16일 공개된 WO 03/004602에서 기술된 것들이 포함된다.
세포 배양물 및 안티센스 화합물들 처리
C9ORF72 핵산의 수준, 활성 또는 발현에서 안티센스 화합물들의 효과가 시험관내 다양한 세포 유형들에서 테스트될 수 있다. 이러한 분석에 이용된 세포 유형은 시판업자 (가령. American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD)로부터 얻을 수 있으며, 시판되는 시약(가령. Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하여 판매업자의 지시에 따라 배양된다. 예시적인 세포 유형은 HepG2 세포, Hep3B 세포, 그리고 일차 간세포들이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 테스트
세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하는 방법들이 본 명세서에서 기술되는데, 이 방법들은 다른 안티센스 화합물들을 이용한 처리에 적절하게 변형될 수 있다.
일반적으로, 세포가 배양물에서 대략 60-80% 합류될 때 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된다.
배양된 세포 안으로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입시키는데 흔히 이용되는 한 가지 시약은 양이온 지질 트랜스펙션(transfection) 시약 LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함한다. 원하는 최종 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드당 전형적으로 2 내지 12 ug/mL 범위의 LIPOFECTIN 농도를 얻기 위하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 LIPOFECTIN과 혼합된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포 안으로 도입시키는데 이용되는 또다른 시약은 LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함한다. 원하는 최종 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드당 전형적으로 2 내지 12 ug/mL 범위의 LIPOFECTAMINE 농도를 얻기 위하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 OPTI-MEM 1 환원된 혈청 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 LIPOFECTAMINE과 혼합된다.
안티센스 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포 안으로 도입시키는데 이용되는 또다른 기술은 전기천공(electroporation)이다.
세포들은 통상적인 방법에 의해 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 처리된다. 세포는 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 16-24시간 시점에 일반적으로 수확되며, 이때 당업계에 공지된 그리고 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준이 측정된다. 일반적으로, 처리가 다수의 복제물(replicates)에서 실행될 때, 데이터는 복제물 처리의 평균으로 제시된다.
이용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포계통에 따라 다양하다. 특정 세포 계통에 최적의 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 LIPOFECTAMINE으로 트렌스펙션되었을 때 1nM 내지 300nM 범위의 농도가 일반적으로 이용된다. 전기천공을 이용하여 트랜스펙션될 때 안티센스 올리고뉴클레오티드는 625 내지 20,000 nM 범위의 다소 더 높은 농도 범위가 이용된다.
RNA 단리(Isolation)
RNA 분석은 전체 세포의 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에서 실행될 수 있다. RNA 단리 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. RNA는 당분야에 잘 공지되어 있는 방법들, 예를 들면, TRIZOL 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 제조업자가 추천하는 방법에 따라 준비된다.
표적 수준 또는 발현의 저해 분석
C9ORF72 핵산의 수준 또는 발현 저해는 당분야에 공지된 다양한 방식에서 분석될 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산 수준은 가령, Northern 블랏(blot) 분석, 경쟁적 중합효소 쇄 반응 (PCR), 또는 정량적 실-시간 PCR에 의해 정량화될 수 있다. RNA 분석은 전체 세포의 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에서 실행될 수 있다. RNA 단리 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. Northern 블랏 분석 또한 당분야에서는 통상적인 것이다. 정량적인 실-시간 PCR은 PE-Applied Biosystems, Foster City, CA에서 이용가능한 그리고 제조업자의 지시에 따라 이용되는 시판되는 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 Sequence Detection System을 이용하여 통상적으로 이용될 수 있다.
표적 RNA 수준의 정량적 실시간 PCR 분석
표적 RNA 수준의 정량화는 제조업자의 지시에 따라 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 정량적 실-시간 PCR에 의해 실행될 수 있다. 정량적 실-시간 PCR 방법들은 당분야에 잘 공지되어 있다.
실-시간 PCR을 하기에 앞서, 단리된 RNA는 역 전사효소 (RT) 반응을 거치게 되며, 이로써 상보적 DNA (cDNA)가 생성되며, 그 다음 실-시간 PCR 증폭을 위한 기질로 이용된다. RT 및 실-시간 PCR 반응은 동일한 시료 웰에서 순차적으로 실행된다. RT 및 실-시간 PCR 시약들은 Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입한다. RT 실-시간-PCR 반응은 당업계 숙련자들에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 실시된다.
실시간 PCR에 의해 획득되는 유전자 (또는 RNA) 표적 양은 발현이 일정한 유전자, 이를 테면 시클로필린 A의 발현 수준을 이용하거나, 또는 RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA)을 이용하여 전체 RNA를 정량화함으로써 표준화된다. 시클로필린 A 발현은 실시간 PCR에 의해 표적과 복합되어, 또는 별개로 동시에 진행되어 정량화된다. 전체 RNA는 RIBOGREEN RNA 정량화 시약 (Invetrogen, Inc. Eugene, OR)을 이용하여 정량화된다. RIBOGREEN에 의한 RNA 정량화 방법은 Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374)에서 교시된다. CYTOFLUOR 4000 기구 (PE Applied Biosystems)는 RIBOGREEN 형광을 측정하는데 이용된다.
프로브와 프라이머는 C9ORF72 핵산에 혼성화되도록 기획된다. 실-시간 PCR 프로브와 프라이머를 기획하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 그리고 소프트웨어 이를 테면 PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA)의 사용이 포함될 수 있다.
단백질 수준 분석
C9ORF72 핵산의 안티센스 저해는 C9ORF72 단백질 수준을 측정함으로써 평가될 수 있다. C9ORF72의 단백질 수준은 당분야에 공지된 다양한 방법, 이를 테면 면역침전, Western 블랏 분석 (면역블랏팅), 효소-연계된 면역흡착 분석 (ELISA), 정량적 단백질 분석, 단백질 활성 분석 (예를 들면, 카스파제 활성 분석), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성화된 세포 소팅 (FACS)에서 평가 또는 정량화될 수 있다. 표적을 지향하는 항체는 다양한 원천, 이를 테면 항체의 MSRS 카탈로그 (Aerie Corporation, Birmingham, MI)에서 확인 및 획득될 수 있거나, 또는 당분야에 잘 공지되어 있는 통상적인 단일클론 또는 다중클론 항체 생성 방법들을 통하여 준비될 수 있다. 마우스, 렛, 원숭이, 그리고 인간 C9ORF72를 탐지하는데 유용한 항체들은 시판되는 것을 이용할 수 있다.
안티센스 화합물들의 생체내 테스트
안티센스 화합물들, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 발현을 저해하는 능력과, 표현형 변화, 이를 테면, 개선된 운동 기능 및 호흡을 만드는 능력을 평가하기 위하여 동물에서 테스트된다. 특정 구체예들에 있어서, 운동 기능은 동물에서 로타로드(rotarod), 그립 강도, 장대 올라가기, 개방 공간에서의 기능(open field performance), 평균대, 발자국 시험에 의해 측정된다. 특정 구체예들에 있어서, 호흡은 동물에서 전신 혈량측정, 침습 저항(invasive resistance), 그리고 순응성(compliance) 측정에 의해 측정된다. 테스트는 일반 동물, 또는 실험용 질환 모델에서 실행될 수 있다. 동물에게 투여를 위하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약학적으로 수용가능한 희석제, 이를 테면 인산염-완충된 염수에서 제형화된다. 투여는 비경구 경로 투여, 이를 테면 복막내, 정맥내, 그리고 피하를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여량(dosage) 및 투여 빈도의 산출은 당업계 숙련자들의 능력 범위내에 있으며, 인자들, 이를 테면 투여 경로 및 동물 체중에 따라 달라진다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한 후, CNS 조직 또는 CSF으로부터 RNA가 단리되며, 그리고 C9ORF72 핵산 발현에서 변화가 측정된다.
C9ORF72를 표적화
본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 RNA 프로세싱의 임의의 단계에서 C9ORF72 핵산에 혼성화될 수 있다. 예를 들면, 프레(pre)-mRNA 또는 완성(mature) mRNA에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 명세서에서 기술된다. 추가적으로, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 핵산의 임의의 요소에 혼성화될 수 있다. 예를 들면, C9ORF72 핵산의 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 반복 영역, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부, 스플라이스 연접부, 엑손:엑손 스플라이스 연접부, 엑손의 스플라이싱 사일런서 (ESS), 엑손의 스플라이싱 인헨서 (ESE), 엑손 1a, 엑손 1b, 엑손 1c, 엑손 1d, 엑손 1e, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손11, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 또는 인트론 10에 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 명세서에서 설명된다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는는 C9ORF72의 모든 변이체들에대해 혼성화된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 특정 변이체들에 대해 선택적으로 혼성화된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 포함하는 C9ORF72의 변이체들에 대해 선택적으로 혼성화된다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 C9ORF72의 이러한 변이체들은 서열 번호: 1-3 및 6-10을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG중 임의의 것의 최소한 30회 반복을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 모든 변이체들의 발현을 저해한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 모든 변이체들의 발현을 대등하게 저해한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72의 특정 변이체들의 발현을 선호적으로 저해한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 C9ORF72의 변이체들의 발현을 선호적으로 저해한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 이러한 C9ORF72 변이체들은 서열 번호: 1-3 및 6-10을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 GGGGCC, GGGGGG, GGGGGC, 또는 GGGGCG중 임의의 것의 최소한 30회 반복을 포함한다. 특정 구체예들에 있어서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부는 핵 좌(nuclear foci)를 형성한다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 핵 좌를 감소시키는데 유용하다. 핵 좌는 핵좌를 보유한 세포의 % 뿐만 아니라 세포당 좌의 수에 있어서도 감소될 수 있다.
반복 확장부에 관한 초기 연구를 기반으로 하면, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부 외측의 C9ORF72를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 C9ORF72의 발현을 성공적으로 저해할 것인지의 예측은 2가지 이유로 불가능하다. 첫째, C9ORF72 반복 확장부는 인트론 안에 위치되며, 그리고 좌에 있는 RNA가 반복 만을 보유하는지 또는 측면 인트론 서열을 또한 포함하는지를 알 수 없다. 예를 들면, ZNF9 유전자의 인트론 1에서 CCTG 확장부 돌연변이에 의해 야기되는 질환인 근육 긴장디스트로피 유형 2(DM2)의 초기 연구에서 큰 DM2 확장부는 대립형질-특이적 프레-mRNA 스플라이싱, 전사체의 핵 반출(export), 또는 mRNA 또는 단백질의 평행(steady-state) 수준을 저지하지 못하였던 것으로 판단되었다. 이 연구는 상기 질환에 연합된 것으로 밝혀진 리보핵 봉입체는 CCUG 확장부에 풍부하지만, 측면 인트론 서열에는 풍부하지 않음을 더 입증하였다. 이들 데이터로부터 DM2 돌연변이의 하류 분자 효과는 CCUG 반복 트랙만의 축적에 의해 촉발될 수 있음이 암시된다. 따라서, 측면 서열, 특히 반복 확장부의 하류 영역을 표적으로 하는 것이 리보핵 봉입체의 형성에 영향을 주지 않을 것이기 때문에, CCUG 반복 확장부 만을 표적으로 하는 것은 이 질환의 개선으로 이어질 수 있을 것으로 본 연구에서 시사된다(Margolis et al. Hum. Mol. Genet., 2006, 15:1808-1815). 둘째, 반복이 포함된 C9ORF72의 인트론 1이 얼마나 빨리 잘려나나고, 그리고 좌 안에 축적되는지 알 수 없다. 따라서, 프레-mRNA의 표적화가 반복 RNA 및 좌가 제거될 것인지를 예측하는 것이 불가능하다.
C9OFF72 특징
본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 프로세싱의 임의의 단계에서 C9ORF72 유전자의 임의의 요소내 임의의 C9ORF72 변이체에 혼성화될 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 반복 영역, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부, 스플라이스 연접부, 엑손:엑손 스플라이스 연접부, 엑손의 스플라이싱 사일런서 (ESS), 엑손의 스플라이싱 인헨서 (ESE), 엑손 1a, 엑손 1b, 엑손 1c, 엑손 1d, 엑손 1e, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 또는 인트론 10에 혼성화될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 변이체들에 대하여 하기에서 설명되는 표 1-5의 다양한 특징화된 임의의 엑손을 표적으로 할 수 있다. 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기에서 특징화되지 않은 표적 변이체들과 GENBANK에서 특징화된 변이체들을 또한 표적으로 할 수 있다. 더욱이, 본 명세서에서 설명된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 이외의 요소와 GENBANK에서 특징화된 요소들을 또한 표적으로 할 수 있다.
특정 징후들(Certain Indications)
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물을 투여하는 것이 포함된 개체를 치료하는 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 특정 구체예들에 있어서, 개체는 신경퇴행성 질환을 가진다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 개체는 ALS 또는 FTD를 포함하나 이에 한정되지 않은 신경퇴행성 질환의 발생 위험에 처해있다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 개체는 C9ORF72 연합된 질환을 가진 것으로 확인되었다. 특정 구체예들에 있어서, 상기 개체는 C9ORF72 헥사뉴클레오티드 반복 확장부 연합된 질환을 가진 것으로 확인되었다. 특정 구체예들에 있어서, 개체내에서 C9ORF72 발현을 예방적으로 감소시키는 방법들이 본 명세서에서 제공된다. 특정 구체예들은 치료요법적으로 유효량의 C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 개체에게 투여함으로써 이러한 치료를 요하는 개체를 치료하는 것을 포함한다.
한 구체예에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 치료요법적으로 유효량의 안티센스 화합물의 투여와 개체에서 C9ORF72 수준을 감시하는 것이 동반되어, 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응이 결정된다. 의사는 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 반응을 이용하여 치료 중재 양과 기간을 결정할 수 있다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여로 인하여 C9ORF72 발현은 최소한 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 값중 임의의 2개 값에 의해 한정된 범위로 감소된다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여로 동물에서 운동 기능 및 호흡이 개선된다. 특정 구체예들에 있어서, C9ORF72 안티센스 화합물의 투여로 운동 기능 및 호흡은 최소한 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 99%, 또는 이들 값중 임의의 2개 값에 의해 한정된 범위로 개선된다.
특정 구체예들에 있어서, C9ORF72를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물은 ALS 및 FTD를 포함하는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 환자 또는 이 질환에 취약한 환자를 치료하는 약물의 제조에 이용된다.
특정 복합 요법
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물은 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질과 공동-투여된다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물과 동일한 질환, 장애, 또는 상태를 치료하도록 기획된다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물과 상이한 질환, 장애, 또는 상태를 치료하도록 기획된다. 특정 구체예들에 있어서, 이러한 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물의 바람직하지 못한 부작용을 치료하도록 기획된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물은 다른 약학 물질의 부작용을 치료하기 위하여 또다른 약학 물질과 공동-투여된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물은 복합 효과를 얻기 위하여 또다른 약학 물질과 공동-투여된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물은 상승 효과를 얻기 위하여 또다른 약학 물질과 공동-투여된다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물과 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 동시에 투여된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물과 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 상이한 시점에 투여된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물과 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 단일 제제에서 함께 준비된다. 특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 하나 또는 그 이상의 약학 조성물과 하나 또는 그 이상의 다른 약학 물질은 별개로 준비된다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 약학 조성물과 공동-투여될 수 있는 약학 물질은 Riluzole (Rilutek), Lioresal (Lioresal), 그리고 Dexpramipexole을 포함한다.
특정 구체예들에 있어서, 본 명세서에서 설명된 C9ORF72 특이적 저해제와 함께 투여될 수 있는 약학 물질은 추가 C9ORF72 저해제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에 있어서, 공동-투여되는 약학 물질은 본 명세서에서 설명된 약학 조성물의 투여에 앞서 투여된다. 특정 구체예들에 있어서, 공동-투여되는 약학 물질은 본 명세서에서 설명된 약학 조성물 투여 후 투여된다. 특정 구체예들에 있어서 공동-투여되는 약학 물질은 본 명세서에서 설명된 약학 조성물과 동시에 투여된다. 특정 구체예들에 있어서 공동-투여되는 약학 물질의 투여분량은 공동-투여되는 약학 물질이 단독으로 투여될 때 투여될 수 있는 투여분량과 동일하다. 특정 구체예들에 있어서 공동-투여되는 약학 물질의 투여분량은 공동-투여되는 약학 물질이 단독으로 투여될 때 투여될 수 있는 투여분량보다 적다. 특정 구체예들에 있어서공동-투여되는 약학 물질의 투여분량은 공동-투여되는 약학 물질이 단독으로 투여될 때 투여될 수 있는 투여분량보다 더 많다.
특정 구체예들에 있어서, 제 2 화합물의 공동-투여는 제 1 화합물의 효과를 강화시켜, 화합물들의 공동-투여가 제 1 화합물 단독 투여 효과보다 더 큰 효과를 야기한다. 다른 구체예들에 있어서, 공동-투여는 단독으로 투여되었을 때 화합물의 효과의 부가적인 효과를 야기한다. 특정 구체예들에 있어서, 공동-투여는 단독으로 투여되었을 때 화합물의 효과의 부가적인 효과 이상을 야기한다. 특정 구체예들에 있어서, 제 1 화합물은 안티센스 화합물이다. 특정 구체예들에 있어서, 제 2 화합물은 안티센스 화합물이다.
실시예들
비-제한적 설명 및 참고자료의 편입
본 명세서에서 설명된 특정 화합물들, 조성물, 그리고 방법들은 특정 구체예들에 따라 특이적으로 설명되지만, 다음의 실시예들은 본 명세서에서 설명된 화합물들 설명하기 위한 의도이며, 이에 제한시키고자 함은 아니다. 본 출원에서 언급된 각 참고자료는 이의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.
실시예 1:
HepG2 세포에서 인간 C9ORF72의 안티센스 저해
안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 핵산을 표적화하도록 기획되었으며, 그리고 시험관내에서 C9ORF72 mRNA에 대한 이들의 효과가 테스트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유사한 배양 조건을 가진 일련의 실험에서 테스트되었다. 각 실험의 결과는 하기 별도 표에서 제시된다. 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배양된 HepG2 세포에는 전기천공을 이용하여 7,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드가 트랜스펙션되었다. 처리 후 대략 24 시간 시점에서 세포로부터 RNA가 단리되었고, C9ORF72 mRNA 수준은 정량적 실-시간 PCR에 의해 측정되었다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3750 (포워드 서열 TGTGACAGTTGGAATGCAGTGA, 본 명세서에서 서열 번호: 15로 지정됨; 역 서열 GCCACTTAAAGCAATCTCTGTCTTG, 본 명세서에서 서열 번호: 16으로 지정됨; 프로브 서열 TCGACTCTTTGCCCACCGCCA, 본 명세서에서 서열 번호: 17로 지정됨)를 이용하여 mRNA 수준이 측정되었다. C9ORF72 mRNA 수준은 RIBOGREEN®에 의해 측정되었을 때 전체 RNA 함량에 따라 조정되었다. 결과는 처리안된 대조군 세포와 비교하여 C9ORF72의 저해 %로 제시된다.
표 6-10에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5-10-5 MOE 갭머로 기획되었다. 이들 갭머는 길이가 20개의 뉴클레오시드이며, 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각 5개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 5' 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드와 3' 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 MOE 변형을 보유한다. 각 갭머에서 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지다. 각 갭머의 모든 시토신 잔기들은 5-메틸시토신이다. "시작 부위"는 인간 유전자 서열에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 5'-가장끝 뉴클레오시드를 가리킨다. "종료 부위"는 인간 유전자 서열에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 3'-가장끝 뉴클레오시드를 가리킨다. 표 6-10에서 각 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 mRNA 서열, 본 명세서에서 서열 번호: 1로 지정됨(GENBANK 수탁 번호. NM_001256054.1) 또는 인간 C9ORF72 게놈 서열, 본 명세서에서 서열 번호: 2로 지정됨 (뉴클레오시드 27535000에서 27565000까지 절두된 GENBANK 수탁 번호. NT_008413.18의 보체), 또는 이 둘 모두를 표적으로 한다. 'n/a'는 특정 유전자 서열을 표적하지 못하였던 안티센스 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 표 10의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 3 (GENBANK 수탁 번호. BQ068108.1) 또는 서열 번호: 4 (GENBANK 수탁 번호. NM_018325.3)를 표적으로 한다.
하기 표 6-10에서 나타낸 것과 같이, 서열 번호 1의 핵염기들 90-647, 728-1541, 1598-1863, 1935-2146, 2232-2251, 2429-2576, 2632-2743, 2788-2807, 2860-2879, 2949-2968, 3062-3081, 3132-3151, 그리고 3250-3269가 포함된 서열 번호: 1을 표적으로 하는 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 50% 저해를 나타낸다. 이들 서열은 서열 번호: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 61, 62, 64, 66, 67, 72, 73, 75, 76, 81, 82, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 102, 103, 109, 111, 112, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 130, 131, 132, 133, 137, 139, 140, 141, 145, 146, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 174, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 188, 190, 192, 195, 197, 199, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 및 332를 포함한다. 서열 번호 1의 핵염기들 90-359, 430-479, 550-569, 617-647, 940-959, 1013-1033, 1446-1465, 1687-1706, 1844-1863, 1935-2007, 및 2679-2698를 표적으로 하는 것들이 포함된 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 70% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 32, 33, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 66, 67, 85, 96, 103, 117, 119, 154, 165, 168, 186, 320, 321, 324, 327, 328, 및 331을 포함한다. 핵염기들 90-265 및 310-329를 표적으로 하는 것들이 포함된 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 80% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 32, 33, 35, 40, 42, 및 321을 포함한다. 서열 번호 1의 핵염기들 190-209 및 310-329를 표적으로 하는 것들이 포함된 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 90% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 40 및 321을 포함한다.
하기 표 6-20에서 나타낸 것과 같이, 서열 번호: 2의 핵염기들 1552-1572, 2187-2238, 2728-2779, 3452-2471, 3752-3771, 5025-5044, 5656-5675, 6200-6219, 7594-7613, 7840-8328, 9415-9434, 12526-12545, 13357-13524, 13642-13661, 13790-14130, 14243-14335, 14699-14777, 15587-15606, 16395-16488, 18233-18373, 24306-24340, 24472-24491, 24565-24676, 26400-26424, 26606-26982, 27054-27265, 27351-27370, 27548-27998, 28068-28087, 28181-28270, 및 28369-28388이 포함된 서열 번호: 2을 표적으로 하는 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 50% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 50, 51, 53, 55, 56, 57, 64, 67, 72, 73, 75, 76, 81, 82, 85, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 96, 97, 100, 102, 103, 111, 112, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 130, 131, 132, 133, 137, 139, 140, 141, 145, 146, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 165, 166, 168, 169, 170, 171, 174, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 188, 190, 192, 195, 197, 199, 205, 206, 208, 211, 212, 224, 226, 230, 231, 250, 251, 252, 256, 300, 301, 304, 306, 307, 310, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 및 332를 포함한다. 서열 번호 2의 핵염기들 3452-2471, 7840-8159, 8230-8249, 12526-12545, 13642-13661, 14075-14094, 14316-14335, 14758-14777, 16395-16414, 16469, 16488, 24655-24674, 26963, 26982, 27054-27126, 및 27798-27817을 표적으로 하는 것들이 포함된 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 70% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 32, 33, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 43, 44, 47, 67, 85, 96, 103, 117, 119, 154, 165, 168, 186, 251, 306, 320, 321, 324, 327, 328, 및 331을 포함한다. 서열 번호 2의 핵염기들 7848-8023을 표적으로 하는 것들이 포함된 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 80% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 32, 33, 35, 40, 42, 및 321을 포함한다. 서열 번호 2의 핵염기들 7870-7889 및 7990-8009를 표적으로 하는 것들이 포함된 몇몇 올리고뉴클레오티드는 최소한 90% 저해를 나타낸다. 이들은 서열 번호: 40 및 321을 포함한다.
실시예 2:
HepG2 세포에서 인간 C9ORF72의 투여분량-의존적 안티센스 저해
상기 연구로부터 시험관에서 C9ORF72 mRNA의 상당한 저해를 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 선별되었고, HepG2 세포 안에서 다양한 투여분량으로 테스트되었다. 유사한 실험 조건을 가진 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오티드들이 테스트되었다. 각 실험의 결과는 하기 별도 표에서 제시된다. 세포는 웰당 20,000개의 세포 밀도로 도말되었으며, 전기천공을 이용하여 82.3 nM, 246.9 nM, 740.7 nM, 2,222.2 nM, 6,666.7 nM, 또는 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션되었다. 처리 후 대략 16 시간 시점에서 세포로부터 RNA가 단리되었고, C9ORF72 mRNA 수준은 정량적 실-시간 PCR에 의해 측정되었다. 인간 C9ORF72 프라이머 프로브 세트 RTS3750을 이용하여 mRNA 수준이 측정되었다. C9ORF72 mRNA 수준은 RIBOGREEN®의해 측정되었을 때 전체 RNA 함량에 따라 조정되었다. 결과는 처리안된 대조군 세포와 비교하여 C9ORF72의 저해 %로 제시된다.
각 올리고뉴클레오티드의 최대 저해 농도의 절반 (IC50)이 표 11-13에서 또한 제시된다. 설명된 것과 같이, C9ORF72 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리된 세포에서 투여분량-의존적 방식으로 감소되었다.
실시예 3:
HepG2 세포에서 인간 C9ORF72의 투여분량-의존적 안티센스 저해
상기 연구로부터 시험관에서 C9ORF72 mRNA의 상당한 저해를 나타내는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 선별되었고, HepG2 세포 안에서 다양한 투여분량으로 테스트되었다. 유사한 실험 조건을 가진 일련의 실험에서 안티센스 올리고뉴클레오티드들이 테스트되었다. 각 실험의 결과는 하기 별도 표에서 제시된다. 세포는 웰당 20,000개의 세포 밀도로 도말되었으며, 전기천공을 이용하여 246.9 nM, 740.7 nM, 2,222.2 nM, 6,666.7 nM, 또는 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션되었다. 처리 후 대략 16 시간 시점에서 세포로부터 RNA가 단리되었고, C9ORF72 전체 mRNA 수준, 뿐만 아니라, 엑손 1 전사체의 mRNA 수준은 정량적 실-시간 PCR에 의해 측정되었다. 인간 C9ORF72 프라이머 프로브 세트 RTS3750을 이용하여 전체 C9ORF72 mRNA 수준이 측정되었다. 프라이머 프로브 세트 RTS3905 (포워드 서열 GGGTCTAGCAAGAGCAGGTG, 본 명세서에서 서열 번호: 18로 지정됨; 역 서열 GTCTTGGCAACAGCTGGAGAT, 본 명세서에서 서열 번호: 19로 지정됨; 프로브 서열 TGATGTCGACTCTTTGCCCACCGC, 본 명세서에서 서열 번호: 20으로 지정됨)를 이용하여 엑손 1 메세지 전사체가 측정되었다. C9ORF72 mRNA 수준은 RIBOGREEN®의해 측정되었을 때 전체 RNA 함량에 따라 조정되었다. 결과는 처리안된 대조군 세포와 비교하여 C9ORF72의 저해 %로 제시된다.
각 올리고뉴클레오티드의 최대 저해 농도의 절반 (IC50) 이 표 14와 15에서 또한 제시된다. 설명된 것과 같이, C9ORF72 mRNA 수준은 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리된 세포에서 투여분량-의존적 방식으로 감소되었다. 'n.d.'는 특정 투여분량에 대한 데이터가 없음을 나타낸다.
실시예 4
HepG2 세포에서 인간 C9ORF72의 안티센스 저해
안티센스 올리고뉴클레오티드는 C9ORF72 핵산의 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 표적하도록 기획되었고, 시험관에서 C9ORF72 mRNA에 있어서의 이들 효과가 테스트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 유사한 배양 조건을 가진 일련의 실험에서 테스트되었다. 각 실험의 결과는 하기 별도 표에서 제시된다. ISIS 576816 및 ISIS 577065는 비교용으로 이들 분석에 포함되었다. 웰당 35,000개 세포 밀도로 배양된 C9ORF72 섬유아세포에는 전기천공을 이용하여 7,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드가 트랜스펙션되었다. 처리 후 대략 24 시간 시점에서 세포로부터 RNA가 단리되었고, C9ORF72 mRNA 수준은 정량적 실-시간 PCR에 의해 측정되었다. 인간 프라이머 프로브 세트 RTS3750, RTS 3905, 또는 RTS4097 (포워드 서열 CAAGCCACCGTCTCACTCAA, 본 명세서에서 서열 번호: 24로 지정됨; 역 서열 GTAGTGCTGTCTACTCCAGAGAGTTACC, 본 명세서에서 서열 번호: 25로 지정됨; 프로브 서열 CTTGGCTTCCCTCAAAAGACTGGCTAATGT, 본 명세서에서 서열 번호: 26으로 지정됨)을 이용하여 mRNA 수준이 측정되었다. RTS3750은 mRNA 전사체의 엑손 2를 표적으로 하고, 따라서 전체 mRNA 전사체가 측정된다. RTS3905는 전사체가 포함된 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 표적으로 하고, 따라서 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA 전사체만 측정되었다. RTS4097은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부의 3' 부위에서 유전자 서열을 표적으로 한다. mRNA 수준은 RIBOGREEN®에 의해 측정되었을 때 전체 RNA 함량에 따라 조정되었다. 결과는 처리안된 대조군 세포와 비교하여 C9ORF72의 저해 %로 제시된다. 'n.d.'는 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 데이터가 없음을 나타낸다.
표 16의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 균일한 MOE 올리고뉴클레오티드, 또는 3-10-3 MOE, 4-10-3 MOE, 4-10-4 MOE, 5-10-4 MOE, 또는 5-10-5 MOE 갭머로 기획되었다. 균일한 MOE 올리고뉴클레오티드는 길이가 20개 뉴클레오시드이며, 이때 각 뉴클레오시드는 2'-MOE 기를 포함한다. 3-10-3 MOE 갭머는 길이가 16개의 뉴클레오시드이며 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각 3개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 4-10-3 갭머는 길이가 17개의 뉴클레오시드이며 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각각 4개와 3개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 4-10-4 갭머는 길이가 18개의 뉴클레오시드이며 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각각 4개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 5-10-4 갭머는 길이가 19개의 뉴클레오시드이며 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각각 5개와 4개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 5-10-5 갭머는 길이가 20개의 뉴클레오시드이며, 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각 5개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 5' 윙 세그먼트에서 각 뉴클레오시드와 3' 윙 세그먼트에서 각 뉴클레오시드는 2'-MOE 기를 포함한다. 각 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지다. 각 올리고뉴클레오티드의 모든 시토신 잔기들은 5-메틸시토신이다. "시작 부위"는 인간 유전자 서열에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 5'-가장끝 뉴클레오시드를 가리킨다. "종료 부위"는 인간 유전자 서열에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 3'-가장 끝 뉴클레오시드를 가리킨다. 표 16에 열거된 각 안티센스 올리고뉴클레오티드는 다음을 표적한다: 인간 C9ORF72 게놈 서열, 본 명세서에서 서열 번호: 2로 지정됨 (뉴클레오시드 27535000에서 27565000까지 절두된 GENBANK 수탁 번호. NT_008413.18의 보체) 또는 서열 번호: 13, 이는 C9ORF72 유전자의 인트론 1로부터 헥사뉴클레오티드 반복의 확장된 형태다.
데이터에서 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드는 헥사뉴클레오티드 반복이 포함된 C9ORF72 mRNA 전사체 수준을 선호적으로 저해한다는 것을 나타낸다.
실시예 5:
C9ORF72 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 생체내 설치류 저해 및 내성
생체내 C9ORF72 발현의 저해 내성을 평가하기 위하여, 뮤린 C9ORF72 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 기획하였으며, 마우스와 렛 모델에서 평가되었다.
ISIS 571883은 길이가 20개 뉴크렐오시드의 5-10-5 MOE 갭머로 기획되었으며, 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각 5개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 5' 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드와 3' 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 MOE 변형을 보유한다. 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지다. 갭머의 모든 시토신 잔기들은 5-메틸시토신이다. ISIS 571883은 뮤린 C9ORF72 게놈 서열, 본 명세서에서 서열 번호: 11로 지정됨 (뉴클레오시드 3587000에서 3625000까지 절두된 GENBANK 수탁 번호. NT_166289.1의 보체)에서 뉴클레오시드 33704의 표적 시작 부위를 보유한다.
ISIS 603538은 길이가 20개 뉴크렐오시드의 5-10-5 MOE 갭머로 기획되었으며, 이때 중앙의 갭 세그먼트는 10개의 2'-데옥시뉴클레오시드를 포함하며, 5' 단부와 3' 단부에 각 5개의 뉴클레오시드를 포함하는 윙 세그먼트가 측면에 있다. 5' 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드와 3' 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 MOE 변형을 보유한다. 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지 또는 인산염 에스테르 링키지다 (Gs Ao Co Co Gs Cs Ts Ts Gs As Gs Ts Ts Ts Gs Co Co Ao Cs A; 이때 's' 는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 링키지를 나타내고, 'o'는 인산염 에스테르 링키지를 나타내며; 그리고 A, G, C, T는 관련 뉴클레오시드를 나타낸다). 갭머의 모든 시토신 잔기들은 5-메틸시토신이다. ISIS 603538은 렛 C9ORF72 mRNA 서열, 본 명세서에서 서열 번호: 12로 지정됨 (GENBANK 수탁 번호. NM_001007702.1)에서 뉴클레오시드 2872의 표적 시작 부위를 보유한다.
마우스 실험 1
4마리의 C57BL/6 마우스 집단의 각 마우스에게 50 μg, 100 μg, 300 μg, 500 μg, 또는 700 μg의 ISIS 571883이 뇌실 볼루스 주사를 통하여 주사 투여되었다. 4마리의 C57/BL6 대조군 마우스도 PBS를 이용하여 유사하게 처리되었다. 동물은 3% 이소플로란으로 마취되었고, 정위(stereotactic) 프레임에 위치시켰다. 외과술 부위를 소독한 후, 각 마우스의 정수리점(bregma)으로부터 -0.2mm 전후로부터, 그리고 na d 정수리점에서 배복으로 3mm 지점에 Hamilton 주사기를 비용하여 전술한 투여분량의 ISIS 571883이 주사되었다. 절개는 봉합사로 봉합되었다. 마우스는 14일의 회복기를 가지며, 그 이후 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인한 인도적 프로토콜에 따라 동물들을 안락사시켰다. 뇌와 척수 조직이 수거되었으며, 액화 질소에서 스냅 냉동되었다. 냉동에 앞서, 뇌 조직은 마우스 뇌 매트릭스를 이용하여 횡으로 5개 조각으로 절단되었다.
RNA 분석
C9ORF72 mRNA 발현 분석을 위하여 주사 부위로부터 후방 2-3mm 뇌 단편, 뇌 전두 피질에서, 그리고 척수 조직의 요추 부분으로부터 RNA가 추출되었다. C9ORF72 mRNA 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 표 17에 데이터가 제시된다. ISIS 571883의 투여 분량을 증가시키면 C9ORF72 mRNA 발현은 투여분량-의존적으로 저해된다는 것이 결과에서 나타난다.
CNS 독성의 척도로써 소교세포(microglial) 표지 AIF-1의 유도가 또한 평가되었다. 표 18에 데이터가 제시된다. ISIS 571883의 투여분량을 증가시킨 처리는 AIF-1 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키지 못하였음이 이 결과에서 나타난다. 이런 이유로, ISIS 571883의 주사는 이 모델에서 내성있는 것으로 간주되었다.
마우스 실험 2
4 C57BL/6 마우스 집단의 각 마우스에게 500 μg의 ISIS 571883이 상기에서 설명된 것과 유사한 과정으로 뇌실 볼루스 주사를 통하여 주사 투여되었다. 4마리의 C57/BL6 대조군 마우스도 PBS를 이용하여 유사하게 처리되었다. ICV 투여 이후 정기적 시점에서 마우스들을 테스트하였다.
거동 분석
운동 행동을 평가하기 위한 2가지 표분 분석이 이용되었다; 로타로드 분석과 그립 강도 분석. 로타로드 분석의 경우, 떨어질 때까지의 대기시간이 측정되었다. 분석을 위한 데이터는 표 19와 20에 제시된다. ISIS 571883의 안티센스 저해 또는 ICV 주사로 인하여 마우스의 운동 행동에서 유의적인 변화가 없었음이 결과에서 나타난다. 이런 이유로, C9ORF72의 안티센스 저해는 이 모델에서 내성있는 것으로 간주되었다.
렛 실험
4 마리 Sprague-Dawley 집단의 각 렛에게 700 μg, 1,000 μg, 또는 3,000 μg의 ISIS 603538이 척수관내 볼루스 주사로 주사되었다. 4마리의 Sprague-Dawley 대조군 렛도 PBS를 이용하여 유사하게 처리되었다. 동물은 3% 이소플로란으로 마취되었고, 정위 프레임에 위치시켰다. 외과수술 부위 살균 후, 각 렛에게 8 cm 척수관내 카테테르 2 cm를 통하여 투여된 30 μL의 ASO 용액과 50 μL 플러쉬가 주사되었다. 렛은 4주일의 회복기를 가지며, 그 이후 Institutional Animal Care and Use Committee에서 승인한 인도적 프로토콜에 따라 동물들을 안락사시켰다.
RNA 분석
C9ORF72 mRNA 발현 분석을 위하여 주사 부위로부터 후방 2-3mm 뇌 단편, 뇌 전두 피질에서, 그리고 뇌와 척수 조직의 요추 부분으로부터 RNA가 추출되었다. C9ORF72 mRNA 발현은 RT-PCR에 의해 측정되었다. 표 21에 데이터가 제시된다.. ISIS 603538의 투여 분량을 증가시키면 C9ORF72 mRNA 발현은 투여분량-의존적으로 저해된다는 것이 결과에서 나타난다.
CNS 독성의 척도로써 소교세포 표지 AIF-1의 유도가 또한 평가되었다. 표 22에 데이터가 제시된다. ISIS 603538의 투여분량을 증가시킨 처리는 AIF-1 mRNA 발현을 유의적으로 증가시키지 못하였음이 이 결과에서 나타난다. 이런 이유로, ISIS 603538의 주사는 이 모델에서 내성있는 것으로 간주되었다.
체중 분석
렛의 체중은 정기적인 시간적 간격에서 측정되었다. 표 23에 데이터가 제시된다. ISIS 603538의 투여분량을 증가시킨 처리는 렛 체중의 임의적인 유의적 변화를 야기하지 못하였음이 이 결과에서 나타난다.
실시예 6:
2명의 환자 섬유아세포 계통에서 인간 C9ORF72 발현의 선호적 저해
인간 환자로부터 2가지 상이한 섬유아세포 계통 (F09-152 및 F09-229)은 엑손 1B 앞 C9ORF72 프레-mRNA 서열을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이를 테면 전사체가 포함된 핵사뉴클레오티드 반복 확장부를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 엑손 1의 하류를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 분석되었다. 각 올리고뉴클레오티드에서 서열 번호: 1과 2에 있어서 표적 시작 부위와 종료 부위 그리고 표적 영역은 표 24에 제공된다. ISIS 577061과 ISIS 577065는 표적 엑손 1B의 C9ORF72 상류와 헥사뉴클레오티드 반복의 바로 상류를 표적으로 한다. 표 24의 ISIS 올리고뉴클레오티드의 나머지는 엑손 1B의 C9ORF72 하류와 헥사뉴클레오티드 반복을 표적으로 한다.
세포는 웰당 20,000개의 세포 밀도로 도말되었으며, 전기천공을 이용하여 246.9 nM, 740.7 nM, 2,222.2 nM, 6,666.7 nM, 그리고 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션되었다. 처리 후 대략 16 시간 시점에서 세포로부터 RNA가 단리되었고, C9ORF72 mRNA 수준은 정량적 실-시간 PCR에 의해 측정되었다. 2가지 프라이머 프로브 세트가 이용되었다: (1) 인간 C9ORF72 프라이머 프로브 세트 RTS3750, 이는 전체 mRNA 수준을 측정하며, 그리고 (2) RTS3905, 이는 전사체가 포함된 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 표적으로 하며, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA 전사체만을 측정한다. C9ORF72 mRNA 수준은 RIBOGREEN®의해 측정되었을 때 전체 RNA 함량에 따라 조정되었다. 결과는 처리안된 대조군 세포와 비교하여 C9ORF72의 저해 %로 제시된다
하기 표 25에서 설명된 것과 같이, 엑손 1B의 상류를 표적으로 하고, 따라서 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA 전사체를 표적으로 하는 2개의 올리고뉴클레오티드 (ISIS 577061 및 ISIS 577065)는 C9ORF72의 전체 mRNA 수준을 저해하지 않고 (RTS3750에 의해 측정되었을 때) 뿐만 아니라 엑손 1B의 하류를 표적으로 하는 ISIS 576974, 576816, 및 577083은 엑손 1B의 하류를 표적으로 하고, 따라서 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA를 표적으로 하지 않는다. 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 C9ORF72 mRNA 전사체의 발현 수준은 낮고 (전체 C9ORF72 발현산물의 약 10 %), 따라서, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 하기 표 25에서 제시된 바와 같이 전체 C9ORF72 mRNA를 강력하게 저해하지 않는다(RTS3905에 의해 측정되었을 때). 따라서, ISIS 577061 및 ISIS 577065는 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA 전사체의 발현을 선호적으로 저해한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.
<120> COMPOSITIONS FOR MODULATING C9ORF72 EXPRESSION
<130> BIOL0211WO
<140> PCT/US2013/065073
<141> 2013-10-15
<150> 61/714,132
<151> 2012-10-15
<160> 369
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (203)..(1648)
<400> 1
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct gcccggttgc ttctcttttg 120
ggggcggggt ctagcaagag caggtgtggg tttaggagat atctccggag catttggata 180
atgtgacagt tggaatgcag tg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca 232
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro
1 5 10
gct gtt gcc aag aca gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta 280
Ala Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu
15 20 25
gca gct act ttt gct tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg 328
Ala Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg
30 35 40
cac att tgg gct cca aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa 376
His Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu
45 50 55
ata act ttt ctt gcc aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat 424
Ile Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn
60 65 70
gca gag agt ggt gct ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag 472
Ala Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys
75 80 85 90
gga gtg att att gtt tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat 520
Gly Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp
95 100 105
cgc agc aca tat gga cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt 568
Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser
110 115 120
ttc tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata 616
Phe Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile
125 130 135
atc cgg aaa gga aga ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc 664
Ile Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val
140 145 150
cag aag att atc tta gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag 712
Gln Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln
155 160 165 170
agt att att cca atg ctt act gga gaa gtg att cct gta atg gaa ctg 760
Ser Ile Ile Pro Met Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu
175 180 185
ctt tca tct atg aaa tca cac agt gtt cct gaa gaa ata gat ata gct 808
Leu Ser Ser Met Lys Ser His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala
190 195 200
gat aca gta ctc aat gat gat gat att ggt gac agc tgt cat gaa ggc 856
Asp Thr Val Leu Asn Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly
205 210 215
ttt ctt ctc aat gcc atc agc tca cac ttg caa acc tgt ggc tgt tcc 904
Phe Leu Leu Asn Ala Ile Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser
220 225 230
gtt gta gta ggt agc agt gca gag aaa gta aat aag ata gtc aga aca 952
Val Val Val Gly Ser Ser Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr
235 240 245 250
tta tgc ctt ttt ctg act cca gca gag aga aaa tgc tcc agg tta tgt 1000
Leu Cys Leu Phe Leu Thr Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys
255 260 265
gaa gca gaa tca tca ttt aaa tat gag tca ggg ctc ttt gta caa ggc 1048
Glu Ala Glu Ser Ser Phe Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly
270 275 280
ctg cta aag gat tca act gga agc ttt gtg ctg cct ttc cgg caa gtc 1096
Leu Leu Lys Asp Ser Thr Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val
285 290 295
atg tat gct cca tat ccc acc aca cac ata gat gtg gat gtc aat act 1144
Met Tyr Ala Pro Tyr Pro Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr
300 305 310
gtg aag cag atg cca ccc tgt cat gaa cat att tat aat cag cgt aga 1192
Val Lys Gln Met Pro Pro Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg
315 320 325 330
tac atg aga tcc gag ctg aca gcc ttc tgg aga gcc act tca gaa gaa 1240
Tyr Met Arg Ser Glu Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu
335 340 345
gac atg gct cag gat acg atc atc tac act gac gaa agc ttt act cct 1288
Asp Met Ala Gln Asp Thr Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro
350 355 360
gat ttg aat att ttt caa gat gtc tta cac aga gac act cta gtg aaa 1336
Asp Leu Asn Ile Phe Gln Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys
365 370 375
gcc ttc ctg gat cag gtc ttt cag ctg aaa cct ggc tta tct ctc aga 1384
Ala Phe Leu Asp Gln Val Phe Gln Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg
380 385 390
agt act ttc ctt gca cag ttt cta ctt gtc ctt cac aga aaa gcc ttg 1432
Ser Thr Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu Val Leu His Arg Lys Ala Leu
395 400 405 410
aca cta ata aaa tat ata gaa gac gat acg cag aag gga aaa aag ccc 1480
Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro
415 420 425
ttt aaa tct ctt cgg aac ctg aag ata gac ctt gat tta aca gca gag 1528
Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu
430 435 440
ggc gat ctt aac ata ata atg gct ctg gct gag aaa att aaa cca ggc 1576
Gly Asp Leu Asn Ile Ile Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly
445 450 455
cta cac tct ttt atc ttt gga aga cct ttc tac act agt gtg caa gaa 1624
Leu His Ser Phe Ile Phe Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu
460 465 470
cga gat gtt cta atg act ttt taa atgtgtaact taataagcct attccatcac 1678
Arg Asp Val Leu Met Thr Phe
475 480
aatcatgatc gctggtaaag tagctcagtg gtgtggggaa acgttcccct ggatcatact 1738
ccagaattct gctctcagca attgcagtta agtaagttac actacagttc tcacaagagc 1798
ctgtgagggg atgtcaggtg catcattaca ttgggtgtct cttttcctag atttatgctt 1858
ttgggataca gacctatgtt tacaatataa taaatattat tgctatcttt taaagatata 1918
ataataggat gtaaacttga ccacaactac tgtttttttg aaatacatga ttcatggttt 1978
acatgtgtca aggtgaaatc tgagttggct tttacagata gttgactttc tatcttttgg 2038
cattctttgg tgtgtagaat tactgtaata cttctgcaat caactgaaaa ctagagcctt 2098
taaatgattt caattccaca gaaagaaagt gagcttgaac ataggatgag ctttagaaag 2158
aaaattgatc aagcagatgt ttaattggaa ttgattatta gatcctactt tgtggattta 2218
gtccctggga ttcagtctgt agaaatgtct aatagttctc tatagtcctt gttcctggtg 2278
aaccacagtt agggtgtttt gtttatttta ttgttcttgc tattgttgat attctatgta 2338
gttgagctct gtaaaaggaa attgtatttt atgttttagt aattgttgcc aactttttaa 2398
attaattttc attatttttg agccaaattg aaatgtgcac ctcctgtgcc ttttttctcc 2458
ttagaaaatc taattacttg gaacaagttc agatttcact ggtcagtcat tttcatcttg 2518
ttttcttctt gctaagtctt accatgtacc tgctttggca atcattgcaa ctctgagatt 2578
ataaaatgcc ttagagaata tactaactaa taagatcttt ttttcagaaa cagaaaatag 2638
ttccttgagt acttccttct tgcatttctg cctatgtttt tgaagttgtt gctgtttgcc 2698
tgcaataggc tataaggaat agcaggagaa attttactga agtgctgttt tcctaggtgc 2758
tactttggca gagctaagtt atcttttgtt ttcttaatgc gtttggacca ttttgctggc 2818
tataaaataa ctgattaata taattctaac acaatgttga cattgtagtt acacaaacac 2878
aaataaatat tttatttaaa attctggaag taatataaaa gggaaaatat atttataaga 2938
aagggataaa ggtaatagag cccttctgcc ccccacccac caaatttaca caacaaaatg 2998
acatgttcga atgtgaaagg tcataatagc tttcccatca tgaatcagaa agatgtggac 3058
agcttgatgt tttagacaac cactgaacta gatgactgtt gtactgtagc tcagtcattt 3118
aaaaaatata taaatactac cttgtagtgt cccatactgt gttttttaca tggtagattc 3178
ttatttaagt gctaactggt tattttcttt ggctggttta ttgtactgtt atacagaatg 3238
taagttgtac agtgaaataa gttattaaag catgtgtaaa cattgttata tatcttttct 3298
cctaaatgga gaattttgaa taaaatatat ttgaaatttt g 3339
<210> 2
<211> 30001
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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tttctttggc tggtttattg tactgttata cagaatgtaa gttgtacagt gaaataagtt 28380
attaaagcat gtgtaaacat tgttatatat cttttctcct aaatggagaa ttttgaataa 28440
aatatatttg aaattttgcc tctttcagtt gttcattcag aaaaaaatac tatgatattt 28500
gaagactgat cagcttctgt tcagctgaca gtcatgctgg atctaaactt tttttaaaat 28560
taattttgtc ttttcaaaga aaaaatattt aaagaagctt tataatataa tcttatgtta 28620
aaaaaacttt ctgcttaact ctctggattt cattttgatt tttcaaatta tatattaata 28680
tttcaaatgt aaaatactat ttagataaat tgtttttaaa cattcttatt attataatat 28740
taatataacc taaactgaag ttattcatcc caggtatcta atacatgtat ccaaagtaaa 28800
aatccaagga atctgaacac tttcatctgc aaagctagga ataggtttga cattttcact 28860
ccaagaaaaa gttttttttt gaaaatagaa tagttgggat gagaggtttc tttaaaagaa 28920
gactaactga tcacattact atgattctca aagaagaaac caaaacttca tataatacta 28980
taaagtaaat ataaaatagt tccttctata gtatatttct ataatgctac agtttaaaca 29040
gatcactctt atataatact attttgattt tgatgtagaa ttgcacaaat tgatatttct 29100
cctatgatct gcagggtata gcttaaagta acaaaaacag tcaaccacct ccatttaaca 29160
cacagtaaca ctatgggact agttttatta cttccatttt acaaatgagg aaactaaagc 29220
ttaaagatgt gtaatacacc gcccaaggtc acacagctgg taaaggtgga tttcatccca 29280
gacagttaca gtcattgcca tgggcacagc tcctaactta gtaactccat gtaactggta 29340
ctcagtgtag ctgaattgaa aggagagtaa ggaagcaggt tttacaggtc tacttgcact 29400
attcagagcc cgagtgtgaa tccctgctgt gctgcttgga gaagttactt aacctatgca 29460
aggttcattt tgtaaatatt ggaaatggag tgataatacg tacttcacca gaggatttaa 29520
tgagacctta tacgatcctt agttcagtac ctgactagtg cttcataaat gctttttcat 29580
ccaatctgac aatctccagc ttgtaattgg ggcatttaga acatttaata tgattattgg 29640
catggtaggt taaagctgtc atcttgctgt tttctatttg ttctttttgt tttctcctta 29700
cttttggatt tttttattct actatgtctt ttctattgtc ttattaacta tactctttga 29760
tttattttag tggttgtttt agggttatac ctctttctaa tttaccagtt tataaccagt 29820
ttatatacta cttgacatat agcttaagaa acttactgtt gttgtctttt tgctgttatg 29880
gtcttaacgt ttttatttct acaaacatta taaactccac actttattgt tttttaattt 29940
tacttataca gtcaattatc ttttaaagat atttaaatat aaacattcaa aacaccccaa 30000
t 30001
<210> 3
<211> 1031
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
attcccggga tacgtaacct acggtgtccc gctaggaaag agaggtgcgt caaacagcga 60
caagttccgc ccacgtaaaa gatgacgctt ggtgtgtcag ccgtccctgc tgcccggttg 120
cttctctttt gggggcgggg tctagcaaga gcaggtgtgg gtttaggaga tatctccgga 180
gcatttggat aatgtgacag ttggaatgca gtgatgtcga ctctttgccc accgccatct 240
ccagctgttg ccaagacaga gattgcttta agtggcaaat cacctttatt agcagctact 300
tttgcttact gggacaatat tcttggtcct agagtaaggc acatttgggc tccaaagaca 360
gaacaggtac ttctcagtga tggagaaata acttttcttg ccaaccacac tctaaatgga 420
gaaatccttc gaaatgcaga gagtggtgct atagatgtaa agttttttgt cttgtctgaa 480
aagggagtga ttattgtttc attaatcttt gatggaaact ggaatgggga tcgcagcaca 540
tatggactat caattatact tccacagaca gaacttagtt tctacctccc acttcataga 600
gtgtgtgttg atagattaac acatataatc cggaaaggaa gaatatggat gcataaggaa 660
agacaagaaa aatgtccaga agattatctt agaaggcaca gagagaatgg aagatcaggg 720
tcagagtatt attccaatgc ttactggaga agtgattcct gtaatggaaa ctgctttcct 780
ctatgaaatt cccccgggtt cctggaggaa atagatatag gctgatacag ttacccaatg 840
atggatgaat attgggggac cgcctggtca ttgaaaggct ttcttttctc caggaaagaa 900
atttttttcc ttttccataa aaagcttggg aatggaagac aacaattccc attctttttt 960
tgcgttccac ccctatgtga caacagaaat ttttggggaa acaacaacga aaaaatttta 1020
tcccgcgcgc a 1031
<210> 4
<211> 3244
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (108)..(1553)
<400> 4
gggcggggct gcggttgcgg tgcctgcgcc cgcggcggcg gaggcgcagg cggtggcgag 60
tggatatctc cggagcattt ggataatgtg acagttggaa tgcagtg atg tcg act 116
Met Ser Thr
1
ctt tgc cca ccg cca tct cca gct gtt gcc aag aca gag att gct tta 164
Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu
5 10 15
agt ggc aaa tca cct tta tta gca gct act ttt gct tac tgg gac aat 212
Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn
20 25 30 35
att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct cca aag aca gaa cag 260
Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln
40 45 50
gta ctt ctc agt gat gga gaa ata act ttt ctt gcc aac cac act cta 308
Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu
55 60 65
aat gga gaa atc ctt cga aat gca gag agt ggt gct ata gat gta aag 356
Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys
70 75 80
ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga gtg att att gtt tca tta atc ttt 404
Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe
85 90 95
gat gga aac tgg aat ggg gat cgc agc aca tat gga cta tca att ata 452
Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile
100 105 110 115
ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt 500
Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys
120 125 130
gtt gat aga tta aca cat ata atc cgg aaa gga aga ata tgg atg cat 548
Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His
135 140 145
aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aag att atc tta gaa ggc aca gag 596
Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu
150 155 160
aga atg gaa gat cag ggt cag agt att att cca atg ctt act gga gaa 644
Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met Leu Thr Gly Glu
165 170 175
gtg att cct gta atg gaa ctg ctt tca tct atg aaa tca cac agt gtt 692
Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys Ser His Ser Val
180 185 190 195
cct gaa gaa ata gat ata gct gat aca gta ctc aat gat gat gat att 740
Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn Asp Asp Asp Ile
200 205 210
ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aat gcc atc agc tca cac 788
Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn Ala Ile Ser Ser His
215 220 225
ttg caa acc tgt ggc tgt tcc gtt gta gta ggt agc agt gca gag aaa 836
Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly Ser Ser Ala Glu Lys
230 235 240
gta aat aag ata gtc aga aca tta tgc ctt ttt ctg act cca gca gag 884
Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe Leu Thr Pro Ala Glu
245 250 255
aga aaa tgc tcc agg tta tgt gaa gca gaa tca tca ttt aaa tat gag 932
Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser Ser Phe Lys Tyr Glu
260 265 270 275
tca ggg ctc ttt gta caa ggc ctg cta aag gat tca act gga agc ttt 980
Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp Ser Thr Gly Ser Phe
280 285 290
gtg ctg cct ttc cgg caa gtc atg tat gct cca tat ccc acc aca cac 1028
Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro Tyr Pro Thr Thr His
295 300 305
ata gat gtg gat gtc aat act gtg aag cag atg cca ccc tgt cat gaa 1076
Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met Pro Pro Cys His Glu
310 315 320
cat att tat aat cag cgt aga tac atg aga tcc gag ctg aca gcc ttc 1124
His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser Glu Leu Thr Ala Phe
325 330 335
tgg aga gcc act tca gaa gaa gac atg gct cag gat acg atc atc tac 1172
Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln Asp Thr Ile Ile Tyr
340 345 350 355
act gac gaa agc ttt act cct gat ttg aat att ttt caa gat gtc tta 1220
Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile Phe Gln Asp Val Leu
360 365 370
cac aga gac act cta gtg aaa gcc ttc ctg gat cag gtc ttt cag ctg 1268
His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp Gln Val Phe Gln Leu
375 380 385
aaa cct ggc tta tct ctc aga agt act ttc ctt gca cag ttt cta ctt 1316
Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu Ala Gln Phe Leu Leu
390 395 400
gtc ctt cac aga aaa gcc ttg aca cta ata aaa tat ata gaa gac gat 1364
Val Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys Tyr Ile Glu Asp Asp
405 410 415
acg cag aag gga aaa aag ccc ttt aaa tct ctt cgg aac ctg aag ata 1412
Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu Arg Asn Leu Lys Ile
420 425 430 435
gac ctt gat tta aca gca gag ggc gat ctt aac ata ata atg gct ctg 1460
Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn Ile Ile Met Ala Leu
440 445 450
gct gag aaa att aaa cca ggc cta cac tct ttt atc ttt gga aga cct 1508
Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe Ile Phe Gly Arg Pro
455 460 465
ttc tac act agt gtg caa gaa cga gat gtt cta atg act ttt taa 1553
Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu Met Thr Phe
470 475 480
atgtgtaact taataagcct attccatcac aatcatgatc gctggtaaag tagctcagtg 1613
gtgtggggaa acgttcccct ggatcatact ccagaattct gctctcagca attgcagtta 1673
agtaagttac actacagttc tcacaagagc ctgtgagggg atgtcaggtg catcattaca 1733
ttgggtgtct cttttcctag atttatgctt ttgggataca gacctatgtt tacaatataa 1793
taaatattat tgctatcttt taaagatata ataataggat gtaaacttga ccacaactac 1853
tgtttttttg aaatacatga ttcatggttt acatgtgtca aggtgaaatc tgagttggct 1913
tttacagata gttgactttc tatcttttgg cattctttgg tgtgtagaat tactgtaata 1973
cttctgcaat caactgaaaa ctagagcctt taaatgattt caattccaca gaaagaaagt 2033
gagcttgaac ataggatgag ctttagaaag aaaattgatc aagcagatgt ttaattggaa 2093
ttgattatta gatcctactt tgtggattta gtccctggga ttcagtctgt agaaatgtct 2153
aatagttctc tatagtcctt gttcctggtg aaccacagtt agggtgtttt gtttatttta 2213
ttgttcttgc tattgttgat attctatgta gttgagctct gtaaaaggaa attgtatttt 2273
atgttttagt aattgttgcc aactttttaa attaattttc attatttttg agccaaattg 2333
aaatgtgcac ctcctgtgcc ttttttctcc ttagaaaatc taattacttg gaacaagttc 2393
agatttcact ggtcagtcat tttcatcttg ttttcttctt gctaagtctt accatgtacc 2453
tgctttggca atcattgcaa ctctgagatt ataaaatgcc ttagagaata tactaactaa 2513
taagatcttt ttttcagaaa cagaaaatag ttccttgagt acttccttct tgcatttctg 2573
cctatgtttt tgaagttgtt gctgtttgcc tgcaataggc tataaggaat agcaggagaa 2633
attttactga agtgctgttt tcctaggtgc tactttggca gagctaagtt atcttttgtt 2693
ttcttaatgc gtttggacca ttttgctggc tataaaataa ctgattaata taattctaac 2753
acaatgttga cattgtagtt acacaaacac aaataaatat tttatttaaa attctggaag 2813
taatataaaa gggaaaatat atttataaga aagggataaa ggtaatagag cccttctgcc 2873
ccccacccac caaatttaca caacaaaatg acatgttcga atgtgaaagg tcataatagc 2933
tttcccatca tgaatcagaa agatgtggac agcttgatgt tttagacaac cactgaacta 2993
gatgactgtt gtactgtagc tcagtcattt aaaaaatata taaatactac cttgtagtgt 3053
cccatactgt gttttttaca tggtagattc ttatttaagt gctaactggt tattttcttt 3113
ggctggttta ttgtactgtt atacagaatg taagttgtac agtgaaataa gttattaaag 3173
catgtgtaaa cattgttata tatcttttct cctaaatgga gaattttgaa taaaatatat 3233
ttgaaatttt g 3244
<210> 5
<211> 761
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (693)..(693)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (722)..(722)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
cacgaggctt tgatatttct tacaacgaat ttcatgtgta gacccactaa acagaagcta 60
taaaagttgc atggtcaaat aagtctgaga aagtctgcag atgatataat tcacctgaag 120
agtcacagta tgtagccaaa tgttaaaggt tttgagatgc catacagtaa atttaccaag 180
cattttctaa atttatttga ccacagaatc cctattttaa gcaacaactg ttacatccca 240
tggattccag gtgactaaag aatacttatt tcttaggata tgttttattg ataataacaa 300
ttaaaatttc agatatcttt cataagcaaa tcagtggtct ttttacttca tgttttaatg 360
ctaaaatatt ttcttttata gatagtcaga acattatgcc tttttctgac tccagcagag 420
agaaaatgct ccaggttatg tgaagcagaa tcatcattta aatatgagtc agggctcttt 480
gtacaaggcc tgctaaagga ttcaactgga agctttgtgc tgcctttccg gcaagtcatg 540
tatgctccat atcccaccac acacatagat gtggatgtca atactgtgaa gcagatgcca 600
ccctgtcatg aacatattta taatcagcgt agatacatga gatccgagct gacagccttc 660
tggagagcca cttcagaaga agacatggct cangatacga tcatctacac tgacgaaagc 720
tntactcctg atttgaatat ttttcaagat gtcttacaca g 761
<210> 6
<211> 1901
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (125)..(793)
<400> 6
acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc 60
cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc 120
agtg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca gct gtt gcc aag aca 169
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys Thr
1 5 10 15
gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta gca gct act ttt gct 217
Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe Ala
20 25 30
tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct cca 265
Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala Pro
35 40 45
aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa ata act ttt ctt gcc 313
Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu Ala
50 55 60
aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat gca gag agt ggt gct 361
Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly Ala
65 70 75
ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga gtg att att gtt 409
Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile Val
80 85 90 95
tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat cgc agc aca tat gga 457
Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr Gly
100 105 110
cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc tac ctc cca ctt 505
Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro Leu
115 120 125
cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata atc cgg aaa gga aga 553
His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly Arg
130 135 140
ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aag att atc tta 601
Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Ile Leu
145 150 155
gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag agt att att cca atg 649
Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro Met
160 165 170 175
ctt act gga gaa gtg att cct gta atg gaa ctg ctt tca tct atg aaa 697
Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ser Ser Met Lys
180 185 190
tca cac agt gtt cct gaa gaa ata gat ata gct gat aca gta ctc aat 745
Ser His Ser Val Pro Glu Glu Ile Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu Asn
195 200 205
gat gat gat att ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aag taa 793
Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Lys
210 215 220
gaatttttct tttcataaaa gctggatgaa gcagatacca tcttatgctc acctatgaca 853
agatttggaa gaaagaaaat aacagactgt ctacttagat tgttctaggg acattacgta 913
tttgaactgt tgcttaaatt tgtgttattt ttcactcatt atatttctat atatatttgg 973
tgttattcca tttgctattt aaagaaaccg agtttccatc ccagacaaga aatcatggcc 1033
ccttgcttga ttctggtttc ttgttttact tctcattaaa gctaacagaa tcctttcata 1093
ttaagttgta ctgtagatga acttaagtta tttaggcgta gaacaaaatt attcatattt 1153
atactgatct ttttccatcc agcagtggag tttagtactt aagagtttgt gcccttaaac 1213
cagactccct ggattaatgc tgtgtacccg tgggcaaggt gcctgaattc tctatacacc 1273
tatttcctca tctgtaaaat ggcaataata gtaatagtac ctaatgtgta gggttgttat 1333
aagcattgag taagataaat aatataaagc acttagaaca gtgcctggaa cataaaaaca 1393
cttaataata gctcatagct aacatttcct atttacattt cttctagaaa tagccagtat 1453
ttgttgagtg cctacatgtt agttccttta ctagttgctt tacatgtatt atcttatatt 1513
ctgttttaaa gtttcttcac agttacagat tttcatgaaa ttttactttt aataaaagag 1573
aagtaaaagt ataaagtatt cacttttatg ttcacagtct tttcctttag gctcatgatg 1633
gagtatcaga ggcatgagtg tgtttaacct aagagcctta atggcttgaa tcagaagcac 1693
tttagtcctg tatctgttca gtgtcagcct ttcatacatc attttaaatc ccatttgact 1753
ttaagtaagt cacttaatct ctctacatgt caatttcttc agctataaaa tgatggtatt 1813
tcaataaata aatacattaa ttaaatgata ttatactgac taattgggct gttttaaggc 1873
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1901
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<211> 562
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<221> misc_feature
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gacagagatt gctttaagtg gcaaatcacc tttattagca gctacntttt gcttactggg 180
acaatattct tggtcctaga gtaaggcaca tttgggctcc aaagacagaa caggtacttc 240
tcagtgatgg agaaataact tttcttgcca accacactct aaatggagaa atccttcgaa 300
atgcagagag tggtgctata gatgtaaagt tttttgtctt gtctgaaaag ggagtgatta 360
ttgtttcatt aatctttgat ggaaactgga atggggatcg cagcacatat ggactatcaa 420
ttatacttcc acagacagaa cttagtttct acctcccact tcatagagtg tgtgttgata 480
gattaacaca tataatccgg aaaggaagaa tatggatgca taaggaaaga caagaaaatg 540
tccagaagat tatcttagaa gg 562
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<211> 798
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (81)..(590)
<400> 8
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gtgacagttg gaatgcagtg atg tcg act ctt tgc cca ccg cca tct cca gct 113
Met Ser Thr Leu Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala
1 5 10
gtt gcc aag aca gag att gct tta agt ggc aaa tca cct tta tta gca 161
Val Ala Lys Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Lys Ser Pro Leu Leu Ala
15 20 25
gct act ttt gct tac tgg gac aat att ctt ggt cct aga gta agg cac 209
Ala Thr Phe Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His
30 35 40
att tgg gct cca aag aca gaa cag gta ctt ctc agt gat gga gaa ata 257
Ile Trp Ala Pro Lys Thr Glu Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile
45 50 55
act ttt ctt gcc aac cac act cta aat gga gaa atc ctt cga aat gca 305
Thr Phe Leu Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala
60 65 70 75
gag agt ggt gct ata gat gta aag ttt ttt gtc ttg tct gaa aag gga 353
Glu Ser Gly Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly
80 85 90
gtg att att gtt tca tta atc ttt gat gga aac tgg aat ggg gat cgc 401
Val Ile Ile Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg
95 100 105
agc aca tat gga cta tca att ata ctt cca cag aca gaa ctt agt ttc 449
Ser Thr Tyr Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe
110 115 120
tac ctc cca ctt cat aga gtg tgt gtt gat aga tta aca cat ata atc 497
Tyr Leu Pro Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile
125 130 135
cgg aaa gga aga ata tgg atg cat aag gaa aga caa gaa aat gtc cag 545
Arg Lys Gly Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln
140 145 150 155
aag att atc tta gaa ggc aca gag aga atg gaa gat cag ggt cag 590
Lys Ile Ile Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln
160 165 170
agtattattc caatgcttac tggagaagtg attcctgtaa tgggactgct ttcatctatg 650
aaatcacaca gtgttcctga agaaatagat atagctgata cagtactcca tgatgatgat 710
atttggtgac agctgtcatg aaaggctttc ttctcaagta ggaatttttt cttttcataa 770
aagctgggat gaagccagat tcccatct 798
<210> 9
<211> 169
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgatgcttg gtgtgtcagc cgtccctgct 60
gcccggttgc ttctcttttg ggggcggggt ctagcaagag cagatatctc cggagcattt 120
ggataatgtg acagttggaa tgcggtgatg tcgactcttt gcccaccgc 169
<210> 10
<211> 176
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 10
aaaacgtcat cgcacataga aaacagacag acgtaaccta cggtgtcccg ctaggaaaga 60
gaggtgcgtc aaacagcgac aagttccgcc cacgtaaaag atgacgcttg atatctccgg 120
agcatttgga taatgtgaca gttggaatgc agtgatgtcg actctttgcc caccgc 176
<210> 11
<211> 38001
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
caaacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacactgg 60
catatcaagt ctctgttagg ctaggcgcat cctctcccac tgaggtcaga caagactgcc 120
cagctagaag aacatatccc acggacaggc aacagctttt gggacagcca cgctccagtt 180
gtttgggact cataaaagac taaactcaca cctgctacaa aagtgcaggg aggcctaggt 240
ccagcctgtg tgtgctcttt gcttagtggt gtctctgaga gccctaagga tcaaagtttg 300
ttgactctgt tggtcttcct gtggagttcc tatccccttc gtccccctcc ccaccctgca 360
atctttccct caactcttct ttaggcctgg tggtggtggt gtggtggcat ggaggaggtg 420
gtggaggggg tgggggtctt taatcccggt tcttgtgaga ccgaagcagg gacgatttcg 480
gagctctgtg agtttgaggc cagcctggtc tatagatcta gttccaggac agtcagagct 540
acatagagaa accctgcccc gagggggggg gggcgcgggg aatggttaaa gattattgca 600
ggacccagct gatctgtgga agaggtaacg ggtgtttatg tttttcgaaa ctcattgaac 660
aatgcacttc aattgtgcgc actttagaaa tataaagcca ccacgcgaaa agctgcgccc 720
caacttaaag gcaatttcca aggtacttct gggtccttgc ggttcagtgg ctgtctaggt 780
tcagaaacga aactggatcc ccgccccgcc cccccgcccc ccccctcccc agcgccctga 840
ggcagtttcg atttcctatg gccagccggc taggcagctt tttcatcggg actccttgga 900
aagtccccac ttcgttcatc tctggcggat ttgcgggagc cagggcgctc atcgatcgcc 960
tggagccaca gaatgacagc ggagcagcgg cagaatctgc aagcattcag agactatatc 1020
aagaagattc tggaccccac ctacatcctc agctacatga gttcctggct cgaggatggt 1080
gagtggtccc caactggggc tctcaggctc tccaccttag cgaggggaaa acatcactca 1140
gatcagaaac aattgaaggc tctgcccccc cccctccccc gcgctgtcct taagttaatt 1200
tgtgtaaccc ggtgtatgtg agactcccag gccatattag agtagacagc atagggattt 1260
gatggtcagg aacaaaattc ctgcaagctg tagtaacttg cataaggatg ccactctttt 1320
ctttctttca atgctgggga aatagtttgt ttctcttatt tacaccttct agactgctgt 1380
gtgcctccct ttgtcctgtc atgagaaact gagaaatcag aatgcgcccg cccctcctta 1440
gattcctgta cagagcaaag agcaaggctt tgggctcggg ccaaaggtgg aggtgggggc 1500
cgcaggaagc aagaggactg actgacacgc acatttctgt caaaggatgt tgctcacagg 1560
aagtccgtgg aagaaaactt tctccagact ccgtgtgttc agagtttaac acagttgttc 1620
atatctagct ttggggattt gattggtgga taatagactc tttgtaaatt gcactgggtg 1680
tttccacctg agcaaacaga cctccccacc tcacccccac ccccagggag aagggagagg 1740
gcgtttgaag gggtgaccga gggcgtgcgg cagctacttt tcattttgcc agttaaagcc 1800
tagatgtctt tcctggcgtt ggacgacggt ggcaactgca ggttaattct gactctcttg 1860
agttccgaag cctaacaggc tatgcagaga ggagtaaaag agcactaccc agggctaccc 1920
acatcccggt tgtgttagag agaagcagca aaaaagccct aatgattggg ggcggggtct 1980
gaggagagga aacccaccca agaggtttct taacaccagg gtcacttgcc tttcaatcct 2040
ttaatctgat ctttagtcat ttacattagc atacaaagta actagtttca atactgaaac 2100
aaagtaacta gtttgttcag ccattcctgc cattgctctt tgttcttatt taattgcctc 2160
ttctgtggct cttccacccc ctttacctgt ccctctctgg atgccctccc ccccaaatgg 2220
taccccgttc tgctttctta taacatgagg ttcatcacac tccctccctc cctccctccc 2280
ccatttaaag tatcatcctt tcctctcagg gtgcctgttt tagtttcatg aattttaggg 2340
ttttggtttt ttgtctgttt agttatgaga tttttttaaa aatgtggatt atgttgaatt 2400
tgtagattgt tcttggtgct agaggccttt ttatagtatt atttccaccc atcttgggag 2460
atctttctga aatcttccag tgtcttcaag aatttttttt tcccactgcc ttagaagttt 2520
gcattgtagc tatcgttcac ctctttggtt agggtttgtt gttatttgtt tgtttgaggc 2580
tattgtgaat agaactccct ccttccccca tatctttctg ggccaggttg ttcttagtat 2640
gtaagtaagc tactggtttc tgtatgttta tttagaaccc tgcctcttgg ttgacttttt 2700
atgagggctg agagtttgtg gtagtctttg gggggtcttt ataggattat ataagaatca 2760
tttgactcat tcctttccta tttgtctaac ttttgtttgt ttgtttgttt gtttttttga 2820
gacagggttt ctctgtatag ccctggcagt cctggaactc actttgtaga ccaggctggc 2880
ctcgaactca gaaatctgcc tgcctctgcc tcccgagtgc tgggattaaa ggcgtgcacc 2940
accacacccg gccatcattt ccaagttaaa gatttgatct acattagacg ccgccacgca 3000
gaaaaccttg agacttggtg gaaaggccaa aggccattaa aataaatttt cttttttctt 3060
tcttccattc tttcctttat tccttccttc ctttcttttt gttttctttc ttttcttttt 3120
cctttttcct gagacagggt ttctctgtat agccctggca tcctggaact cactctgtag 3180
accaggctgg cctcgaactc agaaatccac cagcctttgc ctcccaagtg ttgggattaa 3240
aggcattcgc caccactgcc caaatatttt atttatttat ttatttattt atttttatat 3300
atgtgatgag tacactggaa attccatcaa aaagagcagg tttgactggt gtcactagat 3360
ttactattga tagggatccc taaaggagag ctaaggtaaa gggctctccc tctcctaggt 3420
cttctgcata ccttccttga gtgttctggg ccagatctcc taagctctaa gaatgtgctg 3480
aaaacacact gggaactggc tccctccttg ggaatttgta ctccctctgc tgtgggaaac 3540
ttggatataa gaggctacag gaggacagtg agttataccc caggcacaga gttagcgtgt 3600
acattcaaaa cgcataccat tttgaaagta gcagctgcta gcatttcctg tcacctggtc 3660
aacctggtct ctttagctgc cccacccctt ccacttttct gctgtgtttc ttttactctc 3720
ttagcaaaaa ttggaatgaa agaccacaaa tgtatttgta attcaaaatg cttgctgcat 3780
cagctatact cgttactgtt gccatagggc gttcattccc acccaccccc aaccccttag 3840
tccagcagtt gcttcagagt tttgaagaag aggaggaagc ctttcttctt ccatgtgaca 3900
ccctccactg cgacttctgc ttactgtggg gaacttgagt ggaggacggg agtgtgcata 3960
gatgaaagag tggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga gtggaggacg ggagtgtgca 4020
tacatgaagg agtggaggac gggagtgtgc atacatgaag gagtggagga cgggagtgtg 4080
catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga aggagtggag gatgggagtg 4140
tgcatacatg aaggagtgga ggacgggagt gtgcatacat gaaggagtgg aggacgggag 4200
tgtgcataca tgaaggagag gaggacggga gtgtgcatag atgaaggaga ggaggacggg 4260
agtgtgcata gatgaaggag aggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga gaggaggacg 4320
ggagtgtgca tagatgaagg agaggaggac gggagtgtgc atagatgaag gagtggagga 4380
cgggagtgtg catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga aggagtggag 4440
gacgggagtg tgcatacatg aaggagtgga ggacgggagt gtgcatacat gaaggagtgg 4500
aggacgggag tgtgcataca tgaaggagag gaggacggga gtgtgcatag atgaaggaga 4560
ggaggacggg agtgtgcata gatgaaggag aggaggacgg gagtgtgcat agatgaagga 4620
gaggaggacg ggagtgtgca tacatgaagg aaaggaggac gggagtgtgc atagatgaag 4680
gagtggagga cgggagtgtg catacatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga 4740
aggagtggag gacgggagtg tgcatatgaa ggagtggagg acgggagtgt gcatacatga 4800
aggagtggag gacgggagtg tgcatagatg aaggagagga ggacgggagt gtgcatagat 4860
gaaggagagg aggacgggag agtgcataga tgaaggagtg gaggacggga gtgtgcatac 4920
atgaaggagt ggaggacggg agtgtgcata catgaaggag tggaggacgg gagtgtgcat 4980
agatgaagga gaggaggacg ggagtgtgca tagatgaagg agaggaggac gggagagtgc 5040
atagatgaag gagtggagga cgggagtgtg catagatgaa ggagtggagg acgagagtgt 5100
gcatacatga aggagtggag gacgggagtg tgcgaggatg gatgagtgga gtctgctgcc 5160
tctcaaaggt cttctggttc catgagttgt tatgactccc agacccacat gggaaggtct 5220
ggtctgttat cttccagtga ctagtgcttc tgcaggctac tcacttgccc ttgcttctgt 5280
ttgcagagga ggtgcagtac attcaggctg agaagaacaa caagggccca atggaagctg 5340
cctcactctt cctccagtac ctgttgaagc tgcagtcaga gggctggttc caggcctttt 5400
tggatgccct gtaccatgca ggttggttcc ttcttcttcc tcacagttca gagtacttca 5460
ctctgctgcc tcagaaggct gaggggagaa aagtgactcg ttctgtgaca tctgtgtgtg 5520
gcttctgcct caggcgggaa atgtaaagac tattttgaat cagataagag aatggtttat 5580
accagaaata tccaaagcaa tctacagagt tgtaactact aggagaggtg acaatattag 5640
tagcatgccg gtatctttca agaggagaac gagtaaataa atcggtttta taatgtttac 5700
agtgctccat tatactgcaa tgaagcgtgt ggacatgtct gtaaatgaca acccagctga 5760
actgtaggca cgcagcattt aaatttgaat atcataaact ataatagcta taaagttcca 5820
catgagtcaa actaaacata tagggaagga aactggatct tgggcgaccc tggctgacca 5880
gtcctgggga gtaagcttaa taaactctcc ctgtctgact gagatcggtg tcctgtggtt 5940
tgtgaggcaa ttcctggact ctaacactta ggcaattaca tttcttgccc ctctgccact 6000
ctagcttatt cactggtgaa agaaggagaa tactttagtg ttaccaacaa tggggggggg 6060
ggggcggggg atgggaaatg ggaaaaagca ggcccggccc agtgtagtaa gaaagaaaca 6120
ccaaagaaag ccaagggctc ctgttgcttt cattgtattg gagtgtttgt cagtcggctg 6180
ggggatgggg tggggggtgg ggaagcacac ctttaatccc agctctgggg aggcagaggc 6240
aggcagatcc ctgtgagctc caccagtcat ggctggcctc agcaagaact gtatccatca 6300
catcctaaca caggtgtgtt gaattaacat ggtactgtta aagcaaacac gctgccttcc 6360
tcgggtgctg cggtccctag gaagccacac attggcagca tgttggcagc agttgtataa 6420
aaactaatgc ttttttttcc ttttcttttt aattcggtaa aagggtttaa atgtcatttg 6480
ttataaaact tggtttcctg ctatttccag gattaacaat tgacttattc tttctatttc 6540
ctgctttata gaccatcatt ttgatacatt atctatttgc atctcagtga tacatgctta 6600
tcttaccctt ttatttcgtt ttaagaattg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 6660
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtctgagag tgggcatgca tttatgagtg cattgcctag 6720
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tgggatctga ccccagtccc ctgcaagaac acgatgaacc ttacttgcta agccatctcc 6840
ccagccctta gctgttgcag ttactctcca ttccaaataa gccctggcaa tgaaaacaag 6900
acttaattca tatgaataca tgctgtgcac ctagattggg cagatctacc gctacactac 6960
catcttctcc atctatgaga ctcccccttt tttttttctt tttttctttt ttgtggtttt 7020
ggttttttga gacagggttt ctctgtatag ccctggctgt cctggaactc actttgtaga 7080
ccaggctggc ctcgaactca gaaatccgcc tgcctctgcc tcccaagtgc tgggaattaa 7140
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tcctctgtgg tatcctctcc ctcttcctct ttctccttct ctcttcccac cttcctctcc 7260
aacttccctt tatcagccca atcaccagct ctcctttatt ttactaattg aggtgggaag 7320
caggtttaca ggaaatcacc ggagtgctga ctcattcctt gttcgcagcc actcaatgca 7380
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atcaaatggc ccagcagggg atcaagagaa aaggaaactc aacttctgct tattttcctc 7500
atctcttatg tagccccatc agagaagctg ttgttttcct tttgtgggct ctaactaatt 7560
tgaatattat atttaagatc tattctctta agtaaaaatg gcacagctaa ctttaactgt 7620
aaaattatat gaggtttact aggaaaagtc ttgagtttaa gcaagaaagg gaattttaaa 7680
acatttgtat tggaacataa gtgctggaac atctctcttt gcaagtgagg tgctttgtgt 7740
gtacaaccct aagagtttct tttttttttt tttttaattt atttacttca tatttcagac 7800
agatctcatt tcaggtggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggatttga actcaggacc 7860
tctggaagag cagtcagtgc tcctctgcgc tgagccatct ctccagcccc cctaagagtt 7920
tcataaagga atagtctgca ttaataaatt cagaaaaggc tcagaatata aagccaatat 7980
catcaagtag gtttccagtt tatgtattaa caaataatgc aaaaaagatt ttaagcaagc 8040
gattcctttt ataacagcac caagaacaat aaagttagga atgccagtgc tcctaactgc 8100
tgaaccacct cagcaatgca aacttttaca tcttagcact aagtccagct cctaattcgt 8160
gaatgtaaga tgtcattcat gtccgtgtcc ctatggttcg tttcagaagt ggtttatggt 8220
cttcgggtca taggtctttc ccctgctcag ctttgcttat tcctaacttt atttaaagtt 8280
ctcactgttg ttataaaagg aatcacttgg ggctggcgag atggctcagt gggtaagagc 8340
acccgactgc tcttccgaag gtcctgagtt caaatcccag caaccacatg gtggctcaca 8400
accatccgta acgagatctg actccctctt ctggagtgtc ggaagacagc tacagtgtat 8460
ttacatataa taaataaata aataaataaa tcttcaaaaa aattctaaaa aaatatggaa 8520
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taatcccagc acttgggtgg cagaggcagg cggatttcta agtttgaggt ctacaaagtg 8640
agttccaggt ctctgaaaac cacaaaaaaa aaaaaaaaaa atagcactgg ctgctcttcc 8700
gaaggttctg agttcaaatc cctccaacca catagtggct cacaaccata tgtaatggga 8760
tctgatgccc tcttctggtg tgtctgaaga cagtaacagt gtacttacat ataataaata 8820
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actacagtgt acttacatat aatagataaa taaatcttta aaaaaatcaa taaatgaaag 8940
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aggattgttt gtttattaaa caggaataga aaaatttact ctcaaatttg tatgaaatct 9060
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gtaaactctg aaggatatgg ccaaaggttc ttcaacaagg gtaccatgac cacccaaaag 9240
ggggaaaaaa aacccagtcc ctttaatatg aaaatacatt ggggtaagtg ggtatacata 9300
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cacattcatg ttttgagtgc ttggtcccca gcttgtgggg ttttaggagg tagagcctag 9420
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atagggtcat gctgctacac ttggcttttt acatgatagc tggggacagg aactcaggtc 9660
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attgttttag ttttttgggt ctataggggg gagaaaaaaa aaaaaaccac attgtcttcc 9780
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tttgcccatt gacttaatct tttcttggaa tggtgtggaa ggaaacactt ttcaagggca 9960
ggatgtaaga tttgtatttc ctctggtctt ctttactgtt tcctcttgag aagataaaca 10020
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cacccccttc caaaaaaaaa aaaaaaagat tctaagctgt aagctgttat ttgtgtttat 13920
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taatgaatgt gggtgtttac catgtgcgtg tcgtgcccac agagtccagg aagggggcat 27900
gacatgccct ggaactggag ttaacagaca gttgtaagtt gccatgtagg tgctgggaat 27960
tgaactcagg tcctctggaa gaacaaccag tgctcttaac caccgagcca tctctccagc 28020
cccctttgct gtgttttatt agcattttgt catttttagt atagaggtcc tgcatacatt 28080
ttgttagatt catacctagg tattaatttt agtgttgtca ttccgaaatt gtactttcaa 28140
atatttctca ctgtgggcta ggaagacatc tcagtaaagt gtctaaagta caggcatcag 28200
gacctggctt ccagcaacct ggtaaaaaag ccgagtacag tagagtactc ttgtaatccc 28260
agccctgggg acagagataa gcacaaccct aactggcaat gcccaggtcc cagggagtta 28320
ctcattactc agtcttaggc agaacgaagg tgggtggctg ttaagaaatg atacctaggg 28380
ctggtgagat ggctcagtgg gtaagagcac ctgactgctc ttccgaaggt ccagagttca 28440
aatcccagca accacatggt ggctcacaac catccgtaac gagatctgac tccctcttct 28500
ggtgtgtctg aagacagcta cagtgtactt acatataata aataaataaa tctttaaaaa 28560
aaaaaaaaaa aaaaaagaaa tgatacctga ggttgacctc cacatgcatg tacacacaca 28620
cacacacaca cacatgcgtg cgtggacata ctcccctcca acacagtcag ccatgtacac 28680
ctccacacaa cacacagttc ttccaattgc agctgtctgc tgatatttac tgtgtaatta 28740
atttacatgg attgatcttt caccttaaag ccttgctaaa tttcacttac tctatgtctg 28800
aagcttgtct ttttaatcac ttaaaatatc tcctacatta agccataatg aggcagagtt 28860
ctatatcact agcatcaatt gttgtttgga atttaggatt tgccagtctg aaatccattt 28920
ttatctttag ttgtattctc tttttgcata tacatccatt atatcaaatt gatgtgaggt 28980
ttaaagttta caagtggtgt ctaactggcc gttgcttttc acttttaggc tctgaagaaa 29040
tggattgaag aaaatcctgc actaagcttt ctaaagcctg gcatactgac tgggcgtggc 29100
agaacaaacc gggcaacagg tatttatgtc tattgaatta gatttagtat actatgtata 29160
taaaatgtat aaacactaca ttgttttagt gtttctatca gtcagagctc aaccagagaa 29220
ataaagctac tagattatgc atatgtatgt ggtatatatg taagtatgta tgcttatttg 29280
tttgtttgtt tatttatgta cttagagata gggtttctct gtgtaaccct tgctctcctg 29340
gaactcactc tgtggaccag gctggccttg aattcagaaa tccgcctgcc tctgcctccc 29400
gagtgctggg attaaaggtg tgcgccacca ctgcctggcc tatactgtta ttctttaccc 29460
agtagatttt ttttccccat ctactgcctc tttaatagtt ttaaaaaaac agtccaggca 29520
atcctgaact ctagctagtg tggtctaggg aggaaggtta tcatttccca taagaaccct 29580
atgtggctag ctctcatcac agctacgtcc caagtcatat ctcacgactg tatgacctgc 29640
cctcgctgtt cttcctgcca gtgttgttta cactaaacaa gtctccaccc cttctctctc 29700
cgtcctcagg cattgctctt gtacttttcc attgtggaat ttcccgatct cataaacata 29760
gaatggactc aagtgttgaa tgtgtggttt cgagtctaac actaccctaa tgtggctgga 29820
ttttcaaagt tctttgccat ctctccaaca tgaatccaac ttgattttca agctttgcta 29880
ctgacatata aatcgagcct tgaataatat tttgtgtgct catccatgca tgcatggatc 29940
catggatcca atcatgtgtc caaccactca tccacccatc cgtgcatgca tccatctttc 30000
cgtcatgcat ttagacctta ctcagctcct gcttctgtga agaagcagcc atccctgtca 30060
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taacctggga aaaaaggtgg acttttacaa aaagccacag gttgcttggt gtttggacat 30360
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ttatgcctta ctatcttcat ctgtcaaatg gaacaataaa tagttgtccc cagctcatag 30480
gttaacgaga atggtgaaac ctgagctttt tttttttttt tttttttttt tgtgaaaatg 30540
actttggcac ttttagatgg ttcaaaatta gtagccagtt tatgagtgag ttgtacagtg 30600
acctctttat ccaacacagg aatgacgctc ccggcacaga agtgtgtgct ggaggcattc 30660
agagccagcg gagataacaa tattctgatt gctacctcgg tcgctgatga aggcattgac 30720
attgctgagt gcaatctcgt cattctctat gagtacgtgg gcaacgtcat caagatgatc 30780
caaaccagag gtgagagcgg ctgatgtcat tcccgccccg cacccgcttt tctcctttcc 30840
tcagctgtac catgtgattg acagcacagc tgactctggt actcgaaatc taaaagctga 30900
ctgccttggt caggattggg tggttatagg tttacccata atactccatt gcaactctcc 30960
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ctaggccaga ggctttgcca gtcggcaagt agacctttga tgggtgtggt gagtagctct 31080
ctgtactcca gagtctggtc ccacctgaac cagagtctga cttcctttcc ctttcttgtt 31140
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cagtcacatc catttttcgt cctcctccac cgcttactgt gcggttcagc cagccagact 31260
ccgcttcctg ctcgtccagt ttctcagata ctgtcgctct acatgttagg tcctatctct 31320
gtctctgcca cacacaacct aattcttcta cctagaacaa gcactccttt aaatgcccac 31380
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ttagtgttgc tggcagtgca gagcaatcag actatgccat tggagacccc atgaaaactg 31560
ccagagatgg cttatctgtg tgctgagcac actggctaga acctgcattt gagtctactc 31620
ttcggttcag cttccctaga aagtaggatg cagtgaatca aagttgaact cgagaaatac 31680
tcctcacatc tctttccagt aacctcagag tttgacatta acacacaaag aaaacgtttt 31740
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ctcttatgga atctgactag aaataacaaa tgaccatggt tggtcctgag tgtgtgtgtg 31980
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gagtggccct ggtgatttag caccggttaa atcttaccat cttccggaga aatggttgta 32280
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acacagagaa accctgtctt ggaaaaacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaataaaatc 32520
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ttacaactct tacaaagaat tagacgagag gaattcatag cttcagacat aaagagatga 32760
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gaaggctctg ctagatacag tgttatgtcc ttggttagtt ccagggagga ggaagggcta 33060
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gaactgggct aaaggcattt gcaaatcttc tgaggcatct ctgtaacttt actgtatgtc 33180
aaagattatg ccaaagaaat gttaaggctc tgattttgaa gtgtacatgg ttctagtata 33240
aacctgccag caaatgaatg gtaaagtggg aaaatactat gaatatgaaa ttataaagat 33300
gcttttgtta tggctacata caacatgagc agtgatatct ttgtcatgac caatgtgggt 33360
ccacctttcc taaaggggaa aaaaggctaa tatataaaaa tgacatattc tgctagtgaa 33420
ttctctcttc ctgttttgtt ttctaaactt ccttattgga acagagaatg cttttataat 33480
gaaaacaaaa cacctcattt taaaaaatat aacacttgta ggttagcttt ctactttttc 33540
accccttaaa cttttttttt ttttttttga gacaggatct ctctctatag cactgggtat 33600
cttgaaactc attatatgga gattcccttg tccctgcctc ccaaacgctg ggacgtaaag 33660
gcatgtacca ttacacaagg tcttcttaaa acttttaact aaggcaaaaa acctccagag 33720
acgaatcttg cagtcatcat tcctgctacc gatggcgggg gcagatggct gtgctagcta 33780
ggggaggggt acagtcctta ttatgagtga catccacttt ctgagtctga ttctttagat 33840
gcagaaggtc ctttcagctc caaattcaag gcttctcctt cccagtggcc tggagaacga 33900
gatgcttggt ctgcgcttgc gtctgtaggg tacactcttt tttttttaat tggatatttt 33960
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gtggcttcta agtcattttc agacccgttt ctaacattgt gcgctccatc tcttcctcct 34560
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gcactgattc ctttccggat ttgaccctgc caccctgtca ccctctgcag agtctcctgg 35400
tttctgtctc ttccttggtt tctttgctga ctcaaatttg gtagttgcaa ggttcagtat 35460
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cctggaggtc aacagtatga catgggatag cacaccactt ctcacagatg cctagagaaa 36420
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tcgaactcag aaatccgcct tcctctgcct cccaagtgtt gggattaaag gcgtgcgcca 36720
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ttttaacagc ccacgggtca ctgtgttgct tccatcatat taacatcaac ttgaaccagt 37740
ggttcctgaa acacttcagt tcattggacc ttgctaatta gcatcctgta aaaacccacc 37800
aacaaatatc aactagacag gtagaatcca agtgaactgt acactcctgg atcatgccag 37860
taactgtttt aataatacac cataaaatat aactacgact tcattttaca aatctgtgtt 37920
taataaacag gtacaggctt gttgggtgcg aacttttaaa actcctaata aaaatgccag 37980
ctatgattat ctttgtttat g 38001
<210> 12
<211> 3435
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<220>
<221> CDS
<222> (370)..(1815)
<400> 12
cgtttgtagt gtcagccatc ccaattgcct gttccttctc tgtgggagtg gtgtctagac 60
agtccaggca gggtatgcta ggcaggtgcg ttttggttgc ctcagatcgc aacttgactc 120
cataacggtg accaaagaca aaagaaggaa accagattaa aaagaaccgg acacagaccc 180
ctgcagaatc tggagcggcc gtggttgggg gcggggctac gacggggcgg actcgggggc 240
gtgggagggc ggggccgggg cggggcccgg agccggctgc ggttgcggtc cctgcgccgg 300
cggtgaaggc gcagcggcgg cgagtggcta ttgcaagcgt ttggataatg tgagacctgg 360
gatgcaggg atg tcg act atc tgc ccc cca cca tct cct gct gtt gcc aag 411
Met Ser Thr Ile Cys Pro Pro Pro Ser Pro Ala Val Ala Lys
1 5 10
aca gag att gct tta agt ggt gaa tca ccc ttg ttg gcg gct acc ttt 459
Thr Glu Ile Ala Leu Ser Gly Glu Ser Pro Leu Leu Ala Ala Thr Phe
15 20 25 30
gct tac tgg gat aat att ctt ggt cct aga gta agg cac att tgg gct 507
Ala Tyr Trp Asp Asn Ile Leu Gly Pro Arg Val Arg His Ile Trp Ala
35 40 45
cca aag aca gac caa gta ctc ctc agt gat gga gaa atc act ttt ctt 555
Pro Lys Thr Asp Gln Val Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ile Thr Phe Leu
50 55 60
gcc aac cac act ctg aat gga gaa att ctt cgg aat gcg gag agt ggg 603
Ala Asn His Thr Leu Asn Gly Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Ser Gly
65 70 75
gca ata gat gta aag ttt ttt gtc tta tct gaa aag ggc gtc att att 651
Ala Ile Asp Val Lys Phe Phe Val Leu Ser Glu Lys Gly Val Ile Ile
80 85 90
gtt tca tta atc ttc gac ggg aac tgg aac gga gat cgg agc act tac 699
Val Ser Leu Ile Phe Asp Gly Asn Trp Asn Gly Asp Arg Ser Thr Tyr
95 100 105 110
gga cta tca att ata ctg ccg cag acg gag ctg agt ttc tac ctc cca 747
Gly Leu Ser Ile Ile Leu Pro Gln Thr Glu Leu Ser Phe Tyr Leu Pro
115 120 125
ctg cac aga gtg tgt gtt gac agg cta acg cac atc att cga aaa gga 795
Leu His Arg Val Cys Val Asp Arg Leu Thr His Ile Ile Arg Lys Gly
130 135 140
agg ata tgg atg cac aag gaa aga caa gaa aat gtc cag aaa att gtc 843
Arg Ile Trp Met His Lys Glu Arg Gln Glu Asn Val Gln Lys Ile Val
145 150 155
ttg gaa ggc acc gag agg atg gaa gat cag ggt cag agt atc atc cct 891
Leu Glu Gly Thr Glu Arg Met Glu Asp Gln Gly Gln Ser Ile Ile Pro
160 165 170
atg ctt act ggg gag gtc atc cct gtg atg gag ctg ctt gcg tct atg 939
Met Leu Thr Gly Glu Val Ile Pro Val Met Glu Leu Leu Ala Ser Met
175 180 185 190
aga tca cac agt gtt cct gaa gac ctc gat ata gct gat aca gta ctc 987
Arg Ser His Ser Val Pro Glu Asp Leu Asp Ile Ala Asp Thr Val Leu
195 200 205
aat gat gat gac att ggt gac agc tgt cat gaa ggc ttt ctt ctc aat 1035
Asn Asp Asp Asp Ile Gly Asp Ser Cys His Glu Gly Phe Leu Leu Asn
210 215 220
gcc atc agc tca cat ctg cag acc tgc ggc tgt tct gtg gtg gta ggc 1083
Ala Ile Ser Ser His Leu Gln Thr Cys Gly Cys Ser Val Val Val Gly
225 230 235
agc agt gca gag aaa gta aat aag ata gta aga aca ctg tgc ctt ttt 1131
Ser Ser Ala Glu Lys Val Asn Lys Ile Val Arg Thr Leu Cys Leu Phe
240 245 250
ctg aca cca gca gag agg aag tgc tcc agg ctg tgt gaa gcc gaa tcg 1179
Leu Thr Pro Ala Glu Arg Lys Cys Ser Arg Leu Cys Glu Ala Glu Ser
255 260 265 270
tcc ttt aaa tac gaa tct gga ctc ttt gta caa ggc ttg cta aag gat 1227
Ser Phe Lys Tyr Glu Ser Gly Leu Phe Val Gln Gly Leu Leu Lys Asp
275 280 285
gcg act ggc agt ttt gta cta cct ttc cgg caa gtt atg tat gcc cct 1275
Ala Thr Gly Ser Phe Val Leu Pro Phe Arg Gln Val Met Tyr Ala Pro
290 295 300
tat ccc acc aca cac atc gat gtg gat gtc aac act gtc aag cag atg 1323
Tyr Pro Thr Thr His Ile Asp Val Asp Val Asn Thr Val Lys Gln Met
305 310 315
cca ccg tgt cat gaa cat att tat aat caa cgc aga tac atg agg tca 1371
Pro Pro Cys His Glu His Ile Tyr Asn Gln Arg Arg Tyr Met Arg Ser
320 325 330
gag ctg aca gcc ttc tgg agg gca act tca gaa gag gac atg gct cag 1419
Glu Leu Thr Ala Phe Trp Arg Ala Thr Ser Glu Glu Asp Met Ala Gln
335 340 345 350
gac acc atc atc tac aca gat gag agc ttc act cct gat ttg aat att 1467
Asp Thr Ile Ile Tyr Thr Asp Glu Ser Phe Thr Pro Asp Leu Asn Ile
355 360 365
ttc caa gat gtc tta cac aga gac act cta gtg aaa gcc ttt ctg gat 1515
Phe Gln Asp Val Leu His Arg Asp Thr Leu Val Lys Ala Phe Leu Asp
370 375 380
cag gtc ttc cat ttg aag cct ggc ctg tct ctc agg agt act ttc ctt 1563
Gln Val Phe His Leu Lys Pro Gly Leu Ser Leu Arg Ser Thr Phe Leu
385 390 395
gca cag ttc ctc ctc att ctt cac aga aaa gcc ttg aca cta atc aag 1611
Ala Gln Phe Leu Leu Ile Leu His Arg Lys Ala Leu Thr Leu Ile Lys
400 405 410
tac ata gag gat gac acg cag aag ggg aaa aag ccc ttt aag tct ctt 1659
Tyr Ile Glu Asp Asp Thr Gln Lys Gly Lys Lys Pro Phe Lys Ser Leu
415 420 425 430
cgg aac ctg aag ata gat ctt gat tta aca gca gag ggc gac ctt aac 1707
Arg Asn Leu Lys Ile Asp Leu Asp Leu Thr Ala Glu Gly Asp Leu Asn
435 440 445
ata ata atg gct cta gct gag aaa att aag cca ggc cta cac tct ttc 1755
Ile Ile Met Ala Leu Ala Glu Lys Ile Lys Pro Gly Leu His Ser Phe
450 455 460
atc ttc ggg aga cct ttc tac act agt gtc caa gaa cgt gat gtt cta 1803
Ile Phe Gly Arg Pro Phe Tyr Thr Ser Val Gln Glu Arg Asp Val Leu
465 470 475
atg act ttt taa acatgtggtt tgctccgtgt gtctcatgac agtcacactt 1855
Met Thr Phe
480
gctgttacag tgtctcagcg ctttggacac atccttcctc cagggtcctg ccgcaggaca 1915
cgttacacta cacttgtcag tagaggtctg taccagatgt caggtacatc gttgtagtga 1975
atgtctcttt tcctagacta gatgtaccct cgtagggact tatgtttaca accctcctaa 2035
gtactagtgc tgtcttgtaa ggatacgaat gaagggatgt aaacttcacc acaactgctg 2095
gttggttttg ttgtttttgt tttttgaaac ttataattca tggtttacat gcatcacact 2155
gaaaccctag ttagcttttt acaggtaagc tgtgagttga ctgcctgtcc ctgtgttctc 2215
tggcctgtac gatctgtggc gtgtaggatc acttttgcaa caactaaaaa ctaaagcact 2275
ttgtttgcag ttctacagaa agcaacttag tctgtctgca gattcgtttt tgaaagaaga 2335
catgagaaag cggagtttta ggtgaagtca gttgttggat cttcctttat agacttagtc 2395
ctttagatgt ggtctgtata gacatgccca accatcatgc atgggcactg aatatcgtga 2455
actgtggtat gctttttgtt ggtttattgt acttctgtca aagaaagtgg cattggtttt 2515
tataattgtt gccaagtttt aaggttaatt ttcattattt ttgagccaaa ttaaaatgtg 2575
cacctcctgt gcctttccca atcttggaaa atataatttc ttggcagaag gtcagatttc 2635
agggcccagt cactttcgtc tgacttccct ttgcacagtc cgccatgggc ctggcttaga 2695
agttcttgta aactatgcca gagagtacat tcgctgataa aatcttcttt gcagagcagg 2755
agagcttctt gcctctttcc tttcatttct gcctggactt tggtgttctc cacgttccct 2815
gcatcctaag gacagcagga gaactctgac cccagtgcta tttctctagg tgctattgtg 2875
gcaaactcaa gcggtccgtc tctgtccctg taacgttcgt accttgctgg ctgtgaagta 2935
ctgactggta aagctccgtg ctacagcagt gtagggtata cacaaacaca agtaagtgtt 2995
ttatttaaaa ctgtggactt agcataaaaa gggagactat atttattttt tacaaaaggg 3055
ataaaaatgg aaccctttcc tcacccacca gatttagtca gaaaaaaaca ttctattctg 3115
aaaggtcaca gtggttttga catgacacat cagaacaacg cacactgtcc atgatggctt 3175
atgaactcca agtcactcca tcatggtaaa tgggtagatc cctccttcta gtgtgccaca 3235
ccattgcttc ccacagtaga atcttattta agtgctaagt gttgtctctg ctggtttact 3295
ctgttgtttt agagaatgta agttgtatag tgaataagtt attgaagcat gtgtaaacac 3355
tgttatacat cttttctcct agatggggaa tttggaataa aataccttta aaattcaaaa 3415
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3435
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ggggccgggg ccggggccgg ggccggggcc ggggcc 36
<210> 14
<400> 14
000
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 15
tgtgacagtt ggaatgcagt ga 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
gccacttaaa gcaatctctg tcttg 25
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 17
tcgactcttt gcccaccgcc a 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
gggtctagca agagcaggtg 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
gtcttggcaa cagctggaga t 21
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 20
tgatgtcgac tctttgccca ccgc 24
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
tcctgtaatg gaactgcttt ca 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 22
ggtatctgct tcatccagct tt 22
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 23
ccccggcccc ggcccc 16
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 24
caagccaccg tctcactcaa 20
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 25
gtagtgctgt ctactccaga gagttacc 28
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Probe
<400> 26
gtagtgctgt ctactccaga gagttacc 28
<210> 27
<400> 27
000
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Slynthetic oligonucleotide
<400> 30
agcgggacac cgtaggttac 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 31
gtgggcggaa cttgtcgctg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 32
gtcacattat ccaaatgctc 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 33
ggtgggcaaa gagtcgacat 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 34
atctctgtct tggcaacagc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 35
aagcaatctc tgtcttggca 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 36
acttaaagca atctctgtct 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 37
ttgccactta aagcaatctc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 38
cccagtaagc aaaagtagct 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 39
actctaggac caagaatatt 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 40
gccttactct aggaccaaga 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 41
ccaaatgtgc cttactctag 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 42
tggagcccaa atgtgcctta 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 43
tctgtctttg gagcccaaat 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 44
ccatcactga gaagtacctg 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 45
atttctccat cactgagaag 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 46
aaaagttatt tctccatcac 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 47
tggcaagaaa agttatttct 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 48
gtgtggttgg caagaaaagt 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 49
ctccatttag agtgtggttg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 50
tgcatttcga aggatttctc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 51
ccactctctg catttcgaag 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 52
acaaaaaact ttacatctat 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 53
ccttttcaga caagacaaaa 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 54
aagattaatg aaacaataat 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 55
gtttccatca aagattaatg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 56
attgatagtc catatgtgct 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 57
agtataattg atagtccata 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 58
ggaggtagaa actaagttct 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 59
atgtgttaat ctatcaacac 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 60
tgcatccata ttcttccttt 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 61
ttccttatgc atccatattc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 62
cttgtctttc cttatgcatc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 63
acattttctt gtctttcctt 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 64
tctggacatt ttcttgtctt 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 65
ataatcttct ggacattttc 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 66
ctctgaccct gatcttccat 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 67
ttggaataat actctgaccc 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 68
cagttccatt acaggaatca 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 69
cttcaggaac actgtgtgat 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 70
atctatttct tcaggaacac 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 71
agtactgtat cagctatatc 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 72
tcattgagta ctgtatcagc 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 73
tcatcatcat tgagtactgt 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 74
ccaatatcat catcattgag 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 75
tcatgacagc tgtcaccaat 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 76
aagccttcat gacagctgtc 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 77
agaagaaagc cttcatgaca 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 78
tacttgagaa gaaagccttc 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 79
attcttactt gagaagaaag 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 80
aaaaattctt acttgagaag 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 81
agatggtatc tgcttcatcc 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 82
caatctaagt agacagtctg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 83
ttaagcaaca gttcaaatac 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 84
ctttaaatag caaatggaat 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 85
gccatgattt cttgtctggg 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 86
gctttaatga gaagtaaaac 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 87
tctacagtac aacttaatat 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 88
ataattttgt tctacgccta 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 89
cactgctgga tggaaaaaga 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 90
tggtttaagg gcacaaactc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 91
ttgcccacgg gtacacagca 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 92
cagatgagga aataggtgta 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 93
acacattagg tactattact 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 94
tttttatgtt ccaggcactg 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 95
aataggaaat gttagctatg 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 96
ggcactcaac aaatactggc 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 97
tacatgtaaa gcaactagta 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 98
taaaatttca tgaaaatctg 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 99
aagtgaatac tttatacttt 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 100
catcatgagc ctaaaggaaa 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 101
ggctcttagg ttaaacacac 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 102
tgcttctgat tcaagccatt 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 103
atacaggact aaagtgcttc 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 104
caaatgggat ttaaaatgat 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 105
tgacatgtag agagattaag 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 106
ttattgaaat accatcattt 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 107
tagtcagtat aatatcattt 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 108
gcattgagaa gaaagccttc 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 109
aagacctgat ccaggaaggc 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 110
tgagctgatg gcattgagaa 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 111
acaacggaac agccacaggt 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 112
ttagtgtcaa ggcttttctg 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 113
gacggctgac acaccaagcg 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 114
tgatggcatt gagaagaaag 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 115
tttactttct ctgcactgct 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 116
tcttatttac tttctctgca 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 117
ggcataatgt tctgactatc 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 118
ataacctgga gcattttctc 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 119
ccctgactca tatttaaatg 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 120
ccagttgaat cctttagcag 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 121
catacatgac ttgccggaaa 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 122
gacatccaca tctatgtgtg 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 123
tgttcatgac agggtggcat 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 124
ttataaatat gttcatgaca 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 125
cagctcggat ctcatgtatc 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 126
ctccagaagg ctgtcagctc 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 127
gtatcctgag ccatgtcttc 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 128
aatcaggagt aaagctttcg 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 129
aaaatattca aatcaggagt 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 130
tctctgtgta agacatcttg 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 131
gagtgtctct gtgtaagaca 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 132
cactagagtg tctctgtgta 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 133
gctttcacta gagtgtctct 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 134
gatccaggaa ggctttcact 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 135
aaagtacttc tgagagataa 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 136
aactgtgcaa ggaaagtact 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 137
gtcaaggctt ttctgtgaag 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 138
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<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 139
atcttcaggt tccgaagaga 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 140
ccctctgctg ttaaatcaag 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 141
tgttaagatc gccctctgct 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 142
attattatgt taagatcgcc 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 143
agagccatta ttatgttaag 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 144
ataaaagagt gtaggcctgg 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 145
acactagtgt agaaaggtct 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 146
gttcttgcac actagtgtag 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 147
taaaaagtca ttagaacatc 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 148
tattaagtta cacatttaaa 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 149
ctttaccagc gatcatgatt 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 150
ttctggagta tgatccaggg 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 151
acttaactgc aattgctgag 20
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 152
tgtagtgtaa cttacttaac 20
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 153
atgcacctga catcccctca 20
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 154
cccaaaagca taaatctagg 20
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 155
atatttatta tattgtaaac 20
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 156
agcaataata tttattatat 20
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 157
agatagcaat aatatttatt 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 158
aaagatagca ataatattta 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 159
ttaaaagata gcaataatat 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 160
atctttaaaa gatagcaata 20
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 161
atatctttaa aagatagcaa 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 162
attatatctt taaaagatag 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 163
tattattata tctttaaaag 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 164
caagtttaca tcctattatt 20
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 165
aaaacagtag ttgtggtcaa 20
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 166
aaaaaacagt agttgtggtc 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 167
tgaatcatgt atttcaaaaa 20
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 168
gccaactcag atttcacctt 20
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 169
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<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 170
agttttcagt tgattgcaga 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 171
catcctatgt tcaagctcac 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 172
taaacatctg cttgatcaat 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 173
aatccacaaa gtaggatcta 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 174
attagacatt tctacagact 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 175
ctcaactaca tagaatatca 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 176
ttggcaacaa ttactaaaac 20
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 177
tcaaaaataa tgaaaattaa 20
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 178
caatttggct caaaaataat 20
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 179
ggcacaggag gtgcacattt 20
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 180
tagattttct aaggagaaaa 20
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 181
actgaccagt gaaatctgaa 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 182
ggtaagactt agcaagaaga 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 183
tctcagagtt gcaatgattg 20
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 184
agatcttatt agttagtata 20
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 185
agtactcaag gaactatttt 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 186
ggcaaacagc aacaacttca 20
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 187
gcacttcagt aaaatttctc 20
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 188
ggtccaaacg cattaagaaa 20
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 189
gaattatatt aatcagttat 20
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 190
tgtgtttgtg taactacaat 20
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 191
atattacttc cagaatttta 20
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 192
ggcagaaggg ctctattacc 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 193
cattcgaaca tgtcattttg 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 194
ctgattcatg atgggaaagc 20
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 195
gtggttgtct aaaacatcaa 20
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 196
atgactgagc tacagtacaa 20
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 197
gggacactac aaggtagtat 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 198
ttaaataaga atctaccatg 20
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 199
gctttaataa cttatttcac 20
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 200
aggagaaaag atatataaca 20
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 201
ccatttagga gaaaagatat 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 202
ttcaccctca gcgagtactg 20
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 203
aggctgcggt tgtttccctc 20
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 204
gccagatccc catcccttgt 20
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 205
tcacttcctt taagcaagtc 20
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 206
agtgatgccc aagtcacaat 20
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 207
agtcaagtga tgcccaagtc 20
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 208
ccatcagtca agtgatgccc 20
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 209
gattaccatc agtcaagtga 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 210
caactgatta ccatcagtca 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 211
gcagtttcca actgattcag 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 212
cgttcttgtt tcagatgtac 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 213
gccaaacaaa atattttatc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 214
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<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 215
tcccagccca aagagaagca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 216
ggatcatagc tctcggtaac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 217
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 218
ctgattggta tttagaaagg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 219
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 220
ttcatcatta aactgaaaat 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 221
cttttaggtt aaaaaggtgg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<213> Artificial sequence
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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accgcaaccg cagccccgcc 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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cgcctccgcc gccgcgggcg 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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ccactcgcca ccgcctgcgc 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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ggtccccggg aaggagacag 20
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Synthetic oligonucleotide
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ctaacagaat aagaaaaaaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gagcattaga tgagtgcttt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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tgcattccta agcaatgtgt 20
<210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 312
tctaggcctt cacattaatt 20
<210> 313
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 313
cctgtctatg cctaggtgaa 20
<210> 314
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
<400> 314
tagcacatac aattattaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide
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gaggagaaga acataaacgc 20
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cccggccccg gccccg 16
Claims (41)
- C9ORF72 핵산 또는 C9ORF72 동족체(homolog) 핵산에 상보적인 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물.
- 청구항 1에 있어서, C9ORF72 핵산은 인간 C9ORF72 핵산인, 화합물.
- 청구항 1-2에 있어서, C9ORF72 핵산은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부(repeat expansion)를 포함하는, 화합물.
- 청구항 1-2에 있어서, C9ORF72 핵산은 헥사뉴클레오티드 반복 확장부를 포함하지 않는, 화합물.
- 청구항 1-4에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 핵산에 특이적으로 혼성화가능한, 화합물.
- 청구항 1-5에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 핵산의 동일한 길이 부분에 대하여 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 또는 100% 상보적인, 화합물.
- 청구항 1-6에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 C9ORF72 핵산의 엑손, 인트론, 5' UTR, 3' UTR, 반복 영역, 스플라이스 연접부, 엑손:엑손 스플라이스 연접부, 엑손의 스플라이싱 사일런서 (ESS), 엑손의 스플라이싱 인헨서 (ESE), 엑손 1a, 엑손 1b, 엑손 1c, 엑손 1d, 엑손 1e, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7, 엑손 8, 엑손 9, 엑손 10, 엑손 11, 인트론 1, 인트론 2, 인트론 3, 인트론 4, 인트론 5, 인트론 6, 인트론 7, 인트론 8, 인트론 9, 또는 인트론 10중 임의의 것에 상보적인, 화합물.
- 12 내지 30개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 서열 30-369의 최소한 8, 최소한 9, 최소한 10, 최소한 11, 최소한 12, 최소한 13, 최소한 14, 최소한 15, 최소한 16, 최소한 17, 최소한 18, 최소한 19, 또는 최소한 20개의 인접핵염기들이 포함된 핵염기 서열을 포함하는, 화합물.
- 전술한 임의의 항에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형을 포함하는, 화합물.
- 청구항 9에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드간 링키지를 포함하는, 화합물.
- 청구항 10에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 뉴클레오시드간 링키지는 변형된 뉴클레오시드간 링키지인, 화합물.
- 청구항 10-11에 있어서, 변형된 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 링키지인, 화합물.
- 청구항 9-12에 있어서, 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 화합물.
- 청구항 9-13에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 당을 보유하는 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 화합물.
- 청구항 14에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 이환 당(bicyclic sugar)이 포함된 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 화합물.
- 청구항 15에 있어서, 이환 당은 n이 1 또는 2인 4'-(CH2)n-O-2' 다리; 및 4'-CH2-O-CH2-2'에서 선택된 4'에서 2'로의 다리를 포함하는, 화합물.
- 청구항 16에 있어서, 이환 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함하는, 화합물.
- 청구항 14에 있어서, 변형된 당을 보유한 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드는 비-이환 2'-변형된 변형된 당 모이어티를 포함하는, 화합물.
- 청구항 18에 있어서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸 기를 포함하는, 화합물.
- 청구항 18에 있어서, 2'-변형된 당 모이어티는 2'-O-메틸 기를 포함하는, 화합물.
- 청구항 14에 있어서, 변형된 당을 보유한 최소한 한 가지 변형된 뉴클레오시드는 당 대용물을 포함하는, 화합물.
- 청구항 21에 있어서, 당 대용물은 몰포리노인, 화합물.
- 청구항 21에 있어서, 당 대용물은 펩티드 핵산인, 화합물.
- 청구항 13-23에 있어서, 각 뉴클레오시드는 변형된, 화합물.
- 청구항 9-24에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 최소한 한 가지 변형된 핵염기를 포함하는, 화합물.
- 청구항 25에 있어서, 변형된 핵염기는 5'-메틸시토신인, 화합물.
- 청구항 9-26에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는
연계된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 세그먼트;
연계된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 세그먼트;
연계된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
이때 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 이때 각 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 변형된 당을 포함하는, 화합물. - 청구항 37에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는
10개의 연계된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 세그먼트;
5개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 세그먼트;
5개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 세그먼트를 포함하며,
이때 상기 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트에 바로 인접하고, 이들 사이에 위치하며, 이때 각 윙 세그먼트의 각 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하고; 이때 각 뉴클레오시드간 링키지는 포스포로티오에이트 링키지인, 화합물. - 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 15개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 16개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 17개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 18개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 19개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-28에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 21개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 22개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 23개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 24개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 청구항 1-27에 있어서, 이때 단일-가닥으로 된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 25개의 연계된 뉴클레오시드로 구성된, 화합물.
- 신경퇴행성 질환을 치료하는 약물 제조용 전술한 임의의 항의 화합물의 용도.
- 엑손 1B의 상류를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 세포에 접촉시킴으로써, 헥사뉴클레오티드 반복 확장부가 포함된 mRNA 전사체의 발현을 선호적으로 저해시키는 방법.
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