JP2011502514A - 第7因子発現の調節 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は電子形式の配列表と共に出願される。配列表は2008年11月5日に作成されたサイズ180Kbのファイル(ファイル名:BIOL0099WOSEQ.txt)として提出される。配列表の電子形式での情報は参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、動物における第7因子mRNAおよびタンパク質の発現を減少させるための方法、化合物、および組成物を提供する。そのような方法、化合物および組成物は、血栓塞栓性合併症、過剰増殖性障害、および炎症状態を処置し、予防し、または改善するのに役立つ。
循環系は、不適切な血管内閉塞に対抗する機序だけでなく、失血を予防する機序も必要とする。一般に凝固は、結果として可溶性フィブリノゲンを不溶性フィブリンゲルに変換することになる反応のカスケードを含む。カスケードの各ステップでは、不活性なチモーゲンが活性化された酵素に変換される。そして、その活性酵素が、カスケード中の次のステップを触媒する。
凝固カスケードは、2つの分枝、すなわち主要経路である組織因子経路(「外因性経路」ともいう)と接触活性化経路(「内因性経路」ともいう)によって開始されうる。
少なくとも3つの機序、すなわち、活性化プロテインC、アンチトロンビン、および組織因子経路インヒビターの作用が、凝固カスケードを抑制している。活性化プロテインCは、補助因子VaおよびVIIIaを分解するセリンプロテアーゼである。プロテインCはトロンビンとトロンボモジュリンの組み合わせによって活性化され、機能するには補酵素プロテインSを必要とする。アンチトロンビンは、セリンプロテアーゼであるトロンビン、Xa、XIIa、XIaおよびIXaを阻害するセリンプロテアーゼインヒビター(セルピン)である。組織因子経路インヒビターは、XaおよびTF−VIIa複合体の作用を阻害する(非特許文献2)。
血栓症は凝血塊の病的発生であり、塞栓症は凝血塊が身体の別の部分に移動して臓器機能を妨害する際に起こる。血栓塞栓症は、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中などの状態を引き起こしうる。重要なことに、血栓塞栓症は毎年200万人を超えるアメリカ人を冒す主要な罹病原因である(非特許文献3)。血栓症の大半の症例は後天的な外因性の問題、例えば手術、がん、不動などによるものであるが、一部の症例は遺伝的素因、例えば抗リン脂質抗体症候群および常染色体優性異常、第V因子ライデンなどによるものである(非特許文献4)。
最もよく使用される抗凝固剤であるワルファリン、ヘパリン、および低分子量ヘパリン(LMWH)はいずれも重大な短所を持っている。
ここでは、凝固障害を処置および予防するためのアンチセンス化合物、組成物、および方法が提供される。
(i)連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップ(gap)セグメント;
(ii)連結されたヌクレオシドからなる5’ウイング(wing)セグメント;
(iii)連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは修飾糖を含む。
(i)10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
(ii)5個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
(iii)5個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
(i)14個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
(ii)3個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
(iii)3個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
(i)13個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
(ii)2個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
(iii)5個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドは2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合はホスホロチオエート結合である。
(i)12個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
(ii)2個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
(iii)2個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント
を含み、ギャップセグメントが5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
上記の一般的説明および下記の詳細な説明はどちらも例示および解説に過ぎず、特許請求する発明を限定するものではないと理解すべきである。本明細書において、単数形の使用には、別段の明記がない限り、複数形が含まれる。本明細書で使用される「または(or)」の使用は、別段の記載がない限り、「および/または(and/or)」を意味する。さらにまた、「を含む(including)」という用語ならびに他の語形(「includes」および「included」など)の使用は、限定ではないものとする。また、「エレメント(element)」または「コンポーネント(component)」などの用語は、別段の明記がない限り、1つのユニットを含むエレメントおよびコンポーネントと、2つ以上のサブユニットを含むエレメントおよびコンポーネントを、どちらも包含する。
個別の定義を下さない限り、本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して使用される命名法ならびにその手順および技法は、当技術分野でよく知られ、よく使用されるものである。化学合成および化学分析には標準的な技法を使用することができる。可能である場合は、すべての特許、出願、出願公開および他の刊行物、GENBANKアクセッション番号および国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)などのデータベースから得ることができる関連する配列情報、ならびに本明細書の全体を通して言及される他のデータは、その文書の本明細書で議論された部分について、ならびにそのすべてが、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の実施形態は、第7因子mRNAおよびタンパク質の発現を調節するための方法、化合物、および組成物を提供する。ある実施形態では、第7因子mRNAおよびタンパク質の発現を減少させる。ある実施形態では、第7因子特異的インヒビターが、第7因子mRNAおよびタンパク質の発現を調節する。ある実施形態では、第7因子特異的インヒビターが核酸、タンパク質、または小分子である。
(i)本明細書に記載する第7因子特異的インヒビター;または
(ii)本明細書に記載する追加の薬剤または治療
を含むキットを提供する。
オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチドミメティック、アンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNAが含まれるが、これらに限るわけではない。オリゴマー化合物は、標的核酸に対して「アンチセンス」であることができる。すなわち、水素結合を介した標的核酸へのハイブリダイゼーションを起こす能力を有する。
ある実施形態では、第7因子核酸を標的とするアンチセンス化合物が、アンチセンス化合物に、阻害活性の強化、標的核酸に対する結合アフィニティの増加、またはインビボでのヌクレアーゼによる分解に対する耐性などの性質を付与するようなパターンまたはモチーフで配置された、化学修飾されたサブユニットを有する。
第7因子遺伝子配列をコードするヌクレオチド配列には、以下に挙げる配列が含まれるが、これらに限るわけではない:1255000〜1273000で切り取られたGENBANK(登録商標)アクセッション番号NT_027140.6、GENBANK(登録商標)には2001年7月17日に初めて登録され、本明細書には配列番号1として組み込まれる;GENBANKアクセッション番号NM_019616.2、GENBANK(登録商標)には2000年10月3日に初めて登録され、本明細書には配列番号2として組み込まれる;GENBANK(登録商標)アクセッション番号DB184141.1、GENBANK(登録商標)には2005年11月11日に初めて登録され、本明細書には配列番号3として組み込まれる;GENBANKアクセッション番号NM_000131.3、GENBANK(登録商標)には1999年3月24日に初めて登録され、本明細書には配列番号167として組み込まれる;ヌクレオチド10024000〜10037000で切り取られたGENBANKアクセッション番号NT_039455.6、GENBANK(登録商標)には2003年2月24日に初めて登録され、本明細書には配列番号160として組み込まれる;GENBANKアクセッション番号NW_00104507.1、本明細書には配列番号162として組み込まれる;およびGENBANKアクセッション番号3360_061_B、本明細書には配列番号163として組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するアンチセンス化合物と第7因子核酸との間でハイブリダイゼーションが起こる。最も一般的なハイブリダイゼーションの機序には、核酸分子の相補的核酸塩基間の水素結合形成(例えばワトソン−クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合形成)が関わる。
アンチセンス化合物の十分な数の核酸塩基が、所望の効果(例えば第7因子核酸などの標的核酸のアンチセンス阻害)が生じるような形で、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合することができるのであれば、そのアンチセンス化合物と標的核酸は互いに相補的である。
本明細書に記載するアンチセンス化合物は、特定のヌクレオチド配列、配列番号、もしくは特定のアイシス番号で表される化合物、またはその一部分に対して、所定の一致率(percent identity)を有しうる。本明細書では、あるアンチセンス化合物が同じ核酸塩基対形成能を有するのであれば、そのアンチセンス化合物は本明細書に開示する配列と同一であるという。例えば、開示されたDNA配列中のチミジンの代わりにウラシルを含有するRNAは、そのDNA配列と同一であるとみなされるだろう。というのも、ウラシルとチミジンはどちらもアデニンと対を形成するからである。本明細書に記載するアンチセンス化合物の短縮型または延長型、ならびに本明細書に記載するアンチセンス化合物と比較して非同一塩基を有する化合物も考えられる。非同一塩基は、互いに隣接していてもよいし、アンチセンス化合物全体に分散していてもよい。アンチセンス化合物の一致率は、比較対象である配列と比較して同一の塩基対形成を有する塩基の数に応じて算出される。
ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの核酸塩基(塩基とも呼ばれている)部分は通常は複素環式塩基成分である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は糖の2’、3’または5’ヒドロキシル成分に連結することができる。オリゴヌクレオチドは隣接するヌクレオシドが互いに共有結合されて線状のポリマー状オリゴヌクレオチドを形成することによって形成される。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成すると言われる。
RNAおよびDNAの天然のヌクレオシド間結合は3’→5’ホスホジエステル結合である。天然のヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物よりも、1つ以上の修飾された、すなわち非天然の、ヌクレオシド間結合を有するアンチセンス化合物が、しばしば選択される。それが、例えば、細胞取り込みの強化、標的核酸に対するアフィニティの強化、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の増加など、望ましい性質を有するからである。
本発明のアンチセンス化合物は、場合によっては、糖基が修飾されているヌクレオシドを1つ以上含有することができる。そのような糖修飾ヌクレオシドは、ヌクレアーゼ安定性の強化、結合アフィニティの増加または他の何らかの有益な生物学的性質を、アンチセンス化合物に付与しうる。ある実施形態では、ヌクレオシドが化学修飾リボフラノース環成分を含む。化学修飾リボフラノース環の例には、置換基の付加(5’および2’置換基、非ジェミナル環原子の架橋による二環式核酸(BNA)の形成、リボシル環酸素原子のS、N(R)、またはC(R1)(R)2(R=H、C1−C12アルキルまたは保護基)による置き換え)およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限るわけではない。化学修飾糖の例には、2’−F−5’−メチル置換ヌクレオシド(他の開示された5’,2’−ビス置換ヌクレオシドについてはPCT国際出願WO2008/101157(公開日2008年8月21日)参照)、またはリボシル環酸素原子の「S」による置き換えおよび2’位におけるさらなる置換(米国特許出願US2005−0130923(公開日2005年6月16日)参照)、あるいはBNAの5’−置換(PCT国際出願WO2007/134181(公開日2007年11月22日)参照;ここでは、LNAが例えば5’−メチル基または5’−ビニル基で置換される)が含まれる。
核酸塩基(または塩基)修飾または置換は、天然のまたは合成の非修飾核酸塩基とは構造的に識別可能であるが、機能的には交換可能である。天然核酸塩基と修飾核酸塩基はどちらも、水素結合に参加する能力を有する。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合アフィニティまたは他の何らかの有益な生物学的性質を、アンチセンス化合物に付与することができる。修飾核酸塩基には、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)などの合成および天然核酸塩基が含まれる。5−メチルシトシン置換を含むいくつかの核酸塩基置換は、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合アフィニティを増加させるのに、特に有用である。例えば、5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を0.6〜1.2℃増加させることが示されている(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.およびLebleu,B.編「Antisense Research and Applications」CRC Press、ボカラトン、1993、pp.276−278)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬組成物または医薬製剤を製造するために、医薬上許容される活性または不活性物質と混合することができる。医薬組成物を製剤するための組成物および方法は、限定するわけではないが、投与経路、疾患の程度、または投与されるべき用量など、いくつかの基準に依存する。
アンチセンス化合物は、得られたアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを強化する1つ以上の成分またはコンジュゲートに共有結合することができる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール成分および脂質成分が含まれる。他のコンジュゲート基には、糖質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、および色素が含まれる。
第7因子核酸のレベル、活性または発現に対するアンチセンス化合物の効果は、さまざまな細胞タイプにおいて、インビトロで試験することができる。そのような分析に使用される細胞タイプは供給業者(例えばAmerican Type Culture Collection、バージニア州マナッサス;Zen−Bio,Inc.、ノースカロライナ州リサーチトライアングルパーク;Clonetics Corporation、メリーランド州ウォーカーズビル)から入手することができ、細胞は、市販の試薬(例えばInvitrogen Life Technologies、カリフォルニア州カールズバッド)を使って、供給者の指示に従って培養される。例示的細胞タイプには、HepG2細胞、HepB3細胞、および初代肝細胞が含まれる。
ここでは、細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理するための方法を説明する。この方法は、他のアンチセンス化合物による処理のために、適当に変更することができる。
RNA分析は全細胞RNAまたはポリ(A)+ mRNAに対して行うことができる。RNA単離の方法は当技術分野ではよく知られている。RNAは当技術分野で周知の方法を使って、例えばTRIZOL(登録商標)(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)を使用し、製造者が推奨するプロトコールに従って、調製される。
第7因子核酸のレベルまたは発現の阻害は、当技術分野で知られるさまざまな方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、ノーザンブロット分析、競合逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、または定量リアルタイムRT−PCRなどによって定量することができる。RNA分析は、全細胞RNAまたはポリ(A)+ mRNAに対して行うことができる。RNA単離の方法は当技術分野ではよく知られている。ノーザンブロット分析も当技術分野では常法である。リアルタイムRT−PCRは、PE−Applied Biosystems(カリフォルニア州フォスターシティ)から入手することができる市販のABI PRISM(登録商標)7600、7700、または7900 Sequence Detection Systemを、製造者の指示に従って使用することにより、便利に達成することができる。
標的RNAレベルの定量は、ABI PRISM(登録商標)7600、7700、または7900 Sequence Detection System(PE−Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティ)を使用し、製造者の指示に従って、定量リアルタイムRT−PCRで達成することができる。リアルタイムRT−PCRの方法は当技術分野ではよく知られている。
第7因子核酸のアンチセンス阻害は、第7因子タンパク質レベルを測定することによって評価することができる。第7因子のタンパク質レベルは、当技術分野で周知のさまざまな方法、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析(イムノブロット法)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、定量タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えばカスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫細胞化学または蛍光活性化細胞選別(FACS)で評価または定量することができる。標的に対する抗体はMSRS抗体カタログ(Aerie Corporation、ミシガン州バーミンガム)などのさまざまな供給源から同定し、入手するか、当技術分野でよく知られる従来のモノクローナルまたはポリクローナル抗体作製方法によって製造することができる。ヒトおよびマウス第7因子の検出に役立つ抗体は市販されている。
アンチセンス化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第7因子の発現を阻害して、例えばPTの延長、aPTT時間の延長、血小板因子4(PF−4)量の減少、血栓形成の減少または血栓形成に要する時間の増加、および細胞増殖の減少などといった表現型の変化をもたらすその能力について評価するために、動物中で試験される。試験は正常な動物で行なうか、実験的疾患モデルで行うことができる。動物への投与のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは医薬上許容される希釈剤、例えばリン酸緩衝食塩水中に製剤される。投与には、非経口投与経路、例えば腹腔内、静脈内、および皮下が含まれる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの投薬量および投薬頻度の計算は当業者の技量の範囲内であり、投与経路および動物の体重などの因子に依存する。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理期間に続いて、RNAを肝臓組織から単離し、第7因子核酸配列の変化を測定する。第7因子タンパク質レベルの変化も、トロンビン生成アッセイを使って測定される。また、凝固時間、例えばPTおよびaPTTに対する効果も、処置された動物から得た血漿を使って決定される。
ある実施形態では、本発明は、1つ以上の本発明の医薬組成物を投与することを含む、個体を処置する方法を提供する。ある実施形態では、個体は血栓塞栓性合併症を有する。ある実施形態では、個体が、血液凝固障害、例えば限定するわけではないが、梗塞、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、例えば深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中のリスクにさらされている。これには、血栓症のリスクにつながる後天的な問題、疾患、または障害、例えば手術、がん、不動、敗血症、アテローム性動脈硬化、心房細動を有する個体、ならびに遺伝的素因、例えば抗リン脂質抗体症候群および常染色体優性異常、第V因子ライデンを有する個体が含まれる。ある実施形態では、個体が抗凝固治療の必要があると同定された個体である。そのような個体の例には、大きな整形外科手術(例えば人工股/膝関節置換術または股関節骨折手術)を受けた個体、および慢性期処置を必要とする患者、例えば心房細動を患っている患者(脳卒中を予防するため)が含まれるが、これらに限るわけではない。ある実施形態において、本発明は、個体における第7因子発現を予防的に減少させるための方法を提供する。いくつかの実施形態は、第7因子核酸を標的とするアンチセンス化合物の治療有効量を個体に投与することによって、その必要がある個体を処置することを含む。
ある実施形態では、本発明の1つ以上の医薬組成物が、1つ以上の他の医薬剤と併用投与される。ある実施形態では、そのような1つ以上の他の医薬剤が、当該本発明の1つ以上の医薬組成物と同じ疾患、障害、または状態を処置するための医薬剤である。ある実施形態では、そのような1つ以上の他の医薬剤が、当該本発明の1つ以上の医薬組成物とは異なる疾患、障害、または状態を処置するための医薬剤である。ある実施形態では、そのような1つ以上の他の医薬剤が、本発明の1つ以上の医薬組成物の望ましくない副作用を処置するための医薬剤である。ある実施形態では、本発明の1つ以上の医薬組成物が、もう1つの医薬剤と、当該他の医薬剤の望ましくない効果を処置するために、併用投与される。ある実施形態では、本発明の1つ以上の医薬組成物がもう1つの医薬剤と併用投与されて、複合的効果を生じる。ある実施形態では、本発明の1つ以上の医薬組成物がもう1つの医薬剤と併用投与されて相乗効果を生じる。
限定でない開示および参照による組み込み
本明細書に記載するいくつかの化合物、組成物および方法をいくつかの実施形態に従って具体的に説明したが、以下の実施例は本明細書に記載する化合物の例示を目的とするにすぎず、それを限定しようとするものではない。本願において言及する参考文献はそれぞれ参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
HepB3細胞におけるヒト第7因子mRNAのアンチセンス阻害
第7因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、インビトロでの第7因子mRNAに対するそれらの効果について試験した。リポフェクチン試薬を使って、1ウェルあたり4,000細胞の密度の培養HepB3細胞を、50nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処理期間後に、細胞からRNAを単離し、第7因子mRNAレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムRT−PCRで測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第7因子の阻害百分率として表す。
[表1]
配列番号1、配列番号2、および配列番号3を標的とする5−10−5MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第7因子mRNAレベルの阻害
[表2]
5−10−5MOEウイングおよびデオキシギャップを有するヒト/アカゲザル交差反応性キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
HepB3細胞におけるヒト第7因子の用量依存的アンチセンス阻害
ヒト第7因子の少なくとも80%のインビトロ阻害を示す、実施例1に記載したいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド(表1参照)を、HepB3細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を1ウェルあたり4,000細胞の密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を使って、表3に示すように、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、および100nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。約16時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、第7因子mRNAレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムRT−PCRで測定した。ヒト第7因子プライマープローブセットRTS2927(フォワード配列:GGGACCCTGATCAACACCAT、本明細書には配列番号164として組み込まれる;リバース配列:CCAGTTCTTGATTTTGTCGAAACA、本明細書には配列番号165として組み込まれる;プローブ配列:TGGGTGGTCTCCGCGGCCX、本明細書には配列番号166として組み込まれる)を使って、mRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第7因子の阻害百分率として表す。表3に示すように、第7因子mRNAレベルは用量依存的に減少した。
HepB3細胞におけるヒト第7因子のアンチセンス阻害
第7因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでの第7因子mRNAに対するそれらの効果を試験した。表3に記載するアンチセンスオリゴヌクレオチドのいくつかも、インビトロでの第7因子mRNAに対するそれらの効果について再試験した。1ウェルあたり4,000細胞の密度の培養HepB3細胞を、リポフェクチン試薬を使って、50nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、第7因子mRNAレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムRT−PCRで測定した。ヒト第7因子プライマープローブセットRTS2927を使ってmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照と比較した第7因子の阻害百分率として表す。
[表4]
配列番号1、配列番号2、および配列番号167を標的とする5−10−5MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第7因子mRNAレベルの阻害
[表5]
5−10−5MOEウイングおよびデオキシギャップを有するヒト/アカゲザル交差反応性キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド
HepB3細胞におけるヒト第7因子のアンチセンス阻害
第7因子核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、インビトロでの第7因子mRNAに対するそれらの効果を試験した。1ウェルあたり4,000細胞の密度の培養HepB3細胞を、リポフェクチン試薬を使って、50nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、第7因子mRNAレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムRT−PCRで測定した。ヒト第7因子プライマープローブセットRTS2927を使ってmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照と比較した第7因子の阻害百分率として表す。
[表6]
配列番号1を標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第7因子mRNAレベルの阻害
HepB3細胞におけるヒト凝固第7因子の用量依存的アンチセンス阻害
第7因子のインビトロ阻害を示すギャップマー(上記表1〜6に記載のもの)を選択し、HepB3細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を1ウェルあたり4,000細胞の密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を使って、表7に示すように、6.25nM、12.5nM、25.0nM、50.0nM、および100.0nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約16時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、第7因子mRNAレベルを、本明細書で述べるように、リアルタイムRT−PCRで測定した。ヒト第7因子プライマープローブセットRTS2927を使ってmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第7因子の阻害百分率として表す。表7に示すように、第7因子mRNAレベルは用量依存的に減少した。
マイクロウォーク(microwalk)によって設計されたオリゴヌクレオチドによるHepB3細胞におけるヒト第7因子のアンチセンス阻害
さらなるギャップマーを、表7に記載のギャップマーに基づいて設計した。これらのギャップマーは、表7に記載する元のギャップマーの上流および下流にわずかにシフトさせたギャップマーを作製すること(すなわち「マイクロウォーク」)によって設計された。5−10−5MOE、3−14−3MOE、および2−13−5MOEなど、さまざまなモチーフを有するギャップマーも作製した。これらのギャップマーをインビトロで試験した。1ウェルあたり4,000細胞の密度の培養HepB3細胞を、リポフェクチン試薬を使って、50nMアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約24時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、第7因子mRNAレベルをリアルタイムRT−PCRで測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第7因子の阻害百分率として表す。
[表8]
配列番号1の核酸塩基4868〜4899を標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第7因子mRNAレベルの阻害
[表9]
配列番号1の核酸塩基11830〜11869を標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第7因子mRNAレベルの阻害
HepB3細胞におけるヒト第7因子の用量応答アンチセンス阻害
ヒト第7因子のインビトロ阻害を示す実施例5および6のギャップマー(表7、8、9、10、11、12、および13参照)を、HepB3細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を1ウェルあたり4,000細胞の密度でプレーティングし、リポフェクチン試薬を使って、表14に指定するように、3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、および100nM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトした。約16時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、第7因子mRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒト第7因子プライマープローブセットRTS2927を使ってmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第7因子の阻害百分率として表す。表14に示すように、第7因子mRNAレベルは用量依存的に減少した。
HepB3細胞におけるヒト第7因子の効果的な用量依存的アンチセンス阻害の選択および確認
実施例7でヒト第7因子のインビトロ阻害を示したギャップマーを選択し、HepB3細胞において、さまざまな用量で試験した。細胞を1ウェルあたり20,000細胞の密度でプレーティングし、表16に指定するように、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、および100μM濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。約16時間の処理期間後に、RNAを細胞から単離し、ヒト第7因子mRNAレベルを定量リアルタイムPCRで測定した。ヒト第7因子プライマープローブセットRTS2927を使ってmRNAレベルを測定した。RIBOGREEN(登録商標)によって測定される全RNA含有量に応じて、第7因子mRNAレベルを調節した。結果を、無処理対照細胞と比較した第7因子の阻害百分率として表す。表16に示すように、第7因子mRNAレベルは用量依存的に減少した。
短い(14マー)オリゴヌクレオチドによるヒト第7因子のアンチセンス阻害
第7因子核酸を標的とするように短いアンチセンスオリゴヌクレオチド(ショートマー(shortmer))を設計した。表17のショートマーを2−10−2MOEギャップマーとして設計した。これらのギャップマーは14ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは10個の2’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側(5’方向および3’方向)に、それぞれ2個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。5’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドおよび3’ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは2’−MOE修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート(P=S)結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて5−メチルシチジンである。
[表17]
配列番号1または配列番号2を標的とする2−10−2MOEウイングおよびデオキシギャップを有するキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒト第7因子mRNAレベルの阻害
インビトロでのマウス第7因子のアンチセンス阻害
キメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを5−10−5MOEウイングおよびデオキシギャップとして、マウス第7因子(GENBANKアクセッション番号NT_039455.6のヌクレオチド10024000〜10037000;本明細書には配列番号160として組み込まれる)を標的とするように設計した。これらのギャップマーは20ヌクレオチド長であり、中央のギャップセグメントは10個の2’−デオキシヌクレオチドで構成され、その両側(5’方向および3’方向)に、それぞれ5個のヌクレオチドを含むウイングが隣接している。各ウイングセグメント中の各ヌクレオチドは2’−MOE修飾を有する。各ギャップマー中のヌクレオシド間結合はホスホロチオエート(P=S)結合である。各ギャップマー中のシチジン残基はすべて5’メチルシチジンである。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、初代マウス肝細胞におけるマウス第7因子mRNAを減少させるその能力について評価した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドを、初代マウス肝細胞における第7因子mRNAを減少させるその能力について評価した。
インビボでのマウス第7因子のアンチセンス阻害
インビトロ試験で有意な用量依存的阻害を示す4つのアンチセンスオリゴヌクレオチド(実施例10参照)を、インビボで第7因子mRNAを減少させるその能力について評価した。これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マウス第7因子mRNA(GENBANKアクセッション番号NT_039455.6のヌクレオチド10024000〜10037000;配列番号160)を標的とする。それら4つのアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的開始部位は次のとおりである:11326、11336、11613、および11766。
BALB/cマウスをISIS403102(CCATAGAACAGCTTCACAGG、標的部位11336、本明細書には配列番号161として組み込まれる)で処置した。BALB/cマウスに、5mg/kg、10mg/kg、25mg/kg、または50mg/kgのISIS403102を、週に2回、3週間にわたって皮下注射した。対照マウス群には、PBSを週に2回、3週間にわたって皮下注射した。処置期間後に、肝臓全体をRNA分析およびタンパク質分析のために集め、血漿を凝固分析(PT/aPTT)のために集めた。
第7因子のリアルタイムRT−PCR分析用にRNAを肝臓組織から抽出した。表18に示すように、ISIS403102は、PBS対照と比較して、マウス第7因子の用量依存的減少を達成した。結果を、対照と比較した第7因子の阻害百分率として表す。
第7因子発色アッセイ(Hyphen BioMed)を使って血漿第7因子タンパク質を測定した。表19に示すように、ISIS403102は、PBS対照と比較してマウス第7因子タンパク質の用量依存的減少を達成した。結果を、対照と比較した第7因子の阻害百分率として表す。
ISIS403102で処置したマウスから得た乏血小板血漿(PPP)を使って、プロトロンビン時間(PT)および活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)を測定した。表20に記載するPT値およびaPTT値は、国際標準化比(INR)値として報告する。PTおよびaPTTに関するINR値を決定するために、実験群に関するPT値またはaPTT値をPBS処置群に関するPTまたはaPTTで割った。次に、この比を、使用した組織因子の国際感受性指標(ISI)で累乗した。表20に示すように、PTは、対照と比較して、ISIS403102で処置されたマウスでは、有意に延長された。aPTTはISIS403102で処置されたマウスではわずかに延長された。これらのデータは、ISIS403102が血液凝固の内因性経路よりも血液凝固の外因性経路に対して、より大きな影響を有することを示唆している。
ISIS403102の単回投与薬物動態アッセイ
処置
マウスにおけるISIS403102の作用の半減期および持続期間を評価した。27匹のBALB/cマウスからなる群に、50mg/kgのISIS403102を注射した。ISIS403102を単回投与した後、1、2、3、4、6、8、12、24、および56日目に、この群のマウス3匹を屠殺した。3匹のマウスからなる対照群にはPBSを単回投与し、この群のマウスは1日目に屠殺した。すべての群のマウスを、10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した後、頸椎脱臼によって屠殺した。肝臓をRNA分析用に収集し、血漿を凝固分析(PTおよびaPTT)用に集めた。
第7因子のリアルタイムRT−PCR分析用に、RNAを肝臓組織から抽出した。結果を、PBS対照と比較した第7因子の阻害百分率として記載する。表21に示すように、ISIS403102による処置は4日目までに第7因子mRNAの92%阻害をもたらし、その後、ISIS403102の効果は徐々に減少し、24日目までには11%まで低下した。56日目までに、ISIS403102処置マウスにおける第7因子mRNAレベルは、PBS対照のレベルと等しくなる。結果を、対照と比較した第7因子の阻害百分率として表す。これらのデータは、50mg/kgのISIS403102の単回投与のピーク効果が4日目付近で起こり、作用の持続期間が少なくとも24日間は続くことを示している。
ISIS403102で処置したマウスから得た乏血小板血漿(PPP)を使ってプロトロンビン時間(PT)および活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)を測定した。表22に記載するPT値およびaPTT値は、国際標準化比(INR)値として報告する。PTおよびaPTTに関するINR値を決定するために、実験群(すなわち50mg/kg ISIS403102による処置)に関するPT値またはaPTT値をPBS処置群に関するPTまたはaPTTで割った。次に、この比を、使用した組織因子の国際感受性指標(ISI)で累乗した。
ISIS403102の複数回投与薬物動態アッセイ
処置
マウス第7因子のアンチセンス阻害および凝固時間に対するISIS403102の複数回投与の作用の持続期間を評価した。第1のマウス群では、25mg/kgのISIS403102を単回投与として皮下注射した。第1群のマウスは単回投与後の1日目および3日目に屠殺した。第2のマウス群では、25mg/kgのISIS403102を、週に2回、1週間にわたって皮下投与した。第2群のマウスは、ISIS403102の最後の投与を行った後、3日目に屠殺した。第3のマウス群では、25mg/kgのISIS403102を週に2回、2週間にわたって皮下投与した。第3群のマウスは、ISIS403102の最後の投与を行った後、3日目に屠殺した。第4のマウス群では、25mg/kgのISIS403102を、週に2回、3週間にわたって皮下投与した。第4群のマウスは、ISIS403102の最後の投与を行った後、2、7、14、28、42、および56日目に屠殺した。3匹のマウスからなる対照群には、PBSを単回投与として注射した。対照群のマウスは、1日後に屠殺した。すべての群のマウスを、10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した後、頸椎脱臼によって屠殺した。すべての群のマウスについて、肝臓をRNA分析用に収集し、血漿を凝固分析(PTおよびaPTT)用に集めた。
第7因子の定量RT−PCR分析用に、RNAを肝臓組織から抽出した。結果を、PBS対照と比較した第7因子の阻害百分率として記載する。表23に示すように、ISIS403102の単回投与処置は、早くも1日目には、第7因子の阻害をもたらした。単回投与処置群では、阻害は3日目まで増加した。2回のISIS403102投与は、3日目に、ISIS403102の1回投与と比較して増加した阻害をもたらした。阻害は、2回投与処置群では、3日目まで増加した。ISIS403102の4回投与は、3日目に、2回投与処置群と比較して増加した阻害をもたらした。
ISIS403102で処置したマウスから得た乏血小板血漿(PPP)を使ってプロトロンビン時間(PT)および活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT)を測定した。表24に記載するPT値およびaPTT値は、国際標準化比(INR)値として報告する。PTおよびaPTTに関するINR値を決定するために、実験群(すなわち50mg/kg ISIS403102による処置)に関するPT値またはaPTT値をPBS処置群に関するPTまたはaPTTで割った。次に、この比を、使用した組織因子の国際感受性指標(ISI)で累乗した。
FeCl3誘発静脈血栓症(VT)モデルにおけるISIS403102による第7因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
処置
3つのBALB/cマウス群に、25mg/kg、37.5mg/kg、または50mg/kgのISIS403102を、皮下投与により、週に2回、3週間にわたって注射した。BALB/cマウスの2つの対照群はPBSで、皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。マウスの半分ではFeCl3によって血栓形成を誘発させ、残りのマウスは尾出血についてアッセイした。ISIS403102またはPBSの最後の投与を受けた2日後に、マウスを、10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。第1対照群を除くすべてのVTマウス群において、血栓形成をFeCl3で誘発した。
第7因子のリアルタイムRT−PCR分析用に、RNAを肝臓組織から抽出した。結果を、PBS対照と比較した第7因子の阻害百分率として記載する。表25に示すように、ISIS403102による処置は、PBS対照と比較して、第7因子mRNAの有意な用量依存的低下をもたらした。これらのデータは、第7因子の発現を阻害するためにアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用できることを示している。
血栓形成の尺度として、大静脈中の血小板を定量するために、血小板因子4(PF−4)のリアルタイムRT−PCR定量を使用した。結果を、2つのPBS処置対照群と比較した、ISIS403102群におけるPF−4の百分率として記載する。表26に示すように、ISIS403102による処置は、PBS対照と比較して、PF−4の減少をもたらした。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血栓および血塊形成を阻害するのに役立つ。
FeCl3溶液による処置を受けていないマウスを尾採血チャンバーで評価した。ISIS403102またはPBSの最終処置の2日後にマウスを採血チャンバーに入れた。イソフルオラン(isofluorane)を使ってマウスをチャンバー内で麻酔し、尾の小片(先端から約4mm)を滅菌した鋏で切断した。切断した尾を直ちに、37℃に温めた約10mLの0.9%NaClバッファー溶液を充填した15mLファルコンチューブに入れた。血液を40分間にわたって集めた。その食塩水充填チューブの重量を採血の前後に計測した。結果を表27に記載する。
ワルファリンと比較したISIS403102によるマウス第7因子のインビボアンチセンス阻害
処置
ISIS403102およびワルファリン(Coumadin(登録商標))をBALB/cマウスで評価した。4つのBALB/cマウス群を、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、または40mg/kgのISIS403102の皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。最後のISIS403102の投与を行った2日後に、マウスを10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。5番目のBALB/cマウス群は3mg/kgのワルファリンの腹腔内投与により、6日間にわたって毎日処置した。ワルファリンの最後の投与の4時間後に、マウスを屠殺した。対照BALB/cマウス群は、PBSの皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。PBSの最後の投与の2日後に、マウスを10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。第1対照群を除くマウス群では、FeCl3を使って血栓形成を誘発した。
第7因子のリアルタイムRT−PCR分析用に、RNAを肝臓組織から抽出した。結果を、PBS対照と比較した第7因子の阻害百分率として記載する。表28に示すように、ISIS403102による処置は、PBS対照と比較して、第7因子mRNAの有意な用量依存的減少をもたらした。逆に、ワルファリンによる処理は、PBS対照と比較して第7因子の有意な減少をもたらさなかった。
ワルファリンと比較したFeCl3誘発静脈血栓症(VT)モデルに対するマウス第7因子の用量依存的アンチセンス阻害の効果
処置
ISIS403102およびワルファリン(Coumadin(登録商標))をBALB/cマウスで評価した。4つのBALB/cマウス群を、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、または40mg/kgのISIS403102の皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。ISIS403102の最後の投与を行った2日後に、マウスを10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。さらに6つのBALB/cマウス群を、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg.kg、3mg/kg、4mg/kg、または5mg/kgのワルファリンの腹腔内投与により、6日間、毎日処置した。最後のワルファリン投与の4時間後に、マウスを屠殺した。対照BALB/cマウス群は、PBSの皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。最後のPBS投与の2日後に、マウスを10mg/kgキシラジンと混合した150mg/kgケタミンの腹腔内注射による投与で麻酔した。第1対照群を除くマウス群では、FeCl3を使って血栓形成を誘発した。
血栓形成の尺度として、大静脈中の血小板を定量するために、血小板因子4(PF−4)のリアルタイムRT−PCR定量を使用した。結果を、2つのPBS処置対照群と比較した、ISIS403102処置マウスまたはワルファリン処置マウスにおけるPF−4の百分率として記載する。表29に示すように、ISIS403102による処置は、5mg/kg以上の投薬量については、PBS対照と比較して、PF−4の用量依存的減少をもたらした。ワルファリンによる処置は、1mg/kg以上の用量で、PBS対照と比較してPF−4の減少をもたらした。したがって、ISISアンチセンスオリゴヌクレオチドは、血栓および血塊形成を阻害するのに役立つ。
ワルファリンと比較した尾出血アッセイにおけるマウス第7因子のアンチセンス阻害の効果
処置
ISIS403102またはワルファリンによる処置がマウスにおいて内出血を引き起こすかどうかを観察するために、尾出血を測定した。ISIS403102およびワルファリン(Coumadin(登録商標))を尾出血アッセイで評価した。6つのBALB/cマウス群を、1.25mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、または40mg/kgのISIS403102の皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。さらに6つのBALB/cマウス群を、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、および5mg/kgのワルファリンの腹腔内投与により、6日間にわたって毎日処置した。別の対照BALB/cマウス群をPBSの皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。
ISIS403102、ワルファリン、またはPBSの最終処置の2日後に、マウスを尾採血チャンバーに入れた。イソフルオランを使ってマウスをチャンバー内で麻酔し、尾の小片(先端から約4mm)を滅菌した鋏で切断した。切断した尾を直ちに、37℃に温めた約10mLの0.9%NaClバッファー溶液を充填した15mLファルコンチューブに入れた。血液を40分間にわたって集めた。その食塩水充填チューブの重量を採血の前後に計測した。結果を表30に記載する。
アピキサバンと比較した尾出血アッセイにおけるマウス第7因子のアンチセンス阻害の効果
処置
ISIS403102およびアピキサバンをBALB/cマウスで評価した。第1のBALB/cマウス群では、40mg/kgのISIS403102を、週に2回、3週間にわたって皮下投与した。さらに3つのBALB/cマウス群を、5mg/kgおよび10mg/kgのアピキサバンの単回腹腔内投与、ならびに10mg/kgのアピキサバンの単回皮下投与によって処置した。対照BALB/cマウス群は、PBSの皮下投与により、週に2回、3週間にわたって処置した。
ISIS403102またはPBSの最終処置の2日後に、マウスを尾採血チャンバーに入れた。アピキサバンで処置した群のマウスは単回投与の30分後に分析した。イソフルオランを使ってマウスをチャンバー内で麻酔し、尾の小片(先端から約4mm)を滅菌した鋏で切断した。切断した尾を直ちに、37℃に温めた約10mLの0.9%NaClバッファー溶液を充填した15mLファルコンチューブに入れた。血液を40分間にわたって集めた。その食塩水充填チューブの重量を採血の前後に計測した。結果を表31に記載する。
がん転移に対するマウス第7因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
ISIS403102による第7因子の阻害が組織因子−第7因子複合体の形成および転移時のがん細胞の管外遊出におけるその役割に及ぼす効果を評価する。2つの重症複合型免疫不全症(SCID)マウス群を、20mg/kgの用量で週に2回、3週間にわたって注射されるISIS403102で処置する。対照マウス群にはPBSを週に2回、3週間にわたって注射する。ISIS403102またはPBSの最後の投与の2日後に、ISIS403102処置群の1つと対照群には、50×106個のMDA−MB−231乳癌細胞を、静脈内注射する。
肝線維症に対するマウス第7因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
ISIS403102による第7因子の阻害が実験的肝線維症に及ぼす効果を四塩化炭素肝傷害モデルで評価する。
第1のBALB/cマウス群では、20mg/kgのISIS403102を週に2回、8週間にわたって皮下注射する。第2のマウス群では、PBSを週に2回、8週間にわたって皮下注射する。ISIS403102またはPBSによる最初の処置の2週間後に、両方のマウス群に、95μlの鉱油に溶解した5μlの四塩化炭素(CCl4)を、週に2回、5週間にわたって腹腔内投与する。第3のマウス群には、100μlの鉱油だけを注射する。マウスをイソフルオランによる麻酔後に、頸椎脱臼によって屠殺する。肝臓組織をすべてのマウスから収集する。リアルタイムRT−PCRを使って、1型コラーゲン、α−平滑筋アクチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)3、TGF−β、Timp1およびTimp2(MMPインヒビター)を含む線維症関連遺伝子の発現を決定する。実験群におけるレベルを対照マウスにおけるレベルと比較して、第7因子の阻害が肝線維症の発生に及ぼす効果を評価する。
コラーゲン誘発関節炎に対するマウス第7因子のアンチセンス阻害のインビボ効果
ISIS403102による第7因子の阻害が、組織因子−第7因子複合体の形成ならびに関節炎および慢性関節リウマチにつながる関節中のフィブリン蓄積におけるその役割に及ぼす効果を、コラーゲン誘発関節炎モデルで評価する。
第1のDBA/1Jマウス群では、20mg/kgのISIS403102を、週に2回、8週間にわたって皮下注射する。2つのマウス群には、PBSを週に2回、8週間にわたって注射する。最初のISIS403102処置の2週間後に、II型ウシコラーゲン(Chondrex)を完全フロイントアジュバントと混合し、氷上でホモジナイズし、100μgのコラーゲンを含有するそのエマルションを実験群および第1対照群に皮下注射する。1回目のコラーゲン注射の7日後に、これらの群の両方に、100μgのII型コラーゲンが不完全フロイントアジュバントに入っているブースター注射剤を皮下注射する。
Claims (33)
- 12〜30個の連結されたヌクレオシドからなり、核酸塩基配列を有する修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物であって、その核酸塩基配列が、配列番号1のヌクレオチド15128〜15223の同じ数の核酸塩基に相補的な少なくとも12個の連続する核酸塩基部分を含み、その修飾オリゴヌクレオチドが配列番号1に少なくとも80%相補的である化合物。
- 一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる請求項1の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドが配列番号53の核酸塩基配列を有する、請求項2の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号167のいずれかの核酸塩基配列に少なくとも80%相補的である、請求項2の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号167のいずれかの核酸塩基配列に少なくとも90%相補的である、請求項2の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドの核酸塩基配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、または配列番号167のいずれかの核酸塩基配列に100%相補的である、請求項2の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシド間結合が修飾ヌクレオシド間結合である、請求項2の化合物。
- 各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項7の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項2の化合物。
- 少なくとも1つの修飾糖が二環式糖である、請求項9の化合物。
- 少なくとも1つの修飾糖が2’−O−メトキシエチルを含む、請求項9の化合物。
- 少なくとも1つのヌクレオシドが修飾核酸塩基を含む、請求項2の化合物。
- 修飾核酸塩基が5−メチルシトシンである、請求項12の化合物。
- 修飾オリゴヌクレオチドが、
連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが修飾糖を含む、請求項2の化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
10個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
5個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
5個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項14の化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
14個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
3個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
3個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントに直接隣接してそれらの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項14の化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
13個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
2個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
5個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項14の化合物。 - 修飾オリゴヌクレオチドが、
12個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント;
2個の連結されたヌクレオシドからなる5’ウイングセグメント;
2個の連結されたヌクレオシドからなる3’ウイングセグメント;
を含み、ギャップセグメントは5’ウイングセグメントと3’ウイングセグメントの間に位置し、各ウイングセグメントの各ヌクレオシドが2’−O−メトキシエチル糖を含み、各ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項13の化合物。 - 配列番号53の核酸塩基配列の少なくとも12個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む12〜30個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドまたはその塩と、医薬上許容される担体または希釈剤とを含む組成物。
- 修飾オリゴヌクレオチドが一本鎖修飾オリゴヌクレオチドからなる、請求項19の組成物。
- 修飾オリゴヌクレオチドが20個の連結されたヌクレオシドからなる、請求項19の組成物。
- 配列番号53の核酸塩基配列の少なくとも12個の連続核酸塩基を含む核酸塩基配列を含む12〜30個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを動物に投与することを含む方法。
- 動物がヒトである、請求項22の方法。
- 投与により深部静脈血栓症が予防される、請求項23の方法。
- 投与により肺塞栓症が予防される、請求項23の方法。
- 投与により過剰増殖性障害が処置される、請求項23の方法。
- 投与により炎症状態が処置される、請求項23の方法。
- 前記化合物と、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、およびラブノックスから選択される群のいずれかとを併用投与することを含む、請求項23の方法。
- 前記化合物と、アスピリン、クロピドグレル、ジピリダモール、ヘパリン、レピルジン、チクロピジン、ワルファリン、アピキサバン、リバロキサバン、およびラブノックスから選択される群のいずれかとが、同時に投与される、請求項23の方法。
- 投与が非経口投与である、請求項23の方法。
- 非経口投与が皮下投与または静脈内投与のいずれかである、請求項30の方法。
- 血栓塞栓性合併症を有するリスクがある動物を同定すること、および
そのリスクがある動物に、12〜30個の連結されたヌクレオシドからなる修飾オリゴヌクレオチドを含む化合物の治療有効量を投与すること
を含む方法であって、その修飾オリゴヌクレオチドが第9因子核酸に相補的である方法。 - 血栓塞栓性合併症が深部静脈血栓症、肺塞栓症、またはそれらの組み合わせである、請求項32の方法。
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