JP2003512068A - 腫瘍壊死因子アルファ変換酵素（ｔａｃｅ）発現のアンチセンスモジュレーション - Google Patents

腫瘍壊死因子アルファ変換酵素（ｔａｃｅ）発現のアンチセンスモジュレーション

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Abstract

(57)【要約】 ヒト腫瘍壊死因子-α-変換酵素（TACE）の発現を阻害するための組成物および方法を提供する。TACEをコードする核酸を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましい。TACE発現を阻害するための、およびTACEあるいはTNF-αの過剰発現に関連する疾患、特に炎症性および自己免疫性疾患、を治療するためのこれらのオリゴヌクレオチドを使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の属する分野 本発明は、感染および炎症性疾患に関係するサイトカインである腫瘍壊死因子
アルファ（TNF-α）のプロセッシングに関連するディスインテグリンメタロプロ
テアーゼ（disintegrin metalloprotease）をコードする、ヒトTNF-α変換酵素
（TACE）遺伝子の発現をモジュレートする組成物および方法に関する。本発明は
また、TNF-αのTACEプロセッシングを阻害する方法にも関する；これらの方法は
診断的あるいは治療的に使用できる。さらに、本発明はTNF-α媒介細胞性事象、
特にL-セレクチンの発散（shedding）、のモジュレーション、および成熟したプ
ロセッシングされた形態のTNF-α分子の過剰発現と関連する状態の処理にも関す
る。
【０００２】 発明の背景 腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α、カケクチン（cachectin）でもある）は、宿
主防御において役割をする重要なサイトカインである。サイトカインは感染、侵
襲、創傷、あるいは炎症に反応して主にマクロファージおよび単球で産生される
。TNF-αの誘導物資のいくつかの例には、細菌性内毒素、細菌、ウイルス、リポ
多糖（LPS）およびGM-CSF、IL-1、Il-2およびIFN-γを含むサイトカインが含ま
れる。
【０００３】 TNF-αは最初に26 kD膜結合タンパク質として合成される。TNF-αの17 kD断片
は分泌されて、他の分泌型と共に三量体を形成する。この三量体は2つの異なる
受容体、TNF受容体I（TNFRI、p55）およびTNFRII（p75）、と相互作用して、そ
の作用を伝達し、その正味の結果は遺伝子発現および／あるいはアポトーシスの
変化である。TNF-αにより誘導される細胞性因子には、インターロイキン-1（IL
-1）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-8（IL-8）、インターフ
ェロン-γ（IFN-γ）、血小板由来成長因子（PDGF）、表皮成長因子（EGF）、お
よび内皮白血球接着分子1（ELAM-1）、細胞間接着分子-1（ICAM-1）および血管
細胞接着分子-1（VCAM-1）を含む内皮細胞接着分子が含まれる（Tracey,K.J. et
al., Annu. Rev. Cell Biol., 1993, 9, 317-343; Arvin,B. et al., Ann. NY
Acad. Sci., 1995, 765, 62-71）。
【０００４】 TNF-αの膜結合型から分泌型へのプロセッシングは、TNF-α変換酵素（TACE、
ADAM17でもある）として知られる特異的なメタロプロテアーゼによる。TACEはAD
AM（A Disintegrin And Metalloprotease）ファミリーの構成分子である。TACE
はまた、p75 TNF受容体、L-セレクチンおよび形質転換増殖因子-α（TGF-α；Pe
schon, J.J. et al., Science, 1998, 282, 1281-1284）を含む他の膜タンパク
質のプロセッシングにおいて、直接的なタンパク質分解の役割を有することも示
されている。特に、L-セレクチンは、白血球のローリングに関連する接着分子で
あり、白血球が炎症部位で内皮に付着すること、ならびに白血球が末梢リンパ節
の高内皮細静脈（high endothelial venules）に結合することを媒介する。
【０００５】 TACEの阻害物質は、細胞外環境へのTNF-αの放出を阻害して、TNF-α媒介シグ
ナル伝達を妨げるであろう。従って、TACE阻害物質は、TNF-αの過剰産生に関連
する疾患において臨床的な有用性を持ちうる。さらなる有用性は、TGF-αなどの
多くの癌および乾癬（Kumar, V. et al., Cell Biol Int., 1995, 19, 373-388
）に関連することが示されている他の膜結合TACE基質、およびβ-アミロイド前
駆体タンパク質のプロセッシングを制御する場合に存在しうる。
【０００６】 TNF-αの過剰発現により、しばしば疾患状態、特に感染性、炎症性および自己
免疫性疾患が引き起こされる。この過程はアポトーシス経路を含みうる（Ksonti
ni,R. et al., J. Immunol., 1998, 160, 4082-4089）。高レベルの血漿TNF-α
は、敗血症候群、細菌性髄膜炎、大脳マラリア、およびAIDSなどの感染性疾患；
慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、サルコイドーシス、多
発性硬化症、川崎症候群、対宿主性移植片病および移植（同種移植片）拒絶など
の自己免疫疾患；成人呼吸促迫症候群、うっ血性心不全、急性肝不全および心筋
梗塞などの臓器不全症状に見出されている（Eigler,A. et al., Immunol. Today
, 1997, 18, 487-492）。TNF-αが関連する他の疾患には、喘息（Shah, A. et a
l., Clinical and Experimental Allergy, 1995, 25, 1038-1044）、虚血後の脳
損傷（Arvin,B. et al., Ann. NY Acad. Sci., 1995, 765, 62-71）、非インス
リン依存性糖尿病（Hotamisligil,G.S. et al., Science, 1993, 259, 87-90）
、インスリン依存性糖尿病（Yang,X.-D. et al., J. Exp. Med., 1994, 180, 99
5-1004）、肝炎（Ksontini,R. et al., J. Immunol., 1998, 160, 4082-4089）
、アトピー性皮膚炎（Sumimoto,S. et al., Arch. Dis. Child., 1992, 67, 277
-279）、および膵炎（Norman,J.G. et al., Surgery, 1996, 120, 515-521）が
含まれる。さらに、Suganuma, M.ら（Cancer Res., 1996, 56, 3711-3715）は、
TNF-αの阻害物質が癌の予防に有用であり得るということを示唆する。加えて、
亢進したTNF-α発現は、肥満において役割をする場合がある（Kern,P.A., J. Nu
tr., 1997, 127, 1917S-1922S）。TNF-αはヒト脂肪細胞で発現して、一般的に
肥満に相関して発現が増加することが見出された。
【０００７】 L-セレクチンは、虚血／再灌流損傷、特に心筋（Ma, X.L. et al., Circulati
on, 1993, 88, 649-658）、および肝臓（Yadav, S.S., Am. J. Physiol., 1998,
275, G1341-G1352）および血栓塞栓性卒中（Bednar, M.M. et al., Neurol. Re
s., 1998, 20, 403-408）；急性骨髄性白血病（Extermann, M. et al., Blood,
1998, 92, 3115-3122）、B細胞性慢性リンパ性白血病（Csanaky, G. et al., Ha
ematologica, 1994, 79, 132-136）；多発性硬化症の動物モデルである実験的自
己免疫性脳脊髄炎（EAE）（Archelos, J.J. et al., J. Neurol. Sci., 1998, 1
59, 127-134）、ヒトT細胞性リンパ親和性（lymphotropic）ウイルスI型関連ミ
エロパシー（Tsujino, A. et al., J. Neurol. Sci., 1998, 155, 76-79）、髄
膜脳炎（Buhrer, C. et al., Arch. Dis. Child., 1996, 74, 288-292）；慢性
関節リウマチ（Kurohori, Y. et al., Clin. Rheumatol., 1995, 14, 335-341）
、潰瘍性大腸炎（Seidelin, J.B. et al., Am. J. Gastroenterol., 1998, 93,
1854-1859）；慢性肺疾患（Kotecha, S. et al., Arch. Dis. Child. Fetal Neo
natal Ed., 1998, 78, F143-F147）に関連することが見出されている。
【０００８】 現在、TNF-α発現の阻害に対するアプローチがいくつかある。慢性関節リウマ
チの治療に使用されるアプローチには、キメラ抗TNF-α抗体、ヒト化モノクロー
ナル抗TNF-α抗体、および組換えヒト可溶性TNF-α受容体が含まれる（Camussi,
G., Drugs, 1998, 55, 613-620）。他の例は、ホスホジエステラーゼ阻害物質（
例えば、ペントキシフィリン）およびメタロプロテアーゼ阻害物質を含む間接的
TNF-α阻害物質である（Eigler,A. et al., Immunol. Today, 1997, 18, 487-49
2）。直接的TNF-α阻害物質のさらなる種類はオリゴヌクレオチドであり、三重
鎖形成性オリゴヌクレオチド、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオ
チドが含まれる。L-セレクチンの阻害物質には、モノクローナル抗体（Bednar,
M.M. et al., Neurol. Res., 1998, 20, 403-408）、フコイジン（Nasu, T. et
al., Immunol. Lett., 1997, 59, 47-51）、およびオリゴヌクレオチドアプタマ
ー（aptamer）（Ringquist,S.およびParma,D., Cytometry, 1998, 33, 394-405
）が含まれる。
【０００９】 マトリックスメタロプロテアーゼの広域スペクトル阻害物質はTACEの阻害に効
果的であるが、特異的な阻害物質が臨床的な使用にとって望ましい。 米国特許5,629,285は、ペプチジル誘導体に基づくTACEの小分子阻害物質を記
載する。WO 96/41624は、TACEの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌク
レオチドの使用を記載するが、オリゴヌクレオチド配列は開示されなかった。
【００１０】 TACEの発現、およびそれと共に関連する疾患過程を標的とする治療的な組成物
および方法がについて未解決な必要性が存在するままである。 発明の概要 本発明は、TACEをコードする核酸を標的とし、そしてTACE発現をモジュレート
することができるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はまた、ヒトTACEをコ
ードする核酸を標的とするキメラオリゴヌクレオチドも提供する。本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、診断および治療の両方に有用であると信じられており、特に
本発明の方法において有用であると信じられている。
【００１１】 本発明はまた、細胞および組織において、本発明のオリゴヌクレオチドを使用
して、ヒトTACEの発現をモジュレートする方法を含む。TACE発現を阻害する方法
を提供する；これらの方法は、診断および治療の両方に有用であると信じられて
いる。これらの方法はまた、例えば、様々な細胞機能および生理学的な過程およ
び状態におけるTACEの役割を検出および決定するための、およびTACEあるいはそ
の基質である、TNF-αの発現に関連する症状を診断するためのツールとしても有
用である。
【００１２】 本発明はまた、感染性および炎症性疾患、特に糖尿病、慢性関節リウマチ、ク
ローン病、膵炎、多発性硬化症、アトピー性皮膚炎および肝炎を診断および治療
するための方法を含む。これらの方法は、例えば、TACE関連疾患あるいはTNF-α
関連疾患の進行を診断する際に有用であると信じられている。これらの方法は、
本発明のオリゴヌクレオチドを使用する。これらの方法は、予防を含む治療的に
、および臨床的研究および診断的ツールとして共に有用であると信じられている
。
【００１３】 本発明はさらに、L-セレクチンの発散（shedding）を阻害する方法およびL-セ
レクチン発散の変化に関連する疾患および症状を阻害する方法を含む。 発明の詳細な説明 TNF-αは、様々な外来病原体に対する免疫反応において重要な制御的な役割を
する。TNF-αの過剰発現は、多くの感染性および炎症性疾患を引き起こす。その
ように、このサイトカインはそのような疾患の治療のための魅力的な標的だとい
える。特に、TNF-αの発現のモジュレーションは、クローン病、糖尿病、多発性
硬化症、慢性関節リウマチ、肝炎、膵炎および喘息などの疾患の治療のために有
用でありうる。
【００１４】 TACEは、TNF-αの膜結合型からその分泌型へのプロセッシングを担っている。
従って、TACEのモジュレーションは、TNF-αのプロセッシングおよびTNF-αの発
現と関連する疾患あるいは症状をモジュレートする効果的な手段であると考えら
れる。
【００１５】 本明細書中で開示されるように、TACEはまた、L-セレクチンの発散も担ってい
る。TACEのモジュレーションはまた、L-セレクチンおよびL-セレクチンと関連す
る疾患あるいは症状をモジュレートする効果的な手段でもありうる。
【００１６】 本発明は、TACEをコードする核酸分子の機能をモジュレートする際に、究極的
には産生されるTACEの量およびプロセッシングされるTNF-αの量をモジュレート
する際に使用するための、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを利用
する。これは、TACEをコードする核酸、好ましくはmRNAと特異的にハイブリダイ
ズするオリゴヌクレオチドを提供することにより達成される。
【００１７】 オリゴヌクレオチドなどのアンチセンス化合物、およびそれがハイブリダイズ
するその相補的な核酸標的の間のこの関係は、一般に“アンチセンス”として言
われる。本発明の文脈において、選択された核酸標的に対してオリゴヌクレオチ
ドを“標的化する”とは、複数工程のプロセスである。プロセスは通常、その機
能をモジュレートすべき核酸配列を同定することからはじめる。例えば、このこ
とは、その発現が特定の疾患状態と関連する細胞の遺伝子（あるいはその遺伝子
からつくられるmRNA）、あるいは感染性病原体に由来する外来核酸でありうる。
本発明において、標的はTACEをコードする核酸である；言い換えると、TACEをコ
ードする遺伝子、あるいはTACE遺伝子から発現されるmRNAである。TACEをコード
するmRNAは、現在好ましい標的である。標的化のプロセスにはまた、アンチセン
ス相互作用のために核酸配列中の一つあるいは複数の部位の決定を決定し、遺伝
子発現のモジュレーションを結果として生じるようにすることが含まれる。
【００１８】 本発明に従って、当業者はメッセンジャーRNAが3文字遺伝的コードを使用して
タンパク質をコードするための情報だけでなく、5'-非翻訳領域、3'-非翻訳領域
、5'キャップ領域およびイントロン／エクソン結合部リボヌクレオチドとして当
業者に知られる領域を形成する関連するリボヌクレオチドも含むことを理解する
であろう。このように、本発明に従って、これらの関連するリボヌクレオチドお
よび情報性のリボヌクレオチドの全体あるいは一部を標的とするオリゴヌクレオ
チドを処方することができる。それゆえに、オリゴヌクレオチドは、転写開始部
位領域、翻訳開始コドン領域、5'キャップ領域、イントロン／エクソン結合部、
コード配列、翻訳停止コドン領域あるいは5'-あるいは3'-非翻訳領域内の配列と
特異的にハイブリダイズしうる。当該技術分野で既知であるように、翻訳開始コ
ドンは典型的には5'-AUG（転写されたmRNAにおいて；対応するDNA分子では5'-AT
G）であるので、翻訳開始コドンはまた“AUGコドン”、“スタートコドン”ある
いは“AUG開始コドン”としても言及される。少数の遺伝子は、RNA配列5'-GUG、
5'-UUGあるいは5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そして5'-AUA、5'-ACGお
よび5'-CUGがin vivoで機能することが示された。このように、それぞれに事象
における開始アミノ酸は典型的にはメチオニン（真核生物において）あるいはホ
ルミルメチオニン（原核生物において）であるにもかかわらず、用語“翻訳開始
コドン”および“スタートコドン”は多くのコドン配列を含むことができる。真
核細胞の遺伝子および原核細胞の遺伝子は、2あるいはそれ以上の代わりのスタ
ートコドンを有する場合があり、そのいずれをも好ましくは特定の細胞型あるい
は組織においてあるいは特定の条件のセットのもとにおいて、翻訳開始のために
利用することができる、ということも、当該技術分野において既知である。本発
明の文脈において、“スタートコドン”および“翻訳開始コドン”は、そのよう
なコドンの配列にかかわらず、in vivoで使用して、TACEをコードする遺伝子か
ら転写されるmRNA分子の翻訳を開始する、1あるいはそれ以上のコドンのことを
いう。遺伝子の翻訳終止コドン（あるいは“停止コドン”）は、3つの配列、す
なわち、5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ、5'-TAA
、5'-TAGおよび5'-TGA）のうちの一つを有しうることも、当該技術分野において
既知である。用語“スタートコドン領域”“AUG領域”および“翻訳開始コドン
領域”は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（すなわち、5'あるいは3'）に約
25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAあるいは遺伝子の部分のことを
言う。この領域は、好ましい標的領域である。同様に、用語“停止コドン領域”
および“翻訳終止コドン領域”は、翻訳終止コドンからいずれかの方向（すなわ
ち、5'あるいは3'）に約25から約50の連続するヌクレオチドを含む、mRNAあるい
は遺伝子の部分のことを言う。この領域は、好ましい標的領域である。翻訳開始
コドンと翻訳終止コドンとのあいだの領域のことを言うと当該技術分野において
知られているオープンリーディングフレーム（ORF）あるいは“コード領域”は
また、効果的に標的化されうる領域でもある。その他の好ましい標的領域には、
翻訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの部分、そしてしたがってmRNAの5'キャ
ップ部位と翻訳開始コドンとのあいだのヌクレオチドあるいは遺伝子上の対応す
るヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分野において知られている
5'非翻訳領域（5'UTR）、そして翻訳終止コドンから3'方向におけるmRNAの部分
、そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンと3'末端とのあいだのヌクレオチドあ
るいは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含むもの、のことをいうと当該技術分
野において知られている3'非翻訳領域（3'UTR）、が含まれる。mRNAの5'キャッ
プには5'-5'三リン酸結合を介して、mRNAの最も5'側の残基と結合するN7-メチル
化グアノシン残基が含まれる。mRNAの5'キャップ領域には、5'キャップ構造それ
自体だけでなく、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドも含まれると考えら
れている。5'キャップ領域もまた、好ましい標的領域でありうる。
【００１９】 いくつかの真核細胞mRNA転写物は直接的に翻訳されるが、多くは1あるいはそ
れ以上の“イントロン”として知られる領域を含有し、それらがプレ-mRNA転写
物から切り出されて、一つあるいはそれ以上の成熟mRNAを産出する。残りの（そ
してしたがって翻訳される）領域は、“エクソン”として知られ、そして一緒に
スプライシングされて連続的なmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すな
わち、エクソン-エクソンあるいはイントロン-エクソン結合もまた、好ましい標
的領域である場合があり、そして特に異常なスプライシングが疾患に関与してい
るか、あるいは特定のmRNAスプライス産物の過剰産生が疾患に関与している状況
において、特に有用である。再構成あるいは欠損による異常な融合結合もまた、
好ましい標的である。選択的にスプライシングされたmRNAにおいて特定のエクソ
ンを標的化することもまた、好ましい場合がある。イントロンも、たとえばDNA
あるいはプレ-mRNAを標的とするアンチセンス化合物のための有効な、そしてし
たがって好ましい標的領域である場合があることもまた、見出した。
【００２０】 いったん1つあるいは複数の標的部位を同定したら、標的に対して十分に相補
的な、すなわち、十分によくそして十分に特異的にハイブリダイズする、オリゴ
ヌクレオチドを選択し、所望のモジュレーションを得る。
【００２１】 本発明中の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は、通常は対となる核
酸鎖あるいは一つの核酸鎖の2つの領域における相補的塩基間での、ワトソン-ク
リック水素結合としても知られる、水素結合を意味する。グアニンおよびシトシ
ンは、それらの間で3つの水素結合を形成することが知られている相補的塩基の
例である。アデニンおよびチミンは、それらの間で二つの水素結合を形成する相
補的塩基の例である。
【００２２】 “特異的にハイブリダイズ可能”および“相補的”は、安定でそして特異的な
結合がDNAあるいはRNA標的とオリゴヌクレオチドとのあいだで生じるような、十
分な程度の相補性を示すために使用される用語である。
【００２３】 オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的
核酸の配列と100％の相同性がある必要はないことは理解されている。オリゴヌ
クレオチドは、標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能
を妨害して利用できないようにし、そして特異的な結合が所望される条件下、す
なわち、in vivoアッセイあるいは治療の場合には生理学的条件下、そしてin vi
troアッセイの場合には、アッセイを行う条件下にて、非-標的配列に対するオリ
ゴヌクレオチドの非-特異的結合を妨害するための十分な程度の相補性が存在す
る場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【００２４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドのmRNAとのハイブリダイゼーションは、一つ
あるいはそれ以上のmRNAの正常機能を妨害する。妨害されるべきmRNAの機能には
、すべての生存に必要な機能、たとえばRNAのタンパク質翻訳部位への転移（tra
nslocation）、RNAからタンパク質への翻訳、1あるいはそれ以上のmRNA種を得る
ためのRNAのスプライシング、およびRNAに含まれうる触媒活性、が含まれる。RN
Aへの特異的タンパク質の結合もまた、RNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオ
チドのハイブリダイゼーションにより妨害されうる。
【００２５】 mRNA機能の妨害の全体的な効果は、TACEの発現のモジュレーションである。本
発明の文脈において、“モジュレーション”とは、阻害あるいは刺激のいずれか
；すなわち、発現における減少あるいは増加のいずれか、を意味する。このモジ
ュレーションは、当該技術分野では日常的な方法、例えば、mRNA発現のノーザン
ブロットアッセイ、あるいは逆転写酵素PCRにより、本出願の実施例で教示され
るように、あるいはタンパク質発現のウエスタンブロットあるいはELISAアッセ
イにより、あるいはタンパク質発現の免疫沈降アッセイによって、測定できる。
細胞増殖あるいは腫瘍細胞成長に対する効果も、本出願の実施例で教示されるよ
うに、測定できる。阻害は現在好ましい。
【００２６】 本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療、予防、および研究試薬およびキ
ットにおいて使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドは、TACEをコードする核
酸とハイブリダイズするので、サンドイッチアッセイ、発色アッセイおよびその
他のアッセイを容易に構築して、この事実を利用することができる。TACE遺伝子
あるいはmRNAとのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するため
の手段の準備は、日常的に達成することができる。そのような準備には、酵素結
合、放射性標識化あるいはその他の適した検出システムのいずれかが含まれうる
。TACEの存在あるいは非存在を検出するキットも、調製されうる。
【００２７】 本発明はまた、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患を有していると疑われる患
者由来の組織あるいはその他の試料における異常な炎症状態の検出に適している
。本発明のオリゴヌクレオチドが炎症プロセスを阻害する能力を利用して、その
ような状態を診断することができる。多くのアッセイは本発明を使用して計画で
き、それらのアッセイは一般に、そのような阻害を検出、そして通常は定量でき
るように選択された条件の下で、本発明のオリゴヌクレオチドと組織試料とを接
触させることを含むであろう。本発明の文脈において、一つあるいは複数のオリ
ゴヌクレオチドと組織あるいは細胞を“接触させる”ことは、細胞懸濁液あるい
は組織試料に、in vitroあるいはex vivoのいずれかで、通常は液状キャリア中
でオリゴヌクレオチドを加えること、あるいは動物内の細胞あるいは組織にオリ
ゴヌクレオチドを投与することを意味する。
【００２８】 本発明のオリゴヌクレオチドはまた、研究目的にも使用されうる。従って、オ
リゴヌクレオチドにより示される特異的なハイブリダイゼーションは、当業者に
認識されうるアッセイ、精製、細胞性産生物調製およびその他の方法論において
使用することができる。
【００２９】 本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸あるいは
デオキシリボ核酸のオリゴマーあるいはポリマーのことをいう。この用語には、
天然に存在する核塩基、糖および共有糖間（バックボーン）結合、および同様に
機能する非-天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌ
クレオチドが含まれる。このような修飾されたあるいは置換されたオリゴヌクレ
オチドは、たとえば、細胞取り込みの亢進、標的に対する結合の亢進、そしてヌ
クレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性のため、しばしば
天然の型より好ましい。
【００３０】 本発明に従うアンチセンス化合物は、好ましくは、約5から約50核塩基を含む
。約8から約30核塩基（すなわち、約8から約30の連結したヌクレオシド）を含む
アンチセンスオリゴヌクレオチドが特に好ましい。当該技術分野において知られ
ているように、ヌクレオシドは塩基-糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩
基部分は、通常はヘテロ環式塩基である。このようなヘテロ環式塩基の2つの最
も一般的なクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシ
ドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペント
フラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の2'、3'あ
るいは5'ヒドロキシル部分のいずれかに結合することができる。オリゴヌクレオ
チドを形成する際に、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直
鎖ポリマー化合物を形成する。引き続いて、この直鎖ポリマー構造のそれぞれの
末端がさらに一緒になって、環状構造を形成することができるが、しかしながら
、開環直鎖構造が一般的には好ましい。オリゴヌクレオチド構造中において、リ
ン酸基とは、一般的には、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを
形成するものと言われる。RNAおよびDNAの正常な結合あるいはバックボーンは、
3'から5'のホスホジエステル結合である。
【００３１】 本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例には、修飾バ
ックボーンあるいは非-天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチド
が含まれる。本明細書中で定義する場合、修飾バックボーンを有するオリゴヌク
レオチドには、バックボーン中にリン原子を保持するものや、バックボーン中に
リン原子を有さないものが含まれる。本明細書の目的のため、そして当該技術分
野において時々参照される場合、そのヌクレオシド間バックボーン中にリン原子
を有さない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドであると考える
ことができる。
【００３２】 好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、たとえば、ホスホロチオ
エート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステ
ル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネートおよびキ
ラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィ
ネート、3'-アミノホスホールアミデートおよびアミノアルキルホスホールアミ
デートを含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート、チオノアル
キルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な3'-5'結
合を有するボラノホスホネート、2'-5'結合したこれらの類似体、そしてヌクレ
オシドユニットの隣接する対が、5'-3'に対して3'-5'あるいは5'-2'に対して2'-
5'に結合する、逆向きの極性を有するもの、が含まれる。様々な塩、混合塩、そ
して遊離酸型も含まれる。
【００３３】 上述したリン-含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許3,6
87,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423
；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,45
3,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306
；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；および5,625,050が含まれる
が、これらには限定されない。
【００３４】 リン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖ア
ルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテロ原子そしてアル
キルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは1あるいはそれ以上
の短鎖へテロ原子あるいはヘテロ環式ヌクレオシド間結合により形成される、バ
ックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖
部分から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドお
よびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボ
ーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケ
ン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチ
レンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン
；アミドバックボーン；および混合N、O、SおよびCH2構成要素部分を有するその
他のもの、を有するものが含まれる。
【００３５】 上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許
5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,
562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5
,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,0
46；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；お
よび5,677,439が含まれるが、これらには限定されない。
【００３６】 その他の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、ヌクレオチドユニット
の糖およびヌクレオシド間結合の両方、すなわち、バックボーンを、新規の基に
より置換する。塩基ユニットは、適した核酸標的化合物とのハイブリダイゼーシ
ョンのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有すると示され
たそのようなオリゴマー化合物の一つであるオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプ
チド核酸（PNA）とも呼ばれている。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの
糖-バックボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバッ
クボーンにより置換される。核塩基を保持し、そしてそれをバックボーンのアミ
ド部分のアザ窒素原子に直接的あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を
教示する代表的な米国特許には、U.S.特許5,539,082；5,714,331；および5,719,
262が含まれるが、これらだけには限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、
Nielsenら（Science, 1991, 254, 1497-1500）中に見出すことができる。
【００３７】 本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを有するオリ
ゴヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを有するオリゴヌクレオシドであ
り、特に上述の米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N（CH3）-O-CH2-〔
メチレン（メチルイミノ）あるいはMMIバックボーンとして知られる〕、-CH2-O-
N（CH3）-CH2-、-CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2-および-O-N（CH3）-CH2-CH2-〔こ
こで、天然のホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-として示される〕そ
して上述の米国特許5,602,240のアミドバックボーンである。上述した米国特許5
,034,506のモルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ま
しい。
【００３８】 修飾オリゴヌクレオチドは、1あるいはそれ以上の置換糖部分も含有する場合
がある。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位で以下のものの一つを含む：OH；
F；O-、S-、あるいはN-アルキル、O-アルキル-O-アルキル、O-、S-、あるいはN-
アルケニル、あるいはO-、S-あるいはN-アルキニル、ここでアルキル、アルケニ
ルおよびアルキニルは、置換あるいは非置換のC1からC10アルキルあるいはC2か
らC10アルケニルおよびアルキニルでありうる。O［（CH2）nO］mCH3、O（CH2）n OCH3、O（CH2）2ON(CH3)2、O（CH2）nNH2、O（CH2）nCH3、O（CH2）nONH2、およ
びO（CH2）nON［（CH2）nCH3）］2、ここでnおよびmは1から約10である、が特に
好ましい。その他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下のものの一つを
含む:C1からC10の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル
、O-アルカリールあるいはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OC
F3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシク
ロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RN
A切断基、リポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態
特性を向上するための基、あるいはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を向上す
るための基、そして同様の特性を有するその他の置換基を含む。好ましい修飾に
は、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OCH3、2'-O-（2-メトキシエチル）ある
いは2'-MOEとしても知られる）（Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78,
486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修
飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知ら
れるO（CH2）2ON（CH3）2基、そして2'-ジメチルアミノエトキシエトキシ（2'-D
MAEOE）、すなわち、2'-O-CH2-O-CH2-N（CH2）2、が含まれる。
【００３９】 その他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ
（2'-OCH2CH2CH2NH2）および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾もま
た、オリゴヌクレオチドのその他の位、特に3'末端ヌクレオチドあるいは2'-5'
結合オリゴヌクレオチド中の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位において
作製することもできる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに
シクロブチル部分などの糖模倣体を有する場合もある。このような修飾糖構造の
調製を教示する代表的な米国特許には、U.S.特許4,981,957；5,118,800；5,319,
080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5
,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,8
73；5,646,265；5,658,873；5,670,633；および5,700,920が含まれるが、これら
には限定されない。
【００４０】 オリゴヌクレオチドには、核塩基（しばしば当該技術分野において単に“塩基
”としても呼ばれる）修飾あるいは置換も含まれうる。本明細書中に使用される
場合、“非修飾”あるいは“天然”核塩基には、プリン塩基である、アデニン（
A）およびグアニン（G）、そしてピリミジン塩基である、チミン（T）、シトシ
ン（C）およびウラシル（U）が含まれる。修飾核塩基には、その他の合成および
天然核塩基、たとえば5-メチルシトシン（5-me-Cまたはm5c）、5-ヒドロキシメ
チルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよ
びグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニン
の2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンお
よび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルお
よびシトシン、6-アゾのウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（シュー
ドウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキ
ル、8-ヒドロキシルおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特
に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシ
ン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザア
デニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグアニンおよ
び3-デアザアデニンが含まれる。さらなる核塩基には、米国特許No. 3,687,808
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g 1990, pages 858-859、Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sonsに開示され
たもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991,
30, 613に開示されたもの、そしてSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Res
earch and Applications 1993, pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B.
, ed., CRC Pressにより開示されたもの、が含まれる。これらの核塩基の特定の
ものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるために特に有用で
ある。これらには、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-
プロピニルシトシンを含む、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N
-6およびO-6置換プリンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定
性を0.6から1.2℃増加させることが示され（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and
Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications 1993, CRC Press, B
oca Raton, pages 276-278）、そして現在は好ましい塩基置換であり、2'-O-メ
トキシエチル糖修飾と組み合わせた場合にさらにより特に好ましい。
【００４１】 上述した修飾核塩基の特定のものおよびその他の修飾核塩基の調製を教示する
代表的な米国特許には、上述したU.S.特許3,687,808、ならびにU.S.: 4,845,205
；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,45
9,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121
；5,596,091；5,614,617；および5,681,941が含まれるが、これらには限定され
ない。
【００４２】 本発明のオリゴヌクレオチドのその他の修飾には、オリゴヌクレオチドの活性
、細胞分布、あるいは細胞取り込みを向上する、化学的にオリゴヌクレオチドに
結合する1あるいはそれ以上の部分あるいは複合体が含まれる。そのような部分
には、脂質部分、たとえばコレステロール部分（Letsinger et al., Proc. Natl
. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioo
rg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1053-1059）、チオエーテル、たとえば、ヘキ
シル-S-トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 66
0, 306-309；Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765-2770
）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 53
3-538）、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールあるいはウンデシル残基（Sai
son-Behmoaras et al., EMBO J. 1991, 10, 1111-1118；Kabanov et al., FEBS
Lett. 1990, 259, 327-330；Svinarchuk et al., Biochimie 1993, 75, 49-54）
、リン脂質、たとえば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールあるいはトリエチル
アンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manohar
an et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651-3654；Shea et al., Nucl. Aci
ds Res. 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンあるいはポリエチレングリコール
鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleoside 1995, 14, 969-973）、ある
いはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651
-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta 1995, 126
4, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ-カルボニ
ル-オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 199
6, 277, 923-937）が含まれるが、これらには限定されない。
【００４３】 この様なオリゴヌクレオチド複合体の調製を教示する代表的な米国特許には、
U.S.特許4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730
；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,11
8,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046
；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,83
5,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136
；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,26
2,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203
；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,57
4,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928
および5,688,941が含まれるが、これらには限定されない。
【００４４】 本発明には、キメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクオチドも含まれる。
本発明の文脈において、“キメラ”オリゴヌクレオチドあるいは“キメラ”は、
2つあるいはそれ以上の化学的に特徴的な領域を含有するオリゴヌクレオチドで
あり、それぞれが少なくとも一つのヌクレオチドから形成される。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも一つの領域を含有し、ここでオリゴヌ
クレオチドは、オリゴヌクレオチドに対して、ヌクレアーゼ分解耐性の増加、細
胞取り込みの増加および／あるいは標的核酸に対する結合親和性の増加を付与す
るように、修飾される。オリゴヌクレオチドの追加の領域は、RNA:DNAあるいはR
NA:RNAハイブリッドを切断することができる酵素に対する基質として働くことが
できる。例を挙げると、RNase Hは、RNA:DNA二重鎖のRNA鎖を切断する、細胞性
のエンドヌクレアーゼである。RNase Hの活性化により、したがって、結果とし
てRNA標的の開裂を引き起こし、それにより遺伝子発現のアンチセンス阻害の効
率を非常に向上させる。RNA標的の開裂は、ゲル電気泳動により、そして必要な
場合には当該技術分野において既知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術
により、日常的に検出することができる。RNA標的のこのRNAse H媒介開裂は、核
酸を開裂するためのリボザイムの使用とは異なる。リボザイムは本発明には含ま
れない。
【００４５】 キメラオリゴヌクレオチドの例には、“ギャップマー”が含まれるが、これら
には限定されない。ギャップマーには3つの性質が異なる領域が存在し、通常は
お互い化学的に等価であるがギャップとは異なる二つの領域が、中央領域の側面
に接している。ギャップマーの好ましい例は、オリゴヌクレオチドの中央部分（
“ギャップ”）がRNase Hの基質として機能するオリゴヌクレオチドであり、好
ましくは2'-デオキシヌクレオチドで構成され、一方、隣接する部分（5'および3
'“ウイング”）は修飾されて標的RNA分子への親和力が向上するが、ヌクレアー
ゼ活性を支持することはできない（例えば、フルオロ-あるいは2'-O-メトキシエ
チル-置換）。キメラオリゴヌクレオチドは、糖に修飾を持つものに限定されず
、修飾されたバックボーン、例えばホスホロチオエート（P=S）およびホスホジ
エステル（P=O）バックボーン結合の領域、あるいはMMIおよびP=Sバックボーン
結合の領域をもつ1または複数のオリゴヌクレオチドも含む場合がある。他のキ
メラは、当該技術分野で“ヘミマー”としても知られる“ウイングマー”、すな
わち二つの性質の異なる領域を持つオリゴヌクレオチドを含む。ウイングマーの
好ましい例において、オリゴヌクレオチドの5'部分はRNase Hの基質として機能
し、好ましくは2'-デオキシヌクレオチドで構成される一方で、3'部分は標的RNA
分子に対してより大きな親和性を持つ様に修飾されるが、ヌクレアーゼ活性を支
持することはできないか（例えば、2'-フルオロ-あるいは2'-O-メトキシエチル-
置換）、あるいはその逆である。一態様において、本発明のオリゴヌクレオチド
は、少なくとも一つのヌクレオチドの糖部分における2'-O-メトキシエチル（2'-
O-CH2CH2OCH3）修飾を含む。この修飾は、標的に対するオリゴヌクレオチドの親
和性、およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性の両方を増加させることが
示されている。本発明に従うと、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドサ
ブユニットの一つ、複数、あるいは全てが、2'-O-メトキシエチル（-O-CH2CH2OC
H3）修飾を有してもよい。2'-O-メトキシエチル修飾を持つ複数のヌクレオチド
サブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内のいずれかの
ヌクレオチドサブユニットにそのような修飾を持つことができ、キメラオリゴヌ
クレオチドであってもよい。2'-O-メトキシエチル修飾の他に、あるいはそれに
加えて、アンチセンス効率、有効性あるいは標的親和性を亢進する他の修飾を含
有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい。一つあるいはそれ以上のそのような
修飾を含むキメラオリゴヌクレオチドは、現在好ましい。
【００４６】 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術を通
して都合良くそして日常的に作製することができる。そのような合成のための装
置は、Applied Biosystemsを含むいくつかの業者によって販売されている。その
ような合成のためのいくつかの他の手段も使用されうる；オリゴヌクレオチドの
実際の合成は、完全に型どおりの仕事をする人の能力内のものである。同様な技
術を使用して、2'-O-メトキシエチルオリゴヌクレオチドを含む、ホスホロチオ
エートおよび2'-アルコキシあるいは2'-アルコキシアルコキシ誘導体などのオリ
ゴヌクレオチドを調製することが周知である（Martin, P., Helv. Chim. Acta,
1995, 78, 486-504）。同様な技術および商業的に有用な、ビオチン、フルオレ
セイン、アクリジンあるいはソラレン-修飾アミダイトおよび／あるいはCPG（Gl
en Research, Sterling, VAから入手可能）などの修飾アミダイト、および調節
化孔ガラス（CPG）産物（controlled-pore glass product）を使用して、蛍光標
識化、ビオチン化あるいは他の結合オリゴヌクレオチドを合成することは周知で
ある。
【００４７】 本発明のアンチセンス化合物は、医薬的に許容可能な塩類およびプロドラッグ
を含む生物学的等価な化合物を含む。これは、いずれかの医薬的に許容可能な塩
類、エステル、あるいはそのエステルの塩類、あるいはヒトを含めた動物に投与
する際に、生物学的に活性な代謝産物あるいはその残留物を（直接的あるいは間
接的に）提供することができるいずれか他の化合物を含むことを意図する。それ
ゆえ、例えば、本開示は本発明の核酸の医薬的に許容可能な塩類、およびそのよ
うな核酸のプロドラッグに対しても作成される。“医薬的に許容可能な塩類”は
、本発明の核酸の生理学的および医薬的に許容可能な塩類：すなわち、親化合物
の所望する生物学的活性を保持し、それに対する所望しない毒物学的な効果を与
えない塩類である（例えば、 Berge et al., “Pharmaceutical Salts,” J. of
Pharma Sci., 1977, 66, 1-19を参照）。
【００４８】 オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩類は、（a）ナトリウム
、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペ
ルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩類；（b）例えば、塩
酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などの無機酸で形成される酸付加塩類；（
c）例えば、酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン
酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン
酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸
、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの
有機酸で形成される塩類；（d）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素アニオン
で形成される塩類、を含むが、これらには限定されない。
【００４９】 本発明のオリゴヌクレオチドは追加的あるいは代替的に“プロドラッグ”形態
で送達される様に調製することができる。“プロドラッグ”という用語は、体内
あるいはその細胞内で内在性酵素の作用あるいは他の化学的および／あるいは条
件によって活性形態（すなわち、薬剤）に変換される、不活性形態で調製される
治療剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版（version
）は、1993年12月9日に公開されたGosselinらに対するWO 93/24510において開示
される方法に従って、SATE［（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸］誘導体とし
て調製される。
【００５０】 治療的あるいは予防的な処置のため、オリゴヌクレオチドは本発明に従って投
与される。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は医薬的組成物中に処方すること
ができ、オリゴヌクレオチドに加えて、医薬的に許容可能なキャリア、増粘剤、
希釈剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、中性あるいは陽イオン脂質、脂質複合体
、リポソーム、浸透亢進剤、キャリア化合物および他の医薬的に許容可能なキャ
リアあるいは賦形剤などを含んでもよい。そのような組成物および製剤は本発明
により含まれる。
【００５１】 本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬的組成物は、オリゴヌクレオチドの食
餌性送達を亢進するための浸透亢進剤を含んでもよい。浸透亢進剤は五つの広範
なカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤および非
界面活性剤、の一つに属するように分類されうる（Lee et al., Critical Revie
ws in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192; Muranishi, Crit
ical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33）。これ
らの広範なカテゴリーの一つあるいはそれ以上に由来する、一つあるいはそれ以
上の浸透亢進剤が含まれうる。
【００５２】 浸透亢進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体には、例えば、
オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリ
ン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート（dicaprate）、トリカプレート
（tricaprate）、リシンリエート（recinleate）、モノオレイン（別名、1-モノ
オレオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グ
リセリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカ
ルニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリド、およびそれらの生理学的
に許容可能な塩類（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステ
ート、パルミテート、ステアレート、リノレエート、など）が含まれる（Lee et
al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ
92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 199
0, 7, 1; El-Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992 44, 651-654）。
【００５３】 胆汁の生理学的な役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散と吸収を容易に
することが含まれる（Brunton, Chapter 38 In: Goodman & Gilman's The Pharm
acological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al., eds., McGraw-
Hill, New York, NY, 1996,ページ934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそ
れらの合成誘導体は浸透亢進剤として作用する。従って、“胆汁酸塩”という用
語には、天然に存在する胆汁の要素のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体の
いずれかが含まれる。
【００５４】 一つあるいはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を使用することができる。
例えば、胆汁酸塩を脂肪酸と共に使用し、複合製剤を作りうる。 キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、
サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよび
ホモバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アシル誘導体、ラウレス-9
（laureth-9）およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体（エナミン）が含
まれるが、これらには限定されない（Lee et al., Critical Reviews in Therap
eutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ92; Muranishi, Critical Reviews
in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Cont
rol Rel., 1990, 14, 43-51）。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能すると
いうさらなる利点を有する。
【００５５】 界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-
ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Lee et al.,
Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ92）；
およびFC-43などのパーフルオロケミカルエマルジョン（perfluorochemical emu
lsions）（Takahash et al., J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252-257）、が
含まれる。
【００５６】 非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニ
ルアザシクロ-アルカノン誘導体（Lee et al., Critical Reviews in Therapeut
ic Drug Carrier Systems 1991,ページ92）；およびジクロフェナックナトリウ
ム（diclofenac sodium）、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ス
テロイド性抗炎症剤（Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 62
1-626）、が含まれる。
【００５７】 本明細書中で使用される場合、“キャリア化合物”は核酸、あるいはその類似
体のことをいい、それは不活性である（すなわち、それ自体が生物学的活性を持
っていない）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、あるいは循環
系からそれを除去することを促進することによって、生物学的活性を有する核酸
の生物学的利用能を減少させるin vivoでの過程により、核酸として認識される
。核酸とキャリア化合物を、典型的に過剰量の後者の物質とともに共投与（coad
ministration）すると、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核
酸の間での競合のため、肝臓、腎臓あるいは他の循環外貯蔵器において回収され
る核酸の量の実質的な減少を引き起こすことができる。
【００５８】 キャリア化合物とは対照的に、“医薬的に許容可能なキャリア”（賦形剤）は
、医薬的に許容可能な溶媒、懸濁剤、あるいは動物に一つあるいはそれ以上の核
酸を運搬するための他の薬理学的に不活性なビヒクル、である。医薬的に許容可
能なキャリアは、液体あるいは固体であってもよく、核酸と所定の医薬組成物の
他の要素を組み合わせるとき、望ましい量、濃度などを供給するために、計画さ
れた投与様式により選択される。典型的な医薬的に許容可能なキャリアには、結
合剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンあるいはヒド
ロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、ラクトースおよび他
の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセル
ロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ス
テアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化シリコン、ステア
リン酸、金属ステアレート、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコ
ール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン
、グリコール酸デンプンナトリウム（sodium starch glycolate）など）；ある
いは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（sodium lauryl sulphate）など
）、が含まれるが、それらには限定されない。経口的に投与された用量剤形のた
めの、持続的放出経口送達システムおよび／あるいは腸コーティングは、米国特
許4,704,295；4,556,552；4,309,406;および4,309,404に記載される。
【００５９】 本発明の組成物は、医薬組成物において、その技術的に確立した使用レベルで
従来から見出される他の補助的な要素を追加的に含有することができる。従って
、例えば、組成物は、例えば、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤あるいは抗炎症剤
などの、追加的な融和性のある医薬的に活性をもつ物質を含んでもよく、あるい
は色素、着香料、保存剤、抗酸化剤、乳白剤（opacifiers）、増粘剤および安定
剤などの、本発明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化するのに有用な追
加的な物質を含有してもよい。しかし、そのような物質は、追加するとき、本発
明の組成物の要素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。
【００６０】 本発明のオリゴヌクレオチドが患者に導入される方法に関わらず、コロイド分
散システムを送達ビヒクルとして使用し、in vivoでのオリゴヌクレオチドの安
定性を亢進し、および／あるいは特定の器官、組織あるいは細胞型に対してオリ
ゴヌクレオチドを標的化しうる。コロイド分散システムには、高分子複合体、ナ
ノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン（oil-in-w
ater emulsions）、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび構造を特定されてい
ない脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質基本システムが含まれるが、そ
れらには限定されない。好ましいコロイド分散システムは多数のリポソームであ
る。リポソームは、二重層構造（configuration）において配置される脂質で構
成される、一つあるいはそれ以上の外層によって囲まれる水性コアをもつ顕微鏡
的球体である（一般的に、Chonn et al., Current Op. Biotech., 1995, 6, 698
-708参照）。
【００６１】 本発明の医薬的な組成物は、局所性あるいは全身性の治療のどちらが望ましい
かに依存し、および治療すべき部位に依存する多くの方法において投与されうる
。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内、表皮、皮内および経皮を含む）、経
口的あるいは非経口的でありうる。非経口的投与には、静脈内点滴、注入あるい
は注射；皮下、腹腔内あるいは筋肉内注射；例えば吸入あるいは吹き付けによる
肺投与、あるいは、例えば包膜内あるは脳室内の頭蓋内投与、あるいは脳脊髄液
への投与、が含まれる。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル修飾をもつオリ
ゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると信じられている。
【００６２】 局所的な投与のための製剤は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、
ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末を含みうる。従来の医薬的キャリ
ア、水性、粉末あるいは油性基剤、増粘剤などは必要であり、あるいは望ましい
場合がある。コートされたコンドーム、グローブおよびその他も有用でありうる
。
【００６３】 経口投与のための組成物には、粉末あるいは顆粒、水あるいは非水性の媒質に
おける懸濁液あるいは溶液、カプセル、サシェあるいは錠剤、が含まれる。増粘
剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤（dispersing aids）あるいは結合剤
は所望されうる。
【００６４】 非経口投与のための組成物には、緩衝液、希釈剤および他の適した添加物も含
む滅菌した水性溶液が含まれてもよい。ある場合において、治療管理（regimen
）の効力を増加させるために、本発明のオリゴヌクレオチドを、他の伝統的な治
療的様式とともに用いて患者を治療することは、より効果的である。本発明の文
脈において、“治療管理”という用語は、治療的、緩和的および予防的な様式を
含むことを意味する。例えば、患者は、従来からの化学療法剤、特に腫瘍および
癌の治療のために使用されるもの、を用いて治療されうる。そのような化学療法
剤は、本発明の化合物と共に使用するとき、個々に（例えば、5-FUおよびオリゴ
ヌクレオチド）、連続的に（例えば、ある期間の5-FUおよびオリゴヌクレオチド
の後MTXおよびオリゴヌクレオチド）、あるいは一つあるいはそれ以上のそのよ
うな化学療法剤とともに（例えば、5-FU、MTXとオリゴヌクレオチド、あるいは5
-FU、放射線療法とオリゴヌクレオチド）、使用されうる。
【００６５】 治療的組成物の製剤化およびそれらに続く投与は、当業者の技術内にあると信
じられている。投薬は、治療される疾患状態の深刻さおよび反応性に依存してお
り、数日間から数ヶ月、あるいは治療が効果を示すか、あるいは疾患状態の減少
が達せられるまで続く一連の治療をともなう。最適な投薬スケジュールは、患者
の体内の薬剤の蓄積を測定することから算出できる。当業者は、最適な投与量、
投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌ
クレオチドの比効力に依存して変化してもよく、in vitroおよびin vivo動物モ
デルにおいて効果的であると判断されたEC50を基準にして一般的に評価できる。
一般的に、投与量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、一日、一週間、一
ヶ月間あるいは一年間に一回あるいはそれ以上、あるいは2年から20年ごとに一
回、で与えうる。当業者は、体液あるいは組織内の薬剤の残留時間、および濃度
の測定に基づき、投薬のための反復頻度を容易に見積もることができる。成功し
た治療に続いて、患者は維持治療を受けて疾患状態の再発を防ぐことが望ましく
、そこではオリゴヌクレオチドは体重1 kgあたり0.01μgから100 gの範囲で、毎
日一回かあるいはそれ以上から20年ごとに一回の範囲で、維持用量を投与される
。
【００６６】 従って、本発明の文脈において、“治療的有効量”は、治療される個人におい
て治療的効果を持つために必要な化合物の量を意味する。この量は当業者にとっ
て明らかであり、個体の年齢および体重、治療すべき疾患の型、おそらく個体の
性別さえ、および薬剤治療を設計するときに普通に考慮される他の因子、に依存
する。治療的効果は、個体において、動物における疾患状態に対する化合物の効
果を測定することにより評価される。例えば、もし治療すべき疾患が癌であるな
ら、治療的効果は腫瘍の成長速度あるいは大きさを測定することにより、あるい
はその産生が腫瘍の進行あるいは退行の指標となりうるサイトカインなどの化合
物の産生を測定することにより評価する。
【００６７】 以下の実施例は本発明を説明するが、同じものに限定する意図はない。
【００６８】
【実施例】 実施例1：オリゴヌクレオチドの合成 非修飾オリゴデオキシヌクレオチドは自動化DNAシンセサイザー（Applied Bio
systems model 380B）において、ヨウ素による酸化をともなう標準的なホスホー
ルアミダイト（phosphoramidite）化学を使用して合成される。β-シアノエチル
ジイソプロピル-ホスホールアミダイトは、Applied Biosystemsから購入される
（Foster City, CA）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのために、標準
的な酸化ボトルを、亜リン酸結合の段階的なチア化（thiation）のための3H-1,2
-ベンゾジチオール-3-オン1,1-ジオキシドの0.2 M溶液により置換した。チア化
サイクルの待機ステップを68秒まで増加して、キャッピングステップを続けた。
シトシンは5-メチルシトシンであってもよい（Glen Research, Sterling, VA or
Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJから入手可能な5-メチルデオキ
シチジンホスホールアミダイト）。
【００６９】 2'-メトキシオリゴヌクレオチドは、テトラゾールおよび塩基のパルス送達の
後の待機ステップを360秒まで増加することを除いて、2'-メトキシβ-シアノエ
チルジイソプロピル-ホスホールアミダイト（Chemgenes, Needham, MA）、およ
び非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを使用して合成される。他の2'-ア
ルコキシオリゴヌクレオチドは、本方法の改良により、Glen Research, Sterlin
g, VAから入手可能であるものなどの適切な2'-修飾アミダイトを使用して合成さ
れる。
【００７０】 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、Kawasakiら（J. Med. Chem., 1993, 36,
831-841）に記載されるように合成される。簡略すると、保護化されたヌクレオ
シドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-フルオロアデノシンは、開始物質として商業的
に入手可能な9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを使用して、文献の手順を改
良して、2'-α-フルオロ原子を2'-β-O-トリフィル基のSN2-置換によって導入さ
れるようにすることにより合成される。このように、N6-ベンゾイル-9-β-D-ア
ラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体と
して中程度な収量において選択的に保護化される。THPおよびN6-ベンゾイル基の
脱保護は標準的な方法を使用して達せられ、標準的な方法を使用して、5'-ジメ
トキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得る。
【００７１】 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、開始物質としてテトライソプ
ロピルジシロキサニル（TPDS）保護化9-β-D-アラビノフラノシルグアニン、お
よび中間体ジイソブチリル-アラビノフラノシルグアニンへの転化を使用して達
せられる。TPDS基の脱保護の後、THPによるヒドロキシ基の保護化を行い、ジイ
ソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的なO-脱アシ
ル化およびトリフラート化の後に、フッ化物による粗生成物の処理、そしてTHP
基の脱保護を行う。標準的な方法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホ
ールアミダイトを得る。
【００７２】 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-無水-1-β-D-アラビノフラ
ノシルウラシルを70％フッ化水素-ピリジンで処理する既知の手順の改良により
達せられる。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホールア
ミダイトを得る。
【００７３】 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化を経て合成され、その後選択的な保護を行ってN4-ベンゾイル-2'-デオキ
シ-2'-フルオロシチジンを得る。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DM
T-3'-ホスホールアミダイトを得る。
【００７４】 2'-（2-メトキシエチル）-修飾アミダイトは、Martin, P.（Helv. Chim. Acta
, 1995, 78, 486-506）に従って合成された。合成を容易にするために、最後の
ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであってもよい。2'-O-CH2CH2OCH3-シトシ
ンは5'-メチルシトシンであってもよい。
【００７５】 5-メチルシトシンモノマーの合成： 2,2'-無水[1-（β-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン]： 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入
手可能）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）お
よび重炭酸ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に加えた。混合液を
撹拌しながら加熱還流して、発生する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させた。
1時間後、わずかに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを撹
拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産生物はガム状物を形成した
。エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール（約400 mL）に溶解した
。溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、固いガム状物を得た。エーテルをデ
カントし、ガム状物を真空オーブンで乾燥させて（60℃、1 mmHgで24時間）固体
を得、それを粉砕して淡い黄褐色の粉末を得た（57 g、粗収量85％）。その物質
はさらなる反応のため現状のままで使用された。
【００７６】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン： 2,2'-無水-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシエチル
）ホウ酸塩（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を2 Lステ
ンレススチール圧力容器に加え、160℃であらかじめ加熱したオイルバスに置い
た。155-160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥させ、MeO
H（200 mL）を用いて磨砕した。残留物を熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性
の塩を濾過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残留物（280
g）をCH3CN（600 mL）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を0.5
％ Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH（20:5:3）中に充填した。残留物をCH 2 Cl2（250 mL）に溶解し、シリカ（150 g）に吸着させ、その後カラムにロード
した。産生物をパッキング溶媒で溶出し、160 g（63％）の産生物を得た。
【００７７】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン： 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
mL）と共蒸発（co-evaporated）し、乾燥した残留物をピリジン（1.3 L）に溶解
した。ジメトキシトリチルクロリドの最初のアリコート（94.3 g、0.278 M）を
加え、混合液を室温で1時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番目の
アリコート（94.3 g、0.278 M）を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。そして
メタノール（170 mL）を加え、反応を停止した。HPLCの結果、約70％の産生物が
存在することが示された。溶媒を蒸発させ、CH3CN（200 mL）を用いて磨砕した
。残留物をCHCl3（1.5 L）に溶解し、2×500 Lの飽和NaHCO3および2×500 mLの
飽和NaClを用いて抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させて濾過し、蒸発させた。
275 gの残留物を得た。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、パックし
て0.5％ Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で溶出した。純粋
画分を蒸発させ、164 gの産生物を得た。さらに約20 gを不純粋画分から得て、1
83 g（57％）の総収量を得た。
【００７８】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ ジン： 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750
mL の3:1混合液）および無水酢酸（24. 38 mL、0.258 M）を混合して、室温で2
4時間撹拌した。MeOHを添加することによりtlc試料を最初に急冷（quenching）
することにより、tlcにより反応をモニターした。反応の完了の際、tlcにより判
断するとき、MeOH（50 mL）を加え、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl3 （800 mL）に溶解し、2×200 mLの飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200 mLの飽和
NaClを用いて抽出した。水層をふたたび200 mLのCHCl3で抽出した。混合した有
機物を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて蒸発させ、122 gの残留物を得た（約9
0％産物）。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、EtOAc/ヘキサン（4:1
）を使用して溶出した。純粋産物画分を蒸発させて96 g（84％）を産出した。
【００７９】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン： 最初の溶液はCH3CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジ
メトキシトリチル-5-メチルウリジン（96g、0.144 M）を溶解することにより調
製し、取っておいた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をCH3CN（1 L）中の
トリアゾール（90 g、1.3 M）溶液に加え、-5℃に冷却してオーバーヘッドスタ
ーラーを使用して0.5時間撹拌した。POCl3を0-10℃に維持された撹拌溶液に一滴
ずつ（dropwise）30分間にわたり加え、得られた混合物をさらに2時間撹拌した
。最初の溶液を後の溶液に一滴ずつ45分間にわたり加えた。得られた反応混合液
をコールドルームで一晩保存した。塩を反応混合液から濾過し、溶液を蒸発させ
た。残留物をEtOAc（1 L）に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。濾過
物を1×300 mLのNaHCO3および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムを
用いて乾燥させて蒸発させた。残留物はEtAOcを用いて磨砕し、表題化合物を得
た。
【００８０】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン： ジオキサン（500 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメト
キシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.141 M）とNH4OH（3
0 mL）の溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeO
H（2×200 mL）と共沸した。残留物をMeOH（300 mL）に溶解し、2リットルのス
テンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH（400 mL）を加え
、容器を100℃で2時間加熱した（tlcは完全な転化を示した）。容器内容物を蒸
発させて乾燥させ、残留物をEtOAc（500 mL）に溶解し、飽和NaCl（200 mL）で
一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて、85 g（
95％）の表題化合物を得た。
【００８１】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ ジン： 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解して、安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）を撹
拌しながら加えた。3時間の撹拌後、tlcは反応が約95％完了したことを示した。
溶媒を蒸発させ、残留物をMeOH（200 mL）と共沸した。残留物をCHCl3（700 mL
）に溶解し、飽和NaHCO3（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）を用いて抽
出して、MgSO4で乾燥させて蒸発させ、残留物（96 g）を得た。残留物を、溶出
溶媒として0.5％ Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を使用して、1.5 kgの
シリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を蒸発させて、90 g（
90％）の表題化合物を得た。
【００８２】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ ジン-3'-アミダイト： N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH2Cl2（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）亜リン酸塩
（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気中で撹拌しながら加えた。得られた混合液
を、室温で20時間撹拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応混
合液を、飽和NaHCO3（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）を用いて抽出し
た。水性洗浄液をCH2Cl2（300 mL）で再び抽出し、抽出物を混合してMgSO4で乾
燥させて濃縮した。得られた残留物を、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）
を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分
を混合して、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。
【００８３】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト[当該技術分野
では、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても
知られる]を、次のパラグラフに記載するように調製する。アデノシン、シチジ
ンおよびグアノシンヌクレオシドは、環外のアミンが、アデノシンおよびシチジ
ンの場合はベンゾイル部分を用いて、またグアノシンの場合はイソブチリルを用
いて、保護されることを除き、チミジン（5-メチルウリジン）と同様に調製され
る。
【００８４】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン O2-2'-無水-5-メチルウリジン（Pro. Bio. Sint., Varese, Italy、100.0 g、
0.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol）を
、アルゴン雰囲気中で機械的に撹拌しながら、周囲の温度で乾燥ピリジン（500
mL）に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g、119.0 mL、1.
1 eq、0.458 mmol）を一度に加えた。反応液を周囲の温度で16時間撹拌した。TL
C（Rf 0.22、酢酸エチル）は反応完了を示した。溶液を減圧下で濃縮し、濃厚な
油状物（thick oil）にした。これを、ジクロロメタン（1 L）および飽和重炭酸
ナトリウム（2×1 L）およびブライン（1 L）の間で分配した。有機層を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して濃厚な油状物にした。油状物を、酢酸エチ
ルとエチルエーテルの1:1混合液（600 mL）に溶解し、溶液を-10℃まで冷却した
。得られた結晶性産物を濾過して集め、エチルエーテル（3×200 mL）で洗浄し
て乾燥し（40℃、1 mmHg、24時間）、149 g（74.8％）の白色固体とした。TCLお
よびNMRは純粋産物と一致した。
【００８５】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン 2 Lのステンレススチール中で、撹拌しない圧力反応器に、テトラヒドロフラ
ン（1.0 M、2.0 eq、622 mL）中のボランを加えた。ドラフトチャンバー（fume
hood）内において手動で撹拌しながら、エチレングリコール（350 mL,過剰量）
を、水素ガスの発生が静まるまで最初は注意深く加えた。5'-O-tert-ブチルジフ
ェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン（149 g、0.311 mol）および重炭酸
ナトリウム（0.074 g、0.003 eq）を手動で撹拌しながら加えた。反応器を密閉
し、容器内の温度が160℃に達するまで、オイルバスで加熱し、その後16時間維
持した（圧力＜100 psig）。反応容器を周囲の温度まで冷却して開けた。TLC（
所望する産生物のRfは0.67およびara-T副産物のRfは0.82、酢酸エチル）は、約7
0％が産生物に転化したことを示した。さらなる副産物の形成を避けるために、
反応を停止し、エチレングリコールを除去するために使用されるより極度の条件
をともなう温水浴（40〜100℃）中にて、減圧下（10から1 mmHg）で濃縮した。[
あるいは、一度低沸点溶媒を除去して、残りの溶媒を酢酸エチルと水の間で分配
できる。産生物は有機層に存在しうる。] 残留物をカラムクロマトグラフィー
（2 kgシリカゲル、1:1から4:1の酢酸エチル-ヘキサン勾配）にて精製した。適
当な画分を混合し、ストリッピングおよび乾燥させて、白色のパリパリした（cr
isp）泡状物として産生物とし、これには開始物質（17.4 g）および純粋な再利
用可能な開始物質20 gが混在した。収率は、開始物質を基準としており、純度の
低い回収された開始物質の収率は58％であった。TLCおよびNMRは99％の純粋産生
物と一致した。
【００８６】 2'-O-（[2-フタルイミドオキシ）エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メ チルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン（20 g、36.98 mmol）を、トリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 m
mol）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24 g、44.36 mmol）と混合した。そ
して、それを40℃で2日間、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。反応混合液をア
ルゴンでフラッシュし、乾燥THF（369.8 mL、Aldrich、確実に密閉するボトル）
を加えて、透明な溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート（6.98 mL、44
.36 mmol）を反応混合液に一滴ずつ加えた。加える速度は、得られた濃赤色が次
の一滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が完了した後、反応液
を4時間撹拌した。その時までに、TLCは反応の完了を示した（酢酸エチル:ヘキ
サン、60:40）。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラ
ム上に置き、酢酸エチル:ヘキサン（60:40）を用いて溶出し、白色の泡状物とし
て2'-O-（[2-フタルイミドオキシ）エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メ
チルウリジンを得た（21.819、86％）。
【００８７】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル]-5-メチルウリジン 2'-O-（[2-フタルイミドオキシ）エチル]-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-メ
チルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を乾燥CH2Cl2（4.5 mL）に溶解し、メチルヒ
ドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃から0℃で一滴ずつ加えた。1時間後、混
合液を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄して、混合有機層を水、ブラインで洗
浄して、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2'-O-（アミノオキシエチル
）チミジンを得て、次にそれをMeOH（67.5 mL）に溶解した。これに、ホルムア
ルデヒド（20％水溶液、w/w、1.1eg.）を加え、1時間混合した。溶媒を真空下で
除去した；残留物をクロマトグラフィーにかけて、白色の泡状物として5'-O-ter
t-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[（2-ホルムアドキシイミノオキシ）エチル]-5
-メチルウリジンを得た（1.95、78％）。
【００８８】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル] -5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル]-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を、乾燥MeOH（30.6 mL）中
の1 Mピリジニウムp-トルエンスルホネート（PPTS）の溶液に溶解した。シアノ
ホウ化水素ナトリウム（0.39 g、6.13 mmol）をこの溶液に不活性雰囲気のもと1
0℃で加えた。反応混合液を10℃で10分間撹拌した。反応容器を氷冷バスから取
り出して室温で2時間撹拌した後、反応をTLC（CH2Cl2中の5％ MeOH）にてモニタ
ーした。水性NaHCO3溶液（5％、10 mL）を加え、酢酸エチル（2×20 mL）を用い
て抽出した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残
留物を、MeOH（30.6 mL）中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（20
％ w/w、30 mL、3.37 mmol）を加え、反応混合液を室温で10分間撹拌した。反応
混合液を氷冷バス中で10℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（0.39 g、
6.13 mmol）を加えて、反応混合液を10℃で10分間撹拌した。10分後、反応混合
液を氷冷バスから取り出して室温で2時間撹拌した。反応混合液に5％ NaHCO3（2
5 mL）溶液を加え、酢酸エチル（2×25 mL）を用いて抽出した。酢酸エチル層を
無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。得られた残留物をフラッシュカ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、CH2Cl2中の5％ MeOHを用いて溶出して、
白色の泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-[N,N-ジメチルア
ミノオキシエチル]-5-メチルウリジンを得た（14.6 g、80％）。
【００８９】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン トリエチルアミントリヒドロフルオライド（3.91 mL、24.0 mmol）を乾燥THF
およびトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmol、乾燥、KOHで保存）に溶解した。
次に、このトリエチルアミン-2HF混合液を5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2
'-O-[N,N-ジメチルアミノオキシエチル]-5-メチルウリジン（1.40 g、2.4 mmol
）に加え、室温で24時間撹拌した。反応をTLC（CH2Cl2中の5％ MeOH）にてモニ
ターした。溶媒を真空中下で除去し、残留物をフラッシュカラム上に置き、CH2C
l2中の10％ MeOHを用いて溶出して、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-
メチルウリジンを得た（766 mg、92.5％）。
【００９０】 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（750 mg、2.17 mmo
l）を40℃で一晩、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。次に、それを無水ピリジ
ン（20 mL）を用いて共蒸発させた。得られた残留物をアルゴン雰囲気下でピリ
ジン（11 mL）に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）
、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド（880 mg、2.60 mmol）を混合液に加え、
反応混合液を全ての開始物質が消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空中
下で除去し、残留物をクロマトグラフィーして、（数滴のピリジンを含有する）
CH2Cl2中の10％ MeOHを用いて溶出して、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキ
シエチル）-5-メチルウリジンを得た（1.13 g、80％）。
【００９１】 5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3' -[（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト] 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（1.08 g
、1.67 mmol）をトルエン（20 mL）と共蒸発させた。残留物にN,N-ジイソプロピ
ルアミンテトラゾニド（0.29 g、1.67 mmol）を加え、40℃で一晩、高度真空の
もとP2O5で乾燥させた。次に、反応混合液を無水アセトニトリル（8.4 mL）に溶
解し、2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピルホスホールアミダイト（2
.12 mL、6.08 mmol）を加えた。反応混合液を不活性雰囲気のもと室温で4時間撹
拌した。反応の進行をTLC（ヘキサン:酢酸エチル 1:1）によりモニターした。溶
媒を蒸発させ、そして残留物を酢酸エチル（70 mL）に溶解して、5％水性NaHCO3 （40 mL）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Na2SO4で乾燥させて濃縮した。得ら
れた残留物をクロマトグラフィーして（溶出剤として酢酸エチル）、泡状物とし
て5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'
-[（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト]を得た（1.04
g、74.9％）。
【００９２】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-me-C）含有オリゴヌクレオチドは、商業的
に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterling VA or ChemGene
s, Needham MA）を使用して、公開された方法（Sanghvi et al., Nucl. Acids R
es. 1993, 21, 3197-3203）に従って合成された。
【００９３】 メチレン（メチルイミノ）（MMI）のバックボーンを持つオリゴヌクレオチド
は米国特許5,378,825に従って合成され、それは本発明の譲り受け人に対して共
に譲受され、その全体を本明細書中に援用する。合成を容易にするため、MMI結
合を含有する様々なヌクレオシド二量体を合成し、オリゴヌクレオチドの中に組
み込んだ。他の窒素含有バックボーンはWO 92/20823に従って合成され、これも
また本発明の譲り受け人に対して共に譲受され、その全体を本明細書中に援用す
る。
【００９４】 アミドバックボーンを持つオリゴヌクレオチドはDe Mesmaekerら（Acc. Chem.
Res., 1995, 28, 366-374）に従って合成される。アミド部分は簡単で周知の合
成方法により容易に入手可能であり、オリゴヌクレオチドの固層合成に必要な条
件とも両立する。
【００９５】 モルホリノバックボーンを持つオリゴヌクレオチドは米国特許5,034,506（Sum
merton and Weller）に従って合成される。 ペプチド-核酸（PNA）オリゴマーはP.E. Nielsenら（Science, 1991, 254, 14
97-1500）に従って合成される。
【００９６】 制御孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの開裂、および55℃、18時間
の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを2.5
容量のエタノールを用いて0.5 M NaClから2回の遠心分離を行うことにより精製
した。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気
泳動をすることにより解析し、少なくとも85％の完全長物質であると判断した。
合成において得られたホスホロチオエートおよびホスホジエステルの相対的な量
は、31P核磁気共鳴分光器により定期的に確認し、いくつかの研究のためにオリ
ゴヌクレオチドを、Chiangら（J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162）によって記
載されるようにHPLCにより精製した。HPLC精製物質で得られた結果は、非HPLC精
製物質で得られたものと同様であった。
【００９７】 実施例2：ヒトTACEオリゴヌクレオチド配列 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトTACEを標的とするように設計した。
標的配列データは、Black, R.A.ら（Nature, 1997, 385, 729-733）により刊行
されたTACE cDNA配列由来である；Genbank寄託番号U69611、本明細書中でSEQ ID
NO: 1として提供される。オリゴヌクレオチドは、ウイングに5つの2'-O-メトキ
シエチルオリゴヌクレオチド（2'-MOE）の領域を有し、および10のデオキシヌク
レオチドの中央領域を有する均一なホスホロチオエートキメラオリゴヌクレオチ
ドとして合成された。オリゴヌクレオチド配列は表1に示す。オリゴヌクレオチ
ド14834（SEQ ID NO. 14）は、ヒト腫瘍壊死因子-α（TNF-α）を標的とするア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドであり、陽性対照として使用した。
【００９８】 ヒトJurkat T細胞株およびヒトプロ単球性白血病（promonocytic leukaemia）
細胞株、THP-1（American Type Culture Collection, Manassas, VA）は、10％
牛胎児血清（FCS; Life Technologies, Rockville, MD）を加えたRPMI 1640成長
培地中で維持した。HUVEC細胞（Clonetics, San Diego, CA）は、10％牛胎児血
清（Hyclone, Logan, UT）を加えた内皮基礎培地中で増殖させた。
【００９９】 NeoHK細胞、ヒト新生児包皮ケラチノサイト（Cascade Biologicals, Inc., Po
rtland, ORから得た）を、ヒト組換え表皮成長因子1-53およびウシ下垂体抽出物
（Bovine Pituitary Extract、Life Technologies, Rockville, MD）を含有する
ケラチノサイト血清不含（Keratinocyte Serum Free、SFM）培地中で培養した。
NeoHK細胞について、継代2から6の間の細胞を使用した。
【０１００】 HUVECおよびNeoHK細胞は、使用前に75％コンフルエントに達するようにした。
細胞を、温（37℃）OPTI-MEMTM（Life Technologies）を用いて2回洗浄した。細
胞は、成長因子を加えずに、適当な培養培地、および陽イオン脂質N-[1-（2,3-
ジオレイルオキシ）プロピル]-n,n,n-塩化トリメチルアンモニウム（DOTMA）、
およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）の、膜濾過水中1:
1（w/w）リポソーム製剤であるLIPOFECTINTM（Life Technologies）中で製剤化
したオリゴヌクレオチド、の存在下でインキュベートした。初めのスクリーニン
グのため、オリゴヌクレオチド濃度は10μg/ml LIPOFECTINTMにおいて300 nMと
した。処理は4時間行った。処理の後、培地を除去して、さらに細胞を成長因子
および100 nMフォルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA, Sigma, St. Lo
uis, MO）含有培地中でインキュベートした。mRNAはPMAを用いた誘導の4時間後
に解析した。HUVEC細胞は、10μg/ml LIPOFECTINTM中の100 nMオリゴヌクレオチ
ドで処理した。HUVEC細胞は誘導されなかったが、4時間通常成長培地で休息させ
た。
【０１０１】 JurkatおよびTHP-1細胞は、約75％コンフルエントまで成長させて、1×107細
胞/mlの密度で培養培地中に再懸濁させた。全3.6×106細胞は、最終量が400μl
に達するように示された濃度でオリゴヌクレオチドと360μlの細胞懸濁液を合わ
せることによって各々の処理に用いられた。そして、細胞をエレクトロポレーシ
ョンキュベットに移して、13Ωにて350 V、100μFを用いたElectrocell Manipul
ator 600装置（Biotechnologies and Experimental Research, Inc.）を使用し
てエレクトロポレーションした。そして、エレクトロポレーションした細胞を5
mlの培養培地を含有したコニカルチューブに移して、反転させて混合して、10 c
m培養皿上にまいた。
【０１０２】 全mRNAはRNEASYTM Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA；他の製造業者由来の同
様なキットも使用しうる）を使用して単離して、1％アガロースゲル上で分離し
て、陽性荷電ナイロン膜であるHYBONDTM-N+膜（Amersham Pharmacia Biotech, P
iscataway, NJ）、に移して、プローブ化した。TACEプローブは、以下のプライ
マーを用いたPCR増幅を使用して作成した： TS-1746 5'-GTGTCCTACTGCACAGGTAATAGC-3' SEQ ID NO. 15 BS-2489 5'-AATGACTTGGCAGCTGTGCTGCT-3' SEQ ID NO. 16 グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）プローブは、Clontech
（Palo Alto, CA） Catalog Number 9805-1から購入した。断片は、Maniatis, T
. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989に記載されるように
、低融点アガロースから精製して、REDIVUETM 32P-dCTP（Amersham Pharmacia B
iotech, Piscataway, NJ）およびStrip-EZ標識化キット（Ambion, Austin, TX）
を用いて標識化した。mRNAはPhosphoImager（Molecular Dynamics, Sunnyvale,
CA）により定量した。
【０１０３】 タンパク質レベルはフローサイトメトリー解析を使用して測定した。オリゴヌ
クレオチド処理の後、細胞をプレートから外して、Becton Dickinson（San Jose
, CA）FACScanを使用して細胞接着分子の表面発現を解析した。TACE抗血清は、
以下に記載するように調製した。ヒトL-セレクチン（CD62L）モノクローナル抗
体およびヤギ抗マウス抗体は、Becton Dickinsonから入手した。TNF-α抗体は、
R & D Systems（Minneapolis, MN）から入手した。細胞表面発現は、各々の試料
および時点に適した抗体で染色した3,000-5,000細胞を使用した蛍光強度の平均
値を使用して計算した。結果は、平均蛍光強度に基づいて、対照（オリゴヌクレ
オチドで処理していない細胞での細胞表面発現）のパーセンテージとして表した
。
【０１０４】 TACE抗血清の調製 ヒト腫瘍壊死因子-アルファ変換酵素（TACE）のN末端に対応する11merペプチ
ド（R A D P D P M K N T C）（SEQ ID NO: 17）を合成した。ペプチドはREDUCE
-IMMTM Reducingキット（Pierce Chemical Company, rockford, IL）を用いて還
元して、IMJECTTMマレイミド-活性化KLH（Pierce Chemical Company）にカップ
リングした。この溶液を室温で2時間反応させておき、次にPBSに対して透析した
。
【０１０５】 メスNZWウサギをポリクローナル抗血清の産生のために選択した。免疫前血清
（preimmune serum）は、TACEpep-KLHで免疫化する直前に得た。免疫化は以下の
ようにした：等量のTITERMAXTMアジュバント（Sigma Chemical Company, St. Lo
uis, MO）で乳化した500μg TACEpep-KLHを、ウサギの背中に沿った約10部位に
皮内注射した。動物は等量のエマルジョンを用いて、3、5および11週にブースタ
ーをした。3および5週目のブースター注射は500 mgのペプチドを含有し、5週目
のブースターは250 mgを含有した。血清試料は8、12および15週に得て、15週の
採血は最終採血とした。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】 HUVEC細胞における初めのスクリーニングの結果は表2に示す。テストした全て
のオリゴヌクレオチドは、TACE mRNA発現を70％以上阻害した。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】 NeoHK細胞における初めのスクリーニングの結果は表3に示す。テストした全て
のオリゴヌクレオチドは、TACE mRNA発現を55％以上阻害した。
【０１１０】
【表３】
【０１１１】 実施例3：ヒトTACE mRNAレベルに対するキメラ（2'-デオキシ）ギャップ化ア
ンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果の用量反応 ISIS 16337（SEQ ID NO. 2）を、用量反応アッセイを含むさらなる研究のため
に選択した。用量反応のため、オリゴヌクレオチドの濃度を変えた以外は実施例
2に記載したように細胞を処理した。LIPOFECTINTMを10μg/mlで加えた。対照はL
IPOFECTINTMを10μg/mlの濃度で含んだ。HUVEC細胞では、IC50は約50 nMであり
、一方neoHK細胞では、IC50は150 nMであった。対照オリゴヌクレオチドは、ヒ
トTNF-αあるいはマウスCD18を標的としており、TACE mRNAレベルに対する効果
はなかった。
【０１１２】 実施例4：ヒトTACE mRNAレベルに対するキメラ（2'-デオキシ）ギャップ化ア
ンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果の経時 細胞プロセスにおけるTACEの役割を調べるために、時間でのmRNAおよびタンパ
ク質レベル対するTACEオリゴヌクレオチドの効果を決定した。JurkatおよびTHP-
1細胞は、実施例2に記載したように20μMオリゴヌクレオチドで処理した。結果
は表4に示す。
【０１１３】
【表４】
【０１１４】 ISIS 16337（SEQ ID NO. 2）は、Jurkat細胞におけるトランスフェクションの
後24、48、および72時間でのTACE mRNAおよびタンパク質レベルの両方を減少さ
せた。TACEアンチセンスオリゴヌクレオチドでの処理は、タンパク質発現を75％
以上阻害し、72時間まで抑制したままであった。TACE mRNAレベルは48時間で約7
0％までに減少して、72時間では抑制されたままであった。3塩基ミスマッチ対照
オリゴヌクレオチド、ISIS 17965（SEQ ID NO. 13）は、TACE mRNAあるいはタン
パク質レベルのいずれにも効果はなかった。同様な結果がTHP-1細胞で示された
。
【０１１５】 実施例5：L-セレクチン発散に対するTACEアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果 PMA誘導L-セレクチン発散の促進におけるTACEの役割を、Jurkat細胞において
調べた。Jurkat細胞は、実施例2に記載したように、20μMのオリゴヌクレオチド
を用いてエレクロトポレーションした。6.4×105細胞は、1％ FCS（Life Techno
logies）含有OPTI-MEMTM I media（Life Technologies）中で室温で750 V/cmの
電界強度を用いてエレクトロポレーションした。オリゴヌクレオチド処理の24時
間後、L-セレクチン発散を37℃で5分間100 nM PMA処理で誘導した。L-セレクチ
ン細胞表面発現は、実施例2に記載したように、FACScanを使用したフローサイト
メトリーにより解析した。
【０１１６】 結果は表5に示す。
【０１１７】
【表５】
【０１１８】 TACE発現がTACEアンチセンスオリゴヌクレオチドにより減少した細胞において
、PMAでの処理はL-セレクチン発散を劇的に減少させた。対して、対照あるいはT
NF-αアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞では、PMAは依然L-セレク
チン発散を誘導した。ISIS 16337（SEQ ID NO. 2）は、PMA誘導の存在下あるい
は非存在下のいずれにおいても、CD3、CD45、LFA-1あるいはα4インテグリンを
含むその他の接着分子の細胞表面発現を変化させなかった。
【０１１９】 実施例6：TNF-αプロセッシングに対するTACEアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの効果 PMA刺激TNF-αプロセッシングおよび分泌の促進におけるTACEの役割を、THP-1
細胞において調べた。THP-1細胞は、実施例5に記載するように、20μMのオリゴ
ヌクレオチドを用いてエレクロトポレーションした。オリゴヌクレオチド処理の
24時間後、細胞を100 nM PMA（Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA
）で6時間処理した。PMA処理の後、次にTNF-α放出を1μg/mlのリポ多糖（LPS）
を用いて37℃で一晩誘発させた。上清を回収して、製造業者の説明に従ってCyto
screen Immunoassay Kit（Biosource International, Camarillo, CA）を使用し
てTNF-αをアッセイした。
【０１２０】 ISIS 14834（SEQ ID NO: 14）は、TNF-αを標的とする完全にホスホロチオエ
ート化されたオリゴデオキシヌクレオチドであり、陽性対照として使用した。 結果は表6に示す。
【０１２１】
【表６】
【０１２２】 TACEアンチセンスオリゴヌクレオチド、ISIS 16337（SEQ ID NO. 2）で処理し
た細胞は、産生される可溶性TNF-αの量を減少させた。減少のレベルは、TNF-α
特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド、ISIS 14834（SEQ ID NO. 18）と同様
であった。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは、TNF-α分泌に対する効果はな
かった。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２３日（２００２．５．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 1/00 1/16 1/16 1/18 1/18 3/10 3/10 17/00 17/00 17/06 17/06 19/02 19/02 25/00 １０１ 25/00 １０１ 29/00 29/00 １０１ １０１ 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ベネット，シー・フランク アメリカ合衆国カリフォルニア州92008， カールズバッド，キャシンズ・ストリート 1347 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA05 DA02 GA13 GA14 HA17 4B063 QA01 QQ08 QQ36 QQ41 QQ53 QR32 QR77 QS33 QS34 QX02 QX07 4C057 MM01 MM04 MM05 MM09 4C076 AA22 BB11 CC01 CC04 CC07 CC16 CC18 CC21 CC27 CC31 FF16 4C084 AA02 AA07 AA13 BA35 CA53 CA59 MA23 NA14 ZA022 ZA662 ZA752 ZA892 ZA962 ZB072 ZB112 ZB152 ZB262 ZB322 ZC352 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 MA23 MA66 NA14 ZA02 ZA66 ZA75 ZA89 ZA96 ZB07 ZB11 ZB15 ZB26 ZB32 ZC35

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトTNF-α変換酵素をコードする核酸分子を標的とする、長さ
    8から30の核塩基のアンチセンス化合物であって、ヒトTNF-α変換酵素の発現を
    阻害する、前記アンチセンス化合物。
  2. 【請求項２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1のアンチセ
    ンス化合物。
  3. 【請求項３】 ヒトTNF-α変換酵素の発現を阻害するSEQ ID NO: 2、SEQ ID N
    O: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:
    8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、あるいはSEQ ID NO: 12の
    少なくとも8の核塩基部分を含む長さ30までの核塩基のアンチセンス化合物。
  4. 【請求項４】 少なくとも一つの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項2の
    アンチセンス化合物。
  5. 【請求項５】 修飾ヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請
    求項4のアンチセンス化合物。
  6. 【請求項６】 少なくとも一つの修飾糖部分を含む、請求項2のアンチセンス
    化合物。
  7. 【請求項７】 修飾糖部分が2'-O-メトキシエチル糖部分である、請求項6のア
    ンチセンス化合物。
  8. 【請求項８】 少なくとも一つの修飾核塩基を含む、請求項2のアンチセンス
    化合物。
  9. 【請求項９】 修飾核塩基が5-メチルシトシンである、請求項8のアンチセン
    ス化合物。
  10. 【請求項１０】 キメラオリゴヌクレオチドである、請求項2のアンチセンス
    化合物。
  11. 【請求項１１】 請求項1のアンチセンス化合物および医薬的に許容可能な担
    体あるいは希釈剤を含む組成物。
  12. 【請求項１２】 コロイド分散システムをさらに含む、請求項11の組成物。
  13. 【請求項１３】 ヒト細胞あるいは組織においてTNF-α変換酵素の発現をモジ
    ュレートする方法であって、前記細胞あるいは組織と請求項1のアンチセンス化
    合物を接触させ、それによりTNF-α変換酵素の発現を阻害することを含む、前記
    方法。
  14. 【請求項１４】 ヒト細胞あるいは組織において、TNF-αの膜結合型から分泌
    型へのプロセッシングをモジュレートする方法であって、前記細胞あるいは組織
    と請求項1のアンチセンス化合物を接触させ、それによりTNF-α変換酵素の発現
    を阻害し、TNF-αのプロセッシングを阻害することを含む、前記方法。
  15. 【請求項１５】 TNF-α変換酵素と関連する疾患あるいは症状を有する動物を
    治療する方法であって、前記動物に対して、治療的あるいは予防的有効量の請求
    項1のアンチセンス化合物を投与し、それによりTNF-α変換酵素の発現を阻害す
    ることを含む、前記方法。
  16. 【請求項１６】 疾患あるいは症状がTNF-αの過剰発現と関連する、請求項15
    の方法。
  17. 【請求項１７】 前記疾患あるいは症状が炎症性あるいは自己免疫性の疾患あ
    るいは症状である、請求項16の方法。
  18. 【請求項１８】 前記炎症性あるいは自己免疫性の疾患あるいは症状が糖尿病
    、炎症性腸疾患、多発性硬化症、膵炎、慢性関節リウマチ、肝炎、アトピー性皮
    膚炎あるいは同種移植片拒絶である、請求項17の方法。
  19. 【請求項１９】 前記疾患あるいは症状が感染症である、請求項15の方法。
  20. 【請求項２０】 前記感染症が肝炎である、請求項19の方法。
  21. 【請求項２１】 TNF-αと関連する疾患あるいは症状を有する動物を治療する
    方法であって、前記動物に対して、治療的あるいは予防的有効量の請求項1のア
    ンチセンス化合物を投与し、それによりTNF-α変換酵素の発現を阻害し、TNF-α
    のプロセッシングを阻害することを含む方法。
  22. 【請求項２２】 疾患あるいは症状がTNF-αの過剰発現と関連する、請求項21
    の方法。
  23. 【請求項２３】 前記疾患あるいは症状が炎症性あるいは自己免疫性の疾患あ
    るいは症状である、請求項22の方法。
  24. 【請求項２４】 前記炎症性あるいは自己免疫性の疾患あるいは症状が糖尿病
    、炎症性腸疾患、多発性硬化症、膵炎、慢性関節リウマチ、肝炎、アトピー性皮
    膚炎あるいは同種移植片拒絶である、請求項23の方法。
  25. 【請求項２５】 前記疾患あるいは症状が感染症である、請求項22の方法。
  26. 【請求項２６】 前記感染症が肝炎である、請求項25の方法。
  27. 【請求項２７】 細胞あるいは組織において、TGF-αのプロセッシングをモジ
    ュレートする方法であって、前記細胞あるいは組織と請求項1のアンチセンス化
    合物を接触させることを含む、前記方法。
  28. 【請求項２８】 TGF-αと関連する疾患あるいは症状を有する動物を治療する
    方法であって、前記動物に対して、治療的あるいは予防的有効量の請求項1のア
    ンチセンス化合物を投与することを含む、前記方法。
  29. 【請求項２９】 前記疾患あるいは症状が癌あるいは乾癬である、請求項28の
    方法。
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