JP2002531574A - 細胞接着分子の腫瘍壊死因子α−誘導発現のモジュレート方法 - Google Patents
細胞接着分子の腫瘍壊死因子α−誘導発現のモジュレート方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ヒトTNF-αシグナル伝達に関するシグナル伝達分子の阻害剤を使用して、細胞接着分子の発現を阻害するための方法を提供する。これらの阻害剤は、モノクローナル抗体、ペプチド断片、小分子阻害剤、および、望ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。細胞接着分子の過剰発現と関連する疾患、特に炎症性および免疫性の疾患の処置のための方法を提供する。
Description
【０００１】 発明の属する分野 本発明は細胞接着分子の発現のモジュレートに関する。特に、ここではTNF-α
シグナル伝達に関する特異的な阻害剤を介して、細胞接着分子遺伝子発現を阻害
する方法を提供する。細胞接着分子の発現の変化に関連する炎症性および免疫性
疾患の治療のための方法も提供する。
シグナル伝達に関する特異的な阻害剤を介して、細胞接着分子遺伝子発現を阻害
する方法を提供する。細胞接着分子の発現の変化に関連する炎症性および免疫性
疾患の治療のための方法も提供する。
【０００２】 発明の背景 サイトカインは細胞分化、細胞成長、および細胞障害を含む多くの生物学的機
能を持った多様な制御タンパク質群を示す。細胞壊死因子アルファ（TNF-α）お
よびIL-1（インターロイキン-1）などの炎症性サイトカインは、免疫性および炎
症性応答において中枢的な役割をすることが示されている（McIntyre, T.M.ら,
Thromb. Haemos. 1997, 78, 302-305）。これらのサイトカインの最も重要なエ
フェクター機能の一つは、血管内皮において大きい変化を誘導する能力である（
Introna, M. and Mantovani, A., Art. Thromb. and Vasc. Biol. 1997, 17, 42
3-428）。炎症過程の中心は、循環している白血球の炎症部位への接着および動
員に大きく寄与する、内皮細胞表面上の細胞接着分子の誘導である。傷害および
感染に応じて産生されるTNF-αあるいはTL-1に暴露されると、内皮細胞のサイト
カイン受容体は様々な細胞内シグナル伝達分子を活性化する。これらのシグナル
伝達事象は、NF-kBなどの特異的転写因子の活性化を引き起こし、E-セレクチン
、ICAM-1、VCAM-1、およびその他の細胞接着分子の発現を亢進制御する（McInty
re, T.M.ら, Thromb. Haemos. 997, 78, 302-305；Introna, M.および Mantovan
i, A., Art. Thromb. and Vasc. Biol. 1997, 17, 423-428；Mantovani, A.ら,
Thromb. Haemos. 1997, 78, 406-414）。E-セレクチンは血管壁に沿った白血球
の初期の付着およびローリングを媒介することが示されており、一方、ICAM-1お
よびVCAM-1は血管壁に対する白血球の堅固な接着、および血管壁を介する移動（
transmigration）に関連している。E-セレクチンはサイトカインにより急速にそ
して一過性に誘導され、暴露後約4-6時間で発現のピークが起こり、暴露後約24
時間で基底レベルに戻る。対して、サイトカインによるICAM-1およびVCAM-1の誘
導はより遅く、24時間あるいはそれ以上持続する（Mantovani, A.ら, Thromb. H
aemos. 1997, 78, 406-414；Dunon, D.ら, Curr. Opin. Cell Bio, 1996, 8, 71
4-723；Bischoff, J., Cell Adhes. and Angiog., 1997, 99, 373-376）。
能を持った多様な制御タンパク質群を示す。細胞壊死因子アルファ（TNF-α）お
よびIL-1（インターロイキン-1）などの炎症性サイトカインは、免疫性および炎
症性応答において中枢的な役割をすることが示されている（McIntyre, T.M.ら,
Thromb. Haemos. 1997, 78, 302-305）。これらのサイトカインの最も重要なエ
フェクター機能の一つは、血管内皮において大きい変化を誘導する能力である（
Introna, M. and Mantovani, A., Art. Thromb. and Vasc. Biol. 1997, 17, 42
3-428）。炎症過程の中心は、循環している白血球の炎症部位への接着および動
員に大きく寄与する、内皮細胞表面上の細胞接着分子の誘導である。傷害および
感染に応じて産生されるTNF-αあるいはTL-1に暴露されると、内皮細胞のサイト
カイン受容体は様々な細胞内シグナル伝達分子を活性化する。これらのシグナル
伝達事象は、NF-kBなどの特異的転写因子の活性化を引き起こし、E-セレクチン
、ICAM-1、VCAM-1、およびその他の細胞接着分子の発現を亢進制御する（McInty
re, T.M.ら, Thromb. Haemos. 997, 78, 302-305；Introna, M.および Mantovan
i, A., Art. Thromb. and Vasc. Biol. 1997, 17, 423-428；Mantovani, A.ら,
Thromb. Haemos. 1997, 78, 406-414）。E-セレクチンは血管壁に沿った白血球
の初期の付着およびローリングを媒介することが示されており、一方、ICAM-1お
よびVCAM-1は血管壁に対する白血球の堅固な接着、および血管壁を介する移動（
transmigration）に関連している。E-セレクチンはサイトカインにより急速にそ
して一過性に誘導され、暴露後約4-6時間で発現のピークが起こり、暴露後約24
時間で基底レベルに戻る。対して、サイトカインによるICAM-1およびVCAM-1の誘
導はより遅く、24時間あるいはそれ以上持続する（Mantovani, A.ら, Thromb. H
aemos. 1997, 78, 406-414；Dunon, D.ら, Curr. Opin. Cell Bio, 1996, 8, 71
4-723；Bischoff, J., Cell Adhes. and Angiog., 1997, 99, 373-376）。
【０００３】 TNF-αに対する応答は、TNFRI（TNF-α受容体I）およびTNFRII（TNF-α受容体
II）と呼ばれる二つの別個の膜受容体の相互作用を介して媒介される。TNF-α受
容体に関連するアダプタータンパク質（adaptor proteins）の二つの別個のファ
ミリーが同定されている。デス-ドメイン（death domain）含有タンパク質（例
えば、TRADD）は、プログラム化された細胞死に対する受容体と結合する可能性
があり（Fiers, W.ら, J. Inflam., 1996, 47, 67-75；Wallach, D.ら, FEBS Le
tt., 1997, 410, 96-106；Hsu, H.ら, Cell, 1996, 84, 299-308）、一方、TRAF
（TNF受容体関連因子）ドメイン含有タンパク質は特異的な転写因子の活性化に
対する受容体と連結している（Hsu, H.ら, Cell, 1996, 84, 299-308；Baeuerle
, P.A., Curr. Biol., 1998, 8, R19-R22）。これまでに同定されたTRAFファミ
リーの六つの構成分子の中では、TRAF2はJNK（c-Jun N末端キナーゼ）だけでな
く、二つの主要な転写因子、NF-kB（核因子-kB）およびAP-1（活性化タンパク質
1）のTNF-α媒介活性化にとっても重要であることが報告されている（Hsu, H.ら
, Cell, 1996, 84, 299-308；Baeuerle, P.A., Curr. Biol., 1998, 8, R19-R22
；Natoli, G.ら, J. Biol. Chem., 1997, 272, 26079-26082；Liu, Z.G.ら, Cel
l, 1996, 87, 565-576；Song, H.Y.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94
, 9792-9796）。両転写因子は、免疫性および炎症性応答に関する遺伝子も含む
複数の遺伝子の制御において、中心的な役割をしている。AP-1は、ERK（細胞外
シグナル制御化キナーゼ）、JNKおよびp38 MAPKを含む様々なMAPK（有糸分裂活
性化プロテインキナーゼ）により活性化される（Fiers, W.ら, J. Inflam., 199
6, 47, 67-75；Eder, J., TIPS, 1997, 18, 319-322）。NF-kBは構成的に（cons
titutively）内皮細胞のサイトゾルの中に存在し、阻害性IkBファミリータンパ
ク質との関連によって不活化されている。TNF-αに暴露すると、IKK（IkBキナー
ゼ）はIkBをリン酸化して、そのユビキチン化、続いて分解を開始する。放出さ
れるNF-kBは核へ移動し、転写の活性化に加わる（Collins, T.ら, FASEB J., 19
95, 9, 899-909；Stancovski, I., and Baltimore, D., Cell, 1997, 91, 299-3
02）。
II）と呼ばれる二つの別個の膜受容体の相互作用を介して媒介される。TNF-α受
容体に関連するアダプタータンパク質（adaptor proteins）の二つの別個のファ
ミリーが同定されている。デス-ドメイン（death domain）含有タンパク質（例
えば、TRADD）は、プログラム化された細胞死に対する受容体と結合する可能性
があり（Fiers, W.ら, J. Inflam., 1996, 47, 67-75；Wallach, D.ら, FEBS Le
tt., 1997, 410, 96-106；Hsu, H.ら, Cell, 1996, 84, 299-308）、一方、TRAF
（TNF受容体関連因子）ドメイン含有タンパク質は特異的な転写因子の活性化に
対する受容体と連結している（Hsu, H.ら, Cell, 1996, 84, 299-308；Baeuerle
, P.A., Curr. Biol., 1998, 8, R19-R22）。これまでに同定されたTRAFファミ
リーの六つの構成分子の中では、TRAF2はJNK（c-Jun N末端キナーゼ）だけでな
く、二つの主要な転写因子、NF-kB（核因子-kB）およびAP-1（活性化タンパク質
1）のTNF-α媒介活性化にとっても重要であることが報告されている（Hsu, H.ら
, Cell, 1996, 84, 299-308；Baeuerle, P.A., Curr. Biol., 1998, 8, R19-R22
；Natoli, G.ら, J. Biol. Chem., 1997, 272, 26079-26082；Liu, Z.G.ら, Cel
l, 1996, 87, 565-576；Song, H.Y.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94
, 9792-9796）。両転写因子は、免疫性および炎症性応答に関する遺伝子も含む
複数の遺伝子の制御において、中心的な役割をしている。AP-1は、ERK（細胞外
シグナル制御化キナーゼ）、JNKおよびp38 MAPKを含む様々なMAPK（有糸分裂活
性化プロテインキナーゼ）により活性化される（Fiers, W.ら, J. Inflam., 199
6, 47, 67-75；Eder, J., TIPS, 1997, 18, 319-322）。NF-kBは構成的に（cons
titutively）内皮細胞のサイトゾルの中に存在し、阻害性IkBファミリータンパ
ク質との関連によって不活化されている。TNF-αに暴露すると、IKK（IkBキナー
ゼ）はIkBをリン酸化して、そのユビキチン化、続いて分解を開始する。放出さ
れるNF-kBは核へ移動し、転写の活性化に加わる（Collins, T.ら, FASEB J., 19
95, 9, 899-909；Stancovski, I., and Baltimore, D., Cell, 1997, 91, 299-3
02）。
【０００４】 MEKK1、pp90rsk（リボゾームS6プロテインキナーゼ）、ras、およびrafを含む
他のシグナル伝達分子は、NF-kBの活性化に関係している（Schulze-Osthoff, K.
ら, Immunobiol., 1997, 198, 35-49）。rasファミリー構成分子（Ha-ras、Ki-r
as、N-ras）は、TNF-αを含む様々な細胞外刺激に応じた細胞増殖および分化の
制御において、主要なメディエイターとして振る舞うGTP結合タンパク質である
。rasタンパク質はraf/MEK/ERK経路ならびにMEKK/JNKK/JNK経路の両方を活性化
することが示されている（Bos, J.L., Biochem. Biophys. Acta, 1997, 1333, M
19-M31；Marais, R.およびMarshall, C.J., Cancer Surveys, 1996, 27, 101-12
5；Adler, V.ら, J. Biol. Chem., 1996, 271, 23304-23309；Faris, M.ら, J.
Biol. Chem., 1996, 271, 27366-27373；Terada, K.ら, J. Biol. Chem., 1997,
272, 4544-4548）。rafファミリー構成分子（A-、B-、C-raf）は、MAPK経路を
含む様々な細胞内エフェクターに対する細胞表面受容体からのシグナルを伝達す
るセリン／トレオニンプロテインキナーゼである（Marais, R.および Marshall,
C.J., Cancer Surveys, 1996, 27, 101-125；Daum, G.ら, TIBS, 1994, 19, 47
4-480）。rasの他に、SrcファミリーキナーゼおよびPKC（プロテインキナーゼC
）を含む様々なプロテインキナーゼがraf活性を増強しうる（Marais, R.ら, J.
Biol. Chem., 1997, 272, 4378-4383；Ueffing, M.ら, Oncogene, 1997, 15, 29
21-2927）。rafの主な下流エフェクター（downstream effectors）は、MEK/MKK1
（MAPキナーゼキナーゼ1）およびMEK/MKK2（MAPキナーゼキナーゼ2）であり、こ
れらはERK1/2を順次リン酸化して活性化し、究極的には特異的な転写因子を活性
化する（Marais, R.およびMarshall, C.J., Cancer Surveys, 1996, 27, 101-12
5；Daum, G.ら, TIBS, 1994, 19, 474-480）。rasおよびrafはともにNF-kB転写
因子の活性化に加わることが示唆されていた（Schulze-Osthoff, K.ら, Immunob
iol., 1997, 198, 35-49；Folgueira, L.ら, J. Virol., 1996, 70, 2332-2338
；Koong, A.C.ら, Cancer Res., 1994, 54, 5273-5279；Bertrand, F.ら, J. Bi
ol. Chem., 1995, 270, 24435-24441；Kanno, T.およびSiebenlist, U., J. Imm
unol., 1996, 157, 5277-5283）。
他のシグナル伝達分子は、NF-kBの活性化に関係している（Schulze-Osthoff, K.
ら, Immunobiol., 1997, 198, 35-49）。rasファミリー構成分子（Ha-ras、Ki-r
as、N-ras）は、TNF-αを含む様々な細胞外刺激に応じた細胞増殖および分化の
制御において、主要なメディエイターとして振る舞うGTP結合タンパク質である
。rasタンパク質はraf/MEK/ERK経路ならびにMEKK/JNKK/JNK経路の両方を活性化
することが示されている（Bos, J.L., Biochem. Biophys. Acta, 1997, 1333, M
19-M31；Marais, R.およびMarshall, C.J., Cancer Surveys, 1996, 27, 101-12
5；Adler, V.ら, J. Biol. Chem., 1996, 271, 23304-23309；Faris, M.ら, J.
Biol. Chem., 1996, 271, 27366-27373；Terada, K.ら, J. Biol. Chem., 1997,
272, 4544-4548）。rafファミリー構成分子（A-、B-、C-raf）は、MAPK経路を
含む様々な細胞内エフェクターに対する細胞表面受容体からのシグナルを伝達す
るセリン／トレオニンプロテインキナーゼである（Marais, R.および Marshall,
C.J., Cancer Surveys, 1996, 27, 101-125；Daum, G.ら, TIBS, 1994, 19, 47
4-480）。rasの他に、SrcファミリーキナーゼおよびPKC（プロテインキナーゼC
）を含む様々なプロテインキナーゼがraf活性を増強しうる（Marais, R.ら, J.
Biol. Chem., 1997, 272, 4378-4383；Ueffing, M.ら, Oncogene, 1997, 15, 29
21-2927）。rafの主な下流エフェクター（downstream effectors）は、MEK/MKK1
（MAPキナーゼキナーゼ1）およびMEK/MKK2（MAPキナーゼキナーゼ2）であり、こ
れらはERK1/2を順次リン酸化して活性化し、究極的には特異的な転写因子を活性
化する（Marais, R.およびMarshall, C.J., Cancer Surveys, 1996, 27, 101-12
5；Daum, G.ら, TIBS, 1994, 19, 474-480）。rasおよびrafはともにNF-kB転写
因子の活性化に加わることが示唆されていた（Schulze-Osthoff, K.ら, Immunob
iol., 1997, 198, 35-49；Folgueira, L.ら, J. Virol., 1996, 70, 2332-2338
；Koong, A.C.ら, Cancer Res., 1994, 54, 5273-5279；Bertrand, F.ら, J. Bi
ol. Chem., 1995, 270, 24435-24441；Kanno, T.およびSiebenlist, U., J. Imm
unol., 1996, 157, 5277-5283）。
【０００５】 炎症性成分を伴う多くのヒトの疾患では、炎症性応答を和らげる正常な恒常性
機構に欠陥があり、そのため正常組織の損傷および破壊を引き起こす。例えば、
VCAM-1は黒色腫、あるいは場合によっては他の癌の転移の役割を演じる可能性が
ある。加えて、データによると、ICAM-1は一般的な風邪の50％以上の原因である
ライノウイルスの主要な血清型にとっての細胞性受容体であることが明らかにさ
れている（Stauntonら, Cell, 1989, 56, 849-853；Greveら, Cell, 1989, 56,
839-847）。
機構に欠陥があり、そのため正常組織の損傷および破壊を引き起こす。例えば、
VCAM-1は黒色腫、あるいは場合によっては他の癌の転移の役割を演じる可能性が
ある。加えて、データによると、ICAM-1は一般的な風邪の50％以上の原因である
ライノウイルスの主要な血清型にとっての細胞性受容体であることが明らかにさ
れている（Stauntonら, Cell, 1989, 56, 849-853；Greveら, Cell, 1989, 56,
839-847）。
【０００６】 ICAM-1の発現はまた、アレルギー性接触皮膚炎、固定薬疹、扁平苔癬、および
乾癬などの様々な炎症性皮膚障害とも関連している（Hoら, J. Am. Acad. Derma
tol., 1990, 22, 64-68；GriffithsおよびNickoloff, Am. J. Pathology, 1989,
135, 1045-1053；Lisbyら, Br. J. Dermatol., 1989, 120, 479-484；Shiohara
ら, Arch. Dermatol., 1989, 125, 1371-1376）。加えて、ICAM-1発現は、慢性
関節リウマチの患者の滑膜（Haleら, Arth. Rheum., 1989, 32, 22-30）、糖尿
病の膵臓B細胞（Campbellら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86, 4282
-4286）、グレーヴズ病の患者の甲状腺濾胞細胞（Weetmanら, J. Endocrinol.,
1989, 122, 185-191）、および腎臓および肝臓の同種移植片拒絶（FaullおよびR
uss, Transplantation, 1989, 48, 226-230；Adamsら, Lancet, 1989, 2, 1122-
1125）において検出されている。
乾癬などの様々な炎症性皮膚障害とも関連している（Hoら, J. Am. Acad. Derma
tol., 1990, 22, 64-68；GriffithsおよびNickoloff, Am. J. Pathology, 1989,
135, 1045-1053；Lisbyら, Br. J. Dermatol., 1989, 120, 479-484；Shiohara
ら, Arch. Dermatol., 1989, 125, 1371-1376）。加えて、ICAM-1発現は、慢性
関節リウマチの患者の滑膜（Haleら, Arth. Rheum., 1989, 32, 22-30）、糖尿
病の膵臓B細胞（Campbellら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86, 4282
-4286）、グレーヴズ病の患者の甲状腺濾胞細胞（Weetmanら, J. Endocrinol.,
1989, 122, 185-191）、および腎臓および肝臓の同種移植片拒絶（FaullおよびR
uss, Transplantation, 1989, 48, 226-230；Adamsら, Lancet, 1989, 2, 1122-
1125）において検出されている。
【０００７】 ICAM-1、VCAM-1およびELAM-1発現の阻害剤は、様々な炎症性疾患、あるいは喘
息、慢性関節リウマチ、同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、様々な皮膚科的な症状
、および乾癬などの炎症性成分を伴う疾患に対して、活性のある抗炎症剤の新た
な治療的なクラスを提供しうる。加えて、ICAM-1、VCAM-1、およびELAM-1の阻害
剤はまた、ライノウイルス感染による風邪、AIDS、カポジ肉腫およびいくつかの
癌およびそれらの転移の治療に効果的でもあり得る。動物モデルにおけるICAM-1
に対する中和モノクローナル抗体の使用は、そのような阻害剤は、もし同定され
れば、喘息（Wegnerら, Science, 1990, 247, 456-459）、腎臓の同種移植片（C
osimiら, J. Immunol., 1990, 144, 4604-4612）、および心臓の同種移植片（Is
obeら, Science, 1992, 255, 1125-1127）にとって治療的な利益を有するであろ
う、という証拠を与える。ICAM-1分子の可溶化型の使用はまた、培養において細
胞のライノウイルス感染を防ぐことにも効果的であった（Marlinら, Nature, 19
90, 344, 70-72）。
息、慢性関節リウマチ、同種移植片拒絶、炎症性腸疾患、様々な皮膚科的な症状
、および乾癬などの炎症性成分を伴う疾患に対して、活性のある抗炎症剤の新た
な治療的なクラスを提供しうる。加えて、ICAM-1、VCAM-1、およびELAM-1の阻害
剤はまた、ライノウイルス感染による風邪、AIDS、カポジ肉腫およびいくつかの
癌およびそれらの転移の治療に効果的でもあり得る。動物モデルにおけるICAM-1
に対する中和モノクローナル抗体の使用は、そのような阻害剤は、もし同定され
れば、喘息（Wegnerら, Science, 1990, 247, 456-459）、腎臓の同種移植片（C
osimiら, J. Immunol., 1990, 144, 4604-4612）、および心臓の同種移植片（Is
obeら, Science, 1992, 255, 1125-1127）にとって治療的な利益を有するであろ
う、という証拠を与える。ICAM-1分子の可溶化型の使用はまた、培養において細
胞のライノウイルス感染を防ぐことにも効果的であった（Marlinら, Nature, 19
90, 344, 70-72）。
【０００８】 細胞間接着分子に影響を与える現在の薬剤は、合成ペプチド、モノクローナル
抗体、接着分子の可溶化型、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。細
胞接着分子に対するアンチオリゴヌクレオチドは、米国特許No. 5,514,788およ
び5,591,623に開示され、これらは本明細書中に参考文献として援用される。こ
れらは単一の細胞接着分子に対して指向された。さらなる薬剤が望まれる。その
うえ、単一の薬剤でいくつかの接着分子を標的とする広いアプローチは、規模の
利益、広域スペクトルの有用性などを含むいくつかの利点を有する可能性がある
。このように、TNF-αシグナル伝達経路における分子を標的とするためのアプロ
ーチは、有用な治療的な処置であり、単一の薬剤で複数の細胞接着分子を制御す
るための方法を提供しうる。
抗体、接着分子の可溶化型、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。細
胞接着分子に対するアンチオリゴヌクレオチドは、米国特許No. 5,514,788およ
び5,591,623に開示され、これらは本明細書中に参考文献として援用される。こ
れらは単一の細胞接着分子に対して指向された。さらなる薬剤が望まれる。その
うえ、単一の薬剤でいくつかの接着分子を標的とする広いアプローチは、規模の
利益、広域スペクトルの有用性などを含むいくつかの利点を有する可能性がある
。このように、TNF-αシグナル伝達経路における分子を標的とするためのアプロ
ーチは、有用な治療的な処置であり、単一の薬剤で複数の細胞接着分子を制御す
るための方法を提供しうる。
【０００９】 TNF-α媒介性シグナル伝達における分子の阻害剤を使用して、シグナル変換経
路が研究されており、薬理学的な薬剤の設計に有用であることを示唆する。使用
されている阻害剤は、NF-kBに対するDMSO（Essani, N.A.ら, Shock, 1997, 7, 9
0-96）、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤（Adamson, P.ら, Cell Adhes. Com
mun.,1996, 3, 511-525；Pai, R.ら, J. Immunol., 1996, 156, 2571-2579）、
プロテインチロシンキナーゼC阻害剤（Ballestas, M.E.およびBenveniste, E.N.
, Glia, 1995, 14, 267-278）、ユビキチンリガーゼ阻害剤（Yaron, A.ら, EMBO
J., 1997, 16, 6486-6494）、およびホスホリパーゼA2阻害剤（Thommesen, L.
ら, J. Immunol., 1998, 161, 3421-3430）を含む。加えて、サイクリックAMPを
高める薬剤がELAM-1およびVCAM-1を阻害することが分かっている（Pober, J.S.
ら, J. Immunol., 1993, 150, 5114-5123）。
路が研究されており、薬理学的な薬剤の設計に有用であることを示唆する。使用
されている阻害剤は、NF-kBに対するDMSO（Essani, N.A.ら, Shock, 1997, 7, 9
0-96）、プロテインチロシンキナーゼ阻害剤（Adamson, P.ら, Cell Adhes. Com
mun.,1996, 3, 511-525；Pai, R.ら, J. Immunol., 1996, 156, 2571-2579）、
プロテインチロシンキナーゼC阻害剤（Ballestas, M.E.およびBenveniste, E.N.
, Glia, 1995, 14, 267-278）、ユビキチンリガーゼ阻害剤（Yaron, A.ら, EMBO
J., 1997, 16, 6486-6494）、およびホスホリパーゼA2阻害剤（Thommesen, L.
ら, J. Immunol., 1998, 161, 3421-3430）を含む。加えて、サイクリックAMPを
高める薬剤がELAM-1およびVCAM-1を阻害することが分かっている（Pober, J.S.
ら, J. Immunol., 1993, 150, 5114-5123）。
【００１０】 c-raf、Ha-rasおよびJNK2に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは知られ
ているが、以前は細胞接着分子発現を阻害することは示されていなかった。TNF-
αシグナル伝達分子と細胞接着分子発現との関係は完全には詳細に示されていな
い。c-rafアンチセンスオリゴヌクレオチドは米国特許No. 5,563,255および5,65
6,612に開示され、これらは本明細書中に参考文献として援用される。Ha-rasア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、USP 5,576,208および5,582,986に開示され、
これらは本明細書中に参考文献として援用される。JNK2アンチセンスオリゴヌク
レオチドはBost, F.らにより開示される（J. Biol. Chem. 1997, 272, 33422-33
429）。TNF-αシグナル伝達分子、c-raf、Ha-ras、およびJNK2の阻害剤は、細胞
接着分子の発現をモジュレートするためには使用されておらず、新規アプローチ
を示す。
ているが、以前は細胞接着分子発現を阻害することは示されていなかった。TNF-
αシグナル伝達分子と細胞接着分子発現との関係は完全には詳細に示されていな
い。c-rafアンチセンスオリゴヌクレオチドは米国特許No. 5,563,255および5,65
6,612に開示され、これらは本明細書中に参考文献として援用される。Ha-rasア
ンチセンスオリゴヌクレオチドは、USP 5,576,208および5,582,986に開示され、
これらは本明細書中に参考文献として援用される。JNK2アンチセンスオリゴヌク
レオチドはBost, F.らにより開示される（J. Biol. Chem. 1997, 272, 33422-33
429）。TNF-αシグナル伝達分子、c-raf、Ha-ras、およびJNK2の阻害剤は、細胞
接着分子の発現をモジュレートするためには使用されておらず、新規アプローチ
を示す。
【００１１】 発明の詳細な説明 本発明は、TNF-αシグナル伝達経路の一員であるHa-ras、c-rafおよびJNK2の
特異的阻害剤を使用して、細胞接着分子の発現をモジュレートする。これらの阻
害剤は、モノクローナル抗体、ペプチド断片、小分子阻害剤およびアンチセンス
化合物を含みうる。好ましい態様において、アンチセンス化合物、特にオリゴヌ
クレオチドを使用して、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする核酸分子の機
能をモジュレートし、産生されるタンパク質の量をモジュレートし、究極的には
細胞接着分子の発現をモジュレートする。これは、 Ha-ras、c-rafあるいはJNK2
をコードする核酸、好ましくはmRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドを提供することで成し遂げられる。
特異的阻害剤を使用して、細胞接着分子の発現をモジュレートする。これらの阻
害剤は、モノクローナル抗体、ペプチド断片、小分子阻害剤およびアンチセンス
化合物を含みうる。好ましい態様において、アンチセンス化合物、特にオリゴヌ
クレオチドを使用して、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする核酸分子の機
能をモジュレートし、産生されるタンパク質の量をモジュレートし、究極的には
細胞接着分子の発現をモジュレートする。これは、 Ha-ras、c-rafあるいはJNK2
をコードする核酸、好ましくはmRNAと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレ
オチドを提供することで成し遂げられる。
【００１２】 オリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物と、それとハイブリダイズす
るその相補的な核酸標的との関係は、一般に“アンチセンス”として言及される
。本発明の文脈において、選択される核酸標的に対してオリゴヌクレオチドを“
標的化する”ことは、複数段階的な過程である。その過程は通常、その機能をモ
ジュレートすべき核酸配列を同定することから始まる。例として、これはその発
現が特定の疾患状態に関係する細胞遺伝子（あるいはその遺伝子から作成される
mRNA）、あるいは感染性病原体由来の外来遺伝子であり得る。本発明において、
標的はHa-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする核酸であり；言い換えれば、Ha-
ras、c-rafあるいはJNK2をコードする遺伝子、あるいはHa-ras、c-rafあるいはJ
NK2遺伝子から発現するmRNAである。 Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードするm
RNAは、現在は好ましい標的である。標的過程はまた、結果として遺伝子発現の
モジュレートが起こりうるであろうアンチセンス相互作用のための核酸配列内の
一つあるいは複数の部位の決定も含む。
るその相補的な核酸標的との関係は、一般に“アンチセンス”として言及される
。本発明の文脈において、選択される核酸標的に対してオリゴヌクレオチドを“
標的化する”ことは、複数段階的な過程である。その過程は通常、その機能をモ
ジュレートすべき核酸配列を同定することから始まる。例として、これはその発
現が特定の疾患状態に関係する細胞遺伝子（あるいはその遺伝子から作成される
mRNA）、あるいは感染性病原体由来の外来遺伝子であり得る。本発明において、
標的はHa-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする核酸であり；言い換えれば、Ha-
ras、c-rafあるいはJNK2をコードする遺伝子、あるいはHa-ras、c-rafあるいはJ
NK2遺伝子から発現するmRNAである。 Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードするm
RNAは、現在は好ましい標的である。標的過程はまた、結果として遺伝子発現の
モジュレートが起こりうるであろうアンチセンス相互作用のための核酸配列内の
一つあるいは複数の部位の決定も含む。
【００１３】 本発明に従って、当業者はメッセンジャーRNAは三文字遺伝的コードを使用し
てタンパク質をコードする情報だけでなく、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域、5'キ
ャップ領域およびイントロン／エクソン結合部リボヌクレオチドとして当業者に
知られる領域を形成する関連するリボヌクレオチド、も含むことを理解するであ
ろう。このように、オリゴヌクレオチドはこれらの関連するヌクレオチド、なら
びに情報性のリボヌクレオチドに対して、全体あるいは一部を標的とする本発明
に従って処方されうる。それ故、オリゴヌクレオチドは転写開始部位領域、翻訳
開始コドン領域、5'キャップ領域、イントロン／エクソン結合部、コード配列、
翻訳終了コドン領域あるいは、5'あるいは3'非翻訳領域内の配列と特異的にハイ
ブリダイズしうる。当該技術分野で知られるように、翻訳開始コドンは典型的に
5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA分子では5'-ATG）であるた
め、翻訳開始コドンは“AUGコドン”、“開始コドン”あるいは“AUG開始コドン
”としても言及される。少数の遺伝子はRNA配列、5'-GUG、5'-UUGあるいは5'-CU
Gをもつ翻訳開始コドンをもっており、また5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGはin vi
voでの機能が示されている。各々の例における開始アミノ酸は典型的にはメチオ
ニン（真核生物において）あるいはホルミルメチオニン（原核生物）であるが、
このように、“翻訳開始コドン”および“開始コドン”という用語は多くのコド
ン配列を含みうる。真核生物および原核生物の遺伝子は二つあるいはそれ以上の
代替えの開始コドンを持ちうることが、当該技術分野で知られており、そのうち
のいずれもが特定の細胞型あるいは組織において、あるいは特定の一連の条件の
下で、翻訳開始に好ましく利用されうる。本発明の文脈において、“開始コドン
”および“翻訳開始コドン”は、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする遺伝
子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するためにin vivoで使用される、一つ
のコドンあるいは複数のコドンについて言及し、そのようなコドンに配列にはか
かわらない。ある遺伝子の翻訳終了コドン（あるいは“停止コドン”）は三つの
配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（それらに対応するDNA配列は各々5
'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGA）の一つでありうる、ということも当該技術分野で
知られている。“開始コドン領域”、“AUG領域”および“翻訳開始コドン領域
”という用語は、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち5'あるいは3'）
における約25から約50の近接したヌクレオチドを含むmRNAあるいは遺伝子の部分
について言及する。この領域は好ましい標的領域である。同様に、“停止コドン
領域”および“翻訳終了コドン領域”という用語は、翻訳終了コドンからどちら
かの方向（すなわち5'あるいは3'）における約25から約50の近接したヌクレオチ
ドを含むmRNAあるいは遺伝子の部分について言及する。この領域は好ましい標的
領域である。オープンリーディングフレーム（ORF）あるいは“コード領域”は
、当該技術分野では翻訳開始コドンと翻訳終了コドンの間の領域について言及す
ると知られており、効果的な標的となりうる領域でもある。他の好ましい標的領
域は、5'非翻訳領域（5'UTR）および3'非翻訳領域（3'UTR）を含み、5'UTRは翻
訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの部分について言及すると当該技術分野で
知られており、従って、5'キャップ部位とmRNAの翻訳開始コドンとの間のヌクレ
オチドあるいはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含み、そして3'UTRは翻
訳終了コドンから3'方向におけるmRNAの部分に対して言及すると当該技術分野で
知られており、従って、翻訳終了コドンとmRNAの3'末端との間のヌクレオチドあ
るいはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む。mRNAの5'キャップは、5'-5
'三リン酸結合を介してmRNAの5'末端の残基（5'-most residue）と結合するN7メ
チル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自身さ
らにはキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。5'キャッ
プ領域もまた好ましい標的領域である。
てタンパク質をコードする情報だけでなく、5'非翻訳領域、3'非翻訳領域、5'キ
ャップ領域およびイントロン／エクソン結合部リボヌクレオチドとして当業者に
知られる領域を形成する関連するリボヌクレオチド、も含むことを理解するであ
ろう。このように、オリゴヌクレオチドはこれらの関連するヌクレオチド、なら
びに情報性のリボヌクレオチドに対して、全体あるいは一部を標的とする本発明
に従って処方されうる。それ故、オリゴヌクレオチドは転写開始部位領域、翻訳
開始コドン領域、5'キャップ領域、イントロン／エクソン結合部、コード配列、
翻訳終了コドン領域あるいは、5'あるいは3'非翻訳領域内の配列と特異的にハイ
ブリダイズしうる。当該技術分野で知られるように、翻訳開始コドンは典型的に
5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA分子では5'-ATG）であるた
め、翻訳開始コドンは“AUGコドン”、“開始コドン”あるいは“AUG開始コドン
”としても言及される。少数の遺伝子はRNA配列、5'-GUG、5'-UUGあるいは5'-CU
Gをもつ翻訳開始コドンをもっており、また5'-AUA、5'-ACGおよび5'-CUGはin vi
voでの機能が示されている。各々の例における開始アミノ酸は典型的にはメチオ
ニン（真核生物において）あるいはホルミルメチオニン（原核生物）であるが、
このように、“翻訳開始コドン”および“開始コドン”という用語は多くのコド
ン配列を含みうる。真核生物および原核生物の遺伝子は二つあるいはそれ以上の
代替えの開始コドンを持ちうることが、当該技術分野で知られており、そのうち
のいずれもが特定の細胞型あるいは組織において、あるいは特定の一連の条件の
下で、翻訳開始に好ましく利用されうる。本発明の文脈において、“開始コドン
”および“翻訳開始コドン”は、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする遺伝
子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するためにin vivoで使用される、一つ
のコドンあるいは複数のコドンについて言及し、そのようなコドンに配列にはか
かわらない。ある遺伝子の翻訳終了コドン（あるいは“停止コドン”）は三つの
配列、すなわち5'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（それらに対応するDNA配列は各々5
'-TAA、5'-TAGおよび5'-TGA）の一つでありうる、ということも当該技術分野で
知られている。“開始コドン領域”、“AUG領域”および“翻訳開始コドン領域
”という用語は、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち5'あるいは3'）
における約25から約50の近接したヌクレオチドを含むmRNAあるいは遺伝子の部分
について言及する。この領域は好ましい標的領域である。同様に、“停止コドン
領域”および“翻訳終了コドン領域”という用語は、翻訳終了コドンからどちら
かの方向（すなわち5'あるいは3'）における約25から約50の近接したヌクレオチ
ドを含むmRNAあるいは遺伝子の部分について言及する。この領域は好ましい標的
領域である。オープンリーディングフレーム（ORF）あるいは“コード領域”は
、当該技術分野では翻訳開始コドンと翻訳終了コドンの間の領域について言及す
ると知られており、効果的な標的となりうる領域でもある。他の好ましい標的領
域は、5'非翻訳領域（5'UTR）および3'非翻訳領域（3'UTR）を含み、5'UTRは翻
訳開始コドンから5'方向におけるmRNAの部分について言及すると当該技術分野で
知られており、従って、5'キャップ部位とmRNAの翻訳開始コドンとの間のヌクレ
オチドあるいはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含み、そして3'UTRは翻
訳終了コドンから3'方向におけるmRNAの部分に対して言及すると当該技術分野で
知られており、従って、翻訳終了コドンとmRNAの3'末端との間のヌクレオチドあ
るいはその遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む。mRNAの5'キャップは、5'-5
'三リン酸結合を介してmRNAの5'末端の残基（5'-most residue）と結合するN7メ
チル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自身さ
らにはキャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられる。5'キャッ
プ領域もまた好ましい標的領域である。
【００１４】 いくつかの真核生物のmRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは“イントロン”
として知られる一つあるいはそれ以上の領域を含有し、それをプレmRNA配列から
除去して一つあるいはそれ以上の成熟mRNAを産生する。残存（およびそれ故翻訳
される）領域は“エクソン”として知られ、一緒にスプライス（splice）され、
連続したmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわちエクソン-エクソ
ンあるいはイントロン-エクソン結合部もまた好ましい標的領域であり、異常型
スプライシングが疾患に関係する場合や、特定のmRNA産物の過剰産生が疾患に関
係する場合に特に有用である。再構成あるいは欠損による異常型の融合結合部も
また好ましい標的である。選択的スプライスされたmRNAにおいて特定のエクソン
を標的とすることも好ましい可能性がある。イントロンは効果的でもあり、また
それ故、例えばDNAあるいはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物にとって
の標的領域としても好ましい。
として知られる一つあるいはそれ以上の領域を含有し、それをプレmRNA配列から
除去して一つあるいはそれ以上の成熟mRNAを産生する。残存（およびそれ故翻訳
される）領域は“エクソン”として知られ、一緒にスプライス（splice）され、
連続したmRNA配列を形成する。mRNAスプライス部位、すなわちエクソン-エクソ
ンあるいはイントロン-エクソン結合部もまた好ましい標的領域であり、異常型
スプライシングが疾患に関係する場合や、特定のmRNA産物の過剰産生が疾患に関
係する場合に特に有用である。再構成あるいは欠損による異常型の融合結合部も
また好ましい標的である。選択的スプライスされたmRNAにおいて特定のエクソン
を標的とすることも好ましい可能性がある。イントロンは効果的でもあり、また
それ故、例えばDNAあるいはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物にとって
の標的領域としても好ましい。
【００１５】 ひとたび一つあるいは複数の標的部位が同定されると、標的に十分に相補的な
、すなわち十分に良くおよび十分に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドが選択され、所望するモジュレートを与える。
、すなわち十分に良くおよび十分に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドが選択され、所望するモジュレートを与える。
【００１６】 本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”は通常は向かい合ってい
る核酸鎖あるいは核酸鎖の二つの領域における、ワトソン-クリック塩基対とし
ても知られる、相補的な塩基間での水素結合を意味する。グアニンとシトシンは
、それらの間で三つの水素結合を形成すると知られている相補的な塩基の例であ
る。アデニンとチミンは、それらの間で二つの水素結合を形成する相補的な塩基
の例である。
る核酸鎖あるいは核酸鎖の二つの領域における、ワトソン-クリック塩基対とし
ても知られる、相補的な塩基間での水素結合を意味する。グアニンとシトシンは
、それらの間で三つの水素結合を形成すると知られている相補的な塩基の例であ
る。アデニンとチミンは、それらの間で二つの水素結合を形成する相補的な塩基
の例である。
【００１７】 “特異的にハイブリダイズ可能な”および“相補的な”は、十分な程度の相補
性のため、安定した特異的な結合がDNAあるいはRNA標的とオリゴヌクレオチドと
の間で起こる、ということを示すのに使用される用語である。
性のため、安定した特異的な結合がDNAあるいはRNA標的とオリゴヌクレオチドと
の間で起こる、ということを示すのに使用される用語である。
【００１８】 オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズが可能となるためにその標的
核酸配列と100％相補的である必要はない、ということが分かっている。オリゴ
ヌクレオチドは、標的とオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常機能を妨げ
て効力の損失を起こし、そして特異的な結合が所望できる条件下、すなわちin v
ivoでのアッセイあるいは治療的処置の場合およびin vitroでのアッセイの場合
における条件下、アッセイが行われる条件下での、非標的配列とオリゴヌクレオ
チドとの非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、特異的
にハイブリダイズ可能である。
核酸配列と100％相補的である必要はない、ということが分かっている。オリゴ
ヌクレオチドは、標的とオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常機能を妨げ
て効力の損失を起こし、そして特異的な結合が所望できる条件下、すなわちin v
ivoでのアッセイあるいは治療的処置の場合およびin vitroでのアッセイの場合
における条件下、アッセイが行われる条件下での、非標的配列とオリゴヌクレオ
チドとの非特異的な結合を避けるために十分な程度の相補性がある場合、特異的
にハイブリダイズ可能である。
【００１９】 mRNAとのアンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、一つ
あるいはそれ以上のmRNAの正常機能を妨げる。妨げられるmRNAの機能は、例えば
、タンパク質翻訳部位へのRNAのトランスロケーション、RNAからのタンパク質翻
訳、一つあるいはそれ以上のmRNA種を産生するためのRNAのスプライシング、お
よびRNAにより行われうる触媒反応活性化などの全ての生命維持に必要な機能を
含む。特異的タンパク質のRNAへの結合もまた、RNAに対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより妨げられる。
あるいはそれ以上のmRNAの正常機能を妨げる。妨げられるmRNAの機能は、例えば
、タンパク質翻訳部位へのRNAのトランスロケーション、RNAからのタンパク質翻
訳、一つあるいはそれ以上のmRNA種を産生するためのRNAのスプライシング、お
よびRNAにより行われうる触媒反応活性化などの全ての生命維持に必要な機能を
含む。特異的タンパク質のRNAへの結合もまた、RNAに対するアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより妨げられる。
【００２０】 mRNA機能の干渉の全体的な効果は、c-raf、Ha-rasあるいはJNK2の発現のモジ
ュレート、および本発明の文脈中では、究極的には細胞接着分子の発現のモジュ
レートである。本発明の文脈中では、“モジュレート”は阻害あるいは刺激のい
ずれか、すなわち発現の減少あるいは増加のいずれかを意味する。このモジュレ
ートは、当該技術部分野では決まりきった方法において、例えば、本出願の実施
例において教示されるように、mRNA発現のノーザンブロットアッセイ、あるいは
逆転写PCR、あるいはタンパク質発現のウエスタンブロットあるいはELISA、ある
いはタンパク質発現の免疫沈降アッセイによって測定可能である。細胞増殖ある
いは腫瘍細胞の成長に対する効果も、本出願の実施例において教示されるように
測定可能である。現在は阻害が好ましい。
ュレート、および本発明の文脈中では、究極的には細胞接着分子の発現のモジュ
レートである。本発明の文脈中では、“モジュレート”は阻害あるいは刺激のい
ずれか、すなわち発現の減少あるいは増加のいずれかを意味する。このモジュレ
ートは、当該技術部分野では決まりきった方法において、例えば、本出願の実施
例において教示されるように、mRNA発現のノーザンブロットアッセイ、あるいは
逆転写PCR、あるいはタンパク質発現のウエスタンブロットあるいはELISA、ある
いはタンパク質発現の免疫沈降アッセイによって測定可能である。細胞増殖ある
いは腫瘍細胞の成長に対する効果も、本出願の実施例において教示されるように
測定可能である。現在は阻害が好ましい。
【００２１】 本発明のオリゴヌクレオチドは診断法、治療法、予防において、あるいは研究
試薬およびそのキットとして、使用可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは
、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする核酸とハイブリダイズするので、サ
ンドイッチ、比色定量および他のアッセイを容易に行うことができ、この事実を
活用できる。Ha-ras、c-rafあるいはJNK2遺伝子あるいはmRNAを用いたオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーション検出のための手段の提供は、ごく普通に成
し遂げられている。そのような提供は酵素結合、放射性標識、あるいは他の適し
た検出システムを含むことができる。Ha-ras、c-rafあるいはJNK2の有無を検出
するためのキットも調製されうる。
試薬およびそのキットとして、使用可能である。本発明のオリゴヌクレオチドは
、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2をコードする核酸とハイブリダイズするので、サ
ンドイッチ、比色定量および他のアッセイを容易に行うことができ、この事実を
活用できる。Ha-ras、c-rafあるいはJNK2遺伝子あるいはmRNAを用いたオリゴヌ
クレオチドのハイブリダイゼーション検出のための手段の提供は、ごく普通に成
し遂げられている。そのような提供は酵素結合、放射性標識、あるいは他の適し
た検出システムを含むことができる。Ha-ras、c-rafあるいはJNK2の有無を検出
するためのキットも調製されうる。
【００２２】 本発明はまた、慢性関節リウマチなどの炎症性疾患の疑いのある患者からの組
織あるいは他の試料における異常な炎症性の状態を診断することにも適している
。本発明のオリゴヌクレオチドの炎症の進行を阻害する能力は、そのような状態
を診断することに使用されうる。多くのアッセイは本発明を使用するように定型
化され、そのアッセイは一般に、そのような阻害の検出および、通常は定量を可
能とするために選択される条件下で、本発明のオリゴヌクレオチドを組織試料に
接触することを含む。本発明の文脈において、一つあるいは複数の本発明のオリ
ゴヌクレオチドを、組織あるいは細胞に“接触”するということは、オリゴヌク
レオチドを、通常は液状のキャリア中で、in vitroあるいはex vivoのいずれか
で細胞懸濁液あるいは組織試料に加えること、あるいはオリゴヌクレオチドを動
物内で細胞あるいは組織に投与することを意味する。
織あるいは他の試料における異常な炎症性の状態を診断することにも適している
。本発明のオリゴヌクレオチドの炎症の進行を阻害する能力は、そのような状態
を診断することに使用されうる。多くのアッセイは本発明を使用するように定型
化され、そのアッセイは一般に、そのような阻害の検出および、通常は定量を可
能とするために選択される条件下で、本発明のオリゴヌクレオチドを組織試料に
接触することを含む。本発明の文脈において、一つあるいは複数の本発明のオリ
ゴヌクレオチドを、組織あるいは細胞に“接触”するということは、オリゴヌク
レオチドを、通常は液状のキャリア中で、in vitroあるいはex vivoのいずれか
で細胞懸濁液あるいは組織試料に加えること、あるいはオリゴヌクレオチドを動
物内で細胞あるいは組織に投与することを意味する。
【００２３】 本発明のオリゴヌクレオチドはまた研究目的にも使用されうる。例えば、シグ
ナル伝達経路において特定の遺伝子産物の機能は、特異的なオリゴヌクレオチド
を使用して調査されうる。従って、オリゴヌクレオチドにより示される特異的な
ハイブリダイゼーションは、アッセイ、精製、細胞性生成物の調製物のため、お
よび一般的な当業者により評価されうる他の方法論によって使用されうる。
ナル伝達経路において特定の遺伝子産物の機能は、特異的なオリゴヌクレオチド
を使用して調査されうる。従って、オリゴヌクレオチドにより示される特異的な
ハイブリダイゼーションは、アッセイ、精製、細胞性生成物の調製物のため、お
よび一般的な当業者により評価されうる他の方法論によって使用されうる。
【００２４】 本発明の文脈において、“オリゴヌクレオチド”という用語は、リボ核酸ある
いはデオキシリボ核酸のオリゴマーあるいはポリマーについて言及する。この用
語は、天然に存在する（naturally-occurring）のヌクレオ塩基、糖および共有
糖間（covalent intersugar）（バックボーン）結合、ならびに同様に機能する
天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾され
たあるいは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞性取り込みの亢進、
標的との結合の亢進、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の向上などの所望さ
れる特徴のため、しばしば本来の形態以上に好ましい。
いはデオキシリボ核酸のオリゴマーあるいはポリマーについて言及する。この用
語は、天然に存在する（naturally-occurring）のヌクレオ塩基、糖および共有
糖間（covalent intersugar）（バックボーン）結合、ならびに同様に機能する
天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾され
たあるいは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞性取り込みの亢進、
標的との結合の亢進、およびヌクレアーゼ存在下での安定性の向上などの所望さ
れる特徴のため、しばしば本来の形態以上に好ましい。
【００２５】 本発明に従ったアンチセンス化合物は、好ましくは約5から約50のヌクレオ塩
基を含む。約8から約30のヌクレオ塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
が特に好ましい（すなわち、約8から約30結合したヌクレオシド）。当該技術分
野で知られるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組合せである。ヌクレオシドの
塩基部分は通常は複素環式の塩基である。そのような複素環式の塩基の二つの最
も一般的な分類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド
の糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラ
ノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基は糖の2'、3'あるいは
5'の水酸基部分のいずれかと結合しうる。オリゴヌクレオチドの形成において、
リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖のポリマー化合物を
形成する。この直鎖のポリマー構造の各々の末端は順次さらに結合して環状構造
を形成することができるが、開環直鎖構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレオ
チド構造内において、リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボ
ーンを形成するとして一般に言及される。RNAおよびDNAの通常の結合あるいはバ
ックボーンは、3'から5'のリン酸ジエステル結合である。
基を含む。約8から約30のヌクレオ塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
が特に好ましい（すなわち、約8から約30結合したヌクレオシド）。当該技術分
野で知られるように、ヌクレオシドは塩基-糖の組合せである。ヌクレオシドの
塩基部分は通常は複素環式の塩基である。そのような複素環式の塩基の二つの最
も一般的な分類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド
の糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラ
ノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、リン酸基は糖の2'、3'あるいは
5'の水酸基部分のいずれかと結合しうる。オリゴヌクレオチドの形成において、
リン酸基は隣接するヌクレオシドと互いに共有結合し、直鎖のポリマー化合物を
形成する。この直鎖のポリマー構造の各々の末端は順次さらに結合して環状構造
を形成することができるが、開環直鎖構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレオ
チド構造内において、リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボ
ーンを形成するとして一般に言及される。RNAおよびDNAの通常の結合あるいはバ
ックボーンは、3'から5'のリン酸ジエステル結合である。
【００２６】 本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の具体的な例は、修飾され
たバックボーンあるいは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチ
ドを含む。本明細書において定義されるように、修飾されたバックボーンを有す
るオリゴヌクレオチドは、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバ
ックボーン内にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のため、および
当該技術分野において時々言及されるように、ヌクレオシド間のバックボーンに
リン酸原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであ
ると考えられる。
たバックボーンあるいは非天然ヌクレオシド間結合を含有するオリゴヌクレオチ
ドを含む。本明細書において定義されるように、修飾されたバックボーンを有す
るオリゴヌクレオチドは、バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバ
ックボーン内にリン原子を有さないものを含む。本明細書の目的のため、および
当該技術分野において時々言及されるように、ヌクレオシド間のバックボーンに
リン酸原子を持たない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであ
ると考えられる。
【００２７】 好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは、例えば、通常3'-5
'結合を有する、ホスホロチオエート（phosphorothioates）、キラルのホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioates）、リン酸三エステ
ル（phosphotriesters）、アミノアルキルリン酸トリエステル（aminoalkylphos
photriesters）、3'-アルキレンホスホネート（alkylene phosphonates）および
キラルのホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィ
ネート（phosphinates）、3'-アミノホスホールアミデート（phosphoramidates
）およびアミノアルキルホスホールアミデート（aminoalkylphosphoramidates）
を含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート（thionophosphoram
idates）、チオノアルキルホスホネート（thionophosphonates）、チオノアルキ
ルリン酸トリエステル（thionoalkylphosphotriesters）およびボラノホスフェ
ート（boranophosphates）、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単
位の隣接する対合が5'-3'に対して3'-5'に結合するか、またはからあるいは5'-2
'に対して2'-5'を結合する反転した極性を持つもの、を含む。様々な塩、混合塩
のおよび遊離酸の形態も含まれる。
'結合を有する、ホスホロチオエート（phosphorothioates）、キラルのホスホロ
チオエート、ホスホロジチオエート（phosphorodithioates）、リン酸三エステ
ル（phosphotriesters）、アミノアルキルリン酸トリエステル（aminoalkylphos
photriesters）、3'-アルキレンホスホネート（alkylene phosphonates）および
キラルのホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィ
ネート（phosphinates）、3'-アミノホスホールアミデート（phosphoramidates
）およびアミノアルキルホスホールアミデート（aminoalkylphosphoramidates）
を含むホスホールアミデート、チオノホスホールアミデート（thionophosphoram
idates）、チオノアルキルホスホネート（thionophosphonates）、チオノアルキ
ルリン酸トリエステル（thionoalkylphosphotriesters）およびボラノホスフェ
ート（boranophosphates）、これらの2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単
位の隣接する対合が5'-3'に対して3'-5'に結合するか、またはからあるいは5'-2
'に対して2'-5'を結合する反転した極性を持つもの、を含む。様々な塩、混合塩
のおよび遊離酸の形態も含まれる。
【００２８】 上記リン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.：3,687,808；4
,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,0
19；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,
455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,11
1；5,563,253；5,571,799；5,587,361;および5,625,050を含むが、これらには限
定されない。
,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,0
19；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,
455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,11
1；5,563,253；5,571,799；5,587,361;および5,625,050を含むが、これらには限
定されない。
【００２９】 リン原子を含まない好ましい修飾されたオリゴヌクレオチドのバックボーンは
、その中に短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテ
ロ原子およびアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは一
つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環状ヌクレオシド間結合によ
り形成されるバックボーンを持つ。これらは、（一部はヌクレオシドの糖部分か
ら形成される）モルホリノ結合；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホ
キシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル
バックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン
；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノお
よびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバッ
クボーン；アミドバックボーン；および混合したN、O、SおよびCH2構成部分を有
する他のもの、を持つものを含む。
、その中に短鎖アルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合へテ
ロ原子およびアルキルあるいはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは一
つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子あるいはヘテロ環状ヌクレオシド間結合によ
り形成されるバックボーンを持つ。これらは、（一部はヌクレオシドの糖部分か
ら形成される）モルホリノ結合；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホ
キシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル
バックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン
；アルケン含有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノお
よびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバッ
クボーン；アミドバックボーン；および混合したN、O、SおよびCH2構成部分を有
する他のもの、を持つものを含む。
【００３０】 上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、U.S.：5,034,
506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5
,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,3
07；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,
610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437;および5,6
77,439を含むが、これらには限定されない。
506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5
,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,3
07；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,
610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437;および5,6
77,439を含むが、これらには限定されない。
【００３１】 他の好ましいヌクレオチド模倣物（mimetics）において、ヌクレオチド単位の
糖とヌクレシチド間結合の両方、すなわちバックボーンは、新規基に置き換えら
れる。塩基単位は、適した核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために
維持される。このような一つのオリゴマー化合物、優れた素晴らしいハイブリダ
イゼーション特性を持つことを示しているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチ
ド核酸（PNA）として言及される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖
バックボーンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボー
ンに置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のア
ザ窒素原子に直接あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表
的な米国特許は、U.S.：5,539,082；5,714,331;および5,719,262を含むが、これ
らには限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen ら.（Science, 199
1, 254, 1497-1500）に見つけられる。
糖とヌクレシチド間結合の両方、すなわちバックボーンは、新規基に置き換えら
れる。塩基単位は、適した核酸標的化合物とハイブリダイゼーションするために
維持される。このような一つのオリゴマー化合物、優れた素晴らしいハイブリダ
イゼーション特性を持つことを示しているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチ
ド核酸（PNA）として言及される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖
バックボーンはアミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボー
ンに置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のア
ザ窒素原子に直接あるいは間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表
的な米国特許は、U.S.：5,539,082；5,714,331;および5,719,262を含むが、これ
らには限定されない。PNA化合物のさらなる教示は、Nielsen ら.（Science, 199
1, 254, 1497-1500）に見つけられる。
【００３２】 本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴ
ヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオシドであり
、そして特に、上記で参照される米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N
（CH3)-O-CH2-［メチレン（メチルイミノ）あるいはMMIバックボーンとして知ら
れている]、-CH2-O-N（CH3）-CH2-、-CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2-および-O-N（
CH3）-CH2-CH2-［ここで、本来のホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-
として示される］、および上記で参照される米国特許5,602,240のアミドバック
ボーンである。また、上記で参照される米国特許5,034,506のモルホリノバック
ボーン構造を持つオリゴヌクレオチドも好ましい。
ヌクレオチド、およびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオシドであり
、そして特に、上記で参照される米国特許5,489,677の-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N
（CH3)-O-CH2-［メチレン（メチルイミノ）あるいはMMIバックボーンとして知ら
れている]、-CH2-O-N（CH3）-CH2-、-CH2-N（CH3）-N（CH3）-CH2-および-O-N（
CH3）-CH2-CH2-［ここで、本来のホスホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH2-
として示される］、および上記で参照される米国特許5,602,240のアミドバック
ボーンである。また、上記で参照される米国特許5,034,506のモルホリノバック
ボーン構造を持つオリゴヌクレオチドも好ましい。
【００３３】 修飾オリゴヌクレオチドは一つあるいはそれ以上の置換糖部分も含有しうる。
好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位の以下の一つを含む：OH；F；O-、S-、あ
るいはN-アルキル、O-アルキル-O-アルキル、O-、S-、あるいはN-アルケニル、
あるいはO-、S-あるいはN-アルキニル、ここでアルキル、アルケニルおよびアル
キニルは、置換あるいは非置換のC1からC10アルキル、あるいはC2からC10アルケ
ニルおよびアルキニルでありうる。O［（CH2）nO］mCH3、O（CH2）nOCH3、O（CH 2 ）2ON（CH3）2、O（CH2）nNH2、O（CH2）nCH3、O（CH2）nONH2、およびO（CH2
）nON［（CH2）nCH3）］2は特に好ましく、ここでのnおよびmは1から10までであ
る。他の好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位の以下の一つを含む：C1からC10
の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルあ
るいはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3
、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミ
ノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター
基、インターカレーター（intercalator）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性
を改善する基、あるいはオリゴヌクレオチド、薬力学特性を改善する基および同
様な特性を持つ置換基。好ましい修飾は、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OC
H3、2'-O-（2-メトキシエチル）あるいは2'-MOEとしても知られる）（Martin ら
., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ
基を含む。さらなる好ましい修飾は、以下の実施例に記載されるように、2'-ジ
メチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO（CH2）2O
N（CH3）2基を含む。
好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位の以下の一つを含む：OH；F；O-、S-、あ
るいはN-アルキル、O-アルキル-O-アルキル、O-、S-、あるいはN-アルケニル、
あるいはO-、S-あるいはN-アルキニル、ここでアルキル、アルケニルおよびアル
キニルは、置換あるいは非置換のC1からC10アルキル、あるいはC2からC10アルケ
ニルおよびアルキニルでありうる。O［（CH2）nO］mCH3、O（CH2）nOCH3、O（CH 2 ）2ON（CH3）2、O（CH2）nNH2、O（CH2）nCH3、O（CH2）nONH2、およびO（CH2
）nON［（CH2）nCH3）］2は特に好ましく、ここでのnおよびmは1から10までであ
る。他の好ましいオリゴヌクレオチドは2'部位の以下の一つを含む：C1からC10
の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルあ
るいはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3
、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミ
ノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター
基、インターカレーター（intercalator）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性
を改善する基、あるいはオリゴヌクレオチド、薬力学特性を改善する基および同
様な特性を持つ置換基。好ましい修飾は、2'-メトキシエトキシ（2'-O-CH2CH2OC
H3、2'-O-（2-メトキシエチル）あるいは2'-MOEとしても知られる）（Martin ら
., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）、すなわち、アルコキシアルコキシ
基を含む。さらなる好ましい修飾は、以下の実施例に記載されるように、2'-ジ
メチルアミノオキシエトキシ、すなわち、2'-DMAOEとしても知られるO（CH2）2O
N（CH3）2基を含む。
【００３４】 他の好ましい修飾は、2'-メトキシ（2'-O-CH3）、2'-アミノプロポキシ（2'-O
CH2CH2CH2NH2）、および2'-フルオロ（2'-F）を含む。同様な修飾はオリゴヌク
レオチドの他の部位、特に3'末端ヌクレオチド、あるいは2'-5'結合オリゴヌク
レオチドにおける糖の3'部位および5'末端ヌクレオチドの5'部位でもおこなわれ
うる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分
などの糖模倣物も持ちうる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米
国特許は、U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5
,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,7
22；5,597,909；5,610,300；5,627,0531；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5
,670,633;および5,700,920を含むが、これらには限定されない。
CH2CH2CH2NH2）、および2'-フルオロ（2'-F）を含む。同様な修飾はオリゴヌク
レオチドの他の部位、特に3'末端ヌクレオチド、あるいは2'-5'結合オリゴヌク
レオチドにおける糖の3'部位および5'末端ヌクレオチドの5'部位でもおこなわれ
うる。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分
などの糖模倣物も持ちうる。そのような修飾糖構造の調製を教示する代表的な米
国特許は、U.S.：4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5
,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,7
22；5,597,909；5,610,300；5,627,0531；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5
,670,633;および5,700,920を含むが、これらには限定されない。
【００３５】 オリゴヌクレオチドはヌクレオ塩基（しばしば当該技術分野において簡単に“
塩基”として言及される）修飾あるいは置換も含みうる。ここで使用されるよう
に、“非修飾の”あるいは“天然の”ヌクレオ塩基は、プリン塩基のアデニン（
A）およびグアニン（G）、およびピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）
およびウラシル（U）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C
あるいはm5c）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2
-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導
体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウ
ラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、
5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン
、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チ
オール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシおよび他の8-置換アデニンおよびグアニ
ン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルお
よびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよ
び8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグ
アニンおよび3-デアザアデニン、などの他の合成および天然のヌクレオ塩基を含
む。さらなるヌクレオ塩基は、米国特許No. 3,687,808にて開示されるもの、The
Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 1990, Pages 85
8-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sonsにて開示されるもの、Englis
chら（Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613-722）によ
り開示されるもの、およびSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research an
d Applications, 1993, Pages 289-302, Crooke, S.T.およびLebleu, B., ed.,
CRC Pressにて開示されるものを含む。これらのヌクレオ塩基のいくつかは、本
発明のオリゴマー化合物の結合親和力を高めるのに特に有用である。これらには
、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを
含み、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシ
トシンを含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6-1.2℃増加
することを示し（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B., eds., Antis
ense Research and Applications, 1993, CRC Press, Boca Raton, pages 276-2
78）、現在では好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾との結合
時はより一層特別に好ましい。
塩基”として言及される）修飾あるいは置換も含みうる。ここで使用されるよう
に、“非修飾の”あるいは“天然の”ヌクレオ塩基は、プリン塩基のアデニン（
A）およびグアニン（G）、およびピリミジン塩基のチミン（T）、シトシン（C）
およびウラシル（U）を含む。修飾ヌクレオ塩基は、5-メチルシトシン（5-me-C
あるいはm5c）、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2
-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよび他のアルキル誘導
体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよび他のアルキル誘導体、2-チオウ
ラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、
5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン
、5-ウラシル（シュードウラシル）、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チ
オール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシおよび他の8-置換アデニンおよびグアニ
ン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよび他の5-置換ウラシルお
よびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよ
び8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンおよび3-デアザグ
アニンおよび3-デアザアデニン、などの他の合成および天然のヌクレオ塩基を含
む。さらなるヌクレオ塩基は、米国特許No. 3,687,808にて開示されるもの、The
Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 1990, Pages 85
8-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sonsにて開示されるもの、Englis
chら（Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613-722）によ
り開示されるもの、およびSanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research an
d Applications, 1993, Pages 289-302, Crooke, S.T.およびLebleu, B., ed.,
CRC Pressにて開示されるものを含む。これらのヌクレオ塩基のいくつかは、本
発明のオリゴマー化合物の結合親和力を高めるのに特に有用である。これらには
、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンおよびN-2、N-6およびO-6置換プリンを
含み、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシ
トシンを含む。5-メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を0.6-1.2℃増加
することを示し（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B., eds., Antis
ense Research and Applications, 1993, CRC Press, Boca Raton, pages 276-2
78）、現在では好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチル糖修飾との結合
時はより一層特別に好ましい。
【００３６】 上記記載の修飾ヌクレオ塩基の特定のものならびに他の修飾ヌクレオ塩基の調
製を教示する代表的な米国特許は、上記記載のU.S. 3,687,808、ならびにU.S.：
4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,
187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5
,594,121；5,596,091；5,614,617;および5,681,941を含むが、これらには限定さ
れない。
製を教示する代表的な米国特許は、上記記載のU.S. 3,687,808、ならびにU.S.：
4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,
187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5
,594,121；5,596,091；5,614,617;および5,681,941を含むが、これらには限定さ
れない。
【００３７】 本発明のオリゴヌクレオチドのもう一つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性
、細胞分布あるいは細胞性取り込みを亢進する一つあるいはそれ以上の部分ある
いは結合部をオリゴヌクレオチドに対して化学的に結合することを含む。そのよ
うな部分は、コレステロール部分（Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Lett.,
1994, 4, 1053-1059）、チオエステル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（
Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan ら., Bi
oorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhau
serら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジ
オールあるいはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら., EMBO J., 1991, 10, 11
11-1118；Kabanovら., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchukら., Bioc
himie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジヘキサデシル-rac-グリセロー
ルあるいはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-
ホスホネート（Manoharanら., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea
ら., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンあるいはポリエチ
レングリコール鎖（Manoharanら., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969
-973）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharanら., Tetrahedron Lett., 1995,
36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishraら., Biochim. Biophys. Acta., 19
95, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ-カ
ルボニル-オキシコレステロール部分（Crookeら., J. Pharmacol. Exp. Ther.,
1996, 277, 923-937）などの脂質部分を含むが、それらには限定されない。
、細胞分布あるいは細胞性取り込みを亢進する一つあるいはそれ以上の部分ある
いは結合部をオリゴヌクレオチドに対して化学的に結合することを含む。そのよ
うな部分は、コレステロール部分（Letsingerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Lett.,
1994, 4, 1053-1059）、チオエステル、例えばヘキシル-S-トリチルチオール（
Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309；Manoharan ら., Bi
oorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhau
serら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジ
オールあるいはウンデシル残基（Saison-Behmoarasら., EMBO J., 1991, 10, 11
11-1118；Kabanovら., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330；Svinarchukら., Bioc
himie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジヘキサデシル-rac-グリセロー
ルあるいはトリエチルアンモニウム1,2-ジ-O-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-
ホスホネート（Manoharanら., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654；Shea
ら., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンあるいはポリエチ
レングリコール鎖（Manoharanら., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969
-973）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharanら., Tetrahedron Lett., 1995,
36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishraら., Biochim. Biophys. Acta., 19
95, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ-カ
ルボニル-オキシコレステロール部分（Crookeら., J. Pharmacol. Exp. Ther.,
1996, 277, 923-937）などの脂質部分を含むが、それらには限定されない。
【００３８】 そのようなオリゴヌクレオチド結合物（conjugates）の調製を教示する代表的
な米国特許は、U.S.：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,31
3；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,1
09,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718
；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,82
4,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963
；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,25
8,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723
；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,56
7,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923
；5,599,928および5,688,941、を含むが、それらには限定されない。
な米国特許は、U.S.：4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,31
3；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,1
09,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718
；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,82
4,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963
；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,25
8,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723
；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,56
7,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923
；5,599,928および5,688,941、を含むが、それらには限定されない。
【００３９】 本発明はキメラオリゴヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドも含む。本発明
の文脈において、“キメラの”オリゴヌクレオチドあるいは“キメラ”は、二つ
あるいはそれ以上の化学的に別個な領域を含有するオリゴヌクレオチドであり、
それらは各々少なくとも一つのヌクレオチドで構成されている。これらのオリゴ
ヌクレオチドは典型的に一つの領域を含み、そこではヌクレアーゼ分解に対する
増加した抵抗性、標的核酸に対する増加した細胞性取り込み、および／あるいは
増加した結合親和力をオリゴヌクレオチドに与えるためにオリゴヌクレオチドが
修飾される。オリゴヌクレオチドの追加的な領域は、RNA:DNAあるいはRNA:RNAハ
イブリッドを開裂させうる酵素のための基質として機能しうる。例として、RNas
e HはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を開裂させる細胞性エンドヌクレアーゼである。従
って、RNase Hの活性化によりRNA標的が開裂し、それにより遺伝子発現のアンチ
センス阻害の効率がより大きく亢進する。RNA標的の開裂は日常的にゲル電気泳
動により、もし必要ならば、当該技術分野で知られる関連する核酸ハイブリダイ
ゼーション技術により検出できる。RNA標的のこのRNase H媒介開裂は、核酸を開
裂するリボザイムの使用とは異なる。リボザイムは本発明には含まれない。
の文脈において、“キメラの”オリゴヌクレオチドあるいは“キメラ”は、二つ
あるいはそれ以上の化学的に別個な領域を含有するオリゴヌクレオチドであり、
それらは各々少なくとも一つのヌクレオチドで構成されている。これらのオリゴ
ヌクレオチドは典型的に一つの領域を含み、そこではヌクレアーゼ分解に対する
増加した抵抗性、標的核酸に対する増加した細胞性取り込み、および／あるいは
増加した結合親和力をオリゴヌクレオチドに与えるためにオリゴヌクレオチドが
修飾される。オリゴヌクレオチドの追加的な領域は、RNA:DNAあるいはRNA:RNAハ
イブリッドを開裂させうる酵素のための基質として機能しうる。例として、RNas
e HはRNA:DNA二本鎖のRNA鎖を開裂させる細胞性エンドヌクレアーゼである。従
って、RNase Hの活性化によりRNA標的が開裂し、それにより遺伝子発現のアンチ
センス阻害の効率がより大きく亢進する。RNA標的の開裂は日常的にゲル電気泳
動により、もし必要ならば、当該技術分野で知られる関連する核酸ハイブリダイ
ゼーション技術により検出できる。RNA標的のこのRNase H媒介開裂は、核酸を開
裂するリボザイムの使用とは異なる。リボザイムは本発明には含まれない。
【００４０】 キメラオリゴヌクレオチドの例は、“ギャップマー”を含むが、これには限定
されない。ギャップマーには３つの独特な領域が存在し通常は中央領域と、その
側面に接せられるお互い化学的に等価であるがギャップとは異なる二つの領域を
有する。ギャップマーの好ましい例は、オリゴヌクレオチドの中央部分（“ギャ
ップ”）がRNase Hの基質として機能するオリゴヌクレオチドであり、好ましく
は2'-デオキシヌクレオチドで構成され、一方、隣接する（flanking）部分（5'
および3'“ウイング”）は修飾されて標的RNA分子への親和力が向上するが、ヌ
クレアーゼ活性を支持することはできない（例えば、フルオロ-あるいは2'-O-メ
トキシエチル-置換）。キメラオリゴヌクレオチドは、糖における修飾を持つも
のに限定されないだけでなく、修飾されたバックボーン、例えばホスホロチオエ
ート（P=S）およびホスホジエステル（P=O）バックボーン結合の領域、あるいは
MMIおよびP=Sバックボーン結合の領域をもつオリゴヌクレオシドあるいはオリゴ
ヌクレオチドも含む。他のキメラは、当該技術分野で“ヘミマー”としても知ら
れる“ウイングマー”、すなわち二つの独特な領域を持つオリゴヌクレオチドを
含む。ウイングマーの好ましい例において、オリゴヌクレオチドの5'部分はRNas
e Hの基質として機能し、好ましくは2'-デオキシヌクレオチドで構成される一方
で、3'部分は標的RNA分子に対してより大きな親和性を持つ様に修飾されるが、
ヌクレアーゼ活性を支持することはできないか（例えば、2'-フルオロ-あるいは
2'-O-メトキシエチル-置換）、あるいはその逆である。一つの態様において、本
発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのヌクレオチドの糖部分における
2'-O-メトキシエチル（2'-O-CH2CH2OCH3）修飾を含む。この修飾は、標的に対す
るオリゴヌクレオチドの親和性、およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性
の両方を増加させることが示されている。本発明に従うと、本発明のオリゴヌク
レオチドのヌクレオチドサブユニットの一つ、複数、あるいは全てが、2'-O-メ
トキシエチル（-O-CH2CH2OCH3）修飾を有してもよい。2'-O-メトキシエチル修飾
を持つ複数のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌ
クレオチド内のいずれかのヌクレオチドサブユニットにそのような修飾を持つこ
とができ、キメラオリゴヌクレオチドであってもよい。2'-O-メトキシエチル修
飾の他に、あるいは加えて、アンチセンス効率、有効性あるいは標的親和性を亢
進する他の修飾を含有するオリゴヌクレオチドも好ましい。一つあるいはそれ以
上のそのような修飾を含むキメラオリゴヌクレオチドは、現在好ましい。
されない。ギャップマーには３つの独特な領域が存在し通常は中央領域と、その
側面に接せられるお互い化学的に等価であるがギャップとは異なる二つの領域を
有する。ギャップマーの好ましい例は、オリゴヌクレオチドの中央部分（“ギャ
ップ”）がRNase Hの基質として機能するオリゴヌクレオチドであり、好ましく
は2'-デオキシヌクレオチドで構成され、一方、隣接する（flanking）部分（5'
および3'“ウイング”）は修飾されて標的RNA分子への親和力が向上するが、ヌ
クレアーゼ活性を支持することはできない（例えば、フルオロ-あるいは2'-O-メ
トキシエチル-置換）。キメラオリゴヌクレオチドは、糖における修飾を持つも
のに限定されないだけでなく、修飾されたバックボーン、例えばホスホロチオエ
ート（P=S）およびホスホジエステル（P=O）バックボーン結合の領域、あるいは
MMIおよびP=Sバックボーン結合の領域をもつオリゴヌクレオシドあるいはオリゴ
ヌクレオチドも含む。他のキメラは、当該技術分野で“ヘミマー”としても知ら
れる“ウイングマー”、すなわち二つの独特な領域を持つオリゴヌクレオチドを
含む。ウイングマーの好ましい例において、オリゴヌクレオチドの5'部分はRNas
e Hの基質として機能し、好ましくは2'-デオキシヌクレオチドで構成される一方
で、3'部分は標的RNA分子に対してより大きな親和性を持つ様に修飾されるが、
ヌクレアーゼ活性を支持することはできないか（例えば、2'-フルオロ-あるいは
2'-O-メトキシエチル-置換）、あるいはその逆である。一つの態様において、本
発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのヌクレオチドの糖部分における
2'-O-メトキシエチル（2'-O-CH2CH2OCH3）修飾を含む。この修飾は、標的に対す
るオリゴヌクレオチドの親和性、およびオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性
の両方を増加させることが示されている。本発明に従うと、本発明のオリゴヌク
レオチドのヌクレオチドサブユニットの一つ、複数、あるいは全てが、2'-O-メ
トキシエチル（-O-CH2CH2OCH3）修飾を有してもよい。2'-O-メトキシエチル修飾
を持つ複数のヌクレオチドサブユニットを含むオリゴヌクレオチドは、オリゴヌ
クレオチド内のいずれかのヌクレオチドサブユニットにそのような修飾を持つこ
とができ、キメラオリゴヌクレオチドであってもよい。2'-O-メトキシエチル修
飾の他に、あるいは加えて、アンチセンス効率、有効性あるいは標的親和性を亢
進する他の修飾を含有するオリゴヌクレオチドも好ましい。一つあるいはそれ以
上のそのような修飾を含むキメラオリゴヌクレオチドは、現在好ましい。
【００４１】 本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られる技
術を通して都合良く日常的に作製されうる。そのような合成の装置は、Applied
Biosystemsを含むいくつかの業者によって販売されている。そのような合成のい
くつかの他の手段も使用されうる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、型どお
りの仕事をする人の能力内で十分である。2'-O-メトキシエチルオリゴヌクレオ
チドを含む、ホスホロチオエートおよび2'-アルコキシあるいは2'-アルコキシア
ルコキシ誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために、同様な技術を使用
することがよく知られている（Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-
504）。蛍光性標識化、ビオチン化あるいは他の結合オリゴヌクレオチドを合成
するために、同様な技術および商業的に有用な、ビオチン、フルオレシン、アク
リジンあるいはソラレン-修飾アミダイトおよび／あるいはCPG（Glen Research,
Sterling, VAから入手可能）などの修飾アミダイト、および調節化孔ガラス（C
PG）産物（controlled-pore glass product）を使用することはよく知られてい
る。
術を通して都合良く日常的に作製されうる。そのような合成の装置は、Applied
Biosystemsを含むいくつかの業者によって販売されている。そのような合成のい
くつかの他の手段も使用されうる；オリゴヌクレオチドの実際の合成は、型どお
りの仕事をする人の能力内で十分である。2'-O-メトキシエチルオリゴヌクレオ
チドを含む、ホスホロチオエートおよび2'-アルコキシあるいは2'-アルコキシア
ルコキシ誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために、同様な技術を使用
することがよく知られている（Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-
504）。蛍光性標識化、ビオチン化あるいは他の結合オリゴヌクレオチドを合成
するために、同様な技術および商業的に有用な、ビオチン、フルオレシン、アク
リジンあるいはソラレン-修飾アミダイトおよび／あるいはCPG（Glen Research,
Sterling, VAから入手可能）などの修飾アミダイト、および調節化孔ガラス（C
PG）産物（controlled-pore glass product）を使用することはよく知られてい
る。
【００４２】 本発明のアンチセンス化合物は、医薬的に許容可能な塩類およびプロドラッグ
を含む生物学的等価な化合物を含む。これは、ある医薬的に許容可能な塩類、エ
ステル、あるいはそのエステルの塩類、あるいはヒトを含めた動物に投与する上
で、生物学的な活性代謝産物あるいはその残余を（直接的あるいは間接的に）提
供することができる他の化合物を含む意図を持つ。それゆえ、例えば、本開示は
本発明の核酸の医薬的に許容可能な塩類、およびそのような核酸のプロドラッグ
に対しても作成される。“医薬的に許容可能な塩類”は、本発明の核酸の生理学
的および医薬的に許容可能な塩類：すなわち、親化合物の所望する生物学的活性
を保持し、それに対する所望しない毒物学的な効果を与えない塩類である（例え
ば、Bergeら, “Pharmaceutical Salts” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19
を参照）。
を含む生物学的等価な化合物を含む。これは、ある医薬的に許容可能な塩類、エ
ステル、あるいはそのエステルの塩類、あるいはヒトを含めた動物に投与する上
で、生物学的な活性代謝産物あるいはその残余を（直接的あるいは間接的に）提
供することができる他の化合物を含む意図を持つ。それゆえ、例えば、本開示は
本発明の核酸の医薬的に許容可能な塩類、およびそのような核酸のプロドラッグ
に対しても作成される。“医薬的に許容可能な塩類”は、本発明の核酸の生理学
的および医薬的に許容可能な塩類：すなわち、親化合物の所望する生物学的活性
を保持し、それに対する所望しない毒物学的な効果を与えない塩類である（例え
ば、Bergeら, “Pharmaceutical Salts” J. of Pharma Sci., 1977, 66, 1-19
を参照）。
【００４３】 オリゴヌクレオチドについて、医薬的に許容可能な塩類は、（a）ナトリウム
、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペ
ルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩類；（b）例えば、塩
酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、その他の無機酸で形成される酸付加塩類
；（c）例えば、酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グル
コン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミ
チン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホ
ン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸な
どの有機酸で形成される塩類；（d）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素状態
での陰イオンで形成される塩類、を含むが、これらには限定されない。
、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペ
ルミジンなどのポリアミンなどの陽イオンで形成される塩類；（b）例えば、塩
酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、その他の無機酸で形成される酸付加塩類
；（c）例えば、酢酸、蓚酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グル
コン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミ
チン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホ
ン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸な
どの有機酸で形成される塩類；（d）塩素、臭素、およびヨウ素などの元素状態
での陰イオンで形成される塩類、を含むが、これらには限定されない。
【００４４】 本発明のオリゴヌクレオチドは追加的あるいは代替的に“プロドラッグ（prod
rug）”形態で輸送される様に調製することができる。“プロドラッグ”という
用語は、体内あるいは細胞内では、その細胞内で内在性酵素あるいは他の化学的
および／あるいは状況にによって活性形態（すなわち、薬剤）に変わる、不活性
形態で調製される治療的薬品を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロ
ドラッグ版（version）は、1993年12月9日発行のGosselinらに対するWO 93/2451
0において開示される方法に従って、SATE［（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸
］誘導体として調製される。
rug）”形態で輸送される様に調製することができる。“プロドラッグ”という
用語は、体内あるいは細胞内では、その細胞内で内在性酵素あるいは他の化学的
および／あるいは状況にによって活性形態（すなわち、薬剤）に変わる、不活性
形態で調製される治療的薬品を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロ
ドラッグ版（version）は、1993年12月9日発行のGosselinらに対するWO 93/2451
0において開示される方法に従って、SATE［（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸
］誘導体として調製される。
【００４５】 治療的あるいは予防的な処置のため、オリゴヌクレオチドは本発明に従って投
与される。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は医薬的組成物中に処方され、オ
リゴヌクレオチドに加えて、医薬的に許容可能なキャリア、濃縮剤、希釈剤、緩
衝剤、保存剤、界面活性剤、中性あるいは陽イオン脂質、脂質複合体、リポソー
ム、浸透亢進剤、キャリア化合物および他の医薬的に許容可能なキャリアあるい
は補形剤などを含んでいてもよい。そのような組成物および製剤は本発明により
含まれる。
与される。本発明のオリゴヌクレオチド化合物は医薬的組成物中に処方され、オ
リゴヌクレオチドに加えて、医薬的に許容可能なキャリア、濃縮剤、希釈剤、緩
衝剤、保存剤、界面活性剤、中性あるいは陽イオン脂質、脂質複合体、リポソー
ム、浸透亢進剤、キャリア化合物および他の医薬的に許容可能なキャリアあるい
は補形剤などを含んでいてもよい。そのような組成物および製剤は本発明により
含まれる。
【００４６】 本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬的組成物は、オリゴヌクレオチドの食
餌性運搬を亢進するための浸透亢進剤を含んでもよい。浸透亢進剤は五つの広範
なカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤および非
界面活性剤、の一つに属するように分類されうる（Leeら, Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192；Muranishi, Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33）。これらの広
範なカテゴリーの一つあるいはそれ以上から、一つあるいはそれ以上の浸透亢進
剤が含まれうる。
餌性運搬を亢進するための浸透亢進剤を含んでもよい。浸透亢進剤は五つの広範
なカテゴリー、すなわち、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、界面活性剤および非
界面活性剤、の一つに属するように分類されうる（Leeら, Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8, 91-192；Muranishi, Critical
Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33）。これらの広
範なカテゴリーの一つあるいはそれ以上から、一つあるいはそれ以上の浸透亢進
剤が含まれうる。
【００４７】 浸透亢進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体は、例えば、オ
レイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート（dicaprate）、トリカプレート（t
ricaprate）、リシンリエート（recinleate）、モノオレイン（別名、1-モノオ
レオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリ
セリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカル
ニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリド、およびそれらの生理学的に
許容可能な塩類（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステー
ト、パルミテート、ステアレート、リノレエート、など）を含む（Leeら, Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ92；Muranis
hi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1；El
-Haririら, J. Pharm. Pharmacol., 1992 44, 651-654）。
レイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート（dicaprate）、トリカプレート（t
ricaprate）、リシンリエート（recinleate）、モノオレイン（別名、1-モノオ
レオイル-rac-グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリ
セリル1-モノカプレート、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、アシルカル
ニチン、アシルコリン、モノ-およびジ-グリセリド、およびそれらの生理学的に
許容可能な塩類（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステー
ト、パルミテート、ステアレート、リノレエート、など）を含む（Leeら, Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ92；Muranis
hi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1；El
-Haririら, J. Pharm. Pharmacol., 1992 44, 651-654）。
【００４８】 胆汁の生理学的な役割は、脂質および脂溶性ビタミンの分散と吸収を容易にす
ることを含む（Brunton, Chapter 38 In：Goodman & Gilman's The Pharmacolog
ical Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardmanら, eds., McGraw-Hill, New Y
ork, NY, 1996,ページ934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成
誘導体は浸透亢進剤として作用する。従って、“胆汁酸塩”という用語は、天然
に起こる胆汁の要素のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む
。
ることを含む（Brunton, Chapter 38 In：Goodman & Gilman's The Pharmacolog
ical Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardmanら, eds., McGraw-Hill, New Y
ork, NY, 1996,ページ934-935）。様々な天然の胆汁酸塩、およびそれらの合成
誘導体は浸透亢進剤として作用する。従って、“胆汁酸塩”という用語は、天然
に起こる胆汁の要素のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを含む
。
【００４９】 一つあるいはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を使用することができる。
例えば、胆汁酸塩を脂肪酸と共に使用し、複合製剤を作りうる。 キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サ
リチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホ
モバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アセチル誘導体、ラウレス-9
（laureth-9）およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体（エナミン）を含
むが、これらには限定されない（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Dru
g Carrier Systems, 1991, ページ92；Muranishi, Critical Reviews in Therap
eutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Buurら, J. Control Rel., 1990
, 14, 43-51）。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能するというさらなる利
点を有する。
例えば、胆汁酸塩を脂肪酸と共に使用し、複合製剤を作りうる。 キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、クエン酸、サ
リチレート（例えば、サリチル酸ナトリウム、5-メトキシサリチレートおよびホ
モバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-アセチル誘導体、ラウレス-9
（laureth-9）およびベータ-ジケトンのN-アミノアシル誘導体（エナミン）を含
むが、これらには限定されない（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Dru
g Carrier Systems, 1991, ページ92；Muranishi, Critical Reviews in Therap
eutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33；Buurら, J. Control Rel., 1990
, 14, 43-51）。キレート剤は、DNase阻害剤としても機能するというさらなる利
点を有する。
【００５０】 界面活性剤は、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-ラ
ウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Leeら, Critica
l Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ92）；およびF
C-43などのパーフルオロケミカルエマルジョン（perfluorochemical emulsions
）（Takahashら, J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252-257）、を含む。
ウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Leeら, Critica
l Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, ページ92）；およびF
C-43などのパーフルオロケミカルエマルジョン（perfluorochemical emulsions
）（Takahashら, J. Pharm. Phamacol., 1988, 40, 252-257）、を含む。
【００５１】 非界面活性剤は、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニル
アザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems 1991,ページ92）；およびジクロフェナックナトリウム（dic
lofenac sodium）、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド
性抗炎症剤（Yamashitaら, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）、を含
む。
アザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug
Carrier Systems 1991,ページ92）；およびジクロフェナックナトリウム（dic
lofenac sodium）、インドメタシンおよびフェニルブタゾンなどの非ステロイド
性抗炎症剤（Yamashitaら, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626）、を含
む。
【００５２】 ここで使用されるように、“キャリア化合物”は核酸、あるいはその類似体に
言及し、それは不活性である（すなわち、それ自体が生物学的活性を持っていな
い）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、あるいは循環系からの
それを除去することを促進することによって、生物学的活性を持つ核酸の生物学
的利用能を減少させるin vivoでの過程により、核酸として認識される。核酸と
キャリア化合物を、典型的に過剰量の後者の物質とともに共投与（coadministra
tion）すると、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸の間で
の競合のため、肝臓、腎臓あるいは他の循環外貯蔵器において回収される核酸の
総量の実質的な減少を引き起こすことができる。キャリア化合物に対して、“医
薬的に許容可能なキャリア”（補形薬）は、医薬的に許容可能な溶剤、懸濁剤、
あるいは動物に一つあるいはそれ以上の核酸を運搬するための他の医薬的に不活
性なビヒクル、である。医薬的に許容可能なキャリアは液体あるいは固体であっ
てもよく、核酸と所定の医薬的な組成物の他の要素を組み合わせるとき、望まし
い量、濃度などを供給するために、考えた投与の計画された様式と共に選択され
る。典型的な医薬的に許容可能なキャリアは、結合剤（例えば、α化トウモロコ
シデンプン、ポリビニルピロリドンあるいはヒドロキシプロピルメチルセルロー
スなど）；増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペ
クチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リ
ン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、シリカ、コロイド状二酸化シリコン、ステアリン酸、金属ステアレート、硬
化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢
酸ナトリウムなど）；分解剤（例えば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリ
ウム（sodium starch glycolate）など）；あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル
硫酸ナトリウムなど）、を含むが、それらには限定されない。経口的に投与され
た用量剤形のための、持続的放出経口運搬システムおよび／あるいは腸コーティ
ングは、米国特許No. 4,704,295；4,556,552；4,309,406;および4,309,404に記
載される。
言及し、それは不活性である（すなわち、それ自体が生物学的活性を持っていな
い）が、例えば、生物学的に活性な核酸を分解すること、あるいは循環系からの
それを除去することを促進することによって、生物学的活性を持つ核酸の生物学
的利用能を減少させるin vivoでの過程により、核酸として認識される。核酸と
キャリア化合物を、典型的に過剰量の後者の物質とともに共投与（coadministra
tion）すると、おそらく共通のレセプターに対するキャリア化合物と核酸の間で
の競合のため、肝臓、腎臓あるいは他の循環外貯蔵器において回収される核酸の
総量の実質的な減少を引き起こすことができる。キャリア化合物に対して、“医
薬的に許容可能なキャリア”（補形薬）は、医薬的に許容可能な溶剤、懸濁剤、
あるいは動物に一つあるいはそれ以上の核酸を運搬するための他の医薬的に不活
性なビヒクル、である。医薬的に許容可能なキャリアは液体あるいは固体であっ
てもよく、核酸と所定の医薬的な組成物の他の要素を組み合わせるとき、望まし
い量、濃度などを供給するために、考えた投与の計画された様式と共に選択され
る。典型的な医薬的に許容可能なキャリアは、結合剤（例えば、α化トウモロコ
シデンプン、ポリビニルピロリドンあるいはヒドロキシプロピルメチルセルロー
スなど）；増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペ
クチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リ
ン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タル
ク、シリカ、コロイド状二酸化シリコン、ステアリン酸、金属ステアレート、硬
化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢
酸ナトリウムなど）；分解剤（例えば、デンプン、グリコール酸デンプンナトリ
ウム（sodium starch glycolate）など）；あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル
硫酸ナトリウムなど）、を含むが、それらには限定されない。経口的に投与され
た用量剤形のための、持続的放出経口運搬システムおよび／あるいは腸コーティ
ングは、米国特許No. 4,704,295；4,556,552；4,309,406;および4,309,404に記
載される。
【００５３】 本発明の組成物は、医薬組成物において、その技術的に確立した使用レベルで
従来から見出される他の補助的要素を追加的に含みうる。従って、例えば、組成
物は、例えば、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤あるいは抗炎症剤などの、追加的
な互換性のある医薬的に活性をもつ物質を含んでもよく、あるいは色素、着香料
、保存剤、抗酸化剤、乳白剤（opacifiers）、濃縮剤および安定剤などの、本発
明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加的な物質を含
有してもよい。しかし、そのような物質は、追加するとき、本発明の組成物の要
素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。
従来から見出される他の補助的要素を追加的に含みうる。従って、例えば、組成
物は、例えば、抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔剤あるいは抗炎症剤などの、追加的
な互換性のある医薬的に活性をもつ物質を含んでもよく、あるいは色素、着香料
、保存剤、抗酸化剤、乳白剤（opacifiers）、濃縮剤および安定剤などの、本発
明の組成物の様々な用量剤形を物理的に製剤化するのに有用な追加的な物質を含
有してもよい。しかし、そのような物質は、追加するとき、本発明の組成物の要
素の生物学的活性を過度に妨害すべきではない。
【００５４】 本発明のオリゴヌクレオチドが患者に導入される方法に関わらず、コロイド状
の分散システムは運搬ビヒクルとして使用され、in vivoでのオリゴヌクレオチ
ドの安定性を亢進し、および／あるいは特定の器官、組織あるいは細胞型をオリ
ゴヌクレオチドの標的としうる。コロイド状の分散システムは、高分子複合体、
ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン（oil-in
-water emulsions）、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび非特徴的な構造の
脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質基本システムを含むが、それらには
限定されない。好ましいコロイド状の分散システムは多数のリポソームである。
リポソームは、二重層構造（configuration）において配置される脂質で構成さ
れる、一つあるいはそれ以上の外層によって囲まれる水性コアをもつ顕微鏡的球
体である（一般的に、Chonnら, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708参照
）。
の分散システムは運搬ビヒクルとして使用され、in vivoでのオリゴヌクレオチ
ドの安定性を亢進し、および／あるいは特定の器官、組織あるいは細胞型をオリ
ゴヌクレオチドの標的としうる。コロイド状の分散システムは、高分子複合体、
ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン（oil-in
-water emulsions）、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび非特徴的な構造の
脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質基本システムを含むが、それらには
限定されない。好ましいコロイド状の分散システムは多数のリポソームである。
リポソームは、二重層構造（configuration）において配置される脂質で構成さ
れる、一つあるいはそれ以上の外層によって囲まれる水性コアをもつ顕微鏡的球
体である（一般的に、Chonnら, Current Op. Biotech., 1995, 6, 698-708参照
）。
【００５５】 本発明の医薬的な組成物は、局所性あるいは全身性の処置のどちらが望ましい
かに依存し、および処置すべき部位に依存する多くの方法において投与されうる
。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内、表皮および経皮）、経口的あるいは
非経口的でありうる。非経口的投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内あるいは筋肉
内注射、例えば吸入あるいは吹き付けによる肺投与、あるいは例えば包膜内ある
は脳室内の投与による頭蓋内、を含む。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル
修飾をもつオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると信じられている
。
かに依存し、および処置すべき部位に依存する多くの方法において投与されうる
。投与は、局所的（眼、膣、直腸、鼻腔内、表皮および経皮）、経口的あるいは
非経口的でありうる。非経口的投与は、静脈内点滴、皮下、腹腔内あるいは筋肉
内注射、例えば吸入あるいは吹き付けによる肺投与、あるいは例えば包膜内ある
は脳室内の投与による頭蓋内、を含む。少なくとも一つの2'-O-メトキシエチル
修飾をもつオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると信じられている
。
【００５６】 局所的な投与のための処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、
ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末を含みうる。従来からの医薬的キ
ャリア、水性、粉末あるいは油性基剤、濃縮剤などは必要であり、あるいは望ま
しい場合がある。コートされたコンドーム、グローブおよびその他も有用であり
うる。
ゲル、点滴、坐剤、スプレー、液体および粉末を含みうる。従来からの医薬的キ
ャリア、水性、粉末あるいは油性基剤、濃縮剤などは必要であり、あるいは望ま
しい場合がある。コートされたコンドーム、グローブおよびその他も有用であり
うる。
【００５７】 経口投与のための組成物は、粉末あるいは顆粒、水あるいは非水性の媒質にお
ける懸濁液あるいは溶液、カプセル、サシェあるいは錠剤、を含む。濃縮剤、着
香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤（dispersing aids）あるいは結合剤は所望
されうる。
ける懸濁液あるいは溶液、カプセル、サシェあるいは錠剤、を含む。濃縮剤、着
香料、希釈剤、乳化剤、分散補助剤（dispersing aids）あるいは結合剤は所望
されうる。
【００５８】 非経口投与のための組成物は、緩衝液、希釈剤および他の適した添加物も含む
滅菌した水性溶液を含んでもよい。ある場合において、処置管理（regimen）の
効力を増加させるために、本発明のオリゴヌクレオチドを、他の伝統的な治療的
様式と組み合わせて用いて患者を処置することは、より効果的である。本発明の
文脈において、“処置管理”という用語は、治療的、緩和的および予防的な様式
を含むことを意味する。例えば、患者は、従来からの化学療法剤、特に腫瘍およ
び癌の処置のために使用されるもの、を用いて処置されうる。そのような化学療
法剤の例は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビ
シン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォス
ファミド、イフォスファミド、シトシン、アラビノシド、ビス-クロロエチルニ
トロスウレア（bis-chloroethylnitrosurea）、ブスルファン、マイトマイシンC
、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステ
ロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキ
サメチルメラミン、ペンタメチルメラミン（pentamethylmelamine）、ミトキサ
ントロン、アムサクリン（amsacrine）、クロラムブシル、メチルシクロヘキシ
ルニトロスウレア（methylcyclohexylnitrosurea）、ナイトロジェンマスタード
、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、
シタラビン（CA）、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン
、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホールアミド（4-hydroxyperoxycyclophos
phoramide）、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-F
UdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、
ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド（teniposide）
、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）、を含むが、これら
には限定されない。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1
5th Ed., 1987, pp. 1206-1228, Berkowら, eds., Rahway, N.J を参照せよ。そ
のような化学療法剤は、本発明の化合物と共に使用するとき、個々に（例えば、
5-FUおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレ
オチドをある一定期間投与した後、MTXおよびオリゴヌクレオチド）、あるいは
一つあるいはそれ以上の他のそのような化学療法剤との組み合わせにて（例えば
、5-FU、MTXとオリゴヌクレオチド、あるいは5-FU、放射線療法とオリゴヌクレ
オチド）、使用されうる。
滅菌した水性溶液を含んでもよい。ある場合において、処置管理（regimen）の
効力を増加させるために、本発明のオリゴヌクレオチドを、他の伝統的な治療的
様式と組み合わせて用いて患者を処置することは、より効果的である。本発明の
文脈において、“処置管理”という用語は、治療的、緩和的および予防的な様式
を含むことを意味する。例えば、患者は、従来からの化学療法剤、特に腫瘍およ
び癌の処置のために使用されるもの、を用いて処置されうる。そのような化学療
法剤の例は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビ
シン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マフォス
ファミド、イフォスファミド、シトシン、アラビノシド、ビス-クロロエチルニ
トロスウレア（bis-chloroethylnitrosurea）、ブスルファン、マイトマイシンC
、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステ
ロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキ
サメチルメラミン、ペンタメチルメラミン（pentamethylmelamine）、ミトキサ
ントロン、アムサクリン（amsacrine）、クロラムブシル、メチルシクロヘキシ
ルニトロスウレア（methylcyclohexylnitrosurea）、ナイトロジェンマスタード
、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、
シタラビン（CA）、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン
、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホールアミド（4-hydroxyperoxycyclophos
phoramide）、5-フルオロウラシル（5-FU）、5-フルオロデオキシウリジン（5-F
UdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、
ビンブラスチン、エトポシド、トリメトレキサート、テニポシド（teniposide）
、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（DES）、を含むが、これら
には限定されない。一般的に、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1
5th Ed., 1987, pp. 1206-1228, Berkowら, eds., Rahway, N.J を参照せよ。そ
のような化学療法剤は、本発明の化合物と共に使用するとき、個々に（例えば、
5-FUおよびオリゴヌクレオチド）、連続的に（例えば、5-FUおよびオリゴヌクレ
オチドをある一定期間投与した後、MTXおよびオリゴヌクレオチド）、あるいは
一つあるいはそれ以上の他のそのような化学療法剤との組み合わせにて（例えば
、5-FU、MTXとオリゴヌクレオチド、あるいは5-FU、放射線療法とオリゴヌクレ
オチド）、使用されうる。
【００５９】 治療的組成物の製剤化およびそれらに続く投与は、当業者の技術内にあると信
じられている。投薬は、処置される疾患の状態の深刻さおよび反応性に依存して
おり、数日間から数ヶ月、あるいは治療が効果を示すか、あるいは疾患状態の減
少が達せられるまで続く一連の治療をともなう。最適な投薬スケジュールは、患
者の体内の薬剤の蓄積を測定することから算出できる。当業者は、最適な投与量
、投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴ
ヌクレオチドの比効力に依存して変化してもよく、in vitroおよびin vivo動物
モデルにおいて効果的であると判断された EC50sを基準にして一般的に評価でき
る。一般的に、投与量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、毎日、一週間
、一ヶ月間あるいは一年間に一回あるいはそれ以上、あるいは2年から20年ごと
に一回、で与えうる。当業者は、体液あるいは組織内の薬剤の残留時間、および
濃度の測定に基づき、投薬のための反復頻度を容易に見積もることができる。成
功した処置に続いて、患者は維持治療を受けて疾患状態の再発を防ぐことが望ま
しく、そこではオリゴヌクレオチドは体重1 kgあたり0.01μgから100 gの範囲で
、毎日一回かあるいはそれ以上から20年ごとに一回の範囲で、維持用量を投与さ
れる。
じられている。投薬は、処置される疾患の状態の深刻さおよび反応性に依存して
おり、数日間から数ヶ月、あるいは治療が効果を示すか、あるいは疾患状態の減
少が達せられるまで続く一連の治療をともなう。最適な投薬スケジュールは、患
者の体内の薬剤の蓄積を測定することから算出できる。当業者は、最適な投与量
、投薬方法および反復頻度を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴ
ヌクレオチドの比効力に依存して変化してもよく、in vitroおよびin vivo動物
モデルにおいて効果的であると判断された EC50sを基準にして一般的に評価でき
る。一般的に、投与量は体重1 kgあたり0.01μgから100 gであり、毎日、一週間
、一ヶ月間あるいは一年間に一回あるいはそれ以上、あるいは2年から20年ごと
に一回、で与えうる。当業者は、体液あるいは組織内の薬剤の残留時間、および
濃度の測定に基づき、投薬のための反復頻度を容易に見積もることができる。成
功した処置に続いて、患者は維持治療を受けて疾患状態の再発を防ぐことが望ま
しく、そこではオリゴヌクレオチドは体重1 kgあたり0.01μgから100 gの範囲で
、毎日一回かあるいはそれ以上から20年ごとに一回の範囲で、維持用量を投与さ
れる。
【００６０】 従って、本発明の文脈において、“治療的に効果的な量”は、処置される個人
において治療的効果を持つために必要な化合物の量を意味する。この量は当業者
にとって明らかであり、個体の年齢および体重、処置される疾患の型、おそらく
個体の性別さえ、および薬剤処置を設計するときに普通に考慮される他の因子、
に依存する。治療的効果は、個人において、動物における疾患状態に対する化合
物の効果を測定することにより評価される。例えば、もし処置すべき疾患が癌で
あるなら、治療的効果は腫瘍の成長速度あるいは大きさを測定することにより、
あるいはその産生が腫瘍の進行あるいは退行の指標となりうるサイトカインなど
の化合物の産生を測定することにより評価する。
において治療的効果を持つために必要な化合物の量を意味する。この量は当業者
にとって明らかであり、個体の年齢および体重、処置される疾患の型、おそらく
個体の性別さえ、および薬剤処置を設計するときに普通に考慮される他の因子、
に依存する。治療的効果は、個人において、動物における疾患状態に対する化合
物の効果を測定することにより評価される。例えば、もし処置すべき疾患が癌で
あるなら、治療的効果は腫瘍の成長速度あるいは大きさを測定することにより、
あるいはその産生が腫瘍の進行あるいは退行の指標となりうるサイトカインなど
の化合物の産生を測定することにより評価する。
【００６１】 以下の実施例は本発明を説明するが、同じものに限定する意図はない。
【００６２】
実施例１：オリゴヌクレオチドの合成 非修飾オリゴデオキシヌクレオチドは自動化DNAシンセサイザー（Applied Bio
systems model 380B）において、ヨウ素による酸化をともなう標準的なホスホー
ルアミダイト（phosphoramidite）化学を使用して合成される。β-シアノエチル
ジイソプロピル-ホスホールアミダイトは、Applied Biosystemsから購入される
（Foster City, CA）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのために、標準
的な酸化ボトルを、亜リン酸結合の段階的なチア化（thiation）のための3H-1,2
-ベンゾジチオール-3-オン1,1-二酸化物の0.2 M溶液に換えた。チア化サイクル
の待機ステップを68秒まで増加して、キャッピングステップを続けた。シトシン
は5-メチルシトシンであってよい（Glen Research, Sterling, VAまたはAmersha
m Pharmacia Biotech, Piscataway, NJから入手可能な5-メチルデオキシチジン
ホスホールアミダイト）。
systems model 380B）において、ヨウ素による酸化をともなう標準的なホスホー
ルアミダイト（phosphoramidite）化学を使用して合成される。β-シアノエチル
ジイソプロピル-ホスホールアミダイトは、Applied Biosystemsから購入される
（Foster City, CA）。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのために、標準
的な酸化ボトルを、亜リン酸結合の段階的なチア化（thiation）のための3H-1,2
-ベンゾジチオール-3-オン1,1-二酸化物の0.2 M溶液に換えた。チア化サイクル
の待機ステップを68秒まで増加して、キャッピングステップを続けた。シトシン
は5-メチルシトシンであってよい（Glen Research, Sterling, VAまたはAmersha
m Pharmacia Biotech, Piscataway, NJから入手可能な5-メチルデオキシチジン
ホスホールアミダイト）。
【００６３】 2'-メトキシオリゴヌクレオチドは、テトラゾールおよび塩基のパルス運搬の
後の待機ステップが360秒まで増加することを除いて、2'-メトキシβ-シアノエ
チルジイソプロピル-ホスホールアミダイト（Chemgenes, Needham, MA）、およ
び非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを使用して合成される。他の2'-ア
ルコキシオリゴヌクレオチドは、本方法の改良により、Glen Research, Sterlin
g, VAから入手可能であるような適切な2'-修飾アミダイトを使用して合成される
。
後の待機ステップが360秒まで増加することを除いて、2'-メトキシβ-シアノエ
チルジイソプロピル-ホスホールアミダイト（Chemgenes, Needham, MA）、およ
び非修飾オリゴヌクレオチドの標準サイクルを使用して合成される。他の2'-ア
ルコキシオリゴヌクレオチドは、本方法の改良により、Glen Research, Sterlin
g, VAから入手可能であるような適切な2'-修飾アミダイトを使用して合成される
。
【００６４】 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、Kawasakiら（J. Med. Chem., 1993, 36,
831-841）に記載されるように合成される。簡略すると、保護化されたヌクレオ
シドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-フルオロアデノシンは、開始物質として商業的
に入手可能な9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを使用して、文献の手順を改
良して、2'-α-フルオロ原子を2'-β-O-トリフィル基のSN2-置換によって導入さ
れるようにすることにより合成される。このように、N6-ベンゾイル-9-β-D-ア
ラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体と
して中程度の収量において選択的に保護化される。THPおよびN6-ベンゾイル基の
脱保護は標準的な方法を使用して達せられ、標準的な方法を使用して、5'-ジメ
トキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得る。
831-841）に記載されるように合成される。簡略すると、保護化されたヌクレオ
シドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-フルオロアデノシンは、開始物質として商業的
に入手可能な9-β-D-アラビノフラノシルアデニンを使用して、文献の手順を改
良して、2'-α-フルオロ原子を2'-β-O-トリフィル基のSN2-置換によって導入さ
れるようにすることにより合成される。このように、N6-ベンゾイル-9-β-D-ア
ラビノフラノシルアデニンは、3',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体と
して中程度の収量において選択的に保護化される。THPおよびN6-ベンゾイル基の
脱保護は標準的な方法を使用して達せられ、標準的な方法を使用して、5'-ジメ
トキシトリチル-（DMT）および5'-DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得る。
【００６５】 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、開始物質としてテトライソプ
ロピルジシロキサニル（TPDS）保護化9-β-D-アラビノフラノシルグアニン、お
よび中間体ジイソブリチル-アラビノフラノシルグアノシンへの転化を使用して
達せられる。TPDS基の脱保護の後、THPをともなうヒドロキシ基の保護化を行い
、ジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的なO-
脱アシル化およびトリフラート化の後に、フッ化物をともなう粗生成物の処理、
そしてTHP基の脱保護を行う。標準的な方法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3
'-ホスホールアミダイトを得る。
ロピルジシロキサニル（TPDS）保護化9-β-D-アラビノフラノシルグアニン、お
よび中間体ジイソブリチル-アラビノフラノシルグアノシンへの転化を使用して
達せられる。TPDS基の脱保護の後、THPをともなうヒドロキシ基の保護化を行い
、ジイソブチリルジ-THP保護化アラビノフラノシルグアニンを得る。選択的なO-
脱アシル化およびトリフラート化の後に、フッ化物をともなう粗生成物の処理、
そしてTHP基の脱保護を行う。標準的な方法を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3
'-ホスホールアミダイトを得る。
【００６６】 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、2,2'-無水-1-β-D-アラビノフラ
ノシルウラシルを70％フッ化水素-ピリミジンで処理する既知の手順の改良によ
り達せられる。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホール
アミダイトを得る。
ノシルウラシルを70％フッ化水素-ピリミジンで処理する既知の手順の改良によ
り達せられる。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DMT-3'-ホスホール
アミダイトを得る。
【００６７】 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化を経て合成され、その後選択的な保護を行ってN4-ベンゾイル-2'-デオキ
シ-2'-フルオロシチジンを得る。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DM
T-3'-ホスホールアミダイトを得る。
ミノ化を経て合成され、その後選択的な保護を行ってN4-ベンゾイル-2'-デオキ
シ-2'-フルオロシチジンを得る。標準的な手順を使用して、5'-DMT-および5'-DM
T-3'-ホスホールアミダイトを得る。
【００６８】 2'-（2-メトキシエチル）-修飾アミダイトは、Martin, P.（Helv. Chim. Acta
, 1995, 78, 486-506）に従って合成された。合成を容易にするために、最後の
ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであってもよい。2'-O-CH2CH2OCH3-シトシ
ンは5'-メチルシトシンであってもよい。
, 1995, 78, 486-506）に従って合成された。合成を容易にするために、最後の
ヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであってもよい。2'-O-CH2CH2OCH3-シトシ
ンは5'-メチルシトシンであってもよい。
【００６９】 5-メチルシトシンモノマーの合成： 2,2'-無水［1-（β-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン］： 5-メチルウリジン（リボシルチミン、Yamasa, Choshi, Japanから商業的に入
手可能）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）お
よび重炭酸ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に加えた。混合液を
撹拌しながら熱して還流して、放出する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させた
。1時間後、わずかに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを
撹拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産生物はガムを形成した。
エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール（約400 mL）に溶解した。
溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、固いガムを得た。エーテルを静かにデ
カントし、ガムを真空オーブンで乾燥させて（60℃、1 mmHgで24時間）固体を得
、それを粉砕して淡い黄褐色の粉末を得た（57 g、粗収量85％）。その物質はさ
らなる反応のため現状のままで使用された。
手可能）（72.0 g、0.279 M）、ジフェニルカーボネート（90.0 g、0.420 M）お
よび重炭酸ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 mL）に加えた。混合液を
撹拌しながら熱して還流して、放出する二酸化炭素ガスを制御様式で放出させた
。1時間後、わずかに暗色化した溶液を減圧下で濃縮した。得られたシロップを
撹拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産生物はガムを形成した。
エーテルをデカントし、残留物を最少量のメタノール（約400 mL）に溶解した。
溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、固いガムを得た。エーテルを静かにデ
カントし、ガムを真空オーブンで乾燥させて（60℃、1 mmHgで24時間）固体を得
、それを粉砕して淡い黄褐色の粉末を得た（57 g、粗収量85％）。その物質はさ
らなる反応のため現状のままで使用された。
【００７０】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン： 2,2'-無水-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシエチル
）ホウ酸塩（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を2 Lステ
ンレススチール圧力容器に加え、160℃のあらかじめ加熱したオイルバスに置い
た。155-160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥させ、MeO
H（200 mL）を用いて研磨した。残留物を熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性
の塩を濾過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残留物（280
g）をCH3CN（600 mL）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を0.5
％ Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH（20:5:3）中にパックした。残留物を
CH2Cl2（250 mL）に溶解し、シリカ（150 g）に吸着させ、その後カラムにロー
ドした。産生物をパッキング溶媒で溶出し、160 g（63％）の産生物を得た。
）ホウ酸塩（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を2 Lステ
ンレススチール圧力容器に加え、160℃のあらかじめ加熱したオイルバスに置い
た。155-160℃で48時間の加熱後、容器を開け、溶液を蒸発させて乾燥させ、MeO
H（200 mL）を用いて研磨した。残留物を熱アセトン（1 L）に懸濁した。不溶性
の塩を濾過し、アセトン（150 mL）で洗浄し、濾液を蒸発させた。残留物（280
g）をCH3CN（600 mL）に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（3 kg）を0.5
％ Et3NHを含有するCH2Cl2/アセトン/MeOH（20:5:3）中にパックした。残留物を
CH2Cl2（250 mL）に溶解し、シリカ（150 g）に吸着させ、その後カラムにロー
ドした。産生物をパッキング溶媒で溶出し、160 g（63％）の産生物を得た。
【００７１】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン： 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリミジン（25
0 mL）と共蒸発（co-evaporated）し、乾燥した残留物をピリミジン（1.3 L）に
溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの最初のアリコート（94.3 g、0.278 M
）を加え、混合液を室温で1時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番
目のアリコート（94.3 g、0.278 M）を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。そ
してメタノール（170 mL）を加え、反応を停止した。HPLCの結果、約70％の産生
物が存在することが示された。溶媒を蒸発させ、CH3CN（200 mL）を用いて研磨
した。残留物をCHCl3（1.5 L）に溶解し、2×500 Lの飽和NaHCO3および2×500 m
Lの飽和NaClを用いて抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させて濾過し、蒸発させ
た。275 gの残留物を得た。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、パッ
クして0.5％ Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で溶出した。
純粋画分を蒸発させ、164 gの産生物を得た。さらに約20 gを不純粋画分から得
て、183 g（57％）の総収量を得た。
0 mL）と共蒸発（co-evaporated）し、乾燥した残留物をピリミジン（1.3 L）に
溶解した。ジメトキシトリチルクロリドの最初のアリコート（94.3 g、0.278 M
）を加え、混合液を室温で1時間撹拌した。ジメトキシトリチルクロリドの二番
目のアリコート（94.3 g、0.278 M）を加え、反応液をさらに1時間撹拌した。そ
してメタノール（170 mL）を加え、反応を停止した。HPLCの結果、約70％の産生
物が存在することが示された。溶媒を蒸発させ、CH3CN（200 mL）を用いて研磨
した。残留物をCHCl3（1.5 L）に溶解し、2×500 Lの飽和NaHCO3および2×500 m
Lの飽和NaClを用いて抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させて濾過し、蒸発させ
た。275 gの残留物を得た。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、パッ
クして0.5％ Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン/アセトン（5:5:1）で溶出した。
純粋画分を蒸発させ、164 gの産生物を得た。さらに約20 gを不純粋画分から得
て、183 g（57％）の総収量を得た。
【００７２】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ ジン： 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750
mLの3:1混合液）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を混合して、室温で24
時間撹拌した。MeOHを添加することによりtlc試料を最初に急冷（quenching）す
ることにより、tlcにより反応をモニターした。反応の完了の際、tlcにより判断
するとき、MeOH（50 mL）を加え、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl3（
800 mL）に溶解し、2×200 mLの飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200 mLの飽和Na
Clを用いて抽出した。水層をふたたび200 mLのCHCl3で抽出した。混合した有機
物を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて蒸発させ、122 gの残留物を得た（約90
％産物）。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、EtOAc/ヘキサン（4:1
）を使用して溶出した。純粋産物画分を蒸発させて96 g（84％）を産生した。
.167 M）、DMF/ピリジン（562 mLのDMFおよび188 mLのピリジンから調製した750
mLの3:1混合液）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を混合して、室温で24
時間撹拌した。MeOHを添加することによりtlc試料を最初に急冷（quenching）す
ることにより、tlcにより反応をモニターした。反応の完了の際、tlcにより判断
するとき、MeOH（50 mL）を加え、混合液を35℃で蒸発させた。残留物をCHCl3（
800 mL）に溶解し、2×200 mLの飽和重炭酸ナトリウムおよび2×200 mLの飽和Na
Clを用いて抽出した。水層をふたたび200 mLのCHCl3で抽出した。混合した有機
物を硫酸ナトリウムを用いて乾燥させて蒸発させ、122 gの残留物を得た（約90
％産物）。残留物を3.5 kgのシリカゲルカラムで精製し、EtOAc/ヘキサン（4:1
）を使用して溶出した。純粋産物画分を蒸発させて96 g（84％）を産生した。
【００７３】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン： 最初の溶液はCH3CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジ
メトキシトリチル-5-メチルウリジン（96g、0.144 M）を溶解することにより調
製し、取っておいた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をCH3CN（1 L）中の
トリアゾール（90 g、1.3 M）溶液に加え、-5℃に冷却してオーバーヘッドスタ
ーラーを使用して0.5時間撹拌した。POCl3を0-10℃に維持された撹拌溶液に一滴
ずつ（dropwise）30分間にわたり加え、得られた混合物をさらに2時間撹拌した
。最初の溶液を後の溶液に一滴ずつ45分間にわたり加えた。得られた反応混合液
をコールドルームで一晩保存した。塩を反応混合液から濾過し、溶液を蒸発させ
た。残留物をEtOAc（1 L）に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。濾過
物を1×300 mLのNaHCO3および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムを
用いて乾燥させて蒸発させた。残留物をEtAOcを用いて研磨し、表題化合物を得
た。
トリアゾールウリジン： 最初の溶液はCH3CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジ
メトキシトリチル-5-メチルウリジン（96g、0.144 M）を溶解することにより調
製し、取っておいた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）をCH3CN（1 L）中の
トリアゾール（90 g、1.3 M）溶液に加え、-5℃に冷却してオーバーヘッドスタ
ーラーを使用して0.5時間撹拌した。POCl3を0-10℃に維持された撹拌溶液に一滴
ずつ（dropwise）30分間にわたり加え、得られた混合物をさらに2時間撹拌した
。最初の溶液を後の溶液に一滴ずつ45分間にわたり加えた。得られた反応混合液
をコールドルームで一晩保存した。塩を反応混合液から濾過し、溶液を蒸発させ
た。残留物をEtOAc（1 L）に溶解し、不溶性の固体を濾過により除去した。濾過
物を1×300 mLのNaHCO3および2×300 mLの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナトリウムを
用いて乾燥させて蒸発させた。残留物をEtAOcを用いて研磨し、表題化合物を得
た。
【００７４】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン： ジオキサン（500 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメト
キシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.141 M）とNH4OH（3
0 mL）の溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeO
H（2×200 mL）と共沸した。残留物をMeOH（300 mL）に溶解し、2リットルのス
テンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH（400 mL）を加え
、容器を100℃で2時間加熱した（tlcは完全な転化を示した）。容器内容物を蒸
発させて乾燥させ、残留物をEtOAc（500 mL）に溶解し、飽和NaCl（200 mL）で
一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発させて、85 g（
95％）の表題化合物を得た。
キシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g、0.141 M）とNH4OH（3
0 mL）の溶液を室温で2時間撹拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をMeO
H（2×200 mL）と共沸した。残留物をMeOH（300 mL）に溶解し、2リットルのス
テンレススチール圧力容器に移した。NH3ガスで飽和したMeOH（400 mL）を加え
、容器を100℃で2時間加熱した（tlcは完全な転化を示した）。容器内容物を蒸
発させて乾燥させ、残留物をEtOAc（500 mL）に溶解し、飽和NaCl（200 mL）で
一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を蒸発させて、85 g（
95％）の表題化合物を得た。
【００７５】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ ジン： 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解して、安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）を撹
拌して加えた。3時間の撹拌後、tlcは反応が約95％完了したことを示した。溶媒
を蒸発させ、残留物をMeOH（200 mL）と共沸した。残留物をCHCl3（700 mL）に
溶解し、飽和NaHCO3（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）を用いて抽出し
て、MgSO4で乾燥させて蒸発させ、残留物（96 g）を得た。残留物を、溶出溶媒
として0.5％ Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を使用して、1.5 kgのシリ
カカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を蒸発させて、90 g（90％
）の表題化合物を得た。
134 M）をDMF（800 mL）に溶解して、安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）を撹
拌して加えた。3時間の撹拌後、tlcは反応が約95％完了したことを示した。溶媒
を蒸発させ、残留物をMeOH（200 mL）と共沸した。残留物をCHCl3（700 mL）に
溶解し、飽和NaHCO3（2×300 mL）および飽和NaCl（2×300 mL）を用いて抽出し
て、MgSO4で乾燥させて蒸発させ、残留物（96 g）を得た。残留物を、溶出溶媒
として0.5％ Et3NHを含有するEtOAc/ヘキサン（1:1）を使用して、1.5 kgのシリ
カカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分を蒸発させて、90 g（90％
）の表題化合物を得た。
【００７６】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ ジン-3'-アミダイト： N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH2Cl2（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）亜リン酸塩
（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気中で撹拌しながら加えた。得られた混合液
を、室温で20時間撹拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応混
合液を、飽和NaHCO3（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）を用いて抽出し
た。水性洗浄液をCH2Cl2（300 mL）で再び抽出し、抽出物を混合してMgSO4で乾
燥させて濃縮した。得られた残留物を、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）
を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分
を混合して、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。
ジン（74 g、0.10 M）をCH2Cl2（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシテトラ（イソプロピル）亜リン酸塩
（40.5 mL、0.123 M）を、窒素雰囲気中で撹拌しながら加えた。得られた混合液
を、室温で20時間撹拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応混
合液を、飽和NaHCO3（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）を用いて抽出し
た。水性洗浄液をCH2Cl2（300 mL）で再び抽出し、抽出物を混合してMgSO4で乾
燥させて濃縮した。得られた残留物を、溶出溶媒としてEtOAc/ヘキサン（3:1）
を使用して、1.5 kgのシリカカラムでクロマトグラフィーをした。純粋産物画分
を混合して、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。
【００７７】 オリゴヌクレオチドを含有する5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-me-C）を、
公開された方法（Sanghviら, Nucl. Acids Res., 1993, 21, 3197-3203）に従っ
て、商業的に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterling VA o
r ChemGenes, Needham MA）を使用して合成した。
公開された方法（Sanghviら, Nucl. Acids Res., 1993, 21, 3197-3203）に従っ
て、商業的に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterling VA o
r ChemGenes, Needham MA）を使用して合成した。
【００７８】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト 2'-（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［当該技術分
野では、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとして
も知られる］を、次のパラグラフに記載するように調製する。アデノシン、シチ
ジンおよびグアノシンヌクレオシドは、環外のアミンが、アデノシンおよびシチ
ジンの場合はベンゾイル部分を用いて、またグアノシンの場合はイソブチリルを
用いて、保護されることを除き、チミジン（5-メチルウリジン）と同様に調製さ
れる。
野では、2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとして
も知られる］を、次のパラグラフに記載するように調製する。アデノシン、シチ
ジンおよびグアノシンヌクレオシドは、環外のアミンが、アデノシンおよびシチ
ジンの場合はベンゾイル部分を用いて、またグアノシンの場合はイソブチリルを
用いて、保護されることを除き、チミジン（5-メチルウリジン）と同様に調製さ
れる。
【００７９】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン O2-2'-無水-5-メチルウリジン（Pro. Bio. Sint., Varese, Italy, 100.0 g,
0.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol）を
、アルゴン雰囲気中で機械的に撹拌しながら、周囲温度で乾燥ピリジン（500 mL
）に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g、119.0 mL、1.1
eq、0.458 mmol）を一度に加えた。反応液を周囲温度で16時間撹拌した。TLC（R
f 0.22、エチル酢酸）は反応完了を示した。溶液を減圧下で濃縮し、濃厚なオイ
ル（thick oil）にした。これを、ジクロロメタン（1 L）および飽和重炭酸ナト
リウム（2×1 L）およびブライン（1 L）の間で分配した。有機層を硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、減圧下で濃縮して濃厚なオイルにした。オイルを、エチル酢酸と
エチルエーテルの1:1混合液（600 mL）に溶解し、溶液を-10℃まで冷却した。得
られた結晶性産物を濾過して集め、エチルエーテル（3×200 mL）で洗浄して乾
燥し（40℃、1 mmHg、24時間）、149 g（74.8％）の白色固体とした。TCLおよび
NMRは純粋産物と一致した。
0.416 mmol）、ジメチルアミノピリジン（0.66 g、0.013 eq、0.0054 mmol）を
、アルゴン雰囲気中で機械的に撹拌しながら、周囲温度で乾燥ピリジン（500 mL
）に溶解した。tert-ブチルジフェニルクロロシラン（125.8 g、119.0 mL、1.1
eq、0.458 mmol）を一度に加えた。反応液を周囲温度で16時間撹拌した。TLC（R
f 0.22、エチル酢酸）は反応完了を示した。溶液を減圧下で濃縮し、濃厚なオイ
ル（thick oil）にした。これを、ジクロロメタン（1 L）および飽和重炭酸ナト
リウム（2×1 L）およびブライン（1 L）の間で分配した。有機層を硫酸ナトリ
ウムで乾燥し、減圧下で濃縮して濃厚なオイルにした。オイルを、エチル酢酸と
エチルエーテルの1:1混合液（600 mL）に溶解し、溶液を-10℃まで冷却した。得
られた結晶性産物を濾過して集め、エチルエーテル（3×200 mL）で洗浄して乾
燥し（40℃、1 mmHg、24時間）、149 g（74.8％）の白色固体とした。TCLおよび
NMRは純粋産物と一致した。
【００８０】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン 2 Lのステンレススチール中で撹拌しない圧力反応器に、テトラヒドロフラン
（1.0 M、2.0 eq、622 mL）中のボランを加えた。ドラフトチャンバー（fume ho
od）内において手動で撹拌しながら、エチレングリコール（350 mL,過剰量）を
、水素ガスの放散が静まるまで最初に注意深く加えた。5'-O-tert-ブチルジフェ
ニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン（149 g、0.311 mol）および重炭酸ナ
トリウム（0.074 g、0.003 eq）を手動で撹拌しながら加えた。反応器を密閉し
、容器内の温度が160℃に達して、その後16時間維持するまで、オイルバスで加
熱した（圧力< 100 psig）。反応容器を周囲の温度まで冷却して開けた。TLC（
所望する産生物のRfは0.67およびara-T副産物のRfは0.82、エチル酢酸）は、約7
0％が産生物に転化したことを示した。さらなる副産物の形成を避けるために、
反応を停止し、エチレングリコールを除去するために使用されるより極度の条件
をともなう温水バス中にて、減圧下（10から1 mmHg）で濃縮した。［あるいは、
一度低温煮沸溶媒を除去して、残りの溶媒をエチル酢酸と水の間で分配できる。
産生物は有機層に存在しうる。］ 残留物をカラムクロマトグラフィー（2 kgシ
リカゲル、1:1から4:1のエチル酢酸-ヘキサン勾配）にて精製した。適当な画分
を混合し、ストリッピング（stripping）および乾燥させて、白色のパリパリし
た（crisp）泡状物として産生物とし、汚染された（contaminated）開始物質（1
7.4 g）および純粋な再利用可能な開始物質20 gを産生した。収率は、開始物質
を基準としており、純度の低い回収開始物質の収率は58％であった。TLCおよびN
MRは99％の純粋産生物と一致した。
ウリジン 2 Lのステンレススチール中で撹拌しない圧力反応器に、テトラヒドロフラン
（1.0 M、2.0 eq、622 mL）中のボランを加えた。ドラフトチャンバー（fume ho
od）内において手動で撹拌しながら、エチレングリコール（350 mL,過剰量）を
、水素ガスの放散が静まるまで最初に注意深く加えた。5'-O-tert-ブチルジフェ
ニルシリル-O2-2'-無水-5-メチルウリジン（149 g、0.311 mol）および重炭酸ナ
トリウム（0.074 g、0.003 eq）を手動で撹拌しながら加えた。反応器を密閉し
、容器内の温度が160℃に達して、その後16時間維持するまで、オイルバスで加
熱した（圧力< 100 psig）。反応容器を周囲の温度まで冷却して開けた。TLC（
所望する産生物のRfは0.67およびara-T副産物のRfは0.82、エチル酢酸）は、約7
0％が産生物に転化したことを示した。さらなる副産物の形成を避けるために、
反応を停止し、エチレングリコールを除去するために使用されるより極度の条件
をともなう温水バス中にて、減圧下（10から1 mmHg）で濃縮した。［あるいは、
一度低温煮沸溶媒を除去して、残りの溶媒をエチル酢酸と水の間で分配できる。
産生物は有機層に存在しうる。］ 残留物をカラムクロマトグラフィー（2 kgシ
リカゲル、1:1から4:1のエチル酢酸-ヘキサン勾配）にて精製した。適当な画分
を混合し、ストリッピング（stripping）および乾燥させて、白色のパリパリし
た（crisp）泡状物として産生物とし、汚染された（contaminated）開始物質（1
7.4 g）および純粋な再利用可能な開始物質20 gを産生した。収率は、開始物質
を基準としており、純度の低い回収開始物質の収率は58％であった。TLCおよびN
MRは99％の純粋産生物と一致した。
【００８１】 2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5- メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-（2-ヒドロキシエチル）-5-メチル
ウリジン（20 g、36.98 mmol）を、トリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 m
mol）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24 g、44.36 mmol）と混合した。そ
して、それを40℃で2日間、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。反応混合液をア
ルゴンでフラッシュし、乾燥THF（369.8 mL、Aldrich、確実に密閉するボトル）
を加えて、透明な溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート（6.98 mL、44
.36 mmol）を反応混合液に一滴ずつ加えた。加える速度は、得られた濃赤色が次
の一滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が完了した後、反応液
を4時間撹拌した。その時までに、TLCは反応の完了を示した（エチル酢酸:ヘキ
サン、60:40）。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラ
ム上に置き、エチル酢酸:ヘキサン（60:40）を用いて溶出し、白色の泡状物とし
て2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジンを得た（21.819、86％）。
ウリジン（20 g、36.98 mmol）を、トリフェニルホスフィン（11.63 g、44.36 m
mol）およびN-ヒドロキシフタルイミド（7.24 g、44.36 mmol）と混合した。そ
して、それを40℃で2日間、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。反応混合液をア
ルゴンでフラッシュし、乾燥THF（369.8 mL、Aldrich、確実に密閉するボトル）
を加えて、透明な溶液を得た。ジエチル-アゾジカルボキシレート（6.98 mL、44
.36 mmol）を反応混合液に一滴ずつ加えた。加える速度は、得られた濃赤色が次
の一滴を加える前にちょうど消えるように維持した。添加が完了した後、反応液
を4時間撹拌した。その時までに、TLCは反応の完了を示した（エチル酢酸:ヘキ
サン、60:40）。溶媒を真空中で蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラ
ム上に置き、エチル酢酸:ヘキサン（60:40）を用いて溶出し、白色の泡状物とし
て2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジンを得た（21.819、86％）。
【００８２】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ ）エチル］-5-メチルウリジン 2'-O-（［2-フタルイミドオキシ）エチル］-5'-t-ブチルジフェニルシリル-5-
メチルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を乾燥CH2Cl2（4.5 mL）に溶解し、メチル
ヒドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃から0℃で一滴ずつ加えた。1時間後、
混合液を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄して、混合有機層を水、ブラインで
洗浄して、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2'-O-（アミノオキシエチ
ル）チミジンを得て、次にそれをMeOH（67.5 mL）に溶解した。これに、ホルム
アルデヒド（20％水溶液、w/w、1.1eg.）を加え、1時間混合した。溶媒を真空下
で除去した；残留物をクロマトグラフィーして、白色の泡状物として5'-O-tert-
ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］-5
-メチルウリジンを得た（1.95、78％）。
メチルウリジン（3.1 g、4.5 mmol）を乾燥CH2Cl2（4.5 mL）に溶解し、メチル
ヒドラジン（300 mL、4.64 mmol）を-10℃から0℃で一滴ずつ加えた。1時間後、
混合液を濾過し、濾過物を氷冷CH2Cl2で洗浄して、混合有機層を水、ブラインで
洗浄して、無水Na2SO4で乾燥させた。溶液を濃縮して2'-O-（アミノオキシエチ
ル）チミジンを得て、次にそれをMeOH（67.5 mL）に溶解した。これに、ホルム
アルデヒド（20％水溶液、w/w、1.1eg.）を加え、1時間混合した。溶媒を真空下
で除去した；残留物をクロマトグラフィーして、白色の泡状物として5'-O-tert-
ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］-5
-メチルウリジンを得た（1.95、78％）。
【００８３】 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノオキシエチル ］-5-メチルウリジン 5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［（2-ホルムアドキシイミノオキシ
）エチル］-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を、乾燥MeOH（30.6 mL）
中の1 Mピリジニウムp-トルエンスルホネート（PPTS）に溶解した。シアノホウ
化水素ナトリウム（0.39 g、6.13 mmol）をこの溶液に不活性雰囲気のもと10℃
で加えた。反応混合液を10℃で10分間撹拌した。反応容器を氷冷バスから取り出
して室温で2時間撹拌した後、反応をTLC（CH2Cl2中の5％ MeOH）にてモニターし
た。水性NaHCO3溶液（5％、10 mL）を加え、エチル酢酸（2×20 mL）を用いて抽
出した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残留物
を、MeOH（30.6 mL）中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（20％ w/
w、30 mL、3.37 mmol）を加え、反応混合液を室温で10分間撹拌した。反応混合
液を氷冷バス中で10℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（0.39 g、6.13
mmol）を加えて、反応混合液を10℃で10分間撹拌した。10分後、反応混合液を
氷冷バスから取り出して室温で2時間撹拌した。反応混合液に5％ NaHCO3（25 mL
）溶液を加え、エチル酢酸（2×25 mL）を用いて抽出した。エチル酢酸層を無水
Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。得られた残留物をフラッシュカラム
クロマトグラフィーにより精製し、CH2Cl2中の5％ MeOHを用いて溶出して、白色
の泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノ
オキシエチル］-5-メチルウリジンを得た（14.6 g、80％）。
）エチル］-5-メチルウリジン（1.77 g、3.12 mmol）を、乾燥MeOH（30.6 mL）
中の1 Mピリジニウムp-トルエンスルホネート（PPTS）に溶解した。シアノホウ
化水素ナトリウム（0.39 g、6.13 mmol）をこの溶液に不活性雰囲気のもと10℃
で加えた。反応混合液を10℃で10分間撹拌した。反応容器を氷冷バスから取り出
して室温で2時間撹拌した後、反応をTLC（CH2Cl2中の5％ MeOH）にてモニターし
た。水性NaHCO3溶液（5％、10 mL）を加え、エチル酢酸（2×20 mL）を用いて抽
出した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。残留物
を、MeOH（30.6 mL）中の1 M PPTS溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（20％ w/
w、30 mL、3.37 mmol）を加え、反応混合液を室温で10分間撹拌した。反応混合
液を氷冷バス中で10℃まで冷却し、シアノホウ化水素ナトリウム（0.39 g、6.13
mmol）を加えて、反応混合液を10℃で10分間撹拌した。10分後、反応混合液を
氷冷バスから取り出して室温で2時間撹拌した。反応混合液に5％ NaHCO3（25 mL
）溶液を加え、エチル酢酸（2×25 mL）を用いて抽出した。エチル酢酸層を無水
Na2SO4で乾燥させ、蒸発させて乾燥させた。得られた残留物をフラッシュカラム
クロマトグラフィーにより精製し、CH2Cl2中の5％ MeOHを用いて溶出して、白色
の泡状物として5'-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノ
オキシエチル］-5-メチルウリジンを得た（14.6 g、80％）。
【００８４】 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン トリエチルアミントリヒドロフルオライド（triethylamine trihydrofluoride
）（3.91 mL、24.0 mmol）を乾燥THFおよびトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmo
l、乾燥、KOHで保存）に溶解した。次に、このトリエチルアミン-2HF混合液を5'
-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノオキシエチル］-5
-メチルウリジン（1.40 g、2.4 mmol）に加え、室温で24時間撹拌した。反応をT
LC（CH2Cl2中の5％ MeOH）にてモニターした。溶媒を真空中下で除去し、残留物
をフラッシュカラム上に置き、CH2Cl2中の10％ MeOHを用いて溶出して、白色の
泡状物として2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジンを得た（
766 mg、92.5％）。
）（3.91 mL、24.0 mmol）を乾燥THFおよびトリエチルアミン（1.67 mL、12 mmo
l、乾燥、KOHで保存）に溶解した。次に、このトリエチルアミン-2HF混合液を5'
-O-tert-ブチルジフェニルシリル-2'-O-［N,N-ジメチルアミノオキシエチル］-5
-メチルウリジン（1.40 g、2.4 mmol）に加え、室温で24時間撹拌した。反応をT
LC（CH2Cl2中の5％ MeOH）にてモニターした。溶媒を真空中下で除去し、残留物
をフラッシュカラム上に置き、CH2Cl2中の10％ MeOHを用いて溶出して、白色の
泡状物として2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジンを得た（
766 mg、92.5％）。
【００８５】 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン 2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（750 mg、2.17 mmo
l）を40℃で一晩、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。次に、それを無水ピリジ
ン（20 mL）を用いて共蒸発させた。得られた残留物をアルゴン雰囲気下でピリ
ジン（11 mL）に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）
、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド（880 mg、2.60 mmol）を混合液に加え、
反応混合液を全ての開始物質が消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空中
下で除去し、残留物をクロマトグラフィーして、CH2Cl2中の10％ MeOHを用いて
溶出して（数滴のピリジンを含有する）、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキ
シエチル）-5-メチルウリジンを得た（1.13 g、80％）。
l）を40℃で一晩、高度真空のもとP2O5で乾燥させた。次に、それを無水ピリジ
ン（20 mL）を用いて共蒸発させた。得られた残留物をアルゴン雰囲気下でピリ
ジン（11 mL）に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン（26.5 mg、2.60 mmol）
、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド（880 mg、2.60 mmol）を混合液に加え、
反応混合液を全ての開始物質が消失するまで室温で撹拌した。ピリジンを真空中
下で除去し、残留物をクロマトグラフィーして、CH2Cl2中の10％ MeOHを用いて
溶出して（数滴のピリジンを含有する）、5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキ
シエチル）-5-メチルウリジンを得た（1.13 g、80％）。
【００８６】 5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3' -［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト］ 5'-O-DMT-2'-O-（ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン（1.08 g
、1.67 mmol）をトルエン（20 mL）と共蒸発させた。残留物にN,N-ジイソプロピ
ルアミンテトラゾニド（0.29 g、1.67 mmol）を加え、40℃で一晩、高度真空の
もとP2O5で乾燥させた。次に、反応混合液を無水アセトニトリル（8.4 mL）に溶
解し、2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピルホスホールアミダイト（2
.12 mL、6.08 mmol）を加えた。反応混合液を不活性雰囲気のもと室温で4時間撹
拌した。反応の進行をTLC（ヘキサン:エチル酢酸 1:1）によりモニターした。溶
媒を蒸発させ、そして残留物をエチル酢酸（70 mL）に溶解して、5％水性NaHCO3 （40 mL）で洗浄した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させて濃縮した。得ら
れた残留物をクロマトグラフィーして（溶出剤としてエチル酢酸）、泡状物とし
て5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'
-［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト］を得た（1.
04 g、74.9％）。
、1.67 mmol）をトルエン（20 mL）と共蒸発させた。残留物にN,N-ジイソプロピ
ルアミンテトラゾニド（0.29 g、1.67 mmol）を加え、40℃で一晩、高度真空の
もとP2O5で乾燥させた。次に、反応混合液を無水アセトニトリル（8.4 mL）に溶
解し、2-シアノエチル-N,N,N1,N1-テトライソプロピルホスホールアミダイト（2
.12 mL、6.08 mmol）を加えた。反応混合液を不活性雰囲気のもと室温で4時間撹
拌した。反応の進行をTLC（ヘキサン:エチル酢酸 1:1）によりモニターした。溶
媒を蒸発させ、そして残留物をエチル酢酸（70 mL）に溶解して、5％水性NaHCO3 （40 mL）で洗浄した。エチル酢酸層を無水Na2SO4で乾燥させて濃縮した。得ら
れた残留物をクロマトグラフィーして（溶出剤としてエチル酢酸）、泡状物とし
て5'-O-DMT-2'-O-（2-N,N-ジメチルアミノオキシエチル）-5-メチルウリジン-3'
-［（2-シアノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホールアミダイト］を得た（1.
04 g、74.9％）。
【００８７】 メチレン（メチルイミノ）（MMI）のバックボーンを持つオリゴヌクレオチド
は米国特許5,378,825に従って合成され、それは本発明の譲り受け人に対して共
に譲受され、その全体を本明細書中に援用する。合成を容易にするため、MMI結
合を含有する様々なヌクレオシド二量体を合成し、オリゴヌクレオチドの中に組
み込んだ。他の窒素含有バックボーンはWO 92/20823に従って合成され、これも
また本発明の譲り受け人に対して共に譲受され、その全体を本明細書中に援用す
る。
は米国特許5,378,825に従って合成され、それは本発明の譲り受け人に対して共
に譲受され、その全体を本明細書中に援用する。合成を容易にするため、MMI結
合を含有する様々なヌクレオシド二量体を合成し、オリゴヌクレオチドの中に組
み込んだ。他の窒素含有バックボーンはWO 92/20823に従って合成され、これも
また本発明の譲り受け人に対して共に譲受され、その全体を本明細書中に援用す
る。
【００８８】 アミドバックボーンを持つオリゴヌクレオチドはDe Mesmaekerら（Acc. Chem.
Res., 1995, 28, 366-374）に従って合成される。アミド部分は簡単でよく知ら
れている合成方法により容易に入手可能であり、オリゴヌクレオチドの固層合成
に必要な条件とも両立する。
Res., 1995, 28, 366-374）に従って合成される。アミド部分は簡単でよく知ら
れている合成方法により容易に入手可能であり、オリゴヌクレオチドの固層合成
に必要な条件とも両立する。
【００８９】 モルホリノバックボーンを持つオリゴヌクレオチドは米国特許5,034,506（Sum
merton and Weller）に従って合成される。 ペプチド-核酸（PNA）オリゴマーはP.E. Nielsenら（Science, 1991, 254, 14
97-1500）に従って合成される。
merton and Weller）に従って合成される。 ペプチド-核酸（PNA）オリゴマーはP.E. Nielsenら（Science, 1991, 254, 14
97-1500）に従って合成される。
【００９０】 制御孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの開裂、および55℃、18時間
の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを2.5
容量のエタノールを用いて0.5 M NaClから2回の遠心分離を行うことにより精製
した。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気
泳動することにより解析し、少なくとも85％の完全長物質であると判断した。合
成において得られたホスホールアミダイトおよびホスホジエステルの相対的な量
は、31P核磁気共鳴分光器により定期的に確認し、いくつかの研究のためにオリ
ゴヌクレオチドを、Chiangら（J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162）によって記
載されるようにHPLCにより精製した。HPLC精製物質で得られた結果は、非HPLC精
製物質で得られたものと同様であった。
の濃水酸化アンモニウム中での脱ブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを2.5
容量のエタノールを用いて0.5 M NaClから2回の遠心分離を行うことにより精製
した。合成したオリゴヌクレオチドを変性ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気
泳動することにより解析し、少なくとも85％の完全長物質であると判断した。合
成において得られたホスホールアミダイトおよびホスホジエステルの相対的な量
は、31P核磁気共鳴分光器により定期的に確認し、いくつかの研究のためにオリ
ゴヌクレオチドを、Chiangら（J. Biol. Chem., 1991, 266, 18162）によって記
載されるようにHPLCにより精製した。HPLC精製物質で得られた結果は、非HPLC精
製物質で得られたものと同様であった。
【００９１】 実施例２：オリゴヌクレオチド配列および細胞培養 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、E-セレクチン、Ha-ras、c-raf、JNK1、
およびJNK2に対して設計された。さらなる配列はスクランブル化対照（scramble
d control）として設計された。使用したオリゴヌクレオチドの配列は表１に与
えられる。ISIS 11928（SEQ ID NO. 1）以外の全てのこれらのヌクレオチドは、
2'-デオキシヌクレオチド／ホスホロチオエート領域に隣接する2'-O-メトキシエ
チル／ホスホジエステル残基を含有する。ISIS 11928（SEQ ID NO. 1）は完全に
ホスホロチオエート化したオリゴヌクレオチドであり、3'末端の2'-デオキシヌ
クレオチド以外は、全てが2'-メトキシエトキシヌクレオチドである。E-セレク
チンの標的配列は、Genbankの内皮白血球接着分子Iエクソン1配列、HUMELAM1（
寄託番号M61895；SEQ ID NO. 8）から得られた。Ha-rasの標的配列は、Genbank
のHa-ras配列、HSRAS1（寄託番号V00574；SEQ ID NO. 10）から得られた。c-raf
の標的配列は、Genbankのc-raf配列、HSRAFR（寄託番号X03484；SEQ ID NO. 12
）から得られた。JNK1の標的配列は、GenbankのJNK1配列、HUMJNK1（寄託番号L2
6318；SEQ ID NO. 14）から得られた。JNK2の標的配列は、GenbankのJNK2配列、
HUMJNK2（寄託番号L31951；SEQ ID NO. 16）から得られた。
およびJNK2に対して設計された。さらなる配列はスクランブル化対照（scramble
d control）として設計された。使用したオリゴヌクレオチドの配列は表１に与
えられる。ISIS 11928（SEQ ID NO. 1）以外の全てのこれらのヌクレオチドは、
2'-デオキシヌクレオチド／ホスホロチオエート領域に隣接する2'-O-メトキシエ
チル／ホスホジエステル残基を含有する。ISIS 11928（SEQ ID NO. 1）は完全に
ホスホロチオエート化したオリゴヌクレオチドであり、3'末端の2'-デオキシヌ
クレオチド以外は、全てが2'-メトキシエトキシヌクレオチドである。E-セレク
チンの標的配列は、Genbankの内皮白血球接着分子Iエクソン1配列、HUMELAM1（
寄託番号M61895；SEQ ID NO. 8）から得られた。Ha-rasの標的配列は、Genbank
のHa-ras配列、HSRAS1（寄託番号V00574；SEQ ID NO. 10）から得られた。c-raf
の標的配列は、Genbankのc-raf配列、HSRAFR（寄託番号X03484；SEQ ID NO. 12
）から得られた。JNK1の標的配列は、GenbankのJNK1配列、HUMJNK1（寄託番号L2
6318；SEQ ID NO. 14）から得られた。JNK2の標的配列は、GenbankのJNK2配列、
HUMJNK2（寄託番号L31951；SEQ ID NO. 16）から得られた。
【００９２】 表１ 混合バックボーンキメラ（デオキシギャップ化）2'-O-メトキシエチルオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列
ヌクレオチドのヌクレオチド配列
【００９３】
【表１】
【００９４】1 下線の残基は2'-メトキシエトキシ残基である（他は2'-デオキシ-である）。全
ての2'-メトキシエトキシシチジンは5-メチル-シチジンである；“s”結合はホ
スホロチオエート結合、“o”結合はホスホジエステル結合である。
ての2'-メトキシエトキシシチジンは5-メチル-シチジンである；“s”結合はホ
スホロチオエート結合、“o”結合はホスホジエステル結合である。
【００９５】 ヒトの皮膚の微小血管の細胞（HMVEC-d；Clonetics, San Diego, CA）を、10
％牛胎児血清（HyClone, Logan, UT）を補った内皮基礎培地（EBM, Clonetics）
で培養した。細胞を70-80％コンフルエントまで100 mmペトリ皿で成長させ、そ
してPBSおよびOPTI-MEM（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）で洗浄
した。次に、細胞を、100 nMのオリゴヌクレオチドあたり、OPTI-MEMおよび3 mg
/ml LIPOFECTIN（陽イオン性脂質N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-n
,n,n-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）およびジオレイルホスホチジ
ルエタノールアミン（DOPE）の膜濾過水（Life Technologies, Gaithersburg, M
D）中1:1（w/w）のリポソーム製剤）の存在下でインキュベートし、その後適切
な濃度でオリゴヌクレオチドを加えた。
％牛胎児血清（HyClone, Logan, UT）を補った内皮基礎培地（EBM, Clonetics）
で培養した。細胞を70-80％コンフルエントまで100 mmペトリ皿で成長させ、そ
してPBSおよびOPTI-MEM（Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD）で洗浄
した。次に、細胞を、100 nMのオリゴヌクレオチドあたり、OPTI-MEMおよび3 mg
/ml LIPOFECTIN（陽イオン性脂質N-［1-（2,3-ジオレイルオキシ）プロピル］-n
,n,n-トリメチルアンモニウムクロライド（DOTMA）およびジオレイルホスホチジ
ルエタノールアミン（DOPE）の膜濾過水（Life Technologies, Gaithersburg, M
D）中1:1（w/w）のリポソーム製剤）の存在下でインキュベートし、その後適切
な濃度でオリゴヌクレオチドを加えた。
【００９６】 ノーザンブロットによるmRNAレベルの決定のため、オリゴヌクレオチド処理開
始後の指示された時間に、グアニジニウムイソチオシアネート法、あるいはQiag
en RNAEASY法（Qiagen, Santa Clarita, CA）によって、細胞から全RNAを調製し
た。ノーザンブロット解析は、Current Protocols in Molecular Biology（Ausu
bel, F.M.ら,（eds）, 1987, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscien
ce, New York）に記載されるように行った。グリセルデヒド3-リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（G3PDH）プローブをClontech（Palo Alto, CA, Catalog Number 9805-1
）から購入した。Molecular Dynamic PHOSPHORIMAGER（Sunnyvale, CA）を使用
して、RNAの定量およびC3PDH mRNAレベルに対する標準化を行った。
始後の指示された時間に、グアニジニウムイソチオシアネート法、あるいはQiag
en RNAEASY法（Qiagen, Santa Clarita, CA）によって、細胞から全RNAを調製し
た。ノーザンブロット解析は、Current Protocols in Molecular Biology（Ausu
bel, F.M.ら,（eds）, 1987, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscien
ce, New York）に記載されるように行った。グリセルデヒド3-リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（G3PDH）プローブをClontech（Palo Alto, CA, Catalog Number 9805-1
）から購入した。Molecular Dynamic PHOSPHORIMAGER（Sunnyvale, CA）を使用
して、RNAの定量およびC3PDH mRNAレベルに対する標準化を行った。
【００９７】 ウエスタンブロットによるタンパク質レベルの決定のため、細胞抽出物を100
mm皿あたり300 mlのRIPA抽出緩衝液を使用して調製した。タンパク質濃度はBioR
adキット（BioRad, Hercules, CA）を使用してBradfordアッセイにより定量した
。タンパク質等量を10％あるいは12％のSDS-PAGEミニゲル（Novex, San Diego,
CA）にロードした。PVDF膜（Millipore, Bedford, MA）に一度トランスファーし
て、そして膜を特異的な一次抗体を用いて最短2時間処理した後、HRP結合二次抗
体でインキュベートした。その結果を強化化学発光（Enhanced Chemiluminescen
t）（ECL）検出（New England BioLab, Beverly, MA）により視覚化した。いく
つかの実験において、ブロットをストリッピング緩衝液（2％ SDS、12.5 mM Tri
s、pH 6.8）中にて50℃、30分間ストリッピング（stripped）した。しっかりと
（extensive）洗浄した後、ブロットをブロックして、異なる一次抗体でブロッ
トした。
mm皿あたり300 mlのRIPA抽出緩衝液を使用して調製した。タンパク質濃度はBioR
adキット（BioRad, Hercules, CA）を使用してBradfordアッセイにより定量した
。タンパク質等量を10％あるいは12％のSDS-PAGEミニゲル（Novex, San Diego,
CA）にロードした。PVDF膜（Millipore, Bedford, MA）に一度トランスファーし
て、そして膜を特異的な一次抗体を用いて最短2時間処理した後、HRP結合二次抗
体でインキュベートした。その結果を強化化学発光（Enhanced Chemiluminescen
t）（ECL）検出（New England BioLab, Beverly, MA）により視覚化した。いく
つかの実験において、ブロットをストリッピング緩衝液（2％ SDS、12.5 mM Tri
s、pH 6.8）中にて50℃、30分間ストリッピング（stripped）した。しっかりと
（extensive）洗浄した後、ブロットをブロックして、異なる一次抗体でブロッ
トした。
【００９８】 実施例３：アンチセンスオリゴヌクレオチドによるc-rafおよびHa-ras発現の
阻害 ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）は2'-O-メトキシエチル混合バックボーンキメラ
アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ヒトc-raf mRNA内に含まれる3'-非翻
訳配列とハイブリダイゼーションするように設計された。このアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが、内皮細胞においてc-raf阻害剤として効果的であるかどうか
を決定するために、ヒトの皮膚の微小血管の細胞（HMVEC）を実施例２に記載し
たようにISIS 12854（SEQ ID NO. 2）を用いて処理した。c-raf mRNAおよびタン
パク質発現はノーザンおよびウエスタンブロット解析により調べた。 c-raf cDN
Aプローブは供給される説明書に従い、プラスミド、p627（American Type Cultu
re Collection, Manassas, VA；catalog #41050）から生成した。c-raf抗体はTr
ansduction Laboratories, Inc.（Lexington, KY）から得られた。ノーザンブロ
ットの結果を表２に示す。ウエスタンブロットの結果を図１に示す。
阻害 ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）は2'-O-メトキシエチル混合バックボーンキメラ
アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ヒトc-raf mRNA内に含まれる3'-非翻
訳配列とハイブリダイゼーションするように設計された。このアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが、内皮細胞においてc-raf阻害剤として効果的であるかどうか
を決定するために、ヒトの皮膚の微小血管の細胞（HMVEC）を実施例２に記載し
たようにISIS 12854（SEQ ID NO. 2）を用いて処理した。c-raf mRNAおよびタン
パク質発現はノーザンおよびウエスタンブロット解析により調べた。 c-raf cDN
Aプローブは供給される説明書に従い、プラスミド、p627（American Type Cultu
re Collection, Manassas, VA；catalog #41050）から生成した。c-raf抗体はTr
ansduction Laboratories, Inc.（Lexington, KY）から得られた。ノーザンブロ
ットの結果を表２に示す。ウエスタンブロットの結果を図１に示す。
【００９９】 表２ HMVEC細胞におけるc-raf mRNAレベルに対するISIS 12854の用量反応
【０１００】
【表２】
【０１０１】 ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）を用いたHMVECの処理は、劇的にc-raf mRNAレベ
ルを減少させた。c-raf mRNAレベルの減少は、0.5から200 nMの範囲内で用量依
存性であった。c-raf mRNA減少のIC50は約2.5 nMであった。対照オリゴヌクレオ
チド、ISIS 15727（SEQ ID NO. 3）はc-raf mRNAに対するいかなる効果も示さな
かった。
ルを減少させた。c-raf mRNAレベルの減少は、0.5から200 nMの範囲内で用量依
存性であった。c-raf mRNA減少のIC50は約2.5 nMであった。対照オリゴヌクレオ
チド、ISIS 15727（SEQ ID NO. 3）はc-raf mRNAに対するいかなる効果も示さな
かった。
【０１０２】 c-rafタンパク質レベルの減少も、オリゴヌクレオチド処理に続き起こった。
タンパク質発現の減少は、処理の24時間後に最初に検出され、c-rafタンパク質
レベルの最大減少は、150 nMオリゴヌクレオチドを用いた処理の48時間後に達せ
られた。c-rafタンパク質レベルの減少は、最初の処理の後72時間まで持続した
。ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）によるc-raf 発現の阻害は特異的であり、なぜな
らA-rafタンパク質発現は、同じブロットをA-rafに対する抗体（Transduction L
aboratories, Inc., Lexington, KY）でストリッピングしてブロットしたとき、
大きく影響されなかったからである。
タンパク質発現の減少は、処理の24時間後に最初に検出され、c-rafタンパク質
レベルの最大減少は、150 nMオリゴヌクレオチドを用いた処理の48時間後に達せ
られた。c-rafタンパク質レベルの減少は、最初の処理の後72時間まで持続した
。ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）によるc-raf 発現の阻害は特異的であり、なぜな
らA-rafタンパク質発現は、同じブロットをA-rafに対する抗体（Transduction L
aboratories, Inc., Lexington, KY）でストリッピングしてブロットしたとき、
大きく影響されなかったからである。
【０１０３】 ISIS 15168（SEQ ID NO. 4）は2'-O-メトキシエチル混合バックボーンキメラ
アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ヒトHa-ras mRNA内に含有される配列
とのハイブリダイゼーションするように設計された。内皮細胞におけるHa-ras発
現に対するISIS 15168（SEQ ID NO. 4）の効果を決定するために、実施例２に記
載したようにオリゴヌクレオチドを用いてHMVECを処理し、ノーザンブロットを
使用してHa-ras mRNAレベルを測定した。Ha-rasプローブは、供給される説明書
に従い、プラスミド、pbc-N1（American Type Culture Collection, Manassas,
VA；catalog #41001）から生成された。結果は表３に示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ヒトHa-ras mRNA内に含有される配列
とのハイブリダイゼーションするように設計された。内皮細胞におけるHa-ras発
現に対するISIS 15168（SEQ ID NO. 4）の効果を決定するために、実施例２に記
載したようにオリゴヌクレオチドを用いてHMVECを処理し、ノーザンブロットを
使用してHa-ras mRNAレベルを測定した。Ha-rasプローブは、供給される説明書
に従い、プラスミド、pbc-N1（American Type Culture Collection, Manassas,
VA；catalog #41001）から生成された。結果は表３に示す。
【０１０４】 表３ HMVEC細胞におけるHa-ras mRNAレベルに対するHa-rasアンチセンスオリゴヌク
レオチドの用量反応
レオチドの用量反応
【０１０５】
【表３】
【０１０６】 HMVECでのHa-ras mRNAレベルの減少は、オリゴヌクレオチド処理に続いて観察
され、配列特異的、および用量依存性（IC50 < 5 nM）であることが分かった。 Ha-rasタンパク質レベルに対するISIS 15168（SEQ ID NO. 4）の効果を調べる
ため、全rasタンパク質をpan-rasモノクローナル抗体（Oncogene Science, Camb
ridge, MA）を使用して免疫沈降した。沈降したタンパク質をSDS-PAGEで解析し
、Ha-rasタンパク質レベルをHa-rasに特異的なモノクローナル抗体（Oncogene S
cience, Cambridge, MA）を使用してウエスタンブロットにより決定した。図２
に示すように、Ha-rasタンパク質発現の用量依存性減少は、ISIS 15168（SEQ ID
NO. 4）を用いた処理の後48時間で観察された。この減少は最初の処理の後72時
間まで維持した。Ha-ras減少の動態はc-rafのそれよりも遅かった。対照オリゴ
ヌクレオチド、ISIS 17552（SEQ ID NO. 5）、はHa-rasタンパク質レベルに対す
る効果を持たなかった。同じブロットをストリッピングして、Ki-ras-特異的抗
体（Oncogene Science, Cambridge, MA）を用いて二回目のブロットをした。ISI
S 15168（SEQ ID NO. 4）あるいは対照オリゴヌクレオチド、ISIS 17552（SEQ I
D NO. 5）を用いて処理した細胞において、Ki-rasタンパク質レベルに対する効
果は何も観察されなかった。
され、配列特異的、および用量依存性（IC50 < 5 nM）であることが分かった。 Ha-rasタンパク質レベルに対するISIS 15168（SEQ ID NO. 4）の効果を調べる
ため、全rasタンパク質をpan-rasモノクローナル抗体（Oncogene Science, Camb
ridge, MA）を使用して免疫沈降した。沈降したタンパク質をSDS-PAGEで解析し
、Ha-rasタンパク質レベルをHa-rasに特異的なモノクローナル抗体（Oncogene S
cience, Cambridge, MA）を使用してウエスタンブロットにより決定した。図２
に示すように、Ha-rasタンパク質発現の用量依存性減少は、ISIS 15168（SEQ ID
NO. 4）を用いた処理の後48時間で観察された。この減少は最初の処理の後72時
間まで維持した。Ha-ras減少の動態はc-rafのそれよりも遅かった。対照オリゴ
ヌクレオチド、ISIS 17552（SEQ ID NO. 5）、はHa-rasタンパク質レベルに対す
る効果を持たなかった。同じブロットをストリッピングして、Ki-ras-特異的抗
体（Oncogene Science, Cambridge, MA）を用いて二回目のブロットをした。ISI
S 15168（SEQ ID NO. 4）あるいは対照オリゴヌクレオチド、ISIS 17552（SEQ I
D NO. 5）を用いて処理した細胞において、Ki-rasタンパク質レベルに対する効
果は何も観察されなかった。
【０１０７】 実施例４：E-セレクチンの誘導に対するc-rafおよびHa-ras遺伝子発現の阻害
の効果 TNF-αによるE-セレクチン誘導に対するc-rafおよびHa-rasアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド処理の効果を調べた。HMVEC細胞をc-rafおよびHa-rasアンチセン
ス化合物のいずれかを用いて、用量反応条件の下、あるいは単一用量レベルにお
ける時間にわたり処理した後、TNF-αによる5時間のE-セレクチン発現の刺激を
行った。E-セレクチンの細胞表面発現をフローサイトメトリー解析で決定した。
オリゴヌクレオチド処理に続き、細胞をプレートから分離し、Becton Dickinson
（San Jose, CA）FACScanを使用して細胞接着分子の表面発現について解析した
。TNF-αおよびE-セレクチンに対するFITC結合抗体をR & D Systems（Minneapol
is, MN）から得た。ICAM-1に対するPE-結合抗体をPharmingen（San Diego, CA）
から得た。VCAM-1抗体はSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CAから得た。
細胞表面発現は、各々の試料および時点にとって適切な抗体で染色した3,000-5,
000細胞を使用した蛍光強度の平均値を使用して計算した。結果は平均蛍光強度
に基づいて対照（オリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞においてTNF-αによ
り誘導される細胞表面発現）のパーセンテージとして表した。結果は表４および
５に示した。E-セレクチンおよびVCAM-1の基底発現はTNF-αがない場合は検出不
可であるのに対し、ICAM-1は低レベルの基底発現が検出可能である。
の効果 TNF-αによるE-セレクチン誘導に対するc-rafおよびHa-rasアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド処理の効果を調べた。HMVEC細胞をc-rafおよびHa-rasアンチセン
ス化合物のいずれかを用いて、用量反応条件の下、あるいは単一用量レベルにお
ける時間にわたり処理した後、TNF-αによる5時間のE-セレクチン発現の刺激を
行った。E-セレクチンの細胞表面発現をフローサイトメトリー解析で決定した。
オリゴヌクレオチド処理に続き、細胞をプレートから分離し、Becton Dickinson
（San Jose, CA）FACScanを使用して細胞接着分子の表面発現について解析した
。TNF-αおよびE-セレクチンに対するFITC結合抗体をR & D Systems（Minneapol
is, MN）から得た。ICAM-1に対するPE-結合抗体をPharmingen（San Diego, CA）
から得た。VCAM-1抗体はSanta Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CAから得た。
細胞表面発現は、各々の試料および時点にとって適切な抗体で染色した3,000-5,
000細胞を使用した蛍光強度の平均値を使用して計算した。結果は平均蛍光強度
に基づいて対照（オリゴヌクレオチドで処理しなかった細胞においてTNF-αによ
り誘導される細胞表面発現）のパーセンテージとして表した。結果は表４および
５に示した。E-セレクチンおよびVCAM-1の基底発現はTNF-αがない場合は検出不
可であるのに対し、ICAM-1は低レベルの基底発現が検出可能である。
【０１０８】 表４ E-セレクチン誘導におけるc-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの効果の用量反応
ドの効果の用量反応
【０１０９】
【表４】
【０１１０】 E-セレクチン細胞表面発現の用量依存性阻害は、c-rafを標的とするISIS 1285
4（SEQ ID NO. 2）、およびHa-rasを標的とするISIS 15168（SEQ ID NO. 4）の
両アンチセンス化合物を用いて処理した細胞において観察された。E-セレクチン
誘導の最大の阻害は、ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）では約80％、およびISIS 151
68（SEQ ID NO. 4）では約60％であった。対照オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO.
3およびSEQ ID NO. 5）は、E-セレクチン誘導に対する効果をほとんど示さなか
った。これらの結果から、c-rafまたはHa-rasタンパク質レベルの減少は、HMVEC
においてTNF-αによるE-セレクチンの誘導を妨げることが示される。
4（SEQ ID NO. 2）、およびHa-rasを標的とするISIS 15168（SEQ ID NO. 4）の
両アンチセンス化合物を用いて処理した細胞において観察された。E-セレクチン
誘導の最大の阻害は、ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）では約80％、およびISIS 151
68（SEQ ID NO. 4）では約60％であった。対照オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO.
3およびSEQ ID NO. 5）は、E-セレクチン誘導に対する効果をほとんど示さなか
った。これらの結果から、c-rafまたはHa-rasタンパク質レベルの減少は、HMVEC
においてTNF-αによるE-セレクチンの誘導を妨げることが示される。
【０１１１】 動的条件の下でのTNF-α誘導E-セレクチン細胞表面発現に対する、c-raf、Ha-
rasおよびE-セレクチンアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べた。もし
、c-rafおよびHa-rasアンチセンス化合物によるE-セレクチン誘導の阻害が、c-r
afおよびHa-rasタンパク質レベルの減少に依存していれば、アンチセンス化合物
によるE-セレクチン誘導の阻害の動態は、c-rafおよびHa-rasタンパク質レベル
（それらは細胞におけるタンパク質の半減期に依存する）の抑制と相関するはず
である。E-セレクチンアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するE-セレクチン
誘導の阻害は、この阻害剤がE-セレクチン誘導を直接に阻害するので、かなりよ
り素早く起こるはずである。これをテストするために、細胞をE-セレクチン、IC
AM-1およびVCAM-1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで別々に処理し、回
復させた後にTNF-α処理をした。オリゴヌクレオチド処理に続き、TNF-αを12お
よび72時間の間の様々な時点で加えた。E-セレクチン細胞表面発現は、TNF-α処
理の5時間後にフローサイトメトリーにより測定した。結果は表５に示す。
rasおよびE-セレクチンアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べた。もし
、c-rafおよびHa-rasアンチセンス化合物によるE-セレクチン誘導の阻害が、c-r
afおよびHa-rasタンパク質レベルの減少に依存していれば、アンチセンス化合物
によるE-セレクチン誘導の阻害の動態は、c-rafおよびHa-rasタンパク質レベル
（それらは細胞におけるタンパク質の半減期に依存する）の抑制と相関するはず
である。E-セレクチンアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用するE-セレクチン
誘導の阻害は、この阻害剤がE-セレクチン誘導を直接に阻害するので、かなりよ
り素早く起こるはずである。これをテストするために、細胞をE-セレクチン、IC
AM-1およびVCAM-1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドで別々に処理し、回
復させた後にTNF-α処理をした。オリゴヌクレオチド処理に続き、TNF-αを12お
よび72時間の間の様々な時点で加えた。E-セレクチン細胞表面発現は、TNF-α処
理の5時間後にフローサイトメトリーにより測定した。結果は表５に示す。
【０１１２】 表５ E-セレクチン誘導におけるc-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの効果の経時的変化
ドの効果の経時的変化
【０１１３】
【表５】
【０１１４】 20 nM程度の低濃度のE-セレクチンオリゴヌクレオチド、ISIS 11928（SEQ ID
NO. 1）は、処理後12時間でE-セレクチン細胞表面発現を80％阻害することが分
かった。対して、c-rafおよびHa-rasアンチセンス化合物、SEQ ID NO. 2およびS
EQ ID NO. 4、によるE-セレクチン誘導の最大阻害は、それぞれアンチセンス処
理後48時間で観察された。E-セレクチン誘導のいくつかの阻害は処理後12時間で
観察されたが、この阻害は明らかに最大ではなかった。これらの結果から、c-ra
fおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理の後、HMVECにおけ
るTNF-αによるE-セレクチン誘導の阻害は、減少したc-rafおよびHa-rasタンパ
ク質レベルの結果であることが強く示唆される。
NO. 1）は、処理後12時間でE-セレクチン細胞表面発現を80％阻害することが分
かった。対して、c-rafおよびHa-rasアンチセンス化合物、SEQ ID NO. 2およびS
EQ ID NO. 4、によるE-セレクチン誘導の最大阻害は、それぞれアンチセンス処
理後48時間で観察された。E-セレクチン誘導のいくつかの阻害は処理後12時間で
観察されたが、この阻害は明らかに最大ではなかった。これらの結果から、c-ra
fおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた処理の後、HMVECにおけ
るTNF-αによるE-セレクチン誘導の阻害は、減少したc-rafおよびHa-rasタンパ
ク質レベルの結果であることが強く示唆される。
【０１１５】 実施例５：他の細胞接着分子の誘導に対するc-rafおよびHa-rasアンチセンス
オリゴヌクレオチドの効果 c-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞におけるI
CAM-1およびVCAM-1のTNF-α誘導も調べて、サイトカインシグナル伝達におけるc
-rafおよびHa-rasの役割をさらに同定した。実施例４に記載したように、フロー
サイトメトリー解析を使用してオリゴヌクレオチドをテストした。結果は表６（
ICAM-1）および表７（VCAM-1）に示した。
オリゴヌクレオチドの効果 c-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞におけるI
CAM-1およびVCAM-1のTNF-α誘導も調べて、サイトカインシグナル伝達におけるc
-rafおよびHa-rasの役割をさらに同定した。実施例４に記載したように、フロー
サイトメトリー解析を使用してオリゴヌクレオチドをテストした。結果は表６（
ICAM-1）および表７（VCAM-1）に示した。
【０１１６】 表６ ICAM-1の誘導におけるc-raf およびHa-ras アンチセンスオリゴヌクレオチド
の効果の用量反応
の効果の用量反応
【０１１７】
【表６】
【０１１８】 TNF-αによるICAM-1の誘導も、c-raf（ISIS 12854、SEQ ID NO. 2）およびHa-
ras（ISIS 15168、SEQ ID NO. 4）アンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害
され、最大阻害は40％以上であった。
ras（ISIS 15168、SEQ ID NO. 4）アンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害
され、最大阻害は40％以上であった。
【０１１９】 c-raf およびHa-ras アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた細胞の処理に
より、用量依存性様式でVCAM-1発現も阻害された。結果を表７に示す。 表７ VCAM-1の誘導におけるc-raf およびHa-ras アンチセンスオリゴヌクレオチド
の効果の用量反応
より、用量依存性様式でVCAM-1発現も阻害された。結果を表７に示す。 表７ VCAM-1の誘導におけるc-raf およびHa-ras アンチセンスオリゴヌクレオチド
の効果の用量反応
【０１２０】
【表７】
【０１２１】 TNF-αによるVCAM-1の誘導も、c-raf（ISIS 12854、SEQ ID NO. 2）およびHa-
ras（ISIS 15168、SEQ ID NO. 4）アンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害
された。ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）の最大阻害は70％以上であり、一方ISIS 1
5168（SEQ ID NO. 4）の最大阻害は50％以上であった。
ras（ISIS 15168、SEQ ID NO. 4）アンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害
された。ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）の最大阻害は70％以上であり、一方ISIS 1
5168（SEQ ID NO. 4）の最大阻害は50％以上であった。
【０１２２】 実施例６：細胞接着分子mRNAレベルに対するc-rafおよびHa-rasアンチセンス
オリゴヌクレオチドの効果 ノーザンブロット解析を行い、c-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレ
オチドが、転写レベルで細胞接着分子の誘導を阻害するかどうかを調べた。細胞
をc-raf（ISIS 12854、SEQ ID NO. 2）またはHa-ras（ISIS 15168、SEQ ID NO.
4）アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、48時間回復させた。TNF-αをRNA
解析の2から3時間前に加え、ノーザンブロットをE-セレクチン、ICAM-1、および
VCAM-1に特異的なプローブで行った。E-セレクチンのプローブは、HUMELAM1A（G
enbank寄託番号M24736；SEQ ID NO. 18）に対するプライマーを使用したPCR増幅
によって得られた。
オリゴヌクレオチドの効果 ノーザンブロット解析を行い、c-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレ
オチドが、転写レベルで細胞接着分子の誘導を阻害するかどうかを調べた。細胞
をc-raf（ISIS 12854、SEQ ID NO. 2）またはHa-ras（ISIS 15168、SEQ ID NO.
4）アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、48時間回復させた。TNF-αをRNA
解析の2から3時間前に加え、ノーザンブロットをE-セレクチン、ICAM-1、および
VCAM-1に特異的なプローブで行った。E-セレクチンのプローブは、HUMELAM1A（G
enbank寄託番号M24736；SEQ ID NO. 18）に対するプライマーを使用したPCR増幅
によって得られた。
【０１２３】 ELAM-1のプローブは、以下のプライマーを使用したPCR増幅により得られた。 FORWARD 5'-TTGAAGTCATGATTGCTTCACAGTT-3' SEQ ID NO. 20 REVERSE 5'-TTCTGATTCTTTTGAACTTAAAGGAT-3' SEQ ID NO. 21； ICAM-1のプローブは、以下のプライマーを使用したPCR増幅により得られた。 FORWARD 5'-CGCGGATCCGCGTACTCAGAGTT-3' SEQ ID NO. 22 REVERSE 5'-CGGAATTCCGTTCAGGGAGGCGT-3' SEQ ID NO. 23； VCAM-1のプローブは、以下のプライマーを使用したPCR増幅により得られた。 FORWARD 5'-CTTAAAATGCCTGGGAAGATGGTCGT-3' SEQ ID NO. 24 REVERSE 5'-ATCAAGCATTAGCTACACTTTTGATT-3' SEQ ID NO. 25。 結果は表８に示す。
【０１２４】 表８ E-セレクチン、VCAM-1、およびICAM-1の誘導に対するc-rafおよびHa-rasアン
チセンスオリゴヌクレオチドの効果
チセンスオリゴヌクレオチドの効果
【０１２５】
【表８】
【０１２６】 三つの細胞接着分子のmRNA発現の誘導は、両オリゴヌクレオチドにより減ぜら
れたのに対し、対照オリゴヌクレオチドでの処理はほとんど効果を示さなかった
。mRNAレベルでの各々の細胞接着分子にとっての阻害のレベルは、細胞接着分子
の細胞表面発現に対するc-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果と一致した。
れたのに対し、対照オリゴヌクレオチドでの処理はほとんど効果を示さなかった
。mRNAレベルでの各々の細胞接着分子にとっての阻害のレベルは、細胞接着分子
の細胞表面発現に対するc-rafおよびHa-rasアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果と一致した。
【０１２７】 実施例７：MAPキナーゼ活性に対するc-rafアンチセンスオリゴヌクレオチドの
効果 TNF-αにより刺激されるERK、JNK、およびp38 MAPK活性に対するc-rafアンチ
センスオリゴヌクレオチド（ISIS 12854、SEQ ID NO. 2）の効果を調べるため、
in vitroキナーゼアッセイを、ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）で処理した細胞由来
の抽出物において行った。細胞をオリゴヌクレオチドで処理し、サイトカインで
誘導した。指示された時間で細胞を氷上で溶解し、破片を遠心して除去した。タ
ンパク質濃度をBradfordアッセイにより測定した。タンパク質の等量を含有する
溶解物を、一次抗体-アガロース結合物（ERKおよびp38アッセイ；Santa Cruz Bi
otechnology, Santa Cruz, CA）、あるいはJNK1-特異的あるいはJNK2-特異的抗
体（JNKアッセイ；Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）と共に、4℃で一
晩インキュベートした。
効果 TNF-αにより刺激されるERK、JNK、およびp38 MAPK活性に対するc-rafアンチ
センスオリゴヌクレオチド（ISIS 12854、SEQ ID NO. 2）の効果を調べるため、
in vitroキナーゼアッセイを、ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）で処理した細胞由来
の抽出物において行った。細胞をオリゴヌクレオチドで処理し、サイトカインで
誘導した。指示された時間で細胞を氷上で溶解し、破片を遠心して除去した。タ
ンパク質濃度をBradfordアッセイにより測定した。タンパク質の等量を含有する
溶解物を、一次抗体-アガロース結合物（ERKおよびp38アッセイ；Santa Cruz Bi
otechnology, Santa Cruz, CA）、あるいはJNK1-特異的あるいはJNK2-特異的抗
体（JNKアッセイ；Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY）と共に、4℃で一
晩インキュベートした。
【０１２８】 アイソフォーム-特異的JNKアッセイのため、アガロースビーズに結合した抗ウ
サギIgGをJNK抗体処理および洗浄ステップに続いて細胞抽出物に加え、4℃で2時
間インキュベートした。溶解緩衝液およびキナーゼ緩衝液で洗浄した後、ペレッ
ト状のビーズを1μgの基質（ERKにはElk-1、p38にはATF-2、およびJNK MAPKには
c-Jun）および100αMのATPと共に、37℃で20分間インキュベートした。MAPKおよ
びJNKアッセイキット、ATF-2融合タンパク質およびATF-2、Elk-1リン酸-ATF-2の
抗体は、New England BioLabs（Boston, MA）から購入した。反応を3×SDS試料
緩衝液を加えることにより終了した後、煮沸した。試料を12％ SDS-PAGEゲル上
にロードした。リン酸化された基質に対して特異的な抗体（New England Biolab
s）を用いたウエスタンブロットを行った。結果はECLにより視覚化した。
サギIgGをJNK抗体処理および洗浄ステップに続いて細胞抽出物に加え、4℃で2時
間インキュベートした。溶解緩衝液およびキナーゼ緩衝液で洗浄した後、ペレッ
ト状のビーズを1μgの基質（ERKにはElk-1、p38にはATF-2、およびJNK MAPKには
c-Jun）および100αMのATPと共に、37℃で20分間インキュベートした。MAPKおよ
びJNKアッセイキット、ATF-2融合タンパク質およびATF-2、Elk-1リン酸-ATF-2の
抗体は、New England BioLabs（Boston, MA）から購入した。反応を3×SDS試料
緩衝液を加えることにより終了した後、煮沸した。試料を12％ SDS-PAGEゲル上
にロードした。リン酸化された基質に対して特異的な抗体（New England Biolab
s）を用いたウエスタンブロットを行った。結果はECLにより視覚化した。
【０１２９】 細胞をc-rafアンチセンス化合物、ISIS 12854（SEQ ID NO. 2）で処理し、48
時間回復させ、その時TNF-αを5あるいは15分間加えた後、細胞を溶解させおよ
びキナーゼアッセイを開始させた。特異的抗体-結合アガロースビーズを使用し
てERKおよびp38 MAPKを免疫沈降させ、c-Jun-結合アガロースビーズを使用してJ
NKを沈降させた。適した基質およびATPを免疫沈降したキナーゼ複合体に加えて
、反応混合物をSDS-PAGEで解析した。リン酸化された基質に対する特異的抗体を
用いたウエスタンブロットを行い、比キナーゼ活性を決定した。結果は図３に示
す。
時間回復させ、その時TNF-αを5あるいは15分間加えた後、細胞を溶解させおよ
びキナーゼアッセイを開始させた。特異的抗体-結合アガロースビーズを使用し
てERKおよびp38 MAPKを免疫沈降させ、c-Jun-結合アガロースビーズを使用してJ
NKを沈降させた。適した基質およびATPを免疫沈降したキナーゼ複合体に加えて
、反応混合物をSDS-PAGEで解析した。リン酸化された基質に対する特異的抗体を
用いたウエスタンブロットを行い、比キナーゼ活性を決定した。結果は図３に示
す。
【０１３０】 これらの基質がかなりリン酸化されていることから示されるように、TNF-αに
より15分間インキュベーションした後、3種すべてのキナーゼは活性化された。I
SIS 12854（SEQ ID NO. 2）によるc-rafレベルの阻害により、ERK活性が減少し
た。驚くべきことに、JNK活性もISIS 12854（SEQ ID NO. 2）を用いて細胞を処
理することで阻害された。p38 MAPKの活性化はc-rafアンチセンス処理によって
影響されなかった。
より15分間インキュベーションした後、3種すべてのキナーゼは活性化された。I
SIS 12854（SEQ ID NO. 2）によるc-rafレベルの阻害により、ERK活性が減少し
た。驚くべきことに、JNK活性もISIS 12854（SEQ ID NO. 2）を用いて細胞を処
理することで阻害された。p38 MAPKの活性化はc-rafアンチセンス処理によって
影響されなかった。
【０１３１】 これらの結果は初めて、 c-raf阻害が、JNK経路の抑制によって細胞接着分子
のTNF-α媒介誘導を阻害することを示す。JNK1あるいはJNK2を標的とするアンチ
センスオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO. 6あるいはSEQ ID NO. 7）を、JNK発現
、JNK活性およびTNF-αによるE-セレクチン誘導を阻害する能力のためにテスト
した。
のTNF-α媒介誘導を阻害することを示す。JNK1あるいはJNK2を標的とするアンチ
センスオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO. 6あるいはSEQ ID NO. 7）を、JNK発現
、JNK活性およびTNF-αによるE-セレクチン誘導を阻害する能力のためにテスト
した。
【０１３２】 オリゴヌクレオチド処理、RNA分離およびノーザンブロットを実施例２に記載
したように行った。JNK1のcDNAクローン（Derijard ら., Cell, 1994, 76, 1025
）を放射性標識し、JNK1-特異的プローブとして使用した。JNK2のcDNAクローン
（Kallunkiら, Genes & Development, 1994, 8, 2996）を放射性標識し、JNK2-
特異的プローブとして使用した。図４に示すように、JNK1およびJNK2アンチセン
ス処理により、JNK1およびJNK2 mRNA発現がそれぞれほとんど完全に阻害された
。さらに、両アンチセンスオリゴヌクレオチドは、使用濃度ではアイソフォーム
特異的であった。JNK2アンチセンス分子は、より高いオリゴヌクレオチド濃度で
わずかにJNK1発現を阻害するであろうが、それは、それがその20塩基中17塩基に
おいてJNK1 mRNAと相補的であるという事実による。しかし、テストした濃度で
は、JNK2アンチセンスオリゴヌクレオチドは特異的にJNK2発現を阻害し、JNK1レ
ベルには影響しなかった。図５に示すように、JNK1あるいはJNK2アンチセンスの
どちらかを用いた細胞の処理は、アイソフォーム特異的な様式にてJNK活性のTNF
-α媒介誘導を効果的に減少させた。しかし、 JNK1アンチセンス処理と比較する
と、 JNK2アンチセンス処理により、E-セレクチン細胞表面発現のTNF-α媒介誘
導は実質的により大きく阻害された。結果は表９に示す。これらの結果からさら
に、HMVEC中の細胞接着分子のTNF-α媒介誘導におけるc-rafの関与はJNKの制御
を含むこと、およびこの制御はJNK2アイソフォームに特異的であると信じられる
こと、が確かめられる。
したように行った。JNK1のcDNAクローン（Derijard ら., Cell, 1994, 76, 1025
）を放射性標識し、JNK1-特異的プローブとして使用した。JNK2のcDNAクローン
（Kallunkiら, Genes & Development, 1994, 8, 2996）を放射性標識し、JNK2-
特異的プローブとして使用した。図４に示すように、JNK1およびJNK2アンチセン
ス処理により、JNK1およびJNK2 mRNA発現がそれぞれほとんど完全に阻害された
。さらに、両アンチセンスオリゴヌクレオチドは、使用濃度ではアイソフォーム
特異的であった。JNK2アンチセンス分子は、より高いオリゴヌクレオチド濃度で
わずかにJNK1発現を阻害するであろうが、それは、それがその20塩基中17塩基に
おいてJNK1 mRNAと相補的であるという事実による。しかし、テストした濃度で
は、JNK2アンチセンスオリゴヌクレオチドは特異的にJNK2発現を阻害し、JNK1レ
ベルには影響しなかった。図５に示すように、JNK1あるいはJNK2アンチセンスの
どちらかを用いた細胞の処理は、アイソフォーム特異的な様式にてJNK活性のTNF
-α媒介誘導を効果的に減少させた。しかし、 JNK1アンチセンス処理と比較する
と、 JNK2アンチセンス処理により、E-セレクチン細胞表面発現のTNF-α媒介誘
導は実質的により大きく阻害された。結果は表９に示す。これらの結果からさら
に、HMVEC中の細胞接着分子のTNF-α媒介誘導におけるc-rafの関与はJNKの制御
を含むこと、およびこの制御はJNK2アイソフォームに特異的であると信じられる
こと、が確かめられる。
【０１３３】 表９ E-セレクチンの誘導におけるJNKアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果の用
量反応
量反応
【０１３４】
【表９】
【０１３５】 発明の簡単な説明 本発明は、腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）シグナル伝達分子の一つである、
Ha-ras、c-rafあるいはJNK2の特異的な阻害剤を用いて細胞を処理することを含
む、前記細胞内での細胞接着分子発現をモジュレートする方法を示す。一態様に
おいて、特異的阻害剤はHa-ras、c-rafあるいはJNK2とハイブリダイゼーション
が可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。また、TNF-αシグナル伝達分
子の一つである、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2の特異的な阻害剤を投与すること
を含む、細胞接着分子の発現の変化と関連する炎症性あるいは免疫性の疾患、あ
るいは症状を治療する方法も提供する。
Ha-ras、c-rafあるいはJNK2の特異的な阻害剤を用いて細胞を処理することを含
む、前記細胞内での細胞接着分子発現をモジュレートする方法を示す。一態様に
おいて、特異的阻害剤はHa-ras、c-rafあるいはJNK2とハイブリダイゼーション
が可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。また、TNF-αシグナル伝達分
子の一つである、Ha-ras、c-rafあるいはJNK2の特異的な阻害剤を投与すること
を含む、細胞接着分子の発現の変化と関連する炎症性あるいは免疫性の疾患、あ
るいは症状を治療する方法も提供する。
【配列表】
【図１】 図1は、c-rafおよびa-rafタンパク質レベルに対するc-rafアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの効果を経時的に示すウエスタンブロットである。
ンスオリゴヌクレオチドの効果を経時的に示すウエスタンブロットである。
【図２】 図2は、Ha-rasおよびKi-rasタンパク質レベルに対するHa-rasアン
チセンスオリゴヌクレオチドの効果を経時的に示すウエスタンブロットである。
チセンスオリゴヌクレオチドの効果を経時的に示すウエスタンブロットである。
【図３】 図3は、TNF-α媒介ERK、JNKおよびp38キナーゼ活性に対するc-raf
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すウエスタンブロットである。リン
-基質-特異的（phospho-substrate-specific）抗体を使用して、キナーゼ活性を
解析した。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すウエスタンブロットである。リン
-基質-特異的（phospho-substrate-specific）抗体を使用して、キナーゼ活性を
解析した。
【図４】 図4は、TNF-α媒介JNK1およびJNK2 mRNA発現に対するJNK1およびJN
K2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すノーザンブロットである。
K2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すノーザンブロットである。
【図５】 図5は、TNF-α媒介JNK1およびJNK2キナーゼ活性に対するJNK1およ
びJNK2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すウエスタンブロットである
。リン-基質-特異的抗体を使用してキナーゼ活性を解析した。
びJNK2アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すウエスタンブロットである
。リン-基質-特異的抗体を使用してキナーゼ活性を解析した。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年７月２日（２００１．７．２）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 5/14 5/14 17/04 17/04 17/06 17/06 29/00 29/00 １０１ １０１ 31/00 31/00 35/00 35/00 37/00 37/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チュー，ジアオジン・エス アメリカ合衆国ニュージャージー州07940， マディソン，メイン・ストリート 18，ナ ンバー ３ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 CA09 CA11 CA12 CA20 DA03 HA17 4B065 AA93X AA99Y AB01 AC20 BA01 BA05 BB01 BC01 BD50 CA44 4C084 AA01 AA02 AA03 AA13 AA17 BA44 CA53 CA59 DC50 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA32 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA56 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 NA15 ZA662 ZA892 ZB082 ZB112 ZB132 ZB152 ZB262 ZB312 ZC352 ZC542 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 MA13 MA17 MA22 MA23 MA28 MA31 MA32 MA35 MA36 MA37 MA41 MA43 MA52 MA59 MA60 MA63 MA66 NA14 NA15 ZA66 ZA89 ZB08 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB32 ZC54
Claims (38)
- 【請求項１】 Ha-ras、c-rafおよびJNK2からなる群から選択される、腫瘍壊
死因子アルファシグナル伝達分子の特異的阻害剤を用いて、細胞接着分子を発現
する細胞を処理して、細胞接着分子発現をモジュレートすることを含む、細胞接
着分子発現をモジュレートする方法。 - 【請求項２】 前記の細胞接着分子がE-セレクチン、VCAM-1あるいはICAM-1で
ある、請求項１の方法。 - 【請求項３】 前記の阻害剤が腫瘍壊死因子アルファシグナル伝達分子をコー
ドする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドで
ある、請求項１の方法。 - 【請求項４】 前記の腫瘍壊死因子アルファシグナル伝達分子がHa-rasあるい
はc-rafである、請求項３の方法。 - 【請求項５】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがHa-rasあるいはc-ra
fに対してハイブリダイズ可能である、請求項４の方法。 - 【請求項６】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO. 2あるい
はSEQ ID NO. 4を含む配列を有する、請求項５の方法。 - 【請求項７】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つのホ
スホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項６の方法。 - 【請求項８】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの2'
-メトキシエトキシヌクレオチドを有する、請求項６の方法。 - 【請求項９】 前記の細胞接着分子がE-セレクチンであり、前記の腫瘍壊死因
子アルファシグナル伝達分子がJNK-2である、請求項１の方法。 - 【請求項１０】 前記の阻害剤がJNK-2をコードする核酸と特異的にハイブリ
ダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９の方法。 - 【請求項１１】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO. 7を含
む配列を有する、請求項１０の方法。 - 【請求項１２】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項１１の方法。 - 【請求項１３】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
2'-メトキシエトキシヌクレオチドを有する、請求項１１の方法。 - 【請求項１４】 前記の細胞をc-rafの特異的阻害剤で処理することを含む、
細胞内において、MAPキナーゼの発現を阻害する方法。 - 【請求項１５】 前記の阻害剤がc-rafをコードする核酸と特異的にハイブリ
ダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１４の方法。 - 【請求項１６】 前記のオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO. 2を含む、請求項１
５の方法。 - 【請求項１７】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項１６の方法。 - 【請求項１８】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
2'-メトキシエトキシヌクレオチドを有する、請求項１６の方法。 - 【請求項１９】 細胞接着分子の発現をモジュレートする条件下で、Ha-ras、
c-rafおよびJNK2からなる群から選択される、腫瘍壊死因子アルファシグナル伝
達分子の特異的阻害剤を投与することを含む、前記細胞接着分子の発現の変化と
関連する疾患あるいは症状を治療する方法。 - 【請求項２０】 前記の疾患あるいは症状が炎症性あるいは免疫性の疾患ある
いは症状である、請求項１９の方法。 - 【請求項２１】 前記の疾患が敗血症、慢性関節リウマチ、炎症性の腸疾患、
アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、糖尿病、グレーヴズ病、同種移植拒絶あるいは
癌である、請求項１９の方法。 - 【請求項２２】 前記の阻害剤が腫瘍壊死因子アルファシグナル伝達分子をコ
ードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド
である、請求項１９の方法。 - 【請求項２３】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO. 2、 S
EQ ID NO. 4あるいはSEQ ID NO. 7を含む配列を有する、請求項２２の方法。 - 【請求項２４】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項２３の方法。 - 【請求項２５】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
2'-メトキシエトキシヌクレオチドを有する、請求項２３の方法。 - 【請求項２６】 前記の阻害剤が細胞接着分子の発現をモジュレートする、Ha
-ras、c-rafおよびJNK2からなる群から選択される、腫瘍壊死因子アルファシグ
ナル伝達分子の阻害剤。 - 【請求項２７】 前記の細胞接着分子がE-セレクチン、VCAM-1あるいはICAM-1
である、請求項２６の阻害剤。 - 【請求項２８】 腫瘍壊死因子アルファシグナル伝達分子をコードする核酸と
特異的にハイブリダイズ可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項
２６の阻害剤。 - 【請求項２９】 前記の腫瘍壊死因子アルファシグナル伝達分子がHa-rasある
いはc-rafである、請求項２７の阻害剤。 - 【請求項３０】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがHa-rasあるいはc-
rafに対してハイブリダイズ可能である、請求項２８の阻害剤。 - 【請求項３１】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO. 2ある
いはSEQ ID NO. 4を含む配列を有する、請求項３０の阻害剤。 - 【請求項３２】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項３１の阻害剤。 - 【請求項３３】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
2'-メトキシエトキシヌクレオチドを有する、請求項３１の阻害剤。 - 【請求項３４】 前記の細胞接着分子がE-セレクチンであり、前記の腫瘍壊死
因子アルファシグナル伝達分子がJNK-2である、請求項２６の阻害剤。 - 【請求項３５】 JNK-2をコードする核酸と特異的にハイブリダイズ可能なア
ンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、請求項３４の阻害剤。 - 【請求項３６】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO. 7を含
む配列を有する、請求項３５の阻害剤。 - 【請求項３７】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、請求項３６の阻害剤。 - 【請求項３８】 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも一つの
2'-メトキシエトキシヌクレオチドを有する、請求項３６の阻害剤。
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| US7262173B2 (en) * | 1997-03-21 | 2007-08-28 | Georgetown University | Chemosensitizing with liposomes containing oligonucleotides |
| US6126965A (en) * | 1997-03-21 | 2000-10-03 | Georgetown University School Of Medicine | Liposomes containing oligonucleotides |
| US20030125272A1 (en) * | 2001-11-19 | 2003-07-03 | Karras James G. | Antisense modulation of toll-like receptor 4 expression |
| US20030139359A1 (en) * | 2001-12-04 | 2003-07-24 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression |
| US20030105044A1 (en) * | 2001-10-17 | 2003-06-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of matrix metalloproteinase 1 expression |
| US6214986B1 (en) * | 1998-10-07 | 2001-04-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of bcl-x expression |
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| ES2377847T3 (es) | 1999-01-13 | 2012-04-02 | Bayer Healthcare Llc | Difenil ureas sustituidas con omega-carboxi arilo como agentes inhibidores de la cinasa p38 |
| US8124630B2 (en) | 1999-01-13 | 2012-02-28 | Bayer Healthcare Llc | ω-carboxyaryl substituted diphenyl ureas as raf kinase inhibitors |
| DE10019252A1 (de) * | 2000-04-18 | 2001-10-31 | Klaus Karl Degitz | Polydesoxyribonukleotide zur Hemmung der ICAM-1-Genexpression |
| AU2002223571A1 (en) * | 2000-09-29 | 2002-04-08 | Gsf-Forschungszentrum Fur Umwelt Und Gesundheit, Gmbh | Pharmaceutical compositions comprising polynucleotides encoding a raf protein |
| EP1575984A4 (en) * | 2001-02-16 | 2006-09-06 | Bristol Myers Squibb Co | IDENTIFICATION AND CLONING OF A NEW HUMAN GENE, RET16, PLAYING A ROLE IN THE CASCADE INTRACELLULAR SIGNALING CASCADE |
| DE10110350A1 (de) * | 2001-03-23 | 2002-09-12 | Ulf R Rapp | Nukleinsäure codierend für ein mit VDAC- oder BAX-Kanälen wechselwirkendes Protein |
| DE10114682A1 (de) * | 2001-02-27 | 2002-11-21 | Ulf R Rapp | Verwendung von raf zur Hemmung von bakteriellen Porin-Faktoren |
| US7888324B2 (en) * | 2001-08-01 | 2011-02-15 | Genzyme Corporation | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
| EP1288222A1 (en) * | 2001-09-03 | 2003-03-05 | Yamanouchi Europe B.V. | Peptidic compounds selectively binding to P-selectin |
| DK1478358T3 (da) | 2002-02-11 | 2013-10-07 | Bayer Healthcare Llc | Sorafenibtosylat til behandling af sygdomme kendetegnet ved unormal angiogenese |
| US20040014699A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of PTPRM expression |
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| AU2003226065B2 (en) * | 2002-04-12 | 2009-02-26 | Ludwig Institute For Cancer Research, Ltd | Recombinant anti-interleukin-9 antibodies |
| EP1539689A2 (en) * | 2002-07-19 | 2005-06-15 | Pharmacia Corporation | Antisense modulation of endothelial lipase expression |
| US20040077083A1 (en) * | 2002-10-17 | 2004-04-22 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of histone deacetylase 4 expression |
| US20040115634A1 (en) | 2002-12-11 | 2004-06-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of stat 6 expression |
| US7101978B2 (en) * | 2003-01-08 | 2006-09-05 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
| UY28213A1 (es) | 2003-02-28 | 2004-09-30 | Bayer Pharmaceuticals Corp | Nuevos derivados de cianopiridina útiles en el tratamiento de cáncer y otros trastornos. |
| ES2391087T3 (es) | 2003-04-11 | 2012-11-21 | Medimmune, Llc | Anticuerpos de IL-9 recombinantes y usos de los mismos |
| US7892563B2 (en) * | 2003-05-20 | 2011-02-22 | Wyeth Holdings Corporation | Methods for treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS) |
| WO2004113274A2 (en) | 2003-05-20 | 2004-12-29 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Diaryl ureas with kinase inhibiting activity |
| EA010485B1 (ru) | 2003-07-23 | 2008-10-30 | Байер Фамэсьютиклс Копэрейшн | Производное n,n'-дифенилмочевины, фармацевтическая композиция (варианты) и способ лечения и предупреждения заболеваний и состояний с его использованием (варианты) |
| US7435799B2 (en) * | 2004-01-08 | 2008-10-14 | Applied Molecular Evolution | TNF-α binding molecules |
| US7351739B2 (en) * | 2004-04-30 | 2008-04-01 | Wellgen, Inc. | Bioactive compounds and methods of uses thereof |
| US8101350B1 (en) * | 2004-05-24 | 2012-01-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of exportin 5 expression |
| EP2422811A2 (en) | 2004-10-27 | 2012-02-29 | MedImmune, LLC | Modulation of antibody specificity by tailoring the affinity to cognate antigens |
| US20060258610A1 (en) * | 2005-05-12 | 2006-11-16 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of STAT 6 expression for the treatment of airway hyperresponsiveness |
| JP2006338738A (ja) * | 2005-05-31 | 2006-12-14 | Tdk Corp | 磁気記録媒体、磁気記録再生装置、スタンパ、スタンパの製造方法及び磁気記録媒体の製造方法 |
| EP2043603A4 (en) | 2006-07-11 | 2010-10-27 | Arubor Corp | PREVENTION AND THERAPY OF RHINOSINUSITIS WITH PROINFLAMMATORY CYTOKINHERMERS |
| PL2068889T3 (pl) | 2006-08-10 | 2020-06-29 | Roy C. Levitt | Anakinra do zastosowania do leczenia zespołu zarostowego zapalenia oskrzelików |
| US7923641B2 (en) * | 2006-08-11 | 2011-04-12 | Superior Essex Communications LLP | Communication cable comprising electrically isolated patches of shielding material |
| CN101861168B (zh) | 2007-05-07 | 2014-07-02 | 米迪缪尼有限公司 | 抗-icos抗体及其在治疗肿瘤、移植和自身免疫病中的应用 |
| KR100957555B1 (ko) | 2007-12-28 | 2010-05-11 | 덕성여자대학교 산학협력단 | Ｒａｓ 융합 단백질 |
| BRPI0921845A2 (pt) | 2008-11-12 | 2019-09-17 | Medimmune Llc | formulação aquosa estéril estável, forma de dosagem unitária farmacêutica, seringa pré-carregada, e, métodos para tratar uma doença ou distúrbio, para tratar ou prevenir rejeição, para esgotar células t que expressam icos em um paciente humano, e para interromper arquitetura central germinal em um órgão linfóide secundário de um primata |
Family Cites Families (11)
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|---|---|---|---|---|
| US5591623A (en) * | 1990-08-14 | 1997-01-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide modulation of cell adhesion |
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| CA2111472A1 (en) * | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Brett P. Monia | Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene |
| US5405941A (en) * | 1993-04-15 | 1995-04-11 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | MEKK protein, capable of phosphorylating MEK |
| US5514778A (en) * | 1993-07-01 | 1996-05-07 | Eli Lilly And Company | Anti-picornaviral agents |
| US5656612A (en) * | 1994-05-31 | 1997-08-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression |
| US5563255A (en) * | 1994-05-31 | 1996-10-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression |
| KR960012714B1 (ko) * | 1994-06-29 | 1996-09-24 | 한국과학기술연구원 | SiC 휘스커 강화 세라믹스 복합 재료의 제조 방법 |
| EP0950060A4 (en) * | 1996-12-02 | 2000-07-05 | Dyad Pharmaceutical Corp | COUNTERSTRAIN INHIBITION OF HUMAN ADHESION MOLECULES |
| US5877309A (en) * | 1997-08-13 | 1999-03-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against JNK |
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