KR100957555B1 - Ｒａｓ 융합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Ras 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 N-Ras 단백질의 일부 영역과 H-Ras 단백질의 일부 영역이 결합되어 다양한 종류의 Ras 단백질 신호전달 경로와 암 발생과의 연관 관계를 확인하는데 유용하게 사용될 수 있는 Ras 융합 단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 Ras 융합 단백질을 발현하는 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명의 Ras 융합 단백질은 암의 발생 및/또는 전이를 억제할 수 있는 분자 표적 암치료법의 개발 및 바이오 신약의 발굴에 유용하게 사용될 수 있다.
Ras, 융합 단백질, 암 전이
Description
본 발명은 Ras 융합 단백질에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 N-Ras 단백질의 일부 영역과 H-Ras 단백질의 일부 영역이 결합된 Ras 융합 단백질에 관한 것이다.
Ras 단백질은 세포가 성장하고 분화하는데 중요한 역할을 하는 21 kDa 크기의 단백질로서, 구아닌 뉴클레오타이드와 결합하여 구아노신 트리포스페이트(GTP)를 구아노신 다이포스페이트(GDP)로 가수분해하는 작용을 한다. 이와 같이 Ras 단백질은 세포 내의 특이적인 GTPase 회로를 조절하는 분자 스위치로 작용하므로 세포 신호전달계에서 매우 중요한 역할을 한다(Bourne, H. R., Sanders, D. A., McCormick, F., Nature, 1991, 349, 117).
암을 유발하는 대사경로는 다양하며, 그 중 하나는 비정상적으로 많은 'ras' 유전자의 단백질 산물이 활성화됨으로써 유발된다. 암 전이의 약 30% 정도가 비정상적으로 활성화된 Ras 단백질의 신호전달 경로에 의해 세포가 악성 표현형으로 변화됨으로써 일어나는 것이라 추정된다. 인체에서 발생하는 몇몇 암 세포는 Ras 단백질의 12번째 아미노산 위치에서 돌연변이가 생긴 것이 관찰되는데, 이 돌연변이 로 인해 Ras 단백질 고유의 GTPase 효소 활성이 저해되면 GTP가 계속적으로 결합되어 있는 상태가 되므로 비정상적인 성장 신호가 지속적으로 전달되게 된다. 이러한 신호 전달체계의 이상으로 발암성이 유발되는 것으로 보고되어 있다. 실제로 이들 발암성을 갖는 ras 유전자는 췌장암, 방광암, 폐암 및 피부암 등과 밀접하게 관련이 있는 것으로 알려져 있다(Bos, J. L., Cancer Res., 49, 4682, 1989).
Ras 유전자군에는 N-Ras (Neuroblastoma-Ras, 서열번호 1), H-Ras (Harvey-Ras, 서열번호 2) 및 K-Ras (Kirsten-Ras)의 3가지가 있고, 이들은 모두 189개의 아미노산으로 된 분자량 21 kDa의 단백질을 코딩한다(Barbacid, 1987). 상기 3가지 형태의 Ras 단백질은 아미노-말단의 85개 아미노산 서열은 동일하고 중간의 80개 아미노산 서열은 85% 상동성(homology)을 보이나 카르복시-말단의 서열은 상동성이 매우 낮다. Ras 단백질들은 조직 특이적으로 발생 과정에서 다르게 발현되며, 이들은 카르복시-말단 부위에 지방이 결합됨으로써 세포막에 부착된다. H-Ras 단백질에서 Cys186에 파네실화(farnesylation)된 후 Cys181과 Cys184에 팔미토일화(palmitoylation)가 일어나고, N-Ras 단백질은 Cys181 한 곳에만 팔미토일화 부위를 갖고 있다고 알려져 있다(도 1 및 도 2 참조). 다양한 카르복시-말단 서열로 인한 다른 세포막 부착성의 차이가 H-Ras, N-Ras, K-Ras 단백질에 의한 차별적인 세포활성 원인의 중요한 요인일 것으로 생각된다.
앞선 연구에서, 본 발명자들은 암전이 활성에 있어서 Ras 신호 전달 경로의 역할을 규명하기 위해 H-Ras 선택적 신호전달 경로와 N-Ras 선택적 신호전달 경로 가 MCF10A 세포의 침윤성 및 이동성에 미치는 분자적 기전을 연구한 결과, H-Ras는 침윤성과 이동성을 유도하는 데 반해 N-Ras는 전혀 유도하지 않음을 밝혀낸 바 있다(Int. J. Cancer, 85:176-181, 2000; Cancer Res., 63:5454-5461, 2003). 이러한 결과는 MCF10A 세포에서 H-Ras 선택적인 신호전달 경로와 N-Ras 선택적인 신호전달 경로가 서로 다른 생물학적 전이 활성을나타낸다는 것을 의미한다. 또한, Ras 신호전달 경로의 하위 신호 분자에 관한 선행연구에서는 H-Ras에 의해 p38 MAPK가 선택적으로 활성화되고, 이는 MMP-2의 발현에 영향을 미친다는 것이 보고된 바 있다(Cancer Res. 63:5454-5461, 2003).
상기 연구 결과들은 Ras 신호전달 경로에서 종래에 알려진 이펙터(effector) 결합 부위인 32-40번 아미노산 서열 이외의 부위가 하위 신호망에 영향을 미칠 가능성이 있음을 의미한다. 그러나, 현재까지 H-Ras와 N-Ras의 도메인 선택적인 암전이 차별성에 관한 비교 분석 연구는 보고된 바가 없다.
본 발명은 H-Ras 단백질의 일부와 N-Ras 단백질의 일부가 결합된 융합 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제조하고, 이를 이용하여 Ras 단백질의 신호전달 경로에서 암의 전이에 영향을 미치는 부위를 동정하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 N-Ras 단백질의 일부 영역과 서열번호 2로 기재되는 H-Ras 단백질의 일부 영역이 결합된 융합 단백질을 제공한다.
본 명세서에 있어서, "N"은 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 N-Ras 단백질의 12번째 아미노산인 Gly을 Asp로 치환한 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 단백질을 나타낸다.
또한, "H"는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 H-Ras 단백질의 12번째 아미노산인 Gly을 Asp로 치환한 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 단백질을 나타낸다.
또한, "NH"는 서열번호 3으로 기재되는 단백질의 아미노 말단 1-165 아미노산 서열과 서열번호 4로 기재되는 단백질의 카르복시 말단 166-189 아미노산 서열이 결합한 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 나타낸다.
또한, "HN"은 서열번호 4로 기재되는 단백질의 아미노 말단 1-165 아미노산 서열과 서열번호 3으로 기재되는 단백질의 카르복시 말단 166-189 아미노산 서열이 결합한 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 나타낸다.
또한, "NCH"은 N-Ras의 12번째 아미노산인 Gly을 Asp로 치환한 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 단백질의 카르복시 말단 186-189 아미노산 서열(CAAX)을 N-Ras의 CAAX 부위(CVVM)에서 H-Ras의 CAAX 부위(CVLS)로 치환한 융합 단백질을 나타낸다. 이때, CAAX의 "C"는 시스테인, "A"는 지방족 아미노산, "X"는 세린 또는 메티오닌을 나타내고, CVVM의 "C"는 시스테인, "V"는 발린, "M"은 메티오닌을 나타내며, CVLS의 "C"는 시스테인, "V"는 발린, "L"은 루이신, "S"은 시스테인을 나타낸다. 통상, Ras 단백질의 카르복시 말단 186-189 아미노산을 CAAX 모티프(motif)라고 한다.
또한, "HCN" H-Ras의 12번째 아미노산인 Gly을 Asp로 치환한 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 단백질의 카르복시 말단 186-189 아미노산 서열(CAAX)을 H-Ras의 CAAX 부위(CVLS)에서 N-Ras의 CAAX 부위(CVVM)로 치환한 융합 단백질을 나타낸다. 이때, CAAX의 "C"는 시스테인, "A"는 지방족 아미노산, "X"는 세린 또는 메티오닌을 나타내고, CVVM의 "C"는 시스테인, "V"는 발린, "M"은 메티오닌을 나타내며, CVLS의 "C"는 시스테인, "V"는 발린, "L"은 루이신, "S"은 시스테인을 나타낸다.
또한, "N184H"는 서열번호 3으로 기재되는 단백질의 184번째 아미노산을 루이신에서 시스테인으로 치환한 돌연변이 단백질을 나타낸다.
또한, "H184N"은 서열번호 4로 기재되는 단백질의 184번째 아미노산을 시스테인에서 루이신으로 치환한 돌연변이 단백질을 나타낸다.
본 발명의 융합 단백질은 모 단백질인 N-Ras 단백질 및 H-Ras 단백질과 동일한 189개의 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하다. 예컨대, 융합 단백질의 아미노 말단 부위로 서열번호 1로 기재되는 N-Ras 단백질의 1 내지 n번째 아미노산이 사용된다면, 카르복시 말단 부위는 서열번호 2로 기재되는 H-Ras 단백질의 n+1 내지 189번째 아미노산이 사용된다(상기에서, n은 165 이하의 자연수임). 본 발명의 융합 단백질은 N-Ras 단백질의 아미노 말단 부위와 H-Ras 단백질의 카르복시 말단 부위가 결합된 형태인 것이 바람직하다.
예컨대, 본 발명의 융합 단백질은 N-Ras 단백질의 아미노 말단 1 내지 120번째 아미노산과 H-Ras 단백질의 카르복시 말단 121 내지 189번째 아미노산이 결합된 형태인 것이 바람직하고, N-Ras 단백질의 아미노 말단 1 내지 141번째 아미노산과 H-Ras 단백질의 카르복시 말단 142 내지 189번째 아미노산이 결합된 형태인 것이 보다 바람직하며, N-Ras 단백질의 아미노 말단 1 내지 165번째 아미노산과 H-Ras 단백질의 카르복시 말단 166 내지 189번째 아미노산이 결합된 형태인 것이 가장 바람직하다. 그러나, 융합 단백질의 형성에 사용되는 아미노 말단 N-Ras 단백질과 카르복시 말단 H-Ras 단백질의 조합이 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다. 또한, Ras 단백질의 발현과 암의 전이와의 연관성을 확인하기 위한 목적에서는, 본 발명의 융합 단백질은 12번째 아미노산이 Gly에서 Asp으로 치환된 형태인 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서는 N-Ras 단백질의 12번째 아미노산을 Asp로 치환시킨 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 돌연변이 N-Ras 단백질의 1 내지 165번째 아미노산과 서열번호 4로 기재되는 돌연변이 H-Ras 단백질의 166 내지 189번째 아미노산을 결합시킨 서열번호 5로 기재되는 NH 융합 단백질을 포함하는 8가지 다른 형태의 융합 단백질 및 돌연변이 단백질을 제조하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명의 유전자는 융합 단백질의 제조에 사용되는 아미노 말단의 N-Ras 단백질과 카르복시 말단의 C-Ras 단백질의 구체적인 구성에 따라 그 서열이 다양할 수 있으며, 이는 당업자에게 있어서 자명하다. 또한, 특정한 아미노산을 코딩할 수 있는 염기의 코돈(codon)이 복수 개일 경우에는, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열도 이에 따라 다양할 수 있으며, 이 또한 당업자에게 있어서 자명하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 서열번호 5로 기재되는 융합 단백질을 코딩하는 서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터의 제조에 사용될 수 있는 모 벡터(vector)에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 원핵생물 또는 진핵생물 형질전환용 벡터가 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 서열번호 7로 기재되는 유전자를 pcDNA 3.1+ 벡터에 삽입시킨 재조합 발현 벡터를 제조하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 형질전환체는 상기 재조합 발현 벡터를 임의의 원핵세포 또는 진핵세포에 도입함으로써 용이하게 제조될 수 있으며, 특정한 벡터를 세포내로 도입시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법의 예로는 리포펙타민(Lipofectamine) 방법 등이 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 상기 재조합 발현 벡터를 리포펙타민 방법을 이용하여 유방 상피세포인 MCF10A 세포주에 도입한 형질전환체를 제조하였다(도 5 및 도 6 참조).
암전이 활성에 있어서의 Ras 단백질 신호 전달 경로의 역할을 규명하기 위하여 H-ras 선택적 신호망과 N-ras 선택적 신호망이 MCF10A 세포의 침윤성 및 이동성에 미치는 분자적 기전을 연구한 결과, H-Ras 단백질은 침윤성과 이동성을 유도하는 데 반하여 N-Ras 단백질은 침윤성과 이동성을 전혀 유도하지 않는다는 것이 보고되어 있다(Int. J. Cancer, 85:176-181, 2000; Cancer Res., 63:5454-5461, 2003). 이러한 선행연구 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 N-Ras와 H-Ras의 아미노 말단 1-165 아미노산 서열 및 카르복시 말단 166-189 아미노산 서열을 N-Ras/H-Ras 형태 또는 H-Ras/N-Ras 형태로 연결시킨 융합 단백질을 제작하였고, 이 융합 단백질을 인간 유방 상피세포에 도입시킨 형질전환 세포주를 구축하여 암의 전이에 Ras 단백질의 어떤 부위가 관여하는지를 확인하였다.
각 형질전환 세포주의 이동성 및 침윤성을 측정한 결과, HN와 HCN의 융합 단백질이 도입된 세포의 침윤성과 이동성은 감소하였고, 반대로 NH의 융합 단백질이 도입된 세포의 침윤성과 이동성은 증가하였다(도 7 및 도 8 참조). 이는 H-Ras 단백질에 의해 유도되는 유방 상피세포의 전이능에 부분적으로는 CAAX 도메인도 관여 를 하지만, H-Ras 단백질의 166-189번째 아미노산이 전이능에 필수적이라는 것을 의미한다.
제작된 H-Ras/N-Ras 융합 단백질 및 이를 발현하는 형질전환체는 H-Ras 특이적인 암 전이 억제를 위한 분자 표적 암 치료법 개발에 사용될 수 있으며, 암 전이에 관련된 신호 분자들간의 연관성을 파악하고 그 작용점을 발굴함으로써, 암 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 Ras 융합 단백질은 다양한 종류의 Ras 단백질의 신호전달 경로와 암 발생과의 연관 관계를 확인하는데 유용하며, 이를 이용하여 암의 발생 및/또는 전이를 억제할 수 있는 분자 표적 암치료법의 개발 및 바이오 신약의 발굴에 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: H-
Ras
/N-
Ras
융합 단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 발현 벡터의 제조
<1-1> 융합 단백질 및 이를 코딩하는 유전자의 제조
본 발명자들은 H-Ras 특이적인 전이능에 관여하는 미세 구조를 분석하기 위하여, 서열번호 1로 기재되는 N-Ras의 12번째 아미노산이 Gly에서 Asp으로 바뀐 서 열번호 3으로 기재되는 활성화된 N-Ras, 서열번호 2로 기재되는 H-Ras의 12번째 아미노산이 Gly에서 Asp로 바뀐 서열번호 4로 기재되는 활성화된 H-Ras 및 H-Ras와 N-Ras의 고도가변(hypervariable) 카르복시 말단 영역(166-189)을 상호 교체한 H-Ras/N-Ras 융합 단백질 키메라(chimera)와 팔미토일화 부위 또는 CAAX 모티프의 아미노산을 바꾼 돌연변이 단백질을 제작하였다(도 3 참조). 이를 위하여, 먼저 H-ras 또는 N-ras 유전자가 삽입되어 있는 pcDNA 3.1+ 벡터들(Guthrie cDNA Resource Center, USA)을 이용하여 H-ras 및 N-ras 유전자를 PCR로 분리하였다(약 570 bp의 단편).
<1-1-1> H,
HCN
및
H184N
의 제조
H-ras 유전자를 주형으로 사용하여 H, HCN 및 H184N을 제조하였다. PCR을 위한 증폭 반응액은 2 ㎕의 10 X 농축반응용액, 1.5㎕의 10 mM dNTP, 1.5 ㎕의 25 mM MgCl2 , 1 ㎕의 H-ras 유전자, 1 ㎕의 Taq 중합효소, 표 1에 제시한 각각의 전방(forward) 프라이머 1 ㎕와 후방(reverse) 프라이머 1.5 ㎕ 및 10.5 ㎕의 증류수를 가하여 제조하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 유지한 후, 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 45초를 30회 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 유지하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 그 결과, 약 570 bp의 유전자가 증폭되었다.
<1-1-2> N,
NCH
및
N184H
의 제조
N-ras 유전자를 주형으로 사용하여 N, NCH 및 N184H을 제조하였다. PCR을 위한 증폭 반응액은 2 ㎕의 10 X 농축반응용액, 1.5 ㎕의 10 mM dNTP, 1.5 ㎕의 25 mM MgCl2 , 1 ㎕의 N-ras 유전자, 1 ㎕의 Taq 중합효소, 표 1에 제시한 각각의 전방 프라이머 1 ㎕와 후방 프라이머 1.5 ㎕ 및 10.5 ㎕의 증류수를 가하여 제조하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 유지한 후, 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 45초를 30회 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 유지하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 그 결과 약 570bp의 유전자가 증폭되었다.
<1-1-3>
NH
의 제조
아미노 말단 1-165 아미노산 부분을 코딩하는 유전자(약 462bp)는 N-Ras 유전자를 주형으로 사용하여 증폭하였다. PCR을 위한 증폭 반응액은 2 ㎕의 10 X 농축반응용액, 1.5 ㎕의 10 mM dNTP, 1.5 ㎕의 25 mM MgCl2 , 1 ㎕의 N-ras 유전자, 1 ㎕의 Taq 중합효소, 표 1에 제시한 NH-1 전방 프라이머 1 ㎕와 후방 프라이머 1.5 ㎕ 및 10.5 ㎕의 증류수를 가하여 제조하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 유지한 후, 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 45초를 30회 반복 수행하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 유지하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
다음으로, 카르복시 말단 166-189 아미노산 부분을 코딩하는 유전자(약 108 bp)는 H-Ras를 주형으로 사용하여 증폭하였다. PCR을 위한 증폭 반응액은 2 ㎕의 10 X 농축반응용액, 1.5 ㎕의 10 mM dNTP, 1.5 ㎕의 25 mM MgCl2 , 1 ㎕의 H-ras 유전자, 1 ㎕의 Taq 중합효소, 표 1에 제시한 NH-2 전방 프라이머 1 ㎕와 후방 프라이머 1.5 ㎕ 및 10.5 ㎕의 증류수를 가하여 제조하였다. 상기 반응액을 94℃에서 5분간 유지한 후, 94℃ 45초, 55℃ 45초, 72℃ 45초를 30회 반복 수행하였고, 마지 막으로 72℃에서 7분간 유지하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
<1-1-4>
HN
의 제조
아미노 말단 1-165 아미노산 부분을 코딩하는 유전자(약 462bp)는 H-Ras 유전자를 주형으로 사용하여 증폭하고, 카르복시 말단 166-189 아미노산 부분을 코딩하는 유전자(약 108 bp)는 N-Ras 유전자를 주형으로 사용한 것을 제외하고는 상기 NH와 동일한 방법에 따라 HN 유전자를 증폭하였다.
상기에서 증폭된 각각의 키메라 및 돌연변이 단백질의 유전자를 PCR 정제 kit(Promega,USA)을 사용하여 정제한 뒤 20㎕의 TE 완충용액에 녹여 다음 단계에 사용하였다.
<1-2> 발현 벡터의 제조
상기에서 증폭된 유전자를 벡터(pcDNA 3.1+)에 삽입하여 발현 벡터를 제조하였다. 증폭된 유전자와 벡터(pcDNA 3.1+)를 제한효소인 BamHI과 XhoI를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 절단한 뒤, 1% 아가로즈 젤 상태에서 분리하였다. 절단된 0.1 ㎍의 유전자와 0.1 ㎍의 벡터를 1 ㎕의 10X 연결반응용액과 0.5㎕ 리가제(Promega, USA)를 넣고 총 부피가 10 ㎕가 되도록 증류수를 가한 후 4℃에서 18시간동안 반응시켜 융합 단백질을 포함하는 발현 벡터를 제조하였다(도 4 참조). 이때, H-Ras와 N-Ras의 고도가변 영역(166-189)을 서로 교체한 H-Ras/N-Ras 키메라의 경우에는 H-Ras 또는 N-Ras 단백질의 아미노 말단 1-165 아미노산 부분(약 462 bp) 및 카르복시 말단 166-189 아미노산 부분(약 108 bp)을 각각 증폭한 후, 아미노 말단 1-165 아미노산 부분(약 462 bp)은 BamHI과 EcoRV로 절단하고, 카르복시 말단 166-189 아미노산 부분(약 108 bp)은 EcoRV와 XhoI으로 절단한 뒤 아가로즈 젤 상태에서 분리하였다. 먼저 벡터를 BamHI과 EcoRV로 절단하여 아미노 말단 1-165 아미노산 부분(약 462 bp)을 삽입하였고, 삽입이 확인된 벡터를 다시 한번 EcoRV와 XhoI으로 절단한 뒤 카르복시 말단 166-189 아미노산 부분(약 108 bp)을 삽입하여, H-ras/N-ras 형태 또는 N-ras/H-ras 형태로 유전자 단편을 연결시켰다. 이 반응액을 대장균 DH5α 컴피턴트(competent) 세포에 첨가하여 대장균을 형질전환 시킨 뒤 엠피실린(50 ㎍/㎖)을 포함하는 LB 평판배지에 배양하여 대장균 형질전환체를 선별하였다. 최종적으로 대장균 형질전환체의 플라스미드 DNA를 분리하고 DNA 서열을 분석하여 제조된 8가지 발현 벡터들이 모두 원하는 대로 유전자 서열이 변형되어 있음을 확인하였다.
실시예
2: 융합 단백질을 발현하는 형질전환 세포주의 구축
실시예 <1-2>에서 제조한 H-Ras/N-Ras 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 유방 상피세포인 MCF10A 세포(Dr. D. Lowy, NCI, Bethesda, MD)에 도입하였다. 6-웰 플레이트에 MCF10A 세포를 3.5×105 세포/웰로 도말하여 80-90% 콘플루언트(confluent)하게 배양하였다. 배양한 세포를 PBS (phosphate-buffered saline)로 2회 세척하여 혈청을 제거한 후, 상기 H-Ras/N-Ras 키메라 및 돌연변이 단백질을 포함하는 발현벡터를 넣은 리포펙타민 2000 혼합액(Invitogen, Carlsbad, CA)을 넣고 6시간동안 배양한 다음 완전한 배지(complete media)(5% horse serum, 0.5 ㎍/㎖ hydrocortisone, 10 ㎍/㎖ insulin, 20 ng/㎖ EGF, 0.1 ㎍/㎖ cholera enterotoxin, 100 units/㎖ penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamine 및 0.5 ㎍/㎖ amphotericin B를 첨가한 DMEM/F12 배지)로 교환하였다. 18시간 이상 배양하여 세포를 안정화시킨 뒤 세포를 떼어내어 100 ㎜ 배양접시로 옮겼고, 2-3일에 한번씩 400 ㎍/㎖의 G418 배지(400 ㎍/㎖ G418, 5% horse serum, 0.5 ㎍/㎖ hydrocortisone, 10 ㎍/㎖ insulin, 20 ng/㎖ EGF, 0.1 ㎍/㎖cholera enterotoxin, 100 units/㎖ penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamine 및 0.5 ㎍/㎖ amphotericin B를 첨가한 DMEM/F12 배지)로 교환해 주었다. 약 한달 동안 세포들을 배양한 후 클론이 형성되면 클로닝 링(cloning ring)을 이용하여 단일클론들을 선별하였다. 구체적으로, 약 한달 동안 배양하여 G418에 저항능력이 있는 클론이 형성되면 각 클론 위에 클로닝 링을 올려놓고, 링 안쪽에 트립신-EDTA를 첨가하여 37℃ 배양기에 넣은 뒤 세포가 배양접시에서 떨어질 때까지 기다렸다. 클론이 배양접시에서 떨어지면 형성된 각각의 클론을 서로 다른 배양접시에 옮겨 배양한 뒤 보관하였다(Moon et al., Int. J. Cancer, 85, 176-181, 2000).
이후, 선별된 형질전환 세포주가 융합 단백질 및 돌연변이 단백질을 올바르게 발현하는지 여부를 H-Ras 또는 N-Ras 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 면역블롯 분석(immunoblot analysis)으로 확인하였다(도 5 및 도 6).
실시예
3: H-
Ras
/N-
Ras
융합 단백질을 생산하는 형질전환 세포의 차별적 침윤성 및 이동성 연구
<3-1> 침윤성 연구(
in
vitro
invasion
assay
)
침윤성 연구는 지름이 6.5 ㎜이고 세공 크기(pore size)가 8.0 ㎛인 24-웰 트랜스웰 유닛(transwell unit)을 사용하여 침윤성 연구를 시행하였다(Albini et al., Cancer Res., 47, 3239-3245, 1987). 먼저, 필터의 바깥쪽 바닥 부분에 0.5 ㎎/㎖의 타입 I 콜라겐을 코팅하고 공기 중에서 1시간 정도 건조시킨 다음, 다 마르면 안쪽 부분에 0.5 ㎎/㎖의 재구성된 기저막 물질(Matrigel)로 코팅하였다. 24-웰의 바닥에는 0.1%의 BSA(Sigma)를 함유한 배지를 600 ㎖ 넣고 트랜스웰의 안쪽에는 세포 (5×104)를 혈청이 포함되지 않은 배지(DMEM/F12, 100 units/㎖ penicillin-streptomycin) 100 ㎕에 잘 혼합하여 넣었다. 37°C, 5% CO2 배양기에 넣고 17시간 동안 배양한 다음, 메탄올에 1분간 담궈서 씻어낸 후 10분 동안 헤마토실린(hematoxylin)으로 세포막 염색을 하고 다시 에오신(eosin)으로 4분 동안 핵염색을 하였다. 필터의 안쪽 부분을 면봉을 이용하여 조심스럽게 안쪽에 남은 세포를 모두 제거하고 한 시간 가량 실온에서 건조시킨 다음, 그 필터를 잘라내어 자일렌(xylene)에 넣어서 불순물을 제거하였다. 이를 슬라이드 글라스(slide glass)에 놓고 그 위에 캐나다 발삼(Canada balsam) 한 방울을 떨어뜨린 후 커버 글라스 (cover glass)를 덮어서 현미경으로 관찰하였다. 400배율 현미경으로 임의의 13곳에서 세고을 통과한 세포 수를 세어서 평균을 내었다.
<3-2> 이동성 연구(
in
vitro
migration
assay
)
지름이 6.5 ㎜이고 세공 크기가 8.0 ㎛인 24-웰 트랜스웰 유닛을 사용하여 이동성 연구를 시행하였다. 필터의 바깥 부분은 0.5 ㎎/㎖의 타입 I 콜라rps으로 코팅한 후 공기 중에서 1시간 동안 건조시켰다. 24-웰의 바닥에는 0.1%의 BSA를 함유한 배지를 600 ㎖ 넣고 트랜스웰 안쪽에는 세포(5×104)를 혈청이 포함되지 않은 배지(DMEM/F12, 100 units/㎖ penicillin-streptomycin) 100 ㎕에 잘 혼합하여 넣었다. 이 후 과정은 침윤성 연구방법과 동일하게 수행하였다.
그 결과, H에 비해 HN 및 HCN의 침윤성과 이동성이 감소되었으며, 그 중에서도 HN이 HCN보다 더 감소되었다(도 7). 이는 H-Ras의 166-189번째 아미노산 및 CAAX (H-Ras: CVLS, N-Ras: CVVM) 부위가 침윤성 및 이동성에 필수적이며, 그 중에서도 H-Ras 단백질의 166-189번째 아미노산이 더 중요하게 작용한다는 것을 의미한다. 또한, N에 비해 NH가 침윤성 및 이동성이 증가되었는데(도 8), 이는 H-Ras 단백질의 166-189번째 아미노산이 침윤성 및 이동성에 필수적이라는 것을 나타낸다.
도 1은 H-Ras와 N-Ras 단백질의 아미노산 서열을 비교한 것으로서, "*"은 H-Ras/N-Ras의 공통적인 아미노산, "Hypervariable"은 H-Ras/N-Ras의 고도가변 영역, "◆"은 팔미토일화 부위(Cys181, Cys184)를 나타낸다.
도 2는 Ras 단백질들의 구조를 도식화한 것으로서, 32-40은 이펙터(effector) 결합 도메인을 나타내고, "*"은 파네실화 및 팔미토일화 부위를 나타내며, 아미노 말단 1 내지 86번째까지는 100% 동일하고, 87 내지 165번째까지는 85% 상동성이 있으며, 166 내지 189번째까지는 고도가변 영역임을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조한 융합 단백질 및 돌연변이 단백질의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 H-Ras/N-Ras 융합 단백질의 구조와, DNA 서열분석에 의해 이를 확인하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 H-Ras/N-Ras 융합 단백질 또는 N-Ras 돌연변이 단백질의 구조를 보여주는 개략도(A), 상기 단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포의 세포학적 형태(B) 및 면역블롯 분석(C) 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 N-Ras/H-Ras 융합 단백질 또는 N-Ras 돌연변이 단백질의 구조를 보여주는 개략도(A), 상기 단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포의 세포학적 형태(B) 및 면역블롯 분석(C) 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 H-Ras/N-Ras 융합 단백질 또는 H-Ras 돌연변이 단백질을 발현하는 벡 터로 형질전환된 세포의 침윤성(A) 및 이동성(B) 연구 결과를 보여주는 그래프로서, HN 및 HCN 융합 단백질을 발현하는 형질전환 세포주에서 침윤성 및 이동성이 유의성 있게 감소하였음을 보여주며, "**"은 대조군에 비해 통계학적으로 차이가 있음을 나타낸다(p <0.01, two-tailed Student's t test).
도 8은 N-Ras/H-Ras 융합 단백질 또는 N-Ras 돌연변이 단백질을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포의 침윤성(A) 및 이동성(B) 연구 결과를 보여주는 그래프로서, NH 융합 단백질을 발현하는 형질전환 세포주에서 침윤성 및 이동성이 유의성 있게 감소하였음을 보여주며, "**"은 대조군에 비해 통계학적으로 차이가 있음을 나타낸다(p <0.01, two-tailed Student's t test).
<110> Duksung Women's University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Ras Fusion Protein
<130> 2007-11-29
<160> 29
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> DOMAIN
<222> (166)..(189)
<223> hypervariable domain
<220>
<221> SITE
<222> (32)..(40)
<223> effector binding site
<220>
<221> SITE
<222> (181)
<223> palmitoylation site
<400> 1
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 2
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> DOMAIN
<222> (166)..(189)
<223> hypervariable domain
<220>
<221> SITE
<222> (32)..(40)
<223> effector binding site
<220>
<221> SITE
<222> (181)
<223> palmitoylation site
<220>
<221> SITE
<222> (184)
<223> palmitoylation site
<400> 2
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 3
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (12)
<223> mutation site
<400> 3
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 4
<211> 189
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SITE
<222> (12)
<223> mutation site
<400> 4
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 5
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fusion protein consisting of N-terminal amino acids of N-Ras
protein and C-terminal amino acids of H-Ras protein
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(165)
<223> N-Ras part
<220>
<221> DOMAIN
<222> (166)..(189)
<223> H-Ras part
<220>
<221> SITE
<222> (12)
<223> mutation site
<400> 5
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys
115 120 125
Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu
165 170 175
Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser
180 185
<210> 6
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fusion protein consisting of N-terminal amino acids of H-Ras
protein and C-terminal amino acids of N-Ras protein
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)..(165)
<223> H-Ras part
<220>
<221> DOMAIN
<222> (166)..(189)
<223> N-Ras part
<220>
<221> SITE
<222> (12)
<223> mutation site
<400> 6
Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Asp Gly Val Gly Lys
1 5 10 15
Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr
20 25 30
Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly
35 40 45
Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr
50 55 60
Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys
65 70 75 80
Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr
85 90 95
Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val
100 105 110
Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg
115 120 125
Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val
145 150 155 160
Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp
165 170 175
Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met
180 185
<210> 7
<211> 567
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a gene coding the fusion protein represented by SEQ. ID. No. 5
<400> 7
atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccgatggtg ttgggaaaag cgcactgaca 60
atccggctaa tccagaacca ctctgtagat gaatatgatc ccaccataga ggattcttac 120
agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc tgtttgttgg acatactgga tacagctgga 180
caagaagagt acagtgccat gagagaccaa tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt 240
gtatttgcca tcaataatag caagtcattt gcggatatta acctctacag ggagcagatt 300
aagcgagtaa aagactcgga tgatgtacct atggtgctag tgggaaacaa gtgtgatttg 360
ccaacaagga cagttgatac aaaacaagcc cacgaactgg ccaagagtta cgggattcca 420
ttcattgaaa cctcagccaa gaccagacag ggtgttgaag atgcctccta cacgttggtg 480
cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc 540
tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcc 567
<210> 8
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccggcggtg tgggcaagag tgcgctgacc 60
atccagctga tccagaacca ttttgtggac gaatacgacc ccactataga ggattcctac 120
cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga taccgccggc 180
caggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg cttcctgtgt 240
gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag ggagcagatc 300
aaacgggtga aggactcgga tgacgtgccc atggtgctgg tggggaacaa gtgtgacctg 360
gctgcacgca ctgtggaatc tcggcaggct caggacctcg cccgaagcta cggcatcccc 420
tacatcgaga cctcggccaa gacccggcag ggagtggagg atgccttcta cacgttggtg 480
cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc ctgatgagag tggccccggc 540
tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcc 567
<210> 9
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
atgacggaat ataagctggt ggtggtgggc gccggcggtg ttgggaaaag cgcactgaca 60
atccagctaa tccagaacca ctttgtagat gaatatgatc ccaccataga ggattcttac 120
agaaaacaag tggttataga tggtgaaacc tgtttgttgg acatactgga tacagctgga 180
caagaagagt acagtgccat gagagaccaa tacatgagga caggcgaagg cttcctctgt 240
gtatttgcca tcaataatag caagtcattt gcggatatta acctctacag ggagcagatt 300
aagcgagtaa aagactcgga tgatgtacct atggtgctag tgggaaacaa gtgtgatttg 360
ccaacaagga cagttgatac aaaacaagcc cacgaactgg ccaagagtta cgggattcca 420
ttcattgaaa cctcagccaa gaccagacag ggtgttgaag atgcttttta cacactggta 480
agagaaatac gccagtaccg aatgaaaaaa ctcaacagca gtgatgatgg gactcagggt 540
tgtatgggat tgccatgtgt ggtgatg 567
<210> 10
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for HG12D protein (H)
<400> 10
ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for HG12D protein (H)
<400> 11
agactcgagc gtcaggagag 20
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for NG12D protein (N)
<400> 12
ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for NG12D protein (N)
<400> 13
agactcgagc gtcacatcac cac 23
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for N-terminal amino acids of HN fusion protein
(HN-1)
<400> 14
ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for N-terminal amino acids of HN fusion protein
(HN-1)
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ggcgatatcc tccactcc 18
<210> 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for C-terminal amino acids of HN fusion protein
(HN-2)
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gaagatatcg ctttttac 18
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<213> Artificial Sequence
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<223> reverse primer for C-terminal amino acids of HN fusion protein
(HN-2)
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agactcgagc gtcacatcac cac 23
<210> 18
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for N-terminal amino acids of NH fusion protein
(NH-1)
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ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for N-terminal amino acids of NH fusion protein
(NH-1)
<400> 19
agcgatatct tcaacacc 18
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for C-terminal amino acids of NH fusion protein
(NH-2)
<400> 20
gaggatgcct cctac 15
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for C-terminal amino acids of NH fusion protein
(NH-2)
<400> 21
agactcgagc gtcaggagag 20
<210> 22
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for HCN fusion protein
<400> 22
ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for HCN fusion protein
<400> 23
agactcgagc gtcacatcac cac 23
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for NCH fusion protein
<400> 24
ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for NCH fusion protein
<400> 25
agactcgagc gtcaggagag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for H184N protein
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ctcggatcca tgacggaata taagctggtg ctgctgggcg ccgatggt 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for H184N protein
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agactcgagc gtcaggagag cacacacttc aag 33
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<213> Artificial Sequence
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<223> forward primer for N184H protein
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for N184H protein
<400> 29
agactcgagc gttacatcac cacacatggg cat 33
Claims (12)
- 삭제
- N-Ras 단백질의 1 내지 120번째 아미노산과 H-Ras 단백질의 121 내지 189번째 아미노산이 결합된 형태인 Ras 융합 단백질.
- N-Ras 단백질의 1 내지 141번째 아미노산과 H-Ras 단백질의 142 내지 189번째 아미노산이 결합된 형태인 Ras 융합 단백질.
- 삭제
- 청구항 2 또는 청구항 3에 있어서,상기 융합 단백질의 12번째 아미노산이 Gly에서 Asp으로 치환된 형태인 Ras 융합 단백질.
- N-Ras 단백질의 1 내지 n번째 아미노산과 H-Ras 단백질의 n+1 내지 189번째 아미노산이 결합된 형태로서, 상기 n은 165 이하의 자연수인 Ras 융합 단백질에 있어서, 상기 융합 단백질의 12번째 아미노산이 Gly에서 Asp으로 치환된 형태인 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 Ras 융합 단백질.
- 청구항 2, 청구항 3 및 청구항 5 중 어느 한 항에 따른 Ras 융합 단백질을 코딩하는 유전자.
- 서열번호 5로 기재되는 Ras 융합 단백질을 코딩하는 유전자.
- 청구항 8에 있어서,서열번호 7로 기재되는 염기서열을 갖는 유전자.
- 청구항 7의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 청구항 10의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
- 청구항 11에 있어서,상기 재조합 발현 벡터를 유방 상피세포인 MCF10A 세포에 도입한 형질전환체.
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| KR100236470B1 (ko) * | 1997-04-18 | 2000-01-15 | 성재갑 | 파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법 |
| US6114517A (en) | 1998-12-10 | 2000-09-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Methods of modulating tumor necrosis factor α-induced expression of cell adhesion molecules |
| WO2007133835A2 (en) | 2006-03-27 | 2007-11-22 | Globeimmune, Inc. | Ras mutation and compositions and mehods related thereto |
-
2007
- 2007-12-28 KR KR1020070140139A patent/KR100957555B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100236470B1 (ko) * | 1997-04-18 | 2000-01-15 | 성재갑 | 파네실 전이효소 저해제의 효능을 평가할 수 있는Ras 단백질을 생산하는 Rat 2 피브로블라스트 세포주 및 그의 제조방법 |
| US6114517A (en) | 1998-12-10 | 2000-09-05 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Methods of modulating tumor necrosis factor α-induced expression of cell adhesion molecules |
| WO2007133835A2 (en) | 2006-03-27 | 2007-11-22 | Globeimmune, Inc. | Ras mutation and compositions and mehods related thereto |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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