JP2002526093A

JP2002526093A - ｂｃｌ−ｘ発現のアンチセンスモジュレーション

Info

Publication number: JP2002526093A
Application number: JP2000574543A
Authority: JP
Inventors: ベネット，シー・フランク; ディーン，ニコラス・エム; モニア，ブレット・ピー; ニッコロフ，ブライアン・ジェイ; ザン，キンキン
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-10-07
Filing date: 1999-09-28
Publication date: 2002-08-20
Anticipated expiration: 2019-09-28
Also published as: EP1507005A2; US20030191300A1; EP1119579A4; CA2345354C; JP4223687B2; AU755515B2; US20010007025A1; WO2000020432A1; AU755515C; US7148204B2; AU6271099A; EP1119579A1; EP1507005A3; CA2345354A1; US6214986B1

Abstract

(57)【要約】 bcl-xの発現をモジュレーションするための組成物および方法が提供される。bcl-xをコードする核酸を標的とする、アンチセンス化合物、特にアンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。bcl-x発現モジュレーションのため、およびbcl-x発現と関連する疾患の治療のため、これらの化合物を用いる方法もまた、提供される。細胞をアポトーシス刺激に感作する方法もまた、提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、1999年3月26日に提出された米国特許出願09／277,020および1998年
10月7日に提出された米国特許出願09／167,921の一部継続出願である。米国特許
出願09／277,020は、それ自体、米国特許出願09／167,921の一部継続出願である
。

【０００２】発明の分野本発明は、bcl-xの発現をモジュレーションするための組成物および方法を提
供する。特に、本発明は、ヒトbcl-xをコードする核酸と特異的にハイブリダイ
ズ可能な、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。こうしたオ
リゴヌクレオチドは、bcl-xの発現をモジュレーションすることが示されてきて
いる。

【０００３】発明の背景プログラム細胞死、またはアポトーシスは、細胞数の調節が細胞増殖および細
胞死の間の平衡であるため、成長および発生の本質的な特徴である。アポトーシ
スは受動的よりむしろ能動的な過程であり、いくつかの外部または内部シグナル
のいずれでもよいものの結果として、細胞自殺を生じる。アポトーシス細胞死は
、核凝縮、ヌクレオソームの間隔でのDNAのヌクレオチド鎖分解（「ラダー化（l
addering）」）および形質膜の小疱化（blebbing）により特徴付けられる。プロ
グラム細胞死は、例えば免疫系発展および神経系発生において、本質的な役割を
果たす。前者では、自己反応性抗原受容体を提示するT細胞がアポトーシスによ
り除去される。後者では、神経構造のかなりの再成形は、部分的にアポトーシス
を通じ、起こる。

【０００４】アポトーシスに関連すると考えられる遺伝子および遺伝子産物の数は増加して
きている。これらの1つがbcl-2であり、これはアポトーシスを遮断するまたは遅
延させることが示された、細胞内膜タンパク質である。bcl-2の過剰発現は、過
形成、自己免疫、および化学療法により誘導されるものを含むアポトーシスに対
する耐性に関連することが示されてきている（Fangら, J. Immunol. 1994, 153,
4388-4398）。bcl-2関連遺伝子のファミリーが記載されてきている。bcl-2ファ
ミリーメンバーはすべて、2つの非常に保存されているドメイン、BH1およびBH2
を共有する。これらのファミリーメンバーには、限定されるわけではないが、A-
1、mcl-1、baxおよびbcl-xが含まれる。bcl-xは、bcl-2とのその配列相同性によ
り、低ストリンジェンシーでbcl-2 cDNAプローブを用い、単離された。bcl-xは
、アポトーシスのbcl-2独立制御因子として機能することが見出された（Boiseら
, Cell, 1993, 74, 597-608）。bcl-xの2つのアイソフォームがヒトで報告され
た。bcl-xl（長）は、非常に保存されているBH1およびBH2ドメインを含む。IL-3
依存細胞株にトランスフェクションすると、bcl-xlは、bcl-2と類似の方式で、
増殖因子枯渇中のアポトーシスを阻害した。対照的に、選択的スプライシングに
より産生され、そしてBH1およびBH2ドメインを含むエクソン1の63アミノ酸の領
域を欠く、bcl-xの短いアイソフォーム、bcl-xsは、bcl-2またはbcl-xlのいずれ
かの抗アポトーシス効果に拮抗する。Boiseら, Cell, 1993 74： 597-608に列挙
されるように、bcl-x転写物は、以下のように当業者に記載される領域に分類す
ることが可能である：ヌクレオチド1-134、5'非翻訳領域（5'-UTR）；ヌクレオ
チド135-137、翻訳開始コドン（AUG）；ヌクレオチド135-836、コード領域、そ
のうち135-509はbcl-xs転写物の、より短いエクソン1であり、そして135-698は
、bcl-xl転写物の、より長いエクソン1である；ヌクレオチド699-836、エクソン
2；ヌクレオチド834-836、停止コドン；およびヌクレオチド837-926、3'非翻訳
領域（3'-UTR）。成熟bcl-xl（長）mRNA転写物が産生される場合、エクソン1お
よび2の間（ヌクレオチド698および699の間）で、プレmRNAのイントロンがスプ
ライシングされる。509位から699位の選択的スプライシングは、長い転写物より
189ヌクレオチド短く、bcl-xlより63アミノ酸短いタンパク質産物（bcl-xs）を
コードする、bcl-xs（短）mRNA転写物を産生する。したがって、ヌクレオチド69
8位は、ときに、当該技術分野において、「5'スプライシング部位」と呼ばれ、
そして509位は、「隠れた（cryptic）5'スプライシング部位」と呼ばれ、ヌクレ
オチド699は、ときに、「3'スプライシング部位」と呼ばれる。

【０００５】アポトーシスと関連付けられてきている疾患および異常は、2つのカテゴリー
に属し、これらは細胞生存の増加がある（すなわちアポトーシスが減少している
）ものおよび細胞死の過剰がある（すなわちアポトーシスが増加している）もの
である。細胞生存の増加のため、細胞の過剰な集積がある疾患には、癌、自己免
疫障害およびウイルス感染が含まれる。最近まで、細胞傷害性薬剤は、何らかの
生命維持機能に干渉することにより、直接標的細胞を殺すと考えられていた。し
かし、最近、別個の作用機構を持ついくつかの細胞傷害性薬剤への曝露により、
悪性および正常細胞両方でアポトーシスが誘導されることが示されてきている。
栄養性（trophic）因子レベルの操作（例えば抗エストロゲン化合物または多様
な増殖ホルモンのレベルを減少させるものによる）は、栄養性因子の枯渇がアポ
トーシスを誘導する可能性があるため、アポトーシスを促進する1つの臨床的ア
プローチとなってきている。アポトーシスはまた、発生中の自己反応性である可
能性があるリンパ球の除去および免疫または炎症性反応の完了後の過剰な細胞の
除去にも必須である。最近の研究は、不適切なアポトーシスが、異常な自己反応
性リンパ球が生存するのを可能にすることにより、自己免疫疾患の病因形成の根
底にある可能性があることを明確に立証してきている。不十分なアポトーシスが
関与していると考えられる、これらおよび他の異常には、アポトーシスの促進が
望ましい。これは、例えば、細胞アポトーシスを促進することにより、または内
因性または外因性アポトーシス刺激、例えばTNFαまたは他のサイトカインなど
の細胞情報伝達分子、細胞傷害性薬剤または照射に対する細胞の感受性を増加さ
せることにより、達成することが可能である。アポトーシスの促進またはアポト
ーシスに対する感作（sensitization）は、例えば、癌細胞の化学療法薬剤また
は放射線照射に対する感作において、臨床的妥当性を有すると考えられる。また
、腫瘍増殖に必要な血管形成を遮断するのにも相当すると考えられる。これは、
腫瘍細胞が血管形成因子を放出し、血管形成性内皮細胞を腫瘍部位に補充するた
めである。これらの血管形成性内皮細胞を、アポトーシス刺激（化学療法薬剤、
照射、または内因性TNFα）に対し感作し、血管形成を遮断し、そしてしたがっ
て腫瘍増殖を遮断することが望ましいであろう。異常な血管形成はまた、多くの
他の異常、例えば、すべて視力の損失を引き起こす可能性がある、黄斑変性、糖
尿病性網膜症および未熟児網膜症にも関連付けられる。異常な血管形成はまた、
他の、目以外の異常にも関連付けられる。このように、「異常な」血管形成は、
過剰なまたは不十分な血管形成、あるいは望ましくない血管形成（例えば腫瘍増
殖を支持する血管形成の場合のように）と呼ぶことが可能である。したがって、
血管形成性内皮細胞の、アポトーシス刺激に対する感作により、異常な血管形成
を遮断することが望ましい。

【０００６】第二のカテゴリーにおいて、AIDSおよび神経変性障害、例えばアルツハイマー
またはパーキンソン病が、アポトーシスの促進（または望ましくないアポトーシ
ス）による細胞死の過剰が関連付けられてきている疾患を代表する。筋萎縮性側
索硬化症、色素性網膜炎、および癲癇は、アポトーシスが関連付けられてきてい
る他の神経障害である。アポトーシスは、虚血により特徴付けられる異常、例え
ば心筋梗塞および脳卒中で起こることが報告されてきている。アポトーシスは、
閉塞性黄疸および毒素および薬剤による肝臓損傷を含む、いくつかの肝臓傷害に
も関連付けられてきている。アポトーシスはまた、腎臓のいくつかの疾患、すな
わち多嚢胞性腎臓と共に、糖尿病を含む膵臓の障害における重要な現象としても
同定されてきている（Thatteら, Drugs, 1997, 54, 511-532）。望ましくないア
ポトーシスが関与していると考えられる、これら並びに他の疾患および異常には
、アポトーシスの阻害剤が望ましい。

【０００７】アンチセンスオリゴヌクレオチドは、bcl-2ファミリーのいくつかのメンバー
の役割を解明するために用いられてきている。bcl-2を標的とするアンチセンス
オリゴヌクレオチドを用いた広範な研究が行われてきており、そしてヒトbcl-2
を標的とするアンチセンス化合物（G3139、Genta Incorporated）がリンパ腫お
よび前立腺癌の臨床試験に加わってきている。

【０００８】 Amarante-Mendesら, Oncogene, 1998, 16, 1383-1390は、bcrおよびbcl-xを標
的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示する。後者はbcl-xlの発現を下
方制御し、そしてスタウロスポリンに対するHL-60 Bcr-Abl細胞の感受性を増加
させた。

【０００９】米国特許5,583,034（Greenら）は、抗アポトーシス遺伝子の核酸配列、好まし
くはbcr-ablの翻訳開始部位にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオ
チドを開示する。

【００１０】 Wangらは、bcl-x翻訳開始部位を標的とし、ネズミWEHI-231リンパ腫細胞にお
ける、CD40L仲介アポトーシス救出（rescue）を遮断する、ホスホロチオエート
オリゴヌクレオチドを用いた（J. Immunol., 1995, 155, 3722-3725）。

【００１１】 Fujioらは、ネズミおよびラットbcl-x mRNAを標的とし、bcl-xlタンパク質発
現を減少させるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いている（J. Cli
n. Invest., 1997, 99, 2898-2905）。試験された化合物は、Wangらのものと同
一であった。オリゴヌクレオチド処置は、マウスおよびラット心筋における白血
病阻害因子の細胞保護効果を阻害した。

【００１２】 Pollmanらは、ホスホロチオエートバックボーンを持ち、血管内膜細胞におけ
るbcl-xl発現を下方制御するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを用いた
（Nature Med., 1988, 4, 222-227）。これは、アポトーシスの誘導および血管
損傷の後退を生じた。アンチセンス配列は、マウス／ヒトbcl-xの翻訳開始コド
ン（保存配列）を標的とし、そしてウサギで用いた。Gibbonsら、米国特許5,776
,905は、好ましくは抗アポトーシス遺伝子、より好ましくはbcl-x、そして最も
好ましくはbcl-xlに特異的なアンチセンス分子を用い、血管疾患を持つ哺乳動物
の血管系における内膜損傷細胞を標的とし、欠失させるための方法を開示する。

【００１３】 Thompsonら、米国特許5,646,008およびWO 95／00642は、脊椎動物のプログラ
ム細胞死を促進するまたは阻害する、bcl-2以外のポリペプチドをコードする、
単離されそして精製されているポリヌクレオチドを記載する。好ましくは、ポリ
ペプチドはbcl-xl、bcl-xsまたはbcl-x₁である。ポリペプチド、単離されそして
精製されているポリヌクレオチドの一部と同一のまたは相補的なポリヌクレオチ
ド、発現ベクター、宿主細胞、抗体並びに療法および診断使用法もまた、提供さ
れる。

【００１４】 Yangら、WO 98／05777は、アンキリンドメインを含む、bcl-xファミリーの新
規アイソフォーム、bcl-xγ（ガンマ）を開示する。本アイソフォームのポリペ
プチドおよび核酸配列と共に、とりわけアンチセンス法を含む、bcl-xγ活性を
モジュレーションするための方法が開示される。

【００１５】発明の概要本発明は、bcl-xをコードする核酸を標的とし、そしてbcl-xの発現をモジュレ
ーションする、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドに関する。本発明
のアンチセンス化合物を含む、薬剤組成物および他の組成物もまた提供される。
さらに提供されるのは、細胞または組織においてbcl-xの発現をモジュレーショ
ンする方法であって、前記細胞または組織を、1つまたはそれ以上の、本発明の
アンチセンス化合物または組成物と接触させることを含む、前記方法である。さ
らに提供されるのは、療法的または予防的に有効な量の、1つまたはそれ以上の
、本発明のアンチセンス化合物または組成物を投与することにより、bcl-xの発
現と関連する疾患または症状を有するあるいは該疾患または症状に対する傾向を
有すると疑われる動物、特にヒトを治療する方法である。

【００１６】発明の詳細な説明本発明は、ヒトbcl-xおよびそのアイソフォーム、bcl-xlおよびbcl-xsの発現
をモジュレーションすることが可能なアンチセンス化合物を包含する。bcl-xlは
、アポトーシスを阻害し、そしてしたがってbcl-xlの阻害剤、特にbcl-xlの特異
的阻害剤、例えば本発明のアンチセンス化合物は、アポトーシスの促進因子（pr
omoter）として望ましい。対照的に、bcl-xの短いアイソフォーム、bcl-xsは、
抗アポトーシス効果に拮抗し、そしてしたがってアポトーシスを促進する。bcl-
xsの阻害剤は、アポトーシスの阻害剤として望ましい。bcl-xの特定のアイソフ
ォーム、bcl-xlまたはbcl-xsいずれかの発現を特異的に阻害する、あるいはこれ
らの2つのアイソフォームの発現比を改変するアンチセンス化合物は、研究、お
よび予防を含む療法的使用に特に有用である。

【００１７】本発明は、bcl-xをコードする核酸分子の機能をモジュレーションし、究極的
に、産生されるbcl-xの量をモジュレーションするのに使用するため、オリゴマ
ーアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを使用する。これは、bcl-xを
コードする1つまたはそれ以上の核酸と特異的にハイブリダイズするアンチセン
ス化合物を提供することにより、達成される。本明細書において、「標的核酸」
および「bcl-xをコードする核酸」という用語は、bcl-xをコードするDNA、こう
したDNAから転写されるRNA（プレmRNAおよびmRNAを含む）、およびまたこうした
RNAに由来するcDNAを含む。オリゴマー化合物とその標的核酸との特異的なハイ
ブリダイゼーションは、核酸の正常な機能に干渉する。標的核酸に特異的にハイ
ブリダイズする化合物による、標的核酸の機能のこのモジュレーションは、一般
的に「アンチセンス」と称される。干渉されるべきDNAの機能には、複製および
転写が含まれる。干渉されるべきRNAの機能には、生命の維持に必要なすべての
機能、例えば、タンパク質翻訳部位へのRNAの転位、RNAからのタンパク質の翻訳
、1つまたはそれ以上のmRNA種を生じるRNAのスプライシング、およびRNAにおい
て行われるまたはRNAにより促進される触媒活性が含まれる。標的核酸機能との
こうした干渉の全体的な効果は、bcl-xの発現モジュレーションである。本発明
の文脈において、「モジュレーション」は、遺伝子産物の発現における増加（刺
激）または減少（阻害）いずれかを意味する。本発明の文脈において、阻害が遺
伝子発現のモジュレーションの好ましい型であり、そしてmRNAが好ましい標的で
ある。さらに、多くの遺伝子（bcl-xを含む）が多数の転写物を有するため、「
モジュレーション」はまた、遺伝子産物間の比率の改変、例えばmRNAスプライシ
ング産物の改変も含む。

【００１８】アンチセンスに関し、特定の核酸を標的とするのが好ましい。本発明の文脈に
おいて、特定の核酸に対するアンチセンス化合物の「標的化」は、多段階過程で
ある。該過程は、通常、その機能をモジュレーションすべき核酸配列の同定で始
まる。これは、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞遺
伝子（または該遺伝子から転写されるmRNA）、または感染性病原体由来の核酸分
子であってもよい。本発明において、標的は、bcl-xをコードする核酸分子であ
る。標的化過程はまた、望ましい効果、例えばタンパク質の発現の検出またはモ
ジュレーションが生じるであろうように、アンチセンス相互作用が起こるための
、本遺伝子中の1または複数の部位の決定も含む。本発明の文脈内で、好ましい
遺伝子内部位は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）の翻訳開始ま
たは終始コドンを含む領域である。当該技術分野において知られるように、翻訳
開始コドンは、典型的には5'-AUG（転写されたmRNA分子において；対応するDNA
分子では5'-ATG）であるため、翻訳開始コドンはまた、「AUGコドン」、「開始
コドン」または「AUG開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、RNA配列5'-G
UG、5'-UUGまたは5'-CUGを有する翻訳開始コドンを有し、そして5'-AUA、5'-ACG
および5'-CUGがin vivoで機能することが示されてきている。したがって、「翻
訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各例のイニシエーターアミ
ノ酸が、典型的にはメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生
物）であっても、多くのコドン配列を含む可能性がある。真核および原核遺伝子
が、2つまたはそれ以上の代替開始コドンを有してもよく、そのいかなる1つを、
特定の細胞種または組織において、あるいは一連の特定の条件下で、翻訳開始に
優先的に利用してもよい。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳
開始コドン」は、こうしたコドンの（1または複数の）配列に関わらず、bcl-xを
コードする遺伝子から転写されるmRNA分子の翻訳を開始するのに、in vivoで用
いられる1または複数のコドンを指す。

【００１９】遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、3つの配列、すなわち5
'-UAA、5'-UAGおよび5'-UGA（対応するDNA配列は、それぞれ、5'-TAA、5'-TAGお
よび5'-TGAである）の1つを有する可能性があることもまた、当該技術分野にお
いて知られる。「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は
、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち5'または3'）の約25ないし約50
の隣接するヌクレオチドを含むmRNAまたは遺伝子の部分を指す。同様に、「終止
コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンから
どちらかの方向（すなわち5'または3'）の約25ないし約50の隣接するヌクレオチ
ドを含むmRNAまたは遺伝子の部分を指す。

【００２０】翻訳開始コドンおよび翻訳終始コドンの間の領域を指すことが当該技術分野に
おいて知られるオープンリーディングフレーム（ORF）または「コード領域」も
また、効果的に標的化することが可能である領域である。他の標的領域には、翻
訳開始コドンから5'方向のmRNAの部分を指すことが当該技術分野において知られ
、そしてしたがってmRNAの5'キャップ部位および翻訳開始コドンの間のヌクレオ
チドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む、5'非翻訳領域（5'UTR）、
並びに翻訳終止コドンから3'方向のmRNAの部分を指すことが当該技術分野におい
て知られ、そしてしたがってmRNAの翻訳終止コドンおよび3'端の間のヌクレオチ
ドまたは遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む、3'非翻訳領域（3'UTR）が含
まれる。mRNAの5'キャップは、5'-5'三リン酸結合を介し、mRNAの最も5'の残基
に結合している、N7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は
、5'キャップ構造自体と共に、キャップに隣接する最初の50ヌクレオチドを含む
とみなされる。5'キャップ領域もまた、好ましい標的領域である可能性がある。

【００２１】いくつかの真核mRNA転写物は直接翻訳されるが、多くは1つまたはそれ以上の
、翻訳前に転写物から切除される、「イントロン」として知られる領域を含む。
残った（そしてしたがって翻訳される）領域は、「エクソン」として知られ、そ
して共にスプライシングされ、連続するmRNA配列を形成する。mRNAスプライシン
グ部位、すなわちイントロン・エクソン接合部もまた、好ましい標的部位であり
、そして異常なスプライシングが疾患に関連付けられている状況、または特定の
mRNAスプライシング産物の過剰発現が疾患に関連付けられている状況で特に有用
である。再編成または欠失による異常な融合接合部もまた好ましい標的である。
イントロンもまた、例えばDNAまたはプレmRNAを標的とするアンチセンス化合物
の、有効な、そしてしたがって好ましい標的領域である可能性があることもまた
見出されてきている。

【００２２】ひとたび1つまたはそれ以上の標的部位が同定されてきたら、標的に十分に相
補的な、すなわち十分によく、そして十分な特異性でハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを選択する、望ましい効果を与える。

【００２３】本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」は、相補的なヌクレオシ
ドまたはヌクレオチド塩基間の、ワトソン-クリック、フーグスティーンまたは
逆フーグスティーン水素結合でもよい水素結合を意味する。例えば、アデニンお
よびチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する相補的ヌクレオ塩基である。
本明細書において、「相補的」は、2つのヌクレオチドの間に正確に対形成する
能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置のヌクレオチドが、DNA
またはRNA分子の同一位置のヌクレオチドと水素結合することが可能であれば、
該オリゴヌクレオチドおよび該DNAまたはRNAは、その位置で、互いに相補的であ
ると見なされる。各分子において、十分な数の対応する位置が、互いに水素結合
することが可能なヌクレオチドで占められていれば、該オリゴヌクレオチドおよ
び該DNAまたはRNAは相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能
」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドおよびDNAまたはRNA標的の間で、安
定したそして特異的な結合が起こるような、十分な程度の相補性または正確な対
形成を示すのに用いられる用語である。アンチセンス化合物の配列は、特異的に
ハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸のものと100％相補的である必
要はないことが当該技術分野において理解される。アンチセンス化合物は、該化
合物の標的DNAまたはRNA分子に対する結合が、標的DNAまたはRNAの正常機能に干
渉し、有用性の損失を引き起こし、そして特異的結合が望ましい条件下、すなわ
ちin vivoアッセイまたは療法処置の場合には、生理学的条件下、またはin vitr
oアッセイの場合には、アッセイが行われる条件下で、非標的配列に対するアン
チセンス化合物の非特異的結合を避けるのに十分な程度の相補性がある場合、特
異的にハイブリダイズ可能である。

【００２４】アンチセンス化合物は、一般的に研究試薬および診断剤として用いられる。例
えば、完全な特異性で遺伝子発現を阻害することが可能なアンチセンスオリゴヌ
クレオチドが、しばしば、特定の遺伝子の機能を解明するため、当業者により用
いられる。アンチセンス化合物はまた、例えば、生物学的経路の多様なメンバー
の機能の間の区別をするのに用いられる。アンチセンスモジュレーションは、し
たがって、研究使用のため、利用されてきている。

【００２５】アンチセンスの特異性および感受性はまた、療法使用のためにも当業者に利用
されてきている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、動物およびヒトにおける
疾患状態の治療において、療法部分として使用されてきている。アンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、安全にそして効果的にヒトに投与され、そして現在多くの
臨床試験が進行中である。したがって、オリゴヌクレオチドが、細胞、組織およ
び動物、特にヒトの治療処置計画に有用であるように設計することが可能である
、有用な療法様式（modality）である可能性があることが確かめられている。本
発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（RNA）
またはデオキシリボ核酸（DNA）またはその擬似体（mimetics）のオリゴマーま
たはポリマーを指す。本用語は、天然に存在するヌクレオ塩基、糖および共有ヌ
クレオシド間（バックボーン）結合からなるオリゴヌクレオチドと共に、同様に
機能する非天然のものではない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。こうし
た修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込み亢進、核酸標的
に対する親和性の亢進、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの望
ましい特性のため、しばしば、天然型より好ましい。

【００２６】アンチセンスオリゴヌクレオチドがアンチセンス化合物の好ましい型であるが
、本発明は、以下に記載されるようなオリゴヌクレオチド擬似体を含む（限定さ
れるわけではない）、他のオリゴマーアンチセンス化合物を含む。本発明にした
がったアンチセンス化合物は、好ましくは約8ないし約30ヌクレオ塩基を含む。
特に好ましいのは、約8ないし約30ヌクレオ塩基を含むアンチセンスオリゴヌク
レオチド（すなわち約8ないし約30の結合したヌクレオシド）である。当該技術
分野において知られるように、ヌクレオシドは塩基・糖の組み合わせである。ヌ
クレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複素環塩基の2つ
の最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、
ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドであ
る。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、該糖の2'
、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれに結合してもよい。オリゴヌクレオチド
を形成する際、リン酸基は、互いに、隣接するヌクレオシドと共有結合し、直線
ポリマー化合物を形成する。次に、この直線ポリマー構造のそれぞれの端を、さ
らに結合させて環状構造を形成させてもよい。しかし、開環の直線構造が、一般
的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌ
クレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成すると称される。RNAおよびDNA
の通常の結合またはバックボーンは、3'から5'のホスホジエステル結合である。

【００２７】本発明に有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例には、修飾バックボー
ンまたは非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが含まれる。本明
細書に定義されるように、修飾バックボーンを有するオリゴヌクレオチドには、
バックボーン内にリン原子を保持するもの、およびバックボーン内にリン原子を
持たないものが含まれる。本明細書の目的のための、そして当該技術分野におい
て時に引用されるような、ヌクレオシド間バックボーンにリン原子を持たない修
飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドと見なすことが可能である。

【００２８】好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンには、例えば、ホスホロチオエ
ート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエ
ステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、3'-アルキレンホスホネート
類およびキラルホスホネート類を含む、メチルおよび他のアルキルホスホネート
類、ホスフィネート類、3'-アミノホスホロアミデート類およびアミノアルキル
ホスホロアミデート類を含む、ホスホロアミデート類、チオノホスホロアミデー
ト類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、
並びにボラノホスフェート類であって、通常の3'-5'結合を有するもの、これら
の2'-5'結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が3'-5'から5'-3'へ
、または2'-5'から5'-2'へ結合する逆の極性を有するものが含まれる。多様な塩
、混合塩および遊離酸型もまた、含まれる。

【００２９】上記のリン含有結合の調製を解説する代表的な米国特許は、限定されるわけで
はないが、米国特許： 3,687,808； 4,469,863； 4,476,301； 5,023,243； 5,1
77,196； 5,188,897； 5,264,423； 5,276,019； 5,278,302； 5,286,717； 5,3
21,131； 5,399,676； 5,405,939； 5,453,496； 5,455,233； 5,466,677； 5,4
76,925； 5,519,126； 5,536,821； 5,541,306； 5,550,111； 5,563,253； 5,5
71,799； 5,587,361；および5,625,050であり、前記特許の各々は本明細書に援
用される。

【００３０】その中にリン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは
、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およ
びアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、あるいは1つまたはそれ
以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間結合により形成されるバック
ボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分
から形成される）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよび
スルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン
；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含
有バックボーン；スルファメートバックボーン；メチレンイミノおよびメチレン
ヒドラジノバックボーン；スルホネートおよびスルホンアミドバックボーン；ア
ミドバックボーンを有するもの；並びに混合N、O、SおよびCH₂構成要素部分を有
する他のものが含まれる。

【００３１】上記のオリゴヌクレオシドの調製を解説する代表的な米国特許は、限定される
わけではないが、米国特許： 5,034,506； 5,166,315； 5,185,444； 5,214,134
； 5,216,141； 5,235,033； 5,264,562； 5,264,564； 5,405,938； 5,434,257
； 5,466,677； 5,470,967； 5,489,677； 5,541,307； 5,561,225； 5,596,086
； 5,602,240； 5,610,289； 5,602,240； 5,608,046； 5,610,289； 5,618,704
；5,623,070； 5,663,312； 5,633,360；5,677,437；および5,677,439であり、
前記特許の各々は本明細書に援用される。

【００３２】他の好ましいオリゴヌクレオチド擬似体において、ヌクレオチド単位の糖およ
びヌクレオシド間結合両方、すなわちバックボーンは、新規の基と置き換えられ
る。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのため、維
持される。こうしたオリゴマー化合物の1つは、優れたハイブリダイゼーション
特性を持つことが示されてきているオリゴヌクレオチド擬似体であって、ペプチ
ド核酸（PNA）と称される。PNA化合物において、オリゴヌクレオチドの糖バック
ボーンは、アミド含有バックボーン、特にアミノエチルグリシンバックボーンと
置き換えられる。ヌクレオ塩基は保持され、そしてバックボーンのアミド部分の
アザ窒素原子と、直接または間接的に結合される。PNA化合物の調製を解説する
代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 5,539,082； 5,7
14,331；および5,719,262であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。PNA
化合物のさらなる解説は、Nielsenら, Science, 1991, 254, 1497-1500に見出す
ことが可能である。

【００３３】本発明の最も好ましい態様は、ホスホロチオエートバックボーンを持つオリゴ
ヌクレオチドおよびヘテロ原子バックボーンを持つオリゴヌクレオチド、特に上
に引用される米国特許5,489,677の-CH₂-NH-O-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-O-CH₂-（メ
チレン（メチルイミノ）またはMMIバックボーンとして知られる）、-CH₂-O-N（C
H₃）-CH₂-、-CH₂-N（CH₃）-N（CH₃）-CH₂-および-O-N（CH₃）-CH₂-CH₂-（天然ホ
スホジエステルバックボーンは-O-P-O-CH₂-として示される）および上に引用さ
れる米国特許5,602,240のアミドバックボーンを持つオリゴヌクレオチドである
。やはり好ましいのは、上に引用される米国特許5,034,506のモルホリノバック
ボーン構造を有するオリゴヌクレオチドである。

【００３４】修飾オリゴヌクレオチドはまた、1つまたはそれ以上の置換糖部分も含んでも
よい。好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含む：OH；F；O-、S-
、またはN-アルキル、O-、S-、またはN-アルケニル；O、S-、またはN-アルキニ
ル；あるいはO-アルキル-O-アルキルであって、該アルキル、アルケニルおよび
アルキニルが、置換または未置換のC₁ないしC₁₀アルキルまたはC₂ないしC₁₀アル
ケニルおよびアルキニルでもよいもの。特に好ましいのは、O［（CH₂）_nO］_mCH₃ 、O（CH₂）_nOCH₃、O（CH₂）_nNH₂、O（CH₂）_nCH₃、O（CH₂）_nONH₂、およびO（CH₂ ）_nON［（CH₂）_nCH₃］］₂であって、nおよびmが1ないし約10であるものである。
他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下の1つを含む：C₁ないしC₁₀の低
級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、O-アルカリールま
たはO-アラルキル、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、O
NO₂、NO₂、N₃、NH₂、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミ
ノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、リポーター
基、挿入剤（intercalator）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するた
めの基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同
様の特性を有する他の置換基。好ましい修飾には、アルコキシアルコキシ基、2'
-メトキシエトキシ（2'-O-CH₂CH₂OCH₃、2'-O-（2-メトキシエチル）または2'-MO
Eとしても知られる）（Martinら, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504）が含
まれる。さらなる好ましい修飾には、2'-ジメチルアミノオキシエトキシ、すな
わち、2'-DMAOEとしても知られる、O（CH₂）₂ON（CH₃）₂基が含まれる。

【００３５】他の好ましい修飾には、2'-メトキシ（2'-O-CH₃）、2'-アミノプロポキシ（2'
-OCH₂CH₂CH₂NH₂）、および2'-フルオロ（2'-F）が含まれる。同様の修飾はまた
、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に3'末端ヌクレオチド上のまたは2'-5'
結合オリゴヌクレオチド内の糖の3'位および5'末端ヌクレオチドの5'位でも行っ
てもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブ
チル部分などの糖擬似体も有してもよい。こうした修飾糖構造の調製を解説する
代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 4,981,957； 5,1
18,800； 5,319,080； 5,359,044； 5,393,878； 5,446,137； 5,466,786； 5,5
14,785； 5,519,134； 5,567,811； 5,576,427； 5,591,722； 5,597,909； 5,6
10,300； 5,627,053； 5,639,873； 5,646,265； 5,658,873； 5,670,633；およ
び5,700,920であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。

【００３６】オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオ塩基（当該技術分野において、しばしば
単に「塩基」と称される）修飾または置換も含んでもよい。本明細書において、
「未修飾」または「天然」ヌクレオ塩基には、プリン塩基、アデニン（A）およ
びグアニン（G）、並びにピリミジン塩基、チミン（T）、シトシン（C）および
ウラシル（U）が含まれる。修飾ヌクレオ塩基には、他の合成および天然ヌクレ
オ塩基が含まれ、例えば5-メチルシトシン（5-me-C）、5-ヒドロキシメチルシト
シン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニ
ンの6-メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピル
および他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシ
ン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-
アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チ
オウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシル
および他の8-置換アデニン類およびグアニン類、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリ
フルオロメチルおよび他の5-置換ウラシル類およびシトシン類、7-メチルグアニ
ンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグ
アニンおよび7-デアザアデニン並びに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニン
である。さらなるヌクレオ塩基には、米国特許3,687,808に開示されるもの、Con
cise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859ページ, Kro
schwitz, J.I.監修, John Wiley ＆ Sons, 1990に開示されるもの、Englischら,
Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613に開示されるもの
、およびSanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B.監修, Antisense Resea
rch and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, 289-302ページに開示さ
れるものが含まれる。これらのヌクレオ塩基の特定のものは、本発明のオリゴマ
ー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、5-置換ピ
リミジン類、6-アザピリミジン類およびN-2、N-6およびO-6置換プリン類が含ま
れ、2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシト
シンが含まれる。5-メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を、0.6-1.2℃増
加させることが示されてきており（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu,
B.監修, Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 199
3, 276-278ページ）、そして現在好ましい塩基置換であり、2'-O-メトキシエチ
ル糖修飾と組み合わされた場合、特により好ましい。

【００３７】上記の修飾ヌクレオ塩基の特定のものと共に他の修飾ヌクレオ塩基の調製を解
説する代表的な米国特許は、限定されるわけではないが、上記の米国特許3,687,
808と共に、米国特許： 4,845,205； 5,130,302； 5,134,066； 5,175,273； 5,
367,066； 5,432,272； 5,457,187； 5,459,255； 5,484,908； 5,502,177； 5,
525,711； 5,552,540； 5,587,469； 5,594,121； 5,596,091； 5,614,617； 5,
681,941；および5,750,692であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。

【００３８】本発明のオリゴヌクレオチドの別の修飾は、オリゴヌクレオチドに、該オリゴ
ヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを亢進させる、1つまたはそ
れ以上の部分または結合体を化学的に結合させることを伴う。こうした部分には
、限定されるわけではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsinge
rら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoha
ranら, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例
えば、ヘキシル-S-トリチルチオール（Manoharanら, Ann. N.Y. Acad. Sci., 19
92, 660, 306-309； Manoharanら, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2
770）、チオコレステロール（Oberhauserら, Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533
-538）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Beh
moarasら, EMBO J., 1991, 10, 1111-1118； Kabanovら, FEBS Lett., 1990, 25
9, 327-330； Svinarchukら, Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例え
ばジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたはトリエチルアンモニウム 1,2-ジ-O-
ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-H-ホスホネート（Manoharanら, Tetrahedron Let
t., 1995, 36, 3651-3654； Sheaら, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783
）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharanら, Nucleosides
＆ Nucleotides, 1995, 14, 969-973）、あるいはアダマンタン酢酸（Manoharan
ら, Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishraら,
Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、あるいはオクタデシルアミ
ンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分（Crookeら, J.
Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-927）が含まれる。

【００３９】こうしたオリゴヌクレオチド結合体の調製を解説する代表的な米国特許は、限
定されるわけではないが、米国特許： 4,828,979； 4,948,882； 5,218,105； 5
,525,465； 5,541,313； 5,545,730； 5,552,538；5,578,717； 5,580,731； 5,
580,731； 5,591,584； 5,109,124； 5,118,802； 5,138,045； 5,414,077； 5,
486,603； 5,512,439； 5,578,718； 5,608,046； 4,587,044； 4,605,735； 4,
667,025； 4,762,779； 4,789,737； 4,824,941；4,835,263； 4,876,335； 4,9
04,582； 4,958,013； 5,082,830； 5,112,963； 5,214,136； 5,082,830； 5,1
12,963； 5,214,136； 5,245,022； 5,254,469； 5,258,506； 5,262,536； 5,2
72,250； 5,292,873； 5,317,098； 5,371,241； 5,391,723； 5,416,203； 5,4
51,463； 5,510,475； 5,512,667；5,514,785； 5,565,552； 5,567,810； 5,57
4,142； 5,585,481； 5,587,371； 5,595,726； 5,597,696； 5,599,923； 5,59
9,928および5,688,941であり、前記特許の各々は本明細書に援用される。

【００４０】既定の化合物のすべての位置が均一に修飾されている必要はなく、そして実際
、1つより多くの上述の修飾が、単一の化合物内に、またはオリゴヌクレオチド
の単一のヌクレオシドにさえ、取り込まれていてもよい。本発明はまた、キメラ
化合物であるアンチセンス化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ」ア
ンチセンス化合物または「キメラ」は、アンチセンス化合物、特にオリゴヌクレ
オチドであって、各々少なくとも1つの単量体単位、すなわちオリゴヌクレオチ
ド化合物の場合にはヌクレオチド、からなる、2つまたはそれ以上の化学的に異
なる領域を含有する。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、該オリゴヌ
クレオチドに、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増加、細胞取り込みの増加、お
よび／または標的核酸に対する結合親和性の増加を与えるように、修飾されてい
る、少なくとも1つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、R
NA：DNAまたはRNA：RNAハイブリッドを切断することが可能な酵素に対する基質
として働く可能性がある。例として、RNase Hは、RNA：DNA二重鎖のRNA鎖を切断
する細胞性エンドヌクレアーゼである。RNase Hの活性化は、したがって、RNA標
的の切断を生じ、それにより、遺伝子発現のオリゴヌクレオチド阻害の効率を非
常に亢進させる。RNA標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要な場合には、当
該技術分野において知られる関連する核酸ハイブリダイゼーション技術により、
日常的に検出可能である。

【００４１】本発明のキメラアンチセンス化合物は、2つまたはそれ以上の、上述のような
オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／ま
たはオリゴヌクレオチド擬似体の複合体構造として形成することが可能である。
こうした化合物はまた、当該技術分野において、ハイブリッドまたはギャップマ
ーと称されてきている。こうしたハイブリッド構造の調製を解説する代表的な米
国特許は、限定されるわけではないが、米国特許： 5,013,830； 5,149,797； 5
,220,007； 5,256,775； 5,366,878； 5,403,711； 5,491,133； 5,565,350； 5
,623,065； 5,652,355； 5,652,356；および5,700,922であり、前記特許の各々
は本明細書に援用される。

【００４２】本発明にしたがい用いられるオリゴヌクレオチドは、好適にそして日常的に、
固相合成の周知の技術を通じ、作成することが可能である。こうした合成のため
の装置は、例えばApplied Biosystems（Foster City, CA）を含む、いくつかの
業者により、販売されている。さらにまたは代わりに、当該技術分野において知
られるこうした合成のためのいかなる他の手段も、使用してもよい。ホスホロチ
オエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製する同様の技
術を使用することもまた、知られる。

【００４３】本発明のアンチセンス化合物は、in vitroで合成され、そして生物学的起源の
アンチセンス組成物、またはアンチセンス分子のin vivo合成を指示するよう設
計された遺伝子ベクター構築物を含まない。

【００４４】本発明の化合物はまた、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、
局所または他の製剤のように、取り込み、分布および／または吸収を補助するた
め、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合し、これらにカプセル化し
、これらと結合させ、または別の方法で関連させてもよい。こうした取り込み、
分布および／または吸収補助製剤の調製を解説する代表的な米国特許は、限定さ
れるわけではないが、米国特許： 5,108,921； 5,354,844； 5,416,016； 5,459
,127； 5,521,291； 5,543,158； 5,547,932； 5,583,020； 5,591,721； 4,426
,330； 4,534,899； 5,013,556； 5,108,921； 5,213,804； 5,227,170； 5,264
,221； 5,356,633； 5,395,619； 5,416,016； 5,417,978； 5,462,854； 5,469
,854； 5,512,295； 5,527,528； 5,534,259； 5,543,152； 5,556,948； 5,580
,575；および5,595,756を含み、前記特許の各々は本明細書に援用される。

【００４５】本発明のアンチセンス化合物は、いかなる薬学的に許容しうる塩、エステル、
またはこうしたエステルの塩も、あるいはヒトを含む動物に投与した際、生物学
的に活性がある代謝産物またはその残基を（直接または間接的に）提供すること
が可能な、いかなる他の化合物も含む。したがって、例えば、本開示はまた、本
発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、こうしたプロドラッ
グの薬学的に許容しうる塩、並びに他の生物学的等価物にも関する。

【００４６】「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素または他の化学薬品および／また
は状態の作用により、体内または体の細胞内で活性型（すなわち薬剤）に変換さ
れる、不活性型で調製されている療法剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオ
チドのプロドラッグ型は、WO 93／24510またはWO 94／26764に開示される方法に
したがったSATE（（S-アセチル-2-チオエチル）リン酸）誘導体として調製され
る。

【００４７】「薬学的に許容しうる塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的および薬
学的に許容しうる塩：すなわち親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そし
てその望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。

【００４８】薬学的に許容しうる塩基付加塩は、金属またはアミン、例えばアルカリおよび
アルカリ土類金属または有機アミンで形成される。陽イオンとして用いられる金
属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、などである。適
切なアミンの例は、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コ
リン、ジエタノールアミン、ジシクロへキシルアミン、エチレンジアミン、N-メ
チルグルカミン、およびプロカインである（例えば、Bergeら, “Pharmaceutica
l Salts,” J. of Pharma Sci., 1977, 66：1-19を参照されたい）。前記酸性化
合物の塩基付加塩は、慣用的な方式で、十分な量の望ましい塩基と、遊離酸型を
接触させ、塩を生じさせることにより、調製する。遊離酸型は、慣用的な方式で
、酸と塩型を接触させ、そして遊離酸を単離することにより、再生してもよい。
遊離酸型は、極性溶媒における可溶性などの特定の物理的特性において、それぞ
れの塩型と幾分異なるが、それ以外は、本発明の目的には、該塩は、それぞれの
遊離酸と同等である。本明細書において、「薬学的付加塩」は、本発明の組成物
の構成要素の1つの酸型の薬学的に許容しうる塩を含む。これらには、アミンの
有機または無機酸塩が含まれる。好ましい付加塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル
酸塩、硝酸塩およびリン酸塩などの酸性塩である。他の適切な薬学的に許容しう
る塩は、当業者に周知であり、そして多様な無機および有機酸の塩基性塩、例え
ば、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸）を用い；有機カルボ
ン酸、スルホン酸、スルホまたはホスホ酸またはN-置換スルファミン酸（例えば
酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイ
ン酸、メチルマレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グル
コン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル
酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、2-フェノキシ安息香酸、2-アセトキシ安
息香酸、エンボン酸（embonic acid）、ニコチン酸またはイソニコチン酸）を用
い；そしてアミノ酸（例えば天然のタンパク質合成に関与する20のアルファ-ア
ミノ酸などのアミノ酸、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸）を用い、そ
してまたフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエ
タンスルホン酸、エタン-1,2-ジスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、4-メチルベ
ンゼンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、
2-または3-ホスホグリセリン酸、グルコース-6-リン酸、N-シクロヘキシルスル
ファミン酸（シクラメートの形成で）を用い、あるいは他の酸性有機化合物（例
えばアスコルビン酸など）を用いる塩基性塩が含まれる。化合物の薬学的に許容
しうる塩はまた、薬学的に許容しうる陽イオンで調製してもよい。適切な薬学的
に許容しうる陽イオンは、当業者に周知であり、そしてアルカリ、アルカリ土類
、アンモニウムおよび第四アンモニウム陽イオンを含む。炭酸塩または炭酸水素
塩もまた、使用可能である。

【００４９】オリゴヌクレオチドに関しては、薬学的に許容しうる塩の好ましい例には、限
定されるわけではないが、（a）陽イオン、例えばナトリウム、カリウム、アン
モニウム、マグネシウム、カルシウム、ポリアミン、例えばスペルミンおよびス
ペルミジン、などで形成される塩；（b）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫
酸、リン酸、硝酸などで形成される酸付加塩；（c）有機酸、例えば酢酸、シュ
ウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リン
ゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポ
リグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホ
ン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、などで形成される塩；並
びに（d）塩素、臭素、およびヨードなど元素陰イオンから形成される塩が含ま
れる。

【００５０】本発明のアンチセンス化合物は、診断剤、療法剤、予防剤のため、そして研究
試薬およびキットとして、利用してもよい。療法剤では、bcl-xの発現をモジュ
レーションすることにより治療することが可能な疾患または障害を有すると疑わ
れる動物、好ましくはヒトを、本発明に従うアンチセンス化合物を投与すること
により、治療する。本発明の化合物は、有効量のアンチセンス化合物を、適切な
薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーに添加することにより、薬剤組成物
に利用することが可能である。本発明のアンチセンス化合物および方法の使用は
また、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を予防するまたは遅延するために、予
防的に有用である可能性もある。

【００５１】本発明のアンチセンス化合物は、これらの化合物がbcl-xをコードする核酸に
ハイブリダイズし、サンドイッチおよび他のアッセイが、この事実を利用するた
めに容易に構築されることを可能にするため、研究および診断剤に有用である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、bcl-xをコードする核酸のハイブ
リダイゼーションは、当該技術分野において知られる手段により検出することが
可能である。こうした手段は、オリゴヌクレオチドに対する酵素の結合、オリゴ
ヌクレオチドの放射標識または他のいかなる適切な検出手段でもよいものを含ん
でもよい。試料中のbcl-xのレベルを検出するための、こうした検出手段を用い
たキットもまた、調製してもよい。

【００５２】本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物を含む薬剤組成物および製剤も含
む。本発明の薬剤組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうか、および治
療しようとする領域に応じ、いくつかの方式で投与してもよい。投与は、局所（
眼および膣および直腸送達を含む粘膜に対するものを含む）、例えば、ネブライ
ザーによるものを含む、粉末またはエアロゾル吸入（inhalation、insufflation
）により、肺；気管内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非経口であっても
よい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入
；あるいは頭蓋内、例えばくも膜下または脳室内、投与を含む。少なくとも1つ
の2'-O-メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用
であると考えられる。

【００５３】局所投与のための薬剤組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、
クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含んでもよい。
慣用的な薬剤キャリアー、水性、粉末または油性基剤、増粘剤（thickener）な
どが必要であるまたは望ましい可能性がある。被覆コンドーム、手袋などもまた
、有用である可能性がある。

【００５４】経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、水または非水性媒体
中の懸濁物または溶液、カプセル、サシェー剤（sachet）または錠剤が含まれる
。増粘剤、香料（flavoring agents）、希釈剤、乳化剤、分散補助または結合剤
が望ましい可能性もある。

【００５５】非経口、くも膜下または脳室内投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希
釈剤および他の適切な添加物、例えば限定されるわけではないが、浸透亢進剤、
キャリアー化合物および他の薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤もまた
含んでもよい、無菌水性溶液を含んでもよい。

【００５６】本発明のオリゴヌクレオチドを含む薬剤組成物および／または製剤はまた、オ
リゴヌクレオチドの消化管送達を亢進するため、浸透亢進剤も含んでもよい。浸
透亢進剤は、5つの広いカテゴリー、すなわち脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、界
面活性剤および非界面活性剤の1つに属するとして、分類することが可能である
（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8,
91-192； Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems
, 1990, 7：1-33）。これらの広いカテゴリーの1つまたはそれ以上からの1つま
たはそれ以上の浸透亢進剤が含まれてもよい。

【００５７】浸透亢進剤として作用する、多様な脂肪酸およびその誘導体には、例えば、オ
レイン酸、ラウリン酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン
酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、レシンレアート
（recinleate）、モノオレイン（別名1-モノオレオイル-rac-グリセロール）、
ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル-1-モノカプレート、1-ド
デシルアザシクロへプタン-2-オン、アシルカルニチン類、アシルコリン類、モ
ノ-およびジ-グリセリド類並びにそれらの生理学的に許容しうる塩（すなわちオ
レイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、
ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が含まれる（Leeら, Critical Reviews in
Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 8：2, 91-192； Muranishi, Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7：1, 1-33； El-H
aririら, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44：651-654）。いくつかの現在好まし
い脂肪酸の例は、0.5ないし5％の濃度で、単一でまたは組み合わせて用いられる
、カプリン酸ナトリウムおよびラウリル酸ナトリウムである。

【００５８】胆汁の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の助長
が含まれる（Brunton, 第38章： Goodman ＆ Gilman’s The Pharmacological B
asis of Therapeutics, 第9版, Hardmanら監修, McGraw-Hill, New York, NY, 1
996中, 934-935ページ）。多様な中性胆汁塩、およびそれらの合成誘導体は、浸
透亢進剤として作用する。したがって、「胆汁塩」という用語には、胆汁のいか
なる天然に存在する構成要素と共にそのいかなる合成誘導体も含まれる。現在好
ましい胆汁塩は、ケノデオキシコール酸（CDCA）（Sigma Chemical Company, St
. Louis, MO）であり、一般的に0.5ないし2％の濃度で用いられる。

【００５９】 1つまたはそれ以上の浸透亢進剤を含む複合製剤を用いてもよい。例えば、胆
汁塩を脂肪酸と組み合わせて用い、複合製剤を作成してもよい。好ましい組み合
わせには、カプリン酸ナトリウムまたはラウリル酸ナトリウム（一般的に0.5な
いし5％）と組み合わせたCDCAが含まれる。

【００６０】キレート剤は、限定されるわけではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリ
ウム（EDTA）、クエン酸、サリチル酸塩類（例えばサリチル酸ナトリウム、5-メ
トキシサリチル酸およびホモバニレート（homovanilate））、コラーゲンのN-ア
シル誘導体、ラウレス（laureth）-9およびベータ-ジケトン類のN-アミノアシル
誘導体（エナミン類）が含まれる（Leeら, Critical Review in Therapeutic Dr
ug Carrier Systems, 1991, 8：2, 92-192； Muranishi, Critical Review Ther
apeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7：1, 1-33； Buurら, J. Control Rel.
, 1990, 14, 43-51）。キレート剤は、DNAse阻害剤としても作用する、さらなる
利点を有する。

【００６１】界面活性剤には、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン-9-
ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン-20-セチルエーテル（Leeら, Criti
cal Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, 92-191）；およびF
C-43などのペルフルオロ化学薬品乳化剤（Takahashiら, J. Pharm. Phamacol.,
1988, 40：252-257）が含まれる。

【００６２】非界面活性剤には、例えば、不飽和環状尿素、1-アルキル-および1-アルケニ
ルアザシクロ-アルカノン誘導体（Leeら, Critical Reviews in Therapeutic Dr
ug Carrier Systems, 1991, 8：2, 92-191）；並びに非ステロイド抗炎症剤、例
えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Yama
shitaら, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39：621-626）が含まれる。

【００６３】本明細書において、「キャリアー化合物」は、不活性である（すなわち、それ
自体、生物学的活性を持たない）が、例えば、生物学的に活性がある核酸を分解
するまたは循環からのその除去を促進することにより、生物学的活性を有する核
酸の生物学的利用能を減少させるin vivo過程により、核酸として認識される、
核酸、またはその類似体を指す。核酸およびキャリアー化合物の共投与は、典型
的には、後者の物質が過剰であり、おそらく共通の受容体に対するキャリアー化
合物および核酸の間の競合のため、肝臓、腎臓または他の循環外貯蔵器官に回収
される核酸の量を実質的に減少させることが可能である。例えば、部分的にホス
ホロチオエート化されたオリゴヌクレオチドの肝組織における回収は、ポリイノ
シン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸または4-アセトアミド-4'-イソチオ
シアノ-スチルベン-2,2'-ジスルホン酸と共投与された際、減少する（Miyaoら,
Antisense Res. Dev., 1995, 5：115； Takakuraら, Antisense ＆ Nucl. Acid
Drug Dev., 1996, 6：177-183）。

【００６４】キャリアー化合物と対照的に、「薬学的に許容しうるキャリアー」（賦形剤）
は、動物に1つまたはそれ以上の核酸を搬送するための、薬学的に許容しうる溶
媒、懸濁剤またはいかなる他の薬理学的に不活性なビヒクルである。薬学的に許
容しうるキャリアーは、液体または固体であってもよく、そして既定の薬剤組成
物の核酸および他の構成要素と組み合わせた際、望ましい体積（bulk）、堅さ（
consistency）などを提供するように、計画した投与方式と共に選択する。典型
的な薬学的に許容しうるキャリアーには、限定されるわけではないが、結合剤（
例えば、α化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキ
シプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えばラクトースおよび他の糖、
微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、カルシウム硫酸、エチルセルロース
、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えばステア
リン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド性二酸化ケイ素、ステアリン酸
、金属性ステアリン酸塩、水素添加植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリ
コール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；分解剤（例えばデンプン
、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸
ナトリウムなど）が含まれる。持続放出経口送達系および／または経口投与投薬
型のための溶腸性被覆は、米国特許4,704,295； 4,556,552； 4,309,406；およ
び4,309,404に記載される。

【００６５】本発明の組成物は、さらに、薬剤組成物に慣用的に見られる他の付属構成要素
を、当該技術分野において確立された使用レベルで、含んでもよい。したがって
、例えば、組成物は、例えばかゆみ止め剤、収斂剤、局所麻酔剤または抗炎症剤
などの、さらなる適合する薬学的に活性がある成分を含んでもよいし、あるいは
、本発明の組成物の多様な投薬型を物理的に製剤化するのに有用である、さらな
る成分、例えば色素、香料、保存剤、酸化防止剤、乳白剤（opacifier）、増粘
剤および安定化剤などを含んでもよい。しかし、こうした成分は、添加される際
、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を、過度に妨げてはならない。

【００６６】本発明のアンチセンス化合物が患者に導入される方法にかかわらず、コロイド
分散系を送達ビヒクルとして用いて、化合物のin vivo安定性を亢進させおよび
／または化合物を特定の器官、組織または細胞種に標的化してもよい。コロイド
分散系には、限定されるわけではないが、巨大分子複合体、ナノカプセル、微小
球体、ビーズ、および水中油乳化物、ミセル、混合ミセル、リポソームおよび性
質決定されていない構造の脂質：オリゴヌクレオチド複合体を含む脂質に基づく
系、が含まれる。好ましいコロイド分散系は、複数のリポソームである。リポソ
ームは、二層立体配置に配置された脂質で構成される、1つまたはそれ以上の外
層に囲まれる水性コアを有する顕微鏡的球体である（一般的には、Chonnら, Cur
rent Op. Biotech., 1995, 6, 698-708を参照されたい）。

【００６７】本発明の特定の態様は、（a）1つまたはそれ以上のアンチセンス化合物および
（b）非アンチセンス機構により機能する、1つまたはそれ以上の他の化学療法剤
、を含むリポソームおよび他の組成物を提供する。こうした化学療法剤の例には
、限定されるわけではないが、抗癌薬剤、例えばダウノルビシン、ダクチノマイ
シン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマス
タード、クロランブシル、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプ
リン、6-チオグアニン、シタラビン（CA）、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロ
クスウリジン（5-FUdR）、メトトレキセート（MTX）、コルヒチン、ビンクリス
チン、ビンブラスチン、エトポシド、テニポシド、シスプラチンおよびジエチル
スチルベストロール（DES）が含まれる。一般的には、The Merck Manual of Dia
gnosis and Therapy,第15版, Berkowら監修, 1987, Rahway, NJ, 1206-1228ペー
ジを参照されたい。限定されるわけではないが非ステロイド抗炎症薬剤およびコ
ルチコステロイドを含む抗炎症薬剤、および限定されるわけではないが、リビビ
リン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含む抗ウイルス薬剤も
また、本発明の組成物と組み合わせてもよい。一般的には、それぞれ、The Merc
k Manual of Diagnosis and Therapy,第15版, Berkowら監修, 1987, Rahway, NJ
, 2499-2506および46-49ページを参照されたい。他の非アンチセンス化学療法剤
もまた、本発明の範囲内である。2つまたはそれ以上の組合せ化合物を、共にま
たは連続的に用いてもよい。

【００６８】別の関連する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸に標的化されてい
る1つまたはそれ以上のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド、および
第二の核酸標的に標的化されている1つまたはそれ以上のさらなるアンチセンス
化合物を含んでもよい。2つまたはそれ以上の組合せ化合物を、共にまたは連続
的に用いてもよい。

【００６９】療法組成物の製剤化およびそれに続く投与は、当業者の技術の範囲内であると
考えられる。投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度および反応性に応じ、
治療過程は数日から数ヶ月、あるいは治癒が達成されるまでまたは疾患状態の軽
減が達成されるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬剤蓄積の測定か
ら計算することが可能である。一般の当業者は、容易に最適投薬、投薬方法論お
よび反復率を決定することが可能である。最適投薬は、個々のオリゴヌクレオチ
ドの相対強度に応じ異なる可能性があり、そして一般的にin vitroおよびin viv
o動物モデルで有効であることが見出されたEC₅₀に基づき、概算することが可能
である。一般的に、投薬は体重1 kg当たり0.01μgないし100 gであり、そして毎
日、毎週、毎月または毎年1回またはそれ以上、あるいは2ないし20年ごとに1回
、投与してもよい。当業者は、体液または組織における、薬剤の測定された滞留
時間および濃度に基づく投薬のための反復率を、容易に概算することが可能であ
る。治療の成功後、患者に疾患状態の再発を防ぐ維持療法を受けさせることが望
ましい可能性があり、ここで、オリゴヌクレオチドは、毎日1回またはそれ以上
、ないし20年ごとに1回、体重1 kg当たり0.01μgないし100 gの範囲の維持用量
で投与される。

【００７０】本発明は特定のその好ましい態様と一致し、特異性を持って記載されているが
、以下の実施例は、本発明を例示するためのみに提供され、そして本発明を限定
することを意図しない。

【００７１】

【実施例】実施例1 オリゴヌクレオチド合成のためのヌクレオシドホスホールアミダイトデオキシおよび2'-アルコキシアミダイト 2'-デオキシおよび2'-メトキシ・ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホ
ールアミダイトは、商業的供給源（例えばChemgenes, Needam, MAまたはGlen Re
search, Inc., Sterling, VA）から購入した。他の2'-O-アルコキシ置換ヌクレ
オシドアミダイトは、本明細書に援用される米国特許5,506,351に記載されるよ
うに、調製する。2'-アルコキシアミダイトを用いて合成されるオリゴヌクレオ
チドに関しては、テトラゾールおよび塩基のパルス送達後の待ち工程を360秒に
増加した以外は、非修飾オリゴヌクレオチドの標準的サイクルを利用した。

【００７２】 5-メチル-2'-デオキシシチジン（5-Me-C）ヌクレオチドを含有するオリゴヌク
レオチドは、商業的に入手可能なホスホールアミダイト（Glen Research, Sterl
ing, VAまたはChemGenes, Needam, MA）を用い、公表されている方法（Sanghvi
ら, Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203）にしたがい、合成した。

【００７３】 2'-フルオロアミダイト 2'-フルオロデオキシアデノシンアミダイト 2'-フルオロオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用されるKawasakiら, J. Me
d. Chem., 1993, 36, 831-841および米国特許5,670,633に以前記載されたように
合成した。簡潔には、商業的に入手可能な9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデ
ニンを出発成分として利用し、そして文献記載の方法を修飾することにより、保
護化ヌクレオシドN6-ベンゾイル-2'-デオキシ-2'-フルオロアデノシンを合成し
、2'-アルファ-フルオロ原子を、2'-ベータ-トリチル基のS_N2置換により導入し
た。したがって、N6-ベンゾイル-9-ベータ-D-アラビノフラノシルアデニンは、3
',5'-ジテトラヒドロピラニル（THP）中間体として、中程度の収量で、選択的に
保護化された。THPおよびN6-ベンゾイル基の脱保護化は、標準的方法論を用い、
達成され、そして標準的方法を用い、5'-ジメトキシトリチル-（DMT）および5'-
DMT-3'-ホスホールアミダイト中間体を得た。

【００７４】 2'-フルオロデオキシグアノシン 2'-デオキシ-2'-フルオログアノシンの合成は、テトライソプロピルジシロキ
サニル（TPDS）保護化された9-ベータ-D-アラビノフラノシルグアニンを出発成
分として、そして中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの変換
を用い、達成した。TPDS基の脱保護化に続き、ヒドロキシル基をTHPで保護化し
、ジイソブチリル・ジTHP保護化アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的O-
脱アシル化およびトリフラート化を行い、粗産物のフルオリドでの処理が続き、
その後、THP基の脱保護化が続いた。標準的方法論を用い、5'-DMTおよび5'-DMT-
3'-ホスホールアミダイトを得た。

【００７５】 2'-フルオロウリジン 2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンの合成は、文献の方法の修飾により達成し
、ここで2,2'-アンヒドロ-1-ベータ-D-アラビノフラノシルウラシルを、70％フ
ルオリド-ピリジン水素で処理した。標準法を用い、5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホス
ホールアミダイトを得た。

【００７６】 2'-フルオロデオキシシチジン 2'-デオキシ-2'-フルオロシチジンは、2'-デオキシ-2'-フルオロウリジンのア
ミノ化を介して合成し、それに続き、選択的保護化によりN4-ベンゾイル-2'-デ
オキシ-2'-フルオロシチジンを得た。標準法を用い、5'-DMTおよび5'-DMT-3'ホ
スホールアミダイトを得た。

【００７７】 2'-O-（2-メトキシエチル）修飾アミダイト 2'-O-メトキシエチル置換ヌクレオシドアミダイトは、以下のように、あるい
はMartin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504の方法にしたがい
、調製する。

【００７８】 2,2'-アンヒドロ［1-（ベータ-D-アラビノフラノシル）-5-メチルウリジン］ 5-メチルウリジン（リボシルチミン、ヤマサ・日本・銚子を通じ商業的に入手
可能）（72.0 g、0.279 M）、炭酸ジフェニル（90.0g、0.420 M）および炭酸水
素ナトリウム（2.0 g、0.024 M）をDMF（300 ml）に添加した。混合物を攪拌し
ながら加熱して還流し、発生する二酸化炭素ガスが調節された方式で放出される
ことを可能にした。1時間後、わずかに黒ずんだ溶液を減圧下で濃縮した。生じ
たシロップを、攪拌しながらジエチルエーテル（2.5 L）に注いだ。産物はゴム
状物質（gum）を形成した。エーテルをデカントし、そして残渣を最少量のメタ
ノール（およそ400 ml）に溶解した。溶液を新鮮なエーテル（2.5 L）に注ぎ、
硬いゴム状物質を得た。エーテルをデカントし、そしてゴム状物質を真空オーブ
ン（60℃、1 mmHgで24時間）で乾燥させ、固体を得て、該固体を粉砕して薄い褐
色の粉末にした（57 g、85％粗収率）。NMRスペクトルは、構造と一致し、ナト
リウム塩としてのフェノールが混入していた（およそ5％）。該成分を、そのま
まさらなる反応に用い、または酢酸エチル中のメタノールの勾配（10-25％）を
用いたカラムクロマトグラフィーにより、さらに精製し、白色固体、mp 222-4℃
を得た。

【００７９】 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン 2,2'-アンヒドロ-5-メチルウリジン（195 g、0.81 M）、トリス（2-メトキシ
エチル）ボレート（231 g、0.98 M）および2-メトキシエタノール（1.2 L）を、
2 lのステンレス圧力容器に添加し、そして160℃にあらかじめ加熱した油槽中に
おいた。155-160℃で48時間加熱した後、容器を開き、そして溶液を蒸発乾固し
、そしてMeOH（200 ml）で磨砕した（triturate）。残渣を熱アセトン（1 L）に
懸濁した。不溶性塩をろ過し、アセトン（150 ml）で洗浄し、そしてろ過物を蒸
発させた。残渣（280 g）をCH₃CN（600 ml）に溶解し、そして蒸発させた。シリ
カゲルカラム（3 kg）を、0.5％Et₃NHを含有するCH₂Cl₂／アセトン／MeOH（20：
5：3）中で充填した。残渣をCH₂Cl₂（250 ml）に溶解し、そしてカラム上に装填
する前に、シリカ（150 g）上に吸着させた。産物を装填溶媒で溶出し、160 g（
63％）の産物を得た。不純分画を再処理することにより、さらなる成分を得た。

【００８０】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン 2'-O-メトキシエチル-5-メチルウリジン（160 g、0.506 M）をピリジン（250
ml）と共蒸発させ、そして乾燥残渣をピリジン（1.3 L）に溶解した。塩化ジメ
トキシトリチル（94.3 g、0.278 M）の第一のアリコートを添加し、そして混合
物を室温で1時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチル（94.3 g、0.278 M）の第二
のアリコートを添加し、そして反応物をさらに1時間攪拌した。その後、メタノ
ール（170 mL）を添加し、反応を停止した。HPLCは、およそ70％の産物の存在を
示した。溶媒を蒸発させ、そしてCH₃CN（200 mL）で磨砕した。残渣をCHCl₃（1.
5 L）に溶解し、そして2×500 mlの飽和NaHCO₃および2×500 mlの飽和NaClで抽
出した。有機相をNa₂SO₄上で乾燥させ、ろ過し、そして蒸発させた。275 gの残
渣を得た。0.5％Et₃NHを含有するEtOAc／ヘキサン／アセトン（5：5：1）で充填
しそして溶出する3.5 kgのシリカゲルカラム上で、残渣を精製した。純粋分画を
蒸発させ、164 gの産物を得た。不純分画からさらにおよそ20 gを得て、総収量1
83 g（57％）を得た。

【００８１】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルウリジン（106 g、0
.167 M）、DMF／ピリジン（562 mlのDMFおよび188 mlのピリジンから調製した3
：1混合物、750 mL）および無水酢酸（24.38 mL、0.258 M）を合わせ、そして室
温で24時間攪拌した。反応は、最初にtlc試料をMeOH添加で反応停止することに
より、tlcによりモニターした。tlcにより判断した場合に反応の完了に際し、Me
OH（50 mL）を添加し、そして混合物を35℃で蒸発させた。残渣をCHCl₃（800 mL
）に溶解し、そして2×200 mlの飽和炭酸水素ナトリウムおよび2×200 mlの飽和
NaClで抽出した。水層を200 mlのCHCl₃で逆抽出した。合わせた有機物を硫酸ナ
トリウムで乾燥させ、そして蒸発させ、122 gの残渣を得た（およそ90％の産物
）。残渣を3.5 kgのシリカゲルカラム上で精製し、そしてEtOAc／ヘキサン（4：
1）を用い溶出した。純粋産物分画を蒸発させ、96 g（84％）を得た。より後の
分画からさらに1.5 gを回収した。

【００８２】 3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-
トリアゾールウリジン CH₃CN（700 mL）に3'-O-アセチル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリ
チル-5-メチルウリジン（96 g、0.144 M）を溶解することにより、第一の溶液を
調製し、そして取り置いた。トリエチルアミン（189 mL、1.44 M）を、CH₃CN（1
L）中のトリアゾール（90 g、1.3 M）の溶液に添加し、-5℃に冷却し、そして
オーバーヘッド攪拌装置を用い、0.5時間攪拌した。POCl₃を、30分かけて、0-10
℃に維持した攪拌溶液に一滴ずつ添加し、そして生じた混合物をさらに2時間攪
拌した。第一の溶液を、45分かけて、後者の溶液に一滴ずつ添加した。生じた反
応混合物を低温室に一晩保存した。反応混合物から塩をろ過し、そして溶液を蒸
発させた。残渣をEtOAc（1 L）に溶解し、そして不溶固体をろ過により除去した
。ろ過物を、1×300 mlのNaHCO₃および2×300 mlの飽和NaClで洗浄し、硫酸ナト
リウム上で乾燥させ、そして蒸発させた。EtOAcで残渣を磨砕し、表題化合物を
得た。

【００８３】 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジンジオキサン（500 mL）およびNH₄OH（30 mL）中の3'-O-アセチル-2'-O-メトキ
シエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチル-4-トリアゾールウリジン（103 g
、0.141 M）の溶液を室温で2時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、そして
残渣をMeOH（2×200 mL）との共沸した。残渣をMeOH（300 mL）に溶解し、そし
て2リットルのステンレス圧力溶液に移した。NH₃ガスで飽和させたMeOH（400 mL
）を添加し、そして容器を100℃に2時間加熱した（tlcは変換が完了したことを
示した）。容器内容物を蒸発乾固させ、そして残渣をEtOAc（500 mL）に溶解し
、そして飽和NaCl（200 mL）で1回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥
させ、そして溶媒を蒸発させ、85 g（95％）の表題化合物を得た。

【００８４】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン 2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチジン（85 g、0.
134 M）をDMF（800 mL）に溶解し、そして安息香酸無水物（37.2 g、0.165 M）
を攪拌しながら添加した。3時間攪拌した後、tlcは反応がおよそ95％完了したこ
とを示した。溶媒を蒸発させ、そして残渣をMeOH（200 mL）と共沸した。残渣を
CHCl₃（700 mL）に溶解し、そして飽和NaHCO₃（2×300 mL）および飽和NaCl（2
×300 mL）で抽出し、MgSO₄上で乾燥させ、そして蒸発させ、残渣（96 g）を得
た。0.5％Et₃NHを含有するEtOAc／ヘキサン（1：1）を溶出溶媒として用い、1.5
kgのシリカカラム上で残渣をクロマトグラフィーした。純粋産物分画を蒸発さ
せ、90 g（90％）の表題化合物を得た。

【００８５】 N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン-3'-アミダイト N4-ベンゾイル-2'-O-メトキシエチル-5'-O-ジメトキシトリチル-5-メチルシチ
ジン（74 g、0.10 M）をCH₂Cl₂（1 L）に溶解した。テトラゾールジイソプロピ
ルアミン（7.1 g）および2-シアノエトキシ-テトラ-（イソプロピル）ホスファ
イト（40.5 mL、0.123 M）を、窒素大気下で、攪拌しながら添加した。生じた混
合物を室温で20時間攪拌した（tlcは反応が95％完了したことを示した）。反応
混合物を飽和NaHCO₃（1×300 mL）および飽和NaCl（3×300 mL）で抽出した。水
性洗浄物をCH₂Cl₂（300 mL）で逆抽出し、そして抽出物を合わせ、MgSO₄上で乾
燥させそして濃縮した。EtOAc／ヘキサン（3：1）を溶出溶媒として用い、1.5 k
gのシリカカラム上で、得られた残渣をクロマトグラフィーした。純粋産物分画
を合わせ、90.6 g（87％）の表題化合物を得た。

【００８６】実施例2 オリゴヌクレオチド合成非置換および置換ホスホジエステル（P＝O）オリゴヌクレオチドを、ヨウ素に
よる酸化を伴う標準的ホスホールアミダイト化学反応を用い、自動化DNA合成装
置（Applied Biosystems モデル380B）上で合成した。

【００８７】ホスホロチオエート（P＝S）は、ホスファイト結合の段階的チア化（thiation
）のため、標準的酸化ビンを、アセトニトリル中の3H-1,2-ベンゾジチオール-3-
オン 1,1-ジオキシドの0.2 M溶液により置き換えた以外、ホスホジエステルオリ
ゴヌクレオチドと同様に、合成する。チア化待ち工程を68秒に増やし、そして続
いてキャッピング工程を行った。CPGカラムからの切断および55℃での濃水酸化
アンモニウム中の脱ブロッキング後、0.5 M NaCl溶液から2.5体積のエタノール
で2回沈殿させることにより、オリゴヌクレオチドを精製した。

【００８８】ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許5,50
8,270に記載されるように調製する。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特
許4,469,863に記載されるように調製する。

【００８９】 3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援
用される、米国特許5,610,289または5,625,050に記載されるように調製する。ホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特
許5,256,775または米国特許5,366,878に記載されるように調製する。

【００９０】アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、
国際公開されたPCT出願PCT／US94／00902およびPCT／US93／06976（それぞれWO
94／17093およびWO 94／02499として公開）に記載されるように調製する。

【００９１】 3'-デオキシ-3'-アミノホスホールアミダイトオリゴヌクレオチドは、本明細
書に援用される、米国特許5,476,925に記載されるように調製する。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、本明細書に援用される、米国特許
5,023,243に記載されるように調製する。

【００９２】ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、共に本明細書に援用される、米国
特許5,130,302または5,177,198に記載されるように調製する。

【００９３】実施例3 オリゴヌクレオシド合成メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（MMI結合オリゴヌクレオシド
と同一）、メチレンジメチル-ヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（MDF結合オリゴ
ヌクレオシドと同一）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシ
ド（アミド-3結合オリゴヌクレオシドと同一）、およびメチレンアミノカルボニ
ル結合オリゴヌクレオシド（アミド-4結合オリゴヌクレオシドと同一および、例
えば交互にMMIおよびP＝OまたはP＝S結合を有する混合バックボーン化合物を、
すべて本明細書に援用される、米国特許5,378,825、5,386,023、5,489,677、5,6
02,240および5,610,289に記載されるように調製する。

【００９４】ホルムアセチルおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、本明
細書に援用される、米国特許5,264,562および5,264,564に記載されるように調製
する。

【００９５】エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される、米国特
許5,223,618に記載されるように調製する。

【００９６】実施例4 PNA合成ペプチド核酸（PNA）は、Peptide Nucleic Acids （PNA）： Synthesis, Prop
erties and Potential Applications, Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry, 19
96, 4,5-23に引用される多様な方法のいずれにしたがって、調製してもよい。こ
れらはまた、本明細書に援用される、米国特許5,539,082、5,700,922および5,71
9,262に従って、調製してもよい。

【００９７】実施例5 キメラオリゴヌクレオチドの合成本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌ
クレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものである可能
性がある。これらには、結合しているヌクレオシドの「ギャップ」部分が、結合
しているヌクレオシドの5'および3'「ウィング」部分の間に置かれる第一のタイ
プ、並びに「ギャップ」部分がオリゴマー化合物の3'または5'末端のいずれかに
位置する第二の「オープン端」タイプが含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレ
オチドはまた、当該技術分野において「ギャップマー」またはギャップ化オリゴ
ヌクレオチドとしても知られる。第二の種類のオリゴヌクレオチドはまた、当該
技術分野において「ヘミマー（hemimer）」または「ウィングマー」としても知
られる。

【００９８】［2'-O-Me］--［2'-デオキシ］--［2'-O-Me］キメラホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド 2'-O-アルキルホスホロチオエートおよび2'-デオキシホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド部分を有するキメラオリゴヌクレオチドは、上述のように、Appl
ied Biosystems自動化DNA合成装置、モデル380Bを用い、合成する。オリゴヌク
レオチドは、自動化合成装置並びにDNA部分のための2'-デオキシ-5'-ジメトキシ
トリチル-3'-O-ホスホールアミダイト並びに5'および3'ウィングのための5'-ジ
メトキシトリチル-2'-O-メチル-3'-O-ホスホールアミダイトを用い、合成する。
テトラゾールおよび塩基の送達後の待ち工程を600秒に増やし、RNAではこれを4
回繰り返し、2'-O-メチルでは2回に増やすことにより、標準的合成周期を修飾す
る。完全に保護化されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そしてリン酸
基を、3：1のアンモニア／エタノール中、室温で一晩、脱保護化し、その後凍結
乾燥する。その後、すべての塩基を脱保護化するため、メタノール性アンモニア
中で室温で24時間処理し、そして試料を再び凍結乾燥する。THF中の1 M TBAFに
、室温で24時間、ペレットを再懸濁し、2'位を脱保護化する。その後、1M TEAA
で反応を停止し、そしてその後、G25サイズ排除カラム上で脱塩する前に、rotov
acにより、試料を1／2体積に減らす。その後、回収したオリゴを、収量および純
度に関し、キャピラリー電気泳動により、そして質量分析により、分光光度的に
解析する。

【００９９】［2'-O-（2-メトキシエチル）］--［2'-デオキシ］--［2'-O-（メトキシエチ
ル）］キメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド［2'-O-メトキシエチル］--［2'-デオキシ］--［2'-O-メトキシエチル］キメ
ラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、2'-O-メチルアミダイトの代わり
に2'-O-（メトキシエチル）アミダイトを置換し、2'-O-メチルキメラオリゴヌク
レオチドに関する上記の方法にしたがい、調製した。

【０１００】［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチ
オエート］--［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌ
クレオチド［2'-O-（2-メトキシエチル）ホスホジエステル］--［2'-デオキシホスホロチ
オエート］--［2'-O-（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメラオリゴヌク
レオチドは、2'-O-メチルアミダイトの代わりに2'-O-（メトキシエチル）アミダ
イトを置換して、2'-O-メチルキメラオリゴヌクレオチドに関する上述の方法に
したがい調製し、ヨウ素で酸化することによりキメラ構造のウィング部分中にホ
スホジエステルヌクレオチド間結合を生成し、そして3,H-1,2-ベンゾジチオール
-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage Reagent）を利用して硫化することにより中
央ギャップにホスホロチオエートヌクレオチド間結合を生成する。

【０１０１】他のキメラオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオシドおよび混合キメラ
オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、本明細書に援用される、米国特許
5,623,065にしたがい、合成する。

【０１０２】実施例6 オリゴヌクレオチド単離調節孔ガラスカラム（Applied Biosystems）からの切断および濃水酸化アンモ
ニウム中での55℃、18時間の脱ブロッキング後、2.5体積のエタノールを用い、0
.5 M NaClからの2回の沈殿により、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシ
ドを精製した。合成されたオリゴヌクレオチドは、変性ゲル上のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により解析し、そして全長成分が少なくとも85％であると判断
された。合成で得られるホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対
量は、³¹P核磁気共鳴分光により、定期的に確認し、そしていくつかの研究では
、オリゴヌクレオチドを、Chiangら, J. Biol. Chem. 1991, 266, 18162-18171
に記載されるように、HPLCにより精製した。HPLC精製成分で得られた結果は、非
HPLC精製成分で得られたものと同様であった。

【０１０３】実施例7 オリゴヌクレオチド合成-96ウェルプレート形式オリゴヌクレオチドは、標準的96ウェル形式で、同時に96の配列を組み立てる
ことが可能な自動化合成装置上で、固相P（III）ホスホールアミダイト化学反応
を介し、合成する。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸
化により、得られる。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニ
トリル中の3,H-1,2 ベンゾジチオール-3-オン 1,1-ジオキシド（Beaucage Reage
nt）を利用した硫化により、生成する。標準的塩基保護ベータ-シアノエチルジ
イソプロピルホスホールアミダイトは、商業的供給者（例えばPE-Applied Biosy
stems, Foster City, CA、またはPharmacia, Piscataway, NJ）から購入する。
非標準的ヌクレオシドは、既知の文献または特許の方法にしたがい、合成する。
これらは、塩基保護化ベータ-シアノエチルジイソプロピルホスホールアミダイ
トとして利用する。

【０１０４】オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃NH₄OHを用い高い温度（55-
60℃）で12-16時間、脱保護化し、そしてその後、遊離した産物を真空で乾燥さ
せる。その後、乾燥産物を無菌水に再懸濁し、マスタープレートを得て、ここか
らその後、すべての解析および試験プレート試料を、ロボットピペッターを利用
し、希釈する。

【０１０５】実施例8 オリゴヌクレオチド解析-96ウェルプレート形式各ウェル中のオリゴヌクレオチド濃度は、試料の希釈およびUV吸収分光により
、評価する。個々の産物の全長完全性（integrity）は、96ウェル形式（Beckman
P／ACE^TM MDQ）で、または個々に調製された試料に関しては商業的CE装置（例
えばBeckman P／ACE^TM 5000、ABI 270）上で、キャピラリー電気泳動（CE）によ
り、評価する。塩基およびバックボーン組成物は、エレクトロスプレー質量分光
法を利用した化合物の質量解析により、確認する。すべてのアッセイ試験プレー
トは、単一または多チャンネルロボットピペッターを用い、マスタープレートか
ら希釈する。プレート上の少なくとも85％の化合物が少なくとも85％全長である
場合、プレートは許容しうると判断する。

【０１０６】実施例9 細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理アンチセンス化合物の標的核酸発現に対する効果は、標的核酸が測定可能なレ
ベルで存在する限り、様々な細胞種のいずれにおいて試験してもよい。これは、
例えばPCR、RNase保護アッセイ（RPA）またはノーザンブロット解析を用い、日
常的に測定することが可能である。以下の4つのヒト細胞種は、例示目的のため
提供されるが、他の細胞種も日常的に用いることが可能である。

【０１０７】 T-24細胞：移行上皮膀胱癌細胞株T-24は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（ATCC）（Manassas, VA）から得る。T-24細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco
／Life Technologies, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100単位／mL、およびス
トレプトマイシン100マイクログラム／ml（Gibco／Life Technologies, Gaither
sburg, MD）を補った、完全McCoyの5A基本培地（Gibco／Life Technologies, Ga
ithersburg, MD）中で日常的に培養する。細胞は、90％集密に達したとき、トリ
プシン処理および希釈により日常的に継代する。RT-PCR解析に使用するには、細
胞を96ウェルプレート（Falcon-Primaria ＃3872）に、7000細胞／ウェルの密度
で蒔く。

【０１０８】ノーザンブロッティングまたは他の解析には、細胞を、100 mmまたは他の標準
的な組織培養プレートに蒔き、そして適切な体積の培地およびオリゴヌクレオチ
ドを用い、同様に処理してもよい。

【０１０９】 A549細胞：ヒト肺癌細胞株A549は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（AT
CC）（Manassas, VA）から得る。A549細胞は、10％ウシ胎児血清（Gibco／Life
Technologies, Gaithersburg, MD）、ペニシリン100単位／mL、およびストレプ
トマイシン100マイクログラム／ml（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg,
MD）を補った、DMEM基本培地（Gibco／Life Technologies, Gaithersburg, MD
）中で日常的に培養する。細胞は、90％集密に達したとき、トリプシン処理およ
び希釈により日常的に継代する。

【０１１０】 NHDF細胞：ヒト新生皮膚線維芽細胞（NHDF）は、Clonetics Corporation（Walkersville,
MD）から得る。NHDFは、供給者により推奨されるように補った、線維芽細胞増
殖培地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で日常的に維持する。
細胞は、供給者により推奨されるように、10継代まで維持する。

【０１１１】 HEK細胞：ヒト胚性角化細胞（HEK）は、Clonetics Corporation（Walkersville, MD）か
ら得る。HEKは、供給者により推奨されるように製剤化された、角化細胞増殖培
地（Clonetics Corporation, Walkersville, MD）中で日常的に維持する。細胞
は、供給者により推奨されるように、10継代まで維持する。

【０１１２】アンチセンス化合物での処理：細胞が80％集密に達したとき、オリゴヌクレオチドで処理する。96ウェルプレ
ートで増殖させた細胞に関しては、ウェルを200μlのOPTI-MEM^TM-1血清減少培地
（Gibco BRL）で1回洗浄し、そしてその後、3.75μg／mlのLIPOFECTIN^TM（Gibco
BRL）および最終濃度150 nMの望ましいオリゴヌクレオチドを含有する、130μl
のOPTI-MEM^TM-1で処理する。処理4時間後、培地を新鮮な培地で置き換える。細
胞は、オリゴヌクレオチド処理16時間後に採取する。

【０１１３】実施例10 bcl-x発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析 bcl-x発現のアンチセンスモジュレーションは、当該技術分野において知られ
る多様な方法でアッセイすることが可能である。例えばbcl-x mRNAレベルを、ノ
ーザンブロット解析、RNase保護アッセイ（RPA）、競合ポリメラーゼ連鎖反応（
PCR）、またはリアルタイムPCR（RT-PCR）により、定量化してもよい。RNA解析
は、総細胞RNAまたはポリ（A）+ mRNAに対し、行ってもよい。RNA単離の方法は
、例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John W
iley ＆ Sons, Inc., 1993, pp.4.1.1-4.2.9および4.5.1-4.5.3に解説される。
ノーザンブロット解析は、当業で日常的であり、そして例えばAusubelら, Curre
nt Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1996
, 4.2.1-4.2.9に解説される。リアルタイム定量的PCRは、PE-Applied Biosystem
s, Foster City, CAから入手可能な、商業的に入手可能なABI PRISM^TM 7700配列
検出系を用いて好適に達成して、そして製造者の指示にしたがって用ることがで
きる。PCRの他の方法もまた、当該技術分野において知られる。

【０１１４】 bcl-xタンパク質レベルは、当該技術分野において周知の多様な方法、例えば
免疫沈降、ウェスタンブロット解析（イムノブロッティング）、ELISA、フロー
サイトメトリーまたは蛍光活性化細胞分取（FACS）で定量化することができる。
bcl-xに対する抗体を同定し、そして多様な供給源、例えばPharMingen Inc., Sa
n Diego, CAから得てもよく、または慣用的な抗体生成法を介し、調製してもよ
い。ポリクローナル抗血清を調製するための方法は、例えばAusubelら, Current
Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1997,
pp.11.12.1-11.12.9に解説される。モノクローナル抗体の調製は、例えばAusube
lら, Current Protocols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons,
Inc., 1997, pp.11.4.1-11.11.5に解説される。

【０１１５】免疫沈降法は、当業で標準的であり、そして例えばAusubelら, Current Proto
cols in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1998, pp.10.
16.1-10.16.11に見出すことが可能である。ウェスタンブロット（イムノブロッ
ト）解析は、当業で標準的であり、そして例えばAusubelら, Current Protocols
in Molecular Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1997, pp.10.8.1-
10.8.21に見出すことが可能である。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、当
業で標準的であり、そして例えばAusubelら, Current Protocols in Molecular
Biology, 第2巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1991, pp.11.2.1-11.2.22に見出
すことが可能である。

【０１１６】実施例11 ポリ（A）+ mRNA単離ポリ（A）+ mRNAは、Miuraら, Clin. Chem., 1996, 42, 1758-1764にしたがい
単離する。ポリ（A）+ mRNA単離のための他の方法は、例えばAusubelら, Curren
t Protocols in Molecular Biology, 第1巻, John Wiley ＆ Sons, Inc., 1993,
pp.4.5.1-4.5.3に解説される。簡潔には、96ウェルプレート上で増殖させた細
胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、そして各ウェルを200μlの冷PBSで
洗浄する。60μlの溶解緩衝液（10 mM Tris-HCl、pH 7.6、1 mM EDTA、0.5 M Na
Cl、0.5％NP-40、20 mM バナジル・リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加
し、プレートを穏やかに攪拌し、そしてその後、室温で5分間インキュベーショ
ンする。55μlの溶解物をオリゴd（T）被覆96ウェルプレート（AGCT Inc., Irvi
ne, CA）に移す。プレートを室温で60分間インキュベーションし、200μlの洗浄
緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 7.6、1 mM EDTA、0.3 M NaCl）で3回洗浄する。最
後の洗浄の後、プレートの水分を紙タオル上で吸い取り、過剰な洗浄緩衝液を除
去し、そしてその後5分間風乾する。あらかじめ70℃に加熱した60μlの溶出緩衝
液（5 mM Tris-HCl、pH 7.6）を、各ウェルに添加し、プレートを90℃のホット
プレート上で5分間インキュベーションし、そして溶出物をその後、新鮮な96ウ
ェルプレートに移す。

【０１１７】 100 mmまたは他の標準的プレート上で増殖させた細胞は、すべての溶液を適切
な体積で用い、同様に処理してもよい。

【０１１８】実施例12 総RNA単離総mRNAは、Quiagen Inc.（Valencia, CA）から購入したRNEASY 96^TMキットお
よび緩衝液を用い、製造者の推奨する方法にしたがい、単離する。簡潔には、96
ウェルプレート上で増殖させた細胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、20
0μlの冷PBSで洗浄する。100μlの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、そしてプレー
トを20秒間、激しく攪拌する。その後、100μlの70％エタノールを各ウェルに添
加し、そして上下に3回ピペッティングすることにより、内容物を混合する。そ
の後、廃水収集トレーを取り付けそして真空供給源につないだQIAVAC^TMマニホー
ルドにつないだRNEASY 96^TMウェルプレートに試料を移す。真空を15秒間適用す
る。1 mlの緩衝液RW1をRNEASY 96^TMプレートの各ウェルに添加し、そして再び真
空を15秒間適用する。その後、1 mlの緩衝液RPEをRNEASY 96^TMプレートの各ウェ
ルに添加し、そして真空を15秒間適用する。その後、緩衝液RPE洗浄を繰り返し
、そして真空をさらに10分間適用する。その後、プレートをQIAVAC^TMマニホール
ドから除き、そして紙タオルで水分を吸い取る。その後、プレートを再び、1.2
mLの収集試験管を含有する収集試験管ラックを取り付けたQIAVAC^TMマニホールド
につなぐ。その後、60μLの水を各ウェルにピペッティングすることによりRNAを
溶出し、1分間インキュベーションし、そしてその後、真空を30秒間適用する。
さらに60μLの水で、溶出段階を繰り返す。

【０１１９】実施例13 bcl-x mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR解析 bcl-x mRNAレベルの定量は、製造者の指示にしたがい、ABI PRISM^TM 7700配列
検出系（PE-Applied Biosystems, Foster City, CA）を用い、リアルタイム定量
的PCRにより、測定する。これは、閉鎖試験管のゲルに基づかない蛍光検出系で
あり、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のハイスループット定
量化を可能にする。増幅産物がPCRの完了後に定量化される、標準的PCRと対照的
に、リアルタイム定量的PCRの産物は、蓄積するにつれ、定量化される。これは
、PCR反応中に、フォワードおよびリバースPCRプライマーの間で特異的にアニー
リングし、そして2つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含む
ことにより、達成される。リポーター色素（例えば、Operon Technologies Inc.
, Alameda, CA、またはPE-Applied Biosystems, Foster City, CAのいずれかか
ら得られる、JOEまたはFAM）をプローブの5'端に結合させ、そしてクエンチャー
色素（例えば、Operon Technologies Inc., Alameda, CA、またはPE-Applied Bi
osystems, Foster City, CAのいずれかから得られる、TAMRA）をプローブの3'端
に結合させる。プローブおよび色素が無傷の場合、レポーター色素発光は、3'ク
エンチャー色素が近接することにより、消光される。増幅中、プローブが標的配
列にアニーリングすることにより、Taqポリメラーゼの5'-エキソヌクレアーゼ活
性により、切断することが可能な基質が生成される。PCR増幅周期の伸長期中、T
aqポリメラーゼによるプローブの切断は、残りのプローブから（そしてしたがっ
てクエンチャー部分から）リポーター色素を遊離させ、そして配列特異的蛍光シ
グナルが生成される。各周期で、さらなるレポーター色素分子がそれぞれのプロ
ーブから切断され、そしてABI PRISM^TM 7700配列検出系に取り付けられたレーザ
ー光学系により、蛍光強度が規則正しい間隔でモニターされる。各アッセイにお
いて、未処理コントロール試料由来のmRNAの一連の希釈を含有する一連の平行反
応は、標準曲線を生成し、それを使用して試験試料のアンチセンスオリゴヌクレ
オチド処理後、阻害パーセントを定量化する。

【０１２０】 PCR試薬は、PE-Applied Biosystems, Foster City, CAから得る。RT-PCR反応
は、25μlのPCRカクテル（1×TAQMAN^TM緩衝液A、5.5 mM MgCl₂、各300μMのdATP
、dCTPおよびdGTP、600μMのdUTP、各100 nMのフォワードプライマー、リバース
プライマー、およびプローブ、20単位のRNase阻害剤、1.25単位のAMPLITAQ GOLD ^TM 、および12.5単位のMuLV逆転写酵素）を、25μlのポリ（A）mRNA溶液を含有す
る96ウェルプレートに添加することにより、行う。RT反応は、48℃で30分間イン
キュベーションすることにより、行う。95℃で10分間インキュベーションし、AM
PLITAQ GOLD^TMを活性化した後、40周期の2段階PCRプロトコルを行う：95℃で15
秒間（変性）の後、60℃で1.5分間（アニーリング／伸長）。bcl-xプローブおよ
びプライマーは、配列番号1として本明細書に取り込まれる、公表された配列情
報（Boiseら, Cell,1993, 74：597-608；GenBank寄託番号L20121；遺伝子座名（
locus name）HSBCLXL）を用い、ヒトbcl-x核酸配列にハイブリダイズするよう設
計する。

【０１２１】実施例14 bcl-x mRNAレベルのノーザンブロット解析アンチセンス処理18時間後、細胞単層を冷PBSで2回洗浄し、そして1 mlのRNAZ
OL^TM（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）で溶解した。製造者が推奨する
プロトコルにしたがい、総RNAを調製した。20マイクログラムの総RNAを、MOPS緩
衝系（AMRESCO, Inc., Solon, OH）を用い、1.1％ホルムアルデヒドを含有する1
.2％アガロースゲルを通じた電気泳動により、分画した。ノーザン／サザントラ
ンスファー緩衝系（TEL-TEST “B” Inc., Friendswood, TX）を用い、一晩、キ
ャピラリートランスファーすることにより、RNAをゲルからHYBOND^TM-N+ナイロン
膜（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）にトランスファーした。RN
AトランスファーはUV視覚化により確認した。STRATALINKER^TM UV Crosslinker 2
400（Staratagene Inc., La Jolla, CA）を用いたUV架橋により、膜を固定した
。

【０１２２】 QUICKHYB^TMハイブリダイゼーション溶液（Staratagene Inc., La Jolla, CA）
を用い、ストリンジェントな条件に関し、製造者の推奨にしたがい、ヒトbcl-x
配列の塩基33-855（Boiseら, 1993, Cell, 74：597-608；GenBank寄託番号第L20
121号）からPCRにより調製した、822塩基対のbcl-x特異的プローブにより膜を探
査した（probed）。装填およびトランスファー効率における変動に関し規準化す
るため、膜を剥がし、そしてグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G
APDH）RNAに関し、探査した（Clontech, Palo Alto, CA）。ハイブリダイズした
膜を、PHOSPHORIMAGER^TMおよびIMAGEQUANT^TMソフトウェアV3.3（Molecular Dyna
mics, Sunnyvale, CA）を用い、視覚化し、そして定量化した。データは、非処
理コントロールにおけるGAPDHレベルに対し、規準化した。

【０１２３】実施例15 mRNAレベルの解析のためのRNase保護アッセイリボヌクレアーゼ（RNase）保護アッセイは、発現レベルを定量化するための
感度の高いそして特異的な方法である（Zinnら, Cell, 1983, 34：865-79）。該
方法は、DNAテンプレートからのin vitro転写³²P標識アンチセンスRNAプローブ
に対する標的RNAのハイブリダイゼーションに基づく。RNase処理に続き、一本鎖
RNAおよび過剰なプローブの分解が生じる。プローブおよび標的RNAを変性ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により分離し、オートラジオグラフィーまたはベータ
画像化装置を用い、「保護化」プローブを視覚化する。各々異なる長さを持ち、
そして異なるmRNA種における配列に相当する、一連の生物学的に適切なテンプレ
ートを含有する、テンプレートセットを購入してもよい（PharMingen Inc., San
Diego, CA）。各テンプレートセットは、単一の反応混合物において、内部コン
トロールとして利用可能である、1つまたはそれ以上のハウスキーピング遺伝子
、L32およびGAPDHに加え、11までの特有の遺伝子メッセージを検出することが可
能である。これらのテンプレートセットは、単一の試料から多数の測定を行うこ
とを可能にする。多プローブRPAは、標準法により得られる総RNA調製物に対し、
ポリ-A+ RNAのさらに精製することなしに、行うことが可能である。

【０１２４】オリゴヌクレオチドは、RIBOQUANT^TM RNase保護キット（Pharmingen, San Die
go, CA）を用い、総bcl-x mRNAレベルに加え、bcl-xsおよびbcl-xl mRNAレベル
に対するそれぞれの影響に関し、評価した。すべてのアッセイは、製造者のプロ
トコルにしたがい、行った。簡潔には、多プローブDNAテンプレートセットを用
い、dUTP-³²Pで放射標識したアンチセンスRNA転写物を生成した。アポトーシス
遺伝子に関し、用いられるテンプレートセットは、ヒトhAPO-2セットであった。
これらの放射標識プローブを、典型的には10μgの総細胞RNAと一晩ハイブリダイ
ズさせた。その後、反応混合物を一本鎖RNaseで消化し、保護化断片を生成し、
該断片を5％アクリルアミド／尿素ゲルを通じ、電気泳動した。PhosphorImager
（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用い、保護化バンドを視覚化し、そ
して定量化した。

【０１２５】実施例16 bcl-x発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド本発明に従って、公表された配列（Boise, L.H.ら, Cell,1993, 74, 597-608
；GenBank寄託番号第L20121号、またGenbank寄託番号第Z23115号としても記載さ
れる；遺伝子座名「HSBCLXL」、本明細書に配列番号1として取り込まれる）を用
い、ヒトbcl-x RNAの異なる領域を標的とする、一連のオリゴヌクレオチドを設
計した。該オリゴヌクレオチドを表1に示す。標的部位は、該オリゴヌクレオチ
ドが結合する配列供給源参考文献（Genbank寄託番号第L20121号）に提供される
ようなヌクレオチド番号により示される。表1中のすべての化合物は、全体的に
ホスホロチオエートバックボーン（ヌクレオシド間結合）を持つ、オリゴデオキ
シヌクレオチドである。

【０１２６】表1 ヒトbcl-xホスホロチオエートオリゴヌクレオチド

【０１２７】

【表１】

【０１２８】¹ すべての結合はホスホロチオエート結合である。 ²Genbank寄託番号第L20121号、遺伝子座名「HSBCLXL」、配列番号1由来の位置
（coordinate）³ エクソン1Lと示されている箇所では、オリゴヌクレオチドはbcl-xの長いmRNA転
写物を標的とするが、短いmRNA転写物を標的としない。

【０１２９】オリゴヌクレオチドは、実施例14に記載されるように、ノーザンブロット解析
により、試験した。オリゴヌクレオチドは、400 nMの濃度で、A549細胞において
、試験した。結果を表2に示す。

【０１３０】表2 ヒトbcl-xを標的とするアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
の、bcl-x mRNAレベルに対する影響

【０１３１】

【表２】

【０１３２】配列番号3、4、5、6、7、8、9、10、11および12は、bcl-xmRNAレベルを50％以
上阻害した。これらのうち、配列番号3、4、5、7、8および11はbcl-x mRNAレベ
ルを85％以上阻害した。

【０１３３】実施例17 ISIS 11219（配列番号3）およびISIS 11224（配列番号8）の用量反応解析用量反応実験を行い、ISIS 11219および11224を用いたオリゴヌクレオチド処
理後、ノーザンブロットにより、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量化し
た。これらの化合物に関し得られたIC₅₀は、それぞれおよそ250 nMおよび175 nM
であった。

【０１３４】実施例18 bcl-x発現のアンチセンス阻害-ホスホロチオエート2'-MOEギャップマーオリゴ
ヌクレオチドヒトbcl-xを標的とする第二の一連のオリゴヌクレオチドを合成した。該オリ
ゴヌクレオチド配列を表3に示す。標的部位は、該オリゴヌクレオチドが結合す
る配列供給源参考文献（Genbank寄託番号第L20121号）に提供されるようなヌク
レオチド番号により示される。

【０１３５】表3中のすべての化合物は、長さ20ヌクレオチドで、5ヌクレオチドの「ウィン
グ」が両端（5'および3'方向）に隣接する、10の2'-デオキシヌクレオチドから
なる中央「ギャップ」領域で構成される、キメラオリゴヌクレオチド（「ギャッ
プマー」）である。ウィングは、2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）ヌクレオチド
で構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全
体でホスホロチオエート（P＝S）である。2'-MOEウィング中のシチジン残基は、
5-メチルシチジンである。

【０１３６】表3 ヒトbcl-xキメラオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列

【０１３７】

【表３】

【０１３８】¹ 太字の残基は2'-MOE残基（他は2'-デオキシ）。2'-MOEシトシンは、5-メチル-
シトシンである；すべての結合はホスホロチオエート結合である。 ²Genbank寄託番号第L20121号、遺伝子座名「HSBCLXL」、配列番号1由来の位置
。

【０１３９】オリゴヌクレオチドは、実施例14に記載されるように、ノーザンブロット解析
により、試験した。キメラオリゴヌクレオチドは、200 nMの濃度で、A549細胞に
おいて、試験した。結果を表2に示す。存在する箇所では、「N.D.」は、「測定
されない」を示す。

【０１４０】表4 ヒトbcl-xを標的とするキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドの、bcl-x mRN
Aレベルに対する影響

【０１４１】

【表４】

【０１４２】試験したキメラオリゴヌクレオチドのうち、配列番号35以外はすべて、少なく
とも60％、bcl-x mRNAレベルを阻害した。これらのうち、配列番号20-27、31、3
2、37、3および2は、80％またはそれ以上、bcl-x mRNAレベルを阻害した。

【０１４３】実施例19 A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルに対するISIS 15999およびミスマッチの用
量反応効果：用量反応実験を行い、ISIS 15999およびISIS 15999配列に基づくが、15999配
列との2、4、6または8のミスマッチを持つ化合物を用いたオリゴヌクレオチド処
理後、ノーザンブロットにより、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量化し
た。ISIS 15999に関し得られるIC₅₀は、試験した最低のオリゴヌクレオチド用量
、25 nMで、bcl-x mRNAレベルのおよそ70％の減少が得られ、そして50 nMないし
200 nMのオリゴヌクレオチド用量が90％を超える阻害を生じ、最高用量でbcl-x
mRNAのほとんど完全な除去を生じたため、25 nMよりはるかに下であると概算さ
れた。2または4のミスマッチを持つオリゴヌクレオチドは、試験した最高用量、
およそ200 nMのIC₅₀を有し、そして6または8のミスマッチを持つオリゴヌクレオ
チドは、コントロールレベル以下にmRNAレベルを阻害しなかった。

【０１４４】実施例20 A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルに対するISIS 16009およびミスマッチの用
量反応効果：用量反応実験を行い、ISIS 16009およびISIS 16009配列に基づくが、16009配
列との2、4、6または8のミスマッチを持つ化合物を用いたオリゴヌクレオチド処
理後、ノーザンブロット解析により、A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルを定量
化した。ISIS 16009に関し得られたIC₅₀は、40-50 nMであると概算された。試験
したいかなる用量（25-200 nM）でもmRNAレベルの50％阻害が達成されなかった
ため、ミスマッチオリゴヌクレオチドに関しては、IC₅₀は得られなかった。

【０１４５】実施例21 ISIS 15999および16009の最適化 ISIS 15999（配列番号21）およびISIS 16009（配列番号31）のいくつかの類似
体を調製した。これらは、2'-O-メトキシエチル（2'-MOE）修飾の多様な配置、
および均質なホスホロチオエート（P＝S）バックボーン、または2'-O-メトキシ
エチルウィングがホスホジエステル（P＝O）バックボーンを有し、そしてデオキ
シギャップがホスホロチオエート（P＝S）バックボーンを有するキメラバックボ
ーンのいずれかを有した。これらの化合物を表5に示す。すべての2'-MOEシトシ
ンは、5-メチル-シトシン（5-meC）である。

【０１４６】表5 ISIS 15999および16009の類似体

【０１４７】

【表５】

【０１４８】¹ 太字の残基は2'-MOE残基である（他は2'-デオキシである）。2'-MOEシトシンは
すべて、5-メチル-シトシンであった；結合はホスホロチオエート（P＝S）結合
に関しては「s」と示され、そしてホスホジエステル（P＝O）結合に関しては「o
」と示される。

【０１４９】実施例22 A549細胞におけるbcl-x mRNAレベルに対するISIS 16009および類似体の用量反
応効果：用量反応実験を行い、ISIS 16009および表5に示される類似体を用いたオリゴ
ヌクレオチド処理後、ノーザンブロット解析により、A549細胞におけるbcl-x mR
NAレベルを定量化した。オリゴヌクレオチドは、50、100、150および200 nMの濃
度で試験した。得られたIC₅₀は表6に示す。ISIS 17619（P＝S、完全デオキシ）
に関しては、200 nMまでの用量で、bcl-x mRNAの50％減少が達成されなかったた
め、IC₅₀は得られなかった。

【０１５０】表6 配列番号31の類似体に関するIC₅₀

【０１５１】

【表６】

【０１５２】実施例23 bcl-xタンパク質レベルのウェスタンブロット解析標準法を用い、ウェスタンブロット解析（イムノブロット解析）を行った。一
般的には、オリゴヌクレオチド処理16-20時間後、細胞を採取し、PBSで1回洗浄
し、Laemmli緩衝液に懸濁し（100μl／ウェル）、5分間煮沸し、そして16％SDS-
PAGEゲル上に装填した。ゲルを150 Vで1.5時間泳動し、そしてウェスタンブロッ
トのため、膜にトランスファーした。bcl-xに対する、適切な一次抗体を用い、
一次抗体種に対する放射標識または蛍光標識二次抗体を用いた。PHOSPHORIMAGER ^TM （Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用い、バンドを視覚化した。

【０１５３】 A549において、bcl-xタンパク質レベルを減少させる能力に関し、ISIS 15999
および16009を試験した。両化合物は、用量依存方式で、bcl-xタンパク質レベル
を減少させることが見出された。

【０１５４】実施例24 SEM-K2細胞におけるbcl-xタンパク質レベルに対するISIS 15999の影響 SEM-K2は、t（4；11）急性リンパ芽球性白血病を患う患者由来のヒト細胞株で
ある。Pocock, C.F.E.ら, Br. J. Haematol.（1995）, 90（4）, 855-67。増殖
の指数期にあるSEM-K2細胞は、10％ウシ胎児血清、2 mM グルタミンおよびペニ
シリン／ストレプトマイシンを補ったRPMI 1460培地（Life Technologies, Inc.
, Gaithersburg, MD）中で、5％CO₂／95％空気中、37℃で維持した。およそ1-5
×10⁶細胞／mlの体積1 mlの細胞を、24ウェルプレートに移した。1時間後、10μ
MのISIS 15999またはスクランブル化コントロール15691（GACATCCCTTTCCCCCTCGG
；配列番号41）を、陽イオン性脂質なしで、ウェルに添加した。24および48時間
に、5μMオリゴヌクレオチドの反復用量を添加した。細胞は72時間で解析した。

【０１５５】ウェスタンブロットおよびフローサイトメトリータンパク質解析には、細胞を
リン酸緩衝生理食塩水で1回洗浄し、そして1200 rpm、5分間の遠心分離により沈
殿させ、そして細胞溶解緩衝液（5 M NaCl、0.1 M HEPES、500 mM スクロース、
0.5 M EDTA、100 mM スペルミン、1 mg／ml アプロチニン、10％Triton X-100）
に再懸濁し、氷上に15分間置いた。総タンパク質を分光光学的に（BioRad）定量
化し、そして100μgの溶解物を15％ポリアクリルアミドゲル上に装填し、そして
200Vで45分間泳動した。ニトロセルロース膜にタンパク質をトランスファーした
後、マウスモノクローナルbcl-x抗体（Transduction Laboratories, Lexington,
KY）でブロットを免疫染色し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ
抗マウス二次抗体（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）で免疫染色し
た。タンパク質は、ECL（Amersham, Piscataway, NJ）により定性的に視覚化し
、そして写真フィルムに曝露した。フローサイトメトリーのための細胞は、氷上
で、70％エタノール中で30分間固定することにより、浸透させた。2段階免疫染
色は、bcl-xl抗体（Jackson ImmunoResearch Lab., Westr Grove, PA）に続き、
フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗マウス抗体を使用した。細胞
は、FACScalibur^TM作動Cellquestソフトウェア（Becton Dickinson, Franklin L
akes, NJ）を用い、解析した。50,000事象の獲得のため、リンパ球濃縮ゲートを
用いた。FITC蛍光検出のため、対数増幅と共に、蛍光検出装置1を用いた。

【０１５６】 bcl-x染色SEM-K2細胞の蛍光強度中央値は、WINMIDI 2.5ソフトウェアを用い、
測定した。SEM-K2は、免疫蛍光により検出されるように、相対的に高レベルでbc
l-xを発現する。10μMのISIS 15999で処理した集団に関する蛍光強度中央値を、
それぞれ陽性および陰性コントロール試料と比較し、そしてbcl-x発現における
減少パーセントを計算した。10μM ISIS 15999を用い、最初の処理から48時間後
に、bcl-xの50％減少を測定した。

【０１５７】実施例25 SCID-ヒト白血病モデルおよびin vivo bcl-xlアンチセンス処理増殖の指数期にある10⁷のSEM-K2細胞を8匹のSCID-NODマウスに多量（bolus）
（無菌生理食塩水に懸濁）として皮下注射した。移植および腫瘍形成は、2-3週
間の期間に渡り起こった。14日かけて、連続皮下注入を送達することが可能なMi
cro Alzetポンプ（Alza, Newark, DE）を用い、100μg／日の用量（5 mg／kgと
等量）のISIS 16009およびスクランブル化コントロールISIS 15691を、それぞれ
3匹の動物の2つの群に送達した。残った2匹の動物には、ビヒクル（無菌生理食
塩水）のみを投与した。

【０１５８】 SCID-hu異種移植片由来のSEM-K2細胞で測定したbcl-xの発現は、ISIS 16009の
5 mg／kg／日等量（100μg／日）の14日の注入により、劇的に減少することが示
された。定量的フローサイトメトリーを用い、コントロールに比べ、平均およそ
90％の発現減少（n＝3）（p＜0.01）が測定された。これは、スクランブル化コ
ントロールオリゴヌクレオチドISIS 15691による、統計的に有意でない（n＝3）
（＜20％、p＜0.3）bcl-xの発現減少に比較された。

【０１５９】実施例26 アポトーシスの刺激および測定屠殺後に異種移植片を取り出し、そして大量の培地中に機械的に分散させた。
密度勾配遠心分離により白血球を精製し、そして培地で洗浄した後、1-5×10⁶細
胞／mlで1 mlの体積に再懸濁した。95％加湿空気／5％CO₂中で、37℃で2時間、
細胞をインキュベーションした後、20μg／mlのVP-16（エトポシド）で24時間に
渡りアポトーシスを誘導した。VP-16で処理した各異種移植片細胞懸濁物を、そ
れぞれの陰性コントロールと対にした。アポトーシスは、光散乱変化の定量化を
用い、非特異的に評価した；側方散乱の減少（クロマチン凝縮による）および前
方散乱の減少（細胞収縮による）は、アポトーシスと関連する初期変化である。
アポトーシスおよび非アポトーシス細胞からなる双峰集団分布をそれぞれ処理お
よび陰性コントロールのアポトーシス指標の概算を可能にするように測定しても
よい。それらの比から、アポトーシスの倍増加を計算した。アポトーシスのより
特異的な測定は、Apo-Alertカスパーゼ-3比色アッセイキット（Clontech, Palo
Alto, CA）を用い、達成した。これはカスパーゼ-3の活性に関する定量的アッセ
イDEVD特異的カスパーゼアッセイで、このカスパーゼ-3とはほとんどの哺乳動物
細胞種においてアポトーシスを仲介すると考えられるカスパーゼファミリーのメ
ンバーである、である。本アッセイは、蛍光分子、7-アミノ-4-トリフルオロメ
チルクマリン（AFC）、または比色分子、p-ニトロアニリド（pNA）いずれかで標
識した、合成テトラペプチド、Asp-Glu-Val-Asp（DEVD；配列番号42）を基質と
して利用する。DEVD依存プロテアーゼ活性は、基質から切断された遊離AFCまた
はpNAの検出により、評価する。CPP32（カスパーゼ-3）により切断され、そして
405 nmでの比色分光測光を用い検出可能な比色基質である、パラニトロアニリド
に結合したDEVDと細胞溶解物をインキュベーションした。OD_405nmの倍増加を用
い、正味VP-16誘導アポトーシスを測定した。

【０１６０】 DEVD-パラニトロアニリド切断により測定されるCPP32活性化の配列特異的増加
を検出した。ISIS 16009処理SCID-huモデル（n＝3）に関し、コントロール異種
移植片よりも、OD_405nmの46％の増加が検出された。スクランブル化コントロー
ルオリゴヌクレオチド処理異種移植片は、VP-16誘導アポトーシス（n＝3）にお
いてほとんど変化を生じず、これはオリゴヌクレオチドで処理しない異種移植片
のものと量的に同様であった。CPP32活性の倍増加に対するbcl-x発現の散乱プロ
ット（scatter plot）（8匹の動物すべてのプール）は、正の相関（r_s＞8）を明
らかにし、bcl-x発現およびVP-16に対するアポトーシス感受性の間の明確な関係
を示唆した。同様の変化プロフィールが、アポトーシスの光散乱測定値において
検出された。アポトーシス指標における配列特異的増加は、ISIS 16009と関連し
；これはISIS 15691（コントロール）処理群または非処理コントロール群では見
られなかった。再び、プールされた散乱プロットは、アポトーシスに対するbcl-
xに関し正の相関（r_s＞8）を示し（光散乱）、強い関係を示唆した。

【０１６１】実施例27 細胞生存率およびクローン原性（clonogenicity）の測定ヨウ化プロピジウム（20μg／ml）をPBS洗浄細胞に添加し、そして側方散乱に
対し蛍光検出装置3を用い、フローサイトメトリーを行った。この荷電色素は生
存細胞から排除され、そしてヨウ化プロピジウムが容易に取り込まれるようにな
った、死んだまたは後期アポトーシス細胞を検出するのに用いることが可能であ
る。生存および非生存細胞を計数し、そして生存分画を計算した。陰性コントロ
ール生存度に対するVP-16の比を測定し、生存度におけるVP-16誘導減少の測定値
を得る。生存細胞はテトラゾリウム塩MTT（Roche Molecular Biochemicals, Ind
ianapolice, IN）を、分光測光により検出可能であり、したがって定量化の手段
を提供する、紫のフォルモザン（formozan）産物に代謝する（還元させる）。細
胞生存度の倍減少は、96時間に測定した。細胞増殖は、in vitroでMTT代謝能力
を増加させ、したがってクローン原性増殖の指標を提供する。陰性コントロール
細胞に対するVP-16処理の倍減少を測定し、クローン原性に対する正味細胞傷害
性効果の測定値を提供した。

【０１６２】 MTT生存率の減少を観察し、そして配列特異的であることが示された。代謝生
存率における倍減少に対するbcl-x発現のプールされた散乱プロット（n＝8）は
負の相関（r_s＝-5）を示し、これはVP-16によりアポトーシスを経験するよう刺
激された細胞を生存させるための利点を提供する、bcl-xの役割と一致する。

【０１６３】実施例28 bcl-xsおよびbcl-xl転写物の発現に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの
影響ヒトbcl-xのエクソン1およびエクソン2の特定の領域、特にエクソン1／エクソ
ン2スプライシング部位の周り、およびbcl-xlに存在するがbcl-xsに存在しない
配列領域中を標的とする、さらなるオリゴヌクレオチドを設計した。これらのオ
リゴヌクレオチドを表7に示す。すべてのバックボーン結合は、ホスホロチオエ
ートであり；すべての2'MOEシトシンは、5-メチルシトシンである。

【０１６４】表7 ヒトbcl-xのエクソン1／エクソン2を標的とするオリゴヌクレオチド

【０１６５】

【表７】

【０１６６】ヒトbcl-xは2つの型、bcl-xlとして知られる長い型、およびbcl-xsとして知ら
れる短い型を有する。これらは、選択的にスプライシングされたmRNA転写物から
生じる。bcl-xlのタンパク質は、大きさおよび構造がbcl-2と類似であり、そし
て増殖因子枯渇に際し細胞死を阻害することが可能であった。bcl-xsのタンパク
質はbcl-xlより63アミノ酸短い。これはbcl-2機能を阻害し、したがってプログ
ラム細胞死（アポトーシス）を促進することが可能である。オリゴヌクレオチド
は、RIBOQUANT^TM RNase保護キット（Pharmingen, San Diego, CA）を用い、総bc
l-x mRNAレベルと共に、bcl-xsおよびbcl-xl mRNAレベルに対するそれぞれの影
響に関し評価した。すべてのアッセイは、製造者のプロトコルにしたがい、行っ
た。結果を表8に示す。

【０１６７】表8 bcl-xsおよびbcl-xlに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響

【０１６８】

【表８】

【０１６９】^* オリゴヌクレオチドを含まないコントロール細胞において、bcl-xs／bcl-xl mR
NA比は17.56である。本欄は、この数字からの変化を示す（すなわち、bcl-xs／b
cl-xl mRNA比が17.56である場合、本欄は「1」と示される）。

【０１７０】 ^**「ND」と示される場合、ゲル上のRNAは定量化することが不可能であった。 ISIS 22783は、bcl-xl転写物（bcl-xs転写物ではない）のエクソン1を標的と
した、完全に2'-MOE、完全にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであり、A5
49細胞において、総bcl-x mRNAレベルを減少させることなく、bcl-xlに対するbc
l-xsの比を17％から293％に変化させることが可能である。すなわち、該オリゴ
ヌクレオチドは、bcl-xl型を減少させたが、bcl-xs型を劇的に増加させた。

【０１７１】別のアポトーシス遺伝子であるbaxを阻害する能力に関し、RNase保護アッセイ
により、ISIS 22783を試験した。該オリゴヌクレオチドはbax mRNAレベルに対し
いかなる影響も持たなかった。ISIS 22783はまた、ネズミbcl-x mRNAに完全に相
補的であり、これにより動物研究に有用となる。

【０１７２】実施例29 他の細胞株におけるbcl-xスプライシング産物のアンチセンス再指示（redirec
tion）先の実施例に示されるA549細胞におけるその活性に加え、ISIS 22783はまた、ヒ
ト293T胚性腎臓癌細胞、ヒトC8161黒色腫細胞およびHeLa細胞においても、bcl-x
l／xsスプライシング産物比を、同様に改変することが可能であった。

【０１７３】実施例30 ISIS 22783配列のさらなる修飾標的に対するアンチセンス化合物の緊密な結合およびヌクレアーゼに対する耐
性を提供する修飾もまた、スプライシング部位の標的化において、特に有用であ
ると考えられる。1つのこうした修飾は、2'-メトキシエトキシ（2'-MOE）修飾で
ある。こうした修飾の他の例は、限定されるわけではないが、2'-ジメチルアミ
ノオキシエトキシ（2'-DMAOE）および2'-アセトアミドを含む糖修飾；モルホリ
ノ、MMIおよびPNAバックボーンなどのバックボーン修飾；およびC-5プロピンな
どの塩基修飾を含む。

【０１７４】 ISIS 22783配列および各糖に2'-DMAOE修飾を有するアンチセンス化合物を、bc
l-xスプライシング産物の比を改変する能力に関し、その2'-MOE類似体に比較し
た。結果を表9に示す。

【０１７５】表9 bcl-xs／bcl-xl比に対する影響に関する、ISIS 22783配列の2'-MOEおよび2'-D
MAOE類似体の比較

【０１７６】

【表９】

【０１７７】こうして2'-MOE化合物に比較すると、2'-DMAOE化合物は、定性的に同様である
が、定量的にはわずかに低い、bcl-xlに対するbcl-xsスプライシング産物の比を
改変する能力を示した。

【０１７８】 22783配列を持つモルホリノバックボーン化合物を用いた予備実験は、RPAによ
り測定されるように優れた活性を示した。化合物は米国特許5,034,506にしたが
い調製し、そして掻爬装填（scrape-loading）により、HeLa細胞にトランスフェ
クションした。Summertonら, 1997, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7, 63
-70。

【０１７９】 ISIS 22783配列（配列番号33）を有するペプチド核酸（PNA）オリゴヌクレオ
チドを、上述の実施例4に記載されるように合成した。該オリゴヌクレオチド（I
SIS 32262）は、PNAバックボーンで全体的に均質に修飾した。5塩基ミスマッチ
化合物（ISIS 32263、配列番号52）もまた、全長PNA同様合成した。BTX Electro
Cell Manipulator 600（Genetronics, San Diego, CA）を用い、200Vパルスで
のエレクトロポレーションにより、これらの化合物でHeLa細胞をトランスフェク
ションし、そしてRNAを24時間後に単離した。bcl-xスプライシングに対するPNA
化合物の影響を表10に示す。

【０１８０】表10

【０１８１】

【表１０】

【０１８２】 bcl-xs／bcl-xl転写物比に対するISIS 22783配列のPNA類似体の影響したがって、PNA化合物もまた、bcl-xスプライシング産物を改変することが可
能であり、そしてしたがって好ましい。

【０１８３】実施例31 初代角化（皮膚）細胞におけるbcl-xl RNAおよびタンパク質のアンチセンス阻
害初代角化細胞である、正常ヒト新生角化細胞（hKn）細胞（Cascade Biologics
, Inc., Portland, OR）をISIS 16009で処理し、そしてbcl-xl mRNAおよびタン
パク質レベルを解析した。細胞は、70-70％集密まで、100 mm組織培養プレート
中で増殖させた。細胞は、陽イオン性脂質の存在下で、以下のように、オリゴヌ
クレオチドでトランスフェクションした。Lipofectin^TM（Gibco／BRL）を10μg
／ml Opti-MEM^TM（Gibco／BRL）の濃度で用いた。5 mlのOpti-MEM^TM、Lipofecti
n^TM、および多様な量のオリゴヌクレオチドの混合物を、室温で30分間平衡化し
た。細胞をOpti-MEM^TMで2回洗浄し、そしてその後、Opti-MEM^TM／Lipofectin^TM
／オリゴヌクレオチド混合物で4時間、処理した。その後、混合物を正常増殖培
地と置き換えた。示される時間、24時間後に、細胞を採取しまたは解析した。ア
ンチセンスまたはスクランブル化オリゴヌクレオチドは、50、100、200または30
0 nMの濃度でトランスフェクションした。RNAeasy^TM法（Qiagen, Valencia, CA
）を用い、細胞から総RNAを採取した。等量のRNA（10-20μg）を、1.1％ホルム
アルデヒドを含有する1.2％アガロースゲル中で分離し、そしてナイロン膜に一
晩トランスファーした。膜を³²P標識bcl-xl、bcl-2またはG3PDH cDNAで探査した
。放射能プローブは、Strip-EZ^TMキット（Ambion, Austin, TX）を用い、生成し
、そしてQuikHyb^TM溶液（Stratagene, La Jolla, CA）を用い、膜にハイブリダ
イズさせた。Molecular Dymnamics PhosphorImagerを用い、RNAの量を定量化し
、そしてG3PDH mRNAレベルに対し規準化した。

【０１８４】 ISIS 15999および16009は、200 nMスクリーニング用量で、bcl-xl mRNA発現の
かなりの（＞90％）阻害を示した。ISIS 16009は、およそ50 nMのIC50で、濃度
依存方式で、hKn細胞におけるbcl-xl mRNAを減少させることが見出された。ISIS
16009、ISIS 20292のスクランブル化コントロールオリゴヌクレオチド（CGACAC
GTACCTCTCGCATT；下線＝2'-MOE、残りは2'-デオキシ；バックボーンはホスホロ
チオエートである；配列番号51）はいかなる影響も持たなかった。他のアポトー
シス遺伝子（A1、Bad、Bak、bcl-2、RiboQuant^TMヒトApo-2プローブセットおよ
びプロトコル（Pharmingen, San Diego, CA）を用いたRNase保護アッセイにより
検出されるようなもの）またはG3PDH（ノーザンブロット解析により検出される
ようなもの）のRNA発現は、ISIS 16009または15999により影響を受けなかった。

【０１８５】 ISIS 16009および15999は、bcl-xlおよびbcl-xs両方に存在するbcl-x遺伝子の
領域にハイブリダイズするが、HUVEC、hKnまたはA549細胞においてbcl-xsの有意
な発現はなく、したがってこれらの化合物は、影響に対しbcl-xsの有意でない貢
献が示されるため、bcl-xl阻害剤とみなされる。

【０１８６】アンチセンス処理hKn細胞におけるbcl-xlタンパク質のレベルは、ウェスタン
解析により、調べた。全細胞抽出物は、細胞をRIPA緩衝液（完全プロテアーゼ阻
害剤混合物（Boehringer Mannheim）を含有する1×PBS、1％NP40、0.1％デオキ
シコール酸、0.1％SDS）中で溶解することにより、調製した。細胞抽出物中のタ
ンパク質濃度は、BioRadキット（BioRad, Hercules, CA）を用いBradfordアッセ
イにより、測定した。その後、等量のタンパク質（10-50μg）を10％SDS-PAGEゲ
ル（Novex, San Diego, CA）上で分離し、そしてPVDF膜（Novex）にトランスフ
ァーした。0.1％Tween-20および5％粉乳を含有するPBS中で、膜を1時間ブロッキ
ングした。1：500希釈のマウスモノクローナルbcl-x抗体（Transduction Labs,
Lexington, KY）と、室温でインキュベーションした後、膜を0.1％Tween-20を含
むPBSで洗浄し、そしてブロッキング緩衝液中の1：5000希釈のヤギ抗マウス西洋
ワサビペルオキシダーゼ結合抗体とインキュベーションした。膜を洗浄し、そし
て化学発光増強（ECL）検出系（Amersham, Piscataway, NJ）を用い、発行させ
た。

【０１８７】処理24時間後、bcl-xlタンパク質レベルは、濃度依存方式で減少した。処理は
、bcl-xlタンパク質の70％以上の阻害を生じた。この減少はトランスフェクショ
ン後48時間に渡り、低いままだった。

【０１８８】実施例32 A549およびhKn細胞の紫外線照射 A549およびhKn細胞がおよそ70-80％集密である、またはオリゴヌクレオチド処
理後24時間たったとき、UV-B光を照射した。UV-B処理直前、細胞をPBSで2回洗浄
し、そしてその後、5-15ワットの312 nm電球を含有する、Stratalinker UV Cros
slinker 1800モデル（Stratagene, La Jolla, CA）中で、UV-B光に曝露した。細
胞を50 mJ／m²、100 mJ／m²または200 mJ／m²のUV-B照射に曝露した。UV-B照射
の用量は、UVX照射測定装置（UVP）を用い、較正した。UV照射後、細胞をさらに
24時間、標準的培地中でインキュベーションした。UV-B処理に関するコントロー
ルプレートは、単にPBSで3回洗浄し、そして標準的培地中でさらに24時間、イン
キュベーションした。ヨウ化プロピジウムでエタノール固定細胞核を染色し、そ
してフローサイトメトリーによりDNA含量を検査することにより、アポトーシス
に関し、細胞を調べた。アポトーシス細胞は、その二倍体以下のDNA含量により
、同定した。細胞を冷PBSで2回洗浄し、そして1 mlの70％エタノールに再懸濁し
た。室温で1時間インキュベーションした後、細胞をPBSで洗浄し、そして1 mlの
ヨウ化プロピジウム染色溶液（50μg／mlヨウ化プロピジウム、0.5 U／ml RNase
A、2000 U／ml RNase T1）に再懸濁した。室温で30分置いた後、Becton Dickin
son Calibur FACS解析装置を用いたフローサイトメトリーにより、細胞周期解析
を行った。FACScanフローサイトメトリー装置を用い、10,000の細胞の個々の核
の蛍光を測定した。結果をアポトーシス細胞パーセントとして示した。

【０１８９】実施例33 UV誘導細胞死に対するA549細胞のアンチセンス感作 A549細胞を100 nMのISIS 22783または5-ミスマッチISIS 26080（CTGGTTACACGA
CTCCAGGT；配列番号52）で処理し、そして紫外線（UV）照射に曝露した。アポト
ーシス細胞パーセントは、標準的方法にしたがい、ヨウ化プロピジウム染色によ
り、定量化した。結果を表11に示す。

【０１９０】表11 ISIS 22783およびUV照射の組み合わせ

【０１９１】

【表１１】

【０１９２】したがって、アポトーシス刺激（照射）に対する反応は、アンチセンス処理後
変化し、アポトーシスの増加を生じた。

【０１９３】実施例34 UV誘導細胞死に対する初代角化細胞のアンチセンス感作 UV照射および他のDNA損傷剤に対する皮膚の曝露は、DNA損傷に対する保護反応
を誘発する。我々は、UV-B誘導アポトーシスに対する角化細胞の耐性におけるbc
l-xlの役割を調べた。A549細胞に関してと同様、ISIS 16009でのhKn細胞の処理
は、UV-B照射により誘導されるアポトーシスに対し、細胞を感作した。オリゴヌ
クレオチドで処理せずまたはコントロールオリゴヌクレオチドで処理し、そして
100 mJ／m²のUV-B照射で照射した細胞の7％未満が、アポトーシスを経験した。
対照的に、細胞を300 nMのbcl-xl阻害剤ISIS 16009でトランスフェクションし、
そして等用量のUV照射で処理した場合、35％を超える細胞がアポトーシスとなっ
た。

【０１９４】実施例35 A549およびhKn細胞のシスプラチン処理シスプラチンは、DNA損傷を引き起こし、そしてアポトーシスを誘導すること
が可能なアルキル化剤である。GillおよびWindebank, 1998, J. Clin. Invest.
101：2842-2850。A549およびhKn細胞がおよそ70-80％集密である、またはオリゴ
ヌクレオチド処理後24時間たったとき、これらの細胞をシスプラチンで処理した
。シス-ジアミンジクロロ白金II（シスプラチン、Sigma, St. Louis, MO）を、1
mg／mlの濃度で再蒸留水に溶解し、そして0.5ないし10μg／mlの用量範囲で、
標準的培地に添加し、そして細胞と24時間インキュベーションした。

【０１９５】実施例36 シスプラチン誘導細胞死に対するA549細胞のアンチセンス感作 A549細胞を100 nM ISIS 22783または5-ミスマッチISIS 26080および多様な用
量のシスプラチンで処理した。アポトーシス細胞パーセントを、標準法にしたが
い、ヨウ化プロピジウムにより、定量化した。結果を表12に示す。

【０１９６】表12 ISIS 22783およびシスプラチンの組み合わせ

【０１９７】

【表１２】

【０１９８】したがって、細胞は、アンチセンス処理後、アポトーシス刺激（この場合、化
学療法薬剤）に感作され、アポトーシスの増加を生じた。

【０１９９】実施例37 シスプラチン誘導細胞死に対するhKn細胞のアンチセンス感作オリゴヌクレオチドでトランスフェクションしない、またはコントロールオリ
ゴヌクレオチドISIS 26080でトランスフェクションしたhKn細胞を、0.5μg／ml
シスプラチンで処理した場合、10％未満の細胞がアポトーシスとなった。hKn細
胞を、bcl-xl阻害剤ISIS 16009および等用量のシスプラチンの組み合わせで処理
すると、25％以上の細胞で死が引き起こされた。

【０２００】実施例38 タキソール誘導細胞死に対するA549細胞のアンチセンス感作 A549細胞を、100 nM ISIS 22783または5-ミスマッチISIS 26080および多様な
用量のタキソールで処理した。アポトーシス細胞パーセントは、標準法にしたが
い、ヨウ化プロピジウム染色により、定量化した。結果を表13に示す。

【０２０１】表13 ISIS 22783およびタキソールの組み合わせ

【０２０２】

【表１３】

【０２０３】したがって、アポトーシス刺激（ここでは細胞傷害性化学療法薬剤）に対する
反応は、アンチセンス処理後変化し、アポトーシスの増加を生じた。

【０２０４】実施例39 bcl-xに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／またはアポトーシス
刺激でのヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）の処理ヒト臍静脈内皮細胞（HUVEC）は、Clonetis（San Diego, CA）から得て、そし
て10％ウシ胎児血清を補った内皮細胞増殖培地（EGM）中で培養した。細胞は継
代2および5の間で用い、そしておよそ80％集密で用いた。細胞を、あらかじめ温
めた（37℃）Opti-MEM^TMで3回洗浄した。50 nM ISIS 16009の濃度で、オリゴヌ
クレオチドを、Opti-MEM^TM中の10μg／ml Lipofectin^TMとあらかじめ混合した。
細胞をオリゴヌクレオチドと37℃で4時間インキュベーションし、その後、培地
を除去し、そして標準的増殖培地と置き換えた。C6-セラミド（Calbiochem, San
Diego, CA）、スタウロスポリン（Calbiochem）、またはz-VAD.fmk（Calbioche
m）での処理は、行うとすれば、オリゴヌクレオチド処理の24時間後に行った。b
cl-xl mRNAレベルは、ノーザンブロット解析により測定し、そしてコントロール
のおよそ5％に減少することが見出され、見かけのIC₅₀は20 nM未満であった。bc
l-xlタンパク質レベルは、ウェスタン解析により測定し、そしてコントロールの
およそ5％であることが見出された。断片化DNAを持つアポトーシス細胞は、二倍
体以下細胞のフローサイトメトリー解析により、同定した。bcl-xタンパク質（
これらの細胞においては、実質的にすべてbcl-xlである）の阻害は、細胞集団の
10-25％にアポトーシスを経験させた。

【０２０５】実施例40 bcl-xl阻害剤ISIS 16009によるアポトーシス刺激に対するHUVEC内皮細胞の感
作スタウロスポリン（タンパク質キナーゼ阻害剤）およびC6-セラミド（脂質二
次メッセンジャー）は、多くの細胞種においてアポトーシスを誘導することが示
されてきている。低用量のスタウロスポリン（2 nM）またはC6-セラミド（5μM
）単独でのHUVECの処理は、細胞DNA断片化（アポトーシスの測定）において、10
-25％のアポトーシス細胞の文脈より、有意な増加を引き起こさなかった。しか
し、ISIS 16009で処理し、bcl-xのレベルが減少した細胞は、これらの用量のア
ポトーシス刺激に対し、より感受性が高く、ISIS 16009およびスタウロスポリン
で処理した試料において、50％を超えるアポトーシス細胞が、そしてISIS 16009
およびセラミドで処理した細胞において、40％を超えるアポトーシス細胞が生じ
た。したがって、bcl-xの阻害は、細胞をこれらのアポトーシス刺激に対し感受
性にする。bcl-x阻害、またはbcl-xに加えスタウロスポリンまたはセラミドによ
り引き起こされたアポトーシスは、カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmkまたはz-DEVD.fm
k（Calbiochem, San Diego, CA）での細胞の処理により、妨げられた。

【０２０６】実施例41 ミトコンドリア機能不全の測定ミトコンドリア膜内外電位（通常Δψmと略される）を評価するため、細胞を1
50 nMの濃度の陽イオン性親油性色素MitoTracker Orange CMTMRos（Molecular P
robes, Eugene, OR）と、37℃で15分間、暗所でインキュベーションした。コン
トロール細胞は、同時に、ミトコンドリア膜間電位を破壊する、プロトノホア、
カルボニルシアニド m-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）（Calbiochem, San D
iego, CA）50μMで処理した。付着および浮遊細胞を共に収集し、1×PBS／2％BS
Aで1回洗浄し、そして4％パラホルムアルデヒドを含有する1 mlのPBS中で、震蘯
しながら15分間室温で固定した。固定細胞を暗所で、4℃で1日保存した後、フロ
ーサイトメトリーにより解析した。

【０２０７】実施例42 ミトコンドリア完全性に対するbcl-x阻害の影響細胞がアポトーシスから保護される、提唱される機構の1つは、ミトコンドリ
ア機能の保護によるものである。bcl-x阻害剤ISIS 16009でHUVECを処理すると、
ミトコンドリア膜内外電位の減少が生じ、これはスタウロスポリンまたはセラミ
ドいずれかにより強力にされた。bcl-xアンチセンス阻害剤単独またはアンチセ
ンスにスタウロスポリンを加えた場合いずれかにより引き起こされる（が、アン
チセンスにセラミドを加えた場合は引き起こされない）ミトコンドリア完全性の
喪失は、カスパーゼ阻害剤z-VAD.fmk（Calbiochem, San Diego, CA）でのHUVEC
の処理により、妨げられた。

【０２０８】実施例43 ヒトbcl-xlのスプライシングを改変するよう設計された、さらなる2'-MOEオリ
ゴヌクレオチドヒトbcl-xlのヌクレオチド699の5'スプライシング部位の上流または該部位に
重複する領域を標的とする、さらなる一連の均質な2'-MOEオリゴヌクレオチドを
設計した。本オリゴヌクレオチドの目的は、スプライシング産物に対する影響を
最適化し、産生されるbcl-xs／bcl-xl転写物の比を増加させることであった。オ
リゴヌクレオチドを表14に示す。バックボーンはすべてホスホロチオエートであ
る。スプライシング部位を架橋し、そしてスプライシングされないヒトbcl-x（b
cl-x-ベータ）をコードする、Genbank寄託番号第U72398号のヌクレオチド555-57
4にハイブリダイズする、ISIS 105751を除き、すべてのヌクレオチド番号はGenb
ank寄託番号第Z23115号のものに対応する。本標的配列は、5'スプライシング部
位の上流の10ヌクレオチド（Genbank寄託番号第Z23115号の689-698位）およびイ
ントロンの10ヌクレオチドに対応する。

【０２０９】表14 ヒトbcl-xlのスプライシングを改変するために設計された、さらなる2'-MOEオ
リゴヌクレオチド

【０２１０】

【表１４】

【０２１１】これらのオリゴヌクレオチドを、RPA解析により検出されるように、A549細胞
におけるbcl-xlおよびbcl-xs mRNAレベルに対するその阻害効果に関し試験した
。結果を表15に示す。オリゴヌクレオチド濃度は200 nMであった。

【０２１２】表15 bcl-xsおよびbcl-xlに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響

【０２１３】

【表１５】

【０２１４】上の表に示されるオリゴヌクレオチドはすべて、少なくとも12倍、bcl-xs／bc
l-xl比を増加させることが可能であり、そしていくつか（106249-106253、26066
、22783および105751）は、表8に示される先の最大値、およそ17倍に比べ、比を
増加させた。ISIS 105751および26066は、bcl-xs／bcl-xl比を、それぞれ45倍お
よび37倍増加させるため、非常に好ましい。この効果は、50ないし400 nMの用量
でISIS 26066に関し測定されるように、用量依存であった。ISIS 26066を、bcl-
x-ベータ（スプライシングされないもの）レベルに関し試験し、そしてまったく
影響を持たなかった。

【０２１５】興味深いことに、bcl-xlの5'スプライシング部位のおよそ15-54ヌクレオチド
上流の領域を標的とするすべてのオリゴヌクレオチドはすべて、スプライシング
の非常に強力な再指示因子（redirector）であり、この領域がスプライシング部
位選択に重要である可能性があることを示す。これは、マウス、ラットおよびブ
タbcl-x配列が、ヌクレオチド654（Genbank寄託番号第Z23115号のヒト配列の番
号付けを用いる）からヌクレオチド698の5'スプライシング部位に同一である事
実により、支持される。したがって、ヌクレオチド698のスプライシング部位か
らおよそ60ヌクレオチド上流（5'方向）に伸長する領域を標的とするオリゴヌク
レオチドが好ましい。スプライシング部位にまたがるオリゴヌクレオチドもまた
、好ましい。

【配列表】

【手続補正書】

【提出日】平成１３年５月２日（２００１．５．２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 31/712 Ａ６１Ｋ 31/7125 ４Ｃ０８６ 31/7125 33/24 33/24 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５Ｃ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号０９／３２３，７４３ (32)優先日平成11年６月２日(1999．6．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ディーン，ニコラス・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州92024，オリベンハイン，ウィスパーウインド・レーン 2110 (72)発明者モニア，ブレット・ピーアメリカ合衆国カリフォルニア州92009，ラ・コスタ，ヌーバ・カスティーリャ・ウェイ 7605 (72)発明者ニッコロフ，ブライアン・ジェイアメリカ合衆国イリノイ州60521−8396，バーリッジ，ターンベリー・コート４ (72)発明者ザン，キンキンアメリカ合衆国カリフォルニア州92130，サンディエゴ，ルエット・デ・メール 5370 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA05 DA02 EA04 GA11 HA17 4B065 AA90X AB01 BA01 CA44 4C057 AA18 BB04 BB05 CC03 DD02 MM09 4C076 AA16 CC27 4C084 AA13 MA01 NA14 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 BA02 EA16 HA10 MA01 MA04 NA14 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】長さ8ないし30ヌクレオ塩基で、ヒトbcl-xをコードする核酸
分子を標的とするアンチセンス化合物であって、ヒトbcl-xの発現をモジュレー
ションする、前記アンチセンス化合物。
【請求項２】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1のアンチ
センス化合物。
【請求項３】アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、31、32、33
、34、36、37、38、39、40、43、44、46、53、54、55、56、57、58、59、50、61
、62、63、64、65または66を含む、請求項2のアンチセンス化合物。
【請求項４】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾ヌ
クレオシド間結合を含む、請求項2のアンチセンス化合物。
【請求項５】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシド間結合
が、ホスホロチオエート結合、モルホリノ結合またはペプチド核酸結合である、
請求項4のアンチセンス化合物。
【請求項６】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾糖
部分を含む、請求項2のアンチセンス化合物。
【請求項７】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾糖部分が、2'-O-メ
トキシエチル糖部分または2'-ジメチルアミノオキシエトキシ糖部分である、請
求項6のアンチセンス化合物。
【請求項８】アンチセンスオリゴヌクレオチドの実質的にすべての糖部分
が修飾糖部分である、請求項6のアンチセンス化合物。
【請求項９】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾ヌ
クレオ塩基を含む、請求項2のアンチセンス化合物。
【請求項１０】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオ塩基が5-
メチルシトシンである、請求項9のアンチセンス化合物。
【請求項１１】アンチセンスオリゴヌクレオチドの各2'-O-メトキシエチ
ル修飾シトシンヌクレオ塩基が5-メチルシトシンである、請求項7のアンチセン
ス化合物。
【請求項１２】キメラオリゴヌクレオチドである、請求項2のアンチセン
ス化合物。
【請求項１３】請求項1のアンチセンス化合物および薬学的に許容しうる
キャリアーまたは希釈剤を含む組成物。
【請求項１４】さらにコロイド分散系を含む、請求項13の組成物。
【請求項１５】アンチセンス化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドで
ある、請求項13の組成物。
【請求項１６】 bcl-xlを標的とする、請求項1のアンチセンス化合物。
【請求項１７】 bcl-xlをコードする核酸分子を標的とし、そしてbcl-xlの
発現を優先的に阻害する、請求項1のアンチセンス化合物。
【請求項１８】 bcl-xsをコードする核酸分子に見られない、bxl-xlをコー
ドする核酸分子の領域を標的とする、請求項17のアンチセンス化合物。
【請求項１９】アポトーシスを促進する、請求項17のアンチセンス化合物
。
【請求項２０】 bcl-xsをコードする核酸分子の領域を標的とし、そしてbc
l-xsの発現を減少させる、請求項1のアンチセンス化合物。
【請求項２１】アポトーシスを阻害する、請求項20のアンチセンス化合物
。
【請求項２２】細胞または組織により発現されるbcl-xアイソフォームの
比を改変する、請求項1のアンチセンス化合物。
【請求項２３】発現されるbcl-xsに対するbcl-xlの比を増加させる、請求
項22のアンチセンス化合物。
【請求項２４】発現されるbcl-xsに対するbcl-xlの比を減少させる、請求
項22のアンチセンス化合物。
【請求項２５】 bcl-xアイソフォームの比が改変されるように、ヒトbcl-x
をコードするRNAのスプライシングを改変する、アンチセンス化合物。
【請求項２６】第一および第二の選択的スプライシング部位を含むRNA転
写物を標的とし、該転写物と接触した際、生じるRNAスプライシング産物の比が
改変されるように、前記の第二のスプライシング部位でのスプライシングの相対
頻度を減少させる、アンチセンス化合物。
【請求項２７】前記の第二のスプライシング部位の5'側の60ヌクレオチド
以内のRNA領域の少なくとも一部を標的とする、請求項26のアンチセンス化合物
。
【請求項２８】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項26のアン
チセンス化合物。
【請求項２９】アンチセンスオリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾
糖部分を含む、請求項28のアンチセンス化合物。
【請求項３０】アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾糖部分が、2'-O-
メトキシエチル糖部分または2'-ジメチルアミノオキシエトキシ糖部分である、
請求項29のアンチセンス化合物。
【請求項３１】アンチセンスオリゴヌクレオチドの実質的にすべての糖部
分が修飾糖部分である、請求項29のアンチセンス化合物。
【請求項３２】ヒトbcl-xをコードする核酸を標的とする、請求項25のア
ンチセンス化合物。
【請求項３３】配列番号1のヌクレオチド638ないし698の領域の少なくと
も一部を標的とする、請求項32のアンチセンス化合物。
【請求項３４】アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項32のアン
チセンス化合物。
【請求項３５】アンチセンスオリゴヌクレオチドが、少なくとも1つの2'-
O-メトキシエチル糖部分または2'-ジメチルアミノオキシエトキシ糖部分を含む
、請求項34のアンチセンス化合物。
【請求項３６】アンチセンスオリゴヌクレオチドの実質的にすべての糖部
分が修飾糖部分である、請求項34のアンチセンス化合物。
【請求項３７】アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号33、34、46
、53、54、55、56、57、58、59、50、61、62、63、64、65または66を含む、請求
項36のアンチセンス化合物。
【請求項３８】選択された遺伝子産物をコードするRNAのスプライシング
を改変するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記の選択された遺伝子
産物を標的とし、そして少なくとも1つの2'-O-メトキシエチルまたは2'-ジメチ
ルアミノオキシエトキシ糖部分を含む、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】実質的にすべての糖部分が2'-O-メトキシエチルまたは2'-
ジメチルアミノオキシエトキシ糖部分である、請求項38のアンチセンスオリゴヌ
クレオチド。
【請求項４０】ヒト細胞または組織において、bcl-x発現を阻害する方法
であって、bcl-x発現が阻害されるように、前記細胞または組織を、請求項1のア
ンチセンス化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４１】ヒト細胞または組織において、bcl-xのアイソフォームの
比を改変する方法であって、bcl-xアイソフォームの比が改変されるように、前
記細胞または組織を、請求項25のアンチセンス化合物と接触させることを含む、
前記方法。
【請求項４２】 bcl-xと関連する疾患または異常を有するヒトを治療する
方法であって、bcl-x発現が阻害されるように、前記動物に、療法的または予防
的に有効な量の請求項1のアンチセンス化合物を投与することを含む、前記方法
。
【請求項４３】 bcl-xと関連する疾患または異常を有するヒトを治療する
方法であって、bcl-xアイソフォームの比が改変されるように、前記動物に、療
法的または予防的に有効な量の請求項25のアンチセンス化合物を投与することを
含む、前記方法。
【請求項４４】アポトーシスの減少により特徴付けられる疾患または異常
を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒトに、予防的または療法的に有効
な量の請求項1のアンチセンス化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】アンチセンス化合物が、bcl-xlをコードする核酸分子を標
的とし、そしてbcl-xlの発現を優先的に阻害する、請求項44の方法。
【請求項４６】アポトーシスの増加により特徴付けられる疾患または異常
を有するヒトを治療する方法であって、前記ヒトに、予防的または療法的に有効
な量の請求項1のアンチセンス化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４７】癌の治療のための化学療法剤をさらに含む、請求項13の組
成物。
【請求項４８】請求項25のアンチセンス化合物および薬学的に許容しうる
キャリアーまたは希釈剤を含む、組成物。
【請求項４９】癌の治療のための化学療法剤をさらに含む、請求項48の組
成物。
【請求項５０】患者において癌を治療する方法であって：（a）請求項13の組成物を患者に投与し；そして（b）癌の治療のための化学療法剤を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】患者において癌を治療する方法であって：（a）請求項48の組成物を患者に投与し；そして（b）癌の治療のための化学療法剤を患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項５２】細胞をアポトーシス刺激に対し感作する方法であって、細
胞をbcl-xlの阻害剤で処置することを含む、前記方法。
【請求項５３】アポトーシス刺激が照射である、請求項52の方法。
【請求項５４】照射が紫外線照射である、請求項53の方法。
【請求項５５】アポトーシス刺激が癌化学療法薬剤である、請求項52の方
法。
【請求項５６】癌化学療法薬剤が、VP-16、シスプラチンまたはタキソー
ルである、請求項55の方法。
【請求項５７】アポトーシス刺激が細胞情報伝達分子である、請求項52の
方法。
【請求項５８】アポトーシス刺激がセラミドまたはサイトカインである、
請求項57の方法。
【請求項５９】 bcl-xlの阻害剤がbcl-xlのアンチセンス阻害剤である、請
求項52の方法。
【請求項６０】 bcl-xlのアンチセンス阻害剤が、配列番号31または33の少
なくとも8ヌクレオ塩基部分を含む配列を有する、請求項59の方法。
【請求項６１】アポトーシス刺激がセラミドまたはスタウロスポリンであ
る、請求項60の方法。
【請求項６２】前記アポトーシス刺激がミトコンドリア機能不全を引き起
こす、請求項52の方法。
【請求項６３】前記ミトコンドリア機能不全がミトコンドリア膜電位の欠
失である、請求項62の方法。
【請求項６４】細胞においてミトコンドリア機能不全を誘導する方法であ
って、細胞を、bcl-xlの阻害剤で処置することを含む、前記方法。
【請求項６５】アポトーシス刺激に細胞を曝露することをさらに含む、請
求項64の方法。
【請求項６６】アポトーシス刺激が照射である、請求項65の方法。
【請求項６７】照射が紫外線照射である、請求項66の方法。
【請求項６８】アポトーシス刺激が癌化学療法薬剤である、請求項65の方
法。
【請求項６９】癌化学療法薬剤が、VP-16、シスプラチンまたはタキソー
ルである、請求項68の方法。
【請求項７０】アポトーシス刺激がセラミドまたはスタウロスポリンであ
る、請求項65の方法。
【請求項７１】 bcl-xlの阻害剤がbcl-xlのアンチセンス阻害剤である、請
求項64の方法。
【請求項７２】 bcl-xlのアンチセンス阻害剤が、配列番号31または33の少
なくとも8ヌクレオ塩基部分を含む配列を有する、請求項71の方法。
【請求項７３】ミトコンドリア機能不全がミトコンドリア膜電位の欠失で
ある、請求項64の方法。