CN102317458B - 通过红细胞生成素(epo)天然反义转录物的抑制对epo相关疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

寡核苷酸化合物调节红细胞生成素(EPO)多核苷酸及其编码产物的表达和/或功能。用于治疗红细胞生成素(EPO)相关疾病的方法包括将一种或多种设计用以抑制EPO天然反义转录物的寡核苷酸化合物给予患者。

Description

通过红细胞生成素(EPO)天然反义转录物的抑制对EPO相关疾 病的治疗

优先权声明

本申请要求于2008年12月4日提交的题为“RNA Molecules TargetingErythropoietin and Related Molecules(靶向红细胞生成素及相关分子的RNA分子)”的美国临时专利申请序列号61/119,961的权益，上述申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明的实施方案包括调节EPO及相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。

背景

DNA-RNA和RNA-RNA杂交对包括DNA复制、转录和翻译在内的核酸功能的许多方面是重要的。杂交对检测特定核酸或者改变其表达的各种技术也是重要的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交而破坏基因表达，从而干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反义DNA具有的额外特征是DNA-RNA杂合体作为核糖核酸酶H消化(大多数细胞类型中存在的活性)的底物。反义分子可被递送到细胞中，如寡脱氧核苷酸(ODN)的情况，或者它们可作为RNA分子从内源基因表达。FDA最近批准了反义药物VITRAVENE^TM(用于治疗巨细胞病毒视网膜炎)，反映出反义物具有治疗效用。

激素红细胞生成素(EPO)介导的增强的红细胞产生是人对低氧的公知适应性应答(Bunn等(1996)Physiological Rev.76,839-845)。通常由成人肾脏和胎儿肝脏产生的EPO刺激骨髓中表达红细胞前体的EPO受体(EpoR)的发育。

EPO是由肾的肾间质细胞产生的糖蛋白(46kDa)激素，其调节骨髓中红细胞的产生。这些细胞对低动脉氧浓度敏感，在氧少(低氧)时将释放红细胞生成素。红细胞生成素刺激骨髓产生更多红细胞，从而提高血液的载氧能力。EPO通过结合骨髓中红细胞前体表面上的EpoR而发挥其作用。但是，已在除肾间质细胞外的来自其他正常组织的细胞(包括肠细胞、滋养层和神经元细胞)上观察到EPO表达。

血流中EPO的测量可表明骨髓障碍或肾疾病。红细胞生成素的正常水平是0-19mU/ml(毫单位/毫升)。水平升高可见于真性红细胞增多症，这是以脾肿大和骨髓产生红细胞增多为特征的病症。低于正常值见于引起贫血的慢性肾衰竭。慢性肾衰竭在某种程度上导致贫血，因为逐渐缺乏用于维持红细胞生成的足够EPO产生。

低氧是实体瘤的主要特征，实体瘤占全部人类癌症的大约90％。实体瘤中低氧的适应性应答与侵占性增强、肿瘤细胞死亡减少和肿瘤对放射疗法和化学疗法的反应降低有关。已在不同的造血和非造血恶性肿瘤中观察到EPO表达，且已表明其介导表达EpoR的红细胞白血病细胞的自主生长。

许多常见人类癌症过表达低氧诱导的转录因子HIF-1，其调节EPO以及增强癌细胞低氧存活所需的若干基因的表达，这些基因包括编码糖酵解酶、葡萄糖转运蛋白和血管内皮生长因子的基因(Semenza(1999)Ann.Rev.Cell.Dev.Biol.15,551-578)。肿瘤低氧被认为是肿瘤对化学疗法和放射疗法的抗性中的主要因素，但其潜在机制未知。低氧主要通过激活受低氧诱导因子-1(HIF-1)调节的若干基因的表达而在细胞中诱导适应性应答，HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亚基组成的异源二聚体转录因子。

概述

该概述被提供用于介绍本发明的概要，以简要说明本发明的性质和实质。它被提出的条件是，它不用来解释或限制权利要求的范围或含义。

在一个实施方案中，本发明提供用于抑制天然反义转录物的作用的方法，其通过利用靶向天然反义转录物的任何区域的反义寡核苷酸导致上调相应有义基因来进行。本文还预期，天然反义转录物的抑制可通过被认为落入本发明范围内的siRNA、核酶和小分子来完成。

一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸或其它基因产物的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与包含SEQ ID NO:3(图4)的第1-156个核苷酸中的5-30个连续核苷酸的多核苷酸的反向互补序列具有至少50％的序列同一性，从而体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸的功能和/或表达。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向EPO多核苷酸的天然反义序列(例如SEQID NO:3所示的核苷酸)及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO:4-6(图5)所示。

另一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与EPO多核苷酸的反义序列的反向互补序列具有至少50％的序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸的功能和/或表达。

另一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与EPO反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％的序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中EPO多核苷酸的功能和/或表达。

在优选实施方案中，组合物包含一种或多种与有义和/或反义EPO多核苷酸结合的反义寡核苷酸。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种修饰或取代核苷酸。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包含一种或多种修饰键。

在又一个实施方案中，修饰核苷酸包括含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯的修饰碱基，肽核酸，2’-O-甲基、氟或碳、亚甲基或其它锁定核酸(LNA)分子。优选地，修饰核苷酸是锁定核酸分子，包括α-L-LNA。

在另一个优选实施方案中，将寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹腔内给予患者。

在另一个优选实施方案中，将寡核苷酸在药物组合物中给予。治疗方案包括将反义化合物给予患者至少一次，但是，该治疗可变更为在一段时间内包括多个剂量。该治疗可与一种或多种其它类型的治疗联合。

在另一个优选实施方案中，将寡核苷酸包封入脂质体中或连到载体分子(例如胆固醇、TAT肽)上。

另一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中红细胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％的序列同一性；从而体内或体外调节患者细胞或组织中红细胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表达。

另一个实施方案提供体内或体外调节患者细胞或组织中红细胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反义寡核苷酸区域的至少一种反义寡核苷酸接触；从而体内或体外调节患者细胞或组织中红细胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表达。

在一个实施方案中，相对对照体内或体外提高红细胞生成素(EPO)的表达和/或功能。

在另一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反义序列。

在另一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸靶向包含红细胞生成素(EPO)多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。

在另一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。

在一个实施方案中，至少一种反义寡核苷酸包含选自以下的一种或多种修饰：至少一种修饰糖部分、至少一种修饰核苷间键、至少一种修饰核苷酸及其组合。

在相关实施方案中，一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰糖部分：2'-O-甲氧乙基修饰糖部分、2'-甲氧基修饰糖部分、2'-O-烷基修饰糖部分、二环糖部分及其组合。

在另一个相关实施方案中，一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰核苷间键：硫代磷酸酯、2'-O-甲氧乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲基酯及其组合。

在另一个相关实施方案中，一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰核苷酸：肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、类似物、衍生物及其组合。

在另一个实施方案中，至少一种寡核苷酸包含至少一种SEQ ID NO:4-6所示的寡核苷酸序列。

另一个实施方案提供体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中红细胞生成素(EPO)基因的功能和/或表达的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为5-30个核苷酸的至少一种短干扰RNA(siRNA)寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义多核苷酸特异，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少50％的序列同一性；和，体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中红细胞生成素(EPO)基因的表达和/或功能。

在实施方案中，所述寡核苷酸与至少约五个连续核酸的序列具有至少80％的序列同一性，所述序列与红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义和/或有义核酸分子互补。

另一个实施方案提供体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中红细胞生成素(EPO)基因的表达和/或功能的方法，其包括将所述细胞或组织与长度为约5-30个核苷酸、对编码红细胞生成素(EPO)分子的多核苷酸有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列特异的至少一种反义寡核苷酸接触，其中至少一种反义寡核苷酸与至少一种SEQ ID NO:1和2所示核酸序列具有至少50％的序列同一性；和，体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中红细胞生成素(EPO)基因的表达和/或功能。

本发明另一个实施方案提供合成修饰寡核苷酸，其包含至少一种修饰，其中至少一种修饰选自：至少修饰糖部分、至少一种修饰核苷酸间键、至少一种修饰核苷酸及其组合；其中所述寡核苷酸是与红细胞生成素(EPO)基因杂交并相比正常对照体内或体外调节其表达和/或功能的反义化合物。

在一个实施方案中，至少一种修饰包括选自以下的至少一种核苷酸间键：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。

在另一个实施方案中，寡核苷酸包含至少一种硫代磷酸酯核苷酸间键。

在相关实施方案中，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键骨架。

在一个实施方案中，寡核苷酸包含选自以下的至少一种修饰核苷酸：肽核酸、锁定核酸(LNA)、类似物、衍生物及其组合。

在另一个实施方案中，寡核苷酸包含选自以下的修饰糖部分：2'-O-甲氧乙基修饰糖部分、2'-甲氧基修饰糖部分、2'-O-烷基修饰糖部分、二环糖部分及其组合。

在另一个实施方案中，寡核苷酸长度为至少约5-30个核苷酸，并与红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述反义化合物与红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少20％的序列同一性。

在另一个实施方案中，寡核苷酸与红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约五个连续核酸的互补序列具有至少约80％的序列同一性。

在另一个实施方案中，寡核苷酸与至少一种红细胞生成素(EPO)多核苷酸杂交并相比正常对照体内或体外调节其表达和/或功能。

在相关实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:4-6所示序列之一。

本发明一个实施方案提供一种组合物，其包含对一种或多种红细胞生成素(EPO)多核苷酸特异的一种或多种寡核苷酸，所述多核苷酸包括反义序列、互补序列、等位基因、同源物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或其组合。

在相关实施方案中，寡核苷酸与SEQ ID NO:4-6所示核苷酸序列中的任一种相比具有至少约40％的序列同一性。

在某实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:4-6所示核苷酸序列中的任一种。

在一个实施方案中，SEQ ID NO:4-6所示寡核苷酸包含一种或多种修饰或核苷酸取代。

在另一个实施方案中，一种或多种修饰或核苷酸取代选自：硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、锁定核酸(LNA)分子及其组合。

本发明实施方案提供预防或治疗与至少一种红细胞生成素(EPO)多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病或病症的方法，其包括：

将治疗有效剂量的至少一种反义寡核苷酸给予患者，所述至少一种反义寡核苷酸结合所述至少一种红细胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反义序列，并调节所述至少一种红细胞生成素(EPO)多核苷酸的表达；从而预防或治疗与至少一种红细胞生成素(EPO)多核苷酸和/或其至少一种编码产物相关的疾病或病症。

在一个实施方案中，与至少一种红细胞生成素(EPO)多核苷酸相关的疾病或病症选自：血液异常的疾病、病症或状态，以红细胞产生少或缺陷为特征的血液障碍，贫血症，镰状细胞贫血，β-地中海贫血，红细胞生成异常，妊娠障碍或月经紊乱，早期早产儿贫血(early anemia of prematurity)，肾机能不全，慢性肾衰竭，高血压，手术相关疾病或病症，儿科患者透析疾病或病症，血细胞比容水平不足相关疾病或状况，AIDS，化学疗法治疗相关障碍，囊性纤维化，癌症或肿瘤，传染病，性病，免疫相关疾病和/或自身免疫疾病或病症，心血管疾病例如中风、低血压、心搏停止，缺血特别是缺血-再灌注损伤，心肌梗死例如急性心肌梗死，慢性心力衰竭，心绞痛，心脏肥大，心肺疾病，心肺分流(heart-lungbypass)，呼吸道疾病，肾、泌尿/生殖疾病，内分泌/新陈代谢异常，胃肠疾病，主要具有神经病学或精神病学症状的中枢神经系统(CNS)或周围神经系统疾病，认知功能的年龄相关丧失，大脑性麻痹，神经变性疾病，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，利氏病(Leigh’s disease)，痴呆，记忆丧失，肌萎缩性侧索硬化，酒精中毒，心境障碍，焦虑障碍，注意力缺陷障碍，过兴奋，孤独症，精神分裂症，抑郁症，脑或脊髓创伤或缺血，克-雅病(Creutzfeld-Jakobdisease)，眼病，癫痫障碍(seizure disorder)，多发性硬化，炎症，辐射损伤，黄斑变性，糖尿病性神经病，糖尿病性视网膜病，青光眼，视网膜缺血，和视网膜创伤，脊髓损伤，宇宙飞行状态，急性失血状态，老化和肿瘤疾病状态。

本发明实施方案提供鉴定和选择用于体内给药的至少一种寡核苷酸的方法，其包括选择与疾病状态相关的靶多核苷酸；鉴定包含至少五个连续核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸与选定的靶多核苷酸互补或相对其处于反义方向上；和在严格杂交条件下测量反义寡核苷酸和靶多核苷酸的杂合体的热解链温度；和基于所得信息选择用于体内给药的至少一种寡核苷酸。

下文说明其它方面。

附图简述

图1是实时PCR结果图，其显示在利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治疗HepG2细胞后相比对照的EPO mRNA倍数变化。实时PCR结果显示，在用针对epoas设计的两种siRNA处理的48小时后显著提高了HepG2细胞中EPO mRNA的水平(epoas_1,P＝0.02和epoas_2,P＝0.04，图1A)。在相同样品中，在用针对epoas的siRNA处理后可能降低了epoas RNA的水平(图1B)。标记为epoas_1、epoas_2、epoas_3的条块分别对应于用SEQ IDNO:4、5和6处理的样品。

图2显示SEQ ID NO:1：人红细胞生成素(EPO)mRNA(NCBI登记号：NM_000799.2)。

图3显示SEQ ID NO:2，EPO的基因组序列(外显子示以大写字母，内含子示以小写字母)。

图4显示SEQ ID NO:3：天然反义序列EPO-AS(NCBI登记号：AW798641.1)。

图5显示反义寡核苷酸SEQ ID NO:4-6。“r”表示RNA；有义寡核苷酸SEQ ID NO:7-9。“r”表示RNA。它们是SEQ ID NO:4-6的反向互补序列；由Applied Biosystems TaqmanGene Expression Assay(Hs00171267_m1)设计的自定义测定(Custom assay)的正向引物(SEQ ID NO:10)、反向引物(SEQ ID NO:11)和报道序列(SEQ ID NO:12)。

详细说明

下文参照用于说明的实施例应用来说明本发明的若干方面。应当理解，阐述的许多细节、关系和方法用于提供对本发明的全面理解。但是，相关领域的普通技术人员将容易地认识到可不利用一个或多个细节或利用其他方法来实施本发明。本发明不受行为或事件顺序的限制，因为一些行为可以不同顺序发生和/或与其他行为或事件同时发生。此外，并非所有阐述的行为或事件为实施本发明的方法所必需。

本文公开的所有基因、基因名称和基因产物意在对应于来自本文公开组合物和方法适用的任何物种的同源物。因此，该术语包括但不限于人和小鼠的基因和基因产物。应当理解，当公开特定物种的基因或基因产物时，该公开仅意为示例性的，而不应被理解为限制，除非其出现的上下文明确指明。因此，例如对于本文公开的基因(在某些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列的基因)意在包括来自其它动物的同源和/或种间同源基因和基因产物，所述其它动物包括但不限于其它哺乳动物、鱼类、两栖动物类、爬行动物类和鸟类。在优选实施方案中，基因或核酸序列来自人。

定义

本文所用术语仅用于说明具体实施方案的目的，而非意在限制本发明。本文所用单数形式意在也包括复数形式，除非上下文明确地另外指明。此外，关于术语“包含”、“含有”、“具有”、“有”、“带有”或其变体在详细的说明书和/或权利要求中所使用的程度，这些术语意在以类似于术语“包括”的方式包括在内。

术语“约”或“大约”是指在本领域普通技术人员测定的具体数值的可接受误差范围内，其部分地取决于如何测量或测定该数值，即测量系统的限制。例如，按照本领域实践，“约”可指在1以上的标准差内。或者，“约”可指给定值的高达20％的范围，优选高达10％，更优选高达5％且还更优选高达1％。或者，具体涉及到生物系统或过程，该术语可指在数值的量级内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。当在本申请和权利要求中描述了具体数值时，除非另有说明，应认为术语“约”指在该具体数值的可接受误差范围内。

本文所用术语“mRNA”指目前已知的靶基因mRNA转录物和可阐明的任何其它转录物。

“反义寡核苷酸”或“反义化合物”指与另外的RNA或DNA(靶RNA、DNA)结合的RNA或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，则它通过RNA-RNA相互作用结合另外的RNA靶标，并改变靶RNA的活性(Eguchi等,(1991)Ann.Rev.Biochem.60,631-652)。反义寡核苷酸可上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意在包括根据治疗、诊断或其它观点有用的任何外源RNA或DNA分子。这样的分子例如包括反义RNA或DNA分子、干扰RNA(RNAi)、微小RNA、诱杀性RNA分子(decoy RNA molecule)、siRNA、酶RNA、治疗性编辑RNA(therapeuticediting RNA)以及激动RNA和拮抗RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接体(alternate splicer)、引物、探针及其它与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。同样地，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明上下文中，术语“寡核苷酸”涉及核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其模拟物的寡聚体或多聚体。术语“寡核苷酸”还包括天然和/或修饰单体或键的线性或环状寡聚体，所述天然和/或修饰单体或键包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-异头形式、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体与单体相互作用的常规方式(例如Watson-Crick型碱基配对、型或反向型碱基配对等)特异结合靶多核苷酸。

寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同区(region)组成。在本发明上下文中，“嵌合”化合物为包含两个以上化学区(例如DNA区、RNA区、PNA区等)的寡核苷酸。每个化学区由至少一个单体单元(换言之，在寡核苷酸化合物情况下为核苷酸)组成。这些寡核苷酸一般包括至少一个区，其中寡核苷酸被修饰以表现一种或多种所需性质。寡核苷酸的所需性质包括但不限于，例如提高的核酸酶降解抗性、提高的细胞吸收和/或提高的靶核酸结合亲和力。因此，寡核苷酸的不同区可具有不同性质。本发明的嵌合寡核苷酸可形成为两种以上上述寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物的混合结构。

寡核苷酸可由区组成，区可以“登记簿(register)”方式连接(即如同天然DNA中那样单体连续连接时)或通过间隔物连接。间隔物是用来在区之间构成共价“桥”，在优选情况下长度不超过约100个碳原子。间隔物可带有不同功能，例如具有正电荷或负电荷、带有特定的核酸结合性质(嵌入剂、沟结合剂、毒素、荧光团等)、是亲脂性的、诱导特定二级结构，例如产生α-螺旋的含丙氨酸的肽。

本文所用“EPO”和“红细胞生成素”包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段、种类(species)、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等。

如本文所用，词语红细胞生成素、EPO和hEPO(人红细胞生成素)在本申请中可互换使用。

本文所用术语“对…特异的寡核苷酸”或“靶向…的寡核苷酸”是指具有下述序列的寡核苷酸：该序列(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体。复合体和双链体的稳定性可通过理论计算和/或体外测定来确定。用于测定杂交复合体和双链体稳定性的示例性测定参见下文实施例。

本文所用术语“靶核酸”包括DNA、转录自这种DNA的RNA(包括前mRNA和mRNA)以及来源于这种RNA的cDNA、编码序列、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰该核酸的正常功能。这种由与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常称为“反义”。被干扰的DNA功能例如包括复制和转录。被干扰的RNA功能包括所有生命机能，例如RNA转运到蛋白质翻译位点、由RNA翻译蛋白质、剪接RNA产生一种或多种mRNA和RNA可能参与或促进的催化活性。这种对靶核酸干扰的总体影响是调节编码产物或寡核苷酸的表达。

RNA干扰“RNAi”由与它们的“靶”核酸序列具有序列特异同源性的双链RNA(dsRNA)分子的介导(Caplen,N.J.等(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:9742-9747)。在本发明某些实施方案中，介体是5-25个核苷酸的“小干扰”RNA双链体(siRNA)。siRNA来源于称为切酶的RNA酶对dsRNA的加工(Bernstein,E.等(2001)Nature 409:363-366)。siRNA双链体产物被募集到称为RISC(RNA诱导性沉默复合体)的多蛋白siRNA复合体中。在不希望受任何具体理论约束的情况下，认为RISC被引导至靶核酸(适宜地为mRNA)，在此处siRNA双链体以序列特异性方式相互作用以介导催化方式的切割(Bernstein,E.等(2001)Nature 409:363-366；Boutla,A.等(2001)Curr.Biol.11:1776-1780)。可依据本发明使用的小干扰RNA可依据本领域公知并为本领域普通技术人员所熟知的步骤合成和使用。用于本发明方法的小干扰RNA适宜地包含约1-约50个核苷酸(nt)。在非限制性实施方案的实例中，siRNA可包含约5-约40个nt、约5-约30个nt、约10-约30个nt、约15-约25个nt或约20-25个核苷酸。

通过使用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性区的计算机程序，辅助选择适当的寡核苷酸。这样的程序用于比较例如通过检索数据库(例如GenBank)或通过对PCR产物测序所得核酸序列。比较一系列物种的核酸序列使得能够选择在物种间表现适当的同一性程度的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹以使得能够测定靶物种和其他物种间基因的同一性程度。通过在不同严格程度下进行DNA印迹，如本领域公知的，可获得同一性的近似测量。这些步骤使得能够选择这样的寡核苷酸：其表现出与对照受试者的靶核酸序列的高度互补性，和与其它物种的对应核酸序列的低度互补性。本领域技术人员会认识到，在选择用于本发明的适当基因区方面存在相当大的自由。

“酶RNA”是指带有酶促活性的RNA分子(Cech,(1988)J.American.Med.Assoc.260,3030-3035)。酶核酸(核酶)通过首先结合靶RNA而作用。这种结合通过酶核酸的靶结合部分发生，该靶结合部分被保持与该分子的酶促部分十分靠近，该酶促部分起切割靶RNA的作用。因此，酶核酸首先识别并接着通过碱基配对结合靶RNA，一旦结合到正确位点，则酶促作用以切割靶RNA。

“诱杀性RNA”是指模拟配体的天然结合结构域的RNA分子。因此，诱杀性RNA与天然结合靶标竞争结合特定配体。例如，已表明，HIV反式激活应答(TAR)RNA过表达可作为“诱饵”，并有效结合HIV tat蛋白，从而防止其结合HIV RNA中编码的TAR序列(Sullenger等(1990)Cell,63,601-608)。这意指特定实例。本领域人员会认识到，这仅是一个实例，利用本领域公知的技术可容易地产生其它实施方案。

本文所用术语“单体”一般是指通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成大小从几个单体单元(例如约3-4个)到约数百个单体单元的寡核苷酸的单体。磷酸二酯键类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、氨基磷酸酯等，如下文更详细说明。

术语“核苷酸”包括天然存在核苷酸及非天然存在核苷酸。本领域技术人员应当明白，许多先前被认为“非天然存在”的核苷酸后来已在自然界中发现。因此，“核苷酸”不仅包括已知含有嘌呤和嘧啶杂环的分子，而且包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型核苷酸的说明性实例为含以下结构的分子：腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-亚乙基胞嘧啶、N6,N6-亚乙基-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶(pseudoisocytosine)、2-羟基-5-甲基-4-三唑并嘧啶、异胞嘧啶(isocytosine)、异鸟嘌呤(isoguanin)、肌苷以及Benner等，美国专利号5,432,272中所述的“非天然存在”核苷酸。术语“核苷酸”意在包括这些实例及其类似物和互变异构体的每一个和全部。尤其令人感兴趣的核苷酸是含有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它们被认为是与人的治疗和诊断应用有关的天然存在核苷酸。核苷酸包含天然2'-脱氧和2'-羟基糖(例如Kornberg和Baker,DNA Replication,第二版(Freeman,SanFrancisco,1992)所述)以及它们的类似物。

核苷酸的“类似物”包括具有修饰碱基部分和/或修饰糖部分的合成核苷酸(参见例如通常以下文献所述：Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York,1980；Freier和Altmann,(1997)Nucl.Acid.Res.,25(22),4429-4443,Toulmé,J.J.,(2001)Nature Biotechnology 19:17-18；Manoharan M.,(1999)Biochemica et BiophysicaActa 1489:117-139；Freier S.M.,(1997)Nucleic Acid Research,25:4429-4443,Uhlman,E.,(2000)Drug Discovery&Development,3:203-213,Herdewin P.,(2000)Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.,10:297-310)；2'-O、3`-C连接的[3.2.0]二环阿糖核苷(参见例如N.K Christiensen.等,(1998)J.Am.Chem.Soc.,120:5458-5463；Prakash TP,Bhat B.(2007)Curr Top Med Chem.7(7):641-9；Cho EJ等(2009)Annual ReviewofAnalytical Chemistry,2,241-264)。这样的类似物包括设计成增强结合性质(例如双链体或三链体稳定性、特异性等)的合成核苷酸。

本文所用术语“杂交”是指寡聚化合物的大致互补链的配对。配对机制之一涉及寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核苷酸)之间的氢键作用，例如Watson-Crick、或反向型氢键作用。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互补核苷酸，其通过形成氢键成对。杂交可在不同环境中发生。

当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以产生功能和/或活性的调节，并存在足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗性治疗情况中的生理条件和体外测定情况中进行测定的条件下)该反义化合物非特异性结合非靶核酸序列时，反义化合物是“可特异性杂交的”。

本文所用短语“严格杂交条件”或“严格条件”是指在这样的条件：除了最低限度的其它序列外，本发明化合物在该条件下将与其靶序列杂交。严格条件是序列依赖性的且在不同环境中不同，在本发明上下文中，寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚化合物性质和组成以及研究它们的测定确定。通常，严格杂交条件包括低浓度(<0.15M)的含无机阳离子如Na++或K++的盐(低离子强度)、高于20℃-25℃且低于寡聚化合物:靶序列复合体Tm的温度和存在变性剂，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)。例如，对于每1％的甲酰胺，杂交率降低1.1％。高度严格杂交条件的实例是0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液(SSC)/0.1％(w/v)SDS中在60℃下维持30分钟。

本文所用“互补的”是指在一条或两条寡聚链上的两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果反义化合物某位置上的核碱基(nucleobase)能够与靶核酸(所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置上的核碱基发生氢键作用，那么认为寡核苷酸和靶核酸之间的氢键作用位置是互补位置。当每个分子中足够数量的互补位置被可相互发生氢键作用的核苷酸占据时，寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子相互互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”两个术语用来表明在足够数量的核苷酸内足以使寡聚化合物和靶核酸之间发生稳定的特异性结合的精确配对程度或互补性。

本领域理解，寡聚化合物序列不需要与其可特异性杂交的靶核酸序列100％互补。此外，寡核苷酸可越过一个或多个区段杂交，使得间插或相邻区段不参与杂交事件(例如环状结构、错配或发夹结构)。本发明寡聚化合物与它们靶向的靶核酸序列中的靶区具有至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的序列互补性。例如，反义化合物中18/20的核苷酸与靶区互补并因此特异性杂交，则该反义化合物表现90％的互补性。在该实例中，剩余的非互补核苷酸可成簇或散布在互补核苷酸之间，不必彼此邻接或与互补核苷酸邻接。同样地，长度为18个核苷酸且具有在两侧为两个与靶核酸具有完全互补性的区的4(四)个非互补核苷酸的反义化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性，并因此落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸的区的互补性百分比可利用本领域已知的BLAST程序(基础局部比对检索工具(basic localalignment search tools))和PowerBLAST程序按常规测定(Altschul等,(1990)J.Mol.Biol.,215,403-410；Zhang和Madden,(1997)Genome Res.,7,649-656)。同源性、序列同一性或互补性百分比可通过例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Unix版本第8版，Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis)使用默认设置测定，该程序利用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.,(1981)2,482-489)。

本文所用术语“热解链温度(Tm)”是指这样的温度：在规定的离子强度、pH和核酸浓度下，与靶序列互补的寡核苷酸有50％与靶序列杂交达到平衡的温度。一般地，严格条件是指这样的条件：其中盐浓度在pH 7.0-8.3下为至少约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，温度对于短寡核苷酸(例如10-50个核苷酸)为至少约30℃。严格条件也可以加入去稳定剂例如甲酰胺的方式实现。

本文所用“调节”是指提高(刺激)或降低(抑制)基因的表达。

术语“变体”，当在多核苷酸序列情况中使用时，可包括与野生型基因有关的多核苷酸序列。该定义也可包括例如“等位”变体、“剪接”变体、“物种”变体或“多态”变体。剪接变体可与参比分子具有显著同一性，但通常由于mRNA加工过程中外显子的可变剪接而具有更多或更少量的多核苷酸。相应多肽可具有另外的功能域或不存在结构域。物种变体是指物种间相互不同的多核苷酸序列。本发明特别利用了野生型基因产物的变体。变体可产生自核酸序列中的至少一个突变，并可导致产生改变的mRNA或其结构或功能可能改变或可能不改变的多肽。任何给定的天然或重组基因可具有0、1或多个等位形式。产生变体的常见突变一般归因于核苷酸的天然缺失、插入或取代。这些种类变化的每一种可在给定序列中单独发生或与其它变化联合发生一次或多次。

所得多肽通常相互之间具有显著的氨基酸同一性。多态变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变异。多态变体还可包括“单核苷酸多态性”(SNP)或单个碱基突变，其中多核苷酸序列因一个碱基而不同。SNP的存在可表明例如某群体对疾病状态的倾向，即易感性对耐受性。

衍生多核苷酸包括经过化学修饰的核酸，例如将氢置换为烷基、酰基或氨基。衍生物例如衍生寡核苷酸可包括非天然存在部分，例如改变的糖部分或糖间键。这其中的实例是硫代磷酸酯和本领域已知的其它含硫种类。衍生核酸还可包含标签，包括放射性核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅助因子、抑制剂、磁性颗粒等。

“衍生”多肽或肽经过修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷化、酰化、化学偶联或温和甲醛处理。衍生物也可被修饰，以含有可直接或间接检测的标签，包括但不限于放射性同位素、荧光标签和酶标签。

本文所用术语“动物”或“患者”意在包括例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴子、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼类、昆虫和蜘蛛类。

“哺乳动物”涵盖一般处在医疗护理下的温血哺乳动物(例如人和驯化动物)。实例包括猫、犬、马、牛和人，以及仅人。

“治疗”涵盖治疗哺乳动物的疾病状态，包括：(a)预防该疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是在该哺乳动物易感染该疾病状态但尚未被确诊为患有它时；(b)抑制该疾病状态，例如抑制其进展；和/或(c)减轻该疾病状态，例如引起该疾病状态消退直到达到所需终点。治疗还包括改善疾病的症状(例如减少疼痛或不适)，其中这种改善可或不可直接影响该疾病(例如病因、传播、表达等)。

多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子

靶标：在一个实施方案中，靶标包括红细胞生成素(EPO)的核酸序列，其包括但不限于与EPO相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。

红细胞生成素(EPO)是作为激素的造血生长因子家族成员。EPO调节红细胞产生(红细胞生成)并维持机体的红细胞量至最佳水平。EPO产生受肾动脉循环中氧含量减少刺激，并由对氧敏感的转录因子的介导。EPO主要由肾管周毛细血管内皮细胞产生。分泌的EPO结合骨髓红细胞前体表面上的EPO受体，并引起它们的快速复制和成熟变为功能性红细胞。该刺激引起红细胞数目的急剧增长和随之发生的血细胞比容(血液中的红细胞百分比)增加(D'Andrea等(1989)Cell 57:277-285；Lodish等(1995)Cold Spring Harb Symp QuantBiol 60:93-104)。

红细胞生成素刺激骨髓产生更多红细胞。所导致的红细胞增长增加血液的载氧能力。作为红细胞产生的主要调节物，红细胞生成素的主要功能是：促进红细胞发育；开始血红蛋白的合成，血红蛋白是红细胞中运输氧的分子。

EPO刺激红细胞前体细胞的有丝分裂和分化，从而保证红细胞的产生。当低氧状态占优时，其在肾脏中产生。在红细胞前体细胞的EPO诱导分化期间，诱导球蛋白合成，提高血红素复合体的合成和增加铁蛋白受体的数目。这使细胞得以获得更多离子并合成功能性血红蛋白。成熟红细胞中的血红蛋白结合氧。因此，红细胞及其中所含血红蛋白在为机体供氧方面发挥关键作用。已阐述的复杂过程开始于EPO与红细胞前体细胞的细胞表面上的适当受体的相互作用。

当机体处于健康状态时，其中组织从既有数目的红细胞接受足够的氧合，EPO以极低浓度存在于血浆中。该正常的低浓度足以刺激更替因老化而正常损失的红细胞。

当循环中血细胞运输的氧减少时，循环中的EPO含量在低氧条件下增加。低氧可起因于因出血而大量失血、因过度暴露于辐射而破坏红细胞、因高海拔或长时间昏迷而减少摄氧或各种形式的贫血症。响应正经历低氧压力的组织，EPO将通过刺激红细胞祖细胞的增殖来增强红细胞产生。当循环中红细胞数目大于正常组织需氧量所需时，循环中的EPO减少。

因为EPO在红细胞形成过程中是必需的，所以该激素在诊断和治疗以血细胞产生少或缺陷为特征的血液障碍方面具有潜在有用的应用。可利用从用反义化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的红细胞生成素介导的示例性疾病和障碍包括，在对响应的哺乳动物细胞、组织或器官造成损伤后利用EPO多肽的组织保护活性以避免损伤或恢复功能的疾病或状况。这样的疾病或状况的实例包括但不限于：血液异常的疾病状态、障碍和状态，以红细胞产生少或缺陷为特征的血液障碍，贫血症，镰状细胞贫血，β-地中海贫血，红细胞生成异常，妊娠障碍和月经紊乱，早期早产儿贫血，肾机能不全，慢性肾衰竭，高血压，手术相关疾病或病症，儿科患者透析疾病或病症，血细胞比容水平不足相关疾病或状况，AIDS，化学疗法治疗相关障碍，囊性纤维化，癌症和肿瘤，传染病，性病，免疫相关疾病和/或自身免疫疾病和障碍，心血管疾病例如中风、低血压、心搏停止，缺血特别是缺血-再灌注损伤，心肌梗死例如急性心肌梗死，慢性心力衰竭，心绞痛，心脏肥大，心肺疾病，心肺分流，呼吸道疾病，肾、泌尿和生殖疾病，内分泌和新陈代谢异常，胃肠疾病，主要具有神经病学或精神病学症状的中枢神经系统(CNS)或周围神经系疾病，认知功能的年龄相关丧失，大脑性麻痹，神经变性疾病，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，利氏病，痴呆，记忆丧失，肌萎缩性侧索硬化，酒精中毒，心境障碍，焦虑障碍，注意力缺陷障碍，过兴奋，孤独症，精神分裂症，抑郁症，脑或脊髓创伤或缺血，克-雅病，眼病，癫痫障碍(seizure disorder)，多发性硬化，炎症，辐射损伤，黄斑变性，糖尿病性神经病，糖尿病性视网膜病，青光眼，视网膜缺血，和视网膜创伤，脊髓损伤，宇宙飞行状态，急性失血状态，老化和多种肿瘤疾病状态。

在实施方案中，本发明的方法和组合物用于调节红细胞生成素的任何功能。用于测定红细胞生成素功能的调节的测定是本领域已知的，且在文献中已有记载。例如美国专利号5,688,679(通过引用结合到本文中的“Human erythropoietin gene；high levelexpression in stably transfected mammalian cells(人红细胞生成素基因；稳定转染哺乳动物细胞中的高水平表达)”)，其报道了基于在血浆凝块中的小鼠骨髓细胞培养物中红细胞集落(来自CFU-E；红细胞集落形成细胞)的形成进行红细胞生成素生物活性的体外测定的应用(Blood Cells 4:89-103,1978)。该测定的灵敏度据报道为约5毫单位/ml。用作测定标准品的红细胞生成素是来自贫血绵羊的部分纯化血浆制备物。测定来自在无氨甲蝶呤的新鲜培养基中生长24小时的传代细胞系的上清液。用培养基以1:200的比例稀释上清液，并加入1-10微升量的测定培养物，每毫升测定培养物包含2×105个骨髓细胞、10％牛柠檬酸盐血浆、20％胎牛血清、1％牛血清白蛋白和1.6％牛胚胎提取液(Gibco)。在孵育36-48小时后，将血浆凝块固定在显微镜载玻片上，用联苯胺对血红蛋白染色和对红细胞集落计数。

美国专利号5,688,679还报道了来自选定细胞系的上清液在利用多价抗人红细胞生成素兔抗血清(J.Cell.Physiol.118:87-96,1984)(通过引用结合到本文中)通过竞争性放射免疫测定来测定免疫反应性红细胞生成素的应用。红细胞生成素还可利用其它免疫学方法例如蛋白质印迹和免疫荧光法来检测。

同一专利还记载了测定分泌到细胞上清液中的红细胞生成素对其它骨髓祖细胞的增殖影响。可测定红细胞生成素对多种来自小鼠和人骨髓的祖细胞的影响，这些祖细胞包括红细胞集落形成细胞(CFU-E)、红细胞爆发集落形成细胞(BFU-E)、粒细胞-巨噬细胞前体(CFU-GM)和混合细胞集落形成细胞(CFU-Mix)(J.Cell.Physiol.Suppl.1:79-85,1982；J.Cell.Physiol.118:87-96,1984)，通过引用结合到本文中。

也已报道红细胞生成素影响红细胞谱系细胞之外的细胞类型。例如Lifshitz等,2009,“Non-erythroid activities of erythropoietin:Functional effects on murinedendritic cells(红细胞生成素的非红细胞活性：对小鼠树突细胞的功能性影响),”MolImmunol.46(4):713-21(通过引用结合到本文中)，其报道了在注射EPO的小鼠和过表达人EPO的转基因小鼠中的体内实验显示CD80和CD86的细胞表面表达较高的脾DC群体增加。Prutchi等,2008,“Erythropoietin effects on dendritic cells:potential mediatorsin its function as an immunomodulator？(红细胞生成素对树突细胞的影响：其作为免疫调节物功能的潜在介导物？)”Exp Hematol.36(12):1682-90报道了当体外施用时，EPO提高了表达共刺激分子CD80和CD86的外周血DC和单核细胞衍生DC(MoDC)的百分比。

在优选实施方案中，寡核苷酸对EPO(包括但不限于非编码区)多核苷酸特异。EPO靶标包括：EPO变体；EPO突变体，包括SNP；EPO的非编码序列；等位基因、片段等。优选地，寡核苷酸是反义RNA分子。

根据本发明实施方案，靶核酸分子不只限于EPO多核苷酸，而且延伸至EPO的任何同种型、受体、同源物、非编码区等。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向EPO靶标的天然反义序列(对编码区和非编码区天然反义)，EPO靶标包括但不限于其变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义RNA或DNA分子。

在另一个优选实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括这样的变体：其中在化合物的一个或多个核苷酸位置上存在不同碱基。例如，如果第一个核苷酸是腺嘌呤，则可产生在该位置含有胸苷、鸟苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的变体。这可在反义化合物的任何位置上完成。然后，利用本文所述方法检验这些化合物，以测定它们抑制靶核酸表达的能力。

在一些实施方案中，反义化合物和靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约50％-约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％-约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％-约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80％-约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。

当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起活性丧失，并存在足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下反义化合物与非靶核酸序列非特异性结合时，反义化合物是可特异性杂交的。这样的条件包括，即体内测定或治疗性治疗情况的生理条件和体外测定情况中进行测定的条件。

当反义化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能而引起效用丧失，并存在足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗性治疗情况的生理条件下和在体外测定情况中进行测定的条件下)该反义化合物与非靶序列非特异性结合时，则不论该反义化合物是DNA、RNA、嵌合体、取代物等，其是可特异性杂交的。

在另一个优选实施方案中，包括但不限于例如利用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列、一个或多个SEQ ID NO:2所示序列等的EPO的靶向，调节EPO的表达或功能。在一个实施方案中，相比对照上调表达或功能。在另一个优选实施方案中，相比对照下调表达或功能。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:4-6所示核酸序列，其包括例如利用PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个修饰核苷酸、较短片段或较长片段、修饰键等。修饰键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一个优选实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明修饰寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰磷酸基)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备和将它们整合入核苷酸、修饰核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此赘述。

本领域技术人员还为治疗用途控制反义的特异性和灵敏度。在动物和人的疾病状态的治疗中已利用反义寡核苷酸作为治疗部分。已将反义寡核苷酸安全有效地给予人，多种临床试验目前正在进行中。因此确立的是，寡核苷酸可以是有用的治疗药物，其可被设计用于治疗细胞、组织和动物(尤其人)的治疗方案。

在本发明实施方案中，寡聚反义化合物(尤其寡核苷酸)结合靶核酸分子并调节靶基因编码分子的表达和/或功能。被干扰的DNA功能例如包括复制和转录。被干扰的RNA功能包括所有生命机能，例如RNA转运到蛋白质翻译位点、由RNA翻译蛋白质、剪接RNA产生一种或多种mRNA和RNA可能参与或促进的催化活性。功能可被上调或抑制，视所需功能而定。

反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、可变剪接体、引物、探针及其它与靶核酸的至少一部分杂交的寡聚化合物。同样地，这些化合物可以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明上下文中，反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步骤过程。该过程通常开始于识别待调节功能的靶核酸。该靶核酸可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或转录自该基因的mRNA)或来自病原体的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码红细胞生成素(EPO)。

靶向过程通常还包括测定靶核酸中的至少一个靶区、区段或位点，以发生反义相互作用使所需影响例如调节表达发生。在本发明上下文中，术语“区”定义为具有至少一种可鉴定结构、功能或特性的靶核酸的一部分。区段在靶核酸的区中。“区段”定义为靶核酸的区的更小部分或次级部分。本发明所用“位点”定义为靶核酸中的位置。

在优选实施方案中，反义寡核苷酸结合红细胞生成素(EPO)的天然反义序列，并调节红细胞生成素(EPO)(SEQ ID NO:1)的表达和/或功能。反义序列的实例包括SEQ ID NO:3-6。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸结合红细胞生成素(EPO)多核苷酸的一个或多个区段，并调节红细胞生成素(EPO)的表达和/或功能。区段包括红细胞生成素(EPO)有义或反义多核苷酸的至少五个连续核苷酸。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸对红细胞生成素(EPO)的天然反义序列特异，其中寡核苷酸与红细胞生成素(EPO)的天然反义序列的结合调节红细胞生成素(EPO)的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸化合物包括SEQ ID NO:4-6所示序列、利用例如PCR、杂交等鉴定和扩增的反义序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个修饰核苷酸、较短片段或较长片段、修饰键等。修饰键或核苷酸间键的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一个优选实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可连接到本发明的修饰寡核苷酸中的糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰磷酸基)可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、链烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备和将它们整合入核苷酸、修饰核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此赘述。

如本领域已知的，由于翻译起始密码子一般是5'-AUG(在转录的mRNA分子中；在对应的DNA分子中是5'-ATG)，故翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有RNA序列为5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG的翻译起始密码子；已表明5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可包括多种密码子序列，但是各种情况下起始氨基酸通常为甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有两个以上的备选起始密码子，在特定细胞类型或组织中或在特定系列条件下可优先将任一个用于翻译起始。在本发明上下文中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指体内用于启始转录自编码红细胞生成素(EPO)的基因的mRNA翻译的密码子，而不考虑这种密码子的序列。基因的翻译终止密码子(或“终止密码子”)可具有三种序列即5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA(对应的DNA序列分别是5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA)之一。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上从翻译起始密码子开始的约25-约50个连续核苷酸。同样地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上从翻译终止密码子开始的约25-约50个连续核苷酸。因此，“起始密码子区”(或“翻译起始密码子区”)和“终止密码子区”(或翻译终止密码子区)均为可用本发明的反义化合物有效靶向的区。

本领域已知开放阅读框(ORF)或“编码区”是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区，亦即可有效靶向的区。在本发明上下文中，靶区是包含基因的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的基因内区。

另一个靶区包含5'非翻译区(5'UTR)，本领域中已知其是指在5'方向上从翻译起始密码子开始的mRNA部分，并因此包含mRNA在5'帽子位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上的对应核苷酸)。又一个靶区包含3'非翻译区(3'UTR)，本领域中已知其是指在3'方向上从翻译终止密码子开始的mRNA部分，并因此包含mRNA在翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸(或基因上的对应核苷酸)。mRNA的5'帽子位点含有与mRNA的5'-最末端残基通过5'-5'三磷酸酯键连接的N7-甲基化鸟苷残基。mRNA的5'帽区被认为包括5'帽子结构本身以及邻近帽子位点的前50个核苷酸。本发明的另一个靶区是5'帽区。

虽然一些真核mRNA转录物被直接翻译，但是多数包含一个或多个称为“内含子”的区，这些区在翻译转录物之前被从转录物上切下。剩余(因此被翻译)的区被称为“外显子”，并被剪接到一起形成连续的mRNA序列。在一个实施方案中，在疾病涉及异常剪接或疾病涉及特定剪接产物生产过剩的情况中，靶向剪接位点(即内含子-外显子连接点或外显子-内含子连接点)特别有用。因重排或缺失引起的异常融合连接点是靶位点的另一个实施方案。通过对不同基因来源的两个(以上)mRNA的剪接加工产生的mRNA转录物称为“融合转录物”。利用靶向例如DNA或前mRNA的反义化合物可有效靶向内含子。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸结合靶多核苷酸的编码和/或非编码区，并调节靶分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸结合天然反义多核苷酸，并调节靶分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸结合有义多核苷酸，并调节靶分子的表达和/或功能。

可变RNA转录物可产生自DNA的相同基因组区。这些可变转录物通常称为“变体”。更具体而言，“前mRNA变体”是产生自相同基因组DNA的转录物，与其它产生自相同基因组DNA的转录物在它们的起始或终止位置方面不同，并同时含有内含子和外显子序列。

通过在剪接过程中切除一个或多个外显子或内含子区或其部分，前mRNA变体产生更小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体是经加工的前mRNA变体，每个独特的前mRNA变体由于剪接必定总是产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可变剪接变体”。如果未发生前mRNA变体的剪接，那么前mRNA变体与mRNA变体相同。

变体可通过利用可变信号起始或终止转录而产生。前mRNA和mRNA可具有多于一个起始密码子或终止密码子。产生自利用可变起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为该前mRNA或mRNA的“可变起始变体”。那些利用可变终止密码子的转录物称为该前mRNA或mRNA的“可变终止变体”。一种具体类型的可变终止变体是“polyA变体”，其中产生的多个转录物产生自转录机制对“polyA终止信号”之一的可变选择，从而产生在独特的polyA位点终止的转录物。在本发明上下文中，本文所述变体类型也是靶核酸的实施方案。

靶核酸上反义化合物与之杂交的部位定义为活性反义化合物靶向的靶区的长度至少为5个核苷酸的部分。

虽然本文阐述了某些示例性靶区段的具体序列，但是本领域技术人员将认识到，它们用于阐述和说明本发明范围内的具体实施方案。根据此公开内容，本领域普通技术人员可容易地确定其它靶区段。

长度5-100个核苷酸、包含选自阐述的优选靶区段中的一段至少五(5)个连续核苷酸的靶区段被认为也适合靶向。

靶区段可包含含有来自阐述的优选靶区段之一的5'末端的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列(剩余核苷酸为同一DNA或RNA的一段连续序列，以紧接靶区段的5'末端上游开始，并持续直到该DNA或RNA含有约5-约100个核苷酸)。同样优选的靶区段是含有从阐述的优选靶区段之一的3'末端开始的至少5个连续核苷酸的DNA或RNA序列(剩余核苷酸是同一DNA或RNA的一段连续序列，以紧接靶区段的3'末端下游开始，并持续直到该DNA或RNA含有约5-约100个核苷酸)。本领域技术人员结合本文所述靶区段能够在不进行过度实验的情况下鉴定其它优选靶区段。

只要已鉴定了一个或多个靶区、区段或位点，就选择与靶标充分互补(即足够充分并以足够特异性杂交)的反义化合物，以得到所需效果。

在本发明实施方案中，寡核苷酸结合特定靶标的反义链。寡核苷酸长度为至少5个核苷酸，并可被合成使每个寡核苷酸靶向重叠序列，从而合成的寡核苷酸覆盖靶多核苷酸的完整长度。靶标还包括编码区和非编码区。

在一个实施方案中，优选通过反义寡核苷酸靶向特定核酸。反义化合物靶向特定核酸是多步骤过程。该过程通常开始于鉴定待调节功能的核酸序列。这可以是例如其表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因(或转录自该基因的mRNA)，或者非编码多核苷酸，例如非编码RNA(ncRNA)。

RNA可归为(1)被翻译成蛋白质的信使RNA(mRNA)和(2)不编码蛋白的RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反义转录物及其它含有高密度的终止密码子并缺乏任何大范围“开放阅读框”的转录单位(TU)。许多ncRNA似乎起始于编码蛋白的基因座的3'非翻译区(3'UTR)的起始位点。ncRNA通常很少，且已由FANTOM公司测序的ncRNA中至少一半似乎未被聚腺苷酸化。由于显而易见的原因，大多数研究人员已聚焦于被加工并输出到胞浆中的聚腺苷酸化mRNA。最近表明，非聚腺苷酸化的核RNA组可能非常大，且许多这样的转录物产生自所谓的基因区间(Cheng,J.等(2005)Science 308(5725),1149-1154；Kapranov,P.等(2005).Genome Res 15(7),987-997)。ncRNA可调节基因表达的机制是通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNA可被分为：(1)顺式编码RNA，其在相同基因位置但在与它们作用的RNA的相对链上被编码，因此显示与它们靶标的完全互补性，和(2)反式编码RNA，其在与它们作用的RNA不同的染色体位置上被编码，且通常不表现与它们的靶标进行完全碱基配对的可能性。

不希望为理论所约束，通过本文所述反义寡核苷酸对反义多核苷酸的干扰可改变相应有义信使RNA的表达。但是，该调节可以是不一致的(discordant)(反义敲减引起信使RNA增加)或一致的(concordant)(反义敲减引起伴随的信使RNA减少)。在这些情况下，可将反义寡核苷酸靶向反义转录物的重叠或非重叠部分，以引起其敲减或隔离(sequestration)。编码或非编码反义物可以相同方式靶向，且任一种能够调节相应的有义转录物－以一致或不一致的方式。用以鉴定新的针对靶标使用的寡核苷酸的策略可基于通过反义寡核苷酸或任何其它调节所需靶标的方法对反义RNA转录物的敲减。

策略1：在不一致的调节情况中，反义转录物的敲减提高常规(有义)基因的表达。如果后者的基因编码已知或推定的药物靶标，那么可想象得到，其反义配对物的敲减可模仿受体激动剂或酶刺激剂的作用。

策略2：在一致调节的情况中，可相伴敲减反义和有义转录物，从而实现常规(有义)基因表达的协同性减少。例如，如果利用反义寡核苷酸完成敲减，那么可利用该策略应用一个靶向有义转录物的反义寡核苷酸和另一个靶向相应反义转录物的反义寡核苷酸，或者应用同时靶向重叠的有义和反义转录物的单个有效的对称反义寡核苷酸。

按照本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)及其它与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能的寡聚化合物。同样地，它们可以是DNA、RNA、类DNA、类RNA及其混合物，或者可以是它们中一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹状的寡聚化合物，并可包含结构元件，例如内部或端部凸起、错配或环。反义化合物常规线性制备，但可连接或另外制备成环状和/或分支。反义化合物可包括构建体，例如杂交形成完全或部分双链化合物的两条链或者具有足够的自我互补性以允许杂交和形成完全或部分双链化合物的单链。两条链可内部连接留下游离的3'或5'末端，或者可连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可包含5'或者3'末端的突出端，产生单链特征的延伸。双链化合物任选地可包括末端的突出端。其它修饰可包括连接至末端之一、选定核苷酸位置、糖位置或核苷间键之一的缀合基。或者，两条链可通过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可呈现自身互补的发夹型分子的形式，该发夹型分子自身对折形成双链体。因此，dsRNA可以是完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来实现，但是在某些实施方案中，基因表达或功能被上调。当由两条链形成或由呈现自身对折形成双链体的自身互补性发夹型分子的形式的单链形成时，两条链(单链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式进行碱基配对的互补RNA链。

一旦被引入系统，本发明化合物可引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以影响靶核酸的切割或其它修饰，或通过基于占用的机制起作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可被描述为“类DNA”(即通常具有一个或多个2'-脱氧糖和通常具有T而非U碱基)或“类RNA”(即通常具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰糖和通常具有U而非T碱基)。核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最常见的是A型和B型。据认为，一般而言，具有类似B型结构的寡核苷酸为“类DNA”，而那些具有类似A型结构的寡核苷酸为“类RNA”。在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可同时包含A型区和B型区。

在另一个优选实施方案中，所需寡核苷酸或反义化合物包括下述的至少一种：反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、含修饰键的反义寡核苷酸、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微小干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；或者短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其组合。

dsRNA还可激活基因表达，这是已称为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa的机制。靶向基因启动子的dsRNA诱导相关基因的有效转录激活。利用称为“小激活RNA(saRNA)”的合成dsRNA在人细胞中表明RNAa。目前不清楚其它生物体内是否保留RNAa。

小双链RNA(dsRNA)例如小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)，已被发现是称为RNA干扰(RNAi)的进化保守机制的触发物。RNAi总是通过重建染色质导致基因沉默，从而抑制转录、降解互补mRNA或阻断蛋白翻译。但是，在下文实施例部分详述的情形中，表明寡核苷酸提高红细胞生成素(EPO)多核苷酸及其编码产物的表达和/或功能。dsRNA也可作为小激活RNA(saRNA)。不希望为理论所约束，通过靶向基因启动子的序列，saRNA在称为dsRNA诱导的转录激活(RNAa)的表型中诱导靶基因表达。

在另一实施方案中，本文鉴定的“优选靶区段”可用来筛选另外的调节红细胞生成素(EPO)多核苷酸表达的化合物。“调节剂”是那些降低或提高编码红细胞生成素(EPO)的核酸分子的表达的那些化合物，其包含与优选靶区段互补的至少5个核苷酸的部分。筛选法包括以下步骤：将编码红细胞生成素(EPO)的有义或天然反义多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选调节剂接触，并选择降低或提高编码红细胞生成素(EPO)多核苷酸(例如SEQ ID NO:4-6)的核酸分子的表达的一种或多种候选调节剂。一旦表明候选调节剂能够调节(例如降低或提高)编码红细胞生成素(EPO)多核苷酸的核酸分子的表达，则调节剂可用于红细胞生成素(EPO)多核苷酸功能的其它调查性研究，或依据本发明用作研究、诊断或治疗的试剂。

靶向天然反义序列优选调节靶基因的功能，靶基因例如EPO基因(例如登记号NM_000799.2，图2)。在优选实施方案中，靶标是红细胞生成素基因的反义多核苷酸。在优选实施方案中，反义寡核苷酸靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸(例如登记号NM_000799.2，图2)的有义和/或天然反义序列，其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义分子，靶标包括反义和/或有义EPO多核苷酸的编码和非编码区。

天然反义多核苷酸可按照例如以下文献所述鉴定：WO2007/087113和美国专利申请公开号2009/0258925，它们的名称均为“Natural Antisense and Non-coding RNATranscripts as Drug Targets(作为药物靶标的天然反义和非编码RNA转录物)”，通过引用以其整体结合到本文中。

本发明的优选靶区段还可与本发明的它们各自互补的反义化合物结合，以形成稳定的双链(双链体)寡核苷酸。

本领域中已表明，这样的双链寡核苷酸部分通过反义机制调节靶标表达和调节翻译及RNA加工。此外，双链部分可经过化学修饰(Fire等,(1998)Nature,391,806-811；Timmons和Fire,(1998)Nature,395,854；Timmons等,(2001)Gene,263,103-112；Tabara等,(1998)Science,282,430-431；Montgomery等,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,15502-15507；Tuschl等,(1999)Genes Dev.,13,3191-3197；Elbashir等,(2001)Nature,411,494-498；Elbashir等,(2001)Genes Dev.15,188-200)。例如，已表明这样的双链部分通过双链体的反义链与靶标的经典杂交而抑制靶标，从而触发靶标的酶促降解(Tijsterman等,(2002)Science,295,694-697)。

在优选实施方案中，反义寡核苷酸靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸(例如登录号NM_000799.2)、其变体、等位基因、同种型、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义分子。

根据本发明实施方案，靶核酸分子不只限于红细胞生成素(EPO)，而且延伸至红细胞生成素(EPO)分子的任何同种型、受体、同源物等。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向EPO多核苷酸的天然反义序列(例如SEQID NO:3所示的多核苷酸)及其任何变体、等位基因、同源物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的实例如SEQ ID NO:4-6所示。

在一个实施方案中，寡核苷酸与红细胞生成素(EPO)反义物的核酸序列互补或与之结合，并调节红细胞生成素(EPO)分子的表达和/或功能，所述核酸序列包括但不限于与红细胞生成素(EPO)多核苷酸相关的非编码有义和/或反义序列。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸与SEQ ID NO:3所示EPO天然反义核酸序列互补或与之结合，并调节EPO分子的表达和/或功能。

在优选实施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO:3-5的至少5个连续核苷酸的序列，并调节红细胞生成素(EPO)分子的表达和/或功能。

多核苷酸靶标包括：EPO，包括其家族成员、EPO变体；EPO突变体，包括SNP；EPO的非编码序列；EPO的等位基因；物种变体、片段等。优选地，寡核苷酸是反义分子。

在另一个优选实施方案中，靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸的寡核苷酸包括：反义RNA、干扰RNA(RNAi)、短干扰RNA(siRNA)；微小干扰RNA(miRNA)；小时序RNA(stRNA)；短发夹RNA(shRNA)；小RNA诱导的基因激活(RNAa)；或小激活RNA(saRNA)。

在另一个优选实施方案中，靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸(例如SEQ ID NO:2)调节这些靶标的表达或功能。在一个实施方案中，相比对照上调表达或功能。在另一个优选实施方案中，相比对照下调表达或功能。

在另一个优选实施方案中，反义化合物包含SEQ ID NO:4-6所示序列。这些寡核苷酸可包含一个或多个修饰核苷酸、较短片段或较长片段、修饰键等。

在另一个优选实施方案中，SEQ ID NO:4-6包含一个或多个LNA核苷酸。

对所需靶核酸的调节可以本领域已知的各种方法进行。例如，反义寡核苷酸、siRNA等。酶核酸分子(例如核酶)是能够催化多种反应中的一种或多种的核酸分子，包括以核苷酸碱基序列特异性方式重复切割其它分离的核酸分子的能力。这样的酶核酸分子可用于例如靶向几乎任何RNA转录物(Zaug等,324,Nature 4291986；Cech,260JAMA 3030,1988；and Jefferies等,17Nucleic Acids Research 1371,1989)。

因为它们的序列特异性，反式切割酶核酸分子显示作为用于人疾病的治疗药物的前景(Usman和McSwiggen,(1995)Ann.Rep.Med.Chem.30,285-294；Christoffersen和Marr,(1995)J.Med.Chem.38,2023-2037)。酶核酸分子可被设计用以切割细胞RNA背景中的特定RNA靶标。这样的切割事件使mRNA为非功能性的，并废除来自该RNA的蛋白质表达。如此，可选择性抑制与疾病状态有关的蛋白质的合成。

通常，具有RNA切割活性的酶核酸通过首先结合靶RNA而起作用。这种结合通过酶核酸的靶结合部分发生，该靶结合部分被保持与该分子的酶促部分十分靠近，该酶促部分作用以切割靶RNA。因此，酶核酸首先识别并接着通过互补碱基配对结合靶RNA，一旦结合到正确位点，则酶促作用以切割靶RNA。这种靶RNA的策略性切割将破坏其直接合成编码蛋白的能力。在酶核酸已结合并切割其RNA靶标之后，其从该RNA上释放，以寻找另一个靶标，并可重复地结合并切割新靶标。

数种方法例如体外选择(进化)策略(Orgel,(1979)Proc.R.Soc.London,B 205,435)已被用于发展能够催化多种反应的新的核酸催化剂，反应例如切割和连接磷酸二酯键和酰胺键(Joyce,(1989)Gene,82,83-87；Beaudry等,(1992)Science 257,635-641；Joyce,(1992)Scientific American 267,90-97；Breaker等,(1994)TIBTECH 12,268；Bartel等,(1993)Science 261:1411-1418；Szostak,(1993)TIBS 17,89-93；Kumar等,(1995)FASEBJ.,9,1183；Breaker,(1996)Curr.Op.Biotech.,7,442)。

催化活性最佳的核酶的发展主要归因于为调节基因表达的目的而使用切割RNA的核酶的任何策略。例如，锤头核酶在饱和(10mM)浓度的Mg2+辅助因子存在下起作用的催化速率(kcat)为约1min-1。已表明人工“RNA连接酶”核酶催化相应的自我修饰反应的速率为约100min-1。此外，已知具有由DNA组成的底物结合臂的某些修饰锤头核酶以接近100min-1的多倍周转(turn-over)速率催化RNA切割。最后，用某些核苷酸类似物取代锤头的催化核心中的特定残基得到的修饰核酶表现差不多10倍的催化速率提升。这些发现说明，核酶可以显著高于由大多数天然自我切割核酶在体外表现出的催化速率的催化速率促进化学转变。那么可能的是，可优化某些自我切割核酶的结构以获得最大催化活性，或者可产生表现出显著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA模体。

符合“锤头”模型的RNA催化剂对RNA底物的分子间切割于1987年首次被表明(Uhlenbeck,O.C.(1987)Nature,328:596-600)。回收RNA催化剂并使之与多种RNA分子反应，证明其确实有催化性。

基于“锤头”模体设计的催化RNA已被用于通过在催化RNA中作出适当的碱基改变以维持与靶序列的必要碱基配对来切割特定靶序列(Haseloff和Gerlach,(1988)Nature,334,585；Walbot和Bruening,(1988)Nature,334,196；Uhlenbeck,O.C.(1987)Nature,328:596-600；Koizumi,M.,等.(1988)FEBS Lett.,228:228-230)。这使得能够利用催化RNA切割特定靶序列并表明，按照“锤头”模型设计的催化RNA也许可体内切割特定底物RNA(参见Haseloff和Gerlach,(1988)Nature,334,585；Walbot和Bruening,(1988)Nature,334,196；Uhlenbeck,O.C.(1987)Nature,328:596-600)。

RNA干扰(RNAi)已成为调节哺乳动物和哺乳动物细胞中基因表达的有力工具。该方法需要利用表达质粒或病毒和被加工成siRNA的小发夹RNA的编码序列将小干扰RNA(siRNA)作为RNA自身或DNA递送。该系统能够将前siRNA有效转运到细胞质中，在细胞质中它们有活性，并允许使用受调节和组织特异的启动子进行基因表达。

在优选实施方案中，寡核苷酸或反义化合物包含核糖核酸(RNA)和/或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或多聚体，或其模拟物、嵌合体、类似物或同源物。该术语包括由天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间(骨架)键组成的寡核苷酸以及类似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性质，例如增加的细胞吸收、增强的靶核酸亲和力和核酸酶存在下增强的稳定性，这种修饰或取代寡核苷酸通常要求以天然形式产生。

按照本发明，寡核苷酸或“反义化合物”包括反义寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模拟物、嵌合体、类似物或同源物)、核酶、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、单链或双链RNA干扰(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和其它与靶核酸的至少一部分杂交并调节其功能的寡聚化合物。同样地，它们可以是DNA、RNA、类DNA、类RNA或其混合物，或者可以是它们中一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹状的寡聚化合物，并可包含结构元件，例如内部或端部凸起、错配或环。反义化合物常规线性制备，但可连接或另外制备成环状和/或分支。反义化合物可包括构建体，例如杂交形成完全或部分双链化合物的两条链或者具有足够的自我互补性以允许杂交和形成完全或部分双链化合物的单链。两条链可内部连接留下游离的3'或5'末端，或者可连接形成连续的发夹结构或环。发夹结构可包含5'或者3'末端的突出端，产生单链特征的延伸。双链化合物任选地可包括末端上的突出端。其它修饰可包括连接至末端之一、选定核苷酸位置、糖位置或核苷间键之一的缀合基。或者，两条链可通过非核酸部分或连接基团连接。当仅由一条链形成时，dsRNA可呈现自身互补的发夹型分子的形式，该发夹型分子自身对折形成双链体。因此，dsRNA可以是完全或部分双链的。基因表达的特异性调节可通过在转基因细胞系中稳定表达dsRNA发夹来实现(Hammond等,(1991)Nat.Rev.Genet.,2,110-119；Matzke等,(2001)Curr.Opin.Genet.Dev.,11,221-227；Sharp,(2001)Genes Dev.,15,485-490)。当由两条链形成或由呈现自身对折形成双链体的自身互补性发夹型分子形式的单链形成时，两条链(或单链的双链体形成区)是以Watson-Crick方式进行碱基配对的互补RNA链。

一旦被引入系统，本发明化合物可引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以影响靶核酸的切割或其它修饰，或者通过基于占用的机制工作。通常，核酸(包括寡核苷酸)可被描述为“类DNA”(即通常具有一个或多个2'-脱氧糖和通常具有T而非U碱基)或“类RNA”(即通常具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰糖和通常具有U而非T碱基)。核酸螺旋可采取多于一种类型的结构，最常见的是A型和B型。据认为，一般而言，具有类似B型结构的寡核苷酸为“类DNA”，而那些具有类似A型结构的寡核苷酸为“类RNA”。在一些(嵌合)实施方案中，反义化合物可同时包含A型区和B型区。

本发明的反义化合物可包含长度为约5-约80个核苷酸(即约5-约80个连接的核苷)的反义部分。这是指反义化合物的反义链或部分的长度。换言之，本发明的单链反义化合物包含约5-约80个核苷酸，本发明的双链反义化合物(例如dsRNA)包含长度为约5-约80个核苷酸的有义和反义链或部分。本领域普通技术人员将理解，这包括以下长度的反义部分：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸或其中的任何范围。

在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长度为10-50个核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员将理解，这包括具有以下长度的反义部分的寡核苷酸：10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或其中任何范围。在一些实施方案中，寡核苷酸长度为15个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的反义化合物或寡核苷酸化合物具有长度为12或13-30个核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员将理解，这包括具有以下长度的反义部分的反义化合物：12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸或其中任何范围。

在另一个优选实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括变体，其中在所述化合物的一个或多个核苷酸位置上存在不同碱基。例如，如果第一个核苷酸是腺苷，则可产生在该位置含有胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这可在反义或dsRNA化合物的任何位置上完成。然后，利用本文所述方法检验这些化合物，以测定它们抑制靶核酸表达的能力。

在一些实施方案中，反义化合物和靶标之间的同源性、序列同一性或互补性为约40％-约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约60％-约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约70％-约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约80％-约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性为约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸例如SEQ ID NO:3-6所示核酸分子包含一个或多个取代或修饰。在一个实施方案中，用锁定核酸(LNA)取代核苷酸。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向与EPO相关的编码和/或非编码序列的有义和/或反义核酸分子的一个或多个区和SEQ ID NO:1、2所示的序列。寡核苷酸也靶向SEQID NO:1、2的重叠区。

本发明的某些优选寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。本发明上下文中的“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”是含有两个以上化学上不同的区(每个区由至少一个核苷酸组成)的寡核苷酸。这些寡核苷酸通常包含至少一个赋予一种或多种有益性质(例如增加的核酸酶抗性、增加的细胞吸收、增加的靶结合亲和力)的修饰核苷酸区，和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物的区。举例来说，RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。RNA酶H的活化因此导致对RNA靶标的切割，从而极大地提高基因表达的反义调节有效性。因此，相比与相同靶区杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸，当使用嵌合寡核苷酸时，通常可利用较短的寡核苷酸获得相似结果。RNA靶标的切割可常规通过凝胶电泳和可能需要的本领域已知的相关核酸杂交技术检测。在一个优选实施方案中，嵌合寡核苷酸包含被修饰以提高靶结合亲和力的至少一个区，并通常包含作为RNA酶H底物的区。寡核苷酸对其靶标(该情况下为编码ras的核酸)的亲和力常规通过测量寡核苷酸/靶标对的Tm而测定，Tm是寡核苷酸和靶标解离时的温度；解离通过分光光度法检测。Tm越高，寡核苷酸对靶标的亲和力越大。

本发明的嵌合反义化合物可形成为两种以上上述寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的混合结构。这样的化合物在本领域中也称为杂合体或gapmer。教导这种杂合体结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,013,830、5,149,797、5,220,007、5,256,775、5,366,878、5,403,711、5,491,133、5,565,350、5,623,065、5,652,355、5,652,356和5,700,922，上述专利各通过引用结合到本文中。

在另一个优选实施方案中，修饰寡核苷酸区包含至少一个在糖的2'位置被修饰的核苷酸，最优选2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰核苷酸。在其它优选实施方案中，RNA修饰包括在RNA 3'末端的嘧啶、脱碱基残基或反向碱基的核糖上的2'-氟、2'-氨基和2'O-甲基修饰。这种修饰被常规整合到寡核苷酸中，并已表明这些寡核苷酸相比2'-脱氧寡核苷酸针对给定靶标具有较高的Tm(即较高的靶结合亲和力)。这种增加的亲和力的影响极大地增强RNAi寡核苷酸对基因表达的抑制。RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶；该酶的活化因此导致对RNA靶标的切割，从而可极大地提高RNAi抑制的有效性。对RNA靶标的切割可常规通过凝胶电泳证明。在另一个优选实施方案中，还修饰嵌合寡核苷酸以增强核酸酶抗性。细胞含有多种可降解核酸的外切和内切核酸酶。已表明许多核苷酸和核苷修饰使它们被整合入的寡核苷酸相比天然寡脱氧核苷酸对核酸酶消化更具抗性。核酸酶抗性常规通过将寡核苷酸与细胞提取液或分离的核酸酶溶液一起孵育，并测量随时间剩余的完整寡核苷酸含量(一般通过凝胶电泳)来测量。已被修饰以增强其核酸酶抗性的寡核苷酸相比未修饰寡核苷酸保持完整持续更长的时间。已证明多种寡核苷酸修饰增强或赋予核酸酶抗性。目前更优选含有至少一种硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸。在某些情况下，增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰还独立地能够增强核酸酶抗性。一些所需修饰可参见De Mesmaeker等(1995)Acc.Chem.Res.,28:366-374。

可预见用于本发明的一些优选寡核苷酸的具体实例包括含有修饰骨架的寡核苷酸，修饰骨架例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和具有杂原子骨架，尤其是CH2--NH--O--CH2、CH,--N(CH3)--O--CH2[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架]、CH2--O--N(CH3)--CH2、CH2-N(CH3)--N(CH3)--CH2和O--N(CH3)--CH2--CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示为O--P--O--CH。还优选De Mesmaeker等(1995)Acc.Chem.Res.28:366-374所披露的酰胺骨架。还优选具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸(Summerton和Weller,美国专利号5,034,506)。在其它优选实施方案中，例如寡核苷酸的肽核酸(PNA)骨架、磷酸二酯骨架为聚酰胺骨架所取代，核苷酸直接或间接结合聚酰胺骨架的氮杂氮原子(Nielsen等(1991)Science254,1497)。寡核苷酸还可包含一个或多个取代糖部分。优选的寡核苷酸在2'位置包含下述基团之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为1-约10；C1-C10的低级烷基、烷氧基烷氧基、取代低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代甲硅烷基；RNA切割基；报道基；嵌入剂；用于改进寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或者用于改进寡核苷酸的药效学性质的基团和其它具有类似性质的取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH2CH2OCH3，亦称为2'-O-(2-甲氧乙基)](Martin等,(1995)Helv.Chim.Acta,78,486)。其它优选的修饰包括2'-甲氧基(2'-O--CH3)、2'-丙氧基(2'-OCH2CH2CH3)和2'-氟(2'-F)。类似修饰也可产生在寡核苷酸的其它位置上，尤其是3'末端核苷酸的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，例如取代呋喃戊糖基的环丁基。

寡核苷酸还可另外或备选地包含核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。本文所用“未修饰”或“天然”核苷酸包含腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰核苷酸包括仅罕见或短暂存在于天然核酸中的核苷酸，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶尤其5-甲基胞嘧啶(亦称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，且本领域通常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC，以及合成核苷酸，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它杂取代烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤和2,6-二氨基嘌呤。(Kornberg,A.,DNA Replication,W.H.Freeman&Co.,San Francisco,1980,第75-77页；Gebeyehu,G.,(1987)等Nucl.Acids Res.15:4513)。可包含本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已表明5-Me-C取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,in Crooke,S.T.和Lebleu,B.,主编.,Antisense Research and Applications,CRC Press,BocaRaton,1993,第276-278页)，且是当前优选的碱基取代。

本发明寡核苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性或细胞吸收的一个或多个部分或缀合物与寡核苷酸化学连接。这样的部分包括但不限于脂部分，例如胆固醇部分、胆甾烯基部分(Letsinger等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6553)，胆酸(Manoharan等.(1994)Bioorg.Med.Chem.Let.4,1053)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醚(Manoharan等(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660,306；Manoharan等(1993)Bioorg.Med.Chem.Let.3,2765)，硫胆固醇(Oberhauser等,(1992)Nucl.Acids Res.20,533)，脂肪链例如十二烷二醇(dodecandiol)或十一基残基(Saison-Behmoaras等EMBOJ.1991,10,111；Kabanov等(1990)FEBS Lett.259,327；Svinarchuk等(1993)Biochimie75,49)，磷脂例如双十六基-rac-甘油或1,2-二-O-十六基-rac-甘油基-3-H-膦酸三乙铵(Manoharan等(1995)Tetrahedron Lett.36,3651；Shea等(1990)Nucl.Acids Res.18,3777)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等(1995)Nucleosides&Nucleotides,14,969)，或金刚烷乙酸(Manoharan等(1995)Tetrahedron Lett.36,3651)。包含亲脂部分的寡核苷酸和用于制备这种寡核苷酸的方法是本领域已知的，例如美国专利号5,138,045、5,218,105和5,459,255。

给定寡核苷酸的所有位置不必被均一地修饰，实际上可将多于一种的上述修饰整合入单个寡核苷酸乃至寡核苷酸的单个核苷中。本发明还包括是本文之前定义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子与另一部分缀合，该另一部分包括但不限于脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖类、脂或聚烃化合物。本领域技术人员将认识到，这些分子可连接到任何核苷酸中的一个或多个，所述核苷酸在糖、碱基或磷酸基的若干位置上包含所述核酸分子。

本发明使用的寡核苷酸可合宜且常规地通过固相合成的公知技术制备。用于这种合成的设备由包括Applied Biosystems在内的若干供应商出售。也可利用用于这种合成的任何其它方法；寡核苷酸的实际合成完全落入本领域普通技术人员的技能中。同样公知的是，利用类似技术制备其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。同样公知的是，利用类似技术和市售修饰amidite和可控孔度玻璃(controlled-pore glass,CPG)产品，例如生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的amidite和/或CPG(可获自Glen Research,Sterling VA)，以合成荧光标记的、生物素化的或其它修饰寡核苷酸，例如胆固醇修饰的寡核苷酸。

根据本发明，使用修饰例如使用LNA单体以增强作用的功效、特异性和持续时间和拓宽寡核苷酸的给药途径，寡核苷酸由例如MOE、ANA、FANA、PS等当前化学物质组成(Uhlman,等(2000)Current Opinions in Drug Discovery&Development第3卷第2期)。这可通过用LNA单体取代当前寡核苷酸中的一些单体来实现。LNA修饰寡核苷酸可具有与母体化合物相似的大小，或者可较大或优选较小。优选地，这种LNA修饰寡核苷酸包含少于约70％、更优选少于约60％、最优选少于50％的LNA单体，且它们的大小为约5-25个核苷酸，更优选为约12-20个核苷酸。

优选的修饰寡核苷酸骨架包括但不限于具有正常3'-5'键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'烯化膦酸酯和手性膦酸酯在内的甲基和其它烷基膦酸酯、亚膦酸酯、包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在内的氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷基磷酸酯(boranophosphate)，它们的2'-5'连接的类似物，和具有反向极性的骨架，其中相邻对的核苷单位为3'-5'连接至5'-3'或2'-5'连接至5'-2'。还包括多种盐、混盐和游离酸形式。

教导上述含磷键制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361和5,625,050，上述专利各通过引用结合到本文中。

不含磷原子的优选修饰寡核苷酸骨架具有由下述键组成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间键。它们包括具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含链烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混N、O、S和CH2成分的其它骨架。

教导上述寡核苷制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，上述专利各通过引用结合到本文中。

在其它优选的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间键(即骨架)均为新的基团所取代。维持碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，即已表明具有优异的杂交性质的寡核苷酸模拟物被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被取代为含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基被保留，并直接或间接与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262，上述专利各通过引用结合到本文中。PNA化合物的更多教导可参见Nielsen,等(1991)Science 254,1497-1500。

在本发明另一个优选实施方案中，具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷，杂原子骨架特别是-CH2-NH-O-CH2-、称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架的-CH2-N(CH3)-O-CH2-、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2N(CH3)-N(CH3)CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示为上文引用的美国专利号5,489,677的-O-P-O-CH2-以及上文引用的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。还优选的是具有上文引用的美国专利号5,034,506的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。

修饰寡核苷酸还可包含一个或多个取代糖部分。优选的寡核苷酸在2'位置包含下述基团之一：OH；F；O-、S-、或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或者O烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C到CO烷基(C to CO alkyl)或C2到CO烯基和炔基(C2to CO alkenyl and alkynyl)。特别优选O(CH2)nOmCH3、O(CH2)n,OCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2nON(CH2)nCH3)2，其中n和m可以是1-约10。其它优选的寡核苷酸在2'位置包含下述基团之一：C到CO(C to CO)、低级烷基、取代低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基、报道基、嵌入剂、用于改进寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改进寡核苷酸的药效学性质的基团以及其它具有类似性质的取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，亦称为2'-O-(2-甲氧乙基)或2'-MOE)(Martin等,(1995)Helv.Chim.Acta,78,486-504)，即一种烷氧基烷氧基。另一优选的修饰包括下文实施例所述的2'-二甲基氨基氧基乙氧基(即O(CH2)2ON(CH3)2基，亦称为2'-DMAOE)和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域亦称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2。

其它优选的修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)和2'-氟(2'-F)。类似修饰也可在寡核苷酸的其它位置上进行，尤其是3'末端核苷酸的糖的3'位置或2'-5'连接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可具有糖模拟物，例如取代呋喃戊糖基糖的环丁基部分。教导这种修饰糖结构制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633和5,700,920，上述专利各通过引用结合到本文中。

寡核苷酸还可包含核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。本文所用“未修饰”或“天然”核苷酸包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰核苷酸包括其它合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤(7-methylquanine)和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

此外，核苷酸包括美国专利号3,687,808披露的核苷酸、“The ConciseEncyclopedia of Polymer Science And Engineering”，第858-859页，Kroschwitz,J.I.主编，John Wiley&Sons,1990披露的核苷酸、Englisch等,“Angewandle Chemie，国际版”,1991,30,第613页披露的核苷酸和Sanghvi,Y.S.,第15章，“Antisense Research andApplications”，第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.ea.,CRC Press,1993披露的核苷酸。这些核苷酸中的一些尤其可用于提高本发明寡聚化合物的结合亲和力。它们包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.和Lebleu,B.,主编,'Antisense Research andApplications',CRCPress,Boca Raton,1993,第276-278页)，且是当前优选的碱基取代，当与2'-O甲氧乙基糖修饰结合时尤其更为优选。

教导上述修饰核苷酸以及其它修饰核苷酸制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808以及4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,596,091、5,614,617、5,750,692和5,681,941，上述专利各通过引用结合到本文中。

本发明寡核苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一个或多个部分或缀合物与寡核苷酸化学连接。

这样的部分包括但不限于脂部分，例如胆固醇部分(Letsinger等,(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6553-6556)，胆酸(Manoharan等,(1994)Bioorg.Med.Chem.Let.,4,1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醚(Manoharan等,(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.,660,306-309；Manoharan等,(1993)Bioorg.Med.Chem.Let.,3,2765-2770)，硫胆固醇(Oberhauser等,(1992)Nucl.Acids Res.,20,533-538)，脂肪链例如十二烷二醇(dodecandiol)或十一基残基(Kabanov等,(1990)FEBSLett.,259,327-330；Svinarchuk等,(1993)Biochimie 75,49-54)，磷脂例如二-十六基-rac-甘油或1,2-二-O-十六基-rac-甘油基-3-H-膦酸三乙铵(Manoharan等,(1995)Tetrahedron Lett.,36,3651-3654；Shea等,(1990)Nucl.Acids Res.,18,3777-3783)，聚胺或聚乙二醇链(Mancharan等,(1995)Nucleosides&Nucleotides,14,969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等,(1995)Tetrahedron Lett.,36,3651-3654)，棕榈基部分(Mishra等,(1995)Biochim.Biophys.Acta,1264,229-237)，或者十八烷基胺或己氨基-羰基-t羟胆固醇部分(Crooke等,(1996)J.Pharmacol.Exp.Ther.,277,923-937)。

教导这种寡核苷酸缀合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941，上述专利各通过引用结合到本文中。

药物发现：本发明的化合物也可应用于药物发现和靶标验证领域。本发明包括在药物发现工作中利用本文鉴定的化合物和优选的靶区段以阐明在红细胞生成素(EPO)多核苷酸和疾病状态、表型或状况之间存在的关系。这些方法包括检测或调节红细胞生成素(EPO)多核苷酸，包括将样品、组织、细胞或生物体与本发明的化合物接触，治疗后一定时间测量红细胞生成素(EPO)多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相关表型或化学终点，并任选地将测量值与未治疗样品或用本发明另一化合物治疗的样品作比较。这些方法也可与其它实验平行或联合进行，以测定靶标验证过程的未知基因的功能，或者测定作为治疗或预防特定疾病、状况或表型的靶标的特定基因产物的有效性。

评价基因表达的上调或抑制

外源核酸到宿主细胞或生物体内的转移可通过直接检测细胞或生物体中核酸的存在情况而评价。这种检测可通过本领域公知的若干方法完成。例如，外源核酸的存在情况可通过DNA印迹或通过利用特异扩增与该核酸相关的核苷酸序列的引物的聚合酶链反应(PCR)技术来检测。外源核酸的表达也可利用包括基因表达分析在内的常规方法测量。例如，从外源核酸产生的mRNA可利用RNA印迹和反转录PCR(RT-PCR)检测和定量分析。

来自外源核酸的RNA表达也可通过测量酶活性或报道蛋白活性来检测。例如，反义调节活性可间接测量为靶核酸表达的减少或增加，其作为外源核酸正在产生效应RNA的指示。基于序列保守，可设计并利用引物扩增靶基因的编码区。首先，可使用各基因的最高表达的编码区建立模型对照基因，但是可使用任何编码或非编码区。通过将各个编码区插入报道编码区和其poly(A)信号之间来装配各对照基因。这些质粒将产生在基因的上游部分带有报道基因的mRNA和3'非编码区中的潜在RNAi靶标。个体反义寡核苷酸的有效性通过报道基因的调节而测定。可用于本发明方法的报道基因包括乙酰羟酸合酶(AHAS)、碱性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶(beta glucoronidase,GUS)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素酶(Luc)、胭脂氨酸合酶(NOS)、章鱼碱合酶(OCS)和其衍生物。可利用多种选择标记，其赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素和四环素的抗性。测定报道基因的调节的方法是本领域公知的，包括但不限于荧光测定法(例如荧光光谱法、荧光活化细胞分选(FACS)、荧光显微术)、抗生素抗性测定。

试剂盒、研究试剂、诊断和治疗

本发明的化合物可用来诊断、治疗和预防，和作为研究试剂和试剂盒的组分。此外，能够以极高的特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸常常为本领域普通技术人员所使用，以阐明特定基因的功能或区分生物途径的不同成员的功能。

对于在试剂盒和诊断以及多种生物系统中的使用，本发明的化合物单独或与其它化合物或治疗药联合，可用作差别分析和/或组合分析中的工具，以阐明细胞和组织中表达的基因的部分或完整互补序列的表达模式。

本文所用术语“生物系统”或“系统”定义为表达或使之有能力表达红细胞生成素(EPO)基因产物的任何生物体、细胞、细胞培养物或组织。它们包括但不限于人、转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植体及其组合。

作为一个非限制性实例，将用一种或多种反义化合物治疗的细胞或组织中的表达模式与未用反义化合物治疗的对照细胞或组织作比较，对所产生模式分析基因表达的差别水平，因为它们例如与受检基因的疾病关联性、信号转导途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能有关。可在其它影响表达模式的化合物存在或不存在的情况下对刺激或未刺激的细胞进行这些分析。

本领域已知的基因表达分析方法的实例包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo,(2000)FEBS Lett.,480,17-24；Celis,等,(2000)FEBS Lett.,480,2-16)、SAGE(基因表达序列分析)(Madden,等,(2000)Drug Discov.Today,5,415-425)、READS(消化cDNA的限制酶扩增)(Prashar和Weissman,(1999)Methods Enzymol.,303,258-72)、TOGA(总基因表达分析)(Sutcliffe,等,(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97,1976-81)、蛋白质阵列和蛋白质组学(Celis,等,(2000)FEBSLett.,480,2-16；Jungblut,等,Electrophoresis,1999,20,2100-10)、表达序列标签(EST)测序(Celis,等,FEBS Lett.,2000,480,2-16；Larsson,等,J.Biotechnol.,2000,80,143-57)、消减式RNA指纹分析(subtractive RNAfingerprinting,SuRF)(Fuchs,等,(2000)Anal.Biochem.286,91-98；Larson,等,(2000)Cytometry 41,203-208)、消减式克隆(subtractive cloning)、差别显示(DD)(Jurecic和Belmont,(2000)Curr.Opin.Microbiol.3,316-21)、比较基因组杂交(Carulli,等,(1998)J.Cell Biochem.Suppl.,31,286-96)、FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson,(1999)Eur.J.Cancer,35,1895-904)和质谱分析法(To,Comb.(2000)Chem.HighThroughputScreen,3,235-41)。

本发明的化合物可用于研究和诊断，因为这些化合物与编码红细胞生成素(EPO)的核酸杂交。例如，作为有效的红细胞生成素(EPO)调节剂以本文公开的这种有效性和在这样的条件下杂交的寡核苷酸在有助于基因扩增或检测的条件下分别是有效的引物或探针。这些引物和探针可用于需要特异性检测编码红细胞生成素(EPO)的核酸分子的方法和用于检测的所述核酸分子的扩增，或者用于红细胞生成素(EPO)的其它研究。本发明的反义寡核苷酸(尤其是引物和探针)与编码红细胞生成素(EPO)的核酸的杂交可通过本领域已知方法检测。这样的方法可包括酶与寡核苷酸的缀合、放射性标记寡核苷酸或任何其它适当的检测方法。也可制备利用这种检测方法检测样品中红细胞生成素(EPO)水平的试剂盒。

本领域技术人员还为治疗用途控制反义的特异性和灵敏度。在动物(包括人)的疾病状态治疗中已使用反义化合物作为治疗部分。已将反义寡核苷酸药物安全有效地给予人，多种临床试验目前正在进行中。因此确定的是，反义化合物可以是有用的治疗方式，其可被设计用于治疗细胞、组织和动物(尤其人)的治疗方案。

对于治疗，通过给予本发明的反义化合物来治疗动物，优选人，所述动物疑似患有可通过调节红细胞生成素(EPO)多核苷酸的表达而治疗的疾病或病症。例如，在一个非限制性实施方案中，方法包括将治疗有效量的红细胞生成素(EPO)调节剂给予需要治疗的动物的步骤。本发明的红细胞生成素(EPO)调节剂有效调节红细胞生成素(EPO)的活性，或者调节红细胞生成素(EPO)蛋白的表达。在一个实施方案中，相比对照，动物中红细胞生成素(EPO)的活性或表达被抑制约10％。优选地，动物中红细胞生成素(EPO)的活性或表达被抑制约30％。更优选地，动物中红细胞生成素(EPO)的活性或表达被抑制50％以上。因此，相比对照，寡聚化合物对红细胞生成素(EPO)mRNA表达的调节为：至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

在一个实施方案中，相比对照，动物中红细胞生成素(EPO)的活性或表达被提高约10％。优选地，动物中红细胞生成素(EPO)的活性或表达被提高约30％。更优选地，动物中红细胞生成素(EPO)的活性或表达被提高50％以上。因此，相比对照，寡聚化合物对红细胞生成素(EPO)mRNA表达的调节为：至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

例如，红细胞生成素(EPO)表达的减少可在动物的血清、血液、脂肪组织、肝脏或任何其它体液、组织或器官中利用文献中所述方法和本领域技术人员已知的方法测量。优选地，包含在待分析的所述体液、组织或器官中的细胞包含编码红细胞生成素(EPO)肽的核酸分子和/或红细胞生成素(EPO)蛋白自身。

通过将有效量的化合物加入合适的药学上可接受的稀释剂或载体中，本发明的化合物可用于药物组合物。本发明的化合物和方法也可用于预防用途。

缀合物

本发明寡核苷酸的另一种修饰涉及将增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或缀合物与寡核苷酸化学连接。这些部分或缀合物可包括共价连接功能性基团的缀合基，例如伯羟基或仲羟基。本发明的缀合基包括嵌入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体的药效学性质的基团和增强寡聚体药代动力学性质的基团。典型的缀合基包括胆固醇、脂类、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。本发明上下文中增强药效学性质的基团包括提高吸收、增强降解抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。本发明上下文中增强药代动力学性质的基团包括改善本发明化合物的吸收、分布、新陈代谢或排出的基团。代表性缀合基披露于1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196和美国专利号6,287,860，“Antisenseinhibition of MEKK2 expression(MEKK2表达的反义抑制)”，二者通过引用结合到本文中。缀合部分包括但不限于：脂部分例如胆固醇部分，胆酸，硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醚，硫胆固醇，脂肪链例如十二烷二醇或十一基残基，磷脂例如二-十六基-rac-甘油或1,2-二-O-十六基-rac-甘油基-3-H膦酸三乙铵，聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸，棕榈基部分，或十八烷基胺或己氨基-羰基-氧基胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可与活性药物缀合，活性药物例如阿斯匹林、华法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪、二氮杂吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥类药物、头孢菌素、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。

教导这种寡核苷酸缀合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941。

制剂

本发明的化合物还可与其它分子、分子结构或化合物混合物一起混合、包封、缀合或者以其它方式关联，作为例如脂质体、靶向受体的分子、口服、直肠、局部或其它制剂，以帮助摄取、分布和/或吸收。教导这种帮助摄取、分布和/或吸收的制剂制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,165、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575和5,595,756，上述专利各通过引用结合到本文中。

虽然反义寡核苷酸不必在载体情况中给予以调节靶标表达和/或功能，但是本发明的实施方案涉及用于表达反义寡核苷酸的表达载体构建体，其包含启动子、杂合启动子基因序列，并具有强的组成性启动子活性或可在所需情况下诱导的启动子活性。

在一个实施方案中，发明实践涉及利用适当的核酸递送系统给予至少一种前述反义寡核苷酸。在一个实施方案中，该系统包含与多核苷酸有效连接(operably linked)的非病毒载体。这种非病毒载体的实例仅包含寡核苷酸(例如SEQ ID NO:4-6中的任何一种或多种)，或包含与适当蛋白、多糖或脂类制备物联合的寡核苷酸。

其它合适的核酸递送系统包括病毒载体，通常为来自腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、依赖辅助病毒的腺病毒、反转录病毒或日本血凝病毒-脂质体(HVJ)复合体中至少一种的序列。优选地，病毒载体包含与多核苷酸有效连接的强真核启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子。

其它优选载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。反转录病毒载体包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包含至少两个载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组，env基因来自另一种病毒。优选DNA病毒载体。这些载体包括痘病毒载体例如正痘病毒载体或禽痘病毒载体，疱疹病毒载体例如单纯性疱疹I型病毒(HSV)载体[Geller,A.I.等,(1995)J.Neurochem,64:487；Lim,F.,等,载于DNA Cloning:Mammalian Systems,D.Glover,编(Oxford Univ.Press,Oxford England)(1995)；Geller,A.I.等,(1993)Proc Natl.Acad.Sci.:U.S.A.:907603；Geller,A.I.,等,(1990)ProcNatl.Acad.Sci USA:87:1149]，腺病毒载体(LeGal LaSalle等,Science,259:988(1993)；Davidson,等,(1993)Nat.Genet.3:219；Yang,等,(1995)J.Virol.69:2004)和腺伴随病毒载体(Kaplitt,M.G.,等,(1994)Nat.Genet.8:148)。

本发明的反义化合物包括任何药学上可接受的盐、酯或这种酯的盐，或者任何其它在给予动物(包括人)时能够提供(直接或间接)其生物活性代谢物或残余物的化合物。

术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的生理学和药学上可接受的盐：即，保留母体化合物的所需生物活性且不使其具有不希望的毒理学作用的盐。对于寡核苷酸，药学上可接受的盐及其应用的优选实例还参见美国专利号6,287,860，其通过引用结合到本文中。

本发明还包括含有本发明反义化合物的药物组合物和制剂。本发明的药物组合物可以多种方式给予，视需要局部治疗或系统性治疗和待治疗区域而定。给药可以是局部的(包括眼科和粘膜，包括阴道和直肠递送)，肺部的例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂(包括通过喷雾器)；气管内的，鼻内的，表皮的和透皮的)，口服或胃肠外的。胃肠外给药包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内给药。带有至少一个2'-O-甲氧乙基修饰的寡核苷酸被认为尤其可用于口服给药。用于局部给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏剂、洗剂、乳膏剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体剂和散剂。常规药学载体、水性、粉或油状基料、增稠剂等可能是必要或所需的。包被避孕套、手套等也可能是有用的。

可合宜地以单位剂型存在的本发明的药物制剂，可按照制药工业中公知的传统技术制备。这样的技术包括使活性成分与药学载体或赋形剂联合的步骤。通常，制剂通过使活性成分与液体载体或细碎的固体载体或者二者均一且紧密地联合并视需要将产物成形来制备。

本发明的组合物可配制成多种可能剂型中的任何一种，例如但不限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可配制为水、非水或混合介质中的混悬剂。水混悬剂还可包含增加混悬剂粘度的物质，其包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。混悬剂还可包含稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液剂、乳剂、泡沫剂和含脂质体的制剂。本发明的药物组合物和制剂可包含一种或多种渗透促进剂、载体、赋形剂或其它活性或非活性成分。

乳剂一般为一种液体以小滴形式分散在另一种液体中的多相系，小滴直径通常大于0.1μm。乳剂可包含除分散相外的其它组分和活性药物，活性药物可作为水相、油相中的溶液或自身作为分离相存在。还包括微乳状液作为本发明的实施方案。乳剂及其使用是本领域公知的，此外参见美国专利号6,287,860。

本发明的制剂包括脂质体制剂。本发明所用术语“脂质体”是指由在一个或多个球形双分子层中布置的两亲性脂组成的囊泡。脂质体为单层或多层囊泡，其具有由亲脂性物质形成的膜和含有待递送组合物的水腔。阳离子脂质体为带正电荷的脂质体，其被认为与带负电荷的DNA分子相互作用形成稳定的复合体。pH敏感或带负电荷的脂质体被认为诱捕DNA，而不是具有它的复合体。阳离子和非阳离子脂质体均已用于递送DNA到细胞。

脂质体还包括“空间稳定”脂质体，如本文所用，该术语是指含有一种或多种特化脂类的脂质体。当被整合到脂质体中时，这些特化脂类导致脂质体相对缺乏这种特化脂类的脂质体具有增强的循环寿命。空间稳定脂质体的实例是这样的脂质体：其中脂质体的形成囊泡的脂部分的一部分包含一种或多种糖脂或用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂质体及其使用进一步参见美国专利号6,287,860。

本发明的药物制剂和组合物还可包含表面活性剂。表面活性剂在药物制品、制剂和乳剂中的使用是本领域公知的。表面活性剂及其使用进一步参见美国专利号6,287,860，其通过引用结合到本文中。

在一个实施方案中，本发明使用多种渗透促进剂，以影响核酸尤其寡核苷酸的有效递送。除了帮助非亲脂性药物跨细胞膜的扩散外，渗透促进剂还增强亲脂性药物的透性。渗透促进剂可归类为属于五大类(即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂)之一。渗透促进剂及其使用进一步参见美国专利号6,287,860，其通过引用结合到本文中。

本领域技术人员将认识到，按照制剂的预期使用(即给药途径)常规设计制剂。

用于局部给药的优选制剂包括这样的制剂：其中本发明的寡核苷酸与局部递送试剂混合，局部递送试剂例如脂类、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。优选的脂类和脂质体包括中性的(例如二油酰-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子型(例如二油酰四甲氨基丙基DOTAP和二油酰-磷脂酰乙醇胺DOTMA)。

对于局部或其它给药，可将本发明的寡核苷酸包封到脂质体中，或者可与脂质体形成复合体，特别是阳离子型脂质体。或者，可将寡核苷酸与脂类尤其阳离子脂类络合。优选的脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐及它们的应用进一步参见美国专利号6,287,860。

用于口服给药的组合物和制剂包括散剂或颗粒剂、微粒(microparticulate)、纳米颗粒(nanoparticulate)、水或非水介质中的混悬剂或溶液剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、小药囊、片剂或小片。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是所需的。优选的口服制剂是这样的制剂：其中本发明的寡核苷酸与一种或多种渗透促进剂、表面活性剂和螯合剂联合给予。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐和脂肪酸及它们的使用进一步参见美国专利号6,287,860，其通过引用结合到本文中。还优选渗透促进剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐联合。特别优选的组合是十二烷酸、癸酸和UDCA的钠盐。其它渗透促进剂包括聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明的寡核苷酸可以含喷雾干燥颗粒的颗粒形式口服递送，或络合形成微粒或纳米颗粒。寡核苷酸络合剂及其使用进一步参见美国专利号6,287,860，其通过引用结合到本文中。干扰RNA的体内给药已载于例如在美国专利号7,528,118，“RNAi modulation ofApoB and uses thereof(ApoB的RNAi调节及其应用)”，其通过引用以其整体结合到本文中。

用于胃肠外、鞘内或心室内给药的组合物和制剂可包括无菌水溶液，该无菌水溶液还可含有缓冲剂、稀释剂和其它合适添加剂，例如但不限于渗透促进剂、载体化合物及其它药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的某些实施方案提供含有一种或多种寡聚化合物和一种或多种其它通过非反义机制起作用的化疗药物的药物组合物。这种化疗药物的实例包括但不限于癌症化疗药物，例如柔红霉素、道诺霉素、放线菌素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氯乙亚硝脲(bischloroethyl-nitrosurea)、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光神霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲密胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氮胞苷、羟基脲、脱氧考福霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱、泰素(taxol)、长春新碱、长春碱、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。当与本发明的化合物一起使用时，这样的化疗药物可单独使用(例如，5-FU和寡核苷酸)、序贯使用(例如，5-FU和寡核苷酸使用一段时间后接着用MTX和寡核苷酸)或与一种或多种其它这样的化疗药物联合使用(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射疗法和寡核苷酸)。抗炎药物(包括但不限于非甾类抗炎药物和皮质类固醇)和抗病毒药物(包括但不限于利巴韦林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦)也可与本发明的组合物联合。反义化合物和其它非反义药物的组合也落入本发明的范围内。两种以上联合化合物可同时或序贯使用。

在另一个相关实施方案中，本发明的组合物可包含靶向第一核酸的一种或多种反义化合物(尤其寡核苷酸)和靶向第二核酸靶标的一种或多种其它反义化合物。例如，第一靶标可以是红细胞生成素(EPO)的特定反义序列，第二靶标可以是来自另一核苷酸序列的区。或者，本发明的组合物可包含两种以上靶向相同红细胞生成素(EPO)核酸靶标的不同区的反义化合物。本文阐明了反义化合物的多个实例，其它实例可从本领域已知的合适化合物中选出。两种以上联合化合物可同时或序贯使用。

给药：

治疗组合物的制剂和它们的后续用药(给药)被认为是本领域公知技术。给药取决于待治疗疾病状态的严重性和响应性，具有长达数天至数月的治疗疗程，或者直到实现治愈或实现疾病状态的缩减。最佳给药方案可根据对患者体内蓄积药物的测量来计算。普通技术人员可容易地测定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可视各种寡核苷酸的相对效能而变化，且通常可根据被认为在体外和体内动物模型中有效的EC50来估计。通常，剂量为0.01μg-100g每kg体重，并可每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或者每2-20年给予一次。本领域普通技术人员可容易地根据测量的药物在体液或组织中的停留时间和浓度估计给药重复率。在成功治疗后，可能需要患者进行维持治疗以防止疾病状态复发，其中以维持剂量给予寡核苷酸，维持剂量为0.01μg-100g每kg体重，每天一次或多次至每20年一次。在剂量放大研究中将核糖核苷酸还原酶反义寡核苷酸给予患有急性骨髓性白血病的患者，参见Klisovic等,2008,“Phase I study of GTI-2040,an antisense to ribonucleotidereductase,in combination with high-dose cytarabine in patients with acutemyeloid leukemia(核糖核苷酸还原酶反义物GTI-2040联合高剂量阿糖胞苷在急性髓性白血病患者中的I期研究),”Clin Cancer Research:14(12):3889-95，其通过引用结合到本文中。

虽然上文已说明本发明的多个实施方案，应当理解它们仅提供作为实施例而非限制。依据本文公开内容可对公开的实施方案作出多种改变，而不偏离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围将不受任何上述实施方案的限制。

本文提及的所有文献通过引用结合到本文中。本申请中引用的所有出版物和专利文献通过引用结合到本文中用于所有目的，到与如同各个体出版物或专利文献如此分别表示的相同程度。至于在该文件中对多种参考文献的引用，申请人不承认任何具体参考文献相对他们的发明是“现有技术”。以下实施例中对发明组合物和方法的实施方案进行说明。

实施例

以下非限制性实施例用来阐明本发明的选定实施方案。应当理解，所示组分的比例变化和备选要素对本领域技术人员而言是显而易见的，并落入本发明实施方案的范围内。

实施例1：设计对红细胞生成素(EPO)多核苷酸的反义核酸分子和/或有义链特异的反义寡核苷酸

如上所指出，术语“对…特异的寡核苷酸”或“靶向…的寡核苷酸”是指具有下述序列的寡核苷酸：其(i)能够与靶基因的一部分形成稳定复合体，或(ii)能够与靶基因的mRNA转录物的一部分形成稳定双链体。

通过使用自动比对核酸序列并指明同一性或同源性区的计算机程序，有助于选择适当的寡核苷酸。这种程序用于比较所得核酸序列，例如通过检索数据库(例如GenBank)或通过对PCR产物测序。比较多个物种的核酸序列使能够选择在物种间显示适当的同一性程度的核酸序列。在未测序基因的情况下，进行DNA印迹以使能够测定靶物种和其它物种的基因间的同一性程度。通过在不同严格程度下进行DNA印迹，如本领域公知的，可获得同一性的近似测量。这些步骤使能够选择这样的寡核苷酸：其对待控制受试者的靶核酸序列表现高度互补性，而对其它物种的对应核酸序列表现低度互补性。本领域技术人员会认识到，在选择用于本发明的适当基因区方面存在相当大的自由。

当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的调节，并存在足够程度的互补性以避免在需要特异性结合的条件下(即在体内测定或治疗性治疗情况中的生理条件和体外测定情况中进行测定的条件下)该反义化合物与非靶核酸序列非特异性结合时，反义化合物是“可特异性杂交的”。

本文所述寡核苷酸的杂交性质可通过本领域已知的一种或多种体外测定来确定。例如，本文所述寡核苷酸的性质可通过利用解链曲线测定来确定靶天然反义物和潜在药物分子之间的结合强度而获得。

靶天然反义物和潜在药物分子(Molecule)之间的结合强度可利用任何测量分子间相互作用强度的已建立方法(例如解链曲线测定)来估计。

解链曲线测定法确定天然反义物/Molecule复合体发生从双链构象到单链构象的快速转变的温度。该温度被广泛接受为两分子间相互作用强度的可靠量度。

解链曲线测定可利用实际的天然反义RNA分子的cDNA拷贝或相当于Molecule的结合位点的合成DNA或RNA核苷酸进行。多种含有用于进行该测定的所有必需试剂的试剂盒是可用的(例如Applied Biosystems Inc.MeltDoctor试剂盒)。这些试剂盒包含合适的缓冲溶液，该缓冲溶液含有一种双链DNA(dsDNA)结合染料(例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等)。dsDNA染料的性质使得它们的游离形式几乎不发出荧光，而与dsDNA结合时是高度荧光的。

为进行测定，将cDNA或对应寡核苷酸与Molecule以由具体制造商的方案规定的浓度混合。将混合物加热到95℃以解离所有预先形成的dsDNA复合体，之后缓慢冷却至室温或试剂盒制造商规定的其它更低温度，以使DNA分子能够退火。然后，将重新形成的复合体缓慢加热到95℃，并同时连续收集由该反应产生的荧光量的数据。荧光强度与反应中存在的dsDNA量成反比。数据采集可利用与试剂盒兼容的实时PCR仪器(例如ABI’s StepOne PlusReal Time PCR System或LightTyper instrument,Roche Diagnostics,Lewes,UK)。

通过利用适当软件(例如LightTyper(Roche)或SDS Dissociation Curve,ABI)将荧光关于温度的负导数(y轴上的-d(荧光)/dT)对温度(x轴)作图，构建解链峰。分析数据，以鉴定dsDNA复合体快速转变成单链分子的温度。该温度称为Tm，与两分子间的相互作用强度成正比。通常，Tm大于40℃。

实施例2：EPO多核苷酸的调节

在37℃和5％CO₂条件下的生长培养基(MEM/EBSS(Hyclone目录号SH30024或Mediatech目录号MT-10-010-CV)+10％FBS(Mediatech目录号MT35-011-CV)+青霉素/链霉素(Mediatech目录号MT30-002-CI))中培养来自ATCC的HepG2细胞(目录号HB-8065)。在实验前一天，将细胞以1.5×10⁵/ml的密度再次铺板到6孔板中并在37℃和5％CO₂条件下孵育。在实验当天，将6孔板中的培养基更换为新鲜生长培养基。将所有反义寡核苷酸稀释为20μM的浓度。将2μl该溶液与400μl Opti-MEM培养基(Gibco目录号31985-070)和4μlLipofectamine 2000(Invitrogen目录号11668019)一起在室温下孵育20分钟，并施用到具有HepG2细胞的6孔板的各孔。含有2μl代替寡核苷酸溶液的水的类似混合物用作模拟转染对照。在37℃和5％CO₂条件下孵育3-18小时后，将培养基更换为新鲜生长培养基。在加入反义寡核苷酸48小时后，除去培养基，并按照制造商说明书利用Promega的SV Total RNAIsolation System(目录号Z3105)或Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation试剂盒(目录号74181)提取细胞RNA。将600ng RNA加入反转录反应，该反转录反应按制造商方案所述利用Thermo Scientific的Verso cDNA试剂盒(目录号AB1453B)或High Capacity cDNAReverse Transcription Kit(目录号4368813)进行。来自该反转录反应的cDNA用来通过实时PCR监测基因表达，该实时PCR利用ABI Taqman Gene Expression Mix(目录号4369510)和ABI(Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay:Hs00171267_m1,AppliedBiosystems Inc.,Foster City CA)设计的引物/探针进行。使用以下PCR循环：50℃2分钟、95℃10分钟，40个循环(95℃15秒，60℃1分钟)，使用StepOne Plus Real Time PCRMachine(Applied Biosystems)。

根据治疗样品和模拟转染样品之间的18S-标准化dCt值的差异，计算在用反义寡核苷酸治疗后基因表达的倍数变化。

用于常规设计Taqman测定EPO天然反义序列EPOAS(SEQ ID NO:3)的引物和探针

正向引物序列ACCACCCCGGTGTCAAG(SEQ ID NO:10)

反向引物序列TTTACCTGTTTTCGCACCTACCAT(SEQ ID NO:11)

报道序列CAAGCTGTGACTTCTC(SEQ ID NO:12)

报道染料1：FAM

结果：

实时PCR结果显示，在用针对epoas设计的两种siRNA处理的48h后显著提高了HepG2细胞中EPO mRNA的水平(epoas_1,P＝0.02和epoas_2,P＝0.04，图1A)。在相同样品中，在用针对epoas的siRNA处理后可能降低了epoas RNA的水平(图1B)。

实施例3：EPO蛋白产物的体外调节

对按照实施例2所述利用EPO反义寡核苷酸治疗的HepG2细胞测定EPO蛋白表达。按照制造商说明书，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(市售，例如Quantikine人红细胞生成素，R&D Systems，Minneapolis,MN)测定细胞上清液中存在的人EPO蛋白浓度和分泌水平，并与未转染对照样品中的水平作比较。

实施例4：ICGN小鼠中EPO多核苷酸和蛋白产物的调节

将对EPO-AS特异的反义寡核苷酸给予基因贫血小鼠模型ICGN(ICR衍生肾小球肾炎)小鼠，并监测贫血症的改善。参见例如Nagasaki,等,2009,“Amelioration of Anemiain the ICGN Mouse,a Renal Anemia Model,with a Subcutaneous Bolus Injection ofErythropoietin Adsorbed to Hydroxyapatite Matrix(皮下大量注射吸附到羟磷灰石的红细胞生成素改善肾贫血模型ICGN小鼠的贫血症),”J.Vet.Med.Sci.71(10):1365–1371，通过引用结合到本文中。通过使用27G针进行的尾静脉注射给予寡核苷酸。将推注给药的反义寡核苷酸(SEQ ID NO:4、5和6)溶于PBS，浓度使得递送的预期剂量为8ul/g体重。在给药前，将小鼠在红外灯下保持约3分钟以易于注射。仅给予对照小鼠相同体积的PBS。

在给药的数天前，通过采集4-7滴尾静脉血而采集预先治疗的血样。

在用CO₂或醚麻醉的情况下，从腔静脉采集血样，并用于血液学分析。如前所述，通过RT-PCR测定来测量EPO mRNA水平。酶联免疫吸附测定(ELISA)利用Human EPO ELISA Kit(可获自例如Quantikine人红细胞生成素，R&D Systems,Minneapolis,MN或StemcellTechnologies,Vancouver,BC,Canada)进行，以测定血浆rhEPO浓度。按照使用手册使用自动计数器(KX-21NV；Sysmex,Kobe,Japan)进行血液学分析。在用Brecher’s New MethyleneBlue Solution染色的载玻片上的血涂片中对网织红细胞进行计数，并计算网织红细胞的比。将RBC数量、血红蛋白浓度、血细胞比容值和持续比(sustaining rate)作为造血作用的持续功效评价，持续比是第21天的值对第0天的值的比。通过过量醚吸入处死小鼠，对它们的摘出肝脏、肾脏和脾称重。将肝、脾和皮下组织固定到10％中性缓冲甲醛中，并在苏木精和伊红染色后进行组织病理学分析。

实施例5：贫血症患者的EPO多核苷酸和蛋白产物的调节

用EPO反义寡核苷酸治疗贫血症患者。通过静脉内输注以每周一至五次5mg/kg的比率将反义寡核苷酸(SEQ ID NO:4、5和6)给予患者。通过标准分光光度测定定期(例如每周一次)测量血红蛋白。视不同周观察的血红蛋白水平的相对变化，相应调节治疗。随着在任何2周的时间段内血红蛋白接近12g/dL，或者增加多于1g/dL，减少剂量。(参见例如包装说明书中的红细胞生成素给药指南，可获自http://www.epogen.com/pdf/ epogen_pi.pdf，通过引用结合到本文中。)

测定了EPO蛋白和mRNA的表达。按照制造商说明书，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(市售，例如Quantikine人红细胞生成素，R&D Systems，Minneapolis,MN)测定人EPO蛋白浓度和分泌水平。如本文它处所述，利用RT-PCR测定mRNA水平。

虽然已参照一种或多种实现方式对本发明进行了解释和说明，但是在阅读和理解本说明书和附图后，本领域技术人员会想到等价的改变和变化。此外，虽然可能已经仅参照若干实现方式之一公开了本发明的某具体特征，但是该特征可与其它实现方式的一个或多个其它特征联合，因为对任何给定或具体应用可能是所需和有利的。

本公开文本的摘要使读者能够快速确定本技术公开的实质。它被提交的条件是，它不会用来解释或限制以下权利要求的范围或含义。

Claims (5)

1.靶向红细胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反义序列的区段的至少一种反义寡核苷酸在制备用于体内或体外增量调节患者细胞或组织中红细胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表达的药物中的用途，其中所述红细胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反义序列是SEQID NO: 3；其中所述反义寡核苷酸选自SEQ ID NO: 4和5所示的寡核苷酸。

2.权利要求1的用途，其中所述至少一种反义寡核苷酸包含选自以下的一种或多种修饰：至少一种修饰糖部分、至少一种修饰核苷间键、至少一种修饰核苷酸及其组合。

3.权利要求2的用途，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰糖部分：2'-O-甲氧乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、二环糖部分及其组合。

4.权利要求2的用途，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰核苷间键：硫代磷酸酯、2'-O-甲氧乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其组合。

5.权利要求2的用途，其中所述一种或多种修饰包括选自以下的至少一种修饰核苷酸：肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)及其组合。