CN102459597A - 通过针对dmd家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病 - Google Patents

Abstract

本发明涉及反义寡核苷酸，其调节肌营养蛋白家族的表达和/或功能，尤其是通过靶向肌营养蛋白家族的天然反义多核苷酸。本发明也涉及这些反义寡核苷酸的鉴定及其在治疗与DMD家族表达有关的疾病和病症中的应用。

Description

通过针对DMD家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病

发明领域

本申请要求于2009年5月8日提交的美国临时专利申请号61/176,594、和2010年3月25日提交的美国临时专利申请号61/317,350的优先权，其整体引入本文作为参考。

本发明的实施方案包括调节DMD家族和相关分子的表达和/或功能的寡核苷酸。

发明背景

DNA-RNA和RNA-RNA杂交对于核酸功能的许多方面是重要的，包括DNA复制、转录和翻译。杂交对于检测特定核酸或改变其表达的各种技术也是关键的。反义核苷酸例如通过与靶RNA杂交破坏基因表达，由此干扰RNA剪接、转录、翻译和复制。反义DNA具有DNA-RNA杂交物充当用于通过核糖核酸酶H消化的底物的附加特征，其是在大多数细胞类型中存在的活性。反义分子可以递送到细胞内，如对于寡聚脱氧核苷酸（ODNs）的情况，或它们可以由内源基因表达为RNA分子。FDA近期批准了反义药物VITRAVENE™（用于治疗巨细胞病毒视网膜炎），反映反义物具有治疗效用。

概述

提供这个概述以呈现本发明的概述，以简要指出本发明的性质和主旨。它的提出伴随将不用于解释或限制权利要求范围或含义的理解。

在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制天然反义转录物的作用的方法，其通过使用靶向天然反义转录物的任何区域的一种或多种反义寡核苷酸，导致相应有义基因的上调。本文还考虑天然反义转录物的抑制可以通过siRNA、核酶和小分子来达到，这被视为在本发明的范围内。

一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与多核苷酸的反向互补体具有至少50％序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID NO：3的核苷酸1-378、SEQ ID NO：4的核苷酸1-294、SEQ ID NO：5的核苷酸1-686、SEQ ID NO：6的核苷酸1-480和SEQ ID NO：7的核苷酸1-501内的5 - 30个连续核苷酸（图3）；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向DMD家族多核苷酸的天然反义序列，例如SEQ ID NO：3-7中所示的核苷酸，以及关于其的任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的例子如SEQ ID NO：8-22中所示（图4和5）。

另一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与DMD家族多核苷酸的反义的反向互补体具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达。

另一个实施方案提供了在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达的方法，其包括使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与针对DMD家族反义多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中的DMD家族多核苷酸功能和/或表达。

在一个优选实施方案中，组合物包括与有义和/或反义DMD家族多核苷酸结合的一种或多种反义寡核苷酸。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个修饰的或取代的核苷酸。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包括一个或多个修饰的键。

在另外一个实施方案中，修饰的核苷酸包括包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-O-甲基、氟或碳、亚甲基或其它锁核酸（LNA）分子的修饰的碱基。优选地，修饰的核苷酸是锁核酸分子，包括α-L-LNA。

在另一个优选实施方案中，将寡核苷酸皮下、肌内、静脉内或腹膜内施用于患者。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸在药物组合物中施用。治疗方案包括给患者施用至少一次反义化合物，然而，这种治疗可以修改为包括经过一段时间的多个剂量。治疗可以与一种或多种其他类型的疗法组合。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸封装在脂质体中或与载体分子（例如胆固醇、TAT肽）连接。

其他方面在下文描述。

附图简述

图1是实时PCR结果的图，显示与对照相比使用应用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理518A2细胞后在DMD家族mRNA中的倍数变化+标准差。实时PCR结果显示，在用针对DMD家族反义BG208074设计的siRNAs中的两个处理后48 h，518A2细胞中DMD家族mRNA的水平显著增加。表示为CUR-0636至CUR-0654的条（Bars）分别对应于用SEQ ID NOS: 8-17处理的样品。

图1B是实时PCR结果的图，显示与对照相比使用应用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理518A2细胞后在DMD家族mRNA中的倍数变化+标准差。用针对其他反义分子BF838561、BF768753和BF950643的siRNAs的处理不提高DMD家族mRNA水平。表示为CUR-0638、CUR-0648、CUR-0646和CUR-0652的条分别对应于用SEQ ID NOS: 9、14、13和16处理的样品。

图1C 是实时PCR结果的图，显示与对照相比使用应用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸处理MCF-7细胞后在UTRN mRNA中的倍数变化+标准差。表示为CUR-1443至CUR-1447的条分别对应于用SEQ ID NOS: 18-22处理的样品。

图2显示

SEQ ID NO: 1: 智人肌营养蛋白家族转录物变体Dp427m, mRNA (NCBI登记号：NM_004006)

SEQ ID NO: 2: 智人Utrophin (UTRN), mRNA。(NCBI登记号：NM_007124)。

图3显示

SEQ ID NO: 3: 天然DMD家族反义序列 (BF838561)

SEQ ID NO: 4: 天然DMD家族反义序列 (BG208074)

SEQ ID NO: 5: 天然DMD家族反义序列 (BF950643)

SEQ ID NO: 6: 天然DMD家族反义序列 (BF768753)

SEQ ID NO: 7: 天然UTRN家族反义序列 (ENST00000431309)。

图4显示DMD反义寡核苷酸SEQ ID NOs: 8-17。‘r’指示RNA。

图5显示UTRN 反义寡核苷酸SEQ ID NOs: 18-22。* 指示硫代磷酸酯（phosphothioate）键。

图6显示DMD有义寡核苷酸SEQ ID NOs: 23-32。有义寡核苷酸SEQ ID NO: 23-32分别是反义寡核苷酸SEQ ID NO: 8-17的反向互补体。‘r’指示RNA。

发明详述

下文就用于举例说明的示例应用而言描述了本发明的几个方面。应当理解阐述了众多具体细节、关系和方法，以提供本发明的全面了解。然而，相关领域普通技术人员将容易认识到本发明可以无需一个或多个具体细节或用其他方法进行实践。本发明不受动作或事件排序限制，因为一些动作可以以不同次序和/或与其他动作或事件同时发生。此外，并非需要所有举例说明的动作或事件来实现依照本发明的方法。

本文公开的所有基因、基因名称和基因产物预期对应于来自任何物种的同系物，本文公开的组合物和方法可应用于所述任何物种。因此，该术语包括但不限于来自人和小鼠的基因和基因产物。应当理解当公开了来自特定物种的基因或基因产物时，这个公开内容预期仅是示例性的，并且不解释为限制，除非它在其中出现的上下文明确指出。因此，例如，对于本文公开的基因，这在一些实施方案中涉及哺乳动物核酸和氨基酸序列，预期包括来自其他动物的同源和/或直向同源基因和基因产物，包括但不限于其他哺乳动物、鱼类、两栖类、爬行类和鸟类。在优选实施方案中，基因或核酸序列是人的。

定义

本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不预期限制本发明。如本文使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”也预期包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，就术语“包括”、“具有”、“含有”或其变化用于详述和/或权利要求来说，此类术语预期以类似于术语“包含”的方式是包括性的。

术语“约”或“大约”意指如通过本领域普通技术人员确定的，在关于具体值的可接受误差范围内，这将部分依赖于该值如何进行测量或测定，即测量系统的局限性。例如，“约”可以意指根据本领域的实践在1或超过1个标准差内。可替代地，“约”可以意指直到给定值20％、优选直到10％、更优选直到5％且更优选直到1％的范围。可替代地，特别就生物系统或过程而言，该术语可以意指在值的一个数量级内，优选在5倍内，且更优选在2倍内。当具体值在本申请和权利要求中描述时，除非另有说明，否则应假定术语“约”意指在关于具体值的可接受误差范围内。

如本文使用的，术语“mRNA”意指目前已知的靶基因的一种或多种mRNA转录物，以及可以阐明的任何进一步转录物。

“反义寡核苷酸”或“反义化合物”意指与另一种RNA或DNA（靶RNA、DNA）结合的RNA或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，那么它借助于RNA-RNA相互作用与另一种RNA靶结合，并且改变靶RNA的活性（Eguchi等人，1991Ann. Rev. Biochem. 60，631-652）。反义寡核苷酸可以上调或下调特定多核苷酸的表达和/或功能。该定义意欲包括从治疗、诊断或其他观点看来有用的任何外来RNA或DNA分子。此类分子包括例如反义RNA或DNA分子、干扰RNA（RNAi）、微小RNA、诱饵RNA分子、siRNA、酶促RNA、治疗编辑RNA及激动剂和拮抗剂RNA、反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、可变剪接物、引物、探针和与靶核酸的至少部分杂交的其他寡聚化合物。像这样，这些化合物可以以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”指核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸（DNA）或其模拟物的寡聚物或聚合物。术语“寡核苷酸”还包括天然和/或修饰单体或键合的线性或环状寡聚物，包括脱氧核糖核苷、核糖核苷、其置换和α-异头物形式、肽核酸（PNA）、锁核酸（LNA）、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能够通过单体间相互作用的规律模式与靶多核苷酸特异性结合，例如沃森-克里克（Watson-Crick）型碱基配对、Hoögsteen或反向Hoögsteen型碱基配对等。

寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同区域组成。在本发明的背景中，“嵌合”化合物是寡核苷酸，其包含2个或更多个化学区域，例如一个或多个DNA区域、一个或多个RNA区域、一个或多个PNA区域等。每个化学区域由至少一个单体单位构成，即在寡核苷酸化合物的情况下核苷酸。这些寡核苷酸一般包括其中寡核苷酸进行修饰的至少一个区域，以便显示出一种或多种所需性质。寡核苷酸的所需性质包括但不限于例如对核酸酶降解的抗性增加、细胞摄取增加、和/或对于靶核酸的结合亲和力增加。寡核苷酸的不同区域因此可以具有不同性质。本发明的嵌合寡核苷酸可以作为2种或更多种如上所述的寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸类似物的混合结构形成。

寡核苷酸可以由可以以“记录器（register）”连接的区域组成，即当单体连续连接时，如在天然DNA中，或经由间隔物连接。间隔物预期构成区域之间的共价“桥”，并且在优选情况下具有不超过约100个碳原子的长度。间隔物可以携带不同功能性，例如具有正或负电荷，携带特定核酸结合性质（插入剂、槽沟结合剂、毒素、荧光团等），是亲脂的，诱导特定二级结构如例如诱导α-螺旋的含丙氨酸肽。

如本文使用的，“DMD家族”、“肌营养蛋白家族”和“肌营养蛋白相关蛋白家族”、“肌营养蛋白基因家族”包括所有家族成员、突变体、等位基因、片段、种类、编码和非编码序列、有义和反义多核苷酸链等在内。

如本文使用的，术语肌营养蛋白、DMD、BMD、CMD3B、DXS142、DXS164、DXS206、DXS230、DXS239、DXS268、DXS269、DXS270和DXS272在本申请中可互换应用。

如本文使用的，术语Utrophin、UTRN、DMDL、DRP、DRP1、肌营养蛋白相关蛋白1、FLJ23678在本申请中可互换应用。

如本文使用的，术语“肌营养蛋白相关蛋白2”、“肌营养蛋白-相关蛋白2”和DRP2在本申请中可互换应用。

如本文使用的，术语小肌营养蛋白、α-小肌营养蛋白、β-小肌营养蛋白、DTNA和DTNB在本申请中可互换应用。

如本文使用的，术语“对……具有特异性的寡核苷酸”或“靶向……的寡核苷酸”指具有下述序列的寡核苷酸：（i）能够与靶基因的部分形成稳定复合物，或（ii）能够与靶基因的mRNA转录物的部分形成稳定双链体。复合物和双链体的稳定性可以通过理论计算和/或体外测定进行测定。用于测定杂交复合物和双链体的稳定性的示例性测定在下文实施例中描述。

如本文使用的，术语“靶核酸”包含DNA、由此类DNA转录的RNA（包括mRNA前体和mRNA）、以及衍生自此类RNA的cDNA、编码、非编码序列、有义或反义多核苷酸。寡聚化合物与其靶核酸的特异性杂交干扰核酸的正常功能。通过与之特异性杂交的化合物的这种靶核酸功能调节，一般被称为“反义”。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重大功能例如RNA易位至蛋白质翻译位点、由RNA翻译蛋白质、RNA剪接以获得一种或多种mRNA种类、和可以与RNA衔接或由RNA促进的催化活性。此类靶核酸功能干扰的总体效应是调节编码产物或寡核苷酸的表达。

RNA干扰“RNAi”通过双链RNA（dsRNA）分子介导，其与其“靶”核酸序列具有序列特异性同源性（Caplen，N. J.,等人（2001），Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747）。在本发明的特定实施方案中，调节物是5-25核苷酸“小干扰”RNA双链体（siRNAs）。siRNAs衍生自通过称为Dicer的RNA酶的dsRNA加工（Bernstein，E.,等人（2001），Nature409:363-366）。siRNA双链体产物召募到命名为RISC（RNA诱导的沉默复合体）的多蛋白质siRNA复合体内。不希望受任何具体理论束缚，RISC随后被认为导向靶核酸（适当地mRNA），在该处siRNA双链体以序列特异性方式相互作用，以催化形式介导切割（Bernstein，E.,等人（2001），Nature409:363-366（2001）；Boutla，A.,等人，Curr. Biol. 11:1776-1780）。可以根据本领域众所周知和普通技术人员熟悉的操作合成且使用可以依照本发明使用的小干扰RNAs。用于在本发明的方法中使用的小干扰RNAs适当地包括约1 – 约50个核苷酸（nt）。在非限制性实施方案的例子中，siRNAs可以包括约5 - 约40 nt、约5 - 约30 nt、约10 - 约30 nt、约15 - 约25 nt、或约20-25个核苷酸。

合适寡核苷酸的选择通过使用计算机程序得到促进，所述计算机程序自动比对核酸序列且指出同一性或同源性区域。此类程序用于比较获得的核酸序列，例如通过搜索数据库例如GenBank或通过测序PCR产物。来自一系列物种的核酸序列的比较允许选择展示物种之间的合适同一性程度的核酸序列。在未测序的基因的情况下，执行DNA印迹以允许测定靶物种和其他物种中在基因之间的同一性程度。通过在各种严格程度下执行DNA印迹，如本领域众所周知的，可以获得同一性的近似测量。这些操作允许选择这样的寡核苷酸，其显示出与待控制受试者中的靶核酸序列的高度互补性和与其他物种中的相应核酸序列的较低程度互补性。技术人员将认识到在选择用于在本发明中使用的基因的合适区域中存在相当大的活动余地。

“酶促RNA”意指具有酶促活性的RNA分子（Cech，（1988）J. American. Med. Assoc. 260，3030-3035）。酶促核酸（核酶）通过首先与靶RNA结合起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，所述酶促核酸与作用于切割靶RNA的分子的酶促部分保持紧密接近。因此，酶促核酸首先识别且随后通过碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确位点结合，就酶促作用以切割靶RNA。

“诱饵RNA”意指模拟关于配体的天然结合结构域的RNA分子。诱饵RNA因此与天然结合靶竞争结合特异性配体。例如，已显示HIV反式激活应答（TAR）RNA的超表达可以充当“诱饵”并且有效结合HIV tat蛋白质，从而阻止其与HIV RNA中编码的TAR序列结合（Sullenger等人（1990），Cell，63，601-608）。这意欲是特定例子。技术人员将认识到这仅是一个例子，并且其他实施方案可以使用本领域一般已知的技术容易地生成。

如本文使用的，术语“单体”一般指示通过磷酸二酯键或其类似物连接的单体，以形成大小范围从几个单体单位例如约3-4个到约数百个单体单位的寡核苷酸。磷酸二酯键的类似物包括：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更全面描述的。

术语“核苷酸”涵盖天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。对于本领域技术人员应明确的是先前已视为“非天然存在的”各种核苷酸已随后在自然界中发现。因此，“核苷酸”不仅包括已知的含嘌呤和嘧啶杂环的分子，还包括其杂环类似物和互变异构体。其它类型的核苷酸的举例说明性例子是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N⁶-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N⁴,N⁴-乙醇胞嘧啶（ethanocytosin）、N⁶,N⁶-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-（C3-C6）-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和Benner等人，美国专利号5,432,272 中描述的“非天然存在的”核苷酸。术语“核苷酸”预期涵盖这些例子以及其类似物和互变异构体中的每一个和全部。特别有利的核苷酸是包含腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的那些，这被视为与在人中的治疗和诊断应用有关的天然存在的核苷酸。核苷酸包括天然2'-脱氧和2'-羟基糖，例如如Kornberg和Baker，DNA Replication，第二版（Freeman，San Francisco，1992）中所述，以及它们的类似物。

提及核苷酸的“类似物”包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸（参见，例如由下述一般描述的：Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York，1980；Freier和Altmann，（1997）Nucl. Acid. Res.，25（22），4429-4443，Toulmé，J.J.，（2001）NatureBiotechnology 19:17-18；Manoharan M.，（1999）Biochemica et Biophysica Acta1489:117-139；Freier S. M.，（1997）Nucleic Acid Research，25:4429-4443，Uhlman，E.，（2000）Drug Discovery & Development，3：203-213，Herdewin P.，（2000）Antisense & Nucleic Acid Drug Dev.，10:297-310）；2'-O，3`-C-连接的[3.2.0]双环阿糖核苷（参见例如，N.K Christiensen.，等人，（1998）J. Am. Chem. Soc.，120：5458-5463；Prakash TP, Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem.7(7):641-9;Cho EJ, et al. (2009)Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264)。此类类似物包括设计为增强结合性质的合成核苷酸，所述结合性质例如双链体或三链体稳定性、特异性等。

如本文使用的，“杂交”意指寡聚化合物的基本上互补链的配对。一种配对机制涉及在寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基（核苷酸）之间的氢键合，这可以是沃森-克里克、Hoögsteen或反向Hoögsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核苷酸。杂交可以在各种情况下发生。

当化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以引起功能和/或活性调节时，并且存在足够程度的互补性，以避免在其中需要特异性结合的条件下反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，即在体内测定或治疗性处理情况下在生理条件下，和其中在体外测定情况下执行测定的条件下，反义化合物是“可特异性杂交的”。

如本文使用的，短语“严格杂交条件”或“严格条件”指在其下本发明的化合物将与其靶序列杂交但与最低限度数目的其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况中和在本发明的背景中将是不同的，在其下寡聚化合物与靶序列杂交的“严格条件”由寡聚化合物的性质和组成以及它们待在其中研究的测定决定。一般而言，严格杂交条件包括具有无机阳离子例如Na⁺⁺或K⁺⁺（即低离子强度）的低浓度（<0.15M）的盐，高于20℃ - 25℃低于寡聚化合物:靶序列复合物的Tm的温度，和变性剂例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）的存在。例如，杂交速率对于每1％甲酰胺下降1.1％。高严格杂交条件的例子是在60℃下0.1X氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（SSC）/0.1％（w/v）SDS共30分钟。

如本文使用的，“互补性”指关于在一条或两条寡聚链上的2个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在反义化合物的特定位置上的核碱基能够与在靶核酸的特定位置上的核碱基氢键合，所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子，那么在寡核苷酸和靶核酸之间氢键合的位置被视为互补位置。当每种分子中足够数目的互补位置由可以彼此氢键合的核苷酸占据时，寡聚化合物和进一步地DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用于指出在足够数目的核苷酸上足够程度的精确配对或互补性的术语，从而使得稳定和特异性结合在寡聚化合物和靶核酸之间发生。

本领域应当理解寡聚化合物的序列无需与其靶核酸100％互补以是可特异性杂交的。此外，寡核苷酸可以在一个或多个区段上杂交，从而使得插入或邻近区段不涉及杂交事件（例如，环结构、错配或发夹结构）。本发明的寡聚化合物包括与在它们靶向其的靶核酸序列内的靶区域至少约70％、或至少约75％、或至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的序列互补性。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补且因此将特异性杂交的反义化合物，将代表90％互补性。在这个例子中，其余非互补核苷酸可以聚簇或由互补核苷酸间断，并且与彼此或互补核苷酸无需是邻接的。像这样，具有4（四）个非互补核苷酸的长度18个核苷酸的反义化合物将与靶核酸具有77.8％总体互补性，并且因此将落入本发明的范围内，所述非互补核苷酸侧面为与靶核酸完全互补性的2个区域。使用本领域已知的BLAST程序（碱基局部比对搜索工具）和PowerBLAST程序（Altschul等人，（1990）J. Mol. Biol.，215，403-410；Zhang和Madden，（1997）Genome Res.，7，649-656），可以照常规测定反义化合物与靶核酸区域的互补性百分比。同源性百分比、序列同一性或互补性可以通过例如Gap程序（Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，University Research Park，Madison Wis.）使用缺省设置进行测定，所述Gap程序使用Smith和Waterman的算法（Adv. Appl. Math.，1981，2，482-489）。

如本文使用的，术语“热解链温度（Tm）”指在限定离子强度、pH和核酸浓度下的温度，在其下与靶序列互补的50％寡核苷酸在平衡状态中与靶序列杂交。一般地，严格条件将是对于短寡核苷酸（例如，10 – 50个核苷酸），其中盐浓度是在pH 7.0 - 8.3下至少约0.01 - 1.0 M Na离子浓度（或其他盐）并且温度是至少约30℃的那些。严格条件还可以用添加去稳定剂例如甲酰胺来达到。

如本文使用的，“调节”意指基因表达中的增加（刺激）或减少（抑制）。

当在多核苷酸序列的背景中使用时，术语“变体”可以包含与野生型基因有关的多核苷酸序列。这个定义还可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态性”变体。剪接变体可以与参考分子具有显著同一性，但由于在mRNA加工过程中外显子的可变剪接，一般将具有更多或更少数目的多核苷酸。相应多肽可以具有另外功能结构域或结构域的不存在。物种变体是从一个物种到另一个不同的多核苷酸序列。在本发明中具有特别效用的是野生型基因产物的变体。变体可以起因于核酸序列中的至少一个突变，且可能导致改变mRNAs或其结构或功能可能改变或不改变的多肽。任何给定天然或重组基因可以具有无一、一个或许多个等位基因形式。引起变体的常规突变改变一般归于核苷酸的天然缺失、添加或置换。这些类型改变各自可以单独或与其他组合在给定序列中发生一次或多次。

所得到的多肽一般将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态性变体是在给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列中的变异。多态性变体还可以包含“单核苷酸多态性”（SNPs）或其中多核苷酸序列通过一个碱基改变的单碱基突变。SNPs的存在可以指示例如对于疾病状态具有倾向的特定群体，即易感性与抗性比较。

衍生多核苷酸包括实施化学修饰的核酸，例如通过烷基、芳基或氨基基团替换氢。衍生物例如衍生寡核苷酸可以包括非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键合。在这些中示例性的是硫代磷酸酯和本领域已知的其他含硫种类。衍生核酸还可以包含标记，包括核糖核苷酸、酶、荧光剂、化学发光剂、显色剂、底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。

“衍生”多肽或肽是例如通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、还原/烷基化、酰化、化学偶联或弱福尔马林处理修饰的那种。衍生物还可以直接或间接进行修饰，以包含可检测标记，包括但不限于放射性同位素、荧光和酶标记。

如本文使用的，术语“动物”或“患者”意欲包括例如人、绵羊、麋鹿、鹿、黑尾鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、犬、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行类、鱼类、昆虫和蛛形类。

“哺乳动物”涵盖一般在医疗护理下的温血动物（例如人和驯养动物）。例子包括猫、犬、马、牛和人，以及仅仅人。

“治疗”或“处理”涵盖哺乳动物中疾病状态的治疗，并且包括：（a）预防哺乳动物中的疾病状态发生，特别是当此类哺乳动物有疾病状态倾向但尚未被诊断为具有其时；（b）抑制疾病状态，例如阻止其发展；和/或（c）缓解疾病状态，例如促使疾病状态消退直到达到所需终末点。治疗还包括疾病症状的改善（例如减轻疼痛或不适），其中此类改善可以直接影响疾病（例如，引起、传染、表达等）或可以不如此。

如本文使用的，“癌症”指哺乳动物中发现的所有类型的癌或瘤或恶性肿瘤，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌症本身表现为“肿瘤”或包含恶性癌细胞的组织。肿瘤的例子包括癌和肉瘤，诸如但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管原癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。可以通过根据本发明公开的组合物治疗的另外的癌症包括但不限于例如何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑肿瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛素瘤(insulanoma)、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高血钙、宫颈癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌和胰腺癌。

如本文使用的，“肌肉疾病或病症”包括但不限于肌营养不良症(MD)、肌萎缩病、炎症性肌病或肌炎(包括例如，皮肌炎、多肌炎、包涵体肌炎(myotosis))、肌小管肌病、纤维体肌病、结蛋白相关肌病、马凡氏肌病、线粒体肌病等。如本文所用，肌营养不良指一组生殖性、遗传性肌肉疾病，其引起进行性肌无力并且其可通过进行性骨骼肌无力、肌蛋白缺陷以及肌细胞和组织死亡表征。肌营养不良包括但不限于杜氏(DMD家族)、贝克尔(BMD)、脊髓性肌萎缩、脊髓延髓性肌萎缩、抗肌萎缩蛋白病、肌聚糖病(sarcoglycanopathy)、肢带肌营养不良(LGMD)、先天性肌营养不良(CMD)、面肩肱型(FSHD)、肌强直型、眼咽型、远端型和Emery- Dreifuss型。

“神经疾病或病症”指神经系统和/或视觉系统的任何疾病或病症。“神经疾病或病症”包括牵涉中枢神经系统(脑、脑干和小脑)、周围神经系统(包括颅神经)和自主神经系统(其部分位于中枢和周围神经系统中)的疾病或病症。神经病症的例子包括但不限于头痛、木僵和昏迷、痴呆、癫痫、睡眠障碍、外伤、感染、肿瘤、神经眼科、运动障碍、脱髓鞘疾病、脊髓病症、和周围神经、肌肉和神经肌肉接头病症。成瘾和心理疾病包括但不限于双相情感障碍和精神分裂症，并且也包括在神经病症的定义内。下列是可以应用根据本发明的组合物和方法治疗的几个神经病症、症状、体征和综合征的列举：获得性癫痫样失语症、急性播散性脑脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、老年性黄斑退化症、胼胝体发育不全、失认症、艾卡迪综合征、亚历山大病、阿耳珀病、交替性偏瘫、血管性痴呆、肌萎缩侧索硬化、无脑畸形、Angelman综合征、血管瘤病、缺氧、失语症、失用症、蛛网膜囊肿、蛛网膜炎、Anronl-Chiari畸形、动静脉畸形、Asperger综合征、共济失调性毛细血管扩张症、注意力缺陷伴多动障碍、孤独症、自主神经功能障碍、背痛、巴腾病、白塞氏病、贝尔麻痹、良性自发性睑痉挛、良性局灶性、肌萎缩、良性颅内高压、宾斯旺格病、眼睑痉挛、Bloch Sulzberger综合征、臂丛神经损伤、脑脓肿、脑损伤、脑瘤(包括多形性胶质母细胞瘤)、脊髓肿瘤、布朗-塞卡尔综合征、卡纳万病、腕管综合征、灼性神经痛、中枢性疼痛综合征、脑桥中央髓鞘溶解、头部病症、脑动脉瘤、脑动脉硬化症、脑萎缩、大脑性巨人症、脑瘫、夏-马-图三氏病、化学疗法诱导的神经病和神经性疼痛、希阿里畸形、舞蹈病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、慢性疼痛、慢性局部疼痛综合征、科-勒二氏综合征、昏迷包括持续性植物人状态、先天性面瘫、皮质基底退化、颅动脉炎、颅缝早闭、克雅氏病、累积性创伤障碍、库兴综合征、嗜酸性巨细胞包涵体病、巨细胞病毒感染、舞蹈眼-舞蹈足综合征、丹沃二氏综合征、道森病、德莫塞尔综合征、代-克二氏麻痹、痴呆、皮肌炎、糖尿病神经病、弥漫性硬化、自主神经功能异常、书写困难、诵读困难、张力失常、早期幼儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、脑突出、脑三叉神经血管瘤病、癫痫症、欧勃麻痹、特发性震颤、法布里病、法尔综合征、昏厥、家族性痉挛性瘫痪、发热性惊厥、菲希尔综合征、弗里德赖希共济失调症、额颞痴呆和其它"tau病变"、高歇病、格斯特曼综合征、巨细胞动脉炎、巨细胞性包涵体病、球样细胞脑白质营养不良、格-巴二氏综合征、HTLV-1-相关的脊髓病、哈-斯二氏病、头部损伤、头痛、半面痉挛、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性共济失调、耳部带状疱疹、带状疱疹、平山综合征、HIV相关的痴呆和神经病(也称为AIDS的神经学表现)、前脑无裂畸形、亨廷顿病和其他聚谷氨酰胺重复病、积水性无脑畸形、脑积水、皮质醇增多症、缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失调症、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷弗苏姆病、婴儿痉挛、炎症性肌病、颅内囊肿、颅内高压、Joubert综合征、Keams-Sayre综合征、肯尼迪病金斯布林纳综合征、克-费二氏综合征、克腊比病、库-韦病、库鲁病、拉福拉病、朗-爱二氏肌无力综合征、Landau-Kleffner综合征、侧髓(瓦伦伯格)综合征、学习失能、利氏病、Lennox-Gustaut综合征、累-奈二氏综合征、脑白质营养不良症、路易体痴呆、无脑回、闭锁综合征、路葛雷克氏病(即，运动神经元病或肌萎缩侧索硬化)、腰间盘病、莱姆病-神经学后遗症、马-约病、巨脑（macrencephaly）、巨脑（megalencephaly）、迈-罗二氏综合征、美尼尔症、髓膜炎、门克斯病、异染性脑白质营养不良、小头畸型、偏头痛、Miller Fisher综合征、小中风、线粒体肌病、默比厄斯综合征、单肢肌萎缩、运动神经元病、脑底异常血管网、粘多糖病、多发性硬化性痴呆、多灶性运动神经病、多发性硬化和其他脱髓鞘病症、多系统萎缩伴体位性低血压、p肌营养不良症、重症肌无力、脱髓鞘弥漫性硬化、婴儿肌阵挛性脑病、肌阵挛、肌病、先天肌强直、睡眠发作、神经纤维瘤病、神经阻滞剂恶性综合征、AIDS的神经学表现、狼疮的神经学后遗症、神经性肌强直、神经元腊样脂褐质症、神经元移行病症、尼曼-皮克二氏病、O'Sullivan-McLeod综合征、枕部神经痛、隐性脊柱神经管闭合不全序列征、大田原综合征、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视性眼阵挛、视神经炎、直立性低血压、过度使用综合征、感觉异常、神经变性疾病或病症(帕金森病、亨延顿病、阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、痴呆、多发性硬化和与神经细胞死亡有关的其他疾病及病症)、先天副肌强直、瘤外病、阵发性发作、帕-罗二氏综合征、佩-梅二氏病、周期性瘫痪、周围神经病、疼痛神经病和神经性疼痛、持续性植物人状态、综合性精神发育障碍、光喷嚏反射、植烷酸贮积病、匹克病、神经挟捏、垂体瘤、多肌炎、孔洞脑、小儿麻痹症后期综合征、带状疱疹后神经痛、感染后脑脊髓炎、体位性低血压、帕-魏二氏综合征、原发性侧索硬化症、朊病毒病、进行性一侧面萎缩、进行性多灶性白质脑病、进行性硬化性灰质萎缩、进行性核上麻痹、假脑瘤、拉姆齐-亨特综合征(I型和II型)、Rasmussen脑炎、反射性交感神经营养不良综合征、雷夫叙姆病、重复性运动病、重复性应激损伤、不宁腿综合征、反转录病毒相关脊髓病、雷特综合征、瑞氏综合征、舞蹈病、山德霍夫病、谢耳德病、脑裂、透明隔-视神经发育不良、惊吓婴儿综合征、带状疱疹、希-德二氏综合征、干燥综合征、睡眠呼吸暂停、索托斯综合征、痉挛状态、脊柱裂、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌萎缩、僵人综合征、中风、斯特奇-韦伯二氏综合征、亚急性硬化性全脑炎、皮层下动脉硬化性脑病、西德纳姆舞蹈病、晕厥、脊髓空洞症、迟发性运动障碍、泰-萨克斯病、颞动脉炎、脊髓栓系综合征、汤姆森病、胸廓出口综合征、三叉神经痛、托德麻痹、图雷特综合征、短暂性脑缺血发作、传播性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、外伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性轻截瘫、结节性硬化症、血管性痴呆 (多发梗塞性痴呆)、脉管炎包括颞动脉炎、希-林二氏病、瓦伦伯格综合征、韦-霍二氏病、韦斯特综合征、急性颈部扭伤、威廉斯综合征、威尔森氏病和泽耳韦格综合征。如本文所用的，“神经肌肉疾病或病症”指负面影响神经元件(脑、脊髓、周围神经)和肌肉(横纹肌或平滑肌)的任何疾病，包括但不限于不随意运动病症、张力失常、脊髓损伤或疾病、多发性硬化、重症肌无力、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿病、朗-爱二氏肌无力综合征 (LES)、先天性肌无力综合征 (CMS)、夏-马-图三氏病 (CMT)、代-索二氏病 (DS)、克雅氏病、弗里德赖希共济失调症、肌营养不良症、来自脑瘫的痉挛状态和中风。

心血管疾病或病症包括可以引起缺血或由心脏再灌注引起的那些病症。实例包括但不限于动脉粥样硬化、冠脉疾病、肉芽肿心肌炎、慢性心肌炎 (非肉芽肿)、原发性肥大性心肌病、周围动脉疾病(PAD)、中风、心绞痛、心肌梗塞、由心脏停搏引起的心血管组织损伤、由心脏旁路引起的心血管组织损伤、心源性休克、以及本领域技术人员会知道或牵涉心脏或脉管系统的功能障碍或组织损伤的相关状况，尤其是但不限于与DMD家族活化有关的组织损伤。CVS疾病包括但不限于动脉粥样硬化、肉芽肿心肌炎、心肌梗塞、继发于瓣膜性心脏病的心肌纤维化、无梗塞的心肌纤维化、原发性肥大性心肌病和慢性心肌炎(非肉芽肿)。

如本文所用的，“心肌病”指心肌(心脏肌肉)的任何疾病或功能障碍，其中心脏异常扩大、增厚和/或僵硬。结果，心脏肌肉的泵血能力通常变弱。该疾病或病症可以是例如炎症、代谢性、毒性、浸润性、纤维形成性、血液性遗传性、或未知来源的。这种心肌病可源自氧缺乏。其他疾病包括源自心肌损伤的那些，其牵涉作为疾病或外伤的结果对肌肉或心脏壁中心肌膜的损伤。心肌损伤可以归于许多事项，诸如但不限于心肌病、心肌梗塞、或先天性心脏病。待治疗的具体心脏病也包括充血性心力衰竭、室间隔或房间隔缺损、先天性心脏缺损或心室壁瘤。心脏病可为儿科起源的。心肌病包括但不限于心肌病(扩张型、肥厚型、限制型、致心律失常型和未分类心肌病)、散发扩张型心肌病、X-连锁扩张型心肌病(XLDC)、急性和慢性心力衰竭、右心衰竭、左心衰竭、两心室心力衰竭、先天性心脏缺损、二尖瓣狭窄、二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣关闭不全、三尖瓣狭窄、三尖瓣闭锁不全、肺动脉瓣狭窄、肺动脉瓣关闭不全、复合瓣膜缺陷、心肌炎、急性心肌炎、慢性心肌炎、病毒性心肌炎、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、糖尿病性心力衰竭和沉着病。

多核苷酸和寡核苷酸组合物和分子

靶：在一个实施方案中，靶包括肌营养蛋白家族的核酸序列，包括但不限于与DMD家族相关的有义和/或反义非编码和/或编码序列。

肌营养蛋白从1987起已知 (Hoffman等人，(1987),Cell.51:509-517)为在杜氏肌营养不良(DMD)中不足的蛋白质。它是脊椎动物肌细胞膜的胞质表面存在的细长蛋白质(Hoffman等人(1987),Cell.51:509-517)。三种其他肌营养蛋白相关蛋白质，即DRP₁(肌营养蛋白相关蛋白质1型或utrophin)、DRP₂(肌营养蛋白相关蛋白质2型)和小肌营养蛋白也已鉴定为不同基因的产物(Wang等人 (1998)Hum Mol Genet. 7:581-588)。肌营养蛋白和utrophin已在其他哺乳动物物种的肌肉中检测(Pons等人(1994)Circulation.90:369-374；Wang等人(1998)Hum Mol Genet. 7:581-588；Rafael等人(2000)Hum Mol Genet.9:1357-1367)并且也在其他组织诸如来自骨骼肌的产电器官(Chang等人(1989)J Biol Chem. 264:20831-20834)和石纹高原鳅（T. marmorata）的神经(Rivier等人(1999a)Histochem J.31:425-432，Rivier等人(1999b)J Muscle Res Cell Motil.20:305-314)中检测。哺乳动物骨骼肌中的肌营养蛋白与相关的蛋白复合物(DAPC)相互作用以形成细胞骨架和细胞外基质间的连接(Ibraghimov-Beskrovnaya等人(1992)Nature.355:696-702)。该复合物由两种肌营养不良蛋白聚糖( α-和ß-) (Deys等人(1995)J Biol Chem.270:25956-25959)、与sarcospan复合的肌聚糖(α-、ß-、γ-、δ-和

)(Nigro等人(1996)Hum Mol Genet.5:1179-1186; Crosbie等人(1997)J Biol Chem. 272:31221-31224; McNally等人(1998)FEBS Lett.422:27-32)、和肌肉组织中的三种syntrophins (α-, ß1-, ß2-)(Ahn等人(1996) J Biol Chem 271:2724-2730)组成。然而，syntrophins的新同种型 (γ1-和 γ2-)也已得到报道并且发现其作为脑特异性蛋白质表达(Piluso等人(2000)J Biol Chem. 275:15851-15860)。某些相关蛋白质中的不足或变化产生不同的肌肉病态，但所有这些相关肌营养不良的发病机制仍然不清楚。这可能是由于记录数据的异质性，例如由于四种肌营养蛋白相关蛋白质的存在，它们都具有与肌营养蛋白的富含半胱氨酸和C-末端结构域的同源性，并且也由于所分析的肌肉类型。

肌营养蛋白是棒状胞质蛋白质，并且是通过细胞膜连接肌肉纤维的细胞骨架与周围的细胞外基质的蛋白复合物的重要部分。该复合物被不同地称为costamere或肌营养蛋白相关蛋白复合物。许多肌肉蛋白质诸如a-小肌营养蛋白、syncoilin、联丝蛋白(synemin)、肌聚糖、肌营养不良蛋白聚糖和sarcospan与肌营养蛋白共定位于costamere。

其缺乏是肌营养不良的根本原因之一。正常组织包含少量的肌营养蛋白(总肌肉蛋白质的约0.002%)，但其缺乏引起DMD家族和纤维化，一种肌肉硬化状况。相同基因的不同突变引起缺陷肌营养蛋白，引起贝克尔肌营养不良(BMD)。因此，其对于调节需要这种治疗的患者的细胞、组织或器官中肌营养蛋白的表达和/或功能将具有重要治疗价值。

肌营养蛋白家族、最大的已知人基因，编码称为肌营养蛋白的蛋白质。存在许多不同形式的肌营养蛋白，其中一些对于某些细胞类型具有特异性。肌营养蛋白主要位于用于运动的肌肉(骨骼肌)和心脏肌肉(心肌)中。少量的蛋白质存在于脑中的神经细胞中。

在骨骼肌和心肌中，肌营养蛋白是加强肌肉纤维并保护它们免于在肌肉收缩和舒张时损伤的蛋白复合物的一部分。肌营养蛋白复合物充当锚，连接每一肌细胞的结构框架(细胞骨架)与细胞外蛋白质和其它分子的网络。肌营养蛋白复合物也可通过与递送和接收化学信号的蛋白质相互作用而在细胞信号转导中起作用。

有关神经细胞中肌营养蛋白的功能知之甚少，并且不希望束缚于理论，肌营养蛋白对于突触的正常结构和功能可以是重要的。

杜氏和贝克尔肌营养不良由DMD家族基因中的突变引起。

肌营养不良症(MD)指一组遗传性病症，其主要症状是肌肉萎缩。有两种主要形式的MD，它们的不同之处在于发生的严重性和年龄。在杜氏肌营养不良中，症状在幼童时期是显著的，并且很快变得虚弱。另一方面，贝克尔肌营养不良是迟发的并且不太严重。两种形式的MD都由肌营养蛋白基因中的突变引起，所述基因是大的(2.6Mb)基因，包括97个外显子。肌营养蛋白蛋白质作为肌纤维膜中大复合物的一部分起重要结构作用。当肌营养蛋白缺失或无功能时，整个复合物受损，引起肌肉组织变性。当再生肌肉的能力耗尽时，发生肌萎缩。

DMD家族基因中的突变也引起称为X-连锁扩张型心肌病的心脏病形式。该状况扩大并衰弱心肌，防止其有效泵血。尽管扩张型心肌病是杜氏和贝克尔肌营养不良的一个体征，该心脏状况的孤立的X-连锁形式不与骨骼肌的衰弱和萎缩相关。

Utrophin是由位于染色体6q24的多外显子1 Mb UTRN基因编码的395 kDa蛋白质(Pearce等人 (1993)Hum Mol Gene. 2: 1765 1772)。该基因的结构具有与肌营养蛋白基因的结构大的相似性。与肌营养蛋白相比，utrophin基因具有在两个外显子上分开的长5'未翻译区，并且其前面是HTF-岛。在小鼠中，该基因对映于染色体10。Utrophin分布于胎儿和再生肌肉的整个肌膜中，但在正常成人肌肉中下调并且限制于肌键和神经肌肉接头(Blake等人，1996)。在肌营养蛋白缺乏mdx小鼠中，与正常小鼠相比，肌肉中的utrophin水平在出生后不久保持升高，一旦utrophin水平已降低至成体水平(出生后约1周)，肌纤维坏死的第一体征得以检测。然而，有证据表明在小尺寸肌肉中，持续增加的utrophin水平可以与肌膜处的DGC复合物(或抗原相关复合物)相互作用，因此防止复合物丢失，结果是这些肌肉看起来正常。也存在大量证据证明，utrophin 能够局部化于正常小鼠的肌膜。在胎儿小鼠发育期间，utrophin表达增加，局部化于肌膜，在人中直至妊娠18周并且在小鼠中直至妊娠20天升高。此后utrophin肌浆染色稳定降低至在出生前不久显著较低的成体水平，其中utrophin几乎对NMJ唯一地局部化。Utrophin表达的降低与肌营养蛋白的增加表达一致。参见综述(Ibraghimov Beskrovnaya等人(1992)Nature355, 696 702, Blake等人(1994) Trends in Cell Biol, 4: 19 23, Tinsley等人(1993)Curr Opin Genet Dev. 3: 484 90)。

DRP2 预测与某些短C-末端同种型的肌营养蛋白和肌营养蛋白相关蛋白1 (DRP1或utrophin)类似。DRP2是相对小的蛋白质，在男性中由位于Xq22的45 kb基因编码。其主要在脑和脊髓中表达，并且在总体结构方面与Dp116肌营养蛋白同种型是类似的。

小肌营养蛋白是肌营养蛋白家族蛋白质的一个成员，最初从太平洋电鳐(Torpedo californica)产电器官鉴定为与突触后膜的胞质表面相关的87-kDa磷蛋白(Wagner K R.等人(1993)Neuron.10:511–522; Carr C.等人 (1989)J Cell Biol.109:1753–1764)。已假设，该87-kDa蛋白质在突触形成或稳定中起作用，因为它与乙酰胆碱受体从产电器官膜共纯化。在哺乳动物骨骼肌中，肌营养蛋白与几种整体和外周膜蛋白质相关地发现，形成称为肌营养蛋白糖蛋白复合物(DGC)的复合物 (Ervasti J M.等人(1991)Cell.66:1121–1131; Ibraghimov-Beskrovnaya O.等人(1992) Nature (London). ; Yoshida M.等人(1990)J Biochem (Tokyo).108:748–752)。

在优选实施方案中，反义寡核苷酸用于预防或治疗与DMD家族成员相关的疾病或病症。可以使用从利用反义化合物获得的干细胞再生的细胞/组织治疗的示例性肌营养蛋白家族介导的疾病和病症包括：肌肉疾病或病症(例如肌营养不良，包括杜氏肌营养不良、贝克尔肌营养不良、脊髓延髓性肌营养不良、抗肌萎缩蛋白病(dystrophinopathy)、肌聚糖病、肢带肌营养不良、先天性肌营养不良症、先天性肌病、远端肌病、女性携带者中杜氏和贝克尔肌营养不良症的症状形式肌强直综合征等；肌萎缩病)、神经疾病或病症(包括神经肌肉疾病或病症例如张力失常、肌阵挛-肌张力障碍综合征等)、与肌营养蛋白或肌营养蛋白DAPC-复合物的改变水平相关的疾病或病症、左室致密化不全(Left ventricular noncompaction)、癌症、心血管疾病或病症、心肌病(例如，散发性扩张型心肌病、X-连锁扩张型心肌病(XLDC)等)、动脉粥样硬化细胞骨架病症、先天性静止性夜盲和听觉缺失。

在一个优选实施方案中，寡核苷酸对于DMD家族的多核苷酸特异，其包括但不限于非编码区。DMD家族靶包括DMD家族的变体；DMD家族的突变体，包括SNPs；DMD家族的非编码序列；等位基因、片段等。优选地，寡核苷酸是反义RNA分子。

依照本发明的实施方案，靶核酸分子不限于单独的DMD家族多核苷酸，还延伸至DMD家族的同种型、受体、同系物、非编码区等中的任何。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向DMD家族靶的天然反义序列（对于编码和非编码区天然反义），包括但不限于关于其的变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义RNA或DNA分子。

在另一个优选实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括其中不同碱基存在于化合物中的一个或多个核苷酸位置上的变体。例如，如果第一个核苷酸是腺嘌呤，那么可以产生在这个位置上包含胸苷、鸟苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的变体。这可以在反义化合物的任何位置上完成。这些化合物随后使用本文描述的方法进行测试，以测定其抑制靶核酸表达的能力。

在一些实施方案中，在反义化合物和靶之间的同源性、序列同一性或互补性是约50％到约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约60％到约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约70％到约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约80％到约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。

当化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以引起活性丧失时，并且存在足够程度的互补性，以避免在其中需要特异性结合的条件下反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，反义化合物是可特异性杂交的。此类条件包括即在体内测定或治疗性处理情况下的生理条件，和其中在体外测定情况下执行测定的条件。

当化合物与靶DNA或RNA分子的结合干扰靶DNA或RNA的正常功能以引起效用丧失时，并且存在足够程度的互补性，以避免在其中需要特异性结合的条件下反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，即在体内测定或治疗性处理情况下在生理条件下，和在体外测定情况下在其中执行测定的条件下，反义化合物无论是DNA、RNA、嵌合、置换的等是可特异性杂交的。

在另一个优选实施方案中，DMD家族的靶向包括但不限于使用例如PCR、杂交等鉴定且扩增的反义序列，如SEQ ID NO：3 - 7所示序列的一个或多个等，调节DMD家族的表达或功能。在一个实施方案中，与对照比较，表达或功能是上调的。在另一个优选实施方案中，与对照比较，表达或功能是下调的。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NOS：8 - 22所示的核酸序列，包括使用例如PCR、杂交等鉴定且扩增的反义序列。这些寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核苷酸、较短或较长片段、修饰键等。修饰键或核苷酸间键合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一个优选实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。在本发明的修饰寡核苷酸中可以与糖或糖类似物部分附着的磷衍生物（或修饰磷酸基）可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸链烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，及其掺入核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸内本身也是已知的，并且无需在本文中描述。

反义的特异性和敏感性也由本领域技术人员用于治疗用途。反义寡核苷酸已在动物和人中的疾病状态治疗中用作治疗部分。反义寡核苷酸已安全有效地施用于人，并且众多临床试验目前在进行中。因此确定寡核苷酸可以是有用的治疗模式，其可以配置为在用于治疗细胞、组织和动物特别是人的治疗方案中有用。

在本发明的实施方案中，寡聚反义化合物特别是寡核苷酸与靶核酸分子结合，并且调节由靶基因编码的分子的表达和/或功能。待干扰的DNA功能包括例如复制和转录。待干扰的RNA功能包括所有重大功能例如RNA易位至蛋白质翻译位点、由RNA翻译蛋白质、RNA剪接以获得一种或多种mRNA种类、和可以与RNA衔接或由RNA促进的催化活性。依赖于所需功能，此类功能可以是上调或抑制的。

反义化合物包括反义寡聚化合物、反义寡核苷酸、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、可变剪接物、引物、探针和与靶核酸的至少部分杂交的其他寡聚化合物。像这样，这些化合物可以以单链、双链、部分单链或环状寡聚化合物的形式引入。

在本发明的背景中，使反义化合物靶向特定核酸分子可以是多步过程。该过程通常以其功能待调节的靶核酸的鉴定开始。这种靶核酸可以是例如细胞基因（或由基因转录的mRNA），其表达与特定病症或疾病状态相关，或来自感染剂的核酸分子。在本发明中，靶核酸编码肌营养蛋白家族。

靶向过程通常还包括测定在靶核酸内用于反义相互作用发生的至少一个靶区域、区段或位点，从而使得将产生所需效应，例如表达的调节。在本发明的背景内，术语“区域”被定义为具有至少一个可鉴定结构、功能或特征的靶核酸的部分。在靶核酸的区域内是区段。“区段”被定义为在靶核酸内的较小或亚部分区域。如在本发明中使用的，“位点”被定义为在靶核酸内的位置。

在一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与肌营养蛋白家族的天然反义序列结合，并且调节肌营养蛋白家族（SEQ ID NO：1和2）的表达和/或功能。反义序列的例子包括SEQ ID NOS：3-22。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与肌营养蛋白家族多核苷酸的一个或多个区段结合，并且调节肌营养蛋白家族的表达和/或功能。区段包括肌营养蛋白家族有义或反义多核苷酸的至少5个连续核苷酸。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸对于肌营养蛋白家族的天然反义序列具有特异性，其中寡核苷酸与肌营养蛋白家族的天然反义序列的结合调节肌营养蛋白家族的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO：8 - 22所示序列，使用例如PCR、杂交等鉴定且扩增的反义序列。这些寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核苷酸、较短或较长片段、修饰键等。修饰的键或核苷酸间键合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一个优选实施方案中，核苷酸包括磷衍生物。在本发明的修饰寡核苷酸中可以与糖或糖类似物部分附着的磷衍生物（或修饰的磷酸基）可以是单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磷酸烷基酯、磷酸链烷酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯类似物的制备，及其掺入核苷酸、修饰的核苷酸和寡核苷酸内本身也是已知的，并且无需在本文中描述。

因为如本领域已知的，翻译起始密码子一般是5'-AUG（在转录的mRNA分子中；在相应DNA分子中为5'-ATG），所以翻译起始密码子也被称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有含RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG的翻译起始密码子；并且5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG已显示在体内起作用。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可以包含许多密码子序列，即使每种情况下的起始子氨基酸一般是甲硫氨酸（在真核生物中）或甲酰甲硫氨酸（在原核生物中）。真核生物和原核生物基因可以具有2个或更多个可变起始密码子，其中任何一个都可以优先用于在特定细胞类型或组织中或在特定条件组下的翻译起始。在本发明的背景中，“起始密码子”和“翻译起始密码子”指这样的一个或多个密码子，其在体内用于起始由编码肌营养蛋白家族的基因转录的mRNA的翻译，与此类密码子的一种或多种序列无关。基因的翻译终止密码子（或“终止密码子”）可以具有三种序列即5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA（相应DNA序列分别是5'-TAA、5'-TAG和5'-TGA）之一。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”指此类mRNA或基因的部分，其包含从翻译起始密码子开始在任一方向中（即，5'或3'）的约25到约50个邻接核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”指此类mRNA或基因的部分，其包含从翻译终止密码子开始在任一方向中（即，5'或3'）的约25到约50个邻接核苷酸。因此，“起始密码子区”（或“翻译起始密码子区”）和“终止密码子区”（或“翻译终止密码子区”）是可以用本发明的反义化合物有效靶向的所有区域。

本领域已知的、指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域的可读框（ORF）或“编码区”也是可以有效靶向的区域。在本发明的背景内，靶向区域是包含基因可读框（ORF）的翻译起始或终止密码子的基因内区域。

另一种靶区域包括本领域已知的5'非翻译区（5'UTR），指从翻译起始密码子开始在5'方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的5'加帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸（或基因上的相应核苷酸）。另外一种靶区域包括本领域已知的3'非翻译区（3'UTR），指从翻译终止密码子开始在3'方向中的mRNA部分，并且因此包括在mRNA的翻译终止密码子和3'末端之间的核苷酸（或基因上的相应核苷酸）。mRNA的5'加帽位点包括经由5'-5'三磷酸键与mRNA的5'最末端残基邻接的N7-甲基化鸟苷残基。mRNA的5'加帽区被视为包括5'加帽结构其自身以及与加帽位点相邻的前50个核苷酸。关于本发明的另一种靶区域是5'加帽区。

尽管一些真核生物mRNA转录物是直接翻译的，但许多包含称为“内含子”的一个或多个区域，这在其翻译前从转录物中切除。其余（和因此翻译的）区域称为“外显子”，并且一起剪接以形成连续mRNA序列。在一个实施方案中，靶向剪接位点即内含子-外显子连接或外显子-内含子连接在下述情况下是特别有用的，当异常剪接牵涉疾病时，或当特定剪接产物的生产过剩牵涉疾病时。由于重排或缺失的异常融合连接是靶位点的另一个实施方案。经由来自不同基因来源的2种（或更多种）mRNAs的剪接过程产生的mRNA转录物称为“融合转录物”。内含子可以使用靶向例如DNA或mRNA前体的反义化合物有效靶向。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与靶多核苷酸的编码和/或非编码区结合，并且调节靶分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与天然反义多核苷酸结合，并且调节靶分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸与有义多核苷酸结合，并且调节靶分子的表达和/或功能。

可变RNA转录物可以由DNA的相同基因组区域产生。这些可变转录物一般称为“变体”。更具体而言，“mRNA前体变体”是由相同基因组DNA产生的转录物，其在其起始或终止位置中不同于由相同基因组DNA产生的其他转录物，并且包含内含子和外显子序列。

在剪接过程中一个或多个外显子或内含子区域或其部分切除后，mRNA前体变体产生更小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体是经加工的mRNA前体变体，并且由于剪接，每种独特mRNA前体变体必须一直产生独特mRNA变体。这些mRNA变体也称为“可变剪接变体”。如果不发生mRNA前体变体的剪接，那么mRNA前体变体等同于mRNA变体。

变体可以通过使用可变信号产生以起始或终止转录。mRNAs前体和mRNAs可以具有多于一个起始密码子或终止密码子。源于使用可变起始密码子的mRNA前体或mRNA的变体称为那种mRNA前体或mRNA的“可变起始变体”。使用可变终止密码子的这些转录物称为那种mRNA前体或mRNA的“可变终止变体”。一个具体类型的可变终止变体是“多聚腺苷酸变体”，其中所产生的多个转录物起因于通过转录机制的“多聚腺苷酸终止信号”之一的可变选择，从而产生在独特多聚腺苷酸位点上终止的转录物。在本发明的背景内，本文描述的变体类型也是靶核酸的实施方案。

反义化合物与之杂交的靶核酸上的定位被定义为活性反义化合物靶向其的靶区域的至少5-核苷酸长部分。

尽管在本文中阐述了特定示例性靶区段的具体序列，但本领域技术人员将认识到这些用来举例说明且描述在本发明范围内的特定实施方案。另外靶区段可由本领域普通技术人员考虑到本公开内容容易地鉴定。

包括选自举例说明性优选的靶区段内的至少五（5）个连续核苷酸段的长度5-100个核苷酸的靶区段被视为也适合于靶向。

靶区段可以包括DNA或RNA序列，其包括从举例说明性优选的靶区段之一的5'末端开始的至少5个连续核苷酸（其余核苷酸是紧在靶区段的5'末端上游开始且继续直至DNA或RNA包含约5到约100个核苷酸的相同DNA或RNA连续段）。类似优选的靶区段由DNA或RNA序列表示，其包括从举例说明性优选的靶区段之一的3'末端开始的至少5个连续核苷酸（其余核苷酸是紧在靶区段的3'末端下游开始且继续直至DNA或RNA包含约5到约100个核苷酸的相同DNA或RNA连续段）。无需过度实验，用本文举例说明的靶区段准备的本领域技术人员将能够鉴定进一步优选的靶区段。

一旦已鉴定一个或多个靶区域、区段或位点，就选择与靶充分互补的反义化合物，即充分良好且具有足够特异性杂交，以给出所需效应。

在本发明的一个实施方案中，寡核苷酸与特定靶的反义链结合。寡核苷酸长度是至少5个核苷酸，并且可以如此合成每个寡核苷酸靶重叠序列，从而使得合成覆盖靶多核苷酸的完整长度的寡核苷酸。靶还包括编码以及非编码区。

在一个实施方案中，优选通过反义寡核苷酸靶向特异性核酸。使反义化合物靶向特定核酸是多步过程。该过程通常以其功能待调节的核酸序列的鉴定开始。这可以是例如表达与特定病症或疾病状态相关的细胞基因（或由基因转录的mRNA），或非编码多核苷酸例如非编码RNA（ncRNA）。

RNAs可以分类成（1）翻译成蛋白质的信使RNAs（mRNAs），和（2）非蛋白质编码RNAs（ncRNAs）。ncRNAs包括微小RNAs、反义转录物和包含高密度终止密码子且缺乏任何广泛“可读框”的其他转录单位（TU）。许多ncRNAs看起来从蛋白质编码基因座的3'非翻译区（3'UTRs）中的起始位点开始。ncRNAs通常是罕见的，并且已通过FANTOM协会测序的至少一半ncRNAs看起来不是多聚腺苷酸化的。由于显而易见的原因，大多数研究者集中于被加工且输出到细胞质的多聚腺苷酸化mRNAs。近来，已显示非多聚腺苷酸化的核RNAs组可以是极大的，并且许多此类转录物起于所谓的基因间区域（Cheng，J. 等人（2005）Science308（5725），1149-1154；Kapranov，P. 等人（2005）。Genome Res15 (7), 987-997)。ncRNAs通过其调节基因表达的机制是通过与靶转录物的碱基配对。通过碱基配对起作用的RNAs可以分组成（1）顺式编码RNAs，其在相同基因定位上编码，但在针对RNAs的相反链上，它们作用于且因此展示出与其靶的完美互补性，和（2）反式编码的RNAs，其在与它们作用于其的RNAs不同的染色体定位上编码，并且一般不显示出与其靶的完美碱基配对潜力。

不希望受理论束缚，通过本文描述的反义寡核苷酸干扰反义多核苷酸，可以改变相应有义信使RNAs的表达。然而，这种调节可以是不协调（反义击倒导致信使RNA升高）或协调的（反义击倒导致信使RNA减少）。在这些情况下，反义寡核苷酸可以靶向反义转录物的重叠或非重叠部分，导致其击倒或隔离（sequestration）。编码以及非编码反义可以以等同方式靶向，并且任一范畴都能够调节相应有义转录物 – 以协调或不协调方式。在鉴定用于针对靶使用的新寡核苷酸中采用的策略可以基于反义RNA转录物的击倒，其通过反义寡核苷酸或调节所需靶的任何其他方式。

策略 1：在不协同调节的情况下，击倒反义转录物升高常规（有义）基因的表达。后面一种基因应编码已知或假定药物靶，然后其反义配对物的击倒可以想得到地模拟受体激动剂或酶刺激物的作用。

策略 2：在协同调节的情况下，可以伴随地击倒反义和有义转录物且从而达到常规（有义）基因表达的协同降低。如果例如反义寡核苷酸用于达到击倒，那么这种策略可以用于应用靶向针对有义转录物的一种反义寡核苷酸，和对于相应反义转录物的另一种反义寡核苷酸，或同时靶向重叠有义和反义转录物的单个有力地对称的反义寡核苷酸。

根据本发明，反义化合物包括反义寡核苷酸、核酶、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、siRNA化合物、单或双链RNA干扰（RNAi）化合物例如siRNA化合物、和与靶核酸的至少部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。像这样，它们可以是DNA、RNA、DNA样、RNA样或其混合物，或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并且可以包含结构元件例如内部或末端凸起、错配或环。反义化合物可以照常规线性制备，但可以连接或以其他方式制备，以是环状和/或分支的。反义化合物可以包括构建体例如杂交的2条链，以形成完全或部分双链的化合物，或具有足够自我互补性的单链，以允许杂交和形成全部或部分双链的化合物。2条链可以内部连接，留下游离3'或5'末端，或可以连接以形成连续发夹结构或环。发夹结构可以包含在5'或3'末端上的突出端，产生单链特征的延长部分。双链化合物任选可以包括在末端上的突出端。进一步的修饰可以包括与末端之一、选择的核苷酸位置、糖位置或核苷间键合之一附着的缀合物基团。可替代地，2条链可以经由非核酸部分或接头基团连接。当由仅1条链形成时，dsRNA可以采取自身互补的发夹型分子形式，其在其自身上折回以形成双链体。因此，dsRNAs可以是全部或部分双链的。基因表达的特异性调节可以通过dsRNA发夹在转基因细胞系中的稳定表达来达到，然而，在一些实施方案中，基因表达或功能是上调的。当由2条链或单链形成时，所述单链采取在其自身上折回以形成双链体的自身互补的发夹型分子形式，2条链（或单链的双链体形成区域）是以沃森-克里克形式碱基配对的互补RNA链。

一旦引入系统中，本发明的化合物就可以引发一种或多种酶或结构蛋白质的作用，以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可以经由基于占据机制工作。一般而言，核酸（包括寡核苷酸）可以描述为“DNA样的”（即，一般具有一个或多个2'-脱氧糖，并且一般是T而不是U碱基）或“RNA样的”（即，一般具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰的糖，并且一般是U而不是T碱基）。核酸螺旋可以采用超过一种类型的结构，最通常A和B形。一般而言，认为具有B形样结构的寡核苷酸是“DNA样的”，并且具有A形样结构的寡核苷酸是“RNA样的”。在一些（嵌合）实施方案中，反义化合物可以包含A和B形区域。

在另一个优选实施方案中，所需寡核苷酸或反义化合物包括下述至少一种：反义RNA、反义DNA、嵌合反义寡核苷酸、包括修饰的键合的反义寡核苷酸、干扰RNA（RNAi）、短干扰RNA（siRNA）；微小、干扰RNA（miRNA）；小、瞬时RNA（stRNA）；或短、发夹RNA（shRNA）；小RNA诱导的基因激活（RNAa）；小激活RNAs（saRNAs）或其组合。

dsRNA还可以激活基因表达，这是已命名为“小RNA诱导的基因激活”或RNAa的机制。靶向基因启动子的dsRNAs诱导相关基因的有效转录激活。RNAa使用合成dsRNAs在人细胞中进行证实，命名为“小激活RNAs”（saRNAs）。目前未知RNAa在其他生物中是否是保守的。

小双链RNA（dsRNA）例如小干扰RNA（siRNA）或微小RNA（miRNA）已发现是称为RNA干扰（RNAi）的进化保守机制的触发物。RNAi总是导致经由重塑染色质的基因沉默，以从而阻遏转录、降解互补mRNA、或阻断蛋白质翻译。然而，在下文实施例节段中详细描述的情况下，寡核苷酸显示增加肌营养蛋白家族多核苷酸及其编码产物的表达和/或功能。dsRNAs还可以充当小激活RNAs（saRNA）。不希望受理论束缚，通过靶向基因启动子中的序列，saRNAs将在被称为dsRNA诱导转录激活（RNAa）的现象中诱导靶基因表达。

在一个进一步的实施方案中，本文鉴定的“优选靶区段”可以用于筛选调节肌营养蛋白家族多核苷酸表达的另外化合物。“调节剂”是这样的化合物，其减少或增加编码肌营养蛋白家族的核酸分子表达，并且包括与优选靶区段互补的至少5-核苷酸部分。筛选方法包括步骤：使编码有义或天然反义肌营养蛋白家族多核苷酸的核酸分子的优选靶区段与一种或多种候选调节剂接触，且选择减少或增加编码肌营养蛋白家族多核苷酸的核酸分子表达的一种或多种候选调节剂，所述核酸分子例如SEQ ID NOS：8-22。一旦显示一种或多种候选调节剂能够调节（例如减少或增加）编码肌营养蛋白家族多核苷酸的核酸分子表达，调节剂随后就可以用于肌营养蛋白家族多核苷酸功能的进一步调查研究，或用于用作依照本发明的研究、诊断或治疗剂。

靶向天然反义序列优选调节靶基因的功能。例如，DMD家族基因（例如，登记号NM_004006和NM_007124，图2）。在一个优选实施方案中，靶是DMD家族基因的反义多核苷酸。在一个优选实施方案中，反义寡核苷酸靶向肌营养蛋白家族多核苷酸（例如，登记号NM_004006和NM_007124，图2）的有义和/或天然反义序列，关于其的变体、等位基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义分子，并且靶包括反义和/或有义DMD家族多核苷酸的编码和非编码区。

本发明的优选靶区段还可以与其分别的本发明的互补反义化合物组合，以形成稳定双链（双链体）寡核苷酸。

此类双链寡核苷酸部分在本领域中已显示调节靶表达，且经由反义机制调节翻译以及RNA加工。此外，可以对双链部分实施化学修饰（Fire等人，（1998）Nature，391，806-811；Timmons和Fire，（1998）Nature，395，854；Timmons等人，（2001）Gene，263，103-112；Tabara等人，（1998）Science，282，430-431；Montgomery等人（1998），Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95，15502-15507；Tuschl等人，（1999）Genes Dev.，13，3191-3197；Elbashir等人，（2001）Nature，411，494-498；Elbashir等人，（2001）Genes Dev.，15，188-200）。例如，此类双链部分已显示通过双链体的反义链与靶的典型杂交抑制靶，从而触发靶的酶促降解（Tijsterman等人，（2002）Science，295，694-697）。

在一个优选实施方案中，反义寡核苷酸靶向肌营养蛋白家族多核苷酸（例如，登记号NM_004006和NM_007124）、关于其的变体、等位基因、同种型、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。优选地，寡核苷酸是反义分子。

依照本发明的实施方案，靶核酸分子不限于单独的肌营养蛋白家族，还延伸至肌营养蛋白家族分子的同种型、受体、同系物等中的任何。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向DMD家族多核苷酸的天然反义序列，例如如SEQ ID NO：3-7所示的多核苷酸，以及关于其的任何变体、等位基因、同系物、突变体、衍生物、片段和互补序列。反义寡核苷酸的例子如SEQ ID NOS：8 - 22所示。

在一个实施方案中，寡核苷酸与肌营养蛋白家族反义的核酸序列互补或结合，包括但不限于与肌营养蛋白家族多核苷酸相关的非编码有义和/或反义序列，且调节肌营养蛋白家族分子的表达和/或功能。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸与如SEQ ID NO：3-7所示的DMD家族天然反义的核酸序列互补或结合，且调节DMD家族分子的表达和/或功能。

在一个优选实施方案中，寡核苷酸包括SEQ ID NOS：8 - 22的至少5个连续核苷酸的序列，且调节肌营养蛋白家族分子的表达和/或功能。

多核苷酸靶包括DMD家族，包括其家族成员、DMD家族的变体；DMD家族的突变体，包括SNPs；DMD家族的非编码序列；DMD家族的等位基因；物种变体、片段等。优选地，寡核苷酸是反义分子。

在另一个优选实施方案中，靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的寡核苷酸包括：反义RNA、干扰RNA（RNAi）、短干扰RNA（siRNA）；微小干扰RNA（miRNA）；小、瞬时RNA（stRNA）；或短、发夹RNA（shRNA）；小RNA诱导的基因激活（RNAa）；或小激活RNA（saRNA）。

在另一个优选实施方案中，肌营养蛋白家族多核苷酸例如SEQ ID NO：3 - 7的靶向调节这些靶的表达或功能。在一个实施方案中，与对照比较，表达或功能是上调的。在另一个优选实施方案中，与对照比较，表达或功能是下调的。

在另一个优选实施方案中，反义化合物包括如SEQ ID NOS：8 - 22所示序列。这些寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核苷酸、较短或较长片段、修饰的键等。

在另一个优选实施方案中，SEQ ID NOS：8 - 22包括一个或多个LNA核苷酸。

所需靶核酸的调节可以以本领域已知的数种方式执行。例如，反义寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子（例如，核酶）是能够催化各种反应中的一种或多种的核酸分子，包括以核苷酸碱基序列特异性方式重复切割其他分开核酸分子的能力。此类酶促核酸分子可以例如用于靶向事实上任何RNA转录物（Zaug等人，324，Nature429 1986；Cech，260JAMA3030，1988；和Jefferies等人，17Nucleic Acids Research1371，1989）。

因为其序列特异性，所以反式切割的酶促核酸分子显示作为用于人疾病的治疗剂的希望（Usman和McSwiggen，1995Ann. Rep. Med. Chem. 30，285-294；Christoffersen和Marr，1995J. Med. Chem. 38，2023-2037）。酶促核酸分子可以设计为切割在细胞RNA背景内的特异性RNA靶。此类切割事件致使mRNA无功能且取消来自那种RNA的蛋白质表达。以这种方式，可以选择性抑制与疾病状态相关的蛋白质合成。

一般而言，具有RNA切割活性的酶促核酸通过首先与靶RNA结合起作用。此类结合通过酶促核酸的靶结合部分发生，所述酶促核酸与分子的酶促部分保持紧密接近，所述分子作用于切割靶RNA。因此，酶促核酸首先识别且随后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦与正确位点结合，就酶促作用以切割靶RNA。此类靶RNA的策略性切割将破坏其指导编码蛋白质合成的能力。在酶促核酸已结合且切割其RNA靶后，它从那种RNA中释放以搜索另一个靶，并且可以重复结合且切割新靶。

几种方法例如体外选择（进化）策略（Orgel，1979，Proc. R. Soc. London，B 205，435）已用于进化能够催化各种反应的新核酸催化剂，例如磷酸二酯键和酰胺键的切割和连接（Joyce，1989，Gene，82，83-87；Beaudry等人，1992，Science257，635-641；Joyce，1992，Scientific American 267，90-97；Breaker等人，1994，TIBTECH12，268；Bartel等人，1993，Science261:1411-1418；Szostak，1993，TIBS17，89-93；Kumar等人，1995，FASEB J.，9，1183；Breaker，1996，Curr. Op. Biotech.，7，442）。

对于催化活性最佳的核酶的开发将显著促成采用RNA切割核酶用于调节基因表达目的的任何策略。锤头核酶例如在饱和（10 mM）浓度的Mg²⁺辅因子的存在下以约1分钟^-1的催化速率（k_cat）起作用。人工“RNA连接酶”核酶已显示以约100分钟^-1的速率催化相应自我修饰反应。此外，已知具有由DNA制成的底物结合臂的特定修饰的锤头核酶催化RNA切割，具有达到100分钟^-1的多重周转率。最后，用特定核苷酸类似物替换在锤头的催化核心内的特定残基给出在催化速率中显示多达10倍改善的修饰核酶。这些发现证实核酶可以促进化学转化，其催化速率明显大于由大多数天然自我切割性核酶在体外展示出的那些。随后可能可以最佳化特定自我切割性核酶的结构，以给出最大限度催化活性，或可以制备完全新的RNA基序，其展示出对于RNA磷酸二酯切割明显更快的速率。

RNA底物通过拟合“锤头”模型的RNA催化剂的分子间切割首先在1987年显示（Uhlenbeck，O. C.（1987）Nature，328：596-600）。RNA催化剂恢复且与多种RNA分子反应，证实它是真正催化性的。

基于“锤头”基序设计的催化RNAs已用于切割特异性靶序列，这通过在催化RNA中进行合适的碱基改变，以维持与靶序列的必需碱基配对（Haseloff和Gerlach，（1988）Nature，334，585；Walbot和Bruening，（1988）Nature，334，196；Uhlenbeck，O. C.（1987）Nature，328：596-600；Koizumi，M.等人（1988）FEBS Lett.，228：228-230）。这已允许使用催化RNA以切割特异性靶序列，且指出根据“锤头”模型设计的催化RNA可以在体内可能地切割特异性底物RNAs。（参见Haseloff和Gerlach，（1988）Nature，334，585；Walbot和Bruening，（1988）Nature，334，196；Uhlenbeck，O. C.（1987）Nature，328：596-600）。

RNA干扰（RNAi）已成为用于调节哺乳动物和哺乳动物细胞中的基因表达的有力工具。这种方法要求作为RNA其自身或作为DNA的小干扰RNA（siRNA）递送，其使用表达质粒或病毒和用于加工为siRNAs的小发夹RNAs的编码序列。这个系统使得siRNAs前体能够有效转运至它们在其中活跃的细胞质，且允许使用调节和组织特异性启动子用于基因表达。

在一个优选实施方案中，寡核苷酸或反义化合物包括核糖核酸（RNA）和/或脱氧核糖核酸（DNA），或其模拟物、嵌合体、类似物或同系物的寡聚物或聚合物。这个术语包括由天然存在的核苷酸、糖和共价核苷间（主链）键合组成的寡核苷酸，以及类似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。通常需要此类修饰的或取代的寡核苷酸超过天然形式，由于所需性质例如细胞摄取增强、对于靶核酸的亲和力增强和在核酸酶的存在下的稳定性增加。

根据本发明，寡核苷酸或“反义化合物”包括反义寡核苷酸（例如，RNA、DNA、其模拟物、嵌合体、类似物或同系物）、核酶、外部指导序列（EGS）寡核苷酸、siRNA化合物、单或双链RNA干扰（RNAi）化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA、和与靶核酸的至少部分杂交且调节其功能的其他寡聚化合物。像这样，它们可以是DNA、RNA、DNA样、RNA样或其混合物，或可以是这些中的一种或多种的模拟物。这些化合物可以是单链、双链、环状或发夹寡聚化合物，并且可以包含结构元件例如内部或末端凸起、错配或环。反义化合物照常规线性制备，但可以连接或以其他方式制备，以是环状和/或分支的。反义化合物可以包括构建体例如杂交的2条链，以形成完全或部分双链的化合物，或具有足够自我互补性的单链，以允许杂交和形成全部或部分双链的化合物。2条链可以内部连接，留下游离3'或5'末端，或可以连接以形成连续发夹结构或环。发夹结构可以包含在5'或3'末端上的突出端，产生单链特征的延长部分。双链化合物任选可以包括在末端上的突出端。进一步的修饰可以包括与末端之一、选择的核苷酸位置、糖位置或核苷间键合之一附着的缀合物基团。可替代地，2条链可以经由非核酸部分或接头基团连接。当由仅1条链形成时，dsRNA可以采取自身互补的发夹型分子形式，其在其自身上折回以形成双链体。因此，dsRNAs可以是全部或部分双链的。基因表达的特异性调节可以通过dsRNA发夹在转基因细胞系中的稳定表达来达到（Hammond等人，（1991）Nat. Rev. Genet.，2，110-119；Matzke等人，（2001）Curr. Opin. Genet. Dev.，11，221-227；Sharp，（2001）Genes Dev.，15，485-490）。当由2条链或单链形成时，所述单链采取在其自身上折回以形成双链体的自身互补的发夹型分子形式，2条链（或单链的双链体形成区域）是以沃森-克里克形式碱基配对的互补RNA链。

一旦引入系统中，本发明的化合物就可以引发一种或多种酶或结构蛋白质的作用，以实现靶核酸的切割或其他修饰，或可以经由基于占据机制工作。一般而言，核酸（包括寡核苷酸）可以描述为“DNA样的”（即，一般具有一个或多个2'-脱氧糖，并且一般是T而不是U碱基）或“RNA样的”（即，一般具有一个或多个2'-羟基或2'-修饰的糖，并且一般是U而不是T碱基）。核酸螺旋可以采用超过一种类型的结构，最通常A和B形。一般而言，认为具有B形样结构的寡核苷酸是“DNA样的”，并且具有A形样结构的寡核苷酸是“RNA样的”。在一些（嵌合）实施方案中，反义化合物可以包含A和B形区域。

依照本发明的反义化合物可以包括长度约5 – 约80个核苷酸（即约5 – 约80个连接核苷）的反义部分。这是指反义化合物的反义链或部分的长度。换言之，本发明的单链反义化合物包括5 – 约80个核苷酸，并且本发明的双链反义化合物（例如dsRNA）包括长度5 – 约80个核苷酸的有义和反义链或部分。本领域普通技术人员应当理解这包含长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个核苷酸，或其内的任何范围的反义部分。

在一个实施方案中，本发明的反义化合物具有长度10 – 50个核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员应当理解这体现了具有长度10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸，或其内的任何范围的反义部分的寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸长度是15个核苷酸。

在一个实施方案中，本发明的反义或寡核苷酸化合物具有长度12或13 – 30个核苷酸的反义部分。本领域普通技术人员应当理解这体现了具有长度12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，或其内的任何范围的反义部分的反义化合物。

在另一个优选实施方案中，本发明的寡聚化合物还包括其中不同碱基存在于化合物中的一个或多个核苷酸位置上的变体。例如，如果第一个核苷酸是腺苷，那么可以产生在这个位置上包含胸苷、鸟苷或胞苷的变体。这可以在反义或dsRNA化合物的任何位置上完成。这些化合物随后使用本文描述的方法进行测试，以测定其抑制靶核酸表达的能力。

在一些实施方案中，在反义化合物和靶之间的同源性、序列同一性或互补性是约40％到约60％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约60％到约70％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约70％到约80％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约80％到约90％。在一些实施方案中，同源性、序列同一性或互补性是约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％。

在另一个优选实施方案中，反义寡核苷酸例如SEQ ID NOS: 3 - 22中所示的核酸分子包括一种或多种置换或修饰。在一个实施方案中，核苷酸由锁核酸（LNA）置换。

在另一个优选实施方案中，寡核苷酸靶向与DMD家族和如SEQ ID NOS：1、2和3-7所示序列相关的编码和/或非编码序列的核酸分子有义和/或反义的一个或多个区域。寡核苷酸还靶向SEQ ID NOS：1、2和3-7的重叠区域。

本发明的特定优选寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本发明背景中的“嵌合寡核苷酸”或“嵌合体”是包含2个或更多个化学上不同区域的寡核苷酸，各自由至少一个核苷酸构成。这些寡核苷酸一般包含赋予一种或多种有利性质（例如，核酸酶抗性增加、进入细胞内的摄取增加、对于靶的结合亲和力增加）的修饰的核苷酸的至少一个区域，和其为关于能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交物的酶的底物的区域。例如，RNA酶H是细胞核酸内切酶，其切割RNA:DNA双链体的RNA链。RNA酶H的激活因此导致RNA靶的切割，从而极大增强基因表达的反义调节效率。因此，当使用嵌合寡核苷酸时，与和相同靶区域杂交的硫代磷酸酯脱氧寡核苷酸比较，用较短寡核苷酸通常可以获得与之相当的结果。RNA靶的切割可以照常规通过凝胶电泳和需要时本领域已知的相关核酸杂交技术进行检测。在一个优选实施方案中，嵌合寡核苷酸包括修饰为增加靶结合亲和力的至少一个区域，和通常充当关于RNA酶H的底物的区域。寡核苷酸对于其靶（在这种情况下，编码ras的核酸）的亲和力通过测量寡核苷酸/靶对的T_m照常规进行测定，T_m是在其下寡核苷酸和靶解离的温度；分光光度法测量地检测解离。T_m越高，寡核苷酸对于靶的亲和力越大。

本发明的嵌合反义化合物可以作为如上所述的2种或更多种寡核苷酸、修饰寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模拟物的复合结构形成。此类化合物在本领域中已被称为杂交物或gapmer。教导此类杂交物结构制备的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356和5,700,922；其各自引入本文作为参考。

在另一个优选实施方案中，修饰的寡核苷酸区域包括在糖的2'位置上修饰的至少一个核苷酸，最优选2'-O-烷基、2'-O-烷基-O-烷基或2'-氟-修饰的核苷酸。在其他优选实施方案中，RNA修饰包括在RNA的3'末端上在嘧啶、脱碱基残基或倒转碱基的核糖上的2'-氟、2'-氨基和2' O-甲基修饰。此类修饰照常规掺入寡核苷酸内，并且这些寡核苷酸已显示具有高于2'-脱氧寡核苷酸针对给定靶的T_m（即，更高的靶结合亲和力）。此类增加的亲和力的效应是为了极大增强基因表达的RNAi寡核苷酸抑制。RNA酶H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶；这种酶的激活因此导致RNA靶的切割，并且因此可以极大增强RNAi抑制的效率。RNA靶的切割可以照常规通过凝胶电泳加以证实。在另一个优选实施方案中，嵌合寡核苷酸也进行修饰，以增强核酸酶抗性。细胞包含可以降解核酸的各种核酸外切和内切酶。许多核苷酸和核苷修饰已显示使得它们引入其中的寡核苷酸比天然寡聚脱氧核苷酸对核酸酶降解更有抵抗力。核酸酶抗性照常规进行测量：通过使寡核苷酸与细胞提取物或分离核酸酶溶液一起孵育，且通常通过凝胶电泳测量随着时间过去剩下的完整寡核苷酸程度。已进行修饰以增强其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修饰寡核苷酸保持完整更长时间。各种寡核苷酸修饰已证实增强或赋予核酸酶抗性。包含至少一种硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸目前是更优选的。在某些情况下，增强靶结合亲和力的寡核苷酸修饰也独立地能够增强核酸酶抗性。一些希望修饰可以在De Mesmaeker 等人（1995）Acc. Chem. Res.，28:366-374中找到。

设想用于本发明的一些优选寡核苷酸的具体例子包括包含修饰主链的那些，例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键合或短链杂原子或杂环糖间键合。最优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，特别是CH₂--NH--O--CH₂、CH,--N（CH₃）--O--CH₂[称为亚甲基（甲基亚氨基）或MMI 主链]、CH₂--O--N（CH₃）--CH₂、CH₂--N（CH₃）--N（CH₃）--CH₂和O--N（CH₃）--CH₂--CH₂主链，其中天然磷酸二酯主链表示为O--P--O--CH,）。由De Mesmaeker 等人（1995）Acc. Chem. Res.，28:366-374公开的酰胺主链也是优选的。还优选的是具有吗啉代主链结构的寡核苷酸（Summerton和Weller，美国专利号5,034,506）。在其他优选实施方案中，例如肽核酸（PNA）主链，寡核苷酸的磷酸二酯主链由聚酰胺主链替换，核苷酸与聚酰胺主链的氮杂氮原子直接或间接结合（Nielsen 等人（1991）Science，254，1497）。寡核苷酸还可以包括一个或多个取代糖部分。优选寡核苷酸在2'位置上包括下述之一：OH、SH、SCH₃、F、OCN、OCH₃OCH₃、OCH₃O（CH₂）_nCH₃、O（CH₂）_nNH₂或O（CH₂）_nCH₃，其中n是1 – 约10；C₁- C₁₀低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF₃；OCF₃；O--、S--或N-烷基；O--、S--或N-烯基；SOCH₃；SO₂CH₃；ONO₂；NO₂；N₃；NH₂；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报道基团；插入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效性质的基团和具有相似性质的其他取代物。优选修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-（2-甲氧基乙基）]（Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486）。其他优选修饰包括2'-甲氧基（2'-O--CH₃）、2'-丙氧基（2'-OCH₂CH₂CH₃）和2'-氟（2'-F）。相似修饰还可以在寡核苷酸上的其他位置上进行，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可以具有糖模拟物例如环丁基代替戊呋喃糖基。

寡核苷酸还可以另外或可替代地包括核碱基（在本领域中通常被简称为“碱基”）修饰或取代。如本文使用的，“未修饰”或“天然”核苷酸包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。修饰核苷酸包括仅在天然核酸中罕见地或暂时地发现的核苷酸，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶特别是5-甲基胞嘧啶（也被称为5-甲基-2'脱氧胞嘧啶，且在本领域中通常被称为5-Me-C）、5-羟甲基胞嘧啶（HMC）、糖基HMC和龙胆二糖基HMC，以及合成核苷酸，例如2-氨基腺嘌呤、2-（甲基氨基）腺嘌呤、2-（咪唑基烷基）腺嘌呤、2-（氨基烷基氨基）腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6（6-氨基己基）腺嘌呤、和2,6-二氨基嘌呤。（Kornberg，A.，DNA Replication，W. H. Freeman & Co.，San Francisco，1980，第75-77页；Gebeyehu，G.，等人（1987）Nucl. Acids Res.，15:4513）。可以包括本领域已知的“通用”碱基例如肌苷。5-Me-C置换已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。（Sanghvi，Y. S.，Crooke，S. T.和Lebleu，B.，编辑，Antisense Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页），并且是目前优选的碱基置换。

本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，所述部分或缀合物增强寡核苷酸的活性或细胞摄取。此类部分包括但不限于脂质部分，例如胆固醇部分、胆固醇基部分（Letsinger等人，（1989）Proc. Natl. Acad. Sci.USA，86，6553）、胆酸（Manoharan 等人（1994）Bioorg. Med. Chem. Let.，4，1053）、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇（Manoharan 等人（1992）Ann. N.Y. Acad. Sci.，660，306；Manoharan 等人（1993）Bioorg. Med. Chem. Let.，3，2765）、巯基胆固醇（Oberhauser等人，（1992）Nucl. Acids Res.，20，533）、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基（Saison-Behmoaras 等人（1991）EMBO J. 1991，10，111；Kabanov 等人（1990）FEBS Lett.，259，327；Svinarchuk 等人（1993）Biochimie，75，49）、磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵（Manoharan 等人（1995）Tetrahedron Lett.，36，3651；Shea 等人（1990）Nucl. Acids Res.，18，3777）、聚胺或聚乙二醇链（Manoharan 等人（1995）Nucleosides & Nucleotides，14，969）、或金刚烷乙酸（Manoharan 等人（1995）Tetrahedron Lett.，36，3651）。包括亲脂部分的寡核苷酸和用于制备此类寡核苷酸的方法是本领域已知的，例如美国专利号5,138,045、5,218,105和5,459,255。

给定寡核苷酸中的所有位置不一定一致地修饰，并且事实上超过一个上述修饰可以掺入单个寡核苷酸中，并且甚至在寡核苷酸内的单个核苷上。本发明还包括了其为如上文定义的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明的核酸分子与另一种部分缀合，所述另一种部分包括但不限于脱碱基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂质或聚烃化合物。本领域技术人员将认识到这些分子可以在糖、碱基或磷酸基上的几个位置上与构成核酸分子的任何核苷酸中的一个或多个连接。

依照本发明使用的寡核苷酸可以方便地且照常规通过众所周知的固相合成技术进行制备。用于此类合成的设备由几个厂商包括Applied Biosystems销售。还可以采用用于此类合成的任何其他方法；寡核苷酸的实际合成完全在本领域普通技术人员的才能内。还众所周知的是使用相似技术以制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。还众所周知的是使用相似技术和商购可得的修饰的亚酰胺（amidites）和可控孔度玻璃（CPG）产物，例如生物素、荧光素、吖啶或补骨脂素修饰的亚酰胺（amidites）和/或CPG（可从Glen Research，Sterling VA获得），以合成荧光标记的、生物素化的或其他修饰的寡核苷酸，例如胆固醇修饰的寡核苷酸。

依照本发明，使用修饰例如使用LNA单体以增强寡核苷酸的效力、特异性和作用持续时间且拓宽施用途径，包括目前化学，例如MOE、ANA、FANA、PS等（Uhlman等人，（2000）Current Opinions in Drug Discovery & Development，第3卷No 2）。这可以通过经由LNA单体置换目前寡核苷酸中的一些单体来达到。LNA修饰的寡核苷酸可以具有类似于母体化合物的大小或可以更大或优选更小。优选此类LNA修饰的寡核苷酸包含小于约70％、更优选小于约60％、最优选小于约50％的LNA单体，并且其大小为约5 – 25个核苷酸、更优选约12 – 20个核苷酸。

优选修饰的寡核苷酸主链包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3'亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键合的硼磷酸酯（boranophosphates），这些的2'-5'连接类似物，和具有倒转极性的那些，其中核苷单位的相邻对3'-5'与5'-3'或2'-5'与5'-2'连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

教导上述含磷键合制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455，233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050，其各自引入本文作为参考。

其中不包括磷原子的优选修饰寡核苷酸主链具有这样的主链，其通过短链烷基或环烷基核苷间键合、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键合、或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键合形成。这些包括具有吗啉代键合的那些（部分由核苷的糖部分形成）；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；formacetyl和thioformacetyl主链；亚甲基formacetyl和thioformacetyl主链；含链烃主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺胺主链；酰胺主链；和具有混合的N、O、S和CH₂组分部分的其他。

教导上述寡核苷制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其各自引入本文作为参考。

在其他优选的寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间键合即主链由新型基团替换。维持这些碱基单位用于与合适的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物，已显示具有极佳杂交性质的寡核苷酸模拟物，被称为肽核酸（PNA）。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链由含酰胺主链替换，特别是氨乙基甘氨酸主链。核碱基被保留且与主链的酰胺部分的氮杂氮原子直接或间接结合。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自引入本文作为参考。PNA化合物的进一步教导可以在Nielsen等人，Science，1991，254，1497-1500中找到。

在本发明的另一个优选实施方案中，具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷，且特别是称为亚甲基（甲基亚氨基）或MMI 主链的-CH₂-NH-O-CH₂-,-CH₂-N（CH₃）-O-CH₂-、-CH₂-O-N（CH₃）-CH₂-,-CH₂N（CH₃）-N（CH₃）CH₂-和-O-N（CH₃）-CH₂-CH₂-，其中天然磷酸二酯主链表示为上文提及的美国专利号5,489,677的O-P-O-CH₂-，和上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺主链。还优选的是具有上文提及的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构的寡核苷酸。

修饰寡核苷酸还可以包括一个或多个取代糖部分。优选寡核苷酸在2'位置上包括下述之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O 烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C至CO烷基或C₂至CO烯基和炔基。特别优选的是O（CH₂）_nO_mCH₃、O（CH₂）_n,OCH₃、O（CH₂）_nNH₂、O（CH₂）nCH₃、O（CH₂）_nONH₂和O（CH_2nON（CH₂）nCH₃）₂，其中n和m可以是1 – 约10。其他优选寡核苷酸在2'位置上包括下述之一：C至CO、（低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH₃、OCN、Cl、Br、CN、CF₃、OCF₃、SOCH₃、SO₂CH₃、ONO₂、NO₂、N₃、NH₂、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、插入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药效性质的基团、和具有相似性质的其他取代物。优选修饰包括2'-甲氧基乙氧基（2'-O-CH₂CH₂OCH₃，也称为2'-O-（2-甲氧基乙基）或2'-MOE）（Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486-504），即烷氧基烷氧基基团。进一步优选的修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O（CH₂）₂ON（CH₃）₂基团，也称为2'-DMAOE，如本文下文实施例中所述，和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基（本领域也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE），即2'-O-CH₂-O-CH₂-N（CH₂）₂。

其他优选修饰包括2'-甲氧基（2'-O CH₃）、2'-氨基丙氧基（2'-O CH₂CH₂CH₂NH₂）和2'-氟（2'-F）。相似修饰还可以在寡核苷酸上的其他位置上进行，特别是在3'末端核苷酸上糖的3'位置或在2'-5'连接寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸还可以具有糖模拟物例如环丁基部分代替戊呋喃糖基糖。教导此类修饰糖结构物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其各自引入本文作为参考。

寡核苷酸还可以包括核碱基（在本领域中通常被简称为“碱基”）修饰或取代。如本文使用的，“未修饰”或“天然”核苷酸包括嘌呤碱基腺嘌呤（A）和鸟嘌呤（G），以及嘧啶碱基胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）。修饰核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶（5-Me-C）、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶（假尿嘧啶）、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤（methylquanine）和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

进一步地，核苷酸包括公开于美国专利号3,687,808中的那些，公开于'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering'，第858-859页，Kroschwitz，J.I.，ed. John Wiley和Sons，1990中的那些，由Englisch等人，'Angewandle Chemie，International Edition'，1991，30，第613页公开的那些，和由Sanghvi，Y.S.，第15章，'Antisense Research and Applications'，第289-302页，Crooke，S.T.和Lebleu，B. ea.，CRC Press，1993公开的那些。这些核苷酸中的一些特别用于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃（Sanghvi，Y. S.，Crooke，S. T.和Lebleu，B.，编辑，'Antisense Research and Applications'，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页），并且是目前优选的碱基置换，更加特别当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

教导上述修饰核苷酸以及其他修饰核苷酸制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692和5,681,941，其各自引入本文作为参考。

本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，所述部分或缀合物增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。

此类部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分（Letsinger等人，（1989）Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86，6553-6556）、胆酸（Manoharan等人，（1994）Bioorg.Med. Chem. Let.，4，1053-1060）、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇（Manoharan等人，（1992）Ann. N. Y. Acad. Sci.，660，306-309；Manoharan等人，（1993）Bioorg. Med. Chem. Let.，3，2765-2770）、巯基胆固醇（Oberhauser等人，（1992）Nucl. Acids Res.，20，533-538）、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基（Kabanov等人，（1990）FEBS Lett.，259，327-330；Svinarchuk等人，（1993）Biochimie，75，49-54）、磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵（Manoharan等人，（1995）Tetrahedron Lett.，36，3651-3654；Shea等人，（1990）Nucl. Acids Res.，18，3777-3783）、聚胺或聚乙二醇链（Manoharan 等人（1995）Nucleosides & Nucleotides，14，969-973）、或金刚烷乙酸（Manoharan等人，（1995）Tetrahedron Lett.，36，3651-3654）、棕榈酰基部分（Mishra等人，（1995）Biochim. Biophys. Acta，1264，229-237）、或十八胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分（Crooke等人，（1996）J. Pharmacol. Exp. Ther.，277，923-937）。

教导此类寡核苷酸缀合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552，538；5,578,717，5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486，603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082，830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203，5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928和5,688,941，其各自引入本文作为参考。

药物开发：本发明的化合物还可以应用于药物开发和靶确认领域。本发明包含在药物开发努力中使用本文鉴定的化合物和优选靶区段，以阐明在肌营养蛋白家族多核苷酸和疾病状态、表型或病状之间存在的关系。这些方法包括检测或调节肌营养蛋白家族多核苷酸，其包括使样品、组织、细胞或生物与本发明的化合物接触，在治疗后某时测量肌营养蛋白家族多核苷酸的核酸或蛋白质水平和/或相关表型或化学终末点，和任选地使测量值与非处理样品或用本发明的进一步化合物处理的样品比较。这些方法还可以与其他实验平行或组合执行，以测定未知基因的功能用于靶确认过程，或测定特定基因产物作为用于治疗或预防特定疾病、病状或表型的靶的有效性。

评估基因表达的上调或抑制：

外源核酸转移到宿主细胞或生物内可以通过直接检测细胞或生物中核酸的存在进行评估。此类检测可以通过本领域众所周知的几种方法来达到。例如，外源核酸的存在可以通过DNA印迹或通过聚合酶链反应（PCR）技术，使用特异性扩增与核酸相关的核苷酸序列的引物进行检测。外源核酸的表达还可以使用常规方法进行测量，包括基因表达分析。例如，由外源核酸产生的mRNA可以使用RNA印迹和逆转录PCR（RT-PCR）进行检测且定量。

来自外源核酸的RNA表达也可以通过测量酶促活性或报道蛋白质活性进行检测。例如，反义调节活性可以作为靶核酸表达中的减少或增加间接地进行测量，作为外源核酸产生效应子RNA的指示。基于序列保守性，可以设计引物且用于扩增靶基因的编码区。最初，来自每种基因最高度表达的编码区可以用于构建模型对照基因，尽管可以使用任何编码或非编码区。每种对照基因通过将每个编码区插入报道编码区及其多聚腺苷酸信号之间进行装配。这些质粒将产生具有在基因上游部分中的报道基因和在3'非编码区中的潜在RNAi靶的mRNA。个别反义寡核苷酸的有效性将通过报道基因的调节进行评估。在本发明的方法中有用的报道基因包括乙酰羟酸合酶（AHAS）、碱性磷酸酶（AP）、β半乳糖苷酶（LacZ）、β葡糖醛酸酶（GUS）、氯霉素乙酰转移酶（CAT）、绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、蓝色荧光蛋白（CFP）、辣根过氧化物酶（HRP）、萤光素酶（Luc）、胭脂碱合酶（NOS）、章鱼碱合酶（OCS）及其衍生物。多重可选标记是可获得的，其赋予对于氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、草胺膦、嘌呤霉素和四环素的抗性。测定报道基因调节的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于荧光法（例如荧光光谱法、荧光激活细胞分选（FACS）、荧光显微镜检查）、抗生素抗性测定。

DMD家族蛋白质和mRNA表达可以应用本领域技术人员已知并在本文其他处描述的方法分析。例如，免疫分析诸如ELISA可以用于测定蛋白质水平。用于ELISAs的DMD家族抗体可从例如Abnova, (Walnut, CA), Abcam, Cambridge, MA购得。

在各实施方案中，用本发明反义寡核苷酸处理的样品(例如体内或体外细胞或组织)中的DMD家族表达(例如mRNA或蛋白质)通过与对照样品中的DMD家族表达进行评价。例如，蛋白质或核酸的表达可以用本领域技术人员已知的方法与模拟处理或未处理样品比较。可选地，与用对照反义寡核苷酸处理的样品(例如，具有改变或不同序列)的比较可以取决于所需信息进行。在另一实施方案中，处理相对于未处理样品中DMD 家族蛋白质或核酸表达中的差异可以用处理相对于未处理样品中不同核酸（包括研究者认为合适的任何标准，例如管家基因）表达中的差异进行比较。

观察的差异可以按希望表示，例如，以比或分数的形式，用于与对照比较。在各实施方案中，相对于未处理样品或用对照核酸处理的样品，用本发明反义寡核苷酸处理的样品中DMD家族mRNA或蛋白质的水平增加或降低约1.25-倍至约10-倍或更多。在各实施方案中，DMD家族mRNA或蛋白质的水平增加或降低至少约1.25-倍、至少约1.3-倍、至少约1.4-倍、至少约1.5-倍、至少约1.6-倍、至少约1.7-倍、至少约1.8-倍、至少约2-倍、至少约2.5-倍、至少约3-倍、至少约3.5-倍、至少约4-倍、至少约4.5-倍、至少约5-倍、至少约5.5-倍、至少约6-倍、至少约6.5-倍、至少约7-倍、至少约7.5-倍、至少约8-倍、至少约8.5-倍、至少约9-倍、至少约9.5-倍、至少约10-倍或更多。

试剂盒、研究试剂、诊断和治疗

本发明的化合物可以用于诊断、治疗和预防，并且用作研究试剂和试剂盒组分。此外，能够以强烈特异性抑制基因表达的反义寡核苷酸通常由本领域普通技术人员用于阐明特定基因的功能，或区分生物途径的各种成员的功能。

对于在试剂盒和诊断中以及在各种生物系统中的使用，本发明的化合物单独或与其他化合物或治疗剂组合用作区分和/或组合分析中的工具，以阐明在细胞和组织内表达的基因的部分或完整互补体的表达模式。

如本文使用的，术语“生物系统”或“系统”定义为任何生物、细胞、细胞培养物或组织，其表达或使得能够表达肌营养蛋白家族基因的产物。这些包括但不限于人、转基因动物、细胞、细胞培养物、组织、异种移植物、移植物及其组合。

作为一个非限制性例子，在用一种或多种反义化合物处理的细胞或组织内的表达模式与未用反义化合物处理的对照细胞或组织比较，并且产生的模式就基因表达的差异水平进行分析，因为它们例如涉及被检查基因的疾病相关、信号途径、细胞定位、表达水平、大小、结构或功能。这些分析可以对刺激或未刺激细胞并且在影响表达模式的其他化合物的存在或不存在下执行。

本领域已知的基因表达分析的方法的例子包括DNA阵列或微阵列（Brazma和Vilo，（2000）FEBS Lett.，480，17-24；Celis,等人，（2000）FEBS Lett.，480，2-16）、SAGE（基因表达的系列分析（Madden,等人，（2000）Drug Discov. Today，5，415-425）、READS（消化cDNAs的限制性酶扩增）（Prashar和Weissman，（1999）Methods Enzymol.，303，258-72）、TOGA（总基因表达分析）（Sutcliffe,等人，（2000）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，97，1976-81）、蛋白质阵列和蛋白质组学（Celis,等人，（2000）FEBS Lett.，480，2-16；Jungblut,等人，（1999）Electrophoresis，20，2100-10）、已表达序列标记（EST）测序（Celis,等人，（2000）FEBS Lett.，480，2-16；Larsson,等人，（2000）J. Biotechnol.，80，143-57）、消减RNA指纹法（SuRF）（Fuchs,等人，（2000）Anal. Biochem.，286，91-98；Larson,等人，（2000）Cytometry，41，203-208）、消减克隆、差异显示（DD）（Jurecic和Belmont，（2000）Curr. Opin. Microbiol.，3，316-21）、比较基因组杂交（Carulli,等人，（1998）J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96）、FISH（荧光原位杂交）技术（Going和Gusterson，（1999）Eur. J. Cancer，35，1895-904）和质谱法（To，Comb.（2000）Chem. High Throughput Screen，3，235-41）。

本发明的化合物对于研究和诊断有用，因为这些化合物与编码肌营养蛋白家族的核酸杂交。例如，以此类效率且在如本文公开的此类条件下杂交以成为有效肌营养蛋白家族调节剂的寡核苷酸，在有利于基因扩增或检测的条件下分别是有效引物或探针。这些引物和探针用于要求编码肌营养蛋白家族的核酸分子的特异性检测的方法，和用于所述核酸分子的扩增用于检测或用于在肌营养蛋白家族的进一步研究中使用。本发明的反义寡核苷酸特别是引物和探针与编码肌营养蛋白家族的核酸的杂交可以通过本领域已知的方法进行检测。此类方法可以包括酶与寡核苷酸的缀合、寡核苷酸的放射性标记、或任何其他合适的检测方法。还可以制备使用此类检测方法用于检测样品中的肌营养蛋白家族水平的试剂盒。

反义的特异性和敏感性也由本领域技术人员用于治疗用途。反义化合物已在动物包括人中的疾病状态治疗中用作治疗部分。反义寡核苷酸药物已安全有效地施用于人，并且众多临床试验目前在进行中。因此确定反义化合物可以是有用的治疗模式，其可以配置为在用于治疗细胞、组织和动物特别是人的治疗方案中有用。

对于治疗，怀疑具有可以通过调节肌营养蛋白家族多核苷酸表达进行治疗的疾病或病症的动物优选人通过施用依照本发明的反义化合物进行治疗。例如，在一个非限制性实施方案中，该方法包括给需要治疗的动物施用治疗有效量的肌营养蛋白家族调节剂的步骤。本发明的肌营养蛋白家族调节剂有效调节肌营养蛋白家族的活性，或调节肌营养蛋白家族蛋白质的表达。在一个实施方案中，与对照比较，在动物中肌营养蛋白家族的活性或表达被抑制约10％。优选地，在动物中肌营养蛋白家族的活性或表达被抑制约30％。更优选地，在动物中肌营养蛋白家族的活性或表达被抑制50％或更多。因此，与对照比较，寡聚化合物使肌营养蛋白家族mRNA的表达调节至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

在一个实施方案中，与对照比较，在动物中肌营养蛋白家族的活性或表达增加约10％。优选地，在动物中肌营养蛋白家族的活性或表达增加约30％。更优选地，在动物中肌营养蛋白家族的活性或表达增加50％或更多。因此，与对照比较，寡聚化合物使肌营养蛋白家族mRNA的表达调节至少10％、至少50％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％。

例如，肌营养蛋白家族的表达减少可以在动物的血清、血液、脂肪组织、肝脏或任何其他体液、组织或器官中进行测量。优选地，在分析的所述液体、组织或器官中包含的细胞包含编码肌营养蛋白家族肽的核酸分子和/或肌营养蛋白家族蛋白质其自身。

通过将有效量的化合物加入合适的药学上可接受的稀释剂或载体中，本发明的化合物可以用于药物组合物中。本发明的化合物和方法的使用也可以是预防上有用的。

缀合物

本发明的寡核苷酸的另一种修饰涉及使寡核苷酸与一种或多种部分或缀合物化学连接，所述部分或缀合物增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。这些部分或缀合物可以包括与官能团例如伯或仲醇羟基共价结合的缀合物基团。本发明的缀合物基团包括插入剂、报道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效性质的基团、和增强寡聚物的药代动力学性质的基团。一般的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的背景中，增强药效性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性、和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的背景中，增强药代动力学性质的基团包括改善本发明的化合物的摄取、分布、代谢或排出的基团。代表性缀合物基团公开于1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196和美国专利号6,287,860中，其引入本文作为参考。缀合物部分包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-S-三苯甲硫醇、巯基胆固醇、脂肪族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈酰基部分或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。本发明的寡核苷酸还可以与活性药物材料缀合，例如阿司匹林、华法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、（S）-（+）-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂、吲哚美辛（indomethicin）、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺药、抗糖尿病药、抗菌剂或抗生素。

教导此类寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928和5,688,941。

制剂

本发明的化合物还可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、封装、缀合或以其他方式结合，作为例如脂质体，受体靶向分子，经口、直肠、局部或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导此类摄取、分布和/或吸收辅助制剂制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,165；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，其各自引入本文作为参考。

尽管反义寡核苷酸无需在载体的背景中施用，以便调节靶表达和/或功能，但本发明的实施方案涉及用于表达反义寡核苷酸的表达载体构建体，包括启动子、杂合启动子基因序列，且具有强组成型启动子活性，或可以在所需情况下诱导的启动子活性。

在一个实施方案中，本发明实践涉及用合适的核酸递送系统施用前述反义寡核苷酸中的至少一种。在一个实施方案中，该系统包括与多核苷酸可操作地连接的非病毒载体。此类非病毒载体的例子包括单独（例如，SEQ ID NO：8 – 22中的任何一个或多个）或与合适蛋白质、多糖或脂质制剂组合的寡核苷酸。

另外合适的核酸递送系统包括病毒载体，一般是来自下述中的至少一种的序列：腺病毒、腺相关病毒（AAV）、辅助病毒依赖型腺病毒、逆转录病毒、或日本脂质体（HVJ）复合物的血凝病毒。优选地，病毒载体包括与多核苷酸可操作地连接的强真核启动子，例如巨细胞病毒（CMV）启动子。

另外优选的载体包括病毒载体、融合蛋白和化学缀合物。逆转录病毒载体包括莫洛尼鼠类白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包括至少2种载体，其中gag和pol基因来自HIV基因组，并且env基因来自另一种病毒。DNA病毒载体是优选的。这些载体包括痘病毒载体例如正痘病毒或鸡痘病毒载体、疱疹病毒载体例如单纯疱疹I病毒（HSV）载体[Geller，A.I.等人，（1995）J. Neurochem，64：487；Lim，F.,等人，DNA Cloning：Mammalian Systems，D. Glover，Ed.（Oxford Univ. Press，Oxford England）（1995）；Geller，A.I.等人，（1993）Proc Natl. Acad. Sci.：U.S.A.:90 7603；Geller，A.I.,等人，（1990）Proc Natl. Acad. SciUSA：87:1149]、腺病毒载体（LeGal LaSalle等人，Science，259:988（1993）；Davidson,等人，（1993）Nat. Genet.3： 219；Yang,等人，（1995）J. Virol. 69：2004）和腺相关病毒载体（Kaplitt，M.G.,等人，（1994）Nat. Genet. 8:148）。

本发明的反义化合物包含任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐、或任何其他化合物，其在施用于动物包括人后，能够提供（直接或间接地）生物学活性代谢产物或其残余。

术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物的生理学和药学上可接受的盐：即保留母体化合物的所需生物活性且不对其赋予不希望有的毒理学效应的盐。对于寡核苷酸，药学上可接受的盐的优选例子及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

本发明还包括包含本发明的反义化合物的药物组合物和制剂。本发明的药物组合物可以以许多方式施用，这依赖于是需要局部还是全身性治疗和依赖于待治疗的区域。施用可以是局部的（包括眼和至粘膜包括阴道和直肠递送）、肺的例如通过粉剂或气溶胶的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮）、经口或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或心室内施用。

为了处理中枢神经系统中的组织，给药可以通过例如注射或输注到脑脊液中进行。反义RNA在脑脊液中的给药在例如美国专利申请公开号2007/0117772、“用于减慢家族性ALS疾病进展的方法”中描述，其整体并入本文作为参考。

当意图本发明的反义寡核苷酸给予中枢神经系统中的细胞时，给药可以应用能够促进主题反义寡核苷酸渗透通过血脑屏障的一种或多种试剂进行。注射可以例如在海马内嗅皮层中进行。神经营养因子通过施用腺病毒载体到肌肉组织中运动神经元的递送描述于例如美国专利号6,632,427、“腺病毒载体介导的向延髓运动神经元的基因转移”，其并入本文作为参考。载体向脑例如纹状体、丘脑、海马或黑质中的直接递送是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号6,756,523、“用于运输外源基因到中枢神经系统尤其是脑的细胞中的腺病毒载体”中，其并入本文作为参考。施用可以是快速的，如通过注射，或在一段时期内进行，如通过缓慢输注或施用缓慢释放制剂。

主题反义寡核苷酸可以与提供期望药学或药动学性质的试剂连接或偶联。例如，反义寡核苷酸可以与本领域已知促进跨血脑屏障渗透或转运的任何物质偶联，诸如转铁蛋白受体的抗体，并且通过静脉内注射施用。反义化合物可以与病毒载体连接，例如，其使得反义化合物更有效和/或增加反义化合物跨血脑屏障的转运。渗透血脑屏障破坏也可以这样实现，通过例如输注糖，包括但不限于内消旋赤藓醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、半乳糖醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纤维二糖、D(+) 麦芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D(-)核糖、核糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)岩藻糖、L(-)岩藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖，或氨基酸，包括但不限于谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增加血脑屏障渗透的方法和材料描述于例如美国专利号4,866,042“用于输送遗传材料跨血脑屏障的方法”、6,294,520“用于通过血脑屏障的材料”和6,936,589“胃肠外输送系统”中，它们都整体并入本文作为参考。

主题反义化合物可与其他分子、分子结构或化合物的混合物例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂混合、包封、偶联或另外连接，用于促进摄取、分配和/或吸收。例如，阳离子脂质可以包含在制剂中以促进寡核苷酸摄取。显示促进摄取的一种这样的组合物是LIPOFECTIN (可得自GIBCO-BRL, Bethesda, MD)。

具有至少一个2'-O-甲氧基乙基修饰的寡核苷酸被认为对于经口施用特别有用。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药学载体，水、粉末或油基，增稠剂等可以是需要或希望的。包被避孕套、手套等也可以是有用的。

可以方便地以单位剂型呈现的本发明的药物制剂可以根据药物工业中众所周知的常规技术进行制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药学载体或赋形剂达到结合的步骤。一般而言，制剂通过下述进行制备：使活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均匀地且紧密地达到结合，并且随后在需要时使产物成形。

本发明的组合物可以配制成许多可能剂型中的任何，例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本发明的组合物还可以在水、非水或混合介质中配制为栓剂。水悬浮液可以进一步包含增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以包含稳定剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳状液、泡沫和含脂质体制剂。本发明的药物组合物和制剂可以包括一种或多种穿透促进剂、载体、赋形剂或其他活性或非活性成分。

乳状液一般是一种液体以直径通常超过0.1 μm的小滴形式在另一种中分散的非均质系统。乳状液除分散相可以包含另外组分，以及可以作为在水相、油相中的溶液或其自身作为分离相存在的有效药。微乳液包括作为本发明的一个实施方案。乳状液及其用途是本领域众所周知的，并且在美国专利号6,287,860中进一步描述。

本发明的制剂包括脂质体制剂。如在本发明中使用的，术语“脂质体”意指由在一个或多个球状双层中排列的两亲脂质组成的囊泡。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂材料形成的膜和包含待递送组合物的水性内部。阳离子脂质体是带正电的脂质体，其被认为与带负电的DNA分子相互作用，以形成稳定复合物。其为pH敏感或带负电的脂质体被认为诱陷DNA而不是与之复合。阳离子和非阳离子脂质体已用于将DNA递送至细胞。

脂质体还包括“立体稳定的”脂质体，如本文使用的，这是指包括一种或多种专门脂质的脂质体的术语。当掺入脂质体内时，这些专门脂质导致相对于缺乏此类专门脂质的脂质体具有增强的循环寿命的脂质体。立体稳定的脂质体的例子是其中脂质体的囊泡形成脂质部分的部分包括一种或多种糖脂，或由一种或多种亲水聚合物例如聚乙二醇（PEG）部分衍生的那些。脂质体及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述。

本发明的药物制剂和组合物还可以包括表面活性剂。表面活性剂在药物产品、制剂和乳状液中的用途是本领域众所周知的。表面活性剂及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

在一个实施方案中，本发明采用各种穿透促进剂，以实现核酸特别是寡核苷酸的有效递送。除帮助非亲脂药物扩散越过细胞膜外，穿透促进剂还增强亲脂药物的渗透性。穿透促进剂可以分类为属于5个广泛范畴之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、和非螯合非表面活性剂。穿透促进剂及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

本领域技术人员将认识到照常规根据其预期用途即施用途径来设计制剂。

用于局部施用的优选制剂包括其中本发明的寡核苷酸与局部递送试剂混合的那些，所述局部递送试剂例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂。优选脂质和脂质体包括中性（例如二油酰-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱）、阴性（例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG）和阳离子的（例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA）。

对于局部或其他施用，本发明的寡核苷酸可以封装在脂质体内或可以与其特别是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，寡核苷酸可以与脂质特别是与阳离子脂质复合。优选脂肪酸和酯、其药学上可接受的盐及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述。

用于经口施用的组合物和制剂包括粉剂或颗粒剂、微粒、纳米颗粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或小片。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可能是希望的。优选经口制剂是其中本发明的寡核苷酸与一种或多种穿透促进剂、表面活性剂和螯合剂结合施用的那些。优选表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。优选胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。还优选的是穿透促进剂的组合，例如与胆汁酸/盐组合的脂肪酸/盐。特别优选的组合是月桂酸的钠盐、癸酸和UDCA。进一步的穿透促进剂包括聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本发明的寡核苷酸可以以颗粒形式包括喷雾干燥颗粒经口递送，或复合以形成微粒或纳米颗粒。寡核苷酸络合剂及其用途在美国专利号6,287,860中进一步描述，其引入本文作为参考。

用于肠胃外、鞘内或心室内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液，其还可以包含缓冲剂、稀释剂和其他合适添加剂，例如但不限于穿透促进剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的特定实施方案提供包含一种或多种寡聚化合物和一种或多种其他化学治疗剂的药物组合物，所述其他化学治疗剂通过非反义机制起作用。此类化学治疗剂的例子包括但不限于癌症化学治疗药，例如柔红霉素、道诺霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、依达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞甙、双-氯乙基-亚硝基脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、光辉霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、它莫西芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氮杂胞苷、羟基脲、喷司他丁、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-氟脱氧尿苷（5-FUdR）、氨甲蝶呤（MTX）、秋水仙碱、泰素、长春新碱、长春碱、依托泊苷（VP-16）、三甲曲沙、依立替康、托泊替康、吉西他滨、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚（DES）。当与本发明的化合物一起使用时，此类化学治疗剂可以个别（例如5-FU和寡核苷酸）、顺次（例如5-FU和寡核苷酸一段时间，随后为MTX和寡核苷酸）、或与一种或多种其他此类化学治疗剂组合（例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU放射疗法和寡核苷酸）使用。抗炎药包括但不限于非甾体抗炎药和皮质类固醇，和抗病毒药包括但不限于利巴韦林、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，也可以在本发明的组合物中组合。反义化合物和其他非反义药物的组合也在本发明的范围内。2种或更多种组合化合物可以一起或顺次使用。

在另一个相关实施方案中，本发明的组合物可以包含靶向第一种核酸的一种或多种反义化合物特别是寡核苷酸，和靶向第二种核酸靶的一种或多种另外反义化合物。例如，第一种靶可以是肌营养蛋白家族的特定反义序列，并且第二种靶可以是来自另一种核苷酸序列的区域。可替代地，本发明的组合物可以包含靶向相同肌营养蛋白家族核酸靶的不同区域的2种或更多种反义化合物。反义化合物的众多例子在本文中举例说明，并且其他可以选自本领域已知的合适化合物。2种或更多种组合化合物可以一起或顺次使用。

给药：

治疗组合物的配制及其后续施用（给药）被认为在本领域技术内。给药依赖于待治疗疾病状态的严重度和应答性，应用持续数天到数月的治疗过程，或直至实现治愈或达到疾病状态的缩减。最佳给药方案可以由患者体内的药物蓄积测量进行计算。普通技术人员可以容易地决定最佳剂量、给药方法和重复速率。最佳剂量可以依赖于个别寡核苷酸的相对功效而变，并且一般可以基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC_50s进行估计。一般而言，剂量是0.01 μg - 100 g/kg体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予一次或多次，或甚至每2 – 20年给予一次。本领域普通技术人员可以容易地估计关于给药的重复速率，这基于在体液或组织中测量的药物停留时间和浓度。在成功治疗后，可以希望使患者经历维持疗法以预防疾病状态复发，其中寡核苷酸以维持剂量施用，范围为0.01 μg - 100 g/kg体重，每天一次或多次，到每20年一次。

在各实施方案中，患者用下列药物剂量处理：至少约1、至少约 2、至少约 3、至少约 4、至少约 5、至少约 6、至少约 7、至少约 8、至少约 9、至少约 10、至少约 15、至少约 20、至少约 25、至少约 30、至少约 35、至少约 40、至少约 45、至少约 50、至少约 60、至少约 70、至少约 80、至少约 90或至少约100 mg/kg体重。某些注射剂量的反义寡核苷酸在例如美国专利号7,563,884 “PTP1B表达的反义调节”中描述，其整体并入本文作为参考。

尽管已在上文描述了本发明的各种实施方案，但应当理解它们仅作为例子而不是限制呈现。依照本文公开内容可以进行对于公开实施方案的众多改变，而不背离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受上述实施方案中的任何限制。

本文提及的所有文件引入本文作为参考。本申请中引用的所有出版物和专利文件为了所有目的引入作为参考，其程度与每个个别出版物或专利文件如此个别指出相同。通过其在本文件的各种参考文献中的引用，申请人不承认任何具体参考文献是其发明的“现有技术”。本发明组合物和方法的实施方案在下述实施例中举例说明。

实施例

下述非限制性实施例用来举例说明本发明的选择实施方案。应当理解在所示组分元件中的比例和可替代物中的变化对于本领域技术人员将是显而易见的，并且在本发明的实施方案的范围内。

实施例 1 ：反义寡核苷酸的设计，其对于与肌营养蛋白家族反义的核酸分子和 / 或肌营养蛋白家族多核苷酸的有义链具有特异性

如上所述，术语“对于……特异的寡核苷酸”或“寡核苷酸靶”指具有下述序列的寡核苷酸：（i）能够与靶基因的部分形成稳定复合物，或（ii）能够与靶基因的mRNA转录物的部分形成稳定双链体。

合适寡核苷酸的选择通过使用计算机程序得到促进，所述计算机程序自动比对核酸序列且指出同一性或同源性区域。此类程序用于比较获得的核酸序列，例如通过搜索数据库例如GenBank或通过测序PCR产物。来自一系列物种的核酸序列的比较允许选择展示物种之间的合适同一性程度的核酸序列。在未测序的基因的情况下，执行DNA印迹以允许测定靶物种和其他物种中在基因之间的同一性程度。通过在各种严格程度下执行DNA印迹，如本领域众所周知的，可以获得同一性的近似测量。这些操作允许选择这样的寡核苷酸，其显示出与待控制受试者中的靶核酸序列的高度互补性和与其他物种中的相应核酸序列的较低程度互补性。技术人员将认识到在选择用于在本发明中使用的基因的合适区域中存在相当大的活动余地。

反义化合物是“可特异性杂交的”，此时化合物与靶核酸的结合干扰靶核酸的正常功能以引起功能和/或活性调节，并且存在足够程度的互补性，以避免在其中需要特异性结合的条件下反义化合物与非靶核酸序列的非特异性结合，即在体内测定或治疗性处理情况下在生理条件下，和其中在体外测定情况下执行测定的条件下。

本文描述的寡核苷酸的杂交性质可以通过如本领域已知的一种或多种体外测定进行测定。例如，使用解链曲线测定，通过测定靶天然反义和潜在药物分子之间的结合强度可以获得本文描述的寡核苷酸的性质。

使用测量分子间相互作用强度的任何确定方法例如解链曲线测定，可以估计靶天然反义和潜在药物分子（分子）之间的结合强度。

解链曲线测定确定在其下对于天然反义/分子复合物发生从双链到单链构象的快速转变的温度。这个温度被广泛公认为2种分子之间的相互作用强度的可靠测量。

使用实际天然反义RNA分子的cDNA拷贝或与分子的结合位点对应的合成DNA或RNA核苷酸，可以执行解链曲线测定。包含执行这种测定的所有必需试剂的多种试剂盒是可获得的（例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor试剂盒）。这些试剂盒包括包含双链DNA（dsDNA）结合染料（例如ABI HRM染料、SYBR Green、SYTO等）之一的合适缓冲溶液。dsDNA染料的性质是这样的，使得它们以游离形式几乎不发出荧光，但在与dsDNA结合时是高度荧光的。

为了执行测定，使cDNA或相应寡核苷酸与分子以由具体制造商的方案限定的浓度混合。使混合物加热至95℃，以解离所有预形成的dsDNA复合物，随后缓慢冷却至室温或由试剂盒制造商限定的其他较低温度，以允许DNA分子退火。新近形成的复合物随后缓慢加热至95℃，伴随关于由反应产生的荧光量的同时连续数据收集。荧光强度与反应中存在的dsDNA量成反比。数据可以使用与试剂盒相容的实时PCR仪器（例如ABI’s StepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper仪器，Roche Diagnostics，Lewes，UK）进行收集。

使用合适软件（例如LightTyper（Roche）或SDS Dissociation Curve，ABI），通过针对温度（x轴）标绘就温度而言的荧光负衍生物（在y轴上的-d（荧光）/dT）构建解链峰。分析数据以鉴定从dsDNA复合物到单链分子的快速转变的温度。这个温度被称为Tm，并且与2种分子之间的相互作用强度成正比。一般地，Tm将超过40℃。

实施例 2 ： DMD 家族多核苷酸的调节

用反义寡核苷酸处理 518A2 细胞：

使来自Albert Einstein-Montefiore Cancer Center, NY的518A2细胞在生长培养基（MEM/EBSS（Hyclone 目录号SH30024或Mediatech 目录号MT-10-010-CV）+10％FBS（Mediatech 目录号MT35-011-CV）+ 青霉素/链霉素（Mediatech 目录号MT30-002-CI））中在37℃和5％CO₂下生长。在实验前一天，使细胞以1.5 × 10⁵/ml的密度再铺到6孔板内，并且在37℃和5％CO₂下孵育。在实验当天，将6孔板中的培养基替换为新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸稀释至20 μM的浓度。使2 μl这种溶液与400 μl Opti-MEM培养基（Gibco 目录号31985-070）和4 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen 目录号11668019）在室温下孵育20分钟，并且应用于具有518A2细胞的6孔板的每个孔。包括2 μl水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模拟转染对照。在37℃和5％CO₂下孵育3-18小时后，将培养基换成新鲜生长培养基。在加入反义寡核苷酸后48小时，去除培养基，并且使用来自Promega的SV Total RNA Isolation System（目录号Z3105）或来自Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation试剂盒（目录号74181），根据制造商的说明书从细胞中提取RNA。将600 ng RNA加入使用来自Thermo Scientific的Verso cDNA试剂盒（目录号AB1453B）或High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (目录号4368813)执行的逆转录反应中，如制造商的方案中所述。来自这种逆转录反应的cDNA用于通过实时PCR监控基因表达，使用ABI Taqman Gene Expression Mix（目录号4369510）和由ABI设计的引物/探针（Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00187805_m1，Applied Biosystems Inc., Foster City CA）。使用下述PCR循环：使用StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)，50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环（95℃15秒，60℃1分钟）。

基于处理和模拟转染样品之间在18S标准化dCt值中的差异，计算在用反义寡核苷酸处理后在基因表达中的倍数变化。

结果：

实时PCR结果显示，在用针对DMD家族反义BG208074设计的siRNAs中的两个处理后48小时，在518A2细胞中DMD家族mRNA水平显著增加。用针对其他反义分子BF838561、BF768753和BF950643的siRNAs的处理不提高DMD家族mRNA水平(图1A和B)。

用反义寡核苷酸处理 MCF-7 细胞：

使来自ATCC的MCF-7细胞（目录号HTB-22）在生长培养基（MEM/EBSS（Hyclone 目录号SH30024或Mediatech 目录号MT-10-010-CV）+10％FBS（Mediatech 目录号MT35-011-CV）+ 青霉素/链霉素（Mediatech 目录号MT30-002-CI））中在37℃和5％CO₂下生长。在实验前一天，使细胞以1.5 × 10⁵/ml的密度再铺到6孔板内，并且在37℃和5％CO₂下孵育。在实验当天，将6孔板中的培养基替换为新鲜生长培养基。所有反义寡核苷酸稀释至20 μM的浓度。使2 μl这种溶液与400 μl Opti-MEM培养基（Gibco 目录号31985-070）和4 μl Lipofectamine 2000（Invitrogen 目录号11668019）在室温下孵育20分钟，并且应用于具有MCF-7细胞的6孔板的每个孔。包括2 μl水代替寡核苷酸溶液的相似混合物用于模拟转染对照。在37℃和5％CO₂下孵育3-18小时后，将培养基换成新鲜生长培养基。在加入反义寡核苷酸后48小时，去除培养基，并且使用来自Promega的SV Total RNA Isolation System（目录号Z3105）或来自Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation试剂盒（目录号74181），根据制造商的说明书从细胞中提取RNA。将600 ng RNA加入使用来自Thermo Scientific的Verso cDNA试剂盒（目录号AB1453B）或High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (目录号4368813)执行的逆转录反应中，如制造商的方案中所述。来自这种逆转录反应的cDNA用于通过实时PCR监控基因表达，使用ABI Taqman Gene Expression Mix（目录号4369510）和由ABI设计的引物/探针（Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs01126016_m1，Applied Biosystems Inc., Foster City CA）。使用下述PCR循环：使用Mx4000热循环仪(Stratagene)或StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)，50℃2分钟，95℃10分钟，40个循环（95℃15秒，60℃1分钟）。

基于处理和模拟转染样品之间在18S标准化dCt值中的差异，计算在用反义寡核苷酸处理后在基因表达中的倍数变化。

结果：

实时PCR结果显示，在用针对UTRN家族反义ENST00000431309设计的siRNAs处理后48小时，在MCF-7细胞中UTRN mRNA的水平显著增加。

尽管本发明已就一个或多个实现而言举例说明且描述，但在阅读和理解本说明书和附图后，本领域技术人员将想到等价改变和修饰。此外，虽然本发明的特定特征可以就几个实现中的唯一一个而言公开，但此类特征可以与其他实现的一个或多个其他特征组合，如对于任何给定或特定应用可以是所需和有利的。

公开内容的摘要将允许读者快速确定技术公开内容的性质。提供该摘要并理解，它将不用于解释或限制所附权利要求范围或含义。

Claims (37)

1.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：

使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与多核苷酸的反向互补体具有至少50％序列同一性，所述多核苷酸包括在SEQ ID NO：3的核苷酸1-378、SEQ ID NO：4的核苷酸1-294、SEQ ID NO：5的核苷酸1-686、SEQ ID NO：6的核苷酸1-480和SEQ ID NO：7的核苷酸1-501内的5 - 30个连续核苷酸（图3）；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中所述肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。

2.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：

使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述至少一种寡核苷酸与肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义的反向互补体具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中所述肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。

3.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：

使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸与针对肌营养蛋白家族多核苷酸的反义寡核苷酸具有至少50％序列同一性；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中所述肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。

4.一种在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达的方法，其包括：

使所述细胞或组织与靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义寡核苷酸的区域的至少一种反义寡核苷酸接触；从而在体内或体外调节患者细胞或组织中肌营养蛋白家族多核苷酸的功能和/或表达。

5.权利要求4的方法，其中相对于对照，所述肌营养蛋白家族的功能和/或表达在体内或体外增加。

6.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义序列。

7.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向包括肌营养蛋白家族多核苷酸的编码和/或非编码核酸序列的核酸序列。

8.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸靶向肌营养蛋白家族多核苷酸的重叠和/或非重叠序列。

9.权利要求4的方法，其中所述至少一种反义寡核苷酸包括选自下列的一种或多种修饰：至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷间键合、至少一种修饰的核苷酸和其组合。

10.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自下列的至少一种修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分及其组合。

11.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自下列的至少一种修饰的核苷间键合：硫代磷酸酯、2'-O-甲氧基乙基（MOE）、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和其组合。

12.权利要求9的方法，其中所述一种或多种修饰包括选自下列的至少一种修饰的核苷酸：肽核酸(PNA)、锁核酸（LNA）、阿糖核酸（FANA），其类似物、衍生物和其组合。

13.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡核苷酸包括如SEQ ID NOS：8 -22所示的至少一个寡核苷酸序列。

14.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族基因的功能和/或表达的方法，其包括：

使所述细胞或组织与长度5 – 30个核苷酸的至少一种短干扰RNA（siRNA）寡核苷酸接触，所述至少一种siRNA寡核苷酸对于肌营养蛋白家族多核苷酸的反义多核苷酸具有特异性，其中所述至少一种siRNA寡核苷酸与所述肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义核酸分子的至少约5个连续核酸的互补序列具有至少50％序列同一性；以及在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族的功能和/或表达。

15.权利要求14的方法，其中所述寡核苷酸与与所述肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义核酸分子互补的至少约5个连续核酸的序列具有至少80％序列同一性。

16.一种在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族的功能和/或表达的方法，其包括：

使所述细胞或组织与长度约5 – 30个核苷酸的至少一种反义寡核苷酸接触，所述至少一种反义寡核苷酸对于肌营养蛋白家族多核苷酸的有义和/或天然反义链的非编码和/或编码序列具有特异性，其中所述至少一种反义寡核苷酸与如SEQ ID NOS：1、2和3 -7所示的至少一个核酸序列具有至少50％序列同一性；以及在体内或体外调节哺乳动物细胞或组织中肌营养蛋白家族的功能和/或表达。

17.一种包括至少一种修饰的合成的、修饰的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰选自：至少一种修饰的糖部分、至少一种修饰的核苷酸间键合、至少一种修饰的核苷酸和其组合，其中与正常对照比较，所述寡核苷酸是在体内或体外与肌营养蛋白家族基因杂交、且调节其功能和/或表达的反义化合物。

18.权利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一种修饰包括选自下述的核苷酸间键合：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和其组合。

19.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键合。

20.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间键合的主链。

21.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括至少一种修饰的核苷酸，所述修饰的核苷酸选自肽核酸，锁核酸（LNA），其类似物、衍生物和组合。

22.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自下列的修饰的核苷酸：硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、亚氨酸乙酯、羧甲基酯和其组合。

23.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自下列的修饰的核苷酸：肽核酸，锁核酸（LNA），其类似物、衍生物和组合。

24.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括选自下列的至少一种修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分和其组合。

25.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括多种修饰，其中所述修饰包括选自下列的修饰的糖部分：2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分、双环糖部分和其组合。

26.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸长度至少约5 – 30个核苷酸，并且与肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义链杂交，其中所述寡核苷酸与所述肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约5个连续核酸的互补序列具有至少约20％序列同一性。

27.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸与所述肌营养蛋白家族多核苷酸的反义和/或有义编码和/或非编码核酸序列的至少约5个连续核酸的互补序列具有至少约80％序列同一性。

28.权利要求17的寡核苷酸，其中与正常对照比较，所述寡核苷酸在体内或体外与至少一种肌营养蛋白家族多核苷酸杂交，且调节其表达和/或功能。

29.权利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包括如SEQ ID NOS：8 - 22所示的序列。

30.一种组合物，其包括对于一种或多种肌营养蛋白家族多核苷酸具有特异性的一种或多种寡核苷酸，所述多核苷酸包括其反义序列、互补序列、等位基因、同系物、同种型、变体、衍生物、突变体、片段或组合。

31.权利要求30的组合物，其中所述寡核苷酸与如SEQ ID NOS：8 - 22所示的任何一个核苷酸序列比较具有至少约40％序列同一性。

32.权利要求30的组合物，其中所述寡核苷酸包括如SEQ ID NOS：8 - 22所示的核苷酸序列。

33.权利要求32的组合物，其中如SEQ ID NOS：8 - 22所示的所述寡核苷酸包括一种或多种修饰或取代。

34.权利要求33的组合物，其中所述一种或多种修饰选自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、锁核酸（LNA）分子和其组合。

35.一种预防或治疗与至少一种肌营养蛋白家族多核苷酸和/或至少一种其编码产物相关的疾病的方法，其包括：

给患者施用治疗有效剂量的至少一种反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸与所述至少一种肌营养蛋白家族多核苷酸的天然反义序列结合，且调节所述至少一种肌营养蛋白家族多核苷酸的表达；从而预防或治疗与至少一种肌营养蛋白家族多核苷酸和/或至少一种其编码产物相关的疾病。

36.权利要求35的方法，其中与肌营养蛋白家族多核苷酸相关的疾病选自：肌肉疾病或病症(例如肌营养不良，包括杜氏肌营养不良、贝克尔肌营养不良、脊髓延髓性肌营养不良、抗肌萎缩蛋白病、肌聚糖病、肢带肌营养不良、先天性肌营养不良症、先天性肌病、远端肌病、女性携带者中杜氏和贝克尔肌营养不良症的症状形式肌强直综合征等；肌萎缩病)、神经疾病或病症(包括神经肌肉疾病或病症例如张力失常、肌阵挛-肌张力障碍综合征等)、与肌营养蛋白或肌营养蛋白DAPC-复合物的改变水平相关的疾病或病症、左室致密化不全、癌症、心血管疾病或病症、心肌病(例如，散发性扩张型心肌病、X-连锁扩张型心肌病(XLDC)等)、动脉粥样硬化细胞骨架病症、先天性静止性夜盲和听觉缺失。

37.一种鉴定和选择至少一种寡核苷酸用于体内施用的方法，其包括：选择与疾病状态相关的靶多核苷酸；鉴定包括至少5个连续核苷酸的至少一种寡核苷酸，所述连续核苷酸与所述选择的靶多核苷酸互补或与对所述选择的靶多核苷酸反义的多核苷酸互补；在严格杂交条件下测量反义寡核苷酸和靶多核苷酸或对所述选择的靶多核苷酸反义的多核苷酸的杂交体的热解链温度；和根据获得的信息选择至少一种寡核苷酸用于体内施用。

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