CN114555095A

CN114555095A - 使用针对CD49d的抑制性寡核苷酸治疗肌营养不良症的方法

Info

Publication number: CN114555095A
Application number: CN202080049373.1A
Authority: CN
Inventors: G·塔查斯
Original assignee: Antisense Therapeutics Ltd
Current assignee: Percheron Therapeutics Ltd
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2022-05-27
Also published as: CA3138945A1; AU2020269078A1; BR112021022208A2; WO2020223762A1; JP2022532098A; EP3965778A1; KR20220061915A; US20220296631A1; EP3965778A4

Abstract

一种在患有或处于与肌肉萎缩、肌肉脂肪组织、或假性肥大或肌营养不良症相关的病症的风险中的受试者中改进肌肉或肢体性能的方法，该方法通过施用足以改进肌肉脂肪、肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的一种或多种标志物、体征或参数的针对CD49d的药物组合物抑制性寡核苷酸。一种方法，包括以下步骤：(i)确定来自受试者的血液样品中CD4+CD49d+T细胞的水平；(ii)施用一个疗程的反义寡核苷酸并且在接近给药周期结束时重复步骤(i)至少一次；(iii)在给药完成的一周内重复步骤(i)；(iv)处理结果以确定受试者是否在CD4+CD49d+T细胞水平上表现出或未表现出剂量完成后反弹、稳定性或损失。

Description

使用针对CD49d的抑制性寡核苷酸治疗肌营养不良症的方法

技术领域

本说明书实现了用于改进肌肉性能的组合物和方法。

背景技术

本说明书中参考文献的书目信息也列在本说明书的末尾。

本说明书中对任何现有技术的引用不是，也不应被认为是承认或任何形式的暗示现有技术形成任何国家的公知常识的一部分。

肌营养不良症(MD)是一组病症，特征为特定肌肉组织的进行性衰弱和消瘦(肌坏死)以及骨骼肌被纤维、骨或脂肪组织替代。肌营养不良症有几种不同的形式，影响男性或男性和女性，其中许多出现在婴儿期和儿童期，直到中年或更晚。其形式和严重程度随着发病年龄的不同而不同，尤其是较年轻的受试者经常经历急性进展性疾病。

最常见的MD形式有Duchene肌营养不良症(DMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、Becker肌营养不良症(BMD)、先天性肌营养不良症(CMD，包括Fukuyama型先天性MD和先天性MD伴肌球蛋白缺乏症)、面肩肱型、眼咽型、Emery-Dreifuss型和远端型肌营养不良症。几乎所有类型的MD都是由单基因突变引起的。

DMD和BMD涉及X染色体上的肌营养不良蛋白(dystrophin)基因缺陷。肌营养不良蛋白用于将肌细胞(肌节)和细胞骨架的收缩机制(肌动蛋白丝)与细胞外基质(ECM)连接，胶原蛋白在细胞外基质中传递肌力(Grounds MD，2008)。已知ECM在肌肉功能和肌肉再生中扮演着复杂的角色。营养不良的肌纤维与坏死、炎症和纤维化有关。由于肌营养不良蛋白缺乏导致进展性疾病的确切事件序列在分子水平上还不清楚。如Rosen等人(2015)中所概述，患有DMD的儿童具有肌营养不良蛋白缺陷的肌肉，并且易受由收缩引起的肌肉损伤的影响，这触发了免疫系统，其加剧了肌肉损伤。肌肉强度的持续恶化影响下肢，导致行动能力受损，还影响上肢，导致功能和自我护理能力的进一步丧失。虽然基因治疗和外显子跳跃方法将是理想的，但是研究人员也专注于了解疾病的性质，以便开发能够改善其严重性并延缓其进展的策略和药剂。mdx小鼠模型被广泛用于临床前研究机制和干预措施。根据GroundsMD(2008)，确定了一种针对慢性和急性期疾病的双级法的必要性。

DMD是一种破坏性疾病，主要影响男孩，发病率为约1:3,500活产婴儿。男孩子们在很小的时候就失去了行走的能力，在青春期之后就只能坐在轮椅上，而且常常是在生命的第三个十年中死于心肺功能衰竭。BMD与DMD相似但更温和。

目前使用皮质类固醇的治疗旨在通过减少炎症来减轻疾病的严重程度，从而在一段时间内保持肌肉质量和功能。皮质类固醇有急性抗炎效果，但可能是短期的，其作用机制尚不清楚。它们不是最理想的，因为副作用严重限制了它们的使用，而且它们还可能导致肌肉萎缩。0.75mg/kg/天的泼尼松龙和0.9mg/kg/天的地夫可特(Deflazacort)是用于能行走的DMD患者的标准疗法，但是当男孩子们不能行走时，关于皮质类固醇(CS)的益处没有共识，并且男孩子们可能继续治疗，有时当他们失去行走能力时，他们所使用的固定剂量是减少的mg/kg/天剂量，或者他们可能脱离CS治疗。Edasalonexent作为一种抗炎的NF-κB药物正在开发中，作为一种单一疗法用于患有DMD的年轻能行走的男孩。有几种药物正在进行临床试验，针对营养不良的不同方面。例如，针对纤维化的它莫昔芬(Tamoxifen)、针对呼吸功能的艾地苯醌(Idebenone)和针对终止密码子跳跃的Ataluren正在进行MD的临床试验。通过诱导肌营养不良蛋白基因外显子的定向跳跃来治疗DMD的寡核苷酸治疗已经被评估，结果好坏参半。Eteplirsen(一种吗啉代寡核苷酸)已经在13％的DMD儿童中进行了验证性研究，其中外显子51中的遗传终止密码子突变服从外显子51跳跃，而Drisapersen(一种用于外显子51跳跃的2'-O-甲基硫代磷酸寡核苷酸)未能获得活性和FDA批准。

国际公开号WO 2011/020874A1(Inserm)公开了高表达的CD49d和/或CD29的水平升高，以及与DMD受试者的疾病严重性相关。

皮质类固醇治疗通常与DMD中肢体性能的丧失(例如，PUL1或PUL2性能降低)相关。

目前的治疗方法存在缺陷，这促使迫切需要另外的治疗方法。

发明内容

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises或comprising)”的变化形式将被理解为意指包括所陈述的要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤，或要素、整体或步骤的组。

除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数形式“一种(a、an)”和“该(the)”包括复数方面。因此，例如，提及“一种组合物”包括单一组合物以及两种或更多种组合物；提及“一种药剂”包括一种药剂以及两种或更多种药剂；提及“本发明”包括本发明的单个和多个方面等。

在一个实施方案中，本发明实现了一种改进受试者的肌肉或肢体性能的方法。本文所提及的“改进(modifying)”肌肉或肢体性能包括改善肌肉或肢体性能和延缓或维持或稳定降低的肌肉或肢体性能的进展。在一个实施方案中，受试者患有或处于与肌肉萎缩、肌肉脂肪组织或假性肥大或肌营养不良症相关的病症的风险中。本发明以MD举例说明，然而本发明的实施方案延伸至与肌肉脂肪组织、肌肉萎缩或肥大相关的病症。在一个实施方案中，该方法包括在足以改进受试者的肌肉脂肪、肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的一种或多种标志物、体征或参数的条件下，向这类受试者定期施用药物组合物一段时间，该药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的针对CD49d(VLA-4的α4链)的抑制性寡核苷酸。在一个实施方案中，该方法包括在足以改善患有肌营养不良症的受试者的肌肉脂肪、肌肉或肢体性能或功能的条件下，向这类受试者定期施用药物组合物一段时间，该药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的针对CD49d(VLA-4的α4链)的抑制性寡核苷酸。

在一个实施方案中，寡核苷酸是RNA-DNA杂合体。

在一个实施方案中，其中寡核苷酸包含以下结构：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)寡核苷酸的19个核苷酸间键中的每一个都是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

d)自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；以及

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一个实施方案中，受试者患有肌营养不良症并且该方法改善了受试者中肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延缓肌营养不良症的进展(稳定)。

上肢性能(PUL)2.0或早期1.2评分是一种功能评分，旨在以反映影响日常生活的实际生活性能丧失并告知临床治疗选择的方式测量或评估受试者的近端至远端肌无力进展和肢体功能丧失。上肢功能测试是为不能行走的MD受试者设计的，但适用于能行走的受试者。下肢功能的等效测量遵循与经历下肢性能丧失的能行走的受试者相同的原则。

在一个实施方案中，受试者在治疗前具有升高的CD49d+T细胞水平。

如本文所确定的，与施用治疗之前的基线水平相比，向CD49d施用反义寡核苷酸导致MD受试者中CD49d+T细胞水平的持续降低。

在一个实施方案中，当抑制性寡核苷酸作为单一疗法或与皮质类固醇治疗联合施用时，治疗方法改善了肌肉或肢体性能或延缓(稳定)肌肉或肢体性能的下降。

在一个实施方案中，该方法改善了肌肉脂肪组织水平、肌肉性能或延缓(稳定)肌肉脂肪、肌肉性能的下降，其中肌肉脂肪或肌肉性能的一种或多种标志物、体征或参数包括患有与肌肉假性肥大、萎缩或营养不良相关的病症的受试者的强度、力量、耐力、长度。

在一个实施方案中，改进的或增强的/改善的性能是增强的或增加的进行如实施例中所述的偏心肌肉收缩(eccentric muscle contraction)的能力。

例如，这会影响安全步行下楼的能力。

实施例说明了在6周的给药方案中实施本发明的方法。本领域技术人员将理解，可以调整剂量方案以适应情况、受试者及其健康的偶然性。

根据本发明，本发明人已经表征了一群MD受试者，其对抑制性寡核苷酸治疗应答更多并且表现出改善或稳定的肌肉或肢体性能以及肌肉脂肪组织水平的改善。这些受试者的特征在于，通过如本文所述的给药完成而表现出改善的PUL2.0评分，以及在治疗过程期间或治疗过程结束时与对照水平如CD4+CD49d+T细胞水平相比，表现出给药后完成的CD4+CD49d+T细胞水平的反弹或稳定性(维持)。“反弹(rebound)”是指当仍然施用抑制性寡核苷酸时，在最后一次剂量或在最后一次剂量的大约一周内采集的血液中CD4+CD49d+T细胞的水平高于或超过对照水平，例如在给药结束前血液中CD4+CD49d+T细胞的水平。在一些实施方案中，任何反弹的存在或程度可以通过将CD49d+T细胞或其标志物(例如标记强度)的给药后完成反弹水平与指示应答者或非应答者状态的预定对照进行比较来确定。

在相关的实施方案中，本发明人已经表征了对抑制性寡核苷酸治疗没有最佳或不良应答的个体受试者群体，如以针对CD49d的反义寡核苷酸作为单一疗法或与低剂量皮质类固醇组合所例证的，由于用抑制性寡核苷酸治疗未显示出肌肉或四肢性能的改善。这些受试者的特征在于通过如本文所述的给药完成基本上未表现出改善的PUL2.0评分，或者未表现出CD4+CD49d+T细胞的水平的给药完成后反弹。“反弹(rebound)”是指当仍然施用抑制性寡核苷酸时，在最后一次剂量或在最后一次剂量的大约一周内采集的血液中CD4+CD49+T细胞的水平高于或超过对照水平，例如在给药结束前血液中CD49d+T细胞的水平。在一些实施方案中，任何反弹的存在或程度可以通过将CD49d+T细胞或其标志物(例如标记强度)的给药后完成反弹水平与指示应答者或非应答者状态的预定对照进行比较来确定。这些“无应答的”受试者的特征在于表现出在给药周期完成后CD4+CD49d+T细胞血液水平的降低，并且与响应于抑制性寡核苷酸治疗/在抑制性寡核苷酸治疗期间肢体性能的次优水平和/或肢体性能的丧失相关。

因此，在该方法的一个实施方案中，个体受试者中改进的肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的一种标志物是CD4+CD49d+T细胞的水平，其中CD4+CD49d+T细胞的血液水平的给药周期完成后反弹和/或稳定性(维持)与改善的和/或稳定的肢体性能相关，以及给药周期完成后CD4+CD49d+T细胞血液水平的降低与响应于抑制性寡核苷酸治疗/在抑制性寡核苷酸治疗期间肢体性能的次优水平和/或肢体性能的丧失相关。

在一个实施方案中，在患有DMD的患者中使用PUL评分或上肢性能的临床等效测度(clinically equivalent measure)来测量改善的肢体性能。

在该方法的一个实施方案中，CD4+CD49d+T细胞的水平在给药周期结束前和给药周期前一次给药的一周内测量。

在一个实施方案中，受试者由于MD而不能行走。

在一个实施方案中，受试者由于DMD而不能行走。

在一个实施方案中，其中受试者为青春期后的。

因此，在一个实施方案中，该方法还包括测量受试者中CD4+CD49d+T细胞的血液水平的给药完成后反弹和/或稳定性的存在或不存在，其中反弹和/或稳定性的存在与改善的肌肉和/或稳定的肢体性能相关，以及CD4+CD49d+细胞的血液水平的给药后降低与响应于反义寡核苷酸治疗的次优水平的肢体性能和/或丧失相关。

在一个实施方案中，抑制性寡核苷酸在以低剂量施用12至24周时降低DMD受试者中的CD4+CD49d+T细胞水平，并且如通过PUL2.0或临床上可接受的等效物所确定的，抑制性寡核苷酸改善和/或稳定在给药完成后在前一次给药的一周内CD4+CD49d+的血液水平反弹或稳定的受试者的肢体功能。

这些方法可用作治疗方法、筛选治疗剂的方法、确定受试者或群体对特定治疗或特定药剂、药剂组合或给药方案、或特定剂量或方案的治疗的应答性的方法中的步骤，对受试者或群体进行分级以优化剂量、药剂、药剂组合、给药周期等。

在一个实施方案中，本说明书实现了一种方法，该方法用于通过根据改善的PUL1/2评分显示改善的肌肉或肢体功能来评估受试者是否可能对用针对CD49d的反义寡核苷酸的治疗作出应答。

在一个实施方案中，本说明书实现了一种方法，该方法用于通过根据改善的PUL1/2评分显示改善的肌肉或肢体功能来评估受试者是否可能对用针对CD49d的反义寡核苷酸的单一疗法治疗作出应答。

在一个实施方案中，本说明书实现了一种方法，该方法用于通过根据改善的PUL1/2评分显示改善的肌肉或肢体功能来评估受试者是否可能对用针对CD49d的低反义寡核苷酸的单一疗法治疗作出应答。

在另一个实施方案中，本说明书实现了一种方法，该方法用于通过表现出改善的肌肉或肢体功能(通过改善的PUL1/2评分确定或等同于改善的PUL1/2评分)来评估受试者是否不太可能对用针对CD49d的反义寡核苷酸的治疗作出应答。

因此，在一个实施方案中，提供了一种治疗诊断方法，用于通过根据改善的PUL评分或临床等效评分显示改善的肌肉或肢体功能来评估个体受试者是否可能或不太可能对用针对CD49d的反义寡核苷酸的治疗作出应答。

该方法包括以下步骤：

(i)确定来自受试者的血液样品中CD4+CD49d+T细胞的水平；

(ii)施用一个疗程的反义寡核苷酸并且在接近给药周期结束时重复步骤(i)至少一次；

(iii)在给药完成的一周内重复步骤(i)；

(iv)处理结果以确定受试者是否在CD4+CD49d+T细胞水平上表现出或未表现出剂量完成后反弹、稳定性或损失。

在一个实施方案中，如果受试者显示剂量完成后降低，则调整反义寡核苷酸的疗程并重复该方法，或其中如果受试者显示剂量完成后反弹，则可重复相同的反义寡核苷酸疗程。

例如，在一个实施方案中，通过增加施用的抑制性寡核苷酸的剂量来调整疗程。

在一个调整的实施方案中，以约75-300mg/周的剂量施用抑制性寡核苷酸。

在一个实施方案中，抑制寡核苷酸以约25-50mg/周的低剂量给药或初始给药。

在一个实施方案中，其中给药或初始给药是单一疗法或联合标准或低剂量皮质类固醇治疗。

在一个实施方案中，方法还包括通过PUL或临床上可接受的等效物来评估基线和治疗终点、肌肉或肢体功能。

因此，在另一种表达中，本发明提供了如本文所述或要求保护的抑制性寡核苷酸或药物组合物，其用于或用于制造或制备药物或治疗诊断剂，该药物或治疗诊断剂用于本文所述或要求保护的治疗方法或治疗诊断方法。

在另一种表达中，本发明实现了本文所述或要求保护的抑制性寡核苷酸在制造或制备用于本文所述或要求保护的治疗方法或治疗诊断方法的药物的用途。

以上概述不是并且不应以任何方式被视为对本发明的所有实施方案的详尽叙述。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局在请求并支付必要费用后提供。

包含在说明书中并形成其一部分的附图示出了本发明的几个实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。

图1A和1B是示出试验和对照小鼠在基线和治疗6周内的握力强度(平均值和SEM)的数据的图示。

图2A和2B是示出在肌肉疲劳恢复中MDX高剂量反义药物治疗和其他MDX或对照治疗之间没有观察到差异的数据的图示。图2B中的每组四列从左到右示出了随时间的力量输出：MDX-盐水；MDX-非靶向寡核苷酸；MDX-高；和MDX-低。

图3是示出与野生型对照+/-SEM相比的偏心肌肉收缩的数据的图示。高剂量抑制性寡核苷酸治疗延缓了偏心收缩期间的肌肉损伤。

图4是示出与MDX-盐水治疗的小鼠相比的偏心肌肉收缩的数据的图示。与MDX对照组相比，高剂量抑制性寡核苷酸组显示了显著更高的力的生成能力和药物延缓的肌肉损伤。

图5是示出与MDX非靶向对照相比的偏心肌肉收缩的数据的图示。与相同剂量的非靶向阴性对照相比，高剂量的抑制性寡核苷酸特异性地延缓肌肉损伤并在偏心收缩后产生更大的肌力。

图6是示出在偏心肌肉收缩之后产生的力的数据的图示。虽然MDX对照产生的力比初始产生的力小约50％，但注射高剂量抑制性寡核苷酸的小鼠产生显著更大的力，即产生的初始力的约70％。

图7是显示WT和MDX-盐水、非靶向寡核苷酸和治疗的(高和低剂量)小鼠的血液中肌酸激酶水平的数据的图示。与野生型对照相比，在所有MDX小鼠中观察到显著的增加。

图8是数据的表格和图示，示出了对上肢性能相对于基线增强的治疗应答良好的受试者中的CD4+CD49d+T细胞反弹效应。类似地，T细胞数量损失的受试者通过PUL 2.0表现出上肢性能的损失。

序列表的关键字

SEQ ID NO:1人α4整联蛋白反义化合物(ATL1102)

SEQ ID NO:2鼠科动物α4整联蛋白反义化合物(ISIS348574)

SEQID NO:3：SEQ ID NO:2(ISIS 358342)的阴性对照

具体实施方式

本发明不限于药剂的特定筛选程序、药剂的特定制剂和各种医学方法，因为这些可以变化。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。与本文所述的那些类似或等同的任何材料和方法可用于实践或测试本发明。

专业人员具体针对以下中的定义和术语以及本领域技术人员已知的其他方法：约翰威立父子出版公司出版的Ausubel等人《精编分子生物学实验指南》增刊47(Currentprotocols in molecular biology，Supplement47，John wiley&Sons，NewYork，1999)；学术出版社出版的Colowick和Kaplan编著的《酶学方法》(Colowick and Kaplan,eds.,Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.)；布莱克韦尔科学出版物出版的Weir和Blackwell编著的《实验免疫学手册》I-IV卷(Weir and Blackwell,eds.,Handbook ofExperimental Immunology,Vols.I-IV,Blackwell Scientific Publications,1986)；《雷明顿药物科学》第18版(Remington's Pharmaceutical Sciences(18th ed.,Mack Easton,Pa.(1990))；Hogarth等人《自然通讯》(Nature Communications)8:14143,2017；Garton等人《美国人类遗传学杂志》(The American Journal of Human Genetics)102，845-857，2018。参考Pane等人发表于2018年6月20日的PLOS One(13(6)1-8)上文章，报告了一大批患有DMD的能行走和不能行走的男孩中使用上肢性能功能测试(PUL2.0)的修订版本的上肢性能的24个月变化，特别是结果部分。

术语“受试者(subject)”包括诊断患有MD的人类受试者或个体或临床研究模型动物。

术语“受试者”包括人或非人动物。

在一个实施方案中，本发明提供了治疗受试者的肌营养不良症的方法，其包括向人CD49d(VLA-4的α4链)施用抑制性寡核苷酸。

在一个实施方案中，示例性抑制性寡核苷酸包括分离的或合成的反义RNA或DNA、iRNA、siRNA或siDNA、miRNA、miRNA模拟物、shRNA或DNA和反义DNA或RNA或DNA:RNA杂交体。

在一个实施方案中，本发明提供了在有需要的受试者中改进肌肉性能的方法，该方法包括向受试者定期施用药物组合物，该药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的包括以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

在一个实施方案中，在足以改善受试者中肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延缓肌营养不良症的进展的条件下施用一段时间。

在一个实施方案中，在足以改善受试者的肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的一种或多种标志物、体征或参数的条件下施用一段时间。本文提及的肌肉性能包括运动性能，并且包括与肌肉萎缩或假性肥大或肌营养不良症相关的病症中的诸如强度、力量、耐力、长度的属性。

在一个实施方案中，本说明书实现了一种用于在患有与肌肉萎缩/假性肥大或营养不良相关的病状或处于与肌肉萎缩/假性肥大或营养不良相关的病状的风险的受试者中改善肌肉性能或延缓肌肉性能下降的方法，该方法包括定期向受试者施用包含药学上可接受的载体和治疗有效量的寡核苷酸的药物组合物。

在一个实施方案中，本说明书提供了一种在有需要的受试者中治疗或预防肌肉萎缩症或与肌肉萎缩/假性肥大或营养不良相关的病症的方法，该方法包括定期向受试者施用治疗有效量的针对人CD49d的抑制性寡核苷酸，以在患有肌营养不良或与肌萎缩、假性肥大或营养不良相关的病症的受试者或处于发展与肌萎缩、假性肥大或营养不良相关的病症的风险的受试者中改善肌肉性能(包括肌肉强度/力量和肢体功能中的一种或两种)、或延缓肌肉强度/力量和肢体功能中的一种或两种的衰退的进展。

在一个实施方案中，假性肥大、萎缩或营养不良是免疫介导的。在一个实施方案中，假性肥大、萎缩或营养不良是炎性介导的。在一个实施方案中，病症可以是神经性疾病或其他疾病。

在一个实施方案中，在足以改善肌肉脂肪或肌肉性能的一种或多种标志物、体征或参数，或延缓患有与假性肥大，萎缩或营养不良相关的病症的受试者的肌肉脂肪、肌肉性能(包括强度、力量、耐力、长度)的一种或多种标志物、体征或参数的进展或进展速率的条件下施用一段时间。

在一个实施方案中，肌肉脂肪、肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的改善在开始单一疗法或联合治疗的6至8周或6至12周内迅速发生。

在一个实施方案中，施用联合标准皮质类固醇治疗。

在一个实施方案中，皮质类固醇以低剂量施用。参考低剂量皮质类固醇包括标准剂量的2/3、1/2、1/4和1/3。在一个实施方案中，皮质类固醇以低剂量施用。参考低剂量皮质类固醇包括标准剂量的4/5、3/4、2/3、1/2、1/3、1/4和1/5。在另一个实施方案中，皮质类固醇剂量为10、20、30、40、50、60、70mg/kg/天口服泼尼松龙，或10、20、40、40、50、60、70或80mg地夫可特。

在一个实施方案中，抑制性寡核苷酸的施用在标准或低剂量皮质类固醇的存在下是治疗有效的。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的施用在不存在皮质类固醇的情况下是治疗有效的。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在不存在皮质类固醇的情况下是治疗有效的，并且其中受试者是能行走的。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的给药在不存在皮质类固醇的情况下是治疗有效的，并且其中受试者是不能行走的。

在一个实施方案中，本发明提供了用于改进肌肉性能的方法，该方法包括使肌肉细胞或组织与针对人CD49d(VLA-4的α4链)的抑制性寡核苷酸接触。

肌肉细胞或组织可以离体、局部或体内接触。

在一个实施方案中，接触是通过向有需要的受试者施用抑制性寡核苷酸以增加肌肉性能或延缓或降低肌营养不良症的进展速率。

在一个实施方案中，改进的肌肉性能包括增加的肌肉强度和/或增加的肌肉功能。

在一个实施方案中，增加的肌肉强度是增加的偏心收缩。偏心收缩是在伸长肌肉纤维时的收缩，其在行走和肢体的受控和无痛运动中是关键的。

在一个实施方案中，寡核苷酸是RNA-DNA杂合体。

在一个实施方案中，受试者由于MD而不能行走。

在一个实施方案中，其中受试者为青春期后的。

在一个实施方案中，该方法包括监测CD4+和/或CD8+T细胞水平。在一个实施方案中，该方法包括监测降低的CD4+和/或CD8+T细胞水平。在一个实施方案中，该方法包括监测M1巨噬细胞或HLADR⁺单核细胞。在一个实施方案中，该方法包括监测减少的M1巨噬细胞或HLADR+单核细胞。

在一个实施方案中，该方法包括测定一种或多种MD或营养不良的肌纤维标志物的水平或存在，包括免疫细胞或由此产生的免疫调节因子的水平或数量、炎性标志物的水平或纤维化标志物的水平或肌肉状态标志物的水平。

在一个实施方案中，MD或MD进展或营养不良的肌纤维的一种或多种标志物包括免疫细胞或由此产生的免疫调节因子的水平或数量、炎性标志物的水平或纤维化标志物的水平。

在一个实施方案中，肌肉性能的标志物或肌肉状态的标志物水平包括肌肉强度、力量、耐力和长度功能。

肌肉状态的标志物包括但不限于运动肌功能的标志物、指示肌肉纤维化或其不存在的标志物、指示肌肉退化或再生的标志物、心脏功能的标志物和肺功能的标志物。

在一个实施方案中，改善MD或营养不良的肌纤维的一种或多种体征包括改善肢体功能、身体肌肉功能、心脏和/或肺功能。

在一个实施方案中，该方法包括测定MD或营养不良的肌纤维的一种或多种体征的水平或存在。示例性的体征包括肢体功能、身体肌肉功能、心脏和肺功能。

在一个实施方案中，MD或营养不良肌纤维的一个或多个症状包括生活质量因素，诸如能量水平、幸福感、感觉到的步行舒适性、上肢功能活动等。

在一个实施方案中，有此需要的受试者包括具有MD的遗传和/或临床诊断以及相对低水平的营养不良的肌纤维和炎性标志物的受试者。

在一个实施方案中，受试者表现出正常或仅稍微升高的炎性细胞水平。炎性细胞包括T细胞(CD4、CD8)、B细胞(CD-19)、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。

在一个实施方案中，受试者表现出正常或仅稍微升高的CD49d细胞水平。

在一个实施方案中，受试者表现出正常或仅稍微升高的CD49d T细胞水平。

在一个实施方案中，受试者表现出正常或仅稍微升高的免疫细胞标志物如CD3、CD4、CD8、CD49d、CD29和HLA-DR水平。

标志物的合适方法包括细胞或蛋白质/核酸或脂质分析是本领域已知的，并且包括但不限于流式细胞计量术、微珠技术和基于ELISA的方法、层析和/或MS方法、基于杂交或测序的方法。

在另一个实施方案中，被诊断为患有MD的受试者表现出严重营养不良的肌纤维的显著升高或急性水平，伴随严重的肌肉坏死和炎症。

在一个实施方案中，受试者相对于正常健康对照表现出显著升高的CD49d T细胞水平。

在一个实施方案中，受试者中MD的形式选自Duchene肌营养不良症(DMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、Becker肌营养不良症(BMD)、先天性肌营养不良症(CMD，包括Fukuyama型先天性MD和先天性MD伴肌球蛋白缺乏症)、面肩肱型、眼咽型、Emery-Dreifuss型和远端型肌营养不良症。

在一个实施方案中，受试者有DMD或BMD并且是不能行走的。

在一个实施方案中，受试者患有DMD或BMD并且为青春期后的。

在本发明的另一种形式中，考虑了涉及的实施方案：当药物组合物用于目前所述的方法或用途时，本文描述的组合物在制备用于治疗或预防受试者肌营养不良症的药物中的用途，用于目前描述的方法的药物组合物。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了包括以下结构的寡核苷酸的用途：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体在制备用于治疗或预防受试者中与肌肉假性肥大或营养不良相关的病症或延缓假性肥大和/或肌肉营养不良的进展的药物中的用途。

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体在制备用于在有此需要的受试者中增强肌肉性能的药物中的用途。

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体在制备用于在有此需要的受试者中增强肌肉性能、维持肌肉性能或降低肌肉性能下降的速率的药物中的用途。

在一个实施方案中，增强的肌肉性能与在开始单一疗法或联合治疗的6至8周内肌肉性能或功能或肢体功能性能的改善有关。

在一个实施方案中，肌肉性能是肌肉功能或使用已知的肌肉功能估计器来测量。

在一个实施方案中，肌肉性能是肌肉强度或使用已知的肌肉强度估计器来测量。

在一个实施方案中，改进的或增强的性能是增强的或增加的进行如实施例中所述的偏心肌肉收缩的能力。

在另一个实施方案中，本说明书实现了包含以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体，其用于在受试者中治疗或预防肌营养不良症或延缓肌营养不良症的进展，其中所述进展延缓与在开始单一疗法或联合治疗的6至8周内肌肉性能或功能或肢体功能性能的改善相关。

在一个实施方案中，肌肉性能或功能或肢体功能性能的改善在开始单一疗法或联合治疗的6至8周内迅速发生。

在一个实施方案中，本发明实现了一种在有需要的受试者中治疗肌营养不良症的方法，该方法包括向受试者定期施用治疗有效量的针对人CD49d的抑制性寡核苷酸以改善肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延缓受试者中肌营养不良症的进展。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的施用联合标准或低剂量皮质类固醇治疗或是用标准或低剂量皮质类固醇治疗的辅助治疗。

在一个实施方案中，皮质类固醇以低剂量施用。

在一个实施方案中，反义寡核苷酸的施用在不存在皮质类固醇的情况下是有效的。

在另一个实施方案中，公开了针对人CD49d的抑制性寡核苷酸在制备药物中的用途，该药物用于在患有肌营养不良症的受试者中改善肌营养不良症的一种或多种标志、体征或症状或延缓肌营养不良症的进展。在一个实施方案中，肌肉性能或功能或肢体功能性能的改善在开始单一疗法或联合治疗的6至8周内迅速发生。

在一个实施方案中，提供了一种包含针对人CD49d的抑制性寡核苷酸的药物组合物，其用于治疗受试者的肌营养不良症或延缓肌营养不良症的进展。

如本文所测定的，治疗结束时(第24周)的CD4+CD49d+T细胞数量显示治疗后反弹(第28周)。这些观察结果与所有6例患者的改善-第24周对DMD中的PUL2的稳定化相关联。当第24周至第28周给药未显示CD4+CD49d+T细胞反弹时，这与所有2例患者DMD中PUL2的恶化相关联。

因此，在一个实施方案中，建议测试或分级受试者对本治疗的应答性或无应答性。使用例如RAPID或流式/芯片细胞计量术标志物的诊断性血液测试可用于简单地指示受试者是否是否对或能够对具有增强的肌肉性能或稳定或延迟的肌肉性能下降的反义寡核苷酸治疗作出应答。基于应答性测试的结果，例如可以改变剂量方案以增强治疗。治疗也可完全停止或停止一段时间。在一个实施方案中，在给药后没有CD49d T细胞反弹的情况下，施用后续改变剂量的抑制性寡核苷酸。例如，施用较高剂量的反义寡核苷酸。例如，在一个实施方案中，在给药后没有CD49d T细胞反弹的情况下，施用后续改变剂量的皮质类固醇。

在一个实施方案中，施用反义寡核苷酸至少6至10周，以观察对T细胞和肌肉性能的影响(例如，PUL2功能)。在停止给药后，存在CD49d+细胞的反弹，其与改善的肌肉性能正相关，这可以在停止给药的1周内或长达约4至约5周进行评估。在对具有改善的PUL评分的治疗没有反应的受试者中没有观察到反弹。

例如，当婴儿运动里程碑在18个月延迟时，通常在临床上诊断出DMD。肌肉无力的早期特征包括步态宽阔、脚趾行走、脊柱前凸过度、经常摔倒、肌肉肥大、如腓肠肌、三角肌、股四头肌、舌头咬肌、站起困难、手臂无力。DMD患者的行走能力丧失通常发生在7-13岁之间，而之后还能行走则是BMD的特征。心肺缺陷也可能是明显的。疲劳和言语发展也可能延迟。然而，没有观察到上部运动神经元信号或肌肉肌束震颤。

DMD的诊断可以通过肌营养不良蛋白免疫荧光检测和/或免疫印迹显示肌营养不良蛋白缺乏，并且临床表现与典型的DMD一致。或者，基因缺失检测为肌营养不良蛋白基因阳性(缺失一个或多个外显子)，其中阅读框可预测为“框外”，并且指示与典型DMD一致的临床图像。在一个实施方案中，完整的肌营养不良蛋白基因测序可以表现为点突变、重复或其他突变，其导致终止密码子突变可以明确地与DMD相关。通过上述同胞或母本大家属中所列标准之一证实的DMD阳性家族史也是有用的。还使用了DMD特征性临床症状或体征(例如，近端肌无力、Gowers征(Gowers'manoeuvre)、血清肌酸酐激酶水平升高)的评估。

MD或营养不良肌纤维/改善的肌肉功能的合适的改善的标志物、体征和症状是本领域技术人员已知的。

合适的测试包括在治疗期间随时间增加的运动、肌肉、心脏、血流、肺功能的测试。

在患有临床前心脏假性肥大的受试者中，可以基于血清生物标志物应答确定心脏疗效。这可以通过测定一个或多个标志物的水平来实现，如肌肉生长抑制素(myostatin)比率、心肌肌钙蛋白、心肌BNP等。也可以监测eGFR的变化。其他心脏功能可以通过遥测来评估，或者通过持续的移动遥测监测来评估节律异常。

进一步的测试包括测试肌肉氧合参数和线粒体表型。

减少的纤维化可以通过MRI评估。减少肌肉脂肪、减少心脏纤维化、增加收缩力、握力、改善心脏和肺功能测试。其他评估试图减慢上述功能的衰退速率。

生活质量调查表对于确定治疗效果非常有用。

临床结果可能包括，例如，确定标准化上肢可达表面积的百分比变化，通过MRI评估心脏周向应变的百分比变化，心脏侧壁和后壁应变的百分比变化。另一个有用的测试是测量用力肺活量、呼吸功能的延迟性丧失，例如通过肺活量测量从基线开始的FVC 5p的变化。

运动功能测试包括测定治疗前后4个标准爬楼梯试验的平均变化、从地面上升的时间、股外侧肌的脂肪部分的磁共振磁波谱均值变化、股四头肌肌能测试、膝伸肌峰力矩测量、前臂超声肌肉微血管供血。

重要的临床评估包括行走/跑步6或10米的时间、爬4层楼的时间、下4层楼的时间、从仰卧姿势站立的时间。还可以评估体重、身高、BMI的变化。

替代地或另外地，评估来自肌肉活检评估的生物标志物、通过ELISA或蛋白质组学测量的血浆生物标志物组中药效学标志物测量变化、或循环免疫细胞标志物的变化。

如本文所用，术语“反义化合物(antisense compound)”是指与编码VLA-4和/或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链(α4β1)的核酸分子杂交的寡聚化合物。人的α4整联蛋白链是CD49d。反义化合物可干扰CD49d、β1整联蛋白和/或β7整联蛋白的表达。

如本文所用，术语“编码α4整联蛋白的核酸分子”包括编码VLA-4或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链的DNA、从该DNA转录的RNA(包括前mRNA和mRNA或其部分)、以及衍生自该RNA的cDNA。

如本文所用，术语“VLA-4”是指α4整联蛋白和β1整联蛋白的异源二聚体。VLA-4在正常外周血B和T细胞、胸腺细胞、单核细胞和其他细胞以及造血干细胞和祖细胞中以显著水平表达。VLA-4在间充质和内皮祖细胞、间充质干细胞和潜在的内皮干细胞中也有表达。VLA-4的配体包括血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和CS-1、纤连蛋白的Hep II区内的交替剪接结构域。

如本文所用，术语“α4β7整联蛋白”是指α4整联蛋白和β7整联蛋白的异源二聚体。α4β7整联蛋白识别具有肠道向性的记忆T细胞亚群。α4β7整联蛋白也在肥大细胞、淋巴细胞和NK祖细胞的亚群上表达。α4β7整联蛋白在一些干细胞和祖细胞上表达。α4β7整联蛋白的配体包括MAdCam-1和VCAM-1。

核酸

本发明涵盖也称为核酸的各种寡核苷酸的用途。示例性核酸包括DNA(例如，互补DNA(cDNA)、基因组DNA(gDNA))、RNA(例如，信使RNA(mRNA)、短发夹RNA(shRNA)、iRNA、短抑制RNA(SiRNA)、核糖体RNA(rRNA)、tRNA、微小RNA、DNA或RNA类似物(例如，包含碱基类似物、糖类似物和/或非天然骨架等)、RNA/DNA杂交物和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些都可以是单链或双链形式。在一个实例中，分离核酸。如本文所用，术语“分离的核酸”是指通过人为干预从天然状态改变或除去的核酸。

术语“寡核苷酸”广泛地指短核酸分子。寡核苷酸容易以序列特异性方式与它们各自的互补寡核苷酸、DNA或RNA结合形成双链体。在一个实施方案中，寡核苷酸长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或更长。

在一个实施方案中，本发明的寡核苷酸是抑制性寡核苷酸。在一个实例中，术语“抑制性寡核苷酸”是指降低一种或多种蛋白质的产生、表达或生物活性的任何寡核苷酸。例如，抑制性寡核苷酸可干扰mRNA在核糖体中翻译为蛋白质。在另一个实例中，抑制性寡核苷酸可以与编码一种或多种蛋白的基因或mRNA充分互补，以结合(杂交)靶基因或mRNA，从而降低靶蛋白的表达或生物活性。在另一个实例中，抑制性寡核苷酸抑制不编码蛋白质的细胞内核酸的生物活性。例如，抑制性寡核苷酸可抑制非编码RNA的生物活性。

如本文所用，术语“反义”意指与编码序列互补并因此能够结合编码序列的核苷酸序列，编码序列可以是经历转录的DNA双螺旋链的核苷酸序列，或信使RNA分子的核苷酸序列。反义DNA是与双链DNA中的编码链互补的非编码链。

术语“短发夹RNA”或“shRNA”是指具有双链体区和环区的RNA结构。

术语小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类长度为约19-25个碱基对的双链或单链RNA分子。抑制或阻止翻译为特定蛋白质的siRNA由与术语siRNA偶联的蛋白质名称表示。通常，在各种实施方案中，siRNA是具有约19至约28个核苷酸(即，约19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸)的双链或单链核酸分子。“iRNA”是指含有RNA并且经由RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割的试剂。如本文所用，术语“双链RNA”或“dsRNA”包括iRNA，iRNA包括具有杂交双链区的RNA分子或分子复合物，该杂交双链区包含两条反平行且基本上互补的核酸链，其将被称为相对于靶RNA具有“有义”和“反义”取向。双链体区可以是允许通过RISC途径特异性降解所需靶RNA的任何长度，但通常长度范围为9-36个碱基对，例如长度为15-30个碱基对。考虑到9-36个碱基对的双链体，双链体可以是该范围内的任何长度，例如9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36以及其中在其间的任何子范围，包括但不限于15-30碱基对、15-26碱基对、15-23碱基对、15-22碱基对、15-21碱基对、15-20碱基对、15-19碱基对、15-18碱基对、15-17碱基对、18-30碱基对、18-26碱基对、18-23碱基对、18-22碱基对、18-21碱基对、18-20碱基对、19-30碱基对、19-26碱基对、19-23碱基对、19-22碱基对、19-21碱基对、19-20碱基对、20-30碱基对、20-26碱基对、20-25碱基对、20-24碱基对、20-23碱基对、20-22碱基对、20-21碱基对、21-30碱基对、21-26碱基对、21-25碱基对、21-24碱基对、21-23碱基对、或21-22个碱基对。通过用Dicer和类似的酶处理在细胞中产生的dsRNA的长度通常在19-22个碱基对的范围内。dsDNA双链体区域的一条链包含与靶RNA区域基本互补的序列。形成双链体结构的两条链可以来自具有至少一个自身互补区的单个RNA分子，或者可以由两个或多个单独的RNA分子形成。当双链体区由单个分子的两条链形成时，该分子可以具有在一条链的3'端和形成双链体结构的相应的另一条链的5'端之间由单链核苷酸(本文中称为“发夹环”)分开的双链体区域。发夹环可包含至少一个未配对的核苷酸；在一些实施方案中，发夹环可包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸。当dsRNA的两条基本上互补的链由分开的RNA分子组成时，这些分子不需要，但可以共价连接。当两条链通过发夹环以外的方式共价连接时，连接结构称为“接头”。术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的dsRNA。本领域技术人员将认识到，术语“RNA分子”或“核糖核酸分子”不仅包括在自然界中表达或发现的RNA分子，而且包括如本文所述或本领域已知的包含一个或多个核糖核苷酸/核糖核苷类似物或衍生物的RNA的类似物和衍生物。严格地说，“核糖核苷”包括核苷碱基和核糖，且“核糖核苷”是具有一个、两个或三个磷酸部分的核糖核苷。然而，本文所用的术语“核糖核苷(ribonucleoside)”和“核糖核苷酸(ribonucleotide)”可以认为是等同的。例如，如下文所述，RNA可以在核碱基结构或核糖-磷酸主链结构中被修饰。然而，包含核糖核苷类似物或衍生物的分子必须保持形成双链体的能力。作为非限制性实例，RNA分子还可以包括至少一种修饰的核糖核苷，包括但不限于2'-O-甲基修饰的核苷、包含5'硫代磷酸酯基团的核苷、与胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团连接的末端核苷、锁定核苷、脱碱基核苷(abasic nucleoside)、2'-脱氧-2'-氟修饰核苷、2'-氨基修饰核苷、2'-烷基修饰核苷、吗啉代核苷、氨基磷酸酯或包含核苷的非天然碱基、或其任何组合。或者，RNA分子可以包含至少两个修饰的核糖核苷，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多，直至dsRNA分子的全长。对于RNA分子中的多种修饰的核糖核苷中的每一种，修饰不需要相同。在一个实施方案中，预期用于本文所述的方法和组合物中的经修饰的RNA是肽核酸(PNA)，其具有形成所需双链体结构的能力并且允许或介导靶RNA经由RISC途径的特异性降解。

术语“微小RNA”(缩写为miRNA)是在植物、动物和一些病毒中发现的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中起作用。前缀“miR”后面跟有破折号和数字，后者通常指示命名顺序。除一个或两个核苷酸外具有几乎相同序列的不同miRNA用附加小写字母标注。许多miRNA是本领域已知的(miRBase V.21命名法；参见Kozomara等人2013；Griffiths-Jones，S.2004)。这些miRNA的序列是本领域熟知的，并且可以在例如万维网mirbase.org上找到。

在一个实施方案中，“抑制性寡核苷酸”模拟一种或多种miRNA的活性。如本文所用，术语“miRNA模拟物”是指当引入细胞中时被设计成模拟内源性成熟miRNA分子的小的双链RNA分子。miRNA模拟物可以从各种供应商获得，例如Sigma Aldrich和Thermo FisherScientific。

在一个实施方案中，“抑制性寡核苷酸”抑制一种或多种miRNA的活性。各种miRNA种类适于此目的。实例包括但不限于拮抗剂、干扰RNA、核酶、miRNA海绵(miRNA sponge)和miR-屏障(miR-mask)。术语“拮抗剂(antagomir)”在本发明的上下文中用于指化学修饰的反义寡核苷酸，其结合靶miRNA并通过阻止miRNA与其同源基因靶标结合来抑制miRNA功能。拮抗剂可以包括本领域已知的任何碱基修饰。在一个实例中，以上引用的miRNA种类的长度是约10至50个核苷酸。例如，拮抗剂可具有长度为分10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的反义部分。

在一个实施方案中，miRNA种类是含两个或更多个化学上不同的区域的嵌合寡核苷酸，每个区域由至少一个核苷酸组成。这些寡核苷酸通常含有至少一个修饰核苷酸的区域和作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物的区域，修饰核苷酸赋予一种或多种有益性质(例如，核酸酶抗性增加、细胞摄取增加、对靶标的结合亲和力增加)。

在一个实施方案中，本发明所涵盖的核酸是合成的。术语“合成核酸”意指核酸不具有天然存在的核酸的化学结构或序列。合成的核苷酸包括工程化的核酸分子。在另一个实例中，也可以将核酸结构修饰成锁核酸(LNA)，其在2'氧和4'碳之间具有亚甲基桥，以将核糖锁定在核酸的A-型构象中的3'-内(N)构象(Lennox等人2011；Bader等人2011)。在miRNA的情况下，这种修饰可以显著增加分子的靶特异性和杂交性质。

可根据需要使用常规方法设计用于本文公开的方法的核酸。例如，在抑制性寡核苷酸的上下文中，长度为5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸的靶标片段被认为适于靶向基因，靶片段包括种子序列内或与其紧邻的至少五(5)个连续核苷酸的一段序列。示例性的靶片段可以包括包括至少5个连续核苷酸的序列，5个连续核苷酸来自种子序列之一的5'末端(剩余的核苷酸是同一RNA的连续片段，从紧邻种子序列的5'末端的上游开始，并持续至核酸含有约5至约30个核苷酸)。在另一个实例中，靶片段由RNA序列表示，RNA序列包括从种子序列之一的3'末端开始的至少5个连续核苷酸(剩余的核苷酸是同一RNA的连续片段，从紧邻靶片段的3'末端的下游开始，并且持续至核酸含有约5个至约30个核苷酸)。术语“种子序列”在本发明的上下文中用于指miRNA(即，种子序列)的5-端的第一个8nt内的6-8个核苷酸(nt)长的子串，其是靶标特异性的重要决定因素。一旦鉴定了一个或多个靶区域、片段或位点，选择与靶标充分互补的抑制性核酸化合物，即充分良好杂交并具有充分特异性的抑制性核酸化合物(即基本上不与其他非靶核酸序列结合)，以产生所需效果。

α4整联蛋白的反义化合物

在一个实施方案中，本发明的方法依赖于使用α4整联蛋白的反义化合物。这样的反义化合物靶向编码VLA-4(α4β1)或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链的核酸。在一个实施方案中，反义化合物是寡核苷酸。然而，考虑了其他寡聚反义化合物，包括但不限于寡核苷酸模拟物。

反义化合物与其靶核酸的杂交通常称为“反义”。反义化合物与其靶核酸的杂交抑制靶核酸的功能。这样的“反义抑制”通常基于反义化合物与靶核酸的基于氢键键合的杂交，使得靶核酸被切割、降解或以其他方式变得不可操作。被干扰的靶DNA的功能可以包括复制和转录。例如，复制和转录可以来自内源细胞模板、载体(vector)、质粒构建体或其他。被干扰的RNA的功能可以包括以下功能，如将RNA易位到蛋白质翻译的位点，将RNA易位到细胞内远离RNA合成位点的位点，从RNA翻译蛋白质，剪接RNA以产生一种或多种RNA种类，以及RNA参与或促进的与RNA有关的催化活性或复合物的形成。

如本文所用，“杂交”是指寡核苷酸和靶核酸的互补碱基的配对。碱基配对通常涉及互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的氢键，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡格斯汀(Hoogsteen)或反向胡格斯汀(Hoogsteen)氢键。鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)是通过形成3个氢键配对的互补核碱基的实例。腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)是通过形成2个氢键配对的互补核碱基的实例。杂交可在各种情况下发生。

“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这类杂环碱基的两个最常见类别是嘌呤和嘧啶。“核苷酸”是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接至糖的2'羟基部分、3'羟基部分或5'羟基部分。

“可特异性杂交的”和“互补的”是用于指示足够程度的互补性使得在反义化合物和靶核酸之间发生稳定和特异性结合的术语。应理解反义化合物不必与其待特异性杂交的靶核酸序列100％互补。当反义化合物与靶核酸的结合干扰靶分子的正常功能以引起活性丧失时，反义化合物是可特异性杂交的，并且在需要特异性结合的条件下，例如在治疗性处理的生理条件下，存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶序列的非特异性结合。

如本文所用，“互补”是指反义化合物的核碱基与靶核酸之间精确配对的能力。例如，如果反义化合物的某个位置的核碱基能够与靶核酸的某个位置的核碱基氢键键合，则认为反义化合物与靶核酸之间的氢键键合的位置是互补位置。反义化合物可以在一个或多个片段上杂交，使得插入或相邻片段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。在一个实施方案中，反义化合物包括与靶核酸内的靶区域至少70％的序列互补性。

例如，其中20个核碱基中的18个与靶核酸内的靶区域互补，并且因此将特异性杂交的反义化合物将代表90％互补性。在该实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补核碱基成簇或散布，并且不需要彼此相邻或与互补核碱基相邻。因此，长度为18个核碱基，具有4个非互补核碱基，侧接与靶核酸完全互补的2个区域的反义化合物将与靶核酸具有77.8％的总体互补性，因此将落入本发明的范围内。可以使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序常规地确定反义化合物与靶核酸区域的互补性百分比(Altschul等人，1990；Zhang和Madden，1997)。

反义寡核苷酸

本发明提供了用于抑制α4整联蛋白和/或VLA-4和/或α4β7整联蛋白表达的反义寡核苷酸。这样的反义寡核苷酸靶向编码VLA-4或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链的核酸。

如本文所用，术语“抑制”是指VLA-4或α4β7整联蛋白表达的任何可测量的降低(例如，10％、20％、50％、90％或100％)。术语“抑制性核苷酸”在本文中表示如本文所述的寡核苷酸，其诱导VLA-4或α4β7整联蛋白表达的任何可测量的降低(例如，10％、20％、50％、90％或100％)。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指RNA或DNA或其模拟物、嵌合体、类似物和同系物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然存在的核碱基、糖和共价核苷(骨架)键组成的寡核苷酸，以及具有类似功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。这种修饰的或取代的寡核苷酸通常优于天然形式，因为其具有所需的性质，例如增强的细胞摄取、增强的对靶核酸的亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。

寡核苷酸可以含有手性(不对称)中心，或者分子作为整体可以是手性的。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)和这些的混合物在本发明的范围内。关于包含手性硫代磷酸酯键的反义寡核苷酸的公开，可参考Wan等人，《核酸研究》(Nucleic AcidsResearch)42(22：13456-13468，2014)。关于ASO的一般描述，可参考Scoles等人，2019年4月版《反义寡核苷酸神经遗传学》(Antisesne Oligonucleotides Neurology GeneticsApril 2019；5(2)DOI:doi.org/10.1212/NXG.000000000000032)。

在形成寡核苷酸时，磷酸基团彼此共价连接相邻的核苷以形成线性聚合化合物。依次地，该线性聚合化合物的相应末端可以进一步接合以形成环状化合物；然而，通常优选直链化合物。此外，线性化合物可以具有内部核碱基互补性，并且因此可以以产生完全或部分双链的化合物的方式折叠。对于寡核苷酸，磷酸基团通常指的是形成寡核苷酸的核苷间骨架。RNA和DNA的正常键或骨架是3'至5'磷酸二酯键。

本发明的反义寡核苷酸包括例如核酶、siRNA、外部指导序列(EGS)寡核苷酸、替代剪接器、引物、探针、以及与靶核酸的至少一部分杂交的其他寡核苷酸。本发明的反义寡核苷酸可以以单链、双链、环状或发夹的形式施用，并且可以含有结构元件，例如内部或末端隆起或环。一旦施用，反义寡核苷酸可以引起一种或多种酶或结构蛋白的作用以实现靶核酸的修饰。

这种酶的一个非限制性实例是RNAse H，一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。本领域已知“DNA样(DNA-like)”的单链反义化合物引起RNAse H。因此，RNaseH的激活导致RNA靶标的切割，从而大大提高了寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。对于其他核糖核酸酶，例如RNase III和核糖核酸酶L家族的酶，已经假设了类似的作用。

双链RNA(dsRNA)分子的引入，已经被证明可以诱导基因或其相关基因产物的功能的有效和特异性的反义介导的降低。这种现象发生在植物和动物中，并被认为与病毒防御和转座子沉默具有进化关系。

dsRNA可以在动物中导致基因沉默的第一个证据来自1995年在线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的工作中(Guo和Kempheus，1995)。Montgomery等人(1998)已经显示dsRNA的主要干扰作用是转录后的。在秀丽隐杆线虫中定义的由暴露于双链RNA(dsRNA)引起的转录后反义机制自此被称为RNA干扰(RNAi)。该术语已经被概括为意指反义介导的基因沉默，其涉及dsRNA的引入，导致内源靶mRNA水平的序列特异性降低(Fire等人，1998)。最近，已经显示事实上是dsRNA的反义极性的单链RNA寡聚物，它是RNAi的有效诱导剂(Tijsterman等人，2002)。

本领域普通技术人员无需过多实验即可鉴定可用于本发明方法的反义寡核苷酸。

修饰的核苷间键(internucleoside linkage)(骨架)

本发明的反义化合物包括具有修饰的骨架或非天然核苷间键的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的寡核苷酸和在骨架中不具有磷原子的寡核苷酸。

其中含有磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸盐、氨基磷酸酯，包括3'-氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代膦酸酯、具有正常3'-5'键硼代膦酸酯、2'-5'键类似物的硼代膦酸酯以及具有反转极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'键、5'至5'或2'至2'键。具有反转极性的寡核苷酸在最靠近3'端的核苷酸间键包括单一的3'至3'键，即单个反转的核苷残基，其可能是碱性的(核碱基缺失或在其位置具有羟基)。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。

教导制备上述含磷键的代表性美国专利包括但不限于US 3,687,808、US 4,469,863、US 4,476,301、US 5,023,243、US 5,177,196、US 5,188,897、US 5,264,423、US 5,276,019、US 5,278,302、US 5,286,717、US 5,321,131、US 5,399,676、US 5,405,939、US5,453,496、US 5,455,233、US 5,466,677、US 5,476,925、US 5,519,126、US 5,536,821、US5,541,306、US 5,550,111、US 5,563,253、US 5,571,799、US 5,587,361、US 5,194,599、US5,565,555、US 5,527,899、US 5,721,218、US 5,672,697和US 5,625,050。

其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架包括例如由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基(methylene formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；核糖乙酰基骨架；含骨架的烯烃；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的那些；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他。

教导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括，但不限于，US 5,034,506、US 5,166,315、US 5,185,444、US 5,214,134、US 5,216,141、US 5,235,033、US 5,264,562、US5,264,564、US 5,405,938、US 5,434,257、US 5,466,677、US 5,470,967、US 5,489,677、US5,541,307、US 5,561,225、US 5,596,086、US 5,602,240、US 5,610,289、US 5,602,240、US5,608,046、US 5,610,289、US 5,618,704、US 5,623,070、US 5,663,312、US 5,633,360、US5,677,437、US 5,792,608、US 5,646,269和US 5,677,439。

在磷酰二胺吗啉代(PMO)中，寡核苷酸骨架中的磷酸二酯(PO)键被非离子磷酰二胺键代替，导致对PO的抗性。其他ASO类型具有PS修饰，其导致对广谱核酸酶的抗性，支持RNase H活性并增加蛋白质结合，这也改善了组织摄取。吗啉代是对核糖具有独特修饰的aldo寡核苷酸，其导致更大的靶亲和力并促进核酸酶回避。

硫代磷酸酯(PS)ASO通常相对于手性PS中心是立体无规的，每个手性PS中心具有2个不同的立体化学构型，使得具有19个键的20mer ASO可能有两种立体异构形式(Rp和Sp)。在一个实施方案中，寡核苷酸是Rp立体异构形式。在一个实施方案中，寡核苷酸是Sp类固醇。

修饰的糖和核苷间键

本发明的反义化合物包括寡核苷酸模拟物，其中核苷酸单元的糖和核苷间键(即，骨架)均被新基团取代。保持核碱基单元用于与靶核酸杂交。

已显示具有优良杂交性质的寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架替代。核碱基被保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于US 5,539,082、US 5,714,331和US 5,719,262。PNA化合物的进一步教导可见于Nielsen等人，1991。

本发明的反义化合物还包括具有硫代磷酸骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷酸，例如US5,489,677的-CH2-NH-O-CH2-，-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲亚氨基)或MMI骨架]，-CH2-O-N(CH3)-CH2-,-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-[其中，天然磷酸二酯骨架表示为-O-P-O-CH2-]以及US 5,602,240的酰胺骨架。

本发明的反义化合物还包括具有US 5,034,506的吗啉代骨架结构的寡核苷酸。

改性糖

本发明的反义化合物包括具有一个或多个取代的糖部分的寡核苷酸。

实例包括在2'位置包括以下之一的寡核苷酸：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。

在一个实施方案中，寡核苷酸在2'位置包括以下之一：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。

修饰的寡核苷酸的进一步实例包括在2'位置包括以下之一的寡核苷酸：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团、或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团、和具有类似性质的其他取代基。

在一个实施方案中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3(也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等人，1995)，即烷氧基烷氧基。在另一个实施方案中，修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团(也称为2'-DMAOE)，或2'-二甲基氨基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2'-DMAEOE)，即，2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。

其他修饰包括2'-甲氧基(2'-O-CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-烯丙基(2'-CH2-CH＝CH2)、2'-O-烯丙基(2'-O-CH2-CH＝CH2)和2'-氟(2'-F)。2'修饰可以在阿拉伯糖(上)位或核糖(下)位。在一个实施方案中，2'-阿拉伯糖修饰是2'-F。

也可以在寡核苷酸上的其他位置进行类似的修饰，特别是在3'末端核苷酸上的糖的3'位置或在2'-5'连接的寡核苷酸中的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。

寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如环丁基部分代替呋喃戊糖。

教导制备这种修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于US 4,981,957、US5,118,800、US 5,319,080、US 5,359,044、US 5,393,878、US 5,446,137、US 5,466,786、US5,514,785、US 5,519,134、US 5,567,811、US 5,576,427、US 5,591,722、US 5,597,909、US5,610,300、US 5,627,053、US 5,639,873、US 5,646,265、US 5,658,873、US 5,670,633、US5,792,747和US 5,700,920。

糖的进一步修饰包括锁核酸(Locked Nucleic Acids，LNA)，其中2'-羟基与糖环的3'或4'碳原子连接，从而形成双环糖部分。在一个实施方案中，键是桥接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)n基团，其中n是1或2。LNA及其制备描述于WO 98/39352和WO 99/14226中。

天然和修饰的核碱基

本发明包括具有核碱基修饰或取代的寡核苷酸。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-CC-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶、嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。

进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，例如吩恶嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)，G型夹(G-clamps)，例如：取代的吩恶嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并恶嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并[3',2':4,5]吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。

修饰的核碱基还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。其他核碱基包括US 3,687,808中公开的那些；约翰·威利父子出版公司出版的J.I.Kroschwitz编著的《聚合物科学和工程的简要百科全书》858-859页(The Concise Encyclopedia of Polymer Science andEngineering，pages 858-859，John Wiley and Sons(1990))中公开的那些；Englisch等人(1991)公开的那些；以及CRC出版社出版的S.T.Crooke和B.Lebleu编著、Y.S.Sanghvi的《第15章：反义研究与应用》289-302页(Chapter 15:Antisense Research and Applications,pages 289-302,S.T.Crooke,B.Lebleu(editors),CRC Press,1993)中公开的那些。

这些核碱基中的某些对于增加寡核苷酸的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃。在一个实施方案中，这些核碱基取代与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合。

教导制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于US 3,687,808、US 4,845,205、US 5,130,302、US 5,134,066、US 5,175,273、US5,367,066、US 5,432,272、US 5,457,187、US 5,459,255、US 5,484,908、US 5,502,177、US5,525,711、US 5,552,540、US 5,587,469、US 5,594,121、US 5,596,091、US 5,614,617、US5,645,985、US 5,830,653、US 5,763,588、US 6,005,096、US 5,681,941和US 5,750,692。

缀合物

本发明的寡核苷酸化合物可以缀合至增强反义化合物的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或基团。

这些部分或基团可以共价键合至官能团如伯羟基或仲羟基。

示例性的部分或基团包括嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团和增强低聚物的药代动力学性质的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、若丹明、香豆素和染料。

增强药效学性质的部分或基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的那些。

增强药代动力学性质的部分或基团包括改善本发明的化合物的吸收、分布、代谢或排泄的那些。代表性的部分或基团公开于PCT/US92/09196和US 6,287,860中。部分或基团包括但不限于脂质部分例如胆固醇部分、胆酸、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫代胆固醇、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯、聚胺或聚乙二醇链、或金刚烷乙酸、棕榈基部分、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧基胆固醇部分。

嵌合化合物

如本领域技术人员将理解的，不必对给定化合物中的所有位置均一地修饰，并且实际上，可将上述修饰中的多于一种掺入单个寡核苷酸中或甚至掺入寡核苷酸内的单个核苷处。

本发明的化合物包括嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”含有两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元组成，即在寡核苷酸化合物的情况下是核苷酸。这些寡核苷酸通常含至少一个区域，其中寡核苷酸被修饰以增强对核酸酶降解的抵抗力、增加细胞摄取、增加稳定性和/或增加与靶核酸的结合亲和力。寡核苷酸的额外区域可用作能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。例如，RNAse H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞核酸内切酶。因此，RNase H的激活导致RNA靶标的切割，从而大大提高了寡核苷酸介导的基因表达抑制的效率。RNA:RNA杂合体的切割可以以类似的方式通过内切核糖核酸酶如切割细胞和病毒RNA的RNAseL的作用完成。RNA靶标的切割可通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关的核酸杂交技术常规检测。

本发明的嵌合反义化合物可以形成为两种或更多种寡核苷酸、修饰的寡核苷酸和/或寡核苷酸模拟物的复合结构。这样的化合物在本领域中也被称为杂合体或gapmer。教导制备这种杂化结构的代表性美国专利包括但不限于US 5,013,830、US 5,149,797、US 5,220,007、US 5,256,775、US 5,366,878、US 5,403,711、US 5,491,133、US 5,565,350、US5,623,065、US 5,652,355、US 5,652,356和US 5,700,922。

示例性寡核苷酸

本领域已知的示例性反义平台包括但不限于吗啉代、第1基因寡核苷酸(1genoligos)、第2基因寡核苷酸(2^nd gen oligo’s)、gapmer、siRNA、LNA、BNA或寡核苷酸模拟物样肽核酸。寡核苷酸可以是裸露的或配制在脂质体中。寡核苷酸可以连接到细胞的传递方式，也可以不连接。寡核苷酸可以使用或不使用核内体释放剂。

在一个实施方案中，反义化合物是第二代硫代磷酸骨架2'-MOE修饰的嵌合寡核苷酸gapmer，其设计用于与VLA-4mRNA的3'-非翻译区杂交。在一个实施方案中，寡核苷酸通过与编码CD49的RNA杂交选择性地抑制原代人细胞和几种人细胞系中的VLA-4表达，其是VLA-4和α4β7整联蛋白的α4整联蛋白亚基。

在一个实施方案中，寡核苷酸是3'→5'硫代磷酸酯寡核苷酸20mer的19-钠盐，也称为3-9-8MOE gapmer，分子量为7230道尔顿，其中位于5'端1-3位的核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'MOE)修饰的核糖核苷(2'-O-(2-甲氧基乙基核糖)；5'端4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷，其中所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶；自5'端起13-20位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷。

在一个实施方案中，寡核苷酸的序列是(SEQ ID NO：1)：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

寡核苷酸的经验式为：

C₂₃₃H₃₂₇N₆₀O₁₂₉P₁₉S₁₉Na₁₉。

先前已显示反义寡核苷酸ATL1102在中枢神经系统病症MS中有效且剂量显著高于本文所提出的剂量(Limmroth等人)。针对VLA-4的CD49dα链的反义寡核苷酸选择性抑制免疫细胞中的VLA-4的能力防止了显著的安全性事件，例如PML，其特征在于施用了VLA-4的抗体和小分子抑制剂，它们是影响表达VLA-4的所有细胞的泛性VLA-4抑制剂。

在一个实施方案中，所有尿嘧啶均为5-甲基尿嘧啶(MeU)。通常，使用2-甲氧基乙基修饰的胸苷而不是5-甲基尿嘧啶来合成寡核苷酸。

在一个实施方案中，所有嘧啶均为C5甲基化的(即，U、T、C是C5甲基化的)。

在一个实施方案中，寡核苷酸的序列可以通过接受的寡核苷酸命名法命名，显示每个O-O连接的硫代磷酸酯核苷酸间键：

2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基鸟苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-脱氧腺苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-脱氧鸟苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-脱氧鸟苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5’O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-胸苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-甲氧基乙基-5-甲基胞苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-甲氧基乙基-5-甲基胞苷酰基-(3'→5’O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-腺苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞嘧啶、(3'→5'O,O-硫代磷酰基)-2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷酰基-19钠盐。

寡核苷酸可以通过多步法合成，多步法可以分为两个不同的操作：固相合成和下游处理。在第一操作中，通过计算机控制的固相合成器组装寡核苷酸的核苷酸序列。随后的下游处理包括脱保护步骤，制备反相色谱纯化、分离和干燥以得到寡核苷酸药物物质。寡核苷酸的化学合成利用亚磷酰胺偶联化学，随后氧化硫化，并且涉及活化的单体与延伸的低聚物的顺序偶联，延伸的低聚物的3'-末端共价连接至固相支持体。

脱三苯甲基化(反应a)－固相合成的每个循环开始于除去支持物结合的寡核苷酸的5'末端核苷的酸不稳定的5'-O-4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护基。这通过用酸溶液(例如在甲苯中的二氯乙酸(DCA))处理来完成。在脱三苯甲基化之后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

偶联(反应b)－链延长是通过在活化剂(例如，1H-四唑)存在下，载体结合的寡核苷酸的5'-羟基与对应于该特定碱基位置的亚磷酰胺溶液(例如，对于碱基2：MOE-MeC酰胺)反应来实现的。这导致在引入的核苷酸合成子和载体结合的寡核苷酸链之间形成亚磷酸三酯键。偶联反应后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

硫化(反应c)－通过硫转移试剂(例如苯乙酰二硫化物)的溶液处理，将新形成的亚磷酸三酯键转化为相应的[O,O,O)-三烷基硫代磷酸三酯。硫化后，通过用乙腈洗涤以从载体去除过量试剂以准备下一反应。

加帽(反应d)－在任何给定的循环中可获得的小比例的5'-羟基未能延伸。这些基团在任何后续循环中的偶联将导致形成难以与所需产物分离的与过程相关的杂质(“有DMT(n-l)-单体单元(DMT-on(n-l)-mers)”)。为了防止这些杂质的形成并且为了促进纯化，将“加帽剂(capping reagent)”(例如，乙酸酐和N-甲基咪唑/乙腈/吡啶)引入反应器容器中以得到加帽序列。通过反相HPLC纯化从所需产物中分离得到的故障序列(“无DMT短单体单元(DMT-off shortmers)”)。在加帽反应之后，在下一反应的制备中通过用乙腈洗涤从载体除去过量的试剂。

使用适当的被保护的核苷亚磷酰胺重复这个基本的四步循环可以组装整个被保护的寡核苷酸序列。

骨架脱保护(反应e)－在该过程的组装部分完成后，通过用三乙胺(TEA)在乙腈中的溶液处理除去保护(O,O,O)-三烷基硫代磷酸三酯核苷酸间键的氰乙基。通过用乙腈洗涤柱除去在该步骤过程中产生的试剂和丙烯腈。

从载体上的切割和碱基脱保护(反应f)－通过与氢氧化铵水溶液孵育实现环外氨基的脱保护和粗产物从载体上的切割(反应f)。通过反相HPLC纯化粗产物，得到5'-O-DMT保护的产物。反相HPLC步骤除去DMT-off故障序列。通过UV吸收光谱监测洗脱曲线。收集并分析含有DMT-on寡核苷酸产物的级分。

酸性脱保护(反应g)－收集含有5'-O-DMT保护的寡核苷酸的反相HPLC级分并转移至沉淀槽。在该方法的这一阶段合并从几种合成的纯化获得的产物。用酸(例如，乙酸)处理纯化的DMT-on寡核苷酸以除去连接在5'端的DMT基团。在酸暴露规定时间和中和后，分离并干燥寡核苷酸药物物质。

在最后的酸性脱保护步骤之后，通过加入氢氧化钠水溶液中和溶液，并通过加入乙醇从溶液中沉淀寡核苷酸药物物质。使沉淀的物质沉降在反应容器底部，倾析乙醇上清液。将沉淀的物质再溶解在纯水中，并将溶液pH调节至pH 7.2-7.3。重复沉淀步骤。将沉淀的物质溶于水中并将溶液通过0.45微米过滤器过滤并转移到一次性聚丙烯盘中，然后将其装入冻干器中。将溶液冷却至-50℃。一次干燥在25℃下进行37小时。将温度升至30℃，进行二次干燥步骤5.5小时。冻干过程完成后，将药物转移到高密度聚乙烯瓶中并储存在-200℃。

合适的靶向CD49d/VLA-4的其他反义化合物描述于转让给Isis Pharmaceuticals公司的美国专利6,258,790和转让给Antisense Therapeutics有限公司的US2009/0029931中，其全文以引用方式并入本文。靶向ITGA4基因转录物以修饰ITGA4基因中前mRNA剪接的其他反义寡聚体公开于例如Murdoch大学的国际申请PCT/AU2016/000158中，其通过引用整体并入本文。

靶核酸

“靶向”反义化合物至特定核酸可以是多步骤过程。该过程通常从鉴定将要调节其功能的靶核酸开始。在本发明内容中，靶核酸编码VLA-4或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链。

靶向过程通常还包括确定靶核酸内的至少一个靶区域、片段或位点，以发生反义相互作用，从而产生所需效果，例如抑制表达。如本文所用，术语“区域(region)”定义为具有至少一种可鉴定的结构、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸的区域内是片段。“片段(segment)”定义为靶核酸内的区域的较小或亚部分。如本文所用，“位点(site)”是指靶核酸内的位置。

由于“翻译起始密码子”通常是5'-AUG(在转录的mRNA分子中；在相应的DNA分子中为5'-ATG)，所以翻译起始密码子也称为“AUG密码子”、“起始密码子”或“AUG起始密码子”。少数基因具有RNA序列5'-GUG、5'-UUG或5'-CUG的翻译起始密码子，5'-AUA、5'-ACG和5'-CUG已显示在体内发挥功能。因此，术语“翻译起始密码子”和“起始密码子”可涵盖许多密码子序列，即使在每种情况下起始氨基酸通常是甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。本领域还已知真核和原核基因可以具有两个或更多个可选起始密码子，其中任一个都可以优先用于在特定细胞类型或组织中或在特定组的条件下的翻译起始。如本文所用，术语“起始密码子”和“翻译起始密码子”是指在体内用于起始mRNA翻译的一个或多个密码子，该mRNA转录自编码例如VLA-4或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链的基因，而不考虑这些密码子的序列。

“翻译终止密码子”也称为“终止密码子”，其可以具有三种RNA序列之一：5'-UAA、5'-UAG和5'-UGA(在相应的DNA分子中分别为55'-TAA、5'-TAG和5'-TGA)。如本文所用，术语“翻译终止密码子”和“终止密码子”是指在体内用于终止mRNA翻译的一个或多个密码子，该mRNA转录自编码VLA-4或α4β7整联蛋白的α4整联蛋白链的基因，而不考虑这些密码子的序列。

术语“起始密码子区”和“翻译起始密码子区”是指mRNA或基因的一部分，其包括从翻译起始密码子起始的沿任一方向(即，5'或3')的约25至约50个连续核苷酸。类似地，术语“终止密码子区”和“翻译终止密码子区”是指mRNA或基因的一部分，其包括从翻译起始密码子终止的沿任一方向(即，5'或3')的约25至约50个连续核苷酸。因此，“起始密码子区”或“翻译起始密码子区”和“终止密码子区”或“翻译终止密码子区”都是可以用本发明的反义化合物有效靶向的区域。

本领域已知“开放阅读框”(ORF)或“编码区”是指翻译起始密码子和翻译终止密码子之间的区域，也是可以有效靶向的区域。在一个实施方案中，靶向包括基因ORF的翻译起始或终止密码子的基因内区。

其他靶区域包括5'非翻译区(5'UTR)，本领域已知是指mRNA从翻译起始密码子起5'方向的部分，因此包括mRNA的5'帽位点和翻译起始密码子之间的核苷酸(或基因上相应的核苷酸)，且本领域已知的3'非翻译区(3'UTR)指从翻译终止密码子起3'方向的mRNA部分，因此包括翻译终止密码子和mRNA的3'端之间的核苷酸(或基因上的相应核苷酸)。mRNA的5'帽位点包括N7-甲基化鸟苷残基，N7-甲基化鸟苷残基通过5'-5'三磷酸酯键与mRNA的最靠近5'端的残基接合。认为mRNA的5'帽区域包括5'帽结构本身，以及邻近帽位点的前50个核苷酸。在一个实施方案中，靶向5'帽区域。

尽管一些真核mRNA转录物被直接翻译，但许多转录物含有一个或多个称为“内含子(intron)”的区域，这些区域在翻译前从转录物中切除。剩余的(并因此翻译的)区域称为“外显子(exon)”，并拼接在一起形成连续的mRNA序列。通过剪接来自不同基因来源的两种(或多种)mRNA的过程产生的mRNA转录物称为“融合转录物(fusion transcript)”。在一个实施方案中，靶向内含子或剪接位点，即内含子-外显子连接处或外显子-内含子连接处，或由于重排或缺失引起的异常融合连接处。选择性RNA转录物可以从DNA的相同基因组区域产生。这些选择性转录物通常称为“变体”。

“前mRNA变体”是由相同的基因组DNA产生的转录物，其在起始或终止位置上不同于由相同的基因组DNA产生的其他转录物，并且含有内含子和外显子序列。在剪接期间切除一个或多个外显子或内含子区域或其部分时，前mRNA变体产生较小的“mRNA变体”。因此，mRNA变体是加工前mRNA变体，并且每种独特的前mRNA变体必须总是由于剪接而产生独特的mRNA变体。这些mRNA变体也称为“选择性剪接变体(alternative splice variant)”。如果没有发生前mRNA变体的剪接，则前mRNA变体与mRNA变体相同。

可以通过使用选择性信号来开始或停止转录，即通过使用选择性起始密码子或终止密码子来产生变体。起源于使用选择性起始密码子的前mRNA或mRNA的变体称为该前mRNA或mRNA的“选择性起始变体(alternative start variant)”。使用选择性终止密码子的那些转录物被称为前mRNA或mRNA的“选择性终止变体(alternative stop variant)”。一种特定类型的选择性终止变体是“polyA变体(polyA variant)”，其中所产生的多个转录物是由转录机器对“polyA终止信号”之一的替代选择产生的，从而产生终止于独特polyA位点的转录物。在一个实施方案中，靶向前mRNA或mRNA变体。

与反义化合物杂交的靶核酸上的位置称为“靶片段”。如本文所用，术语“靶片段(target segment)”定义为反义化合物所靶向的靶区域的至少8个核碱基部分。虽然不希望受理论的束缚，但目前认为这些靶片段代表可用于杂交的靶核酸的部分。

一旦鉴定了一个或多个靶区域、片段或位点，选择与靶片段充分互补的反义化合物，即充分良好杂交并具有充分特异性的反义化合物，以产生所需效果。

靶片段也可以与其相应的互补反义化合物组合以形成稳定的双链(双链的)寡核苷酸。这种双链寡核苷酸部分在本领域中已经显示通过反义机制调整靶表达和调节翻译以及RNA加工。此外，可以对双链部分进行化学修饰(Fire等人，1998；Timmons和Fire，1998；Timmons等人，2001；Tabara等人，1998；Montgomery等人，1998；Tuschl等人，1999；Elbashir等人，2001a；Elbashir等人，2001b)。例如，已经显示这样的双链部分通过双链体的反义链与靶标的经典杂交来抑制靶标，从而触发靶标的酶促降解(Tijsterman等人，2002)。

组合物

本发明的化合物可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物混合、包封、缀合或以其他方式缔合，从而产生例如脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂，用于帮助摄取、分布和/或吸收。教导此类吸收、分布和/或吸收辅助制剂的制备的代表性美国专利包括但不限于US 5,108,921、US 5,354,844、US 5,416,016、US 5,459,127、US 5,521,291、US 5,543,158、US 5,547,932、US 5,583,020、US 5,591,721、US 4,426,330、US 4,534,899、US 5,013,556、US 5,108,921、US 5,213,804、US 5,227,170、US 5,264,221、US5,356,633、US 5,395,619、US 5,416,016、US 5,417,978、US 5,462,854、US 5,469,854、US5,512,295、US 5,527,528、US 5,534,259、US 5,543,152、US 5,556,948、US 5,580,575和US 5,595,756。

本发明的化合物可以在药学上可接受的载体中施用。术语“药学上可接受的载体(pharmaceutically acceptable carrier)”是指当给予受试者(特别是哺乳动物，更特别是人)时不产生变应性、毒性或其他不良反应的分子实体。药学上可接受的载体可以是固体或液体。药学上可接受的载体的有用实例包括但不限于不影响本发明的活性剂的活性的稀释剂、溶剂、表面活性剂、赋形剂、悬浮剂、缓冲剂、润滑剂、佐剂、媒介物、乳化剂、吸收剂、分散介质、包衣、稳定剂、保护胶体、粘合剂、增稠剂、触变剂、渗透剂、螯合剂、等渗剂和吸收延迟剂。

在一个实施方案中，药物载体是注射用水(WFI)并且将药物组合物调节至pH 7.4、7.2-7.6.

在一个实施方案中，盐为钠盐或钾盐。

寡核苷酸可以含有手性(不对称)中心，或者分子作为整体可以是手性的。单独的立体异构体(对映异构体和非对映异构体)和这些的混合物在本发明的范围内。

本发明的化合物可以是药学上可接受的盐、酯或酯的盐、立体异构体、或在给药时能够提供(直接或间接)生物活性代谢物的任何其他化合物。

如本文所用的术语“药学上可接受的盐”是指化合物的生理学上和药学上可接受的盐，其保留母体化合物的所需生物活性并且在给药时不赋予不期望的毒理学作用。药学上可接受的盐的实例及其用途进一步描述于US 6,287,860中。

本发明的寡核苷酸化合物可以是前药、立体异构体、或前药的药学上可接受的盐、或其他生物等效物。如本文所用的术语“前药”是指以非活性形式制备的治疗剂，其在给药时通过内源酶或其他化学品和/或条件的作用转化成活性形式(即药物)。特别地，根据WO93/24510、WO 94/26764和US 5,770,713中公开的方法，将本发明的反义化合物的前药形式制备为SATE[(S乙酰基-2-硫乙基)磷酸酯]衍生物。

前药可例如在体内(例如在血液中水解)转化成具有医疗效果的其活性形式。药学上可接受的前药描述于A.C.S.Symposium Series(1976)第14卷的T.Higuchi和V.Stella的《作为新型给药系统的前药》(Prodrugs as Novel Delivery Systems,Vol.14of theA.C.S.Symposium Series(1976))；Elsevier的H.Bundgaard编著的《前药设计》("Designof Prodrugs"ed.H.Bundgaard,Elsevier,1985)；以及1987年美国药学协会和培格曼出版公司的Edward B.Roche编著的《药物设计中的生物可逆性载体》(Edward B.Roche,ed.,Bioreversible Carriers in Drug Design,American Pharmaceutical Association andPergamon Press,1987)，其通过引用并入本文。有机化学领域的技术人员将理解，许多有机化合物可以与它们在其中反应或它们从其中沉淀或结晶的溶剂形成络合物。这些复合物称为“溶剂合物”。例如，与水的络合物称为“水合物”。

常规治疗

皮质类固醇治疗是能行走的患者DMD治疗的主要手段。“皮质类固醇(corticosteroid)”是指几种合成的或天然存在的物质中的任一种，其具有模拟或增强天然存在的皮质类固醇的作用的类固醇的一般化学结构。合成皮质类固醇的实例包括泼尼松、泼尼松龙(包括泼尼松龙的前体泼尼松、甲泼尼龙)、地塞米松曲安奈德、布地奈德和倍他米松。

在一个实施方案中，本发明针对患有MD的人类受试者的MD的治疗包括向受试者施用有效量的治疗剂，例如针对CD49d(VLA-4的α链)的反义寡核苷酸，并且进一步包括向受试者施用有效量的第二药物，即皮质类固醇。在一个实施方案中，皮质类固醇是泼尼松(或泼尼松等效物)、地夫可特(泼尼松龙衍生物)。如上所述，其他皮质类固醇是本领域已知的。

本文中的联合给药包括使用单独的制剂(或单独的药物制剂)联合施用和以任一顺序的连续施用，其中通常存在两种(或所有)活性剂同时发挥其生物活性的时间段。

DMD患者在能行走时使用标准剂量的皮质类固醇治疗，因为这已被证明对某些患者的行走能力有一定效果。然而，以标准剂量(0.75mg/kg/天泼尼松或0.9mg/kg/天地夫可特)长期治疗可导致肌肉萎缩和/或具有其他副作用。对于继续使用CS的不能行走的DMD患者，没有护理标准，有时是他们失去行走能力时使用的固定剂量的CS，也就是减少了CS的mg/kg/天的剂量，或者他们可能因为副作用和/或缺乏益处而停止CS治疗。如本文所提出和示出的，CD49d的反义治疗与皮质类固醇治疗相结合，包括降低皮质类固醇治疗水平，在不能行走的受试者中减少或延缓肌肉功能的进展。不清楚CS治疗是否在这样的受试者中提供任何益处，因此这支持ATL1102单一疗法或联合治疗。

如本文所用，在施用疗法的上下文中的术语“组合(combination)”是指使用多于一种疗法或治疗剂。术语“组合(in combination)”的使用不限制向受试者施用疗法或治疗剂的顺序。治疗或治疗剂可以在向受试者施用第二治疗或治疗剂之前，与其同时或在其之后施用。

施用

在一个实施方案中，本发明的反义化合物全身施用。如本文所用，“全身施用”是经肠或肠胃外的施用途径。

如本文所用，“肠内(enteral)”是指涉及胃肠道的任何部分的施用形式，并且包括例如片剂、胶囊或滴剂形式的反义寡核苷酸的口服施用；胃饲管、十二指肠饲管或胃造口术；以及例如以栓剂或灌肠剂形式的反义化合物的直肠施用。

如本文所用，“肠胃外”包括通过注射或输注施用。实例包括，静脉内(进入静脉内)、动脉内(进入动脉内)、肌内(进入肌肉内)、心内(进入心脏内)、皮下(在皮肤下)、骨内输注(进入骨髓内)、皮内(进入皮肤本身内)、鞘内(进入椎管内)、腹膜内(输注或注射到腹膜内)、膀胱内(输注到膀胱内)、经皮(通过完整皮肤扩散)、透粘膜(通过粘膜扩散)、吸入。

在一个实施方案中，药物组合物是皮下施用的。

反义化合物可以作为单次剂量或按周期重复施用，例如每天、每两天一次、每三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三或十四天一次、每周一次、每周两次、每周三次、或每两周或每三周。

在一个实施方案中，每周1至3次、或每周一次、两周一次、三周一次、四周一次、或每两个月一次进行施用。

在一个实施方案中，施用是每周一次。

在一个实施方案中，低剂量施用3至6个月，例如约25-50mg/周，持续至少3至6个月，然后长达12个月和长期。

示例性的剂量在约10-300mg之间。示例性剂量包括25、50、100、150、200mg。示例性剂量包括0.1mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg(约50-100mg)和3mg/kg(100-200mg)和4.5mg/kg(150-300mg)。在一个实施方案中，剂量每周施用一次。因此，在一个实施方案中，可以将约10-30、或20-40、或20-28mg的低剂量给予通常体重在约25-65kg之间的受试者。在一个实施方案中，反义寡核苷酸以每剂小于50mg、或小于30mg、或约25mg的剂量施用以产生治疗效果。在一个实施方案中，反义寡核苷酸ATL1102以每剂小于50mg、或小于30mg、或约25mg的剂量施用以产生治疗效果。

在一个实施方案中，在施用第一剂量后约三个月内观察到治疗效果，例如进展的延缓。如本文所用的术语“治疗有效量”是指在给药条件下足以例如改善受试者的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延迟受试者的肌营养不良症的进展，或改善受试者的肌营养不良肌纤维的一种或多种标志物、体征或症状或延迟受试者的肌营养不良症的进展的反义化合物的剂量。

在另一个实施方案中，该施用有效地提供了在人类受试者的血浆中寡核苷酸的Cmax高达2890ng/mL，并且在一个实施方案中，为约10,000-11,000ng/mL。

在另一个实施方案中，该施用有效地提供了人类受试者的血浆中寡核苷酸的至少2.5ng/mL、在一个实施方案中至少20ng/mL、或至少45ng/mL的Cmin或Ctrough。

关于剂量方案或治疗过程的决定包括诸如负载和/或维持剂量、剂量频率、剂量持续时间、特定群体的剂量调整和与其他治疗组合物共同施用的因素。对于给定疗程的反义寡核苷酸，本文鉴定了在治疗期间和治疗后均显示CD4+CD49d+T细胞水平降低的受试者。这些受试者对治疗没有应答，这可以通过评估血液样品中在最后一次给药的约7天内没有经历CD49d+T细胞的给药完成后反弹来检测或监测。相反，这些受试者显示治疗后CD4+CD49d+T细胞水平没有变化或甚至进一步降低。并且它们显示出肌肉性能降低，这可以通过PUL2.0相当快速地评估。这些受试者可以通过例如增加或减少用于单一疗法的反义寡核苷酸的剂量和/或通过增加或减少皮质类固醇的剂量或改变皮质类固醇来调整其剂量方案。

研究证明用VLA-4整联蛋白的抑制性寡核苷酸治疗肌营养不良症，降低了人受试者血液或肌肉中VLA-4的水平。可以在一个或多个器官(包括血液、肌肉或肺)的细胞亚群中检测到VLA-4水平的降低。

为了测量受试者中的反义寡核苷酸对皮质类固醇的作用，在施用寡核苷酸之前约24小时受试者停止服用皮质类固醇(即，他们在当天服用其最后剂量)。这允许在没有皮质类固醇的情况下评估免疫细胞中VLA-4整联蛋白的CD49dα链的抑制性反义寡核苷酸的作用，所述皮质类固醇在施用后24小时在血流中不以足够显著的水平存在以对循环免疫细胞产生作用。

评估CD4+CD49d+T细胞的水平－可以通过流式细胞计量术或本领域已知的许多技术之一来评估细胞。基于免疫层析和微流体的方法广泛用于定点照护。细胞计量术包括芯片细胞计量术，并且盒技术(cartridge technology)(参见WO11128893)也是可用的。可以直接或间接测量CD4+CD49d+T细胞的水平以评估来自受试者的样品中CD4+CD49d+细胞的浓度。评估细胞数量的直接方法是本领域已知的，包括通过各种技术定量样品中CD49d标志物的量和定量CD4+和/或CD8+T细胞的数量。可以评估标志物的平均表达水平、细胞内以及细胞内水平。通常，该方法包括使来自受试者的生物样品与特异性结合所获得的生物样品中的CD49d的试剂接触。通常，试剂是单克隆抗体或其结合片段、适体或抗体模拟物。WO13036620描述了检测样品中的靶细胞。WO06058816描述了用于自动化执行集成软件－荧光微珠标准系统的试剂盒，所述试剂盒包括：用一种或多种荧光染料标记的单克隆抗体；包含用于标记抗体的相同的一种或多种荧光染料的微珠；以及包含用于在计算机上实现的软件程序的计算机可读非暂时性介质。通常，软件程序与特定批次的微珠标准品和荧光标记的单克隆抗体混合物相匹配，并且包括关于每个微珠群体的荧光强度的信息。软件程序从流式细胞仪获取关于结合到细胞的微珠和荧光标记的抗体的悬浮液的信息，并且分析数据、平滑曲线、计算新的参数、提供质量控制措施并且指示微珠和荧光标记的抗体的过期；软件程序警告操作员并进一步询问用户，以验证正在使用的检定批次和用作样品分析一部分的流式细胞仪的类型；软件程序记录产生累积文件历史，以提供仪器性能的全面记录。软件程序可以通过由批次之间的回归分析和分配给软件程序内微珠荧光值的变化确定的因子来将不同生产批次之间的荧光表达的偏差或差异归一化；软件程序监测不同生物样品上不同微珠生产批次和荧光标记抗体生产批次数据的比较，以确定微珠是否在所需的荧光强度范围内，以确保批次之间的不精密度水平小于5％；并且如果需要，通过使用外标确定样品细胞结合的荧光抗体的实际量。

WO17062646中描述了可替代的方法，其描述了用于检测细胞的生物标志物－形态学特征的技术，其中细胞与官能化的纳米颗粒物质接触，每个官能化的纳米颗粒物质包含生物标志物－结合部分，并且通过包含生物标志物－结合部分的官能化的纳米颗粒物质与其各自的生物标志物的结合形成纳米颗粒－细胞复合物。将复合物固定并用落射光或渐逝光照射，收集来自每个观察到的复合的官能化纳米颗粒的共振光散射，以获得每个成像细胞的生物标志物特征。进一步染色允许评估细胞的形态学特征。

在一个实施方案中，在10-18岁、体重超过25kg的不能行走的DMD患者中进行随机双盲安慰剂对照研究。将参与者随机分成4组，每组约25例患者，3组分别接受25mg每周一次、50mg每周一次或100mg每周一次的ATL1102，最后一组接受安慰剂52周。在任何现有的皮质类固醇(CS)、泼尼松龙或地夫可特治疗的基础上，ATL1102或安慰剂每周施用一次，持续52周。

本研究的所有参与者都被提供输入开放标签延长6个月(26周)。

继续进行开放标签研究的患者，其在52周显示基于PUL2.0评分(或等效临床评分)的应答性，与基线相比，可以继续他们的ATL1102和CS治疗。在6个月(26周)的开放标签研究中，与基线相比，在52周时显示出对ATL1102+/-CS治疗无应答性(相对于基线PUL2.0评分为例如-2、-3或更低)的患者可被置于不同剂量(较高剂量或较低剂量)的ATL1102。

开放标签治疗6个月(26周)后，将78周时患者的PUL2.0与52周时的PUL2.0进行比较，以获得PUL2.0应答性。将78周的循环CD4+CD49d+T细胞的数量与上述PUL2.0结果后(在任何CS剂量前)82周、4周的数量进行比较。对PUL2.0评分为－2，－3或更低的ATL1102显示无应答性的患者将选择改变ATL1102剂量，或将其CS剂量调整至例如标准剂量的三分之二或所例示的标准剂量的三分之一，并在进一步的随访中进一步监测PUL2.0应答性。

临床评估的其它次要终点包括安全性的量度和功效的量度，例如通过myogrip和myopinch测量的肌肉强度、呼吸标记、EK2、生活质量和肌肉纤维化、脂肪炎症-水肿和萎缩的MRI评估。基于PUL2.0应答性和PUL2.0评估后的CD4+CD49d+变化，可以在调整ATL1102剂量或CS剂量之前考虑这些测量中的任何一种或多种。

可以根据本发明修改给药方案，例如，如本领域技术人员所设想的，在相对于基线评估PUL2.0和PUL2.0后循环CD4+CD49d+细胞变化之前给药3个月、6个月、1年或超过1年，并相应地调整ATL1102剂量。其他修改包括评估PUL2.0最后一次给药后1、2、3或4周或更多周的循环CD4+CD49d+细胞，通过芯片上的流式细胞术对它们进行测量。

本发明的一个方面营养不良的编号陈述如下所述。

1.一种在有需要的受试者中治疗肌营养不良症的方法，所述方法包括在足以改善受试者中肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延缓肌营养不良症的进展的条件下定期向所述受试者施用药物组合物一段时间，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的包含以下结构的抑制性寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或其立体异构体。

2.一种在患有肌营养不良症的受试者中改善肌肉功能如肢体功能或延缓肌肉功能如肢体功能衰退的方法，所述方法包括在足以改善受试者的肌肉功能如肢体功能的条件下向所述受试者定期施用药物组合物一段时间，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的包含以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

3.一种在患有肌营养不良症的受试者中改善肌肉性能如肌肉或肢体力量或延缓肌肉性能如肌肉或肢体力量下降的方法，所述方法包括在足以改善肌肉性能诸如肌肉(例如肢体)强度或延迟肌肉性能诸如肌肉(例如肢体)强度的下降的条件下向所述受试者定期施用药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的包含以下结构的寡核苷酸：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述定期施用是每周或两星期或一个月一次或两次或三次。

5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述治疗有效量为10-300mg。

6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述治疗有效量选自25-50mg、50-100mg、100-200mg和150-300mg。

7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述寡核苷酸为钠盐或钾盐。

8.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述药物载体为WFI，并且将所述组合物调节至pH7.2-7.6。

9.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述MD选自Duchene肌营养不良症(DMD)、肢带型肌营养不良症(LGMD)、Becker肌营养不良症(BMD)、先天性肌营养不良症(CMD，包括Fukuyama型先天性MD和先天性MD伴肌球蛋白缺乏症)、面肩肱型、眼咽型、Emery-Dreifuss型和远端型肌营养不良症。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述MD涉及肌营养不良蛋白基因中的突变。

11.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述受试者被诊断为患有MD并且是能行走的或不能行走的。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述受试者为10岁或更大的少年或青春期男孩。

13.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中所述组合物通过皮下施用。

14.根据权利要求1或2或3所述的方法，其中施用联合皮质类固醇治疗。

15.根据权利要求14所述的方法，其中皮质类固醇以低剂量施用。

实施例

实施例1

在一个实施方案中，ATL1102每周以约1.5mg/kg(约50-100mg)和3mg/kg(100-200mg)和4.5mg/kg(150-300mg)给10岁或10岁以上患有DMD的不能行走的少年(或青春期)男孩施用长达12周。测量所施用的寡核苷酸例如对运动/肌肉功能和炎性标志物的作用。还评估了肌肉退化-再生和纤维化的标志物。标记物可以原位检测或在样品中检测，例如在血浆、尿或肌肉活检中。评估吸气和呼气压力、最大咳嗽流量、用力肺活量(FVC)以评估呼吸功能的变化。采用标准化上肢可达表面积变化百分比、上肢功能评估评分变化百分比、患者报告的结果测量上肢功能能力评分变化百分比(PROM-UL)来评估肌肉功能。生活质量调查表可用于确定治疗效果。

皮质类固醇可以每天给药，或以较低频率给药。泼尼松龙可以0.75mg/kg/天和0.9mg/kg/天的剂量作为用于能行走的DMD患者的标准疗法，以三分之二标准剂量、一半剂量或三分之一剂量给药。

实施例2

在一个实施方案中，将ATL1102每周以约1.5mg/kg(约10-100mg)和3mg/kg(约20-200mg)和4.5mg/kg(30-300mg)给4-11岁患有DMD的能行走的儿科男孩施用长达12周。确定所施用的寡核苷酸例如对运动/肌肉功能和炎性标志物的作用。能行走的儿科男孩可能是步行状况良好或差步行状况较差。保持或减少步行能力的损失可以通过本领域技术人员已知的方法来评估。

实施例3

在一个实施方案中，10例12至18岁的不能行走的DMD患者接受ATL1102，起始剂量为3mg/kg，每周一次，持续4周。前5例患者继续以3mg/kg/周继续给药4周，其余5例患者剂量增至4.5mg/kg/周(每周两次，每周2.25mg/kg)，共4周。治疗8周后，进行4周的监测。在治疗和监测期间，分别在基线、2周、4周、6周、8周、10周和12周进行评估。主要的活性结果是评估治疗4周和8周的循环淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞以及hi CD49d T细胞的数量和安全性，包括注射部位应答、血小板变化、肝酶GGT-胆红素、CRP和白蛋白、A/G比值的变化。临床评估的次要终点是测量强度、上肢功能、功能能力、生活质量和呼吸标志物，MRI评估肌肉纤维化、脂肪炎症水肿和萎缩以及药代动力学。探索性结果指标将包括血清/血浆生物标志物应答，例如与肌肉炎症、肌肉纤维化、肌肉凋亡/退化和肌肉再生(包括细胞因子)以及蛋白质组学和单核细胞RNA阵列和外泌体RNA相关的那些。

实施例4

低剂量施用抑制性寡核苷酸

在一个实施方案中，9例10-18岁、体重25-65kg的不能行走的DMD患者以每周一次25mg的起始剂量接受ATL1102，持续24周。治疗24周后，进行8周的监测。在治疗和监测期间，在基线、在治疗期间每2周和在治疗后监测期间每4周进行评估。主要的活性结果是评估治疗4周和8周的循环淋巴细胞、CD4+和CD8+T细胞以及hi CD49d T细胞的数量和安全性，包括注射部位应答、血小板变化、肝酶GGT-胆红素、CRP和白蛋白、A/G比值的变化。临床评估的次要终点是测量肌肉强度和上肢功能、由myoset测量的强度、PUL-2(DMD上肢性能模块2.0)测量的上肢功能能力、生活质量、呼吸标志物以及MRI评估肌肉纤维化、脂肪炎症-水肿、萎缩和药代动力学。探索性结果指标将包括血清/血浆生物标志物反应，例如与肌肉炎症、肌肉纤维化、肌肉凋亡/退化和肌肉再生(包括细胞因子，其中一种或多种可能是肌肉损伤的标志物)以及蛋白质组学和单核细胞RNA阵列和潜在的外泌体RNA相关的那些。

实施例5

结果

12周时1号患者的结果

对一例13岁、体重62kg的不能行走的受试者施用低剂量25mg/周的ATL1102，施用30mg日剂量的皮质类固醇(CS)地夫可特(0.48mg/kg/天)，持续12周。ATL1102有效地降低了患者每日服用CS前基线(第1周)每微升循环CD8+细胞和CD8+细胞高水平表达CD49d的细胞数，降低了生化探索性标志物测量的肌肉损伤标志物、myoset测量的肌力以及PUL-2.0测量的重要肌肉功能。该受试者在大约2.5年前丧失行走能力，并且在能行走时使用54％(～50％)的标准护理，0.90mg/kg/天剂量的Deflazacort治疗患有DMD的受试者。当能行走时，DMD中用作标准护理的等效泼尼松龙剂量是0.75mg/kg/天。

免疫细胞

通过流式细胞术和血液学测量ATL1102在基线(第1周)、第5周(ATL1102给药后3天)、第8周和第12周(第8周和第周12周给药后7天)对免疫细胞的影响。与在多发性硬化(MS)中使用较高ATL1102剂量的先前经验相比，ATL1102对CD8+细胞的作用是相对选择性的(Limmroth等人，2014)。这些效果也比之前在MS研究中测量的给药后3天更长，其中ATL1102给药后7天首次显示出效果。在该剂量下某些免疫细胞不受影响，评估时表明ATL1102的作用在0.4mg/kg/周的低25mg剂量下相对更特异。例如，在MS研究中，使用ATL1102在较高剂量下观察到的中性粒细胞或血小板没有显着降低(Limmroth等人)。

Myoset-肌肉强度数据

这1号受试者的Myoset初步数据表明，与基线相比，给药12周后，通过Myocgrip测量，他的优势手强度损失，但是通过Myocgrip测量，拇指强度没有损失，通过Moriplate测量，当轻叩次数相同时，手指强度相对于基线也没有损失。另一方面的数据表明，与基线相比，在第12周，手或手指的力量没有损失，并且拇指的力量在数值上更高。Ricotti等人(2016)观察了15例使用CS和myoset治疗12周或更长时间的患者(14例使用CS治疗)，观察到与基线相比myogrip的均值趋势降低0.22kg且myopinch的均值趋势降低0.1kg，而moviplate有所增加。

PUL-2-功能数据

DMD的PUL-2是用于测量上肢功能的PUL-1的更新版本。PUL-2测量较高水平的肩关节功能，最大评分为12；中位肘关节功能，最大评分为17；远端腕关节和手部功能，最大评分为13。入组评分为3到6分意味着(6分为最高分，零分为最低分)，表示可以对受试者的肩部功能进行评估。

1号受试者的入组水平功能为5，记录的测评分明他已经给药超过12周，在基线和12周时评分为8，肩部功能没有受损。1号受试者在第12周获得了中位肘关节功能，评分为14分，而在基线时为13分；在第12周获得了远端手腕和手的功能，评分为12分，而在基线时为10分。与基线相比，给药12周时，PUL-2评分为34分，而基线为31分。患者入组评分也从基线水平5增加到与记录的PUL-2结果一致的水平6。

ATL1102附加疗法可能有助于保持myoset测量的肌肉强度，并且如果不能改善受试者的功能，则似乎可以维持PUL-2测量的功能。ATL1102疗法因此可减缓疾病进展。

结果证实了使用CD49d(VLA-4的α链)的反义链和ATL1102作为单一疗法或与联合CS来治疗DMD患者，以改善和稳定肌肉强度和肢体功能以及减缓肌营养不良症疾病的进展。

结果证实了使用CD49d(VLA-4的α链)的反义链和ATL1102作为单一疗法或与联合CS来治疗DMD患者，以改善和稳定肌肉脂肪组织水平、肌肉强度和肢体功能以及减缓肌营养不良症疾病的进展。

如技术人员将理解的，肌肉性能的关键要素是强度，其是最大的力并且其在myogrip和myopinch测试中方便地测量。此外，耐力/疲劳性是例如用myogrip和myopinch重复测量反复测试的承受力的能力。此外，力量是力/单位时间，如6分钟行走测试。运动表现是肌肉动作的运动，例如手腕、手指、脚和脚趾中的粗略运动技能和精细运动技能。本领域技术人员应当理解，运动性能包括每天与上肢或下肢或动物前肢和后肢有关的生命活动。在具有DMD模块的不能行走的儿童中，可用于测量诸如PUL 1.0、PUL 1.2、PUL 2.0的上肢性能，并且这些还可用于具有DMD和其他肌肉萎缩状况的能行走的儿童。

本领域技术人员还将理解，肌肉强度可以是上肢或下肢强度的量度，并且在上肢中，肌肉强度用于肩部屈曲、肘部拉伸和腕部拉伸，如使用手持肌力计(myometer)以克或磅测量的。

myoset测量了上肢的强度和疲劳性，因为这些是重复测量(疲劳性的数据未示出)，结果主要提供三次或更多次重复的有效结果的强度最大结果。有时最大的结果是第二或第三测试。

肌肉损伤的探索性药效学结局指标

肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)是患有DMD的男孩的肌肉损伤的指标，主要与肌营养不良蛋白水平低或没有肌营养不良蛋白和收缩时对肌肉的损伤有关，其次与炎性和其他对肌肉的下游损伤有关。肌酸激酶(CK)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)是年轻的能行走的DMD患者的肌肉损伤的指标，他们与不能行走的患者相比具有更多的肌肉量和炎症。

尽管如此，还是收集了血液和血清样品，以调查1号受试者肌肉损伤标志物的变化。在1号受试者中，与基线和第5周相比，CK、ALT、AST、LDH在第8周和第12周降低。与4606/5358、265/250、116/134和564/498的第8/12周水平相比，CK、ALT、AST、LDH的基线/第5周水平(单位/升)分别在5860/6881、304/404、未测试/184和632/681。LDH水平从被认为高的水平下降到正常范围内。这表明与肌营养不良蛋白缺失或炎症或其他损伤相关的肌肉损伤迹象在该不能行走的患者中已经减少。

实施例6

4例患者12周数据和2例患者24周数据的结果

来自4例不能行走的患者(包括1号患者)12周内的数据，与实施例5中1号患者的观察结果一致，并且支持每周一次25mg的ATL1102治疗，以改善和维持肌肉强度和肢体功能。4例患者在9个月至4.5岁、10至15岁时丧失行走能力，并且开始ATL1102治疗时为13至17岁。体重约为40-65kg，接受约0.4-0.6mg/kg/周的ATL1102。他们都在能行走时使用0.90mg/kg/天剂量的地夫可特和0.75mg/kg/天的泼尼松龙治疗患有DMD的受试者，并固定了20mg和25mg剂量的泼尼松龙和30mg剂量的地夫可特，当用于能行走的患者时，约为这些类固醇标准剂量的一半、五分之二和五分之四。

24周内2例不能行走的患者(包括1号患者)的数据也与12周内的观察结果一致。2例患者分别在2.5岁至4.5岁、10至13岁时丧失行走能力，并且开始ATL1102治疗时为13岁和17岁。体重约60-65kg的患者接受约0.4mg/kg/周的ATL1102。1号患者服用了30mg地夫可特，2号患者服用了20mg泼尼松龙，这分别是能行走的患者使用的CS标准日剂量的54％和40％。

Myoset：myogrip和myopinch肌肉强度数据

用优势臂和非优势臂产生myogrip和myopinch数据，并且在每个时间点进行几次抓握和挤压测试。这允许获得有效的结果并测定肌肉强度和耐力。

Myogrip－肌肉强度数据

按照myoset供应商的建议，在患者使用的优势臂中评估了给药12周后与基线相比的4例DMD患者的myogrip数据。优势手的myogrip强度显示出0.09kg的平均增益和自基线的10.52％的强度增加。Ricotti等人(2016)观察了治疗12周的15例患者(14例接受CS治疗)，并观察到10例患者在12周时的myogrip分析中，与基线相比，myogrip强度的均值趋势损失0.22kg，损失3.28％。

在患者使用的优势臂中评估了给药24周后与基线相比的2例DMD患者的myogrip数据。优势手的myogrip强度显示出仅0.42kg的均值损失和自基线的平均1.24％的强度损失。Ricotti等人(2016)在9例患者中分析了24周时的强度，显示出0.50kg的显著均值损失，以及与基线相比10.45％的myogrip强度损失。

Myopinch－肌肉强度数据

按照myoset供应商的建议，在患者使用的优势臂中评估了给药12周后与基线相比的4例DMD患者的myopinch数据。优势手的myopinch强度显示出0.169kg的平均增益和自基线的5.31％的强度增加。Ricotti等人(2016)在10例患者中分析了12周时的myopinch，显示出0.1kg的均值趋势损失，以及与基线相比4％的myopinch强度损失。

在患者使用的优势使用臂中评估了给药24周后与基线相比的2例DMD患者的myopinch数据。优势手的myopinch强度显示出0.034kg的平均增益(mean gain)和自基线负2.58％的强度损失。Ricotti等人(2016)9例患者中分析了24周时的myopinch，显示出0.38kg的显著均值损失，以及与基线相比15.2％的myopinch损失。

Moviplate

按照myoset供应商的建议，在患者使用的优势臂中评估了给药12周后与基线相比的4例DMD患者的moviplate数据。优势手的moviplate在30秒内显示出63.5的平均轻叩速率，平均轻叩次数相比于基线增加了4。Ricotti等人(2016)在10例患者中分析了12周时的Moviplate，与基线相比，平均增加了2.3次轻叩。

PUL 2肢体肌肉功能数据

评估了4例DMD患者在给药12周后与基线相比的PUL 2.0数据。PUL 2.0总功能评分显示平均增益为3.66分，与基线相比平均增益为9.6％。3例患者从基线增加+3分，1例患者增加+2分。

评估了2例DMD患者在给药24周后与基线相比的PUL 2.0数据。PUL 2.0总功能评分显示平均增益为2分，与基线相比增加为9.9％。两例患者的总功能评分增加+2。

Pane等人(2018)在90例患有DMD的不能行走的患者中观察到了基线、12个月和24个月时的PUL 2.0功能数据。90例患者中有52例(即58％)进行了CS。在这24个时间段内的结果是线性的，并且在12和24个月的时间段内显示显著的损失。插值(interpolation)表明与基线相比，PUL 2.0总功能评分中估计平均总功能评分损失为1，估计平均损失为5.4％。

1号受试者的入组水平基线功能评分为可能的6分中的5分，在12周时增加至水平6，在24周时保持在水平6。2号患者的入组水平基线功能评分为1，刚好高于最低可能评分0，并且入组评分在12周时增加至水平2并且在24周时保持在水平2。其他患者保持基线入组水平3。入组评分为3到6分意味着(6分为最高分，零分为最低分)，表示可以对受试者的肩部功能进行评估。

PUL-2测量较高水平的肩关节功能，最大评分为12；中位肘关节功能，最大评分为17；远端腕关节和手部功能，最大评分为13。在12周时，1、2、3和4号患者相对于基线具有0、0、+2和+3的评分差异，在第24周时具有0和0的评分差异。在12周时，中位肘关节相对于基线的功能分别为+1、_2、+1和-1，第24周时为+1和+2。在12周时，与基线相比，远端腕部和手部尺寸的功能为+2、0、0和+1，第24周为+1和+0。

实施例7

患者8周数据的结果

早在8周时对Myoset肌肉强度和PUL2.0功能数据的快速影响

12周前未报告myoset结果，Ricotti等人在12周时获得最早数据，其他所有研究均在12个月及以上。皮质类固醇的作用也没有在12周之前报道过。令人惊讶的是，ATL1102早在前6例患者中的8周就改善了平均myogrip和平均myopinch肌肉强度以及PUL2.0肢体功能，并且迄今为止所评估的4例患者中的作用维持至12周。

实施例8

针对CD49d MDX小鼠研究的反义寡核苷酸

ATL1102，即针对人CD49d的反义抑制剂，已经如本文所述研究作为减少DMD患者中炎性免疫介导的肌纤维损伤的治疗。在实施例5、6和7中概述了ATL1102对肌肉强度和肌肉功能的影响，并且首次显示CD49d或VLA-4的任何抑制剂在DMD治疗中的作用。目前，皮质类固醇(CS)用于减轻DMD中观察到的炎症，并且CS用于上述对1、2、3和4号患者的人类研究。然而，皮质类固醇当长期使用时具有一系列严重的副作用，如DMD中所要求的，因此，优选使用较低剂量的CS，如在人类研究中所测试的，并且还避免使用CS。这在人类中并不总是可行，因此在小鼠中进行测试。

下面的动物研究是首次测试针对CD49d(VLA-4的α链)的反义抑制剂作为肌营养不良症中的单一疗法的效果。还首次测试了CD49d或VLA-4的任何抑制剂在肌营养不良症中的作用。此外，这是首次在肌营养不良症小鼠模型中测试肌肉损伤开始后的任何抗炎、免疫介导的治疗，因为在肌肉损伤的初始阶段已经预防性地进行了其他治疗。

ATL1102是人CD49d的反义抑制剂，与小鼠CD49d RNA不同源，因此在小鼠研究中使用了小鼠和人CD49d的反义寡核苷酸抑制剂ISIS 348574。

方法－本研究为盲法研究。总共48只购自JAX的C57BL10 MDX雄性小鼠和12只野生型(WT)C57BL10雄性小鼠。两组12只MDX小鼠每周一次以20mg/kg和每周一次以5mg/kg皮下注射(s.c.)ISIS 348574。一组12只MDX小鼠每周一次以20mg/kg皮下注射ISIS 358342(一种非靶向错配对照寡核苷酸)。一组12只WT对照小鼠皮下注射盐水，并用作MDX小鼠中疾病发展的量度。各组情况如下：

WT-C57BL10 n＝12(安慰剂，对照，盐水，皮下注射)

MDX n＝12(高剂量ISIS 348574 20mg/kg，皮下注射)

MDX n＝12(低剂量ISIS 348574 5mg/kg，皮下注射)

MDX n＝12(高剂量非靶向错配对照ISIS 358342，20mg/kg，皮下注射)

MDX n＝12(安慰剂对照，盐水，皮下注射)

本研究的对照包括WT、MDX的盐水对照以及仅高剂量的非靶向寡核苷酸对照。不结合CD49d RNA的非靶向核苷酸序列具有与CD49d寡核苷酸相同的核苷酸组成。选择高剂量(20mg/kg)和低剂量(5mg/kg)ISIS 348574作为小鼠中基于暴露水平对应于临床中低约五倍mg/kg剂量的剂量，即临床中每周1mg/kg和4mg/kg。在8周的急性研究中施用的MS患者中，每周4mg/kg的剂量低于ATL1102的每周三次和两次200mg的剂量(Limmroth等人，2014)。然而，每周4mg/kg和1mg/kg的剂量包括比实施例5、6和7中基于每周mg/kg对DMD患者给予ATL1102的剂量更高的剂量，尽管后者是24周的慢性研究。临床中的患者可以在这些浓度下以临床中注射的合适体积提供反义物。

ISIS 348574(ATATTTTTCCACCTGTGCCC:SEQ ID NO:2)是一种5-10-5MOE gapmer，对于与小鼠和大鼠整联蛋白α4完全互补的每个C，具有硫代磷酸酯骨架和5-甲基肌胞嘧啶

还运行了ISIS 348574的8碱基对错配寡核苷酸。这是ISIS 358342(ACAGTGTACCTCCTTTTCTC:SEQ ID NO:3))，一种具有硫代磷酸酯骨架的5-10-5MOE。

仅评估雄性小鼠，因为DMD是仅影响男孩的X连锁遗传性肌肉疾病。每个治疗组使用总共n＝12只MDX小鼠，以确保按照方案治疗足够的动物以启动研究。使MDX小鼠和WT对照适应环境，并在9周龄时开始治疗(在第一轮肌肉损伤开始后，认为在2-5周龄之间发生肌肉损伤)。每周一次通过皮下注射盐水、非靶向寡核苷酸或两种剂量的CD49d反义物(20mg/kg(高)和5mg/kg(低))治疗6周。

测试小鼠的握力，并通过原位肌肉生理学观察疲劳、等长收缩(绝对力和比力)和偏心收缩诱导的肌肉损伤。将组织与血液和神经分布相连。收集骨骼肌、膈肌、心脏、脾脏和血液并储存用于将来的生物化学和分子分析。对于所用的技术，可以参考以下出版物：Hogarth等人《自然通讯》8:14143,2017(“偏心收缩”)(Hogarth et al.NatureCommunications 8:14143,2017(eccentric contractions))，Garton等人《美国人类遗传学期刊》102,845-857,2018(“力频率与疲劳”)(Garton et al.The American Journal ofHuman Genetics 102,845-857,2018(force frequency and fatigue))。

药物施用和握力测试－在第一次注射之前，小鼠进行基线握力测试以检查前肢强度。一旦完成，使用上述浓度的针对CD49d的反义寡核苷酸、盐水或非靶向寡核苷酸，每周一次给所有小鼠注射最大体积150微升，持续6周。然后每两周对小鼠进行如下所述的握力评估(总共4次测试)，直到6周治疗期完成。

握力测定方法(PROCEDURE for Grip strength)如下：

1.称重小鼠。

2.通过尾部将小鼠提升到前爪与杆等高的高度。

3.将小鼠水平移向该杆，直到它在可及范围内。目视检查抓握是否良好，即对称、用两个爪正确抓握，并施加可检测的阻力抵抗研究者的拉力。

4.轻轻地将小鼠拉开，直到其抓握被破坏。如果动物仅使用一只爪子或还使用其后爪子，在拉动过程中向后转动，或者离开杆而没有阻力，则必须放弃测量。

5.重复测试5次，每次尝试之间休息1分钟，以获得最佳性能。

6.将小鼠放回笼中并将向日葵种子置于底部作为食物奖赏。

组织收集和原位肌肉生理学－使用Arora Scientific开发的设备进行骨骼肌功能分析。该技术已经在实验室中进行了～5年的研究，并且是确定肌肉性能和力量在许多与骨骼肌相关的病症中的功能性影响的金标准方法。该系统允许测定胫骨前肌(TA，后腿肌肉)产生的力量，同时保持完整的血液供应和神经系统。通过进行反复的肌肉收缩和恢复(疲劳后)来评估肌肉疲劳的影响，并在偏心收缩后测量肌力损失以评估肌肉损伤。使用其他方法(例如体内握力)收集该信息是不可能的，体内握力仅提供对肌力的估计。该方法用于评估反义寡核苷酸药物在治疗6周后的效果。交错进行分析，每天最多完成10只小鼠的分析，并通过以下方法进行分析：

肌肉生理学测定方法如下：

1.称重小鼠。

2.用异氟烷麻醉小鼠。使用脚趾夹作为指示器，确保充分的初始麻醉。在使用脚趾夹的过程中，每5分钟监测一次麻醉深度。

3.将小鼠充分麻醉后，通过在皮肤上切开～2mm的切口暴露足肌腱。

4.使用外科缝线5-0，用两根单独的缝合引线系住肌腱连接处远端～5mm的暴露肌腱。一个锚结和一个固定到力传感器的结)。

5.从膝盖上除去皮肤并暴露膝盖骨。

6.将四头肌上的皮肤切开，露出坐骨神经

7.通过将不锈钢针或注射器针在髌腱后面穿过而不损伤周围组织来固定膝盖。该针应固定在平台底部。麻醉的动物必须牢牢固定以防止收缩期间的任何运动。

8.使用来自步骤4的缝线，将肌肉腱系到双模式伺服电机的杠杆臂上。

9.将两个线状(模拟)电极置于神经上(或钩在神经下)，使用300-400ms持续时间的方波脉冲的超大电压(即～10V)刺激肌肉收缩。

10.使用适当的计算机软件控制和测量所有刺激参数和收缩应答。

11.通常通过以小增量逐渐增加长度直到获得最大抽搐力来确定最佳肌肉长度(Lo)。

12.在确定Lo之后，以增加的频率刺激肌肉以构建全频-力关系。肌肉在成功收缩之间应休息30秒。最大力由频率-力关系的平稳段确定。

13.一旦确定了最大力，肌肉可以经受不同的方案以确定缩短力，肌肉疲劳或对收缩引起的损伤的敏感性。

14.在刺激方案结束时，通过心脏采血收集血液，并通过颈椎脱位和心脏穿刺对小鼠实施安乐死。

15.收集胫骨前肌(以及生化和RNA分析所需的其他肌肉/组织)并对肌肉进行称重，以便能够根据力频率关系计算具体的力测量值。

在测定期间将小鼠麻醉，并在测定后立即剔除而不恢复。

统计分析-使用Graphpad Prism进行统计分析。使用单向ANOVA、Fishers LSD检验评估从每组12只小鼠获得的握力、绝对和特定肌力和肌肉重量。使用双向ANOVA、FishersLSD检验对每组12只小鼠进行肌肉疲劳分析，以及对于偏心收缩，使用单向或双向ANOVA、LSD检验对每组9只小鼠进行肌肉疲劳分析。

结果

握力(Grip Strength)－基线和6周治疗期间的握力(平均值和SEM)。在治疗前的基线，mdx组显著弱于WT(图1A)。虽然该研究是盲法的，并且动物随机分开，但是高剂量反义寡核苷酸组中的MDX小鼠在基线时显著弱于基线时的MDX-盐水(但不是MDX-非靶向寡核苷酸或低剂量)(图1B)。

原位胫骨前肌(TA)肌肉生理学－肌肉质量和等长肌肉收缩数据(最大绝对力和最大比力)。表1提供了肌肉生理特性。如文献中已知的，WT小鼠具有比MDX小鼠低的TA质量(mg)。在4组MDX小鼠中，在研究结束时肌肉质量没有差异。在WT和任何MDX治疗组之间，在小于50Hz的抽搐下通过mN测量的最大绝对力没有差异。WT小鼠具有最大的最大比力(mN/mm2)，并且在MDX小鼠中治疗组之间没有显著差异。

疲劳－WT和MDX小鼠均显著疲劳。WT在恢复的10分钟内恢复力量。10分钟后MDX恢复，但仍产生比基线时更小的力。MDX－高剂量反义药物与其他MDX(盐水、非靶向对照高剂量或低剂量反义药物)之间没有差异(图2A、B)。

偏心肌肉收缩数据－图3显示与野生型对照相比的偏心肌肉收缩。与WT相比，所有MDX组均显示出力量丧失。然而，高剂量反义寡核苷酸组仅显示30％拉伸仅产生显著的力损失(p，0.0001)，而mdx－盐水显示20％拉伸产生显著的损失(p＝0.001)。这表明高剂量反义物治疗延迟了偏心收缩期间的肌肉损伤。

图4显示与mdx－盐水+/-SEM相比的偏心肌肉收缩。与MDX－盐水相比，高剂量反义物组显示20％拉伸产生显著更高的力的生成能力(p＝0.001)。这表明与mdx－盐水处理的动物相比，反义寡核苷酸药物延迟肌肉损伤并在偏心收缩后产生更大的肌力。

图5显示了与MDX－非靶向对照+SEM相比的偏心肌肉收缩。与非靶向寡核苷酸对照相比，CD49d的高剂量反义寡核苷酸显示30％拉伸的力量输出显著增加(p＝0.01)。这表明在治疗的动物中，与相同剂量的非靶向寡核苷酸对照相比，CD49d的反义药物特异性地延迟肌肉损伤，并在偏心收缩后产生更大的肌力。

恢复5分钟后，与WT相比，MDX小鼠产生显著更小的力。而WT小鼠产生相似量的力，这表示缺乏肌肉损伤。

图6显示产生的偏心肌肉收缩力作为初始收缩+/-SEM的％。MDX盐水、非靶向和低剂量反义寡核苷酸产生的力比最初产生的力小～50％。注射高剂量反义寡核苷酸的小鼠产生～70％的初始力。这显著小于WT，但显著大于盐水、非靶向和低剂量治疗的MDX小鼠。

生物化学血液标志物－图7显示WT和MDX－盐水、非靶向寡核苷酸和(高和低剂量)治疗的小鼠的血液中的肌酸激酶(CK)水平。在治疗6周后在WT和MDX小鼠的血液中测量肌肉CK水平(U/L)。CK是一种循环蛋白，可用作评价肌肉损伤的间接标志物。与WT相比，在所有MDX样品中观察到循环CK的显著增加，然而在MDX组中没有观察到治疗之间的差异(图7)。

脾脏中的免疫细胞：表达CD49d细胞表面标志物的T细胞的减少

施用至小鼠的寡核苷酸药物从血液快速分布到组织，包括分布到含有白细胞的初级和次级淋巴器官。收集脾脏、淋巴器官，并分离细胞用于白细胞的流式细胞计量术分析。使用荧光标记的抗体评估包括反义寡核苷酸靶细胞表面分子CD49d(VLA-4的α链)水平的各种细胞表面标志物，所述抗体由激光激发以发射不同波长的光。与盐水对照相比，用高剂量的针对CD49d的反义寡核苷酸ISIS 348574(20mg/kg，皮下注射)治疗的小鼠的脾脏中CD49d阳性T细胞计数减少(数据未显示)。

实施例9

实施例4中9例患者研究的结果：

实施例4中的9例患者，12至18岁(平均14.9(SD2.1)岁)，每周一次以25mg皮下注射给药ATL1102，持续24周，并使用上肢性能模块(PUL2.0)和淋巴细胞调节潜力进行评估，如通过流式细胞计量术评估淋巴细胞、CD4和CD8+T细胞以及CD4+CD49d+和CD8+CD49d+T细胞的数目和百分比所确定的。

第24周相对于基线的平均PUL 2肢体肌肉功能数据

在24周，分别与从Pane等人(2018)建立的匹配对照组(n＝20，39 24周测量值)中的-2.00(3.018)和-1.333(2.043)相比，ATL1102治疗的患者显示平均(SD)总PUL2.0评分+0.89(2.89)(p＝0.010)和PUL2.0中位肘关节(Mid-Level Elbow)评分+0.11(1.27)(p＝0.010)统计学显著改善。

24周时，与匹配对照组的平均变化-0.538(1.295)、-0.128)0.951)和-0.282(0.605)相比，ATL1102组显示出PUL2.0高位肩关节+0.86(2.67)、远端腕关节+0.11(0.60)和PUL2.0条目+0.11(0.60)的平均评分的改善，但差异不显著(p＝0.182，0.349和0.084)。匹配的对照数据与来自Pane等人的数据一致，表明不能行走的患者的PUL2.0在1年和2年内下降。

9位参与者中的7位已经证明在给药ATL1102 24周后他们的PUL 2.0评分从基线改善或没有变化。ATL1102治疗的患者显示总PUL2.0评分改善或无变化的频率为78％，相比之下，匹配对照组为33％。

ATL1102治疗的患者显示PUL2.0的显著平均改善以及相对于匹配的对照组患者具有更高频率的PUL2.0改善或维持。

第24周相对于基线的平均肌肉脂肪分数数据和萎缩数据

MRI用于评估在中央切片中跨六组肌肉的前臂背侧组、四组肌肉的手掌组和ECRLB-Br肌肉，以及在中央、近端和远端切片中跨总肌肉区室的脂肪分数％作为六组测量值，对于该六组测量值，存在六个月的数据，如Ricotti等人2016在表2中所报告的，该表以其全文并入本文。

在24周时，9例ATL1102治疗的患者表现出脂肪％的平均降低，表明在所有6组肌肉脂肪测量中，骨骼肌脂肪含量相比于基线有所改善。这与脂肪％的增加相反，表明Ricotti等人(2016)报道的肌肉脂肪含量恶化。与骨骼肌脂肪含量恶化相比，9例ATL1102治疗的患者的平均总脂肪％在所有肌肉组中近端切片减少-2.14％、中心切片减少-0.52％和远端切片减少-5.14％，背侧中心减少了-0.88％、掌侧中心减少了-0.57％、ECRLB-Br中心减少了-0.12％，而在Ricotti等人(2016)报道的不能行走的患者组(n＝7，24周测量)中，平均脂肪％分别增加了+4.5、+3.9、+2.2、+5.5、+0.7和+6.1。

ATL1102治疗的患者的萎缩评估为0、2和3。在第12周，在更多患者中，掌侧和背侧肌肉远端方向的萎缩似乎比基线减少，但在第24周没有获得这样的远端数据。在第24周，在每个象限中，与基线相比，相似％的患者分级，表明稳定性。这与标准剂量(0.75mg/kg/天泼尼松或0.9mg/kg/天地夫可特)的延长治疗相反，后者可导致肌肉萎缩。

第24周相对于基线的个体PUL 2肢体肌肉功能数据

评估了8例DMD患者在给药24周后与基线相比关于ATL1102和皮质类固醇的的PUL2.0数据。PUL 2.0总功能评分显示与基线相比平均增加1分。1例患者获得+7分，3例患者获得+2分，2例患者无变化，1例患者损失2分，1例患者自基线损失3分。另一位未服用皮质类固醇的患者(10)在24周后与基线相比PUL2评分没有变化。

将结果制成表格并图示于图8中。在给药24周后，评估复服ATL1102和皮质类固醇的所有DMD患者相比于基线的第24周和第28周的CD4+CD49d。PUL2.0功能评分增加或无变化的所有6名ATL1102和皮质类固醇患者在第28周的CD4+CD49d+T细胞与第24周相比增加，PUL2.0功能评分丧失的两名ATL1102和皮质类固醇患者(患者6和患者11)在第28周的CD4+CD49d+T与第24周相比进一步减少。未服用皮质类固醇的患者(10)24周后PUL2评分与基线相比没有变化，第24周CD4+CD49d+T细胞与第28周相比没有变化。

该数据表明，与Pul2.0无应答性或ATL1102治疗后疾病结果的降低相比，24周给药后血液CD4+CD49d+T细胞改变与疾病结果改善或稳定的PUL2.0应答性相关。PUL2.0中的功效倾向于用给药后CD4CD49d T细胞的增加来指示，或以CD4+CD49d+T细胞的减少来指示无变化和无功效或最小功效结果。CD4+CD49d+T细胞可以是使用ATL1102的总PUL2.0治疗功效的独立预测因子。

实施例10

使用患者血液CD4+CD49d T细胞变化作为PUL2.0治疗功效的预测因子或调整治疗

在一个实施方案中，在100例10-18岁、体重超过25kg的不能行走的DMD患者中进行随机双盲安慰剂对照研究。将参与者随机分成4组，每组约25例患者，3组分别接受25mg每周一次、50mg每周一次或100mg每周一次的ATL1102，最后一组接受安慰剂52周。在任何现有的皮质类固醇(CS)、泼尼松龙或地夫可特治疗的基础上，ATL1102或安慰剂每周施用一次，持续52周。

主要功效结果是评估不同剂量组52周时通过PUL-2.0(DMD上肢性能模块2.0)测量的与安慰剂相比的上肢功能能力的变化。次要功效结果包括在基线、第24周和第52周PUL2.0的变化，并且次要功效结果是循环CD4+CD49d+T细胞的数量在(i)治疗的第24周相对于第25周的变化，如果患者正在进行CS，则在第24周给药后一周、并且在施用每日剂量的CS之前和第25周剂量的ATL1102的变化，以及(ii)再次在第52周相对于第53周的变化。

本研究的所有参与者都被提供输入开放标签延长6个月(26周)。继续进行开放标签研究的患者，其在52周显示基于PUL2.0评分的应答性，与基线相比，可以继续他们的ATL1102和CS治疗。在6个月(26周)的开放标签研究中，与基线相比，在52周时显示出对ATL1102+/-CS治疗无应答性(相对于基线PUL2.0评分为例如-2、-3或更低)的患者可被置于不同剂量(较高剂量或较低剂量)的ATL1102。

开放标签治疗6个月(26周)后，将78周时患者的PUL2.0与52周时的PUL2.0进行比较，以获得PUL2.0应答性。将78周的循环CD4+CD49d+T细胞的数量与上述PUL2.0结果后(在任何CS剂量前)82周、4周的数量进行比较。对PUL2.0评分为－2、－3或更低的ATL1102显示无应答性的患者将选择改变ATL1102剂量，或将其CS剂量调整至例如标准剂量的三分之二或所例示的标准剂量的三分之一，并在进一步的随访中进一步监测PUL2.0应答性。

可以根据本发明修改给药方案，例如，如本领域技术人员所设想的，在相对于基线评估PUL2.0和PUL2.0后循环CD4+CD49d+细胞变化之前给药3个月、6个月、1年或超过1年，并相应地调整ATL1102剂量。其他修改包括在评估PUL2.0的最后一次给药后1、2、3或4周或更多周评估循环CD4+CD49d+细胞，通过芯片上流式细胞计量术测量它们。

在不脱离本发明的范围的情况下，许多修改对于本领域技术人员将是显而易见的。

本领域技术人员已知包括许多修改。

表1：TA肌肉生理特征

(a)与WT显著不同(P<0.0001)

(b)P＝0.0780

表2

第24周(给药结束时)的淋巴细胞平均细胞数相对于第28周显著降低(p＝0.051配对T检验)。

第24周的CD3、CD4、CD8、CD4+CD49d+和CD8+CD49d+细胞平均数类似地倾向于低于第28周(p＝0.056-0.073)。

*第24周的CD3+CD49d+T细胞(＝CD4+CD49d+和CD8+CD49d+细胞)的平均数在统计学上显著低于第28周(p＝0.030配对T检验)。

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<120> 治疗用途和方法

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<151> 2019-05-06

<160> 3

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (1)..(1)

<220>

<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

<222> (1)..(3)

<220>

<221> 甲基脲嘧啶

<222> (2)..(2)

<220>

<221> 2'脱氧核糖核苷

<222> (4)..(13)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (7)..(7)

<220>

<221> 甲基脲嘧啶

<222> (13)..(13)

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<221> 甲基胞嘧啶

<222> (14)..(14)

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<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

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<221> 甲基胞嘧啶

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<221> 甲基脲嘧啶

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<221> 甲基脲嘧啶

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<221> 甲基胞嘧啶

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<400> 1

cugagtctgt ttuccauucu 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 反义寡核苷酸

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<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

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<221> 2'脱氧核糖核苷

<222> (6)..(15)

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<221> 甲基胞嘧啶

<222> (9)..(9)

<220>

<221> 甲基胞嘧啶

<222> (10)..(10)

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<221> 甲基胞嘧啶

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<221> 2'-O-(2-甲氧乙基) 修饰的核糖核苷

<222> (16)..(20)

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<221> 甲基胞嘧啶

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<220>

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<221> 甲基胞嘧啶

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<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反义寡核苷酸

<400> 3

acagtgtacc tccttttctc 20

Claims

1.一种在患有或处于与肌肉萎缩、肌肉脂肪组织、或假性肥大或肌营养不良症相关的病症的风险中的受试者中改进肌肉或肢体性能的方法，所述方法包括在足以改进受试者的肌肉脂肪、肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的一种或多种标志物、体征或参数的条件下，向这类受试者定期施用药物组合物一段时间，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的针对CD49d(VLA-4的α4链)的抑制性寡核苷酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡核苷酸包括以下结构：

5'-^MeC^MeUG AGT ^MeCTG TTT ^MeU^MeC^MeC A^MeU^MeU ^MeC^MeU-3'

其中，

a)寡核苷酸的19个核苷酸间键(internucleotide linkage)中的每一个都是O,O-连接的硫代磷酸二酯；

b)自5'端起1-3位核苷酸为2'-O-(2-甲氧基乙基)修饰的核糖核苷；

c)自5'端起4-12位核苷酸为2'-脱氧核糖核苷；

e)所有胞嘧啶均为5-甲基胞嘧啶(^MeC)，

或其药学上可接受的盐或立体异构体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者患有肌营养不良症，并且所述方法改善所述受试者的肌营养不良症的一种或多种标志物、体征或症状或延缓肌营养不良症的进展。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述受试者是不能行走的。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸以每周约10-300mg的剂量施用。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸以每周约25-50mg的低剂量施用。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中施用是单一疗法或联合标准或低剂量皮质类固醇治疗。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中个体受试者中改进的肌肉性能或功能、或肢体性能或功能的一种标志物是CD4+CD49d+T细胞的水平，其中CD4+CD49d+T细胞的血液水平的给药周期完成后反弹和/或稳定性(维持)与改善的和/或稳定的肢体性能相关，以及给药周期完成后CD4+CD49d+T细胞血液水平的降低与响应于抑制性寡核苷酸治疗/在抑制性寡核苷酸治疗期间肢体性能的次优水平和/或肢体性能的丧失相关。

9.根据权利要求8所述的方法，其中在患有DMD的患者中使用PUL评分或上肢性能的临床等效测度来测量改善的肢体性能。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中CD4+CD49d+T细胞的水平在给药周期结束前和给药周期前一次给药的一周内测量。

11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测量所述受试者中CD4+CD49d+T细胞的血液水平的给药完成后反弹和/或稳定性的存在或不存在，其中所述反弹和/或稳定性的存在与改善的肌肉和/或稳定的肢体性能相关，以及CD4+CD49d+细胞的血液水平的给药后降低与响应于反义寡核苷酸治疗的次优水平的肢体性能和/或丧失相关。

12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸在以低剂量施用12至24周时降低DMD受试者中的CD4+CD49d+T细胞水平，并且如通过PUL2.0或临床上可接受的等效物所确定的，所述抑制性寡核苷酸改善和/或稳定在给药完成后在前一次给药的一周内CD4+CD49d+的血液水平反弹或稳定的受试者的肢体功能。

13.一种通过根据改进的PUL评分或临床等效评分显示改善的肌肉或肢体功能来评估个体受试者是否可能或不太可能对用针对CD49d的反义寡核苷酸的治疗作出应答的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)确定来自所述受试者的血液样品中CD4+CD49d+T细胞的水平；

(iii)在给药完成的一周内重复步骤(i)；

(iv)处理结果以确定所述受试者是否在CD4+CD49d+T细胞水平上表现出或未表现出剂量完成后反弹、稳定性或损失。

14.根据权利要求12所述的方法，其中如果所述受试者显示剂量完成后降低，则调整所述反义寡核苷酸的疗程并重复所述方法，或者其中如果所述受试者显示剂量完成后反弹，则可重复所述反义寡核苷酸疗程。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述疗程通过增加抑制性寡核苷酸施用的剂量来调整。

16.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸以每周约75-300mg的剂量施用。

17.根据权利要求12或13所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸以每周约25-50mg的低剂量施用。

18.根据权利要求12或13所述的方法，其中施用是单一疗法或联合标准或低剂量皮质类固醇治疗。