KR20220061915A - Cd49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 근이영양증의 치료 방법 - Google Patents

Cd49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 근이영양증의 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근육 지방, 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터를 변경시키기에 충분한 CD49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 투여함으로써, 근육 위축, 근육 지방 조직, 또는 가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상을 앓거나 앓을 위험에 처한 피험체에서 근육 또는 사지 수행력을 변경시키는 방법; 및 (i) 피험체로부터의 혈액 샘플에서 CD4+CD49d+ T 세포의 수준을 결정하는 단계; (ii) 일정 투약 방침으로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하고 투약 기간의 종료까지 적어도 1회 단계 (i)을 반복하는 단계; (iii) 투약 완료 1주 이내에 단계 (i)을 반복하는 단계; 및 (iv) 피험체가 투약 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 수준에서 재상승, 안정성 또는 감소를 나타내는지 나타내지 않는지의 여부를 결정하기 위해 결과를 처리하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

CD49D에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 근이영양증의 치료 방법
본 명세서는 근육 수행력을 변경시키기 위한 조성물 및 방법을 가능하게 한다.
본 명세서에서 참고문헌에 관한 세부사항은 본 명세서의 말미에 또한 나열된다.
본 명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 언급은, 이러한 선행 기술이 임의의 국가에서 일반적인 상식의 일부를 형성함을 인정하거나 제안하는 형식으로 간주되지 않으며 간주되지 않아야 한다.
근이영양증(MD)은 특정 근육 조직의 점진적 약화 및 소모(근섬유괴사), 및 골격근의 섬유 조직, 골 조직 또는 지방 조직으로의 대체를 특징으로 하는 일군의 질병이다. 남성 또는 남성 및 여성에서 발병하는 몇몇 상이한 형태의 근이영양증이 존재하고, 이들중 대부분은 유아기 및 아동기로부터 중년 또는 그 이후 동안 나타난다. 형태 및 위중성은 특히 개시 연령에 따라 다양하고, 더 어린 환자의 경우 종종 급성 진행성 질환을 겪는다.
MD의 가장 흔한 형태는 뒤센 근이영양증(DMD: Duchene muscular dystrophy), 지대형 근이영양증(LGMD: limb girdle muscular dystrophy), 베커 근이영양증(BMD: Becker muscular dystrophy), 선천성 근이영양증(CMD: congenital muscular dystrophy), 예컨대 후쿠야마 타입(Fukuyama Type) 선천성 MD, 및 미오신 결핍이 있는 선천성 MD, 안면견갑상완형(fascioscapulohumeral), 안구인두형, 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss), 및 원위 형태의 선천성 MD이다. 거의 대부분의 MD 유형은 단일-유전자 돌연변이에 의해 발생한다.
DMD 및 BMD는 X-염색체 상의 디스트로핀(dystrophin) 유전자에서의 결함과 관련된다. 디스트로핀 단백질은 근육 세포(근섬유분절)의 수축 기구(액틴 필라멘트) 및 세포골격을 세포외 기질(ECM: extracellular matrix)과 연결시키는 작용을 하고, 이때 콜라겐은 근력을 전달한다[그라운즈(Grounds MD)의 문헌, 2008]. ECM은 근육 기능 및 근육 재생에 있어서 복합적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 위축성 근섬유는 괴사, 염증 및 섬유증과 연관된다. 디스트로핀 결핍의 결과로서 진행성 질환을 유도하는 사건들의 정확한 순서는 분자 수준에서 이해되지 않는다. 로센(Rosen) 등의 문헌(2015)에 요약된 바와 같이, DMD를 앓는 어린이는 디스트로핀 결핍 근육을 갖고 있고, 근육 손상을 유도하도록 수축되기 쉬워서 근육 손상을 악화시키는 면역 시스템을 촉발시킨다. 근육 강도에 있어서의 계속되는 저하는 하지의 운동성 장애에 영향을 주고, 또한 상지의 추가적인 기능 및 스스로 돌보는 능력을 잃는데 영향을 준다. 유전자 치료법 및 엑손 스키핑(skipping) 접근법이 이상적일 수 있지만, 그의 위중성을 개선시키고 그의 진행을 지연시킬 수 있는 전략 및 제제를 개발하기 위해서, 연구자들은 질병의 성질을 이해하는데에 또한 집중한다. mdx 마우스 모델은 기작 및 중재를 조사하기 위해 사전임상적으로 널리 이용된다. 그라운즈(Grounds MD)의 문헌(2008)으로부터, 이러한 질환의 만성 및 급성 상 두 경우를 표적화하는 2단계 접근법에 대한 필요성이 확인되었다.
DMD는 정상 출산아 3,500명중 약 1명의 발생율로 주로 소년들에서 발병하는 무서운 증상이다. 소년들은 어린 시절에 걷기 힘들어져서 전형적으로 사춘기 이후에는 휠체어 신세를 지게 된다. 종종 심폐 기능에 의한 사망은, 30대에 빈번히 발생한다. BMD는 DMD와 유사하지만, 훨씬 증상이 가볍다.
코르티코스테로이드에 의한 현행 치료법은 일정 기간 동안 근육량 및 기능을 유지하기 위해 염증을 감소시킴으로써 질환의 위중성을 낮추는데 목적을 둔다. 코르티코스테로이드는 단기간일 수 있는 급성 소염 효과를 갖고, 이들의 작용 기작은 알려지지 않았다. 이들은 이들의 사용을 심각하게 제한하는 부작용으로 인해 최선이 아니고, 이들은 또한 근육 위축을 일으킬 수 있다. 0.75mg/kg/일의 프레드니솔론(Prednisolone) 및 0.9mg/kg/일의 데플라자코트(Deflazacort)는 걸을 수 있는 DMD 환자를 위한 표준 치료법이지만, 소년이 걸을 수 없게될 경우, 코르티코스테로이드(CS)의 이점에 대해서는 합의되지 않았고, 소년은 때때로 이들이 걸을 수 없게되는 경우 받는 고정된 용량(이는 감소된 mg/kg/일 용량)으로 치료를 계속해야 하거나, CS 치료를 중단할 수 있다. 소염성 NF-카파 B 약물로서의 에다살로넥센트(Edasalonexent)는 DMD를 앓는 걸을 수 있는 어린 소년에서 단일 치료법으로서 개발되고 있다. 위축의 상이한 양태를 표적화하는 임상 실험에서 몇몇 약물이 존재한다. 예를 들면, 섬유증을 표적화하는 타목시펜(Tamoxifen), 호흡 기능을 표적화하는 이데베논(Idebenone), 및 코돈 스키핑을 중단하기 위해 사용하는 아탈루렌(Ataluren)은 MD를 위한 임상 실험중에 있다. 디스트로핀 유전자의 표적화된 엑손 스키핑을 유도함에 의한 DMD에 대한 올리고뉴클레오티드 치료법은 혼합된 결과에 의해 평가되어 왔다. 모폴리노 올리고뉴클레오티드인 에테플리르센(Eteplirsen)은, 엑손 51 스키핑이 가능한 엑손 51에서의 유전자 종결 코돈 돌연변이를 갖는 DMD 어린이의 13%에서 보강 연구로 진척중인 반면, 엑손 51 스키핑을 위한 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, 드리사페르센(Drisapersen)은 활성 및 FDA 승인을 달성하지 못하였다.
국제 특허출원 공개공보 제WO 2011/020874 A1호[인섬(Inserm)]는 DMD를 앓는 피험체에서 고 발현 CD49d 및/또는 CD29의 상승된 수준, 및 질환 위중성과의 상관관계를 개시한다.
코르티코스테로이드 치료는 일반적으로 DMD에서 사지 수행력의 감소(예를 들어, 감소된 PUL1 또는 PUL2 수행력)와 연관된다.
현행 치료법에 결함이 존재하여 추가적인 치료학적 접근법에 대한 긴급한 필요성이 요구된다.
본 명세서 전반을 통해, "포함하다", 또는 "포함하는" 또는 "포함한"과 같은 변형어는 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들, 또는 단계들의 그룹을 포괄하지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들, 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해할 것이다.
본원에서 사용될 경우, 단일 형태인 "하나의", "한개의" 및 "그"는 문맥상 달리 명확히 지시하지 않는 한, 복수개의 양태를 포함한다. 이와 같이, 예를 들면, "하나의 조성물"에 대한 언급은 단일 조성물, 뿐만 아니라 둘 이상의 조성물을 포함하고; "하나의 제제"에 대한 언급은 한가지 제제, 뿐만 아니라 둘 이상의 제제를 포함하며; "본 개시내용"에 대한 언급은 본 개시내용의 단일 양태 및 다중 양태를 포함하고, 나머지도 마찬가지이다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 피험체에서 근육 또는 사지 수행력을 변경시키는 방법을 가능하게 한다. 본원에서 근육 또는 사지 수행력을 "변경시킴"에 대한 언급은 근육 또는 사지 수행력을 향상시키고, 감소된 근육 또는 사지 수행력의 진행을 지연시키거나, 이를 유지시키거나 안정화시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 피험체는 근육 위축, 근육 지방 조직, 또는 가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상의 위험을 갖거나 위험에 처해 있다. 본 개시내용은 MD로 예시되지만, 본 발명의 실시태양은 근육 지방 조직, 근육 위축 또는 비대와 연관된 증상으로 확장된다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 피험체에서 근육 지방, 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터를 변경시키기에 충분한 조건하에 일정 기간 동안 이러한 피험체에게 약학적으로 허용가능한 담체 및 치료학적 효과량의 CD49d(VLA-4의 알파 4 쇄)에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 주기적으로 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 근이영양증을 앓는 피험체에서 근육 지방, 근육 또는 사지 수행력 또는 기능을 향상시키기에 충분한 조건하에 일정 기간 동안 이러한 피험체에게 약학적으로 허용가능한 담체 및 치료학적 효과량의 CD49d(VLA-4의 알파 4 쇄)에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 주기적으로 투여함을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA-DNA 혼성체이다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함한다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 근이영양증을 갖고, 본 방법은 피험체에서 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나 근이영양증의 진행을 지연(안정화)시킨다.
상지 수행력(PUL: Performance of the Upper Limb) 2.0 또는 이전의 1.2 등급은, 매일 매일에 영향을 주는 실생활에서의 수행력의 감소를 반영하고 임상적 치료 선택을 공지하는 방식으로, 피험체에서 근육 약화 및 사지 기능 감소의 근위에서 원위로의 진행을 측정하거나 평가하도록 고안된 기능적 척도이다. 상지 기능 시험은 걷지 못하는 MD 피험체를 위해 고안되었지만, 걸을 수 있는 피험체에게 적용한다. 하지 기능에 대한 동등한 측정법은 하지 수행력의 감소를 겪는 걸을 수 있는 피험체에 대해 동일한 원칙을 따른다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 치료 이전에 CD49d+ T-세포의 상승된 수준을 갖는다.
본원에서 결정된 바와 같이, CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는, 치료 이전의 기선 수준과 비교하여 MD 피험체에서 CD49d+ T-세포의 수준 감소를 유지시킨다.
하나의 실시태양에서, 본 치료 방법은, 억제성 올리고뉴클레오티드를 단일치료법으로서, 또는 코르티코스테로이드 치료와 병용하여 투여할 경우, 근육 또는 사지 수행력을 향상시키거나, 근육 또는 사지 수행력의 감소를 지연(안정화)시킨다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 근육 지방 조직 수준, 근육 수행력을 향상시키거나, 근육 지방, 근육 수행력의 감소를 지연(안정화)시키고, 이때 근육 지방 또는 근육 수행력에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터는 근육 가성비대, 위축, 또는 근이영양증과 연관된 증상을 갖는 피험체에서 강도, 힘, 지구력, 길이를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 변경되거나 증진/향상된 수행력은 실시예에 기재된 바와 같이 편심성(eccentric) 근육 수축을 수행하는 증진되거나 증가된 능력이다. 이러한 효과는, 예를 들면, 안전하게 아래층으로 내려가는 능력이다.
실시예는 6주 투약 계획 동안의 본 개시내용의 방법의 실행을 예시한다. 숙련가라면 투약 계획은 불확실한 상황, 피험체 및 이들의 건강에 맞춰 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
본 개시내용에 따라서, 본 발명자는 억제성 올리고뉴클레오티드 치료에 더욱 반응성이고 향상되거나 안정한 근육 또는 사지 수행력, 및 근육 지방 조직 수준에서의 향상을 나타내는 MD 피험체의 집단을 특정지웠다. 이들 피험체는 본원에 기재된 바와 같이 투약을 완료함으로써 향상된 PUL2.0 스코어를 나타내고, 치료 과정 동안 또는 종료시 CD4+CD49d+ T-세포의 수준과 같은 대조 수준과 비교하여 CD4+CD49d+ T-세포의 수준이 투약 완료후 재상승하거나 안정성(유지)을 나타냄을 특징으로 한다. "재상승"은, 억제성 올리고뉴클레오티드가 여전히 투여되는 경우, 마지막 투약시 또는 투약후 대략 일주일 이내에 채취된 혈액중의 CD4+CD49d+ T 세포의 수준이 투약 종료 이전의 혈액중의 CD4+CD49d+ T-세포의 수준과 같은 대조군 수준에 비해 더 높거나 이를 초과함을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 임의의 재상승의 존재 또는 정도는, 투약 완료 후 CD49d+ T-세포 또는 이의 표지(예컨대 라벨 강도)의 재상승을 반응자 또는 무반응자 상태를 나타내는 예정된 대조군과 비교함으로써 결정될 수 있다.
관련된 실시태양에서, 본 발명자는, 단일치료법으로서의 또는 낮은 용량의 코르티코스테로이드와 병용하는 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 예시된 바와 같이, 억제성 올리고뉴클레오티드 치료에 최적으로 반응하지 않거나 불량하게 반응하고 억제성 올리고뉴클레오티드에 의한 치료의 결과로서 향상된 근육 또는 사지 수행력을 나타내지 않는 개별 피험체의 집단을 특정지웠다. 이들 피험체는 본원에 기재된 바와 같이 투약을 완료함으로써 향상된 PUL2.0 스코어를 실질적으로 나타내지 않거나, 투약 완료 후 CD4+CD49d+ T-세포의 수준이 재상승되지 않음을 특징으로 한다. "재상승"은 억제성 올리고뉴클레오티드가 여전히 투여되는 경우, 마지막 투약시 또는 투약 후 대략 일주일 이내에 채취된 혈액중의 CD4+CD49d+ T 세포의 수준이 투약 종료 이전의 혈액중의 CD49d+ T-세포의 수준과 같은 대조군 수준에 비해 더 높거나 이를 초과함을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 임의의 재상승의 존재 또는 정도는 투약 완료 후 CD49d+ T-세포 또는 이의 표지(예컨대 라벨 강도)의 재상승을 반응자 또는 무반응자 상태를 나타내는 예정된 대조군과 비교함으로써 결정될 수 있다. 이들 "무반응" 피험체는 억제성 올리고뉴클레오티드 치료법에 반응하여/치료법 동안에 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준에서 투약 기간 완료 후 감소를 나타내거나 사지 수행력의 최적 미달 수준 및/또는 사지 수행력의 감소와 연관됨을 특징으로 한다.
따라서 본 발명의 하나의 실시태양에서, 개별 피험체에서 변경된 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에 대한 하나의 표지는 CD4+CD49d+ T 세포의 수준이고, 이때 투약 기간 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준의 재상승 및/또는 안정성(유지)은 향상되고/되거나 안정한 사지 수행력과 연관되고, 투약 기간 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준의 감소는 억제성 올리고뉴클레오티드 치료법에 반응하여/치료법 동안에 사지 수행력의 최선이 아닌 수준 및/또는 사지 수행력의 감소와 연관된다.
하나의 실시태양에서, PUL 스코어 또는 상지 수행력의 임상적으로 동등한 측정법을 사용하여 DMD를 앓는 환자에서 향상된 사지 수행력을 측정한다.
본 방법의 하나의 실시태양에서, 투약 기간의 종료 전, 및 투약 기간 동안 이전 투약의 1주일 이내에 CD4+CD49d+ T 세포의 수준을 측정한다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 MD로 인하여 걷지 못한다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 DMD로 인하여 걷지 못한다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 사춘기 이후이다.
따라서 하나의 실시태양에서, 본 방법은 피험체에서 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준이 투약 완료 후 재상승하고/하거나 안정적인지의 여부를 측정함을 추가로 포함하고, 이때 재상승 및/또는 안정함의 존재는 향상된 근육 및/또는 안정한 사지 수행력 및 투약 후 CD4+CD49d+ 세포의 혈액 수준 감소와 연관되고, 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료법에 대한 반응으로 사지 수행력의 최적 미달 수준 및/또는 감소와 연관된다.
하나의 실시태양에서, 억제성 올리고뉴클레오티드는 12 내지 24주 동안 낮은 용량으로 투여될 경우 DMD를 앓는 피험체에서 CD4+CD49d+ T 세포의 수준을 감소시키고, PUL2.0 또는 임상적으로 허용가능한 동등한 측정법에 의해 결정될 경우, CD4+CD49d+의 혈액 수준이 투약 완료 후 이전 투약 완료 1주일 이내에 재상승하거나 안정한 피험체에서 사지 기능을 향상시키고/시키거나 안정화시킨다.
이러한 방법은 치료 방법, 치료법을 선별하는 방법, 특정 치료 또는 특정 제제, 제제의 조합 또는 투약 섭생에 대한 피험체 또는 집단의 반응성을 결정하는 방법, 또는 특별한 용량 또는 투약 계획으로의 치료, 최적의 용량, 제제, 제제의 조합, 투약 기간 등을 최적화하기 위하여 피험체 또는 집단을 계층화하는 방법에 있어서 하나의 단계로서 유용하다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서는 피험체가 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료에 쉽게 반응하는지의 여부를 향상된 PUL1/2 스코어에 따라서 향상된 근육 또는 사지 기능을 나타내는지에 의해 평가하는 방법을 가능하게 한다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서는 피험체가 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 단일치료법에 쉽게 반응하는지의 여부를 향상된 PUL1/2 스코어에 따라서 향상된 근육 또는 사지 기능을 나타내는지에 의해 평가하는 방법을 가능하게 한다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서는 피험체가 CD49d에 대한 낮은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 단일치료법에 쉽게 반응하는지의 여부를 향상된 PUL1/2 스코어에 따라서 향상된 근육 또는 사지 기능을 나타내는지에 의해 평가하는 방법을 가능하게 한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서는 피험체가 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료에 쉽게 반응하지 않는지의 여부를 향상된 PUL1/2 스코어 또는 이에 동등한 측정법에 의해 결정될 경우 향상된 근육 또는 사지 기능을 나타내는지에 의해 평가하는 방법을 가능하게 한다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 테라노스틱(theranostic) 방법은 개별 피험체가 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료에 쉽게 반응하는지 반응하지 않는지의 여부를 향상된 PUL 스코어 또는 임상적으로 동등한 스코어에 따라서 향상된 근육 또는 사지 기능을 나타내는지에 의해 평가하기 위해 제공되고, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
(i) 피험체로부터의 혈액 샘플에서 CD4+CD49d+ T 세포의 수준을 결정하는 단계;
(ii) 일정 투약 방침으로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하고 투약 단계의 종료까지 적어도 1회 단계 (i)을 반복하는 단계;
(iii) 투약 완료 1주 이내에 단계 (i)을 반복하는 단계; 및
(iv) 피험체가 투약 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 수준에서 재상승을 나타내는지, 안정성을 나타내는지 또는 감소를 나타내는지를 결정하기 위해 결과를 처리하는 단계.
하나의 실시태양에서, 피험체가 투약 완료 후 감소를 나타낸다면, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투약 방침을 조정하고, 방법을 반복하거나, 피험체가 투약 완료 후 재상승을 나타낸다면, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 동일한 투약 방침을 반복할 수 있다.
예를 들면, 하나의 실시태양에서, 투여되는 억제성 올리고뉴클레오티드의 용량을 증가시킴으로써 투약 방침을 조정한다.
하나의 실시태양에서, 조정된 억제성 올리고뉴클레오티드를 1주 당 약 75mg 내지 300mg 사이로 투약한다.
하나의 실시태양에서, 투약 방침을 위해 약 25 내지 50mg/주의 낮은 용량으로 억제성 올리고뉴클레오티드를 투여하거나 초기에 투여한다.
하나의 실시태양에서, 투여 또는 초기 투여는 단일치료법이거나, 표준 또는 저 용량 코르티코스테로이드 치료와 병용된다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 PUL 또는 임상적으로 허용가능한 동등한 측정법에 의해 기선 및 치료 종료시 근육 또는 사지 기능을 평가함을 추가로 포함한다.
따라서, 다른 표현으로, 본 개시내용은 본원에 기재되거나 청구된 치료학적 방법 또는 테라노스틱 방법에 사용하기 위한, 또는 이에 사용하기 위한 약제 또는 테라노스틱 제제의 제작 또는 제조에 있어서의 본원에 기재되거나 청구된 바와 같은 억제성 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물을 제공한다.
다른 표현으로, 본 개시내용은 본원에 기재되거나 청구된 치료학적 방법 또는 테라노스틱 방법에 사용하기 위한 약제의 제작 또는 제조에 본원에 기재되거나 청구된 바와 같은 억제성 올리고뉴클레오티드 또는 약학 조성물을 사용할 수 있도록 한다.
상기 요약은 본 개시내용의 모든 실시태양에 대한 완전한 설명이 아니며 어떠한 방식으로도 그와 같이 간주되지 않아야 한다.
특허 또는 특허 출원 파일은 적어도 1개의 컬러 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 복사본은 필요한 요금을 요청받고 지불할 경우 특허청에 의해 제공될 것이다.
명세서에 혼입되어 그의 일부를 형성하는 첨부된 도면은 본 발명의 몇몇 실시태양을 예시하고, 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a 및 1b는 시험 및 대조 마우스에 대한 기선에서 및 치료 6주에 걸친 그립(grip) 강도(평균 및 SEM)를 나타내는 데이터를 그래프로 표시한다.
도 2a 및 2b는 근육 피로 회복에 있어서 MDX 고 용량 안티센스 약물 치료 및 기타 MDX 또는 대조군 치료 사이에 차이가 관찰되지 않음을 나타내는 데이터를 그래프로 표시한다. 도 2b에서 4개의 세로 막대로 구성된 각 세트는 좌측에서 우측으로 시간에 따른 힘 생산을 보여준다: MDX-생리식염수; MDX-스크램블(scrambled); MDX-고 용량; 및 MDX-저 용량.
도 3은 야생형 대조군과 비교되는 편심성 근육 수축을 나타내는 데이터를 그래프로 표시한다(+/- SEM). 고 용량 억제성 올리고뉴클레오티드 치료는 편심성 수축 동안 근육 손상을 지연시킨다.
도 4는 MDX-생리식염수 처리된 마우스와 비교되는 편심성 근육 수축을 나타내는 데이터를 그래프로 표시한다. 고 용량 억제성 올리고뉴클레오티드 그룹은 MDX 대조군과 비교하여 유의적으로 더 높은 힘 생산 능력 및 약물 지연된 근육 손상을 나타내었다.
도 5는 MDX 스크램블 대조군과 비교되는 편심성 근육 수축을 나타내는 데이터를 그래프로 표시한다. 고 용량 억제성 올리고뉴클레오티드는 동일한 용량에서 스크램블 음성 대조군과 비교하여 특별히 근육 손상을 지연시키고 편심성 수축 이후 더 큰 근력을 생산한다.
도 6은 편심성 근육 수축 이후 생산된 힘을 나타내는 데이터를 그래프로 표시한다. MDX 대조군은 생산된 초기 힘에 비해 약 50% 적은 힘을 생성하였지만, 고 용량 억제성 올리고뉴클레오티드가 주입된 마우스는 유의적으로 더 큰 힘, 즉 생산된 초기 힘의 약 70%를 생성하였다.
도 7은 WT 및 MDX-생리식염수, 스크램블 및 치료(고 용량 및 저 용량) 마우스의 혈액에서의 크레아틴 키나아제(creatine kinase) 수준을 보여주는 데이터를 그래프로 표시한다. 야생형 대조군과 비교하여 모든 MDX 마우스에서 유의적인 증가가 관찰되었다.
도 8은 치료에 잘 반응하여 기선에 비하여 증진된 상지 수행력을 갖는 피험체에서 CD4+CD49d+ T 세포 재상승 효과를 나타내는 데이터를 표 및 그래프로 표시한다. 유사하게, T-세포 수가 감소된 피험체는 PUL2.0에 의해 상지 수행력의 감소를 나타낸다.
핵심 서열 목록
서열 번호 1: 인간 α4 인테그린 안티센스 화합물(ATL1102)
서열 번호 2: 뮤린(murine) α4 인테그린 안티센스 화합물(ISIS348574)
서열 번호 3: 서열 번호 2에 대한 음성 대조군(ISIS358342)
구체적인 실시태양의 상세한 논의
본 개시내용은 제제, 제제의 특정 제형 및 다양한 의학적 방법론을 위한 특별한 선별 절차에 제한되지 않고, 이와 같이 다양할 수 있다. 달리 규정되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 통상적인 숙련가가 상식적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 재료 및 방법은 본 개시내용을 실행하거나 시험하기 위해 사용될 수 있다. 당분야의 정의 및 용어 및 당분야의 숙련가에게 공지된 기타 방법을 위해 실무자는 어수벨(Ausubel) 등의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 47, John Wiley & Sons, New York, 1999]; 콜로윅(Colowick) 및 카플란(Kaplan)(편저자)의 문헌[Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.]; 웨이어(Weir) 및 블랙웰(Blackwell)(편저자)의 문헌[Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications, 1986]; 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed., Mack Easton, Pa. (1990))]; 호가트(Hogarth) 등의 문헌[Nature Communications 8:14143, 2017]; 가톤(Garton) 등의 문헌[The American Journal of Human Genetics 102, 845-857, 2018]을 참조한다. 상지 기능 시험의 개정된 버전(PUL2.0)을 사용하여 DMD를 앓는 걸을 수 있는 소년 및 걷지 못하는 소년으로 구성된 규모가 큰 코호트(cohort)에서 상지 기능에서의 24 개월 변화를 보고하는 페인(Pane) 등의 문헌[PLOS One, 13(6) 1-8, June 20, 2018], 및 특별히 이의 결과 부분을 참조한다.
용어 "피험체"는 MD를 앓는 것으로 진단된 인간 피험자 또는 개개인 또는 임상 연구 모델 동물을 포함한다.
용어 "피험체"는 인간 또는 인간 이외의 동물을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 인간 CD49d(VLA-4의 알파 4 쇄)에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 투여함을 포함하는, 피험체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 예시적인 억제성 올리고뉴클레오티드는 단리된 또는 합성 안티센스 RNA 또는 DNA, iRNA, siRNA 또는 siDNA, miRNA, miRNA 모방체, shRNA 또는 DNA 및 안티센스 DNA 또는 RNA 또는 DNA:RNA 혼성체를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 근육 수행력을 변경시킬 필요가 있는 피험체에게 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 치료학적 효과량의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 주기적으로 투여함을 포함하는, 상기 피험체에서 근육 수행력을 변경시키는 방법을 제공한다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
하나의 실시태양에서, 피험체에서 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키고 근이영양증의 진행을 지연시키기에 충분한 조건하에 일정 기간 동안 투여한다.
하나의 실시태양에서, 피험체에서 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터를 향상시키기에 충분한 조건하에 일정 기간 동안 투여한다. 본원에서 근육 수행력에 대한 언급은 운동 수행력을 포함하고, 근육 위축, 또는 가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상에서 강도, 힘, 지구력 및 길이와 같은 속성을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서는 근육 위축을 앓거나 근육 위축/가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상의 위험을 갖거나 위험에 처해 있는 피험체에서 근육 수행력을 향상시키거나 근육 수행력의 감소를 지연시키는 방법을 가능하게 하고, 이러한 방법은 약학적으로 허용가능한 담체 및 치료학적 효과량의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서는 근육 위축을 앓거나 근육 위축, 가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상을 갖는 피험체 또는 근육 위축, 가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상으로 발전될 위험이 있는 피험체에서 근육 강도/근력 및 사지 기능중 한가지 또는 두가지를 포함하는 근육 수행력을 향상시키거나 근육 강도/근력 및 사지 기능중 한가지 또는 두가지에서의 감소의 진행을 지연시키기 위해 치료학적 효과량의 인간 CD49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 필요한 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함하는, 필요한 피험체에서 근이영양증 또는 근육 위축/가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 가성비대, 위축, 또는 근이영양증은 면역 매개성이다. 하나의 실시태양에서, 가성비대, 위축 또는 근이영양증은 염증 매개성이다. 하나의 실시태양에서, 증상은 신경성이거나 다른 질환일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 가성비대, 위축, 또는 근이영양증과 연관된 증상을 갖는 피험체에서 근육 지방 또는 근육 수행력에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터를 향상시키거나, 근육 지방, 근육 수행력(강도, 동력, 지구력, 길이 포함)에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터의 진행 또는 진행 속도를 지연시키기에 충분한 조건하에 일정 기간 동안 투여한다.
하나의 실시태양에서, 근육 지방, 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능의 향상은 단일치료법 또는 병용 치료를 개시한지 6 내지 8주 또는 6 내지 12주 이내에 신속히 발생한다.
하나의 실시태양에서, 표준 코르티코스테로이드 치료와 함께 투여를 병용한다.
하나의 실시태양에서, 코르티코스테로이드를 낮은 용량으로 투여한다. 저 용량 코르티코스테로이드에 대한 언급은 표준 용량의 2/3, 1/2, 1/4, 및 1/3을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 코르티코스테로이드를 낮은 용량으로 투여한다. 저 용량 코르티코스테로이드에 대한 언급은 표준 용량의 4/5, 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 및 1/5을 포함한다. 또 다른 실시태양에서 코르티코스테로이드 용량은 경구 프레드니솔론의 경우 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70mg/kg/일이거나, 데플라자코트의 경우 10, 20, 40, 40, 50, 60, 70 또는 80mg이다.
하나의 실시태양에서, 억제성 올리고뉴클레오티드의 투여는 표준 용량 또는 저 용량의 코르티코스테로이드의 존재하에 치료학적으로 효과적이다.
하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 코르티코스테로이드의 부재하에 치료학적으로 효과적이다.
하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 코르티코스테로이드의 부재하에 치료학적으로 효과적이고, 이때 피험체는 걸을 수 있다.
하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 코르티코스테로이드의 부재하에 치료학적으로 효과적이고, 이때 피험체는 걸을 수 없다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 근육 세포 또는 조직을 인간 CD49d(VLA-4의 알파 4 쇄)에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드와 접촉시킴을 포함하는, 근육 수행력을 변경시키는 방법을 제공한다.
근육 세포 또는 조직을 생체외에서, 국소적으로 또는 생체내에서 접촉시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 접촉은 근육 수행력을 증가시키거나, 근이영양증의 진행 속도를 지연시키거나 감소시키기 위해 필요한 피험체에게 억제성 올리고뉴클레오티드를 투여함으로써 이루어 진다.
하나의 실시태양에서, 변경된 근육 수행력은 증가된 근육 강도, 및 또는 증가된 근육 기능을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 증가된 근육 강도는 증가된 편심성 수축이다. 편심성 수축은 보행, 및 제어되고 통증 없는 사지의 움짐임에 있어서 중요한 근육 섬유를 신장시키는 동안의 수축이다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA-DNA 혼성체이다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 MD로 인해 걷지 못한다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 사춘기 이후이다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 CD4+ 및/또는 CD 8+ T 세포 수준에 대해 모니터링함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 감소된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 수준에 대해 모니터링함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 Ml 대식세포 또는 HLADR+ 단핵구에 대해 모니터링함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 감소된 M1 대식세포 또는 HLADR+ 단핵구에 대해 모니터링함을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 MD 또는 이영양성 근섬유에 대한 하나 이상의 표지, 예컨대 면역 세포 또는 이에 의해 생산된 면역조절 인자의 수준 또는 수, 염증성 표지의 수준 또는 섬유증에 대한 표지의 수준 또는 근육 상태에 대한 표지의 수준을 결정함을 포함한다.
하나의 실시태양에서, MD 또는 MD 진행 또는 이영양성 근섬유에 대한 하나 이상의 표지로는 면역 세포 또는 이에 의해 생산된 면역조절 인자의 수준 또는 수, 염증성 표지의 수준 또는 섬유증에 대한 표지의 수준이 포함된다.
하나의 실시태양에서, 근육 수행력에 대한 표지 또는 근육 상태에 대한 표지의 수준으로는 근육 강도, 동력, 지구력 및 길이 기능이 포함된다.
근육 상태에 대한 표지로는, 제한없이, 운동 근육 기능에 대한 표지, 근육 섬유증 또는 이의 부재를 지시하는 표지, 근육 변성 또는 재생을 지시하는 표지, 심장 기능의 표지 및 폐 기능에 대한 표지가 포함된다.
하나의 실시태양에서, MD 또는 이영양성 근섬유에 대한 향상된 하나 이상의 징후로는 향상된 사지 기능, 신체 근육 기능, 심장 및/또는 폐 기능이 포함된다.
하나의 실시태양에서, 본 방법은 MD 또는 이영양성 근섬유에 대한 하나 이상의 징후의 수준 또는 존재를 결정함을 포함한다. 예시적인 징후로는 사지 기능, 신체 근육 기능, 심장 및/또는 폐 기능이 포함된다.
하나의 실시태양에서, MD 또는 이영양성 근섬유에 대한 하나 이상의 증후로는 삶의 질 요인, 예컨대 에너지 수준, 행복감, 보행에 대한 인지된 용이함, 상지 기능 활동 등이다.
하나의 실시태양에서, "필요한" 피험체로는 MD의 유전적 및/또는 임상적 진단을 받고 이영양성 근섬유 및 염증성 표지가 비교적 낮은 수준인 피험체가 포함된다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 정상적이거나 단지 약간 상승된 수준의 염증 세포를 나타낸다. 염증 세포로는 T 세포(CD4, CD8), B-세포(CD-19), 과립구(호중구, 호염기구, 및 호산구)가 포함된다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 정상적이거나 단지 약간 상승된 수준의 CD49d 세포를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 정상적이거나 단지 약간 상승된 수준의 CD49d T 세포를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 정상적이거나 단지 약간 상승된 수준의 면역 세포 표지, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD49d, CD29 및 HLA-DR을 나타낸다.
표지, 예컨대 세포 또는 단백질/핵산 또는 지질 분석을 위해 적합한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 제한없이, 유세포분석, 비이드 기술(bead technology) 및 ELISA-기반의 방법, 크로마토그래피 및/또는 MS 방법, 혼성화 또는 서열분석 기반의 방법이 포함된다.
추가의 실시태양에서, MD를 진단받은 피험체는 심각한 근육 괴사 및 염증이 수반된, 유의적으로 상승되거나 급성 수준의 심각한 이영양성 근섬유를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 정상적인 건강한 대조군과 비교하여 유의적으로 상승된 수준의 CD49d T-세포를 나타낸다.
하나의 실시태양에서, 피험체에서 MD의 형태는 뒤센 근이영양증(DMD), 지대형 근이영양증(LGMD), 베커 근이영양증(BMD), 선천성 근이영양증, 예컨대 후쿠야마 타입 선천성 MD, 및 미오신 결핍이 있는 선천성 MD, 안면견갑상완형, 안구인두, 에머리-드레이푸스, 및 원위 근이영양증으로 구성된 군에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 DMD 또는 BMD를 앓고, 걷지 못한다.
하나의 실시태양에서, 피험체는 DMD 또는 BMD를 앓고, 사춘기 이후이다.
본 개시내용의 또 다른 형태에서, 실시태양은 현재 기재된 방법 또는 용도에 사용될 경우의 약학 조성물, 피험체에서 근이영양증을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 기재된 조성물의 용도, 현재 기재된 방법에 사용하기 위한 약학 조성물에 관한 것으로 간주된다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 근육 가성비대, 또는 근이영양증과 연관된 증상을 치료 또는 예방하거나, 가성비대 및/또는 근이영양증의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서의 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 근육 수행력을 증진시킬 필요가 있는 피험체에서 근육 수행력을 증진시키기 위한 약제의 제조에 있어서의 하기 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 필요한 피험체에서 근육 수행력을 증진시키거나, 근육 수행력을 유지시키거나, 근육 수행력의 감소 속도를 저하시키기 위한 약제의 제조에 있어서의 하기 서열 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용도를 제공한다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
하나의 실시태양에서, 증진된 근육 수행력은 단일치료법 또는 병용 치료를 개시한지 6 내지 8주 이내의 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에서의 향상과 연관된다.
하나의 실시태양에서, 근육 수행력은 근육 기능이거나 근육 기능에 대한 공지된 평가법을 사용하여 측정된다.
하나의 실시태양에서, 근육 수행력은 근육 강도이거나 근육 강도에 대한 공지된 평가법을 사용하여 측정된다.
하나의 실시태양에서, 변경된 또는 증진된 수행력은 실시예에 기재된 바와 같은 편심성 근육 수축을 수행하는 증진된 또는 증가된 능력이다.
또 다른 실시태양에서, 상세한 설명은 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 피험체에서 근이영양증을 치료 또는 예방하거나 이의 진행을 지연시키는데 사용될 수 있도록 하고, 이때 진행의 지연은 단일치료법 또는 병용 치료를 개시한지 6 내지 8주 이내의 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에서의 향상과 연관된다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
하나의 실시태양에서, 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에서의 향상은 단일치료법 또는 병용 치료를 개시한지 6 내지 8주 이내에 신속히 발생한다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용은 피험체에서 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나 근이영양증의 진행을 지연시키기 위해 치료학적 효과량의 인간 CD49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 필요한 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함하는, 피험체에서 근이영양증을 치료하는 방법을 가능하게 한다.
하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 표준 용량 또는 저 용량 코르티코스테로이드 치료와 병용되거나 이와의 보조적 치료이다.
하나의 실시태양에서, 코르티코스테로이드를 낮은 용량으로 투여한다.
하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여는 코르티코스테로이드 치료법의 부재하에 효과적이다.
또 다른 실시태양에서, 근이영양증을 앓는 피험체에서 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나 근이영양증의 진행을 지연시키기 위한 약제의 제조에 있어서의 인간 CD49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드의 용도가 개시된다. 하나의 실시태양에서, 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에서의 향상은 단일치료법 또는 병용 치료를 개시한지 6 내지 8주 이내에 신속히 발생한다.
하나의 실시태양에서, 피험체에서 근이영양증을 치료하거나 근이영양증의 진행을 지연시키는데 사용하기 위한 인간 CD49d에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본원에서 결정된 바와 같이, 치료 종료시(24주) CD4+CD49d+ T 세포 수는 치료 후 재상승을 보여주었다(28주). 이들 관찰은 24주째 모든 6명의 환자 향상(DMD에서 PUL2 상의 안정화)과 관련되었다. 24주 내지 28주 투약이 CD4+CD49d+ T 세포 재상승을 나타내지 않는 경우, 이는 DMD에서 PUL2가 악화된 모든 2명의 환자와 관련되었다.
따라서, 하나의 실시태양에서, 본 치료에 반응성인지 또는 무반응성인지에 대하여 피험체를 시험하거나 계층화하는 것이 제안된다. 증가된 근육 수행력, 또는 근육 수행력에서의 안정화 또는 지연된 감소와 함께 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료에 반응할 수 있는지의 여부를 간편히 지시하기 위해, 예를 들면, RAPID 또는 유동/칩(chip) 세포분석 표지를 사용하는 진단적 혈액 시험을 사용할 수 있다. 반응성 시험의 결과에 근거하여, 예를 들면 치료를 증진시키기 위해 투약 계획을 바꿀 수 있다. 또한 완전히 또는 일정 기간 동안 치료를 중단할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 투약 후 CD49d T 세포가 재상승하지 않는 경우, 억제성 올리고뉴클레오티드를 후속적으로 변경된 용량으로 투여한다. 예를 들면, 더 높은 용량의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여한다.
예를 들면, 하나의 실시태양에서, 투약 후 CD49d T 세포가 재상승하지 않는 경우, 코르티코스테로이드를 후속적으로 변경된 용량으로 투여한다.
하나의 실시태양에서, T-세포 및 근육 수행력(예를 들어 PUL2 기능)에 대한 효과를 관찰하기 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드를 적어도 6 내지 10주 동안 투여한다. 투약 중단 후 향상된 근육 수행력과 긍정적으로 연관되는 CD49d+ 세포의 재상승이 존재하고, 이는 투약을 중단한지 1주 이내에 또는 이후 약 4 내지 약 5주까지 평가될 수 있다. 향상된 PUL 스코어를 갖는 치료법에 반응하지 않는 피험체에서는 재상승이 관찰되지 않는다.
DMD는, 예를 들면 유아 운동의 중요한 단계가 18 개월에서 지연되는 경우 종종 임상적으로 진단된다. 근육 약화의 초기 특징으로는 넓은 폭의 걸음걸이, 발끝으로 걷는 척추의 과전만증(hyperlordosis), 빈번한 넘어짐, 근육, 예컨대 종아리, 삼각근, 사두근, 교근의 비대, 일어나기 어려움, 팔 약화가 포함된다. 보행의 손상은 전형적으로 DMD의 7 내지 13세 사이에 전형적으로 발생하는 한편, 늦은 보행은 BMD의 특징이다. 심폐 손상이 또한 나타날 수 있다. 피로 및 언어 발달이 또한 지연될 수 있다. 그러나, 상체 운동 뉴런 신호 또는 근육 섬유속연축은 관찰되지 않는다.
DMD의 진단은 디스트로핀 결핍을 나타내는 디스트로핀 면역형광 시험 및/또는 면역블롯(immunoblot), 및 전형적인 DMD와 일치하는 임상 사진에 의해 확인될 수 있다. 다르게는, 유전자 결실 시험은 디스트로핀 유전자를 확신하고(하나 이상의 엑손 소실), 이때 판독 프레임은 '아웃-오브-프레임(out-of-frame)'으로서 예상될 수 있고, 전형적인 DMD와 일치하는 임상 사진이 암시적이다. 하나의 실시태양에서, 완전한 디스트로핀 유전자 서열분석은, DMD와 확실히 연관될 수 있는 종결 코돈 돌연변이를 초래하는 점 돌연변이, 복제, 또는 기타 돌연변이를 보여줄 수 있다. 형제자매 또는 외숙부에서 상기 열거된 범주중 하나에 의해 확인된 DMD의 양성 가족력이 또한 유용하다. 또한 DMD 특징적 임상 증후 또는 징후(예를 들어, 근위 근육 약화, 가워의 동작(Gowers' manoeuvre), 상승된 혈청 크레아티닌 키나아제 수준)에 대한 평가가 사용된다. MD 또는 이영양성 근섬유에 대한 적합한 향상된 표지, 징후 및 증후/향상된 근육 기능은 당분야의 숙련가에게 공지될 것이다.
적합한 시험으로는 치료 동안 시간에 따른 증가된 운동, 근육, 심장, 혈류, 폐 기능에 대한 시험이 포함된다.
임상전 심근가성비대를 갖는 피험체에서, 혈청 생물표지 반응에 기초한 심장 효능을 결정할 수 있다. 이는 하나 이상의 표지, 예컨대 마이오스타틴(myostatin) 비율, 심장 트로포닌(troponin), 심장 BNP 등의 수준을 결정함으로써 달성될 수 있다. eGFR 변화를 또한 모니터링할 수 있다. 연속 이동 원격측정 모니터링에 의해 평가되는 원격측정 또는 리듬 이상성에 의해 기타 심장 기능을 평가할 수 있다.
추가의 시험으로는 근육 산소화 파라미터 및 미토콘드리아 표현형에 대한 시험이 포함된다.
감소된 섬유증을 MRI에 의해 평가할 수 있다. 감소된 근육 지방, 감소된 심장 섬유증, 증가된 핀치(pinch) 강도, 그립 강도, 향상된 심장 및 폐 기능 시험. 기타 평가는 상기 기능의 감소 속도에서의 둔화를 검사한다.
삶의 질 질문지는 치료 효과를 결정하는데 있어서 매우 유용하다.
임상적 결과는, 예를 들면, 정규화된 상지 도달 표면적에서의 백분율 변화, MRI에 의한 심장 원주 변형에서의 백분율 변화, 심장 측벽 및 후벽 변형을 결정하는 것과 관련된다. 또 다른 유용한 시험은 노력성 폐활량(forced vital capacity), 호흡 기능 감소의 지연, 예컨대 폐활량 측정법에 의한 기선으로부터의 FVC 5p에서의 변화를 측정하는 것이다.
운동 기능 시험은 치료 이전 및 이후 4개의 표준 계단 오르기 시험에서의 평균 변화, 층을 올라가는데 걸리는 시간, MRS에서 외측광근 근육의 지방 비율에서의 자기 공명 분광분석 평균 변화, 사두근의 근육 시험, 무릎 신근 최대 회전력 측정값, 전완(forearm)으로 가는 초음파 근육 미세혈관 혈액 공급을 결정함을 포함한다.
중요한 임상 평가는 6 또는 10 미터를 걷는데/뛰는데 걸리는 시간, 4개의 계단을 올라가는데 걸리는 시간, 4개의 계단을 내려가는데 걸리는 시간, 바로 누운 자세에서 일어나는데 걸리는 시간을 포함한다. 체중, 키, BMI의 변화를 또한 평가할 수 있다.
다르게는, 또는 추가적으로, 근육 생검 평가로부터의 생체표지, ELISA 또는 프로테오믹스(proteomics)에 의해 측정된 혈장 생체표지 패널에서의 변화를 측정하는 약력학적 표지, 또는 순환 면역 세포 표지에서의 변화를 평가한다.
용어 "안티센스 화합물"은 본원에서 사용될 경우, VLA-4(α4β1) 및/또는 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 쇄를 인코딩하는 핵산 분자에 혼성화되는 올리고머 화합물을 지칭한다. 인간에서 α4 인테그린 쇄는 CD49d이다. 안티센스 화합물은 CD49d, β1 인테그린 및/또는 β7 인테그린의 발현을 방해할 수 있다.
용어 "알파4 인테그린을 인코딩하는 핵산 분자"는 본원에서 사용될 경우, VLA-4 또는 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 쇄를 인코딩하는 DNA, 이러한 DNA로부터 전사된 RNA[전구(pre)-mRNA 및 mRNA 또는 이의 일부분 포함], 및 추가로, 이러한 RNA로부터 유래된 cDNA를 포괄한다.
용어 "VLA-4"는 본원에서 사용될 경우, α4 인테그린 및 β1 인테그린의 이종이량체를 지칭한다. VLA-4는 정상 말초 혈액 B 및 T 세포, 흉선세포, 단핵구, 및 기타 세포 상에서, 뿐만 아니라 조혈 줄기 세포 및 간세포(progenitor cell) 상에서 상당한 수준으로 발현된다. VLA-4는 또한 간충직 및 내피 간세포 및 간충직 줄기 세포 및 잠재적으로 내피 줄기 세포 상에서 발현된다. VLA-4에 대한 리간드로는 혈관 세포 부착 분자-1(VCAM-1) 및 CS-1, 피브로넥틴의 Hep II 영역내의 교호 스플라이싱된 도메인이 포함된다.
용어 "α4β7 인테그린"은 본원에서 사용될 경우, α4 인테그린 및 β7 인테그린의 이종이량체를 지칭한다. α4β7 인테그린은 장관으로의 향성(tropism)을 갖는 기억 T 세포의 소집합을 식별한다. α4β7 인테그린은 비만 세포, 림프구 및 NK 간세포의 소집합 상에서 발현된다. α4β7 인테그린은 일부 줄기 세포 및 간세포 상에서 발현된다. α4β7 인테그린에 대한 리간드로는 MAdCam-1 및 VCAM-1이 포함된다.
핵산
본 개시내용은 또한 핵산으로 지칭되는 다양한 올리고뉴클레오티드의 용도를 포괄한다. 예시적인 핵산으로는 DNA(예를 들어, 상보성 DNA(cDNA), 유전체 DNA(gDNA)), RNA(예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 짧은 헤어핀(hairpin) RNA (shRNA), iRNA, 짧은 억제성 RNA(siRNA), 리보솜 RNA(rRNA), tRNA, 마이크로RNA, DNA 또는 RNA 유사체(예를 들어, 염기 유사체, 당분 유사체 및/또는 비-고유적(non-native) 주쇄 등 포함), RNA/DNA 혼성체 및 폴리아미드 핵산(PNA)이 포함되고, 이들 모두는 단일- 또는 이중-가닥 형태일 수 있다. 일예에서, 핵산은 단리된다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "단리된 핵산"은 인간 개입을 통해 천연 상태로부터 변형되거나 제거된 핵산을 의미한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 광범위하게는 짧은 핵산 분자를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는, 서열-특이적 방식으로, 이들 각각의 상보성 올리고뉴클레오티드, DNA, 또는 RNA에 쉽게 결합하여 이중체를 형성한다. 하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이이다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용의 올리고뉴클레오티드는 억제성 올리고뉴클레오티드이다. 일예에서, 용어 "억제성 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 단백질의 생산, 발현 또는 생물 활성을 감소시키는 임의의 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들면, 억제성 올리고뉴클레오티드는 리보솜에서 mRNA의 단백질로의 번역을 방해할 수 있다. 또 다른 예에서, 억제성 올리고뉴클레오티드는 표적화된 유전자(들) 또는 mRNA에 결합(혼성화)하는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 mRNA에 충분히 상보성이어서, 표적 단백질의 발현 또는 생물 활성을 감소시킬 수 있다. 또 다른 예에서, 억제성 올리고뉴클레오티드는 단백질을 코딩하지 않는 세포내 핵산의 생물 활성을 억제한다. 예를 들면, 억제성 올리고뉴클레오티드는 비-코딩 RNA의 생물 활성을 억제할 수 있다.
용어 "안티센스"는 본원에서 사용될 경우, 코딩 서열에 상보성이어서 이에 결합할 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 의미하고, 이는 전사를 겪는 DNA 이중 나선의 가닥의 서열, 또는 메신저 RNA 분자의 서열일 수 있다. 안티센스 DNA는 이중-가닥 DNA에서 코딩 가닥에 상보성인 비-코딩 가닥이다.
용어 "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 이중체 영역 및 루우프 영역을 갖는 RNA 구조물을 지칭한다.
때때로 짧은 간섭 RNA 또는 침묵 RNA로서 공지된, 용어 "소 간섭 RNA(siRNA)"는 길이가 약 19 내지 25개 염기 쌍인 이중-가닥 또는 단일 가닥 RNA 분자의 한 부류이다. 특정 단백질로의 번역을 억제하거나 방지하는 siRNA는 용어 siRNA와 짝지워진 단백질 명칭에 의해 지시된다. 전형적으로, 다양한 실시태양에서 siRNA는 약 19 내지 약 28개의 뉴클레오티드(즉, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개의 뉴클레오티드)를 갖는 이중-가닥 또는 단일 가닥 핵산 분자이다. "iRNA"는 RNA를 함유하고, RNA-유도된 억압 복합체(RISC: RNA-induced silencing complex) 경로를 경유하여 RNA 전사물의 표적화된 분할을 매개하는 제제를 지칭한다. 용어 "이중-가닥 RNA" 또는 "dsRNA"는 본원에서 사용될 경우, 2개의 역평행성(anti-parallel)의 실질적으로 상보성인 핵산 가닥을 포함하는 혼성화된 이중체 영역을 갖는 RNA 분자 또는 분자의 착체를 포함하는 iRNA를 포함하고, 이는 표적 RNA에 대하여 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 언급될 것이다. 이중체 영역은 RISC 경로를 통해 목적하는 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로 9 내지 36개의 염기 쌍 길이, 예를 들어, 15 내지 30개의 염기 쌍 길이일 것이다. 9 내지 36개 염기 쌍의 이중체를 고려하여, 이중체는, 예를 들면, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개의 임의의 길이의 범위, 및 이들 사이의 임의의 하위-범위, 예컨대, 제한되지 않지만 15 내지 30개 염기 쌍, 15 내지 26개 염기 쌍, 15 내지 23개 염기 쌍, 15 내지 22개 염기 쌍, 15 내지 21개 염기 쌍, 15 내지 20개 염기 쌍, 15 내지 19개 염기 쌍, 15 내지 18개 염기 쌍, 15 내지 17개 염기 쌍, 18 내지 30개 염기 쌍, 18 내지 26개 염기 쌍, 18 내지 23개 염기 쌍, 18 내지 22개 염기 쌍, 18 내지 21개 염기 쌍, 18 내지 20개 염기 쌍, 19 내지 30개 염기 쌍, 19 내지 26개 염기 쌍, 19 내지 23개 염기 쌍, 19 내지 22개 염기 쌍, 19 내지 21개 염기 쌍, 19 내지 20개 염기 쌍, 20 내지 30개 염기 쌍, 20 내지 26개 염기 쌍, 20 내지 25개 염기 쌍, 20 내지 24개 염기 쌍, 20 내지 23개 염기 쌍, 20 내지 22개 염기 쌍, 20 내지 21개 염기 쌍, 21 내지 30개 염기 쌍, 21 내지 26개 염기 쌍, 21 내지 25개 염기 쌍, 21 내지 24개 염기 쌍, 21 내지 23개 염기 쌍, 또는 21 내지 22개 염기 쌍 길이일 수 있다. 다이서(Dicer) 및 유사한 효소에 의한 가공에 의해 세포에서 생성된 dsRNA는 일반적으로 19 내지 22개 범위의 염기 쌍 길이이다. dsDNA의 이중체 영역의 하나의 가닥은 표적 RNA의 영역에 실질적으로 상보성인 서열을 포함한다. 이중체 구조를 형성하는 2개 가닥은 적어도 1개의 자가-상보성 영역을 갖는 단일 RNA 분자로부터이거나, 2개 이상의 별도의 RNA 분자로부터 형성될 수 있다. 단일 분자의 2개의 가닥으로부터 이중체 영역이 형성되는 경우, 분자는 하나의 가닥의 3'-말단 및 이중체 구조를 형성하는 나머지 가닥의 5'-말단 사이의 뉴클레오티드의 단일 가닥 쇄에 의해 분리되는 이중체 영역(본원에서 "헤어핀 루우프"로서 지칭됨)을 가질 수 있다. 헤어핀 루우프는 쌍을 이루지 않는 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고; 몇몇 실시태양에서 헤어핀 루우프는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 이상의 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. dsRNA의 2개의 실질적으로 상보성인 가닥이 별도의 RNA 분자로 구성되는 경우, 이들 분자는 필수적이지는 않지만 공유 결합될 수 있다. 2개의 가닥이 헤어핀 루우프 이외의 수단에 의해 공유적으로 결합되는 경우, 이러한 결합 구조는 "링커(linker)"로 지칭된다. 용어 "siRNA"는 또한 본원에서 상기 기재된 바와 같은 dsRNA를 지칭하기 위해 사용된다. 숙련가라면 용어 "RNA 분자" 또는 "리보핵산 분자"가 천연에서 발현되거나 발견되는 RNA 분자 뿐만 아니라, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 바와 같은 하나 이상의 리보뉴클레오티드/리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 RNA의 유사체 또는 유도체를 포괄함을 인식할 것이다. 엄격히 말하자면, "리보뉴클레오시드"는 뉴클레오시드 염기 및 리보스 당을 포함하고, "리보뉴클레오티드"는 1개, 2개 또는 3개의 포스페이트 작용부분(moiety)을 갖는 리보뉴클레오시드이다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오시드" 및 "리보뉴클레오티드"는 본원에서 사용될 경우 동등한 것으로 고려될 수 있다. RNA는 핵염기 구조에서 또는 리보스-포스페이트 주쇄 구조에서, 예를 들어, 아래에 기재된 바와 같이 변형될 수 있다. 그러나, 리보뉴클레오시드 유사체 또는 유도체를 포함하는 분자는 이중체를 형성하는 능력을 보유해야 한다. 비제한적인 예로서, RNA 분자는 또한 제한되지 않지만 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오시드, 5' 포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오시드, 콜레스테릴 유도체 또는 도데카노산 비스데실아미드 기에 결합된 말단 뉴클레오시드, 락킹된(locked) 뉴클레오시드, 무염기 뉴클레오시드, 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오시드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오시드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오시드, 모폴리노 뉴클레오시드, 포스포르아미데이트 또는 비-천연 염기 포함 뉴클레오시드, 또는 이의 임의의 조합을 비롯한 적어도 1개의 변형된 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 다르게는, RNA 분자는 적어도 2개의 변형된 리보뉴클레오시드, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개 이상 또는 dsRNA 분자의 전체 길이까지 포함할 수 있다. 변형은 RNA 분자에서 이러한 복수개의 변형된 리보뉴클레오시드 각각에 대해 동일할 필요는 없다. 하나의 실시태양에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용하도록 고려되는 변형된 RNA는, 요구되는 이중체 구조를 형성하는 능력을 갖고 RISC 경로를 경유하여 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하거나 중재하는 펩티드 핵산(PNA)이다.
용어 "마이크로RNA"(miRNA로 약자화됨)는, 유전자 발현의 전사후 조절 및 RNA 침묵에서 작용하는, 식물, 동물 및 몇몇 바이러스에서 발견되는 작은 비-코딩 RNA 분자(약 22개 뉴클레오티드 함유)이다. 접두어 "miR"은 대시 기호 및 숫자가 수반되고, 후자는 종종 명명하는 순서를 나타낸다. 1개 또는 2개의 뉴클레오티드를 제외하고 거의 동일한 서열을 갖는 상이한 miRNA는 추가의 소문자로 주석이 달린다. 다수의 miRNA는 당분야에 공지되어 있다[miRBase V.21 nomenclature; 코조마라(Kozomara) 등의 문헌(2013); 그리프츠-존스(Griffiths-Jones, S.)의 문헌(2004) 참조]. 이들 miRNA의 서열은 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면, 월드 와이드 웹(world wide web) mirbase.org상에서 찾아볼 수 있다.
하나의 실시태양에서, "억제성 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 miRNA의 활성을 모방한다. 용어 "miRNA 모방체"는, 본원에서 사용될 경우, 세포내로 도입될 경우 내생성 성숙 miRNA 분자를 모방하도록 고안된 작은 이중-가닥 RNA 분자를 지칭한다. miRNA 모방체는 다양한 공급업체, 예컨대 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 및 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 수득될 수 있다.
실시태양에서, "억제성 올리고뉴클레오티드"는 하나 이상의 miRNA의 활성을 억제한다. 이러한 목적을 위해 다양한 miRNA 종들이 적합하다. 예로는, 제한없이, 안타고미어(antagomir), 간섭 RNA, 리보자임, miRNA 스폰지(sponge) 및 miR-마스크(mask)가 포함된다. 용어 "안타고미어"는 본 개시내용의 맥락에서 표적 miRNA에 결합하고, miRNA의 그의 동족(cognate) 유전자 표적으로의 결합을 방지함으로써 miRNA 기능을 억제하는 화학적으로 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용된다. 안타고미어는 당분야에 공지된 임의의 염기 변형을 포함할 수 있다. 일예에서, 상기 언급된 miRNA 종은 약 10 내지 50개 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들면, 안타고미어는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 부분을 가질 수 있다.
하나의 실시태양에서, miRNA 종은 각각 적어도 하나의 뉴클레오티드로 구성된 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 함유하는 키메라성 올리고뉴클레오티드이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 하나 이상의 유리한 특성(예를 들면, 증가된 뉴클레아제 내성, 세포내로의 증가된 섭취, 표적에 대한 증가된 결합 친화도)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 적어도 하나의 영역 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성체를 분할시킬 수 있는 효소에 대한 기질인 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 핵산은 합성 핵산이다. 용어 "합성 핵산"은 핵산이 천연 발생 핵산의 화학적 구조 또는 서열을 갖지 않음을 의미한다. 합성 뉴클레오티드는 조작된 핵산 분자를 포함한다. 또 다른 예에서, 핵산 구조는, 핵산의 A-형 입체배좌에서 3'-(엔도)(노쓰(North)) 입체배좌에 리보스를 락킹하도록 2' 산소 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 가교를 갖는 락킹된 핵산(LNA)으로 또한 변형될 수 있다[레녹스(Lennox) 등의 문헌(2011); 바더(Bader) 등의 문헌(2011)]. miRNA와 관련하여, 이러한 변형은 분자의 표적 특이성 및 혼성화 특성 둘 다를 유의적으로 증가시킬 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 핵산은 필요할 경우 관례적 방법을 사용하여 고안될 수 있다. 예를 들면, 억제성 올리고뉴클레오티드와 관련하여, 적어도 다섯개(5)의 연속적 뉴클레오티드의 연장부를 종자(seed) 서열내에 또는 이에 바로 인접하여 포함하는, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 뉴클레오티드 길이의 표적 분절은 유전자를 표적화하기에 적합한 것으로 고려된다. 예시적인 표적 분절은 종자 서열중 하나의 5'-말단으로부터 적어도 5개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 포함할 수 있다(나머지 뉴클레오티드는 종자 서열의 5'-말단의 바로 업스트림에서 시작하여 핵산이 약 5 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유할 때까지 지속되는 동일한 RNA의 연속적 연장부이다). 또 다른 예에서, 표적 분절은 종자 서열중 하나의 3'-말단으로부터 적어도 5개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 RNA 서열에 의해 표시된다(나머지 뉴클레오티드는 표적 분절의 3'-말단의 바로 다운스트림에서 시작하여 핵산이 약 5 내지 약 30개의 뉴클레오티드를 함유할 때까지 지속되는 동일한 RNA의 연속적 연장부이다). 용어 "종자 서열"은 본 개시내용과 관련하여 표적 특이성의 중요한 결정자인 miRNA(즉, 종자 서열)의 5-말단에서 최초 8개의 뉴클레오티드(nt)내의 6 내지 8개의 뉴클레오티드 길이의 서브스트링(substring)을 지칭하기 위해 사용된다. 일단 1개 이상의 표적 영역, 분절 또는 자리가 식별된다면, 목적하는 효과를 제공하도록 표적에 충분히 상보성인, 즉 충분히 잘 혼성화되고 충분한 특이성을 갖는(즉, 다른 비-표적 핵산 서열에 실질적으로 결합하지 않는) 억제성 핵산 화합물을 선택한다.
α4 인테그린에 대한 안티센스 화합물
하나의 실시태양에서, 본 개시내용의 방법은 α4 인테그린에 대한 안티센스 화합물의 용도에 의존한다. 이러한 안티센스 화합물은 VLA-4(α4β1) 또는 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 쇄를 인코딩하는 핵산에 표적화된다. 하나의 실시태양에서, 안티센스 화합물은 올리고뉴클레오티드이다. 그러나, 제한되지 않지만 올리고뉴클레오티드 모방체를 비롯한 다른 올리고머 안티센스 화합물이 고려된다.
안티센스 화합물의 그의 표적 핵산과의 혼성화는 일반적으로 "안티센스"로서 지칭된다. 안티센스 화합물의 그의 표적 핵산과의 혼성화는 표적 핵산의 기능을 억제한다. 이러한 "안티센스 억제"는 전형적으로 표적 핵산이 분할되거나, 분해되거나, 다르게는 작동불가능하게 되도록 하는 안티센스 화합물의 표적 핵산으로의 수소-결합 기반의 혼성화에 기초한다. 방해되어지는 표적 DNA의 기능으로는 복제 및 전사가 포함될 수 있다. 복제 및 전사는, 예를 들면, 내생성 세포 주형, 벡터, 플라스미드 작성물 등으로부터 유래될 수 있다. 방해되어지는 RNA의 기능으로는, 단백질 번역 자리로의 RNA의 전좌, RNA 합성 자리로부터 멀리 있는 세포내의 자리로의 RNA의 전좌, RNA로부터의 단백질의 번역, 하나 이상의 RNA 종을 생성하는 RNA의 스플라이싱, 및 RNA가 관여되거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 RNA 관련 촉매 활성 또는 복합체 형성과 같은 기능이 포함될 수 있다.
"혼성화"는 본원에서 사용될 경우, 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산의 상보성 염기의 짝형성을 의미한다. 염기 짝형성은 전형적으로 상보성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기(핵염기) 사이에 존재하는 수소 결합, 예컨대 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합을 포함한다. 구아닌(G) 및 사이토신(C)은 3개의 수소 결합의 형성을 통해 짝을 형성하는 상보성 핵염기의 예이다. 아데닌(A) 및 티민(T)은 2개의 수소 결합의 형성을 통해 짝을 형성하는 상보성 핵염기의 예이다. 혼성화는 다양한 환경에서 발생할 수 있다.
"뉴클레오시드"는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 정상적으로는 헤테로환식 염기이다. 이러한 헤테로환식 염기중 가장 흔한 2가지 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유적으로 결합된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 이들 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 작용부분에 결합될 수 있다.
"특이적으로 혼성화가능한" 및 "상보성"은 안정하고 특이적인 결합이 안티센스 화합물 및 표적 핵산 사이에 발생하기에 충분한 정도의 상보적 상태를 지시하기 위해 사용되는 용어이다. 안티센스 화합물은 특이적으로 혼성화가능한 표적 핵산 서열에 100% 상보성일 필요가 없음을 알아야 한다. 안티센스 화합물은, 안티센스 화합물의 표적 핵산으로의 결합이 표적 분자의 정상적 기능을 방해하여 활성의 감소를 초래하고, 특이적 결합이 요망되는 조건하에, 예를 들면, 치료시의 생리학적 조건하에 안티센스 화합물의 비-표적 서열로의 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보적 상태가 존재할 경우, 특이적으로 혼성화가능하다.
"상보성"은 본원에서 사용될 경우, 안티센스 화합물 및 표적 핵산의 핵염기 사이의 정확한 짝형성에 대한 능력을 지칭한다. 예를 들면, 안티센스 화합물의 특정 위치에 있는 핵염기가 표적 핵산의 특정 위치에 있는 핵염기와 수소결합을 할 수 있다면, 안티센스 화합물 및 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 상보성 위치인 것으로 고려된다. 안티센스 화합물은 하나 이상의 분절 상에서 혼성화되어, 사이에 있는 또는 인접한 분절이 혼성화에 관여되지 않도록 한다(예를 들어, 루우프 구조 또는 헤어핀 구조). 하나의 실시태양에서, 안티센스 화합물은 표적 핵산내의 표적 영역에 적어도 70%의 서열 상보성을 포함한다.
예를 들면, 20개 핵염기중 18개가 표적 핵산내의 표적 영역에 상보성이고 이에 따라 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90%의 상보성을 나타낸다. 이러한 예에서, 나머지 비상보성 핵염기는 무리를 이루거나 상보성 핵염기와 섞여 있고, 서로서로 또는 상보성 핵염기에 인접할 필요는 없다. 이와 같이, 표적 핵산과 완전히 상보성인 2개 영역이 옆에 배치된 4개의 비-상보성 핵염기를 갖는 18개 핵염기 길이의 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8%의 전체 상보성을 가질 수 있고, 따라서 본 개시내용의 범주에 속한다. 안티센스 화합물과 표적 핵산의 영역의 상보성 퍼센트는 당분야에 공지된 BLAST(basic local alignment search tool) 프로그램(기본 국소 정렬 검색 도구) 및 파워(Power)BLAST 프로그램을 사용하여 관례대로 결정될 수 있다[알트슐(Altschul) 등의 문헌(1990); 장(Zhang) 및 마덴(Madden)의 문헌(1997)].
안티센스 올리고뉴클레오티드
본 개시내용은 무엇 보다도 α4 인테그린, 및/또는 VLA-4 및/또는 α4β7 인테그린의 발현을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 VLA-4 또는 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 쇄를 인코딩하는 핵산을 표적화한다.
용어 "억제하다"는 본원에서 사용될 경우, VLA-4 또는 α4β7 인테그린 발현에 있어서 임의의 측정가능한 감소(예를 들어, 10%, 20%, 50%, 90%, 또는 100%)를 의미한다. 용어 "억제성 뉴클레오티드"는 본원에서 VLA-4 또는 α4β7 인테그린 발현에 있어서 임의의 측정가능한 감소(예를 들어, 10%, 20%, 50%, 90%, 또는 100%)를 유도하는 본원에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 및 동족체의 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 이러한 용어는 천연 발생 핵염기, 당 및 공유 뉴클레오시드간(주쇄) 결합으로 구성된 올리고뉴클레오티드, 뿐만 아니라 유사하게 작용하는 비-천연 발생 부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 증진된 세포 섭취, 표적 핵산에 대한 증진된 친화도 및 뉴클레아제의 존재하의 증가된 안정성과 같은 목적하는 특성으로 인해 고유의 올리고뉴클레오티드에 비해 종종 바람직하다.
올리고뉴클레오티드는 키랄성(비대칭성) 중심을 함유할 수 있거나, 분자는 전체적으로 키랄성일 수 있다. 개별 입체이성체(거울상이성체 및 부분입체이성체) 및 이들의 혼합물은 본 개시내용의 범주내에 속한다. 키랄성 포스포로티오에이트 결합을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 내용을 위해 완(Wan) 등의 문헌[Nucleic Acids Research 42 (22: 13456-13468, 2014]를 참조할 수 있다. ASO에 대한 전반적 설명을 위해, 스콜스(Scoles) 등의 문헌[Antisesne Oligonucleotides Neurology Genetics April 2019; 5 (2) DOI: doi.org/10.1212/NXG.000000000000032]를 참조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 형성하는데 있어서, 포스페이트 기는 인접한 뉴클레오시드를 서로 공유적으로 결합시켜 선형 중합체 화합물을 형성한다. 다시, 이러한 선형 중합체 화합물의 개개의 말단은 추가로 연결되어 환형 화합물을 형성하지만, 선형 화합물이 일반적으로 바람직하다. 또한, 선형 화합물은 내부 핵염기 상보성을 가질 수 있고, 따라서 완전한 또는 부분적인 이중-가닥 화합물을 생성하는 방식으로 폴딩(folding)될 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 관하여, 포스페이트 기는 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드 사이의 주쇄를 형성하는 것으로 흔히 언급된다. RNA 및 DNA의 정상적 결합 또는 주쇄는 3'에서 5'로의 포스포디에스테르 결합이다.
본 개시내용의 안티센스 올리고뉴클레오티드로는, 예를 들면, 리보자임, siRNA, 외부 안내 서열(EGS: external guide sequence) 올리고뉴클레오티드, 교호 스플라이서, 프라이머, 프로브(probe), 및 표적 핵산의 적어도 일부에 혼성화되는 다른 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 본 개시내용의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥, 이중-가닥, 환형 또는 헤어핀의 형태로 투여될 수 있고, 구조적 요소, 예컨대 내부 또는 말단의 불룩한 부분이나 루우프를 함유할 수 있다. 일단 투여되면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 변형에 영향을 주는 하나 이상의 효소 또는 구조적 단배질의 작용을 유도해낼 수 있다.
이러한 효소의 비제한적인 하나의 예는 RNA:DNA 이중체의 RNA 가닥을 분할시키는 세포내 엔도뉴클레아제인 RN아제(RNAse) H이다. "DNA-유사성"인 단일-가닥 안티센스 화합물이 RN아제 H를 유도해낼 수 있음은 당분야에 공지되어 있다. 따라서 RN아제 H의 활성화는 RNA 표적의 분할을 초래함으로써, 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드-중재된 억제 효율을 크게 증진시킨다. 유사한 역할은 다른 리보뉴클레아제, 예컨대 RN아제 III에서의 리보뉴클레아제 및 효소의 리보뉴클레아제 L 계열에 대해서 상정된다.
이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자의 도입은, 유전자 또는 그의 연관된 유전자 생성물의 기능의 강력하고 특이적인 안티센스-중재된 감소를 유도하는 것으로 제시되어 왔다. 이러한 현상은 식물 및 동물 둘 다에서 발생하고, 바이러스 방어 및 트랜스포존 침묵(transposon silencing)에 진화적 연관성을 갖는 것으로 믿겨진다. dsRNA가 동물에서 유전자 침묵을 이끌어낸다는 첫번째 증거는 1995년에 선충류, 캐노르하브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)에서의 연구로부터 나왔다[구오(Guo) 및 켐페우스(Kempheus)의 문헌(1995)]. 몽고메리(Montgomery) 등(1998)은 dsRNA의 주요 간섭 효과가 전사 이후임을 보여주었다. 이중-가닥 RNA(dsRNA)로의 노출로부터 얻어진 캐노르하브디티스 엘레간스에서 규정된 전사후 안티센스 기작은 RNA 간섭(RNAi)으로 지정되었다. 이러한 용어는, 내생성의 표적화된 mRNA 수준의 서열-특이적 감소를 이끌어내는 dsRNA의 도입과 관여되는 안티센스-중재된 유전자 침묵을 의미하기 위해 일반화되었다[파이어(Fire) 등의 문헌(1998)]. 최근에, 이는, 사실 RNAi의 강력한 유도자인 dsRNA의 안티센스 극성의 단일-가닥 RNA 올리고머인 것으로 제시되었다[티즈스터만(Tijsterman) 등의 문헌(2002)].
당분야의 숙련가라면, 과도한 실험을 하지 않고도, 본 개시내용의 방법에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 식별할 수 있을 것이다.
변형된 뉴클레오시드간 결합(주쇄)
본 개시내용의 안티센스 화합물은 변형된 주쇄 또는 비-천연 뉴클레오시드간 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드는 주쇄에 인 원자를 보유하는 올리고뉴클레오티드 및 주쇄에 인 원자를 갖지 않는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 인 원자를 함유한 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄로는, 예를 들면, 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 포스포로티오에이트, 키랄성 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄성 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 셀레노포스페이트, 및 보라노포스페이트, 및 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 반대 극성을 갖는 것들이 포함되고, 이때 하나 이상의 뉴클레오티드간 결합은 3'에서 3'으로, 5'에서 5'로 또는 2'에서 2'로의 결합이다. 반대 극성을 갖는 올리고뉴클레오티드는 대부분의 3'-뉴클레오티드간 결합에서 단일한 3'에서 3'으로의 결합을 포함하고, 즉 단일 역전 뉴클레오시드 잔기는 비염기성일 수 있다(핵염기가 소실되거나 이 대신 하이드록실 기를 가짐). 다양한 염, 혼합된 염 및 자유 산 형태가 또한 포함된다.
상기 인-함유 결합의 형성을 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제3,687,808호, US 제4,469,863호, US 제4,476,301호, US 제5,023,243호, US 제5,177,196호, US 제5,188,897호, US 제5,264,423호, US 제5,276,019호, US 제5,278,302호, US 제5,286,717호, US 제5,321,131호, US 제5,399,676호, US 제5,405,939호, US 제5,453,496호, US 제5,455,233호, US 제5,466,677호, US 제5,476,925호, US 제5,519,126호, US 제5,536,821호, US 제5,541,306호, US 제5,550,111호, US 제5,563,253호, US 제5,571,799호, US 제5,587,361호, US 제5,194,599호, US 제5,565,555호, US 제5,527,899호, US 제5,721,218호, US 제5,672,697호 및 US 제5,625,050호가 포함된다.
본원에서 인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 주쇄로는, 예를 들면, 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 결합, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로환식 뉴클레오시드간 결합에 의해 형성된 주쇄가 포함된다. 이들은 모폴리노 결합 갖는 주쇄(부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성됨); 실록산 주쇄; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 주쇄; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 주쇄; 리보아세틸 주쇄; 알켄 함유 주쇄; 설파메이트 주쇄; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 주쇄; 설포네이트 및 설폰아미드 주쇄; 아미드 주쇄; 및 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 기타 주쇄를 포함한다.
상기 올리고뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제5,034,506호, US 제5,166,315호, US 제5,185,444호, US 제5,214,134호, US 제5,216,141호, US 제5,235,033호, US 제5,264,562호, US 제5,264,564호, US 제5,405,938호, US 제5,434,257호, US 제5,466,677호, US 제5,470,967호, US 제5,489,677호, US 제5,541,307호, US 제5,561,225호, US 제5,596,086호, US 제5,602,240호, US 제5,610,289호, US 제5,602,240호, US 제5,608,046호, US 제5,610,289호, US 제5,618,704호, US 제5,623,070호, US 제5,663,312호, US 제5,633,360호, US 제5,677,437호, US 제5,792,608호, US 제5,646,269호 및 US 제5,677,439호가 포함된다.
포스포로디아미데이트 모폴리노(PMO)에서, 올리고뉴클레오티드 주쇄중의 포스포디에스테르(PO) 결합은 비이온성 포스포로디아미데이트 결합과 대체되어 PO에 저항성을 유도한다. 기타 ASO 유형은 광범위한 뉴클레아제에 대해 내성을 초래하고, RN아제 H 활성을 지지하며, 단백질 결합을 증가시키는 PS 변형을 갖고, 이는 또한 조직 섭취를 향상시킨다. 모폴리노는 또한 더 큰 표적 친화도를 유도하고 뉴클레아제 회피를 촉진시키는 리보스 당에 대한 특유의 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드이다.
포스포로티오에이트(PS) ASO는 대체적으로 키랄성 PS 중심에 대해 입체무작위(stereorandom)적이고, 이들 각각은 2개의 별개의 입체화학적 배열을 가져서, 19개의 연결기를 갖는 20량체 ASO에 대해 가능한 2개의 입체이성체(Rp 및 Sp)를 만들어 낸다. 하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 Rp 입체이성체이다. 하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 Sp 입체이성체이다.
변형된 당 및 뉴클레오시드간 결합
본 개시내용의 안티센스 화합물은 뉴클레오티드 단위의, 당 및 뉴클레오시드간 결합(즉, 주쇄) 둘 다 새로운 기로 대체되는 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 핵염기 단위는 표적 핵산과의 혼성화를 위해 유지된다.
탁월한 혼성화 특성을 갖는 것으로 제시된 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산(PNA)으로서 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-주쇄는 주쇄, 특히, 아미노에틸글리신 주쇄를 함유하는 아미드로 대체된다. 핵염기는 보유되고 주쇄의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제5,539,082호, US 제5,714,331호, 및 US 제5,719,262호가 포함된다. PNA 화합물에 대한 추가의 교시는 니엘센(Nielsen) 등의 문헌(1991)에서 찾아볼 수 있다.
본 개시내용의 안티센스 화합물은 또한 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 헤테로원자 주쇄, 예를 들면, US 제5,489,677호의 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 주쇄로서 공지됨], -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-[이때, 고유의 포스포디에스테르 주쇄는 -O-P-O-CH2-로 표시됨], 및 US 제5,602,240호의 아미드 주쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시내용의 안티센스 화합물은 또한 US 제5,034,506호의 모폴리노 주쇄 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
변형된 당
본 개시내용의 안티센스 화합물은 1개 이상의 치환된 당 작용부분을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
예로는 2' 위치에서 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 포함되고, 이때 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2중 하나를 포함하고, 이때 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 변형된 올리고뉴클레오티드의 추가의 예로는 2' 위치에서 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH3, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 분할 기, 리포터(reporter) 기, 삽입기(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 향상시키는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 향상시키는 기, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기중 하나 이상을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 포함된다.
하나의 실시태양에서, 변형은 2'-메톡시에톡시(2'-O-CH2CH2OCH3(또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지됨)[마르틴(Martin) 등의 문헌(1995)], 즉 알콕시알콕시 기를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기(또한 2'-DMAOE로서 공지됨), 또는 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(또한 당분야에 2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로서 공지됨), 즉, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2를 포함한다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴(2'-CH2-CH=CH2), 2'-O-알릴(2'-O-CH2-CH=CH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 2'-변형은 아라비노(위쪽) 위치 또는 리보(아래쪽) 위치에 존재할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 2'-아라비노 변형은 2'-F이다.
유사한 변형은 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특별히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 당 모방체, 예컨대 사이클로부틸 작용부분을 펜토푸라노실 당 대신에 가질 수 있다.
이러한 변형된 당 구조물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제4,981,957호, US 제5,118,800호, US 제5,319,080호, US 제5,359,044호, US 제5,393,878호, US 제5,446,137호, US 제5,466,786호, US 제5,514,785호, US 제5,519,134호, US 제5,567,811호, US 제5,576,427호, US 제5,591,722호, US 제5,597,909호, US 제5,610,300호, US 제5,627,053호, US 제5,639,873호, US 제5,646,265호, US 제5,658,873호, US 제5,670,633호, US 제5,792,747호, 및 US 제5,700,920호가 포함된다.
당의 추가의 변형으로는 락킹된 핵산(LNA)이 포함되고, 이때 2'-하이드록실 기는 당 고리의 3' 또는 4' 탄소 원자에 연결됨으로써, 이환식 당 작용부분을 형성한다. 하나의 실시태양에서, 연결기는 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 가교화하는 메틸렌(-CH2-)n 기이고, 이때 n은 1 또는 2이다. LNA 및 이의 제조는 국제 특허출원 공개공보 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호에 기재되어 있다.
천연 핵염기 및 변형 핵염기
본 개시내용은 핵염기 변형 또는 치환을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용될 경우, "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 사이토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다.
변형된 핵염기로는, 예를 들면, 5-메틸사이토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐(-CC-CH3) 우라실 및 사이토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실(의사우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특별히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7- 메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 핵염기가 포함된다.
추가의 변형된 핵염기로는 삼환식 피리미딘, 예컨대 페녹사진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프(clamp), 예를 들면, 치환된 페녹사진 시티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 카바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)이 포함된다.
변형된 핵염기로는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로환에 의해 대체된 핵염기, 예를 들면, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈이 포함된다. 추가의 핵염기로는 US 제3,687,808호에 개시된 핵염기, 크로슈위츠(J.I. Kroschwitz)(편저자)의 문헌[The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, John Wiley and Sons (1990)]에 개시된 핵염기, 잉글리쉬(Englisch) 등의 문헌(1991)에 개시된 핵염기, 및 상비(Y.S. Sanghvi)의 문헌[Chapter 15: Antisense Research and Applications, pages 289-302, S.T. Crooke, B. Lebleu (editors), CRC Press, 1993]에 개시된 핵염기가 포함된다.
이들중 특정 핵염기는 올리고뉴클레오티드의 결합 친화도를 증가시키기 위해 특별히 유용하다. 이러한 핵염기로는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 예컨대 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신이 포함된다. 5-메틸사이토신 치환은 0.6 내지 1.2 □C 만큼 핵산 이중체 안정성을 증가시키는 것으로 제시되었다. 하나의 실시태양에서, 이들 핵염기 치환은 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합된다.
상기 주지된 특정한 변형된 핵염기 뿐만 아니라 기타 변형된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제3,687,808호, US 제4,845,205호, US 제5,130,302호, US 제5,134,066호, US 제5,175,273호, US 제5,367,066호, US 제5,432,272호, US 제5,457,187호, US 제5,459,255호, US 제5,484,908호, US 제5,502,177호, US 제5,525,711호, US 제5,552,540호, US 제5,587,469호, US 제5,594,121호, US 제5,596,091호, US 제5,614,617호, US 제5,645,985호, US 제5,830,653호, US 제5,763,588호, US 제6,005,096호, US 제5,681,941호 및 US 제5,750,692호가 포함된다.
컨주게이트
본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 화합물은 안티센스 화합물의 활성, 세포 분포 또는 세포 섭취를 증진시키는 하나 이상의 작용부분 또는 기에 공액될 수 있다.
이들 작용부분 또는 기는 작용기, 예컨대 1차 또는 2차 하이드록실 기에 공유적으로 결합될 수 있다.
예시적인 작용부분 또는 기로는 삽입기, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 특성을 증진시키는 기, 및 올리고머의 약동학적 특성을 증진시키는 기가 포함된다. 전형적인 컨주게이트 기로는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진(phenazine), 엽산, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인(fluoresein), 로다민, 쿠마린 및 염료가 포함된다.
약력학적 특성을 증진시키는 작용부분 또는 기로는 섭취를 향상시키고, 분해에 대한 저항성을 증진시키고/시키거나, 표적 핵산과의 서열-특이적 혼성화를 강화시키는 것들이 포함된다.
약동학적 특성을 증진시키는 작용부분 또는 기로는 본 개시내용의 화합물의 섭취, 분포, 대사 또는 배설을 향상시키는 것들이 포함된다. 대표적인 작용부분 또는 기는 PCT/US 92/09196호 및 US 제6,287,860호에 개시되어 있다. 작용부분 또는 기로는, 제한되지 않지만, 지질 작용부분, 예컨대 콜레스테롤 작용부분, 콜산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 작용부분, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 작용부분이 포함된다.
키메라성 화합물
당분야의 숙련가에게 인식될 수 있듯이, 소정의 화합물에서 모든 위치는 균일하게 변형될 필요가 없으며, 실제로, 전술된 변형중 하나 보다 많은 변형이 단일한 올리고뉴클레오티드에, 또는 심지어 올리고뉴클레오티드내의 단일한 뉴클레오시드에 혼입될 수 있다.
본 개시내용의 화합물은 키메라성 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "키메라성 올리고뉴클레오티드"는 둘 이상의 화학적으로 별개의 영역을 갖고, 각각은 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드는, 전형적으로, 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 섭취, 증가된 안정성 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화도를 부여하도록 올리고뉴클레오티드가 변형되어지는 적어도 하나의 영역을 갖는다. 올리고뉴클레오티드의 추가적인 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성체를 분할할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 통해, RN아제 H는 RNA:DNA 이중체의 RNA 가닥을 분할하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RN아제 H의 활성화는 RNA 표적의 분할을 초래함으로써, 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드-중재된 억제의 효율을 크게 증진시킨다. RNA:RNA 혼성체의 분할은, 마찬가지로, 엔도리보뉴클레아제, 예컨대 세포 및 바이러스 RNA 둘 다를 분할하는 리보뉴클레아제 L의 작용을 통해 달성될 수 있다. RNA 표적의 분할은 관례대로 겔 전기영동, 및 필요한 경우, 당분야에 공지된 연관된 핵산 혼성화 기법에 의해 검출될 수 있다.
본 개시내용의 키메라성 안티센스 화합물은 둘 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 복합 구조물로서 형성될 수 있다. 이러한 화합물은 또한 혼성체 또는 갭머(gapmer)로서 당분야에 지칭되어 왔다. 이러한 혼성체 구조물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제5,013,830호, US 제5,149,797호, US 제5,220,007호, US 제5,256,775호, US 제5,366,878호, US 제5,403,711호, US 제5,491,133호, US 제5,565,350호, US 제5,623,065호, US 제5,652,355호, US 제5,652,356호, 및 US 제5,700,922호가 포함된다.
예시적인 올리고뉴클레오티드
당분야에 공지된 예증적 안티센스 플랫폼으로는, 제한없이, 모폴리노, 1세대 올리고, 2세대 올리고, 갭머, siRNA, LNA, BNA, 또는 올리고 모방체 유사 펩티드 핵산이 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 노출되거나 리포솜에 제형화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 세포로의 전달 수단에 연결되거나 연결되지 않을 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 엔도솜(endosome) 방출제를 사용하거나 사용하지 않을 수 있다.
하나의 실시태양에서, 안티센스 화합물은 VLA-4 mRNA의 3'-미번역 영역으로 혼성화되도록 고안된 2세대 포스포로티오에이트 주쇄 2'-MOE-변형된 키메라성 올리고뉴클레오티드 갭머이다. 하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 VLA-4 및 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 서브유닛인 CD49를 인코딩하는 RNA에 혼성화함으로써 1차 인간 세포 및 몇몇 인간 세포주 둘다에서 선택적으로 VLA-4 발현을 억제한다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 분자량이 7230 달톤인 3-9-8 MOE 갭머로서도 지칭되는 3'→ 5' 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 20량체의 19-나트륨 염이고, 이때 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸)(2'MOE) 변형된 리보뉴클레오시드(2'-O-(2-메톡시에틸 리보스)이고; 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 모든 사이토신이 5-메틸사이토신인 2'-데옥시리보뉴클레오시드이며; 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이다.
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 서열은 (서열 번호 1)이다:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
올리고뉴클레오티드의 실험식은 다음과 같다:
C233H327N60O129P19S19Na19
안티센스 올리고뉴클레오티드 ATL1102는 중추 신경계 질환, MS에서 본원에 제안된 용량에 비해 유의적으로 더 높은 용량에서 효과적인 것으로 이전에 제시되었다[림로쓰(Limmroth) 등]. 면역 세포에서 VLA-4를 선택적으로 억제하는, VLA-4의 CD49d 알파 쇄에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력은, 예컨대 VLA-4를 발현하는 모든 세포에 영향을 미치는 pan VLA-4 억제제인 VLA-4의 항체 및 소분자 억제제의 투여를 특징으로 하는 PML과 같은 상당한 안전성 문제를 방지한다.
하나의 실시태양에서, 모든 우라실은 5-메틸우라실(MeU)이다. 전형적으로, 올리고뉴클레오티드는 5-메틸우라실이 아닌 2-메톡시에틸 변형된 티미딘을 사용하여 합성된다.
하나의 실시태양에서, 모든 피리미딘은 C5 메틸화된다(즉, U, T, C는 C5 메틸화된다).
하나의 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드의 서열은, 각각 O-O 연결된 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 결합을 보여주는 허용된 올리고뉴클레오티드 명명법에 의해 명명될 수 있다: 2'-O-메톡시에틸-5-메틸시티딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸구아노실릴-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-데옥시아데노실릴-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-데옥시구아노실릴-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-티미딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-데옥시-5-메틸시티딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-티미딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-데옥시구아노실릴-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-티미딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-티미딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-티미딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-메톡시에틸-5-메틸시티딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-메톡시에틸-5-메틸시티딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-아데노실릴-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딜일-(3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-메틸사이토신, (3'→5' O,O-포스포로티오일)-2'-O-메톡시에틸-5-메틸유리딜일-19 나트륨 염.
올리고뉴클레오티드는 2개의 별개의 작업으로 나뉘어질 수 있는 다단계 과정에 의해 합성될 수 있다: 고체-상 합성 및 다운스트림 공정(downstream processing). 첫번째 작업에서, 컴퓨터-제어된 고체-상 합성기를 통해 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 조립한다. 후속적인 다운스트림 공정은 보호제거 단계, 준비용 역상 크로마토그래피 정제, 단리 및 건조를 포함하여 올리고뉴클레오티드 약물을 수득한다. 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 산화적 황화작용이 수반되는 포스포르아미다이트(phosphoramidite) 커플링 화학작용을 이용하고, 활성화된 단량체의 연장 올리고머(이의 3'-말단은 고체 지지체에 공유 결합됨)로의 순차적 커플링을 포함한다.
트리틸제거(detritylation)(반응 a) - 지지체 결합된 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오시드의 산-불안정성 5'-O-4,4'-디메톡시트리틸(DMT) 보호기의 제거에 의해 고체-상 합성의 각각의 사이클을 시작한다. 이는 산 용액(예를 들면 톨루엔중 디클로로아세트산(DCA))으로 처리함으로써 달성된다. 트리틸제거 이후, 다음 반응을 위한 준비에서 아세토니트릴에 의해 세척함으로써 과량의 시약을 지지체로부터 제거한다.
커플링(반응 b) - 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록실 기를 활성화제(예를 들어, 1H-테트라졸)의 존재하에 특정 염기 위치에 상응하는 포스포르아미다이트의 용액(예를 들어, 염기2의 경우: MOE-MeC 아미다이트)과 반응시킴으로써 쇄 연장을 달성한다. 이는 유입된 뉴클레오티드 신톤(synthon) 및 지지체-결합된 올리고뉴클레오티드 쇄 사이에 포스파이트 트리에스테르 결합을 형성한다. 커플링 반응 이후, 다음 반응을 위한 준비에서 아세토니트릴에 의해 세척함으로써 과량의 시약을 지지체로부터 제거한다.
황화작용(반응 c) - 새로 형성된 포스파이트 트리에스테르 결합을 황 전달 시약(예를 들어, 페닐아세틸 디설파이드) 용액으로 처리함으로써 상응하는 (O,O,O)-트리알킬 포스포로티오에이트 트리에스테르로 전환시킨다. 황화작용 이후, 다음 반응을 위한 준비에서 아세토니트릴에 의해 세척함으로써 과량의 시약을 지지체로부터 제거한다.
캐핑(capping)(반응 d) - 소정의 사이클에서 이용가능한 5'-하이드록실 기중 소량의 일부는 연장되지 못한다. 임의의 후속 사이클에서 이들 기의 커플링은 목적하는 생성물로부터 분리하기 어려운 공정-관련된된 불순물("DMT-온(on) (n-1)-량체")을 형성할 것이다. 이들 불순물의 형성을 예방하고 정제를 용이하게 하기 위해, "캐핑 시약"(예를 들어, 아세트산 무수물 및 N-메틸이미다졸/아세토니트릴/피리딘)을 반응기 용기내로 도입하여 캐핑된 서열을 제공한다. 생성된 실패 서열("DMT-오프(off) 쇼트머(shortmer)")을 역상 HPLC 정제에 의해 목적하는 생성물로부터 분리한다. 캐핑 반응 이후, 다음 반응을 위한 준비에서 아세토니트릴에 의해 세척함으로써 과량의 시약을 지지체로부터 제거한다.
적절한 보호된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하는 상기 염기성 4-단계 사이클의 반복은 전체 보호된 올리고뉴클레오티드 서열의 조립을 허용한다.
주쇄 보호제거(반응 e) - 공정의 조립 부분을 완료한 이후, (O,O,O)-트리알킬 포스포로티오에이트 트리에스테르 뉴클레오티드간 결합을 보호하는 시아노에틸 기를 아세토니트릴중 트리에틸아민(TEA)의 용액으로 처리하여 제거한다. 아세토니트릴에 의해 칼럼을 세척함으로써 시약 및 이러한 단계 동안 생성된 아크릴로니트릴을 제거한다.
지지체로부터의 분할 및 염기 보호제거(반응 f) - 환외 아미노 기의 보호제거 및 지지체로부터 조질의 생성물의 분할을 수성 수산화 암모늄과의 항온처리(반응 f)에 의해 달성한다. 조질의 5'-O-DMT-보호된 생성물의 정제를 역상 HPLC에 의해 달성한다. 역상 HPLC 단계는 DMT-오프 실패 서열을 제거한다. 용리 프로파일을 UV 흡수 분광법에 의해 모니터링한다. DMT-온 올리고뉴클레오티드 생성물이 함유된 분별물을 수집하고 분석한다.
산성 보호제거(반응 g) - 5'-O-DMT-보호된 올리고뉴클레오티드가 함유된 역상 HPLC 분별물을 모아서 침전 탱크로 옮긴다. 몇몇 합성물질의 정제로부터 수득된 생성물을 공정의 이번 단계에서 합한다. 정제된 DMT-온 올리고뉴클레오티드를 산(예를 들어, 아세트산)으로 처리하여 5'-말단에 결합된 DMT 기를 제거한다. 미리 정해진 시간 동안 산에 노출시키고 중화시킨 후, 올리고뉴클레오티드 약물 물질을 단리하고 건조시킨다.
최종 산성 보호제거 단계 이후, 수성 수산화 나트륨을 첨가하여 용액을 중화시키고, 에탄올을 첨가하여 올리고뉴클레오티드 약물 물질을 용액으로부터 침전시킨다. 침전된 물질을 반응 용기의 바닥에 침강되도록 하고 에탄올성 상청액을 따라 버린다. 침전된 물질을 정세수에 재용해시키고 용액 pH를 pH 7.2 내지 7.3으로 조정한다. 침전 단계를 반복한다. 침전된 물질을 물에 용해시키고, 용액을 0.45 미크론 필터를 통해 여과하고, 일회용 폴리프로필렌 트레이로 옮긴 다음 동결건조기에 적재한다. 용액을 -50℃로 냉각시킨다. 1차 건조를 25℃에서 37 시간 동안 실행한다. 온도를 30℃로 증가시키고, 2차 건조 단계를 5.5 시간 동안 수행한다. 동결건조 과정을 완료한 후, 약물 물질을 고밀도 폴리에틸렌 병으로 옮기고 -200℃에서 저장한다.
CD49d/VLA-4를 표적화하는 적합한 추가의 안티센스 화합물은 본원에 참고로 그의 전체가 인용된, 이시스 파마슈티칼스 인크.(Isis pharmaceuticals, Inc.)에 양도된 미국 특허 제6,258,790호 및 안티센스 테라퓨틱스 리미티드(Antisense Therapeutics Ltd)에 양도된 US2009/0029931호에 기재되어 있다. ITGA4 유전자에서 전구-mRNA 스플라이싱을 변형시키기 위해 ITGA4 유전자 전사물을 표적화하는 추가의 안티센스 올리고머는 예를 들면 본원에 참고로 그의 전체가 인용된 국제 특허출원 공개공보 제PCT/AU2016/000158호[머독 유니버시티(Murdoch University)]에 개시되어 있다.
표적 핵산
특별한 핵산에 대한 안티센스 화합물의 "표적화"는 다단계 과정일 수 있다. 이러한 과정은 대체적으로 기능이 조절되어야 하는 표적 핵산의 식별에 의해 시작된다. 본 개시내용에서, 표적 핵산은 VLA-4 또는 α4β7 인테그린의 알파4 인테그린 쇄를 인코딩한다.
표적화 공정은, 대체적으로 또한 목적하는 효과, 예를 들면, 발현의 억제가 일어나도록 발생하는 안티센스 상호작용에 대하여 표적 핵산내에서 적어도 하나의 표적 영역, 분절, 또는 자리를 결정함을 포함한다. 용어 "영역"은 본원에서 사용될 경우, 적어도 하나의 식별가능한 구조, 기능, 또는 특징을 갖는 표적 핵산의 일부분으로서 정의된다. 표적 핵산의 영역내에 분절이 존재한다. "분절"은 표적 핵산내의 더 작은 영역 또는 영역의 하위-부분으로서 정의된다. "자리"는 본원에서 사용될 경우, 표적 핵산내의 위치를 의미한다.
"번역 개시 코돈"이 전형적으로 5'-AUG(전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA 분자에서는 5'-ATG)이므로, 번역 개시 코돈은 또한 "AUG 코돈", "출발 코돈" 또는 "AUG 출발 코돈"으로 지칭된다. 소량의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG, 또는 5'-CUG를 갖는 번역 개시 코돈을 갖고, 및 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 작용하는 것으로 제시되었다. 이와 같이, 용어 "번역 개시 코돈" 및 "출발 코돈"은 많은 코돈 서열을 포괄할 수 있지만, 각 경우 개시자 아미노산은 전형적으로 메티오닌(진핵생물) 또는 포밀메티오닌(원핵생물)이다. 또한 진핵생물 및 원핵생물 유전자는 둘 이상의 대체 출발 코돈을 가질 수 있고, 이중 임의의 하나는 특별한 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정한 조건들의 집합하에 번역 개시를 위해 바람직하게 이용될 수 있음이 당분야에 공지되어 있다. 용어 "출발 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은, 본원에서 사용될 경우, 이러한 코돈의 서열(들)과 무관하게, 예를 들면, VLA-4 또는 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 쇄를 인코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 개시하기 위해 생체내에서 사용되는 코돈 또는 코돈들을 지칭한다.
"종결 코돈"으로서도 지칭되는 "번역 종료 코돈"은 또한 다음 3가지 RNA 서열중 하나를 가질 수 있다: 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA(상응하는 DNA 분자에서는 각각 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA). 용어 "번역 종료 코돈" 및 "종결 코돈"은, 본원에서 사용될 경우, 이러한 코돈의 서열(들)과 무관하게, 예를 들면, VLA-4 또는 α4β7 인테그린의 α4 인테그린 쇄를 인코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 종료하기 위해 생체내에서 사용되는 코돈 또는 코돈들을 지칭한다.
용어 "출발 코돈 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 약 25 내지 약 50개의 인접한 뉴클레오티드를 번역 개시 코돈으로부터의 방향(즉 5' 또는 3')에서 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "종결 코돈 영역" 및 "번역 종료 코돈 영역"은 약 25 내지 약 50개의 인접한 뉴클레오티드를 번역 종료 코돈으로부터의 방향(즉 5' 또는 3')에서 포함하는 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 결과적으로, "출발 코돈 영역" 또는 "번역 개시 코돈 영역" 및 "종결 코돈 영역" 또는 "번역 종료 코돈 영역"은 본 개시내용의 안티센스 화합물에 의해 효과적으로 표적화될 수 있는 모든 영역이다.
번역 개시 코돈 및 번역 종료 코돈 사이의 영역으로 지칭되는 것으로 당분야에 공지된 "개방형 해독틀"(ORF: open reading frame) 또는 "코딩 영역"은 또한 효과적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 하나의 실시태양에서, 유전자의 ORF의 번역 개시 또는 종료 코돈을 포괄하는 유전자내 영역이 표적화된다.
다른 표적 영역으로는 5' 미번역 영역(5'UTR)(당분야에서 번역 개시 코돈으로부터의 5' 방향에서의 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 공지됨) 및 이에 따라 5' 캡 자리 및 mRNA의 번역 개시 코돈 사이의 뉴클레오티드(또는 유전자상의 상응하는 뉴클레오티드), 및 3' 미번역 영역(3'UTR)(당분야에서 번역 종료 코돈으로부터의 3' 방향에서의 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 공지됨) 및 이에 따라 번역 종료 코돈 및 mRNA의 3'말단 사이의 뉴클레오티드(또는 유전자상의 상응하는 뉴클레오티드)가 포함된다. mRNA의 5' 캡 자리는 5'-5' 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA의 대부분의 5'-잔기에 연결되는 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 영역은 5' 캡 구조물 그 자체, 뿐만 아니라 캡 자리에 인접한 최초 50개의 뉴클레오티드를 포함하도록 고려된다. 하나의 실시태양에서, 5' 캡 영역이 표적화된다.
비록 몇몇 진핵생물 mRNA 전사물이 직접 번역되지만, 대부분의 전사물은 번역되기 이전에 전사물로부터 삭제되는 "인트론"으로서 공지된 하나 이상의 영역을 함유한다. 나머지(따라서 번역된) 영역은 "엑손"으로 공지되고, 함께 스플라이싱되어 연속적인 mRNA 서열을 형성한다. 상이한 유전자 공급원으로부터의 두개(또는 그 이상)의 mRNA의 스플라이싱 과정을 통해 생산된 mRNA 전사물은 "융합 전사물"로서 공지된다. 하나의 실시태양에서, 인트론, 또는 스플라이스 자리, 즉 인트론-엑손 접합부 또는 엑손-인트론 접합부, 또는 비정상적 융합 접합부(재배열 또는 결실에 기인함)가 표적화된다. 대체 RNA 전사물은 DNA의 동일한 게놈 영역으로부터 생산될 수 있다. 이들 대체 전사물은 일반적으로 "변이체"로 공지된다.
"전구-mRNA 변이체"는 그들의 출발 또는 종결 위치에서 동일한 유전체 DNA로부터 생산된 다른 전사물과 상이하고 인트론 및 엑손 서열 둘 다를 함유하는 동일한 유전체 DNA로부터 생산된 전사물이다. 스플라이싱 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역, 또는 이의 일부를 절제할 때, 전구-mRNA 변이체는 더 작은 "mRNA 변이체"를 생산한다. 결과적으로, mRNA 변이체는 가공된 전구-mRNA 변이체이고, 각각의 특유의 전구-mRNA 변이체는 스플라이싱의 결과로서 항상 특유의 mRNA 변이체를 생산해야 한다. 이들 mRNA 변이체는 또한 "대체 스플라이스 변이체"로서 공지된다. 만일 전구-mRNA 변이체의 스플라이싱이 발생되지 않는다면, 전구-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하다.
변이체는 전사를 출발 또는 종결시키는 대체 신호의 사용을 통해, 즉 대체 출발 코돈 또는 종결 코돈의 사용을 통해 생산될 수 있다. 대체 출발 코돈을 사용하는 전구-mRNA 또는 mRNA로부터 기원된 변이체는 그러한 전구-mRNA 또는 mRNA의 "대체 출발 변이체"로서 공지된다. 대체 종결 코돈을 사용하는 이들 전사물은 그러한 전구-mRNA 또는 mRNA의 "대체 종결 변이체"로서 공지된다. 대체 종결 변이체의 한가지 특정한 유형은 "폴리A(polyA) 변형체"이고, 이때 생산된 다중 전사물은 전사 기작에 의해 "폴리A 종결 신호"중 하나의 대안적 선택으로부터 생성되고, 이로써 특유의 폴리A 자리에서 종료되는 전사물을 생산한다. 하나의 실시태양에서, 전구-mRNA 또는 mRNA 변이체는 표적화된다.
안티센스 화합물이 혼성화되는 표적 핵산상의 장소는 "표적 분절"로서 지칭된다. 본원에서 사용될 경우, 용어 "표적 분절"은 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 영역의 적어도 8-핵염기 부분으로서 정의된다. 이론에 얽매려는 것은 아니지만, 이들 표적 분절은 혼성화하기 쉬운 표적 핵산의 부분을 나타내는 것으로 현재 믿겨진다.
일단 하나 이상의 표적 영역, 분절 또는 자리가 식별되면, 표적 분절에 충분히 상보성인 안티센스 화합물, 즉 목적하는 효과를 제공하기에 충분한 특이성을 갖고 충분히 잘 혼성화되는 안티센스 화합물이 선택된다.
표적 분절은 또한 개개의 상보성 안티센스 화합물과 조합되어 안정화된 이중-가닥(이중화된) 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 이러한 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 작용부분은 표적 발현을 조율하고, 번역 뿐만 아니라 안티센스 기작을 경유해 RNA 가공을 조절하는 것으로 제시되었다. 게다가, 이중-가닥 작용부분은 화학적 변형을 거칠 수 있다[파이어(Fire) 등의 문헌(1998); 티몬스(Timmons) 및 파이어의 문헌(1998); 티몬스 등의 문헌(2001); 타바라(Tabara) 등의 문헌(1998); 몽고메리(Montgomery) 등의 문헌(1998); 투스클(Tuschl) 등의 문헌(1999); 엘바쉬르(Elbashir) 등의 문헌(2001a); 엘바쉬르 등의 문헌(2001b)]. 예를 들면, 이러한 이중-가닥 작용부분은 이중체의 안티센스 가닥의 표적으로의 고전적 혼성화에 의해 표적을 억제함으로써, 표적의 효소적 분해를 개시하는 것으로 제시되었다[티즈스터만(Tijsterman) 등의 문헌(2002)].
조성물
본 개시내용의 화합물은, 섭취, 분포 및/또는 흡수를 돕기위해, 혼합되거나, 캡슐화되거나, 컨주게이트화되거나, 달리는 기타 분자, 분자 구조물 또는 화합물의 혼합물과 회합되어, 예를 들면, 리포솜, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국부 또는 기타 제형을 생성할 수 있다. 이러한 섭취, 분포 및/또는 흡수-보조용 제형의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는, 제한되지 않지만, US 제5,108,921호, US 제5,354,844호, US 제5,416,016호, US 제5,459,127호, US 제5,521,291호, US 제5,543,158호, US 제5,547,932호, US 제5,583,020호, US 제5,591,721호, US 제4,426,330호, US 제4,534,899호, US 제5,013,556호, US 제5,108,921호, US 제5,213,804호, US 제5,227,170호, US 제5,264,221호, US 제5,356,633호, US 제5,395,619호, US 제5,416,016호, US 제5,417,978호, US 제5,462,854호, US 제5,469,854호, US 제5,512,295호, US 제5,527,528호, US 제5,534,259호, US 제5,543,152호, US 제5,556,948호, US 제5,580,575호, 및 US 제5,595,756호가 포함된다.
본 개시내용의 화합물은 약학적으로 허용가능한 담체내에서 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는, 피험체, 특별히 포유동물, 더욱 특별히 인간에게 투여될때, 알레르기, 독성 또는 달리는 부작용을 생산하지 않는 분자 실체를 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체의 유용한 예로는, 제한되지 않지만, 본 개시내용의 활성제의 활성에 영향을 주지 않는 희석제, 용제, 계면활성제, 부형제, 현탁제, 완충제, 윤활제, 보조제, 비히클, 유화제, 흡수제, 분산 매질, 코팅제, 안정화제, 보호용 콜로이드, 접착제, 증점제, 요변화제(thixotropic agent), 침투제, 금속이온 봉쇄제, 등장성 및 흡수 지연제가 포함된다.
하나의 실시태양에서, 약학적 담체는 주사용 증류수(WFI: water for injection)이고, 약학 조성물은 pH 7.4, 7.2 내지 7.6으로 조정된다.
하나의 실시태양에서, 염은 나트륨 또는 칼륨 염이다.
올리고뉴클레오티드는 키랄성(비대칭성) 중심을 가질 수 있거나, 전체로서의 분자가 키랄성일 수 있다. 개별 입체이성체(거울상이성체 및 부분입체이성체) 및 이들의 혼합물은 본 개시내용의 범주내에 속한다.
본 개시내용의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 에스테르의 염, 입체이성체, 또는 투여시 생물학적 활성 대사물질을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있게 하는 다른 화합물일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은, 본원에서 사용될 경우, 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고 투여시 원치않는 독물학적 영향을 부여하지 않는 화합물의 생리학적으로 및 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 염의 예 및 이들의 용도는 미국 특허 제6,287,860호에 추가로 기재되어 있다.
본 개시내용의 올리고뉴클레오티드 화합물은 전구약물, 입체이성체, 또는 전구약물의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 기타 생물학적 등가물질일 수 있다. 용어 "전구약물"은 본원에서 사용될 경우, 내생성 효소 또는 기타 화학약품 및/또는 조건의 작용에 의해 투여시 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 비활성 형태로 제조되는 치료제를 지칭한다. 특히, 본 개시내용의 안티센스 화합물의 전구약물 형태는 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/24510호, 제WO 94/26764호 및 US 제5,770,713호에 개시된 방법에 따라서 SATE[(S 아세틸-2-티오에틸) 포스페이트] 유도체로서 제조된다.
전구약물은, 예를 들면, 신체내에서, 예를 들어 혈액에서 가수분해에 의해 의학적 효과를 갖는 그의 활성 형태로 전환될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 전구약물은 본원에 참고로 인용된 히구치(T. Higuchi) 및 스텔라(V. Stella)의 문헌[Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A. C. S. Symposium Series (1976)]; ["Design of Prodrugs" ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985]; 및 에드워드(Edward B). 로쉐(Roche)(편저자)의 문헌[Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 기재되어 있다. 유기 화학 분야의 숙련가라면, 많은 유기 화합물은 이들이 안에서 반응되거나 이들이 침전 또는 결정화되어지는 용매와 복합체를 형성할 수 있음을 인식할 것이다. 이들 복합체는 "용매화물"로서 공지된다. 예를 들면, 물과의 복합체는 "수화물"로 공지된다.
종래의 치료법
코르티코스테로이드 치료법은 걸을 수 있는 환자에서 DMD 치료의 중심이 된다. "코르티코스테로이드"는 천연 발생 코르티코스테로이드의 효과를 모방하거나 증대시키는 스테로이드의 일반 화학 구조를 갖는 몇몇 합성 또는 천연 발생 물질중 임의의 하나를 지칭한다. 합성 코르티코스테로이드의 예로는 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론으로의 전구체 포함), 덱사메타손 트리암시놀론(dexamethasone triamcinolone), 부데소니드(budesonide), 및 베타메타손(betamethasone)이 포함된다.
하나의 실시태양에서, MD를 앓는 인간 피험자에서 MD에 대한 본 발명의 치료는 효과량의 치료제, 예컨대 CD49d(VLA-4의 알파 쇄)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 피험체에게 투여함을 포함하고, 추가로 효과량의 제2 약제, 즉 코르티코스테로이드를 피험체에게 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 코르티코스테로이드는 프레드니손(또는 프레드니손 등가물), 데플라자코트(유도체 또는 프레드니솔론)이다. 기타 코르티코스테로이드는 상기 언급된 바와 같이 당분야에 공지된다.
본원에서 병용 투여로는 별도의 제형(또는 단일 약학 제형)을 사용하는 공-투여, 및 어떤 순서로의 연속 투여가 포함되고, 이때 일반적으로 양쪽(또는 모든) 활성제가 이들의 생물 활성을 동시적으로 부여하는 시간 기간이 존재한다.
표준 용량에서의 코르티코스테로이드 치료는 걸을 수 있는 동안 DMD 환자에서 사용되는데, 이는 몇몇 환자에서 보행을 유지하는데 일부 효과를 갖는 것으로 제시되었기 때문이다. 그러나, 표준 용량(0.75mg/kg/일의 프레드니손 또는 0.9mg/kg/일의 데플라자코트)의 연장된 치료는 근육 위축을 일으키고/거나 다른 부작용을 가질 수 있다. CS 치료를 유지하는 걸을 수 없는 DMD 환자에서 표준 치료는 없고, 때때로 이들이 걸을 수 없게될 경우 CS의 고정된 용량(이는 CS의 감소된 mg/kg/일 용량임)으로 치료되거나, 이들은 부작용 및/또는 이점이 없기 때문에 CS 치료를 중단할 수 있다. 본원에 제안되거나 제시된 바와 같이, 코르티코스테로이드 치료(감소된 수준의 코르티코스테로이드 치료 포함)와 병용되는 CD49d에 대한 안티센스 치료는, 걸을 수 없는 피험체에서 근육 기능의 진행을 감소시키거나 지연시켰다. CS 치료가 이러한 피험체에서 임의의 이점을 제공하였는지가 불분명하므로, 이는 ATL1102 단일치료법 또는 병용 치료를 뒷받침한다.
본원에서 사용될 경우, 치료법의 적용과 관련하여 용어 "병용"은 한가지 보다 더 많은 치료법 또는 치료제를 사용함을 지칭한다. 용어 "병용하여"의 사용은 치료법 또는 치료제가 피험체에 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 치료법 또는 치료제는 제2 치료법 또는 치료제를 피험체에게 투여하기 이전에, 이와 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다.
투여
하나의 실시태양에서, 본 개시내용의 안티센스 화합물은 전신으로 투여된다. 본원에서 사용될 경우, "전신 투여"는 장을 통한 투여 또는 비경구 투여 경로이다.
본원에서 사용될 경우, "장을 통한"은 위장관의 임의의 부분이 관여된 투여의 형태를 지칭하고, 예를 들면, 정제, 캡슐 또는 드롭(drop) 형태; 위 공급관, 십이지장 공급관, 또는 위루형성술로의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경구 투여; 및 예를 들면, 좌약 또는 관장약 형태의 안티센스 화합물의 직장 투여를 포함한다.
본원에서 사용될 경우, "비경구"는 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 예로는, 정맥내(정맥내로), 동맥내(동맥내로), 근육내(근육내로), 심장내(심장내로), 피하(피부 아래), 골내 주입(골수내로), 피내(피부 자체내로), 경막내(척추 관내로), 복강강내(복막내로의 주입 또는 주사), 방광내(방광내로의 주입), 경피(접촉 피부를 통한 확산), 경점막(점성 막을 통한 확산), 흡인 투여가 포함된다.
하나의 실시태양에서, 약학 조성물은 피하 투여된다.
안티센스 화합물은 기간 기준으로, 예를 들면, 매일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일에 1회, 주 1회, 주 2회, 주 3회, 또는 2주 마다, 또는 3주 마다 단일 용량으로 또는 반복된 용량으로 투여될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 주 1 내지 3회, 또는 주 1회, 2주 마다 1회, 3주 마다 1회, 4주 마다 1회, 또는 2달에 1회 투여된다.
하나의 실시태양에서, 주 1회 투여된다.
하나의 실시태양에서, 낮은 용량은 3 내지 6 개월 동안 투여되고, 예컨대 적어도 3 내지 6 개월 동안 약 25 내지 50mg/주, 및 이어서 12 개월까지 및 장기적으로 투여된다.
실례가 되는 용량은 약 10 내지 300mg이다. 실례가 되는 용량으로는 25, 50, 100, 150, 200mg이 포함된다. 실례가 되는 용량으로는 0.1mg/kg, 0.4mg/kg, 0.5mg/kg, 1mg/kg 1.5mg/kg(약 50 내지 100mg) 및 3mg/kg(100 내지 200mg) 및 4.5mg/kg(150 내지 300mg)이 포함된다. 하나의 실시태양에서, 용량은 주 1회 투여된다. 이와 같이, 하나의 실시태양에서, 대략 10 내지 30, 또는 20 내지 40, 또는 20 내지 28mg의 낮은 용량은 전형적으로 약 25 내지 65kg 체중의 피험체에게 투여될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 치료학적 효과를 제공하기 위해 50mg 미만, 또는 30mg 미만, 또는 약 25mg 용량으로 투여된다. 하나의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드, ATL1102는 치료학적 효과를 제공하기 위해 50mg 미만, 또는 30mg 미만, 또는 약 25mg 용량으로 투여된다.
하나의 실시태양에서, 치료학적 효과, 예컨대 진행의 지연은 최초 용량의 투여 이후 약 3 개월 이내에 관찰된다. 용어 "치료학적 효과량"은 본원에서 사용될 경우, 예를 들면 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나 피험체에서 근이영양증의 진행을 지연시키거나, 이영양성 근섬유에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나, 투여 조건하에 피험체에서 근이영양증의 진행을 지연시키기에 충분한 안티센스 화합물의 용량을 지칭한다.
또 다른 실시태양에서, 투여는 인간 피험자의 혈장중 2890ng/㎖ 이상, 하나의 실시태양에서, 약 10,000 내지 11,000ng/㎖의 올리고뉴클레오티드의 Cmax를 제공하는 것이 효과적이다.
또 다른 실시태양에서, 투여는 인간 피험자의 혈장중 적어도 2.5 ng/㎖, 하나의 실시태양에서, 적어도 20 ng/㎖, 또는 적어도 45ng/㎖의 올리고뉴클레오티드의 Cmin 또는 Ctrough를 제공하는 것이 효과적이다.
치료법의 투약 계획 및 방침에 대한 결정은, 예컨대 적재 및/또는 유지 용량, 투약 빈도, 투약 기간, 특정 집단 및 다른 치료 조성물과의 공-투여를 위한 용량 조정과 같은 인자를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 주어진 투약 방침을 위해, 치료법 동안 및 이후 둘 다 CD4+CD49d+ T 세포의 감소된 수준을 보여주는 피험체를 식별한다. 이들 피험체는 치료법에 반응하지 못하고, 이는 마지막 투여 후 대략 7일 이내에 CD49d+ T 세포에서 투약 완료 후 재상승을 나타내지 못함을 혈액 샘플에서 평가함으로써 검출되거나 모니터링될 수 있다. 그 대신, 이들 피험체는 치료 후 CD4+CD49d+ T 세포 수준에서 변화가 없거나, 더욱 감소한다. 이들은 PUL2.0에 의해 꽤 신속히 평가될 경우 감소된 근육 수행력을 보여준다. 이들 피험체는, 예컨대 단일 치료법의 경우 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용량을 증가시키거나 감소시킴으로써, 및/또는 코르티코스테로이드의 용량을 증가 또는 감소시키거나, 코르티코스테로이드를 변경함으로써 조정된 투약 계획을 가질 수 있다.
인간 피험자의 혈액 또는 근육에서 T 세포 VLA-4의 수준을 감소시키는 VLA-4 인테그린에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드에 의해 근이영양증을 치료함을 입증하기 위해 연구를 수행한다. VLA-4의 수준의 감소를 혈액, 근육 또는 폐와 같은 하나 이상의 기관중의 T 세포의 소집합에서 검출할 수 있다.
코르티코스테로이드에 대한 피험체에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 측정하기 위해, 피험체에게 올리고뉴클레오티드를 투여하기 대략 24시간 전에 코르티코스테로이드를 중단한다(즉, 이들은 그날을 위해 마지막으로 투여된다). 이로써 코르티코스테로이드의 부재(이는 순환 면역 세포에 효과를 주도록 투여 후 24 시간째 혈류에서 충분히 유의적인 수준으로 존재하지 않음)하에 면역 세포에서 VLA-4 인테그린의 CD49d 알파 쇄에 대한 억제성 안티센스 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가할 수 있다.
CD4+CD49d+ T 세포의 수준 평가 - 유세포분석법 또는 당분야에 공지된 많은 기법들중 하나에 의해 세포를 평가할 수 있다. 면역 크로마토그래피 및 미소유체학 기반의 접근법이 현장 진단을 위해 널리 사용된다. 세포분석법은 칩(chip) 세포분석법을 포함하고 카트리지 기술(국제 특허출원 공개공보 제WOl1128893호)이 또한 이용가능하다. 피험체로부터의 샘플중의 CD4+CD49d+ 세포의 농도를 평가하기 위해 CD4+CD49d+ T 세포 수준을 직접적으로 또는 간접적으로 측정할 수 있다. 세포 수를 평가하는 직접적인 방법은 당분야에 공지되어 있고, 다양한 기술들에 의해 샘플중의 CD49d 표지(들)의 양을 정량화하고 CD4+ 및/또는 CD8+ T-세포의 수를 정량화함을 포함한다. 평균 발현 수준, 세포내 수준 뿐만 아니라 표지의 세포내 수준을 평가할 수 있다. 전형적으로, 이러한 방법은 수득된 생물 샘플에서 CD49d에 특이적으로 결합하는 시약과 피험체로부터의 생물 샘플을 접촉시킴을 포함한다. 전형적으로 시약은 단일클론 항체, 또는 이의 결합 단편, 압타머(aptamer) 또는 항체 모방체이다. 국제 특허출원 공개공보 제W013036620호에는 샘플중의 표적 세포를 검출함이 기재되어 있다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 06058816호에는 통합 소프트웨어-형광 마이크로비이드 표준 시스템의 자동화된 수행을 위한 키트가 기재되어 있고, 상기 키트는 하나 이상의 플루오로크롬이 표지화된 단일클론 항체; 항체를 표지화하기 위해 사용되는 동일한 하나 이상의 플루오로크롬을 포함하는 마이크로비이드; 및 컴퓨터 상에서의 실행을 위한 소프트웨어 프로그램을 갖는 컴퓨터 해독가능한 비-일시적 매체를 포함한다. 전형적으로 소프트웨어 프로그램은 특정 로트(lot)의 마이크로비이드 표준물 및 단일클론 항체의 형광-표지화된 혼합물에 부합되고, 마이크로비이드의 각각의 집단의 형광 강도에 대한 정보를 포함한다. 소프트웨어 프로그램은 마이크로비이드의 현탁액 및 세포에 결합된 형광 표지화된 항체에 대한 정보를 유세포분석기로부터 취하고, 데이터, 매끄러운 곡선을 분석하고, 새로운 파라미터를 계산하고, 품질 관리 측정값을 제공하고, 마이크로비이드 및 형광 표지화된 항체의 만료를 지시하고; 소프트웨어 프로그램은 조작자를 경계시키고, 추가로 사용되는 분석 로트 및 견본 분석의 일부로서 이용되는 유세포분석 기기의 유형을 확인하기 위해 사용자로부터 정보를 얻고; 소프트웨어 프로그램 기록은 기기 성능의 포괄적 문서자료를 제공하기 위해 누적 파일 기록을 생성한다. 소프트웨어 프로그램은 소프트웨어 프로그램내의 마이크로비이드에 할당된 형광값에서의 변화 및 로트 사이에서의 회귀 분석에 의해 결정되는 인자에 의해 상이한 생산 로트 사이의 형광 발현에서의 편차 또는 차이를 정규화할 수 있고; 소프트웨어 프로그램은 로트 사이의 부정확성 수준이 5% 미만임을 보장하기 위해 요구되는 형광 강도의 범위내에 마이크로비이드가 속하는지의 여부를 결정하고, 필요할 경우, 외부 표준물의 사용을 통해 견본 세포에 의해 결합된 형광 항체의 실제 양을 결정하기 위해, 상이한 생물 샘플 상에서 상이한 마이크로비이드 생산 로트 및 형광 표지화된 항체 생산 로트의 데이터를 비교하여 모니터링한다.
대안의 방법은 국제 특허출원 공개공보 제WO 17062646호에 기재되어 있고, 이는 세포의 생물표지-형태학적 프로파일을 검출하기 위한 기법을 설명하며, 이때 세포는 작용화된 나노입자 종과 접촉되고, 각각의 작용화된 나노입자 종은 생물표지-결합 작용부분을 포함하고, 생물표지-결합 작용부분을 포함하는 작용화된 나노입자 종의 그의 개별 생물표지로의 결합을 통해 나노입자-세포 복합체를 형성한다. 복합체를 고정화하고, 에피-일루미네이션(epi-illumination) 또는 소실광으로 비추고, 각각 관찰된 복합체화된 작용화된 나노입자로부터 산란되는 공명광을 수집하여 각각의 영상화된 세포의 생물표지 특징을 수득한다. 추가로 염색하여, 평가되는 세포의 형태학적 프로파일을 가능하게 한다.
하나의 실시태양에서, 무작위화 이중-맹검 플라시보-대조 연구를 걸을 수 없는 10 내지 18세의 체중 25kg 이상의 DMD 환자에서 수행한다. 참가자를 1개의 그룹 당 대략 25명의 환자로 4개의 그룹으로 무작위로 나누고, 3개의 그룹에 ATL1102를 주 1회 25mg으로 또는 주 1회 100mg으로 각각 제공하고, 마지막 그룹에 플라시보를 52주 동안 제공한다. 코르티코스테로이드(CS), 프레드니솔론 또는 데플라자코트에 의한 기존의 치료에 더하여 ATL1102 또는 플라시보를 52주 동안 주 1회 투여한다.
모든 연구 참가자들에게 6 개월(26주) 동안 오픈 라벨 연장 연구(open label extension)를 시작하도록 제안한다. 기선과 비교하여 52주째 PUL2.0 스코어(또는 동등한 임상 스코어)에 기초한 반응성을 나타내는 오픈 라벨 연장 연구를 지속하는 환자는 이들의 ATL1102 및 CS 치료를 유지할 수 있다. 예를 들어 기선에 비해 -2., -3 또는 그 이하의 PUL2.0 스코어를 가지면서, 기선과 비교하여 52주째 ATL1102 +/- CS 치료에 무반응성인 환자는 6 개월(26주)의 오픈 라벨 연장 연구 동안 상이하거나, 더 많거나 더 적은 용량의 ATL1102를 제공받을 수 있다.
6 개월(26주)의 오픈 라벨 치료 이후, 78주째 환자의 PUL2.0을 PUL2.0 반응성에 대해 52주째 PUL2.0과 비교할 것이다. 78주째 순환 CD4+CD49d+ T 세포의 수를 상기 개략화된 바와 같이 PUL2.0 결과 4주 후인 82주째의 수와 비교할 것이다(CS의 임의의 투약 전). -2., -3 또는 그 이하의 PUL2.0 스코어를 가지면서 ATL1102에 무반응성인 환자는, 추가의 추적 검사에서 PUL2.0 반응성을 추가로 모니터링하면서, ATL1102 용량을 바꾸거나, 그들의 CS 용량을 예를 들어 예시된 바와 같이 표준 용량의 2/3 또는 1/3로 조정하는 선택지를 가질 것이다.
임상 평가를 위한 기타 2차 종점으로는 안전성에 대한 측정값 및 효험에 대한 측정값, 예컨대 미오그립(myogrip) 및 미오핀치(myopinch)에 의해 측정되는 근육 강도, 호흡 표지, EK, EK2, 삶의 질, 및 근육 섬유증, 지방 염증-부종 및 위축에 대한 MRI 평가가 포함된다. 임의의 하나 이상의 이들 측정값은, PUL2.0 반응성 및 PUL2.0 평가 후 CD4+CD49d+ 변화에 기초하여 ATL1102 용량 또는 CS 용량을 조정하기 이전에 고려될 수 있다.
투약 계획은 본 개시내용에 따라서 변경될 수 있고, 예를 들면, 기선에 대하여 PUL2.0을 평가하기 전 3 개월, 6 개월, 1년 또는 그 이상 동안의 투약, PUL2.0 이후 순환 CD4+CD49d+ 세포의 변화 및 이에 따른 ATL1102 용량 조정은 당분야의 숙련가에 의해 구현되는 바와 같이 포괄된다. 다른 변경은 PUL2.0이 평가되는 마지막 투약 1, 2, 3 또는 4주 또는 그 이상의 주 이후에 순환 CD4+CD49d+ 세포를 평가함을 포함하고, 이들은 칩 상에서 유세포분석에 의해 측정된다.
본 발명의 위축의 한 양태에 대한 설명은 다음과 같이 번호와 함께 제시된다.
1. 피험체에서 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나, 근이영양증의 진행을 지연시키기에 충분한 시간 및 조건하에 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 치료학적 효과량의 억제성 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 근이영양증 치료가 필요한 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함하는, 피험체에서 근이영양증을 치료하는 방법:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
2. 피험체에서 근육 기능, 예컨대 사지 기능을 향상시키기에 충분한 조건하에 일정 시간 동안 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 치료학적 효과량의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 근이영양증을 앓는 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함하는, 근이영양증을 앓는 피험체에서 근육 기능, 예컨대 사지 기능을 향상시키거나 근육 기능, 예컨대 사지 기능의 감소를 지연시키는 방법:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
3. 근육 수행력, 예컨대 근육(예를 들어 사지) 강도를 향상시키거나 근육 수행력, 예컨대 근육(예를 들어 사지) 강도의 감소를 지연시키기에 충분한 조건하에 일정 시간 동안 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는 치료학적 효과량의 올리고뉴클레오티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 근이영양증을 앓는 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함하는, 근이영양증을 앓는 피험체에서 근육 수행력, 예컨대 근육 또는 사지 강도를 향상시키거나 근육 수행력, 예컨대 근육 또는 사지 강도의 감소를 지연시키는 방법:
5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
이때,
a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이며;
e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
4. 주당 1회, 2회 또는 3회, 또는 2주에 1회, 또는 1 개월에 1회 주기적으로 투여하는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
5. 치료학적 효과량이 10mg 내지 300mg인, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
6. 치료학적 효과량을 25mg 내지 50mg, 50mg 내지 100mg, 100mg 내지 200mg 및 150mg 내지 300mg으로 구성된 군에서 선택하는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
7. 올리고뉴클레오티드가 나트륨 또는 칼륨 염인, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
8. 약학적 담체가 WFI이고, 조성물을 pH 7.2 내지 7.6으로 조정하는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
9. MD가 뒤센 근이영양증(DMD), 지대형 근이영양증(LGMD), 베커 근이영양증(BMD), 선천성 근이영양증(후쿠야마 타입 선천성 MD, 및 미오신 결핍이 있는 선천성 MD를 비롯한 CMD), 안면견갑상완형, 안구인두형, 에머리-드레이푸스, 및 원위 근이영양증으로 구성된 군에서 선택되는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
10. MD가 디스트로핀 유전자에서의 돌연변이와 연관되는, 제9항의 방법.
11. 피험체가 MD로 진단받고 걸을 수 있거나 걷지 못하는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
12. 피험체가 청소년이거나 10세 이상의 사춘기 소년인, 제11항의 방법.
13. 조성물을 피하로 투여하는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
14. 투여를 코르티코스테로이드 치료와 병용하는, 제1항, 제2항 또는 제3항의 방법.
15. 코르티코스테로이드를 낮은 용량으로 투여하는, 제14항의 방법.
실시예
실시예 1
하나의 실시태양에서, DMD를 앓는 10세 이상의 청소년기(또는 사춘기)의 걷지 못하는 소년에게 ATL1102를 매주 약 1.5mg/kg(약 50 내지 100mg), 3mg/kg(100 내지 200mg) 및 4.5mg/kg(150 내지 300mg)으로 12주 이하 동안 투여한다. 예를 들면 운동/근육 기능 및 염증 표지에 미치는 투여된 올리고뉴클레오티드의 효과를 측정한다. 근육 변성-재생 및 섬유증에 대한 표지를 또한 평가한다. 표지를 제자리에서 또는 샘플, 예컨대 혈장, 뇨, 또는 근육 생검에서 검출할 수 있다. 흡기 및 호기 압력, 최고 기침량, FVC를 검사하여 호흡 수행력의 변화를 평가한다. 정규화된 상지 도달가능한 표면적에서의 백분율 변화, 상지 평가 스코어의 수행력에서의 백분율 변화, 개인-보고 결과 측정 상지(PROM-UL: Person-Reported Outcome Measure Upper Limb) 기능성 능력 스코어에서의 백분율 변화를 사용하여 근육 기능을 평가한다. 삶의 질 질문지는 치료 효과를 결정하는데 있어서 유용하다. 코르티코스테로이드를 매일, 또는 덜 자주 투약할 수 있다. 걸을 수 있는 DMD 환자를 위한 표준 치료법으로서 프레드니솔론을 0.75mg/kg/일로, 데플라자코트를 0.9mg/kg/일로 투약할 수 있고, 표준 용량의 2/3, 1/2, 또는 1/3로 투약할 수 있다.
실시예 2
하나의 실시태양에서, DMD를 앓는 걸을 수 있는 4 내지 11세의 소아 소년에게 매주 ATL1102를 약 1.5mg/kg(약 10 내지 100mg), 3mg/kg(20 내지 200mg) 및 4.5mg/kg(30 내지 300mg)으로 12주 이하 동안 투여한다. 예를 들면 운동/근육 기능 및 염증 표지에 미치는 투여된 올리고뉴클레오티드의 영향을 결정한다. 걸을 수 있는 소아 소년은 잘 걸을 수 있거나 잘 못걸을 수 있다. 당분야의 숙련가에게 공지된 방법에 의해 걷는 능력의 상실이 유지되거나 감소됨을 평가할 수 있다.
실시예 3
하나의 실시태양에서, 10명의 걷지 못하는 12 내지 18세의 DMD 환자에게 ATL1102를 3mg/kg의 출발 용량으로 주 1회 4주 동안 제공한다. 처음 5명의 환자에게 추가의 4주 동안 3mg/kg/주로 투약을 지속하고, 나머지 5명의 환자의 용량을 4주 동안 4.5mg/kg/주(주 2회 2.25mg/kg)로 증가시킨다. 치료 8주 후, 4주의 모니터링 기간을 수행한다. 치료 및 모니터링 기간 동안, 기선, 2주, 4주, 6주, 8주, 및 10주 및 12주째 평가한다. 1차 활성 결과는 기선에 대하여 4주 및 8주째 순환 림프구, CD4+ 및 CD8+ T 세포, 및 hi CD49d T 세포의 수, 및 안정성, 예컨대 주사 자리 반응, 혈소판 변화, 간 효소 GGT-빌리루빈(bilirubin), CRP 및 알부민, A/G 비 변화를 평가하는 것이다. 임상 평가를 위한 2차 종점은 상지 기능에서의 강도, 및 기능적 능력, 삶의 질, 및 호흡 표지, 및 근육 섬유증, 지방 염증-부종 및 및 위축에 대한 MRI 평가, 및 약동학에 대한 측정값이다. 탐구적 결과 측정값으로는 혈청/혈장 생물표지 반응, 예컨대 근육 염증, 근육 섬유증, 근육 세포자멸/변성, 및 근육 재생과 관련된 반응, 예컨대 사이토킨, 및 프로테오믹스(proteomics) 및 단핵 세포 RNA 어레이(array) 및 엑소솜 RNA가 포함될 것이다.
실시예 4
억제성 올리고뉴클레오티드의 저 용량 투여
하나의 실시태양에서, 9명의 걷지 못하는 10 내지 18세의 25 내지 65kg 체중의 DMD 환자에게 ATL1102를 25mg의 출발 용량으로 주 1회 24주 동안 제공한다. 치료 24주 후, 8주의 모니터링 기간을 수행한다. 치료 및 모니터링 기간에서, 치료 기간 동안 기선, 및 2주 마다, 치료 후 모니터링 기간 동안 4주 마다 평가한다. 1차 활성 결과는 기선에 대하여 치료 4주 및 8주째 순환 림프구, CD4+ 및 CD8+ T 세포, 및 hi CD49d T 세포의 수, 및 안정성, 예컨대 주사 자리 반응, 혈소판 변화, 간 효소 GGT-빌리루빈, CRP 및 알부민, A/G 비 변화를 평가하는 것이다. 임상 평가를 위한 2차 종점은 근육 강도, 및 상지 기능, 미오셋(myoset)에 의해 측정되는 강도, 및 PUL-2(DMD에 대한 상지 수행력 모듈 2.0)에 의해 측정되는 사지 기능적 능력, 삶의 질, 및 호흡 표지, 및 근육 섬유증, 지방 염증-부종 및 및 위축에 대한 MRI 평가, 및 약동학에 대한 측정값이다. 탐구적 결과 측정값으로는 혈청/혈장 생물표지 반응, 예컨대 근육 염증, 근육 섬유증, 근육 세포자멸/변성, 및 근육 재생과 관련된 반응, 예컨대 사이토킨(이중 하나 이상은 근육 손상의 표지일 수 있음), 및 프로테오믹스 및 단핵 세포 RNA 어레이 및 엑소솜 RNA가 포함될 것이다.
실시예 5
결과
12주째 환자 1의 결과
25mg/주의 낮은 용량의 ATL1102를 12주 동안 13세의 62kg 체중의 걷지 못하는 피험자(30mg의 1일 용량의 코르티코스테로이드(CS) 및 데플라자코트(0.48mg/kg/일)로 치료중)에게 투여하였다. ATL1102는, CS의 매일 투약 이전에 기선(1주)에서 환자에서 관찰되는 높은 수준의 CD49d를 발현하는 순환 CD8+ 세포 및 CD8+ 세포의 마이크로리터 당 세포의 수를 감소시키고, 생화학 탐구 표지에 의해 측정되는 근육 손상의 표지를 감소시키며, 미오셋에 의해 측정되는 근육 강도, 및 중요하게는 PUL-2.0에 의해 측정되는 근육 기능에 효과적이다. 이러한 피험자는 대략 2.5년 전에 보행 능력을 잃었고, 걸을 수 있는 경우 DMD를 앓는 피험자를 치료하는 데플라자코트 사용의 표준 치료량인 0.90mg/kg/일 용량의 54%(∼50%)로 치료중이었다. 표준 치료로서 사용되는 동등한 프레드니솔론 용량은 걸을 수 있는 DMD 피험자의 경우 0.75mg/kg/일이다.
면역 세포
면역 세포에 미치는 ATL1102의 효과를 기선(1주), 5주(ATL1102 투약 후 3 일), 및 8주 및 12주(8주 및 12주 투약 후 7 일)에 유세포 분석 및 혈액 분석에 의해 측정하였다. CD8+ 세포에 미치는 ATL1102의 효과를 다발성 경화증(MS)에서 사용되는 더 높은 ATL1102 용량에서의 이전 경험[림로쓰(Limmroth) 등의 문헌(2014)]에 상대적으로 선택 비교하였다. 또한 MS 연구에서 이전에 측정된 바와 같이, 투약 후 3 일 보다 더 길게 효과가 연장되었고, ATL1102 투약 후 처음 7 일 동안 효과가 나타났다. 특정 면역 세포는 이러한 용량 및 평가 시간에서 영향을 받지 않았고, ATL1102 효과는 0.4mg/kg/주의 이러한 낮은 25mg 용량에서 비교적 더욱 특이적임을 지시하였다. 예를 들어, MS 연구에서 ATL1102에 의한 더 높은 용량에서 관찰되는 바와 같은 유의적인 감소는 호중구 또는 혈소판에서 없었다[림로쓰(Limmroth) 등의 문헌].
미오셋 - 근육 강도 데이터
이러한 피험자 1로부터의 미오셋 예비 데이터는, 기선과 비교하여 투약 12주 이후 미오그립에 의해 측정되는 주로 사용하는 손에서 강도가 감소하였지만, 미오핀치에 의해 측정되는 엄지에서 강도가 감소하지 않았고, 기선에 대하여 12주 이후 탭(tap)의 수가 동일한 모비플레이트(moviplate)에 의해 결정되는 손가락 강도에서 강도가 감소하지 않았음을 제시한다. 나머지 손에서의 데이터는, 기선과 비교하여 12주째 손, 또는 손가락에서 강도의 감소가 없고 엄지에서 수치적으로 더 높은 강도가 있었음을 제시한다. 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에 따르면, CS 및 미오셋과 함께 12주 이상 동안 치료된 15명의 환자(14명은 CS로 치료됨)를 살펴본 결과, 기선과 비교하여 미오그립에서 0.22kg이 감소하고, 미오핀치에서 0.1kg이 감소하였으며, 모비플레이트에서 증가하는 평균 경향을 나타내었다.
PUL-2 -기능 데이터
DMD에 대한 PUL-2는 상지 기능을 측정하기 위해 사용되는 PUL-1의 최신 버전이다. PUL-2는 12의 최대 스코어를 갖는 더 높은 수준의 어깨 기능, 17의 최대 스코어를 갖는 중간 수준의 팔꿈치 기능, 및 13의 최대 스코어를 갖는 원위 손목 및 손 기능을 측정한다. 평균 3 내지 6의 진입(entry) 스코어(6은 최고값이고, 0은 최저값임)는, 피험자가 어깨 기능에 대해 평가될 수 있음을 지시한다. 피험자 1은 5의 진입 수준 기능 스코어를 가졌고, 기록된 측정값은 피험자가 12주에 걸쳐 투약받고 기선 및 12주에서 8의 스코어를 가지면서 어깨에서 기능 손실이 없었음을 지시한다. 피험자 1은 기선에서의 13의 스코어에 비해 12주째 14의 스코어를 가지면서 중간-수준 팔꿈치에서 기능이 증가하였고, 기선에서의 10의 스코어에 비해 12주째 12의 스코어를 가지면서 원위 손목 및 손에서 기능이 증가하였다. 기선과 비교하여 투약 12주째, PUL-2.0 총 기능 스코어는 31에 비교되는 34였다. 환자 진입 수준 스코어는 또한 기록된 PUL-2 결과와 일치하여 기선에서의 수준 5에서 수준 6으로 증가하였다.
치료법에 ATL1102를 더하는 것은 미오셋에 의해 측정되는 근육 강도를 보유하는데 도움을 주고, 상기 피험자에서 기능을 향상시키지 않는다면 PUL-2에 의해 측정되는 경우 기능을 유지시키는 것으로 보인다. 이와 같이 ATL1102 치료법은 질병의 진행을 둔화시킬 수 있다.
DMD 환자를 치료하고, 근육 강도 및 사지 기능을 향상 및 안정화시키며, 근이영양증 질환의 진행을 둔화시키기 위한 단일치료법으로서의 또는 CS와 병용되는, 일반적으로 CD49d(VLA-4의 알파 쇄)에 대한 안티센스 및 특별히 ATL1102의 용도가 상기 결과로부터 인정된다.
DMD 환자를 치료하고, 근육 지방 조직 수준, 근육 강도 및 사지 기능을 향상 및 안정화시키고, 근이영양증 질환의 진행을 둔화시키기 위한 단일치료법으로서의 또는 CS와 병용되는, 일반적으로 CD49d(VLA-4의 알파 쇄)에 대한 안티센스 및 특별히 ATL1102의 용도가 상기 결과로부터 인정된다.
숙련가라면 근육 수행력의 핵심 요소는 가장 큰 힘이고 미오그립 및 미오핀치에서 편리하게 측정되는 강도임을 인식할 것이다. 또한, 반복적으로 힘을 지탱하는 능력인 지구력/피로도는, 예를 들면 미오그립 및 미오핀치의 반복적 측정에 의해 시험된다. 또한, 힘/단위 시간인 동력은 6분 보행 시험에 의해 측정된다. 운동 수행력은 근육 작용의 움직임, 예컨대 대근육 운동 기량 및 손목, 손, 손가락, 발 및 발가락에서의 소근육 운동 기량이다. 당분야의 숙련가라면, 운동 수행력이 상지 또는 하지, 동물의 경우 앞발 및 뒷발과 관련된 일상 생활에서의 활동을 포함함을 이해할 것이다. DMD를 앓는 걷지 못하는 어린이에서, PUL1.0, PUL1.2, PUL2.0과 같은 상지 수행력을 측정하기 위한 모듈이 이용가능하고, 이들은 또한 DMD 및 다른 근육 위축 증상을 앓는 걸을 수 있는 어린이를 위해 사용될 수 있다.
추가로 당분야의 숙련가라면, 근육 강도는 상지 또는 하지 강도의 척도일 수 있고, 상지 근육에서 강도는 손으로 잡는 근육기록계를 사용하여 그램, 또는 파운드로 측정되는 어깨 굴곡, 팔꿈치 신전 및 손목 신전에 대해 사용됨을 알 것이다.
미오셋은 상지의 강도 및 피로도를 측정하고, 이들은 반복된 측정값이므로(피로도에 대한 데이터는 제시되지 않음), 결과는 대부분 3회 이상 반복된 유효 결과의 강도 최대 결과를 제공한다. 때때로 가장 큰 결과값은 두번째 또는 세번째 시험이다.
근육 손상에 대한 탐구적 약력학적 결과 측정
크레아틴 키나아제(CK), 아스파르트산 아미노기전달효소(AST), 및 락트산 탈수소효소(LDH)는, DMD를 앓는 소년에서 일차적으로 낮은 수준의 디스트로핀과 관련되거나 디스트로핀과 관련되지 않은 근육 손상 및 수축 시의 근육 손상, 및 이차적으로 근육에 대한 염증 및 다른 후속적 손상과 관련된 근육 손상에 대한 척도이다. 크레아틴 키나아제(CK), 아스파르트산 아미노기전달효소(AST), 및 락트산 탈수소효소(LDH)는 걷지 못하는 환자에 비해 더 많은 근육량 및 염증을 갖는 젊은 걸을 수 있는 DMD 환자에서 근육 손상에 대한 척도이다.
그럼에도 불구하고, 혈액 및 혈청 샘플을 수집하여 피험자 1에서 근육 손상 표지 변화를 조사하였다. 피험자 1에서, CK, ALT, AST, LDH는 8주 및 12주째 기선 및 5주와 비교하여 감소하였다. CK, ALT, AST, LDH에 대한 기선/5주 수준(단위/리터)은 각각 5860/6881, 304/404, 시험되지 않음/184, 및 632/681이었고, 이와 비교되는 8주/12주 수준은 4606/5358, 265/250, 116/134, 및 564/498이었다. LDH 수준은 높은 것으로 고려되는 수준에서 정상 범위내로 감소하였다. 이는 디스트로핀 감소 또는 염증 또는 기타 손상과 관련된 근육 손상의 징후가 걷지 못하는 환자에서 감소되었음을 제시한다.
실시예 6
4명 환자의 12주 데이터 및 2명 환자의 24주 데이터의 결과
12주에 걸친 4명의 걷지 못하는 환자(환자 1 포함)로부터의 데이터는 환자 1에서의 실시예 5의 관찰과 일치하고, 25mg의 ATL1102에 의한 주 1회 치료가 근육 강도 및 사지 기능을 향상 및 유지시킴을 뒷받침한다. 4명의 환자는 10세 내지 15세의 연령에서 9 개월 내지 4.5년의 기간에 걸쳐 보행 능력을 잃었고, ATL1102 치료를 시작하였을때 13세 내지 17세였다. 대략 40 내지 65kg 범위의 체중을 갖는 이들 환자에게 대략 0.4 내지 0.6mg/kg/주의 ATL1102를 제공하였다. 이들은 모두 걸을 수 있을 때 DMD를 앓는 피험자를 치료하기 위한 0.90mg/kg/일 용량의 데플라자코트 및 0.75mg/kg/일의 프레드니솔론 사용의 표준 치료를 중단하였고, 고정된 20 및 25mg 용량의 프레드니솔론 및 30mg 용량의 데플라자코트로 치료중이었으며, 이는 걸을 수 있는 환자에서 사용할 경우 이들 스테로이드의 표준 용량의 대략 1/2, 2/5 및 4/5이다.
24주에 걸친 2명의 걷지 못하는 환자(환자 1 포함)로부터의 데이터는 또한 12주에 걸친 관찰과 일치한다. 2명의 환자는 각각 10세 내지 13세의 연령에서 2.5년 내지 4.5년에 걸쳐 보행 능력을 잃었고, ATL1102 치료를 시작하였을때 13세 및 17세였다. 대략 60 내지 65kg 범위의 체중을 갖는 이들 환자에게 대략 0.4mg/kg/주의 ATL1102를 제공하였다. 환자 1은 30mg의 데플라자코트로, 환자 2는 20mg의 프레드니솔론으로 치료중이었고, 이는 각각 걸을 수 있는 환자에서 사용되는 CS의 표준 1일 용량의 54% 및 40%이다.
미오셋: 미오그립 및 미오핀치 근육 강도 데이터
주로 사용하는 팔 및 주로 사용하지 않는 팔에 의해 미오그립 및 미오핀치 데이터를 생성하고, 그립 및 핀치 시험을 각각의 시점에 수회 실행한다. 이는 유효한 결과를 수득하고 근육 강도 및 지구력을 결정할 수 있도록 허용한다.
미오그립-근육 강도 데이터
기선과 비교되는 투약 12주 이후의 4명의 DMD 환자로부터의 미오그립 데이터를 환자가 주로 사용하는 팔에서 미오셋 공급업체에 의해 권고되는 바와 같이 평가하였다. 주로 사용하는 손에서 미오그립 강도는 기선으로부터 0.09kg의 평균 증가 및 10.52%의 강도 증가를 보여주었다. 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에서는 12주 동안 치료된 15명의 환자(14명은 CS에 의해 치료됨)를 살펴보았고 12주째 미오그립에 대해 분석된 10명의 환자에서 기선과 비교하여 미오그립 강도의 0.22kg의 평균 감소 경향 및 3.28%의 감소가 관찰되었다.
기선과 비교되는 투약 24주 이후의 2명의 DMD 환자로부터의 미오그립 데이터를 환자가 주로 사용하는 팔에서 평가하였다. 주로 사용하는 손에서 미오그립 강도는 기선으로부터 단지 0.42kg의 평균 감소 및 평균 1.24%의 감소를 보여주었다. 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에 따르면, 24주째 강도에 대해 분석된 9명의 환자에서 기선과 비교하여 미오그립 강도의 0.50kg의 유의적인 평균 감소 및 10.45%의 감소를 보여주었다.
미오핀치-근육 강도 데이터
기선과 비교되는 투약 12주 이후의 4명의 DMD 환자로부터의 미오핀치 데이터를 환자가 주로 사용하는 팔에서 미오셋 공급업체에 의해 권고되는 바와 같이 평가하였다. 주로 사용하는 손에서 미오핀치 강도는 기선으로부터 평균 0.169kg의 증가 및 5.31%의 강도 증가를 보여주었다. 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에서는 12주째 미오핀치에 대해 분석된 10명의 환자에서 기선과 비교하여 미오핀치 강도의 0.1kg의 평균 감소 경향 및 4%의 감소가 관찰되었다.
기선과 비교되는 투약 24주 이후의 2명의 DMD 환자로부터의 미오핀치 데이터를 환자가 주로 사용하는 팔에서 평가하였다. 주로 사용하는 손에서 미오핀치 강도는 기선으로부터 0.034kg의 평균 증가 및 강도의 -2.58% 감소를 보여주었다. 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에 따르면, 24주째 미오핀치에 대해 분석된 9명의 환자에서 기선과 비교하여 미오핀치에서 0.38kg의 유의적인 평균 감소 및 15.2%의 감소를 보여주었다.
모비플레이트
기선과 비교되는 투약 12주 이후의 4명의 DMD 환자로부터의 모비플레이트 데이터를 환자가 주로 사용하는 팔에서 미오셋 공급업체에 의해 권고되는 바와 같이 평가하였다. 주로 사용하는 손에서 모비플레이트는 30초에서 63.5의 평균 탭 속도를 보여주었고, 기선에 대하여 4의 평균 탭 수가 증가하였다. 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에서는 12주째 모비플레이트에 대해 분석된 10명의 환자에서 기선과 비교하여 2.3 탭의 평균 증가가 관찰되었다.
PUL 2 사지 근육 기능 데이터
기선과 비교되는 투약 12주 이후의 4명의 DMD 환자로부터의 PUL2.0 데이터를 평가하였다. PUL2.0 총 기능 스코어는 기선으로부터 평균 3.66 포인트의 상승, 및 평균 9.6%의 상승을 보여주었다. 3명의 환자는 +3 포인트 상승하였고, 1명의 환자는 +2 포인트 상승하였다.
기선과 비교되는 투약 24주 이후의 2명의 DMD 환자로부터의 PUL2.0 데이터를 평가하였다. PUL2.0 총 기능 스코어는 기선으로부터 평균 2 포인트의 상승, 및 평균 9.9%의 상승을 보여주었다. 두 환자 모두 총 기능 스코어에서 +2의 상승을 나타내었다.
페인(Pane) 등의 문헌(2018)에서는 90명의 걷지 못하는 DMD 환자에서, 기선, 12 개월 및 24 개월에 PUL2.0 기능 데이터를 관찰하였다. 90명의 환자중 52명, 즉 58%는 CS 치료중에 있었다. 결과는 24 개월의 기간에 걸쳐 선형적이었고, 이는 12 및 24 개월의 기간에 걸쳐 유의적으로 감소함을 보여주었다. 내삽법에 따라 추정된 평균 총 기능 스코어는 1이 감소하였고, 기선과 비교하여 PUL2.0 총 기능 스코어에서 평균 5.4%의 감소가 추정되었다.
피험자 1은 가능한 6개의 스코어중 5의 진입 수준 기선 기능 스코어를 가졌고, 이는 12주째 수준 6으로 증가되었고 24주째 수준 6에서 유지되었다. 환자 2는 가장 낮은 가능한 스코어 0의 바로 위인 1의 진입 수준 기선 기능 스코어를 가졌고, 진입 스코어는 12주째 수준 2로 증가되었고 24주째 수준 2에서 유지되었다. 나머지 환자는 3의 기선 진입 수준에서 유지되었다. 3 내지 6의 평균 진입 스코어(6은 최고점, 0은 최저점)는 피험자를 어깨 기능에 대해 평가할 수 있음을 나타낸다.
PUL-2는 12의 최대 스코어를 갖는 더 높은 수준의 어깨 기능, 17의 최대 스코어를 갖는 중간 수준의 팔꿈치 기능, 및 13의 최대 스코어를 갖는 원위 손목 및 손 기능을 측정한다. 12주째, 환자 1, 2, 3, 및 4는 기선에 대해 0, 0, +2 및 +3의 스코어 차이를 나타내었고, 24주째, 0 및 0이었다. 기선에 대한 12주째의 중간-수준 팔꿈치의 기능은 각각 +1, -2, +1, 및 -1이었고, 24주째 +1 및 + 2이었다. 기선에 대한 12주째의 원위 손목 및 손의 기능은 각각 +2, 0, 0, 및 +1이었고, 24주째 +1 및 +0이었다.
DMD 환자를 치료하고, 근육 강도 및 사지 기능을 향상 및 안정화시키며, 근육 근이영양증 질환의 진행을 둔화시키기 위해 단일치료법으로서 이용되거나 CS와 병용되는, 일반적으로 CD49d(VLA-4의 알파 쇄)에 대한 안티센스 및 특별히 ATL1102의 용도가 상기 결과로부터 인정된다.
실시예 7
환자 8주 데이터의 결과
미오셋 근육 강도 및 PUL2.0 기능 데이터에 대한 이른 8주간의 신속한 효과
미오셋 결과는 12주 이전에는 보고되지 않았고, 12주째 가장 초기의 데이터는 리코티(Ricotti) 등의 문헌에서 이용가능하고, 모든 다른 연구는 12 개월이 지나서이다. 코르티코스테로이드 효과 또한 12주 보다 더 일찍 보고되지 않았다. 놀랍게도, ATL1102는 처음 6명의 환자에서 8주 만큼 이른 시기에 평균 미오그립 및 평균 미오핀치 근육 강도, 및 PUL2.0 사지 기능을 향상시켰고, 효과는 지금까지 평가된 4명의 환자에서 12주까지 유지되었다.
실시예 8
CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 MDX 마우스 연구
인간 CD49d에 대한 안티센스 억제제, ATL1102는 DMD 환자에서 염증성 면역 중재된 근육 섬유 손상을 감소시키기 위한 치료로서 본원에 기재된 바와 같이 연구되었다. 근육 강도 및 근육 기능에 미치는 ATL1102 효과는 실시예 5, 6 및 7에 개략화되어 있고, DMD의 치료에서 CD49d, 또는 VLA-4에 대한 임의의 억제제의 효과를 최초로 보여준다. 현재 코르티코스테로이드(CS)는 DMD에서 관찰되는 염증을 감소시키기 위해 사용되고, CS는 환자 1, 2, 3 및 4에서 상기 인간 연구에 사용되었다. 그러나, 코르티코스테로이드는, DMD에서 요구되는 바와 같이, 연장된 기간 동안 사용될 경우 일정 범위의 심각한 부작용을 갖고, 따라서, 예컨대 인간 연구에서 시험되는 바와 같이 CS 용량을 더 낮추고, 또한 CS의 사용을 피하는 것이 바람직할 것이다. 이는 인간에서 항상 가능한 것이 아니므로, 이를 마우스에서 시험하였다.
하기 동물 연구는 VLA-4의 알파 쇄, CD49d에 대한 안티센스 억제제의 효과를 단일치료법으로서 근이영양증에서 시험하는 최초의 연구이다. 이는 또한 CD49d 또는 VLA-4의 임의의 억제제의 효과를 근이영양증에서 시험하는 최초의 연구이다. 게다가, 다른 치료들이 근육 손상의 초기 상 동안 예방학적으로 실행되었으므로, 이는 근이영양증 마우스 모델에서 근육 손상의 개시 이후 임의의 항-염증성 면역 중재된 치료를 시험하는 최초의 연구이다.
인간 CD49d에 대한 안티센스 억제제, ATL1102는 마우스 CD49d RNA에 대해 동종성이 아니므로, 마우스 및 인간 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제제, ISIS 348574를 마우스 연구에서 사용하였다.
방법 - 본 연구는 맹검 연구였다. 총 48 마리의 C57BL10 MDX 수컷 마우스를 JAX로부터 구입하였고, 12 마리는 야생형(WT) C57BL10 수컷 마우스였다. 12 마리의 MDX 마우스로 이루어진 2개 그룹에게 ISIS 348574를 20mg/kg으로 주 1회 및 5mg/kg으로 주 1회 피하(s.c) 주사하였다. 12 마리의 MDX 마우스로 이루어진 하나의 그룹에게 ISIS 358342 스크램블 부정합 대조 올리고뉴클레오티드를 20mg/kg으로 주 1회 피하 주사하였다. 12 마리의 WT 대조군 마우스로 이루어진 하나의 그룹에게 생리식염수를 피하로 주사하고, MDX 마우스에서 질환 진전의 척도로서 사용하였다. 그룹은 다음과 같다:
WT-C57BL10 n = 12(플라시보, 대조군, 생리식염수 s.c)
MDX n = 12(고 용량 ISIS 348574 20mg/kg s.c)
MDX n = 12(저 용량 ISIS 348574 5mg/kg s.c)
MDX n = 12(고 용량 스크램블 부정합 대조 ISIS 358342, 20mg/kg s.c)
MDX n = 12(플라시보 대조군, 생리식염수 s.c)
본 연구를 위한 대조군은 WT, MDX 둘 다에 대한 생리식염수 대조군 뿐만 아니라, 스크램블 올리고뉴클레오티드 대조군(고 용량에서만)을 포함한다. CD49d RNA에 결합하지 않는 스크램블된 혼합 뉴클레오티드 서열은 CD49d에 대한 올리고뉴클레오티드와 동일한 뉴클레오티드 조성을 가졌다. 마우스에서의 용량이, 노출 수준에 기초하여, 임상시험에서 대략 5배 더 낮은 mg/kg 용량, 즉 임상시험에서 1mg/kg/주 및 4mg/kg/주에 상응하므로, 고 용량(20mg/kg) 및 저 용량(5mg/kg)의 ISIS 348574를 선택하였다. 4mg/kg/주의 용량은 주 3 및 2회 미만이고, 200mg 용량의 ATL1102를 MS 환자에게 8-주의 급속 연구에서 투여하였다[림로쓰(Limmroth) 등의 문헌(2014)]. 그러나 4mg/kg/주 및 1mg/kg/주 용량은, 실시예 5, 6 및 7에서 mg/kg/주 기준으로 DMD 환자에게 제공된 ATL1102의 용량에 비해 더 높은 용량을 포함하지만, 후자는 장기간의 24주 연구이다. 임상시험중의 환자에게 임상시험에서 주사되는 적합한 부피로 안티센스를 이들 농도로 제공할 수 있다.
포스포로티오에이트 주쇄 및 5-메틸시토신을 C 마다 갖는 5-10-5 MOE 갭머(gapmer), ISIS 348574(ATATTTTTCCACCTGTGCCC: 서열 번호 2)는 마우스 및 래트 인테그린 α4에 완전히 상보성이다. ISIS 348574에 대한 8개의 염기 쌍-부정합 올리고뉴클레오티드를 또한 검사하였다. 이는 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는 5-10-5 MOE 갭머, ISIS 358342(ACAGTGTACCTCCTTTTCTC: 서열 번호 3)이었다.
DMD가 소년에게만 영향을 주는 X-결합된 유전된 근육 질환이므로, 단지 수컷 마우스만을 평가하였다. 치료 그룹 당 총 n = 12의 MDX 마우스를 사용함으로써, 충분한 동물이 프로토콜에 따라 치료되었음을 보장하여 연구를 진척시켰다. MDX 마우스 및 WT 대조군을 적응시키고, 치료를 9주령에 시작하였다(2 내지 5주령 사이에 발생하는 것으로 생각되는 근육 손상의 최초 회차의 개시 이후). 생리식염수, 스크램블 올리고뉴클레오티드 또는 2가지 용량의 CD49d에 대한 안티센스(20mg/kg(고) 및 5mg/kg(저))를 주 1회 피하 주사하면서 6주 동안 치료하였다.
그립 강도, 및 피로시 보이는 제자리 근육 생리학적 특징, 등척성 수축(절대 근력 및 비근력), 및 편심성 수축 유도된 근육 손상에 대해 마우스를 시험하였다. 조직을 혈액 및 신경 지배(nerve supply)에 연결하였다. 골격근, 횡경막, 심장, 비장 및 혈액을 수집하고, 추가의 생화학적 및 분자 분석을 위해 저장하였다. 이용되는 기법에 대해 하기 출판물을 참조할 수 있다: 호가트(Hogarth) 등의 문헌[Nature Communications 8: 14143, 2017](편심성 수축), 가톤(Garton) 등의 문헌[The American Journal of Human Genetics 102, 845-857, 2018](힘 빈도 및 피로).
약물 투여 및 그립 강도 시험 - 최초로 주사하기 이전에, 마우스에게 기선 그립 강도 시험을 수행하여 앞다리 강도를 검사하였다. 완료되면, 모든 마우스에게 6주 동안 주 1회 상기 농도의 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 생리식염수 또는 스크램블 올리고뉴클레오티드를 사용하여 150 마이크로리터의 최대 부피를 주사하였다. 이어서, 6주의 치료 기간이 완료될 때까지 2주에 1회(총 4회 시험) 하기 개략화된 바와 같이 마우스에게 그립 강도 평가를 수행하였다.
그립 강도 시험의 절차는 다음과 같았다:
1. 마우스 체중을 측정한다.
2. 마우스 꼬리를 잡고 높이 들어 올리고, 이때 앞발은 막대와 동일한 높이에 있다.
3. 마우스를 막대를 향해 발이 닿을때까지 수평으로 이동시킨다. 그립이 양호한지, 즉 양쪽 발에 의해 대칭적으로 바르게 잡고 있는지의 여부와 연구자가 잡아당기는데 대하여 감지할만한 저항을 하는지를 육안으로 확인한다.
4. 마우스가 잡은 것을 놓칠때까지 마우스를 부드럽게 잡아당긴다. 만일 동물이 한쪽 발만 사용하거나 그의 뒷발을 사용하거나, 잡아당기는 동안 몸을 뒤로 돌리거나, 저항없이 막대를 놓친다면, 측정값을 버려야 한다.
5. 시험을 5회 반복하고, 최대 수행력을 수득하기 위해 각각의 시험 사이에 1 분간 휴식한다.
6. 마우스를 우리에 돌려보내고, 음식 보상으로서 바닥에 해바라기씨를 놓아 둔다.
조직 수집 및 제자리 근육 생리학적 특징 - 아로라 사이언티픽(Arora Scientific)에 의해 개발된 장비를 사용하여 골격근 기능에 대한 분석을 수행하였다. 이러한 기법을 실험실에서 사용하여 ∼5년 동안 연구를 수행하였고, 이는 골격근과 연관된 많은 질환에서 근육 수행력 및 강도의 기능적 영향을 결정하기 위한 최적의 표준 방법이다. 이러한 시스템은 온전한 혈액 공급 및 신경계를 유지시키면서 전경골근(TA, 뒷 다리 근육)에 의해 생성되는 강도를 결정할 수 있다. 반복된 근육 수축 및 회복(피로 후)을 수행함으로써 근육 피로의 영향을 평가하고, 근력 감소를 편심성 수축 후에 측정하여 근육 손상을 평가한다. 이러한 정보의 수집은 다른 방법, 예컨대 근력의 추정값만을 제공하는 생체내 그립 강도에 의해서는 가능하지 않다. 이러한 방법을 사용하여 6주 동안의 치료 이후 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하였다. 하루에 최대 10 마리의 마우스가 시험을 완료하도록 엇갈리게 분석하였고, 하기 절차를 통해 실행하였다.
근육 생리학적 특징 시험에 대한 절차는 다음과 같았다:
1. 마우스 체중을 측정한다.
2. 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시킨다. 지표로서 발가락 꼬집기를 사용하여 적절한 초기 마취를 보장한다. 발가락 꼬집기를 사용하여 절차 동안 5 분 마다 마취의 깊이를 모니터링한다.
3. 마우스를 적절히 마취시킨 후, 피부를 ∼2mm 절개함으로써 발에서 힘줄을 노출시켰다.
4. 5-0 수술용 봉합사를 사용하여, 근육-건 접합부로부터 ∼5mm 떨어진 곳에서 2개의 별도의 봉합사 리드(lead)에 의해 노출된 힘줄을 묶는다. 하나의 정착 매듭 및 힘 변환기에 고정하는 하나의 매듭.
5. 무릎에서 피부를 제거하고 슬개골을 노출시킨다.
6. 사두근 위의 피부를 자르고 좌골 신경을 노출시킨다.
7. 주변 조직에 손상을 주지 않으면서 슬개골 힘줄 뒤로 스테인레스 스틸 핀 또는 주사기 바늘을 통과시킴으로써 무릎을 고정화시킨다. 핀은 단의 기부에 고착되어야 한다. 마취된 동물은 수축 동안 움직임을 방지하도록 단단히 고정되어야 한다.
8. 단계 4로부터의 봉합사를 사용하여, 근육의 힘줄을 2중 방식 서보모터(servomotor)의 레버 암(lever arm)에 묶는다.
9. 2개의 와이어 (자극) 전극을 신경 위에 놓고(또는 아래에 걸고), 300-400 ms 지속기의 사각파 진동의 최대 초과 전압(즉, ∼10V)을 사용하여 근육을 자극시켜 수축시킨다.
10. 모든 자극 파라미터 및 수축성 반응을 제어하고 적절한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 측정한다.
11. 최대 경련 힘이 수득될 때까지 작은 증분으로 길이를 점진적으로 증가시킴으로써 최적 근육 길이(Lo)를 결정하는 것이 통상적이다.
12. Lo를 결정한 후, 빈도를 증가시키면서 근육을 자극하여 완전한 빈도-힘 관계를 구축한다. 근육은 성공 수축 사이에 30 초 동안 휴식해야 한다. 빈도-힘 관계의 안정기로부터 최대 힘을 결정한다.
13. 일단 최대 힘이 결정되면, 근육을 상이한 프로토콜에 적용하여 단축력, 근육 피로, 또는 수축 유도된 손상에 대한 감수성을 결정할 수 있다.
14. 자극 종료시, 프로토콜은 심장 채혈을 통해 혈액을 수집하고 경추 탈골 및 심장 천공을 통해 마우스를 안락사시킨다.
15. 전경골근(및 생화학적 및 RNA 분석에 필요한 다른 근육/조직)을 수집하고 근육을 칭량하여 비근력 측정값이 힘-빈도 관계로부터 계산될 수 있도록 한다.
마우스를 절차 동안 마취시키고, 절차 후 즉시 회복 없이 도태시켰다.
통계 분석 - 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 원-웨이(One-way) ANOVA, 피셔스(Fishers) LSD 시험을 사용하여 그룹 당 12 마리의 마우스로부터 수득된 그립 강도, 절대 근력 및 비근력 및 근육 중량을 평가하였다. 투-웨이(Two-way) ANOVA, 피셔스 LSD 시험을 사용하여 그룹 당 12 마리의 마우스에서 근육 피로 분석을 실행하였고, 편심성 수축을 위하여, 그룹 당 9 마리 마우스에서 원-웨이 또는 투-웨이 ANOVA, LSD 시험을 실행하였다.
결과
그립 강도 - 기선에서 및 치료 6주에 걸친 그립 강도(평균 및 SEM). 치료 전 기선에서, mdx 코호트(cohort)는 WT에 비해 유의적으로 더 약하였다(도 1a). 연구가 맹검이고 동물이 무작위로 나뉘어 졌지만, 고 용량 안티센스 올리고뉴클레오티드 코호트의 MDX 마우스는 기선에서 MDX-생리식염수(MDX-스크램블 또는 저 용량은 아님)에 비해 유의적으로 더 약하였다(도 1b).
제자리 전경골근(TA) 근육 생리학적 특징 - 근육량 및 등척성 근육 수축 데이터(최대 절대 근력 및 최대 비근력). 표 1은 근육 생리학적 특징을 제공한다. 문헌에 공지된 바와 같이, WT 마우스는 MDX 마우스에 비해 더 낮은 TA 양(mg)을 가졌다. MDX 마우스의 4개 그룹에서, 연구의 종료시 근육량에서 차이가 없었다. 50Hz 미만에서 경련시 mN에 의해 측정될 경우 최대 절대 근력과 관련하여 WT 사이에서 뿐만 아니라 어떠한 MDX 치료된 그룹에서도 차이가 없었다. WT 마우스는 가장 큰 최대 비근력(mN/mm2)을 가졌고, MDX 마우스에서 치료 부문 사이에 유의적인 차이는 없었다.
피로 - WT 및 MDX 마우스 둘 다의 유의적인 피로. WT는 회복 10 분 이내에 다시 힘을 얻었다. MDX는 10 분 후에 회복하였지만, 여전히 기선에 비해 더 적은 힘을 생성하였다. MDX-고 용량 안티센스 약물 대 다른 MDX(생리식염수, 스크램블 대조군, 고 용량 또는 저 용량 안티센스 약물) 사이에 차이는 없었다(도 2a 및 2b).
편심성 근육 수축 데이터 - 도 3은 야생형 대조군에 비교되는 편심성 근육 수축을 보여준다. WT와 비교하여, 모든 MDX 코호트는 근육 감소를 보여준다. 그러나, 높은 안티센스 올리고뉴클레오티드 용량 그룹은 단지 30% 신장으로부터 유의적인 힘 감소를 보여준 반면(p=O.OOO1), mdx-생리식염수 그룹은 20% 신장시에 유의적인 감소를 보여주었다(p=0.001). 이는 고 용량 안티센스 치료가 편심성 수축 동안 근육 손상을 지연시킴을 나타낸다.
도 4는 mdx-생리식염수와 비교되는 편심성 근육 수축을 보여준다(+/-SEM). MDX-생리식염수 그룹과 비교하여, 고 용량 안티센스 그룹은 20% 신장으로부터 유의적으로 더 높은 힘 생산 능력을 보여주었다(p=0.001). 이는 mdx-생리식염수 치료된 동물과 비교하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드 약물이 편심성 수축 후 근육 손상을 지연시키고 더 큰 근력을 생산함을 제시한다.
도 5는 MDX-스크램블 대조군과 비교되는 편심성 근육 수축을 보여준다(+ SEM). 스크램블 올리고뉴클레오티드 대조군과 비교하여, 고 용량의, CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 30% 신장으로부터 유의적으로 증가된 힘 생산을 보여준다(p=0.01). 이는 CD49d에 대한 안티센스 약물이, 치료된 동물에서 동일한 용량의 스크램블 올리고뉴클레오티드 대조군에 비하여 편심성 수축 후 특별히 근육 손상을 지연시키고 더 큰 근력을 생산함을 제시한다.
5 분간 회복한 후, MDX 마우스는 WT에 비해 유의적으로 더 적은 힘을 생산하였다. 반면 WT 마우스는 근육 손상이 없음을 나타내는 유사한 양의 힘을 생성하였다.
도 6은 초기 수축의 %로서 생산되는 편심성 근육 수축력을 보여준다(+/- SEM). MDX 생리식염수, 스크램블 및 저 용량 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생산된 초기 힘에 비해 ∼50% 더 작은 힘을 생성하였다. 고 용량 안티센스 올리고뉴클레오티드가 주사된 마우스는 생산된 초기 힘의 ∼70%를 생성하였다. 이는 WT에 비해 유의적으로 더 적지만, 생리식염수, 스크램블 및 저 용량 치료된 MDX 마우스에 비해 유의적으로 더 높다.
생화학적 혈액 표지 - 도 7은 WT 및 MDX-생리식염수, 스크램블 및 치료된(고 용량 및 저 용량) 마우스의 혈액중의 크레아틴 키나아제(CK) 수준을 보여준다. 근육 CK 수준(U/L)을 치료 6주 후 WT 및 MDX 마우스의 혈액에서 측정하였다. CK는 근육 손상을 평가하기 위한 간접적 표지로서 사용될 수 있는 순환 단백질이다. WT에 비해 순환 CK의 유의적인 증가는 모든 MDX 샘플에서 관찰되었지만, MDX 그룹에서의 치료간에는 차이가 관찰되지 않았다(도 7).
비장에서의 면역 세포: CD49d 세포 표면 표지를 발현하는 T 세포에서의 감소
마우스에 투여된 올리고뉴클레오티드 약물은 혈액으로부터 조직, 예컨대 백혈구를 함유하는 1차 및 2차 림프 기관으로 신속히 분포된다. 림프 기관인 비장을 수집하고, 백혈구의 유세포분석을 위해 세포를 단리하였다. VLA-4 수준의 안티센스 올리고뉴클레오티드 표적 세포 표면 분자 CD49d 알파 쇄를 비롯하여 다양한 세포 표면 표지를, 다양한 파장에서 빛을 발산하는 레이저에 의해 여기되는 형광 표지화된 항체를 사용하여 평가하였다. CD49d 양성 T 세포 수는 고 용량의 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, ISIS 348574(20mg/kg s.c.)에 의해 치료된 마우스의 비장에서 생리식염수-대조군과 비교하여 감소하였다(데이터는 제시되지 않음).
실시예 9
실시예 4에서의 9명의 환자 연구로부터의 결과:
실시예 4에서 12 내지 18세(평균 14.9세(SD 2.1))의 9명의 환자에게 ATL1102를 주 1회 25mg씩 피하로 24주 동안 투약하였고, 림프구, CD4 및 CD8+ T 세포 및 CD4+CD49d+ 및 CD8+CD49d+ T 세포의 수 및 백분율을 유세포분석에 의해 평가함으로써 결정되는 바와 같이, 림프구 변조 가능성(lymphocyte modulation potential), 및 상지 수행력 모듈(PUL2.0)을 사용하여 평가하였다.
기선에 대한 24주째의 평균 PUL2 사지 근육 기능 데이터
24주째, ATL1102 치료된 환자는, 페인(Pane) 등의 문헌(2018)으로부터 확립된 부합된 대조군(n=20, 39 24-주 측정)에서의 -2.00(3.018) 및 -1.333(2.043)과 비교하여, 각각 +0.89(2.89)(p=0.010)의 평균(SD) 총 PUL2.0 스코어 및 +0.11(1.27)(p=0.010)의 PUL2.0 중간-수준 팔꿈치 스코어에서 통계적으로 유의적인 향상을 나타내었다.
ATL1102 그룹은 24주째 PUL2.0 고-수준 어깨의 경우 +0.86(2.67), 원위 손목 및 손의 경우 +0.11(0.60), 및 PUL2.0 진입 스코어의 경우 +0.11(0.60)의 값으로, -0.538(1.295), -0.128(0.951) 및 -0.282(0.605)의 부합된 대조군 평균 변화와 비교하여 평균 스코어에서 향상을 나타내었지만, 차이는 각각 유의적이지 않았다(p=0.182, 0.349 및 0.084). 부합된 대조군 데이터는, 걷지 못하는 환자에서 1년 및 2년에 걸쳐 PUL2.0에서의 감소를 보여주는 페인(Pane) 등의 문헌으로부터의 데이터와 일치한다.
9명의 참가자들중 7명은 ATL1102를 투약받은지 24주 후에 PUL2.0 스코어에서 기선으로부터 향상되거나 변화가 없었다. 총 PUL2.0 스코어에서 향상을 나타내거나 변화가 없는 ATL1102 치료된 환자의 빈도는, 부합된 대조군에서 33%인것과 비교하여 78%였다.
ATL1102 치료된 환자는 부합된 대조군에 비하여 PUL2.0에서의 유의적인 평균 향상, 및 이들의 PUL2.0이 향상되거나 유지된 환자의 더 높은 빈도를 보여주었다.
24주째 기선에 대한 평균 근육 지방 비율 데이터 및 위축 데이터
본원에 전체가 인용된 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016) 표 2에 보고된 바와 같이 6 개월 데이터가 존재하는 6개의 측정값으로서, MRI를 사용하여 6개 근육의 전완 배측 그룹, 4개 근육의 바닥 그룹 및 중심 슬라이스에서의 ECRLB-Br 근육에 대해, 및, 중심, 근위 및 원위 슬라이스에서 총 근육 구간에 대해 지방 비율%을 평가하였다.
24주째, 9명의 ATL1102 치료된 환자는 지방%에서의 평균적 감소를 나타내었고, 이는 모든 6가지 이들 근육 지방 측정에 대해 기선과 비교하여 골격근 지방 함량에서의 개선을 지시한다. 이는 지방%에서의 증가와 대조적으로, 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에 의해 보고된 근육 지방 함량의 악화를 지시한다. 9명의 ATL1102 치료된 환자는, 골격근 지방 함량에서의 악화와 비교하여, 모든 근육 그룹에 대해 근위 슬라이스 -2.14%, 중심 슬라이스 -0.52% 및 원위 슬라이스 -5.14%, 및 중심 배측 -0.88, 중심 바닥 -0.57% 및 중심 ECRLB-Br -0.12%로 평균 총 지방%에서 감소하였고, 리코티(Ricotti) 등의 문헌(2016)에 의해 보고된 걷지 못하는 환자(n=7, 24-주 측정) 그룹에서는 각각 +4.5, +3.9, + 2.2, +5.5, + 0. 7, 및 +6.1로 평균 지방%가 증가하였다.
ATL1102 치료된 환자에서의 위축을 0, 1, 2, 및 3으로서 평가하였다. 위축은 기선에 비해 12주째 바닥 및 배측 근육 원위 배향에서 감소하였지만, 이러한 원위 데이터는 24주째 이용할 수 없었다. 기선과 비교하여 24주째 환자의 유사한 %가 각각의 사분면에 랭크되고, 안정성을 제시한다. 이는 근육 위축을 일으킬 수 있는 표준 용량(0.75mg/kg/일의 프레드니손 또는 0.9mg/kg/일의 데플라자코트)에서의 연장된 치료와 대조적이다.
24주째 기선에 대한 개별 PUL2 사지 근육 기능 데이터
ATL1102 및 코르티코스테로이드로 치료중인 8명의 DMD 환자로부터의 PUL2.0 데이터를 투약 24주 후 기선과 비교하여 평가하였다. PUL2.0 총 기능 스코어는 기선으로부터 1 포인트의 평균 상승을 보여주었다. 기선으로부터 1명의 환자는 +7 포인트 상승하였고, 3명의 환자는 +2 포인트 상승하였으며, 2명의 환자는 변화가 없었고, 1명의 환자는 2 포인트 감소하였으며, 1명의 환자는 3 포인트 감소하였다. 또 다른 환자(10)는 코르티코스테로이드로 치료되지 않았고, 24주 후 기선과 비교하여 PUL2 스코어에서 변화가 없었다.
결과를 도 8에 도표화하고 그래프로 표시하였다. 기선과 비교하여 투약한지 24주 후에 ATL1102 및 코르티코스테로이드로 치료중인 모든 DMD 환자를 CD4+CD49d에 대해 24주 및 28주째 평가하였다. PUL2.0 기능 스코어가 상승되거나 변화되지 않은 모든 6명의 ATL1102 및 코르티코스테로이드 치료 환자에서 CD4+CD49d+ T 세포는 24주에 비해 28주째 상승하였고, PUL2.0 기능 스코어가 감소된 ATL1102 및 코르티코스테로이드로 치료중인 2명의 환자(환자 6 및 환자 11)에서 CD4+CD49d+ T는 24주에 비해 28주째 추가로 감소하였다. 코르티코스테로이드로 치료되지 않는 환자(10)는 24주 후 기선과 비교하여 PUL2 스코어에서 변화가 없었고, 28주에 비해 24주째 CD4+CD49d+ T 세포의 변화가 없었다.
이러한 데이터는 24주 투약 후 혈액 CD4+CD49d+ T 세포의 변경이 Pul2.0 무반응성과 비교하여 향상되거나 안정된 질환 결과에서의 PUL2.0 반응성 또는 ATL1102 치료 후 질환 결과에서의 감소와 연관됨을 제안하였다. PUL2.0에서의 효험은 투약 후 CD4CD49d T-세포의 증가 또는 또는 비-변화 및 비-효과성 또는 최소 효과성 결과(CD4+CD49d+ T 세포의 감소로 지시됨)와 함께 지시되는 경향을 가졌다. CD4+CD49d+ T 세포는 ATL1102에 의한 총 PUL2.0 치료 효험에 대하여 독립적인 예측자일 수 있다.
실시예 10
PUL2.0 치료 효험의 예측자로서 또는 치료를 조정하는데 있어서의 환자 혈액 CD4+CD49d T-세포 변화의 용도
하나의 실시태양에서, 무작위화 이중 맹검 플라시보-제어 연구를 100명의 걷지 못하는 10 내지 18세의 DMD 환자(체중 25kg 이상)에서 실행한다. 참가자를 그룹 당 대략 25명의 환자로 무작위로 4개의 그룹으로 나누고, 52주 동안 3개의 그룹에게 ATL1102를 각각 25mg씩 주 1회, 50mg씩 주 1회, 또는 100mg씩 주 1회 제공하고, 마지막 그룹에게 플라시보를 제공한다. 코르티코스테로이드(CS), 프레드니솔론 또는 데플라자코트에 의한 기존의 치료에 더하여 ATL1102 또는 플라시보를 52주 동안 주 1회 투여한다.
1차 효험 결과는 플라시보에 비교되는 상이한 용량 그룹에 대하여 PUL-2.0(DMD에 대한 상지 수행력 모듈 2.0)에 의해 52주째 측정하는 상지 기능적 능력에서의 변화를 평가하는 것이다. 2차 효험 결과는 기선, 24주 및 52주에서의 PUL2.0의 변화를 포함하고, 2차 활성 결과는 (i) 치료 24주 대 25주(24주 투약후 1주임)에서, 및 만일 환자가 CS 치료중이라면 CS의 1일 용량의 투여 이전에, 및 ATL1102의 25주 투약에서, 및 (ii) 다시 52주 대 53주에서, 순환 CD4+CD49d+ T 세포 수의 변화이다.
모든 연구 참가자들에게 6 개월(26주) 동안 오픈 라벨 연장 연구를 시작하도록 제안하였다. 기선과 비교된 52주째 PUL2.0 스코어에 기반하여 반응성을 보여주는, 오픈 라벨 연구를 지속하는 환자는 ATL1102 및 CS의 치료를 유지할 수 있다. 기선과 비교하여 52주째 ATL1102 +/- CS 치료에서 무반응성인 환자(기선과 비교하여 PUL2.0 스코어가 예를 들어 -2, -3 또는 더 낮음)는 6 개월(26주)의 오픈 라벨 연구 동안 더 높거나 더 낮은 상이한 용량의 ATL1102로 치료될 수 있다.
오픈 라벨 치료 6 개월(26주) 이후, 78주째 환자의 PUL2.0을 PUL2.0 반응성에 대해 52주째의 PUL2.0과 비교할 것이다. 78주째 순환 CD4+CD49d+ T 세포의 수를 상기 개략화된 바와 같이 PUL2.0 결과 4주 후인 82주째(CS의 투약 이전)의 수와 비교할 것이다. -2, -3, 또는 그 이하의 PUL2.0 스코어를 갖는, ATL1102에 무반응성인 환자는, 추가의 추적 검사에서 PUL2.0 반응성을 추가로 모니터링하면서, ATL1102 용량을 바꾸거나, 그들의 CS 용량을 예를 들어 예시된 바와 같은 표준 용량의 2/3 또는 1/3으로 조정하는 선택지를 가질 것이다.
임상 평가를 위한 다른 2차 종점은 안전성에 대한 측정값 및 효험에 대한 측정값, 예컨대 근육 강도(미오그립 및 미오핀치에 의해 측정됨), 호흡 표지, EK, EK2, 삶의 질, 및 근육 섬유증, 지방 염증-부종 및 위축에 대한 MRI의 측정값을 포함한다. 임의의 하나 이상의 이들 측정값은 PUL2.0 평가 이후 PUL2.0 반응성 및 CD4+CD49d+ 변화에 근거하여 ATL1102 용량 또는 CS 용량을 조정하기 이전에 고려될 수 있다.
투약 계획은 기선에 대한 PUL2.0 및 PUL2.0 이후의 순환 CD4+CD49d+ 세포 변화를 평가하기 이전에 본 개시내용에 따라서 변경될 수 있고(예를 들면, 3 개월, 6 개월, 1년 또는 1년 이상 동안의 투약), 이에 따른 ATL1102 용량의 조정은 당분야의 숙련가에 의해 구상되는 바와 같이 포괄된다. 다른 변경은 PUL2.0이 평가되는 마지막 투약 후 1, 2, 3 또는 4주 또는 그 이상에서 순환 CD4+CD49d+ 세포를 평가함을 포함하고, 이들을 칩 상에서 유세포분석에 의해 측정한다.
본 개시내용의 범주로부터 벗어나지 않고 많은 변경이 당분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
많은 변경이 당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 포괄될 수 있다.
[표 1]
TA 근육 생리학적 특징
Figure pct00001
[표 2]
Figure pct00002
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Claims (18)

  1. 근육 위축, 근육 지방 조직, 또는 가성비대 또는 근이영양증과 연관된 증상을 앓거나 앓을 위험에 처한 피험체에서 근육 또는 사지 수행력을 변경시키는 방법으로서,
    상기 피험체에서 근육 지방, 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 파라미터를 변경시키기에 충분한 조건하에 일정 기간 동안, 약학적으로 허용가능한 담체 및 치료학적 효과량의 CD49d(VLA-4의 알파 4 쇄)에 대한 억제성 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 상기 피험체에게 주기적으로 투여함을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드가 하기 구조의 서열, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 입체이성체를 포함하는, 방법:
    5'-MeCMeUG AGT MeCTG TTT MeUMeCMeC A MeUMeU MeCMeU-3'
    이때,
    a) 올리고뉴클레오티드의 19개의 뉴클레오티드간 결합은 각각 O,O-연결된 포스포로티오에이트 디에스테르이고;
    b) 5' 말단으로부터 1 내지 3 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이고;
    c) 5' 말단으로부터 4 내지 12 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보뉴클레오시드이고;
    d) 5' 말단으로부터 13 내지 20 위치에 있는 뉴클레오티드는 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형된 리보뉴클레오시드이고;
    e) 모든 사이토신은 5-메틸사이토신(MeC)이다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    피험체가 근이영양증을 앓고, 방법이 피험체에서 근이영양증에 대한 하나 이상의 표지, 징후 또는 증후를 개선시키거나 근이영양증의 진행을 지연시키는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    피험체가 걷지 못하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    억제성 올리고뉴클레오티드가 1주 당 약 10mg 내지 300mg으로 투여되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    억제성 올리고뉴클레오티드가 약 25 내지 50mg/주의 낮은 용량으로 투여되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    투여가 단일치료법이거나, 표준 용량 또는 저 용량 코르티코스테로이드 치료와 병용되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    개별 피험체에서 변경된 근육 수행력 또는 기능, 또는 사지 수행력 또는 기능에 대한 하나의 표지가 CD4+CD49d+ T 세포의 수준이고, 이때 투약 기간 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준에서의 재상승 및/또는 안정(유지)은 향상되고/되거나 안정한 사지 수행력과 연관되고, 투약 기간 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준에서의 감소는 억제성 올리고뉴클레오티드 치료법에 반응하여/치료법 동안에 사지 수행력의 최적 미달(sub optimal) 수준 및/또는 사지 수행력의 감소(loss)와 연관되는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    향상된 사지 수행력이 PUL 스코어, 또는 상지 수행력에 대한 임상적으로 동등한 척도를 사용하여 DMD를 앓는 환자에서 측정되는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    CD4+CD49d+ T 세포의 수준이 투약 기간의 종료 전에, 및 투약 기간 동안 이전 투약의 1주 이내에 측정되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법이, 투약 완료 후 피험체에서 CD4+CD49d+ T 세포의 혈액 수준에서의 재상승 및/또는 안정이 존재하는지 존재하지 않는지에 대해 측정함을 추가로 포함하고, 이때
    재상승 및/또는 안정의 존재는 향상된 근육 및/또는 안정한 사지 수행력 및 투약 후 CD4+CD49d+ 세포의 혈액 수준에서의 감소와 연관되고, 안티센스 올리고뉴클레오티드 치료법에 반응하여 사지 수행력의 최적 미달 수준 및/또는 감소와 연관되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    억제성 올리고뉴클레오티드가 DMD를 앓는 피험체에서 12 내지 24주 동안 낮은 용량으로 투여될 때 CD4+CD49d+ T 세포의 수준을 감소시키고, 이전 투약을 완료한지 1주 이내에 투약 완료 후 CD4+CD49d+의 혈액 수준에서 재상승 또는 안정을 나타내는 피험체에서 PUL2.0 또는 임상적으로 허용가능한 동등한 척도에 의해 결정될 때 사지 기능을 향상시키고/시키거나 안정화시키는, 방법.
  13. (i) 피험체로부터의 혈액 샘플에서 CD4+CD49d+ T 세포의 수준을 결정하는 단계;
    (ii) 일정 투약 방침으로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하고 투약 기간의 종료까지 1회 이상 단계 (i)을 반복하는 단계;
    (iii) 투약 완료 1주 이내에 단계 (i)을 반복하는 단계; 및
    (iv) 피험체가 투약 완료 후 CD4+CD49d+ T 세포의 수준에서 재상승, 안정 또는 감소를 나타내는지 나타내지 않는지의 여부를 결정하기 위해 결과를 처리하는 단계
    를 포함하는, 개별 피험체가 CD49d에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 치료에 쉽게 반응하는지 반응하지 않는지의 여부를 향상된 PUL 스코어 또는 임상적으로 동등한 스코어에 따라서 향상된 근육 또는 사지 기능을 나타내는지에 의해 평가하는 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    피험체가 투약 완료 후 감소를 나타낼 때, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투약 방침이 조정되고, 제12항에 따른 방법을 반복하거나, 피험체가 투약 완료 후 재상승을 나타낼 때, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투약 방침이 반복될 수 있는, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    투약 방침이 억제성 올리고뉴클레오티드 투여 용량을 증가시킴으로써 조정되는, 방법.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    억제성 올리고뉴클레오티드가 1주 당 약 75mg 내지 300mg으로 투여되는, 방법.
  17. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    억제성 올리고뉴클레오티드가 약 25 내지 50mg/주의 낮은 용량으로 투여되는, 방법.
  18. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    투여가 단일치료법이거나, 표준 용량 또는 저 용량 코르티코스테로이드 치료와 병용되는, 방법.
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