JP2009516710A - eIF4E−BP2の発現のモジュレート - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はeIF4E−BP2の発現をモジュレートするための組成物及び方法を提供する。特に本発明は、好ましい実施形態においてeIF4E−BP2をコードする核酸分子にハイブリダイズするアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド化合物に関する。そのような化合物はeIF4E−BP2の発現をモジュレートすることが本明細書において示される。
真核生物の遺伝子発現は、細胞が広範な種類の異なる状態に迅速に応答できるように調節されなければならない。mRNA翻訳のプロセスは遺伝子発現が高度に調節される1つの工程である。ホルモン、成長因子、サイトカイン及び泳法に応答して、動物の細胞は、増殖応答のための準備において一般的に翻訳を活性化させる。蛋白合成の速度は典型的には酸化性又は浸透圧性のストレス、DNA損傷又は栄養撤退のようなストレス過剰状態では減少する。mRNA翻訳の活性化又は抑制は数分以内に生じ、そしてこのプロセスの制御は蛋白合成の開始相において発揮されると考えられている(非特許文献1)。
本発明はeIF4E−BP2をコードする核酸をターゲティングし、そして、eIF4E−BP2の発現をモジュレートするアンチセンス化合物、特に核酸及び核酸様オリゴマーに関する。本発明の化合物を含む医薬品及び他の組成物も提供される。更に提供されるものは、eIF4E−BP2のモジュレーションのためのスクリーニングの方法、及び、本発明の化合物又は組成物の1つ以上に細胞、組織又は動物を接触させることを含む、そのような細胞、組織又は動物におけるeIF4E−BP2の発現をモジュレートする方法である。eIF4E−BP2の発現に関連する疾患又は状態を有するか、それに罹患しやすいことが疑われる動物、特にヒトを治療する方法を本明細書に記載する。そのような方法は治療を必要とする人間に本発明の化合物又は組成物1つ以上の治療上又は予防上有効な量を投与することを含む。
本明細書において提供されるものはeIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物であって、ここで該化合物はeIF4E−BP2をコードする該核酸分子に相補であり、そしてeIF4E−BP2mRNAの発現を抑制する。1つの実施形態において、アンチセンス化合物は12〜50核酸塩基長、又は、15〜30核酸塩基長である。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物は、オリゴヌクレオチド、DNAオリゴヌクレオチド又はRNAオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態においては、アンチセンス化合物は2本鎖オリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、アンチセンス化合物はキメラオリゴヌクレオチドである。好ましい実施形態においては、該化合物の少なくとも一部分はRNAとハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド−RNAデュプレックスを形成する。
一部の実施形態においてはアンチセンス化合物は配列番号
「アンチセンス機序」とはハイブリダイゼーションの結果が所望の作用の達成となるような標的核酸とのアンチセンス化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物のハイブリダイゼーションを包含する。所望の作用は例えば標的の分解、標的の占有と同時に起こる細胞機序、例えば転写又はスプライシング又は他の表現型作用の一端停止を包含できる。
本発明によれば、アンチセンス化合物はアンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列(EGS)オリゴヌクレオチド、オルタナティブスプライシング体、プライマー、プローブ及び標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物を包含する。即ち、これ等の化合物は1本鎖、2本鎖、環状又はヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入してよく、そして、内部又は末端のバルジ又はループのような構造エレメントを含有してよい。系内に導入された後、本発明の化合物は1つ以上の酵素又は構造蛋白の作用を発揮して標的核酸を修飾する。
特定の核酸分子にアンチセンス化合物をターゲティングすることは、本発明に関する場合、多工程のプロセスであることができる。プロセスは通常は機能をモジュレートすべき標的核酸の識別から開始する。標的核酸は、例えば、発現が特定の障害又は疾患の状態に関連している細胞性の遺伝子(又は遺伝子から転写されたmRNA)、又は、感染性物質に由来する核酸分子であることができる。本発明においては標的核酸はeIF4E−BP2をコードする。
別の実施形態において、本明細書において識別される「好ましい標的セグメント」はeIF4E−BP2の発現をモジュレートする追加的化合物を得るためのスクリーニングにおいて使用してよい。「モジュレーター」とはeIF4E−BP2をコードする核酸分子の発現を低減又は増大させ、そして好ましい標的セグメントに相補である少なくとも8核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング方法は候補モジュレーター1つ以上にeIF4E−BP2をコードする核酸分子の好ましい標的セグメントを接触させ、そしてeIF4E−BP2をコードする核酸分子の発現を低減又は増大させる候補モジュレーター1つ以上を選択する皇帝を含む。候補モジュレーターがeIF4E−BP2をコードする核酸分子の発現をモジュレート(例えば低減又は増大の何れか)することができることが判明した後、モジュレーターはeIF4E−BP2の機能を更に調査する試験において、又は、研究、診断又は治療薬としての使用のために、本発明に従って用いてよい。
本発明のアンチセンス化合物は診断薬、治療薬、予防薬用に、そして研究用試薬及びキットとして利用できる。更に又、高度な特異性で遺伝子発現を抑制することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するため、又は、生物学的経路における種々のメンバーの機能の間の区別のために、当業者により頻繁に使用される。
当該分野で知られる通り、ヌクレオシドは塩基−糖の複合物である。ヌクレオシドの塩基部分は通常は場合により「核酸塩基」又は単に「塩基」と称される複素環塩基である。そのような複素環塩基の2つの最も一般的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドはヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスフェート基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を包含するヌクレオシドについては、ホスフェート基は糖の2’、3’又は5’ヒドロキシル部分のいずれかに連結できる。オリゴヌクレオチドを形成する場合、ホスフェート基は隣接するヌクレオシドと相互に共有結合することにより線状の重合体化合物を形成する。次に、この線状重合体化合物のそれぞれの末端が更に接続して環状の化合物を形成することができるが、線状化合物が一般的には好ましい。更に又、線状化合物は内部核酸塩基相補性を有する場合があり、従って、完全又は部分的に2本鎖化合物を形成するような態様において折り畳まれる。オリゴヌクレオチド内において、ホスフェート基は一般的にはオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するものとされる。RNA及びDNAの通常の連結部又は骨格は3’から5’へのホスホジエステル連結である。
修飾されたヌクレオシド間連結部(骨格)
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物の特定の例は修飾された骨格又は非天然のヌクレオシド間連結部を含有するオリゴヌクレオチドを包含する。本明細書において定義する通り、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは骨格にリン原子を保持しているもの、及び骨格にリン原子を有さないものを包含する。本明細書の目的のため、そして場合により当該分野で参照される通り、自身のヌクレオシド間骨格にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオチドと見なすことができる。
修飾された糖及びヌクレオシド間連結部のミメティック
他の好ましいアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチドミメティックにおいて、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間連結部(即ち骨格)の両方は新規な基により置き換えられている。核酸塩基単位は適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持されている。1つのそのような化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することがわかっているオリゴヌクレオチドミメティックはペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物においては、オリゴヌクレオチドの糖−骨格はアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格により置き換えられている。核酸塩基は保持され、そして骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接又は間接的に結合している。PNAの調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第5,539,082;5,714,331;及び5,719,262号を包含し、これ等の各々は参照により本明細書に組み込まれる。PNAの別の教示はNielsen等、Science,1991,254,1497−1500に記載されている。
修飾された糖
修飾されたアンチセンス化合物はまた1つ以上の置換された糖部分を含有してよい。好ましいものは、2’位に以下のもの、即ち:OH;F;O−、S−又はN−アルキル;O−、S−又はN−アルケニル;O−、S−又はN−アルキニル;又はO−アルキル−O−アルキル、ただしここでアルキル、アルケニル及びアルキニルは置換された、又は未置換のC1〜C10アルキル又はC2〜C10アルケニル及びアルキニルであるもの、の1つを含むアンチセンス化合物、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特に好ましいものはO[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、及びO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2、ただし式中n及びmは1〜約10であるものである。他の好ましいオリゴヌクレオチドは2’位に以下のもの、即ち:C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、O−アルカリル又はO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を向上させる基、又は、オリゴヌクレオチドの薬力学特性を向上させる基、及び同様の特性を有する他の置換基の1つを含む。好ましい修飾は2’−メトキシエトキシ(2’−O−CH2CH2OCH3、2’−O−(2−メトキシエチル)又は2’−MOEとしても知られている)(Martin等、Helv.Chim.Acta,1995,78,486−504)、即ちアルコキシアルコキシ基を包含する。更に好ましい修飾は2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち後述する実施例に記載するようなO(CH2)2ON(CH3)2基、2’−DMAOEとしても知られているもの、および、やはり後述する実施例に記載する2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(2’−O−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は2’−DMAEOEとしても知られている)、即ち2’−O−CH2−O−CH2−N(CH3)2を包含する。
天然及び修飾された核酸塩基
アンチセンス化合物はまた核酸塩基(頻繁には当該分野において複素環塩基又は単に「塩基」と称される)の修飾又は置換を包含してよい。本明細書においては、「未修飾」又は「天然」の核酸塩基はプリン塩基アデニン(A)及びグアニン(G)及びピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)及びウラシル(U)を包含する。修飾された核酸塩基は他の合成及び天然の核酸塩基、例えば5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチル シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2−プロピル及び他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン及び2−チオシトシン、5−ハロウラシル及びシトシン、5−プロピニル(C≡C−CH3)ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、6−アゾ ウラシル、シトシン及びチミン、5−ウラシル(シュードウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル及び他の8置換アデニン及びグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル及び他の5置換ウラシル及びシトシン、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン、2−F−アデニン,2−アミノ−アデニン、8−アザグアニン及び8−アザアデニン、7−デアザグアニン及び7−デアザアデニン及び3−デアザグアニン及び3−デアザアデニンを包含する。その他の修飾された核酸塩基は3巻のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン(1H−ピリミド[5,4−b][1,4]ベンゾキサジン−2(3H)−オン)、フェノチアジンシチジン(1H−ピリミド[5,4−b][1,4]ベンゾチアジン−2(3H)−オン)、G−クランプ、例えば置換されたフェノキサジンシチジン(例えば9−(2−アミノエトキシ)−H−ピリミド[5,4−b][1,4]ベンゾキサジン−2(3H)−オン)、カルバゾールシチジン(2H−ピリミド[4,5−b]インドール−2−オン)、ピリドインドールシチジン(H−ピリド[3’,2’:4,5]ピロロ[2,3−d]ピリミジン−2−オン)を包含する。修飾された核酸塩基は又プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば7−デアザアデニン、7−デアザグアノシン、2−アミノピリジン及び2−ピリジンで置き換えられているものを包含してよい。別の核酸塩基は米国特許第3,687,808号に開示されているもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering、p858−859、Kroschwitz、J. I.編、John Wiley & Sons,1990に開示されているもの、Englisch et al.,Angewandte Chemie、International Edition、1991、30、613に開示されているもの、及びSanghvi、Y.S.,Chapter 15,Antisense Research and Applications、p289−302、Crooke、S.T.and Lebleu,B.編、CRC Press,1993に開示されているものを包含する。これ等の核酸塩基の特定のものは本発明の化合物の結合親和性を増大させる場合に特に有用である。これ等には5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン及びN−2、N−6及びO−6置換プリン、例えば2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル及び5−プロピニルシトシンが包含される。5−メチルシトシン置換が核酸デュプレックスの安定性を0.6〜1.2℃上昇させることがわかっており、そして、現時点では、特に2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に更に好ましい塩基置換となる。
コンジュゲート
本発明のアンチセンス化合物の別の修飾では、アンチセンス化合物にオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取り込みを増強する部分又はコンジュゲート1つ以上を化学的に連結する。これ等の部分又はコンジュゲートは第1又は第2ヒドロキシル基のような官能基に共有結合したコンジュゲート基を包含できる。本発明のコンジュゲート基はインターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、及び、オリゴマーの薬物動態特性を増強する基を包含する。典型的なコンジュゲート基はコレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び染料を包含する。薬力学的特性を増強する基は、本発明に関する場合、取り込みを向上させ、分解への抵抗性を増強し、及び/又は、標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を包含する。薬物動態特性を増強する基は、本発明に関する場合、本発明の化合物の取り込み、分泌、代謝又は排出を向上させる基を包含する。代表的なコンジュゲート基は参照により全体が本明細書に組み込まれる1992年10月23日出願の国際特許出願PCT/US92/09196及び米国特許第6,287,860号に開示されている。コンジュゲート部分は限定しないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−S−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基、リン脂質、例えばジヘキサデシル−rac−グリセロール又はトリエチルアンモニウム1,2−ジ−O−ヘキサデシル−rac−グリセロール−3−H−ホスホネート、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖、又は、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、又は、オクタデシルアミン又はヘキシルアミノカルボニルオキシコレステロール部分を包含する。本発明のアンチセンス化合物はまた、活性な薬品物質、例えばアスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、(S)−(+)−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、2,3,5−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤又は抗生物質にコンジュゲートしてもよい。オリゴヌクレオチド−薬品コンジュゲート及びそれらの製造は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第09/334,130号(1999年6月15日出願)に記載されている。
キメラ化合物
所定の化合物における全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際は、上記した修飾の1つより多くが単一の化合物中に、又、オリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドにおいてさえも、取り込まれてよい。
本発明の化合物は取り込み、分布及び/又は吸収を支援するために、例えばリポソーム、受容体−ターゲティング分子、経口、直腸、局所又は他の製剤として、他の分子、分子構造又は化合物の混合物と添加混合、カプセル化、コンジュゲート又は別様に会合させてよい。このような取り込み、分布及び/又は吸収を支援する製剤の調製を教示している代表的な米国特許は限定しないが、米国特許第
治療用組成物の製剤及びその後のそれらの投与(投薬)は当業者の知る通りである。投薬は治療すべき疾患状態の重症度及び応答性に応じたものであり、治療の過程は数日間から数ヶ月、又は治癒するか疾患状態の縮小が達成されるまで継続する。最適な投薬日程は患者の身体における薬品の蓄積の計測から計算できる。当業者であれば最適な用量、投薬方法及び反復速度は容易に決定できる。最適な用量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的力価により変動してよく、そして一般的にはインビトロ及びインビボの動物モデルにおいて有効であることがわかっているEC50に基づいて推定できる。一般的に、用量は体重kg当たり0.01ug〜100gであり、1回以上を毎日、毎週、毎月又は毎年、又は更には、2〜20年毎に1回を投与してよい。当業者であれば体液又は組織中の薬品の測定された滞留時間及び濃度に基づいて投薬の反復速度を容易に推定できる。治療が良好に行われた後、患者には維持療法を行うことにより疾患状態の再発を防止することが望ましい場合があり、そのような場合には、オリゴヌクレオチドは体重kg当たり0.01ug〜100gの範囲の維持用量において、1日1回以上〜20年毎に1回を投与する。
NASH
「非アルコール性脂肪肝症」(NAFLD)という用語は肝細胞における単純なトリグリセリドの蓄積(肝脂肪症)から炎症を伴う肝脂肪症の範囲の疾患スペクトルを包含する。肝脂肪症は肝臓の脂質含有量を特に測定することにより試験される。そのような試験は脂質の沈着を可視化するために一般的に使用されているオイルレッドO染色で染色され、そして核及び細胞質をそれぞれ可視化するためのヘマトキシリン及びエオシンで逆染色された凍結肝組織切片の組織学的分析を介して行ってよい。非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)は肝臓におけるトリグリセリドの沈着を超えてNAFLDが進行することにより生じる。壊死、炎症及び線維症を誘導することができるセカンドヒットがNASHの発症のためには必要である。セカンドヒットの候補は広範な範疇、即ち酸化性ストレスの増大を誘発する要因及びプロ炎症性サイトカインの発現を増進する要因に群分けすることができる。増大した肝トリグリセリドは動物及びヒトの肝細胞中の増大した酸化性ストレスをもたらし、肝トリグリセリド蓄積、酸化性ストレス及び肝脂肪症からNASHへの進行の間の潜在的な原因−作用の関係を示していることが示唆されている(Browning and Horton,J.Clin.Invest.,2004,114,147−152)。高グリセリド血症及び高脂肪酸血症は末梢組織におけるトリグリセリド蓄積を誘発する場合がある(Shimamura等、Biochem.Biophys.Res.Commun.,2004,322,1080−1085)。
メタボリックシンドローム
「メタボリックシンドローム」は代謝起源の脂質及び非脂質の心臓血管の危険因子の集団として定義される。これはインスリン抵抗性として知られている全般性の代謝障害に緊密に関連付けられている。National Cholesterol Education Program(NCEP)Adult Treatment Panel III(ATPIII)は5つの危険性決定因の3つ以上が存在する場合にメタボリックシンドロームの診断のための基準を確定した。5つの危険性決定因は、男性102cm超又は女性88cm超の胴囲として定義される腹部肥満、150mg/dL異常のトリグリセリドレベル、男性40mg/dL未満及び女性50mg/dL未満のHDLコレステロールレベル、130/85mmHg以上の血圧及び110mg/dL以上の絶食時グルコースレベルである。これ等の決定因は臨床慣行において容易に計測できる(JAMA,2001,285:2486−2497)。
eIF4E−BP2をターゲティングするデュプレックスアンチセンス化合物の設計及びスクリーニング
本発明によれば、本発明の化合物を含むdsRNA及びそのミメティックを包含する一連のデュプレックス及びその相補物をeIF4E−BP2をターゲティングするように設計することができる。デュプレックスのアンチセンス鎖の核酸塩基配列は本明細書に記載したeIF4E−BP2にターゲティングされたアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を含む。鎖の末端は1つ以上の天然又は修飾された核酸塩基の付加により修飾し、オーバーハングを形成してよい。次にdsRNAのセンス鎖をアンチセンス鎖の相補物として設計して合成し、そして同様に何れかの末端に修飾又は付加を含有してよい。デュプレックスのアンチセンス及びセンス鎖は、約17−25ヌクレオチド、又は約19−23ヌクレオチドを含む。デュプレックスのアンチセンス及びセンス鎖は20、21又は22ヌクレオチドを含む。
オリゴヌクレオチド単離
コントロールされた多孔性ガラス固体支持体から分離し、12〜16時間55℃で濃水酸化アンモニウム中で脱ブロッキングした後、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオシドを>3容量のエタノールを用いて1MのNH4OAc析出により回収する。合成されたオリゴヌクレオチドは電子スプレースペクトル分析器(分子量測定)により、そしてキャピラリーゲル電気泳動により分析し、少なくとも70%完全長の物質であると判断した。合成で得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル連結の相対量を−16amu産物(+/−32+/−48)と相対比較した場合の正しい分子量の比により求めた。一部の試験では、オリゴヌクレオチドはChiang等、J.Biol.Chem.1991,226,18162−18171に記載の通りHPLCで精製した。HPLC精製物質を用いて得られた結果は非HPLC精製物質で得られたものと同様であった。
オリゴヌクレオチド合成−96穴プレートフォーマット
オリゴヌクレオチドは96穴フォーマットにおいて同時に96配列を組み立てることができる自動合成器上で固相P(III)ホスホロアミダイト化学により合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間連結は水性ヨウ素による酸化により行った。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結は無水アセトニトリル中3,H−1,2−ベンゾジチオール−3−オン1,1時オキシド(Beaucage Reagent)を用いたイオウ化により形成した。標準塩基保護ベータシアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトは市販品を購入した(例えばPE−Applied Biosystems,Foster City,CA又はPharmacia,Piscataway,NJ)。非鎖ヌクレオシドは標準的又は特許付与された方法により合成する。それらは塩基保護ベータシアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイトとして使用する。
オリゴヌクレオチド分析−96穴プレートフォーマット
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度は試料の希釈及びUV吸収スペクトル分析により評価した。個々の精子得物の完全長の一貫性は96プレートフォーマット(Beckman P/ACETMMDQ)において、又は、個々に調製した試料については市販のCE装置(例えばBeckman P/ACETM5000、ABI270)上のいずれかでキャピラリー電気泳動(CE)により評定した。塩基及び骨格の組成は電子スプレー質量スペクトル分析器を用いて化合物の質量の分析により確認した。全試験の試験プレートはシングル及びマルチチャンネルのロボットピペッターを用いてマスタープレートから希釈した。プレート上の化合物の少なくとも85%が少なくとも85%完全長である場合にプレートを許容可能と判断した。
細胞培養及びオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の作用は、測定可能なレベルにおいて標的核酸が存在する限り種々の細胞型の何れにおいても試験できる。これは例えばPCR又はノーザンブロット分析を用いて日常的に測定できる。以下の細胞型を説明目的のために提示するが、他の細胞型も選択された細胞型で標的が発現される限り日常的に使用できる。これは当該分野で日常的な方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護試験又はRT−PCRにより容易に測定できる。
T−24細胞:
ヒト一過性細胞膀胱癌細胞系統T−24はAmerican Type Culture Collection (ATCC)(Manassas,VA)から入手した。T−24細胞は10%ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、ペニシリン100単位/mL及びストレプトマイシン100マイクログラム/mL(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)を添加した完全McCoy5A基礎培地(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして90%コンフルエントに達した時点で希釈した。RT−PCR分析において使用するために7000個/ウェルの細胞密度において96穴プレート(Falcon−Primaria #353872)に細胞を播種した。
ヒト肺癌細胞系統A549はAmerican Type Culture Collection (ATCC)(Manassas,VA)から入手した。A549細胞は10%ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、ペニシリン100単位/mL及びストレプトマイシン100マイクログラム/mL(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)を添加したDMEM基礎培地(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして90%コンフルエントに達した時点で希釈した。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞(NHDF)はClonetics Corporation(Wakjersville,MD)より入手した。NHDFは供給元の推奨する通り添加物を加えた腺維芽細胞生育培地(Clonetics Corporation,Wakjersville,MD)中で日常的に維持した。細胞は供給元の推奨する通り10継代まで維持した。
ヒト胚性ケラチノサイト(HEK)はClonetics Corporation(Wakjersville,MD)より入手した。HEKは供給元の推奨する通り添加物を加えたケラチノサイト生育培地(Clonetics Corporation,Wakjersville,MD)中で日常的に維持した。細胞は供給元の推奨する通り10継代まで日常的に維持した。
マウス脳内皮細胞系統b.ENDはMax Plank Institute (Bad Nauheim,Germany)のDr.Werner Risauより入手した。b.END細胞は10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies,Gaithersburg,MD)を添加した高グルコースDMEM(Gibco/Life Technologies,Gaithersburg,MD)中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして90%コンフルエントに達した時点で希釈した。RT−PCR分析において使用するために3000個/ウェルの細胞密度において96穴プレート(Falcon−Primaria #3872)に細胞を播種した。
ラット大動脈平滑筋細胞系統A10はAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)から入手した。A10細胞は10%ウシ胎児血清(Gibco/Life Technologies,Gaithersburg,MD)を添加した高グルコースDMEM(American Type Culture Collection,Manassas,VA)中で日常的に培養した。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして80%コンフルエントに達した時点で希釈した。RT−PCR分析において使用するために2500個/ウェルの細胞密度において96穴プレート(Falcon−Primaria #3872)に細胞を播種した。
マウス乳房上皮癌細胞系統EMT−6はAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)から入手した。これ等は37℃において90%空気−10%CO2の湿潤雰囲気下に10%ウシ胎児血清(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)、100ug/mlペニシリン及び100ug/mlストレプトマイシン(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)を添加した高グルコースDMEM(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)中で連続単層培養において生育させた。細胞はトリプシン処理により日常的に継代し、そして85〜90%コンフルエントに達した時点で希釈した。細胞はアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションにおいて使用するために1000個/ウェルの細胞密度において96穴プレート(Falcon−Primaria #353872)に播種した。
細胞が65〜75%コンフルエントに達した時点で、それらをオリゴヌクレオチドで処理した。96穴プレート中に生育している細胞については、ウェルを1回100μLのOPTI−MEM(登録商標)1減血清培地(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad,CA)で洗浄し、次に3.75μg/mLのLIPOFECTAINTM(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad,CA)及び所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含有する130μLのOPTI−MEMTM−1で処理した。細胞は3連で処理してデータを得た。37℃で4〜7時間処理後、培地を新鮮培地に交換した。細胞はオリゴヌクレオチド処理後16〜24時間に採取した。
eIF4E−BP2発現のオリゴヌクレオチド抑制の分析
eIF4E−BP2発現のアンチセンスモジュレーションは当該分野で知られた種々の態様において試験できる。例えば、eIF4E−BP2mRNAレベルは、例えばノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はリアルタイムPCR(RT−PCR)により定量できる。リアルタイム定量的PCRが現時点で好ましい。RNA分析は全細胞RNA又はポリ(A)+mRNAに対して実施できる。本発明のRNA分析の好ましい方法は本明細書の別の実施例において記載する通り全細胞RNAの使用である。RNA単離方法は当該分野で良く知られている。ノーザンブロット分析も当該分野で日常的に行われている。リアルタイム定量的(PCR)はPE−Applied Biosystems,Foster City,CAより入手可能であり、製造元の説明書に従って使用される市販のABIPRISMTM7600、7700又は7900配列検出システムを用いて好都合に達成できる。
eIF4E−BP2抑制剤の使用のための表現型試験の設計
表現型試験
eIF4E−BP2抑制剤を本明細書に開示する方法で識別した後、特定の疾患の状況又は状態の治療において薬効を予測させる測定可能なエンドポイントを各々が有する表現型試験1つ以上において更に化合物を検討する。
RNA単離
ポリ(A)+mRNA単離
ポリ(A)+mRNAはMiura等(Clin.Chem.,1996,42,1758−1764)に従って単離した。ポリ(A)+mRNA単離のための他の方法も当該分野で日常的に行われている。慨すれば、96穴プレート上で生育している細胞については、生育培地を細胞から分離し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。60μLの溶解緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.6、1mM EDTA、0.5M NaCl、0.5%NP−40、20mMバナジルリボヌクレオシド複合体)を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、次に5分間室温でインキュベートした。溶解物55μLをOligod(T)コーティング96穴プレート(AGCT Inc.,Irvine,CA)に移した。プレートを室温で60分間インキュベートし、洗浄緩衝液(10mMTris−HCl pH7.6、1mM EDTA、0.3M NaCl)200μLで3回洗浄した。最終洗浄の後、プレートをペーパータオル上で吸水させて過剰な洗浄緩衝液を除去し、次に5分間風乾した。予め70℃に加熱しておいた溶離緩衝液(5mMTris−HCl pH7.6)60μLを各ウェルに添加し、プレートを5分間90℃のホットプレート上でインキュベートし、次に溶出駅を新しい96穴プレートに移した。
全RNAをRNEASY96TMキット及びQuiagen Inc.(Valencia,CA)から購入した緩衝液を用いながら、製造元の推奨する操作法に従って単離した。慨すれば、96穴プレート上で生育している細胞については、生育培地を細胞から分離し、各ウェルを200μLの冷PBSで洗浄した。150μLの緩衝液RLTを各ウェルに添加し、プレートを20秒間激しく攪拌した。次に150μLの70%エタノールを各ウェルに添加し、内容物をピペットで3回吸入吐出を繰り返すことにより混合した。次に試料を廃棄物収集トレーを装着し、真空源に連結したQIAVCTMマニホールドに連結したRNEASY96TMウェルプレートに移した。真空を1分間適用した。500μLの緩衝液RW1をRNEASY96TMプレートの各ウェルに添加し、15分間インキュベートし、そして再度1分間真空を適用した。更に500μLの緩衝液RW1をRNEASY96TMプレートの各ウェルに添加し、2分間真空を適用した。次に1mlの緩衝液RPEをRNEASY96TMプレートの各ウェルに添加し、90秒間真空を適用した。次に緩衝液RPE洗浄を反復し、更に3分間真空を適用した。次にプレートをQIAVCTMマニホールドから取り外し、そしてペーパータオル上で吸水乾燥させた。次にプレートを1.2mlの収集管の入った収集管ラックを装着したQIAVCTMマニホールドに再度連結した。次に各ウェル内にRNAse非含有水140μLをピペッティングすることによりRNAを溶出させ、1分間インキュベートし、次に3分間真空を適用した。
eIF4E−BP2mRNAレベルのリアルタイム定量的PCR分析
eIF4E−BP2mRNAレベルの定量はABIPRISMTM7600、7700又は7900配列検出システム(PE−Applied Biosystems,Foster City,CA)を用いながら製造元の説明書に従ってリアルタイム定量的PCRにより行った。これは閉鎖管の非ゲル系の蛍光検出システムであり、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物の高スループットの定量を可能にする。増幅産物をPCR終了後に定量する標準的なPCRとは異なり、リアルタイム定量的PCRの産物はそれらが蓄積するに従って定量される。これはフォワード及びリバースPCRプライマーの間で特異的にアニーリングし、そして2つの蛍光染料を含有するオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応に包含させることにより達成される。レポーター染料(例えばFAM又はJOE、入手元はPE−Applied Biosystems,Foster City,CA、Operon Technologies Inc.,Alameda,CA又はIntegrated DNA Technologies Inc.,Coralville,IAの何れか)をプローブの5’末端に連結し、そしてクエンチャー染料(例えばTAMRA、入手元はPE−Applied Biosystems,Foster City,CA、Operon Technologies Inc.,Alameda,CA又はIntegrated DNA Technologies Inc.,Coralville,IAの何れか)をプローブの3’末端に連結する。プローブと染料が未損傷の場合は、レポーター染料の発光は3’クエンチャー染料の接近によりクエンチングされる。増幅の間、標的配列へのプローブのアニーリングによりTaqポリメラーゼの5’−エキソヌクレアーゼ活性により切断されることができる基質が形成される。PCR増幅サイクルの伸長期の間、Taqポリメラーゼによるプローブの切断により残余のプローブから(従ってクエンチャー部分から)のレポーター染料の放出が起こり、そして配列特異的な蛍光シグナルが発生する。各サイクルに付き、追加的なレポーター染料分子がそれらの対応するプローブから切断され、そして蛍光強度はABIPRISMTM配列検出システムに搭載されたレーザー光学により一定間隔でモニタリングされる。各試験において、未投与対照試料由来のmRNAの連続希釈物を含有する一連の平行反応が標準曲線を与え、これを用いて被験試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のパーセント抑制を定量する。
eIF4E−BP2mRNAレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理後18時間に、細胞の単層を2回冷PBSで洗浄し、1mLのRNAZOLTM(TEL−TEST”B”Inc.,Friendswood,TX)中で溶解した。全RNAは製造元の推奨するプロトコルに従って調製した。20マイクログラムの全RNAをMOPS緩衝液系(AMRESCO,Inc.Solon,OH)を用いて1.1%ホルムアルデヒドを含有する1.2%アガロースゲルを通した電気泳動により分画した。ノーザン/サザン転移緩衝液系(TEL−TEST”B”Inc.,Friendswood,TX)を用いた一夜キャピラリー転移によりHYBONDTM−N+ナイロン膜(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)にゲルからRNAを転移させた。RNA転移はUV可視化により確認した。膜はSTRATALINKERTMUV交差結合剤2400(Stratagene,Inc.La Jolla,CA)を用いてUV交差結合により固定し、そして次にQUICKHYBTMハイブリダイゼーション溶液(Stratagene,Inc.La Jolla,CA)を用いながらストリンジェントな条件に関する製造元の推奨事項を用いてプローブした。
2’−MOEウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトeIF4E−BP2発現のアンチセンス抑制
本発明により、一連のアンチセンス化合物を、公開された配列情報(配列番号4として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号NM_004096.3、配列番号25として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号NT_008583.16の配列のヌクレオチド20714677〜20740000、配列番号26として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号AK057643.1、配列番号27として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号AK001936.1、及び配列番号28として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号BF686401.1、)を用いてヒトeIF4E−BP2RNAの異なる領域をターゲティングするために設計した。化合物を表1に示す。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的配列上の第1(最も5’側)のヌクレオチド番号を示す。表1に示す全化合物は5ヌクレオチドの「ウイング」により両側(5’及び3’方向)においてフランキングされた2’−デオキシヌクレオチド10個よりなる中央の「ギャップ」領域を有する20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドを有する。ヌクレオシド間(骨格)連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムPCRによりヒトeIF4E−BP2mRNAに対するそれらの作用について分析した。データは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド75nMでA549細胞を処理した2つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「N.D.」とある場合は「データ無し」を示す。
実施例12
2’−MOEウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスeIF4E−BP2発現のアンチセンス抑制
本発明により、第2の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列情報(配列番号11として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号NM_010124.1、配列番号107として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号BI696127.1及び配列番号108として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号BE332409.1)を用いてマウスeIF4E−BP2RNAの異なる領域をターゲティングするために設計した。化合物を表2に示す。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的核酸上の第1(最も5’側)のヌクレオチド番号を示す。表2に示す全化合物は5ヌクレオチドの「ウイング」により両側(5’及び3’方向)においてフランキングされた2’−デオキシヌクレオチド10個よりなる中央の「ギャップ」領域を有する20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドを有する。ヌクレオシド間(骨格)連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムPCRによりマウスeIF4E−BP2mRNAに対するそれらの作用について分析した。表2に示すデータは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド150nMでb.END細胞を処理した2つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「N.D.」とある場合は「データ無し」を示す。
2’−MOEウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるラットeIF4E−BP2発現のアンチセンス抑制
本発明により、第3の一連のアンチセンス化合物を、公開された配列情報(配列番号18として本明細書に取り込まれるGenBankアクセッション番号XM_215414.1)を用いてラットeIF4E−BP2RNAの異なる領域をターゲティングするために設計した。化合物を表4に示す。「標的部位」は化合物が結合する特定の標的核酸上の第1(最も5’側)のヌクレオチド番号を示す。表4に示す全化合物は5ヌクレオチドの「ウイング」により両側(5’及び3’方向)においてフランキングされた2’−デオキシヌクレオチド10個よりなる中央の「ギャップ」領域を有する20ヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド(「ギャップマー」)である。ウイングは2’−メトキシエチル(2’−MOE)ヌクレオチドを有する。ヌクレオシド間(骨格)連結はオリゴヌクレオチド全体に渡ってホスホロチオエート(P=S)である。全シチジン残基は5−メチルシチジンである。化合物は本明細書の別の実施例に記載する通り定量的リアルタイムPCRによりラットeIF4E−BP2mRNAに対するそれらの作用について分析した。表4に示すデータは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド50nMでA10細胞を処理した2つの実験の平均である。各データ点に関する陽性対照は表中では配列番号により識別される。「N.D.」とある場合は「データ無し」を示す。
eIF4E−BP2蛋白レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析(イムノブロット分析)は標準的な方法を用いて実施される。細胞をオリゴヌクレオチド処理後16〜20時間に採取し、PBSで1回洗浄し、Laemmli緩衝液(100uL/ウェル)に懸濁し、5分間煮沸し、そして16%SDS−PAGEゲル上にロードする。ゲルを150Vで1.5時間泳動し、ウエスタンブロット用の膜に転移させる。eIF4E−BP2に指向された適切な一次抗体を一次抗体種に対して指向された放射標識又は蛍光標識された二次抗体と共に使用する。バンドはPHOSPHORIMAGERTM(Molecular Dynamixs,Sunnyvale,CA)を用いて可視化する。
eIF4E−BP2のアンチセンス抑制によるob/obマウスにおける血中グルコースレベルの低下
ob/obマウスは肥満及び高血糖症をもたらすレプチン遺伝子における突然変異を有している。即ち、これ等のマウスは肥満及び糖尿病の研究及びこれ等の状態を治療するために設計された治療のための有用なモデルである。本発明に従って、肥満及び糖尿病のob/obモデルにおいてeIF4E−BP2にターゲティングされた化合物を試験する。
高脂肪食餌誘導肥満マウスにおけるeIF4E−BP2のアンチセンス抑制の作用
C57BL/6マウス系統は高脂血症誘導アテローム性動脈硬化プラーク形成に罹患しやすいことが報告されている。結果として、これ等のマウスに高脂肪食餌を給餌すれば、それらは給餌誘導の肥満を発症する。従ってこれ等のマウスは肥満の研究及びこの状態を治療するために設計された治療のための有用なモデルである。本発明の別の実施形態においては、本発明のオリゴマー化合物を食餌誘導肥満のモデルにおいて試験した。
Claims (20)
- 動物における肝トリグリセリドレベルを低減する方法であって、eIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がeIF4E−BP2の発現を抑制する、方法。
- 前記動物が脂肪症を有する請求項1記載の方法。
- 前記脂肪症が脂肪肝である請求項3記載の方法。
- 前記脂肪症がNASHである請求項3記載の方法。
- 動物における体脂肪を低減する方法であって、eIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がeIF4E−BP2の発現を抑制する、方法。
- 動物におけるグルコース耐性を改善する方法であって、eIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がeIF4E−BP2の発現を抑制する、方法。
- 動物における脂肪生成を低減する方法であって、eIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がeIF4E−BP2の発現を抑制する、方法。
- 動物における脂肪組織中の脂肪生成に関与する遺伝子の発現を低減する方法であって、eIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がeIF4E−BP2の発現を抑制する、方法。
- 前記脂肪生成に関与する遺伝子がDGAT2及びFASである請求項12記載の方法。
- 動物におけるグルコース代謝に関与する遺伝子の肝発現をモジュレートする方法であって、eIF4E−BP2をコードする核酸分子にターゲティングされた12〜80核酸塩基長のアンチセンス化合物を該動物に投与することを含み、該化合物がeIF4E−BP2の発現を抑制する、方法。
- 前記グルコース代謝に関与する遺伝子がグルコース−6−ホスファターゼ及びグリコーゲンシンターゼである請求項15記載の方法。
- 前記動物が代謝性の疾患又は状態を有する請求項1〜17の何れか1項に記載の方法。
- 前記代謝性の疾患又は状態が肥満、高脂血症、高血糖症、糖尿病、メタボリックシンドローム又はインスリン抵抗性である請求項18記載の方法。
- 前記代謝性の疾患又は状態が2型糖尿病である請求項18記載の方法。
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