JP2022532098A - ＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドを使用して筋ジストロフィーを治療する方法 - Google Patents

ＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドを使用して筋ジストロフィーを治療する方法 Download PDF

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Abstract

筋内脂肪、筋肉動作性もしくは機能または四肢動作性もしくは機能の１つ以上のマーカー、兆候またはパラメータを改変するのに十分な、ＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドの医薬組成物を投与することによって、筋萎縮症、筋内脂肪組織または仮性肥大もしくは筋ジストロフィーに関連する症状またはそのリスクを有する対象において筋肉または四肢の動作性を改変する方法。以下のステップを含む方法：（ｉ）対象からの血液試料のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルを決定すること、（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドのクールを施し、投薬期間の終わり頃にステップ（ｉ）を少なくとも１回繰り返すこと、（ｉｉｉ）投薬完了から１週間以内にステップ（ｉ）を繰り返し、（ｉｖ）結果を処理して、対象が投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの回復、安定性または消失を呈したか否かを判定すること。

Description

本明細書は、筋肉動作性を改変するための組成物及び方法を可能にする。
本明細書の中の参考文献の目録詳細は本明細書の最後にも列挙されている。
本明細書におけるいかなる先行技術に対する言及も、いずれかの国でこの先行技術が共通一般知識の一部を形成することの承認または何らかの形態の示唆であるとはみなされず、また、みなされるべきでない。
筋ジストロフィー（ＭＤ）は、特定の筋組織の進行性虚弱及び消耗（筋壊死）、ならびに線維性、骨性または脂肪組織による骨格筋の置換を特徴とする障害の一群である。男性か、男性と女性かのどちらかに影響を与える筋ジストロフィーのいくつかの異なる形態が存在し、その多くは幼年期及び小児期から中年期以降までの間に出現する。形態及び重症度は発症の年齢によって様々であり、若い対象は急性進行性疾患を経験することが多い。
ＭＤの最も一般的な形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（福山型先天性ＭＤ及びミオシン欠損を伴う先天性ＭＤを含めたＣＭＤ）、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、エメリー・ドレイフス型及び遠位型形態である。ほぼ全種類のＭＤが単一遺伝子突然変異に起因している。
ＤＭＤ及びＢＭＤは、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子における欠陥を伴う。ジストロフィンタンパク質は、筋細胞（サルコメア）及び細胞骨格の収縮機構（アクチンフィラメント）を、コラーゲンによる筋力の伝達が行われる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と結び付けるのに役立っている（Ｇｒｏｕｎｄｓ ＭＤ，２００８）。ＥＣＭは、筋肉機能及び筋肉再生において複雑な役割を果たすことが知られている。ジストロフィー性筋線維は、壊死、炎症及び線維症と関連している。ジストロフィン欠損の結果として進行性疾患をきたす正確な一連の事象は分子レベルでは解明されていない。ＤＭＤを有する小児は、筋肉にジストロフィンが欠損しており、Ｒｏｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５に概要が示されているように、筋肉の傷みを増悪させる免疫系を誘発する収縮起因性の筋肉への損傷を受けやすい。進行中の筋肉強度の悪化は、下肢に影響を与えて可動性の悪化を招き、また、上肢にも影響を与えて機能及び身辺自立能力のさらなる損失を招く。遺伝子療法及びエクソンスキッピング手法は理想的であろうが、研究者達は、その重症度を改善しその進行を遅延させることができる方策及び薬剤を開発するために、疾患の性質を理解することにも注力している。ｍｄｘマウスモデルは、機序及び介入を前臨床で研究するために広く採用されている。Ｇｒｏｕｎｄｓ ＭＤ，２００８は、疾患の慢性期及び急性期を両方とも標的とする２層式の手法の必要性を明らかにした。
ＤＭＤは、主に男児に影響を与えて出生の頻度が約１：３，５００となる壊滅的症状である。男児は若くして歩行能力を喪失する可能性があり、典型的には思春期を過ぎてから車椅子生活になる可能性がある。３０歳代には死亡が頻繁に、大抵は心肺合併症によって起こる。ＢＭＤはＤＭＤと類似しているがはるかに軽度である。
コルチコステロイドによる現在の治療は、炎症を軽減して筋肉の量及び機能を一定期間にわたって維持することによって疾患の重症度を低下させることをねらいとしている。コルチコステロイドは、短期間であり得る即効性抗炎症作用を有し、その作用機序は解明されていない。それは最適未満のものである、というのも、副作用がその使用を厳しく制約しており、またそれが筋萎縮症を引き起こすこともあるからである。０．７５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、及びデフラザコート０．９ｍｇ／ｋｇ／日は、歩行可能なＤＭＤ患者のための標準的療法であるが、男児が非歩行可能になった場合にコルチコステロイド（ＣＳ）の有益性に関する統一的見解は存在せず、男児は、治療、時には彼らが歩行喪失時に続けていた低減されたｍｇ／ｋｇ／日の用量である固定用量を受け続ける場合もあるし、またはＣＳ治療が中止される場合もある。エダサロネキセントは、ＤＭＤを有する歩行可能な若齢男児において単剤療法としての開発がなされている抗炎症性ＮＦ－カッパＢ薬である。ジストロフィーの異なる側面を標的として治験中であるいくつかの薬物が存在する。例えば、線維症を標的とするタモキシフェン、呼吸機能を標的とするイデベノン、及びコドンスキッピングを停止するために使用されるアタルレンは、ＭＤのための治験がなされているところである。ジストロフィン遺伝子を標的とするエクソンスキッピングを誘導することによるＤＭＤのためのオリゴヌクレオチド療法は、評価がなされたことがあるが結果はまちまちであった。モルホリノオリゴヌクレオチドであるエテプリルセンは、エクソン５１スキッピングを受けやすいエクソン５１における遺伝的終止コドン突然変異を有するＤＭＤの小児の１３％において検証的試験にまで進んだことがある一方、エクソン５１スキッピングのための２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであるドリサペルセンは、活性及びＦＤＡ承認を勝ち取ることができなかった。
国際公開第ＷＯ２０１１／０２０８７４Ａ１号（Ｉｎｓｅｒｍ）は、ＤＭＤを有する対象における高度に発現しているＣＤ４９ｄ及び／またはＣＤ２９のレベルの上昇、及び疾患重症度との相関を開示している。
コルチコステロイド治療は大抵、ＤＭＤにおける四肢動作性の喪失（例えば、ＰＵＬ１またはＰＵＬ２動作性の低下）に関連している。
国際公開第ＷＯ２０１１／０２０８７４Ａ１号
現行の治療には欠陥があり、さらなる治療手法の早急な必要性を駆り立てている。
本明細書の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる」が、示された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を包含するがしかし他の任意の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群を排除しないことを暗に示していることは、理解されよう。また、本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、別段の指示が文脈から明らかでない限り、複数形の態様を含む。したがって、例えば、「組成物」に対する言及は単一の組成物も２つ以上の組成物も含み、「薬剤」に対する言及は１つの薬剤も２つ以上の薬剤も含み、「開示」に対する言及は開示の単一及び複数の態様を含むなどである。
一実施形態では、本開示は、対象における筋肉または四肢の動作性を改変する方法を可能にする。本明細書における筋肉または四肢の動作性を「改変すること」に対する言及は、筋肉または四肢の動作性を改善すること、及び筋肉または四肢の動作性の低下を進行遅延させるまたは維持するもしくは安定させることを含む。一実施形態では、対象は、筋萎縮症、筋内脂肪組織または仮性肥大もしくは筋ジストロフィーに関連する症状またはそのリスクを有する。本開示はＭＤについて例証されているが、本発明の実施形態は、筋内脂肪組織、筋萎縮症または筋肥大に関連する症状に及ぶ。一実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量のＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ４鎖）に対する阻害オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を、そのような対象において筋内脂肪、筋肉動作性もしくは機能または四肢動作性もしくは機能の１つ以上のマーカー、兆候またはパラメータを改変するのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で対象に周期的に投与することを含む。一実施形態では、方法は、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量のＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ４鎖）に対する阻害オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を、筋ジストロフィーに罹患しているそのような対象において筋内脂肪、筋肉または四肢の動作性または機能を改善するのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で対象に周期的に投与することを含む。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ－ＤＮＡ混成鎖である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む。
一実施形態では、対象は筋ジストロフィーを有し、方法は、対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善する、または筋ジストロフィーを進行遅延させる（安定させる）。
上肢動作性（ＰＵＬ）２．０または以前の１．２尺度は、対象における筋虚弱の近位から遠位への進行及び四肢機能の喪失を、毎日の生活に影響する実生活での動作性喪失を反映し臨床治療選択肢を知らせる方法で測定または評価するために考案された機能スケールである。上肢機能検査は、非歩行可能ＭＤ対象のために考案されたものであるが、歩行可能対象に適用される。等価な下肢機能の評価尺度は、下肢動作性の喪失を被っている歩行可能対象に関して同じ原理に従っている。
一実施形態では、対象は、治療前にＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルが上昇している。
本明細書において判定した場合、ＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、治療の施行前のベースラインレベルと比較してＭＤ対象におけるＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの持続的な低下をもたらした。
一実施形態では、治療方法は、阻害オリゴヌクレオチドを単剤療法としてまたはコルチコステロイド治療と組み合わせて投与したときに筋肉または四肢の動作性を改善する、または筋肉または四肢の動作性を減退遅延させる（安定させる）。
一実施形態では、方法は、筋内脂肪組織レベル、筋肉動作性を改善する、または筋内脂肪、筋肉動作性を減退遅延させ（安定させ）、筋内脂肪または筋肉動作性の１つ以上のマーカー、兆候またはパラメータには、筋肉の仮性肥大、萎縮症またはジストロフィーに関連する症状を有する対象における強度、体力、持久力、長さが含まれる。
一実施形態では、改変されたまたは増強／改善された動作性は、実施例に記載されるように、伸張性筋収縮を行う増強されたまたは向上した能力である。これは、例えば、安全に階段を下りる能力に影響を及ぼす。
実施例では、６週間の投薬計画にわたって本開示の方法の実践を例示する。当業者であれば、状況、対象及び彼らの健康状態の不測性に合わせて投薬計画が調整され得ることを理解するであろう。
本開示によれば本発明者らは、阻害オリゴヌクレオチド治療に対する応答性がより高く、改善されたまたは安定した筋肉または四肢の動作性、及び筋内脂肪組織レベルの改善を示すＭＤ対象の集団の特徴を明らかにした。これらの対象は、本明細書に記載される投薬完了によって改善されたＰＵＬ２．０スコアを呈すること、及び対照レベル、例えば治療クールの途中またはその終わりまででのＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルと比較したときの投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの回復または安定性（維持）を呈することを特徴とする。「回復」とは、阻害オリゴヌクレオチドが依然として投与されているときに、最終投薬時またはそれからおよそ１週間以内に採取された血液のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルが、対照レベル、例えば投薬を終える前の血液のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルよりも高い、またはそれを超えることを意味する。いくつかの実施形態では、いくらかの回復の有無または程度は、投薬完了後に回復したＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞またはそのマーカーのレベル（例えば標識強度）と、応答者または非応答者の状態を示す所定の対照とを比較することによって決定され得る。
関連する実施形態において、本発明者らは、単剤療法としてのまたは低用量コルチコステロイドと組み合わせた、ＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって例示される阻害オリゴヌクレオチド治療に対する応答が最適未満であるかまたは乏しく、阻害オリゴヌクレオチドによる治療の結果として筋肉または四肢の動作性の改善を示さない個体対象の集団の特徴を明らかにした。これらの対象は、本明細書に記載の投薬完了によって改善されたＰＵＬ２．０スコアを実質的に全く呈さないこと、または投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの回復を呈さないことを特徴とする。「回復」とは、阻害オリゴヌクレオチドが依然として投与されているときに、最終投薬時またはそれからおよそ１週間以内に採取された血液のＣＤ４＋ＣＤ４９＋Ｔ細胞のレベルが、対照レベル、例えば投薬を終える前の血液のＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルよりも高い、またはそれを超えることを意味する。いくつかの実施形態では、いくらかの回復の有無または程度は、投薬完了後に回復したＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞またはそのマーカーのレベル（例えば標識強度）と、応答者または非応答者の状態を示す所定の対照とを比較することによって決定され得る。これらの「非応答」対象は、投薬期間完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血液レベルの低下を呈することを特徴としており、阻害オリゴヌクレオチド療法に応答した／その途中での四肢動作性の最適未満レベル及び／または四肢動作性の喪失に関連付いている。
したがって、方法の一実施形態では、個体対象における改変された筋肉動作性もしくは機能または四肢動作性もしくは機能の１つのマーカーはＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルであり、投薬期間完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血中レベルの回復及び／または安定性（維持）は、改善された及び／または安定した四肢動作性に関連付いており、投薬期間完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血中レベルの低下は、阻害オリゴヌクレオチド療法に応答した／その途中での四肢動作性の最適未満レベル及び／または四肢動作性の喪失に関連付いている。
一実施形態では、改善された四肢動作性は、ＤＭＤを有する患者において上肢動作性のＰＵＬスコアまたは臨床的に等価な手段を用いて測定されるものである。
方法の一実施形態では、投薬期間が終わる前であって投薬期間中の前回の投薬から１週間以内に、ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルが測定される。
一実施形態では、対象はＭＤのために非歩行可能である。
一実施形態では、対象はＤＭＤのために非歩行可能である。
一実施形態では、対象は思春期を過ぎた者である。
したがって、一実施形態では、方法は、対象における投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血中レベルの回復及び／または安定性の有無について測定することをさらに含み、回復及び／または安定性の存在が、改善された筋肉及び／または安定した四肢動作性に関連付いており、投薬後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋細胞の血中レベルの低下が、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法に応答した四肢動作性の最適未満レベル及び／または喪失に関連付いている。
一実施形態では、阻害オリゴヌクレオチドは、低用量で１２～２４週間投与されたときに、ＤＭＤを有する対象においてＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルを低下させ、前回の投薬の完了から１週間以内に投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋の血中レベルの回復または安定化を有する対象において、ＰＵＬ２．０または臨床的に許容される等価なものによって決定される四肢機能を改善する及び／または安定させる。
そのような方法は、治療方法の中、スクリーニング治療薬の方法の中、特定の治療もしくは特定の薬剤、薬剤の組合せもしくは投薬計画、または特定の用量もしくは治療計画での治療に対する対象または集団の応答性を決定し対象または集団を層別して用量、薬剤、薬剤の組合せ、投薬期間などを最適化する方法の中のステップとして有用である。
一実施形態では、本明細書は、対象が改善されたＰＵＬ１／２スコアによる改善された筋肉または四肢の機能を呈することによってＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療に応答する可能性があるか否かを評価する方法を可能にする。
一実施形態では、本明細書は、対象が改善されたＰＵＬ１／２スコアによる改善された筋肉または四肢の機能を呈することによってＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる単剤療法での治療に応答する可能性があるか否かを評価する方法を可能にする。
一実施形態では、本明細書は、対象が改善されたＰＵＬ１／２スコアによる改善された筋肉または四肢の機能を呈することによって少量のＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる単剤療法での治療に応答する可能性があるか否かを評価する方法を可能にする。
別の実施形態では、本明細書は、対象が、改善されたＰＵＬ１／２スコアによって判定されるまたはそれと等価である改善された筋肉または四肢の機能を呈することによってＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療に応答する可能性が低いか否かを評価する方法を可能にする。
したがって、一実施形態では、個体対象が改善されたＰＵＬスコアまたは臨床的に等価なスコアによる改善された筋肉または四肢の機能を呈することによってＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療に応答する可能性があるか否かを評価するためのセラノスティクス方法であって、以下のステップ：
（ｉ）対象からの血液試料のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルを決定すること、
（ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドのクールを施し、投薬期間の終わり頃にステップ（ｉ）を少なくとも１回繰り返すこと、
（ｉｉｉ）投薬完了から１週間以内にステップ（ｉ）を繰り返し、
（ｉｖ）結果を処理して、対象が投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの回復、安定性または消失を呈したか否かを判定すること
を含む、当該方法が提供される。
一実施形態では、対象が投薬完了後の低下を呈した場合にアンチセンスオリゴヌクレオチドのクールが調整され方法が繰り返されるか、または対象が投薬完了後の回復を呈した場合にアンチセンスオリゴヌクレオチドの同じクールが繰り返され得る。
例えば、一実施形態では、クールは、投与される阻害オリゴヌクレオチドの用量を増加させることによって調整される。
一実施形態では、調整された阻害オリゴヌクレオチドは週に約７５ｍｇ～３００ｍｇで投与される。
一実施形態では、クールのために阻害オリゴヌクレオチドは約２５～５０ｍｇ／週の低用量で投与または初回投与が行われる。
一実施形態では、投与または初回投与は、単剤療法である、または標準もしくは低用量のコルチコステロイド治療と組み合わせて行われる。
一実施形態では、方法は、ＰＵＬまたは臨床的に許容される等価なものによってベースライン、及び治療の終わりに、筋肉または四肢の機能を評価することをさらに含む。
したがって、別の表現をすれば、本開示は、本明細書に記載または特許請求される治療方法またはセラノスティクス方法に使用するための、本明細書に記載もしくは特許請求される、または医薬もしくはセラノスティクス剤の製造もしくは調製の中に含まれる、阻害オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物を提供する。
別の表現をすれば、本開示は、本明細書に記載または特許請求される治療方法またはセラノスティクス方法に使用するための医薬の製造または調製における本明細書に記載または特許請求される阻害オリゴヌクレオチドの使用を可能にする。
上記概要は、本開示の全ての実施形態の網羅的列挙であるとは決してみなされず、みなされるべきでない。
特許及び出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面（複数可）付きの本特許または特許出願公開のコピーは、請求及び必要な手数料の納付をすれば特許庁によって提供されるであろう。
添付の図面は、本明細書に組み込まれその一部を形成するものであるが、本発明のいくつかの実施形態を例示しており、記載と共に、本発明の原理を説明するのに役立つ。
試験及び対照マウスのベースライン時の、及び６週間の治療にわたる（平均及びＳＥＭ）握力を示すデータをグラフで表したものである。 筋疲労回復においてＭＤＸ高用量アンチセンス薬治療と他のＭＤＸまたは対照治療との間に差異が認められないことを示すデータをグラフで表したものである。Ｂにおいて、４本の柱の各組は、左から右に向かってＭＤＸ－生理食塩水、ＭＤＸ－混交、ＭＤＸ－高、及びＭＤＸ－低の経時的な力産生量を示す。 野生型対照＋／－標準誤差と比較したときの伸張性筋収縮を示すデータをグラフで表したものである。高用量阻害オリゴヌクレオチド治療は伸張性収縮の間の筋損傷を遅延させる。 ＭＤＸ－生理食塩水処理マウスと比較したときの伸張性筋収縮を示すデータをグラフで表したものである。高用量阻害オリゴヌクレオチド群は、ＭＤＸ対照群と比較して有意により高い力産生能及び薬物遅延筋損傷を示した。 ＭＤＸ混交対照と比較したときの伸張性筋収縮を示すデータをグラフで表したものである。高用量の阻害オリゴヌクレオチドは、同用量での混交陰性対照と比較して明瞭に筋損傷を遅延させ、伸張性収縮後のより大きな筋肉力を産生した。 伸張性筋収縮後に産生された力を示すデータをグラフで表したものである。ＭＤＸ対照が初期産生力よりも約５０％少ない力を生み出したのに対して、高用量の阻害オリゴヌクレオチドを注射したマウスは有意により大きな力、すなわち初期産生力の約７０％の力を生み出した。 野生型ならびにＭＤＸ－生理食塩水、混交及び処置（高用量及び低用量）マウスの血中のクレアチンキナーゼレベルを示すデータをグラフで表したものである。野生型対照と比較して全てのＭＤＸマウスにおいて有意な増加がみられた。 ベースラインに比べて増強された上肢動作性によって治療に良好に応答する対象におけるＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞回復効果を示すデータを作表しグラフで表したものである。同様に、Ｔ細胞数の減少を有する対象はＰＵＬ２．０による上肢動作性の喪失を呈する。
配列表の凡例
配列番号１ ヒトα４インテグリンアンチセンス化合物（ＡＴＬ１１０２）
配列番号２ マウスα４インテグリンアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ３４８５７４）
配列番号３ 配列番号２に対する陰性対照（ＩＳＩＳ３５８３４２）
本開示は、薬剤に対する特定のスクリーニング手順、薬剤の特定の配合組成、及び様々な医療方法論に限定されない、というのも、そのようなものは様々であり得るからである。特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するまたは等価である任意の材料及び方法を使用して本開示を実施または試験することができる。実施者には、当技術分野の定義及び用語、ならびに当業者に知られている他の方法に関して、特にＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９、Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ－ＩＶ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８６、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０））、Ｈｏｇａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：１４１４３，２０１７，Ｇａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０２，８４５－８５７，２０１８を薦める。ＤＭＤを有する歩行可能及び歩行不可能な男児の大コホートにおいて上肢動作性機能検査の改訂版（ＰＵＬ２．０）を用いて２４ヶ月間の上肢機能の変化を報告している、Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ，１３（６）１－８，Ｊｕｎｅ ２０，２０１８、特にその結果の節を参照されたい。
「対象」という用語は、ＭＤと診断されたヒト対象もしくは個人、または臨床試験モデル動物を含む。
「対象」という用語は、ヒトまたは非ヒト動物を含む。
一実施形態では、本開示は、ヒトＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ４鎖）に対する阻害オリゴヌクレオチドを投与することを含む、対象における筋ジストロフィーを治療する方法を提供する。
一実施形態では、例示的な阻害オリゴヌクレオチドには、単離されたまたは合成のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｉＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣体、ｓｈＲＮＡまたはＤＮＡ、及びアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡ混成鎖が含まれる。
一実施形態では、本開示は、筋肉動作性の改変を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量の構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕
を含むオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、医薬組成物を対象に周期的に投与することを含む、当該方法を提供する。
一実施形態では、投与は、対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善するまたは筋ジストロフィーの進行を遅延させるのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で行われる。
一実施形態では、投与は、対象において筋肉動作性もしくは機能または四肢動作性もしくは機能の１つ以上のマーカー、兆候またはパラメータを改善するのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で行われる。本明細書中での筋肉動作性に対する言及は、運動能力を含み、筋萎縮症または仮性肥大または筋ジストロフィーに関連する症状における強度、体力、持久力及び長さなどの属性を含む。
一実施形態では、本明細書は、筋萎縮症／仮性肥大またはジストロフィーに関連する症状またはそのリスクを有する対象において筋肉動作性を改善するまたは筋肉動作性の低下を遅延させる方法であって、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量のオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を対象に周期的に投与することを含む、当該方法を可能にする。
一実施形態では、本明細書は、筋ジストロフィー、または筋萎縮症／仮性肥大もしくはジストロフィーに関連する症状の治療または予防を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療的有効量のヒトＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドを対象に周期的に投与して、筋ジストロフィーを有するかまたは筋萎縮症、仮性肥大もしくはジストロフィーに関連する症状を有する対象、あるいは筋萎縮症、仮性肥大またはジストロフィーに関連する症状を進展させるリスクを有する対象において筋肉強度／力及び四肢機能のうちの１つもしくは２つを含む筋肉動作性を改善するかまたは筋肉強度／力及び四肢機能のうちの１つもしくは２つの低下の進行を遅延させることを含む、当該方法を提供する。
一実施形態では、偽性肥大、萎縮症またはジストロフィーは、免疫によって媒介されるものである。一実施形態では、仮性肥大、萎縮症またはジストロフィーは、炎症によって媒介されるものである。一実施形態では、症状は、神経の、または他の疾患であり得る。
一実施形態では、投与は、仮性肥大、萎縮症またはジストロフィーに関連する症状を有する対象において筋内脂肪もしくは筋肉動作性の１つ以上のマーカー、兆候もしくはパラメータを改善するかまたは筋内脂肪、強度、体力、持久力、長さを含めた筋肉動作性の１つ以上のマーカー、兆候もしくはパラメータの進行もしくは進行速度を遅延させるのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で行われる。
一実施形態では、筋内脂肪、筋肉動作性もしくは機能または四肢動作性もしくは機能の改善は、単剤療法または併用治療の開始から６～８または６～１２週間以内に速やかに起こる。
一実施形態では、投与は標準的なコルチコステロイド治療と組み合わせて行われる。
一実施形態では、コルチコステロイドは低用量で投与される。低用量コルチコステロイドに対する言及は、標準用量の２／３、１／２、１／４及び１／３を含む。一実施形態では、コルチコステロイドは低用量で投与される。低用量コルチコステロイドに対する言及は、標準用量の４／５、３／４、２／３、１／２、１／３、１／４及び１／５を含む。別の実施形態では、コルチコステロイド用量は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０ｍｇ／ｋｇ／日の経口プレドニゾロン、または１０、２０、４０、４０、５０、６０、７０または８０ｍｇのデフラザコートである。
一実施形態では、阻害オリゴヌクレオチドの投与は、標準または低用量のコルチコステロイドの存在下で治療的に有効である。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、コルチコステロイドの非存在下で治療的に有効である。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、コルチコステロイドの非存在下で治療的に有効であり、対象は歩行可能である。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、コルチコステロイドの非存在下で治療的に有効であり、対象は歩行不可能（非歩行可能）である。
一実施形態では、本開示は、筋肉動作性を改変する方法であって、筋細胞または組織をヒトＣＤ４９ｄ（（ＶＬＡ－４のアルファ４鎖）に対する阻害オリゴヌクレオチドと接触させることを含む、当該方法を提供する。
筋細胞または組織は、生体外、局所または生体内で接触がなされる。
一実施形態では、接触は、筋肉動作性を向上させるためまたは筋ジストロフィーの進行速度を遅延させるもしくは低減するために阻害オリゴヌクレオチドの投与をそれを必要とする対象に行うことによってなされる。
一実施形態では、改変された筋肉動作性は、増加した筋肉強度及びまたは向上した筋肉機能を含む。
一実施形態では、増加した筋肉強度は、増加した伸張性収縮である。伸張性収縮は、歩行時及び四肢の制御された無痛運動の際に必須となる、筋線維が伸びる間の収縮である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ－ＤＮＡ混成鎖である。
一実施形態では、対象はＭＤのために歩行不可能である。
一実施形態では、対象は思春期を過ぎた者である。
一実施形態では、方法は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞レベルを追跡評価することを含む。一実施形態では、方法は、低下したＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞レベルを追跡評価することを含む。一実施形態では、方法は、Ｍ１マクロファージまたはＨＬＡＤＲ＋単球を追跡評価することを含む。一実施形態では、方法は、減少したＭ１マクロファージまたはＨＬＡＤＲ＋単球を追跡評価することを含む。
一実施形態では、方法は、ＭＤまたはジストロフィー性筋線維の１つ以上のマーカーのレベルまたは有無を決定することを含み、これには、免疫細胞もしくはそれによって産生される免疫調節因子のレベルもしくは数、炎症マーカーのレベル、または線維症のマーカーのレベル、または筋肉状態のマーカーのレベルが含まれる。
一実施形態では、ＭＤもしくはＭＤ進行またはジストロフィー性筋線維の１つ以上のマーカーは、免疫細胞もしくはそれによって産生される免疫調節因子のレベルもしくは数、炎症マーカーのレベル、または線維症のマーカーのレベルを含む。
一実施形態では、筋肉動作性のマーカー、または筋肉状態のマーカーのレベルには、筋肉強度、体力、持久力及び長さ機能が含まれる。
筋肉状態のマーカーとしては、運動筋肉機能のマーカー、筋線維症またはその非存在を指し示すマーカー、筋変性または再生を指し示すマーカー、心機能のマーカー、及び肺機能のマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＭＤまたはジストロフィー性筋線維の１つ以上の兆候の改善には、四肢機能、身体筋肉機能、心及び／または肺機能の改善が含まれる。
一実施形態では、方法は、ＭＤまたはジストロフィー性筋線維の１つ以上の兆候のレベルまたは有無を決定することを含む。例示的な兆候としては、四肢機能、身体筋肉機能、心及び肺機能が挙げられる。
一実施形態では、ＭＤまたはジストロフィー性筋線維の１つ以上の症候には、生活の質因子、例えば、エネルギーレベル、幸福度、知覚される歩行しやすさ、上肢機能の活動性などが含まれる。
一実施形態では、それを必要とする対象には、遺伝的及び／または臨床的にＭＤと診断され、ジストロフィー性筋線維及び炎症マーカーのレベルが比較的低い対象が含まれる。
一実施形態では、対象は、炎症細胞の正常なまたはごくわずかに上昇したレベルを呈する。炎症細胞としては、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８）、Ｂ細胞（ＣＤ１９）、顆粒球、（好中球、好塩基球及び好酸球）が挙げられる。
一実施形態では、対象は、ＣＤ４９ｄ細胞の正常なまたはごくわずかに上昇したレベルを呈する。
一実施形態では、対象は、ＣＤ４９ｄ Ｔ細胞の正常なまたはごくわずかに上昇したレベルを呈する。
一実施形態では、対象は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ２９及びＨＬＡ－ＤＲなどの免疫細胞マーカーの正常なまたはごくわずかに上昇したレベルを呈する。
細胞またはタンパク質／核酸または脂質を含めたマーカーの分析の好適な方法は、当技術分野で知られており、限定されないが、フローサイトメトリー、ビーズ技術及びＥＬＩＳＡ系の方法、クロマトグラフィー及び／またはＭＳ方法、ハイブリダイゼーション、または配列決定に基づく方法を含む。
さらなる実施形態では、ＭＤと診断された対象は、重度の筋壊死及び炎症を伴う重度のジストロフィー性筋線維の有意に上昇したまたは急性なレベルを呈する。
一実施形態では、対象は、正常な健常対照に比べて有意に上昇したＣＤ４９ｄ Ｔ細胞のレベルを呈する。
一実施形態では、対象におけるＭＤの形態は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（福山型先天性ＭＤ及びミオシン欠損を伴う先天性ＭＤを含めたＣＭＤ）、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、エメリー・ドレイフス型及び遠位型筋ジストロフィーからなる群から選択される。
一実施形態では、対象はＤＭＤまたはＢＭＤを有し、歩行不可能である。
一実施形態では、対象は、ＤＭＤまたはＢＭＤを有し、思春期を過ぎた者である。
本開示の別の形態では、本明細書に記載の方法または用途において使用される場合の医薬組成物、対象における筋ジストロフィーの治療または予防のための医薬の製造での本明細書に記載の組成物の使用、本明細書に記載の方法に使用するための組成物に関する実施形態が企図される。
したがって、一実施形態では、本開示は、対象において筋肉の仮性肥大もしくはジストロフィーに関連する症状の治療もしくは予防のためまたは仮性肥大及び／または筋ジストロフィーの進行を遅延させるための医薬の製造における構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕
を含むオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体の使用を提供する。
したがって、一実施形態では、本開示は、筋肉動作性の増強をそれを必要とする対象において行うための医薬の製造における構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕
を含むオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体の使用を提供する。
したがって、一実施形態では、本開示は、筋肉動作性の増強、筋肉動作性の維持または筋肉動作性の低下速度の低減をそれを必要とする対象において行うための医薬の製造における構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕
を含むオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体の使用を提供する。
一実施形態では、筋肉動作性の増強は、単剤療法または併用治療の開始から６～８週間以内の筋肉動作性もしくは機能または四肢の機能の動作性の改善に関連付いている。
一実施形態では、筋肉動作性は筋肉機能である、または筋肉機能の既知の推定手段を用いて測定される。
一実施形態では、筋肉動作性は筋肉強度である、または筋肉強度の既知の推定手段を用いて測定される。
一実施形態では、改変または増強された動作性は、実施例に記載される伸張性筋収縮を行う増強されたまたは向上した能力である。
別の実施形態では、本発明の記載は、対象における筋ジストロフィーの治療もしくは予防に使用されるまたはその進行を遅延させるための、構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕
を含むオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を可能にし、進行の遅延は、単剤療法または併用治療の開始から６～８週間以内の筋肉動作性もしくは機能または四肢の機能の動作性の改善に関連付いている。
一実施形態では、筋肉動作性もしくは機能または四肢の機能の動作性は、単剤療法または併用治療の開始から６～８週間以内に速やかに起こる。
一実施形態では、本開示は、筋ジストロフィーの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、治療的有効量のヒトＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドを対象に周期的に投与して対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善するかまたは筋ジストロフィーの進行を遅延させることを含む、当該方法を可能にする。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、標準または低用量コルチコステロイド治療と組み合わせて行われる、またはそれに伴う補助的治療である。
一実施形態では、コルチコステロイドは低用量で投与される。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、コルチコステロイド療法の非存在下で有効である。
別の実施形態では、筋ジストロフィーを有する対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善するためまたは筋ジストロフィーの進行を遅延させるための医薬の調製におけるヒトＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドの使用が開示される。一実施形態では、筋肉動作性もしくは機能または四肢の機能の動作性の改善は、単剤療法または併用治療の開始から６～８週間以内に速やかに起こる。
一実施形態では、対象における筋ジストロフィーの治療または筋ジストロフィーの進行遅延に使用するための、ヒトＣＤ４９ｄに対する阻害オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物が提供される。
本明細書において決定した場合、治療を終えた時（２４週目）のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞数は、治療後（２８週目）の回復を示した。これらの観察結果は、ＤＭＤにおいてＰＵＬ２での６名の患者全員の２４週目の改善－安定化に関連していた。２４週目から２８週目までの投薬がＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の回復を示さなかった場合、これはＤＭＤにおいてＰＵＬ２での２名の患者全員の悪化に関連していた。
したがって、一実施形態では、本治療に対する応答性または非応答性に関して対象を検査または層別することが提案される。例えばＲＡＰＩＤまたはフロー／チップサイトメトリーマーカーを使用する診断的血液検査を用いて、対象が向上した筋肉動作性または筋肉動作性の安定化もしくは低下遅延によってアンチセンスオリゴヌクレオチド治療に応答するまたはできるか否かを簡単に示すことができる。応答性検査の結果に基づいて投薬計画を変更して例えば治療を強化することができる。治療が完全にあるいは一定期間にわたって中止されることもある。一実施形態では、投薬後のＣＤ４９ｄ Ｔ細胞回復の非存在下で、その後の改変された用量の阻害オリゴヌクレオチドが投与される。例えば、より高い用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与する。例えば、一実施形態では、投薬後のＣＤ４９ｄ Ｔ細胞回復の非存在下で、その後の改変された用量のコルチコステロイドが投与される。
一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｔ細胞及び筋肉動作性（例えばＰＵＬ２機能）に対する影響をみるために少なくとも６～１０週間にわたって投与される。投薬を中断した後には、改善した筋肉動作性に肯定的に関連付けられるＣＤ４９ｄ＋細胞の回復があるが、これは、投薬の中断から１週間以内に、またはその後の約４～約５週間以内にわたって評価され得る。回復は、改善されたＰＵＬスコアによる療法への応答をしない対象では認められない。
ＤＭＤは、例えば、１８ヶ月目に乳児の運動マイルストーンが遅延している場合に臨床的に診断されることが多い。筋肉虚弱の早期の特徴としては、ガニ股歩行、尖足歩行 脊柱前彎、頻繁な転倒、下腿部、三角筋、大腿四頭筋、舌咬筋などの筋肉の肥大、起床困難、腕虚弱が挙げられる。ＤＭＤにおいて歩行の喪失が典型的には７～１３歳の間に起こる一方、もっと後の歩行はＢＭＤに特徴的である。心肺障害も顕在化し得る。疲労及び発話発達も遅延し得る。しかしながら、上位運動ニューロンの兆候も筋線維束性収縮も認められない。
ＤＭＤの診断は、ジストロフィン欠損を示すジストロフィン免疫蛍光試験及び／またはイムノブロット、ならびに典型的なＤＭＤと整合する臨床写真によって確認され得る。あるいは、リーディングフレームが「フレーム外」と予測され得るジストロフィン遺伝子の遺伝子欠失試験陽性（１つ以上のエクソンの逸失）、及び典型的なＤＭＤと整合する臨床写真によって示唆される。一実施形態では、完全ジストロフィン遺伝子配列決定は、ＤＭＤに明らかに関連し得る終止コドン突然変異をもたらす点突然変異、重複または他の突然変異を示し得る。兄弟または母系祖父において上に列挙される判断基準の１つによって確認された陽性のＤＭＤの家族歴も有用である。ＤＭＤに特徴的な臨床症候または兆候（例えば、近位筋虚弱、登攀性起立、上昇した血清中クレアチニンキナーゼレベル）の評価も用いられる。
改善されたＭＤまたはジストロフィー性筋線維／改善された筋肉機能の好適なマーカー、兆候及び症候は、当業者に知られているであろう。
好適な検査としては、治療中に増加した経時的な運動、筋肉、心拍出量、血流量、肺機能が挙げられる。
前臨床の心臓仮性肥大を有する対象では、血清バイオマーカー応答に基づいて心臓効率が決定され得る。これは、１つ以上のマーカー、例えば、ミオスタチン比率、心筋トロポニン、心臓ＢＮＰなどのレベルを決定することによって成し遂げられ得る。ｅＧＦＲ変化を追跡評価してもよい。他の心機能を遠隔測定法によって評価してもよいし、または心拍異常を連続移動式遠隔測定による追跡評価によって評価してもよい。
さらなる検査としては、筋肉酸化パラメータ及びミトコンドリア表現型の検査が挙げられる。
軽減された線維症は、ＭＲＩによって評価される。軽減された筋内脂肪、軽減された心臓線維症、増大したつまみ力、握力、改善した心肺機能検査。他の評価は上記機能の低下速度の減速を調べる。
生活の質についての質問票は、治療の効果を見極める上で非常に有用である。
臨床転帰は、例えば、正規化上肢到達可能表面積の変化パーセント、心臓周辺の歪みの変化パーセントをＭＲＩによって決定することを伴い得、心臓の側後壁の歪みが評価される。別の有用な検査は、肺活量測定によって努力性肺活量、呼吸機能喪失遅延、例えばベースラインからのＦＶＣ５ｐの変化を測定することである。
運動機能検査としては、治療の前と後とでの４段標準階段昇降検査の平均変化、起き上がる時間、ＭＲＳでの外側広筋の脂肪画分の磁気共鳴分光法平均変化を決定すること、大腿四頭筋の筋力検査、膝伸展ピークトルク測定、前腕への超音波筋肉微小血管血液供給が挙げられる。
重要な臨床評価としては、６または１０メートル歩く／走る時間、階段を４段昇る時間、階段を４段降りる時間、仰臥位から立ち上がる時間が挙げられる。体重、身長、ＢＭＩの変化も評価され得る。
あるいは、またはさらに、筋肉生検評価からのバイオマーカー、ＥＬＩＳＡまたはプロテオミクスによって測定された血漿中バイオマーカーパネルの変化、または循環免疫細胞マーカーの変化を測定する薬力学マーカーが評価される。
本明細書中で使用する「アンチセンス化合物」という用語は、ＶＬＡ－４（α４β１）及び／またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸分子にハイブリダイズするオリゴマー化合物を指す。ヒトにおいてα４インテグリン鎖はＣＤ４９ｄである。アンチセンス化合物は、ＣＤ４９ｄ、β１インテグリン及び／またはβ７インテグリンの発現を妨害し得る。
本明細書中で使用される「α４インテグリンをコードする核酸分子」という用語は、ＶＬＡ－４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードするＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレｍＲＮＡ及びｍＲＮＡまたはその断片を含む）、そしてさらにはそのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含する。
本明細書中で使用する「ＶＬＡ－４」という用語は、α４インテグリンとβ１インテグリンとのヘテロ二量体を指す。ＶＬＡ－４は、正常な末梢血Ｂ及びＴ細胞、胸腺細胞、単球及び他の細胞、ならびに造血幹細胞及び前駆細胞の上にかなりのレベルで発現する。ＶＬＡ－４はまた、間葉系及び内皮前駆細胞、ならびに間葉系幹細胞、ならびにおそらく内皮幹細胞の上にも発現する。ＶＬＡ－４のリガンドとしては、接着分子－１（ＶＣＡＭ－１）、及びフィブロネクチンのＨｅｐＩＩ領域内で選択的スプライシングを受けるドメインであるＣＳ－１が挙げられる。
本明細書中で使用される「α４β７インテグリン」という用語は、α４インテグリンとβ７インテグリンとのヘテロ二量体を指す。α４β７インテグリンは、腸管への向性を有するメモリーＴ細胞のサブセットを識別する。α４β７インテグリンはまた、マスト細胞、リンパ球及びＮＫ前駆細胞のサブセットの上にも発現する。α４β７インテグリンは、いくつかの幹細胞及び前駆細胞の上に発現する。α４β７インテグリンのリガンドとしては、ＭＡｄＣａｍ－１及びＶＣＡＭ－１が挙げられる。
核酸
本開示は、核酸とも呼称される様々なオリゴヌクレオチドの使用を包含する。例示的な核酸としては、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ））、ＲＮＡ（例えば、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｉＲＮＡ、短鎖阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ類縁体（例えば、塩基類縁体、糖類縁体及び／または非天然主鎖などを含有するもの）、ＲＮＡ／ＤＮＡ混成鎖、及びポリアミド核酸（ＰＮＡ）が挙げられ、これらはどれも一本鎖または二本鎖形態であり得る。一例では、核酸は、単離されたものである。本明細書中で使用する場合、「単離された核酸」という用語は、人間の介入によって天然の状態から変更されたまたは取り出された核酸を意味する。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、広義には短鎖核酸分子を意味する。オリゴヌクレオチドは、配列特異的な方法でその各々の相補オリゴヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡに容易に結合して二本鎖を形成する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド以上である。
一実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは阻害オリゴヌクレオチドである。一例では、「阻害オリゴヌクレオチド」という用語は、１つ以上のタンパク質の産生、発現または生物活性を低減する任意のオリゴヌクレオチドを指す。例えば、阻害オリゴヌクレオチドは、リボソームにおけるｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を妨害し得る。別の例では、阻害オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子（複数可）またはｍＲＮＡに結合する（ハイブリダイズする）のに十分に、１つ以上のタンパク質をコードする遺伝子かｍＲＮＡかのどちらかに対して相補的であり得、それによって標的タンパク質の発現または生物活性を低減し得る。別の例では、阻害オリゴヌクレオチドは、タンパク質をコードしない細胞内核酸の生物活性を阻害する。例えば、阻害オリゴヌクレオチドは、非コードＲＮＡの生物活性を阻害し得る。
本明細書中で使用する「アンチセンス」という用語は、転写を受けるＤＮＡ二重らせんの鎖のものか伝令ＲＮＡ分子のものかのどちらかであり得るコード配列に対して相補的であり、したがってそれに結合することができる、ヌクレオチドの配列を意味する。アンチセンスＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ中のコード鎖に対して相補的な非コード鎖である。
「短鎖ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」という用語は、二本鎖領域及びループ領域を有するＲＮＡ構造を指す。
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）という用語は、短鎖干渉ＲＮＡまたはサイレンシングＲＮＡとして知られていることがあるが、長さ約１９～２５塩基対の二本鎖または一本鎖ＲＮＡ分子の部類である。特定のタンパク質への翻訳を阻害または防止するｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡという用語と連結されたタンパク質名によって表される。典型的には、様々な実施形態においてｓｉＲＮＡは、約１９～２８個のヌクレオチド（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８個のヌクレオチド）を有する二本鎖または一本鎖核酸分子である。「ｉＲＮＡ」は、ＲＮＡを含有しＲＮＡ転写産物の特異的切断をＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介して媒介する薬剤を指す。本明細書中で使用する場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡに関して「センス」及び「アンチセンス」配向を有すると呼称されることになる逆平行な実質的に相補的な２つの核酸鎖を含むハイブリダイズした二本鎖領域を有するＲＮＡ分子または分子の複合体を含むｉＲＮＡを含む。二本鎖領域は、ＲＩＳＣ経路による所望の標的ＲＮＡの特異的分解を許容する任意の長さのものであり得るが、典型的には９～３６塩基対の長さ、例えば１５～３０塩基対の長さの範囲であろう。９～３６塩基対の二本鎖を考えれば、二本鎖は、この範囲に入る任意の長さ、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５または３６、及びそれらの間の任意の小範囲、例えば、限定されないが、１５～３０塩基対、１５～２６塩基対、１５～２３塩基対、１５～２２塩基対、１５～２１塩基対、１５～２０塩基対、１５～１９塩基対、１５～１８塩基対、１５～１７塩基対、１８～３０塩基対、１８～２６塩基対、１８～２３塩基対、１８～２２塩基対、１８～２１塩基対、１８～２０塩基対、１９～３０塩基対、１９～２６塩基対、１９～２３塩基対、１９～２２塩基対、１９～２１塩基対、１９～２０塩基対、２０～３０塩基対、２０～２６塩基対、２０～２５塩基対、２０～２４塩基対、２０～２３塩基対、２０～２２塩基対、２０～２１塩基対、２１～３０塩基対、２１～２６塩基対、２１～２５塩基対、２１～２４塩基対、２１～２３塩基対または２１～２２塩基対であり得る。Ｄｉｃｅｒ及び類似する酵素によるプロセシングによって細胞内に生成したｄｓＲＮＡは、長さが大抵１９～２２塩基対の範囲である。ｄｓＤＮＡの二本鎖領域の１本の鎖は、標的ＲＮＡの領域に対して実質的に相補的である配列を含む。二本鎖構造を形成している２本の鎖は、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一のＲＮＡ分子からのものであり得、または２つ以上の別個のＲＮＡ分子から形成され得る。二本鎖領域が単一の分子の２本の鎖から形成される場合、分子は、二本鎖構造を形成している一方の鎖の３’末端と各々の他方の鎖の５’末端との間がヌクレオチドの一本鎖（本明細書中では「ヘアピンループ」と呼称される）によって隔てられた二本鎖領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも１つの非対合性ヌクレオチドを含み得、いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２３個またはそれよりも多い非対合性ヌクレオチドを含み得る。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的な鎖が別個のＲＮＡ分子からなる場合、それらの分子は、必ずとは言わないが、共有結合で連結されていてもよい。２本の鎖がヘアピンループ以外の手段によって共有結合で連結されている場合、連結している構造体は「リンカー」と呼称される。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、上記ｄｓＲＮＡを指すためにも本明細書中で使用される。当業者であれば、「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語が、天然に発現するまたは見つかるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載されるかまたは当技術分野で知られている１つ以上のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類縁体または誘導体を含むＲＮＡの類縁体及び誘導体も包含することを認識するであろう。厳密に言うと、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基及びリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、１つ、２つまたは３つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、「リボヌクレオシド」及び「リボヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用する場合には等価であるとみなされ得る。ＲＮＡは、例えば本明細書中で以下に記載されるように、核酸塩基構造またはリボース－リン酸主鎖構造が改変され得る。しかしながら、リボヌクレオシド類縁体または誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する能力を保持していなければならない。非限定的な例を挙げると、ＲＮＡ分子は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホロアミダートもしくは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはそれらの任意の組合せを含むがこれに限定されない少なくとも１つの修飾リボヌクレオシドを含み得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ分子の全長を上限として少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれよりも多い修飾リボヌクレオシドを含み得る。改変は、ＲＮＡ分子中のそのような複数の修飾リボヌクレオシドの各々において同じである必要はない。一実施形態は、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することが企図される修飾ＲＮＡは、必要とされる二本鎖構造を形成する能力を有しＲＩＳＣ経路を介した標的ＲＮＡの特異的分解を許容または媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
「マイクロＲＮＡ」（略してｍｉＲＮＡ）という用語は、遺伝子発現のＲＮＡサイレンシング及び転写後調節において機能する、植物、動物及びいくつかのウイルスにみられる（約２２個のヌクレオチドを含有する）小さい非コードＲＮＡ分子のことである。「ｍｉＲ」という接頭辞の後にダッシュ記号と番号を続け、後者は命名の順番を表していることが多い。１つまたは２つのヌクレオチドを除いて配列がほぼ同一である異なるｍｉＲＮＡには、追加の小文字の注釈を付ける。幾多のｍｉＲＮＡが当技術分野で知られている（ｍｉＲＢａｓｅ Ｖ．２１命名法；Ｋｏｚｏｍａｒａ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．２００４参照）。これらのｍｉＲＮＡの配列は当技術分野でよく知られており、例えば、ワールドワイドウェブ上のｍｉｒｂａｓｅドットｏｒｇで見つかり得る。
一実施形態では、「阻害オリゴヌクレオチド」は、１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を模倣している。「ｍｉＲＮＡ模倣体」という用語は、本明細書中で使用される場合、細胞内に導入されたときに内在性成熟ｍｉＲＮＡ分子を模倣するように考案された小さな二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、様々な供給業者、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、及びＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得ることができる。
実施形態において、「阻害オリゴヌクレオチド」は１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を阻害する。様々なｍｉＲＮＡ種がこの目的に適している。例としては、アンタゴミール、干渉ＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡスポンジ、及びｍｉＲ－マスクが挙げられるが、これらに限定されない。「アンタゴミール」という用語は、本開示の文脈では、標的ｍｉＲＮＡに結合し、ｍｉＲＮＡとその同属遺伝子標的との結合を防止することによってｍｉＲＮＡ機能を阻害する化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを指すために使用される。アンタゴミールは、当技術分野で知られている任意の塩基修飾を含み得る。一例では、上に言及されるｍｉＲＮＡ種は長さが約１０～５０ヌクレオチドである。例えば、例えば、アンタゴミールは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチドの長さのアンチセンス部分を有し得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ種は、少なくとも１つのヌクレオチドで各々構成されている２つ以上の化学的に異なる領域を含有する、キメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、１つ以上の有益な特性（例えば、向上したヌクレアーゼ耐性、増加した細胞内取込み、標的に対する増大した結合親和性など）を付与する少なくとも１つの修飾ヌクレオチド領域、及びＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡ混成鎖を切断できる酵素の基質である領域を含有する。
一実施形態では、本開示に包含される核酸は、合成のものである。「合成の核酸」という用語は、核酸が、天然に存在する核酸の化学構造または配列を有さないことを意味する。合成のヌクレオチドには、操作型核酸分子が含まれる。別の例では、核酸構造を、核酸のＡ型立体配座において３’－エンド（Ｎｏｒｔｈ）の立体配座にリボースを固定する２’酸素と４’炭素との間のメチレン架橋を有するロックド核酸（ＬＮＡ）に改変することもできる（Ｌｅｎｎｏｘ ｅｔ ａｌ ２０１１、Ｂａｄｅｒ ｅｔ ａｌ ２０１１）。ｍｉＲＮＡの文脈において、この改変は、分子の標的特異性とハイブリダイゼーション特性との両方を有意に向上させ得る。
本明細書に開示される方法に使用される核酸は、必要に応じて慣例的な方法を用いて設計され得る。例えば、阻害オリゴヌクレオチドの文脈において、シード配列中に一続きの少なくとも５連続ヌクレオチドを含んでいるかまたはそのすぐ隣にある、長さ５、６、７、８、９、１０ヌクレオチドの、またはそれより長い標的配列は、遺伝子を標的とするのに適しているとみなされる。例示的な標的セグメントは、シード配列の１つの５’末端から少なくとも５連続ヌクレオチドを含んでいる配列（残りのヌクレオチドは、シード配列の５’末端のすぐ上流から始まって核酸が約５～約３０ヌクレオチドを含有するまで続く連続した一続きの同じＲＮＡである）を含み得る。別の例では、標的セグメントは、シード配列の１つの３’末端から少なくとも５連続ヌクレオチドを含むＲＮＡ配列（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの３’末端のすぐ下流から始まって核酸が約５～約３０ヌクレオチドを含有するまで続く連続した一続きの同じＲＮＡである）で表される。「シード配列」という用語は、本開示の文脈において、標的特異性の重要な決定基であるｍｉＲＮＡの５末端にある最初の８ヌクレオチド（ｎｔ）の中の長さ６～８ｎｔの部分列（すなわちシード配列）を指して使用される。１つ以上の標的領域、セグメントまたは部位が同定された時点で、所望の効果を得るのに十分に標的に対して相補的な、つまり十分に良好にハイブリダイズし十分に特異性を有する（つまり、他の非標的核酸配列には実質的に結合しない）阻害核酸化合物が選択される。
α４インテグリンに対するアンチセンス化合物
一実施形態では、本開示の方法は、α４インテグリンに対するアンチセンス化合物の使用に依拠する。そのようなアンチセンス化合物は、ＶＬＡ－４（α４β１）またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸を標的とする。一実施形態では、アンチセンス化合物はオリゴヌクレオチドである。しかしながら、オリゴヌクレオチド模倣体を含むがこれに限定されない他のオリゴマー型アンチセンス化合物が企図される。
アンチセンス化合物とその標的核酸とのハイブリダイゼーションは一般に、「アンチセンス」とみなされる。アンチセンス化合物とその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、標的核酸の機能を阻害する。そのような「アンチセンス阻害」は、標的核酸が切断される、分解される、あるいは機能不能にされるような、標的核酸に対するアンチセンス化合物の水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づいているのが典型的である。妨害されることになる標的ＤＮＡの機能には、複製及び転写が含まれ得る。複製及び転写は、例えば、内在性細胞内鋳型、ベクター、プラスミド構築物などからのものであり得る。妨害されることになるＲＮＡの機能には、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡ合成の部位から離れた細胞内の部位へのＲＮＡの移行、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ以上のＲＮＡ種をもたらすＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡが参加し得るまたはそれによって促進され得る、ＲＮＡが関与する触媒活性または複合体形成などの機能が含まれ得る。
本明細書中で使用される「ハイブリダイゼーション」は、オリゴヌクレオチドと標的核酸の相補塩基の対合を意味する。塩基対合は、典型的には水素結合を伴うが、これは、相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）同士のワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合であり得る。グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）は、３つの水素結合の形成によって対合する相補核酸塩基の例である。アデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）は、２つの水素結合の形成によって対合する相補核酸塩基の例である。ハイブリダイゼーションは様々な状況下で起こり得る。
「ヌクレオシド」は、塩基－糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の最もよくある２つの部類はプリンとピリミジンである。「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに連結され得る。
「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」は、アンチセンス化合物と標的核酸との間での安定した特異的な結合が起こるような十分な度合いの相補性を表すために使用される用語である。特異的にハイブリダイズ可能となる上でアンチセンス化合物がその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことは、理解される。標的核酸とのアンチセンス化合物の結合が標的分子の正常な機能に干渉して活性の喪失をもたらし、特異的な結合が望まれる条件、例えば治療処置の場合の生理条件の下で非標的配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するのに十分な度合いの相補性が存在する場合、アンチセンス化合物は、特異的にハイブリダイズ可能である。
本明細書中で使用される「相補的」は、アンチセンス化合物の核酸塩基と標的核酸との間で正確に対合する能力を意味する。例えば、アンチセンス化合物の特定位置にある核酸塩基が標的核酸の特定位置にある核酸塩基と水素結合することができる場合には、アンチセンス化合物と標的核酸との間での水素結合の位置は、相補的位置とみなされる。アンチセンス化合物は、介在または隣接するセグメント（例えばループ構造またはヘアピン構造）がハイブリダイゼーション事象に関与しないような、１つ以上のセグメントにわたるハイブリダイゼーションをするものであり得る。一実施形態では、アンチセンス化合物は、標的核酸中の標的領域との少なくとも７０％の配列相補性を含む。
例えば、２０個中１８個の核酸塩基が標的核酸中の標的領域と相補的でありそれゆえ特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０％の相補性に相当するであろう。この例では、残存する非相補的核酸塩基は、塊をなしていてもよいし、または間に相補的核酸塩基が配置されていてもよく、互いにまたは相補的核酸塩基と連続している必要はない。したがって、標的核酸と完全に相補的である２つの領域に挟まれた非相補的核酸塩基を４つ有する長さ１８核酸塩基のアンチセンス化合物は、標的核酸との７７．８％の全体的相補性を有することになり、かくして本開示の範囲に含まれることになる。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当技術分野で知られているＢＬＡＳＴプログラム（基礎的局所アラインメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて慣例的に決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｈ，１９９０、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，１９９７）。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本開示は、とりわけ、α４インテグリン及び／またはＶＬＡ－４及び／またはα４β７インテグリンの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＶＬＡ－４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする核酸を標的とする。
本明細書中で使用される「阻害する」という用語は、ＶＬＡ－４またはα４β７インテグリン発現の任意の測定可能な（例えば、１０％、２０％、５０％、９０％または１００％の）低下を意味する。本明細書において、「阻害ヌクレオチド」という用語は、ＶＬＡ－４またはα４β７インテグリン発現の任意の測定可能な（例えば、１０％、２０％、５０％、９０％または１００％の）低下を誘発する本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを意味する。
本明細書中で使用する場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡのオリゴマーもしくはポリマー、またはその模倣体、キメラ、類縁体及び相同体を指す。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及び共有結合性のヌクレオシド間（主鎖）リンケージからなるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞内取込み、標的核酸に対する増強された親和性、及びヌクレアーゼの存在下での向上した安定性などの望ましい特性ゆえに、天然形態よりも好まれることが多い。
オリゴヌクレオチドは、キラル（不斉）中心を含有していてもよく、または分子が全体としてキラルであってもよい。個々の立体異性体（エナンチオマー及びジアステレオマー）及びこれらの混合物は本開示の範囲に含まれる。キラルホスホロチオエートリンケージを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの開示については、Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２：１３４５６－１３４６８，２０１４を参照するとよい。ＡＳＯの全般的な記載については、Ｓｃａｌｅｓ ｅｔ ａｌ Ａｎｔｉｓｅｓｎｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｐｒｉｌ ２０１９；５（２）ＤＯＩ：ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２１２／ＮＸＧ．０００００００００００００３２を参照するとよい。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は隣接するヌクレオシドを互いに共有結合で連結して直鎖状ポリマー化合物を形成する。そして今度はこの直鎖状ポリマー化合物の各々の端部がさらに繋ぎ合わさって環状化合物を形成し得るが、一般には、直鎖状化合物が好まれる。加えて、直鎖状化合物は、内部核酸塩基相補性を有し得、それゆえ、完全または部分的に二本鎖化合物となるような具合に折りたたまれ得る。オリゴヌクレオチドに関してリン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成しているとみなされるのが普通である。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常のリンケージまたは主鎖は、３’から５’へのホスホジエステルリンケージである。
本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、例えば、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライシング因子、プライマー、プローブ、及び標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴヌクレオチドが含まれる。本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピンの形態で投与され得、また、構造要素、例えば、内部または末端にある突出部またはループを含有し得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、投与された時点で１つ以上の酵素または構造タンパク質の作用を誘出して標的核酸の改変をもたらし得る。
そのような酵素の１つの非限定的な例は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞ヌクレアーゼであるＲＮアーゼＨである。「ＤＮＡ様」である一本鎖アンチセンス化合物がＲＮアーゼＨを誘出することが当技術分野で知られている。それゆえ、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド媒介阻害の効率を大幅に増強する。同様の役割が他のリボヌクレアーゼ、例えばＲＮアーゼＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＬファミリーの酵素において仮定されている。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子の導入は、遺伝子及びその関連遺伝子産物の機能の強力かつ特異的なアンチセンス媒介低減を誘導することが示されている。この現象は、植物及び動物の両方において起こり、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシングとの進化的な関わりがあると考えられている。動物においてｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングをもたらし得ることの最初の証拠が１９９５年に線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの研究から得られた（Ｇｕｏ ａｎｄ Ｋｅｍｐｈｅｕｓ，１９９５）。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）は、ｄｓＲＮＡの主要な干渉作用が転写後に起こることを示した。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への曝露の結果として生じる、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいて定義された転写後アンチセンス機序は、それ以来、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれてきた。この用語は、内在性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的な低減につながるｄｓＲＮＡの導入を伴うアンチセンス媒介遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｈ，１９９８）。近年になってそれは実際に、ＲＮＡｉの強力な誘導因子であるｄｓＲＮＡのアンチセンス極性の一本鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，２００２）。
当業者であれば、実験を必要以上に行うことなく、本開示の方法に有用となるアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定することができるであろう。
修飾ヌクレオシド間リンケージ（主鎖）
本開示のアンチセンス化合物には、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間リンケージを有するオリゴヌクレオチドが含まれる。修飾主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、主鎖中にリン原子を保持しているもの、及び主鎖中にリン原子を有しないものが含まれる。
中にリン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホナート、例えば、３’－アルキレンホスホナート、５’アルキレンホスホナート及びキラルホスホナート、ホスフィナート、ホスホロアミダート、例えば３’－アミノホスホロアミダート及びアミノアルキルホスホロアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスホナート、ならびに通常の３’－５’リンケージを有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類縁体、及び１つ以上のヌクレオチド間リンケージが３’から３’へ、５’から５’へまたは２’から２’へのリンケージとなった逆極性を有するものが挙げられる。逆極性を有するオリゴヌクレオチドは、３’最末端ヌクレオチド間リンケージに単一の３’から３’へのリンケージ、すなわち、脱塩基したもの（核酸塩基がないかまたはその代わりにヒドロキシル基を有するもの）であり得る単一の逆位ヌクレオシド残基を含む。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。
上記リン含有リンケージの調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ３，６８７，８０８、ＵＳ４，４６９，８６３、ＵＳ４，４７６，３０１、ＵＳ５，０２３，２４３、ＵＳ５，１７７，１９６、ＵＳ５，１８８，８９７、ＵＳ５，２６４，４２３、ＵＳ５，２７６，０１９、ＵＳ５，２７８，３０２、ＵＳ５，２８６，７１７、ＵＳ５，３２１，１３１、ＵＳ５，３９９，６７６、ＵＳ５，４０５，９３９、ＵＳ５，４５３，４９６、ＵＳ５，４５５，２３３、ＵＳ５，４６６，６７７、ＵＳ５，４７６，９２５、ＵＳ５，５１９，１２６、ＵＳ５，５３６，８２１、ＵＳ５，５４１，３０６、ＵＳ５，５５０，１１１、ＵＳ５，５６３，２５３、ＵＳ５，５７１，７９９、ＵＳ５，５８７，３６１、ＵＳ５，１９４，５９９、ＵＳ５，５６５，５５５、ＵＳ５，５２７，８９９、ＵＳ５，７２１，２１８、ＵＳ５，６７２，６９７及びＵＳ５，６２５，０５０が挙げられるが、これらに限定されない。
中にリン原子を含んでいない修飾オリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間リンケージ、混合したヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間リンケージ、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間リンケージによって形成された主鎖が挙げられる。これらには、（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）モルホリノリンケージを有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホナート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合したＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。
上記オリゴヌクレオチドの調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ５，０３４，５０６、ＵＳ５，１６６，３１５、ＵＳ５，１８５，４４４、ＵＳ５，２１４，１３４、ＵＳ５，２１６，１４１、ＵＳ５，２３５，０３３、ＵＳ５，２６４，５６２、ＵＳ５，２６４，５６４、ＵＳ５，４０５，９３８、ＵＳ５，４３４，２５７、ＵＳ５，４６６，６７７、ＵＳ５，４７０，９６７、ＵＳ５，４８９，６７７、ＵＳ５，５４１，３０７、ＵＳ５，５６１，２２５、ＵＳ５，５９６，０８６、ＵＳ５，６０２，２４０、ＵＳ５，６１０，２８９、ＵＳ５，６０２，２４０、ＵＳ５，６０８，０４６、ＵＳ５，６１０，２８９、ＵＳ５，６１８，７０４、ＵＳ５，６２３，０７０、ＵＳ５，６６３，３１２、ＵＳ５，６３３，３６０、ＵＳ５，６７７，４３７、ＵＳ５，７９２，６０８、ＵＳ５，６４６，２６９及びＵＳ５，６７７，４３９が挙げられるが、これらに限定されない。
ホスホロジアミダートモルホリノ（ＰＭＯ）では、オリゴヌクレオチド主鎖中のホスホジエステル（ＰＯ）リンケージが非イオン性ホスホロジアミダートリンケージで置き換えられており、ＰＯに対する耐性につながっている。他のＡＳＯタイプは、広範なヌクレアーゼに対する耐性をもたらすＰＳ修飾を有し、ＲＮアーゼＨ活性を支援し、タンパク質結合性を向上させ、これが組織取込みも改善する。モルホリノは、より高い標的親和性をもたらしヌクレアーゼ回避を容易にするリボース糖に対する独特の修飾を有するオリゴヌクレオチドでもある。
ホスホロチオート（ＰＳ）ＡＳＯは大抵、各々２つの別個な立体化学配置を有するキラルＰＳ中心に関して立体的に無秩序であり、１９個のリンケージを有する２０ｍｅｒのＡＳＯについて２つの立体異性体（Ｒｐ及びＳｐ）を可能にしている。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＲｐ立体アイソフォームである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはＳｐ立体アイソフォームである。
修飾糖及びヌクレオシド間リンケージ
本開示のアンチセンス化合物には、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間リンケージ（すなわち主鎖）が両方とも新たな基に置き換わっているオリゴヌクレオチド模倣体が含まれる。標的核酸とのハイブリダイゼーションのための核酸塩基単位は維持される。
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖－主鎖は、主鎖、詳しくはアミノエチルグリシン主鎖を含有するアミドに置き換わっている。核酸塩基は保持されており、直接的または間接的に主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ５，５３９，０８２、ＵＳ５，７１４，３３１及びＵＳ５，７１９，２６２が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＮＡ化合物についてのさらなる教示事項はＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１の中に見つかり得る。
本開示のアンチセンス化合物にはまた、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチド、ならびにヘテロ原子主鎖、例えば、ＵＳ５，４８９，６７７の－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖としても知られる］、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、及び－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－［ここで、天然ホスホジエステル主鎖は－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ２－として表される］、及びＵＳ５，６０２，２４０のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。
本開示のアンチセンス化合物にはまた、ＵＳ５，０３４，５０６のモルホリノ主鎖構造を有するオリゴヌクレオチドも含まれる。
修飾糖
本開示のアンチセンス化合物には、１つ以上の置換糖部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。
例としては、以下：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを２’位置に含むオリゴヌクレオチドが挙げられ、ここで、アルキル、アルケニル及びアルキニルは、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、またはＣ２～Ｃ１０アルケニルもしくはアルキニルで置換されていてもよいし置換されていなくてもよい。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下：Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２のうちの１つを２’位置に含み、式中のｎ及びｍは１～約１０である。修飾オリゴヌクレオチドさらなる例としては、以下のうちの１つを２’位置に含むオリゴヌクレオチドが挙げられる：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、及び類似する特性を有する他の置換基。
一実施形態では、修飾は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらなる実施形態では、修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる）、または２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－アリル（２’－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。２’修飾は、アラビノ（上向き）配置、またはリボ（下向き）配置であり得る。一実施形態では、２’－アラビノ修飾は２’－Ｆである。
同様の修飾が、オリゴヌクレオチド上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上または２’－５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位置、及び５’末端ヌクレオチドの５’位置においてなされていてもよい。
オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣体、例えばシクロブチル部分を有していてもよい。
そのような修飾糖構造の調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ４，９８１，９５７、ＵＳ５，１１８，８００、ＵＳ５，３１９，０８０、ＵＳ５，３５９，０４４、ＵＳ５，３９３，８７８、ＵＳ５，４４６，１３７、ＵＳ５，４６６，７８６、ＵＳ５，５１４，７８５、ＵＳ５，５１９，１３４、ＵＳ５，５６７，８１１、ＵＳ５，５７６，４２７、ＵＳ５，５９１，７２２、ＵＳ５，５９７，９０９、ＵＳ５，６１０，３００、ＵＳ５，６２７，０５３、ＵＳ５，６３９，８７３、ＵＳ５，６４６，２６５、ＵＳ５，６５８，８７３、ＵＳ５，６７０，６３３、ＵＳ５，７９２，７４７及びＵＳ５，７００，９２０が挙げられるが、これらに限定されない。
さらなる糖の修飾としては、２’－ヒドロキシル基が糖環の３’または４’炭素に結合しておりそれによって二環式糖部分を形成しているロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる。一実施形態では、リンケージは、２’酸素原子と４’炭素原子とに架橋しているメチレン（－ＣＨ２－）ｎ基であり、式中のｎは１または２である。ＬＮＡ及びその調製はＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
天然及び修飾核酸塩基
本開示は、核酸塩基修飾または置換を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中で使用する場合、「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。
修飾核酸塩基には、他の合成及び天然核酸塩基、例えば、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６－メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２－プロピル及び他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニル（－ＣＣ－ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシ及び他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル及び他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、ならびに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンなどが含まれる。
さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミジノ［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、Ｇ－ｃｌａｍｐ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）などが挙げられる。
修飾核酸塩基には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン及び２－ピリドンに置き換わったものも含まれ得る。さらなる核酸塩基としては、ＵＳ３，６８７，８０８に開示されているもの、Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９０）に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって開示されたもの、及びＹ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ １５：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されたものが挙げられる。
これらの核酸塩基のうちのいくつかは、オリゴヌクレオチドの結合親和性を向上させるのに特に有用である。これらには、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、ならびにＮ－２、Ｎ－６及びＯ－６置換プリン、例えば、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル及び５－プロピニルシトシンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二本鎖安定性を０．６～１．２ Ｃ向上させることが示されている。一実施形態では、これらの核酸塩基置換を２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせる。
上記修飾核酸塩基のいくつか及び他の修飾核酸塩基の調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ３，６８７，８０８、ＵＳ４，８４５，２０５、ＵＳ５，１３０，３０２、ＵＳ５，１３４，０６６、ＵＳ５，１７５，２７３、ＵＳ５，３６７，０６６、ＵＳ５，４３２，２７２、ＵＳ５，４５７，１８７、ＵＳ５，４５９，２５５、ＵＳ５，４８４，９０８、ＵＳ５，５０２，１７７、ＵＳ５，５２５，７１１、ＵＳ５，５５２，５４０、ＵＳ５，５８７，４６９、ＵＳ５，５９４，１２１、ＵＳ５，５９６，０９１、ＵＳ５，６１４，６１７、ＵＳ５，６４５，９８５、ＵＳ５，８３０，６５３、ＵＳ５，７６３，５８８、ＵＳ６，００５，０９６、ＵＳ５，６８１，９４１及びＵＳ５，７５０，６９２が挙げられるが、これらに限定されない。
結合体
本開示のオリゴヌクレオチド化合物は、アンチセンス化合物の活性、細胞内分布または細胞内取込みを増強する１つ以上の部分または基に結合体化され得る。
これらの部分または基は、第一級または第二級ヒドロキシ基などの官能基に共有結合で結合したものであってもよい。
例示的な部分または基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が挙げられる。典型的な結合体基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が挙げられる。
薬力学特性を増強する部分または基としては、取込みを改善する、分解に対する耐性を増強する及び／または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強化するものが挙げられる。
薬物動態特性を増強する部分または基としては、本開示の化合物の取込み、分布、代謝または排出を改善するものが挙げられる。代表的な部分または基は、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６及びＵＳ６，２８７，８６０に開示されている。部分または基としては、脂質部分、例えば、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールもしくはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分が挙げられるが、これらに限定されない。
キメラ化合物
当業者には理解されるであろうが、所与の化合物において全ての位置が一様に修飾されている必要はなく、実際には、単一のオリゴヌクレオチドの中に、またはオリゴヌクレオチド中の単一のオリゴヌクレオシドにさえ、上記修飾の１つよりも多くが組み込まれ得る。
本開示の化合物には、キメラオリゴヌクレオチドが含まれる。「キメラオリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つのモノマー単位、すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合にはヌクレオチドで各々構成された２つ以上の化学的に別個な領域を含有する。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する向上した耐性、増大した細胞内取込み、向上した安定性及び／または標的核酸に対する向上した結合親和性をオリゴヌクレオチドに付与するようにオリゴヌクレオチドが修飾された少なくとも１つの領域を含有する。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡ混成鎖を切断できる酵素の基質として役立ち得る。例を挙げると、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞内エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化はＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のヌクレオチド媒介阻害の効率を大幅に増強する。ＲＮＡ：ＲＮＡ混成鎖の切断は、細胞性及びウイルス性ＲＮＡを両方とも切断するＲＮアーゼＬなどのエンドリボヌクレアーゼの作用によって同様の様式で成し遂げられ得る。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、及び必要に応じて当技術分野で知られている関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって慣例的に検出され得る。
本開示のキメラアンチセンス化合物は、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド及び／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合構造体として形成されてもよい。そのような化合物も、当技術分野では混成鎖またはギャップマーと呼称されている。そのような混成構造の調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ５，０１３，８３０、ＵＳ５，１４９，７９７、ＵＳ５，２２０，００７、ＵＳ５，２５６，７７５、ＵＳ５，３６６，８７８、ＵＳ５，４０３，７１１、ＵＳ５，４９１，１３３、ＵＳ５，５６５，３５０、ＵＳ５，６２３，０６５、ＵＳ５，６５２，３５５、ＵＳ５，６５２，３５６及びＵＳ５，７００，９２２が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的なオリゴヌクレオチド
当技術分野で知られているアンチセンス基幹の例としては、モルホリノ、第１世代オリゴ、第２世代オリゴ、ギャップマー、ｓｉＲＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、またはオリゴ模倣体様ペプチド核酸が挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドは、裸であってもよいし、またはリポソーム中に配合されていてもよい。オリゴヌクレオチドは、細胞への送達手段に連結されていてもいなくてもよい。オリゴヌクレオチドは、エンドソーム脱出剤を使用するものであってもなくてもよい。
一実施形態では、アンチセンス化合物は、ＶＬＡ－４ ｍＲＮＡの３’非翻訳領域にハイブリダイズするように設計された第２世代ホスホロチオエート主鎖２’－ＭＯＥ修飾キメラオリゴヌクレオチドギャップマーである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＶＬＡ－４及びα４β７インテグリンのα４インテグリンサブユニットであるＣＤ４９をコードするＲＮＡにハイブリダイズすることによって初代ヒト細胞といくつかのヒト細胞株との両方におけるＶＬＡ－４発現を選択的に阻害する。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドを２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’ＭＯＥ）修飾リボヌクレオシド（２’－Ｏ－（２－メトキシエチルリボース）とし、５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドを、全てのシトシンが５－メチルシトシンである２’－デオキシリボヌクレオシドとし、５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドを２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドとした、７２３０ダルトンの分子量を有する３－９－８ＭＯＥギャップマートとも呼称される３’→５’ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒの１９－ナトリウム塩である。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、（配列番号１）：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
である。
オリゴヌクレオチドの実験式は、
Ｃ２３３Ｈ３２７Ｎ６０Ｏ１２９Ｐ１９Ｓ１９Ｎａ１９
である。
アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＴＬ１１０２は、本明細書中で提示されるよりも著しく高い用量で、中枢神経系障害、ＭＳに有効であることが以前に示された（Ｌｉｍｍｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ）。免疫細胞においてＶＬＡ－４を選択的に阻害する、ＶＬＡ－４のＣＤ４９ｄアルファ鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力は、ＶＬＡ－４が発現する全ての細胞に影響を与える汎ＶＬＡ－４阻害剤である抗体及びＶＬＡ－４の低分子阻害剤の投与を特徴とするＰＭＬなどの重大な安全性関連事象を防止する。
一実施形態では、全てのウラシルは５－メチルウラシル（ＭｅＵ）である。典型的には、オリゴヌクレオチドは、５－メチルウラシルではなく２－メトキシエチル修飾チミジンを使用して合成される。
一実施形態では、全てのピリミジンはＣ５メチル化されている（つまり、Ｕ、Ｔ、ＣはＣ５メチル化されている）。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドの配列は、承認されたオリゴヌクレオチド命名法によって、各Ｏ－Ｏ結合ホスホロチオエートヌクレオチド間リンケージを示して命名され得る：
２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシチジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチルグアノシリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－デオキシアデノシリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－デオキシグアノシリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－チミジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－デオキシ－５－メチルシチジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－チミジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－デオキシグアノシリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－チミジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－チミジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－チミジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－メトキシエチル－５－メチルシチジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－メトキシエチル－５－メチルシチジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－アデノシリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジリル－（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルシトシン、（３’→５’Ｏ，Ｏ－ホスホロチオイル）－２’－Ｏ－メトキシエチル－５－メチルウリジリル－１９ナトリウム塩。
オリゴヌクレオチドは、２つの別個の操作：固相合成と下流処理とに分割され得る多段プロセスによって合成され得る。最初の操作では、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列をコンピュータ制御下の固相合成装置によって組み立てる。その後の下流処理は、脱保護工程、分取逆相クロマトグラフィー精製、単離及び乾燥を含み、その結果としてオリゴヌクレオチド薬剤物質を得る。オリゴヌクレオチドの化学合成は、ホスホロアミダイトカップリング化学とそれに続く酸化的硫化を利用するものであり、３’末端が固体担体に共有結合で結合した伸長オリゴマーに対する活性化されたモノマーの逐次的カップリングを伴う。
脱トリチル化（反応ａ）－固相合成の各サイクルは、担体に結合したオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオシドの４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基である酸不安定性５’－Ｏ－４の除去から始まる。これは、酸溶液（例えばトルエン中のジクロロ酢酸（ＤＣＡ））による処理によって成し遂げられる。脱トリチル化後、次の反応に備えてアセトニトリルで洗浄することによって余分な試薬を担体から除去する。
カップリング（反応ｂ）－活性化剤（例えば、ＩＨ－テトラゾール）の存在下、担体に結合したオリゴヌクレオチドの５’－ヒドロキシ基と、その特定塩基位置に対応するホスホロアミダイト（例えば、塩基２に対してはＭＯＥ－ＭｅＣアミダイト）の溶液との反応によって鎖伸長が成し遂げられる。この結果として、入ってくるシントンと、担体に結合したオリゴヌクレオチド鎖との間に亜リン酸トリエステルリンケージが形成される。カップリング反応後、次の反応に備えてアセトニトリルで洗浄することによって担体から余分な試薬を除去する。
硫化（反応ｃ）－新しく形成された亜リン酸トリエステルリンケージを、硫黄転移試薬（例えばフェニルアセチルジスルフィド）の溶液による処理によって、対応する［Ｏ，Ｏ，Ｏ）－トリアルキルホスホロチオエートトリエステルに変換する。硫化後、次の反応に備えてアセトニトリルで洗浄することによって担体から余分な試薬を除去する。
キャッピング（反応ｄ）－任意の所与のサイクルにおいて利用可能である小さい割合の５’ヒドロキシ基は、伸長することができない。後に続くサイクルのいずれかにおいてこれらの基のカップリングは、所望の生成物からの分離が難しいプロセス関連の不純物（「ＤＭＴ－ｏｎ（ｎ－ｌ）－ｍｅｒｓ」）の形成を招くであろう。これらの不純物の形成を防止し精製を容易にするために、「キャッピング試薬」（例えば、無水酢酸及びＮ－メチルイミダゾール／アセトニトリル／ピリジン）を反応器容器内に導入してキャッピングされた配列を得る。得られた不良配列（「ＤＭＴ－ｏｆｆ ｓｈｏｒｔｍｅｒｓ」）を逆相ＨＰＬＣ精製によって所望の生成物から分離する。キャッピング反応後、次の反応に備えてアセトニトリルで洗浄することによって担体から余分な試薬を除去する。
適切な保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを使用してこの基本的な４工程のサイクルを反復することによって、保護オリゴヌクレオチド配列全体の組立てが可能になる。
主鎖脱保護（反応ｅ）－プロセスの組立て部分の完了後、（Ｏ，Ｏ，Ｏ）－トリアルキルホスホロチオエートトリエステルヌクレオチド間リンケージを保護しているシアノエチル基を、トリエチルアミン（ＴＥＡ）のアセトニトリル溶液による処理によって除去する。試薬、及びこの工程の間に生成したアクリロニトリルをアセトニトリルによるカラムの洗浄によって除去する。
担体からの切り離し及び塩基脱保護（反応ｆ）－環外アミノ基の脱保護、及び担体からの粗生成物の切り離しは、水酸化アンモニウム水とのインキュベーション（反応ｆ）によって成し遂げられる。粗製５’－Ｏ－ＤＭＴ保護生成物の精製は、逆相ＨＰＬＣによって成し遂げられる。逆相ＨＰＬＣ工程はＤＭＴ－ｏｆｆ不良配列を除去する。溶離プロファイルをＵＶ吸収分光法によって追跡評価する。ＤＭＴ－ｏｎオリゴヌクレオチド生成物を含有する画分を回収及び分析する。
酸性脱保護（反応ｇ）－５’－Ｏ－ＤＭＴ保護オリゴヌクレオチドを含有する逆相ＨＰＬＣ画分を溜めて沈降タンクに移す。いくつかの合成の精製から得られた生成物をプロセスのこの段階でまとめ合わせる。精製ＤＭＴ－ｏｎオリゴヌクレオチドを酸（例えば酢酸）で処理して、５’末端に結合しているＤＭＴ基を除去する。定められた時間にわたる酸曝露及び中和の後、オリゴヌクレオチド原薬を単離し、乾燥させる。
最終酸性脱保護工程の後、溶液を水酸化ナトリウム水の添加によって中和し、オリゴヌクレオチド原薬をエタノールの添加によって溶液から析出させる。析出物質を反応容器の底に沈澱させ、エタノール性の上清をデカントする。析出物質を精製水に再溶解させ、溶液のｐＨをｐＨ７．２～７．３に調整する。析出工程を繰り返す。析出物質を水に溶解させ、溶液を０．４５ミクロンのフィルターで濾過し、使い捨てポリプロピレン製トレイに移し、次いでそれを凍結乾燥装置に装填する。溶液を－５０℃に冷却する。一次乾燥を２５℃で３７時間行う。温度を３０℃に上昇させ、二次乾燥工程を５．５時間実施する。凍結乾燥プロセスの完了後、原薬を高密度ポリエチレン製ボトルに移し、－２００℃で保存する。
ＣＤ４９ｄ／ＶＬＡ－４を標的とする好適なさらなるアンチセンス化合物は、参照により全体が本明細書に援用されるＩｓｉｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許第６，２５８，７９０号及びＡｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｔｄに譲渡されたＵＳ２００９／００２９９３１に記載されている。ＩＴＧＡ４遺伝子転写産物を標的としてＩＴＧＡ４遺伝子におけるプレｍＲＮＡスプライシングを改変するさらなるアンチセンスオリゴマーは、例えば、参照により全体が本明細書に援用されるＭｕｒｄｏｃｈ大学の国際出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０１６／０００１５８号に開示されている。
標的核酸
アンチセンス化合物を特定の核酸に対して「標的指向化すること」は、多段プロセスであり得る。プロセスは大抵、機能を調節すべき標的核酸の同定から開始される。本開示では、標的核酸は、ＶＬＡ－４またはα４β７インテグリンのアルファ４インテグリン鎖をコードする。
標的指向化プロセスは大抵、所望の効果、例えば発現の阻害が生じるようなアンチセンス相互作用を起こすための標的核酸中の少なくとも１つの標的領域、セグメントまたは部位の決定も含む。本明細書中で使用される「領域」という用語は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能または特質を有する標的核酸の部分として定義される。標的核酸の領域の中にあるのがセグメントである。「セグメント」は、標的核酸中のより小さな部分または小部分として定義される。本明細書中で使用される「部位」は、標的核酸中の位置を意味する。
「翻訳開始コドン」は典型的には５’－ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子の中にある。対応するＤＮＡ分子では５’－ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも呼称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’－ＧＵＧ、５’－ＵＵＧまたは５’－ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’－ＡＵＡ、５’－ＡＣＧ及び５’－ＣＵＧは生体内で機能することが示されている。したがって、各場合において開始因子アミノ酸が典型的には（真核生物では）メチオニンまたは（原核生物では）ホルミルメチオニンであるとはいえ、「翻訳開始コドン」及び「開始コドン」という用語は多くのコドン配列を包含し得る。当技術分野では、真核生物及び原核生物遺伝子が２つ以上の代替開始コドンを有することがあることも知られており、それらのうちのいずれか１つは、特定の細胞種もしくは組織におけるまたは特定の一組の条件の下での翻訳開始のために優先的に利用されることがある。本明細書中で使用される「開始コドン」及び「翻訳開始コドン」という用語は、そのようなコドンの配列（複数可）にかかわらず、例えばＶＬＡ－４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を開始するために生体内で使用されるコドンまたは複数のコドンを指す。
「終止コドン」とも呼称される「翻訳停止コドン」は、３つのＲＮＡ配列：５’－ＵＡＡ、５’－ＵＡＧ及び５’－ＵＧＡ（対応するＤＮＡ分子ではそれぞれ５’－ＴＡＡ、５’－ＴＡＧ及び５’－ＴＧＡ）のうちの１つを有し得る。本明細書中で使用される「翻訳停止コドン」及び「終止コドン」という用語は、そのようなコドンの配列（複数可）にかかわらず、ＶＬＡ－４またはα４β７インテグリンのα４インテグリン鎖をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を終結させるために生体内で使用されるコドンまたは複数のコドンを指す。
「開始コドン領域」及び「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからどちらか（すなわち５’または３’）の方向に約２５～約５０連続ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。同様に、用語「終止コドン領域」及び「翻訳停止コドン領域」は、翻訳停止コドンからどちらか（すなわち５’または３’）の方向に約２５～約５０連続ヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を指す。結果として、「開始コドン領域」または「翻訳開始コドン領域」、及び「終止コドン領域」または「翻訳停止コドン領域」は全て、効果的に本開示のアンチセンス化合物の標的になり得る領域である。
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）または「コード領域」は、翻訳開始コドンと翻訳停止コドンとの間の領域を指すことが当技術分野で知られているが、効果的に標的になり得る領域でもある。一実施形態では、遺伝子のＯＲＦの翻訳開始または停止コドンを包含する遺伝子内領域が標的になり得る。
他の標的領域としては、当技術分野で翻訳開始コドンから５’方向にあるｍＲＮＡの一部を指すことが知られておりそれゆえｍＲＮＡの５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、及び当技術分野で翻訳停止コドンから３’方向にあるｍＲＮＡの一部を指すことが知られておりそれゆえｍＲＮＡの翻訳停止コドンと３’末端との間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が挙げられる。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’－５’トリホスフェートリンケージを介してｍＲＮＡの５’最末端残基に繋げられたＮ７－メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体、及びキャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。一実施形態では、５’キャップ領域が標的になる。
真核生物ｍＲＮＡ転写産物の中には直接翻訳されるものもあるが、多くのものは、翻訳される前に転写産物から切除される「イントロン」として知られる１つ以上の領域を含有する。残りの（したがって翻訳される）領域は、「エクソン」として知られ、スプライシングされ合って連続ｍＲＮＡ配列を形成する。異なる遺伝子源からの２つ（またはそれより多い）ｍＲＮＡのスプライシングのプロセスによって産生されたｍＲＮＡ転写産物は「融合転写産物」として知られる。一実施形態では、イントロン、またはスプライス部位、すなわちイントロン－エクソン接合部もしくはエクソン－イントロン接合部、または再構成もしくは欠失に起因する異常融合接合部が標的になる。ＤＮＡの同じゲノム領域から代替ＲＮＡ転写産物が産生されることがある。これらの代替転写産物は一般に「変異体」として知られる。
「プレｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムＤＮＡから産生された他の転写産物とは開始または停止位置のどちらかが異なっており、イントロン及びエクソン配列を両方とも含有する、同じゲノムＤＮＡから産生された転写産物である。スプライシング中に１つ以上のエクソンもしくはイントロン領域またはその一部が切除されると、プレｍＲＮＡ変異体はより小さい「ｍＲＮＡ変異体」を産生する。それゆえ、ｍＲＮＡ変異体は、プロセシングされたプレｍＲＮＡ変異体であり、各々の独特なプレｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として常に独特なｍＲＮＡ変異体を産生するはずである。これらのｍＲＮＡ変異体は、「代替スプライス変異体」としても知られる。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起こらない場合には、プレｍＲＮＡ変異体はｍＲＮＡ変異体と同一である。
変異体は、転写を開始または停止する代替シグナルの利用、すなわち代替開始コドンまたは終止コドンの利用によって産生され得る。代替開始コドンを利用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに由来する変異体は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替開始変異体」として知られる。代替終止コドンを利用する転写産物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替終止変異体」として知られる。代替終止変異体の１つの具体的なタイプは「ポリＡ変異体」であり、この場合、産生される複数の転写産物は、転写機構によって「ポリＡ終止シグナル」の１つが代替選択されてそれによって独特なポリＡ部位で終結する転写産物が産生されることによってもたらされる。一実施形態では、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ変異体が標的になり得る。
アンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は「標的セグメント」と呼称される。本明細書中で使用する場合、「標的セグメント」という用語は、アンチセンス化合物が指向する標的領域の少なくとも８核酸塩基の部分として定義される。理論に拘泥することを望まないが、今日、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのために利用できる標的核酸の部分に相当すると考えられている。
１つ以上の標的領域、セグメントまたは部位が同定された時点で、標的セグメントに対して十分に相補的なアンチセンス化合物、すなわち十分な特異性で十分良好にハイブリダイズして所望の効果を生じさせるアンチセンス化合物が選択される。
また、標的セグメントをその各々の相補性アンチセンス化合物と組み合わせて安定化二本鎖（二本鎖形成した）オリゴヌクレオチドを形成してもよい。そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、アンチセンス機序によって標的発現を調節し翻訳及びＲＮＡプロセシングを制御することが当技術分野で示されている。しかも、二本鎖部分は化学修飾に供され得る（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｆｉｒｅ，１９９８、Ｔｉｍｍｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｔａｂａｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ａ、Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ｂ）。例えば、各二本鎖部分は、標的に対して二本鎖のアンチセンス鎖が古典的ハイブリダイゼーションを行い、それによって標的の酵素的分解を誘発することによって、標的を阻害することが示されている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。
組成物
本開示の化合物は、他の分子、分子構造、または化合物の混合物との混合、それによる封入、それとの結合体化あるいは会合がなされて、例えば、取込み、分配及び／または吸収を支援するためのリポソーム、受容体標的化分子、経口用、直腸用、局所用などの製剤をもたらし得る。そのような取込み、分配及び／または吸収を支援する製剤の調製について教示している代表的な米国特許としては、ＵＳ５，１０８，９２１、ＵＳ５，３５４，８４４、ＵＳ５，４１６，０１６、ＵＳ５，４５９，１２７、ＵＳ５，５２１，２９１、ＵＳ５，５４３，１５８、ＵＳ５，５４７，９３２、ＵＳ５，５８３，０２０、ＵＳ５，５９１，７２１、ＵＳ４，４２６，３３０、ＵＳ４，５３４，８９９、ＵＳ５，０１３，５５６、ＵＳ５，１０８，９２１、ＵＳ５，２１３，８０４、ＵＳ５，２２７，１７０、ＵＳ５，２６４，２２１、ＵＳ５，３５６，６３３、ＵＳ５，３９５，６１９、ＵＳ５，４１６，０１６、ＵＳ５，４１７，９７８、ＵＳ５，４６２，８５４、ＵＳ５，４６９，８５４、ＵＳ５，５１２，２９５、ＵＳ５，５２７，５２８、ＵＳ５，５３４，２５９、ＵＳ５，５４３，１５２、ＵＳ５，５５６，９４８、ＵＳ５，５８０，５７５及びＵＳ５，５９５，７５６が挙げられるが、これらに限定されない。
本開示の化合物は、薬学的に許容される担体の中に含まれた状態で投与され得る。「薬学的に許容される担体」という用語は、対象、特に哺乳動物、なおいっそう特にヒトに投与されたときにアレルギー反応、中毒反応または他の副反応を生じさせない分子実体を指す。薬学的に許容される担体は固体または液体であり得る。薬学的に許容される担体の有用な例としては、本開示の活性薬剤の活性に影響を及ぼさない希釈剤、溶媒、界面活性剤、賦形剤、懸濁化剤、緩衝剤、滑沢剤、アジュバント、ビヒクル、乳化剤、吸収剤、分散媒、コーティング剤、安定化剤、保護コロイド、粘着剤、増粘剤、チキソトロピック剤、浸透剤、金属イオン封鎖剤、等張化剤及び吸収遅延剤が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、医薬担体は注射用水（ＷＦＩ）であり、医薬組成物はｐＨ７．４、７．２～７．６に調整される。
一実施形態では、塩はナトリウムまたはカリウム塩である。
オリゴヌクレオチドは、キラル（不斉）中心を含有していてもよく、または分子が全体としてキラルであってもよい。個々の立体異性体（エナンチオマー及びジアステレオマー）及びこれらの混合物は本開示の範囲に含まれる。
本開示の化合物は、投与された時に生物活性代謝産物を（直接的または間接的に）提供することができる薬学的に許容される塩、エステルもしくはエステルの塩、立体異性体、または他の任意の化合物であり得る。
本明細書中で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の所望の生物活性を保持しており、投与された時に望ましくない毒性作用を与えない、化合物の生理学的及び薬学的に許容される塩を指す。薬学的に許容される塩及びその使用の例はＵＳ６，２８７，８６０にさらに記載されている。
本開示のオリゴヌクレオチド化合物は、プロドラッグ、プロドラッグの立体異性体もしくは薬学的に許容される塩、または他の生物学的等価体であり得る。本明細書中で使用される「プロドラッグ」という用語は、投与された時に内在性酵素または他の化学物質及び／または条件の作用によって活性形態（すなわち薬物）に変換される、不活性形態で調製された治療剤を指す。特に、本開示のアンチセンス化合物のプロドラッグ形態は、ＷＯ９３／２４５１０、ＷＯ９４／２６７６４及びＵＳ５，７７０，７１３に開示される方法によるＳＡＴＥ［（Ｓアセチル－２－チオエチル）ホスフェート］誘導体として調製される。
プロドラッグは、例えば、体内で例えば血中での加水分解によって医学的作用を有するその活性形態に変換され得る。薬学的に許容されるプロドラッグは、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｐｒｏｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ（１９７６）；“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｍｇｓ”ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５、及びＥｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，ｅｄ．，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７に記載があり、参照によりこれらを本明細書に援用する。有機化学分野における技能を有する者であれば、多くの有機化合物が、それらを中で反応させるまたは析出もしくは結晶化させる溶媒との複合体を形成し得ることを理解するであろう。これらの複合体は「溶媒和物」として知られる。例えば、水との複合体は「水和物」として知られる。
在来療法
在来療法は、歩行可能患者におけるＤＭＤ治療の主力である。「コルチコステロイド」は、天然に存在するコルチコステロイドの作用を模倣するまたは増大させるステロイドの一般化学構造を有するいくつかの合成のまたは天然に存在する物質のいずれか１つを指す。合成コルチコステロイドの例としては、プレドニゾン、プレドニゾロン（プレドニゾロンの前駆体であるプレドニゾン、メチルプロ土にゾロンを含む）、デキサメタゾントリアムシノロン、ブデソニド及びベタメタゾンが挙げられる。
一実施形態では、ＭＤを有するヒト対象におけるＭＤのための本発明の治療は、有効量の治療剤、例えばＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ鎖）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象に投与することを含み、さらに、有効量の第２医薬、すなわちコルチコステロイドを対象に投与することを含む。一実施形態では、コルチコステロイドはプレドニゾン（またはプレドニゾン等価体）、デフラザコート（誘導体またはプレドニゾロン）である。他のコルチコステロイドは上に言及されるように当技術分野で知られている。
本明細書での併用投与には、別個の製剤（または単一の医薬製剤）を使用する共投与、及びいずれかの順序での連続投与が含まれるが、両方（または全て）の活性薬剤がそれらの生物活性を同時に働かせる間の期間が存在するのが通常である。
標準用量のコルチコステロイド治療は、歩行可能である間はＤＭＤ患者に使用される、というのも、それは歩行を維持するのにいくらかの効果があることが数名の患者において示されているからである。しかしながら、標準用量（０．７５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾンまたは０．９ｍｇ／ｋｇ／日のデフラザコート）での長期の治療は、筋萎縮症を招く可能性及び／または他の副作用を有する可能性がある。ＣＳ、時には歩行喪失時に続けていた低減されたＣＳのｍｇ／ｋｇ／日の用量である固定用量でのＣＳを受け続ける場合もあるし、または副作用のため及び／または有益性の非存在のためにＣＳ治療が中止される場合もある、非歩行可能ＤＭＤ患者においては、標準治療が存在しない。本明細書において提案され示されるように、ＣＤ４９ｄに対するアンチセンスによる治療は、低減されたレベルのコルチコステロイド治療を含めたコルチコステロイド治療と併せて、非歩行可能対象において筋肉機能の進行を軽減したかまたは遅延させた。そのような対象においてＣＳ治療が何らかの利益をもたらしていたのか否かは不明であり、よってこれはＡＴＬ１１０２による単剤療法または併用治療を支持する。
本明細書中で使用する場合、療法の施行の文脈において「併用」という用語は、１つより多い療法または治療剤の使用を指す。「組み合わせて」という用語の使用は、療法または治療剤を対象に施行する順序を制限するものではない。療法または治療剤は、対象への第２の療法または治療剤の施行の前にか、それに対して付随的にか、またはその後に施行され得る。
投与
一実施形態では、本開示のアンチセンス化合物は全身投与される。本明細書中で使用する場合、「全身投与」は、経腸か非経口かのどちらかである投与経路である。
本明細書中で使用する場合、「経腸」は、消化管の任意の部分が関与する投与形態を指し、錠剤、カプセル剤またはドロップ剤の形態での例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの経口投与；経胃栄養チューブ、経十二指腸栄養チューブまたは胃瘻造設術；及び坐剤または浣腸剤形態での例えばアンチセンス化合物の直腸投与を含む。
本明細書中で使用する場合、「非経口」には、注射または輸注による投与が含まれる。例としては、静脈内（静脈の中）、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の中）、心臓内（心臓の中）、皮下（皮膚の下）、骨内（骨髄の中）への輸注、皮内（皮膚自体の中）、クモ膜下腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹膜の中への輸注または注射）、膀胱内（膀胱の中への輸注）経皮（無処置皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、吸入が挙げられる。
一実施形態では、医薬組成物の投与は皮下に行われる。
アンチセンス化合物は、単回用量として、または定期的な、例えば１日１回、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３もしくは１４日に１回、週１回、週２回、週３回、または２週間ごともしくは３週間ごとの反復投与として投与され得る。
一実施形態では、投与は、週に１～３回、または１週間、２週間、３週間、４週間に１回、または２ヶ月に１回行われる。
一実施形態では、投与は週に１回行われる。
一実施形態では、低用量を３～６ヶ月にわたって、例えば、約２５～５０ｍｇ／週を少なくとも３～６ヶ月にわたって投与し、その後１２ヶ月目まで長期的に投与する。
例示的な用量は約１０～３００ｍｇである。例示的な用量としては、２５、５０、１００、１５０、２００ｍｇが挙げられる。例示的な用量としては、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ（約５０～１００ｍｇ）、及び３ｍｇ／ｋｇ（１００～２００ｍｇ）、及び４．５ｍｇ／ｋｇ（１５０～３００ｍｇ）が挙げられる。一実施形態では、用量は週に１回投与される。このように、一実施形態では、典型的には体重が約２５～６５ｋｇである対象に、およそ１０～３０、２０～４０、または２０～２８ｍｇの低用量が投与され得る。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドが投薬１回あたり５０ｍｇ未満または３０ｍｇ未満または約２５ｍｇの用量で投与されて治療効果を生む。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドＡＴＬ１１０２が用量１回分あたり５０ｍｇ未満または３０ｍｇ未満または約２５ｍｇの用量で投与されて治療効果を生む。
一実施形態では、治療効果、例えば進行遅延は、１回目の用量の投与から約３ヶ月以内にみられる。本明細書中で使用される「治療的有効量」という用語は、投与条件の下で例えば、対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善するかまたは筋ジストロフィーの進行を遅延させるのに十分な、あるいは対象においてジストロフィー性筋線維の１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善するかまたは筋ジストロフィーの進行を遅延させるのに十分な、アンチセンス化合物の用量を指す。
別の実施形態では、投与は、２８９０ｎｇ／ｍＬよりも多く一実施形態では約１０，０００～１１，０００ｎｇ／ｍＬのオリゴヌクレオチドのＣｍａｘをヒト対象の血漿においてもたらすのに有効である。
別の実施形態では、投与は、少なくとも２．５ｎｇ／ｍＬ、一実施形態では少なくとも２０ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも４５ｎｇ／ｍＬのオリゴヌクレオチドのＣｍｉｎまたはＣｔｒｏｕｇｈをヒト対象の血漿においてもたらすのに有効である。
投薬計画または療法のクールに関する決定は、負荷投与量及び／または維持投与量、投薬頻度、投薬継続期間、特定集団のため及び他の治療薬組成物との共投与のための用量調整などの因子を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの所与のクールのために本明細書では療法の途中及び後の両方においてＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の低下したレベルを示す対象を同定する。これらの対象は療法に応答することができず、これは、血液試料において最後の投薬からおよそ７日以内での投薬完了後のＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の回復の未達成状況を評価することによって検出または追跡評価され得る。むしろ、これらの対象は治療後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞レベルの変化を示さず、またはそのさらなる低下さえ示す。そして彼らは急速に、ＰＵＬ２．０によって評価され得る筋肉動作性の低下を示す。これらの対象は、例えば単剤療法のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量を増加もしくは減少させることによって、及び／またはコルチコステロイドの用量を増加もしくは減少させるかまたはコルチコステロイドを変更することによって、用量計画が調整され得る。
ヒト対象の血液または筋肉においてＴ細胞ＶＬＡ－４のレベルを低下させる、ＶＬＡ－４インテグリンに対する阻害オリゴヌクレオチドによる筋ジストロフィーの治療を証明すべく、試験を行う。ＶＬＡ－４のレベルの低下は、血液、筋肉または肺を含めた１つ以上の臓器のＴ細胞のサブセットにおいて検出され得る。
コルチコステロイドを受けている対象におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を測定するために、対象はオリゴヌクレオチド投与のおよそ２４時間前にコルチコステロイドが中止される（つまり、当日に最後の用量を受ける）。これは、投与の２４時間後には循環免疫細胞に影響を与えるほどの高いレベルで血流中に存在していないものであるコルチコステロイドの非存在下で免疫細胞におけるＶＬＡ－４インテグリンのＣＤ４９ｄアルファ鎖に対する阻害アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を評価することを可能にする。
ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの評価－細胞は、フローサイトメトリー、または当技術分野で知られている多くの技術の１つによって評価され得る。免疫クロマトグラフィー、及び微小流体に基づく手法はポイント・オブ・ケアのために広く利用されている。サイトメトリーにはチップ型サイトメトリーが含まれ、カートリッジ技術（ＷＯ１１１２８８９３）も利用可能である。対象からの試料においてＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の濃度を評価するために、ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルを直接的または間接的に測定する。細胞数の直接的な評価方法は、当技術分野で知られており、様々な技術によってＣＤ４９ｄのマーカー／複数のマーカーの量を試料において定量することならびにＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量することを含む。マーカーの平均発現レベル、細胞内及び細胞内レベルが評価され得る。典型的には、方法は、対象からの生体試料を、得られた生体試料の中のＣＤ４９ｄに特異的に結合する試薬と接触させることを含む。典型的には、試薬は、モノクローナル抗体もしくはその結合性断片、アプタマー、または抗体模倣体である。Ｗ０１３０３６６２０には、試料中の標的細胞を検出することについての記載がある。ＷＯ０６０５８８１６には、一体型ソフトウェア－蛍光マイクロビーズ標準システムの自動実施のためのキットについての記載があり、上記キットは、１つ以上の蛍光色素で標識付けされたモノクローナル抗体；抗体の標識付けのために使用される同じ１つ以上の蛍光色素を含むマイクロビーズ；及びコンピュータでの実行のためのソフトウェアプログラムを含有するコンピュータ可読非一時的媒体を含む。典型的には、ソフトウェアプログラムは、特異的な多くのマイクロビーズ標準及びモノクローナル抗体の蛍光標識混合物に適合しており、マイクロビーズの各集団の蛍光強度についての情報を含む。ソフトウェアプログラムは、懸濁しているマイクロビーズ、及び細胞に結合した蛍光標識抗体において情報をフローサイトメータから取り込み、データを解析し、曲線を滑らかにし、新しいパラメータを計算し、品質制御の評価尺度を提供し、マイクロビーズ及び蛍光標識抗体の消光を示し、ソフトウェアプログラムは、操作者に警告を発してさらに問合せをユーザーに行って、使用されるアッセイロット及び検体分析の一部として採用されるフローサイトメトリー機器のタイプを確認し、ソフトウェアプログラムは、結果を蓄積ファイル履歴に記録して機器の性能についての包括的文書を提供する。ソフトウェアプログラムは、異なる生産ロット間での蛍光発現の偏りまたは差を、ロット間での回帰解析によって決定される係数、及びマイクロビーズに帰属される蛍光値の変化によってソフトプログラム内で正規化することができ、ソフトウェアプログラムは、異なるマイクロビーズ生産ロット及び蛍光標識抗体生産ロットのデータの比較を異なる生体試料において監視して、マイクロビーズが蛍光強度の要求される範囲に入っているか否かを判定してロット間の不正確性のレベルが５パーセント未満となることを保証し、所望により、検体細胞に結合された蛍光抗体の実際の量を外部標準の使用によって決定する。
別の方法は、細胞のバイオマーカー－形態プロファイルを検出するための技術について記載したＷＯ１７０６２６４６に記載されており、ここでは、細胞を官能化ナノ粒子種に接触させ、各官能化ナノ粒子種は、バイオマーカー結合性部分を含んでおり、バイオマーカー結合性部分を含む官能化ナノ粒子種とその各々のバイオマーカーとの結合によってナノ粒子－細胞複合体を形成する。複合体は固定化され、落射照射またはエバネセント光によって照射され、観察される各複合体化官能化ナノ粒子からの共鳴光散乱を集光して各撮像細胞のバイオマーカーシグネチャを得る。さらなる染色は、細胞の形態プロファイルを評価することを可能にする。
一実施形態では、体重２５ｋｇ超の１０～１８歳の非歩行可能ＤＭＤ患者において無作為化二重盲検プラセボ対照試験を行う。参加者を群１つあたりおよそ２５名の患者の４つの群に無作為化し、５２週にわたって、３つの群には週１回の２５ｍｇ、週１回の５０ｍｇ、または週１回の１００ｍｇのＡＴＬ１１０２をそれぞれ与え、最後の群にはプラセボを与える。ＡＴＬ１１０２またはプラセボは、コルチコステロイド（ＣＳ）、プレドニゾロンまたはデフラザコートによる任意の既存治療に重ねて、５２週にわたって週１回投与される。
試験の全ての参加者に、６ヶ月間（２６週間）の非盲検延長を開始することを勧めることになる。５２週目にベースラインと比較してＰＵＬ２．０スコア（または等価な臨床スコア）に基づく応答性を示した、非盲検試験で継続される患者は、ＡＴＬ１１０２及びＣＳの処置を受けたままにされ得る。５２週目にベースラインと比較してＡＴＬ１１０２＋／－ＣＳ処置に対する非応答性を示し、ベースラインと比較して例えば－２の、－３の、またはそれより低いＰＵＬ２．０スコアを有する患者は、６ヶ月間（２６週間）の非盲検試験のためのより高い用量かより低い用量かのどちらかの異なる用量のＡＴＬ１１０２に供され得る。
６ヶ月（２６週間）の非盲検治療の後、ＰＵＬ２．０応答性に関して７８週目の患者のＰＵＬ２．０を５２週目のＰＵＬ２．０と比較することになる。７８週目の循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の数は、上に概略を示したＰＵＬ２．０結果から４週間後である８２週目（いかなるＣＳの投与よりも前）の数と比較されることになる。ＡＴＬ１１０２に対する非応答性を示し、－２の、－３の、またはそれより低いＰＵＬ２．０スコアを有する患者は、さらなる経過観察においてＰＵＬ２．０応答性をさらに追跡評価しながら、ＡＴＬ１１０２用量を変更するかまたは彼らのＣＳ用量を例えば標準用量の３分の２もしくは例えば標準用量の３分の１に調整する選択肢を有することになる。
臨床評価のための他の副次評価項目には、安全性の評価尺度、及び有効性の評価尺度、例えば、ミオグリップ及びミオピンチによって測定される筋肉強度、呼吸マーカー、ＥＫ、ＥＫ２、生活の質、ならびに筋線維症、脂肪炎症－浮腫及び萎縮症のＭＲＩ評価が含まれる。これらの評価尺度のいずれか１つ以上は、ＰＵＬ２．０応答性及びＰＵＬ２．０評価後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋変化に基づいてＡＴＬ１１０２用量またはＣＳ用量を調整する前に考慮され得る。
投薬計画は本開示に従って改変されてもよく、例えば、当業者によって予想されるように、ベースラインと比較したときのＰＵＬ２．０及びＰＵＬ２．０後の循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋細胞変化を評価する前の３ヶ月間、６ヶ月間、１年間または１年超にわたる投薬、ならびにそれに対応させたＡＴＬ１１０２用量の調整が包含される。他の改変としては、ＰＵＬ２．０を評価した最後の投薬から１、２、３もしくは４週間後またはそれより後に循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋細胞を評価すること、それらをチップ上でのフローサイトメトリーによって測定することが挙げられる。
番号を振って本発明のジストロフィーの１つの態様を記すと以下のとおりになる。
１．筋ジストロフィーの治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量の構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）前記オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む阻害オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を、対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善するまたは筋ジストロフィーの進行を遅延させるのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で前記対象に周期的に投与することを含む、前記方法。
２．筋ジストロフィーを有する対象において四肢機能などの筋肉機能を改善するまたは四肢機能などの筋肉機能の低下を遅延させる方法であって、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量の構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）前記オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含むオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を、対象において四肢機能などの筋肉機能を改善するのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で前記対象に周期的に投与することを含む、前記方法。
３．筋ジストロフィーを有する対象において筋肉もしくは四肢の強度などの筋肉動作性を改善するまたは筋肉もしくは四肢の強度などの筋肉動作性の低下を遅延させる方法であって、薬学的に許容される担体、及び治療的有効量の構造：
５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
〔ここで、
ａ）前記オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕、
またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含むオリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を、筋肉（例えば四肢）強度などの筋肉動作性を改善するまたは筋肉（例えば四肢）強度などの筋肉動作性の低下を遅延させるのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で前記対象に周期的に投与することを含む、前記方法。
４．前記周期的投与が、１週間または２週間または１ヶ月に１回または２回または３回である、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
５．前記治療的有効量が１０ｍｇ～３００ｍｇである、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
６．前記治療的有効量が、２５ｍｇ～５０ｍｇ、５０ｍｇ～１００ｍｇ、１００ｍｇ～２００ｍｇ、及び１５０ｍｇ～３００ｍｇからなる群から選択される、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
７．前記オリゴヌクレオチドがナトリウムまたはカリウム塩である、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
８．前記医薬担体がＷＦＩであり、前記組成物がｐＨ７．２～７．６に調整される、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
９．前記ＭＤが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、先天性筋ジストロフィー（福山型先天性ＭＤ及びミオシン欠損を伴う先天性ＭＤを含めたＣＭＤ）、顔面肩甲上腕型、眼咽頭型、エメリー・ドレイフス型及び遠位型筋ジストロフィーからなる群から選択される、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
１０．前記ＭＤが、ジストロフィン遺伝子における突然変異を伴うものである、請求項９に記載の方法。
１１．前記対象が、ＭＤと診断され、歩行可能または非歩行可能である、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
１２．前記対象が少年期または思春期の１０歳以上の男児である、請求項１１に記載の方法。
１３．前記組成物が皮下投与される、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
１４．前記投与が、コルチコステロイド治療と組み合わせて行われる、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。
１５．前記コルチコステロイドが低用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
実施例１
一実施形態では、ＤＭＤを有する非歩行可能な少年期の（または思春期の）１０歳以上の男児に毎週約１．５ｍｇ／ｋｇ（約５０～１００ｍｇ）及び３ｍｇ／ｋｇ（１００～２００ｍｇ）及び４．５ｍｇ／ｋｇ（１５０～３００ｍｇ）のＡＴＬ１１０２を１２週目まで投与する。投与されたオリゴヌクレオチドが例えば運動／筋肉機能に及ぼす影響、及び炎症マーカーを測定する。筋変性－再生及び線維症のマーカーも評価する。マーカーは、現位置または試料、例えば血漿、尿または筋肉生検において検出され得る。吸気及び呼気圧、咳の最大流量、ＦＶＣを評価して呼吸能の変化を見極める。正規化された上肢到達可能表面積の変化パーセント、上肢動作性評価スコアの変化パーセント、上肢の患者報告アウトカム評価尺度（ＰＲＯＭ－ＵＬ）機能容量スコアの変化パーセントを用いて筋肉機能を評価する。生活の質についての質問票は治療の効果を見極める上で有用である。
コルチコステロイドは、毎日またはより少ない頻度で投与され得る。歩行可能ＤＭＤ患者のための標準治療として、３分の２の標準用量、半分の用量または３分の１の用量で、プレドニゾロンは０．７５ｍｇ／ｋｇ／日、デフラザコートは０．９ｍｇ／ｋｇ／日で投与され得る。
実施例２
一実施形態では、ＤＭＤを有する４～１１歳の歩行可能な小児男児に約１．５ｍｇ／ｋｇ（約１０～１００ｍｇ）及び３ｍｇ／ｋｇ（２０～２００ｍｇ）及び４．５ｍｇ／ｋｇ（３０～３００ｍｇ）のＡＴＬ１１０２を１２週目まで毎週投与する。投与されたオリゴヌクレオチドが例えば運動／筋肉機能に及ぼす効果、及び炎症マーカーを決定する。歩行可能な小児男児は、歩行が良好であることも歩行が芳しくないことも得る。歩行能力喪失の維持または軽減は、当業者に知られている方法によって評価され得る。
実施例３
一実施形態では、１０名の非歩行可能な１２～１８歳のＤＭＤ患者に、週１回の３ｍｇ／ｋｇの出発用量で４週間にわたってＡＴＬ１１０２を与える。最初の５名の患者は３ｍｇ／ｋｇ／週で投薬をさらに４週間継続し、残りの５名の患者については用量を４週間にわたって４．５ｍｇ／ｋｇ／週（２．２５ｍｇ／ｋｇを週２回）に漸増させる。８週間の治療の後、４週間の追跡評価期間を実施する。治療及び追跡評価期間中、評価は、ベースライン時、２週目、４週目、６週目、８週目、ならびに１０及び１２週目に行われる。主要活性アウトカムは、ベースラインと比較したときの治療の４週目及び８週目の循環しているリンパ球、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにｈｉＣＤ４９ｄ Ｔ細胞の数、ならびに注射部位反応、血小板変化、肝酵素ＧＧＴ－ビリルビン、ＣＲＰ及びアルブミン、Ａ／Ｇ率変化を含めた安全性を評価することである。副次評価項目臨床評価は、上肢機能の強度、ならびに機能容量、生活の質、ならびに呼吸マーカー、ならびに筋線維症、脂肪炎症－浮腫及び萎縮症のＭＲＩ評価、ならびに薬物動態の評価尺度である。探索的アウトカム評価尺度には、血清／血漿バイオマーカー応答、例えば、筋肉炎症筋線維症、筋アポトーシス／変性及び筋肉再生に関連するもの、例えば、サイトカイン、ならびにプロテオミクス、及び一連の単核細胞ＲＮＡ、及びエクソソームＲＮＡを含めることになる。
実施例４
阻害オリゴヌクレオチドの低用量投与
一実施形態では、９名の体重２５～６５ｋｇの１０～１８歳の非歩行可能なＤＭＤ患者に、２５ｍｇの出発用量のＡＴＬ１１０２を週１回、２４週間にわたって与える。２４週間の治療の後、８週間の追跡評価期間を実施する。治療及び追跡評価期間中、評価は、ベースライン時、及び治療期間中の２週間ごと、及び治療後追跡評価期間中の４週間ごとに行われる。主要活性アウトカムは、ベースラインと比較したときの治療の４週目及び８週目の循環しているリンパ球、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにｈｉＣＤ４９ｄ Ｔ細胞の数、ならびに注射部位反応、血小板変化、肝酵素ＧＧＴ－ビリルビン、ＣＲＰ及びアルブミン、Ａ／Ｇ率変化を含めた安全性を評価することである。臨床評価のための副次評価項目は、筋肉強度、ならびにミオセットによって測定される上肢の機能、強度、ならびにＰＵＬ－２（ＤＭＤのための上肢動作性測定基準２．０）によって測定される四肢機能容量、生活の質、ならびに呼吸マーカー、ならびに筋線維症、脂肪炎症－浮腫及び萎縮症のＭＲＩ評価、ならびに薬物動態の評価尺度である。探索的アウトカム評価尺度には、血清／血漿バイオマーカー応答、例えば、筋肉炎症筋線維症、筋アポトーシス／変性及び筋肉再生に関連しており１つ以上は筋損傷のマーカーとなり得るもの、例えばサイトカイン、ならびにプロテオミクス、及び一連の単核細胞ＲＮＡ、及び場合によってはエクソソームＲＮＡを含めることになる。
実施例５
結果
１２週目の患者１の結果
２５ｍｇ／週の低用量のＡＴＬ１１０２を、コルチコステロイド（ＣＳ）デフラザコートの３０ｍｇの一日用量（０．４８ｍｇ／ｋｇ／日）を受けている１３歳の体重６２ｋｇの非歩行可能な対象に１２週間投与した。一日用量のＣＳを受ける前のベースライン時（１週目）にこの患者にみられた循環ＣＤ８＋細胞及び高レベルのＣＤ４９ｄが発現しているＣＤ８＋細胞の１ミリリットルあたりの細胞数を減少させること、ならびに生化学探索マーカーによって測定される筋損傷のマーカーを減少させること、ミオセットによって測定される筋肉強度、ならびに重要なことにＰＵＬ－２．０によって測定される筋肉機能において、ＡＴＬ１１０２は有効であった。この対象はおよそ２年半前に歩行を喪失し、歩行可能であるときのＤＭＤを有する対象を治療するために用いられる標準治療０．９０ｍｇ／ｋｇ／日用量のデフラザコートの５４％（約５０％）を受けていた。歩行可能であるときのＤＭＤにおいて標準治療として使用される等価なプレドニゾロン用量は０．７５ｍｇ／ｋｇ／日である。
免疫細胞
ベースライン時（１週目）、５週目（ＡＴＬ１１０２投与の３日後）ならびに８及び１２週目（８及び１２週目の投与の７日後）に免疫細胞に対するＡＴＬ１１０２の効果をフローサイトメトリー及び血液学によって測定した。ＣＤ８＋細胞に対するＡＴＬ１１０２の効果は、多発性硬化症（ＭＳ）に用いたより高いＡＴＬ１１０２用量での以前の実験（Ｌｉｍｍｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ ２０１４）と比較して比較的選択的であった。効果も、以前にＭＳ試験で測定された投薬の３日後と比較してより大きく引き伸ばされ、ＡＴＬ１１０２投薬から７日後に初めて効果が示された。特定の免疫細胞はこの用量及び評価時間では影響を受けず、このことは、０．４ｍｇ／ｋｇ／週のこの低い２５ｍｇ用量においてＡＴＬ１１０２の効果が比較的より特異的であることを示唆していた。例えば、ＭＳ研究（Ｌｉｍｍｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ）では、より高い用量のＡＴＬ１１０２において好中球または血小板の有意な減少は認められなかった。
ミオセット－筋肉強度データ
この対象１からのミオセット予備データは、ベースラインと比較して１２週間の投薬の後に、ミオグリップによって測定される彼の利き手の強度の喪失があったが、ミオピンチによって測定される親指の強度の喪失もモビプレート（ｍｏｖｉｐｌａｔｅ）によって決定される指強度の喪失もなかったことを示唆しており、タップ回数はベースラインと比較して１２週間後も同じであった。もう片方の手についてのデータは、手または指に強度の喪失がなかったことを示唆しており、ベースラインと比較して１２週目の親指の強度は数値的により高かった。Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、１２週間にわたって及びそれより長くＣＳ及びミオセットで処置された１５名の患者（１４名はＣＳで処置された）を観察し、ベースラインと比較したときのミオグリップでの０．２２ｋｇの平均低下傾向及びミオピンチでの０．１ｋｇの低下、ならびにモビプレートでの増加を認めた。
ＰＵＬ－２－機能データ
ＤＭＤのためのＰＵＬ－２は、上肢機能を測定するために用いられるＰＵＬ－１の更改バージョンである。ＰＵＬ－２は、最大スコアを１２としてより高いレベルの肩機能を測定し、最大スコアを１７として中レベルの肘機能を測定し、最大スコアを１３として遠位手首及び手機能を測定する。３～６の入力スコア（最高が６であり最低がゼロである）は、対象を肩機能について評価できることを意味する。対象１は入力レベル機能スコアが５であり、記録された測定結果は、１２週間の間投薬を受けており肩機能に喪失がなくベースライン時及び１２週目のスコアが８であったことを示している。対象１は、中レベルの肘における機能を獲得してスコアがベースライン時の１３に対して１２週目に１４であり、遠位手首及び手の範囲における機能を獲得してスコアがベースライン時の１０に対して１２週目に１２であった。ＰＵＬ－２．０総合機能スコアは、ベースラインと比較して投薬の１２週目には３１に対して３４であった。患者入力レベルスコアも、ベースライン時のレベル５からレベル６に上昇し、記録されたＰＵＬ－２結果と整合していた。
ＡＴＬ１１０２付加療法は、この対象において、ミオセットによって測定される筋肉強度を保持するのに役立つ可能性があり、ＰＵＬ－２によって測定される機能を改善はしないまでも維持するものと見受けられる。したがって、ＡＴＬ１１０２療法は疾患の進行を遅延させる可能性がある。
結果は、ＤＭＤ患者を治療するため、筋肉強度及び四肢機能を改善し安定させるため、ならびに筋ジストロフィー疾患の進行を遅延させるための、単剤療法としてのまたはＣＳと組み合わせたＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ鎖）に対するアンチセンス全般及び具体的にはＡＴＬ１１０２の使用の正当性を立証している。
結果は、ＤＭＤ患者を治療するため、筋内脂肪組織レベル、筋肉強度及び四肢機能を改善し安定させるため、ならびに筋ジストロフィー疾患の進行を遅延させるための、単剤療法としてのまたはＣＳと組み合わせたＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ鎖）に対するアンチセンス全般及び具体的にはＡＴＬ１１０２の使用の正当性を立証している。
当業者であれば理解するであろうが、筋肉動作性の肝要な要素は、最大の力でありミオグリップ及びミオピンチ検査で簡便に測定される強度である。さらには、例えば検査が例えばミオグリップ及びミオピンチの反復測定によってなされる、力を繰り返し維持する能力である持久力／易疲労感がある。さらには、６分歩行検査のような力／単位時間である体力がある。運動能力は、粗大運動技能ならびに手首手指、足及びつま先の微細運動技能などの筋肉の動作の運動である。当業者であれば、上肢もしくは下肢または動物の前肢及び後肢に関連する日常生活の活動が運動能力に含まれていることを理解するであろう。ＤＭＤ測定基準を有する非歩行可能な小児は、そのような上肢動作性のＰＵＬ１．０、ＰＵＬ１．２、ＰＵＬ２．０のような尺度が利用可能であり、これらは、ＤＭＤ及び他の筋萎縮症の症状を有する歩行可能な小児にも使用され得る。
当業者であればさらに、筋肉強度が上肢または下肢強度の尺度となり得ること、ならびに上肢において筋肉強度が、手持ち式筋力計を使用してグラムまたはポンド単位で測定される肩屈曲、肘伸展及び手首伸展のために用いられることを理解するであろう。
ミオセットは上肢の強度及び易疲労感を測定するが、これらは反復測定（易疲労感のデータは示さず）であるため、結果は大抵、３回以上の反復有効結果の強度最大結果を提供する。最大の結果は２回目または３回目の検査に得られることがある。
筋損傷の探索的薬力学アウトカム尺度
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、主として低レベルのジストロフィンまたはジストロフィンの欠如及び収縮時の筋肉の損傷に関連しており副次的には炎症性の及び他の下流での筋肉損傷に関連しているＤＭＤを有する男児における筋損傷の尺度である。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、非歩行可能患者よりも大きな筋肉量及び炎症を有する者であるＤＭＤを有する若年の歩行可能患者における筋損傷の尺度である。
それでもなお、対象１において筋損傷マーカー変化を調べるために血液及び血清試料を採取した。対象１においてＣＫ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨは８及び１２週目にベースライン及び５週目に比べて減少した。単位／リットルでのＣＫ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＬＤＨのベースライン／５週目のレベルはそれぞれ、５８６０／６８８１、３０４／４０４、未検査／１８４、及び６３２／６８１であり、これとは対照的に８／１２週目のレベルは４６０６／５３５８、２６５／２５０、１１６／１３４、及び５６４／４９８であった。ＬＤＨレベルは、高いとみなされるところから正常範囲内に低下した。これは、ジストロフィン損失または炎症または他の損傷に関連する筋損傷の兆候がこの非歩行可能患者において軽減されたことを示唆している。
実施例６
４名の患者の１２週間のデータ及び２名の患者の２４週間のデータの結果
患者１を含めた４名の非歩行可能患者からの１２週間にわたるデータは、実施例５での患者１における観察結果と整合しており、週１回の２５ｍｇのＡＴＬ１１０２による処置が筋肉強度及び四肢機能を改善及び維持することを支持している。当該４名の患者は、１０～１５歳の間に９ヶ月～４年半の範囲にわたって歩行を喪失し、ＡＴＬ１１０２治療を開始した時には１３～１７歳であった。体重範囲はおよそ４０～６５ｋｇの体重で、彼らはおよそ０．４～０．６ｍｇ／ｋｇ／週のＡＴＬ１１０２を受けていた。彼らは全員、歩行可能であるときのＤＭＤを有する対象を治療するための標準治療である０．９０ｍｇ／ｋｇ／日用量のデフラザコート及び０．７５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロンの使用が中止され、歩行可能患者に使用する場合のこれらのステロイドの標準用量のおよそ半分、５分の２及び５分の４である固定の２０及び２５ｍｇの用量のプレドニゾロン及び３０ｍｇ用量のデフラザコートを受けていた。
患者１を含めた２名の非歩行可能患者からの２４週間にわたるデータも、１２週間にわたる観察結果と整合していた。２名の患者はそれぞれ２年半～４年半目に１０～１３歳の時に歩行を喪失し、ＡＴＬ１１０２治療を開始した時には１３～１７歳であった。彼らは体重がおよそ６０～６５ｋｇで、およそ０．４ｍｇ／ｋｇ／週のＡＴＬ１１０２を受けていた。患者１は３０ｍｇのデフラザコート、患者２は２０ｍｇのプレドニゾロン及び３０ｍｇ用量受けていたが、これらはそれぞれ、歩行可能患者に使用されるＣＳの標準一日用量の５４％及び４０％である。
ミオセット：ミオグリップ及びミオピンチ筋肉強度データ
利き腕及び非利き腕についてミオグリップ及びミオピンチデータを生成し、握力及びつまみ力検査を各時点で数回行った。これは、有効な結果を得ること及び筋肉強度及び持久力を決定することを可能にする。
ミオグリップ－筋肉強度データ
ミオセット供給業者が推奨するとおりに、患者が使用する利き腕において、ベースラインと比較したときの投薬から１２週間後の４名のＤＭＤ患者からのミオグリップデータを評価した。利き手のミオグリップ強度は、ベースラインからの強度の０．０９ｋｇの平均増加及び１０．５２％の増加を示した。Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、１２週間にわたって処置された１５名の患者（１４名はＣＳで処置された）を観察し、１２週目にミオグリップに関して解析した１０名の患者において、ベースラインと比較したときのミオグリップ強度の０．２２ｋｇ及び３．２８％の平均低下傾向を認めた。
ベースラインと比較したときの投薬から２４週間後の２名のＤＭＤ患者からのミオグリップデータを、患者が使用する利き腕において評価した。利き手におけるミオグリップ強度は、ベースラインからのたったの０．４２ｋｇの平均低下及び平均１．２４％の強度損失を示した。Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、２４週目の強度に関して解析した９名の患者において、ベースラインと比較してミオグリップ強度の有意な０．５０ｋｇの平均低下及び１０．４５％の損失を示した。
ミオピンチ－筋肉強度データ
ミオセット供給業者が推奨するとおりに、患者が使用する利き腕において、ベースラインと比較したときの投薬から１２週間後の４名のＤＭＤ患者からのミオピンチデータを評価した。利き手のミオピンチ強度は、ベースラインからの強度の０．１６９ｋｇの平均増加及び５．３１％の増加を示した。Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、１２週目にミオピンチに関して解析した１０名の患者において、ベースラインと比較したときのミオピンチ強度の０．１ｋｇの平均低下傾向及び４％の損失を認めた。
ベースラインと比較したときの投薬から２４週間後の２名のＤＭＤ患者からのミオピンチデータを、患者によって使用される利き腕において評価した。利き手におけるミオピンチ強度はベースラインからの強度の０．０３４ｋｇの平均増加及びマイナス２．５８％の損失を示した。Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、２４週目にミオピンチに関して解析した９名の患者において、ベースラインと比較したときのミオピンチの０．３８ｋｇの有意な平均低下及び１５．２％の損失を示した。
モビプレート
ミオセット供給業者が推奨するとおりに、患者が使用する利き腕において、ベースラインと比較したときの投薬から１２週間後の４名のＤＭＤ患者からのモビプレートデータを評価した。利き手においてモビプレートは３０秒間に６３．５回の平均タップ速度を示し、平均タップ回数がベースラインに比べて４だけ増加した。Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ（２０１６）は、１２週目にモビプレートに関して解析した１０名の患者において、ベースラインと比較したときのタップの２．３の平均増加を認めた。
ＰＵＬ２四肢筋肉機能データ
ベースラインと比較したときの投薬から１２週間後の４名のＤＭＤ患者からのＰＵＬ２．０データを評価した。ＰＵＬ２．０総合機能スコアは、ベースラインからの３．６６点の平均増加及び９．６％の平均増加を示した。ベースラインから、３名の患者は＋３点増加し、１名の患者は＋２点増加した。
ベースラインと比較したときの投薬から２４週間後の２名のＤＭＤ患者からのＰＵＬ２．０データを評価した。ＰＵＬ２．０総合機能スコアは、ベースラインからの２点の平均増加及び９．９％の増加を示した。どちらの患者も総合機能スコアに＋２の増加があった。
Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ（２０１８）は、ＤＭＤを有する９０名の非歩行可能患者において、ベースライン時、１２ヶ月目及び２４ヶ月目のＰＵＬ２．０機能データを観察した。９０名のうち５２名、すなわち５８％の患者はＣＳを受けていた。結果はこの２４期間にわたって線形であり、１２及び２４ヶ月の期間にわたって有意な損失を示した。外挿から、ベースラインと比較したときのＰＵＬ２．０総合機能スコアにおける１の推定平均総合機能スコア損失及び５．４％の推定平均損失が示唆された。
対象１は、６までとり得る入力レベルベースライン機能スコアが５であり、それは１２週目にレベル６に上昇し、２４週目もレベル６のままであった。患者２は、入力レベルベースライン機能スコアが、とり得る最低スコアである０のすぐ上の１であり、入力スコアは１２週目にレベル２に上昇し、２４週目もレベル２のままであった。他の患者は、３のベースライン入力レベルのままであった。３～６の入力スコア（最高が６であり最低がゼロである）は、対象を肩機能について評価できることを示している。
ＰＵＬ－２は、最大スコアを１２としてより高いレベルの肩機能を測定し、最大スコアを１７として中レベルの肘機能を測定し、最大スコアを１３として遠位手首及び手機能を測定する。１２週目に患者１、２、３及び４はベースラインとのスコア差がゼロ、ゼロ、＋２及び＋３となり、２４週目にはゼロ、ゼロとなった。ベースラインと比較して１２週目の中レベルの肘の機能はそれぞれ＋１、＿２、＋１及び－１となり、２４週目には＋１及び＋２となった。ベースラインに対する１２週目の遠位手首及び手の範囲における機能は、＋２、ゼロ、ゼロ及び＋１、ならびに２４週目には＋１及び＋０となった。
結果は、ＤＭＤ患者を治療するため、筋肉強度及び四肢機能を改善し安定させるため、ならびに筋ジストロフィー疾患の進行を遅延させるための、単剤療法としてのまたはＣＳと組み合わせたＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ鎖）に対するアンチセンス全般及び具体的にはＡＴＬ１１０２の使用の正当性を立証している。
実施例７
患者８週目データの結果
ミオセット筋肉強度及びＰＵＬ２．０機能データに対する早くも８週目における急速な効果
１２週目よりも前のミオセット結果が報告されたことはなく、最も早いデータはＲｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌにおいて１２週目のものが利用可能であり、他の研究は全て１２ヶ月以降のものである。１２週目よりも早くにコルチコステロイドの影響について報告されたことはない。驚くべきことに、ＡＴＬ１１０２は、平均ミオグリップ及び平均ミオピンチ筋肉強度、ならびにＰＵＬ２．０四肢機能を最初の６名の患者において早くも８週目に改善し、今日までに評価された４名の患者において効果が１２週目まで維持された。
実施例８
ＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドのＭＤＸマウス試験
本明細書に記載されるように、ヒトＣＤ４９ｄに対するアンチセンス阻害剤であるＡＴＬ１１０２を、ＤＭＤ患者における炎症性の免疫媒介筋線維損傷を軽減するための治療として研究した。筋肉強度及び筋肉機能に対するＡＴＬ１１０２の効果は、実施例５、６及び７に概要が示されており、ＤＭＤの治療におけるＣＤ４９ｄまたはＶＬＡ－４に対する何らかの阻害剤の効果を初めて示すものである。現在、コルチコステロイド（ＣＳ）は、ＤＭＤにおいてみられる炎症を軽減するために使用されており、上記ヒト研究では患者１、２、３及び４においてＣＳが使用された。しかしながら、コルチコステロイドは、ＤＭＤにおいて要求される長期間にわたって使用された場合に多様な重篤な副作用を有し、それゆえ、ヒト研究で試験したようなより低い用量のＣＳを使用すること、及びさらにはＣＳの使用を回避することが好ましかろう。それはヒトにおいては常に可能なことではないため、マウスにおいてこれを試験した。
以下の動物研究は、筋ジストロフィーにおいて単剤療法としての、ＶＬＡ－４のアルファ鎖であるＣＤ４９ｄに対するアンチセンス阻害剤の効果を初めて試験するものである。それはまた、筋ジストロフィーにおけるＣＤ４９ｄまたはＶＬＡ－４の何らかの阻害剤の効果を初めて試験するものでもある。しかもこれは、筋ジストロフィーマウスモデルにおいて筋損傷の開始の後における何らかの抗炎症性免疫媒介治療を初めて試験するものである、というのも、他の治療は筋損傷の初期に予防的に行われたものであるからである。
ヒトＣＤ４９に対するアンチセンス阻害剤であるＡＴＬ１１０２はマウスＣＤ４９ｄ ＲＮＡとの相同性を有していないので、マウス及びヒトＣＤ４９ｄのアンチセンスオリゴヌクレオチド阻害剤であるＩＳＩＳ３４８５７４をマウス研究に使用した。
方法－試験は盲検試験であった。ＪＡＸから計４８匹の雄のＣ５７ＢＬ１０ ＭＤＸマウス、及び１２匹の雄の野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ１０マウスを購入した。１２匹のＭＤＸマウスの２つの群に週１回の２０ｍｇ／ｋｇ及び週１回の５ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ３４８５７４を皮下（ｓ．ｃ）注射した。１つの群の１２匹のＭＤＸマウスには、２０ｍｇ／ｋｇの混交ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ３５８３４２を週１回皮下注射した。１つの群の１２匹の野生型対照マウスには、生理食塩水を皮下注射し、ＭＤＸマウスにおける疾患進展の尺度として用いた。群は以下のとおりであった：
ＷＴ－Ｃ５７ＢＬ１０ ｎ＝１２（プラセボ、対照、生理食塩水 皮下）
ＭＤＸ ｎ＝１２（高用量ＩＳＩＳ３４８５７４ ２０ｍｇ／ｋｇ 皮下）
ＭＤＸ ｎ＝１２（低用量ＩＳＩＳ３４８５７４ ５ｍｇ／ｋｇ 皮下）
ＭＤＸ ｎ＝１２（高用量混交ミスマッチ対照ＩＳＩＳ３５８３４２、２０ｍｇ／ｋｇ 皮下）
ＭＤＸ ｎ＝１２（プラセボ対照、生理食塩水 皮下）
この試験のための対照は、野生型、ＭＤＸの両方についての生理食塩水対照、及び高用量のみの混交オリゴヌクレオチド対照を含む。ＣＤ４９ｄ ＲＮＡに結合しない混交型の混合ヌクレオチド配列は、ＣＤ４９ｄに対するオリゴヌクレオチドと同じヌクレオチド組成を有する。高用量（２０ｍｇ／ｋｇ）及び低用量（５ｍｇ／ｋｇ）のＩＳＩＳ３４８５７４は、マウスの用量が曝露レベル基準で臨床での５分の１のｍｇ／ｋｇ用量、すなわち臨床での毎週１ｍｇ／ｋｇ及び４ｍｇ／ｋｇに相当するがために選択された。毎週４ｍｇ／ｋｇの用量は、急性８週間試験において投与されるＭＳ患者での３回と毎週２回の２００ｍｇ用量のＡＴＬ１１０２よりも少ない（Ｌｉｍｍｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ，２０１４）。しかしながら、毎週４ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量は、週あたりのｍｇ／ｋｇ基準では、実施例５、６及び７でＤＭＤ患者に与えられたＡＴＬ１１０２よりも高い用量を含んでおり、但し、後者は長期にわたる２４週間試験である。臨床下の患者にはこれらの濃度のアンチセンスが、臨床で注射される好適な体積で提供され得る。
マウス及びラットインテグリンα４に対して完全に相補的な、ホスホロチオエート主鎖及び各Ｃのための５－メチルシトシンを有する５－１０－５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ３４８５７４（ＡＴＡＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＧＴＧＣＣＣ：配列番号２）。
ＩＳＩＳ３４８５７４の代わりに８塩基対ミスマッチオリゴヌクレオチドについても試験した。これは、ホスホロチオエート主鎖を有する５－１０－５ＭＯＥギャップマーであるＩＳＩＳ３５８３４２（ＡＣＡＧＴＧＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣ：配列番号３）であった。
雄のマウスのみを評価した、というのも、ＤＭＤは、男児にのみ影響を与えるＸ染色体関連の遺伝性筋疾患であるからである。十分な動物をプロトコールに従って処置して試験を補強するために、処置群１つあたり合計ｎ＝１２匹のＭＤＸマウスを使用した。ＭＤＸマウス及び野生型対照を順化させ、９週齢の時（２～５週齢で起こると考えられる１回目の筋損傷の開始よりも後）に処置を開始した。処置は６週間にわたって週１回の生理食塩水か混交オリゴヌクレオチドか２種の用量のＣＤ４９ｄに対するアンチセンス（２０ｍｇ／ｋｇ（高）及び５ｍｇ／ｋｇ（低））かのいずれかの皮下注射によって行った。
握力について、ならびに疲労、等尺性収縮（絶対及び固有力）及び遠心性収縮によって誘発される筋損傷を観察する現位置での筋肉生理学によって、マウスを検査した。組織は血液及び神経供給系に連結されていた。骨格筋、横隔膜、心臓、脾臓及び血液を採取し、将来の生化学及び分子分析のために保存した。採用された技術については以下の刊行物が参照され得る：Ｈｏｇａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：１４１４３，２０１７（遠心性収縮）、Ｇａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １０２，８４５－８５７，２０１８（力収縮頻度及び疲労）。
薬物投与及び握力検査－１回目の注射の前に、マウスにベースライン握力検査を受けさせて前肢強度を調べた。完了した時点で、ＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、生理食塩水または混交オリゴヌクレオチドを上記濃度で使用して全てのマウスに１５０マイクロリットルの最大体積を週１回、６週間にわたって注射した。その後、以下に概要が示される握力評価を、６週間の治療期間が完了するまで２週間ごとにマウスに受けさせた（合計４回の検査）。
握力強度の手順は以下のとおりであった：
１．マウスの体重を測る。
２．尾を持ってマウスを前肢がバーと同じ高さになる位置に持ち上げる。
３．マウスをバーに向かって水平に、それが到達範囲に来るまで移動させる。良好に掴まっていること、つまり両足で対称に正しく掴まっており研究者の引っ張りに対して検出可能な抵抗が働くことを目視確認する。
４．マウスをその掴まりが解けるまで穏やかに引っ張る。動物が片足のみを使ったか、またはその後肢も使ったか、引っ張られている間に後ろを向いたか、または抵抗なくバーから離れた場合には、測定結果を破棄せねばならない。
５．試行の合間に１分間の休憩を挟みつつ検査を５回繰り返して最良の成績を得る。
６．マウスを巣箱に戻し、餌報酬としてヒマワリ種子を床に置く。
組織採取及び現位置での筋肉生理学－Ａｒｏｒａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって開発された装置を使用して骨格筋機能の分析を実施した。この技術は、約５年間にわたって試験を行う実験室で用いられており、骨格筋に関連する多くの障害において筋肉動作性及び強度の機能効果を判定するための至適基準方法である。このシステムは、完全な血液供給及び神経系を維持しながら前脛骨筋（ＴＡ、後肢筋）によって生み出される強度の決定を可能にする。筋疲労の影響は、筋収縮と回復（疲労後）との繰返しを実施することによって評価され、筋力喪失は、筋損傷を評価する以下の遠心性収縮に従って測定された。他の方法、例えば、筋力の概算を提供するにすぎない生体内での握力を用いてこの情報を収集することは可能ではない。この方法を用いて、処置から６週間後のアンチセンスオリゴヌクレオチド薬の効果を評価した。分析は、完了するマウスを１日あたり最大１０匹としてずらして行い、以下の手順によって行った。
筋肉生理学のための手順は以下のとおりであった：
１．マウスの体重を測る。
２．イソフルランを使用してマウスに麻酔を掛ける。つま先摘まみを指標として用いて十分な初期麻酔を確保する。処置中は５分ごとにつま先摘まみを用いて麻酔の深度を監視する。
３．マウスに十分に麻酔が掛かった後、皮膚に約２ｍｍの切開部を作ることによって足にある腱を露出させる。
４．５－０縫合糸を使用して、露出腱を筋腱間接合部よりも約５ｍｍ遠位にある所で２本の別個の縫合糸によって結紮する。１つのいかり結び目、及び力伝播材に固定するための１つの結び目）。
５．皮膚を膝から除去して膝蓋骨を露出させる。
６．大腿四頭筋の上の皮膚を切開して坐骨神経を露出させる。
７．周囲組織を損傷することなくステンレス鋼製ピンまたはシリンジ針を膝蓋腱の後方に通すことによって膝を固定する。ピンを台の基部に貼り付けておくべきである。収縮中のいかなる動きも防止するために麻酔状態の動物はしっかりと固定されていなければならない。
８．ステップ４からの縫合糸を使用して筋肉の腱をデュアルモードのサーボモーターのレバーアームに結び付ける。
９．２本の電極（を模した）ワイヤを神経の上に置き（またはその下に引っ掛け）、最大上電圧（すなわち約１０Ｖ）の持続時間３００～４００ｍｓの矩形波パルスを用いて筋肉を刺激して収縮させる。
１０．全ての刺激パラメータ及び収縮応答は適切なコンピュータソフトウェアを使用して制御及び測定される。
１１．小さな増分で最大単収縮力が得られるまで長さを漸増させることによって最適筋肉長（Ｌｏ）を決定することは一般的である。
１２．Ｌｏを決定した後、漸増頻度で筋肉を刺激して完全な収縮頻度－力関係を確立する。成功収縮の合間に筋肉を３０秒間休ませねばならない。収縮頻度－力関係の平坦部から最大力を決定する。
１３．最大力が決定された時点で筋肉を異なるプロトコールに供して短縮力、筋疲労、または収縮誘発損傷の感受性を決定する。
１４．刺激プロトコールの最後に血液を心臓採血によって採集し、マウスを頚椎脱臼及び心臓穿刺によって安楽死させる。
１５．前脛骨筋（ならびに生化学及びＲＮＡ分析のために必要とされる他の筋肉／組織）を採取し、筋肉を計量して、力収縮頻度関係から固有力測定結果を算出することを可能にする。
処置の継続期間にわたってマウスを麻酔し、処置後は回復させずにすぐさま処分する。
統計解析－Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して統計解析を実施した。群１つあたり１２匹のマウスから得られた握力、絶対及び固有筋力、ならびに筋肉重量を、一元配置ＡＮＯＶＡ，Ｆｉｓｈｅｒｓ ＬＳＤ検定を用いて評価した。筋疲労解析は、群１つあたり１２匹のマウスにおいて二元配置ＡＮＯＶＡ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＬＳＤ検定を用いて行われ、遠心性収縮に関しては群１つあたり９匹のマウスにおいて一元配置または二元配置ＡＮＯＶＡ，ＬＳＤ検定を用いて行われた。
結果
握力－ベースライン時及び６週間の処置にわたる握力（平均及び標準誤差）。処置前のベースライン時においてｍｄｘコホートは野生型よりも弱かった（図１のＡ）。試験が盲検化され、動物が無作為に分配されたにもかかわらず、ベースライン時に高用量アンチセンスオリゴヌクレオチドコホートのＭＤＸマウスは、（ＭＤＸ－混交または低用量よりもというわけではなかったが）ＭＤＸ－生理食塩水よりは有意に弱かった（図１のＢ）。
現位置での前脛骨筋（ＴＡ）生理学－筋肉量及び等尺性筋収縮データ（最大絶対力及び最大固有力）。表１は、筋肉生理学特性を示す。文献で知られているように、野生型マウスはＭＤＸマウスよりもＴＡ量（ｍｇ）が少なかった。ＭＤＸマウスの４つの群において試験最後には筋肉量に差がなかった。野生型同士でも、ＭＤＸ処置群のいずれかにおいても、５０Ｈｚ未満の単収縮でｍＮ単位で測定される最大絶対力に関しては差がなかった。野生型マウスは最大固有力（ｍＮ／ｍｍ２）が最も大きくなり、ＭＤＸマウスの処置アーム間に有意差はなかった。
疲労－野生型及びＭＤＸマウスの疲労はどちらも顕著である。野生型は１０分以内の回復で力を再獲得する。ＭＤＸは１０分後に回復するが、生み出す力は依然としてベースライン時よりも弱い。ＭＤＸ－高用量アンチセンス薬と他のＭＤＸ（生理食塩水、混交対照高用量または低用量アンチセンス薬）との間に差はなかった（図２のＡ、Ｂ）。
遠心性筋収縮データ－図３は、野生型対照と比較した遠心性筋収縮を示す。野生型と比較して全てのＭＤＸコホートは力の喪失を示す。しかしながら、高アンチセンスオリゴヌクレオチド用量群は３０％伸縮からしか有意な力喪失を示さず（ｐ，０．０００１）、これに対してｍｄｘ－生理食塩水は２０％伸縮から有意な喪失を示した（ｐ＝０．００１）。これは、高用量アンチセンス処置が遠心性収縮中の筋損傷を遅延させることを示唆している。
図４は、ｍｄｘ－生理食塩水＋／－標準誤差と比較した遠心性筋収縮を示す。ＭＤＸ－生理食塩水と比較して高用量アンチセンス群は、有意により高い力産生能を２０％伸縮から示した（ｐ＝０．００１）。これは、ｍｄｘ－生理食塩水処置動物と比較してアンチセンスオリゴヌクレオチド薬が遠心性収縮後に筋損傷を遅延させてより大きな筋力を生み出したことを示唆している。
図５は、ＭＤＸ－混交対照＋標準誤差と比較した遠心性筋収縮を示す。混交オリゴヌクレオチド対照と比較して高用量のＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有意に増加した力産生を３０％伸縮から示す（ｐ＝０．０１）。これは、処置動物において同じ用量の混交オリゴヌクレオチド対照と比較してＣＤ４９ｄに対するアンチセンス薬が遠心性収縮後に筋損傷を特異的に遅延させてより大きな筋力を生み出したことを示唆している。
回復から５分後にＭＤＸマウスは野生型と比較して有意に少ない力を生成した。野生型マウスは、筋損傷がないことを表して同程度の量の力を生成した。
図６は、生じた遠心性筋収縮を初期収縮＋／－標準誤差の％として示す。ＭＤＸ生理食塩水、混交及び低用量アンチセンスオリゴヌクレオチドは、産生された初期力に比べて－５０％のより少ない力を生成した。高用量アンチセンスオリゴヌクレオチドを注射したマウスは、産生された初期力の－７０％を生成した。これは、野生型よりも有意に小さいが、生理食塩水、混交及び低用量処置ＭＤＸマウスよりも有意に大きい。
生化学血液マーカー－図７は、野生型及びＭＤＸ－生理食塩水、混交及び（高及び低）処置マウスの血液のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを示す。処置から６週間後に野生型及びＭＤＸマウスの血液において筋肉ＣＫレベル（Ｕ／Ｌ）を測定した。ＣＫは、筋損傷を評価するための間接的なマーカーとして使用され得る循環タンパク質である。野生型と比較して全てのＭＤＸ試料において循環ＣＫの有意な増加が認められたが、ＭＤＸ群において処置間の差は認められなかった（図７）。
脾臓中の免疫細胞：ＣＤ４９ｄ細胞表面マーカーが発現するＴ細胞の減少
マウスに投与されたオリゴヌクレオチド薬は、血液から、白血球を含有する一次及び二次リンパ系臓器を含めた組織へと急速に分配される。リンパ系臓器である脾臓を採取し、白血球のフローサイトメトリー分析のために細胞を単離した。ＶＬＡ－４のアンチセンスオリゴヌクレオチド標的細胞表面分子ＣＤ４９ｄアルファ鎖を含めた様々な細胞表面マーカーのレベルを、レーザーによって励起されて様々な波長の光を放射する蛍光標識抗体を使用して評価した。ＣＤ４９ｄ陽性Ｔ細胞計数は、高用量のＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ３４８５７４（皮下に２０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスの脾臓において減少した。
実施例９
実施例４の９名の患者の試験からの結果：
実施例４の９名の１２～１８歳（平均１４．９（標準偏差２．１）歳）の患者は、２５ｍｇのＡＴＬ１１０２が週１回、２４週間にわたって皮下投与され、上肢動作性測定基準（ＰＵＬ２．０）、ならびにリンパ球、ＣＤ４及びＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋及びＣＤ８＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の数及び百分率をフローサイトメトリーで評価することによって決定されるリンパ球調節潜在能力を用いた評価がなされた。
ベースラインと比較したときの２４週目の平均ＰＵＬ２四肢筋肉機能データ
２４週目にＡＴＬ１１０２処置患者は、Ｐａｎｅ ｅｔ ａｌ，２０１８から確立された一致する対照群（ｎ＝２０、３９ ２４週目の測定結果）でのそれぞれ－２．００（３．０１８）及び－１．３３３（２．０４３）と比較して統計的に有意な、平均（標準偏差）総合ＰＵＬ２．０スコアの＋０．８９（２．８９）の改善（ｐ＝０．０１０）及びＰＵＬ２．０中レベル肘スコアの＋０．１１（１．２７）の改善（ｐ＝０．０１０）を示した。
２４週目にＡＴＬ１１０２群は、一致する対照群の－０．５３８（１．２９５）、－０．１２８（０．９５１）及び－０．２８２（０．６０５）の平均変化と比較して、ＰＵＬ２．０高レベル肩の平均スコアの＋０．８６（２．６７）の改善、遠位手首及び手の＋０．１１（０．６０）の改善、及びＰＵＬ２．０入力の＋０．１１（０．６０）の改善を示したが、それぞれの差は有意ではなかった（ｐ＝０．１８２、０．３４９及び０．０８４）。一致する対照群のデータは、非歩行可能患者において１年及び２年にわたってＰＵＬ２．０の低下を示しているＰａｎｅ ｅｔ ａｌからのデータと整合している。
９名中７名の参加者は、ＡＴＬ１１０２による投薬から２４週間後に彼らのベースラインからのＰＵＬ２．０スコアの改善か無変化かのどちらかを示した。ＡＴＬ１１０２処置患者が総合ＰＵＬ２．０スコアの改善または無変化を示す頻度は、一致する対照群において３３％であったのに比べて、７８％であった。
ＡＴＬ１１０２処置患者は、一致する対照群に対して相対的に、ＰＵＬ２．０の有意な平均改善、及びＰＵＬ２．０の改善または維持がある患者のより多い頻度を示した。
ベースラインと比較したときの２４週目の平均筋内脂肪画分データ及び萎縮症データ
ＭＲＩを用いて、６つの筋肉の前腕背部群、４つの筋肉の手掌群、及び中央スライスでのＥＣＲＬＢ－Ｂｒ筋肉を横切って、ならびに中央、近位及び遠位スライスでの全筋肉区画を横切って脂肪画分％を６つの測定結果として評価するが、これに関して、本明細書に全体が援用されるＲｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ ２０１６によって表２中に報告された６ヶ月データが存在する。
２４週目に９名のＡＴＬ１１０２処置患者は脂肪％の平均低下を示し、６つ全てのこれらの筋内脂肪測定にわたってベースラインと比較して骨格筋内脂肪含有量の改善が示唆された。これは、筋内脂肪含有量の悪化を示唆するＲｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．２０１６によって報告された脂肪％の増加とは対照的である。９名のＡＴＬ１１０２処置患者は、Ｒｉｃｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ，２０１６によって報告された非歩行可能患者の群（ｎ＝７、２４週目の測定結果）における骨格筋内脂肪含有量の悪化、平均脂肪％の＋４．５、＋３．９、＋２．２、＋５．５、＋０．７及び＋６．１の増加と比較してそれぞれ、平均合計脂肪％の低下を全ての筋肉群にわたる－２．１４％の近位スライス、－０．５２％の中央スライス及び－５．１４％の遠位スライスにおいて、ならびに－０．８８の中央背部、－０．５７％の中央手掌及び－０．１２％の中央ＥＣＲＬＢ－Ｂｒにわたって有していた。
ＡＴＬ１１０２処置患者における萎縮症は０、２及び３として評価された。萎縮症は、１２週目に手掌及び背部筋遠位配向においてより多くの患者で軽減されたと見受けられるが、２４週目のそのような遠位データは利用可能でなかった。各四半部ではベースラインと比較して２４週目に同程度の％の患者が並び、安定性を示唆していた。これは、筋萎縮症を招く可能性がある標準用量（０．７５ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾンまたは０．９ｍｇ／ｋｇ／日のデフラザコート）での長期にわたる治療とは対照的である。
ベースラインと比較したときの２４週目の個別ＰＵＬ２四肢筋肉機能データ
ＡＴＬ１１０２及び２４週間の投薬の後のコルチコステロイドを受けている８名のＤＭＤ患者からのＰＵＬ２．０データをベースラインと比較して評価した。ＰＵＬ２．０総合機能スコアは、ベースラインから１点の平均増加を示した。ベースラインから、１名の患者は＋７の増加を有し、３名の患者は＋２点の増加を有し、２名の患者は変化がなく、１名の患者は２点減少し、１名の患者は３点減少した。２４週目以降にコルチコステロイドを受けていない別の患者（１０）は、ベースラインと比較してＰＵＬ２スコアの変化がなかった。
結果を表に示し、図８にはグラフで表した。ＡＴＬ１１０２及び２４週間の投薬の後のコルチコステロイドを受けている全てのＤＭＤ患者を、ベースラインと比較して２４週目及び２８週目にＣＤ４＋ＣＤ４９ｄについて評価した。ＰＵＬ２．０機能スコアが増加したかまたは変化しなかった６名全てのＡＴＬ１１０２及びコルチコステロイド患者は、２８週目にＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞が２４週目に比べて増加し、ＰＵＬ２．０機能スコアの減少を有しＡＴＬ１１０２及びコルチコステロイドを受けている２名の患者（患者６及び患者１１）は２８週目にＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔが２４週目に比べてさらに減少した。２４週目以降にコルチコステロイドを受けていない患者（１０）はＰＵＬ２．０スコアがベースラインに比べて変化せず、２８週目と比較して２４週目にＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の変化がなかった。
このデータは、ＡＴＬ１１０２治療後の疾患アウトカムのＰｕｌ２．０非応答性または低下と比較して、改善したかまたは安定している疾患アウトカムにおいて２４週間の投薬の後の血中ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞変化がＰＵＬ２．０応答性に関連していることを示唆していた。ＰＵＬ２．０における有効性は、投薬後のＣＤ４ＣＤ４９ｄ Ｔ細胞の増加もしくは無変化によって示唆される傾向にあり、または非有効性もしくは最小有効性アウトカムはＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の減少によって示唆される傾向にあった。ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞は、ＡＴＬ１１０２による総合ＰＵＬ２．０治療有効性の独立した予測因子である可能性がある。
実施例１０
ＰＵＬ２．０治療有効性の予測因子としてのまたは治療を調整するための患者血中ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ Ｔ細胞変化の利用
一実施形態では、１００名の体重２５ｋｇ超の１０～１８歳の非歩行可能ＤＭＤ患者において無作為化二重盲検プラセボ対照試験を行う。参加者を無作為化して群１つあたりおよそ２５名の患者の４つの群に分けるが、３つの群にはそれぞれ週１回の２５ｍｇ、週１回の５０ｍｇまたは週１回の１００ｍｇのＡＴＬ１１０２を与え、最後の群には５２週間にわたってプラセボを与える。ＡＴＬ１１０２またはプラセボは５２週間にわたってプレドニゾロンまたはデフラザコートのコルチコステロイド（ＣＳ）による任意の既存治療に重ねて週１回投与される。
主要有効性アウトカムは、ＰＵＬ－２．０によって測定される上肢機能能力の変化（ＤＭＤのための上肢動作性測定基準２．０）を異なる用量群にわたって５２週目にプラセボと比較して評価することである。副次有効性アウトカムは、ベースライン時、２４週目及び５２週目のＰＵＬ２．０の変化を含み、副次活性アウトカムは、（ｉ）患者がＣＳを受けている場合の一日用量のＣＳの投与及びＡＴＬ１１０２の２５週目の用量の前の、２４週目の投薬の１週間後である治療の２５週目に対する２４週目の、ならびに（ｉｉ）またも５３週目に対する５２週目の、循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の数の変化である。
試験の全ての参加者に、６ヶ月間（２６週間）の非盲検延長を開始することを勧めることになる。５２週目にベースラインと比較してＰＵＬ２．０スコアに基づく応答性を示した、非盲検試験で継続される患者は、ＡＴＬ１１０２及びＣＳの処置を受けたままにされ得る。５２週目にベースラインと比較してＡＴＬ１１０２＋／－ＣＳ処置に対する非応答性を示し、ベースラインと比較して例えば－２の、－３の、またはそれより低いＰＵＬ２．０スコアを有する患者は、６ヶ月間（２６週間）の非盲検試験のためのより高い用量かより低い用量かのどちらかの異なる用量のＡＴＬ１１０２に供され得る。
６ヶ月（２６週間）の非盲検治療の後、ＰＵＬ２．０応答性に関して７８週目の患者のＰＵＬ２．０を５２週目のＰＵＬ２．０と比較することになる。７８週目の循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の数は、上に概略を示したＰＵＬ２．０結果から４週間後である８２週目（いかなるＣＳの投与よりも前）の数と比較されることになる。ＡＴＬ１１０２に対する非応答性を示し、－２の、－３のまたはそれより低いＰＵＬ２．０スコアを有する患者は、さらなる経過観察においてＰＵＬ２．０応答性をさらに追跡評価しながら、ＡＴＬ１１０２用量を変更するかまたは彼らのＣＳ用量を例えば標準用量の３分の２もしくは例えば標準用量の３分の１に調整する選択肢を有することになる。
臨床評価のための他の副次評価項目には、安全性の評価尺度、及び有効性の評価尺度、例えば、ミオグリップ及びミオピンチによって測定される筋肉強度、呼吸マーカー、ＥＫ、ＥＫ２、生活の質、ならびに筋線維症、脂肪炎症－浮腫及び萎縮症のＭＲＩ評価が含まれる。これらの評価尺度のいずれか１つ以上は、ＰＵＬ２．０応答性及びＰＵＬ２．０評価後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋変化に基づいてＡＴＬ１１０２用量またはＣＳ用量を調整する前に考慮され得る。
投薬計画は本開示に従って改変されてもよく、例えば、当業者によって予想されるように、ベースラインと比較したときのＰＵＬ２．０及びＰＵＬ２．０後の循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋細胞変化を評価する前の３ヶ月間、６ヶ月間、１年間または１年超にわたる投薬、ならびにそれに対応させたＡＴＬ１１０２用量の調整が包含される。他の改変としては、ＰＵＬ２．０を評価した最後の投薬から１、２、３もしくは４週間後またはそれより後に循環ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋細胞を評価すること、それらをチップ上でのフローサイトメトリーによって測定することが挙げられる。
本開示の範囲から逸脱することなく多くの改変形態が当業者にとって明らかとなろう。
当業者に知られている多くの改変形態が包含される。
Figure 2022532098000001
Figure 2022532098000002
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Claims (18)

  1. 筋萎縮症、筋内脂肪組織または仮性肥大もしくは筋ジストロフィーに関連する症状またはそのリスクを有する対象において筋肉または四肢の動作性を改変する方法であって、
    薬学的に許容される担体、及び治療的有効量のＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４のアルファ４鎖）に対する阻害オリゴヌクレオチドを含む、医薬組成物を、
    そのような対象において筋内脂肪、筋肉動作性もしくは機能、または四肢動作性もしくは機能の１つ以上のマーカー、兆候またはパラメータを改変するのに十分な時間にわたって及び十分な条件の下で前記対象に周期的に投与すること
    を含む、方法。
  2. 前記オリゴヌクレオチドが、構造：
    ５’－ＭｅＣＭｅＵＧ ＡＧＴ ＭｅＣＴＧ ＴＴＴ ＭｅＵＭｅＣＭｅＣ ＡＭｅＵＭｅＵ ＭｅＣＭｅＵ－３’
    〔ここで、
    ａ）前記オリゴヌクレオチドの１９個のヌクレオチド間リンケージの各々はＯ，Ｏ－結合ホスホロチオエートジエステルであり、
    ｂ）５’末端から位置１～３にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
    ｃ）５’末端から位置４～１２にあるヌクレオチドは２’－デオキシリボヌクレオシドであり、
    ｄ）５’末端から位置１３～２０にあるヌクレオチドは２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）修飾リボヌクレオシドであり、
    ｅ）全てのシトシンは５－メチルシトシン（ＭｅＣ）である〕、
    またはその薬学的に許容される塩もしくは立体異性体を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記対象が筋ジストロフィーを有し、前記方法が、前記対象において筋ジストロフィーの１つ以上のマーカー、兆候もしくは症候を改善する、または筋ジストロフィーを進行遅延させる、請求項１または請求項２に記載の方法。
  4. 前記対象が歩行不可能である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記阻害オリゴヌクレオチドが週に約１０ｍｇ～３００ｍｇで投与される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記阻害オリゴヌクレオチドが約２５～５０ｍｇ／週の低用量で投与される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記投与が、単剤療法である、または標準もしくは低用量のコルチコステロイド治療と組み合わせて行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 個体対象における改変された筋肉動作性もしくは機能または四肢動作性もしくは機能の１つのマーカーがＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルであり、
    投薬期間完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血中レベルの回復及び／または安定性（維持）が、改善された及び／または安定した四肢動作性に関連付いており、
    投薬期間完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血中レベルの低下が、阻害オリゴヌクレオチド療法に応答した／その途中での四肢動作性の最適未満レベル及び／または四肢動作性の喪失に関連付いている、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記改善された四肢動作性が、ＤＭＤを有する患者において上肢動作性のＰＵＬスコアまたは臨床的に等価な手段を用いて測定されるものである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記投薬期間が終わる前であって前記投薬期間中の前回の投薬から１週間以内に、前記ＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルが測定される、請求項８または請求項９に記載の方法。
  11. 前記対象における投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞の血中レベルの回復及び／または安定性の有無について測定することをさらに含み、
    前記回復及び／または安定性の存在が、改善された筋肉及び／または安定した四肢動作性に関連付いており、
    投薬後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋細胞の血中レベルの低下が、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法に応答した四肢動作性の最適未満レベル及び／または喪失に関連付いている、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記阻害オリゴヌクレオチドが、低用量で１２～２４週間投与されたときに、ＤＭＤを有する前記対象においてＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルを低下させ、前回の投薬の完了から１週間以内に投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋の血中レベルの回復または安定化を有する前記対象において、ＰＵＬ２．０または臨床的に許容される等価なものによって決定される四肢機能を改善する及び／または安定させる、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  13. 個体対象が、改善されたＰＵＬスコアまたは臨床的に等価なスコアによって改善された筋肉または四肢の機能を呈することによってＣＤ４９ｄに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによる治療に応答する可能性があるか否かを評価する方法であって、以下のステップ：
    （ｉ）前記対象からの血液試料のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルを決定すること、
    （ｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチドのクールを施し、投薬期間の終わり頃にステップ（ｉ）を少なくとも１回繰り返すこと、
    （ｉｉｉ）投薬完了から１週間以内にステップ（ｉ）を繰り返し、
    （ｉｖ）結果を処理して、前記対象が投薬完了後のＣＤ４＋ＣＤ４９ｄ＋Ｔ細胞のレベルの回復、安定性または消失を呈したか否かを判定すること
    を含む、方法。
  14. 前記対象が投薬完了後の回復を呈した場合にアンチセンスオリゴヌクレオチドのクールが調整され請求項１２に記載の方法が繰り返される、または
    前記対象が投薬完了後の回復を呈した場合にアンチセンスオリゴヌクレオチドのクールが繰り返され得る、
    請求項１２に記載の方法。
  15. 前記クールが、阻害オリゴヌクレオチド投与の用量を増加させることによって調整される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記阻害オリゴヌクレオチドが週に約７５ｍｇ～３００ｍｇで投与される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
  17. 前記阻害オリゴヌクレオチドが約２５～５０ｍｇ／週の低用量で投与される、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
  18. 前記投与が、単剤療法である、または標準もしくは低用量のコルチコステロイド治療と組み合わせて行われる、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
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