CN105517556A - 前激肽释放酶(pkk)表达的调节 - Google Patents
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Abstract
本文提供了降低PKK？mRNA和蛋白质表达的反义化合物和方法。此类方法、化合物和组合物用于治疗、预防或改善PKK相关的疾病、病症和病状。
Description
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为2014年8月15日生成的标题为BIOL0172WOSEQ_ST25.txt，大小为约632KB的文件提供。电子格式的序列表中的信息通过引用整体并入本文。
技术领域
提供了降低动物中人血浆前激肽释放酶(PKK)mRNA和蛋白质的表达的化合物、组合物和方法。此类组合物和方法用于治疗、预防或改善炎症性和血栓栓塞性病状。
发明背景
血浆前激肽释放酶(PKK)是由KLKB1基因编码的血浆激肽释放酶(PK)的前体。PKK是参与血液凝固、纤维蛋白溶解、激肽生成和炎症的表面依赖性活化的糖蛋白。PKK由因子XIIa通过裂解内部Arg-Ile肽键而转化为PK。PK从激肽原释放激肽并且还由血纤蛋白溶解酶原生成血纤蛋白溶解酶。PK是激肽-激肽释放酶途径的成员，其由在炎症、血压控制、凝固和疼痛中起作用的几种蛋白质组成。
发明概述
本文提供了调节PKKmRNA和蛋白质表达的化合物、组合物和方法。在某些实施方案中，用于调节PKKmRNA和蛋白质表达的化合物为反义化合物。在某些实施方案中，所述反义化合物为反义寡核苷酸。
在某些实施方案中，调节可在细胞或组织内发生。在某些实施方案中，所述细胞或组织在动物体内。在某些实施方案中，所述动物为人。在某些实施方案中，PKKmRNA水平降低。在某些实施方案中，PKK蛋白质水平降低。此类降低可按时间依赖性方式或按剂量依赖性方式发生。
还提供了用于预防、治疗和改善与PKK相关的疾病、病症和病状的化合物、组合物和方法。在某些实施方案中，此类PKK相关的疾病、病症和病状为炎症性疾病。在某些实施方案中，所述炎症性疾病可为急性或慢性炎症性疾病。在某些实施方案中，此类炎症性疾病可包括遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑血管性水肿、眼部水肿、黄斑水肿和脑水肿。在某些实施方案中，此类PKK相关的疾病、病症和病状为血栓栓塞性疾病。在某些实施方案中，此类血栓栓塞性疾病可包括血栓形成、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞、中风和梗塞。
此类疾病、病症和病状可具有一种或多种共同的风险因素、起因或结果。
炎症性疾病发展的某些风险因素和起因包括对炎症性疾病的遗传倾向和环境因素。在某些实施方案中，受试者具有突变补体1酯酶抑制剂(C1-INH)基因或突变因子12基因。在某些实施方案中，受试者已经服用或正在服用血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)或血管紧张素II受体阻断剂(ARB)。在某些实施方案中，受试者已经有过导致血管性水肿的变态反应。在某些实施方案中，受试者具有I型HAE。在某些实施方案中，受试者具有II型HAE。在某些实施方案中，受试者具有III型HAE。
与炎症性疾病发展相关的某些结果包括在不同的身体部位，包括四肢(即，手、足部、臂、腿)、肠(腹部)、面部、生殖器、喉(即，喉头)的水肿/肿胀；血管通透性；血管渗漏；普遍性炎症；腹痛；肿胀；呕吐；腹泻；皮肤瘙痒；呼吸(哮喘)反应；鼻炎；过敏性反应；支气管收缩；低血压；昏迷；和死亡。
血栓栓塞性疾病发展的某些风险因素和起因包括对血栓栓塞性疾病的遗传倾向、不动、手术(特别是骨科手术)、恶性肿瘤、妊娠、老龄、使用口服避孕药、心房纤维性颤动、先前的血栓栓塞性病状、慢性炎症性疾病和遗传性或获得性血栓前凝血障碍。与血栓栓塞性病状发展相关的某些结果包括通过受影响的血管的血流量降低、组织坏死和死亡。
在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用PKK反义化合物。在某些实施方案中，治疗方法包括向有需要的个体施用PKK反义寡核苷酸。
附图说明
图1为来自于如实施例11中描述的血样的HMWK的Western印迹量化。
图2为来自于如实施例14中描述的血样的HMWK的Western印迹量化。
发明详述
正如所要求保护的那样，应理解前面的概述和以下的详述仅为示例性和解释性并不限制本发明。除非另有特别说明，否则本文中，单数的使用包括复数。除非另有说明，否则如本文中所用，使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其它形式，诸如“包括”和“被包括”的使用，并非限制性。同样地，除非另有特别说明，否则诸如“元素”或“组分”的术语涵盖包含一个单位的元素和组分和包含一个以上亚单位的元素和组分。
本文所用的分段标题仅用于组织的目的，不得被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，特此通过对本文讨论的文件的部分的引用，以及整体明确并入。
定义
除非提供了明确定义，否则连同本文描述的分析化学、合成有机化学及医学和药物化学使用的命名和分析化学、合成有机化学及医学和药物化学的工序和技术是本领域公知且常用的那些。标准技术可用于化学合成和化学分析。在允许的情况下，所有专利、申请、公开申请和其它申请、可通过数据库诸如国家生物技术信息中心(NCBI)获得的基因库登录号和相关序列信息及本文公开内容中通篇所提到的其它数据通过对本文讨论的文件的部分的引用以及整体并入。
除非另外指出，否则以下术语具有以下含义：
“2’-O-甲氧基乙基”(也为2’-MOE和2’-OCH2CH2-OCH3和MOE)是指呋喃糖环的2’位置的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是经修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷”(也为“2’-MOE核苷”)意指包含2’-MOE修饰糖部分的核苷。
“2’-取代的核苷”意指在呋喃糖基环的2’-位置包含除H或OH外的取代基的核苷。在某些实施方案中，2’取代的核苷包括具有双环糖修饰的核苷。
“2’-脱氧核苷”意指在核苷的糖部分的2’位置包含氢的核苷。
“3’靶位点”是指靶核酸的与特定反义化合物的3’-最末端核苷酸互补的核苷酸。
“5’靶位点”是指靶核酸的与特定反义化合物的5’-最末端核苷酸互补的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指经附着于5位置的甲基修饰的胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶是经修饰的核碱基。
“约”意指值的±7％以内。例如，如有说明，则“所述化合物影响PKK的至少约70％抑制”，其暗示PKK水平受到63％和77％范围内的抑制。
“相伴施用”是指两种药物剂以两者的药理学作用在患者中同时表现的任何方式联合施用。相伴施用不需要两种药物剂呈单一药物组合物，呈相同剂型或通过相同施用途径施用。两种药物剂的作用本身不需要同时表现。作用仅需重叠一段时间而不需要在时间上共同扩张。
“施用”意指向动物提供药物剂并且包括但不限于由医疗技术人员施用和自我施用。
“改善”是指病状或疾病的严重程度的至少一种指标减轻、减缓、停止或逆转。可通过本领域中技术人员已知的主观或客观测量测定指标的严重程度。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪及非人灵长类动物，包括但不限于猴子和黑猩猩。
“反义活性”意指反义化合物与其靶核酸杂交所引起的任何可检测或可测量的活性。在某些实施方案中，反义活性为靶核酸或该靶核酸编码的蛋白质的量或表达的减少。“反义化合物”意指能够通过氢键合进行与靶核酸的杂交的寡聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA和基于占用的化合物。
“反义化合物”意指能够通过氢键合进行与靶核酸的杂交的寡聚化合物。反义化合物的实例包括单链和双链化合物，诸如反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、ssRNA和基于占用的化合物。
“反义抑制”意指在与靶核酸互补的反义化合物存在时，与没有所述反义化合物时的靶核酸水平相比，靶核酸水平降低。“反义机制”是牵涉化合物与靶核酸杂交的所有机制，其中杂交的结果或影响是靶标降解或靶标占用，及牵涉例如转录或剪接的细胞器的相伴失速。
“反义机制”是牵涉化合物与靶核酸杂交的所有机制，其中杂交的结果或影响是靶标降解或靶标占用，及牵涉例如转录或剪接的细胞器的相伴失速。
“反义寡核苷酸”意指具有容许与靶核酸的相应区段杂交的核碱基序列的单链寡核苷酸。“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核碱基与靶核酸中的相应核碱基的精确碱基配对(即，杂交)的能力，并且受相应核碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反胡斯坦氢结合介导。
“碱基互补性”是指反义寡核苷酸的核碱基与靶核酸中的相应核碱基的精确碱基配对(即，杂交)的能力，并且受相应核碱基之间的沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反胡斯坦氢结合介导。
“双环糖”意指通过两个原子的桥联而修饰的呋喃糖环。双环糖是经修饰的糖。
“双环核苷”(也为双环核酸或BNA)意指具有包含连接糖环的两个碳原子，从而形成双环环系的桥的糖部分的核苷。在某些实施方案中，所述桥连接糖环的4’-碳和2’-碳。
“帽结构”或“末端帽部分”意指已经并入反义化合物任一末端的化学修饰。
“cEt”或“限制型乙基”意指具有包含连接4’-碳和2’-碳的桥的糖部分的双环核苷，其中所述桥具有式：4’-CH(CH3)-O-2’。
“cEt修饰的核苷”(也为“限制型乙基核苷”)意指包含含4’-CH(CH3)-O-2’桥的双环糖部分的核苷。
“化学独特区域”是指反义化合物中在某些方面在化学上不同于相同反义化合物的另一区域的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域在化学上不同于具有无2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷的区域。
“嵌合型反义化合物”意指具有至少2个化学独特区域，每个位置具有多个亚单位的反义化合物。
“共同施用”意指向个体施用两种或更多种药物剂。所述两种或更多种药物剂可呈单一药物组合物，或可呈单独的药物组合物。所述两种或更多种药物剂的每一种可通过相同或不同的施用途径施用。共同施用涵盖并行或相继施用。
“互补性”意指第一核酸和第二核酸的核碱基之间配对的能力。
“包含”将被理解为暗示包括规定的步骤或元素或一组步骤或元素但不排除任何其它步骤或元素或其它组的步骤或元素。
“连续核碱基”意指彼此直接相邻的核碱基。
“设计”或“设计为”是指产生与所选核酸分子特异性杂交的寡聚化合物的过程。
“稀释剂”意指组合物中缺乏药理学活性，但是在药学上必需或合乎需要的成分。例如，在注射的药物中，稀释剂可为液体，例如盐水溶液。
“剂量”意指在单次施用或在规定时间段内提供的药物剂的规定量。在某些实施方案中，一个剂量可分一个、两个或更多个丸剂、片剂或注射剂施用。例如，在需要皮下施用的某些实施方案中，所需剂量需要不易于通过单个注射剂提供的体积，因此，可使用两个或更多个注射剂以达到所需剂量。在某些实施方案中，可通过在长时间段内或不断地输注而施用药物剂。剂量可规定为每小时、每天、每周或每月药物剂的量。
“下游”是指朝着核酸3’末端或C末端的相对方向。
“有效量”在调节活性或治疗或预防病状的情况下意指向需要此类调节、治疗或预防的受试者，呈单剂量或作为一系列的一部分施用的对调节该作用，或对该病状的治疗或预防或改善有效的药物剂的量。有效量可在个体中根据待治个体的健康和身体状况，待治个体的分类学类别、所述组合物的配方、个体医疗状况的评估和其它有关因素而改变。
“功效”意指产生所需效果的能力。
“表达”包括将基因的编码信息转化为在细胞中存在且起作用的结构的所有功能。此类结构包括但不限于转录和翻译的产物。
“完全互补”或“100％互补”意指第一核酸的每个核碱基具有第二核酸中的互补核碱基。在某些实施方案中，第一核酸为反义化合物并且靶核酸为第二核酸。
“间隔体(gapmer)”意指一种嵌合型反义化合物，其中具有多个支持RNA酶H裂解的核苷的内部区域位于具有一个或多个核苷的外部区域之间，其中构成内部区域的核苷化学上不同于构成外部区域的核苷或多个核苷。内部区域可被称为“间隙”而外部区域可被称为“侧翼”。
“杂交”意指互补核酸分子的退火。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和靶核酸。在某些实施方案中，互补核酸分子包括但不限于反义寡核苷酸和核酸靶标。
“鉴定具有炎症性疾病的动物”意指鉴定已经诊断出炎症性疾病或倾向于发展炎症性疾病的动物。倾向于发展炎症性疾病的个体包括具有发展炎症性疾病的一个或多个风险因素，包括环境因素，具有个人或家族史，或对一种或多种炎症性疾病的遗传倾向的个体。此类鉴定可通过任何方法实现，包括评价个体的病史和标准临床试验或评估，诸如基因检测。
“鉴定具有PKK相关疾病的动物”意指鉴定已经诊断出PKK相关疾病或倾向于发展PKK相关疾病的动物。倾向于发展PKK相关疾病的个体包括具有发展PKK相关疾病的一个或多个风险因素，包括具有个人或家族史，或对一种或多种PKK相关疾病的遗传倾向的个体。此类鉴定可通过任何方法实现，包括评价个体的病史和标准临床试验或评估，诸如基因检测。
“鉴定具有血栓栓塞性疾病的动物”意指鉴定已经诊断出血栓栓塞性疾病或倾向于发展血栓栓塞性疾病的动物。倾向于发展血栓栓塞性疾病的个体包括具有发展血栓栓塞性疾病的一个或多个风险因素的个体，包括具有个人或家族史，或对一种或多种血栓栓塞性疾病的遗传倾向、不动、手术(特别是骨科手术)、恶性肿瘤、妊娠、老龄、使用口服避孕药、心房纤维性颤动、先前的血栓栓塞性病状、慢性炎症性疾病和遗传性或获得性血栓前凝血障碍。此类鉴定可通过任何方法实现，包括评价个体的病史和标准临床试验或评估，诸如基因检测。
“直接相邻”意指在直接相邻的元素之间没有介入元素。“个体”意指选择用于处理或治疗的人或非人动物。
“个体”意指选择用于处理或治疗的人或非人动物。
“抑制PKK”意指降低PKKmRNA和/或蛋白质的水平或表达。在某些实施方案中，PKKmRNA和/或蛋白质水平在靶向PKK的反义化合物，包括靶向PKK的反义寡核苷酸的存在下，与没有PKK反义化合物，诸如反义寡核苷酸时的PKKmRNA表达和/或蛋白质水平相比受抑制。
“抑制表达或活性”是指降低或阻滞表达或活性并且不一定指完全消除表达或活性。
“核苷间键联”是指核苷之间的化学键。
“连接的核苷”意指通过核苷间键联连接在一起的相邻核苷。
“锁核酸”或“LNA”或“LNA核苷”意指具有连接核苷糖单位的4’和2’位置之间的两个碳原子，从而形成双环糖的桥的核酸单体。此类双环糖的实例包括但不限于如以下所描绘的A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA、(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA、(C)乙烯氧基(4’-(CH2)2-O-2’)LNA、(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)LNA和(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)LNA。
如本文中所用，LNA化合物包括但不限于在糖的4’和2’位置之间具有至少一个桥的化合物，其中每个桥独立地包含独立地选自-[C(R1)(R2)]n-、-C(R1)＝C(R2)-、-C(R1)＝N-、-C(＝NR1)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(R1)2-、-S(＝O)x-和-N(R1)-的1个或2至4个连接的基团；其中：x为0、1或2；n为1、2、3或4；每个R1和R2独立地为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、杂环基团、经取代的杂环基团、杂芳基、经取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、经取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且每个J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、杂环基团、经取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、经取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。
涵盖在LNA定义内的4’-2’桥联基团的实例包括但不限于下式之一：-[C(R1)(R2)]n-、-[C(R1)(R2)]n-O-、-C(R1R2)-N(R1)-O-或-C(R1R2)-O-N(R1)-。此外，涵盖在LNA定义内的其它桥联基团为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R1)-2'和4'-CH2-N(R1)-O-2'-桥，其中每个R1和R2独立地为H、保护基团或C1-C12烷基。
根据本发明在LNA定义内还包括其中核糖基糖环的2'-羟基与糖环的4'碳原子连接，从而形成亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)桥以形成双环糖部分的LNA。所述桥也可为连接2'氧原子和4'碳原子的亚甲基(-CH2-)基团，对其而言使用术语亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA。此外，在这个位置具有乙烯桥联基团的双环糖部分的情况下，使用术语乙烯氧基(4’-CH2CH2-O-2’)LNA。如本文中所用，α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)，其为亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)LNA的异构体，也涵盖在LNA定义内。
“错配”或“非互补核碱基”是指第一核酸的核碱基不能与第二或靶核酸的相应核碱基配对时的情况。
“经修饰的核苷间键联”是指天然存在的核苷间键(即，核苷间磷酸二酯键)的取代或任何变化。
“经修饰的核碱基”意指除了腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶(也称为5-甲基尿嘧啶)或尿嘧啶之外的任何核碱基。“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“经修饰的核苷”意指独立具有经修饰的糖部分和/或经修饰的核碱基的核苷。
“经修饰的核苷酸”意指独立具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷间键联或经修饰的核碱基的核苷酸。
“经修饰的寡核苷酸”意指包含至少一个经修饰的核苷间键联、经修饰的糖和/或经修饰的核碱基的寡核苷酸。
“经修饰的糖”意指从天然糖部分的取代和/或任何变化。
“单体”意指寡聚物的单个单位。单体包括但不限于天然存在的或经修饰的核苷和核苷酸。
“基序”意指反义化合物中未修饰和经修饰的核苷的模式。
“天然糖部分”是指在DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中发现的糖部分。
“天然存在的核苷间键联”是指3'至5'磷酸二酯键联。
“非互补核碱基”是指相互不形成氢键或以其它方式支持杂交的一对核碱基。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、双链核酸、小干扰核糖核酸(siRNA)和微RNA(miRNA)。
“核碱基”意指能够与另一核酸的碱基配对的杂环部分。
“核碱基互补性”是指核碱基能够与另一核碱基碱基配对。例如，在DNA中，腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)互补。例如，在RNA中，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)互补。在某些实施方案中，互补核碱基是指反义化合物的能够与其靶核酸的核碱基碱基配对的核碱基。例如，如果在反义化合物某一位置的核碱基能够与在靶核酸某一位置的核碱基氢键合，则认为寡核苷酸和靶核酸之间氢键合的位置在该核碱基对处互补。
“核碱基序列”意指不依赖于任何糖、键联和/或核碱基修饰的连续核碱基的顺序。
“核苷”意指与糖连接的核碱基。
“核苷模拟物”包括用于置换寡聚化合物的一个或多个位置上的糖或糖和碱基而未必是键联的那些结构，例如具有吗啉代、环己烯基、环己基、四氢吡喃基、如非呋喃糖单元的双环或三环糖模拟物的核苷模拟物。核苷模拟物包括用于置换寡聚化合物的一个或多个位置上的核苷和键联的那些结构，例如肽核酸或吗啉代(通过-N(H)-C(＝O)-O-或其它非磷酸二酯键联连接的吗啉代)。糖替代物与稍广义的术语核苷模拟物有重叠，但仅仅旨在用于表示糖单元(呋喃糖环)的置换。本文提供的四氢吡喃环说明了糖替代物的实例，其中呋喃糖基团已经被四氢吡喃环系所置换。“模拟物”是指取代糖、核碱基和/或核苷间键联的基团。通常，模拟物用于代替糖或糖-核苷间键联组合，并且核碱基保持与所选靶标杂交。
“核苷酸”意指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。
“脱靶效应”是指与除预期靶核酸外的基因的RNA或蛋白质表达调节相关的不必要或有害生物效应。
“寡聚化合物”或“寡聚物”意指能够与核酸分子的至少一个区域杂交的连接的单体亚单位的聚合物。
“寡核苷酸”意指连接核苷的聚合物，每个核苷可经修饰或未修饰，彼此独立。
“肠胃外施用”意指通过注射(例如，弹丸注射)或输注施用。肠胃外施用包括皮下施用、静脉施用、肌肉施用、动脉施用、腹腔内施用或颅内施用，例如鞘内或脑室内施用。
“肽”意指通过酰胺键连接至少两个氨基酸形成的分子。无限制，如本文中所用，肽是指多肽和蛋白质。
“药物剂”意指当施用给个体时提供治疗益处的物质。例如，在某些实施方案中，靶向PKK的反义寡核苷酸为药物剂。
“药物组合物”意指适于施用给受试者的物质的混合物。例如，药物组合物可包含反义寡核苷酸和无菌水溶液。
“药学上可接受的衍生物”涵盖本文描述的化合物药学上可接受的盐、缀合物、前药或异构体。
“药学上可接受的盐”意指生理学和药学上可接受的反义化合物的盐，即保持亲本寡核苷酸的所需生物活性而不赋予其不需要的毒性效果的盐。
“硫代磷酸酯键联”意指核苷之间的键联，其中通过用硫原子置换非桥联氧原子之一而修饰磷酸二酯键。硫代磷酸酯键联是经修饰的核苷间键联。
“PKK”意指哺乳动物血浆前激肽释放酶，包括人血浆前激肽释放酶。血浆前激肽释放酶(PKK)是由KLKB1基因编码的血浆激肽释放酶(PK)的前体。
“PKK相关疾病”意指与任何PKK核酸或其表达产物相关的任何疾病。此类疾病可包括炎症性疾病或血栓栓塞性疾病。此类疾病可包括遗传性血管性水肿(HAE)。
“PKKmRNA”意指编码PKK的DNA序列的任何信使RNA表达产物。
“PKK核酸”意指编码PKK的任何核酸。例如，在某些实施方案中，PKK核酸包括编码PKK的DNA序列、由编码PKK的DNA转录的RNA序列(包括含内含子和外显子的基因组DNA)和编码PKK的mRNA序列。“PKKmRNA”意指编码PKK蛋白质的mRNA。
“PKK蛋白质”意指PKK核酸的多肽表达产物。
“部分”意指核酸中确定数量的连续(即，连接的)核碱基。在某些实施方案中，部分是靶核酸中确定数量的连续核碱基。在某些实施方案中，部分是反义化合物中确定数量的连续核碱基。
“预防”是指延迟或预先阻止疾病、病症或病状的发作或发展从几分钟到几天、几周到几个月或不确定的时间段。
“前药”意指呈非活性形式制备的在身体或细胞内通过内源酶或其它化学药品和/或条件转化为活性形式(即，药物)的治疗剂。
“预防有效量”是指为动物提供预防性或预防性益处的药物剂的量。
“区域”定义为靶核酸的具有至少一种可鉴定结构、功能或特征的一部分。
“核糖核苷酸”意指在核苷酸糖部分的2’位置具有羟基的核苷酸。核糖核苷酸可经多种取代基中的任一种取代。
“盐”意指生理学和药学上可接受的反义化合物的盐，即保持亲本寡核苷酸的所需生物活性而不赋予其不需要的毒性效果的盐。
“区段”定义为靶核酸内区域的较小或子部分。
“副作用”意指由治疗所引起的除所需效果之外的生理反应。在某些实施方案中，副作用包括但不限于注射部位反应、肝功能试验异常、肾功能异常、肝脏毒性、肾脏毒性、中枢神经系统异常和肌病。
“单链寡核苷酸”意指未与互补链杂交的寡核苷酸。
如本文中所用，“位点”定义为靶核酸内独特的核碱基位置。
“可特异性杂交”是指反义化合物在反义寡核苷酸和靶核酸之间具有足以诱导所需效应的互补度，同时在需要特异性结合的条件下，即在体内测定和治疗处理时的生理条件下对非靶核酸表现出最低影响或无影响。
“严格杂交条件”或“严格条件”是指寡聚化合物将与其靶序列杂交，但不与最少数量的其它序列杂交的条件。
“受试者”意指选择用于处理或治疗的人或非人动物。
“靶标”是指需要对其调节的蛋白质。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶向”意指设计并选择将与靶核酸特异性杂交并诱导所需效应的反义化合物的过程。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录产物”和“核酸靶标”全部意指能够被反义化合物靶向的核酸。
“靶区”意指一种或多种反义化合物靶向的靶核酸的一部分。
“靶区段”意指反义化合物靶向的靶核酸的核苷酸的序列。“5’靶位点”是指靶区段的5’最末端核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’最末端核苷酸。
“治疗有效量”意指为个体提供治疗益处的药物剂的量。
“治疗”是指施用组合物以实现所述疾病或病状的改善。
“未修饰的核碱基”意指嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。
“未修饰的核苷酸”意指由天然存在的核碱基、糖部分和核苷间键联组成的核苷酸。在某些实施方案中，未修饰的核苷酸为RNA核苷酸(即β-D-核糖核苷)或DNA核苷酸(即β-D-脱氧核糖核苷)。
“上游”是指朝着核酸的5’末端或N末端的相对方向。
“侧翼区段”意指经修饰而赋予寡核苷酸诸如增强的抑制活性、提高的对靶核酸的结合亲和力或对体内核酸酶降解的抵抗力等性质的多个核苷。
某些实施方案
某些实施方案提供了抑制血浆前激肽释放酶(PKK)mRNA和蛋白质表达的化合物、组合物和方法。某些实施方案提供了降低PKKmRNA和蛋白质水平的化合物、组合物和方法。
某些实施方案提供了靶向血浆前激肽释放酶(PKK)核酸的反义化合物。在某些实施方案中，PKK核酸为基因库登录号NM_000892.3(本文作为SEQIDNO:1并入)、基因库登录号DC412984.1(本文作为SEQIDNO:2并入)、基因库登录号CN265612.1(本文作为SEQIDNO:3并入)、基因库登录号AK297672.1(本文作为SEQIDNO:4并入)、基因库登录号DC413312.1(本文作为SEQIDNO:5并入)、基因库登录号AV688858.2(本文作为SEQIDNO:6并入)、基因库登录号CD652077.1(本文作为SEQIDNO:7并入)、基因库登录号BC143911.1(本文作为SEQIDNO:8并入)、基因库登录号CB162532.1(本文作为SEQIDNO:9并入)、基因库登录号NT_016354.19(截自核碱基111693001至111730000)(本文作为SEQIDNO:10并入)、基因库登录号NM_008455.2(本文作为SEQIDNO:11并入)、基因库登录号BB598673.1(本文作为SEQIDNO:12并入)、基因库登录号NT_039460.7(截自核碱基6114001至6144000)(本文作为SEQIDNO:13并入)、基因库登录号NM_012725.2(本文作为SEQIDNO:14并入)、基因库登录号NW_047473.1(截自核碱基10952001至10982000)(本文作为SEQIDNO:15并入)、基因库登录号XM_002804276.1(本文作为SEQIDNO:17并入)和基因库登录号NW_001118167.1(截自核碱基2358000至2391000)(本文作为SEQIDNO:18并入)中列出的序列。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:30-2226中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:570的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:705的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:1666的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
某些实施方案提供了化合物，其包含由20个连接的核苷组成并且具有SEQIDNO:570的核碱基序列的经修饰的寡核苷酸。
某些实施方案提供了化合物，其包含由20个连接的核苷组成并且具有SEQIDNO:705的核碱基序列的经修饰的寡核苷酸。
某些实施方案提供了化合物，其包含由16个连接的核苷组成并且具有SEQIDNO:1666的核碱基序列的经修饰的寡核苷酸。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:62、72、103、213、312、334-339、344、345、346、348、349、351、369、373、381、382、383、385、387-391、399、411、412、414、416、444、446-449、452、453、454、459、460、462-472、473、476、477、479、480、481、484、489-495、497、500、504、506、522、526、535、558、559、560、564、566、568-571、573、576、577、578、587、595、597-604、607、608、610、613、615、618、619、622、623、624、633、635、636、638、639、640、642、643、645、652、655-658、660、661、670、674-679、684、685、698、704、705、707、708、713、716、717、728、734、736、767、768、776、797、798、800、802、810、815、876、880、882、883、886、891、901-905、908-911、922、923、924、931、942、950-957、972、974、978、979、980、987-991、1005、1017-1021、1025、1026、1029、1030、1032、1034、1035、1037、1040、1041、1045、1046、1051、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1076、1087、1089、1111、1114、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1181、1182、1187、1196、1200、1214、1222、1267、1276、1277、1285、1286、1289、1290、1291、1303、1367、1389、1393、1398-1401、1406、1407、1408、1411、1419-1422、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1439、1440、1443、1444、1451、1452、1471、1516、1527、1535、1537、1538、1539、1540、1541、1563、1564、1567、1568、1616、1617、1623、1629、1664、1665、1666、1679、1687、1734、1804、1876、1886、1915、2008、2018、2100、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少80％mRNA抑制。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:62、72、103、213、334-339、344、346、348、349、351、381、382、383、385、389、390、391、446、448、452、453、454、466-473、476、481、484、491、492、494、495、497、504、526、558、559、566、568-571、576、578、587、595、597、598、600-604、607、610、613、618、619、624、635、638、639、645、652、656、657、658、660、674、675、676、684、698、704、705、707、713、716、768、876、880、901-905、908-911、922、923、924、931、942、951、954-957、972、974、978、979、987、988、990、1005、1019、1020、1021、1025、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1111、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1200、1222、1267、1285、1290、1291、1303、1367、1398、1399、1401、1406、1408、1411、1419、1420、1421、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1440、1443、1444、1451、1537-1540、1563、1616、1679、1687、1804、2008、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少85％mRNA抑制。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、346、351、382、390、391、446、448、452、453、468、469、470、471、472、476、481、491、495、504、558、566、568、570、571、578、587、597、598、600、604、613、635、638、645、656、658、660、674、675、684、704、705、880、901-905、909、922、931、951、954、956、990、1005、1020、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1075、1111、1125、1133、1153、1200、1267、1291、1303、1398、1399、1401、1406、1420、1426、1430、1431、1434、1435、1436、1440、1443、1451、1537-1540、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少90％mRNA抑制。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、391、448、468、469、568、570、598、635、658、674、684、705、901、903、904、922、990、1267、1291、1420、1430、1431、1434、1435、1436、1537、1538和1540中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少95％mRNA抑制。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、338、346、349、382、383、390、448、452、453、454、495、526、559、570、587、598、635、660、705、901、903、904、908、923、931、955、974、988、990、1020、1039、1040、1111、1117、1267、1291、1349、1352、1367、1389、1393、1399、1401、1408、1411、1426、1499、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1624、1643、1661、1665、1666、1673、1679、1695、1720、1804、1817、1876、1881、1886、1940、1947、2008、2018、2019、2031、2044、2100、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现0.4或更低的IC50(μM)。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、346、349、382、453、454、495、526、570、587、598、635、660、901、903、904、931、955、990、1020、1111、1267、1349、1352、1367、1389、1399、1408、1411、1426、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1643、1661、1665、1666、1673、1695、1804、1876、1881、2019、2044、2100、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现0.3或更低的IC50(μM)。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、346、382、453、495、526、570、587、598、635、901、904、931、955、1020、1111、1349、1352、1389、1426、1516、1535、1544、1548、1564、1569、1598、1616、1617、1665、1666、1804、1876、1881、2019、2044、2101和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现0.2或更低的IC50(μM)。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、495、587、598、635、1349、1352、1389、1516、1544、1548、1569、1598、1617、1665、1666、1804、1881和2019中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸实现低于0.2的IC50(μM)。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基27427-27466的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基33183-33242的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基30570-30610的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基27427-27520的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基33085-33247的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基30475-30639的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基27362-27524的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基33101-33240的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基30463-30638的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
某些实施方案提供了化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与PKK核酸的外显子9、外显子12或外显子14的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
在某些实施方案中所述经修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQIDNO:10至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在某些实施方案中，所述化合物由单链经修饰的寡核苷酸组成。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键联为经修饰的核苷间键联。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的至少一个经修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联均为硫代磷酸酯键联。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含经修饰的核碱基。
在某些实施方案中，所述经修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖。
在某些实施方案中，所述经修饰的糖包含2’修饰的糖、BNA或THP。
在某些实施方案中，所述经修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲基、限制型乙基、LNA或3’-氟-HNA中的任一种。
在某些实施方案中，所述化合物包含至少一个2’-O-甲氧基乙基核苷、2’-O-甲基核苷、限制型乙基核苷、LNA核苷或3’-氟-HNA核苷。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸包含：
由10个连接的脱氧核苷组成的间隙区段；
由5个连接的核苷组成的5’侧翼区段；和
由5个连接的核苷组成的3’侧翼区段；
其中所述间隙区段位于所述5’侧翼区段和所述3’侧翼区段之间并且其中每个侧翼区段的每个核苷均包含经修饰的糖。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。
在某些实施方案中，所述经修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
某些实施方案提供了由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成的化合物：TesGesmCesAesAesGdsTdsmCdsTdsmCdsTdsTdsGdsGdsmCdsAesAesAesmCesAe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
某些实施方案提供了由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成的化合物：mCesmCesmCesmCesmCesTdsTdsmCdsTdsTdsTdsAdsTdsAdsGdsmCesmCesAesGesmCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
某些实施方案提供了由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成的化合物：mCesGesAksTdsAdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsTdsTdsmCksmCksmCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
k＝cEt修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
某些实施方案提供了根据下式的化合物：
某些实施方案提供了根据下式的化合物：
某些实施方案提供了根据下式的化合物：
某些实施方案提供了包含根据任何前述权利要求所述的化合物或其盐和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂的组合物。
某些实施方案提供了包括向动物施用根据任何前述权利要求所述的化合物或组合物的方法。
在某些实施方案中，所述动物为人。
在某些实施方案中，施用所述化合物预防、治疗或改善PKK相关的疾病、病症或病状。
在某些实施方案中，所述PKK相关的疾病、病症或病状为遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑血管性水肿、眼部水肿、黄斑水肿、脑水肿、血栓形成、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞、中风或梗塞。
某些实施方案提供了根据任何前述权利要求所述的化合物或组合物用于生产治疗炎症性疾病或血栓栓塞性疾病的药剂的用途。
反义化合物
寡聚化合物包括但不限于寡核苷酸、寡核苷、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、反义化合物、反义寡核苷酸和siRNA。寡聚化合物可与靶核酸“反义”，意味着寡聚化合物能够通过氢键合进行与靶核酸的杂交。
在某些实施方案中，反义化合物具有在按5’至3’方向书写时，包含其靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。在某些此类实施方案中，反义寡核苷酸具有在按5’至3’方向书写时，包含其靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列的核碱基序列。
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为12至30个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为12至25个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为12至22个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为14至20个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为15至25个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为18至22个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为19至21个亚单位。在某些实施方案中，反义化合物长度为8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至30、18至50、19至30、19至50或20至30个连接的亚单位。
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为12个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为13个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为14个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为15个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为16个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为17个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为18个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为19个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为20个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为21个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为22个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为23个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为24个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为25个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为26个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为27个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为28个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为29个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为30个亚单位。在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物长度为31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80个连接的亚单位，或为以上任两个值限定的范围。在某些实施方案中，反义化合物为反义寡核苷酸，并且连接的亚单位为核苷酸。
在某些实施方案中靶向PKK核酸的反义寡核苷酸可缩短或截短。例如，可从5’末端(5’截短)，或可选地从3’末端(3’截短)删除单个亚单位。靶向PKK核酸的缩短或截短反义化合物可有两个亚单位从反义化合物的5’末端删除，或可选地可有两个亚单位从3’末端删除。可选地，删除的核苷可分散在整个反义化合物中，例如在有一个核苷从5’末端删除和一个核苷从3’末端删除的反义化合物中。
当在延长的反义化合物中存在单个附加亚单位时，该附加亚单位可位于反义化合物的5’或3’末端。当存在两个或更多个附加亚单位时，添加的亚单位可相互邻近，例如，在有两个亚单位添加到反义化合物的5’末端(5’添加)，或可选地添加到3’末端(3’添加)的反义化合物中。可选地，添加的亚单位可分散在整个反义化合物中，例如在有一个亚单位添加到5’末端和一个亚单位添加到3’末端的反义化合物中。
可能增加或减小反义化合物，诸如反义寡核苷酸的长度，和/或引入错配碱基，而不消除活性。例如，在Woolf等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:7305-7309,1992)中，在卵母细胞注射模型中试验了一系列长度为13-25个核碱基的反义寡核苷酸诱导靶RNA裂解的能力。虽然程度低于不含错配的反义寡核苷酸，但长度为25个核碱基，在反义寡核苷酸末端附近具有8或11个错配碱基的反义寡核苷酸能够指导靶mRNA的特异性裂解。类似地，使用13个核碱基的反义寡核苷酸，包括具有1或3个错配的反义寡核苷酸实现靶标特异性裂解。
Gautschi等(J.Natl.CancerInst.93:463-471，2001年3月)证明了与bcl-2mRNA具有100％互补性并且与bcl-xLmRNA具有3个错配的寡核苷酸降低bcl-2和bcl-xL两者在体外和体内的表达的能力。此外，这种寡核苷酸在体内展现出有效的抗肿瘤活性。
Maher和Dolnick(Nuc.Acid.Res.16:3341-3358，1988)在兔网织红细胞测定中试验了一系列14个核碱基的串联反义寡核苷酸和分别由两个或三个串联反义寡核苷酸组成的28和42个核碱基的反义寡核苷酸阻止人DHFR翻译的能力。虽然在比28或42个核碱基的反义寡核苷酸更适度的水平上，但三个14个核碱基的反义寡核苷酸单独的每一个均能抑制翻译。
反义化合物基序
在某些实施方案中，靶向PKK核酸的反义化合物具有呈赋予反义化合物诸如增强的抑制活性、提高的对靶核酸的结合亲和力或对体内核酸酶降解的抵抗力等性质的模式或基序排列的化学修饰亚单位。
嵌合型反义化合物通常含有至少一个经修饰的区域以便赋予对核酸酶降解提高的抵抗力、提高的细胞摄取、提高的对靶核酸的结合亲和力和/或提高的抑制活性。嵌合型反义化合物的第二个区域可任选地用作裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶RNA酶H的底物。
具有间隔体基序的反义化合物被视为嵌合型反义化合物。在间隔体中，具有多个支持RNA酶H裂解的核苷酸的内部区域位于具有多个化学上不同于内部区域核苷的核苷酸的外部区域之间。在具有间隔体基序的反义寡核苷酸的情况下，间隙区段通常用作内切核酸酶裂解的底物，而侧翼区段包含经修饰的核苷。在某些实施方案中，间隔体的区域区别在于包含每个独特区域的糖部分的类型。在一些实施方案中用于区别间隔体区域的糖部分的类型可包括β-D-核糖核苷、β-D-脱氧核糖核苷、2’-修饰的核苷(此类2'-修饰的核苷可包括2’-MOE和2’-O-CH3等等)和双环糖修饰的核苷(此类双环糖修饰的核苷可包括具有其中n＝1或n＝2的4’-(CH2)n-O-2’桥和4’-CH2-O-CH2-2’的核苷)。在某些实施方案中，侧翼可包括几个经修饰的糖部分，包括例如2’-MOE。在某些实施方案中，侧翼可包括几个经修饰和未修饰的糖部分。在某些实施方案中，侧翼可包括2’-MOE核苷和2’-脱氧核苷的各种组合。
每个独特区域可包含一致的糖部分、不同或交替的糖部分。侧翼-间隙-侧翼基序经常描述为“X-Y-Z”，其中，“X”表示5’侧翼的长度,“Y”表示间隙的长度，并且“Ζ”表示3’侧翼的长度。“X”和“Ζ”可包含一致、不同或交替的糖部分。在某些实施方案中，“X”和“Y”可包括一个或多个2’-脱氧核苷。“Y”可包含2’-脱氧核苷。如本文中所用，被描述为“X-Y-Z”的间隔体具有使得间隙与5’侧翼和3”侧翼中的每一个直接相邻的构型。因此，在5’侧翼和间隙之间或间隙和3’侧翼之间不存在介入核苷酸。本文描述的任何反义化合物可以具有间隔体基序。在某些实施方案中，“X”和“Ζ”相同；在其它实施方案中，它们不同。
在某些实施方案中，本文提供的价格提包括，例如具有5-10-5基序的20聚体。
靶核酸、靶区和核苷酸序列
编码人血浆前激肽释放酶(PKK)的核苷酸序列包括但不限于以下：基因库登录号NM_000892.3(本文作为SEQIDNO:1并入)、基因库登录号DC412984.1(本文作为SEQIDNO:2并入)、基因库登录号CN265612.1(本文作为SEQIDNO:3并入)、基因库登录号AK297672.1(本文作为SEQIDNO:4并入)、基因库登录号DC413312.1(本文作为SEQIDNO:5并入)、基因库登录号AV688858.2(本文作为SEQIDNO:6并入)、基因库登录号CD652077.1(本文作为SEQIDNO:7并入)、基因库登录号BC143911.1(本文作为SEQIDNO:8并入)、基因库登录号CB162532.1(本文作为SEQIDNO:9并入)、基因库登录号NT_016354.19(截自核碱基111693001至111730000)(本文作为SEQIDNO:10并入)、基因库登录号NM_008455.2(本文作为SEQIDNO:11并入)、基因库登录号BB598673.1(本文作为SEQIDNO:12并入)、基因库登录号NT_039460.7(截自核碱基6114001至6144000)(本文作为SEQIDNO:13并入)、基因库登录号NM_012725.2(本文作为SEQIDNO:14并入)、基因库登录号NW_047473.1(截自核碱基10952001至10982000)(本文作为SEQIDNO:15并入)、基因库登录号XM_002804276.1(本文作为SEQIDNO:17并入)和基因库登录号NW_001118167.1(截自核碱基2358000至2391000)(本文作为SEQIDNO:18并入)。
应理解本文所含实施例中每个SEQIDNO列出的序列和对糖部分、核苷间键联或核碱基的任何修饰无关。这样，由SEQIDNO限定的反义化合物可独立地包含对糖部分、核苷间键联或核碱基的一个或多个修饰。用Isis号(IsisNo)描述的反义化合物表示核碱基序列和基序的组合。
在某些实施方案中，靶区是靶核酸的结构限定区域。例如，靶区可涵盖3’UTR、5’UTR、外显子、内含子、外显子/内含子接点、编码区、翻译起始区、翻译终止区或其它限定的核酸区域。可通过登录号从序列数据库诸如NCBI获得PKK的结构限定区域并且此类信息通过引用并入本文。在某些实施方案中，靶区可涵盖从靶区内一个靶区段的5’靶位点到靶区内另一靶区段的3’靶位点的序列。
靶向包括确定与反义化合物杂交，使得发生所需作用的至少一个靶区段。在某些实施方案中，所需效果为mRNA靶核酸水平降低。在某些实施方案中，所需效果为靶核酸编码的蛋白质的水平降低或与靶核酸相关的表型变化。
靶区可含一个或多个靶区段。靶区内的多个靶区段可重叠。可选地，它们可非重叠。在某些实施方案中，靶区内的靶区段被不超过约300个核苷酸隔开。在某些实施方案中，靶区内的靶区段被靶核酸上的许多核苷酸，即约、不超过、不超过约250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10个核苷酸，或为前述任两个值限定范围的核苷酸隔开。在某些实施方案中，靶区内的靶区段被靶核酸上不超过或不超过约5个核苷酸隔开。在某些实施方案中，靶区段连续。考虑到了由具有为本文所列5’靶位点或3’靶位点中的任一个的起始核酸的范围所限定的靶区。
可在5’UTR、编码区、3’UTR、内含子、外显子或外显子/内含子接点中找到合适的靶区段。含起始密码子或终止密码子的靶区段也是合适的靶区段。合适的靶区段可明确排除某一结构限定区域诸如起始密码子或终止密码子。
合适的靶区段的确定可包括靶核酸的序列与整个基因组的其它序列的比较。例如，可使用BLAST算法鉴定在不同核酸中具有相似性的区域。这种比较可预防选择可按非特异性方式与除所选靶核酸外的序列(即，非靶或脱靶序列)杂交的反义化合物。
在活性靶区中反义化合物的活性(例如，如由靶核酸水平的降低百分数所定义的)可存在变化。在某些实施方案中，PKKmRNA水平降低表明抑制PKK表达。PKK蛋白质水平降低也表明抑制靶mRNA表达。进一步地，表型变化表明抑制PKK表达。例如，炎症得以减轻或预防可表明抑制PKK表达。再如，水肿/肿胀得以减轻或预防可表明抑制PKK表达。再如，血管通透性得以降低或预防可表明抑制PKK表达。再如，血管渗漏得以减少或预防可表明抑制PKK表达。在某些实施方案中，通过染料，诸如伊文氏蓝(EvansBlue)的量化而测量血管通透性。
杂交
在一些实施方案中，在本文公开的反义化合物和靶核酸之间发生杂交。最常见的杂交机制牵涉核酸分子互补核碱基之间的氢键合(例如，沃森-克里克、胡斯坦或反胡斯坦氢键合)。
杂交可在不同条件下发生。严格条件具有序列依赖性并且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
确定序列是否可与靶核酸特异性杂交的方法为本领域公知。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物可与靶核酸特异性杂交。
互补性
当反义化合物的足够数量的核碱基可与靶核酸的相应核碱基氢键合，使得发生所需作用(例如，靶核酸诸如PKK核酸的反义抑制)时，反义化合物和靶核酸相互互补。
可耐受反义化合物和PKK核酸之间非互补的核碱基，只要反义化合物仍能够与靶核酸特异性杂交。而且，反义化合物可与PKK核酸的一个或多个区段杂交，使得杂交事件中不牵涉介入或邻近区段(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其特定部分与PKK核酸、其靶区、靶区段或特定部分有或至少有70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补。反义化合物与靶核酸的互补性百分数可使用常规方法测定。
例如，其中反义化合物的20个核碱基中有18个与靶区互补，并且因此将特异性杂交的反义化合物将代表90％互补性。在这个实例中，剩余的非互补核碱基可聚集或散布有互补核碱基而不需要相互或与互补核碱基连续。这样，两侧是与靶核酸完全互补的两个区域的具有4个非互补核碱基的长度为18个核碱基的反义化合物将与靶核酸总共具有77.8％互补性并且因此将落入本发明的范围内。反义化合物与靶核酸一个区域的互补性百分数可使用本领域已知的BLAST程序(基础局部比对检索工具)和PowerBLAST程序常规测定(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990，215,403410；Zhang和Madden，GenomeRes.,1997,7,649656)。同源性、序列同一性或互补性百分数可通过例如使用Smith和Waterman算法(Adv.Appl.Math.,1981,2,482489)的Gap程序(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,MadisonWis.)使用缺省设置来测定。
在某些实施方案中，本文提供的反义化合物或其特定部分与靶核酸或其特定部分完全互补(即100％互补)。例如，反义化合物可与血浆前激肽释放酶核酸或其靶区或靶区段或靶序列完全互补。如本文中所用，“完全互补”意指反义化合物的每个核碱基都能够与靶核酸的相应核碱基精确碱基配对。例如，20个核碱基的反义化合物与400个核碱基长度的靶序列完全互补，只要存在与反义化合物完全互补的靶核酸的相应20个核碱基部分。完全互补也可用于指第一和/或第二核酸的特定部分。例如，30个核碱基的反义化合物的20个核碱基部分可与400个核碱基长度的靶序列“完全互补”。如果靶序列具有相应的20个核碱基部分，其中每个碱基与反义化合物的20个核碱基部分互补，则30个核碱基寡核苷酸的20个核碱基部分与靶序列完全互补。同时，根据反义化合物的剩余10个核碱基是否也与靶序列互补，整个30个核碱基的反义化合物可与靶序列完全互补或不完全互补。
非互补核碱基的位置可在反义化合物的5’末端或3’末端。可选地，非互补的一个核碱基或多个核碱基可在反义化合物的内部位置。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即，连接的)或非连续的。在一个实施方案中，非互补核碱基位于间隔体反义寡核苷酸的侧翼区段中。
在某些实施方案中，长度为或达11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核碱基的反义化合物包含不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个相对于靶核酸或其特定部分非互补的核碱基。
在某些实施方案中，长度为或达11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核碱基的反义化合物包含不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个相对于靶核酸或其特定部分非互补的核碱基。
提供的反义化合物还包括与靶核酸的一部分互补的反义化合物。如本文中所用，“部分”是指靶核酸的区域或区段内确定数量的连续(即，连接的)核碱基。“部分”也可指反义化合物的确定数量的连续核碱基。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少8个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少9个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少10个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少11个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少12个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少13个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少14个核碱基的部分互补。在某些实施方案中，反义化合物与靶区段的至少15个核碱基的部分互补。还考虑了与靶区段的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核碱基的部分或由这些值中的任何两个限定的范围的核碱基部分互补的反义化合物。
同一性
本文提供的反义化合物也可与特定核苷酸序列、SEQIDNO或由特定Isis号表示的化合物或其部分具有确定的同一性百分数。如本文中所用，如果反义化合物具有相同的核碱基配对能力，则它与本文公开的序列相同。例如，含有代替公开的DNA序列中的胸腺嘧啶的尿嘧啶的RNA将被认为与DNA序列相同，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶两者均与腺嘌呤配对。还考虑了本文描述的反义化合物的缩短和延长形式以及相对于本文提供的反义化合物具有不相同的碱基的化合物。在整个反义化合物中不相同的碱基可相互邻近或分散。根据相对于比较的序列具有相同碱基配对的碱基数量来计算反义化合物的同一性百分数。
在某些实施方案中，反义化合物或其部分与本文公开的一种或多种反义化合物或SEQIDNO或其部分至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些实施方案中，将反义化合物的一部分与靶核酸的等长部分比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基的部分与靶核酸的等长部分比较。
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸的一部分与靶核酸的等长部分比较。在某些实施方案中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核碱基的部分与靶核酸的等长部分比较。
修饰
核苷为碱基-糖组合。核苷的核碱基(也称为碱基)部分通常是杂环碱基部分。核苷酸是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖的那些核苷而言，磷酸基团可与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。寡核苷酸的形成是通过相邻核苷相互之间的共价键联而形成线性聚合寡核苷酸。在寡核苷酸结构内，通常称磷酸基团形成寡核苷酸的核苷间键联。
对反义化合物的修饰涵盖对核苷间键联、糖部分或核碱基的取代或改变。因为合乎需要的性质，例如，细胞摄取增强、对核酸靶标的亲和力增强、在核酸酶的存在下稳定性增加或抑制活性增加，经修饰的反义化合物通常比天然形式优选。
经化学修饰的核苷也可用于增加缩短或截短的寡核苷酸对其靶核酸的结合亲和力。因此，用具有此类经化学修饰的核苷的较短反义化合物常常可获得具有可比性的结果。
经修饰的核苷间键联
RNA和DNA的天然存在的核苷间键联为3'至5'磷酸二酯键联。因为合乎需要的性质，例如，细胞摄取增强、对靶核酸的亲和力增强及在核酸酶的存在下稳定性增加，具有一个或多个经修饰的，即非天然存在的核苷间键联的反义化合物常常比具有天然存在的核苷间键联的反义化合物优选。
具有经修饰的核苷间键联的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间键联和不具有磷原子的核苷间键联。代表性的含磷核苷间键联包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。含磷和不含磷键联的制备方法公知。
在某些实施方案中，靶向血浆前激肽释放酶核酸的反义化合物包含一种或多种经修饰的核苷间键联。在某些实施方案中，经修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。在某些实施方案中，反义化合物的每个核苷间键联均为硫代磷酸酯核苷间键联。
经修饰的糖部分
反义化合物可任选地含有其中糖基已经被修饰的一种或多种核苷。此类糖经修饰的核苷可赋予反义化合物增强的核酸酶稳定性、增加的结合亲和力或一些其它有益的生物性质。在某些实施方案中，核苷包含经化学修饰的呋喃核糖环部分。经化学修饰的呋喃核糖环的实例包括但不限于添加取代基团(包括5’和2’取代基团，非孪位环原子桥联形成双环核酸(BNA)，以S、N(R)或C(R1)(R2)(R、R1和R2各自独立地为H、C1-C12烷基或保护基团)置换核糖基环氧原子及其组合。经化学修饰的糖的实例包括2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其它公开的5',2'-双取代核苷，参见2008年8月21日公布的PCT国际申请WO2008/101157)或以S置换核糖基环氧原子以及在2'位置的进一步取代(参见2005年6月16日公布的美国专利申请US2005-0130923)或可选地BNA的5'取代(参见2007年11月22日公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中使用例如5'-甲基或5'-乙烯基取代LNA)。
具有经修饰的糖部分的核苷的实例包括但不限于包含5'-乙烯基、5'-甲基(R或S)、4'-S、2'-F、2'-OCH3、2’-OCH2CH3、2’-OCH2CH2F和2'-O(CH2)2OCH3取代基团的核苷。2'位置的取代基也可选自烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、OCF3、OCH2F、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)和O-CH2-C(＝O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn)，其中每个Rl、Rm和Rn独立地为H或经取代或未取代的C1-C10烷基。
如本文中所用，“双环核苷”是指包含双环糖部分的经修饰的核苷。双环核苷的实例包括但不限于包含介于4'和2'核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施方案中，本文提供的反义化合物包括含4’至2’桥的一个或多个双环核苷。此类4’至2’桥联双环核苷的实例包括但不限于下式之一：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(也称为限制型乙基或cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其类似物，参见2008年7月15日颁发的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其类似物，参见2009年1月8日作为WO/2009/006478公布的PCT/US2008/068922)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其类似物，参见2008年12月11日作为WO/2008/150729公布的PCT/US2008/064591)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见2004年9月2日公布的公开美国专利申请US2004-0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R为H、C1-C12烷基或保护基团(参见2008年9月23日颁发的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4'-CH2-C(＝CH2)-2'(及其类似物，参见2008年12月8日作为WO2008/154401公布的PCT/US2008/066154)。
也在可公开文献中找到关于双环核苷的更多报道(参见例如：Frieden等，NucleicAcidsResearch,2003,21,6365-6372；Singh等，Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin等，Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh等，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26)8362-8379；Elayadi等，Curr.OpinionInvest.Drugs,2001,2,558-561；Braasch等，Chem.Biol.,2001,8,1-7；和Orum等，Curr.OpinionMol.Ther.,2001,3,239-243；美国专利第6,268,490、6,525,191、6,670,461、6,770,748、6,794,499、7,034,133、7,053,207、7,399,845、7,547,684和7,696,345号；美国专利公布第US2008-0039618、US2009-0012281、US2007-0287831、US2004-0171570号；美国专利申请序列号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787和61/099,844；公开PCT国际申请WO1994/014226、WO2004/106356、WO2005/021570、WO2007/134181、WO2008/150729、WO2008/154401和WO2009/006478。每个前述双环核苷均可制备成具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见1999年3月25日作为WO99/14226公布的PCT国际申请PCT/DK98/00393)。
在某些实施方案中，BNA核苷的双环糖部分包括但不限于在戊呋喃糖基糖部分的4'和2’位置之间具有至少一个桥的化合物，其中此类桥独立地包含独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝O)-、-C(＝NRa)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-和-N(Ra)-的1个或2至4个连接的基团；
其中：
x为0、1或2；
n为1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地为H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、杂环基团、经取代的杂环基团、杂芳基、经取代的杂芳基、C5-C7脂环族基团、经取代的C5-C7脂环族基团、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地为H、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、经取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、经取代的酰基、杂环基团、经取代的杂环基团、C1-C12氨基烷基、经取代的C1-C12氨基烷基或保护基团。
在某些实施方案中，双环糖部分的桥为-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-。在某些实施方案中，所述桥为4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4'-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地为H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施方案中，双环核苷进一步受异构构型限定。例如，包含4’-2’亚甲氧基桥的核苷可呈α-L构型或呈β-D构型。先前，α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA已经并入显示出反义活性的反义寡核苷酸中(Frieden等，NucleicAcidsResearch,2003,21,6365-6372)。
在某些实施方案中，双环核苷包括但不限于如以下描绘的(A)α-L-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA，(B)β-D-亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA，(C)乙烯氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA，(D)氨氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA，(E)氧氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA，和(F)甲基(亚甲氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA，(G)亚甲基-硫代(4’-CH2-S-2’)BNA，(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA，(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA，(J)丙烯碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA和(K)乙烯基BNA：
其中Bx为碱基部分并且R独立地为H、保护基团、C1-C12烷基或C1-C12烷氧基。
在某些实施方案中，提供了具有式I的双环核苷：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
-Qa-Qb-Qc-为-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(＝O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-或-N(Rc)-O-CH2；
Rc为C1-C12烷基或氨基保护基；并且
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价附着。
在某些实施方案中，提供了具有式II的双环核苷：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价附着；
Za为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C2-C6烯基、经取代的C2-C6炔基、酰基、经取代的酰基、经取代的酰胺基、硫醇基或经取代的硫醇基。
在一个实施方案中，每个经取代的基团独立地经独立地选自卤素、氧代基、羟基、OJc、NJcJd、SJc、N3、OC(＝X)Jc和NJeC(＝X)NJcJd的取代基团单或多取代，其中每个Jc、Jd和Je独立地为H、C1-C6烷基或经取代的C1-C6烷基并且X为O或NJc。
在某些实施方案中，提供了具有式III的双环核苷：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价附着；
Zb为C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、经取代的C1-C6烷基、经取代的C2-C6烯基、经取代的C2-C6炔基或经取代的酰基(C(＝O)-)。
在某些实施方案中，提供了具有式IV的双环核苷：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价附着；
Rd为C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基；
每个qa、qb、qc和qd独立地为H、卤素、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、经取代的C1-C6烷氧基、酰基、经取代的酰基、C1-C6氨基烷基或经取代的C1-C6氨基烷基；
在某些实施方案中，提供了具有式V的双环核苷：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价附着；
qa、qb、qe和qf各自独立地为氢、卤素、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、经取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；
或qe和qf一起为＝C(qg)(qh)；
qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或经取代的C1-C12烷基。
已经描述了亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备，连同其寡聚化和核酸识别性质(Koshkin等，Tetrahedron,1998,54,3607-3630)。在WO98/39352和WO99/14226中也描述了BNA及其制备。
还已制备了亚甲氧基(4’-CH2-O-2’)BNA和2'-硫代-BNA的类似物(Kumar等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222)。还已描述了作为核酸聚合酶底物的包含寡脱氧核糖核苷酸双链体的锁核苷类似物的制备(Wengel等，WO99/14226)。此外，在本领域中已经描述了2'-氨基-BNA，一种新型构象限制高亲和力寡核苷酸类似物的合成(Singh等，J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039)。另外，已经制备了2'-氨基-和2'-甲氨基-BNA并且先前已经报道了其具有互补RNA和DNA链的双链体的热稳定性。
在某些实施方案中，提供了具有式VI的双环核苷：
其中：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为H、羟基保护基、缀合基团、反应性磷基、磷部分或与支撑介质的共价附着；
每个qi、qj、qk和ql独立地为H、卤素、C1-C12烷基、经取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、经取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、经取代的C2-C12炔基、C1-C12烷氧基、经取代的C1-C12烷氧基、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(＝O)OJj、C(＝O)NJjJk、C(＝O)Jj、O-C(＝O)NJjJk、N(H)C(＝NH)NJjJk、N(H)C(＝O)NJjJk或N(H)C(＝S)NJjJk；并且
qi和qj或ql和qk一起为＝C(qg)(qh)，其中qg和qh各自独立地为H、卤素、C1-C12烷基或经取代的C1-C12烷基。
已经描述了具有4'-(CH2)3-2'桥和烯基类似物桥4'-CH＝CH-CH2-2'的一种碳环双环核苷(Freier等，NucleicAcidsResearch,1997,25(22),4429-4443和Albaek等，J.Org.Chem.,2006,71,7731-7740)。还已经描述了碳环双环核苷的合成和制备连同其寡聚化和生物化学研究(Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(26),8362-8379)。
如本文中所用，“4’-2’双环核苷”或“4’至2’双环核苷”是指包含呋喃糖环的双环核苷，呋喃糖环包含的连接呋喃糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2’碳原子和4’碳原子。
如本文中所用，“单环核苷”是指包含并非双环糖部分的经修饰糖部分的核苷。在某些实施方案中，核苷的糖部分或糖部分类似物可在任何位置经修饰或取代。
如本文中所用，“2’-修饰的糖”意指在2’位置经修饰的呋喃糖基糖。在某些实施方案中，此类修饰包括选自：卤化物的取代基，包括但不限于经取代和未取代的烷氧基、经取代和未取代的硫代烷基、经取代和未取代的氨基烷基、经取代和未取代的烷基、经取代和未取代的烯丙基及经取代和未取代的炔基。在某些实施方案中，2’修饰选自包括但不限于以下的取代基：O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nF、O(CH2)nONH2、OCH2C(＝O)N(H)CH3和O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2，其中n和m为1至约10。其它2'-取代基团也可选自：C1-C12烷基、经取代的烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、F、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、经取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、插入部分、提高药代动力学性质的基团或提高反义化合物药效学性质的基团和具有类似性质的其它取代基。在某些实施方案中，经修饰的核苷包含2’-MOE侧链(Baker等，J.Biol.Chem.,1997,272,11944-12000)。已经将此类2'-MOE取代描述为与未修饰的核苷和其它经修饰的核苷，诸如2’-O-甲基、O-丙基和O-氨基丙基相比具有更高的结合亲和力。还已证实具有2'-MOE取代基的寡核苷酸是基因表达的反义抑制剂，具有对于体内使用有前景的特征(Martin，Helv.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann等，Chimia,1996,50,168-176；Altmann等，Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；和Altmann等，NucleosidesNucleotides,1997,16,917-926)。
如本文中所用，“经修饰的四氢吡喃核苷”或“经修饰的THP核苷”意指具有六元四氢吡喃“糖”取代正常核苷(糖替代物)中的戊呋喃糖残基的核苷。经修饰的THP核苷包括但不限于本领域称为己糖醇核酸(HNA)、anitol核酸(ANA)、甘露糖醇核酸(MNA)(参见Leumann，Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-854)或具有如下所示四氢吡喃环系的氟代HNA(F-HNA)的核苷：
在某些实施方案中，选择具有式VII的糖替代物：
VII
其中独立地对于式VII的所述至少一种四氢吡喃核苷类似物的每一个而言：
Bx为杂环碱基部分；
Ta和Tb各自独立地为将四氢吡喃核苷类似物连接到反义化合物的核苷间连接基团或Ta和Tb中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接到反义化合物的核苷间连接基团而Ta和Tb中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'或3'-末端基团；
q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地为H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基；并且R1和R2中的每一个均选自氢、羟基、卤素、经取代或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2和CN，其中X为O、S或NJ1并且每个J1、J2和J3独立地为H或C1-C6烷基。
在某些实施方案中，提供了式VII的经修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自均为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个不为H。在某些实施方案中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中的至少一个为甲基。在某些实施方案中，提供了式VII的THP核苷，其中R1和R2中的一个为氟。在某些实施方案中，R1为氟而R2为H；R1为甲氧基而R2为H；及R1为甲氧基乙氧基而R2为H。
在某些实施方案中，糖替代物包含具有5个以上原子和一个以上杂原子的环。例如，已经报道了包含吗啉基糖部分的核苷及其在寡聚化合物中的用途(参见例如：Braasch等，Biochemistry,2002,41,4503-4510；和美国专利5,698,685、5,166,315、5,185,444和5,034,506)。如此处所用，术语“吗啉基”意指具有下式的糖替代物：
在某些实施方案中，吗啉基可经修饰，例如通过添加或改变来自以上吗啉基结构的各种取代基团。本文将此类糖替代物称为“经取代的吗啉基”。
还提供了修饰的组合，但不限于，诸如2'-F-5'-甲基取代的核苷(对于其它公开的5',2'-双取代核苷，参见2008年8月21日公布的PCT国际申请WO2008/101157)和以S置换核糖基环氧原子以及在2'位置的进一步取代(参见2005年6月16日公布的公开美国专利申请US2005-0130923)或可选地双环核酸的5'-取代(参见2007年11月22日公布的PCT国际申请WO2007/134181，其中4'-CH2-O-2'双环核苷在5'位置经5'-甲基或5'-乙烯基进一步取代)。还已经描述了碳环双环核苷的合成和制备连同其寡聚化和生物化学研究(参见，例如，Srivastava等，J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379)。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个经修饰的环己烯基核苷，这是具有六元环己烯基代替天然存在的核苷中的戊呋喃糖残基的核苷。经修饰的环己烯基核苷包括但不限于本领域中描述的经修饰的环己烯基核苷(参见例如2010年4月10日公布的共同所有、公开PCT申请WO2010/036696，Robeyns等，J.Am.Chem.Soc.,2008,130(6),1979-1984；Horváth等，TetrahedronLetters,2007,48,3621-3623；Nauwelaerts等，J.Am.Chem.Soc.,2007,129(30),9340-9348；Gu等，Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids,2005,24(5-7),993-998；Nauwelaerts等，NucleicAcidsResearch,2005,33(8),2452-2463；Robeyns等，ActaCrystallographica,SectionF:StructuralBiologyandCrystallizationCommunications,2005,F61(6),585-586；Gu等，Tetrahedron,2004,60(9),2111-2123；Gu等，Oligonucleotides,2003,13(6),479-489；Wang等，J.Org.Chem.,2003,68,4499-4505；Verbeure等，NucleicAcidsResearch,2001,29(24),4941-4947；Wang等，J.Org.Chem.,2001,66,8478-82；Wang等，Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids,2001,20(4-7),785-788；Wang等，J.Am.Chem.,2000,122,8595-8602；公开PCT申请WO06/047842；和公开PCT申请WO01/049687；各自的正文通过引用整体并入本文)。某些经修饰的环己烯基核苷具有式X。
其中独立地对于式X的所述至少一种环己烯基核苷类似物的每一个而言，
Bx为杂环碱基部分；
T3和T4各自独立地为将环己烯基核苷类似物连接到反义化合物的核苷间连接基团或T3和T4中的一个为将四氢吡喃核苷类似物连接到反义化合物的核苷间连接基团而T3和T4中的另一个为H、羟基保护基、连接的缀合基团或5'或3'-末端基团；并且
q1、q2、q3、q4、q5、q6、q7、q8和q9各自独立地为H、C1-C6烷基、经取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、经取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基或经取代的C2-C6炔基或其它糖取代基团。
如本文中所用，“2’-修饰”或“2’-取代”是指核苷包含在2’位置包含除H或OH外的取代基的糖。2’-修饰的核苷包括但不限于双环核苷，其中连接糖环的两个碳原子的桥连接糖环的2’碳和另一个碳；和具有非桥联2’取代基，诸如烯丙基、氨基、叠氮基、硫代基、O-烯丙基、O-C1-C10烷基、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)的核苷，其中每个Rm和Rn独立地为H或经取代或未取代的C1-C10烷基。2’-修饰的核苷可进一步包含例如在糖其它位置和/或在核碱基处的其它修饰。
如本文中所用，“2’-F”是指包含在糖环的2’位置包含氟基的糖的核苷。
如本文中所用，“2’-OMe”或“2’-OCH3”或“2’-O-甲基”每个都指包含在糖环的2’位置包含-OCH3基团的糖的核苷。
如本文中所用，“MOE”或“2’-MOE”或“2’-OCH2CH2OCH3”或“2’-O-甲氧基乙基”每个都指包含在糖环的2’位置包含-OCH2CH2OCH3基团的糖的核苷。
如本文中所用，“寡核苷酸”是指包含多个连接的核苷的化合物。在某些实施方案中，所述多个核苷中的一个或多个经修饰。在某些实施方案中，寡核苷酸包含一个或多个核糖核苷(RNA)和/或脱氧核糖核苷(DNA)。
在本领域中也已知可用于修饰核苷以并入如本文提供的反义化合物中的许多其它单环、双环和三环糖替代物环系(参见例如综述论文：Leumann，Bioorg.Med.Chem.,2002,10,841-1954)。此类环系可进行各种附加取代以增强活性。
制备经修饰的糖的方法为本领域技术人员公知。一些教导此类经修饰的糖的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利：4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5,597,909、5,610,300、5,627,053、5,639,873、5,646,265、5,670,633、5,700,920、5,792,847和6,600,032及2005年6月2日提交且于2005年12月22日作为WO2005/121371公开的国际申请PCT/US2005/019219，并且其各自通过引用整体并入本文。
在具有经修饰的糖部分的核苷酸中，核碱基部分(天然的、经修饰的或其组合)保持与适当核酸靶标杂交。
在某些实施方案中，反义化合物包含一个或多个具有经修饰的糖部分的核苷。在某些实施方案中，经修饰的糖部分为2’-MOE。在某些实施方案中，2’-MOE修饰的核苷呈间隔体基序排列。在某些实施方案中，经修饰的糖部分是具有(4’-CH(CH3)-O-2’)桥联基团的双环核苷。在某些实施方案中，(4’-CH(CH3)-O-2’)修饰的核苷排列在间隔体基序的整个侧翼中。
缀合反义化合物
反义化合物可与提高所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一种或多种部分或缀合物共价连接。典型的缀合基团包括胆固醇部分和脂质部分。另外的缀合基团包括碳水化合物、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸酯、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。
还可将反义化合物修饰为具有一个或多个稳定基团，所述稳定基团通常附着于反义化合物的一端或两端以提高性质，诸如核酸酶稳定性。稳定基团中包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸的反义化合物免受外切核酸酶降解，并且可有助于在细胞内递送和/或定位。帽可存在于5'-端(5'-帽)或3'-端(3'-帽)，或可存在于两端。帽结构为本领域公知，包括，例如倒置的脱氧无碱基帽。其它可用于在反义化合物的一端或两端加帽而赋予核酸酶活性的3'和5'稳定基团包括2003年1月16日公布的WO03/004602中公开的稳定基团。
细胞培养和反义化合物处理
可在体外在多种细胞类型中试验反义化合物对PKK核酸水平、活性或表达的影响。用于此类分析的细胞类型可从商业供应商(例如，AmericanTypeCultureCollection,Manassus,VA；Zen-Bio,Inc.,ResearchTrianglePark,NC；CloneticsCorporation,Walkersville,MD)获得并根据供应商的说明使用市场上可买到的试剂(例如，LifeTechnologies,Carlsbad,CA)培养。说明性细胞类型包括但不限于HepaRGTMT细胞和小鼠原代肝细胞。
反义寡核苷酸的体外试验
本文描述了用反义寡核苷酸处理细胞的方法，所述方法可经适当修改以用其它反义化合物处理。
当细胞在培养中达到约60-80％融合时，可用反义寡核苷酸处理细胞。
常用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的一种试剂包括阳离子脂质转染试剂LIPOFECTIN(LifeTechnolpgies,Carlsbad,CA)。可将反义寡核苷酸与处于OPTI-MEM1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中的LIPOFECTIN混合以达到反义寡核苷酸的所需最终浓度和范围可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的LIPOFECTIN浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的另一种试剂包括LIPOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将反义寡核苷酸与处于OPTI-MEM1降低的血清培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)中的LIPOFECTAMINE混合以达到反义寡核苷酸的所需最终浓度和范围可在每100nM反义寡核苷酸2至12ug/mL的LIPOFECTAMINE浓度。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的另一种技术包括电穿孔。
用于将反义寡核苷酸引入培养细胞中的再一种技术包括由细胞自由摄取寡核苷酸。
通过常规方法用反义寡核苷酸处理细胞。可在反义寡核苷酸处理16-24小时后收获细胞，此时通过本领域已知和本文描述的方法测量靶核酸的RNA或蛋白质水平。通常，多次重复进行处理时，将数据表示为重复处理的平均值。
所用反义寡核苷酸的浓度在细胞系间不同。测定特定细胞系的最佳反义寡核苷酸浓度的方法为本领域公知。当用LIPOFECTAMINE转染时通常以1nM至300nM范围的浓度使用反义寡核苷酸。当使用电穿孔转染时通常以625至20,000范围的较高浓度使用反义寡核苷酸。
RNA分离
可对细胞总RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法为本领域公知。使用本领域公知的方法，例如，根据生产商的推荐方案使用TRIZOL试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)制备RNA。
对靶标水平或表达的抑制分析
可按本领域已知的各种方式测定对PKK核酸水平或表达的抑制。例如，可通过(例如)Northern印迹分析、竞争性聚合酶链反应(PCR)或定量实时PCR量化靶核酸水平。可对细胞总RNA或聚(A)+mRNA进行RNA分析。RNA分离的方法为本领域公知。Northern印迹分析也是本领域常规的。定量实时PCR可以使用可从PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA获得并根据生产商的说明使用的市场上可买到的ABIPRISM7600、7700或7900序列检测系统方便地实现。
靶RNA水平的定量实时PCR分析
靶RNA水平的定量可使用ABIPRISM7600、7700或7900序列检测系统(PE-AppliedBiosystems,FosterCity,CA)根据生产商的说明通过定量实时PCR实现。定量实时PCR的方法为本领域公知。
在实时PCR之前，分离的RNA经受逆转录酶(RT)反应，生成之后用作实时PCR扩增的底物的互补DNA(cDNA)。RT和实时PCR反应在相同样品孔中相继进行。RT和实时PCR试剂可从LifeTechnologies(Carlsbad,CA)得到。RT实时PCR反应通过本领域技术人员公知的方法进行。
使用表达恒定的基因，诸如亲环素A(cyclophilinA)的表达水平，或通过使用RIBOGREEN(LifeTechnologies,Inc.Carlsbad,CA)量化总RNA来标准化通过实时PCR获得的基因(或RNA)靶量。通过实时PCR量化亲环素A表达，与靶标同时或多通路或分别地运行。使用RIBOGREENRNA定量试剂(Invetrogen,Inc.Eugene,OR)量化总RNA。在Jones,L.J.等(AnalyticalBiochemistry,1998,265,368-374)中教导了用RIBOGREEN量化RNA的方法。使用CYTOFLUOR4000仪器(PEAppliedBiosystems)测量RIBOGREEN荧光。
设计与PKK核酸杂交的探针和引物。设计实时PCR探针和引物的方法为本领域所公知，并且可包括软件诸如PRIMEREXPRESS软件(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)的使用。
蛋白质水平分析
PKK核酸的反义抑制可以通过测量PKK蛋白质水平来评估。PKK的蛋白质水平可以用本领域公知的各种方式来评价或量化，诸如免疫沉淀反应、Western印记分析(免疫印记)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、定量蛋白质测定、蛋白质活性测定(例如，半胱天冬酶活性测定)、免疫组织化学、免疫细胞化学或荧光活化细胞分选(FACS)。指向靶标的抗体可鉴定并从各种来源，诸如MSRS抗体目录(AerieCorporation,Birmingham,MI)获得，或可以经由本领域公知的常规单克隆或多克隆抗体生成技术来制备。
反义化合物的体外试验
在动物体内试验了反义化合物，例如反义寡核苷酸，以评价它们抑制PKK表达和产生表型变化的能力。
在某些实施方案中，此类表型变化包括与炎症性疾病相关的变化，诸如炎症、水肿/肿胀、血管通透性和血管渗漏减轻。在某些实施方案中，通过测量动物中水肿、温度、疼痛、组织颜色和腹部功能的增加或减少来测量炎症。
在某些实施方案中，此类表型变化包括与血栓栓塞性疾病相关的变化，诸如aPTT延长、连同正常PT的aPTT时间延长、血小板因子4(PF-4)的量减少及血栓形成减少或血栓形成时间增加。
试验可以在正常动物体内或在实验疾病模型中进行。为了向动物施用，将反义寡核苷酸配制在药学上可接受的稀释剂，诸如磷酸盐缓冲盐水中。施用包括肠胃外施用途径，诸如腹腔内、静脉内和皮下。对反义寡核苷酸剂量和给药频率的计算在本领域技术人员的能力范围之内，并且取决于诸如施用途径和动物体重等因素。用反义寡核苷酸处理一段期间之后，从肝脏组织中分离RNA，并测量PKK核酸表达的变化。
某些适应症
在某些实施方案中，本发明提供了治疗个体的方法，其包括施用如本文描述的一种或多种药物组合物。
在某些实施方案中，所述个体具有炎症性疾病。在某些实施方案中，所述个体处于发展炎症性病状的风险中，包括但不限于遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑血管性水肿、眼部水肿、黄斑水肿和脑水肿。这包括具有引起炎症风险的获得性问题、疾病或病症的个体，例如对炎症性病状的遗传倾向、环境因素和对某些药剂，包括例如ACE抑制剂和ARB的暴露。在某些实施方案中，个体已经被鉴定为需要抗炎治疗。此类个体的实例包括但不限于在补体1酯酶抑制剂(即，C1-INH)或因子12的遗传编码中具有突变的个体。在某些实施方案中，异常密码可导致C1-INH缺乏(即，I型HAE)、现有C1-INH不能正常作用(II型HAE)或因子12功能亢进(即，III型HAE)。
在某些实施方案中，所述个体具有血栓栓塞性疾病。在某些实施方案中，所述个体处于凝血障碍的风险中，包括但不限于梗塞、血栓形成、栓塞、血栓栓塞如深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞和中风。这包括具有导致血栓形成风险的获得性问题、疾病或病症，例如手术、癌症、不动、脓毒症、动脉粥样硬化心房纤维性颤动，以及遗传倾向，例如抗磷脂综合征和常染色体显性病状(莱顿第五因子(FactorVLeiden))的个体。在某些实施方案中，所述个体已经被鉴定为需要抗凝治疗。此类个体的实例包括但不限于接受大型骨科手术(例如，髋/膝关节置换或髋骨折手术)的个体和需要慢性治疗的患者，诸如患有心房纤维性颤动以防中风的患者。
在某些实施方案中本发明提供了在个体中预防性降低PKK表达的方法。某些实施方案包括通过向个体施用治疗有效量的靶向PKK核酸的反义化合物治疗有需要的个体。
在一个实施方案中，施用治疗有效量的靶向PKK核酸的反义化合物的同时伴随监测个体血清中的PKK水平，以确定个体对反义化合物施用的反应。个体对反义化合物施用的反应被医师用于确定治疗干预的量和持续时间。
在某些实施方案中，施用靶向PKK核酸的反义化合物导致PKK表达降低至少15、20、25、30、35、40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％，或这些数值中任两个所定义的范围。在某些实施方案中，包含靶向PKK的反义化合物的药物组合物用于制备治疗患有或易感炎症性疾病或血栓栓塞性疾病的患者的药剂。
某些组合物
1.ISIS546254
在某些实施方案中，将ISIS546254表征为具有(从5’到3’)TGCAAGTCTCTTGGCAAACA序列(本文作为SEQIDNO:570并入)的5-10-5MOE间隔体，其中每个核苷间键联均为硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶均为5’-甲基胞嘧啶，核苷1-5和16-20中的每一个均为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，并且核苷6-15中的每一个均为2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，用以下化学符号描述ISIS546254：TesGesmCesAesAesGdsTdsmCdsTdsmCdsTdsTdsGdsGdsmCdsAesAesAesmCesAe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，用以下化学结构描述ISIS546254：
结构1.ISIS546254
在某些实施方案中，正如实施例2(下文)所提供，当在24小时处理期后使用电穿孔经5,000nM反义寡核苷酸转染并且使用人引物探针组RTS3454通过定量实时PCR测量并根据用测量的RNA总含量调节时，ISIS546254在培养的HepaRGTM细胞(密度为20,000个细胞/孔)中实现对人PKKmRNA的95％抑制。
在某些实施方案中，正如实施例5(参见下文表34和41)所提供，当在16小时处理期后使用电穿孔转染并且使用人引物探针组RTS3454通过定量实时PCR测量并根据用测量的RNA总含量调节时，ISIS546254在培养的HepaRGTM细胞(密度为20,000个细胞/孔)中在4-点记录反应曲线(0.19μM、0.56μM、1.67μM和5.0μM)上实现0.2μM和0.3μM的IC50。
在某些实施方案中，正如实施例7(下文)所提供，当以2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周皮下注射ISIS546254每周两次，历时3周时，ISIS546254在携带人PKK基因序列的转基因小鼠中实现31％、55％、84％和83％的人PKKmRNA抑制和0％、36％、51％和76％的人PKK蛋白质抑制。
在某些实施方案中，正如实施例8(下文)所提供，ISISI546254对抑制PKKmRNA和蛋白质表达有效并且在灵长类动物中可耐受。
2.ISIS546343
在某些实施方案中，将ISIS546343表征为具有(从5’到3’)CCCCCTTCTTTATAGCCAGC序列(本文作为SEQIDNO:705并入)的5-10-5MOE间隔体，其中每个核苷间键联均为硫代磷酸酯键联，每个胞嘧啶均为5’-甲基胞嘧啶，核苷1-5和16-20中的每一个均为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，并且核苷6-15中的每一个均为2’-脱氧核苷。
在某些实施方案中，用以下化学符号描述ISIS546343：mCesmCesmCesmCesmCesTdsTdsmCdsTdsTdsTdsAdsTdsAdsGdsmCesmCesAesGesmCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，用以下化学结构描述ISIS546343：
结构2.ISIS546343
在某些实施方案中，正如实施例2(参见下文表9和10)所提供，当在24小时处理期后使用电穿孔经5,000nM反义寡核苷酸转染并且使用人引物探针组RTS3454通过定量实时PCR测量并根据用测量的RNA总含量调节时，ISIS546343在培养的HepaRGTM细胞(密度为20,000个细胞/孔)中实现97％和91％的人PKKmRNA抑制。
在某些实施方案中，正如实施例5(见下文表34和41)中两次所提供，当在16小时处理期后使用电穿孔转染并且使用人引物探针组RTS3454通过定量实时PCR测量并根据用测量的RNA总含量调节时，ISIS546343在培养的HepaRGTM细胞(密度为20,000个细胞/孔)中在4-点记录反应曲线(0.19μM、0.56μM、1.67μM和5.0μM)上实现0.4μM的IC50。
在某些实施方案中，正如实施例7(下文)所提供，当以2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周皮下注射ISIS546343每周两次，历时3周时，ISIS546343在携带人PKK基因序列的转基因小鼠中实现46％、66％和86％的人PKKmRNA抑制和0％、38％和79％的人PKK蛋白质抑制。
在某些实施方案中，正如实施例8(下文)所提供，ISISI546343对抑制PKKmRNA和蛋白质表达有效并且在灵长类动物中可耐受。
3.ISIS548048
在某些实施方案中，将ISIS548048表征为具有由16个2’-脱氧核苷、2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷和cEt修饰的核苷的组合组成的核碱基序列(从5’到3’)CGATATCATGATTCCC(本文作为SEQIDNO:1666并入)的经修饰的反义寡核苷酸，其中核苷1、2和16中的每一个均为2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，其中核苷3、14和15中的每一个均为cEt修饰的核苷，其中核苷4-13中的每一个均为2’-脱氧核苷，每个核苷间键联均为硫代磷酸酯键联，并且其中每个胞嘧啶均为5’-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，用以下化学符号描述ISIS548048：mCesGesAksTdsAdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsTdsTdsmCksmCksmCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
k＝cEt修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施方案中，用以下化学结构描述ISIS548048：
结构3.ISIS548048
在某些实施方案中，正如实施例3(下文)所提供，当在24小时处理期后使用电穿孔经1,000nM反义寡核苷酸转染并且使用人引物探针组RTS3454通过定量实时PCR测量并根据用测量的RNA总含量调节时，ISIS548048在培养的HepaRGTM细胞(密度为20,000个细胞/孔)中实现84％mRNA抑制。
在某些实施方案中，正如实施例6(下文)所提供，当在16小时处理期后使用电穿孔转染并且使用人引物探针组RTS3454通过定量实时PCR测量并根据用测量的RNA总含量调节时，ISIS548048在培养的HepaRGTM细胞(密度为20,000个细胞/孔)中在4-点记录反应曲线(0.11μM、0.33μM、1.00μM和3.00μM)上实现0.1μM的IC50。
在某些实施方案中，正如实施例7(下文)所提供，当以2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周皮下注射ISIS548048每周两次，历时3周时，ISIS548048在携带人PKK基因序列的转基因小鼠中实现7％、77％、72％和80％的人PKKmRNA抑制和23％、70％、89％和98％的人PKK蛋白质抑制。
在某些实施方案中，正如实施例8(下文)所提供，ISISI548048对抑制PKKmRNA和蛋白质表达有效并且在灵长类动物中可耐受。
某些热点区域
1.SEQIDNO:10的核碱基27427-27466
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基27427-27466。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27466为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27466受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27466受以下ISIS号靶向：530993、530994、530995、546251、546252、546253、546254、546255、546256、547410、547411、547978、547979、547980和547981。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27466受以下SEQIDNO靶向：94、95、96、566、567、568、569、570、571、572、573、1597、1598、1599和1600。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基27427-27466的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
2.SEQIDNO:10的核碱基33183-33242
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基33183-33242。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33183-33242为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33183-33242受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33183-33242受以下ISIS号靶向：531052、531053、531054、531055、531056、531057、531158、546343、546345、547480、547481、547482和547483。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33183-33242受以下SEQIDNO靶向：155、156、157、158、159、160、261、702、703、704、705、706和707。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基33183-33242的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKKmRNA和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
3.SEQIDNO:10的核碱基30570-30610
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基30570-30610。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30570-30610为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30570-30610受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30570-30610受以下ISIS号靶向：531026、546309、546310、546311、546313、547453、547454、547455、547456、547457、547458、548046、548047、548048、548049和548050。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30570-30610受以下SEQIDNO靶向：129、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、1664、1665、1666、1667和1668。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基30570-30610的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKKmRNA和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
4.SEQIDNO:10的核碱基27427-27520
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基27427-27520。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27520为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27520受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27520受以下ISIS号靶向：530993-530999、546251-546256、546258-546260、546263、546265-546268、547410-547417和547978-547992。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27427-27520受以下SEQIDNO靶向：94-100、566-587和1597-1611。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基27427-27520的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
5.SEQIDNO:10的核碱基33085-33247
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基33085-33247。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33085-33247为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33085-33247受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33085-33247受以下ISIS号靶向：531041-531158、546336、546339、546340、546343、546345、547474-547483、547778、548077-548082和548677-548678。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33085-33247受以下SEQIDNO靶向：144-160、261、693-707、1256、1320-1325、2214和2215。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基33085-33247的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
6.SEQIDNO:10的核碱基30475-30639
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基30475-30639。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30475-30639为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30475-30639受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30475-30639受以下ISIS号靶向：531021-531029、531146、546297、546299-546304、546306-546311、546313、546316-546319、547444-547462、548031、548032和548034-548056。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30475-30639受以下SEQIDNO靶向：124-132、249、633-669和1650-1674。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基30475-30639的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
7.SEQIDNO:10的核碱基27362-27524
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基27362-27524。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27362-27524对应于PKK的外显子9(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27362-27524为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27362-27524受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27361-27524受以下ISIS号靶向：530985-530999、546244、546247-546256、546258-546260、546263、546265-546268、547403-547417、547723、547968-547970和547972-547992。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基27361-27524受以下SEQIDNO靶向：86-100、554-587、1217和1588-1611。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基27362-27524的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
8.SEQIDNO:10的核碱基33101-33240
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基33101-33240。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33101-33240对应于PKK(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的外显子14。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33101-33240为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33101-33240受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33101-33240受以下ISIS号靶向：531041-531158、546336、546339、546340、546343、546345、547474-547483、548077-548082和548678-548678。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基33101-33240受以下SEQIDNO靶向：144-160、261、693-707、1320-1325和2215。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基33101-33240的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
9.SEQIDNO:10的核碱基30463-30638
在某些实施方案中，将反义寡核苷酸设计为靶向SEQIDNO:10(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的核碱基30463-30638。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30463-30638对应于PKK(基因库登录号NT_016354.19，截自核碱基111693001至111730000)的外显子12。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30463-30638为热点区域。在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30463-30638受反义寡核苷酸靶向。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸长度为15、16、17、18、19或20个核碱基。在某些实施方案中，所述反义寡核苷酸为间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。在某些实施方案中，所述间隔体为5-10-5MOE和cEt间隔体、4-9-4MOE和cEt间隔体、4-10-4MOE和cEt间隔体、4-10-3MOE和cEt间隔体、3-10-4MOE和cEt间隔体或3-10-3MOE和cEt间隔体。在某些实施方案中，反义寡核苷酸的核苷通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30463-30638受以下ISIS号靶向：531021-531029、531146、546297、546299-546304、546306-546311、546313、546316-546319、547444-547462、548031、548032和548034-548056。
在某些实施方案中，SEQIDNO:10的核碱基30463-30638受以下SEQIDNO靶向：124-132、249、633-669和1650-1674。
在某些实施方案中，靶向SEQIDNO:10的核碱基30463-30638的反义寡核苷酸在体外和/或在体内实现PKK和/或蛋白质水平的至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％降低。
实施例
非限制性公开和引用并入
虽然已经根据某些实施方案专门描述了本文所描述的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用以说明本文描述的化合物而非旨在对其限制。本申请中所引用的各参考文献通过引用整体并入本文。
实施例1：在HepaRGTMT细胞中的人PKK受具有2’-MOE糖修饰的反义寡核苷酸的反义抑制
设计靶向PKK核酸的反义寡核苷酸并试验其在体外对PKKmRNA的影响。在筛选中使用HepaRGTM细胞，其为源自人肝祖细胞系的终末分化肝细胞并且保持人原代肝细胞的许多特征(LubberstedtM.等，J.Pharmacol.Toxicol.Methods201163:59-68)。
下表中的嵌合型反义寡核苷酸设计为5-10-5MOE间隔体。所述间隔体长度为20个核苷，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上各包含5个核苷的侧翼区段。5’侧翼区段中的每个核苷和3’侧翼区段中的每个核苷具有2’-O-甲氧基乙基修饰。遍及每个间隔体的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。遍及每个间隔体的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指在人基因序列中间隔体所靶向的5’-最末端核苷。“终止位点”指在人基因序列中间隔体所靶向的3’-最末端核苷。下表中所列的每个间隔体均靶向本文指定为SEQIDNO:1(基因库登录号NM_000892.3)的人PKKmRNA或本文指定为SEQIDNO:10(截自核苷酸111693001至111730000的基因库登录号NT_016354.19)的人PKK基因组序列。‘n/a’表明反义寡核苷酸不靶向该特定基因序列。
用3,000nM反义寡核苷酸使用电穿孔转染密度为20,000个细胞/孔的培养HepaRGTM细胞。约24小时处理期后，从细胞分离RNA并通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平。使用人引物探针组RTS3454(正向序列CCAAAAAAGGTGCACCAGTAACA，本文指定为SEQIDNO:20；反向序列CCTCCGGGACTGTACTTTAATAGG，本文指定为SEQIDNO:21；探针序列CACGCAAACATTTCACAAGGCAGAGTACC本文指定为SEQIDNO:22)测量mRNA水平。正如通过所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。在一系列具有相似培养条件的实验中试验反义寡核苷酸。在以下所示单独的表中呈现了每个实验的结果。结果呈现为相对于未处理的对照细胞，PKK的抑制百分数。
表1
表2
表3
表4
实施例2：在HepaRGTM细胞中的人PKK受具有2’-MOE糖修饰的反义寡核苷酸的反义抑制
设计另外的靶向PKK核酸的反义寡核苷酸并试验其在体外对PKKmRNA的影响。
下表中的嵌合型反义寡核苷酸设计为5-10-5MOE间隔体、4-9-4MOE间隔体、4-10-4MOE间隔体、4-10-3MOE间隔体、3-10-4MOE间隔体或3-10-3MOE间隔体。5-10-5MOE间隔体长度为20个核苷，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上各包含5个核苷的侧翼区段。4-9-4MOE间隔体长度为17个核苷，其中中央间隙区段由9个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上各包含4个核苷的侧翼区段。4-10-4MOE间隔体长度为18个核苷，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上各包含4个核苷的侧翼区段。4-10-3MOE间隔体长度为17个核苷，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上分别包含4个和3个核苷的侧翼区段。3-10-4MOE间隔体长度为17个核苷，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上分别包含3个和4个核苷的侧翼区段。3-10-3MOE间隔体长度为16个核苷，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且两侧是在5’方向和3’方向上各包含3个核苷的侧翼区段。5’侧翼区段中的每个核苷和3’侧翼区段中的每个核苷具有2’-O-甲氧基乙基修饰。遍及每个间隔体的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。遍及每个间隔体的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指在人基因序列中间隔体所靶向的5’-最末端核苷。“终止位点”指在人基因序列中间隔体所靶向的3’-最末端核苷。下表中所列的每个间隔体均靶向SEQIDNO:1或SEQIDNO:10。‘n/a’表明反义寡核苷酸不靶向该特定基因序列。
用5,000nM反义寡核苷酸使用电穿孔转染密度为20,000个细胞/孔的培养HepaRGTM细胞。约24小时处理期后，从细胞分离RNA并通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平。使用人引物探针组RTS3454测量mRNA水平。正如通过所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。在一系列具有相似培养条件的实验中试验反义寡核苷酸。在以下所示单独的表中呈现了每个实验的结果。结果呈现为相对于未处理的对照细胞，PKK的抑制百分数。
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
表17
表18
实施例3：在HepaRGTM细胞中的人PKK受具有MOE、脱氧和cEt糖修饰的反义寡核苷酸的反义抑制
设计另外的靶向PKK核酸的反义寡核苷酸并试验其在体外对PKKmRNA的影响。
下表中的嵌合型反义寡核苷酸设计为脱氧、MOE和cEt间隔体。所述间隔体长度为16个核苷，其中所述核苷具有MOE糖修饰、cEt糖修饰或脱氧修饰。‘化学’一栏描述了每个寡核苷酸的糖修饰。‘k’指cEt糖修饰；数字指脱氧核苷的数量；另外，‘d’指脱氧核糖；并且‘e’指2’-O-甲氧基乙基修饰。遍及每个间隔体的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。遍及每个寡核苷酸的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指在人基因序列中间隔体所靶向的5’-最末端核苷。“终止位点”指在人基因序列中间隔体所靶向的3’-最末端核苷。下表中所列的每个间隔体均靶向本文指定为SEQIDNO:1的人PKKmRNA或本文指定为SEQIDNO:10的人PKK基因组序列。‘n/a’表明反义寡核苷酸不靶向该特定基因序列。
用1,000nM反义寡核苷酸使用电穿孔转染密度为20,000个细胞/孔的培养HepaRGTM细胞。约24小时处理期后，从细胞分离RNA并通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平。使用人引物探针组RTS3454测量mRNA水平。在这项测定中也包括ISIS531231。正如通过所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。在一系列具有相似培养条件的实验中试验反义寡核苷酸。在以下所示单独的表中呈现了每个实验的结果。结果呈现为相对于未处理的对照细胞，PKK的抑制百分数。
表19
表20
表21
表22
表23
表24
表25
表26
表27
表28
表29
表30
表31
实施例4：对HepaRGTM细胞中的人PKK的剂量依赖性反义抑制
选择来自于上述研究的表现出对PKKmRNA显著体外抑制的间隔体并且在不同剂量下在HepaRGTM细胞中试验。按20,000个细胞/孔的密度接种细胞并且用0.12μM、0.37μM、1.11μM、3.33μM和10.00μM浓度的反义寡核苷酸使用电穿孔转染细胞。约16小时处理期后，从细胞分离RNA并通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平。使用人PKK引物探针组RTS3454测量mRNA水平。正如通过所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。在一系列具有相似培养条件的实验中试验反义寡核苷酸。在以下所示单独的表中呈现了每个实验的结果。结果呈现为相对于未处理的对照细胞，PKK的抑制百分数。
还呈现了每种寡核苷酸的半最高抑制浓度(IC50)。在经反义寡核苷酸处理的细胞中PKKmRNA水平以剂量依赖方式显著降低。
表32
| ISIS号 | 0.12μM | 0.37μM | 1.11μM | 3.33μM | 10.00μM | IC50(μM) |
| 486847 | 0 | 34 | 48 | 71 | 87 | 1.1 |
| 530933 | 15 | 13 | 42 | 67 | 66 | 1.7 |
| 530959 | 12 | 27 | 53 | 80 | 94 | 0.9 |
| 530965 | 8 | 5 | 63 | 83 | 91 | 0.8 |
| 530967 | 30 | 36 | 48 | 82 | 91 | 0.7 |
| 530970 | 1 | 0 | 66 | 76 | 84 | 1.0 |
| 530971 | 12 | 40 | 52 | 66 | 70 | 1.3 |
| 530988 | 0 | 25 | 54 | 86 | 78 | 0.9 |
| 530992 | 0 | 50 | 63 | 83 | 80 | 0.7 |
| 531002 | 6 | 28 | 58 | 82 | 86 | 0.9 |
| 531004 | 0 | 14 | 25 | 71 | 84 | 2.1 |
| 531005 | 14 | 28 | 61 | 73 | 77 | 0.9 |
| 531022 | 0 | 0 | 32 | 62 | 77 | 2.2 |
| 531078 | 10 | 27 | 54 | 69 | 92 | 1.1 |
| 531231 | 23 | 30 | 76 | 89 | 94 | 0.6 |
表33
实施例5：对HepaRGTM细胞中的人PKK的剂量依赖性反义抑制
选择来自于上述研究的表现出对PKKmRNA显著体外抑制的间隔体并且在不同剂量下在HepaRGTM细胞中试验。按20,000个细胞/孔的密度接种细胞并且用0.19μM、0.56μM、1.67μM和5.00μM浓度的反义寡核苷酸使用电穿孔转染细胞。约16小时处理期后，从细胞分离RNA并通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平。使用人PKK引物探针组RTS3454测量mRNA水平。正如通过所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。在一系列具有相似培养条件的实验中试验反义寡核苷酸。在以下所示单独的表中呈现了每个实验的结果。结果呈现为相对于未处理的对照细胞，PKK的抑制百分数。‘n/a’表明未对该特定剂量的该特定反义寡核苷酸进行测量。
还呈现了每种寡核苷酸的半最高抑制浓度(IC50)。在经反义寡核苷酸处理的细胞中PKKmRNA水平以剂量依赖方式显著降低。
表34
表35
| ISIS号 | 0.19μM | 0.56μM | 1.67μM | 5.00μM | IC50(μM) |
| 531231 | 25 | 34 | 84 | 92 | 0.7 |
| 546190 | 33 | 65 | 86 | n/a | 0.4 |
| 546208 | 16 | 45 | 79 | 91 | 0.7 |
| 546216 | 62 | 69 | 88 | 88 | 0.1 |
| 546255 | 32 | 35 | 78 | 87 | 0.5 |
| 546268 | 56 | 50 | 82 | 93 | 0.1 |
| 546301 | 25 | 50 | 53 | 87 | 0.8 |
| 546849 | 23 | 35 | 83 | 91 | 0.7150 --> |
| 546852 | 19 | 40 | 78 | 85 | 0.8 |
| 546889 | 23 | 54 | 78 | 91 | 0.6 |
| 546916 | 43 | 71 | 79 | 89 | 0.2 |
| 546967 | 20 | 39 | 76 | 71 | 0.7 |
| 547273 | 44 | 69 | 87 | 87 | 0.2 |
| 547276 | 35 | 44 | 71 | 77 | 0.6 |
| 547335 | 8 | 52 | 85 | 92 | 0.7 |
| 547340 | 46 | 79 | 88 | n/a | 0.2 |
| 547602 | 18 | 53 | 92 | 87 | 0.5 |
| 547647 | 1 | 70 | 72 | n/a | 0.8 |
| 547694 | 0 | 29 | 67 | 90 | 1.2 |
表36
表37
| ISIS号 | 0.19μM | 0.56μM | 1.67μM | 5.00μM | IC50(μM) |
| 531231 | 34 | 47 | 72 | n/a | 0.5 |
| 546214 | 0 | 0 | 68 | 85 | 1.3 |
| 546304 | 0 | 6 | 51 | 71 | 2.1 |
| 546739 | 35 | 55 | 57 | 79 | 0.6 |
| 546832 | 19 | 38 | 70 | 95 | 0.8151 --> |
| 546847 | 39 | 57 | 75 | 89 | 0.4 |
| 546855 | 18 | 7 | 30 | 82 | 2.2 |
| 546877 | 0 | 19 | 75 | 80 | 1.3 |
| 546939 | 1 | 66 | 86 | 90 | 0.6 |
| 547349 | 0 | 8 | 66 | 76 | 1.6 |
| 547360 | 8 | 27 | 76 | 76 | 0.8 |
| 547368 | 0 | 0 | 31 | 80 | 2.5 |
| 547483 | 0 | 9 | 49 | 71 | 2.1 |
| 547575 | 0 | 34 | 82 | 93 | 1.1 |
| 547618 | 0 | 0 | 73 | 98 | 1.3 |
| 547622 | 0 | 47 | 79 | 90 | 0.9 |
| 547637 | 10 | 21 | 36 | 82 | 1.8 |
| 547731 | 0 | 0 | 17 | 56 | 5.0 |
| 548752 | 0 | 0 | 51 | 90 | 1.9 |
表38
表39
| ISIS号 | 0.19μM | 0.56μM | 1.67μM | 5.00μM | IC50(μM) |
| 531231 | 21 | 39 | 90 | 97 | 0.6 |
| 546232 | 49 | 50 | 94 | 97 | 0.2152 --> |
| 546248 | 25 | 66 | 87 | 93 | 0.4 |
| 546835 | 9 | 35 | 68 | 93 | 0.9 |
| 546848 | 0 | 18 | 91 | 97 | 1.0 |
| 546853 | 47 | 64 | 84 | n/a | 0.2 |
| 546870 | 35 | 42 | 80 | 95 | 0.5 |
| 546872 | 32 | 33 | 82 | 94 | 0.4 |
| 546876 | 0 | 50 | 85 | 95 | 0.8 |
| 547275 | 34 | 66 | 82 | 95 | 0.3 |
| 547341 | 36 | 58 | 91 | 95 | 0.3 |
| 547366 | 0 | 45 | 68 | 91 | 1.2 |
| 547453 | 25 | 40 | 54 | 92 | 0.8 |
| 547457 | 41 | 65 | 80 | 85 | 0.3 |
| 547616 | 26 | 50 | 72 | 89 | 0.6 |
| 547632 | 44 | 47 | 81 | 97 | 0.6 |
| 547633 | 12 | 46 | 78 | n/a | 0.7 |
| 547718 | 36 | 12 | 69 | 74 | 1.6 |
| 548757 | 18 | 49 | 82 | 93 | 0.6 |
表40
| ISIS号 | 0.19μM | 0.56μM | 1.67μM | 5.00μM | IC50(μM) |
| 531231 | 6 | 38 | 74 | 95 | 0.8 |
| 546291 | 22 | 32 | 34 | 72 | 2.0 |
| 546310 | 0 | 36 | 56 | 80 | 1.3 |
| 546896 | 0 | 45 | 82 | 97 | 0.8 |
| 546980 | 0 | 18 | 29 | 80 | 2.2 |
| 547009 | 0 | 9 | 21 | 63 | 3.6 |
| 547019 | 0 | 6 | 54 | 86 | 1.6 |
| 547277 | 2 | 32 | 34 | 62 | 2.8 |
| 547288 | 0 | 0 | 0 | 38 | >5.0 |
| 547374 | 0 | 15 | 24 | 44 | >5.0 |
| 547493 | 0 | 26 | 64 | 77 | 1.3 |
| 547520 | 0 | 25 | 66 | 64 | 1.1 |
| 547712 | 0 | 5 | 21 | 62 | 3.8 |
| 547722 | 0 | 15 | 32 | 73 | 2.4 |
| 547728 | 0 | 2 | 16 | 61 | 4.4 |
| 547780 | 0 | 10 | 36 | 55 | 3.9 |
| 548743 | 25 | 57 | 73 | 88 | 0.5 |
| 548753 | 0 | 23 | 49 | 84 | 1.5 |
| 548756 | 0 | 4 | 16 | 86 | >5.0 |
表41
| ISIS号 | 0.19μM | 0.56μM | 1.67μM | 5.00μM | IC50(μM) |
| 531231 | 25 | 55 | 89 | 97 | 0.5 |
| 546188 | 27 | 69 | 88 | 97 | 0.4 |
| 546216 | 23 | 78 | 95 | 98 | <0.2 |
| 546254 | 40 | 63 | 84 | 95 | 0.3 |
| 546268 | 0 | 71 | 92 | 92 | 0.5 |
| 546343 | 37 | 32 | 83 | 95 | 0.4 |
| 546825 | 38 | 82 | n/a | 99 | 0.2 |
| 546827 | 23 | 74 | 98 | 96 | 0.4 |
| 546828 | 0 | 64 | 89 | 97 | 0.2 |
| 546846 | 26 | 49 | 85 | n/a | 0.5 |
| 546967 | 22 | 45 | 74 | 92 | 0.7 |
| 547273 | 0 | 60 | 82 | 83 | 0.6 |
| 547340 | 34 | 84 | 96 | n/a | 0.3 |
| 547423 | 78 | 92 | n/a | n/a | <0.2 |
| 547445 | 80 | 87 | 98 | 91 | <0.2 |
| 547564 | 46 | 66 | 90 | 97 | 0.2 |
| 547587 | 38 | 64 | 91 | 97 | 0.3 |
| 547602 | 1 | 9 | 52 | 93 | 1.4 |
| 548758 | 0 | 72 | 79 | n/a | 0.6 |
表42
| ISIS号 | 0.19μM | 0.56μM | 1.67μM | 5.00μM | IC50(μM) |
| 531231 | 7 | 39 | 56 | 97 | 1.0 |
| 546190 | 21 | 34 | 76 | 98 | 0.7 |
| 546208 | 5 | 33 | 70 | 97 | 0.9 |
| 546251 | 19 | 45 | 91 | 97 | 0.6 |
| 546255 | 5 | 39 | 82 | 96 | 0.8 |
| 546739 | 4 | 62 | 84 | 86 | 0.6 |
| 546753 | 17 | 31 | 70 | 91 | 0.9 |
| 546849 | 13 | 45 | 84 | 98 | 0.7 |
| 546889 | 25 | 9 | 73 | 92 | 1.4 |
| 546897 | 16 | 17 | 69 | 97 | 0.8 |
| 546916 | 0 | 27 | 73 | 97 | 1.0 |
| 546986 | 7 | 28 | 69 | 86 | 1.1 |
| 547276 | 6 | 3 | 53 | 68 | 2.2 |
| 547293 | 0 | 45 | 65 | 70 | 1.3154 --> |
| 547298 | 0 | 12 | 67 | 87 | 1.7 |
| 547335 | 0 | 13 | 73 | 95 | 1.3 |
| 547426 | 18 | 35 | 80 | 95 | 0.7 |
| 547617 | 17 | 37 | 79 | 98 | 0.7 |
| 548770 | 9 | 0 | 61 | 92 | 1.7 |
表43
实施例6：对HepaRGTM细胞中的人PKK的剂量依赖性反义抑制
选择来自于上述研究的表现出对PKKmRNA显著体外抑制的间隔体并且在不同剂量下在HepaRGTM细胞中试验。按20,000个细胞/孔的密度接种细胞并且用0.11μM、0.33μM、1.00μM和3.00μM浓度的反义寡核苷酸使用电穿孔转染细胞。约16小时处理期后，从细胞分离RNA并通过定量实时PCR测量PKKmRNA水平。使用人PKK引物探针组RTS3454测量mRNA水平。正如通过所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。在一系列具有相似培养条件的实验中试验反义寡核苷酸。在以下所示单独的表中呈现了每个实验的结果。结果呈现为相对于未处理的对照细胞，PKK的抑制百分数。‘n/a’表明未对该特定剂量的该特定反义寡核苷酸进行测量。
还呈现了每种寡核苷酸的半最高抑制浓度(IC50)。在经反义寡核苷酸处理的细胞中PKKmRNA水平以剂量依赖方式显著降低。
表44
表45
| ISIS号 | 0.11μM | 0.33μM | 1.00μM | 3.00μM | IC50(μM) |
| 547747 | 8 | 61 | 90 | 92 | 0.3 |
| 547807 | 26 | 71 | 61 | 94 | 0.4 |
| 547922 | 67 | 75 | 81 | 92 | 0.0 |
| 547927 | 56 | 64 | 92 | 88 | 0.1 |
| 547948 | 60 | 80 | 88 | 97 | 0.0 |
| 547979 | 56 | 58 | 94 | 97 | 0.1 |
| 548005 | 53 | 49 | 71 | 95 | 0.4 |
| 548024 | 28 | 57 | 84 | 82 | 0.3 |
| 548043 | 14 | 60 | 90 | 92 | 0.3 |
| 548055 | 43 | 57 | 50 | 88 | 0.3 |
| 548106 | 53 | 54 | 82 | 94 | 0.1 |
| 548109 | 50 | 92 | 79 | 85 | 0.1 |
| 548155 | 49 | 50 | 70 | 81 | 0.3 |
| 548180 | 11 | 59 | 71 | 88 | 0.4 |
| 548278 | 3 | 59 | 78 | 93 | 0.4 |
| 548343 | 61 | 67 | 88 | 92 | 0.0 |
| 548558 | 53 | 61 | 78 | 95 | 0.1156 --> |
| 548570 | 20 | 40 | 70 | 94 | 0.4 |
| 548583 | 43 | 46 | 93 | 88 | 0.2 |
表46
表47
| ISIS号 | 0.11μM | 0.33μM | 1.00μM | 3.00μM | IC50(μM) |
| 547747 | 16 | 59 | 85 | 96 | 0.3 |
| 547808 | 19 | 22 | 48 | 71 | 1.1 |
| 547861 | 7 | 40 | 75 | 84 | 0.5 |
| 548069 | 6 | 0 | 27 | 66 | 1.9 |
| 548128 | 14 | 29 | 49 | 66 | 1.1 |
| 548170 | 0 | 8 | 26 | 65 | 2.0 |
| 548174 | 20 | 18 | 29 | 62 | 2.0 |
| 548197 | 33 | 37 | 51 | 75 | 0.8 |
| 548201 | 0 | 7 | 70 | 85 | 0.8 |
| 548217 | 22 | 24 | 54 | 71 | 0.9 |
| 548220 | 0 | 0 | 0 | 6 | >3 |
| 548247 | 16 | 50 | 62 | 82 | 0.5 |
| 548422 | 0 | 32 | 71 | 93 | 0.7 |
| 548479 | 2 | 52 | 82 | 97 | 0.4157 --> |
| 548486 | 20 | 48 | 77 | 92 | 0.4 |
| 548521 | 21 | 0 | 3 | 1 | >3 |
| 548655 | 0 | 0 | 8 | 33 | >3 |
| 548667 | 0 | 37 | 73 | 86 | 0.7 |
| 548668 | 10 | 30 | 61 | 84 | 0.7 |
实施例7：在转基因小鼠中靶向人PKK的反义寡核苷酸的功效
用选自上述研究的ISIS反义寡核苷酸处理含有人KLKB1基因序列(4号染色体：位置187148672-187179625，登录号：NC_000004.11)的37,390个碱基对的片段的转基因小鼠，评价其在这种模型中的功效。
处理
多组转基因小鼠皮下注射2.5mg/kg/周、5.0mg/kg/周、10mg/kg/周或20mg/kg/周的ISIS546232、ISIS546251、ISIS546254、ISIS546343、ISIS546828、ISIS547455、ISIS547457、ISIS547927和ISIS548048每周两次，历时3周。一组转基因小鼠皮下注射PBS每周两次，历时3周。在最后一个剂量之后对小鼠施安乐死，并且收获器官和血浆做进一步分析。
RNA分析
为了评价ISIS寡核苷酸对靶标减少的影响，从肝脏组织提取RNA进行人PKK的实时PCR分析。结果作为相对于PBS对照，PKKmRNA的抑制百分数呈现。如表48所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致与PBS对照相比PKKmRNA显著减少。
表48
在转基因小鼠肝脏中PKKmRNA相对于PBS对照的抑制百分数
蛋白质分析
评价所有组中的血浆PKK蛋白质水平。结果作为相对于PBS对照，PKK蛋白质的抑制百分数呈现。如表49所示，用ISIS寡核苷酸处理导致与PBS对照相比PKK蛋白质水平显著降低。
表49
在转基因小鼠肝脏中PKK蛋白质水平相对于PBS对照的降低百分数
实施例8：在食蟹猴中靶向人PKK的ISIS反义寡核苷酸的作用
用选自上述研究的ISIS反义寡核苷酸处理食蟹猴。评价反义寡核苷酸功效和耐受性。试验的人反义寡核苷酸可与猕猴基因组序列(基因库登录号NW_001118167.1，截自核苷酸2358000至2391000并且本文指定为SEQIDNO:18)交叉反应。表50中呈现了每个寡核苷酸对SEQIDNO:18的靶起始位点。‘错配’指寡核苷酸与猕猴序列错配的核苷酸的数量。人寡核苷酸和猕猴序列之间的互补性越高，人寡核苷酸越可与猕猴序列交叉反应的可能性越高。‘n/a’表明所述寡核苷酸与猕猴基因序列具有3个以上的错配。
表50
与SEQIDNO:18互补的反义寡核苷酸
处理
研究之前，保持猴子隔离，为期30天，期间每天观察动物的总体健康状况。猴子为2-4岁并且重量介于2和4kg之间。为10组各4只随机分配的雄性食蟹猴皮下注射ISIS寡核苷酸或PBS。最初施用剂量为40mg/kg的PBS溶液或ISIS寡核苷酸，负荷给药方案由研究第一周的4个剂量(第1、3、5和7天)组成，接着是维持给药方案由第14天开始的每周一次施用组成(第2至13周)。在背部的4个部位按顺时针旋转进行皮下注射；每个剂量一个部位。在使用克他命(ketamine)镇静的同时用纹身勾画出注射部位，并且间隔最小3cm。
研究期间，最少每天观察一次猴子的疾病或痛苦体征。即时地将由于所述处理、损伤或疾病而经历短暂或轻微疼痛或痛苦的任何动物报告给责任兽医和研究负责人。鉴定健康不佳或处于可能垂死状态的任何动物以进一步监测和可能安乐死。例如，经ISIS547445处理的两只猴子由于行为减弱、侧卧位、对刺激没有反应且呼吸减慢而被施安乐死。实施例中描述的方案经实验动物照护和使用委员会(IACUC)批准。
靶标减少
RNA分析
在第87或88天，在最终剂量48小时后，从肝脏组织提取RNA，使用引物探针组RTS3455(正向序列CCTGTGTGGAGGGTCACTCA，本文指定为SEQIDNO:23；反向序列CCACTATAGATGCGCCAAACATC，本文指定为SEQIDNO:24；探针序列CCCACTGCTTTGATGGGCTTCCC，本文指定为SEQIDNO:25)进行PKK的实时PCR分析。结果标准化为管家基因，亲环素。结果作为PKKmRNA相对于PBS对照的抑制百分数呈现。如表51所示，用ISIS反义寡核苷酸处理导致PKKmRNA与PBS对照相比显著减少。
表51
在食蟹猴肝脏中PKKmRNA相对于PBS对照的抑制百分数
| ISIS号 | 抑制％ |
| 546232 | 88 |
| 546251 | 90 |
| 546254 | 88 |
| 546343 | 74 |
| 546828 | 45 |
| 547455 | 90 |
| 547457 | 89 |
| 547927 | 54 |
| 548048 | 95 |
蛋白质分析
在给药前、第17天、第31天、第45天、第59天和第73天，每次从所有可用动物采集约0.9mL血液并置于装有3.2％柠檬酸钠的管中。离心所述管(在室温下3000rpm离心10分钟)以获得血浆。通过ELISA测量血浆中的PKK蛋白质水平。结果呈现于表52中，表示为与PBS对照水平相比的抑制百分比。结果表明ISIS寡核苷酸显著降低了PKK蛋白质水平。
表52
在食蟹猴血浆中PKK蛋白质水平相对于对照水平的降低(％)
耐受性研究
肝功能
为评价ISIS寡核苷酸对肝功能的影响，猴子禁食整夜。从所有研究组采集约1.5mL血样。将血样采集在无抗凝剂的管中以便血清分离。将所述管保持在室温下最少90分钟，然后在3,000rpm下离心10分钟。使用Toshiba120FRNEO化学分析仪(ToshibaCo.,Japan)测量各种肝功能标志物的水平。结果呈现于表53中并且表明反义寡核苷酸对肝功能没有超出反义寡核苷酸预期范围的影响。
表53
食蟹猴血浆中的肝功能标志物
血液学
为评价食蟹猴中的ISIS寡核苷酸对血液学参数的任何影响，在给药前和在第87天或第88天在装有K2-EDTA的管中从每只可用研究动物采集约1.2mL血液的血样。使用ADVIA2120i血液学分析仪(SIEMENS,USA)分析样品的红血细胞(RBC)计数、白血细胞(WBC)计数、血小板计数、血红蛋白含量和血细胞比容。数据呈现于表54中。
数据表明用大多数寡核苷酸处理并未在血液学参数上引起超出在该剂量下的反义寡核苷酸预期范围的任何变化。
表54
食蟹猴中的血液学参数
肾功能
为评价ISIS寡核苷酸对肾功能的影响，猴子禁食整夜。从所有研究组采集约1.5mL血样。将血样采集在无抗凝剂的管中以便血清分离。将所述管保持在室温下最少90分钟，然后在3,000rpm下离心10分钟。使用Toshiba120FRNEO化学分析仪(ToshibaCo.,Japan)测量BUN和肌酐的水平。结果呈现于表55中，用mg/dL表示。血浆化学数据表明大多数ISIS寡核苷酸对肝功能没有超出反义寡核苷酸预期范围的任何影响。具体地，在猴子的肾功能方面用ISIS546254处理耐受良好。
还在尿液分析中评估了肾功能。在湿冰上使用干净的笼盘从所有动物采集新鲜尿液。在进行新鲜尿液采集之前移除食物整夜，但是供给水。使用Toshiba120FRNEO自动化学分析仪(ToshibaCo.,Japan)测量总蛋白质和肌酐水平并且计算蛋白质与肌酐比率。结果呈现于表56中。
表55
食蟹猴中的血浆BUN和肌酐水平(mg/dL)
| BUN | 肌酐 | |
| PBS | 22.8 | 0.9 |
| ISIS 546232 | 22.7 | 1.0 |
| ISIS 546251 | 25.4 | 1.1 |
| ISIS 546254 | 25.7 | 0.9 |
| ISIS 546343 | 26.2 | 1.0 |
| ISIS 546828 | 24.7 | 0.9 |
| ISIS 547455 | 29.4 | 0.9 |
| ISIS 547457 | 24.3 | 1.0 |
| ISIS 547927 | 22.3 | 1.0 |
| ISIS 548048 | 21.9 | 0.9 |
表56
食蟹猴中的尿蛋白质/肌酐比率
| 比率 | |
| ISIS 546232 | 0.03 |
| ISIS 546251 | 0.12 |
| ISIS 546254 | 0.04 |
| ISIS 546343 | 0.01 |
| ISIS 546828 | 0.03 |
| ISIS 547455 | 0.70 |
| ISIS 547457 | 0.03 |
| ISIS 547927 | 0.04 |
| ISIS 548048 | 0.03 |
| PBS | 0.06 |
C反应蛋白水平分析
为评价在食蟹猴中ISIS寡核苷酸的任何炎症作用，猴子禁食整夜。从所有研究组采集约1.5mL血样。将血液采集在无抗凝剂的管中以便血清分离。将所述管保持在室温下最少90分钟，然后在3,000rpm下离心10分钟。使用Toshiba120FRNEO化学分析仪(ToshibaCo.,Japan)测量在肝脏中合成并且用作炎症标志物的C反应蛋白(CRP)。类似地还测量了补体C3，并且数据作为基线值的百分比呈现。结果呈现于表57中并且表明在猴子中用ISIS寡核苷酸处理并未引起炎症。
表57
食蟹猴血浆中的C反应蛋白和C3水平
实施例9：对小鼠原代肝细胞中的鼠类PKKmRNA的反义抑制
设计靶向鼠类PKK核酸的反义寡核苷酸并试验其在体外对PKKmRNA的影响。使用细胞转染试剂(Cytofectin)用12.5nM、25.0nM、50.0nM、100.0nM和200.0nM的反义寡核苷酸转染培养的密度为10,000个细胞/孔的小鼠原代肝细胞。约24小鼠处理期后，从细胞分离RNA并且使用鼠类引物探针组RTS3313(正向序列TGCCTGCTGTTCAGCTTTCTC，本文指定为SEQIDNO:2228；反向序列TGGCAAAGTCCCTGTAATGCT，本文指定为SEQIDNO:2229；探针序列CGTGACTCCACCCAAAGAGACAAATAAACG，本文指定为SEQIDNO:2230)通过定量实时PCR测量小鼠PKKmRNA水平。正如通过RIBOGREEN所测量，根据RNA总含量调节PKKmRNA水平。
嵌合型反义寡核苷酸设计为5-10-5MOE间隔体。所述间隔体长度为20个核苷酸，其中中央间隙区段由10个2’-脱氧核苷组成并且在两侧上(在5’和3’方向上)是各包含5个核苷的侧翼。5’侧翼区段中的每个核苷和3’侧翼区段中的每个核苷具有2’-O-甲氧基乙基修饰。遍及每个间隔体的核苷间键联为硫代磷酸酯键联。遍及每个间隔体的所有胞嘧啶残基为5-甲基胞嘧啶。结果证明PKKmRNA水平以剂量依赖方式显著降低。
在一个具体实例中，ISIS482584(GGCATATTGGTTTTTGGAAT；SEQIDNO:2244)以剂量依赖方式减少PKKmRNA，产生84nM的半最高抑制浓度(IC50)(参见表58)。ISIS482584靶向SEQIDNO:11(基因库登录号NM_008455.2)并且具有为1586的靶起始位点和为1605的靶终止位点。“靶起始位点”指间隔体所靶向的5’-最末端核苷酸。“靶终止位点”指间隔体所靶向的3’-最末端核苷酸。
表58
小鼠PKKmRNA水平受ISIS482584的剂量依赖性抑制
| 剂量 | 抑制％ |
| 12.5nM | 0 |
| 25.0nM | 47 |
| 50.0nM | 27 |
| 100.0nM | 60 |
| 200.0nM | 82 |
实施例10：对BALB/c小鼠中的PKKmRNA的反义抑制
试验ISIS482584在体外对鼠类PKKmRNA的影响。
处理
用2.5mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg、40.0mg/kg或80.0mg/kg的ISIS482584处理6个组的每只雄性BALB/c小鼠，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg、40.0mg/kg、80.0mg/kg或160.0mg/kg)。用PBS处理对照组的BALB/c小鼠，每周皮下施用两次，历时3周。最后一个剂量的反义寡核苷酸或PBS两天后，用150mg/kg克他命与10mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)混合，通过腹腔内注射施用麻醉来自所有组的小鼠。采集肝脏进行RNA分析。
RNA分析
从肝脏组织提取RNA进行PKK的实时PCR分析。使用鼠类引物探针组(正向序列ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC，本文指定为SEQIDNO:2231；反向序列GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT，本文指定为SEQIDNO:2232；探针序列AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC，本文指定为SEQIDNO:2233)测量PKKmRNA水平。结果作为相对于PBS对照，PKK的抑制百分数呈现。如表59所示，用ISIS482584处理导致PKKmRNA与PBS对照相比显著剂量依赖性减少。
表59
在BALB/c小鼠肝脏中PKKmRNA的剂量依赖性减少
蛋白质分析
将血浆采集在装有作为抗凝剂的柠檬酸钠的管中。使样品在4-12％梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上电泳，接着用鼠类PKK抗体(R&DSystem)进行免疫印迹。用二次荧光团标记抗体(LI-COR)培育印迹并且在Odyssey成像仪(LI-COR)中成像。结果作为相对于PBS对照，PKK的抑制百分数呈现。如表60所示，用ISIS482584处理导致PKK血浆蛋白质与PBS对照相比显著剂量依赖性减少。
表60
在BALB/c小鼠血浆中的PKK蛋白质的剂量依赖性减少
n.d.＝无数据
实施例11：在血管性水肿小鼠模型中反义抑制鼠类PKK的体内效果
遗传性血管性水肿(HAE)特征在于局部肿胀和皮下组织中的血管通透性增加(Morgan,B.P.N.Engl.J.Med.363:581-83,2010)。它是由缺乏C1抑制剂，补体系统的一种蛋白质而引起。在这项研究中使用两种小鼠模型，包括建立的小鼠C1-INH缺乏模型和卡托普利(captopril)诱导的水肿模型，两种模型均引起血管通透性，这是HAE的标志。血管通透性逆转伴随有高分子量激肽原(HMWK)的血浆水平升高。
在第一种模型中，通过用卡托普利(一种在小鼠中增加血管通透性并重现遗传性血管性水肿的病理的已知抗高血压药)处理而诱导血管性水肿。
在第二种模型中，通过用ISIS461756(一种靶向鼠类C1抑制剂mRNA)，在小鼠中增加血管通透性并重现遗传性血管性水肿的病理的反义寡核苷酸处理而诱导血管性水肿。ISIS461756(SEQIDNO:2245；AAAGTGGTTGATACCCTGGG)是靶向NM_009776.3(SEQIDNO:2243)的核苷1730-1749的5-10-5MOE间隔体。
评价HOE-140和ISIS482584(PKK的反义寡核苷酸抑制剂)在卡托普利和ISIS461756诱导的血管通透性小鼠模型中的效果。一些鼠类分组用HOE-140，阻断血管舒张和血管通透性的缓激肽B2受体的选择性拮抗剂处理(Cruden和Newby，ExpertOpin.Pharmacol.9:2383-90,2008)。其它小鼠用抑制PKKmRNA表达的ISIS482584处理。将用HOE-140处理的效果与用ISIS482584处理的效果做比较。
处理
表61中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周的4只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。未向用作对照组以测量血管通透性的基础水平的第1组施用其它处理。
第2组由用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在处理结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第2组用作卡托普利诱导的血管通透性的PBS对照组。
第3组由用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在第14天，用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸，ISIS461756，处理小鼠，每周皮下施用两次，历时2周。在处理结束期时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第3组用作卡托普利和ISIS461756诱导的血管通透性的PBS对照组。
第4组由用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在第14天，用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸，ISIS461756，处理小鼠，每周皮下施用两次，历时2周。在处理结束期时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。然后小鼠还经腹腔内施用30μg的HOE-140。第4组用作以HOE-140抑制血管通透性的阳性对照。
第5组由用40mg/kg对照寡核苷酸ISIS141923，无已知鼠类靶标的5-10-5MOE间隔体(CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC；SEQIDNO:2246)处理，每周皮下施用两次，历时4周的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在第14天，用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸，ISIS461756，处理小鼠，每周皮下施用两次，历时2周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第5组用作卡托普利和ISIS461756诱导的血管通透性的对照组。
第6组由用40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时4周的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第6组用作实验处理组，以检查PKKASO对卡托普利诱导的血管通透性的影响。
第7组由用40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时4周的8只C57BL/6J-Tyrc-2J小鼠组成。在第14天，用50mg/kg靶向C1抑制剂的反义寡核苷酸，ISIS461756，处理小鼠，每周皮下施用两次，历时2周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第7组用作实验处理组，以检查PKKASO对卡托普利和ISIS461756诱导的血管通透性的影响。
然后向尾静脉为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部、耳朵和肠道。通过心脏穿刺取血样。
表61
处理组
血管通透性的量化
将收获自足部、结肠、耳朵和肠道的组织分别置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含耳朵和足部组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度，并呈现于表62中。展现出任何血管性水肿表现的小鼠吸收更多染料并且，因此展示出高OD值。
如表62所呈现，与各自的PBS对照组(第2和3组)相比，在经卡托普利处理的小鼠(第6组)中和在经卡托普利和ISIS461756处理的小鼠(第7组)中用ISIS482584处理预防血管通透性。与经对照寡核苷酸，ISIS141923，处理的小鼠(第5组)相比，在第6和7组的小鼠中血管通透性的程度在大多数组织中也降低，其中血管通透性由卡托普利和ISIS461756诱导。在两个处理组(第6和7组)的结肠和足部组织中血管通透性的程度比得上在仅用PBS处理的小鼠(第1组)中所观察到的基础水平。在用ISIS482584处理的小鼠中血管通透性的降低比得上在用缓激肽2受体拮抗剂(HOE140)处理的小鼠(在这项测定中用作阳性对照)中所见的血管通透性的降低。
因此，对PKKmRNA的反义抑制可能对治疗和预防为HAE症状的血管通透性有益。
表62
用于测量血管通透性的伊文氏蓝的OD600nm
高分子量激肽原(HMWK)的量化
图1中呈现了来自于血样的HMWK的Western印迹量化。
如图1所示，来自于第1和2组的样品与第6和7组相比具有低HMWK水平，表明在第6和7组中血管通透性逆转。也如图1所示，来自于第1和2组的样品与第6和7组相比具有增加的HMWK裂解产物。因此，HMWK的缺乏是由PKK将HMWK裂解为裂解产物(包括缓激肽和HKa)而引起。
实施例12：在小鼠中反义抑制鼠类PKK对基础通透性和卡托普利诱导的通透性的体内影响
基础通透性是在首次接受试验、未经处理的小鼠中出现的血管通透性水平。评价ISIS482584在预防基础或卡托普利诱导的血管通透性中的效果。
处理
表63中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周。未向用作对照组以测量血管通透性的基础水平的第1组施用其它处理。
第2组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第2组用作卡托普利诱导的血管通透性的阴性对照组。
第3组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周。在处理结束期时，小鼠经腹腔内施用30μg的HOE-140。第3组用作抑制基础血管通透性的阳性对照。
第4组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时4周。在处理结束期时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。小鼠还经腹腔内施用30μg的HOE-140。第4组用作抑制卡托普利诱导的血管通透性的阳性对照。
第5组由8只小鼠组成并且用40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时4周。第5组用作实验处理组，以检查ISIS482584对基础血管通透性的影响。
第6组由8只小鼠组成并且用40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时4周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第6组用作实验处理组，以检查ISIS482584对卡托普利诱导的血管通透性的影响。
然后为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部、耳朵和肠道。
表63
处理组
| 分组编号 | 处理 | 卡托普利 | HOE-140 |
| 1.(N＝8) | PBS | 否 | 否 |
| 2.(N＝8) | PBS | 是 | 否 |
| 3.(N＝8) | PBS | 否 | 是 |
| 4.(N＝8) | PBS | 是 | 是 |
| 5.(N＝8) | ISIS 482584 | 否 | 否 |
| 6.(N＝8) | ISIS 482584 | 是 | 否 |
血管通透性的量化
将收获自足部、结肠、肠道和耳朵的组织分别置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含足部和耳朵组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度，并呈现于表64中。展现出任何血管性水肿表现的小鼠吸收更多染料并且，因此展示出高OD值。
如表64所呈现，与PBS对照相比(第5组与第1组)，经ISIS482584处理的小鼠展示出降低的基础血管通透性。通过用ISIS482584处理对基础血管通透性的降低比得上通过用HOE-140处理引起的降低(第3组，其用作阳性对照)。与PBS对照相比(第6组与第2组)，经ISIS482584处理的小鼠在大多数组织中还展示出降低的卡托普利诱导的血管通透性。通过用ISIS482584处理对卡托普利诱导的血管通透性的降低比得上通过用HOE-140处理引起的降低(第4组，其用作阳性对照)。
表64
用于测量血管通透性的伊文氏蓝染料的OD600nm
实施例13：反义抑制鼠类PKK对卡托普利诱导的血管通透性的剂量依赖性影响
评价不同剂量的ISIS482584对卡托普利诱导的血管通透性的影响。
处理
表65中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由4只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。未向用作对照组以测量血管通透性的基础水平的第1组施用其它处理。
第2组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第2组用作卡托普利诱导的血管通透性的对照组。
第3组由4只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理结束期时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。小鼠还经腹腔内施用30μg的艾替班特(Icatibant)(HOE-140)。第4组用作抑制卡托普利诱导的血管通透性的阳性对照。
第4、5、6、7、8和9组各由8只小鼠组成并且用分别为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg(相当于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg或160mg/kg)的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理结束期时，所有组的小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第4-9组用作实验处理组，以检查不同剂量的ISIS482584对卡托普利诱导的血管通透性的影响。
然后向尾静脉为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部、耳朵和肠道。通过心脏穿刺取血样。
表65
处理组
血管通透性的量化
将收获的组织置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含足部和耳朵组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度，并呈现于表66中。展现出任何血管性水肿表现的小鼠吸收更多染料并且，因此展示出高OD值。
如表66所呈现，与相应的PBS对照组(第2组)相比，经较高剂量的ISIS482584处理的小鼠(第4、5和6组)具有降低的卡托普利诱导的血管通透性水平。在这些处理组(第4和5组)的小鼠中血管通透性的降低比得上基线血管通透性水平(如第1组中所示)以及在经HOE-140处理的小鼠(第3组)中的水平。
表66
用于测量血管通透性的伊文氏蓝的OD600nm
血管渗漏的量化
将通过心脏穿刺吸取的血液立即与3倍体积的冰冷乙醇混合。在4℃下以15,000g离心所述溶液20分钟以去除细胞碎片和沉淀的血浆蛋白。通过10kDaMWCO过滤器超滤进一步纯化乙醇提取物。然后在OD620nm下测量经乙醇提取的血浆溶液的颜色强度。结果作为第1组PBS对照的OD值增大和减小百分比呈现于表67中。预计来自于展现出血管性水肿表现的小鼠的组织将从血浆中渗漏更多的染料并且，因此展示出低OD值，而处理组由于血管渗漏减少可展现出更高的OD值。经160mg/kg/周和80mg/kg/周的ISIS482584处理的小鼠(第4和5组)与经卡托普利处理的PBS阴性对照(第2组)相比展示出更少的血管渗漏。来自于第4和5组的结果比得上经HOE-140处理的阳性对照(第3组)。
表67
与PBS基础对照相比用于测量血管渗漏的伊文氏蓝的OD620nm百分比
实施例14：反义抑制鼠类PKK对基础血管通透性的剂量依赖性影响
评价不同剂量的ISIS482584对基础血管通透性的影响。
处理
表68中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。未向用作对照组以测量血管通透性的基础水平的第1组施用其它处理。
第2组由4只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用30μg的HOE-140。第2组用作抑制基础血管通透性的阴性对照。
第3、4、5、6、7和8组各由8只小鼠组成并且用分别为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg(相当于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg或160mg/kg)的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周。第4-9组用作实验处理组，以检查不同剂量的ISIS482584对基础血管通透性的影响。
然后在尾静脉中为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部和耳朵。通过心脏穿刺取血样。
表68
处理组
血管通透性的量化
将收获自足部、结肠和耳朵的组织置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含足部和耳朵组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度并呈现于表69中。OD值较高与通透性水平较高相关。
如表10所呈现，与PBS对照(第1组)相比，在所有剂量下经ISIS482584处理的小鼠(第3-8组)的大多数组织展示出降低的基础血管通透性。在ISIS寡核苷酸处理组的基础血管通透性上的降低比得上在经HOE-140处理的阳性对照组(第2组)中展示的降低。
表69
用于测量血管通透性的伊文氏蓝染料的OD600nm
血管渗漏的量化
将通过心脏穿刺吸取的血液立即与3倍体积的冰冷乙醇混合。在4℃下以15,000g离心所述溶液20分钟以去除细胞碎片和沉淀的血浆蛋白。通过10kDaMWCO过滤器超滤进一步纯化乙醇提取物。然后在OD620nm下测量经乙醇提取的血浆溶液的颜色强度。结果作为第1组PBS对照的OD值增大和减小百分比呈现于表70中。预计处理组由于血管渗漏可显示较高的OD值。在ISIS寡核苷酸处理组中的所有小鼠与PBS阴性对照相比展示出明显减少的血管渗漏。
表70
与PBS基础对照相比用于测量血管渗漏的伊文氏蓝的OD620nm百分比
高分子量激肽原(HMWK)的量化
图2及表71和72中呈现了来自于血样的HMWK的Western印迹量化。
如表71所示，经482584处理的组与PBS对照相比具有更高的HMWK水平，以剂量依赖方式增加。用PKK反义寡核苷酸处理导致HMWK稳定化。因此，在ISIS482584处理组中血管通透性以剂量依赖方式降低。如表72所示，经ISIS482584处理的组与PBS对照相比具有更少的HMWK裂解产物，以剂量依赖方式减少。因此，HMWK减少是由PKK将HMWK裂解为裂解产物(包括缓激肽和HKa)而引起。正如用密度计所测量，数据用强度单位呈现。
表71
用密度计量化HMWK
| 分组编号 | 处理 | 剂量(mg/kg/周) | 强度单位174 --> |
| 1 | PBS | - | 89 |
| 3 | ISIS 482584 | 160 | 21358 |
| 4 | ISIS 482584 | 80 | 7279 |
| 5 | ISIS 482584 | 40 | 873 |
| 6 | ISIS 482584 | 20 | 608 |
| 7 | ISIS 482584 | 10 | 507 |
表72
用密度计量化HMWK裂解产物
| 分组编号 | 处理 | 剂量(mg/kg/周) | 强度单位 |
| 1 | PBS | - | 401738 |
| 3 | ISIS 482584 | 160 | 19936 |
| 4 | ISIS 482584 | 80 | 204482 |
| 5 | ISIS 482584 | 40 | 388135 |
| 6 | ISIS 482584 | 20 | 403360 |
| 7 | ISIS 482584 | 10 | 414774 |
实施例15：在小鼠中靶向PKK和因子12的反义寡核苷酸对卡托普利诱导的血管通透性的联合治疗
在卡托普利诱导的血管通透性模型中用不同剂量的ISIS410944，靶向因子12(GCATGGGACAGAGATGGTGC；SEQIDNO:2247)的5-10-5MOE间隔体，和ISIS482584处理小鼠。
处理
表73中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由4只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。未向用作对照组以测量血管通透性的基础水平的第1组施用其它处理。
第2组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第2组用作卡托普利诱导的血管通透性的对照组。
第3组由4只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。小鼠还经腹腔内施用30μg的HOE-140。第3组用作抑制卡托普利诱导的血管通透性的阳性对照。
第4、5、6、7和8组各由8只小鼠组成并且用分别各为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg(相当于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)的ISIS482584和ISIS410944处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理期结束时，所有组的小鼠经腹腔内施用20μg卡托普利。第4-8组用作实验处理组，以检查ISIS410944和ISIS482584对卡托普利诱导的血管通透性的影响。
然后在尾静脉中为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部、耳朵和肠道。
表73
处理组
血管通透性的量化
将收获自足部、结肠和耳朵的组织置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含足部和耳朵组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度并呈现于表74中。OD值较高与通透性水平较高相关。
如表74所呈现，与PBS对照(第1组)相比，在所有剂量下经ISIS482584和ISIS410944的组合处理的小鼠(第3-8组)的大多数组织展示出降低的血管通透性。在ISIS寡核苷酸处理组的血管通透性上的降低比得上在基础PBS对照(第1组)以及经HOE140处理的阳性对照组(第2组)中展示的降低。PKK和因子12反义寡核苷酸的组合导致在通透性上的协同降低。不出所料，也观察到在血管渗漏上的相应协同降低。
表74
用于测量血管通透性的伊文氏蓝染料的OD600nm
实施例16：在小鼠中靶向PKK和因子12的反义寡核苷酸对基础血管通透性的联合治疗
在基础血管通透性模型中用不同剂量的ISIS410944，靶向因子12的反义寡核苷酸，和ISIS482584处理小鼠。
处理
表75中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。未向用作对照组以测量血管通透性的基础水平的第1组施用其它处理。
第2组由4只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在处理期结束时，小鼠经腹腔内施用30μg的HOE-140。第2组用作抑制基础血管通透性的阳性对照。
第3、4、5、6和7组各由8只小鼠组成并且用分别各为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg(相当于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)的ISIS482584和ISIS410944处理，每周皮下施用两次，历时3周。第3-7组用作实验处理组，以检查ISIS410944和ISIS482584对基础血管通透性的影响。
然后在尾静脉中为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部、耳朵和肠道。
表75
处理组
血管通透性的量化
将收获自足部、结肠、肠道和耳朵的组织置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含足部和耳朵组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度，并呈现于表76中。OD值较高与通透性水平较高相关。
如表76所呈现，与PBS对照(第1组)相比，在所有剂量下经ISIS482584和ISIS410944的组合处理的小鼠(第2-7组)的大多数组织展示出降低的血管通透性。在ISIS寡核苷酸处理组的血管通透性上的降低比得上在经HOE140处理的阳性对照组(第2组)中展示的降低。PKK和因子12反义寡核苷酸的组合导致在通透性上的协同降低。不出所料，也观察到在血管渗漏上的相应协同降低。
表76
用于测量血管通透性的伊文氏蓝染料的OD600nm
实施例17：ISIS482584对因子12活化的抑制
评价反义抑制PKKmRNA对因子12蛋白质活化的影响。
处理
表77中呈现了用于这项测定的各处理组。
第1组由8只小鼠组成并且用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。未向用作对照组以测量因子12活化的第1组施用其它处理。
第2、3、4、5和6组各由8只小鼠组成并且用分别各为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg(相当于每周5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周。第2-6组用作实验处理组，以测量ISIS482584对因子12活化的影响。
在处理期结束时，从小鼠收获血浆用于对血浆中因子12的基于因子12a的酰胺分解测定。
表77
处理组
对血浆中因子12活化的测定
向96孔聚丙烯微孔板中85μL含1ug/ml葡聚糖硫酸酯(500kDa)的PBS添加血浆(5μL)并且所述溶液在室温下温育5分钟。添加FXIIa(10μL的2mM溶液)和0.2mMKALLISTOPTM溶液并且在405nm下测量动力吸光度。在吸光度积累的线性阶段测量因子12活化。结果作为在PBS对照样品中测量的因子12活化的百分比呈现于表78中。正如在表78中所观察到，ISIS482584对PKK的抑制导致因子12受其底物的活化减少，暗示对于因子12恰当活化需要PKK。
表78
与PBS对照相比的因子12活化百分比
实施例18：反义抑制鼠类PKK对C1-INH反义寡核苷酸诱导的血管通透性的体内影响
由ISIS461756，靶向鼠类C1抑制剂mRNA的反义寡核苷酸诱导的血管通透性提高了小鼠中的血管通透性并且重现了遗传性血管性水肿的病理。评价ISIS482584对这种模型的影响。
处理
一组的8只小鼠用40mg/kgISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为80mg/kg)。第二组的8只小鼠用40mg/kg对照寡核苷酸ISIS141923处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为80mg/kg)。第三组的8只小鼠用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在第14天，所有组用12.5mg/kgISIS461756处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为25mg/kg)。对照组的小鼠用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周，但不施用ISIS461756。
在处理期结束时，向尾静脉为所有组注射30mg/kg伊文氏蓝溶液。伊文氏蓝溶液施用30分钟后处死小鼠并且收获结肠、足部、耳朵和肠道。还收获肝脏用于RNA分析。
RNA分析
从肝脏分离RNA进行C1-INH和PKKmRNA的RT-PCR分析。C1-INH的引物探针组为RTS3218(正向序列GAGTCCCCCAGAGCCTACAGT，本文指定为SEQIDNO:2234；反向序列TGTCATTTGTTATTGTGATGGCTACA，本文指定为SEQIDNO:2235；探针序列CTGCCCTCTACCTGGCCAACAACCA，本文指定为SEQIDNO:2236)。PKK的引物探针组为RTS3287(正向序列ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC，本文指定为SEQIDNO:2237；反向序列GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT，本文指定为SEQIDNO:2238；探针序列AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC，本文指定为SEQIDNO:2239)。结果作为与未经ISIS461756处理的PBS对照相比的抑制百分数呈现于表79中。数据表明ISIS461756显著减少了C1-INHmRNA表达并且用ISIS482584处理显著减少了PKK表达。
表79
与未处理的PBS对照相比在经ISIS461756处理的小鼠中mRNA表达的抑制百分数
血管通透性的量化
将收获自足部、结肠和肠道的组织置于甲酰胺溶液中过夜以浸出伊文氏蓝染料。加热含足部组织的甲酰胺溶液至55℃并放置过夜。然后在OD600nm下测量经染料浸渍的甲酰胺溶液的颜色强度。数据作为与未经ISIS461756处理的PBS对照相比的增加或减少百分数呈现于表80中。数据表明用ISIS482584处理预防由ISIS461756诱导的血管通透性。
表80
与未处理的PBS对照相比在经ISIS461756处理的小鼠中血管通透性的变化百分比
| 处理 | 结肠 | 足部 | 肠道 |
| PBS | 13 | 70 | 27 |
| ISIS 141923 | 2 | 80 | 14 |
| ISIS 482584 | -23 | 2 | -25 |
实施例19：在FeCl3诱导的下腔静脉血栓形成模型中反义抑制鼠类PKK的体内影响
在FeCl3诱导的下腔静脉血栓形成模型中评价展示出对PKK的显著体外和体内抑制的ISIS482584。
处理
三个组各8只雄性BALB/c小鼠用10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)。两个对照组各12只BALB/c小鼠用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在最后一个剂量的反义寡核苷酸或PBS两天后，用150mg/kg克他命与10mg/kg甲苯噻嗪混合，通过腹腔内注射施用麻醉来自所有组的小鼠。除第一对照组外，在所有组的麻醉小鼠中用FeCl3诱导血栓形成。
在接受FeCl3处理的小鼠中，通过将一张用10％FeCl3溶液预饱和的滤纸(2x4mm)直接贴在腔静脉上诱导血栓形成。暴露3分钟后，移除滤纸。贴滤纸30分钟后，切下固定长度的含血栓的静脉用于血小板分析。采集肝脏用于RNA分析。
血小板组成的量化
血小板因子-4(PF-4)的实时PCR量化用于量化腔静脉中的血小板作为对血栓形成的量度。使用鼠类引物探针组mPF4_LTS_00086(正向序列AGACCCATTTCCTCAAGGTAGAACT，本文指定为SEQIDNO:2240；反向序列CGCAGCGACGCTCATG，本文指定为SEQIDNO:2241；探针序列TCTTTGGGTCCAGTGGCACCCTCTT，本文指定为SEQIDNO:2242)测量PF-4mRNA水平。结果作为ISIS寡核苷酸处理小鼠中，与两个PBS处理对照组相比PF-4的百分比呈现。如表81所示，用ISIS482584处理导致与PBS对照相比PF-4显著减少。因此，本文提供的化合物对PKK的减少对抑制血栓形成有用。
表81
在FeCl3诱导的下腔静脉血栓形成模型中通过PF-4的实时PCR量化对血栓形成的分析
实施例20：在尾出血测定中反义抑制鼠类PKK的体内影响
测量尾出血以观察在小鼠中用ISIS482584处理是否引起过量出血或溢血。
处理
多组的10只雄性BALB/c小鼠用10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)。一个对照组的8只BALB/c小鼠用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。
尾出血测定
ISIS寡核苷酸或PBS最终处理两天后，将小鼠置于尾出血室内。在室内用异氟烷麻醉小鼠。然后，用无菌剪刀切下一小段尾巴(距尖端约4mm)。立即将切下的尾巴置于15mL装有约10mL温热至37℃的0.9％NaCl缓冲溶液的Falcon管中。在40分钟过程中采集血液。在出血之前和之后为装有盐水的管称重。在表82中提供了结果。
用ISIS482584处理并未显著影响出血。这些数据表明本文提供的化合物的溢血潜力低。这些数据连同实施例19中提供的结果表明用本文描述的化合物抑制PKK对提供抗血栓形成活性有用，无相关的出血风险。
表82
用ISIS482584处理后的尾出血测定
实施例21：在FeCl3诱导的肠系膜血栓形成模型中反义抑制鼠类PKK的体内影响
在FeCl3诱导的肠系膜血栓形成小鼠模型中评价ISIS482584。
处理
一组6-8只Swiss-Webster小鼠用40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为80mg/kg)。对照组的6只Swiss-Webster小鼠用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在最后一个剂量的反义寡核苷酸或PBS两天后，用75mg/kg克他命与25mg/kg甲苯噻嗪混合，通过皮下注射施用麻醉来自所有组的小鼠。
皮下注射剂量为5mg/kg的若丹明6G(Rhodamine6G)染料以使血小板染色。经由尾静脉注射，注射剂量为1mg/kg的Alexa-647-标记的抗纤维蛋白原抗体以使纤维蛋白染色。通过中部切口打开腹部。将内脏肠系膜涂在盖玻片上并且通过在显微镜下观察定位肠系膜小动脉(70-120μm)。通过将用6％FeCl3溶液预饱和的棉线(2x0.3mm)直接贴在目标血管上诱导血栓形成。暴露3分钟后，移除棉线并且通过带有适当滤光片的荧光显微镜(OlympusFluoView1000共聚焦激光扫描显微镜)对两种染料的颜色强度记录70min。
对照和处理组中血小板聚集的结果呈现于表83中，用任意单位(a.u.)表示。与用PBS处理的小鼠相比，在用ISIS482584处理的小鼠中在80mg/kg/周的剂量下血小板聚集减少。对照和处理组中纤维蛋白形成的结果呈现于表84中，也用任意单位(a.u.)表示。与用PBS处理的小鼠相比，在用ISIS482584处理的小鼠中在80mg/kg/周的剂量下纤维蛋白形成减少。因此，这些结果表明ISIS482584抑制血栓形成。
表83
在FeCl3诱导的肠系膜血栓形成模型中通过荧光强度(a.u.)的实时测量对血小板聚集的分析
表84
在FeCl3诱导的肠系膜血栓形成模型中通过荧光强度(a.u.)的实时测量对纤维蛋白形成的分析
实施例22：在狭窄诱导的下腔静脉血栓形成模型中反义抑制鼠类PKK的体内影响
在狭窄诱导的下腔静脉(IVC)血栓形成模型中评价ISIS482584。血流量减小和内皮损伤是这种模型(也称为St.Tomas模型)的标志。
处理
4个组各6-8只BALB/c小鼠用5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg的ISIS482584处理，每周皮下施用两次，历时3周(周剂量为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg)。一个对照组的8只BALB/c小鼠用PBS处理，每周皮下施用两次，历时3周。在施用最后一个剂量的反义寡核苷酸或PBS两天后，用2.5％吸入性异氟烷麻醉来自所有组的小鼠。经由在左肾静脉下方的中线腹部切口暴露出小鼠的IVC，并且通过钝器解剖从腹主动脉分离。将6-0丝带(Ethicon,UK)置于血管后左肾静脉正下方并且将金属4-0缝合线(Ethicon,UK)纵向置于IVC上方以系住顶部的丝带。然后移除金属缝合线。将两个神经血管手术钳(BraunMedicalInc,PA)置于结扎处下方的两个单独位置各20秒，之后将其移除。然后更换腹腔内容物并缝合腹部。24小时后，暴露出IVC并检查血栓形成。收集形成的所有血栓病于10％福尔马林(formalin)中固定24小时。
为血栓称重并且将结果呈现于表85中，用毫克表示。正如结果所展示，用递增剂量的ISIS482584处理导致血栓重量的相应减少。结果表明对PKK的反义抑制对抑制血栓形成有用。
表85
狭窄诱导的IVC血栓形成模型中的血栓重量
Claims (60)
1.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:30-2226中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
2.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:570的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
3.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:705的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基的核碱基序列。
4.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:1666的核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
5.一种化合物，其包含由20个连接的核苷组成并且具有SEQIDNO:570的核碱基序列的经修饰的寡核苷酸。
6.一种化合物，其包含由20个连接的核苷组成并且具有SEQIDNO:705的核碱基序列的经修饰的寡核苷酸。
7.一种化合物，其包含由16个连接的核苷组成并且具有SEQIDNO:1666的核碱基序列的经修饰的寡核苷酸。
8.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:62、72、103、213、312、334-339、344、345、346、348、349、351、369、373、381、382、383、385、387-391、399、411、412、414、416、444、446-449、452、453、454、459、460、462-472、473、476、477、479、480、481、484、489-495、497、500、504、506、522、526、535、558、559、560、564、566、568-571、573、576、577、578、587、595、597-604、607、608、610、613、615、618、619、622、623、624、633、635、636、638、639、640、642、643、645、652、655-658、660、661、670、674-679、684、685、698、704、705、707、708、713、716、717、728、734、736、767、768、776、797、798、800、802、810、815、876、880、882、883、886、891、901-905、908-911、922、923、924、931、942、950-957、972、974、978、979、980、987-991、1005、1017-1021、1025、1026、1029、1030、1032、1034、1035、1037、1040、1041、1045、1046、1051、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1076、1087、1089、1111、1114、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1181、1182、1187、1196、1200、1214、1222、1267、1276、1277、1285、1286、1289、1290、1291、1303、1367、1389、1393、1398-1401、1406、1407、1408、1411、1419-1422、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1439、1440、1443、1444、1451、1452、1471、1516、1527、1535、1537、1538、1539、1540、1541、1563、1564、1567、1568、1616、1617、1623、1629、1664、1665、1666、1679、1687、1734、1804、1876、1886、1915、2008、2018、2100、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少80％mRNA抑制。
10.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:62、72、103、213、334-339、344、346、348、349、351、381、382、383、385、389、390、391、446、448、452、453、454、466-473、476、481、484、491、492、494、495、497、504、526、558、559、566、568-571、576、578、587、595、597、598、600-604、607、610、613、618、619、624、635、638、639、645、652、656、657、658、660、674、675、676、684、698、704、705、707、713、716、768、876、880、901-905、908-911、922、923、924、931、942、951、954-957、972、974、978、979、987、988、990、1005、1019、1020、1021、1025、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1059、1060、1061、1064、1065、1066、1075、1111、1116、1117、1125、1133、1153、1169、1177、1200、1222、1267、1285、1290、1291、1303、1367、1398、1399、1401、1406、1408、1411、1419、1420、1421、1426、1430、1431、1432、1434-1437、1440、1443、1444、1451、1537-1540、1563、1616、1679、1687、1804、2008、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少85％mRNA抑制。
12.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、346、351、382、390、391、446、448、452、453、468、469、470、471、472、476、481、491、495、504、558、566、568、570、571、578、587、597、598、600、604、613、635、638、645、656、658、660、674、675、684、704、705、880、901-905、909、922、931、951、954、956、990、1005、1020、1032、1037、1040、1041、1045、1054、1075、1111、1125、1133、1153、1200、1267、1291、1303、1398、1399、1401、1406、1420、1426、1430、1431、1434、1435、1436、1440、1443、1451、1537-1540、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少90％mRNA抑制。
14.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、391、448、468、469、568、570、598、635、658、674、684、705、901、903、904、922、990、1267、1291、1420、1430、1431、1434、1435、1436、1537、1538和1540中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现对PKK的至少95％mRNA抑制。
16.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、338、346、349、382、383、390、448、452、453、454、495、526、559、570、587、598、635、660、705、901、903、904、908、923、931、955、974、988、990、1020、1039、1040、1111、1117、1267、1291、1349、1352、1367、1389、1393、1399、1401、1408、1411、1426、1499、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1624、1643、1661、1665、1666、1673、1679、1695、1720、1804、1817、1876、1881、1886、1940、1947、2008、2018、2019、2031、2044、2100、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现0.4或更低的IC50(μM)。
18.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、346、349、382、453、454、495、526、570、587、598、635、660、901、903、904、931、955、990、1020、1111、1267、1349、1352、1367、1389、1399、1408、1411、1426、1516、1535、1544、1548、1563、1564、1568、1569、1598、1616、1617、1623、1643、1661、1665、1666、1673、1695、1804、1876、1881、2019、2044、2100、2101、2115和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现0.3或更低的IC50(μM)。
20.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、346、382、453、495、526、570、587、598、635、901、904、931、955、1020、1111、1349、1352、1389、1426、1516、1535、1544、1548、1564、1569、1598、1616、1617、1665、1666、1804、1876、1881、2019、2044、2101和2116中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现0.2或更低的IC50(μM)。
22.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且具有包含SEQIDNO:334、495、587、598、635、1349、1352、1389、1516、1544、1548、1569、1598、1617、1665、1666、1804、1881和2019中的任何核碱基序列的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个或至少16个连续核碱基的核碱基序列。
23.根据权利要求22所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸实现低于0.2的IC50(μM)。
24.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基27427-27466的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
25.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基33183-33242的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
26.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基30570-30610的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
27.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基27427-27521的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
28.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基33085-33248的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
29.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基30475-30639的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
30.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基27362-27525的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
31.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基33101-33241的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
32.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与SEQIDNO:10的核碱基30463-30639的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
33.一种化合物，其包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸由12至30个连接的核苷组成并且包含的核碱基序列包含与PKK核酸的外显子9、外显子12或外显子14的等长部分互补的至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个连续核碱基。
34.根据权利要求24-33所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸的核碱基序列与SEQIDNO:10至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
35.根据任何前述权利要求所述的化合物，其由单链经修饰的寡核苷酸组成。
36.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中至少一个核苷间键联为经修饰的核苷间键联。
37.根据权利要求36所述的化合物，其中至少一个经修饰的核苷间键联为硫代磷酸酯核苷间键联。
38.根据权利要求37所述的化合物，其中每个核苷间键联均为硫代磷酸酯键联。
39.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中至少一个核苷包含经修饰的核碱基。
40.根据权利要求39所述的化合物，其中所述经修饰的核碱基为5-甲基胞嘧啶。
41.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含至少一个经修饰的糖。
42.根据权利要求41所述的化合物，其中所述经修饰的糖包含2’修饰的糖、BNA或THP。
43.根据权利要求42所述的化合物，其中所述经修饰的糖为2’-O-甲氧基乙基、2’-O-甲基、限制型乙基、LNA或3’-氟-HNA中的任一种。
44.根据任何前述权利要求所述的化合物，其包含至少一个2’-O-甲氧基乙基核苷、2’-O-甲基核苷、限制型乙基核苷、LNA核苷或3’-氟-HNA核苷。
45.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
由10个连接的脱氧核苷组成的间隙区段；
由5个连接的核苷组成的5’侧翼区段；和
由5个连接的核苷组成的3’侧翼区段；
其中所述间隙区段位于所述5’侧翼区段和所述3’侧翼区段之间并且其中每个侧翼区段的每个核苷均包含经修饰的糖。
46.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。
47.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。
48.根据任何前述权利要求所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。
49.一种化合物，其由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成：TesGesmCesAesAesGdsTdsmCdsTdsmCdsTdsTdsGdsGdsmCdsAesAesAesmCesAe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
50.一种化合物，其由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成：mCesmCesmCesmCesmCesTdsTdsmCdsTdsTdsTdsAdsTdsAdsGdsmCesmCesAesGesmCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
51.一种化合物，其由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成：mCesGesAksTdsAdsTdsmCdsAdsTdsGdsAdsTdsTdsmCksmCksmCe；其中，
A＝腺嘌呤，
mC＝5’-甲基胞嘧啶
G＝鸟嘌呤，
T＝胸腺嘧啶，
e＝2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷，
k＝cEt修饰的核苷，
d＝2’-脱氧核苷，及
s＝硫代磷酸酯核苷间键联。
52.一种化合物，其由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成：
53.一种化合物，其由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成：
54.一种化合物，其由根据下式的经修饰的寡核苷酸组成：
55.一种组合物，其包含根据任何前述权利要求所述的化合物或其盐和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
56.一种方法，其包括向动物施用根据任何前述权利要求所述的化合物或组合物。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述动物为人。
58.根据权利要求57所述的方法，其中施用所述化合物预防、治疗或改善PKK相关的疾病、病症或病状。
59.根据权利要求57所述的方法，其中所述PKK相关的疾病、病症或病状为遗传性血管性水肿(HAE)、水肿、血管性水肿、肿胀、眼睑血管性水肿、眼部水肿、黄斑水肿、脑水肿、血栓形成、栓塞、血栓栓塞、深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞、中风或梗塞。
60.根据任何前述权利要求所述的化合物或组合物用于生产治疗炎症性疾病或血栓栓塞性疾病的药剂的用途。
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