ES2790574T3 - Modulación de expresión de prekallikrein (PKK) - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consta de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8 nucleobases consecutivas que son 100% complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 90% complementaria a la SEQ ID NO: 10, medida en la totalidad del oligonucleótido modificado.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulación de expresión de prekallikrein (PKK)
Campo
Se proporcionan compuestos, composiciones y métodos para reducir la expresión de ARNm y proteínas de precalicreína (PKK) en plasma humano en un animal. Dichas composiciones y métodos son útiles para tratar, prevenir o mejorar afecciones inflamatorias y tromboembólicas.
Antecedentes
La precalicreína plasmática (PKK) es el precursor de la calicreína plasmática (PK), codificada por el gen KLKB1. PKK es una glicoproteína que participa en la activación dependiente de la superficie de la coagulación de la sangre, la fibrinólisis, la generación de kinina y la inflamación. p Kk se convierte en PK por Factor Xlla mediante la escisión de un enlace peptídico Arg-Ile interno. La PK libera las cininas de los cininógenos y también genera plasmina a partir del plasminógeno. PK es un miembro de la vía cinina-calicreína, que consiste en varias proteínas que juegan un papel en la inflamación, el control de la presión arterial, la coagulación y el dolor.
WO 2012/170945 y WO 2013/003808 describe métodos para modular expresión de calicreína (KLKB1) y oligonucleótidos que se dirigen a ácido nucleico codificado por murino PKK.
Sumario
La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobases que comprende al menos 8 nucleobases consecutivas que son 100% complementarias a una porción de longitud igual de nucleobases 27427-27466 de la SEQ ID NO: 10, en donde la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos el 90% complementario a SEQ ID NO: 10, medido sobre la totalidad del oligonucleótido modificado.
La invención también proporciona un compuesto que consiste en un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae (SEQ ID NO: 570); en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2'-desoxinucleósido y
s = un enlace intemucleósido de fosforotioato.
La invención también proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, en donde el oligonucleótido modificado es un gápmero que consiste en un segmento de ala 5', en donde:
el segmento de ala 5 ' consiste en cinco nucleósidos de 2'-O-metoxietilo,
el segmento del espacio central consiste en diez p-D-desoxirribonucleósidos, y
el segmento de ala 3' consiste en cinco nucleósidos de 2'-O-metoxietilo, en donde el oligonucleótido modificado tiene la secuencia de nucleobase 5'-TGCAAGTCTCTTGGCAAACA-3' (SEQ ID NO: 570), en donde cada citosina es una 5-metilcitosina, y en donde los enlaces intemucleósidos del oligonucleótido modificado son enlaces fosforotioato. La invención también proporciona un compuesto antisentido conjugado que aumenta el compuesto de la invención. La invención también proporciona una sal de un oligonucleótido modificado, en donde el anión del oligonucleótido modificado está de acuerdo con la siguiente estructura:
Figure imgf000003_0001
(SEQ ID NO: 570), opcionalmente en donde la sal es una sal de sodio.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende o consiste esencialmente en el compuesto, compuesto antisentido conjugado o sal de la invención, y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en donde el diluyente farmacéuticamente aceptable es salina tamponada con fosfato (PBS).
La invención también proporciona un compuesto, compuesto antisentido conjugado, sal o composición farmacéutica de la invención para uso en terapia, opcionalmente para uso en un método para prevenir, tratar o mejorar una enfermedad, trastorno o afección asociada a PKK en un animal que lo necesite, preferiblemente en donde la enfermedad, trastorno o afección asociada a PKK es un angioedema hereditario (AEH), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular, edema cerebral, trombosis, embolia, tromboembolismo, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o infarto, y en donde el animal es un humano.
Aquí se describen compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión de ARNm de PKK y proteína. En ciertas realizaciones, los compuestos útiles para modular la expresión de ARNm y proteína PKK son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son oligonucleótidos antisentido.
En ciertas realizaciones, la modulación puede ocurrir en una célula o tejido. En ciertas realizaciones, la célula o tejido está en un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, los niveles de ARNm de PKK se reducen. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de proteína PKK. Tal reducción puede ocurrir de una manera dependiente del tiempo o de una manera dependiente de la dosis.
También se proporcionan compuestos, composiciones y métodos útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con PKK. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con PKK son enfermedades inflamatorias. En ciertas realizaciones, la enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria aguda o crónica. En ciertas realizaciones, tales enfermedades inflamatorias pueden incluir angioedema hereditario (AEH), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular y edema cerebral. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con PKK son enfermedades tromboembólicas. En ciertas realizaciones, tales enfermedades tromboembólicas pueden incluir trombosis, embolia, tromboembolismo, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular e infarto.
Dichas enfermedades, trastornos y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común.
Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una enfermedad inflamatoria incluyen la predisposición genética a una enfermedad inflamatoria y factores ambientales. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un gen inhibidor de la esterasa del complemento 1 mutado (Cl-INH) o un gen del Factor 12 mutado. En ciertas realizaciones, el sujeto ha tomado o está tomando inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de la ECA) o bloqueadores de los receptores de angiotensina II (BRA). En ciertas realizaciones, el sujeto ha tenido una reacción alérgica que conduce al angioedema. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene HAE tipo I. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene HAE tipo II. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene HAE tipo III.
Ciertos resultados asociados con el desarrollo de una enfermedad inflamatoria incluyen edema/hinchazón en varias partes del cuerpo, incluidas las extremidades (es decir, manos, pies, brazos, piernas), los intestinos (abdomen), la cara, los genitales, la laringe (es decir, caja de voz); permeabilidad vascular; fuga vascular; inflamación generalizada; dolor abdominal; hinchazón; vómitos; diarrea; picazón en la piel; reacciones respiratorias (asmáticas); rinitis; anafilaxia; broncoconstricción; hipotensión; coma; y muerte.
Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una enfermedad tromboembólica incluyen predisposición genética a una enfermedad tromboembólica, inmovilidad, cirugía (particularmente cirugía ortopédica), malignidad, embarazo, edad avanzada, uso de anticonceptivos orales, fibrilación auricular, afección tromboembólica previa, enfermedad inflamatoria crónica, y trastornos de coagulación protrombótica heredados o adquiridos. Ciertos resultados asociados con el desarrollo de una afección tromboembólica incluyen disminución del flujo sanguíneo a través de un vaso afectado, muerte del tejido y muerte.
En ciertas realizaciones, los métodos de tratamiento incluyen administrar un compuesto antisentido PKK a un individuo que lo necesite. En ciertas realizaciones, los métodos de tratamiento incluyen administrar un oligonucleótido antisentido PKK a un individuo que lo necesite.
Listado de figuras
La figura 1 es una cuantificación de transferencia Western de HMWK de muestras de sangre como se describe en el Ejemplo 11.
La figura 2 es una cuantificación de transferencia Western de HMWK de muestras de sangre como se describe en el Ejemplo 14.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. Aquí, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluido", así como otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitante. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
Los encabezados de sección utilizados en este documento son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes del tema descrito.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico. Cuando esté permitido, todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones, Números de acceso GENBANK e información de secuencia asociada que se puede obtener a través de bases de datos como el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y otros datos a los que se hace referencia en la divulgación en este documento se incorporan como referencia para partes del documento discutido en este documento, así como en su totalidad.
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietNo" (también de 2'-MOE y 2 -OCH2CH2-OCH3 y MOE) se refiere a una modificación O-metoxietilo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo" (también "nucleósido 2'-MOE") significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-MOE.
"Nucleósido sustituido en 2'” significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcar bicíclicas.
"2'-desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleósido.
"Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
"Sitio diana 5'” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
"Acerca de" significa dentro de ± 7% de un valor. Por ejemplo, si se afirma que "los compuestos afectaron al menos aproximadamente un 70% de inhibición de PKK", se implica que los niveles de PKK se inhiben dentro de un intervalo de 63% y 77%.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la administración conjunta de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en donde los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes farmacéuticos no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse por un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, entre otros, la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Mejoría" se refiere a una disminución, desaceleración, detención o reversión de al menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido a su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína diana codificada por dicho ácido nucleico diana. "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNips, shARNs, ssARNs y compuestos basados en la ocupación.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, ARNips, shARNs, ssARNs y compuestos basados en la ocupación.
"Inhibición antisentido" significa la reducción de los niveles de ácido nucleico diana en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico diana en comparación con los niveles de ácido nucleico diana o en ausencia del compuesto antisentido. Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con ácido nucleico diana, en donde el resultado o efecto de la hibridación es la degradación diana o la ocupación diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o empalme.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico diana, en donde el resultado o efecto de la hibridación es la degradación diana o la ocupación diana con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobase que permite la hibridación a un segmento correspondiente de un ácido nucleico diana. La "complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases precisas de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por Watson-Crick, Hoogsteen o unión de hidrógeno de Hoogsteen invertida entre nucleobases correspondientes.
La "complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases precisas de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico diana (es decir, hibridación), y está mediada por Watson-Crick, Hoogsteen o la unión de hidrógeno de Hoogsteen invertida entre las nucleobases correspondientes.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado por el puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
Nucleósido bicíclico (también ácido nucleico bicíclico o BNA) significa un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
"Estructura de tapa" o "resto de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Nucleósido modificado por cEt" (también "nucleósido de etilo restringido") significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente que otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas, cada posición con una pluralidad de subunidades.
"Administración conjunta" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica, o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de las mismas o diferentes vías de administración. La coadministración abarca la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
Se entenderá que "comprender", "comprende" y "que comprende" implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diseñar" o "diseñado para" se refieren al proceso de creación de un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los medicamentos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionado en una sola administración, o en un período de tiempo especificado. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, tabletas o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones donde se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen no fácilmente acomodado por una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Corriente abajo" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 3' o el extremo de terminal C de un ácido nucleico.
"Cantidad efectiva" en el contexto de la modulación de una actividad o de tratar o prevenir una afección significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un sujeto que necesite dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es efectiva para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento o la profilaxis o la mejora de esa afección. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a ser tratado, el grupo taxonómico de los individuos a ser tratados, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
La "expresión" incluye todas las funciones por las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que operan en una célula. Dichas estructuras incluyen, entre otras, los productos de transcripción y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico.
"Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en donde una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
"Hibridación" significa el recocido de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero sin limitación, un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero sin limitación, un oligonucleótido antisentido y una diana de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad inflamatoria" significa identificar a un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad inflamatoria o predispuesto a desarrollar una enfermedad inflamatoria. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad inflamatoria incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad inflamatoria, incluidos factores ambientales, antecedentes personales o familiares, o predisposición genética a una o más enfermedades inflamatorias. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a PKK" significa identificar a un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad asociada a PKK o predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a PKK. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a PKK incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a PKK, incluyendo antecedentes personales o familiares, o predisposición genética a una o más enfermedades asociadas a PKK. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad tromboembólica" significa identificar un animal que ha sido diagnosticado con una enfermedad tromboembólica o predispuesto a desarrollar una enfermedad tromboembólica. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad tromboembólica incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad tromboembólica, incluyendo antecedentes personales o familiares, o predisposición genética de una o más enfermedades tromboembólicas, inmovilidad, cirugía (particularmente cirugía ortopédica), malignidad, embarazo, edad avanzada, uso de anticonceptivos orales, fibrilación auricular, afección tromboembólica previa, enfermedad inflamatoria crónica y trastornos de coagulación protrombótica heredados o adquiridos. Dicha identificación se puede lograr mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de un individuo y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes. "Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Individual" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir PKK" significa reducir el nivel o la expresión de un ARNm y/o proteína PKK. En ciertas realizaciones, los niveles de ARNm y/o proteína de PKK se inhiben en presencia de un compuesto antisentido dirigido a PKK, que incluye un oligonucleótido antisentido dirigido a PKK, en comparación con la expresión de niveles de ARNm y/o proteína de PKK en ausencia de un compuesto antisentido PKK, como un oligonucleótido antisentido.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes unidos entre sí por un enlace internucleosídico.
"Ácido nucleico bloqueado" o "ANB" o "nucleósidos de ANB" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar nucleósido, formando así un azúcar bicíclico. Los ejemplos de dicho azúcar bicíclico incluyen, pero no están limitados a A) a-L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2 ') ANB, (B) p-D-Metilenoxi (4'-CH2-O-2') ANB, (C) Etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') ANB, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') ANB y (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') A n B, como se representa abajo.
Figure imgf000008_0001
Como se usa en el presente documento, los compuestos de ANB incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de -[C(R i )(R2 )]n-, -C(R i )=N-, -C(=NR i )-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R i )2-, -S(=O)x -y -N (R i )-; en donde: x es 0, 1 o 2; n es 1,2,3 o 4; cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, Ci -C i 2 alquilo, Ci -C i 2 alquilo sustituido, C2-C i 2 alquenilo, C2-C i 2 alquenilo sustituido, C2-C i 2 alquinilo, C2-C i 2 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, C5-C7 radical alicíclico, C5-C7 radical alicíclico sustituido, halógeno, OJi , N JJ 2 , SJi , N3 , COOJi , acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J i ), o sulfoxilo (S(=O)-Ji ) y cada J i y J2 es, independientemente, H, Ci -C i 2 alquilo, Ci -C i 2 alquilo sustituido, C2-C i 2 alquenilo, C2-C i 2 alquenilo sustituido, C2-C i 2 alquinilo, C2-C i 2 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, Ci -C i 2 aminoalquilo, Ci -C i 2 aminoalquilo sustituido o un grupo protector.
Los ejemplos de grupos puente 4'-2' incluidos en la definición de ANB incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: -[C(R i )(R2)]n-, -[C(R i )(R2)]n-O-, -C(R i R2 )-N(Ri )-O- o -C(R i R2)-O-N(Ri )-. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de A n B son puentes 4 '-c H2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(Ch 2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R i )-2' y 4'-CH2-N(R i )-O-2'-, en donde cada Ri y R2 es, independientemente, H, un grupo de protección o Ci -C i 2 alquilo.
También se incluyen dentro de la definición de ANB según la invención los ANB en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando así un puente de metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar el resto de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para lo cual se utiliza el término LET metilenoxi (4'-CH2-O-2'). Además; en el caso del resto de azúcar bicíclico que tiene un grupo puente de etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (4 -CH2CH2-O-2 ') ANB. a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2'), un isómero de metilenoxi (4 -CH2-O-2') ANB también está incluido en la definición de ANB, como se usa en el presente documento.
"No coincidencia" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la nucleobase correspondiente de un segundo ácido nucleico o diana.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Nucleobase modificada" significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina (también conocida como 5-metiluracilo) o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
Nucleósido modificado significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
Nucleótido modificado significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado y/o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, azúcar modificado y/o nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa la sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.
"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, entre otros, nucleósidos y nucleótidos, ya sean naturales o modificados.
"Motivo” significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
"Fracción de azúcar natural" significa una fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH). "Enlace internucleosídico natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí o que de otro modo soportan la hibridación.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, entre otros, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (miARN).
"Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de la nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejarse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas realizaciones, la nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejarse con una nucleobase de su ácido nucleico diana. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de unirse por hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, entonces se considera que la posición de la unión de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana es complementario en ese par de nucleobases.
"Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientes de cualquier modificación de azúcar, enlace y/o nucleobase.
"Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
"Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como por ejemplo miméticos de nucleósidos que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o miméticos de azúcar triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar sin furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término mimósico nucleósido del término un poco más amplio, pero está destinado a indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en el presente documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en donde el grupo azúcar de furanosa se ha reemplazado con un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase y/o un enlace internucleosídico. En general, se usa un mimético en lugar de la combinación de azúcar o enlace de azúcar-internucleosido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación a una diana seleccionada.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Efecto fuera de diana" se refiere a un efecto biológico no deseado o nocivo asociado con la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen distinto del ácido nucleico diana deseado.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas unidas que es capaz de hibridarse con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede modificarse o no modificarse, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa administración por inyección (p. ej., inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada uniendo al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Sin limitación, como se usa en el presente documento, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a PKK es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril. "Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica al reemplazar uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes con un átomo de azufre. Un enlace de fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"PKK" significa precalicreína plasmática de mamíferos, incluida la precalicreína plasmática humana. La precalicreína plasmática (PKK) es el precursor de la calicreína plasmática (PK), que está codificada por el gen KLKB1.
"Enfermedad asociada a PKK" significa cualquier enfermedad asociada con cualquier ácido nucleico de PKK o producto de expresión del mismo. Dichas enfermedades pueden incluir una enfermedad inflamatoria o una enfermedad tromboembólica. Dichas enfermedades pueden incluir angioedema hereditario (AEH).
"PKK ARNm" significa cualquier producto de expresión de ARN mensajero de una secuencia de ADN que codifica PKK.
"Ácido nucleico de PKK" significa cualquier ácido nucleico que codifica PKK. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de PKK incluye una secuencia de ADN que codifica PKK, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica PKK (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica PKK. "ARNm de PKK" significa un ARNm que codifica una proteína PKK.
"Proteína PKK" significa el producto de expresión de polipéptidos de un ácido nucleico PKK.
“Porción” significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" o "previniendo" se refiere a retrasar o prevenir el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a días, semanas a meses o indefinidamente.
"Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas y/o afecciones.
"Cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Sales" significa sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Segmentos" se definen como regiones pequeñas o sub-porciones de regiones dentro de un ácido nucleico diana.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distinto de los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el lugar de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anormalidades del sistema nervioso central y miopatías.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no se hibrida con una cadena complementaria. "Sitios", como se usan en el presente documento, se definen como posiciones únicas de nucleobase dentro de un ácido nucleico diana.
"Específicamente hibridable" o "hibridado específicamente" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o ningún efecto en ácidos nucleicos no diana bajo condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, bajo condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refieren a condiciones bajo las cuales un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. "Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Diana" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen diana" se refiere a un gen que codifica un objetivo.
"Dirigido" o "dirigido a" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcripción de ARN diana" y "diana de ácido nucleico" significan un ácido nucleico capaz de ser diana de compuestos antisentido.
"Región diana" significa una porción de un ácido nucleico diana al que se dirige uno o más compuestos antisentido. "Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio diana 5'” se refiere al nucleótido más 5' de un segmento diana. "Sitio diana 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente efectiva" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" o "tratado" o "tratamiento" se refiere a administrar una composición para lograr una mejora de la enfermedad o afección.
"Nucleobases no modificadas" significan las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos que se producen naturalmente. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido). "Corriente arriba" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 5' o el extremo de terminal N de un ácido nucleico. "Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Ciertas realizaciones
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, composiciones y métodos para inhibir la expresión de proteínas y ARNm de precalicreína (PKK) en plasma. Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, composiciones y métodos para disminuir los niveles de ARNm y proteína de PKK.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de precalicreína (PKK) en plasma. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico PKK es la secuencia establecida en el N° de acceso GENBANK NM_000892,3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1), N° de acceso GENBANK DC412984,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), N° de acceso GENBANK CN265612,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3), N° de acceso GENBANK AK297672,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), N° de acceso GENBANK DC413312,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), N° de acceso GENBANK AV688858,2 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), N° de acceso GENBANK CD652077,1 (incorporado aquí como SEQ ID No : 7), N° de acceso GENBANK BCl43911,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 8), N° de acceso GENBANK CB162532,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 9), N° de acceso GENBANK NT_016354,19 truncado de las nucleobases 111693001 a 11173o0o0 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 10), GENBANK N° de acceso NM 008455,2 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 11), N° de acceso GenBank BB598673,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 12), N° de acceso GENBANK NT_039460,7 truncado de las nucleobases 6114001 a 6144000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 13), N° de acceso GENBANK NM_012725,2 (incorporado aquí como SEQ ID n O: 14), N° de acceso GENBANK NW_047473,1 truncado de las nucleobases 10952001 a 10982000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 15), N° de acceso GENBANK XM_002804276,1 (incorporado aquí como Se Q ID NO: 17), y N° de acceso GENBANK NW_001118167,1 truncado de las nucleobases 2358000 a 2391000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 18).
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 30-2226.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas de la secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 570.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 20 nucleósidos enlazados y que tienen una secuencia de nucleobase de SEQ ID NO: 570.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 62, 72, 103, 213, 312, 334-339, 344, 345, 346, 348, 349, 351, 369, 373, 381, 382, 383, 385, 387-391, 399, 411, 412, 414, 416, 444, 446-449, 452, 453, 454, 459, 460, 462-472, 473, 476, 477, 479480, 481, 484, 489-495, 497, 500, 504, 506, 522, 526, 535, 558, 559, 560, 564, 566, 568-571, 573, 576, 577, 578, 587, 595, 597-604, 607, 608, 610, 613, 615, 618, 619, 622, 623, 624, 633, 635, 636, 638, 639, 640, 642, 643, 645, 652, 655-658, 660, 661,670, 674-679, 684, 685, 698, 704, 705, 707, 708, 713, 716, 717, 728, 734, 736, 767, 768, 776, 797, 798, 800, 802, 810, 815, 876, 880, 882, 883, 886, 891, 901-905, 908-911, 922, 923, 924, 931, 942, 950 -957, 972, 974, 978, 979, 980, 987-991, 1005, 1017-1021, 1025, 1026, 1029, 1030, 1032, 1034, 1035, 1037, 1040, 1041, 1045, 1046, 1051, 1054, 1059, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1075, 1076, 1087, 1089, 1111, 1114, 1116, 1117, 1125, 1133, 1153, 1169, 1177, 1181, 1182, 1187, 1196, 1200, 1214, 1222, 1267, 1276, 1277, 1285, 1286, 1289, 1290, 1291, 1303, 1367, 1389, 1393, 1398-1401, 1406, 1407, 1408, 1411, 1419-1422, 1426, 1430, 1431, 1432, 1434-1437, 1439, 1440, 1443, 1444, 1451, 1452, 1471, 1516, 1527, 1535, 1537, 1538, 1539, 1540, 1541, 1563, 1564, 1567, 1568, 1616, 1617, 1623, 1629, 1664, 1665, 1666, 1679, 1687, 1734, 1804, 1876, 1886, 1915, 2008, 2018, 2100, 2101, 2115 y 2116. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra al menos 80% de inhibición de ARNm de PKK.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 62, 72, 103, 213, 334-339, 344, 346, 348, 349, 351, 381, 382, 383, 385, 389, 390, 391, 446, 448, 452, 453, 454, 466-473, 476, 481, 484, 491, 492, 494, 495, 497, 504, 526, 558, 559, 566, 568-571, 576, 578, 587, 595, 597, 598, 600-604, 607, 610, 613, 618, 619, 624, 635, 638, 639, 645, 652, 656, 657, 658, 660, 674, 675676, 684, 698, 704, 705, 707, 713, 716, 768, 876, 880, 901-905, 908-911, 922, 923, 924, 931, 942, 951, 954-957, 972, 974, 978, 979, 987, 988, 990, 1005, 1019, 1020, 1021, 1025, 1032, 1037, 1040, 1041, 1045, 1054, 1059, 1060, 1061, 1064, 1065, 1066, 1075, 1111, 1116, 1117, 1125, 1133, 1153, 1169, 1177, 1200, 1222, 1267, 1285, 1290, 1291, 1303, 1367, 1398, 1399, 1401, 1406, 1408, 1411, 1419, 1420, 1421, 1426, 1430, 1431, 1432, 1434- 1437, 1440, 1443, 1444, 1451, 1537-1540, 1563, 1616, 1679, 1687, 1804, 2008, 2101, 2115 y 2116. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra al menos 85% de inhibición de ARNm de PKK.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 334, 346, 351, 382, 390, 391, 446, 448, 452, 453, 468, 469, 470, 471, 472, 476, 481, 491, 495, 504, 558, 566, 568, 570, 571, 578, 587, 597, 598, 600, 604, 613, 635, 638, 645, 656, 658, 660, 674, 675, 684, 704, 705, 880, 901-905, 909, 922, 931,951, 954, 956, 990, 1005, 1020, 1032, 1037, 1040, 1041, 1045, 1054, 1075, 1111, 1125, 1133, 1153, 1200, 1267, 1291, 1303, 1398, 1399, 1401, 1406, 1420, 1426, 1430, 1431, 1434, 1435, 1436, 1440, 1443, 1451, 1537-1540, 2115 y 2116. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra al menos 90% de inhibición de ARNm de PKK.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 334, 391, 448, 468, 469, 568, 570, 598, 635, 658, 674, 684, 705, 901, 903, 904, 922, 990, 1267, 1291, 1420, 1430, 1431, 1434, 1435, 1436, 1537, 1538 y 1540. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra al menos un 95% de inhibición de ARNm de PKK.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 334, 338, 346, 349, 382, 383, 390, 448, 452, 453, 454, 495, 526, 559, 570, 587, 598, 635, 660, 705, 901, 903, 904, 908, 923, 931, 955, 974, 988, 990, 1020, 1039, 1040, 1111, 1117, 1267, 1291, 1349, 1352, 1367, 1389, 1393, 1399, 1401, 1408, 1411, 1426, 1499, 1516, 1535, 1544, 1548, 1563, 1564, 1568, 1569, 1598, 1616, 1617, 1623, 1624, 1643, 1661, 1665, 1666, 1673, 1679, 1695, 1720, 1804, 1817, 1876, 1881, 1886, 1940, 1947, 2008, 2018, 2019, 2031, 2044, 2100, 2101, 2115 y 2116. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra un CI50 (-M ) de 0,4 o menos.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 334, 346, 349, 382, 453, 454, 495, 526, 570, 587, 598, 635, 660, 901, 903, 904, 931, 955, 990, 1020, 1111, 1267, 1349, 1352, 1367, 1389, 1399, 1408, 1411, 1426, 1516, 1535, 1544, 1548, 1563, 1564, 1568, 1569, 1598, 1616, 1617, 1623, 1643, 1661, 1665, 1666, 1673, 1695, 1804, 1876, 1881, 2019, 2044, 2100, 2101,2115 y 2116. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra un CI50 (-M) de 0,3 o menos.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NO: 334, 346, 382, 453, 495, 526, 570, 587, 598, 635, 901, 904, 931, 955, 1020, 1111, 1349, 1352, 1389, 1426, 1516, 1535, 1544, 1548, 1564, 1569, 1598, 1616, 1617, 1665, 1666, 1804, 1876, 1881,2019, 2044, 2101 y 2116. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra un CI50 (-M ) de 0,2 o menos.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que tiene una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 nucleobases consecutivas de cualquiera de las secuencias de nucleobase de SEQ ID NOs: 334, 495, 587, 598, 635, 1349, 1352, 1389, 1516, 1544, 1548, 1569, 1598, 1617, 1665, 1666, 1804, 1881 y 2019. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado logra un CI50 (-M ) de menos de 0,2.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de igual longitud de nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19 o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de igual longitud de las nucleobases 27362-27524 de la SEQ ID NO: 10.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos, que comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 12 a 30 nucleósidos enlazados y que comprende una secuencia de nucleobase que comprende al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, o al menos 20 nucleobases consecutivas complementarias a una porción de igual longitud de exón 9, exón 12 o exón 14 de un ácido nucleico PKK.
En ciertas realizaciones, la secuencia de nucleobase del oligonucleótido modificado es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% complementario a la SEQ ID NO: 10.
En ciertas realizaciones, el compuesto consiste en un oligonucleótido modificado monocatenario.
En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado.
En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico modificado del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico fosforotioato.
En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato. En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada.
En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende al menos un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar modificado en 2', un BNA o un THP.
En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es cualquiera de un 2'-O-metoxietilo, 2'-O-metilo, un etilo restringido, un ANB o un 3'-fluoro-HNA.
En ciertas realizaciones, el compuesto comprende al menos un nucleósido de 2'-O-metoxietilo, nucleósido de 2'-O-metilo, nucleósido de etilo restringido, nucleósido de ANB o nucleósido de 3'-fluoro-HNA.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de separación que consiste en 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste en 5 nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste en 5 nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de separación se coloca entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 20 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 19 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consta de 18 nucleósidos enlazados.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos que consisten en un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2'-desoxinucleósido, y
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos de acuerdo con la siguiente fórmula:
Figure imgf000015_0001
Ciertas realizaciones proporcionan composiciones que comprenden un compuesto como se ha descrito en este documento o una sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas realizaciones proporcionan métodos que comprenden administrar a un animal un compuesto o composición como se ha descrito en este documento.
En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
En ciertas realizaciones, la administración del compuesto previene, trata o mejora una enfermedad, trastorno o afección asociada con PKK.
En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección asociada con PKK es un angioedema hereditario (AEH), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular, edema cerebral, trombosis, embolia, tromboembolismo, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o infarto.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso del compuesto o composición de cualquier reivindicación precedente para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o una enfermedad tromboembólica. Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, entre otros, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige. En ciertas realizaciones de este tipo, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobase que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que se dirige.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico PKK tiene una longitud de 12 a 25 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico PKK tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico PKK tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico PKK tiene una longitud de 15 a 25 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico PKK tiene una longitud de 18 a 22 subunidades. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido al ácido nucleico PKK tiene una longitud de 19 a 21 subunidades. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es 8 a 80, 12 a 50, 13 a 30, 13 a 50, 14 a 30, 14 a 50, 15 a 30, 15 a 50, 16 a 30, 16 a 50, 17 a 30, 17 a 50, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 30, 19 a 50, o 20 a 30 subunidades enlazadas en longitud.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 12 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 13 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 14 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 15 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 16 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 17 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 18 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 19 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 20 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 21 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 22 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 23 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 24 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 25 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 26 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 27 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 28 subunidades de longitud. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK tiene 29 subunidades de longitud. En ciertas; realizaciones, un compuesto antisentido dirigido ¡a un ácido nucleico PKK tiene una longitud de 30 subunidades. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK es 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades enlazadas de longitud, o un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido, y las subunidades unidas son nucleósidos.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico PKK pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, una sola subunidad puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento 5'), o alternativamente del extremo 3' (truncamiento 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico PKK puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ubicarse en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más subunidades adicionales, las subunidades agregadas pueden estar adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades agregadas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89: 7305-7309, 1992), se probó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases de falta de coincidencia cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. De manera similar, se logró la escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 nucleobases, incluidos aquellos con 1 o 3 desajustes.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100% de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358,1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido en tándem de 14 nucleobases, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico PKK tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, mayor afinidad de unión por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos típicamente contienen al menos una región modificada para conferir una mayor resistencia a la degradación de la nucleasa, una mayor absorción celular, una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o una mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE, y 2 '-O-CH3 , entre otros), y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2)n-O-2', donde n = 1 o n = 2 y 4' CH2-O-CH2-2 '). En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, que incluyen, por ejemplo, 2'-MOE. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos 2'-MOE y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender restos de azúcar uniformes, variantes o restos de azúcar alternativos. El motivo de ala-hueco-ala se describe con frecuencia como “X-Y-Z”, donde "X" representa la longitud de ala 5', "Y" representa la longitud del espacio y "Z" representa la longitud de ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternativos. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en este documento, un separador descrito como “X-Y-Z” tiene una configuración tal que el espacio se coloca inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el espacio, o el espacio y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en este documento puede tener un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes.
En ciertas realizaciones, los separadores proporcionados en este documento incluyen, por ejemplo, 20-meros que tienen un motivo de 5-10-5.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican la precalicreína en plasma humano (PKK) incluyen, sin limitación, lo siguiente: N° de acceso GENBa Nk NM_000892,3 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 1), N° de acceso GENBANK DC412984,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2), N° de acceso GENBANK CN265612,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 3), Ge NBANK N° de acceso AK297672,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 4), N° de acceso GENBANK DC413312,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 5), N° de acceso GENBANK AV688858,2 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 6), N° de acceso GENBANK CD652077,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 7), N° de acceso GENBANK BC143911,1 (incorporado aquí como SEQ ID No : 8), N° de acceso GENBANK CB162532,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 9), N° de acceso GENBANK NT_016354,19 truncado de las nucleobases 111693001 a 111730000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 10), N° de acceso GENBANK NM_008455,2 (incorporado aquí como Se Q ID No : 11), N° de acceso GENBANK BB598673,1 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 12), N° de acceso GENBANK NT_039460,7 truncado de las nucleobases 6114001 a 6144000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 13), N° de acceso GENBANK NM_012725,2 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 14), N° de acceso GENBANK NW_047473,1 truncado de las nucleobases 10952001 a 10982000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 15), N° de acceso GENBANK XM_002804276,1 (incorporado aquí como SEQ iD NO: 17) y N° de acceso GENBANK nW_001118167,1 truncado de las nucleobases 2358000 a 2391000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 18).
Se entiende que la secuencia establecida en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en este documento es independiente de cualquier modificación a un resto de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tal, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace internudeosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por Isis Number (Isis No) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar un 3' UTR, un 5' UTR, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región de codificación, una región de iniciación de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definido. Las regiones estructuralmente definidas para PKK pueden obtenerse mediante el N° de acceso a partir de bases de datos de secuencias tales como NCBI y dicha información se incorpora aquí como referencia. En ciertas realizaciones, una región diana puede abarcar la secuencia desde un sitio diana 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.
La orientación incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, de modo que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden estar superpuestos. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por una cantidad de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un rango definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios diana 5' o sitios diana 3' enumerados aquí.
Segmentos diana adecuados se pueden encontrar dentro de un 5' UTR, una región de codificación, un 3' UTR, un intrón, un exón, o una unión de exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de detención.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridarse de una manera no específica a secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de diana).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de PKK son indicativas de inhibición de la expresión de PKK. Las reducciones en los niveles de una proteína PKK también son indicativas de inhibición de la expresión de ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de inhibición de la expresión de PKK. Por ejemplo, la inflamación reducida o prevenida puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En otro ejemplo, la reducción o prevención del edema/hinchazón puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En otro ejemplo, la permeabilidad vascular reducida o evitada puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En otro ejemplo, la pérdida vascular reducida o evitada puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En ciertas realizaciones, la permeabilidad vascular se mide mediante la cuantificación de un tinte, como el Evans Blue.
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en este documento y un ácido nucleico diana. El mecanismo más común de hibridación implica el enlace de hidrógeno (por ejemplo, Watson-Crick, Hoogsteen o enlace de hidrógeno de Hoogsteen invertido) entre las nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede ocurrir en diferentes condiciones. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico que se hibridarán.
Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados aquí son hibridables específicamente con un ácido nucleico diana.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se produzca un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico PKK).
Las nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico PKK pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana. Además, un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de PKK de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén involucrados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, desajuste o estructura de horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados aquí, o una porción especificada de los mismos, son, o son al menos, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios a un ácido nucleico PKK, una región diana, segmento diana, o parte especificada del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana se puede determinar utilizando métodos de rutina.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en donde 18 de las 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias de una región diana y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representarían un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no necesitan ser contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de completa complementariedad con el ácido nucleico diana tendrían un 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico diana y, por lo tanto, estarían dentro del alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse rutinariamente utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados aquí, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) a un ácido nucleico diana, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario a un ácido nucleico de precalicreína en plasma, o una región diana, o un segmento diana o secuencia diana del mismo. Como se usa en el presente documento, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejar bases precisas con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico diana. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es completamente complementario a una secuencia diana que tiene 400 nucleobases de largo, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico diana que sea completamente complementaria al compuesto antisentido. Completamente complementario también puede usarse en referencia a una porción especificada del cebador y/o el segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobase puede ser "completamente complementaria" a una secuencia diana que tiene una longitud de 400 nucleobases. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobase es completamente complementaria a la secuencia diana si la secuencia diana tiene una porción correspondiente de 20 nucleobase en donde cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido de 30 nucleobases completo puede o no ser completamente complementario a la secuencia diana, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia diana.
La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está ubicada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido que tienen, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud no comprenden más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana o una porción especificada del mismo.
En ciertas realizaciones, compuestos antisentido que son, o son hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico diana o parte especificada del mismo.
Los compuestos antisentido proporcionados también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. Como se usa en el presente documento, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico diana. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 8 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 9 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 10 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios a al menos una porción de 11 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 12 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 13 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 14 nucleobases de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 15 nucleobases de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios de al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más porciones de nucleobase de un segmento diana, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobase. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN descrita se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en este documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento. Las bases no idénticas pueden ser adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tiene un emparejamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO. o una porción de los mismos, descritos aquí.
En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción de nucleobase 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico diana.
Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de azúcar base. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato puede unirse al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura oligonucleotídica, se refiere a los grupos fosfato comúnmente como enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones a los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por la diana de ácido nucleico, mayor estabilidad en presencia de nucleasas o mayor actividad inhibitoria.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internudeosídicos modificados
El enlace internucleosídico natural del ARN y el ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internudeosídicos modificados, es decir, de origen no natural, a menudo se seleccionan sobre los compuestos antisentido que tienen enlaces internudeosídicos de origen natural debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos diana y aumento de estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internudeosídicos modificados incluyen enlaces internudeosídicos que retienen un átomo de fósforo, así como enlaces internudeosídicos que no tienen un átomo de fósforo.
Los enlaces internudeosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y no fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de precalicreína en plasma comprenden uno o más enlaces internudeosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir mayor estabilidad de la nucleasa, mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa químicamente modificados. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluidos grupos sustituyentes 5' y 2', puente de átomos de anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R) o C(R-i)(R2)(R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, C1-C12 alquilo o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido 2'-F-5'-metilo sustituido (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 8/21/08 para otros nucleósidos sustituidos con 5',2'-bis descritos) o la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE.UU. Publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (véase la solicitud internacional PCT WO 2007/134181 publicada el 11/22/07 en donde ANB está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2 -OCH3, 2 -OCH2CH3, 2 -OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también se puede seleccionar entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R-i)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente de 4' a 2'. Los ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos puenteados de 4' a 2' incluyen, entre otros, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (ANB); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también denominado etilo o cEt restringido) y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y análogos de los mismos, véase la Patente de Estados Unidos 7,399,845, expedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/068922 publicada como WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de, 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/064591 publicada como WO/2008/150729, publicada en 11 de diciembre, 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (véase la solicitud de patente estadounidense publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, C-i-C- âlquilo, o un grupo protector (véase la patente de EE.UU. 7,427,672, expedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al, J. Org Chem, 2009, 74, 118-134.); y 4' CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos ver PCT/US2008/066154 publicada como WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre, 2008).
Otros informes relacionados con los nucleósidos bicíclicos también se pueden encontrar en la literatura publicada (ver por ejemplo: Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372; Singh et al, Chem. Commun., 1998, 4, 455­ 456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU, 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035­ 10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129 (26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; y Orum et al., Curr. Opinión Mol. Ther., 2001,3,239-243; Patentes de los EE.UU. Núms. 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684 y 7,696,345; Publicación de Patente de EE.UU. Núm. US2008- 0039618; US2009-0012281; US2004-0171570; Solicitud de Patente de EE.UU. 12/129,154; 60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; y 61/099,844; Solicitudes PCT internacionales publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226)
En ciertas realizaciones, los restos de azúcar bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y 2' del resto de azúcar pentofuranosilo en donde dichos puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 unidos grupos seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra )=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa )- , -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2- , -S(=O)x-, y -N(Ra)- ;
en donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2 ,3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1 -C12 alquilo, C1 -C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, radical heterociclo, radical de heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical de C5-C7 cicloalquilo alicíclico, radical de C5-C7 alicíclico sustituido, halógeno, OJ1 , NJ1 J2 , SJ1 , N3, COOJ1 , acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo o sulfoxilo y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1 -C12 alquilo, C1 -C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1 -C12 aminoalquilo sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra )(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O-o -C(Ra Rb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-c H2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'-en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o C1 -C12 alquilo.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los BNA de a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') se han incorporado en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA, y (F) metilo(metilenoxi) (4'-CH(CHa )-O-2') BNA, (G) metileno-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metileno-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metilo carbocíclico (4'-CH2-c H(CH3)-2') BNA, (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinilo BNA como se muestra a continuación:
Figure imgf000023_0001
en donde Bx es el resto de base y R es independientemente H, un grupo protector, C1-C12 alquilo o C i-C i2alcoxi. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Figure imgf000023_0002
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
-Qa-Qb-Qc -es -CH2-N(Rc )-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc )-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2 ;
Rc es C1-C12 alquilo o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Figure imgf000023_0003
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos es, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, N JJ d, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd en donde cada Jc , Jd y Je es, independientemente, H, C1-C6 alquilo, o C1 -C6 alquilo sustituido y X es O o NJc .
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000024_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es C1 -C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, sustituido C2-C6 alquinilo o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000024_0002
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1 -C6 alquilo, C1 -C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido o C2-C6 alquinilo;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1 -C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, alqu alquenilo C2-C6 sustituido, C2-C6 alquinilo o alquilo C2-C6 sustituido alquinilo, C1 -C6 alcoxilo, C1 -C6 alcoxilo sustituido, acilo, acilo sustituido, C1-C6 aminoalquilo o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000024_0003
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa , qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1 -C12 alquilo, C1 -C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquenilo, alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido y, C1-C12 alcoxi, C1 -C12 alcoxi sustituido, OJj , SJj , SOJj , SO2Jj , NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj , C (= O )N J C(=O)Jj , O -C (= O )N J N (H )C (=N H )N J N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1 -C12 alquilo sustituido.
Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metilo-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácido nucleico. (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y la preparación de los mismos también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett, 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, la síntesis de 2'-amino-BNA, un análogo novedoso de oligonucleótido de alta afinidad restringido por la conformación se ha descrito en la técnica (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino-y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con hebras complementarias de ARN y ADN.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000025_0001
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj , qk y ql es, independientemente, H, halógeno, C1 -C12 alquilo, C1 -C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1 -C12 alcoxilo sustituido, OJj , SJj , SOJj , SO2Jj , NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj , C(=O)NJjJk, C(=O)Jj , O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son = C(qg)(qh), en donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1 -C12 alquilo o C1 -C12 alquilo sustituido.
Se ha descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH2) 3-2' y el puente análogo alquenílico 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al, Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al, J. Am. Chem. Soc, 2007, 129 (26), 8362-8379).
Como se usa en el presente documento, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar, o análogo de resto de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en el presente documento, "azúcar modificado en 2'” significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido, y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2 , O(CH2)nCHa , O(CH2)nF, O(CH2)nONH2 , OCH2C(=O)n(H)CH3, y O(CH2)nON[(CH2)nCHa]2 , donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes 2' también pueden ser seleccionados de: C1 -C12 alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3 , OCN, CI, Br, CN, F, CF3 , OCF3, SOCH3 , SO2CH3, ONO2 , NO2 , N3 , NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas, o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker y col., J. Biol Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución de 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al, Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en el presente documento, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, entre otros, lo que se conoce en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-1954) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000026_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es un resto de base heterocíclico;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3';
q-i , q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno C1 -C6 alquilo independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1 -C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1 J2 , SJ1 , N3 , O C (= X J OC(=X)NJJ2 , NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en donde X es O, S o NJ1 y cada J1 , J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquilo.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde q1 , q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1 , q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son distintos de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de q1 , q2, q3, q4, q5 , q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos THP de fórmula VII en donde uno de R1 y R2 es fluoro. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se han informado nucleósidos que comprenden restos de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (véase, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; y las patentes de los Ee .UU. 5,698,685; 5,166,315; 5,185,444; y 5,034,506). Como se usa aquí, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000027_0001
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura de morfolino anterior. Dichos sustitutos del azúcar se denominan en el presente documento "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, tales como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase la solicitud internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 8/21/08 para otros nucleósidos sustituidos 5',2'-bis descritos) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y la sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de EE.UU. publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o alternativamente la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase Solicitud internacional PCT WO 2007/134181, publicada el 11/22/07 en donde un nucleósido bicíclico 4'-CH2-O-2' se sustituye adicionalmente en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo) La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos también se han descrito {véase, por ejemplo, Srivastava et al, J. Am. Chem Soc. 2007, 129 (26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, entre otros, los descritos en la técnica (véase, por ejemplo, la solicitud PCT publicada de propiedad común WO 2010/036696, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al, J. Am. Chem. Soc, 2008 130 (6), 1979-1984; Horvath et al. Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem Soc, 2007, 129 (30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24 (5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33 (8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61 (6), 585­ 586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60 (9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13 (6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001,29 (24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20 (4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud PCT publicada, WO 06/047842; y Solicitud Pc T publicada WO 01/049687; el texto de cada uno se incorpora aquí como referencia, en su totalidad). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen Fórmula X.
Figure imgf000027_0002
en donde independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es un resto de base heterocíclico;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido o un grupo terminal 5' o 3'; y
q-i, q2, q3, q4, q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-6 alquenilo, C2-6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo, C2-C6 alquinilo sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en el presente documento, "modificado 2'” o "sustituido 2'" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' diferente de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, entre otros, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2 no puente, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1 -C10 alquilo, -OCF3, O-(CH2 )2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o sustituido o no sustituido C1-C10 alquilo. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en el presente documento, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en este documento, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metilo" se refieren a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en el presente documento, "MOE" o "2'-MOE" o "2 -OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar monociclo, biciclo y triciclo en la técnica que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido como se proporciona en este documento (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-1954). Dichos sistemas de anillo pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la materia. Algunas patentes representativas de EE.UU. que enseñan la preparación de dichos azúcares modificados incluyen, entre otras, las US: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,670,633; 5,700,920; 5,792,847 y 6,600,032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005, y cada una de las cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad.
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con una diana de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gápmero. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo separador.
Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido pueden estar unidos covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, la distribución celular o la absorción celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen hidratos de carbono, fosfolípidos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y tintes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente están unidos a uno o ambos extremos de compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. Se incluyen en los grupos estabilizadores las estructuras de tapa. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación de exonucleasa, y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el terminal 5' (tapa 5'), o en el terminal 3' (tapa 3'), o puede estar presente en ambos terminales. Las estructuras de tapones son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, tapones desoxi abásicos invertidos. Otros grupos estabilizadores 3' y 5' que se pueden usar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido en el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos PKK se pueden probar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para tales análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, Md ) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células T HepaRG™ y hepatocitos primarios de ratón.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En este documento se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE en OPTI-MEM 1 redujo el medio sérico (Life Technologies, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede variar de 2 a 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por métodos de rutina. Las células se pueden cosechar 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el cual los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana se miden por métodos conocidos en la técnica y descritos aquí. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido utilizado varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan mediante electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles o expresión diana
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico PKK se puede analizar de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o poli(A)+ ARNm. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia de Northern también es una rutina en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 disponible en el mercado, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de los niveles de ARN diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana se puede lograr mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (TI), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se utiliza como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de TI y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. Los reactivos de TI y PCR en tiempo real se pueden obtener de Life Technologies (Carlsbad, CA). Las reacciones de TI en tiempo real de PCR se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia.
Las cantidades diana del gen (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEn (Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica por PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica usando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, LJ et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridarse con un ácido nucleico PKK. Los métodos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de niveles de proteínas
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos PKK puede evaluarse midiendo los niveles de proteína PKK. Los niveles de proteína de PKK pueden evaluarse o cuantificarse en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a una diana pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad de inhibir la expresión de PKK y producir cambios fenotípicos.
En ciertas realizaciones, tales cambios fenotípicos incluyen aquellos asociados con una enfermedad inflamatoria, tales como inflamación reducida, edema/hinchazón, permeabilidad vascular y fuga vascular. En ciertas realizaciones, la inflamación se mide midiendo el aumento o la disminución del edema, la temperatura, el dolor, el color del tejido y la función abdominal en el animal.
En ciertas realizaciones, dichos cambios fenotípicos incluyen aquellos asociados con una enfermedad tromboembólica, tales como, aPTT prolongado, tiempo de aPTT prolongado junto con un PT normal, cantidad disminuida de factor de plaquetas 4 (PF-4) y formación reducida de trombo o aumento de tiempo para la formación de trombos.
Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral, como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y depende de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el a Rn del tejido hepático y se miden los cambios en la expresión de ácido nucleico de PKK.
Ciertas indicaciones
En ciertas realizaciones, la invención proporciona métodos para tratar a un individuo que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad inflamatoria. En ciertas realizaciones, el individuo tiene riesgo de desarrollar una afección inflamatoria, que incluye, entre otros, angioedema hereditario (AEH), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular y edema cerebral. Esto incluye a personas con un problema, enfermedad o trastorno adquirido que conlleva un riesgo de inflamación, por ejemplo, predisposición genética a una afección inflamatoria, factores ambientales y exposición a ciertos medicamentos, incluidos, por ejemplo, inhibidores de la ECA y BRA. En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo necesita terapia antiinflamatoria. Los ejemplos de tales individuos incluyen, entre otros, aquellos que tienen una mutación en el código genético para el inhibidor de la esterasa del complemento 1 (es decir, C1-INH) o el Factor 12. En ciertas realizaciones, un código anormal puede conducir a una deficiencia en C1-INH (es decir, HAE tipo I), una incapacidad de C1-INH existente para funcionar correctamente (HAE tipo II), o Factor 12 hiperfuncional (es decir, HAE tipo III).
En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad tromboembólica. En ciertas realizaciones, el individuo está en riesgo de sufrir un trastorno de la coagulación de la sangre, que incluye, entre otros, infarto, trombosis, embolia, tromboembolismo, como trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular. Esto incluye individuos con un problema, enfermedad o trastorno adquirido que conlleva un riesgo de trombosis, por ejemplo, cirugía, cáncer, inmovilidad, sepsis, aterosclerosis, fibrilación auricular, así como predisposición genética, por ejemplo, síndrome antifosfolípido y la condición autosómica dominante, Factor V Leiden. En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo necesita terapia de anticoagulación. Los ejemplos de tales individuos incluyen, entre otros, aquellos sometidos a cirugía ortopédica mayor (por ejemplo, reemplazo de cadera/rodilla o cirugía de fractura de cadera) y pacientes que necesitan tratamiento crónico, como aquellos que sufren fibrilación arterial para prevenir un accidente cerebrovascular.
En ciertas realizaciones, la invención proporciona métodos para reducir profilácticamente la expresión de PKK en un individuo. Ciertas realizaciones incluyen el tratamiento de un individuo que lo necesita mediante la administración a un individuo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK. En una realización, la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK se acompaña de la monitorización de los niveles de PKK en el suero de un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. La respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido es utilizada por un médico para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico PKK da como resultado la reducción de la expresión de PKK en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%, o un rango definido por cualquiera de estos dos valores. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a PKK se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad inflamatoria o enfermedad tromboembólica.
Ciertas composiciones
1. ISIS 546254
En ciertas realizaciones, ISIS 546254 se caracteriza como un gápmero 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5' a 3') TGCAAGTCTCTTGGCAAACA (incorporada aquí como SEQ ID NO: 570), en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato, cada citosina es una 5'-metilcitosina, cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 son nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo, y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-desoxinucleósidos.
En ciertas realizaciones, ISIS 546254 se describe mediante la siguiente notación química: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2'-desoxinucleósido, y
s = un enlace internudeosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, ISIS 546254 se describe mediante la siguiente estructura química:
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Estructura 1. ISIS 546254
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 2 (más adelante), ISIS 546254 logró una inhibición del 95% del ARNm de PKK humano en células HepaRG™ cultivadas (densidad de 20.000 células por pocillo) cuando se transfectó usando la operación eléctrica con oligonucleótido antisentido 5.000 nM después de un tratamiento período de 24 horas y medido por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebador humano RTS3454 y ajustado de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 5 (véanse las Tablas 34 y 41 a continuación), ISIS 546254 logró un CI50de 0,2|jM y 0,3|jM en una curva de respuesta de dosis de 4 puntos (0,19 j iM, 0,56 j iM, 1,67 j iM y 5,0 j iM) en células HepaRG™ cultivadas (densidad de 20.000 células por pocillo) cuando se transfecta usando la operación eléctrica después de un período de tratamiento de 16 y se mide por PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebador humano RTS3454 y se ajusta de acuerdo con el contenido total de ARN, tal como se midió por RIBOGREEN®.
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 7 (más adelante), ISIS 546254 logró una inhibición de ARNm de PKK humana de 31%, 55%, 84% y 83% y una inhibición de proteína de PKK humana de 0%, 36%, 51% y 76% en ratones transgénicos que albergan la secuencia del gen PKK humano cuando se inyectan por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas con 2,5 mg/kg/semana, 5,0 mg/kg/semana, 10 mg/kg/semana o 20 mg/kg/semana con ISIS 546254.
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 8 (más adelante), ISISI 546254 es eficaz para inhibir la expresión de proteínas y ARNm de PKK y es tolerable en primates.
Ciertas regiones críticas
1. Nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido están diseñados para dirigirse a las nucleobases 27427­ 27466 de SEQ ID NO: 10 (N° de Acceso GENBANK NT_016354,19 truncado de las nucleobases 111693001 a 111730000). En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10 son una región crítica. En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido son gápmeros. En ciertas realizaciones, los gápmeros son 5-10­ 5 gápmeros MOE, 4-9-4 gápmeros MOE, 4-10-4 gápmeros MOE, 4-10-3 gápmeros MOE, 3-10-4 gápmeros MOE o 3­ 10-3 gápmeros MOE. En ciertas realizaciones, los gápmeros son 5-10-5 gápmeros MOE y cEt, 4-9-4 gápmeros MOE y cEt, 4-10-4 gápmeros MOE y cEt, 4-10-3 gápmeros MOE y cEt, 3-10-4 gápmeros MOE y cEt, o 3-10-3 gápmeros MOE y cEt. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de los olignonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por los siguientes números ISIS: 530993, 530994, 530995, 546251, 546252, 546253, 546254, 546255, 546256, 547410, 547411,547978, 547979, 547980, y 547981.
En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por las siguientes SEQ ID NO: 94, 95, 96, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 1597, 1598, 1599 y 1600.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a las nucleobases 27427-27466 de SEQ ID NO: 10 logran al menos 30%, al menos 31%, al menos 32%, al menos 33%, al menos 34%, al menos 35%, al menos 36%, al menos 37%, al menos 38%, al menos 39%, al menos 40%, al menos 41%, al menos 42%, al menos 43%, al menos 44%, al menos 45%, al menos 46%, al menos 47%, al menos 48%, al menos 49%, al menos 50%, al menos 51%, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61%, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71%, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de reducción de los niveles de PKK y/o proteínas in vitro y/o in vivo.
4. Nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10
En ciertas realizaciones de la descripción, los oligonucleótidos antisentido están diseñados para dirigirse a las nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10 (N° de Acceso GENBANK NT 016354,19 truncado de las nucleobases 111693001 a 111730000). En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10 son una región crítica. En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido son gápmeros. En ciertas realizaciones, los separadores son 5-10-5 gápmeros MOE, 4-9-4 gápmeros MOE, 4-10-4 gápmeros MOE, 4-10-3 gápmeros MOE, 3-10­ 4 gápmeros MOE o 3-10-3 gápmeros MOE. En ciertas realizaciones, los separadores son 5-10-5 gápmeros MOE y cEt, 4-9-4 gápmeros MOE y cEt, 4-10-4 gápmeros MOE y cEt, 4-10-3 gápmeros MOE y cEt, 3-10-4 gápmeros MOE y cEt, o 3-10-3 gápmeros MOE y cEt. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de los olignonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por los siguientes números ISIS: 530993-530999, 546251-546256, 546258-546260, 546263, 546265-546268, 547410-547417 y 547978-547992.
En ciertas realizaciones, las nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por las siguientes SEQ ID NO: 94-100, 566-587 y 1597-1611.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a las nucleobases 27427-27520 de SEQ ID NO: 10 logran al menos 30%, al menos 31%, al menos 32%, al menos 33%, al menos 34%, al menos 35%, al menos 36%, al menos 37%, al menos 38%, al menos 39%, al menos 40%, al menos 41%, al menos 42%, al menos 43%, al menos 44%, al menos 45%, al menos 46%, al menos 47%, al menos 48%, al menos 49%, al menos 50%, al menos 51%, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61%, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71%, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de reducción de los niveles de PKK y/o proteínas in vitro y/o in vivo.
7. Nucleobases 27362-27524 de SEQ ID NO: 10
En ciertas realizaciones de la descripción, los oligonucleótidos antisentido están diseñados para dirigirse a las nucleobases 27362-27524 de SEQ ID NO: 10 (N° de Acceso GENBANK NT 016354,19 truncado de las nucleobases 111693001 a 111730000). En ciertas realizaciones, las nucleobases 27362-27524 corresponden al exón 9 de PKK (número de acceso GENBANK NT_016354,19 truncado de las nucleobases 111693001 a 111730000). En ciertas realizaciones de la descripción, las nucleobases 27362-27524 de SEQ ID NO: 10 son una región crítica. En ciertas realizaciones, las nucleobases 27362-27524 de la SEQ ID NO: 10 están dirigidas por oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido tienen 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido son gápmeros. En ciertas realizaciones, los gápmeros son 5-10-5 gápmeros MOE, 4-9-4 gápmeros MOE, 4-10-4 gápmeros MOE, 4-10-3 gápmeros MOE, 3-10-4 gápmeros MOE o 3­ 10-3 gápmeros MOE. En ciertas realizaciones, los gápmeros son 5-10-5 gápmeros MOE y cEt, 4-9-4 gápmeros MOE y cEt, 4-10-4 gápmeros MOE y cEt, 4-10-3 gápmeros MOE y cEt, 3-10-4 gápmeros MOE y cEt, o 3-10-3 gápmeros MOE y cEt. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de los oligonucleótidos antisentido están unidos por enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, las nucleobases 27361-27524 de SEQ ID NO: 10 están dirigidas por los siguientes números ISIS: 530985-530999, 546244, 546247-546256, 546258-546260, 546263, 546265-546268, 547403-547417, 547723, 547968-547970 y 547972-547992.
En ciertas realizaciones, las nucleobases nucleobases 27361-27524 de la SEQ ID NO: 10 están dirigidas por las siguientes SEQ ID NO: 86-100, 554-587, 1217 y 1588-1611.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a las nucleobases 27362-27524 de SEQ ID NO: 10 logran al menos 30%, al menos 31%, al menos 32%, al menos 33%, al menos 34%, al menos 35%, al menos 36%, al menos 37%, al menos 38%, al menos 39%, al menos 40%, al menos 41%, al menos 42%, al menos 43%, al menos 44%, al menos 45%, al menos 46%, al menos 47%, al menos 48%, al menos 49%, al menos 50%, al menos 51%, al menos 52%, al menos 53%, al menos 54%, al menos 55%, al menos 56%, al menos 57%, al menos 58%, al menos 59%, al menos 60%, al menos 61%, al menos 62%, al menos 63%, al menos 64%, al menos 65%, al menos 66%, al menos 67%, al menos 68%, al menos 69%, al menos 70%, al menos 71%, al menos 72%, al menos 73%, al menos 74%, al menos 75%, al menos 76%, al menos 77%, al menos 78%, al menos 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de reducción de los niveles de PKK y/o proteínas in vitro y/o in vivo.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Si bien ciertos compuestos, composiciones y métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: Inhibición antisentido de PKK humana en células T HepaRG™ por oligonucleótidos antisentido con modificaciones de azúcar 2'-MOE
Los oligonucleótidos antisentido se diseñaron dirigidos a un ácido nucleico PKK y se evaluaron sus efectos sobre el ARNm de PKK in vitro. Las células HepaRG™, que son células hepáticas diferenciadas terminalmente derivadas de una línea celular progenitora hepática humana y retienen muchas características de los hepatocitos humanos primarios (Lubberstedt M. et al., J. Pharmacol. Toxicol. Methods 2011 63: 59-68), fueron utilizadas en el cribado.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las tablas siguientes se diseñaron como 5-10-5 gápmeros MOE. Los gápmeros tienen una longitud de 20 nucleósidos, en donde el segmento de separación central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-O-metoxietilo. Los enlaces internucleosídicos en cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. "Sitio de inicio" indica el nucleósido 5' más al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de detención" indica el nucleósido 3' más al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm PKK humano, designado aquí como SEQ ID No : 1 (N° de acceso GENBANK NM_000892,3) o la secuencia genómica PKK humana, designada aquí como SEQ ID NO: 10 (N° de acceso GENBANK NT_016354,19 truncado de los nucleótidos 111693001 a 111730000). “n/a” indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular.
Las células HepaRG™ cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando la operación eléctrica con 3.000 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK por PCR cuantitativa en tiempo real. Conjunto de sonda de cebador humano RTS3454 (secuencia directa CCAAAAAAGGTGCACCAGTAACA, designada aquí como SEQ ID NO: 20; secuencia inversa CCTCCGGGACTGTACTTTAATAGG, designada aquí como SEQ ID n O: 21; secuencia de sonda CACGCAAACATTTCACAAGGCAGAGTACC, designada aquí como s Eq ID NO: 22) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de PKK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con las células de control no tratadas.
Tabla 1
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Tabla 2
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Tabla 3
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Tabla 4
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Ejemplo 2: Inhibición antisentido de PKK humana en células HepaRG™ por oligonucleótidos antisentido con modificaciones de azúcar 2'-MOE
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico PKK y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de PKK in vitro.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las tablas siguientes se diseñaron como 5-10-5 gápmeros MOE, 4-9-4 gápmeros MOE, 4-10-4 gápmeros MOE, 4-10-3 gápmeros MOE, 3-10-4 gápmeros MOE, o 3-10-3 gápmeros MOE. Los 5-10-5 gápmeros de MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cinco nucleósidos cada uno. Los 4-9-4 gápmeros MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende nueve 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro nucleósidos cada uno. Los 4-10-4 gápmeros MOE tienen 18 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro nucleósidos cada uno. Los 4-10-3 gápmeros MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden cuatro y tres nucleósidos respectivamente. Los 3-10-4 gápmeros MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres y cuatro nucleósidos respectivamente. Los 3-10-3 gápmeros MOE tienen 16 nucleósidos de longitud, en donde el segmento de separación central comprende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que comprenden tres nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-O-metoxietilo. Los enlaces internucleosídicos en cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada separador son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido a la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 10. “n/a” indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular.
Las células HepaRG™ cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando una electroporación con un oligonucleótido antisentido de 5.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3454 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de PKK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con las células de control no tratadas.
Tabla 5
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Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13
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Tabla 14
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Tabla 15
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Tabla 16
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Tabla 17
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Tabla 18
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Ejemplo 3: Inhibición antisentido de PKK humana en células HepaRG™ por oligonucleótidos antisentido con modificaciones de azúcar MOE, desoxi y cEt
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico PKK y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de PKK in vitro.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos en las tablas siguientes se diseñaron como separadores desoxi, MOE y cEt. Los separadores tienen una longitud de 16 nucleósidos en los que el nucleósido tiene una modificación de azúcar MOE, una modificación de azúcar cEt o una modificación desoxi. La columna "química” describe las modificaciones de azúcar de cada oligonucleótido, “k” indica una modificación de azúcar cEt; el número indica el número de desoxinucleósidos; de lo contrario, “d” indica un desoxinucleósido; y “e” indica una modificación 2'-O-metoxietilo. Los enlaces internucleosídicos en cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada oligonucleótido son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio" indica el nucleósido más 5' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. El "sitio de detención" indica el nucleósido más 3' al que se dirige el gápmero en la secuencia del gen humano. Cada gápmero enumerado en las tablas a continuación está dirigido al ARNm de PKK humano, designado aquí como SEQ ID NO: 1 o la secuencia genómica PKK humana, designada aquí como SEQ ID NO: 10. “n/a” indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia genética particular.
Las células HepaRG™ cultivadas a una densidad de 20.000 células por pocillo se transfectaron usando una operación eléctrica con un oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador humano RTS3454 para medir los niveles de ARNm. ISIS 531231 también se incluyó en este ensayo. Los niveles de ARNm de PKK se ajustaron según el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con las células de control no tratadas.
Tabla 19
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Tabla 20
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Tabla 21
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Tabla 23
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Tabla 24
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Tabla 25
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Tabla 26
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Tabla 27
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Tabla 28
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Tabla 29
ISIS N O S
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o e o e
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Tabla 30
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Tabla 31
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Ejemplo 4: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PKK humana en células HepaRG™
Gápmeros de los estudios descritos anteriormente que exhiben una inhibición in vitro significativa del ARNm de PKK se seleccionaron y probaron a varias dosis en células HepaRG™. Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 0,12 j M, 0,37 j M, 1,11 j M, 3,33 j M y 10,00 j M de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador PKK humano RTS3454 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm PKK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con las células de control no tratadas.
También se presenta la mitad de la concentración inhibitoria máxima (CI50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de PKK se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 32
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Tabla 33
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Ejemplo 5: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PKK humana en células HepaRG™
Gápmeros de los estudios descritos anteriormente que exhiben una inhibición in vitro significativa del ARNm de PKK se seleccionaron y probaron a varias dosis en células HepaRG™. Las células se sembraron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando una operación eléctrica con concentraciones de 0,19 j M, 0,56 |j M, 1,67 j M y 5,00 j M de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló el a Rn de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador PKK humano RTS3454 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm PKK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con las células de control no tratadas, “n/a” indica que no se realizó ninguna medición para ese oligonucleótido antisentido particular para esa dosis particular.
También se presenta la mitad de la concentración inhibitoria máxima (CI50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm de PKK se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 34
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Tabla 35
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Tabla 36
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Tabla 39
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Tabla 40
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Tabla 41
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Tabla 42
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Tabla 43
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Ejemplo 6: inhibición antisentido dependiente de la dosis de PKK humana en células HepaRG™
Gápmeros de los estudios descritos anteriormente que exhiben una inhibición in vitro significativa del ARNm de PKK se seleccionaron y probaron a varias dosis en células HepaRG™. Las células se colocaron en placas a una densidad de 20.000 células por pocillo y se transfectaron usando una operación eléctrica con 0,11 jiM, 0,33 jiM, 1,00 jiM y 3,00 |jM de concentraciones de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, se aisló ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK por PCR cuantitativa en tiempo real. Se usó el conjunto de sonda de cebador PKK humano RTS3454 para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm PKK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®. Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experimentos que tenían condiciones de cultivo similares. Los resultados para cada experimento se presentan en tablas separadas que se muestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con las células de control no tratadas. “n/a” indica que no se realizó ninguna medición para ese oligonucleótido antisentido particular para esa dosis particular.
También se presenta la mitad de la concentración inhibitoria máxima (CI50) de cada oligonucleótido. Los niveles de ARNm PKK se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 44
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Tabla 45
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Tabla 46
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Tabla 47
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Ejemplo 7: Eficacia de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PKK humana en ratones transgénicos Los ratones transgénicos que contenían un fragmento de 37.390 pares de bases de la secuencia del gen KLKB1 humano (cromosoma 4: posición 187148672-187179625, N° de acceso: NC_000004,11) fueron tratados con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente, que se evaluaron para determinar su eficacia en este modelo.
Tratamiento
Se inyectaron grupos de ratones transgénicos por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas con 2,5 mg/kg/semana, 5,0 mg/kg/semana, 10 mg/kg/semana o 20 mg/kg/semana de ISIS 546232, ISIS 546251, ISIS 546254, ISIS 546343, ISIS 546828, ISIS 547455, ISIS 547457, ISIS 547927 e ISIS 548048. Un grupo de ratones transgénicos se inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas con PBS. Los ratones se sacrificaron 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma se recogieron para su posterior análisis.
Análisis de ARN
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS en la reducción de la diana, se extrajo ARN del tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de PKK humana. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del ARNm de PKK, en relación con el control de PBS. Como se muestra en la Tabla 48, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de PKK en comparación con el control de PBS.
Tabla 48
Porcentaje de inhibición del ARNm de PKK en el hígado de ratones transgénicos en relación con el control de PBS
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Análisis de proteínas
Los niveles de proteína PKK en plasma se evaluaron en todos los grupos. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de la proteína PKK, en relación con el control de PBS. Como se muestra en la Tabla 49, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dieron como resultado una reducción significativa de los niveles de proteína PKK en comparación con el control PBS.
Tabla 49
Porcentaje de reducción de los niveles de proteína PKK en los ratones transgénicos en relación con el control PBS
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Ejemplo 8: Efecto de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos a PKK humana en monos cynomolgus
Los monos cynomolgus se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente. Se evaluaron la eficacia y tolerabilidad de los oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido humanos probados son reactivos cruzados con la secuencia genómica rhesus (N° de acceso GENBANK NW_001118167,1 truncado de los nucleótidos 2358000 a 2391000 y designado aquí como SEQ ID NO: 18). El sitio de inicio de destino de cada oligonucleótido con la SEQ ID NO: 18 se presenta en la Tabla 50. "No coincide" indica que el número de nucleótidos por los cuales el oligonucleótido no coincide con la secuencia rhesus. Cuanto mayor sea la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia del mono rhesus, es más probable que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia del mono rhesus, “n/a” indica que el oligonucleótido tiene más de 3 desajustes con la secuencia del gen rhesus.
Tabla 50
Oligonucleótidos antisentido complementarios a la SEQ ID NO: 18
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Tratamiento
Antes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un período de 30 días, durante el cual los animales se observaron diariamente para la salud general. Los monos tenían 2-4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. Diez grupos de cuatro monos cynomolgus machos asignados al azar cada uno fueron inyectados por vía subcutánea con oligonucleótido ISIS o PBS. La solución de PBS u oligonucleótidos ISIS a una dosis de 40 mg/kg se administraron inicialmente con un régimen de carga que consta de cuatro dosis en la primera semana del estudio (días 1, 3, 5 y 7), seguido de un régimen de mantenimiento que consiste en una vez a la semana, a partir del día 14 (semanas 2 a 13). Las inyecciones subcutáneas se realizaron en rotaciones en sentido horario en 4 sitios en la parte posterior; un sitio por dosis. Los sitios de inyección se delinearon por tatuaje, mientras se sedaron con ketamina, y se separaron por un mínimo de 3 cm.
Durante el período de estudio, los monos fueron observados un mínimo de una vez al día por signos de enfermedad o angustia. Cualquier animal que experimente algo más que dolor o angustia momentáneo o leve debido al tratamiento, lesión o enfermedad se notificó de inmediato al veterinario responsable y al Director del Estudio. Se identificó cualquier animal con mala salud o en una posible condición moribunda para un mayor monitoreo y posible eutanasia. Por ejemplo, dos monos tratados con ISIS 547445 fueron sacrificados debido a un comportamiento moderado, posición lateral, falta de respuesta a los estímulos y disminución de la respiración. Los protocolos descritos en el Ejemplo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Reducción diana
Análisis de ARN
En el día 87 u 88, 48 horas después de la dosis final, se extrajo ARN del tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de PKK usando el conjunto de sonda de cebador RTS3455 (secuencia directa CCTGTGTGGAGGGTCACTCA, designada aquí como SEQ ID NO: 23; secuencia inversa CCACTATAGATGCGCCAAACATC, designada aquí como SEQ ID NO: 24; secuencia de sonda CCCACTGCTTTGATGGGCTTCCC, designada aquí como SEQ ID NO: 25). Los resultados se normalizaron al gen de limpieza, ciclofilina. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición del ARNm de PKK, en relación con el control de PBS. Como se muestra en la Tabla 51, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm de PKK en comparación con el control de PBS.
Tabla 51
Porcentaje de inhibición del ARNm de PKK en el hígado de mono cynomolgus en relación con el control de PBS
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Análisis de proteínas
Se recogieron aproximadamente 0,9 ml de sangre cada vez de todos los animales disponibles antes de la dosis, el día 17, el día 31, el día 45, el día 59 y el día 73, y se colocaron en tubos que contenían citrato de sodio al 3,2%. Los tubos se centrifugaron (3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente) para obtener plasma. Los niveles de proteína PKK se midieron en el plasma mediante ELISA. Los resultados se presentan en la Tabla 52, expresados como porcentaje de inhibición en comparación con los niveles de control de PBS. Los resultados indican que los oligonucleótidos ISIS redujeron significativamente los niveles de proteína PKK.
Tabla 52
Reducción del nivel de proteína PKK (%) en el plasma del mono cynomolgus en relación con los niveles de control
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Estudios de tolerabilidad
Funcionamiento del hígado
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, los monos fueron en ayunas durante la noche. Aproximadamente, se recogieron 1,5 ml de muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Se recogió sangre en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. Los niveles de varios marcadores de función hepática se midieron usando un analizador químico Toshiba 120FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la Tabla 53 e indican que los oligonucleótidos antisentido no tuvieron efecto sobre la función hepática fuera del rango esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 53
Marcadores de la función hepática en plasma de mono cynomolgus
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Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus sobre los parámetros hematológicos, se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 1,2 ml de sangre antes de la dosis y el día 87 o el día 88 de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contienen K2-EDTA. Las muestras se analizaron para el recuento de glóbulos rojos (RBC), recuento de glóbulos blancos (WBC), recuento de plaquetas, contenido de hemoglobina y hematocrito, utilizando un analizador de hematología ADVIA2120i (SIEMENS, EE.UU.). Los datos se presentan en la Tabla 54.
Los datos indican que el tratamiento con la mayoría de los oligonucleótidos no causó ningún cambio en los parámetros hematológicos fuera del rango esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis.
Tabla 54
Parámetros hematológicos en monos cynomolgus
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Funcionamiento del riñón
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, los monos fueron en ayunas durante la noche. Aproximadamente, se recogieron 1,5 ml de muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Se recogió sangre en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador químico Toshiba 120FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la Tabla 55, expresada en mg/dL. Los datos de la química del plasma indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del rango esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 546254 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.
La función renal también se evaluó mediante análisis de orina. Se recogió orina fresca de todos los animales usando una bandeja limpia de jaula sobre hielo húmedo. Se retiraron los alimentos durante la noche el día anterior a la recolección de orina fresca, pero se suministró agua. Los niveles totales de proteína y creatinina se midieron utilizando un analizador químico automático Toshiba 120FR NEO (Toshiba Co., Japón) y se calculó la relación proteína/creatinina. Los resultados se presentan en la Tabla 56.
Tabla 55
Niveles de plasma BUN y creatinina (mg/dL) en monos cynomolgus
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Tabla 56
Proporción proteína/creatinina en orina en cinomolgo
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Análisis de nivel de proteína C-reactiva
Para evaluar cualquier efecto inflamatorio de los oligonucleótidos ISIS en monos cynomolgus, los monos fueron en ayunas durante la noche. Aproximadamente, se recogieron 1,5 ml de muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Se recogió sangre en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínimo de 90 minutos y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 minutos. La proteína C-reactiva (PCR), que se sintetiza en el hígado y que sirve como marcador de inflamación, se midió utilizando un analizador químico Toshiba 120FR NEO (Toshiba Co., Japón). El complemento C3 también se midió de manera similar, y los datos se presentan como un porcentaje de los valores de referencia. Los resultados se presentan en la Tabla 57 e indican que el tratamiento con oligonucleótidos ISIS no causó ninguna inflamación en los monos.
Tabla 57
Proteína C-reactiva y niveles de C3 en plasma de mono cynomolgus
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Ejemplo 9: Inhibición antisentido del ARNm de PKK murino en hepatocitos primarios de ratón
Los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico PKK murino fueron diseñados y probados para sus efectos sobre el ARNm de PKK in vitro. Se transfectaron hepatocitos primarios de ratón cultivados a una densidad de 10.000 células por pocillo usando reactivo de citofectina con 12,5 nM, 25,0 nM, 50,0 nM, 100,0 nM y 200,0 nM de oligonucleótido antisentido. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 24 horas, se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de PKK de ratón mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebador murino RTS3313 (secuencia directa TGCCTGCTGTTCAGCTTTCTC, designada aquí como SEQ ID NO: 2228; secuencia inversa TGGCAAAGTCCCTGTAATGCT, designada aquí como SEQ ID NO: 2229; secuencia de sonda CGTGACTCCACCCAAAGAGACAAATAAACG, designada aquí como SEQ ID NO: 2230). Los niveles de ARNm de PKK se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos se diseñaron como 5-10-5 gápmeros MOE. Los gápmeros tienen 20 nucleótidos de longitud, en donde el segmento de separación central está compuesto por diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado en ambos lados (en las direcciones 5' y 3') por alas que comprenden 5 nucleósidos cada una. Cada nucleósido en el segmento de ala 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación 2'-O-metoxietilo. Los enlaces internucleosídicos en cada gápmero son enlaces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cada gápmero son 5-metilcitosinas. Los resultados demuestran que los niveles de ARNm de PKK se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis.
En un ejemplo específico, ISIS 482584 (GGCATATTGGTTTTTGGAAT; SEQ ID NO: 2244) redujo el ARNm de PKK de una manera dependiente de la dosis, produciendo una concentración inhibitoria máxima media (CI50) de 84 nM (ver Tabla 58). ISIS 482584 está dirigido a SEQ ID NO: 11 (N° de acceso GENBANK NM_008455,2) y tiene un sitio de inicio de destino de 1586 y un sitio de parada diana de 1605. "Sitio de inicio diana" indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gápmero. El "sitio de parada diana" indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gápmero.
Tabla 58
Inhibición dependiente de la dosis de los niveles de ARNm de PKK de ratón por ISIS 482584
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Ejemplo 10: Inhibición antisentido del ARNm de PKK en ratones BALB/c
ISIS 482584 se probó por su efecto sobre el ARNm de PKK murino in vivo.
Tratamiento
Seis grupos de ratones BALB/c machos fueron tratados con 2,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 40,0 mg/kg u 80,0mg/kg de ISIS 482584, administrados por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas (dosis semanales de 5,0 mg/kg, 10,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 40,0 mg/kg, 80,0 mg/kg o 160,0 mg/kg). Un grupo de control de ratones BALB/c fue tratado con PBS, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Dos días después de la última dosis de oligonucleótido antisentido o PBS, los ratones de todos los grupos se anestesiaron con 150 mg/kg de ketamina mezclada con 10 mg/kg de xilazina, administrada por inyección intraperitoneal. Se recogió hígado para análisis de ARN.
Análisis de ARN
El ARN se extrajo del tejido hepático para el análisis por PCR en tiempo real de PKK. Los niveles de ARNm de PKK se midieron usando el conjunto de sonda de cebador murino (secuencia directa ACAAGTGCATTTTACAGACCAGAGTAC, designada aquí como SEQ ID NO: 2231; secuencia inversa GGTTGTCCGCTGACTTTATGCT, designada aquí como SEQ ID NO: 2232; secuencia de sonda AAGCACAGTGCAAGCGGAACACCC, designada aquí como SEQ ID NO: 2233). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con el control de PBS. Como se muestra en la Tabla 59, el tratamiento con ISIS 482584 resultó en una reducción significativa dependiente de la dosis de ARNm de PKK en comparación con el control de PBS.
Tabla 59
Reducción dependiente de la dosis de ARNm de PKK en hígado de ratones BALB/c
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Análisis de proteínas
El plasma se recogió en tubos que contenían citrato de sodio como anticoagulante. Las muestras se procesaron en un gel de SDS-poliacrilamida con gradiente de 4-12% (Invitrogen), seguido de inmunotransferencia con anticuerpo PKK murino (R&D Systems). Las transferencias se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo (LI-COR) y se tomaron imágenes en un Odyssey Imager (LI-COR). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PKK, en relación con el control de PBS. Como se muestra en la Tabla 60, el tratamiento con ISIS 482584 resultó en una reducción significativa dependiente de la dosis de la proteína de plama PKK en comparación con el control PBS.
Tabla 60
Reducción dependiente de la dosis de proteína PKK en plasma de ratones BALB/c
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n.d. = sin datos
Ejemplo 11: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en un modelo de ratón con angioedema
El angioedema hereditario (AEH) se caracteriza por hinchazón local y aumento de la permeabilidad vascular en los tejidos subcutáneos (Morgan, B.P. N. Engl. J. Med. 363: 581-83, 2010). Es causado por una deficiencia del inhibidor de C1, una proteína del sistema del complemento. Se usaron dos modelos de ratón en este estudio, incluido un modelo de ratón establecido de deficiencia de C1-INH y un modelo de edema inducido por captoprilo, los cuales causan permeabilidad vascular, un sello distintivo del AEH. La inversión de la permeabilidad vascular se acompaña de un aumento de los niveles plasmáticos de quininógeno de alto peso molecular (HMWK).
En el primer modelo, el tratamiento con Captoprilo, un agente antihipertensivo conocido, indujo el angioedema, lo que aumenta la permeabilidad vascular en ratones y replica la patología del angioedema hereditario.
En el segundo modelo, el tratamiento con ISIS 461756, un oligonucleótido antisentido que se dirige al ARNm inhibidor de C1 murino, induce el angioedema, lo que aumenta la permeabilidad vascular en ratones y replica la patología del angioedema hereditario. ISIS 461756 (Se Q ID NO: 2245; AAAGTGGTTGATACCCTGGG) es un 5-10-5 gápmero MOE dirigido a nucleósidos 1730-1749 de NM_009776,3 (SEQ ID NO: 2243).
El efecto de HOE-140 e ISIS 482584, un inhibidor de oligonucleótidos antisentido de PKK, se evaluó en los modelos de permeabilidad vascular inducidos por Captoprilo e ISIS 461756 en ratones. Algunos de los grupos murinos fueron tratados con HOE-140, un antagonista selectivo del receptor de bradiquinina B2, que bloquea la vasodilatación y la permeabilidad vascular (Cruden y Newby, Expert Opin. Pharmacol. 9: 2383-90, 2008). Otros ratones fueron tratados con ISIS 482584, que inhibe la expresión de ARNm de PKK. El efecto del tratamiento con HOE-140 se comparó con el efecto del tratamiento con ISIS 482584.
Tratamiento
Los diversos grupos de tratamiento para este ensayo se presentan en la Tabla 61.
El grupo 1 consistió en 4 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J tratados con PBS administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 4 semanas. No se administró ningún otro tratamiento al Grupo 1 que sirviera como grupo de control para medir el nivel basal de permeabilidad vascular.
El grupo 2 consistió en 8 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J tratados con PBS administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 4 semanas. Al final del tratamiento, a los ratones se les administraron intraperitonealmente 20 |jg de captoprilo. El grupo 2 sirvió como grupo de control de PBS para la permeabilidad vascular inducida por captoprilo.
El grupo 3 consistió en 8 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J tratados con PBS administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 4 semanas. El día 14, los ratones fueron tratados con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C1, ISIS 461756, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron intraperitonealmente 20 jg de captoprilo. El grupo 3 sirvió como grupo de control de PBS para captoprilo y permeabilidad vascular inducida por ISIS 461756.
El grupo 4 consistió en 8 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J tratados con PBS administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 4 semanas. El día 14, los ratones fueron tratados con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C1, ISIS 461756, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron intraperitonealmente 20 jg de captoprilo. A los ratones también se les administraron intraperitonealmente 30 jg de HOE-140. El grupo 4 sirvió como control positivo para la inhibición de la permeabilidad vascular con HOE-140.
El grupo 5 consistió en 8 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J tratados con 40 mg/kg de oligonucleótido de control ISIS 141923, un 5-10-5 gápmero MOE sin diana murina conocida, (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC; SEQ ID NO: 2246) administrado por vía subcutánea dos veces por semana por 4 semanas. El día 14, los ratones fueron tratados con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C1, ISIS 461756, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron intraperitonealmente 20 jg de captoprilo. El grupo 5 sirvió como grupo de control para captoprilo y permeabilidad vascular inducida por ISIS 461756.
El grupo 6 consistió en 8 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J y se trató con 40 mg/kg de ISIS 482584 administrados por vía subcutánea dos veces por semana durante 4 semanas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron intraperitonealmente 20 jg de captoprilo. El grupo 6 sirvió como grupo de tratamiento experimental para examinar el efecto de PKK ASO sobre la permeabilidad vascular inducida por captoprilo.
El grupo 7 consistió en 8 ratones C57BL/6J-Tyrc-2J tratados con 40 mg/kg de ISIS 482584 administrados por vía subcutánea dos veces por semana durante 4 semanas. El día 14, los ratones fueron tratados con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C1, ISIS 461756, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 2 semanas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron intraperitonealmente 20 jg de captoprilo. El grupo 7 sirvió como grupo de tratamiento experimental para examinar el efecto de PKK ASO sobre captoprilo y la permeabilidad vascular inducida por ISIS 461756.
Todos los grupos fueron inyectados con 30 mg/kg de solución de Evans Blue en la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron 30 minutos después de la administración de la solución de Evans Blue y se recolectaron colones, pies, orejas e intestinos. Se tomaron muestras de sangre mediante punción cardíaca.
Tabla 61
G r u p o s d e t r a t a m ie n t o
Figure imgf000190_0003
Cuantificación de la permeabilidad vascular
L o s t e j id o s r e c o l e c t a d o s d e lo s p ie s , e l c o l o n , l a s o r e j a s y lo s in t e s t in o s s e c o l o c a r o n p o r s e p a r a d o e n s o l u c i ó n d e f o r m a m id a d u r a n t e la n o c h e p a r a f i l t r a r e l t in t e E v a n s B l u e . L a s o l u c i ó n d e f o r m a m id a q u e c o n t ie n e t e j id o d e o r e j a s y p i e s s e c a l e n t ó a 5 5 ° C y s e d e jó d u r a n t e la n o c h e . L a i n t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c i ó n d e f o r m a m i d a i n f u n d id a c o n t in t e s e m id ió l u e g o a O D 600 nm, y s e p r e s e n t a e n la T a b l a 62. L o s r a t o n e s q u e m u e s t r a n c u a l q u i e r m a n if e s t a c ió n d e a n g i o e d e m a t o m a n m á s t in t e y , p o r lo t a n t o , d e m u e s t r a n v a l o r e s a l t o s d e o D .
Figure imgf000190_0001
P o r lo t a n t o , la i n h ib ic ió n a n t is e n t id o d e l A R N m d e P K K p u e d e s e r b e n e f i c i o s a p a r a e l t r a t a m ie n t o y la p r e v e n c ió n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r , q u e e s s in t o m á t ic a d e l A E H .
Tabla 62
T i n t e d e E v a n s B l u e p a r a m e d ir la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r
Figure imgf000190_0002
Cuantificación de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)
L a c u a n t i f i c a c i ó n d e la t r a n s f e r e n c i a W e s t e r n d e H M W K a p a r t ir d e m u e s t r a s d e s a n g r e s e p r e s e n t a e n la f ig u r a 1. C o m o s e m u e s t r a e n la f ig u r a 1, l a s m u e s t r a s d e lo s G r u p o s 1 y 2 t ie n e n n i v e l e s b a jo s d e H M W K e n c o m p a r a c i ó n c o n lo s G r u p o s 6 y 7 , lo q u e in d ic a q u e la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r s e in v ie r t e e n lo s G r u p o s 6 y 7. A d e m á s , c o m o s e m u e s t r a e n la f ig u r a 1, l a s m u e s t r a s d e l o s G r u p o s 1 y 2 t ie n e n a u m e n t o d e l p r o d u c t o d e e s c i s i ó n d e H M W K e n c o m p a r a c i ó n c o n lo s g r u p o s 6 y 7. P o r lo t a n t o , la f a lt a d e H M W K e s c a u s a d a p o r la e s c i s i ó n d e P K K d e H M W K e n p r o d u c t o s d e e s c i s i ó n ( i n c l u y e n d o b r a d i q u i n i n a y H K a ) .
Ejemplo 12: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad basal y la permeabilidad inducida por captoprilo en ratones
Figure imgf000191_0001
Tratamiento
L o s d i v e r s o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p a r a e s t e e n s a y o s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 63.
E l g r u p o 1 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 4 s e m a n a s . N o s e a d m in is t r ó n in g ú n o t r o t r a t a m ie n t o a l G r u p o 1 q u e s i r v i e r a c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a m e d ir lo s n i v e l e s b a s a l e s d e p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r .
E l g r u p o 2 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 4 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r ó in t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 | jg d e c a p t o p r i l o . E l g r u p o 2 s i r v ió c o m o g r u p o d e c o n t r o l n e g a t iv o p a r a la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r i n d u c i d a p o r c a p t o p r i l o .
E l g r u p o 3 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 4 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m i n i s t r ó p o r v í a i n t r a p e r i t o n e a l 30 j g d e H O E -140. E l g r u p o 3 s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o p a r a la i n h ib ic ió n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l .
E l g r u p o 4 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 4 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r ó i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 j g d e c a p t o p r i l o . L o s r a t o n e s t a m b i é n r e c ib ie r o n in t r a p e r i t o n e a l m e n t e 30 j g d e H O E - 140 . E l g r u p o 4 s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o p a r a la in h ib ic ió n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r in d u c i d a p o r c a p t o p r i l o .
Figure imgf000191_0002
E l g r u p o 6 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n 40 m g / k g d e I S I S 482584 a d m i n i s t r a d o s u b c u t á n e a m e n t e d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 4 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e le s a d m in is t r ó i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 j g d e c a p t o p r i l o . E l g r u p o 6 s i r v ió c o m o g r u p o d e t r a t a m ie n t o e x p e r im e n t a l p a r a e x a m i n a r e l e f e c t o d e I S I S 482584 s o b r e la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r i n d u c id a p o r c a p t o p r i l o . T o d o s lo s g r u p o s f u e r o n in y e c t a d o s c o n 30 m g / k g d e s o l u c ió n d e E v a n s B l u e . L o s r a t o n e s f u e r o n s a c r i f i c a d o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n d e la s o l u c ió n d e E v a n s B l u e y s e r e c o l e c t a r o n c o l o n i a s , p ie s , o r e j a s e in t e s t in o s .
Tabla 63
G r u p o s d e t r a t a m ie n t o
Figure imgf000191_0003
Cuantificación de la permeabilidad vascular.
L o s t e j id o s r e c o g id o s d e lo s p ie s , c o l o n , in t e s t in o y o r e j a s s e c o l o c a r o n p o r s e p a r a d o e n s o l u c ió n d e f o r m a m id a d u r a n t e la n o c h e p a r a f i lt r a r e l t in t e d e E v a n s B l u e . L a s o l u c ió n d e f o r m a m id a q u e c o n t e n í a t e j id o d e p i e s y o r e j a s s e c a l e n t ó a 5 5 ° C y s e d e jó d u r a n t e la n o c h e . L a in t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c ió n d e f o r m a m id a in f u n d id a c o n t in t e s e m id ió l u e g o a O D 600 nm, y s e p r e s e n t a e n la T a b l a 64. L o s r a t o n e s q u e m u e s t r a n c u a l q u i e r m a n i f e s t a c i ó n d e a n g i o e d e m a t o m a n m á s t in t e y , p o r lo t a n t o , d e m u e s t r a n a l t o s v a l o r e s d e O D .
C o m o s e p r e s e n t a e n la T a b l a 64 , lo s r a t o n e s t r a t a d o s c o n I S I S 482584 d e m o s t r a r o n u n a p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r b a s a l r e d u c i d a e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S ( G r u p o 5 f r e n t e a l G r u p o 1 ) . L a r e d u c c i ó n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l p o r t r a t a m ie n t o c o n I S I S 482584 f u e c o m p a r a b l e a la c a u s a d a p o r e l t r a t a m ie n t o c o n H O E - 140 ( G r u p o 3 , q u e s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o ) . L o s r a t o n e s t r a t a d o s c o n I S I S 482584 t a m b ié n d e m o s t r a r o n u n a r e d u c c ió n d e la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r i n d u c id a p o r c a p t o p r i l o e n la m a y o r í a d e lo s t e j id o s e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S ( G r u p o 6 v s . G r u p o 2 ) . L a r e d u c c i ó n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r i n d u c i d a p o r c a p t o p r i l o p o r e l t r a t a m ie n t o c o n I S I S 482584 f u e c o m p a r a b l e a la c a u s a d a p o r e l t r a t a m ie n t o c o n H O E - 14 0 ( G r u p o 4 , q u e s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o ) .
Tabla 64
O D 600 nm d e t in t e d e E v a n s B l u e p a r a m e d ir la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r
Figure imgf000192_0002
Ejemplo 13: Efecto dependiente de la dosis de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad vascular inducida por captoprilo
S e e v a l u ó e l e f e c t o d e d o s i s v a r i a b l e s s o b r e I S I S 482584 s o b r e la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r i n d u c i d a p o r c a p t o p r i l o . Tratamiento
L o s d i v e r s o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p a r a e s t e e n s a y o s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 65.
E l g r u p o 1 c o n s i s t i ó e n 4 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . N o s e a d m in is t r ó n in g ú n o t r o t r a t a m ie n t o a l G r u p o 1 q u e s i r v i e r a c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a m e d ir lo s n i v e l e s b a s a l e s d e p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r .
E l g r u p o 2 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r ó i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 | jg d e c a p t o p r i l o . E l g r u p o 2 s i r v ió c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r in d u c i d a p o r c a p t o p r i l o .
E l g r u p o 3 c o n s i s t i ó e n 4 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r ó i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 j g d e c a p t o p r i l o . L o s r a t o n e s t a m b ié n r e c ib ie r o n in t r a p e r i t o n e a l m e n t e 30 j g d e I c a t ib a n t ( H O E - 140 ) . E l g r u p o 4 s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o p a r a la i n h ib ic ió n d e la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r i n d u c id a p o r c a p t o p r i l o .
Figure imgf000192_0001
T o d o s lo s g r u p o s f u e r o n in y e c t a d o s c o n 30 m g / k g d e s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e e n la v e n a d e la c o l a . L o s r a t o n e s s e s a c r i f i c a r o n 30 m in u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n d e la s o l u c ió n d e E v a n s B l u e y s e r e c o l e c t a r o n c o l o n i a s , p ie s , o r e j a s e in t e s t in o s . S e t o m a r o n m u e s t r a s d e s a n g r e m e d ia n t e p u n c ió n c a r d í a c a .
Tabla 65
G r u p o s d e t r a t a m ie n t o
Figure imgf000192_0003
Cuantificación de la permeabilidad vascular
L o s t e j i d o s r e c o l e c t a d o s s e c o l o c a r o n e n s o l u c ió n d e f o r m a m id a d u r a n t e la n o c h e p a r a f i l t r a r e l t in t e d e E v a n s B l u e . L a s o l u c ió n d e f o r m a m id a q u e c o n t e n í a t e j id o d e p ie s y o r e j a s s e c a l e n t ó a 5 5 ° C y s e d e jó d u r a n t e la n o c h e . L a i n t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c ió n d e f o r m a m id a in f u n d id a c o n t in t e s e m id ió l u e g o a O D 600nm, y s e p r e s e n t a e n la T a b l a 66. L o s r a t o n e s q u e m u e s t r a n c u a l q u i e r m a n if e s t a c ió n d e a n g i o e d e m a t o m a n m á s t in t e y , p o r lo t a n t o , d e m u e s t r a n a l t o s v a l o r e s d e O D .
C o m o s e p r e s e n t a e n la T a b l a 66 , l o s r a t o n e s t r a t a d o s c o n d o s i s m á s a l t a s d e I S I S 482584 ( G r u p o s 4 , 5 y 6 ) t e n í a n n i v e l e s r e d u c i d o s d e p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r i n d u c id a p o r c a p t o p r i l o e n c o m p a r a c i ó n c o n e l g r u p o d e c o n t r o l P B S c o r r e s p o n d ie n t e ( G r u p o 2 ) . L a r e d u c c ió n d e la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r e n r a t o n e s d e e s t o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o ( G r u p o s 4 y 5 ) f u e c o m p a r a b l e a lo s n i v e l e s d e p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l ( c o m o s e m u e s t r a e n e l G r u p o 1 ) , a s í c o m o e n r a t o n e s t r a t a d o s c o n H O E - 14 0 ( G r u p o 3 ) .
Tabla 66
O D 600 nm d e t in t e d e E v a n s B l u e p a r a m e d ir la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r
Figure imgf000193_0002
Cuantificación de fuga vascular
Figure imgf000193_0001
Tabla 67
P o r c e n t a j e d e O D 620mn d e t in t e d e E v a n s B l u e e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l b a s a l P B S p a r a m e d ir la f u g a v a s c u l a r
Figure imgf000193_0003
Ejemplo 14: Efecto dependiente de la dosis de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad basal en ratones
S e e v a l u ó e l e f e c t o d e d o s i s v a r i a b l e s s o b r e I S I S 482584 s o b r e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l .
Tratamiento
L o s d i v e r s o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p a r a e s t e e n s a y o s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 68.
E l g r u p o 1 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . N o s e a d m in is t r ó n in g ú n o t r o t r a t a m ie n t o a l G r u p o 1 q u e s i r v i e r a c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a m e d ir lo s n i v e l e s b a s a l e s d e p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r .
E l g r u p o 2 c o n s i s t i ó e n 4 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r a r o n in t r a p e r i t o n e a l m e n t e 30 | jg d e H O E -140. E l g r u p o 2 s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o p a r a la i n h ib ic ió n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l .
Figure imgf000194_0001
T o d o s lo s g r u p o s f u e r o n in y e c t a d o s c o n 30 m g / k g d e s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e e n la v e n a d e la c o l a . L o s r a t o n e s s e s a c r i f i c a r o n 30 m in u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n d e la s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e y s e r e c o l e c t a r o n c o l o n e s , p i e s y o r e j a s y s e e x a m i n a r o n p a r a d e t e c t a r d e f e c t o s d e p e r m e a b i l i d a d . S e t o m a r o n m u e s t r a s d e s a n g r e m e d ia n t e p u n c ió n c a r d í a c a .
Tabla 68
Figure imgf000194_0002
Cuantificación de la permeabilidad vascular
L o s t e j i d o s r e c o g i d o s d e lo s p ie s , e l c o l o n y l a s o r e j a s s e c o l o c a r o n e n s o l u c i ó n d e f o r m a m i d a d u r a n t e la n o c h e p a r a f i lt r a r e l t in t e d e E v a n s B l u e . L a s o l u c ió n d e f o r m a m id a q u e c o n t e n í a t e j id o d e p i e s y o r e j a s s e c a l e n t ó a 55 ° C y s e d e jó d u r a n t e la n o c h e . L a i n t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c i ó n d e f o r m a m id a in f u n d id a c o n t in t e s e m id ió l u e g o a O D 600nm, y s e p r e s e n t ó e n la T a b l a 69. L o s v a l o r e s m á s a l t o s d e O D e s t á n a s o c i a d o s c o n n i v e l e s m á s a l t o s d e p e r m e a b i l id a d . C o m o s e p r e s e n t a e n la T a b l a 10 , la m a y o r í a d e lo s t e j i d o s d e r a t o n e s t r a t a d o s c o n I S I S 482584 e n t o d a s l a s d o s i s ( G r u p o s 3 - 8 ) d e m o s t r a r o n u n a p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l r e d u c i d a e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S ( G r u p o 1 ) . L a r e d u c c ió n e n la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r b a s a l d e lo s g r u p o s t r a t a d o s c o n o l ig o n u c l e ó t id o s I S I S f u e c o m p a r a b l e a la d e m o s t r a d a e n e l g r u p o d e c o n t r o l p o s it iv o t r a t a d o c o n H O E - 14 0 ( G r u p o 2 ) .
Tabla 69
O D 600 nm d e t in t e d e E v a n s B l u e p a r a m e d ir la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r
Figure imgf000194_0003
Cuantificación de fuga vascular
L a s a n g r e e x t r a íd a p o r p u n c ió n c a r d í a c a s e m e z c l ó i n m e d ia t a m e n t e c o n 3 v e c e s e l v o l u m e n d e e t a n o l h e la d o . L a s o l u c i ó n s e c e n t r i f u g ó a 15 .000 g d u r a n t e 20 m in u t o s a 4 ° C p a r a e l i m i n a r lo s r e s t o s c e l u l a r e s y l a s p r o t e ín a s p l a s m á t i c a s p r e c i p i t a d a s . L o s e x t r a c t o s d e e t a n o l s e p u r i f ic a r o n a d i c i o n a l m e n t e p o r u l t r a f i l t r a c ió n a t r a v é s d e u n f ilt r o M W C O d e 10 k D a . L a in t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c ió n d e p l a s m a e x t r a íd a c o n e t a n o l s e m id ió a O D 620 nm. L o s r e s u l t a d o s s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 70 c o m o p o r c e n t a je d e a u m e n t o o d i s m i n u c i ó n d e l o s v a l o r e s d e O D d e l c o n t r o l d e P B S d e l G r u p o 1. S e e s p e r a b a q u e lo s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p u d ie r a n m o s t r a r v a l o r e s d e O D m á s a l t o s d e b id o a la p é r d id a v a s c u l a r r e d u c id a . T o d o s lo s r a t o n e s e n lo s g r u p o s t r a t a d o s c o n o l ig o n u c l e ó t id o s I S I S d e m o s t r a r o n u n a p é r d id a v a s c u l a r s ig n i f i c a t i v a m e n t e r e d u c i d a e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l n e g a t iv o d e P B S .
Tabla 70
P o r c e n t a j e d e O D 620 nm d e t in t e d e E v a n s B l u e e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l b a s a l P B S p a r a m e d ir la f u g a v a s c u l a r
Figure imgf000195_0004
Cuantificación de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)
L a c u a n t i f ic a c ió n d e la t r a n s f e r e n c i a W e s t e r n d e H M W K a p a r t ir d e m u e s t r a s d e s a n g r e s e p r e s e n t a e n la f ig u r a 2 y l a s T a b l a s 71 y 72.
Figure imgf000195_0001
Tabla 71
C u a n t i f i c a c i ó n d e H M W K p o r d e n s it ó m e t r o
Figure imgf000195_0002
Tabla 72
C u a n t i f i c a c i ó n d e l p r o d u c t o d e e s c i s i ó n H M W K p o r d e n s it ó m e t r o
Figure imgf000195_0003
Ejemplo 15: Terapia de combinación de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PKK y Factor 12 en la permeabilidad vascular inducida por captoprilo en ratones
Figure imgf000196_0001
Tratamiento
L o s d i v e r s o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p a r a e s t e e n s a y o s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 73.
E l g r u p o 1 c o n s i s t i ó e n 4 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . N o s e a d m in is t r ó n in g ú n o t r o t r a t a m ie n t o a l G r u p o 1 q u e s i r v i e r a c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a m e d ir lo s n i v e l e s b a s a l e s d e p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r .
E l g r u p o 2 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r ó i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 | jg d e c a p t o p r i l o . E l g r u p o 2 s i r v ió c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r in d u c i d a p o r c a p t o p r i l o .
E l g r u p o 3 c o n s i s t i ó e n 4 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r ó i n t r a p e r i t o n e a l m e n t e 20 j g d e c a p t o p r i l o . L o s r a t o n e s t a m b i é n r e c ib ie r o n in t r a p e r i t o n e a l m e n t e 30 j g d e H O E - 140 . E l g r u p o 3 s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o p a r a la in h ib ic ió n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r in d u c i d a p o r c a p t o p r i l o .
Figure imgf000196_0002
T o d o s lo s g r u p o s f u e r o n in y e c t a d o s c o n 30 m g / k g d e s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e e n la v e n a d e la c o l a . L o s r a t o n e s s e s a c r i f i c a r o n 30 m in u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n d e la s o l u c ió n d e E v a n s B l u e y s e r e c o l e c t a r o n c o l o n i a s , p ie s , o r e j a s e in t e s t in o s .
Tabla 73
G r u p o s d e t r a t a m ie n t o
Figure imgf000196_0004
Cuantificación de la permeabilidad vascular.
L o s t e j i d o s r e c o g i d o s d e l o s p ie s , e l c o l o n y l a s o r e j a s s e c o l o c a r o n e n s o l u c i ó n d e f o r m a m id a d u r a n t e la n o c h e p a r a f i lt r a r e l t in t e d e E v a n s B l u e . L a s o l u c ió n d e f o r m a m id a q u e c o n t e n í a t e j id o d e p i e s y o r e j a s s e c a l e n t ó a 55 ° C y s e d e jó d u r a n t e la n o c h e . L a i n t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c i ó n d e f o r m a m id a in f u n d id a c o n t in t e s e m id ió l u e g o a O D 600nm, y s e p r e s e n t a e n la T a b l a 74. L o s v a l o r e s m á s a l t o s d e O D e s t á n a s o c i a d o s c o n n i v e l e s m á s a l t o s d e p e r m e a b i l id a d .
Figure imgf000196_0003
Tabla 74
O D 600 nm d e t in t e d e E v a n s B l u e p a r a m e d ir la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r
Figure imgf000197_0003
Ejemplo 16: Terapia combinada de oligonucleótidos antisentido dirigidos a PKK y Factor 12 sobre la permeabilidad vascular basal en ratones
Figure imgf000197_0001
Tratamiento
L o s d i v e r s o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p a r a e s t e e n s a y o s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 75.
E l g r u p o 1 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . N o s e a d m in is t r ó n in g ú n o t r o t r a t a m ie n t o a l G r u p o 1 q u e s i r v i e r a c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a m e d ir lo s n i v e l e s b a s a l e s d e p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r .
E l g r u p o 2 c o n s i s t i ó e n 4 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , a lo s r a t o n e s s e l e s a d m in is t r a r o n in t r a p e r i t o n e a l m e n t e 30 | jg d e H O E -140. E l g r u p o 2 s i r v ió c o m o c o n t r o l p o s it iv o p a r a la i n h ib ic ió n d e la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r b a s a l .
Figure imgf000197_0002
T o d o s lo s g r u p o s f u e r o n in y e c t a d o s c o n 30 m g / k g d e s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e e n la v e n a d e la c o l a . L o s r a t o n e s s e s a c r i f i c a r o n 30 m in u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n d e la s o l u c ió n d e E v a n s B l u e y s e r e c o l e c t a r o n c o l o n i a s , p ie s , o r e j a s e in t e s t in o s .
Tabla 75
G r u p o s d e t r a t a m ie n t o
Figure imgf000197_0004
Cuantificación de la permeabilidad vascular
L o s t e j id o s r e c o l e c t a d o s d e lo s p ie s , c o l o n , in t e s t in o s y o r e j a s s e c o l o c a r o n e n s o l u c ió n d e f o r m a m id a d u r a n t e la n o c h e p a r a f i l t r a r e l t in t e d e E v a n s B l u e . L a s o l u c i ó n d e f o r m a m i d a q u e c o n t e n í a t e j id o d e p i e s y o r e j a s s e c a l e n t ó a 5 5 ° C y s e d e jó d u r a n t e la n o c h e . L a in t e n s id a d d e l c o l o r d e la s o l u c ió n d e f o r m a m id a in f u n d id a c o n t in t e s e m id ió l u e g o a O D 600 nm, y s e p r e s e n t a e n la T a b l a 76. L o s v a l o r e s d e O D m á s a l t o s e s t á n a s o c i a d o s c o n n i v e l e s m á s a l t o s d e p e r m e a b i l id a d .
C o m o s e p r e s e n t a e n la T a b l a 76 , la m a y o r í a d e lo s t e j i d o s d e r a t o n e s t r a t a d o s c o n u n a c o m b i n a c i ó n d e I S I S 482584 e I S I S 410944 e n t o d a s l a s d o s i s ( G r u p o s 2 - 7 ) d e m o s t r a r o n u n a p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r r e d u c id a e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S ( G r u p o 1 ) . L a r e d u c c i ó n e n la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r d e lo s g r u p o s t r a t a d o s c o n o l ig o n u c l e ó t id o s I S I S f u e c o m p a r a b l e a la m i s m a d e m o s t r a d a e n e l g r u p o d e c o n t r o l p o s it iv o t r a t a d o c o n H O E 14 0 ( G r u p o 2 ) . L a c o m b in a c i ó n d e o l ig o n u c l e ó t id o s a n t is e n t id o P K K y F a c t o r 12 d a c o m o r e s u lt a d o u n a d i s m i n u c i ó n s i n é r g i c a d e la p e r m e a b i l id a d . C o m o s e e s p e r a b a , t a m b ié n s e o b s e r v ó u n a d is m i n u c i ó n s i n é r g i c a c o r r e s p o n d ie n t e e n la f u g a v a s c u l a r .
Tabla 76
O D 600 mn d e t in t e d e E v a n s B l u e p a r a m e d ir la p e r m e a b i l id a d v a s c u l a r
Figure imgf000198_0002
Ejemplo 17: Inhibición de la activación de la proteína del factor 12 por ISIS 482584
S e e v a l u ó e l e f e c t o d e la i n h ib ic ió n a n t is e n t id o d e l A R N m d e P K K s o b r e la a c t i v a c i ó n d e la p r o t e ín a d e l F a c t o r 12. Tratamiento
L o s d i v e r s o s g r u p o s d e t r a t a m ie n t o p a r a e s t e e n s a y o s e p r e s e n t a n e n la T a b l a 77.
E l g r u p o 1 c o n s i s t i ó e n 8 r a t o n e s y s e t r a t ó c o n P B S a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . N o s e a d m in is t r ó n in g ú n o t r o t r a t a m ie n t o a l G r u p o 1 q u e s i r v i e r a c o m o g r u p o d e c o n t r o l p a r a m e d ir la a c t i v a c i ó n d e l F a c t o r 12 .
Figure imgf000198_0001
A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , s e r e c o g ió p l a s m a d e l o s r a t o n e s p a r a e l e n s a y o a m id o l í t ic o b a s a d o e n F a c t o r 12 a S p e c t r o z y m e ® p a r a e l F a c t o r 12 e n p l a s m a .
Tabla 77
G r u p o s d e t r a t a m ie n t o
Figure imgf000199_0004
Ensayo para la activación del Factor 12 en plasma
Figure imgf000199_0001
Tabla 78
P o r c e n t a j e d e a c t i v a c i ó n d e l F a c t o r 12 e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l P B S
Figure imgf000199_0005
Ejemplo 18: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad vascular inducida por oligonucleótidos antisentido de C1-INH
Figure imgf000199_0002
A l f in a l d e l p e r ío d o d e t r a t a m ie n t o , t o d o s l o s g r u p o s f u e r o n i n y e c t a d o s c o n 30 m g / k g d e s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e e n la v e n a d e la c o l a . L o s r a t o n e s s e s a c r i f i c a r o n 30 m in u t o s d e s p u é s d e la a d m i n i s t r a c i ó n d e la s o l u c i ó n d e E v a n s B l u e y s e r e c o l e c t a r o n c o l o n i a s , p ie s , o r e j a s e in t e s t in o s . E l h í g a d o t a m b ié n s e c o s e c h ó p a r a e l a n á l i s i s d e A R N .
Análisis de ARN
Figure imgf000199_0003
q u e e l t r a t a m ie n t o c o n I S I S 482584 r e d u j o s ig n i f i c a t i v a m e n t e la e x p r e s i ó n d e P K K .
Tabla 79
P o r c e n t a j e d e in h ib ic ió n d e la e x p r e s i ó n d e A R N m e n r a t o n e s t r a t a d o s c o n I S I S 461756 e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l d e P B S n o t r a t a d o
Figure imgf000200_0004
Cuantificación de la permeabilidad vascular.
Figure imgf000200_0001
Tabla 80
C a m b i o p o r c e n t u a l e n la p e r m e a b i l i d a d v a s c u l a r e n r a t o n e s t r a t a d o s c o n I S I S 461756 e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l d e P B S n o t r a t a d o
Figure imgf000200_0003
Ejemplo 19: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en el modelo de trombosis de la vena cava inferior inducida por FeC3
Figure imgf000200_0002
Tratamiento
T r e s g r u p o s d e 8 r a t o n e s B A L B / c m a c h o s f u e r o n t r a t a d o s c o n 10 m g / k g , 20 m g / k g o 40 m g / k g d e I S I S 482584 , a d m i n i s t r a d o s p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s ( d o s i s s e m a n a l e s d e 20 m g / k g , 40 m g / k g u 80 m g / k g ) . D o s g r u p o s d e c o n t r o l d e 12 r a t o n e s B A L B / c f u e r o n t r a t a d o s c o n P B S , a d m i n i s t r a d o s p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s . D o s d í a s d e s p u é s d e la ú l t im a d o s i s d e o l ig o n u c le ó t id o a n t is e n t id o o P B S , lo s r a t o n e s d e t o d o s lo s g r u p o s s e a n e s t e s i a r o n c o n 150 m g / k g d e k e t a m i n a m e z c l a d a c o n 10 m g / k g d e x i l a z i n a , a d m i n i s t r a d a p o r in y e c c ió n in t r a p e r i t o n e a l . L a f o r m a c ió n d e t r o m b o s s e in d u jo c o n F e C h e n t o d o s lo s g r u p o s d e r a t o n e s a n e s t e s i a d o s , e x c e p t o e l p r im e r g r u p o d e c o n t r o l.
E n r a t o n e s s o m e t i d o s a t r a t a m ie n t o c o n F e C h , s e in d u j o la f o r m a c ió n d e t r o m b o s a p l i c a n d o u n t r o z o d e p a p e l d e f ilt r o ( 2 x 4 m m ) p r e v i a m e n t e s a t u r a d o c o n s o l u c ió n d e F e C h a l 10 % d ir e c t a m e n t e s o b r e la v e n a c a v a . D e s p u é s d e 3 m in u t o s d e e x p o s i c i ó n , s e r e t ir ó e l p a p e l d e f ilt r o . T r e i n t a m in u t o s d e s p u é s d e la a p l i c a c i ó n d e l p a p e l d e f ilt r o , u n a lo n g it u d f i ja d e la v e n a q u e c o n t ie n e e l t r o m b o s e d i s e c c i o n ó p a r a e l a n á l i s i s d e p la q u e t a s . S e r e c o g ió h í g a d o p a r a a n á l i s i s d e A R N .
Cuantificación de la composición plaquetaria
L a c u a n t i f i c a c i ó n p o r P C R e n t ie m p o r e a l d e l f a c t o r p la q u e t a r io 4 ( P F - 4 ) s e u s ó p a r a c u a n t i f i c a r l a s p l a q u e t a s e n la v e n a c a v a c o m o u n a m e d id a d e la f o r m a c ió n d e t r o m b o s . L o s n i v e l e s d e A R N m d e P F - 4 s e m id i e r o n u s a n d o e l c o n ju n t o d e s o n d a s d e c e b a d o r m u r in o m P F 4 _ L T S _ 00086 ( s e c u e n c i a d i r e c t a A G A C C C A T T T C C T C A A G G T A G A A C T , d e s i g n a d a a q u í c o m o S E Q ID N O : 2240 ; s e c u e n c i a i n v e r s a C G C A G C G A C G C T C A T G , d e s i g n a d a a q u í c o m o S E Q ID N O : 224 1 ; s e c u e n c i a d e s o n d a T C T T T G G G T C C A G T G G C A C C C T C T T , d e s i g n a d a e n e s t e d o c u m e n t o c o m o S E Q ID N O : 2242 ) . L o s r e s u l t a d o s s e p r e s e n t a n c o m o u n p o r c e n t a je d e P F - 4 e n r a t o n e s t r a t a d o s c o n o l ig o n u c l e ó t id o s I S I S , e n c o m p a r a c i ó n c o n lo s d o s g r u p o s d e c o n t r o l t r a t a d o s c o n P B S . C o m o s e m u e s t r a e n la T a b l a 81 , e l t r a t a m ie n t o c o n I S I S 482584 r e s u lt ó e n u n a r e d u c c ió n s i g n i f i c a t i v a d e P F - 4 e n c o m p a r a c i ó n c o n e l c o n t r o l d e P B S . P o r lo t a n t o , la r e d u c c ió n d e P K K p o r e l c o m p u e s t o p r o p o r c io n a d o a q u í e s ú t il p a r a in h ib ir la f o r m a c ió n d e t r o m b o s .
Tabla 81
A n á l i s i s d e la f o r m a c ió n d e t r o m b o s m e d ia n t e c u a n t i f i c a c i ó n p o r P C R e n t ie m p o r e a l d e P F - 4 e n e l m o d o d e t r o m b o s i s v e n o s a i n d u c i d a p o r F e C h
Figure imgf000201_0002
Ejemplo 20: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en un ensayo de sangrado de cola S e m id ió e l s a n g r a d o d e la c o l a p a r a o b s e r v a r s i e l t r a t a m ie n t o c o n I S I S 482584 c a u s a u n s a n g r a d o e x c e s i v o o h e m o r r a g i a e n r a t o n e s .
Tratamiento
G r u p o s d e 10 r a t o n e s B A L B / c m a c h o s f u e r o n t r a t a d o s c o n 10 m g / k g , 20 m g / k g o 40 m g / k g d e I S I S 482584 , a d m i n i s t r a d o s p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s ( d o s i s s e m a n a l e s d e 20 m g / k g , 40 m g / k g u 80 m g / k g ) . U n g r u p o d e c o n t r o l d e 8 r a t o n e s B A L B / c f u e t r a t a d o c o n P B S , a d m in is t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s .
Ensayo de sangrado de cola
D o s d í a s d e s p u é s d e l t r a t a m ie n t o f in a l d e lo s o l ig o n u c l e ó t id o s I S I S o P B S , lo s r a t o n e s s e c o l o c a r o n e n u n a c á m a r a d e s a n g r a d o d e la c o l a . L o s r a t o n e s f u e r o n a n e s t e s i a d o s e n la c á m a r a c o n is o f l u r a n o . L u e g o , s e c o r t ó u n p e q u e ñ o t r o z o d e c o l a ( a p r o x im a d a m e n t e 4 m m d e s d e la p u n t a ) c o n u n a s t i j e r a s e s t é r i l e s . L a c o l a c o r t a d a s e c o l o c ó in m e d ia t a m e n t e e n u n t u b o F a l c o n d e 15 m l l le n o c o n a p r o x i m a d a m e n t e 10 m l d e s o l u c i ó n t a m p ó n d e N a C l a l 0 , 9 % c a l e n t a d a a 37 ° C . L a s a n g r e s e r e c o g ió e n e l t r a n s c u r s o d e 40 m in u t o s . L o s t u b o s l l e n o s d e s o l u c ió n s a l i n a s e p e s a r o n a n t e s y d e s p u é s d e l s a n g r a d o . L o s r e s u l t a d o s s e p r o p o r c io n a n e n la T a b l a 82.
Figure imgf000201_0001
Tabla 82
E n s a y o d e s a n g r a d o d e la c o l a d e s p u é s d e l t r a t a m ie n t o c o n I S I S 482584
Figure imgf000201_0003
Ejemplo 21: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en el modelo de trombosis mesentérica inducida por FeCh
I S I S 482584 s e e v a l u ó e n e l m o d e lo d e r a t ó n c o n t r o m b o s i s m e s e n t é r i c a i n d u c i d a p o r F e C h .
Tratamiento
U n g r u p o d e 6 - 8 r a t o n e s S w i s s - W e b s t e r f u e t r a t a d o c o n 40 m g / k g d e I S I S 482584 , a d m i n i s t r a d o p o r v í a s u b c u t á n e a d o s v e c e s p o r s e m a n a d u r a n t e 3 s e m a n a s ( d o s i s s e m a n a l d e 80 m g / k g ) . U n g r u p o d e c o n t r o l d e 6 r a t o n e s S w i s s Webster fue tratado con PBS, administrado por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas. Dos días después de la última dosis de oligonucleótido antisentido o PBS, los ratones de todos los grupos fueron anestesiados con 75 mg/kg de ketamina mezclada con 25 mg/kg de xilazina, administrada por inyección subcutánea.
Se inyectó por vía subcutánea tinte de rodamina 6G a una dosis de 5 mg/kg para teñir las plaquetas. Se inyectó un anticuerpo anti-fibrinógeno marcado con Alexa-647 a una dosis de 1 mg/kg mediante inyección en la vena de la cola para teñir fibrina. El abdomen fue abierto por una incisión media. El mesenterio visceral se extendió sobre un cubreobjetos de vidrio y las arteriolas mesentéricas (70-120 pm) se localizaron mediante observación bajo un microscopio. La formación de trombos se indujo mediante la aplicación de hilos de algodón (2 x 0,3 mm) previamente saturados con una solución de FeCh 6 al 6% directamente en el recipiente diana. Después de tres minutos de exposición, se retiró el hilo y se registraron las intensidades de color de ambos tintes mediante microscopía fluorescente (microscopio de escaneo láser confocal Olympus FluoView 1000) con filtros apropiados durante 70 minutos.
Los resultados para la agregación plaquetaria en los grupos de control y tratamiento se presentan en la Tabla 83, expresados en unidades arbitrarias (a.u.). La agregación plaquetaria se redujo en ratones tratados con ISIS 482584 a una dosis de 80 mg/kg/semana en comparación con los ratones tratados con PBS. Los resultados para la formación de fibrina en los grupos de control y tratamiento se presentan en la Tabla 84, también expresados en unidades arbitrarias (a.u.). La formación de fibrina se redujo en ratones tratados con ISIS 482584 a una dosis de 80 mg/kg/semana en comparación con los ratones tratados con PBS. Por lo tanto, estos resultados sugieren que ISIS 482584 inhibe la formación de trombos.
Tabla 83
Análisis de la agregación plaquetaria mediante medición en tiempo real de la intensidad fluorescente (a.u.) en un modelo de trombo mesentérico inducido por FeCh
Figure imgf000202_0001
Tabla 84
Análisis de la formación de fibrina por medición en tiempo real de la intensidad fluorescente (a.u.) en un modelo de trombo mesentérico inducido por FeCh
Figure imgf000202_0002
(Continuación)
Figure imgf000203_0002
Ejemplo 22: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en el modelo de trombosis de vena cava inferior inducida por estenosis
ISIS 482584 se evaluó en el modelo de trombosis de vena cava inferior (VCI) inducida por estenosis. La reducción del flujo sanguíneo y el daño endotelial son características de este modelo, también conocido como el modelo de St. Tomas.
Tratamiento
Cuatro grupos de 6-8 ratones BALB/c fueron tratados con 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de ISIS 482584, administrados por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas (dosis semanales de 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg). Un grupo de control de 8 ratones BALB/c fue tratado con PBS, administrado subcutáneamente dos veces por semana durante 3 semanas. Dos días después de que se administrara la última dosis de oligonucleótido antisentido o PBS, los ratones de todos los grupos se anestesiaron con isoflurano inhalante al 2,5%. La VCI de los ratones se expuso a través de una incisión abdominal en la línea media debajo de la vena renal izquierda, y se separó de la aorta abdominal mediante disección roma. Se colocó una corbata de seda 6-0 (Ethicon, Reino Unido) detrás del vaso sanguíneo justo debajo de la vena renal izquierda y se colocó una sutura metálica 4-0 (Ethicon, Reino Unido) longitudinalmente sobre el VCI para atar la corbata de seda en la parte superior. Luego se retiró la sutura metálica. Se colocaron dos clips quirúrgicos neurovasculares (Braun Medical Inc, PA) en dos posiciones de separación marina debajo de la ligadura durante 20 segundos cada uno, después de lo cual se retiraron. El contenido de la cavidad abdominal se reemplazó y el abdomen se cerró. Después de 24 horas, se expuso el VCI y se verificó la formación de trombos. Todos los trombos formados se recogieron y fijaron en formalina al 10% durante 24 horas.
Se pesaron los trombos y los resultados se presentan en la Tabla 85, expresados en miligramos. Como lo demuestran los resultados, el tratamiento con dosis crecientes de ISIS 482584 resultó en la disminución correspondiente en el peso del trombo. Los resultados indican que la inhibición antisentido de PKK es útil para inhibir la formación de trombos.
Tabla 85
Pesos de trombos en el modelo de trombosis de VCI inducida por estenosis
Figure imgf000203_0001

Claims (1)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S
    1. U n c o m p u e s t o q u e c o m p r e n d e u n o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o q u e c o n s t a d e 12 a 30 n u c l e ó s i d o s u n id o s y q u e t ie n e u n a s e c u e n c i a d e n u c l e o b a s e q u e c o m p r e n d e a l m e n o s 8 n u c l e o b a s e s c o n s e c u t i v a s q u e s o n 10 0 % c o m p l e m e n t a r i a s a u n a p o r c ió n d e lo n g it u d ig u a l d e n u c l e o b a s e s 27427 - 274 66 d e S E Q ID N O : 10 , e n d o n d e la s e c u e n c i a d e n u c l e o b a s e d e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o e s a l m e n o s 9 0 % c o m p l e m e n t a r i a a la S E Q ID N O : 10 , m e d id a e n la t o t a l id a d d e l o l i g o n u c le ó t id o m o d if ic a d o .
    2. E l c o m p u e s t o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 1, e n d o n d e e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o e s u n o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o m o n o c a t e n a r i o .
    3. E l c o m p u e s t o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 1 o la r e i v i n d i c a c i ó n 2 , e n d o n d e a l m e n o s u n e n l a c e i n t e m u c l e ó s id o d e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o e s u n e n l a c e in t e m u c l e ó s i d o m o d if ic a d o .
    4. E l c o m p u e s t o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 3 , e n d o n d e e l a l m e n o s u n e n l a c e in t e m u c l e ó s id o m o d if ic a d o e s u n e n l a c e in t e m u c l e ó s i d o f o s f o r o t io a t o , o p c io n a l m e n t e e n d o n d e c a d a e n l a c e i n t e m u c l e ó s id o e s u n e n l a c e i n t e m u c l e ó s id o f o s f o r o t io a t o .
    5. E l c o m p u e s t o d e c u a l q u i e r r e i v i n d i c a c i ó n p r e c e d e n t e , e n d o n d e a l m e n o s u n n u c l e ó s i d o d e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o c o m p r e n d e u n a n u c l e o b a s e m o d if ic a d a , o p c io n a l m e n t e e n d o n d e la a l m e n o s u n a n u c l e o b a s e m o d if ic a d a e s u n a 5 - m e t i l c i t o s i n a .
    6. E l c o m p u e s t o d e c u a l q u i e r r e i v i n d i c a c i ó n p r e c e d e n t e , e n d o n d e e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o c o m p r e n d e a l m e n o s u n a z ú c a r m o d if ic a d o .
    7. E l c o m p u e s t o d e la r e i v i n d i c a c i ó n 6 , e n d o n d e :
    ( i) e l a z ú c a r m o d if ic a d o e s u n a z ú c a r b ic íc l i c o , o p c io n a l m e n t e e n d o n d e e l a z ú c a r b i c í c l i c o s e s e l e c c i o n a e n t r e e t i lo , A N B y E N A r e s t r in g id o s ; o
    ( i i ) e l a z ú c a r m o d if ic a d o e s u n n u c l e ó s i d o s u s t it u i d o e n 2 ' , o p c io n a l m e n t e e n d o n d e e l n u c l e ó s i d o s u s t it u i d o e n 2 ' c o m p r e n d e u n s u s t i t u y e n t e e n 2 ' s e l e c c i o n a d o e n t r e : 2 - O C H 3 , 2 ' - F y 2 ' - O - m e t o x i e t i l o .
    8. E l c o m p u e s t o d e c u a l q u i e r r e i v i n d i c a c i ó n p r e c e d e n t e , e n d o n d e e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o c o m p r e n d e : u n s e g m e n t o d e s e p a r a c i ó n q u e c o n s i s t e e n d e s o x i n u c l e ó s i d o s u n id o s ;
    u n s e g m e n t o d e a l a 5 ' q u e c o n s i s t e e n n u c l e ó s i d o s u n id o s ;
    y u n s e g m e n t o d e a l a 3 ' q u e c o n s i s t e e n n u c l e ó s i d o s u n id o s ;
    e n d o n d e e l s e g m e n t o d e s e p a r a c i ó n s e c o l o c a e n t r e e l s e g m e n t o d e a l a 5 ' y e l s e g m e n t o d e a l a 3 ' y e n d o n d e c a d a n u c l e ó s i d o d e c a d a s e g m e n t o d e a l a c o m p r e n d e u n a z ú c a r m o d if ic a d o .
    9. E l c o m p u e s t o d e c u a l q u i e r r e i v i n d i c a c i ó n p r e c e d e n t e , e n d o n d e e l o l ig o n u c l e ó t id o m o d if ic a d o c o n s i s t e e n 16 , 17 , 18 , 19 o 20 n u c l e ó s i d o s u n id o s .
    10 . E l c o m p u e s t o d e c u a l q u i e r r e i v i n d i c a c i ó n p r e c e d e n t e , e n d o n d e :
    ( i) la s e c u e n c i a d e n u c l e o b a s e d e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o c o n s i s t e e n S E Q ID N O : 567 , 568 , 569 , 570 , 57 1, 572 , 573 , 574 o 575 ; o
    ( ii) la s e c u e n c i a d e n u c l e o b a s e d e l o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o c o n s i s t e e n S E Q ID N O : 570.
    11 . U n c o m p u e s t o q u e c o n s i s t e e n u n o l ig o n u c le ó t id o m o d if ic a d o d e a c u e r d o c o n la s ig u i e n t e f ó r m u la : T e s G e s m C e s A e s A e s G d s T d s m C d s T d s m C d s T d s T d s G d s G d s m C d s A e s A e s A e s m C e s A e ( S E Q ID N O : 570 ) ; e n d o n d e , A = u n a a d e n i n a ,
    m C = u n a 5 ' - m e t i l c i t o s i n a
    G = u n a g u a n i n a ,
    T = u n a t im i n a ,
    e = u n n u c l e ó s i d o m o d if ic a d o c o n 2 ' - O - m e t o x i e t i l o ,
    d = u n 2 ' - d e s o x i n u c l e ó s i d o y
    s = u n e n l a c e i n t e m u c l e ó s id o d e f o s f o r o t io a t o .
    12. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado, en donde el oligonucleótido modificado es un separador formado por un segmento de ala 5', un segmento de separación central y un segmento de ala 3', en donde:
    el segmento del ala 5' consiste en cinco nucleósidos de 2'-O-metoxietilo,
    el segmento del espacio central consiste en diez p-D-desoxirribonucleósidos, y
    el segmento del ala 3' consiste en cinco nucleósidos de 2'-O-metoxietilo,
    en donde el oligonucleótido modificado tiene secuencia de nucleobase 5-TGCAAGTCTCTTGGCAAACA-3' (SEQ ID NO: 570), en donde cada citosina es una 5-metilcitosina, y en donde los enlaces intemucleósidos del oligonucleótido modificado son enlaces de fosforotioato.
    13. Un compuesto antisentido conjugado que comprende el compuesto de cualquier reivindicación precedente.
    14. Una sal de un oligonucleótido modificado, en donde el anión del oligonucleótido modificado está de acuerdo con la siguiente estructura:
    Figure imgf000205_0001
    (SEQ ID NO: 570), opcionalmente en donde la sal es una sal de sodio.
    15. Una composición farmacéutica que comprende o que consiste esencialmente en el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, el compuesto antisentido conjugado de la reivindicación 13, o la sal de la reivindicación 14, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en donde el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    16. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, un compuesto antisentido conjugado de la reivindicación 13, una sal de la reivindicación 14, o una composición farmacéutica de la reivindicación 15 para usar en terapia, opcionalmente para usar en un método de prevención, tratamiento o mejorar una enfermedad, trastorno o afección asociada a PKK en un animal que lo necesite, preferiblemente en donde la enfermedad, trastorno o afección asociada a PKK es un angioedema hereditario (AEH), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular, edema cerebral, trombosis, embolia, tromboembolia, trombosis de vena profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, derrame o infarto y en donde el animal es un humano.
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