ES2909308T3 - Métodos para modular la expresión de MECP2 - Google Patents
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Abstract
Un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico de MECP2 para su uso en el tratamiento del síndrome de duplicación de MECP2.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para modular la expresión de MECP2
Declaración de apoyo gubernamental
[0001] Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo P30HD024064 y 5R01NS057819 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Campo
[0002] Se proporcionan métodos para modular la expresión del ARNm y la proteína de la proteína 2 de unión a metil CpG (MECP2) en un animal. Dichos métodos son útiles para tratar, prevenir o mejorar trastornos neurológicos, incluido el síndrome de duplicación de MECP2, al reducir la expresión y la cantidad de ARNm y proteína de MECP2 en un animal.
Antecedentes
[0003] La proteína 2 de unión a metil CpG (MECP2) se encuentra en el cromosoma Xq28 y juega un papel fundamental en la epigenética, controlando los estados de la cromatina y la expresión de miles de genes (Chahrour et al., Science, 2008, 320:1224-1229; Nan y col., Nature, 1998, 393:386-389, Jones y col., Nat. Genet., 1998, 19:187-191). La expresión de MECP2 debe mantenerse dentro de un intervalo bastante estrecho para asegurar la expresión génica y la función neuronal adecuadas (Nan et al., Nature, 1988, 393:386-389). El síndrome de duplicación de MECP2 causado por la sobreexpresión de MECP2 se caracteriza por autismo, discapacidad intelectual, disfunción motora, ansiedad, epilepsia, infecciones recurrentes del tracto respiratorio y muerte prematura, típicamente en hombres (Ramocki et al., Am J Med Genet A, 2010, 152A: 1079-1088). La subexpresión de MECP2 se asocia con el síndrome de Rett, que se caracteriza por un crecimiento y desarrollo tempranos normales seguidos de un desarrollo más lento, pérdida del uso de las manos con un propósito determinado, movimientos característicos de las manos, crecimiento lento del cerebro y la cabeza, problemas para caminar, convulsiones y discapacidad intelectual, típicamente en mujeres (Weaving et al., J Med Genet, 2005, 42:1 -7).
[0004] Actualmente hay una falta de opciones aceptables para tratar dichos trastornos neurológicos.
[0005] Los antagonistas de los receptores GABAA pueden ofrecer una posible objetivo terapéutica para el tratamiento del síndrome de duplicación de MECP2 (Elisa et al., Neuropsychopharmacology, 2014, 39:1946-1954).
[0006] Por lo tanto, un objeto del presente documento es proporcionar métodos para el tratamiento de dichos trastornos.
Resumen
[0007] La invención proporciona un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico de MECP2 para su uso en el tratamiento del síndrome de duplicación de MECP2. Las formas de realización de la invención se definen en las reivindicaciones.
[0008] En el presente documento se describen métodos para modular la expresión y la cantidad de ARNm y proteína de la proteína 2 de unión a metil CpG (MECP2). Los compuestos útiles para modular la expresión y la cantidad de ARNm y proteína de MECP2 pueden ser compuestos antisentido. Los compuestos antisentido pueden ser oligonucleótidos antisentido modificados.
[0009] La modulación puede ocurrir en una célula o tejido. La célula o tejido puede estar en un animal. El animal puede ser un humano. Los niveles de ARNm de MECP2 pueden reducirse o los niveles de proteína MECP2 pueden reducirse. Tal reducción puede ocurrir de manera dependiente del tiempo o de manera dependiente de la dosis.
[0010] También se describen métodos útiles para prevenir, tratar y mejorar los trastornos y síndromes asociados con la sobreexpresión de MECP2. Un trastorno asociado con la sobreexpresión de MECP2 puede ser un trastorno neurológico. El trastorno neurológico puede ser el síndrome de duplicación MECP2. El síndrome de duplicación de MECP2 puede caracterizarse por tener copias adicionales de MECP2, lo que conduce a una sobreexpresión de MECP2.
[0011] El síndrome de duplicación de MECP2 se puede caracterizar por autismo, discapacidad intelectual, disfunción motora, ansiedad, epilepsia, infecciones recurrentes del tracto respiratorio y muerte prematura. El síndrome de duplicación MECP2 puede heredarse con un patrón ligado al X.
[0012] Los métodos de tratamiento pueden incluir la administración de un compuesto antisentido de MECP2 a un individuo que lo necesite. Los métodos de tratamiento pueden incluir la administración de un oligonucleótido antisentido modificado con MECP2 a un individuo que lo necesite.
[0013] Los niveles de MECP2 pueden reducirse lo suficiente para prevenir, tratar y mejorar los síntomas del síndrome de
duplicación de MECP2, pero no lo suficiente como para causar síntomas del síndrome de Rett.
Breve descripción de los dibujos
[0014] La Figura 1 muestra trazas de EEG representativas para ratones WT, ratones MECP2-TG1 sin tratamiento con Isis N° 628785 y ratones MECP2-TG1 que recibieron tratamiento con Isis N° 628785.
Descripción detallada
[0015] Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica. En este documento, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en este documento, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, como se usa en este documento, el uso de "y" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
[0016] Los encabezados de las secciones que se utilizan en este documento tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación del tema descrito.
Definiciones
[0017] A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con la química analítica, la química orgánica sintética y la química farmacéutica y médica descritas en este documento, y los procedimientos y técnicas de las mismas, son bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Pueden utilizarse técnicas estándar para la síntesis química y el análisis químico.
[0018] A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-OCH2CH2-OCH3 y MOE) se refiere a una modificación O-metoxietilo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
[0019] "Nucleósido 2'-MOE" (también nucleósido 2'-O-metoxietilo) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-MOE.
[0020] "Nucleósido sustituido en 2'" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En ciertas formas de realización, los nucleósidos sustituidos en 2' incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcar bicíclicas.
[0021] "5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
[0022] "Administrado de forma concomitante" se refiere a la coadministración de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiestan en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una sola composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes farmacéuticos se manifiesten al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no necesitan ser coextensivos.
[0023] "Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, entre otros, la administración por parte de un profesional médico y la autoadministración.
[0024] "Mejoría" se refiere a una disminución, ralentización, detención o inversión de al menos un indicador de la gravedad de un síndrome o afección. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la materia.
[0025] "Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
[0026] "Anticuerpo" se refiere a una molécula caracterizada por reaccionar específicamente con un antígeno de alguna manera, donde el anticuerpo y el antígeno se definen cada uno en términos del otro. El anticuerpo puede referirse a una molécula de anticuerpo completa o cualquier fragmento o región de la misma, como la cadena pesada, la cadena ligera, la región Fab y la región Fc.
[0027] "Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, la actividad antisentido es una disminución
en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificada por tal ácido nucleico objetivo.
[0028] "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos monocatenarios y bicatenarios, tales como oligonucleótidos antisentido, siARN, shARN, ssARN y compuestos basados en ocupación.
[0029] "Inhibición antisentido" o "inhibición" significa reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o en ausencia del compuesto antisentido.
[0030] Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico objetivo, en los que el resultado o efecto de la hibridación es la degradación de la objetivo o la ocupación de la objetivo con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, la transcripción o empalme.
[0031] "Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de nucleobase que permite la hibridación con un segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo.
[0032] "Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el apareamiento preciso de bases de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediado por unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido entre nucleobases correspondientes.
[0033] "Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado por el puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
[0034] "Nucleósido bicíclico" (también BNA) significa un nucleósido que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando así un sistema de anillo bicíclico. En ciertas formas de realización, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
[0035] "Estructura de caperuza" o "resto de caperuza terminal" significa modificaciones químicas que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
[0036] "cEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene un resto de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2', en el que el puente tiene la fórmula: 4 '-CH(CH3)-O-2 '.
[0037] "Nucleósido de etilo restringido" (también nucleósido cEt) significa un nucleósido que comprende un resto de azúcar bicíclico que comprende un puente 4 '-CH(CH3)-O-2 '.
[0038] "Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que es de alguna manera químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
[0039] "Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas, cada posición tiene una pluralidad de subunidades.
[0040] "Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una sola composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma o diferente vía de administración. La coadministración abarca la administración paralela o secuencial.
[0041] "Complementariedad" significa la capacidad de emparejamiento entre bases nitrogenadas de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
[0042] Se entenderá que "comprende", "incluye" y "que comprende" implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
[0043] "Bases nitrogenadas contiguas" significa bases nitrogenadas inmediatamente adyacentes entre sí.
[0044] "Diseñar" o "diseñado para" se refiere al proceso de diseñar un compuesto oligomérico que se hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
[0045] "Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en fármacos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.
[0046] "Dosis" significa una cantidad específica de un agente farmacéutico proporcionado en una sola administración, o en un período de tiempo específico. En ciertas formas de realización, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en determinadas formas de realización en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se acomoda fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En determinadas formas de realización, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis pueden establecerse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
[0047] "Cantidad efectiva" en el contexto de modular una actividad o de tratar o prevenir una condición significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un individuo que necesita tal modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que es eficaz para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento o profilaxis o mejora de esa condición. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
[0048] "Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
[0049] "Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y operativas en una célula. Dichas estructuras incluyen, pero no se limitan a los productos de transcripción y traducción.
[0050] "Totalmente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En determinadas formas de realización, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
[0051] "Gápmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o de los nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna puede denominarse "brecha" y las regiones externas pueden denominarse "alas".
[0052] "Hibridación" significa la hibridación de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen, pero no se limitan a un oligonucleótido antisentido y una objetivo de ácido nucleico.
[0053] "Identificar un animal que tiene un trastorno asociado con MECP2" significa identificar un animal que ha sido diagnosticado con un trastorno asociado a MECP2 o predispuesto a desarrollar un trastorno asociado a MECP2. Los individuos predispuestos a desarrollar un trastorno asociado con MECP2 incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar un trastorno asociado con MECP2, incluyendo antecedentes personales o familiares o predisposición genética a uno o más trastornos asociados con MECP2. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluida la evaluación del historial médico de una persona y las pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como las pruebas genéticas.
[0054] "Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
[0055] "Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
[0056] "Inhibir MECP2" significa reducir el nivel o la expresión de un ARNm y/o proteína de MECP2. En determinadas formas de realización, los niveles de proteína y/o ARNm de MECP2 se inhiben en presencia de un compuesto antisentido dirigido a MECP2, incluido un oligonucleótido antisentido dirigido a MECP2, en comparación con la expresión de los niveles de proteína y/o ARNm de MECP2 en ausencia de un compuesto antisentido de MECP2, tal como un oligonucleótido antisentido.
[0057] "Inhibición de la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de expresión o actividad.
[0058] "Enlace internucleósido" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
[0059] "Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes unidos entre sí por un enlace internucleósido.
[0060] "Compuesto antisentido de MECP2" significa un compuesto antisentido dirigido a MECP2.
[0061] "MECP2" significa la proteína 2 de unión a metil CpG del gen de mamífero (MECP2), que incluye la proteína 2 de unión a metil CpG del gen humano (MECP2). El MECP2 humano se ha mapeado en el cromosoma humano Xq28.
[0062] "Trastorno asociado a MECP2" significa cualquier trastorno o síndrome asociado con cualquier ácido nucleico de MECP2 o producto de expresión del mismo. Dichos trastornos pueden incluir un trastorno neurológico. Dichos trastornos neurológicos pueden incluir el síndrome de duplicación MECP2.
[0063] "Ácido nucleico de MECP2" significa cualquier ácido nucleico que codifica MECP2. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, un ácido nucleico de MECP2 incluye una secuencia de ADN que codifica MECP2, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica MECP2 (incluido el ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica MECP2.
[0064] "ARNm de MECP2" significa cualquier producto de expresión de ARN mensajero de una secuencia de ADN que codifica MECP2.
[0065] "Proteína MECP2" significa el producto de expresión polipeptídica de un ácido nucleico de MECP2.
[0066] "Desemparejamiento" o "base nitrogenada no complementaria" se refiere al caso en el que una base nitrogenada de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la base nitrogenada correspondiente de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico objetivo.
[0067] "Enlace internucleósido modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleósido de origen natural (es decir, un enlace internucleósido fosfodiéster).
[0068] "Base nitrogenada modificada" significa cualquier base nitrogenada distinta de adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una base nitrogenada no modificada significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
[0069] "Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado y/o una nucleobase modificada.
[0070] "Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleósido modificado y/o una nucleobase modificada.
[0071] "Oligonucleótido antisentido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un enlace internucleósido modificado, azúcar modificado y/o base nitrogenada modificada.
[0072] "Azúcar modificado" significa sustitución y/o cualquier cambio de un resto de azúcar natural.
[0073] "Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a nucleósidos y nucleótidos, ya sean naturales o modificados.
[0074] "Motivo" significa el patrón de nucleósidos no modificados y modificados en un compuesto antisentido.
[0075] "Fracción de azúcar natural" significa una fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o en el ARN (2'-OH).
[0076] "Enlace internucleósido de origen natural" significa un enlace fosfodiéster de 3' a 5'.
[0077] "Base nitrogenada no complementaria" se refiere a un par de bases nitrogenadas que no forman enlaces de hidrógeno entre sí ni apoyan la hibridación de otro modo.
[0078] "Ácido nucleico” se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, entre otros, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos nucleicos pequeños de interferencia (siARN) y microARN (miARN).
[0079] "Nucleobase" significa un resto heterocíclico capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico.
[0080] "Complementariedad de nucleobase" se refiere a una nucleobase que es capaz de aparearse con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria a la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria al uracilo (U). En ciertas formas de realización, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de aparearse con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en cierta posición de un ácido nucleico objetivo, entonces se considera que la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo es complementaria en ese par de nucleobases.
[0081] "Secuencia de nucleobase" significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobase.
[0082] "Nucleósido" significa una nucleobase unida a un azúcar.
[0083] "Mimético de nucleósido" incluye aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósido que tienen morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, miméticos de azúcar biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no furanosa. Los miméticos de nucleótidos incluyen aquellas estructuras utilizadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N(H)-C(=O)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto del azúcar se superpone con el término un poco más amplio mimético de nucleósido, pero pretende indicar el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) únicamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en el presente documento son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en el que el grupo de azúcar furanosa ha sido reemplazado por un sistema de anillos de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que se sustituyen por un azúcar, una nucleobase y/o un enlace internucleósido. En general, se usa un mimético en lugar del azúcar o la combinación de enlace azúcar-internucleósido, y la nucleobase se mantiene para la hibridación con un objetivo seleccionado.
[0084] "Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido.
[0085] "Efecto fuera del objetivo" se refiere a un efecto biológico no deseado o perjudicial asociado con la modulación de la expresión de ARN o proteína de un gen distinto del ácido nucleico objetivo previsto.
[0086] "Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas unidas que es capaz de hibridarse con al menos una región de una molécula de ácido nucleico.
[0087] "Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede estar modificado o sin modificar, independientemente uno de otro.
[0088] "Administración parenteral" significa administración mediante inyección (p. ej., inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye la administración subcutánea, la administración intravenosa, la administración intramuscular, la administración intraarterial, la administración intraperitoneal o la administración intracraneal, por ejemplo, la administración intratecal o intracerebroventricular.
[0089] "Péptido" significa una molécula formada al unir al menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Sin limitación, como se usa en este documento, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
[0090] "Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas formas de realización, un oligonucleótido antisentido dirigido a MECP2 es un agente farmacéutico.
[0091] "Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril.
[0092] "Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento.
[0093] "Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
[0094] "Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos donde el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puente con un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleósido modificado.
[0095] "Parte" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En determinadas formas de realización, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, una parte es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
[0096] "Prevenir" o "que previene" se refiere a retrasar o prevenir el inicio o desarrollo de un trastorno o síndrome durante un período de tiempo de minutos a días, semanas a meses o indefinidamente.
[0097] "Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un fármaco) dentro del cuerpo o sus células por la acción de enzimas endógenas u otras sustancias químicas y/o condiciones.
[0098] "Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
[0099] "Región" se define como una parte del ácido nucleico objetivo que tiene al menos una estructura, función o característica identificable.
[0100] "Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la parte de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos se pueden modificar con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
[0101] "Sal" significa una(s) sal(es) fisiológica y farmacéuticamente aceptable(s) de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados al mismo.
[0102] Los "segmentos" se definen como partes más pequeñas o subporciones de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.
[0103] Las versiones "reducidas" o "truncadas" de los oligonucleótidos antisentido enseñados aquí tienen uno, dos o más nucleósidos eliminados.
[0104] "Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas de los efectos deseados. En ciertas formas de realización, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el lugar de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso central y miopatías.
[0105] "Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.
[0106] "Sitios", como se usa en el presente documento, se definen como posiciones de nucleobase únicas dentro de un ácido nucleico objetivo.
[0107] "Progresión más lenta" significa disminución en el desarrollo del trastorno o síndrome.
[0108] "Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, mientras que muestra efectos mínimos o nulos sobre los ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se se desea la unión, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
[0109] Las "condiciones de hibridación estrictas" o "condiciones estrictas" se refieren a las condiciones en las que un compuesto oligomérico se hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.
[0110] "Dirigido a" o "que se dirige a" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
[0111] "Ácido nucleico objetivo", "ARN objetivo" y "transcrito de ARN objetivo" y "objetivo de ácido nucleico" significan un ácido nucleico capaz de ser dirigido por compuestos antisentido. En determinadas formas de realización, el ácido nucleico objetivo es un ácido nucleico de MECP2.
[0112] "Región objetivo" significa una parte de un ácido nucleico objetivo al que se dirigen uno o más compuestos antisentido.
[0113] "Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5'" se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3'" se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
[0114] "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
[0115] "Tratar" o "tratado" o "tratamiento" se refiere a administrar una composición para efectuar una alteración o mejora del trastorno o síndrome.
[0116] "Bases nitrogenadas no modificadas" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
[0117] " Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases, restos de azúcar y enlaces internucleósidos de origen natural. En ciertas formas de realización, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
[0118] "Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión incrementada por un ácido nucleico objetivo o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Ciertas divulgaciones
[0119] En el presente documento se describen métodos para inhibir la expresión de proteínas y ARNm de MECP2. En el presente documento se describen métodos, compuestos y composiciones para disminuir los niveles de proteína y ARNm de MECP2.
[0120] En el presente documento se describen compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de MECP2. El ácido nucleico de MECP2 puede ser 2. la secuencia establecida en el número de acceso de GENBANK NM_004992.3 (incorporado aquí como SEQ ID NO:1) y el complemento del número de acceso de GENBANK NT_167198.1 truncado de los nucleótidos 4203000 a 4283000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2).
[0121] En el presente documento se describen métodos para el tratamiento, prevención o mejora de trastornos y síndromes asociados con MECP2 en un individuo que lo necesita. También se contemplan métodos para la preparación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de un trastorno o síndrome asociado con MECP2. Los trastornos y síndromes asociados con MECP2 incluyen trastornos neurológicos. Los trastornos asociados con MECP2 incluyen el síndrome de duplicación de MECP2.
Compuestos antisentido
[0122] Los compuestos oligoméricos incluyen, entre otros, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y siARN. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno.
[0123] En determinadas formas de realización, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige. En ciertas formas de realización de este tipo, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige.
[0124] En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 12 a 30 subunidades. En determinadas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 12 a 25 subunidades. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 12 a 22 subunidades. En determinadas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 14 a 20 subunidades. En determinadas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 15 a 25 subunidades. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 18 a 22 subunidades. En determinadas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene una longitud de 19 a 21 subunidades. En ciertas formas de realización, el compuesto antisentido es de 8 a 80, de 12 a 50, de 13 a 30, de 13 a 50, de 14 a 30, de 14 a 50, de 15 a 30, de 15 a 50, de 16 a 30, de 16 a 50, de 17 a 30, 17 a 50, 18 a 30, 18 a 50, 19 a 30, 19 a 50 o 20 a 30 subunidades enlazadas de longitud.
[0125] En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 12 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 13 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 14 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 15 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 16 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 17 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 18 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 19 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 20 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 21 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 22 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 23 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 24 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 25 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 26 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 27 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 28 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 29 subunidades de longitud. En ciertas formas de realización, un
compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo tiene 30 subunidades de longitud. En determinadas formas de realización, el compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico objetivo es 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 4 3 , 4 4 , 4 5 , 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 subunidades enlazadas de longitud, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En determinadas formas de realización, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido y las subunidades unidas son nucleósidos.
[0126] En determinadas formas de realización, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico objetivo se pueden acortar o truncar. Por ejemplo, una única subunidad puede eliminarse del extremo 5' (truncamiento en 5') o, alternativamente, del extremo 3' (truncamiento en 3'). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico objetivo puede tener dos subunidades suprimidas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades suprimidas del extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tenga un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
[0127] Cuando una sola subunidad adicional está presente en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede ubicarse en el extremo 5' o 3' del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas al extremo 5' (adición 5'), o alternativamente al extremo 3' (adición de 3'), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden dispersarse por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
[0128] Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases de emparejamiento erróneo sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:7305-7309, 1992), se ensayó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases no coincidentes cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían desajustes. De manera similar, la escisión específica del objetivo se logró utilizando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobase, incluidos aquellos con 1 o 3 desajustes.
[0129] Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene un 100 % de complementariedad con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 desajustes con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de bcl-2 y bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
[0130] Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobases compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, por su capacidad para detener la traducción de DHFR humana en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases solo fue capaz de inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
[0131] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico objetivo tienen subunidades modificadas químicamente dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada por un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
[0132] Los compuestos antisentido quiméricos normalmente contienen al menos una región modificada para conferir mayor resistencia a la degradación por nucleasas, mayor captación celular, mayor afinidad de unión por el ácido nucleico objetivo y/o mayor actividad inhibidora. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la hebra de ARN de un dúplex ARN:ADN.
[0133] Los compuestos antisentido que tienen un motivo gápmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gápmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gápmero, el segmento de brecha generalmente sirve como sustrato para la escisión de la endonucleasa, mientras que los segmentos del ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas formas de realización, las regiones de un gápmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gápmero pueden incluir en algunas formas de realización p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (dichos nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOE, y 2'O-CH3 , entre otros), y nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos (dichos nucleósidos modificados con azúcares bicíclicos pueden incluir aquellos que tienen un puente 4 '-(CH2)nO-2 ', donde n=1 o n=2 y 4 '-CH2-O-CH2-2 '). En determinadas formas de realización, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, incluidos, por ejemplo, 2'-MOE. En ciertas formas de realización, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En ciertas formas de realización, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE y 2'-desoxinucleósidos.
[0134] Cada región distinta puede comprender restos de azúcar uniformes, restos de azúcar variantes o alternos. El motivo del espacio entre alas se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala de 5', "Y" representa la longitud del espacio y "Z" representa la longitud del ala de 3'. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternantes. En ciertas formas de realización, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Tal como se usa en el presente documento, un espaciador descrito como "XYZ" tiene una configuración tal que el espacio se coloca inmediatamente adyacente a cada ala 5' y ala 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el espacio, o entre el espacio y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos aquí puede tener un motivo gápmero. En ciertas formas de realización, "X" y "Z" son iguales; en otras formas de realización son diferentes.
[0135] En determinadas formas de realización, los gápmeros proporcionados en el presente documento incluyen, por ejemplo, 20 meros que tienen un motivo de 5-10-5. En determinadas formas de realización, los gápmeros proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, 19 meros que tienen un motivo de 5-9-5. En determinadas formas de realización, los gápmeros proporcionados en el presente documento incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 5-8-5. En determinadas formas de realización, los gápmeros proporcionados en el presente documento incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 4-8-6. En determinadas formas de realización, los gápmeros proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 6-8-4. En determinadas formas de realización, los gápmeros proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, 18 meros que tienen un motivo de 5-7-6.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
[0136] Las secuencias de nucleótidos que codifican MECP2 incluyen, entre otras, las siguientes: N° de acceso de GENBANK NM_004992.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1) y el complemento del N° de acceso de GENBANK NT_167198.1 truncado de los nucleótidos 4203000 a 4283000 (incorporado aquí como SEQ ID NO: 2).
[0137] Se entiende que la secuencia establecida en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en el presente documento es independiente de cualquier modificación en un resto de azúcar, un enlace internucleósido o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones a un resto de azúcar, un enlace internucleósido o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por Número Isis (Isis N°) indican una combinación de secuencia de nucleobase y motivo.
[0138] En determinadas formas de realización, una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones definidas estructuralmente para MECP2 se pueden obtener por número de acceso de bases de datos de secuencias como NCBI.
[0139] En ciertas formas de realización, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la misma región objetivo.
[0140] El direccionamiento incluye la determinación de al menos un segmento objetivo con el que se hibrida un compuesto antisentido, de modo que se produzca el efecto deseado. En ciertas formas de realización, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo del ARNm. En determinadas formas de realización, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.
[0141] Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Es posible que se superpongan varios segmentos de destino dentro de una región de destino. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas formas de realización, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas formas de realización, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores. En determinadas formas de realización, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por un rango que tiene un ácido nucleico inicial que es cualquiera de los sitios objetivo 5' o sitios objetivo 3' enumerados en este documento.
[0142] Los segmentos objetivo adecuados se pueden encontrar dentro de una UTR 5', una región codificante, una UTR
3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una determinada región definida estructuralmente, como el codón de inicio o el codón de terminación.
[0143] La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias a lo largo del genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridarse de manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera de objetivo).
[0144] Puede haber variación en la actividad (p. ej., definida por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas formas de realización, las reducciones en los niveles de ARNm de MECP2 son indicativas de la inhibición de la expresión de MECP2. Las reducciones en los niveles de una proteína MECP2 también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm objetivo. Los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión de MECP2. La mejora en la función neurológica es indicativa de la inhibición de la expresión de MECP2. La función motora mejorada, la actividad, el comportamiento social y la memoria son indicativos de la inhibición de la expresión de MECP2. La reducción de los comportamientos similares a la ansiedad es indicativa de la inhibición de la expresión de MECP2.
Hibridación
[0145] En algunas formas de realización, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en el presente documento y un ácido nucleico de MECP2. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (p. ej., enlace de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertido) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
[0146] La hibridación puede ocurrir en condiciones variables. Las condiciones estrictas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.
[0147] Los métodos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico de MECP2.
Complementariedad
[0148] Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido pueden formar enlaces de hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de modo que se produzca un efecto deseado (p. ej., inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico MECP2 ).
[0149] Las bases nitrogenadas no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo pueden tolerarse siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridarse específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico objetivo de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (p. ej., una estructura de bucle, una estructura de horquilla o desajuste).
[0150] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o una parte específica de los mismos, son, o son al menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementario a un ácido nucleico de MECP2, una región objetivo, un segmento objetivo o una parte específica del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo se puede determinar usando métodos de rutina.
[0151] Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias a una región objetivo y, por lo tanto, se hibridarían específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden estar agrupadas o intercaladas con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría una complementariedad general del 77,8% con el ácido nucleico objetivo y, por lo tanto, estaría dentro de la alcance de la presente invención. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo se puede determinar de forma rutinaria utilizando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
[0152] En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento, o partes especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 10 0 % complementarios) con un ácido nucleico objetivo, o una parte específica del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser totalmente complementario de un ácido nucleico de MECP2, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en el presente documento, "totalmente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de aparearse de forma precisa con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto antisentido de 20 nucleobases es totalmente complementario a una secuencia objetivo que tiene una longitud de 400 nucleobases, siempre que haya una parte correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que sea totalmente complementaria al compuesto antisentido. También se puede usar completamente complementario en referencia a una parte específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una parte de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "totalmente complementario" a una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de longitud. La parte de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria a la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una parte correspondiente de 20 nucleobases en la que cada nucleobase es complementaria a la parte de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, el compuesto antisentido completo de 30 nucleobases puede o no ser totalmente complementario a la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias a la secuencia objetivo.
[0153] La ubicación de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando están presentes dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas. En una forma de realización, una nucleobase no complementaria está ubicada en el segmento del ala de un oligonucleótido antisentido gápmero.
[0154] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido que son, o tienen hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleobases de longitud comprenden no más de 4, no más de 3, no más de 2, o no más de 1 nucleobase(s) no complementaria(s) en relación con un ácido nucleico objetivo, o una parte específica del mismo.
[0155] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido que son, o son hasta 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleobases de longitud comprenden no más de 6 , no más de 5, no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 nucleobase no complementaria en relación con un ácido nucleico objetivo, o una parte específica del mismo.
[0156] Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también incluyen aquellos que son complementarios a una parte de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en el presente documento, "parte" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, unidas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "parte" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 9 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 10 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 11 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 13 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 14 nucleobases de un segmento objetivo. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una parte de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos una parte de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
Identidad
[0157] Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento también pueden tener un porcentaje definido de identidad con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una parte del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia descrita en el presente documento si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN revelada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con la adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersarse por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula según el número de bases que tienen un apareamiento de bases idéntico en relación con la secuencia con la que se compara.
[0158] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido, o partes de los mismos, son al menos 70 %, 75 %,
80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una parte de los mismos, descritos en el presente documento.
[0159] En ciertas formas de realización, una parte del compuesto antisentido se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, una parte de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
[0160] En ciertas formas de realización, una parte del oligonucleótido antisentido se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas formas de realización, una parte de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 se compara con una parte de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
Modificaciones
[0161] Un nucleósido es una combinación de azúcar base. La parte de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente un resto de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que además incluyen un grupo fosfato unido covalentemente a la parte de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar pentofuranosilo, el grupo fosfato se puede unir al resto hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman mediante la unión covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura del oligonucleótido, se suele hacer referencia a los grupos fosfato como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
[0162] Las modificaciones de los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por el ácido nucleico objetivo, estabilidad incrementada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora incrementada.
[0163] También se pueden emplear nucleósidos modificados químicamente para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen dichos nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces internucleósidos modificados
[0164] El enlace internucleósido natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleósidos modificados, es decir, que no se producen de forma natural, se seleccionan a menudo frente a los compuestos antisentido que tienen enlaces internucleósidos de origen natural debido a sus propiedades deseables, como, por ejemplo, una mejor captación celular, una mayor afinidad por los ácidos nucleicos objetivo y una mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
[0165] Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleósidos modificados incluyen enlaces internucleósidos que retienen un átomo de fósforo así como enlaces internucleósidos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
[0166] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de MECP2 comprenden uno o más enlaces internucleósidos modificados. En determinadas formas de realización, los enlaces internucleósidos modificados se intercalan por todo el compuesto antisentido. En ciertas formas de realización, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En ciertas formas de realización, cada enlace internucleósido de un compuesto antisentido es un enlace internucleósido de fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
[0167] Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en los que se ha modificado el grupo azúcar. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir una mayor estabilidad a la nucleasa, una mayor afinidad de unión o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas formas de realización, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa modificados químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen, entre otros, la adición de grupos sustituyentes (incluidos los grupos sustituyentes 5' y 2', la unión de átomos del anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen 2'-F-5’-nucleósido sustituido con metilo (consulte la Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 publicada el 21/8/08 para conocer otros nucleósidos sustituidos en 5',2'-bis divulgados) o reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (consulte la solicitud de patente estadounidense publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución en 5' de un BNA (consulte la Solicitud Internacional PCt WO 2007/134181 publicada el 22/11/07 en la que LNA se sustituye por
ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
[0168] Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, entre otros, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2 '-Oc H2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, OCF3 , OCH2 F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) y O-CH2-C(=O)-N(R1)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido.
[0169] Como se usa en el presente documento, "nucleósidos bicíclicos'' se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En determinadas formas de realización, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (y sus análogos véase la Patente de EE.Uu . 7.399.845, emitida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y sus análogos véase la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4 '-Ch 2-N(Oc H3)-2 ' (y sus análogos véase la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (véase la solicitud de patente estadounidense publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en el que R es H, C1-C12 alquilo o un grupo protector (véase la patente estadounidense 7.427.672, emitida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (ver Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (y sus análogos véase la Solicitud Internacional WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
[0170] También se pueden encontrar informes adicionales relacionados con los nucleósidos bicíclicos en la literatura publicada (ver por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607 3630; Wahlestedt y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379, Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001,2, 558-561 Braasch et al., Chem. Biol., 2001,8, 1-7 y Orum et al., Curr Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239 -243; Patentes de EE. UU. Nos. 6.268.490; 6.525.191; 6.770.461; 6.770.748; 6.794.499; 7.034.133; 7.053.207; 7.053.207; 7.547.207; 7.547.207; 7.547.204; 7.696.684; 7.696.684; y 7.696.345; Publicación de la Patente de EE. UU. N2 US2008-0039618; US2009-0012281; US2009-0012281; Patente de EE. UU. N2 de serie 60/989.574; 61/026.995; 61/026.998; 61/056.564; 61/086.231; 61/097.787; y 61/099.844; Solicitudes Internacionales PCT publicadas WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/ 021570; documento WO 2007/134181; documento WO 2008/150729; documento WO 2008/154401; y WO 2009/006478. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores se puede preparar con una o más configuraciones estereoquímicas de azúcar que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la Solicitud Internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
[0171] En determinadas formas de realización, los restos de azúcar bicíclicos de los nucleósidos de BNA incluyen, entre otros, compuestos que tienen al menos un puente entre las posiciones 4' y 2' del resto de azúcar de pentofuranosilo en el que dichos puentes comprenden independientemente 1 o 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x- y -N(Ra)-; donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2 , SJ1, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1);
y cada J1 y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido o un grupo protector.
[0172] En ciertas formas de realización, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas formas de realización, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4’-CH2-O-2', 4’-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2’- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
[0173] En ciertas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos se definen además por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Previamente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
[0174] En determinadas formas de realización, los nucleósidos bicíclicos incluyen, entre otros, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4 '-CH2-O-2 ') BNA, (C) etilenoxi (4 '-(CH2)2-O-2 ') BNA, (D) aminooxi (4 '-CH2-O-N(R)-2 ') BNA, (E) oxiamino (4 '-CH2-N(R)-O-2 ') BNA, y (F) metil(metilenoxi) (4 '-CH(CH3)-O-2 ') BNA, (G) metileno-tio (4 '-CH2-S-2 ') BNA, (H) metileno-amino (4 '-CH2-N(R)-2 ') b Na , (i) metil carbocíclico (4 '-CH2-CH(CH3)-2 ') BNa , y (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3 -2 ') BNA como se representa a continuación.
donde Bx es el resto base y R es independientemente H, un grupo protector o C1-C12 alquilo.
[0175] En determinadas formas de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula I:
en la que:
Bx es un resto de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2 ; Rc es C1-C12 alquilo o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
[0176] En ciertas formas de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
[0177] En una forma de realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd SJc, N3 , O-C(=X)Jc y NJeC(= X)NJcJd, donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, C1-C6 alquilo o C1-C6 alquilo sustituido y X es O o NJc.
[0178] En ciertas formas de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula III:
en la que:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es C1-C6 alquilo, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquinilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
[0179] En determinadas formas de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula IV:
en la que:
Bx es un resto de base heterocíclica; Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, C1-C6 aminoalquilo o C1-C6 aminoalquilo sustituido;
[0180] En ciertas formas de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
en donde:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxi, C1-C12 alcoxi sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3 , CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
[0181] Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi (4 '-CH2-O-2 ') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con sus propiedades de oligomerización y reconocimiento de ácidos nucleicos (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en los documentos WO 98/39352 y WO 99/14226.
[0182] También se han preparado análogos de metilenoxi (4 '-CH2-O-2 ') BNA y 2'-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8 , 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácidos nucleicos (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad conformacionalmente restringido (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado previamente sobre la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.
[0183] En determinadas formas de realización, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la fórmula VI:
en la que:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C1-C12 alcoxilo, C1-C12 alcoxilo sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, C1-C12 alquilo o C1-C12 alquilo sustituido.
[0184] Se ha descrito un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4 '-(CH2)3-2 ' y el puente análogo alquenilo 4 '-CH=CH-CH2-2 ' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek y col., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
[0185] Como se usa en el presente documento, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
[0186] Como se usa en el presente documento, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En ciertas formas de realización, el resto de azúcar, o el análogo del resto de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
[0187] Como se usa en el presente documento, "azúcar modificado en 2'" significa un azúcar furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas formas de realización, dichas modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que incluye, entre otros, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido y alquinilo. En ciertas formas de realización, las modificaciones 2 ' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, entre otros: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2 , O(CH2)nCH3, O(CH2)nF, O(CH2)nONH2 , OCH2C(=O)N(H)CH3, y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. También se pueden seleccionar otros grupos sustituyentes en 2 ' de: C1-C12 alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3 , OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3 , SOCH3 , SO2CH3 , ONO2 , NO2 , N3 , NH2 , heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de ruptura de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades
similares. En ciertas formas de realización, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2’-0-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176, Altmann y col., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630 637 y Altmann y col., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
[0188] Como se usa en el presente documento, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en los nucleósidos normales (un sustituto del azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, entre otros, lo que se denomina en la técnica ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (ANM) (véase Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), fluoro HNA (F-Hn A) o aquellos compuestos que tienen la Fórmula VII:
en la que independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de fórmula VII:
Bx es un resto de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleósido que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo terminal 5' o 3';
q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, C1-C6 alquilo, C1-C6 alquilo sustituido, C2-C6 alquenilo, C2-C6 alquenilo sustituido, C2-C6 alquinilo o C2-C6 alquinilo sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2 , SJ1, N3 , O-C(=X)J1, O-C(=X)NJJ2 , NJ3C(=X)NJJ2 y CN, en los que X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o C1-C6 alquilo.
[0189] En determinadas formas de realización, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en los que q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En determinadas formas de realización, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En ciertas formas de realización, al menos uno de q1, q2 , q3 , q4 , q5 , q6 y q7 es metilo. En determinadas formas de realización, se proporcionan nucleósidos de THP de Fórmula VII en los que uno de R2 y R2 es fluoro. En ciertas formas de realización, R1 es fluoro y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es H y R2 es metoxietoxi.
[0190] Como se usa aquí, "modificado en 2'" o "sustituido en 2'" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, entre otros, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' no puente, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-C1-C10 alquilo, -OCF3 , O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o C1-C10 alquilo sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
[0191] Como se usa en el presente documento, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo flúor en la posición 2'.
[0192] Como se usa en el presente documento, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metilo" cada uno se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
[0193] Como se usa en el presente documento, "MOE" o "2'-MOE" o "2'-OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" cada uno se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
[0194] Como se usa en el presente documento, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas formas de realización, se modifica uno o más de la pluralidad de nucleósidos. En ciertas formas de realización, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos
(ADN).
[0195] También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que se pueden usar para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854).
Dichos sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
[0196] Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica.
[0197] En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de nucleobase (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un ácido nucleico objetivo apropiado.
[0198] En ciertas formas de realización, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas formas de realización, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En determinadas formas de realización, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gápmero. En ciertas formas de realización, el resto de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4 '-CH(CH3)-O-2 '). En ciertas formas de realización, los nucleósidos modificados con (4 '-CH(CH3)-O-2 ') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gápmero.
Composiciones y métodos para formular composiciones farmacéuticas
[0199] Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y los métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, entre otros, la vía de administración, la extensión del trastorno o la dosis a administrar.
[0200] Se puede utilizar un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para usar en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, en una forma de realización, se emplea en los métodos descritos en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 y un diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas formas de realización, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas formas de realización, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
[0201] Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal farmacéuticamente aceptable, ésteres o sales de dichos ésteres, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el agente biológicamente activo metabolito o residuo del mismo. En consecuencia, por ejemplo, la divulgación también se refiere a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero no se limitan a sales de sodio y potasio.
[0202] Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que son escindidos por nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
Compuestos antisentido conjugados
[0203] Los compuestos antisentido pueden unirse covalentemente a uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, distribución celular o absorción celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen fracciones de colesterol y fracciones de lípidos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
[0204] Los compuestos antisentido también se pueden modificar para tener uno o más grupos estabilizadores que generalmente se unen a uno o ambos extremos de los compuestos antisentido para mejorar propiedades tales como, por ejemplo, la estabilidad de la nucleasa. En grupos estabilizadores se incluyen estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen al compuesto antisentido que tiene el ácido nucleico terminal de la degradación por exonucleasa y pueden ayudar en el suministro y/o localización dentro de una célula. La tapa puede estar presente en el extremo 5' (tapa 5'), o en el extremo 3' (tapa 3'), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas desoxiabásicas invertidas. Otros grupos estabilizadores de 3' y 5' que se pueden usar para tapar uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad a la nucleasa incluyen los descritos en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento de compuestos antisentido
[0205] Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de MECP2 se pueden probar in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células utilizados para dichos análisis están disponibles de proveedores comerciales (p. ej., American Type Culture Collection, Manassus, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor usando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a células HepG2, células Hep3B y hepatocitos primarios. En ciertas formas de realización, las células son células de pacientes, como células de linfoblastos B.
Ensayo in vitro de oligonucleótidos antisentido
[0206] En el presente documento se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse adecuadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
[0207] Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60 80 % de confluencia en cultivo.
[0208] Un reactivo usado comúnmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se pueden mezclar con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede oscilar entre 2 y 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
[0209] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede oscilar entre 2 y 12 ug/mL por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
[0210] Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye TURBOFECT (Thermo Scientific, Carlsbad, CA).
[0211] Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
[0212] Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos de rutina. Las células se pueden recolectar 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos objetivo mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples réplicas, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos repetidos.
[0213] La concentración de oligonucleótido antisentido utilizada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se utilizan normalmente en concentraciones que oscilan entre 1 nM y 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan en concentraciones más altas que van desde 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
[0214] El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA) según los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de los niveles objetivo o la expresión
[0215] La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de MECP2 se puede ensayar de diversas formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) competitiva o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN se puede realizar en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede lograr convenientemente utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 disponible comercialmente, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y se usa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis PCR cuantitativo en tiempo real de los niveles de ARN objetivo
[0216] La cuantificación de los niveles de ARN objetivo puede lograrse mediante PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el sistema de detección de secuencias ABI PRISm 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) según
las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
[0217] Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real se pueden obtener de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de PCR en tiempo real de RT se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
[0218] Las cantidades objetivo de genes (o ARN) obtenidas mediante PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexado o por separado. El ARN total se cuantifica utilizando el reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invetrogen, Inc. Eugene, OR). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se utiliza un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia RIBOGREEN.
[0219] Las sondas y los cebadores se diseñan para hibridarse con un ácido nucleico de MECP2. Los métodos para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
[0220] La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de MECP2 puede evaluarse midiendo los niveles de proteína de MECP2. Los niveles de proteína de MECP2 pueden evaluarse o cuantificarse en una variedad de formas bien conocidas en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
[0221] Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de MECP2 y producir cambios fenotípicos, como comportamiento mejorado, función motora y cognición. En determinadas formas de realización, la función motora se mide mediante análisis de iniciación a la marcha, rotarod, fuerza de prensión, ascenso de postes, rendimiento en campo abierto, barra de equilibrio, prueba de la huella de la pata trasera en el animal. En ciertas formas de realización, el comportamiento se mide mediante un laberinto en cruz elevado y una interacción social de tres cámaras. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, como una solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenterales, tales como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está al alcance de los expertos en la técnica y depende de factores tales como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido del SNC o del LCR y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de MECP2.
Ciertas indicaciones
[0222] En el presente documento se describen métodos para tratar a un individuo que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. El individuo puede tener un trastorno neurológico. El individuo puede estar en riesgo de desarrollar un trastorno neurológico, incluido, entre otros, el síndrome de duplicación de MECP2. La invención proporciona un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico de MECP2 para su uso en el tratamiento del síndrome de duplicación de MECP2. En ciertas formas de realización, se ha identificado que el individuo tiene un trastorno asociado con MECP2. En el presente documento se describen métodos para reducir profilácticamente la expresión de MECP2 en un individuo. Ciertas formas de realización incluyen administrar a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2.
[0223] En una forma de realización, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 va acompañada de la monitorización de los niveles de MECP2 en un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. Un médico puede utilizar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido para determinar la cantidad y la duración de la intervención terapéutica.
[0224] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado una reducción del ARNm de MECP2 y/o la expresión de proteína en al menos 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0225] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado una función motora mejorada en un animal. En determinadas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido MECP2 mejora la función motora en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,
55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0226] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado una ansiedad mejorada en un animal. En determinadas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido de MECP2 mejora la ansiedad en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59,
60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 
o 100%, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0227] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado una interacción social mejorada en un animal. En determinadas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido MECP2 mejora la interacción social en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,
50, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0228] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado una actividad mejorada en un animal. En determinadas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido de MECP2 mejora la actividad en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57, 58, 59,
60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0229] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado una reducción de las convulsiones. En determinadas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido de MECP2 reduce las convulsiones en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 56, 57,
58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
[0230] En ciertas formas de realización, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de MECP2 da como resultado descargas de EEG normalizadas.
[0231] Las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a MECP2 pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que sufre o es susceptible a un trastorno neurológico que incluye el síndrome de duplicación de MECP2.
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
[0232] Aunque ciertos métodos descritos en el presente documento se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas formas de realización, los siguientes ejemplos sirven solo para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no pretenden limitarlos.
Ejemplo 1: Efecto de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a MECP2 in vivo
[0233] Oligonucleótidos antisentido (ASO) dirigidos a la proteína 2 de unión a metil CpG humana (MECP2), el complemento del número de acceso de g En BANK NT_167198.1 truncado de 4203000 a 4283000, SEQ ID NO: 2, se sintetizaron usando métodos estándar de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. Son oligonucleótidos quiméricos ("gápmeros"), compuestos por una región central "brecha" que consiste en 2 '-desoxinucleótidos, que está flanqueada en ambos lados (5' y 3') por "alas" que están compuestas de nucleótidos modificados. Los enlaces internucleosídicos (esqueleto) son fosforotioato o fosfodiéster en todos los oligonucleótidos. Las secuencias y estructuras de los oligonucleótidos antisentido y sus sitios de inicio y finalización a lo largo de SEQ ID NO: 2 se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1: Oligonucleótidos antisentido dirigidos a MECP2 humana
[0234] El superíndice "m" indica 5-metilcitosina. Subíndices: "o" indica un enlace internucleósido fosfodiéster, "s" indica un enlace internucleósido fosforotioato, "e" indica un nucleósido modificado con 2 '-metoxietilo y "d" indica un 2 '-desoxinucleósido.
[0235] Se analizaron los efectos de los oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de ARNm y proteína de MECP2 en ratones transgénicos con duplicación de MECP2 que sobreexpresan MECP2 humano de tipo salvaje (ratones híbridos F1 MECP2-TG1 (FVB/N x 129)(Samaco et al., Nat Genet, 2012). A las 8 semanas de edad, los ratones FVB/N x 129 muestran hipoactividad en la prueba de campo abierto, aumento de la ansiedad en las pruebas de campo abierto y laberinto en cruz elevado, comportamiento social anormal en la prueba de 3 cámaras y aumento de la coordinación motora en la prueba rotarod. A ratones MECP2-TG de siete semanas de edad se les administró una inyección intracerebral estereotáctica de 500 pg de un oligonucleótido antisentido enumerado en la Tabla 1 o solución salina en el ventrículo derecho del cerebro. A los ratones de tipo salvaje se les administró una inyección intracerebral estereotáctica de solución salina en el ventrículo derecho del cerebro como control. Cada grupo constaba de dos o tres ratones. Dos semanas después de la inyección, los ratones fueron sacrificados y se recolectaron muestras de cerebro cortical para el análisis del ARNm de MECP2 y el nivel de proteína. Los niveles de proteína MECP2 y GAPDH se analizaron mediante transferencia Western realizada en los lisados de muestras corticales. Como anticuerpos primarios se usaron antisuero de conejo producido contra el extremo N-terminal de MECP2 y anti-GAPDH 6C5 de ratón (Advanced Immunochemicals, Long Beach, CA). Las imágenes de transferencia Western se cuantificaron utilizando el software Image J, y los niveles de proteína MECP2 normalizados a niveles de GAPDH se muestran en la Tabla 2 a continuación.
[0236] El ARNm de MECP2 total, el ARNm de MECP2 humano (las isoformas e1 y e2) y el ARNm de MECP2 de ratón (las isoformas tanto e1 como e2) se analizaron por separado mediante RT-qPCR. Los cebadores comunes para humanos y ratones usados para el ARNm total de m Ec P2 fueron: 5'-TATTTGATCAATCCCCAGGG-3', SEQ ID NO: 3, y 5'-CTCCCTCTCCCAGTTACCGT-3’, SEQ ID NO: 4. Los cebadores específicos humanos usados para MECP2-e1 fueron 5'-AGGAGAGACTGGAAGAAAAGTC-3', SEQ ID NO: 5, y 5'-CTTGAGGGGTTTGTCCTTGA-3', SEQ ID NO: 6. Los cebadores específicos humanos usados para MECP2-e2 fueron 5'-CTCACCAGTTCCTGCTTTGATGT-3', SEQ ID NO: 7 y 5'-CTTGAGGGGTTTGTCCTTGA-3', s Eq ID NO: 6. Los cebadores específicos de ratón usados para MEcP2-e1 fueron 5'-AGGAGAGACTGGAGGAAAAGTC-3', SEQ ID NO: 8 y 5'-CTTAAACTTCAGTGGCTTGTCTCTG-3’, SEQ ID NO: 9. Los cebadores específicos de ratón usados para MECP2-e2 fueron 5’-CTCACCAGTTCCTGCTTTGATGT-3', SEQ ID NO: 7 y 5'-CTTAAAcTTCAGTGGCTTGTCTCTG-3', SEQ ID NO: 9. MECP2 Los niveles de ARNm se normalizaron a los niveles de ARNm de Hprt, que se analizaron usando el cebador 5'-CGGGGGACATAAAAGTTATTG-3', SEQ ID NO: 10, y 5'-TGCATTGTTTTACCAGTGTCAA-3', SEQ ID NO: 11. Los resultados se presentan en la Tabla 2 a continuación como niveles de ARNm de MECP2 normalizados promedio relativos a ratones de tipo salvaje (WT) tratados con solución salina. Los resultados muestran que todos los oligonucleótidos antisentido probados inhibieron los niveles de proteína y ARNm de MECP2 en los ratones transgénicos, y los niveles de ARNm de MECP2 humano se inhibieron específicamente, mientras que los niveles de ARNm de MECP2 de ratón no se inhibieron. Isis N° 628785 fue la más potente en los primeros experimentos y se llevó adelante. Las entradas enumeradas como "n/a" indican que no se realizó el experimento correspondiente.
Tabla 2: Niveles de proteína y ARNm de MECP2 en ratones transgénicos después de la administración de ASO
Ejemplo 2: Efecto de la infusión gradual de oligonucleótido antisentido dirigido a MECP2 in vivo
[0237] Para infundir gradualmente oligonucleótido antisentido en el ventrículo derecho del cerebro, bombas microosmóticas (Alzet model 1004, Durect, Cupertino, CA) se llenaron con 500 gg de Isis N° 628785 o un oligonucleótido de control que no está dirigido a MECP2, disueltos en 100 gl de solución salina. A continuación, la bomba se conectó a través de un catéter de plástico a una cánula (Alzet Brain Infusion Kit 3, Durect, Cupertino, CA). La bomba fue diseñada para administrar el fármaco a una velocidad de 0,11 gl por hora durante 28 días. El conjunto de cánula y bomba se cebó en solución salina estéril durante dos días a 37°C. Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se colocaron en un instrumento estereotáxico guiado por computadora (Angle Two Stereotaxic Instrument, Leica Microsystems, Bannockburn, IL). La anestesia (isoflurano al 3%) se administró de forma continua a través de una pequeña máscara facial. Se administró ketoprofeno 5 mg/kg por vía subcutánea al inicio de la cirugía. Luego de esterilizar el sitio quirúrgico con betadina y alcohol al 70%, se realizó una incisión en la línea media sobre el cráneo y se generó una bolsa subcutánea en la parte trasera del animal. A continuación, se insertó la bomba en el bolsillo y se implantó estereotácticamente la cánula para administrar el fármaco en el ventrículo derecho utilizando las siguientes coordenadas: AP = -0,2 mm, ML = 1 mm, DV = -3 mm. Se suturó la incisión. Se proporcionaron gránulos de alimentos que contenían carprofeno durante 5 días después de la cirugía. 28 días después del inicio del tratamiento, se desconectó la bomba de la cánula y se retiró. Se dieron dos semanas adicionales a los animales para que se recuperaran.
[0238] Se infundió gradualmente Isis N° 628785 en los ventrículos derechos de los cerebros de ratones WT o TG de 7 semanas de edad utilizando las bombas microosmóticas. Cada grupo de tratamiento constaba de 4 o 5 animales. Al final del período de tratamiento de cuatro semanas, se realizó una transferencia Western como se describe en el Ejemplo 1 para analizar los niveles de proteína MECP2 a las 4, 8 y 12 semanas después del inicio del tratamiento con oligonucleótidos antisentido. Los resultados se muestran en la Tabla 3 a continuación.
Tabla 3: Niveles de proteína MECP2 después de la infusión de oligonucleótidos antisentido
Ejemplo 3: Efectos de comportamiento de oligonucleótido antisentido dirigido a MECP2 humano in vivo
[0239] Después de la infusión de oligonucleótido antisentido como se describe en el Ejemplo 2, se realizó una batería de ensayos de comportamiento para evaluar los efectos fenotípicos del tratamiento con oligonucleótido en ratones TG tratados con Isis N° 628785 o un oligonucleótido de control y ratones WT tratados con un oligonucleótido de control. Cada grupo de tratamiento contenía al menos 15 animales.
[0240] Se realizó una prueba de campo abierto dos semanas y seis semanas después de completar la infusión de 4 semanas colocando ratones en el centro de una arena abierta después de la habituación en la sala de prueba (40 x 40 x 30 cm). Su comportamiento fue rastreado por roturas de haz de luz láser durante 30 min. La actividad locomotora horizontal, la actividad de crianza, el tiempo pasado en el centro de la arena y las entradas al centro se analizaron utilizando el software AccuScan Fusion (Omnitech, Columbus, OH). Los resultados se presentan en la tabla 4 a continuación. Los resultados muestran que los ratones TG mostraron hipoactividad en la prueba de campo abierto en relación con los ratones WT en ambos momentos, y el tratamiento de los ratones TG con Isis N° 628785 restauró la actividad cerca de los niveles de WT.
Tabla 4: Prueba de campo abierto
[0241] Los ratones se probaron en un laberinto en cruz elevado dos semanas y seis semanas después de completar la infusión de 4 semanas. Después de la habituación en la sala de prueba, los ratones se colocaron en la parte central del laberinto frente a uno de los dos brazos abiertos. El comportamiento de los ratones se siguió en video durante 10 minutos, y el tiempo que los ratones pasaron en los brazos abiertos y las entradas a los brazos abiertos se registraron y analizaron utilizando el sistema ANY-maze (Stoelting, Wood Dale, IL). Los resultados se muestran en la Tabla 5 a continuación. Los resultados muestran que los ratones TG mostraron un aumento de la ansiedad en la prueba del laberinto en cruz elevado en relación con los ratones WT en ambos momentos, y el tratamiento de los ratones TG con Isis N° 628785 restableció los niveles de ansiedad cercanos a los niveles WT.
Tabla 5: Laberinto en cruz elevado
[0242] Los ratones se evaluaron en una prueba de interacción social de tres cámaras tres semanas y siete semanas después de completar la infusión de 4 semanas. El aparato constaba de una caja de plexiglás transparente con particiones removibles que separaban la caja en tres cámaras: izquierda, central y derecha. En las cámaras izquierda y derecha se colocó una copa de alambre cilindrica con el lado abierto hacia abajo. Se utilizaron ratones de la misma edad y género como nuevos compañeros. Dos dias antes de la prueba, los nuevos ratones asociados se habituaron a las copas de alambre (3 pulgadas de diámetro por 4 pulgadas de altura) durante 1 hora al dia. Después de la habituación en la sala de pruebas, cada ratón se colocó en la cámara central y se les permitió explorar las tres cámaras durante 10 minutos (fase de habituación). El tiempo pasado en cada cámara durante la fase de habituación se registró automáticamente y se analizó utilizando el sistema ANY-maze (Stoelting, Wood Dale, IL). A continuación, se colocó un nuevo ratón compañero debajo de una copa de alambre en la cámara izquierda o derecha. Se colocó un objeto inanimado como control debajo de la copa de alambre de la cámara opuesta. La ubicación del nuevo ratón se aleatorizó entre las cámaras izquierda y derecha de cada ratón de prueba para controlar la preferencia lateral. Se permitió que el ratón probado explorara de nuevo durante 10 minutos más. El tiempo dedicado a investigar a la nueva pareja (definido por levantarse, olfatear o tocar con la pata la copa de alambre) y el tiempo dedicado a investigar el objeto inanimado se midieron manualmente. Los resultados se muestran en la Tabla 6 a continuación. Los resultados muestran que los ratones TG mostraron hipoactividad y una disminución de la interacción social en la prueba de interacción social de tres cámaras en relación con los ratones WT en ambos momentos, y el tratamiento de los ratones TG con Isis N° 628785 restableció la interacción social con un nuevo compañero a niveles de WT en el punto de tiempo de 6 semanas.
Tabla 6: Prueba de interacción social de tres cámaras
[0243] Los ratones se evaluaron en una prueba rotarod acelerante tres semanas después de completar la infusión de 4 semanas. Después de la habituación en la sala de pruebas, se midió la coordinación motora utilizando un aparato rotarod acelerador (Ugo Basile, Varese, Italia). Los ratones se probaron 2 días consecutivos, 4 ensayos cada uno, con un intervalo de 60 minutos entre ensayos para descansar. Cada ensayo duró un máximo de 10 minutos; a los ratones que nunca se caían se les dio una medida de 600 segundos. La varilla aceleró de 4 a 40 rpm en los primeros 5 minutos. Se registró el tiempo que tardó cada ratón en caer de la barra (latencia para caer). Los resultados se muestran en la Tabla 7 a continuación. Los resultados muestran que los ratones TG mostraron un mayor rendimiento en la prueba rotarod en relación con los ratones WT, y el tratamiento de los ratones TG con Isis N° 628785 restauró el rendimiento a los niveles de WT.
Tabla 7: Prueba rotarod acelerante
[0244] Los resultados en las tablas 4-7 anteriores muestran que el tratamiento con Isis N° 628785 dirigido a MECP2 invirtió los fenotipos de comportamiento de los ratones TG. Los ratones TG tratados con Isis N° 628785 se desempeñaron de manera similar a los ratones WT en la prueba rotarod 3-4 semanas después de completar la infusión. A las 6-7 semanas después de completar la infusión, la hipoactividad, los comportamientos similares a la ansiedad y el comportamiento social de los ratones TG se revirtieron, como lo demuestran las pruebas de campo abierto, laberinto en cruz elevado y tres cámaras, respectivamente.
Ejemplo 4: Respuesta a la dosis de oligonucleótido antisentido dirigido a MECP2 humano en células de pacientes
[0245] Con el fin de probar un efecto dependiente de la dosis de Isis N° 628785 en células humanas, las células de linfoblastos B de dos individuos afectados con el síndrome de duplicación de MECP2 y células de control emparejadas por la edad se cultivaron en suspensión en medio RPMI 1640 con L-glutamina, penicilina-estreptomicina y suero bovino fetal al 10% (v/v). Un día antes de la transfección, las células se sembraron por triplicado para cada tratamiento en placas de 6 pocillos a razón de 106 células por pocillo en un volumen total de 2 mL de medio. Las células se transfectaron con Isis N° 628785 u oligonucleótido de control a una concentración indicada en la Tabla 8 a continuación con reactivo de transfección TurboFect (Thermo Scientific, Carlsbad, CA). Las células se recolectaron y el ARN se extrajo 48 horas después de la transfección, y los niveles de ARNm de MECP2 se analizaron como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Tabla 8 a continuación como niveles promedio normalizados de ARNm de MECP2 para las células de ambos pacientes en relación con las células de control no tratadas. Los resultados muestran que Isis N° 628785 inhibió la expresión de MECP2 en células de pacientes con duplicación de MECP2 humana.
Tabla 8: Tratamiento con oligonucleótidos antisentido de linfoblastos de pacientes
Ejemplo 5: Reducción de la actividad convulsiva con un oligonucleótido antisentido dirigido a MECP2 humano in
vivo
[0246] Sin tratamiento, se producen convulsiones y descargas electrográficas anormales acompañantes en ratones MECP2-TG1 a medida que envejecen. Para probar el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre la actividad convulsiva en ratones MECP2-TG1, se realizaron registros de electrocefalografía y se observó la actividad convulsiva conductual.
[0247] Se anestesiaron ratones MECP2-TG1 de 25-35 semanas de edad que habían sido tratados como se describe en el Ejemplo 2 con isoflurano y se montaron en un marco estereotáxico para la implantación quirúrgica de tres electrodos de registro (alambre de plata recubierto de teflón, 125 pm de diámetro) en el espacio subdural de la corteza frontal izquierda, la corteza parietal izquierda y la corteza parietal derecha, con un electrodo de referencia colocado en la región occipital del cráneo. Después de 3 a 5 días de recuperación quirúrgica, se registró la actividad y el comportamiento del EEG cortical durante 2 h por día durante 3 a 5 días. Fuertes eventos de convulsiones electrográficas fueron típicamente acompañados por convulsiones conductuales. La Figura 1 muestra los trazos de EEG para ratones WT, ratones MECP2-TG1 sin tratamiento con Isis N° 628785 y ratones MECP2-TG1 que recibieron tratamiento con Isis N° 628785. El
Claims (15)
1. Un compuesto antisentido complementario a un ácido nucleico de MECP2 para su uso en el tratamiento del síndrome de duplicación de MECP2.
2. El compuesto antisentido para uso según la reivindicación 1, en el que el compuesto antisentido se administra por administración parenteral, en donde opcionalmente la administración parenteral es cualquiera de administración intracerebroventricular o administración intratecal.
3. El compuesto antisentido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que:
(a) la administración del compuesto antisentido reduce los niveles de proteína y/o ARNm de MECP2, en el que, opcionalmente, la administración reduce los niveles de proteína y/o ARNm de MECP2 en al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o 65 por ciento; y/o
(b) la administración del compuesto antisentido mejora la función motora, donde opcionalmente la función motora mejora al menos un 10, 15, 20, 25, 30 o 35 por ciento; y/o
(c) la administración del compuesto antisentido mejora la ansiedad, donde opcionalmente la administración mejora la ansiedad en al menos un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento; y/o
(d) la administración del compuesto antisentido mejora la interacción social, donde opcionalmente la administración mejora la interacción social en al menos un 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 por ciento; y/o (e) la administración del compuesto antisentido mejora la actividad, donde opcionalmente la administración mejora la actividad en al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 por ciento; y/o (f) la administración del compuesto antisentido reduce las convulsiones; y/o
(g) la administración del compuesto antisentido normaliza las descargas de EEG.
4. El compuesto antisentido para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido nucleico de MECP2 tiene la secuencia de nucleobases de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
5. El compuesto antisentido para uso según cualquier reivindicación anterior, en el que el compuesto antisentido es un oligonucleótido monocatenario.
6. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto antisentido es un gápmero.
7. El compuesto antisentido para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que al menos un enlace internucleósido del compuesto antisentido, o cada enlace internucleósido del compuesto antisentido, es un enlace internucleósido modificado, en el que opcionalmente el enlace internucleósido modificado es un enlace internucleósido fosforotioato.
8. El compuesto antisentido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que al menos un enlace internucleósido del compuesto antisentido es un enlace internucleósido fosforotioato y al menos un enlace internucleósido es un enlace internucleósido fosfodiéster.
9. El compuesto antisentido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos una nucleobase del compuesto antisentido es una nucleobase modificada, en el que opcionalmente la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
10. El compuesto antisentido para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que al menos un nucleósido del compuesto antisentido comprende un azúcar modificado, en el que opcionalmente el azúcar modificado es un azúcar bicíclico o comprende un grupo 2'-O-metoxietilo o comprende un grupo 2'-O-metilo.
11. El compuesto antisentido para uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde el azúcar bicíclico comprende un puente químico entre las posiciones 4' y 2' del azúcar, donde el puente químico se selecciona de: 4'-(CH2)n-O-2', donde n es 1 ó 2; 4'-CH2-O-CH2-2'; 4'-CH(CH3)-O-2'; y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'.
12. El compuesto antisentido para su uso según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos un nucleósido del compuesto antisentido comprende un sustituto de azúcar.
13. El compuesto antisentido para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto antisentido comprende un grupo conjugado.
14. El compuesto antisentido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6-13, en el que el compuesto antisentido es un compuesto de doble cadena.
15. El compuesto antisentido para uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el compuesto antisentido es 100% complementario al ácido nucleico de MECP2.
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