KR101198046B1

KR101198046B1 - ＴＴＰ 프로모터 내 특정 단일 ＣｐＧ 부위의 후생유전학적 지표를 이용한 암 발병／예후 진단 및 이의 조절을 통한 암 치료기술

Info

Publication number: KR101198046B1
Application number: KR1020090123321A
Authority: KR
Inventors: 염영일; 손보화; 박인영; 이정주; 장예진; 양석진; 박경찬; 유향숙; 최종영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-12-11
Filing date: 2009-12-11
Publication date: 2012-11-07
Also published as: US8703419B2; KR20110066595A; WO2011071232A1; US20120251499A1

Abstract

본 발명은 TTP(Tristetraprolin) 프로모터 내 특정 단일 CpG 부위의 후생유전학적 지표를 이용한 암 발생과 예후 진단 및 이의 조절을 통한 암 치료기술에 관한 것으로, 구체적으로, 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기인 C의 특이적 메틸화를 측정함으로써 간암의 발생여부 및 예후를 진단하고, 이를 조절하여 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 TTP 발현이 하향조절되고, 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기인 C가 메틸화된 간암의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있으며, 본 발명의 범위는 이에 그치지 않고 상기 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기 C의 특이적 메틸화 측정과 이의 조절을 통해 여타의 암 또는 염증질환 등 TTP의 발현이상과 관련된 질병들을 진단 및 치료하는 방법에 일반적으로 적용될 수 있다.

TTP 프로모터, 단일 CpG 섬, CpG 메틸화, 간암, 진단, 치료, shRNA

Description

ＴＴＰ 프로모터 내 특정 단일 ＣｐＧ 부위의 후생유전학적 지표를 이용한 암 발병／예후 진단 및 이의 조절을 통한 암 치료기술{Method for diagnosis/prognosis of cancers using an epigenetic marker consisting of a specific single CpG site in TTP promoter and treatment of cancers by regulating its epigenetic status}

본 발명은 후생유전학적 지표를 이용한 암 예후 진단 및 이의 조절을 통한 암 치료기술에 관한 것이다.

TGFβ1은 다양한 상피세포와 조혈세포의 성장, 이동, 분화, 사멸 등을 조절하는 다기능성 사이토카인으로써, 상기 다양한 기능적 효과에 의해 정상 상피세포의 성장은 억제하나 발암시에는 세포성장 억제기능이 소실되고 오히려 전이성 진행이 촉진되는 양면성을 갖는다. 많은 암세포에서 TGFβ 신호전달의 소실이 발견되는데, 이는 종양 촉진에 있어서 TGFβ 신호전달의 소실의 중요성을 반영하는 것으로 볼 수 있다. 반면에 암세포는 종종 신생혈관형성, 침윤, 전이 등 암 발생에 유 리한 TGFβ 신호전달의 기능을 방해하지 않으면서 TGFβ1에 대한 항증식성 반응을 선택적으로 소실시키기도 한다.

TGFβ1에 의한 항증식성 반응을 회피하기 위해 암에서 사용되는 기작 중의 하나는 암세포에서 높은 수준으로 c- Myc을 축적하는 것이다. 정상상피세포에서는 TGFβ1에 의한 세포증식 억제에 있어 c-Myc 발현량의 급속한 하향 조절이 필수적인 요건으로 작용하는데, 이는 세포증식억제자인 p15 ^Ink4b 및/또는 p21 ^Cip1 의 발현 유도에 중요한 선결조건이기 때문임이 잘 알려져 있다. 반대로 TGFβ1의 발현량과는 상관없이 c- Myc의 비정상적인 상향 조절이 여러 암세포에서 자주 관찰되었다. c- Myc 발현 억제능력의 상실은 유방암 및 난소암에서 TGFβ1에 의한 항증식성 효과를 극복하기에 충분하였다(Chen CR et al., Proc Natl Acad Sci USA 98:992-999, 2001). 이러한 사실들은 c- Myc 발현 조절능력의 상실(de-regulation)이 암세포에서 TGFβ1에 의한 항증식성 반응의 선택적 소실에 매우 중요한 요인으로 작용함을 보여주는 것이다.

이전의 보고에서 TGFβ1에 의한 c- Myc의 하향 조절이 c- Myc 프로모터내 침묵요소(silencer element)에 대한 Smad3의 결합을 통해 전사량을 조절함으로써 이루어짐이 보고된 바 있다(Frederick JP et al., Mol Cell Biol 24:2546-2559, 2004). 또한, 전사후 발현량 조절기작도 보고되었는데, 이는 c- Myc mRNA가 일반적으로 매우 불안정하여 세포에 TGFβ1 처리시 빠르게 분해되기 때문이다(Coffey RJ et al., Mol Cell Biol 8:3088-3093, 1988). 그러나 TGFβ1 신호에도 불구하고 암세포에서 관찰되는 c- Myc의 비정상적인 상향 조절에 대한 자세한 기작은 알려져 있지 않다. 최근에 Marderosian 등은 c- Myc mRNA의 3'-UTR에 위치하는 ARE(AU-rich element)에 TTP(Tristetraprolin)가 결합함으로써 c- Myc mRNA의 안정성이 음성적으로 조절되는 것으로 보고하였다(Marderosian M et al., Oncogene 25:6277-6290, 2006). TTP는 TGFβ1을 포함하는 다양한 자극에 의해 유도되므로, 이는 암에서 TGFβ1에 대한 반응과 관련하여 c- Myc의 중요한 전사후 조절자로 예상된다.

TTP(Tristetraprolin, ZFP36, TIS11 또는 NUP475)는 염증성 반응 조절기능을 갖는 전사후 조절자이다. TTP는 그 단백질 구조상의 CCCH로 이루어지는 연속적 징크 핑커 모티프(zinc finger motif)를 통해 표적 mRNA의 ARE에 결합하고, 디아데닐레이션(deadenylation)의 촉진, 디캡핑(decapping) 및 엑소핵산분해(exonucleolytic) 등을 매개함으로써 사이토카인 및 원형암유전자(Protooncogene)들의 전사체를 불안정화시킨다. 또한, TTP는 잠재적 종양 억제자로써 작용하는데, 이는 과발현시 다양한 인간 암세포주에서 세포사멸을 촉진하고, IL-3를 생산하는 종양 모델마우스에서 종양 형성을 늦추는 것으로 알려져 있다. 따라서 암세포에서는 mRNA 불안정화 활성과 관련된 TTP의 종양 억제기능이 소실되었을 가능성이 크다. 그러나 암발생 및 억제에서 TTP의 역할은 아직까지 명확하게 밝혀지지 않았다.

본 발명자들은 TTP 프로모터내 TGFβ1 반응성 영역에 위치한 단일 CpG 부위에서의 특이적 메틸화를 통해 간암 세포에서 TTP의 발현량이 감소하는 것을 발견하였다. 또한, 상기 단일 CpG 부위의 메틸화는 TGFβ1에 의한 TTP 발현유도 및 이에 따른 c- Myc의 하향조절을 차단하였고, 이는 종양 세포에서 TGFβ1의 항증식성 효과를 억제하는 데에 충분하였다. 상기 결과로부터, 본 발명자들은 TTP 프로모터내 단일 CpG 부위의 메틸화를 통한 c- Myc의 전사후 조절능 소실에 의해 간암 세포에서TGFβ1 신호전달회로의 기능이 세포주기 정지형으로부터 세포증식형으로 전환됨을 제안하였다.

본 발명의 목적은 간암 진단 또는 간암 예후 진단용 키트; 간암 진단; 및 예후 평가 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 간암치료제 및 간암 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되며, 상기 핵산 서열의 32번째 핵산이 시토신(Cytosine) 잔기이고, 상기 시토신 잔기의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 간암 진단 또는 간암 예후 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드의 32번째 핵산이 시토신(Cytosine) 잔기의 메틸화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 간암이 의심되는 개체로부터 수득한 임상시료로부터 분리된 게놈 DNA로부터

1) 상기 DNA를 대상으로 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기의 메틸화를 검출하는 단계; 및,

2) 단계 1)에서 메틸화가 검출된 경우, 간암의 발병가능성 및 예후를 예측하는 단계를 포함하는, 간암을 예측하기 위해 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기의 메틸화를 검출하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 종양 세포가 제거된 개체로부터 수득한 임상시료로부터 분리된 게놈 DNA로부터

2) 단계 1)에서 메틸화가 검출되지 않으면, 종양세포가 모두 제거된 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 간암 치료 개체의 예후를 평가하기 위해 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기의 메틸화를 검출하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 시토신 잔기의 메틸화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 간암발병 고위험군의 개체 또는 간암에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 간암 예방 및 치료방법을 제공한다.

본 발명은 TTP 발현이 하향조절되고, 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기인 C가 메틸화된 간암의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되며, 상기 핵산 서열의 32번째 핵산이 시토신(Cytosine) 잔기이고, 상기 시토신 잔기의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 간암 진단 또는 간암 예후 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체화에서, 잠재적인 종양 억제자로 작용하는 TTP(tristetraprolin)를 대상으로 여러 간암 세포주에서 TTP mRNA의 발현량을 조사한 결과, PLC/PRF/5 세포주를 제외한 11개의 간암 세포주에서 현저하게 발현량이 적은 것을 확인하였다(도 1A 참조). 그러나 상대적으로 TTP mRNA의 발현량이 적었던 상기 간암 세포주에 탈메틸화제를 처리함으로써, 상기 탈메틸화제의 농도에 의존적으로 TTP mRNA의 발현량이 현저하게 증가하였다(도 1B 및 도 1C 참조). 이로부터 간암 세포주에서 TTP mRNA의 하향 조절이 DNA 메틸화와 관련된 전사억제에 기인한 것을 제시하였다. 또한, 본 발명의 바람직한 구체화에서, TTP의 프로모터 및 인핸서(enhacer) 부위의 염기서열을 분석하여(도 2A 참조), TTP 프로모터의 TRR(TGFβ1-responsive region; TGFβ1 반응 영역: 서열번호 41)에 위치하는 단일 CpG 부위(#2 CpG)를 포함하여 90개의 CpG 부위를 확인하였다(도 2B 및 도 2C 참조). 상기 #2 CpG는 PLC/PRF/5 세포를 제외한, 모든 TTP mRNA가 하향조절된 모든 세포주에서 특이적으로 메틸화되었다. 또한, 본 발명의 바람직한 구체화에서 간암 임상조직시료(표 3 참조)를 대상으로 #2 CpG 부위의 메틸화를 조사한 결과, 종양 조직에서 광범위하게 메틸화되었으나, 비종양 및 정상 간 조직에서는 매우 드물게 메틸화되었으며, 다른 89개의 CpG 부위에서는 유의한 수준의 DNA 메틸화가 관찰되 지 않았다(도 3A 참조). 상기 #2 CpG 부위의 메틸화 정도 및 TTP mRNA의 발현량간에는 통계적으로 유의한 역상관 관계에 있음이 확인되었다(도 3B 내지 도 3D 참조).

또한, 본 발명의 바람직한 구체화에서 #2 CpG 부위가 메틸화되지 않은 세포에서 TGFβ1은 탈메틸화제의 도움이 없이도 TTP mRNA의 발현을 유도하였다. 그러나 #2 CpG 부위가 메틸화된 간암 세포주에서는 TGFβ1/탈메틸화제의 공동 처리에 의해 TTP mRNA의 발현이 유도되었다. 이로부터 TGFβ1에 의한 TTP 발현의 유도가 #2 CpG 부위의 메틸화에 의해 차단되는 것을 지시하였다(도 4A 참조). 특히, TGFβ1에 의해 유도된 TTP 프로모터 활성이 #2 CpG 부위에서 시토신(Cytosine; C)의 메틸화에 의해 직접적이고 결정적으로 조절되는 것을 확인하였다(도 4B 및 도 4C 참조).

이에, 본 발명에서 확인한 바와 같이 TTP 프로모터 내의 #2 CpG의 메틸화의 측정은 간암 진단 또는 간암 예후 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 키트는 추가로 메틸화되지 않은 시토신(C) 잔기를 변형시키는 시약을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체화에서, 검출 대상이 되는 임상시료로부터 분리된 DNA에 상기 시약을 처리한 후, 본 발명의 프로브 또는 프라이머 쌍을 이용하여 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기의 메틸화를 측정할 수 있다. 구체적으로, 상기 32번째 염기는 C이므로, 상기 C 잔기의 메틸화 여부에 따라, 상기 시약 처리 후 상기 32번째 염기가 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 이에, 프로브의 경우, 상기 메틸화 여부에 따라 상기 32번째 염기를 포함하는 서열 번호 41로 기재되는 핵산 서열에 상보적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있으며, 프라이머 쌍의 경우, 상기 메틸화 여부에 따라 상기 32번째 염기의 염기서열분석 결과가 C 이거나 C가 아닐 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 추가로 정상 간 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트의 분석대상이 되는 임상시료는 생검시료 또는 혈액시료일 수 있고, 상기 생검시료는 간암 예후 진단의 경우 외과적 수술 도중 종양 세포가 제거된 개체의 간암 조직에서 추가로 적취된 간 조직일 수 있고, 간암 진단의 경우 간암이 의심되는 개체의 간으로부터 적취된 조직일 수 있다.

상기 키트의 프로브는 엄격한 혼성화 조건하에서 상기 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하도록 제작된 것이 바람직하며, 상기 32번째 시토신 잔기를 포함하는 연속적인 15 내지 25 핵산 길이의 센스 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 30 핵산 길이의 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25 핵산 길이의 센스 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것은 모두 사용 가능하다.

상기 특이적 결합은 비특이적인 혼성체가 형성되지 않고, 특이적인 혼성체가 형성되는 것을 의미하고, 상기 엄격한 혼성화 조건은 통상적인 방법에 따라 혼성체를 형성하는 핵산의 융해 온도(Tm) 등에 기초하여 결정할 수 있다. 구체적인 혼성화 상태를 유지할 수 있는 세정 조건으로는 통상 「1× SSC, 0.1% SDS, 37℃」정도의 조건, 더욱 엄격하게는 「0.5× SSC, 0.1% SDS, 42℃」정도의 조건, 더욱더 엄격하게는 「0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃」정도의 조건을 들 수 있다.

상기 프로브는 임의의 고형 기질에 고정화해 이용할 수도 있다. 상기 고형기질로는 유전자 칩 cDNA 마이크로 어레이, 올리고 DNA 어레이, 멤브레인 필터(membrane filter) 등도 포함된다.

상기 키트의 프라이머쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택되어 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 15 내지 50 핵산 길이, 바람직하게는 15 내지 30 핵산 길이, 더욱 바람직하게는 18 내지 25 핵산 길이의 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드는 모두 사용 가능하다:

1) 서열번호 5로 기재되는 센스 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 안티센스 프라이머로 구성되는 프라이머쌍 1;

2) 서열번호 11로 기재되는 센스 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 안티센스 프라이머로 구성되는 프라이머쌍 2; 및,

3) 상기 프라이머쌍 2 및 서열번호 13으로 기재되는 프라이머로 구성되는 프라이머쌍 3.

본 발명에서 상기 프라이머쌍 1은 도 2 및 도 3에서 #2 CpG가 위치하는 R1의 증폭을, 프라이머쌍 2는 #2 CpG의 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석에서 DNA 증폭을, 프라이머쌍 3은 #2 CpG의 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 증폭 및 시퀀싱(sequencing) 등을 각각 수행하기 위해 사용하는 primer들이다.

또는 상기 프라이머쌍은 상기 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기를 포함하는 연속적인 15 내지 50 핵산 길이의 염기로 구성되며, 상기 32번째 염기를 3' 말단으로 갖는 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나 가질 수 있다. 상기 3' 말단에 32번째 염기를 가짐으로써, 상기 32번째 염기가 메틸화되지 않은 경우, 메틸화되지 않은 시토신(C) 잔기를 변형시키는 시약에 의해 변형된 게놈 DNA 시료에서는 증폭 반응이 일어나지 않는 것은 당업자에게 자명하다.

이때, 상기 키트는 PCR 반응의 요소로써 디옥시뉴클레오티드 혼합물(dNTP mixture) 및 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, Taq DNA 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트에는 PCR 결과를 확인하는데 필요한 6-FAM, NED 또는 HEX 등의 형광물질, 아가로스와 전기영동 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 증폭반응 요소가 상기 프라이머 쌍과의 사전혼합물(premix) 형태로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 프라이머쌍 1을 이용하여 증폭한 R1을 서열번호 5 내지 서열번호 6, 또는 R1 내에서 유래한 상보적인 프라이머를 사용하여 일반 염기서열분석장치에서 직접 분석하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 내의 32번째 핵산이 시토신(Cytosine) 잔기의 메틸화를 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구체화에서 간암 세포에서 TTP(tristetraprolin) 프로모터 내의 #2 CpG의 메틸화의 여부에 따라 TTP mRNA의 발현량이 조절되는 것을 확인하였다(도 1 내지 도 3 참조). 또한, 본 발명의 바람직한 구체화에서 TGFβ1에 의 해 유도된 TTP 프로모터 활성이 상기 #2 CpG 부위 시토신(Cytosine; C)의 메틸화에 의해 결정적으로 조절되는 것을 확인하였다(도 4A 내지 도 4C 참조). 상기 #2 CpG의 메틸화에 의해 차단되는 TGFβ1에 대한 반응성은 상기 #2 CpG 부위를 포함하는 TRR을 작동가능하게 연결함으로써 이형 프로모터에 수여될 수도 있다(도 4D 참조). 또한, #2 CpG 부위가 메틸화되지 않은 세포에서는 탈메틸화제의 처리와 상관없이 TGFβ1에 의해 TRR에서의 RNAPII 단백질 결합율이 현저히 증가되었으나, #2 CpG 부위가 메틸화된 세포에서는 탈메틸화제의 전처리가 있는 경우에만 TGFβ1에 의해 TRR에서의 RNAPII 단백질 결합율이 증가되었다(도 5A 및 도 5B 참조). 또한, #2 CpG 부위가 메틸화되지 않은 세포에서는 탈메틸화제의 처리와 상관없이 TGFβ1에 의해 TRR(영역 a)에서 히스톤 H3('Ac-H3') 및 H4('Ac-H4')의 아세틸화가 증가되었으나, 메틸화된 세포에서는 탈메틸화제의 전처리가 있어야 이러한 현상이 일어났다(도 5A 및 도 5C 참조). 또한, 본 발명자들은 #2 CpG 부위가 메틸화된 세포에서 MECP2/c-Ski/DNMT3A(DNA methyltransferase 3A: DNA 메틸전이효소 3A)로 구성되는 단백질 복합체가 TTP 로커스의 메틸화된 TRR에 결합하여 유전자 전사를 억제하는 주요 억제자임을 제안하였다(도 5D 참조).

또한, 본 발명의 바람직한 구체화에서 #2 CpG 부위가 메틸화된 세포의 경우 TGFβ1/탈메틸화제의 공동처리에 의해 TGFβ1에 의한 c- Myc mRNA 하향 조절능이 회복되었고(도 6A 참조), 표현형상으로도 세포성장 억제를 수반하며 p21 ^Cip1 의 발현을 유도하였다(도 6B 참조). 또한, #2 CpG 부위가 메틸화되지 않은 세포에서 c- Myc과 p21 ^Cip1 발현 및 세포성장에 대한 TTP의 직접적인 영향을 확인하였다(도 6C 참조). 특히, 간암 세포에서 TTP에 대한 shRNA를 이용하여 TTP 발현을 비활성화 시켰을 때 c- Myc mRNA와 단백질의 안정성이 증가되고, 이에 따라 p21 ^Cip1 발현이 지속적으로 억제될 뿐 아니라 TGFβ1에 의한 세포성장 억제효과에 대해서도 저항성이 유도됨을 제시하였다(도 6D, 도 6E 및 도 7 참조).

아울러, 본 발명의 바람직한 구체화에서 통계적으로 조사한 결과, 간암에서 #2 CpG 부위가 과메틸화되었을 때 #2 CpG 메틸화와 c- Myc 발현 사이에 임상학적으로 유의한 관련성이 있었다(도 8 참조).

이에, 본 발명에서 확인한 바와 같이 TTP 발현이 하향조절되고, TTP 프로모터 내의 #2 CpG가 메틸화된 간암세포에 이 #2 CpG의 메틸화를 억제하는 물질을 처리할 경우, TGFβ1에 의한 TTP의 발현을 활성화시켜서 c- myc 발현이 감소하고 세포성장이 억제되며 세포사멸이 증가함으로써 간암치료에 유용하게 이용될 수 있는 것을 확인하였다.

상기 약학적 조성물은 TTP 발현이 하향조절되고, 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기인 C가 메틸화된 간암을 대상으로 하는 것을 특징으로 한다. 그러나 본 발명이 간암에만 한정되는 것은 아니며, TTP 발현이 하향조절되고 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기인 C가 메틸화된 모든 암종 및 염증성 질병 등 유관 질병의 치료에도 보편적으로 적용될 수 있다.

상기 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기가 C이고, 상기 32번 째 염기의 메틸화를 억제하는 물질에는 본 발명에서 TTP 로커스의 TRR에 결합하여 이의 메틸화를 유도하는 주요 전사억제자 복합체로 확인된 MECP2/c-Ski/DNMT3A(DNA methyltransferase 3A: DNA 메틸전이효소 3A)의 형성과 결합을 억제하는 물질 또는 DNA 탈메틸화제가 포함될 수 있으며, 상기 MECP2/c-Ski/DNMT3A 복합체의 형성 및 결합을 억제하는 물질로써는 MECP2, c-Ski, DNMT3A, SMAD2/3 등에 대한 siRNA, 안티센스(antisense) RNA, shRNA, 리보자임(ribozyme) 등을 포함하는 재조합바이러스, 상기 단백질들간의 상호작용을 저해하는 저분자물질, 천연물, 펩티드 또는 그 유도체 등이 사용될 수 있고, 또한 상기 DNA 탈메틸화제로는 5-아자데옥시사이티딘(5-Aza-2‘-deoxycytidine, AzadC, Decitabine), 5-아자사이티딘(5-Azacytidine, AzaC), 제부라린{Zebularine, 1-(β-d-ribofuranosyl)-1,2-dihydropyrimidin-2-one} 또는, DNMT1 및 DNMT3A를 표적으로 하는 siRNA 또는 shRNA를 포함하는 재조합바이러스 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 추가로 TGFβ1 또는 TGFβ1 전달경로(pathway)를 활성화시킬 수 있는 물질과 함께 처리될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위해서 상기에 기재된 유효성분 이외에 추가로 약제학적 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용 할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다. 아울러, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 약학적 조성물은 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

본 발명의 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 약학적 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 약학적 조성물의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협 력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 개체의 체중이 증가할 수록 본 발명의 약학적 조성물을 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.

본 발명이 적용가능한 개체는 인간을 포함한 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 인간 또는, 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 인간 또는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

상기 임상시료는 생검시료 또는 혈액시료일 수 있고, 상기 생검시료는 간암 예후 진단의 경우 외과적 수술 도중 종양 세포가 제거된 개체의 간암 조직에서 추가로 적취된 간 조직일 수 있고, 간암 진단의 경우 간암이 의심되는 개체의 간으로부터 적취된 조직일 수 있다.

구체적으로, 단계 1)의 메틸화를 검출하는 단계는

i) 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약을 상기 DNA에 처리하는 단계;

ⅱ) 상기 단계 i)의 처리된 DNA를 본 발명의 키트에 포함된 프로브 또는 프라이머 쌍을 이용하여 혼성화 반응; PCR 또는 염기서열 분석을 수행하는 단계; 및,

ⅲ) 상기 단계 ⅱ)의 분석 결과를 이용하여 메틸화를 판정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 사용목적에 따라 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 등에 투여하는 방법)로 할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여가 바람직하다. 경우에 따라 본 발명의 약학적 조성물의 접근을 빠르고 용이하게 하기 위하여 국부적인 투여가 바람직할 수도 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1회 투여량은 약 5 내지 500 ㎎/m²의 양으로 일 단위 또는 주 단위로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 상기 환자를 치료하는 의사의 재량에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 간암에 걸린 개체의 치료를 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병행하여 사용될 수 있고, 바람직하게는 추가로 TGFβ1과 함께 처리될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 간암 세포주에서 DNA 메틸화를 통한 TTP ( tristetraprolin ) 발현의 억제

<1-1> 간암 세포주의 배양

SK-Hep1, Hep3B, PLC/PRF/5, HepG2(ATCC, USA) 및 HuH-7(HSRRB, Japan) 세포주는 열처리로 비활성화된 10% 우태아혈청 및 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle medium; Invitrogen, USA)에서 배양되었다. SNU 세포주(KCLB, Korea)는 DMEM 배지 대신에 RPMI1640(Invitrogen) 배지를 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 배양되었다.

<1-2> RT - PCR 에 의한 TTP mRNA 발현량 비교

상기 세포주로부터 RNeasy mini kit(QIAGEN, USA)를 이용하여 전체 RNA를 추출한 뒤, 전체 RNA 1 ㎍과 oligo-d(T) 1 ㎕(Invitrogen, USA, 0.5 ㎍/㎕)에 증류수를 50 ㎕까지 채운 후, AccuPower RT-premix(Bioneer, 한국)에 넣어 RT-PCR 반응시켰다. 70℃에서 5분, 4℃에서 5분, 42℃에서 60분, 94℃에서 5분, 4℃에서 5분간 반응하여 cDNA를 합성함으로써 수득하였다. 상기 cDNA(3-5 ㎕) 또는 증류수(음성 대조군)를 주형으로 하여, 표 1의 프라이머 쌍 및 PCR Master Mix(Promega, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 더욱 상세하게는, 95℃에서 5분 동안 변성해주고, 95℃ 45초, 65℃ 45초, 72℃ 45초의 조건으로 35 회전을 돌린 후, 72℃에서 5분 동안 신장시켜준 뒤, 4℃에서 냉각의 순서로 수행하였다. 증폭산물의 정량은 β-액틴에 대하여 표준화하였다.

Gene	센스 프라이머	안티센스 프라이머
TTP	CCATCTACGAGAGCCTCCTG: 서열번호 1	TCCGACATAGCTCAGTCTTGTA: 서열번호 2
β- ACTIN	CCATCGAGCACGGCATCGTCACCA: 서열번호 3	CTCGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT: 서열번호 4

그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 정상 인간 간에서의 TTP mRNA 발현량과 비교하여, PLC/PRF/5를 제외한 11개 HCC 세포주에서 TTP mRNA 발현이 현저하게 낮은 것으로 나타났다.

<1-3> DNA 탈메틸화제의 처리에 의한 TTP mRNA 발현량 비교

상기 실시예 1-1의 12개의 세포주의 배양 시 DNA 탈메틸화제인 5-아자데옥시사이티딘(5-Azadeoxycytidine, AzadC; Sigma-Aldrich, USA)을 72시간 동안 2 mol/L의 농도로 처리한 후, 상기 실시예 1-2의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 1B에서 나타난 바와 같이 상대적으로 낮은 TTP mRNA 발현량을 나타내는 대부분의 세포주에서 AzadC 처리에 의해 TTP의 발현이 현저하게 증가되었다.

<1-4> DNA 탈메틸화제의 농도의존적 TTP 발현량 비교

상기 실시예 1-1의 4개의 세포주의 배양 시 AzadC를 0, 1, 2 및 5 μM의 농도로 처리한 후, 상기 실시예 1-2의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 1C에서 나타난 바와 같이 SK-Hep1, Hep3B 및 SNU182 세포주에서 AzadC 농도 의존적 TTP 발현이 유도되었다. 반대로 본래 TTP 발현이 높은 PLC/PRF/5 세포에서는 AzadC를 고농도로 처리하더라도 TTP 발현이 농도 의존적 증가를 보이지 않았다.

이로부터, 간암 세포주에서 TTP의 하향 조절이 DNA 메틸화와 관련된 전사 억제에 기인한 것임을 시사하였다.

< 실시예 2> 간암 세포주에서 TTP 프로모터 내의 단일 CpG 부위 메틸화를 확인

도 2A에 나타낸 바와 같이 TTP 프로모터 및 인핸서(enhacer) 부위의 염기서열 분석을 위해, TTP의 전사개시점으로부터 -600 bp 내지 +878 bp 위치를 R1 내지 R3의 세 구역으로 나눈 후, 하기 표 2의 프라이머쌍을 이용하여 아황산(bisulfite) 염기서열분석을 수행하였다. 즉, 아황산을 처리하여 모든 시토신(cytosine) 잔기를 우라실(urasil)로 전환시킨 후, 염기서열을 분석하였다. 메틸화된 시토신은 우라실로 전환되지 않았다.

영역	센스 프라이머	안티센스 프라이머
R1	TGGGATTATAGGTGTGAGTT: 서열번호 5	AACAATCAAATCCATAATATAAC: 서열번호 6
R2	GTTATATTATGGATTTGATTGTT: 서열번호 7	CACCCTAAAACTTCAACCC: 서열번호 8
R3	GTTGAAGTTTTAGGGTGGG: 서열번호 9	TAAAACACCTAAAAATACAAAAC: 서열번호 10

그 결과, 도 2B 및 도 2C에 나타난 바와 같이 90개의 CpG 부위를 확인하였고, CpG 섬의 5'-경계에 위치하는 TTP 프로모터의 TRR(TGFβ1 responsive region; TGFβ1 반응 영역: 서열번호 41)에 단일 CpG 부위(#2 CpG)가 위치하였다. TRR은 TGFβ1과 관련된 TTP 유도의 주요 조절 영역에 해당하는 부위로써 4개의 SMAD 결합 요소를 포함하였다. 상기 #2 CpG는 PLC/PRF/5 세포를 제외한, TTP가 하향조절된 모든 세포주에서 독점적으로 메틸화되었다.

< 실시예 3> 간암 임상 시료조직에서 #2 CpG 부위의 메틸화 조사

<3-1> 간암 임상 시료조직

하기 표 3에 나타난 바와 같이, 24개의 수술 절제된 간암 조직 시료 및 대응하는 인접하는 비종양성 조직시료를 한국 카톨릭대의 외과병리파일(CUKCM, Korea)로부터 수득하였다. 간암 조직시료는 Edmondson-Steiner grading system을 이용하여 진단되었다. 모든 시료는 CUKCM의 연구소 심사 위원회에서 승인되었고, 충분한 동의도 얻었다. 대조군으로 정상 인간 간 게놈 DNA(BioChain) 및 정상 인간 간 전체 RNA(Clontech, USA)를 구입하여 사용하였다.

번호	나이	성별	섬유화 정도 ^a	Edmondson- Steiner 정도	Virus ^b	TTP mRNA 발현 ^c		#2 CpG 메틸화^d(%)
번호	나이	성별	섬유화 정도 ^a	Edmondson- Steiner 정도	Virus ^b	비종양	종양	비종양	종양
1	69	M	4	Ⅰ	B	1.36 0.07	0.23 0.01	2.6	45.9
2	49	M	4	Ⅱ	B	1.02 0.08	0.17 0.01	4.1	32.6
3	57	M	4	Ⅳ	B	0.31 0.06	0.23 0.05	31.4	39.8
4	58	F	4	Ⅱ	N	1.50 0.10	0.33 0.04	3.8	39.7
5	70	M	4	Ⅳ	C	0.73 0.04	0.35 0.03	19.9	33.2
6	29	F	4	Ⅰ	B	1.08 0.09	0.19 0.02	4.0	46.9
7	58	M	2	Ⅳ	B	0.32 0.04	0.07 0.01	21.6	29.3
8	53	M	4	Ⅱ	N	0.95 0.08	0.22 0.03	5.1	5.8
9	52	M	4	Ⅱ	B	0.20 0.04	0.46 0.07	5.6	5.8
10	47	M	4	Ⅲ	C	1.06 0.12	0.68 0.07	14.9	20.5
11	49	M	3	Ⅲ	B	1.59 0.07	0.23 0.01	6.8	57.9
12	42	M	4	Ⅲ	B	0.17 0.01	0.18 0.01	6.3	7.3
13	45	M	3	Ⅲ	B	1.69 0.08	0.20 0.02	3.3	60.3
14	50	M	4	Ⅰ	B	0.60 0.09	0.11 0.01	7.5	6.8
15	55	M	4	Ⅰ	B	0.55 0.07	0.52 0.04	16.5	23.1
16	44	M	1	Ⅲ	B	1.17 0.08	1.15 0.08	4.2	3.4
17	53	F	3	Ⅱ	C	1.81 0.12	0.05 0.01	6.6	63.6
18	63	M	4	Ⅲ	B	1.2 0.08	1.16 0.07	2.5	3.4
19	54	M	4	Ⅱ	B	1.09 0.10	0.96 0.10	4.5	5.1
20	59	M	4	Ⅲ	C	0.93 0.07	0.06 0.01	4.6	29.5
21	50	M	4	Ⅳ	B	0.60 0.04	0.11 0.01	15.0	14.8
22	52	M	4	Ⅱ	B	0.39 0.04	0.11 0.01	15.7	11.1
23	60	M	4	Ⅰ	B	0.64 0.09	0.42 0.02	7.9	13.7
24	42	M	4	Ⅱ	B	1.19 0.17	0.46 0.07	3.4	15.0

a: 간견병증을 포함한 섬유화정도(fibrosis grade)는 외과 절제술 당시에 비종양 조직으로부터 수득된 정보를 나타낸다; 0 = 간문맥 섬유화가 없음, 1 = 간문맥의 섬유화, 2 = 문맥주위의 섬유화, 4 = 간견병증.

b: 바이러스 감염; B = HBV 감염, C = HCV 감염, N = HBV 및 HCV 감염이 검출되지 않음.

c: RT-PCR로 분석한 결과,

d: 파이로시퀀싱으로 분석한 결과.

<3-2> 간암 조직에서 메틸화 분석

상기 실시예 3-1의 11번 및 27번 시료의 비종양 조직 및 종양 조직을 대상으로 상기 실시예 2의 방법으로 아황산 염기서열을 분석한 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 #2 CpG 부위는 종양 조직(63.6% 및 72.7%)에서 광범위하게 메틸화되었으나, 비종양(10.0% 및 11.1%) 및 정상 간 조직(0.0%)에서는 드문드문하게 메틸화되었다. 다른 89개의 CpG 부위에서는 어떤 경우에서도 유의한 수준의 DNA 메틸화가 관찰되지 않았다.

< 실시예 4> 간암 임상 시료조직에서 TTP 발현 및 #2 CpG 부위의 메틸화의 상관관계 조사

<4-1> #2 CpG 부위의 메틸화 분석

상기 실시예 3-1의 간암 환자의 비종양 조직 및 종양 조직을 대상으로, 표 4의 프라이머 쌍을 이용하는, 정량적 파이로시퀀싱 분석을 통해 24쌍 종양-비종양 조직의 #2 CpG 부위에서 DNA 메틸화 정도를 측정하였다. 파이로시퀀싱 분석은 이전의 공지된 기술에 따라 PSQ HS 96 Gold SNP 시약 및 PSQ HS 96 파이로시퀀싱기(Biotage, Sweden)를 이용하여 제조자의 설명서에 따라 수행하였다(Park IY et al., J Cell Biochem 94:585-596, 2005).

그 결과, 도 3B 및 표 3에서 나타난 바와 같이 #2 CpG 부위의 평균 메틸화 정도는 비종양 및 종양군에서 각각 9.07% 및 25.6%이었다(도 3B 및 표 3). 개별 조직 분석에서 비종양 조직의 29.2%(7/24) 및 종양조직의 70.8%(17/24)는 비종양 조직의 평균값보다 더 높은 #2 CpG 부위 메틸화 비율을 나타내었다.

PCR	TGTTTTTTTTTGTGATTTTTTTAA: 서열번호 11	Biotin-CAAAAAAATACAAACAAACAAAC: 서열번호 12
서열분석	GAATTTGTTTTTGGGATTGTT(#2 CpG sequencing primer): 서열번호 13

<4-2> TTP 발현 분석

상기 실시예 3-1의 간암 환자의 비종양 조직 및 종양 조직을 대상으로 상기 실시예 1-2의 방법으로 TTP의 발현량을 RT-PCR 분석법으로 확인하였다.

그 결과, 도 3C 및 표 3에서 나타난 바와 같이 비종양 조직의 20.8%(5/24) 및 종양 조직의 79.2%(19/24)가 정상 간에서 측정된 것보다 적은 양의 TTP를 발현하는 것으로 나타났다.

<4-3> TTP mRNA 발현량과 #2 CpG 메틸화 정도간의 상관관계 분석

상기 실시예 4-1의 결과 및 4-2의 결과를 산점도로 나타내었을 때, 도 3D에서 나타난 바와 같이 TTP mRNA 발현량 및 #2 CpG 부위에서의 메틸화 정량값 사이의 통계적으로 유의한 역상관성이 관찰되었다(γ = -0.606383, P <.001).

< 실시예 5> TTP 발현의 조절에서 #2 CpG 메틸화의 직접적인 관련성 조사

<5-1> TGF β1에 의한 TTP 유도와 #2 CpG 메틸화의 관련

도 2A에서 나타낸 바와 같이, #2 CpG 부위는 TTP 프로모터내에서 4개의 SMAD 결합 요소를 보유함으로써 TGFβ1에 의한 TTP 발현유도의 주요 조절 영역으로 작용하는 TRR에 위치하였다. 상기 결과로부터 간암 세포에서 #2 CpG의 후생유전학적(epigenetic) 상태에 의해 TGFβ1에 의한 TTP의 기저 수준의 발현 및 유도성 발현이 결정될 것을 제안하였고, 이를 확인하였다. 구체적으로, PLC/PRF/5 세포 및 SK-Hep1 세포에 AzadC를 상기 실시예 1-3의 방법으로 처리하였고, TGFβ1(R&D systems, USA)을 0, 0.5, 1, 1.5, 3, 6 및 12시간 동안 5 ㎍/L의 농도로 처리하였다. 이후, 상기 실시예 1-2의 방법으로 TTP의 발현량을 RT-PCR 분석법으로 확인하였다.

그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이 #2 CpG 부위가 메틸화되지 않은 PLC/PRF/5 세포에서 TGFβ1 처리 후 30분 안에 TTP 발현이 증가하였고, 1시간 만에 최대로 증가하였으며, 이는 AzadC의 영향과 무관함을 확인하였다. 그러나 #2 CpG 부위의 높은 메틸화를 보이는 SK-Hep1 세포에서는 TGFβ1 단독처리에 의해서 TTP 발현이 유도되지 않았고 TGFβ1/AzadC의 공동 처리에 의해서만 유도되었다. 상기 결과로부터 #2 CpG 부위의 메틸화가 SK-Hep1 세포에서 TGFβ1에 의한 TTP 발현의 유도를 차단하는 것을 제시하였다.

<5-2> TTP 프로모터 영역의 전사 활성과 #2 CpG 메틸화의 관련

#2 CpG 부위의 메틸화에 의해 TTP 발현이 직접적으로 조절되는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 루시퍼라아제 리포터 검사를 사용하여 #2 CpG 부위의 메틸화 상태에 관한 TTP 프로모터 영역의 전사 활성을 검사하였다.

루시퍼라아제 검사는 Promega Luciferase Assay System(Promega, USA)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. TTP 프로모터의 루시퍼라아제 리포터 구조물 제작을 위해 먼저 정상 인간 게놈 DNA(BioChain, USA)로부터 하기 표 5의 프라이머쌍을 이용하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 TTP 프로모터 영역을 증폭함으로써 야생형 TTP 프로모터(WT), #2 CpG 부위에서 단일 염기가 시토신이 티민으로 치환된 TTP 프로모터(C->T) 및 TRR이 결실된 TTP 프로모터(Del) 등의 PCR 산물을 제작하였고, 이들을 선형화된 pGL3 기본 벡터(Promega, USA)의 KpnI/BglII 영역에 클로닝하였다. 연결된 산물은 대장균에서 증폭시킨 후 정제과정을 거쳐 LipofectAMINE Plus 시약(Invitrogen)을 이용하여 SK-Hep1 세포로 형질도입되었다. 즉, 12-웰 플레이트에 1× 10⁵ 세포/웰의 세포에 상기 TTP 프로모터의 루시퍼라아제 리포터 구조물(0.25 ㎍)을 레닐라(renilla) 루시퍼라아제를 암호화하는 대조군 플라스미드(0.05 ㎍)와 함께 공동 형질도입(transfection)하였다. 이때 AzadC는 형질도입 12시간 전에 처리하였다. TGFβ1을 추가로 처리한 후, 루미노미터기(Berthold Lumat LB9501, Germany)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 리포터 구조물의 형질감염 효율은 레닐라 루시퍼라아제의 활성을 대조군으로 이용하여 표준화시켰다.

WT	TAAGGTACCAGGTGTGAGCCACTGCGCTC (Kpn I): 서열번호 14	GGAGATCTGGTGTAACGGTTGGCCATG (Bgl II): 서열번호 15
C->T	TAAGGTACCAGGTGTGAGCCACTGCGCTC (Kpn I): 서열번호 16	GACAGGGTGAGGAAGGGAGGGAAGACAGG (Hph I): 서열번호 17
C->T	CGTCTTCCCTCCCTTCCTCACCCTGTC (Hph I): 서열번호 18	GGAGATCTGGTGTAACGGTTGGCCATG (Bgl II): 서열번호 19
Del	TAAGGTACCATGTTTTTCTCTCTGCCTGTCTG (Kpn I): 서열번호 20	GGGAGATCTGGTGTAACGGTTGGCCATG (BglII): 서열번호 21

그 결과, 도 4B에서 나타난 바와 같이 야생형 TTP 프로모터(WT)는 SK-Hep1 세포에서 TGFβ1에 반응성을 보이지 않았다. 여기에 AzadC를 처리하였을 때 TTP 프로모터의 기저수준의 활성이 향상되었고, TGFβ1에 대한 반응성도 회복되었다. #2 CpG 부위의 단일 염기를 시토신에서 티민으로 치환(C->T)시켜 DNA 메틸화를 차단할 경우 TTP 프로모터의 기저수준의 활성을 현저히 증가되었고, AzadC 처리와는 무관하게 TGFβ1에 대한 반응성도 회복되었다. TRR의 결실(Del)도 (C→T) 치환체의 경우처럼 TTP 프로모터의 기저수준의 활성을 크게 향상시켰으나, TGFβ1에 대한 반응성은 회복되지 않았으며, 이로써 TRR이 TGFβ1에 의한 TTP 발현 유도의 반응성을 부여함을 재확인하였다. #2 CpG 부위의 점돌연변이(C->T)는 TRR 전체의 결실(Del)에서 관찰된 것과 유사한 정도로 기저수준 전사활성에 영향을 주었다. 따라서, SK-Hep1 세포에서 #2 CpG 부위의 시토신 메틸화는 기저수준 및 TGFβ1 유도된 TTP 프로모터의 활성을 모두 하향 조절하는 데에 직접적이고 결정적으로 관여하는 것으로 나타났다.

<5-3> TGF β1에 의한 TTP 프로모터의 유도성과 #2 CpG 의 인위적 메틸화와의 관계

정상 인간 게놈 DNA(BioChain, USA)로부터 하기 표 6의 프라이머쌍을 이용하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 PCR을 수행하여 TTP 프로모터 영역을 증폭함으로써 TTP-Luc 또는 SV40-Luc 구조물을 제작하였다. 상기 PCR 산물을 SssI 메틸전이효소(methyltransferase; New England Biolabs, USA)로 처리하여 위치 특이적 메틸화를 수행하여 #2 CpG 부위 및/또는 TTP 프로모터의 전체 CpG 부위가 in vitro에서 메틸화된 리포터 구조체를 제작한 후, 이를 선형화된 pGL3 기본 벡터의 KpnI/BglII 영역에 클로닝하여 연결시킨 후 증폭 과정을 거치지 않고 상기 실시예 5-2의 방법으로 바로 PLC/PRF/5 세포로 형질도입시켰다. 이어 TGFβ1을 추가로 처리한 후 발현된 루시퍼라아제 리포터의 활성을 측정하였다.

TTP-Luc	TTAGGTACCCTCAGCCCCTTTCTGTTTCTT (Kpn I) 서열번호 22	GACAGGGTGAGGAAGGGAGGGAAGACG (HphI) 서열번호 23
TTP-Luc	CGTCTTCCCTCCCTTCCTCACCCTGTC (Hph I) 서열번호 24	GGGAGATCTGGTGTAACGGTTGGCCATG (Bgl II) 서열번호 25
SV40-Luc	TTAGGTACCCTCAGCCCCTTTCTGTTTCTT (Kpn I) 서열번호 26	GGGAGATCTCACACCAAGAGACATACAGAGA (Bgl II) 서열번호 27

그 결과, 도 4C에서 나타난 바와 같이 TGFβ1에 의한 TTP 프로모터의 유도성은 #2 CpG 부위의 특이적 메틸화에 따라서 PLC/PRF/5 세포에서 분명하게 소실되었다. 또한, 전체 TTP 프로모터 영역의 메틸화는 기저수준 및 TGFβ1에 의해 유도된 프로모터 활성 모두를 억제하였다.

또한, 도 4D에서 나타난 바와 같이 이형 프로모터인 SV40 프로모터에 TTP의 TRR이 연결시켜 루시퍼라아제 리포터 활성을 분석한 결과, #2 CpG의 메틸화에 의해 차단되는 TGFβ1에 대한 반응성이 TTP 프로모터 이외의 이형 프로모터에도 부여될 수 있음을 확인하였고, 이로써 TTP의 TRR에서 #2 CpG가 메틸화된 유전자조절부위가 기저수준 및 TGFβ1에 의해 유도된 프로모터 활성을 일반적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 6> TRR 에 대한 전사 억제자들의 DNA 메틸화 의존적 결합특성 조사

<6-1> TRR 에 대한 RNAPII 결합의 DNA 메틸화 의존적 특성

본 발명자들은 TTP 로커스에 결합하는 여러 가지 형태의 인산화된 RNAPII(RNA polymerase II)의 결합량을 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 분석으로 확인함으로써 TTP의 후생유전학적 조절의 분자기작을 확인하였다. 즉, 전사 개시의 척도로써는 비인산화된 형태(unphosphorylated form; unP)의 RNAPII를, 프로모터 탈출/캡핑 및 전사 연장의 척도로써는 카복시-말단 반복 영역의 세린 5(pS5) 및 세린 2(pS2)가 인산화된 형태의 RNAPII를 각각 측정하였다.

ChIP 분석은 특이적 검사 키트(Millipore, USA)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 미리 AzadC를 72시간 동안 처리하거나 처리하지 않은, SK-Hep1 세포 및 PLC/PRF/5 세포에 TGFβ1을 추가로 처리하거나 처리하지 않았다. 상기 방법으로 처리된 세포에 포름알데하이드를 처리하여 단백질(DNA에 결합된 단백질)과 DNA를 결합시킨 후 세포를 파괴하였다. DNA를 잘게 부순 다음, 하기 표 7에 기재된 RNAPII 단백질에 대한 항체를 첨가한 후, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, Protein A/G PLUS-Agarose 50 ㎕를 첨가하여 항체만을 분리하였다. 이때, 항체가 특이적으로 인식한 단백질과 결합한 DNA가 정제되며, 상기 DNA를 분리정제한 후 하기 표 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. TINA 소프트웨어 패키지(Raytest, Germany)를 사용하여 수득한 DNA 및 0.02% 대조군 DNA로부터의 PCR 산물의 밴드 세기를 비교함으로써 결합률을 결정하였다.

항체명	숙주	제조사	제품번호
Unphosphorylated RNA polymerase (RNAPII)	Mouse	Abcam	ab817
Phosphorylated Serine5 RNAPII	Rabbit	Abcam	ab5131
Phosphorylated Serine2 RNAPII	Mouse	Abcam	ab24758
acetyl histone H3	Rabbit	Millipore	06-599
acetyl histone H4	Rabbit	Millipore	06-866

a	TGTGATCCTCCCAACCCTCT: 서열번호 28	GTGCGCGTGCGACACAGAC: 서열번호 29
b	CTCTCGGTGCCAGCCTCAG: 서열번호 30	CTGGAGTTTGCGGCGCTAGA: 서열번호 31
c	GTGTGCAAGCTCAGTATTCATG: 서열번호 32	GACACTGGAACCTCAGGTCTA: 서열번호 33
d	GAGGCTAGGATCTCAACATTTG: 서열번호 34	GTGTGCGAAGCCTCGGACTT: 서열번호 35

그 결과, 도 5A 및 도 5B에 나타난 바와 같이 PLC/PRF/5 세포에서 TGFβ1은 AzadC 처리와 상관없이 TTP 로커스에 RNAPII 단백질의 결합을 증가시켰다. 그러나 SK-Hep1 세포에서는 TGFβ1 의존적 RNAPII 결합의 증가를 위해서 AzadC 전처리가 필요하였다(P<0.05).

<6-2> TRR 에서 DNA 메틸화 정도에 따른 주변 히스톤의 아세틸화 수준 변화

염색질은 기본적으로 히스톤과 DNA로 이루어져 있고, 히스톤의 상태, 즉 메틸화 또는 아세틸화 된 상태에 따라 주변 유전자의 발현정도를 조절한다. 프로모터 영역에서 전사 활성은 히스톤 H3 및 H4의 아세틸화 정도에 의존적이다. 또한, TGFβ1과 관련된 전사활성화를 위해 H3의 아세틸화가 요구된다(Ross S et al., EMBO J 25:4490-4502, 2006). 따라서, 아세틸화된 히스톤에 대한 항체를 이용하면, 프로모터 영역의 전사 활성에 대한 정보를 수득할 수 있다. 이에, 하기 표 7에 기재된 히스톤에 대한 항체를 이용하여, 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 ChIP 분석을 수행하였다.

그 결과 도 5A 및 도 5C에 나타난 바와 같이 TRR(영역 a)에서 히스톤 H3('Ac-H3') 및 H4('Ac-H4')의 아세틸화가 PLC/PRF/5 세포에서 TGFβ1에 의해 현저하게 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 AzadC 전처리와 무관함을 확인하였다(P<0.05). 그러나 SK-Hep1 세포에서는 TRR에서 H3 및 H4 아세틸화의 TGFβ1 의존적 증가에 AzadC 전처리가 반드시 필요하였다. 또한 히스톤 아세틸화의 증가는 두 가지 세포 모두 TRR에서 주로 관찰되었고, 전사개시영역(영역 b)에서는 관찰되지 않았다. 상기 결과는 TRR이 TTP 로커스에서 TGFβ1에 반응하여 히스톤 아세틸화를 통한 염색질 풀림(chromatin relaxation)현상을 주도하는 것을 제시하였다.

<6-3> TRR 에서의 인산화 SMAD2 /3, 전사억제인자, DNA 메틸전이효소 등의 결합과 DNA 메틸화와의 관계

본 발명자들은 TRR(a)에서 TGFβ1 신호전달의 중요 요소인 인산화된 SMAD2/3, 전사억제인자, 메틸 DNA 결합단백질 및 DNMT(DNA methyltransferase: DNA 메틸전이효소) 등의 결합을 조사하고자 하기 표 9에 기재된 해당 항체들을 이용하여 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 ChIP 분석을 수행하였다. 이 때, input은 세포에 포름알데하이드를 처리하여 고정시키고 DNA를 잘게 부순 후 얻은 세포 추출액의 일부이며, 항체로 면역침전시키기 직전의 상태를 말한다.

항체명	숙주	제조사	제품번호
Phosphorylated SMAD2/3(SMAD family member 2)	Goat	Santa Cruz	sc-11769
MECP2(methyl CpG binding protein 2)	Rabbit	Millipore	07-013
MBD2(methyl-CpG binding domain protein 2)	Sheep	Millipore	07-198
c-Ski(v-ski sarcoma viral oncogene homolog)	Rabbit	Santa Cruz	sc-9140
DNMT1(DNA methyltransferase 1)	Mouse	Imgenex	IMG-261
DNMT3A(DNA methyltransferase 3A)	Mouse	Imgenex	IMG-268
DNMT3B(DNA methyltransferase 3B)	Rabbit	Abgent	AP-1035a
anti-rabbit IgG(immunoglobulin G)		Santa Cruz	sc-2027

그 결과, 도 5D에서 나타낸 바와 같이 TRR에 대한 인산화 SMAD2/3의 TGFβ1 의존적 결합은 예상치 않게 SK-Hep1 및 PLC/PRF/5 등 두 세포주 모두에서 관찰되었다. 상기 결과는 상기 두 개 유형의 세포에서 TGFβ 신호전달 시스템이 이상없이 유지되기는 하였으나, TGFβ1 의존적 TTP 발현을 나타내지 않는 세포인 SK-Hep1 세포에서는 AzadC를 전처리하지 않을 경우 전사 억제자들이 메틸화 의존적으로 TRR에 결합함으로써 TGFβ1 의존적 TTP 발현을 억제한다는 것을 지시하였다(도 4A). SK-Hep1 세포에 대한 ChIP 분석 결과는 HDAC 모집 능력(HDAC-recruiting capability)을 갖는 두 개의 메틸화 DNA 결합성 전사억제자(MBD2 및 MECP2) 및 TGFβ1 신호전달계의 발암성 전사 억제자인 c-Ski 등이 DNA 메틸화 의존적으로 TRR에 결합하는 것을 나타내었다. 반대로, PLC/PRF/5 세포에서는 어떠한 억제자 단백질도 TRR에 결합하지 않았다. DNMT 유전자군에 대한 분석 결과에서는 DNMT3A가 SK-Hep1 세포에서 TRR의 DNA 메틸화에 가장 두드러지게 관련된 요소인 것을 제안하였다. 상기 결과로부터 본 발명자들은 MECP2/c-Ski/DNMT3A가 SK-Hep1 세포에서 TTP 로커스의 메틸화된 TRR에 결합하는 주요 억제자 복합체인 것을 제안하였다.

< 실시예 7> TTP 가 하향조절된 HCC 세포에서 c- Myc mRNA 의 전사후 조절능 소실에 따른 TGF β1 저항성 유발 여부 조사

본 발명자들은 상기 TTP의 전사후조절의 표적으로 알려진 유전자들 중에서 강력한 발암성 유전자이면서 정상 세포에서는 TGFβ에 의해 발현이 억제되는 c- Myc 유전자를 선별하여, 이에 대한 전사후 조절현상이 #2 CpG 메틸화에 의한 TTP 발현억제로 인해 소실되는지 여부를 검사하였다.

<7-1> TGF β1에 의한 c- Myc 의 전사후 조절

AzadC를 72시간 동안 전처리하거나 처리하지 않은 SK-Hep1 세포 및 PLC/PRF/5 세포에 TGFβ1을 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5시간 동안 추가로 처리하였다. 상기 세포를 대상으로 하기 표 10의 프라이머 쌍을 이용하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 RT-PCR을 수행하였다.

c-MYC	TGCTCCATGAGGAGACACCG: 서열번호 36	GACAGGATGTATGCTGTGGCT: 서열번호 37
ACTIN	CCATCGAGCACGGCATCGTCACCA: 서열번호 3	CTCGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT: 서열번호 4

그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이 PLC/PRF/5에서 TGFβ1 처리 1시간 후부터 c-Myc 발현량이 현저하게 감소하였다. 반면, SK-Hep1 세포에서는 TGFβ1에 의한 c-Myc mRNA의 하향 조절현상이 나타나지 않았으나 AzadC 전처리에 의해 SK-Hep1 세포에서도 이 현상이 복원됨을 관찰하였다.

<7-2> TGF β1에 의해 유도된 TTP 발현과 c- Myc 및 p21Cip1 발현 또는 세포 성장의 상관관계

<7-2-1> 웨스턴 블랏팅에 의한 단백질 발현 측정

AzadC를 72시간 동안 전처리하거나 처리하지 않은 SK-Hep1 세포 및 PLC/PRF/5 세포에 TGFβ1을 추가로 처리하거나 처리하지 않았다. 상기 세포를 대상으로 하기 표 11의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 구체적으로, TTP 및 c-Myc의 경우 TGFβ1을 처리한 후 3시간 만에, p21^Cip1의 경우 TGFβ1을 처리한 후 8시간 만에 세포를 회수하였다. 회수한 각 세포들은 PBS로 3회 세척한 후 세포파쇄 완충용액[20 mM Tris-HCl(pH6.8), 1 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, protease inhibitor cocktail(Roche) 및 0.5% Nonidet(Sigma-Aldrich)]으로 세포를 파쇄한 후 15,000× g, 10분, 4℃ 조건으로 원심분리하여 파쇄된 세포를 침전하였고, 상기 침전물(pellet)을 웨스턴 블랏 방법으로 분석하였다. 구체적으로, 10% SDS-PAGE 겔에서 100 V, 2시간의 조건으로 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 겔을 PVDF 막(Millipore)과 함께 80 V에서 3시간동안 전기영동하여 막으로 단백질을 이동 및 부착시켰다. 이 PVDF 막을 1% 트윈(Tween)-20(Sigma-Aldrich)이 들어간 PBST 버퍼에 5% 탈지유(Skim milk)로 1시간 동안 전처리한 후, 하기 표 11의 일차항체(1/1000 희석)와 함께 상온에서 3시간 동안 반응시켜 항체를 단백질과 결합시킨다. PBST 버퍼로 10분 동안 3회 세척 후 HRP(horseradish peroxidase)-결합 이차항체(1/5000 희석)와 1시간 동안 상온에서 반응시켜 상기의 단백질에 결합한 일차항체와 결합시킨다. PBST 버퍼로 10분 동안 3회 세척한 후 화학발광시약인 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)을 사용하여 그 발색 정도를 X-ray 필름으로 현상하고, TINA 소프트웨어(Raytest)를 이용하여 발현 정도를 측정하였다.

항체명	숙주	제조사	제품번호
TTP	Rabbit	Santa Cruz	sc-14030
c-Myc	Mouse	Santa Cruz	sc-40
p21	Mouse	Santa Cruz	sc-6246
β-Actin	Mouse	Sigma-Aldrich	A5441
anti-rabbit IgG		Santa Cruz	sc-2027
HRP-conjugated anti-mouse IgG	Goat	Santa Cruz	sc-2748
HRP-conjugated anti-rabbit IgG	Goat	Santa Cruz	sc-2749

<7-2-2> MTT 검사 및 크리스탈 바이올렛 염색에 의한 세포성장 측정

AzadC를 72시간 동안 전처리하거나 처리하지 않은 SK-Hep1 세포 및 PLC/PRF/5 세포에 TGFβ1을 추가로 96시간 동안 처리하거나 처리하지 않았다. 상기 세포를 대상으로 MTT 검사 및 크리스탈 바이올렛 염색을 수행하였다. MTT(methylthiazoletetrazolium; Sigma-Aldrich) 검사는 공지 기술대로(Mosmann T, J Immunol Methods 65:55-63, 1983) μQuant Universal Microplate Spectrophotometer(Biotek Instruments, USA)를 사용하여 570 ㎚에서 수행하였다. 또한, 이와는 별도로 세포를 10% 포름알데히드에서 고정한 후, 10% 크리스탈 바이올렛 용액으로 실온에서 10분 동안 염색하였다.

그 결과, 도 6B에서 나타난 바와 같이 c- Myc은 PLC/PRF/5에서 TGFβ1 처리에 의해, SK-Hep1 세포에서는 TGFβ1/AzadC의 공동처리에 의해 각각 그 발현이 하향 조절되었으며, 이와 동시에 표현형으로써 세포성장 억제를 수반하였고 p21 ^Cip1 의 발현을 유도하였다.

<7-3> TTP 의 인위적 과발현에 의한 c- Myc 및 p21 ^Cip1 발현 또는 세포 성장의 조사

TTP 발현 벡터는 정상 인간 게놈 DNA(BioChain, USA)로부터 센스 프라이머[GCCGAATTCGCCACCATGGATCTGACTGCCAT (EcoR I): 서열번호 38] 및 안티센스 프라이머[ATCAAGCTTGGCAGTCACTTTGTCACTCAG (Hind III): 서열번호 39]를 이용하여 상기 실시예 1-2의 방법으로 TTP cDNA 전체 영역을 증폭하였다. 전장 cDNA 단편을 pcDNA3.1/myc-His(-) 벡터(Invitrogen)의 EcoRI/HindIII 위치에 태그를 연결하지 않은 채로 클로닝함으로써 TTP 과발현 벡터 pTTP_OE를 제작하였다. pTTP_OE는 LipofectAMINE Plus 시약(Invitrogen)을 이용하여 SK-Hep1 세포로 형질도입한 후 72시간 동안 배양하여 pTTP_OE가 암호화하는 유전자를 발현하는지를 형질전환세포로부터 확인하였다. 상기 형질도입된 세포를 대상으로 실시예 상기 7-2-1의 방법으로 웨스턴 블랏팅을 수행하여, c-Myc 및 p21Cip1의 발현량을 조사하였다. 또한, 상기 실시예 7-2-2의 방법으로 MTT 검사 및 크리스탈 바이올렛 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 6C에 나타난 바와 같이 SK-Hep1 세포에서 TTP 과발현이 c-Myc 단백질의 발현을 억제하고 p21^Cip1 단백질의 발현을 증가시키며, 세포성장을 억제하는 등 TTP의 직접적인 영향을 확인하였다.

<7-4> TTP 의 녹다운에 의한 c- Myc mRNA 의 전사후 조절

TTP에 대한 렌티바이러스 기반의 짧은 헤어핀 RNA(Lentiviral-based short hairpin RNAs, shRNAs; Sigma-Aldrich; CCGGGCTTCGCCAGAGCATCAGCTTCTCGAGAAGCTGATGCTCTGGCGAAGCTTTTT: 서열번호 40) 또는 eGFP를 표적화하는 대조군 shRNA(Sigma-Aldrich)를 PLC/PRF/5 세포에 형질감염시킨 후, 1 ㎎/L 푸로마이신(Invitrogen) 존재하에서 선별하였다. 선별된 형질감염 PLC/PRF/5 세포에 TGFβ1을 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 및 2.5시간 동안 추가로 처리하였다. 한편, c-Myc mRNA의 반감기를 측정하고자 액티노마이신 D를 0, 15, 30, 34, 60 및 75분 동안 처리하였다. 상기 처리된 세포를 대상으로 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 6D에서 나타난 바와 같이 PLC/PRF/5 세포에서 TGFβ1 처리 후의 c-Myc mRNA 분해속도가 TTP 녹다운에 의해 현저하게 지연되었다. 또한, 전사억제자인 액티노마이신 D 존재하에서 측정한 c- Myc mRNA의 반감기가 대조군에서는 24분이었으나 TTP 녹다운 세포에서는 51분으로 증가하였다. 상기 결과로부터 간암 세포에서 c- Myc mRNA의 안정성이 TTP에 의해 직접적으로 조절된 것이 확인되었다.

<7-5> TTP 녹다운에 의한 c- Myc 및 p21 ^Cip1 단백질의 발현 및 세포 성장에 대한 영향 조사

상기 실시예 7-4에서 처리된 세포를 대상으로 상기 실시예 7-2-1의 방법으로 웨스턴 블랏팅을 수행하여, c-Myc 및 p21Cip1의 발현량을 조사하였고, 상기 실시예 7-2-2의 방법으로 MTT 검사 및 크리스탈 바이올렛 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 6E에서 나타난 바와 같이 c- Myc 및 p21 ^Cip1 발현에 대한 TTP 녹다운의 효과는 단백질 수준에서도 추가로 확인되었다. 또한, PLC/PRF/5 세포에서 TTP 녹다운에 의해 TGFβ1의 세포성장 억제효과가 차단되었고, 성장속도가 증가하였다.

<7-6> FACS 분석에 의한 TTP 녹다운의 세포주기에 대한 영향 조사

상기 실시예 7-4에서 처리된 세포를 대상으로 FACS 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 TGFβ1 처리 전과 후 모두에서 TTP 녹다운이 S기 개체군의 상대적인 크기를 증가시키고 G1 및 서브G1 개체군의 상대적인 크기를 감소시킴으로써 상기한 TTP의 c-Myc 및 p21 ^Cip1 발현과 세포 성장에 대한 효과가 세포주기 패턴에서도 반영됨을 확인하였다. 한편, G2/M 개체군의 크기는 TGFβ1 처리 후 대조군 세포에서 현저하기 감소하였으나 TTP 녹다운세포에서는 변화하지 않았다. 결론적으로, 상기의 결과는 간암 세포에서 TTP 발현의 후생유전학적 비활성화에 의해 c- Myc의 전사후 조절에 결함이 유도됨에 따라 p21 ^Cip1 의 발현이 지속적으로 억제되고 TGFβ1의 세포성장 억제작용에 대한 세포의 반응성이 소실됨을 제시하였다.

<7-7> 간암 환자 조직에서 #2 CpG 메틸화 및 c- Myc 발현 사이의 관련도 조사

간암 환자 조직시료를 대상으로 #2 CpG의 메틸화 정도를 상기 실시예 4-1의 파이로시퀀싱 방법으로 측정하였고, c- Myc mRNA의 발현량을 상기 실시예 1-2의 방법으로 측정하였다. 상기 측정값을 바탕으로 두 변수(#2 CpG의 메틸화 정도 및 c- Myc mRNA의 발현량) 사이의 상관관계 및 통계적 유의도를 미니탭 프로그램(Minitab Inc, USA)을 이용하여 피어슨 상관 계수(γ)로부터 결정하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 두 변수 사이의 상관계수(γ 값) 및 통계적 유의도가 #2 CpG 부위의 메틸화 정도에 비례하여 증가하였다. 통계적으로 유의한 상관도는 #2 CpG의 메틸화 정도가 30% 이상인 구간에서 관찰되었다. 상기 결과는 #2 CpG 부위가 과메틸화되면 간암에서 #2 CpG 메틸화와 c- Myc 발현 사이에 임상학적으로 유의한 관련성이 있음을 제시하였다.

도 1은 간암 세포주에서 DNA 메틸화를 통한 TTP(tristetraprolin) 발현의 억제를 확인한 도이다:

1A: 여러 간암 세포주에서 TTP mRNA 발현량 비교;

1B: DNA 탈메틸화제의 처리에 의한 TTP mRNA 발현량 비교; 및,

1C: DNA 탈메틸화제의 농도의존적 TTP 발현량 비교.

도 2는 간암 세포주에서 TTP 프로모터 내의 단일 CpG 부위 메틸화를 확인한 도이다:

2A: TTP 프로모터 및 인핸서(enhacer) 영역의 CpG 분포, 예측된 CpG섬의 위치, TGFβ1 반응부위 (TRR)의 위치 및 염기서열, #2 CpG의 위치;

2B: 90개의 CpG 부위 각각에 대한 메틸화 여부를 확인: 및,

2C: #2 CpG의 메틸화 여부에 따른 bisulfite 염기서열분석의 크로마토그램.

도 3은 간암 임상 시료조직에서 #2 CpG 부위의 메틸화를 확인한 도이다:

3A: TTP 프로모터 및 인핸서(enhacer) 영역내 CpG 부위의 메틸화 분석;

3B: 정상간, 간암주변조직 및 간암조직에서 #2 CpG 부위의 메틸화 분석;

3C: 정상간, 간암주변조직 및 간암조직에서 TTP mRNA 발현량 분석; 및,

3D: 정상간, 간암주변조직 및 간암조직에서 #2 CpG 부위의 메틸화 정도와 TTP mRNA 발현량과의 상관관계 분석.

도 4는 TTP 발현의 조절에서 #2 CpG 메틸화의 직접적인 관련성을 확인한 도이다:

4A: TGFβ1에 의한 TTP 유도와 #2 CpG 메틸화의 관련;

4B: TTP 프로모터 영역의 전사 활성과 #2 CpG 메틸화의 관련;

4C: TGFβ1에 의한 TTP 프로모터의 유도성과 #2 CpG 메틸화의 관련; 및,

4D: #2 CpG를 포함하는 TRR 부위에 의한 TGFβ1 의존적 TTP 발현유도능의 수여.

도 5는 DNA 메틸화 의존적 전사 억제자와 TRR의 결합을 확인한 도이다:

5A: TGFβ1에 의한 RNAPII 결합/히스톤 아세틸화와 TRR의 메틸화 관련;

5B: TGFβ1에 의한 RNAPII 결합과 TRR의 메틸화 관련;

5C: TGFβ1에 의한 히스톤 아세틸화와 TRR의 메틸화 관련; 및,

5D: TRR에 대한 인산화 SMAD2/3, 전사억제인자, DMA 메틸전이효소 등의 DNA 메틸화 의존적 결합.

도 6은 TTP가 하향조절된 HCC 세포에서 c-Myc의 전사후 조절능 소실에 의한, TGFβ1 유래 항증식성 반응의 철회를 확인한 도이다:

6A: TGFβ1에 대한 c- Myc 전사후 조절의 세포별 반응;

6B: TGFβ1 및/또는 DNA 탈메틸화에 의해 유도된 TTP 발현과 c-Myc 및 p21^Cip1 발현 또는 세포 성장의 상관관계;

6C: TTP 과발현에 의한 c-Myc 및 p21^Cip1 발현 또는 세포 성장의 조사;

6D: TTP의 녹다운시 TGFβ1 유도된 c- Myc의 전사후 조절; 및,

6E: TTP의 녹다운시 TGFβ1 유도된 c-Myc 및 p21^Cip1 단백질 발현 또는 세포 성장의 조사.

도 7은 TTP가 하향조절된 HCC 세포에서 c-Myc의 전사후 조절의 소실에 의한, TGFβ1 유래 항증식성 반응의 철회를 FACS 분석으로 확인한 도이다.

도 8은 간암 환자 조직에서 #2 CpG 메틸화 및 c- Myc 발현 사이의 관련 정도를 확인한 도이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> Method for diagnosis/prognosis of cancers using an epigenetic marker consisting of a specific single CpG site in TTP promoter and treatment of cancers by regulating its epigenetic status <130> 9p-05-01 <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP sense primer <400> 1 ccatctacga gagcctcctg 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP antisense primer <400> 2 tccgacatag ctcagtcttg ta 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin sense primer <400> 3 ccatcgagca cggcatcgtc acca 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin antisense primer <400> 4 ctcggtgagg atcttcatga ggtagt 26 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 sense primer <400> 5 tgggattata ggtgtgagtt 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 antisense primer <400> 6 aacaatcaaa tccataatat aac 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 sense primer <400> 7 gttatattat ggatttgatt gtt 23 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 antisense primer <400> 8 caccctaaaa cttcaaccc 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 sense primer <400> 9 gttgaagttt tagggtggg 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 antisense primer <400> 10 taaaacacct aaaaatacaa aac 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 tgtttttttt tgtgattttt ttaa 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer(5'-Biotin) <400> 12 caaaaaaata caaacaaaca aac 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> #2 CpG sequencing primer <400> 13 gaatttgttt ttgggattgt t 21 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(WT) <400> 14 taaggtacca ggtgtgagcc actgcgctc 29 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(WT) <400> 15 ggagatctgg tgtaacggtt ggccatg 27 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(C->T) <400> 16 taaggtacca ggtgtgagcc actgcgctc 29 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(C->T) <400> 17 gacagggtga ggaagggagg gaagacagg 29 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(C->T) <400> 18 cgtcttccct cccttcctca ccctgtc 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(C->T) <400> 19 ggagatctgg tgtaacggtt ggccatg 27 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(Del) <400> 20 taaggtacca tgtttttctc tctgcctgtc tg 32 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP promoter primer(Del) <400> 21 gggagatctg gtgtaacggt tggccatg 28 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP-Luc primer <400> 22 ttaggtaccc tcagcccctt tctgtttctt 30 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP-Luc primer <400> 23 gacagggtga ggaagggagg gaagacg 27 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP-Luc primer <400> 24 cgtcttccct cccttcctca ccctgtc 27 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP-Luc primer <400> 25 gggagatctg gtgtaacggt tggccatg 28 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40-Luc primer <400> 26 ttaggtaccc tcagcccctt tctgtttctt 30 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40-Luc primer <400> 27 gggagatctc acaccaagag acatacagag a 31 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a sense primer <400> 28 tgtgatcctc ccaaccctct 20 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a antisense primer <400> 29 gtgcgcgtgc gacacagac 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b sense primer <400> 30 ctctcggtgc cagcctcag 19 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b antisense primer <400> 31 ctggagtttg cggcgctaga 20 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c sense primer <400> 32 gtgtgcaagc tcagtattca tg 22 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c antisense primer <400> 33 gacactggaa cctcaggtct a 21 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> d sense primer <400> 34 gaggctagga tctcaacatt tg 22 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> d antisense primer <400> 35 gtgtgcgaag cctcggactt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-MYC sense primer <400> 36 tgctccatga ggagacaccg 20 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-MYC antisense primer <400> 37 gacaggatgt atgctgtggc t 21 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP Expression vector sense primer <400> 38 gccgaattcg ccaccatgga tctgactgcc at 32 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TTP Expression vector antisense primer <400> 39 atcaagcttg gcagtcactt tgtcactcag 30 <210> 40 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lentiviral based short hairpin RNAs(shRNAs) <400> 40 ccgggcttcg ccagagcatc agcttctcga gaagctgatg ctctggcgaa gcttttt 57 <210> 41 <211> 61 <212> DNA <213> TGF beta1-responsive region <400> 41 gaatctgtct ctgggactgt ctctgtctcc ccgtcttccc tcccttcctc accctgtcta 60 t 61

Claims

서열번호 41로 기재되는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되며, 상기 핵산 서열의 32번째 핵산이 시토신(Cytosine) 잔기이고, 상기 시토신 잔기의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 간암 진단용 키트.
서열번호 41로 기재되는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 내에서 선택되며, 상기 핵산 서열의 32번째 핵산이 시토신(Cytosine) 잔기이고, 상기 시토신 잔기의 메틸화 여부를 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍을 포함하는 간암 예후 진단용 키트.
제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 아황산(bisulfite)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 상기 32번째 시토신 잔기를 포함하는 연속적인 15 내지 30 핵산 길이의 센스 및/또는 안티센스 올 리고뉴클레오티드에 상보적인 것을 특징으로 하는 키트.
제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 상기 32번째 염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 15 내지 50 핵산 길이의 센스 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 키트.
제 5항에 있어서, 상기 프라이머 쌍은 하기 프라이머쌍 1 내지 3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트:

1) 서열번호 5로 기재되는 센스 프라이머 및 서열번호 6으로 기재되는 안티센스 프라이머로 구성되는 프라이머쌍 1;

2) 서열번호 11로 기재되는 센스 프라이머 및 서열번호 12로 기재되는 안티센스 프라이머로 구성되는 프라이머쌍 2; 및,

3) 상기 프라이머쌍 2 및 서열번호 13으로 기재되는 프라이머로 구성되는 프라이머쌍 3.
삭제
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서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 핵산인 시토신(Cytosine) 잔기의 메틸화를 억제하는,

5-아자데옥시사이티딘(5-Aza-2'-deoxycytidine, AzadC, Decitabine); 또는

DNMT1, DNMT3A, MECP2, c-Ski 또는 SMAD2/3에 대한 siRNA, 안티센스(antisense) RNA 또는 shRNA를 포함하는 재조합바이러스; 및

TGFβ1을 포함하는 간암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
간암이 의심되는 개체로부터 수득한 임상시료로부터 분리된 게놈 DNA로부터

1) 상기 DNA를 대상으로 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기의 메틸화를 검출하는 단계; 및,

2) 단계 1)에서 메틸화가 검출된 경우, 간암의 발병가능성 및 예후를 예측하는 단계를 포함하는, 간암을 예측하기 위해 서열번호 41로 기재되는 핵산 서열의 32번째 잔기의 메틸화를 검출하는 방법.