KR101428702B1 - Ｈｂｖ의 감염에 의한 간 손상 재생용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HBV의 감염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물에 관한 발명이다.

Description

ＨＢＶ의 감염에 의한 간 손상 재생용 조성물{Composition for regenerating liver damage by infection of HBV}

본 발명은 HBV의 감염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물에 관한 발명이다.

B형 간염 바이러스(HBV)의 감염은 급성 또는 만성 염증, 간경변 및 간암을 포함하는 많은 간 질환을 야기한다. 전 세계적으로 약 4억 명 정도가 감염된 것으로 추정되는 HBV의 만성 감염은 간에 손상을 유발하는 간의 만성 염증을 야기한다(Feitelson, M.A. (1999). Hepatitis B virus in hepatocarcinogenesis. J. Cell Physiol.181, 188-202). 장기간 간 손상은 간세포의 감소를 보충하는 간 재생신호를 활성화한다. 간 재생은 간 부전 및 간암의 발생에 대한 중요한 인자로 추측되는 간세포의 만성적이고 신속한 턴오버를 촉발한다(Feitelson, M.A. (1999). Hepatitis B virus in hepatocarcinogenesis. J. Cell Physiol.181, 188-202). 따라서 균형잡힌 간 재생은 간 항상성에 필수적이다. 이 점에서, 만약 바이러스 감염에 의하여 간 재생 과정에서 간섭이 일어나면, 여러 바이러스 매개된 간 질환의 주요한 원인일 것이다.

간 재생은 매우 복잡한 단계로 구성된다. 몇 몇 성장 인자(예를 들어, hepatocyte growth factor (HGF), IL-6, TNF-알파, TGF-베타)가 간 재생 조절에 관여한다(Michalopoulos, G.K., and DeFrances, M.C. (1997). Liver regeneration. Science 276, 60-66; Fausto, N., Campbell, J.S., and Riehle, K.J. (2006). Liver regeneration. Hepatology 43, S45-S53). 그 중에서, HGF는 간 재생에 필수적인 작용을 가지는 것으로 알려졌다. HGF는 비활성 단일 체인 분자 (pro-HGF)로 합성되고 분비되고 HGF의 단백질가수분해적 절단은 활성 두 체인의 형태를 야기하고 그것은 c-met 수용체에 큰 친화성을 가진다(Naldini, L., Tamagnone, L., Vigna, E., Sachs, M., Hartmann, G., Birchmeier, W., Daikuhara, Y., Tsubouchi, H., Blasi, F., and Comoglio, P.M. (1992). EMBO J. 11, 4825-4833).

본 발명의 목적은 인 비보에서 간 재생 동안 HBV의 효과를 조사하는 것이다.

본 발명은 HBx 단백질이 그것의 프로모터에 대한 과메틸화(hyper-methylation)를 통한 후생학적(epigenetic) 조절을 통하여 인 비보 및 인 비트로에서 HGF 활성화에 필수적인 효소인 uPA의 발현을 직접적으로 조절한다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 본 발명자들은 HBV 감염에 의한 간 재생의 손상은 HBx에 의한 간 재생 신호의 분자적 간섭때문이라는 것을 시사한다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제019910015292호는 유효량의 마크로라이드 화합물 또는 그의 염을 함유하는 간조직 재생 촉진용 약제학적 조성물에 대하여 기재되어 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 HBV의 감염에 의한 간 손상 재생용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 항체 또는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 HBV 감염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 siRNA는 서열번호 2의 염기서열 또는 그의 상보적인 서열인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 저해제를 유효성분으로 포함하는 HBV 감염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 저해제는 5-아자-2'-디옥시시티딘인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

발명의 한 실시예에서, 치료적으로 효과적인 양의 본 발명의 항체 또는 화합물이 약학적으로 허용되는 담체와 혼합되어 사용된다. 이런 조성물은 일반적으로 비경구 주사 또는 주입에 의하여 투여된다. 이루어지는 치료 효과에 따라 피하, 정맥내, 또는 근육내 주사 경로가 선택된다.

전신적으로 투여되는 경우에는, 본 발명에 사용하기 위한 조성물은 발열원이 없고, 비경구적으로 허용되는 수용액 형태이다. pH, 등장성, 안정성, 담체 단백질 등을 포함하고 있는 약학적으로 허용되는 멸균 단백질 용액은 당해 기술분야내에 있는 것이다.

또한 본 발명내에는 본 발명의 효과적인 양의 항체 또는 화합물을 치료법에 유용한 적당한 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 보조제 및/또는 담체와 함께 포함하고 있는 약학 조성물이 포함된다. 본원에서 사용되는 '치료적으로 효과적인 양'이란 주어진 조건 및 투여 요법에 대하여 재생 효과를 나타내는 양을 말한다. 그러한 조성물은 액체, 겔, 연고, 또는 동결건조되거나 그렇지 않으면 건조된 제형이며, 다양한 완충제 내용물 (예컨대 트리스-HCl, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도를 가지는 희석제, 표면에 대한 흡착을 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 계면활성제 (예컨대 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉 F68, 담즙산염), 가용화제 (예컨대 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜), 항산화제 (예컨대 아스코르브산, 소디움 메타비술파이트), 보존제 (예컨대 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 부피가 커보이게 하는 물질 또는 강장성 변형제 (예컨대 락토오스, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체의 단백질에 대한 공유 결합 부착물, 금속 이온과의 착화, 또는 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등과 같은 중합체 화합물의 과립 제제안으로의 또는 그것들에 대한 물질의 통합 또는 리포솜, 니오솜, 미소에 멀젼, 미셸, 단층 또는 다층 소포, 생체내 분해가능한 주사가능한 미소캡슐 또는 미소구, 또는 단백질 매트릭스, 적혈구 고스트, 스페로 플라스트, 피부 패취, 또는 다른 공지된 조제약의 배출 또는 포장 방법들을 포함한다.

본 발명의 조성물의 다른 실시예에는 비경구, 폐, 비내, 국소 (피부 또는 점막) 및 경구를 포함하여 다양한 투여 경로를 위하여 보호 코팅, 프로테아제 억제 인자 또는 투과 증강제의 과립형태가 혼입되어 있다.

본 발명의 조성물은 단위 투여 용량 형태로 멸균 바이알 또는 앰퓰로 포장된다.

본 발명의 조성물의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마이크로에멸젼에 통합될 수 있는데, 일반적으로 열역학적으로 안정하고, 계면활성제 분자의 계면 막에 의해 안정화된 오일과 물과 같은 2가지 혼합불가능한 액체의 등방적(isotropically)으로 맑은 분산액이다(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel

Dekker, 1992), volume 9). 마이크로에멸젼 제조를 위하여, 계면활성제(유화제),

공동-계면활성제(공동-유화제), 오일상 및 수상이 필수적이다. 적합한 계면활성제는 유상액 제조에 유용한 임의의 계면활성제, 가령, 크림 제조에 일반적으로 이용되는 유화제다. 공동-계면활성제(또는 "공동-유화제")는 일반적으로 폴리글리세롤 유도체, 글리세롤 유도체 및 지방 알코올의 군으로부터 선택된다. 바람직한 유화제/공동-유화제 조합은 일반적으로 글리세릴 모노스테아레이트 및 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 폴리에틸렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트; 카프릴 및 카프릭 트리글리세리드 및 올레일 마크로골글리세리드로 구성된 군으로부터 선택되나 반드시 그런 것은 아니다. 수성 상은 물 뿐만 아니라, 완충액, 포도당, 프로필렌 글리콜,폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 저 분자량 폴리에틸렌 글리콜(가령, PEG 300 및 PEG 400), 및/또는 글리세롤 그리고 이와 유사한 것을 포함하며, 오일상은 일반적으로 예를 들면, 지방산 에스테르, 변형된 식물성 오일, 실리콘 오일, 모노-, 디- 그리고 트리글리세리드, PEG의 모노- 및 디 에스테르(가령, 올레일 마크로골글리세리드) 등을 포함할 것이다.

본 발명의 약제 제제는 통상적으로 단위 약형으로 제공될 수 있는데, 이는 약학 산업분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 이와 같은 기술은 활성 성분들을 약학적 캐리어 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분들을 액상 캐리어 또는 미세하게 분할된 캐리어 또는 이들 모두와 연합되도록 하고, 그 다음 필요에 따라 산물의 모양을 만들어 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제를 포함하나 이에 한정되지 않는많은 가능한 약형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 액상, 비-액상 또는 혼합형 매질에 현탁액으로 조제될 수 있다. 수용성 현탁액은 카르복시메틸셀룰로오즈, 솔비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 더 포함할 수 있다. 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제 조성물은 용액, 에멸젼, 리포좀-함유 제제를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약제조성물 및 제제는 하나 이상의 침투 강화제, 캐리어, 부형제 또는 기타 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.

경구 투여용 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비-수용성 매질에서의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사셋, 태블릿 또는 미니테블릿을 포함한다. 농후제, 향료, 희석제, 에멸젼화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 하나 이상의 침투 강화제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것들이다. 바람직한 계면활성제는 지방산 및/또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이의 염을 포함한다. 바람직한 담즙산/염 그리고 지방산 및 이의 용도들은 U.S. 특허 제 6,287,860호에서 추가 설명되고 있으며, 이는 참고문헌에 통합된다. 침투 강화제, 예를 들면, 지방산/염과 담즙산/염의 복합 또한 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프리산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 강화제는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르를 포함한다. 본 발명의 조성물이 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우 분무된 건조 과립을 포함하는 과립형으로 경구로 운반될 수 있고, 또는 미립자 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 복합제 및 이의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에 추가 설명되어 있다.

장관외, 기관내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 완충액, 희석액 및 침투 강화제, 캐리어 화합물 및 기타 약제학적으로 허용가능한 캐리어 또는 부형제를 포함하나 이에 한정되지 않는 기타 적합한 첨가제를 포함하는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.

적정량은 수 일 내지 수개월 지속되는 치료 과정, 또는 치료 효과 또는 질병 상태의 감소가 수득되는 날까지의 치료 과정과 함께 치료될 질병 상태의 중증도, 반응성에 따라 달라진다. 최적의 약제주입 일정은 환자의 신체에 약물 축적 측량으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적의 주입량, 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 약량은 상대적 효능에 따라 다양해질 수 있으며, 그리고 일반적으로 시험관 및 생체내 동물모델에서 효과가 발견되는 EC50에 근거하여 예측된다. 일반적으로, 투약량은 올리고뉴크레오타이드 또는 화합물의 경우에 체중 kg당 0.01㎍ 내지 10 g이 되며, 하루에 1회 이상 투여되며, 당업자는 측정된 잔류 시간 및 체액 또는 조직에서 약물의 농도에 근거하여 약액주입에 대한 반복률을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 성공적인 처치후, 질병 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자가 유지요법을 받도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물이 제제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰와 같은 밀폐된 밀봉 용기내에 포장된 것을 제공한다. 하나의 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐된 밀봉 용기 속에 무수 멸균된 동결건조 분말 또는 물이 없는 농축물로서 제공되며 대상체에게 투여하기 위해 적절한 농도로 재구성(예를 들면, 물 또는 염수를 사용하여)될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐된밀봉 용기 속에 무수 멸균된 동결건조 분말로서, 적어도 5 mg, 보다 바람직하게는 적어도 10 mg, 적어도 15 mg,적어도 25 mg, 적어도 35 mg, 적어도 45 mg, 적어도 50 mg, 적어도 75 mg, 또는 적어도 100 mg의 단위 용량으로 제공된다. 본 발명의 동결건조된 약제학적 조성물은 이의 원래의 용기 속에 2℃내지 8℃에서 저장될 수 있으며 본 발명의 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주, 바람직하게는 5일내, 72시간내, 48시간내, 24시간내, 12시간내, 6시간내, 5시간내, 3시간내, 또는 1시간내에 투여되어야 한다. 대체 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 제제의 품질및 농도를 나타내는 밀폐된 밀봉 용기 속에 액체형으로 공급된다. 바람직하게는, 투여된 조성물의 액체형은 밀폐된 밀봉 용기 속에 적어도 0.25 mg/ml, 보다 바람직하게는 적어도 0.5 mg/ml, 적어도 1 mg/ml, 적어도 2.5mg/ml, 적어도 5 mg/ml, 적어도 8 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 15 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50mg/ml, 적어도 75 mg/ml 또는 적어도 100 mg/ml으로 공급된다. 액체형은 이의 원래의 용기 속에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야 한다.

본 발명의 조성물이 항체를 포함하는 경우에 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물로 혼입될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항체-부위는 0.1 내지 250 mg/ml 항체를 함유하는 주사가능한 액제로서 제조될 것이다. 주사가능한 액제는 플린트(flint) 또는 앰버 바이알, 앰플 또는 예비-충전된 주사기 속에 액체 또는 동결건조된 용량형으로 구성될 수 있다. 완충제는 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)에서 임의로 5 내지 10mM의 L-히스티딘(1-50 mM)일 수 있다. 다른 적합한 완충제는 나트륨 석시네이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포스페이트 또는 칼륨 포스페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 염화나트륨을 사용하여 0 내지 300 mM(액체 용량형의 경우 최적으로는 150 mM)의 농도에서 용액의 독성을 조절할 수 있다. 동결보호제, 원칙적으로 0 내지 10%의 슈크로즈(최적으로는 0.5 내지 1.0%)가 동결건조된 용량형을 위해 포함될 수 있다. 다른 적합한 동결보호제는 트레할로즈 및 락토즈를 포함한다. 충전제, 원칙적으로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2-4%)이 동결건조된 용량형을 위해 포함될 수 있다. 안정화제, 원칙저으로 1 내지 50 mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10 mM)이 액제 및 동결건조된 용량 형 둘다에서 사용될 수 있다. 다른 적합한 증량제는 글리신, 아르기닌을 포함하며, 0 내지 0.05% 폴

리소르베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%)로서 포함될 수 있다. 추가의 표면활성제는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 표면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비경구 투여용 주사가능한 용액으로서 제조된 본 발명의 항체 또는 항체 부위를 포함하는 약제학적 조성물은 또한 흡수, 또는 치료학적 단백질(예를 들면, 항체)의 분산을 증가시키는데 사용된 것들과 같은, 부형제로서 유용한 제제를 포함할 수 있다. 특히 유용한 부형제는 히알루로니다제(예를 들면, Hylenex 재조합 사람 히알루로니다제)이다. 주사가능한 액제내 히알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후 사람 생체이용률을 증진시킨다. 이는 또한 통증 및 불편함이 거의 없고, 주사 부위 반응의 발생이 최소인보다 우수한 주사 부위 용적(즉, 1ml 보다 큰)을 허용한다(참조: 제WO 2004/078140호 및 미국 특허공보 제2006104968호).

본 발명의 조성물은 각종 형태로 존재할 수 있다. 이들은 예를 들면, 액체 액제(예를 들면, 주사가능한 및 주입가능한 액제), 분산제 또는 현탁제, 정제, 환제, 산제, 리포좀제 및 좌제와 같은 액체, 반-고체 및 고체 용량형을 포함한다. 바람직한 형태는 의도된 투여 유형 및 치료학적 적용에 의존한다. 바람직한 투여 양식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 본 발명의 조성물이 항체인 경우에 항체의 일일 투여량은 약1~10㎎/㎏, 바람직하게는 약 3~5㎎/㎏체중이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명은 HBx 단백질이 그것의 프로모터에 대한 과메틸화(hyper-methylation)를 통한 후생학적(epigenetic) 조절을 통하여 인 비보 및 인 비트로에서 HGF 활성화에 필수적인 효소인 uPA의 발현을 직접적으로 조절한다는 것을 나타낸다. 본 발명에서 본 발명자들은 HBV 감염에 의한 간 재생의 손상은 HBx에 의한 간 재생 신호의 분자적 간섭때문이라는 것을 시사한다

본 발명자들은 마우스 모델을 사용하여 간 재생의 저해에 대한 분자적 기작을 조사하였다. 부분적 간절제술 후의 간 재생은 HBV 감염의 마우스 모델에서 크게 저해되었다. 기작 연구는 HGF(hepatocyte growth factor)의 활성화를 조절하는 uPA의 발현이 간 조직에서 현저하게 감소되었다는 것을 나타내었다. 또한 본 발명자들은 HBx가 마우스 간 조직 및 인간 간 세포에서 uPA 프로모터의 후생학적 조절을 통하여 uPA의 발현을 억제한다는 것을 보였다. HBx는 DNMT3A2를 리쿠르트하여서 uPA 프로모터의 과메틸화를 강하게 유도하였다. 이 데이터들은 HBV의 감염이 HBx에 의한 간 재생 신호의 후생학적 조절을 통하여 간 재생을 손상시킨다는 것을 시사한다.

HBV 는 HBx 에 의한 uPA 프로모터에 대한 후생학적 조절을 통하여 uPA 발현 및 그것의 활성을 다운조절한다

HBV 감염이 uPA 발현 수준을 변경하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HBx-발현 플라즈미드와 복제-competent HBV 지놈으로 트랜스팩션된 Huh7 세포에서 uPA의 mRNA 수준을 조사하였다. 도 1a에 나타낸 것과 같이, 야생형 1.2mer HBV (HBV1.2(wt))는 내생적인 uPA의 전사를 강하게 저해하는 반면, HBx-null HBV (HBV1.2(HBx-))은 그러하지 않았다. 이것은 HBx 단백질이 uPA 다운 조절에 관여한다는 것을 시사한다. 이것은 HBx-GFP 플라즈미드로 트랜스팩션에 의하여 확인하였다(도 1a).

내생적인 uPA 전사의 감소에 관여하는 기작을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 uPA의 프로모터 부위를 사용한 리포터 어세이를 수행하였다. uPA 유전자의 업스트림 부위(up to -2064 bp까지)를 루시퍼레이즈 리포터 벡터 pGL3basic에 서브클로닝하였다(도 1b). uPA 유전자 전사의 중요부위에 대한 맵핑을 수행하기 위하여, 본 발명자들은 uPA 프로모터 부위의 연속적인 결손 돌연변이체를 구축하였다(도 1b). Huh7 세포에서 48시간 트랜스팩션 후, 각 프로모터 활성을 루시퍼레이즈 어세이 시스템을 사용하여 측정하였다. -2064에서 -1689 및 -542에서 +24를 포함한 uPA 프로모터 부위는 강한 프로모터 활성을 나타내었고(도 1b), 이것은 두 부위가 독립적으로 uPA 전사에 관여한다는 것을 시사한다.

가장 강한 프로모터 클론을 사용하여, 본 발명자들은 Huh7 세포에서 HBV가 HBV 또는 HBx-발현 벡터로 코트랜스팩션 후 uPA 프로모터를 억제하는지를 테스트하였다. uPA 프로모터 활성은 HBV1.2(wt) 트랜스팩션 48시간 후에 현저하게 감소한 반면 HBx-결손 HBV1.2(HBx-)에서는 감소하지 않았다(도 1c). CMV-driven HBx-GFP도 유사한 결과를 나타내었다(도 1d). uPA 프로모터 활성은 HBx-안정 세포주에서 거의 완벽하게 억제되었다(도 1e). 이들 데이터는 uPA의 다운 조절이 HBx에 의한 전사 수준에서 조절된다는 것을 나타낸다.

uPA 단백질이 HBx-발현 세포에서 다운 조절되는지를 체크하기 위하여, 본 발명자들은 각각 RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. uPA mRNA 및 단백질 수준은 HBx에 의하여 현저하게 감소하였다(도 1f). HBx에 의한 uPA의 감소된 단백질 수준이 uPA 활성의 감소와 관련이 있는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 무혈청 배지 하에서 트랜지언트하게 트랜스팩션된 HBx 세포 파쇄액 및 세포 배지로 카세인 자이모그래피 어세이를 통하여 uPA 활성을 측정하였다. 분비된 및 원형질 uPA 모두는 대조군 세포에 비하여 HBx-발현 세포에서 현저하게 감소된 활성을 나타내었다(도 1g).

최종적으로 uPA의 HBx-매개된 다운 조절이 후생학적 조절에 의하여 조절되는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HBx로 트랜지언트하게 또는 안정하게 트랜스팩션된 Huh7 세포에서 uPA 프로모터 부위에 대한 메틸화 상태를 조사하였다. Bisulfite 시컨싱은 uPA 프로모터 (-230 nt to +24 nt)의 CpG 부위가 대조군 세포와 비교하여 HBx-발현 세포(HBV1.2(wt) 및 HBx-stable 세포에 대하여 각각 51.15% 및 99.7%)에서 현저하게 과메틸화된 것을 나타내었다(도 1h). HBx-stable 세포에서 uPA 프로모터에 대한 CpG 아일랜드는 거의 완전하게 메틸화되었고, 이것은 도 1e에서 나타낸 프로모터 활성의 완전한 억제를 설명한다. 이 결과는 HBx가 uPA 프로모터 부위에 대한 과메틸화를 통하여 uPA 발현을 다운 조절한다는 것을 나타낸다.

이상의 결과로, 본 발명자들은 uPA 전사에 관여하는 두 부위를 발견하였고, HBx는 uPA의 proximal 프로모터의 과메틸화를 통하여 uPA 발현을 다운 조절한다는 것을 나타낸다.

DNMT3A2 는 HBx -유도된 uPA 다운조절에 관여함

DNA methyltransferase (DNMT)가 uPA 발현의 HBx-유도된 다운 조절에 관련되는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 각각의 DNMT 발현 벡터(pDNMT1, pDNMT3A1 및 pDNMT3A2)과 puPA-Luc (-2064~+24)를 코트랜스팩션하였다. uPA 프로모터의 활성은 DNMT3A2 (40.41% ± 0.17%)에 의해서만 억제된 반면 DNMT1 (75.75%±0.31%)는 거의 영향이 없었다(도 2A). 이 결과는 DNMTs로 트랜스팩션 후 uPA의 mRNA 및 단백질 수준에 의하여 추가적으로 확인하였다. DNMT3A2 트랜스팩션은 HBV1.2(wt) 트랜스팩션을 커멘셔러트하기 위하여 uPA의 mRNA 및 단백질 수준 모두를 현저하게 다운 조절하였다(도 2b). 다음으로 본 발명자들은 DNMT3A2의 넉다운이 HBx-유도된 uPA 억제를 회복하는지를 조사하였다. DNMT3A2의 mRNA 및 단백질 수준은 특이적으로 siDNMT3A2에 의하여 넉다운되었다(도 2c). 중요하게, DNMT3A2이 넉다운될 때, uPA의 HBx-유도된 다운 억제가 대조군 수준으로 회복되었고(도 2d),이것은 DNMT3A2가 uPA 발현의 HBx-유도된 억제에 직접적으로 관여한다는 것을 확인하는 것이다. 이 결과들은 여러 DNMTs 중 DNMT3A2가 uPA의 HBx-유도된 다운 억제에 관여한다는 것을 나타낸다.

최종적으로, uPA의 HBx-유도된 억제에 대한 DNMT 활성의 관련성을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 DNMT 저해제인 5-aza-2'-deoxycytidine (5-AzaC)로 Huh7-HBx세포에 처리하였다. 루시퍼레이즈 어세이는 uPA 프로모터 활성이 5-AzaC 처리에 의하여 회복되는 것을 나타내었다(도 2e). Semiquantitative RT-PCR 분석도 5-AzaC 처리는 uPA 발현을 현저하게 회복하는 것을 나타내었다(도 2f). 이 결과들은 HBx에 의한 uPA의 억제는 uPA 프로모터에 대한 후생학적 조절에 의하여 조절된다는 것을 나타낸다.

HBx 는 uPA 프로모터로 DNMT3A2 를 리쿠르트

DNMT3A2의 넉다운은 HBx가 발현되지 않을 경우에 내생적인 uPA 발현에 영향을 미치지 않았고(도 2D) 이것은 HBx가 uPA의 프로모터 부위에 DNMT3A2를 리쿠르트할 수 있다는 것을 시사한다. 이 가정을 증명하기 위하여 먼저 DNMT3A2 및 HBx사이의 상호작용을 HBx-발현 Huh7 세포를 사용하여 공동면역침전 어세이에 의하여 조사하였다. 도 2g에 나타낸 것과 같이, HBx는 내생적인 DNMT3A2와 공동으로 면역침전되고, 이것은 HBx가 DNMT3A2와 상호작용한다는 것을 지지한다.

다음 HBx-DNMT3A2 복합체가 uPA 프로모터에 결합할 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 HBx 발현 Huh7 세포를 사용하여 ChIP(chromatin immunoprecipitation) 어세이를 수행하였다. 도 2h에서 나타낸 것과 같이, 과메틸화된 프로모터 부위(-230 to +52, R1)를 ChIP 어세이에 대하여 분석하였고 엑손 1의 일부 (+367 to +656, R2)를 음성 대조군으로 사용하였다. ChIP 어세이는 DNMT3A2가 HBx- 발현 Huh7 세포에서 드 노보 메틸화된 R1에만 결합하는 것을 나타낸다 (도 2i). 이들 데이터는 HBx가 DNMT3A2와 결합하고 이 효소를 uPA 프로모터의 CpG 아일랜드로 리쿠르트하여서 과 메틸화 매개된 uPA 억제를 야기한다는 것을 나타낸다.

HBx 가 uPA - 매개된 HGF 활성화를 억제하여 HGF - 유도된 간 세포 증식을 억제

HBx에 의한 uPA 다운 조절이 HGF 활성화의 세포외 조절을 직접적으로 조절할 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 무혈청 조건하에서 자이모그래피를 사용하여 uPA 활성을 분석하였다. uPA의 활성은 HBx-발현 Huh7 세포에서 현저하게 감소하였다(도 3a). HGF 활성화에 대한 uPA 활성의 HBx-유도된 억제 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 세포 상등액으로 pro-form의 재조합 인간 HGF (rhHGF)를 배양하고 웨스턴 블럿에 의하여 그 절단 산물인 활성 HGF (a-HGF)를 분석하였다. HGF의 활성 형의 생성 및 프로-폼의 감소는 단지 대조군 Huh7-pcDNA 세포에서만 관찰되고 Huh7-HBx stable 세포 배지에서는 그러하지 않았다(도 3b). 이들 데이터는 HBx에 의한 uPA 다운 조절이 HGF 활성화의 저해와 기능적으로 관련되었다는 것을 시사한다.

다음으로 간세포증식에 HGF 활성화의 저해가 영향을 가지는지를 조사하기 위하여, HBx-발현 Huh7 세포를 pro-form의 rhHGF (pro-HGF)를 가지거나 가지지 아니하고 배양하고, 차후 세포 증식을 조사하였다. 도 3c에서 나타낸 것과 같이, 세포 증식의 현저한 저해가 HBx-발현 간 세포에서만 pro-HGF로 자극한 경우에 관찰된 반면, 두 세포주 모두는 세포를 pro-HGF로 자극하지 아니한 경우에 유사한 증식률을 나타내었다. 이 결과는 HBx-유도된 uPA의 억제는 HGF 자극 하에서 간세포 증식의 억제와 기능적으로 연결되었다는 것을 나타낸다.

HBV 는 인 비보에서 uPA 의 후생학적 조절을 통하여 간 재생을 저해

간 세포 증식의 HBV 및 HBx에 의한 억제가 인 비보에서도 관찰될 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스 DNA의 수동력학적 주사를 통하여 급성 HBV감염의 마우스 모델을 확립하였다. pHBV1.2(wt) 또는 pHBV1.2(HBx-)의 플라즈미드를 마우스 꼬리 정맥에 수동력학적으로 주사하였다. 간 조직에서 HBV 복제의 수준을 서던 블럿 분석에 의하여 분석하고 바이러스 단백질의 발현을 간 조직 및 혈청을 사용한 웨스턴 블럿,ELISA, 및 면역조직화학법에 의하여 분석하였다.

도 4a에 나타낸 것과 같이, HBV DNA 복제는 wt HBV 마우스에서만 도미넌트하게 관찰된 반면에 마지널 복제 수준이 HBx-null 마우스에서 검출되었다. 바이러스 단백질(HBsAg 및 HBcAg)의 발현 수준은 wt 및 HBx-null 마우스 사이에 크게 변하지 않았다(도 4b-4d).

HBx의 간 발현이 간 재생에 영향을 주는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 도 4d에 나타낸 것과 같은 시간 일정에 따라 수동력학적으로 주사된 HBV 또는 HBx 마우스의 부분 간절제 후 재생된 간의 상태를 조사하였다. 놀랍게도, 부분적 간절제 후 8일에서 재생된 간은 wt HBV 감염된 마우스 모델에서만 큰 감소를 나타낸 반면 HBx-null HBV 감염의 마우스는 정상 간 재생을 나타내었다(도 4e-4f). 또 유사한 결과가 HBx 발현의 마우스 모델로부터 관찰되었다(도 4g-4h). 이 결과들은 HBx의 발현이 부분적 간절제 촉발된 간 손상 후의 간 재생을 저해한다는 것을 나타낸다.

마우스 uPA가 HBx 발현의 간에서 다운 조절되는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 면역조직화학 및 웨스턴 블럿 분석에 의하여 간 조직에서 마우스 uPA (muPA)의 발현을 조사하였다. uPA의 발현 수준은 HBx-null HBV 마우스의 것과 비교하여 wt HBV-발현 마우스의 간조직에서 크게 감소하였다(도 5a). 다른 항체(각각 감소되고 비감소된 에피토프를 검출할 수 있는)로 웨스턴 블럿 분석은 간 조직에서 uPA 당백질이 wt HBV 마우스에서 감소되었다는 것을 나타낸다. uPA 감소의 수준은 HBx-발현 간 조직에서 더 현저하였다(도 5b).

uPA mRNA의 수준은 HBx 간 조직에서도 감소된 반면에, 활성 HGF 수용체, c-met,의 발현은 일정하게 유지되었다(도 5c). 마우스 uPA의 발현이 후생학적 조절에 의하여 조절되는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 muPA 프로모터의 메틸화 상태를 분석하였다. Bisulfite 시퀀싱은 muPA 프로모터의 CpG 아일랜드(-385 nt to -220 nt)가 HBx-null 마우스(4.8%)에 비교하여 wt HBV-발현 마우스의 간에서 크게 메틸화된 것(42.6%)을 나타내었다(도 5d). 이 결과들은 HBx가 인간 간 세포에서 나타낸 기작과 유사하게 uPA 프로모터의 후생학적 조절을 통하여 마우스 간에서 발현을 억제한다는 것을 나타낸다.

다음, 본 발명자들은 간 세포 증식률이 부분적 간절제 48시간 후 Ki67 (세포 증식의 마커) 염색에 대해서 포지티브 세포를 계수하여 HBx-발현 마우스 간 세포에서 감소되는지를 조사하였고 거기에는 세포 사멸이나 에팝토시스의 특징이 없었다. 면역조직화학에 의한 Ki67-포지티브 세포는 대조군 및 HBx-null 간 조직과 비교하여 wt HBV-발현 마우스 간 조직에서 크게 감소하였다(도 5e). Ki67-포지티브 세포의 퍼센트는 wt HBV-발현 간 조직에서 크게 감소하였다(도 5f). 이 결과들은 HBx가 인 비보에서 uPA의 후생학적 조절을 통하여 간 재생을 저해한다는 것을 시사한다.

변행 ( aberrant ) uPA 발현의 재구축은 인 비보에서 간 재생을 회복

uPA의 다운 조절이 간 재생의 HBV-매개된 저해에 대한 주요 분자적 이벤트이라는 직접적인 증거를 증명하기 위하여, 본 발명자들은 외래적인 uPA의 공급이 간 재생의 HBx-매개된 저해를 구제할 수 있는지를 조사하기 위하여 실험을 수행하였다. uPA 를 도 6a에 나타낸 실험 일정에 따라서 꼬리 정맥에 muPA 유전자의 수동력학적 주사에 의하여 제공하였다.

wt HBV는 간 재생을 억제한 반면 HBx-null HBV는 그러하지 않았다. 놀랍게도, 억제된 간 재생은 uPA를 수동력학적 주사로 공급할 경우에 부분 간절제 8일 후 거의 완전하게 회복하였다(도 6b-6c).

uPA의 발현은 부분적인 간절제된 간 조직을 사용한 semiquantitative RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석에 의하여 확인하였다. 도 6d 및 6e에 나타낸 것과 같이, uPA mRNA 및 단백질의 발현 수준은 wt HBV에 의하여 다운 조절되었지만 uPA 유전자의 공급으로 uPA mRNA 및 단백질의 발현을 회복하였다. 이 결과들은 다운 조절된 uPA가 간 재생의 HBV-매개된 저해의 주요 분자적 원인이라는 것을 시사한다.

본 발명을 통하여 HBV의 HBx 단백질이 인 비트로 및 인 비보에서 uPA 프로모터에 대한 과메틸화를 통하여 후생학적 조절에 의여 직접적으로 uPA 유전자의 발현을 조절한다는 것을 알 수 있다. 따라서 HBV 감염에 의한 간 재생의 저해의 분자적 기초의 해결은 바이러스 매개된 간 질환의 병원생리학의 이해를 확장시킬 뿐만 아니라 궁극적으로는 간 질환을 가지는 환자를 위한 새로운 치료 선택을 제공할 것이다.

도 1은 HBV가 HBx에 의한 uPA 프로모터에 대한 후생학적 조절을 통하여 uPA 발현을 다운 조절한다는 것을 나타낸 그림.
(A) semiquantitative RT-PCR에 의한 uPA의 mRNA 수준. Huh7 세포를 pHBV1.2(wt), pHBV1.2(HBx-), pGFP 또는 pHBx-GFP 플라즈미드로 트랜스팩션하고 기재된 시간에 전체 RNA를 분리하였다. (B) uPA 프로모터-루시퍼레이즈 유전자 구축물의 그림(왼쪽 패널). 루시퍼레이즈 리포터 어세이에 의한 uPA 프로모터 활성의 결정(오른쪽).돌연변이체 리포터 플라즈미드를 Huh7 세포에 트랜스팩션함. 루시퍼레이즈 활성의 수준을 트랜스팩션 48시간 후에 결정하고 베타-gal 활성으로 표준화. (C) pHBV1.2 (wt) 또는 pHBV1.2 (HBx-)으로 코트랜스팩션 후 Huh7 세포에서 uPA 프로모터 (uPA-luc (-2064~+24))의 상대적인 루시퍼레이즈 활성. (D) 기재된 시간에서 pGFP-HBx 또는 pGFP 플라즈미드로 코트랜스팩션 후 Huh7 세포에서 uPA 프로모터 (uPA-luc (-2064~+24))의 상대적인 루시퍼레이즈 활성. (E) HBx 안정 Huh7 세포에서 uPA 프로모터 (uPA-luc (-2064~+24))의 상대적인 루시퍼레이즈 활성. 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균 ± S.D.를 나타냄. (F) HBx 단백질을 안정하게 발현하는 Huh7 세포에서 uPA 발현의 RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석. (G) HBx 유전자로 트랜스패션 후 카세인 자이모그래피를 사용하여 배양 배지 및 세포 파쇄액에서 uPA 활성의 분석. (H) HBx 트랜지언트 및 stable Huh7 세포에서 지노믹 uPA 프로모터의 Bisulfite 시퀀싱 분석. 퍼센트는 적어도 3회 독립적인 실험으로부터 uPA 프로모터 부위(-230~+24)의 전체 CpG 중 메틸화된 CpG에 의하여 계산되었다. TSS, 전사 시작 부위; 오픈 서클, unmethyalted CpG; 검은 원, methylatyed CpG.
도 2는 DNMT3A2가 HBx-유도된 uPA 다운 조절에 관여하고 HBx와 결합하여 uPA 프로모터 상에 리쿠르트하는 것을 나타낸 그림
(A) 각 pDNMT 발현 벡터(pDNMT1, pDNMT3A1, 및 pDNMT3A2)로 코트랜스팩션된 Huh7 세포에서 uPA-luc (-2064~+24)를 사용한 상대적인 루시퍼레이즈 활성 어세이. 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균 ± S.D.를 나타냄. (B) Huh7 세포에서 기재된 플라즈미드로 트랜스팩션 후 uPA의 Semi-quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석. (C) 기재된 siRNAs으로 트랜스팩션된 Huh7 세포에서 DNMT3A의 quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석. (D) 기재된 siRNAs 및 플라즈미드로 트랜스팩션된 Huh7 세포에서 uPA의 quantitative RT-PCR 및 웨스턴 블럿 분석. (E) DNA methyltransferase 저해제인 5-aza-2'-deoxycytidine (5AzaC) 처리 후 pHBV1.2(wt) 또는 pHBV1.2(HBx-)로 트랜스팩션된 Huh7 세포에서 uPA-luc의 상대적인 루시퍼레이즈 활성 어세이. 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균 ± S.D.를 나타냄.. (F) Huh7-HBx stable 세포에서 5AzaC 처리 후 uPA mRNA 발현. (G) HBx-HA를 안정하게 발현하는 Huh7 세포에서 내생적인 DNMT3A로 공동면역침전된 HBx. (H) ChIP(chromatin immunoprecipitation) 어세이를 위한 uPA 프로모터의 도식적인 도면. 전사 시작 부위를 +1로 표시. (I) HBx-stable Huh7 세포에서 항 DNMT3A 항체를 사용하여 지노믹 uPA 프로모터 부위(R1 및 R2)의 ChIP 어세이.
도 3은 HBx가 uPA-매개된 HGF 활성화 및 HGF-유도된 간 세포 증식을 저해한다는 것을 나타낸 그림
(A) 카세인 자이모그래피에 의한 uPA 활성 분석. uPA 활성을 무혈청 조건 하에서 HBx stable Huh7 세포의 배양 배지를 사용하여 어세이. (B) HBx 세포에서 pro-HGF 과정의 저해. 세포 배양 배지를 6시간 동안 무혈청 배지로 변경하고 재조합 pro-HGF를 1시간 동안 처리. 그 배지를 수확하여서 진공 하에서 농축하고 절단된 (활성) HGF 단백질을 검출하기 위하여 10% SDS-PAGE로 분리. (C) pro-HGF 처리 또는 무처리의 세포 증식 어세이. 세포를 12웰 플레이트에서 5 X 10⁴ 세포 밀도로 시딩하고, 24시간 후, 그 배지를 신선한 배지로 대체하고 세포를 pro-HGF (50ng/ml)의 존재 또는 부존재에서 배양하였다. 생존 세포를 기재된 시간 간격에서 트립판 블루를 사용하여 계수하였다. 각 플롯은 세 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 4는 HBx가 HBV 감염의 마우스 모델에서 간 재생을 억제하는 것을 설명한 그림.
(A-D) HBV 감염의 마우스 모델의 확인. 서던 블럿 분석에 의한 HBV 복제(A) 및 웨스턴 블럿에 의한 HBsAg 단백질 발현(B)을 수동력학적 주사 4일 후에 얻어진 간 조직을 사용하여 분석. (C) 마우스 간 조직에서 HBsAg 및 HBcAg의 면역조직화학 염색. (D) ELISA에 의한 HBsAg 수준의 측정. 부분적 간절제에 대한 시간 일정이 기재됨. (E-H) 간 재생이 HBV 마우스 모델에서 HBx에 의하여 저해됨. (E, G) 부분적 간절제 8일 후 HBV 또는 HBx 마우스 모델의 재생된 간의 현미경 평가. (F, H) 부분적 간절제 8일 후 간 중량/체중의 박스 플롯. 부분적 간절제에 대한 마우스의 수를 기재함. 통계적 유의성을 student's t-테스트에 의하여 결정함.
도 5는 uPA가 uPA 프로모터에 대한 후생학적 조절을 통하여 HBV 또는 HBx 모델 마우스의 간에서 다운 조절된다는 것을 나타낸 그림. (A) 마우스 간 조직에서 면역조직화학 염색에 의한 마우스 uPA (muPA) 발현. (B) 비환원 및 환원 조건 하에서 마우스 간에서 웨스턴 불럿에 의한 muPA 단백질 발현. (C) 마우스 간에서 muPA, c-met, 및 바이러스 RNA의 Semiquantitative RT-PCR 분석. (D)HBV 모델 마우스의 지노믹 DNA를 사용한 bisulfide 시퀀싱에 의한 muPA 프로모터의 메틸화 분석. 퍼센트는 적어도 세번의 독립적인 실험을 가지는 muPA 프로모터의 메틸화된 CpG/총 CpG에 의하여 계산됨. 오픈 서클, 비메틸화된 CpG; 검은 원, 메틸화된 CpG. (E) 포르말린 고정된 간 조직에서 Ki 67 (세포 증식 마커) 발현. (F) Percentage of Ki67-포지티브 간세포의 퍼센트는 적어도 세번의 독립적인 실험을 가지고 계산. 값들은 평균 ±SD로 표현. 통계적 유의성은 student's t-테스트에 의하여 결정함. ***, p<0.001.
도 6은 외래 uPA가 인 비보에서 간 재생을 회복하는 것을 나타낸 그림.
A) 마우스 uPA의 공급 및 부분적 간절제의 실험 개략도. (B) 부분적 간절제 8일 후 재생된 간의 거시적인 평가. 값들은 간 중량의 평균 ±SD로 표현. RML, 우측 중엽; RLL, 우측 간엽; PC, 후 미상엽(posterior caudate lobe); AC, 전미상엽(anterior caudate lobe). (C) 부분적 간절제 8일 후 간 중량/체중의 박스 플롯. 통계적 유의성은 student's t-테스트에 의하여 결정함. (D-E) muPA의 mRNA 및 단백질 발현을 마우스 간 조직을 사용한 RT-PCR 및 웨스턴 블럿에 의하여 결정함.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 예시된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 세포 배양

Huh7 세포를 10% (v/v) 열불활성화된 우태아 혈청(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) 및 1% penicillin/streptomycin 용액(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's 배지(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)에서 성장시켰다. 세포를 5% CO₂의 습도 환경에서 37℃에서 배양하였다.

실시예 2: 플라즈미드 구축

전장 uPA 프로모터를 프라이머 세트: 포워드(5-accgctagcTAGGTGAAGAGGTGGCAC-3, -2104 to -2086 ) 및 리버스(5-ttaaagcttGGGCTGCGGTCTCCG-3, + 24 to +9)를 사용한 PCR에 의하여 Huh7 세포의 지노믹 DNA로부터 얻었다. 그 PCR 산물을 루시퍼레이즈 리포터 벡터, pGL3-basic (Promega, Madison, WI)의 NheI 및 HindIII부위에 서브클로닝하여서 uPA-luc 플라즈미드(uPA 프로모터 스패닝 -2064~+24)을 생성하였다. uPA 프로모터의 연속적인 5'결손 돌연변이체를 pGL3-basic 벡터의 NheI 및 HindIII부위에 서브클로닝하여서 구축하였다. 그 생성된 uPA 프로모터 구축물을 레퍼런스 서열(GenBank Accession No. A00794)에 따라서 시퀀싱하여 확인하였다. 그 DNMT1, DNMT3A1, 및 DNMT3A2 발현 벡터는 이용익 박사(KRIBB, Korea)로부터 제공받았다. 마우스 uPA 유전자는 프라이머 세트: 포워드(5-cggatccgATGAAAGTCTGGCTGGCG) 및 리버스-flag (ctcgagTCACTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGAAGGCCAGACCTTTCTC) 또는 리버스(ctcgagTCAGAAGGCCAGACCTTTCTC)를 사용한 PCR에 의하여 BALB/c 마우스 간의 전체cDNA로부터 얻었다. 그 PCR 산물을 pcDNA3.1(+) 벡터의 BamHI 및 XhoI 부위에 서브클로닝하였다. 그 생성된 발현 벡터, muPA를 레퍼런스 서열(GenBank Accession No. NM_008873.3)에 따라서 시퀀싱하여 확인하였다.

실시예 3: 트랜스팩션 및 루시퍼레이즈 리포터 어세이

트랜스팩션은 제조업자의 지시에 따라서 Lipofectamine 2000reagent (Invitrogen, USA)을 사용하여 수행하였다. 트랜스팩션 48시간 후, 루시퍼레이즈 활성을 매뉴얼에 따라 루시퍼레이즈 어세이 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 측정하였다. 얻어진 값을 동일한 세포 파쇄액을 사용한 베타-galactosidase 활성으로 표준화하였다. 어세이는 적어도 3회 반복수행하고, 평균± SD로 나타내었다.

실시예 4: Semiquantitative RT - PCR

세포 및 마우스 간 조직을 제조업자의 지시에 따라서 Trizol reagent (Invitrogen/Gibco BRL, Carlsbad, Calif., USA)을 사용하여 파쇄하고 전체 RNAs를 분리하였다. 역전사 반응을 2 mg의 총 RNA 및 M-MLV reverse transcriptase (iNtRON, Seoul, Korea)을 사용하여 전체 반응부피 20 ml에서 수행하였다. 그 생성 cDNA를 하기 조건하에서 PCR증폭하였다: 초기 변성94^oC에서 5분,25-30 사이클의 94 ^oC (30 s), 55-60 ^oC (30 s), 및 72 ^oC (30 s), 그리고 72 ^oC에서 5분간 최종 익스텐젼. 그 프라이머 서열은 표 1에서 리스트하였다.

실시예 5: 웨스턴 블럿 분석

세포를 파쇄 버퍼(25 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% NP40, 및 프로테이즈 저해제 칵테일)하에서 파쇄하고 원심분리하였다. 그 상등액을 수집하고 95℃에서 3분간 가열하였다. 각 조직을 RIPA 버퍼(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.3 μM Aprotinin, 10 μM Leupeptin, 2 μM Pepstatin, 1.3 mM EDTA-Na₂, 2 mM Na₃VO₄, 및 10 μg/ml E64)에서 균질화하였다. 그 조직을 13000g에서 30분간 원심분리하였고 그 상등액을 수집하였다. 가열 후, 단백질을 표준으로 소 혈청 알부민(10 mg/mL)을 사용하여 Bradford 단백질 어세이 Reagent (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)에 의하여 정량화하였다. 50 μg의 단백질을 10-12% SDS-PAGE 젤로 분리하고 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 사용된 1차 항체는 anti-uPA (389, American Diagnostica, Greenwich, Connecticut, USA and M-20, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), anti-HGF (Santa Cruz Biotechnology), anti-HBsAg (Abcam), anti-DNMT3A (No. IMG-268, Imgenex), anti-HA (Sigma Aldrich), anti-HBx (Mybiosources), 및 anti-베타-actin (Sigma Aldrich)이었다. 2차 항체로, 적당한 peroxidase-conjugated 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 사용하였다. Chemiluminent 검출을 ECL Detection Reagent (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)로 수행하고 X-ray 필름 또는 Bio-Imaging analyzer (LAS-3000, Fuji, Tokyo, Japan)로 육안화하였다.

실시예 6: 카세인 자이모그래피

샘플을 베타-mercaptoethanol과 같은 환원제없는 샘플 버퍼로 혼합한 후 카세인(1 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO) 및 프라즈미노겐(13 mg/ml; American Diagnostica, Stamford, CT)을 포함하는 10% 폴리아크릴아마이드 젤 상에 런닝하였다. 그 젤을 2.5% Triton X-100으로 세척하여 SDS를 제거하고 0.1 M Tris 버퍼로 상온에서 12 24시간 동안 배양하였다. 다음 그 젤을 Coomassie Brilliant Blue (G-250)으로 염색하고 20% methanol 및 10% 초산으로 탈색하였다. PA 활성을 카세인 분해로 인한 라이트 밴드로 육안화하였다. 52 kDa에서 검출된 그 카세인분해 밴드는 표준 uPA 밴드(Chemicon, Temecula, CA)에 해당하기 때문에 uPA에 특이적이다.

실시예 7: 5- AzadC 처리 및 bisulfite DNA 시퀀싱

DNA 메틸화 저해 연구를 위하여, 최종 농도 10 mmol/L의 신선하게 제조된 5-AzadC (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO)를 배양배지에 첨가하고 3일 동안 24시간마다 교체하였다.

Sodium bisulfite 변형을 지노믹 DNA 상에서 하기와 같이 수행하였다. 요약하면, 2 μg의 지노믹 DNA를 2 M NaOH로 37°C에서 15분간 변성하고 3 M sodium bisulfite (pH 5.0)로 50°C에서 16시간 배양하였다. 정제 후, 그 변형된 DNA를 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 젤 추출하고 pGEM-T easy 벡터(Promega)로 서브클로닝하였다. 각 샘플의 10클론 중 다섯 개를 DNA 시퀀싱을 위하여 선택하였다.

실시예 8: 면역침전

세포를 파쇄 버퍼(50 mM Tris-HCl (pH7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% NP40, 및 프로테이즈 저해제 칵테일)에서 파쇄하고 13,000rpm에서 30 분간 원심분리하였다. 그 청정화된 파쇄액을 항체로 4^oC에서 오버나잇 혼합하면서 배양하였다. 아가로스 비드를 첨가 후, 그 혼합물을 4^oC에서 추가로 6시간 덩 배양하였다. 파쇄 버퍼로 그 비드를 세척한 후, 그 면역침전된 단백질을 샘플버퍼로 가열하고 10% SDS PAGE를 사용한 웨스턴 블럿을 수행하였다.

실시예 9: 크로마틴 면역침전( ChIP ) 분석

ChIP 어세이를 ChIP 어세이 키트(Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 수행하였다. 요약하면, Huh7 세포를 37^oC에서 10분간 포름알데히드로 크로스링크하였다. PBS로 세척한 후, 그 수집된 세포를 SDS 파쇄 버퍼(Millipore)에 재부유하였다. 그 세포 파쇄액을 30% 파워로 10초간 7회 초음파하였다. 그 상등액을 protein G-agarose를 사용하여 미리클리어하였다. 그 회수된 상등액을 anti-DNMT3A 항체(No. IMG-268, Imgenex) 또는 음성 대조군으로 정상 마우스 IgG로 배양하였다. 그 면역침전된 DNA 절편을 표 1에 기재된 특정 프라이머를 사용하여 PCR증폭에 의하여 검출하였다.

실시예 10:마우스에서 플라즈미드 DNA 의 수동력학적 주사

6에서 7주령의 수컷 BALB/c 마우스를 플라즈미드 DNA의 수동력학적 주사에 사용하였다(Yang, P.L., Althage, A., Chung, J., and Chisari, F.V. (2002). HProc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13825-13830). 마우스를 25 마이크로그램의 플라즈미드 DNA (pHBV1.2 (wt), pHBV1.2 (HBx-), pCMV-HBx-HA 및 pCMV-HA)으로 꼬리 정맥에 10%의 마우스 체중에 해당하는 PBS의 부피에서 수동력학적으로 주사하였다 . 전체 부피의 DNA를 4-6초 내에 고압으로 그 정맥으로 운반되었다(수동력학적 인 비보 트랜스팩션).

HBV-발현 마우스의 간에서 uPA 발현을 회복하기 위하여, 25 마이크로그램의 마우스 uPA 벡터를 HBV1.2 (wt)로 수동력학적으로 주사하였다. 2일 후, 동량의 uPA 벡터를 추가적으로 주사하였다. 모든 동물 실험은 건국대학교 동물윤리위원회에 승인하에 수행하였다.

실시예 11:부분적 간절제

70% 부분적 간절제 모델을 마우스에서 생리적인 간 재생을 유도하기 위하여 사용하였다. 수동력학적 주사 4일 후, 약 70%의 전체 간 중량을 xylazine (10 mg/kg 체중) 및 Zoletil 50 (10 mg/kg 체중)의 복강내 투여 후에 절제하였다. 요약하면, 마우스 간의 좌엽 및 중간엽의 일부를 중간 복부l 절제를 통하여 제거하였다(Mitchell, C., and Willenbring, H. (2008). Nat. Protoc. 3, 1167-1170). 복벽을 봉합에 의하여 닫은 후, 그 동물을 그들의 케이지로 보내고 자유급식하였다. 간 재생은 부분적 간절제 8일 후 체중과 재생된 간 중량의 비로 평가하였다. 그 동물을 기재된 시간에 희생하여서 간 조직과 혈액 샘플을 수집하여서 어세이때까지 -70 ℃에서 동결하였다.

실시예 12: 서던 블럿 분석 및 HBV 의 ELISA

약 100 mg의 간 조직을 상기 기재된 것과 같이 RIPA 버퍼를 사용하여 파쇄하였다. HBV의 복제를 (Kwon et al., 2010)에 기재된 것과 같이 서던 블럿에 의하여 분석하였다. 표면 항원 분석을 HBsAg 검출 ELISA 키트 (Enzygnost HBsAg 5.0, Siemens)를 사용한 마우스 혈청으로 수행하였다.

실시예 13:마우스 간의 면역조직화학 염색

마우스 간 조직을 10 % 포르말린으로 고정하고 파라핀 충진하였다. 5 um 조직 절편을 anti-HBsAg, anti-HBcAg, 및 anti-uPA 항체로 면역염색하고 avidin-바이오틴 복합체 방법(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)에 의하여 육안화하였다. 모든 조직을 hematoxylin으로 카운터염색하였다.

실시예 14: 마우스 간세포 증식 어세이

부분적 간절체 후 마우스 간세포의 증식을 평가하기 위하여, Ki67-표지 인덱스를 증식 마커로 모니터하였다. Ki67-염색된 간세포를 제조업자의 지시(Cell proliferation kit, Amersham Life Science, Arlington Heights, IL)에 따라 파라핀 충진된 4 mm 조직 절편의 간 샘플에 대해서 동정하였다. 각 샘플에 대해 간 세포 증식 인덱스(Ki67-포지티브 세포의 퍼센트)를 10 high-파워 필드(~100 간세포 핵/필드)에서 Ki67-염색 vs 비표지된 간세포 핵을 카운팅하여 계산하였다. 간세포 증식을 각 군(n = 3-6마우스/군)에서 모든 마우스에 대한 평균±표준편차로 표현하였다.

모든 데이터들은 적어도 3회 독립적인 반복실험에 의하여 얻었고, 평균±표준편차로 표현하였다. 군들 간의 차이는 Student's t-테스트 또는 변량 분석을 사용하여 통계적 유의성에 대해서 테스트하였다. 통계적 유의성은 P<0.05에 세팅하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Composition for regenerating liver damage by infection of HBV <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 912 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ala Met Pro Ser Ser Gly Pro Gly Asp Thr Ser Ser Ser Ala 1 5 10 15 Ala Glu Arg Glu Glu Asp Arg Lys Asp Gly Glu Glu Gln Glu Glu Pro 20 25 30 Arg Gly Lys Glu Glu Arg Gln Glu Pro Ser Thr Thr Ala Arg Lys Val 35 40 45 Gly Arg Pro Gly Arg Lys Arg Lys His Pro Pro Val Glu Ser Gly Asp 50 55 60 Thr Pro Lys Asp Pro Ala Val Ile Ser Lys Ser Pro Ser Met Ala Gln 65 70 75 80 Asp Ser Gly Ala Ser Glu Leu Leu Pro Asn Gly Asp Leu Glu Lys Arg 85 90 95 Ser Glu Pro Gln Pro Glu Glu Gly Ser Pro Ala Gly Gly Gln Lys Gly 100 105 110 Gly Ala Pro Ala Glu Gly Glu Gly Ala Ala Glu Thr Leu Pro Glu Ala 115 120 125 Ser Arg Ala Val Glu Asn Gly Cys Cys Thr Pro Lys Glu Gly Arg Gly 130 135 140 Ala Pro Ala Glu Ala Gly Lys Glu Gln Lys Glu Thr Asn Ile Glu Ser 145 150 155 160 Met Lys Met Glu Gly Ser Arg Gly Arg Leu Arg Gly Gly Leu Gly Trp 165 170 175 Glu Ser Ser Leu Arg Gln Arg Pro Met Pro Arg Leu Thr Phe Gln Ala 180 185 190 Gly Asp Pro Tyr Tyr Ile Ser Lys Arg Lys Arg Asp Glu Trp Leu Ala 195 200 205 Arg Trp Lys Arg Glu Ala Glu Lys Lys Ala Lys Val Ile Ala Gly Met 210 215 220 Asn Ala Val Glu Glu Asn Gln Gly Pro Gly Glu Ser Gln Lys Val Glu 225 230 235 240 Glu Ala Ser Pro Pro Ala Val Gln Gln Pro Thr Asp Pro Ala Ser Pro 245 250 255 Thr Val Ala Thr Thr Pro Glu Pro Val Gly Ser Asp Ala Gly Asp Lys 260 265 270 Asn Ala Thr Lys Ala Gly Asp Asp Glu Pro Glu Tyr Glu Asp Gly Arg 275 280 285 Gly Phe Gly Ile Gly Glu Leu Val Trp Gly Lys Leu Arg Gly Phe Ser 290 295 300 Trp Trp Pro Gly Arg Ile Val Ser Trp Trp Met Thr Gly Arg Ser Arg 305 310 315 320 Ala Ala Glu Gly Thr Arg Trp Val Met Trp Phe Gly Asp Gly Lys Phe 325 330 335 Ser Val Val Cys Val Glu Lys Leu Met Pro Leu Ser Ser Phe Cys Ser 340 345 350 Ala Phe His Gln Ala Thr Tyr Asn Lys Gln Pro Met Tyr Arg Lys Ala 355 360 365 Ile Tyr Glu Val Leu Gln Val Ala Ser Ser Arg Ala Gly Lys Leu Phe 370 375 380 Pro Val Cys His Asp Ser Asp Glu Ser Asp Thr Ala Lys Ala Val Glu 385 390 395 400 Val Gln Asn Lys Pro Met Ile Glu Trp Ala Leu Gly Gly Phe Gln Pro 405 410 415 Ser Gly Pro Lys Gly Leu Glu Pro Pro Glu Glu Glu Lys Asn Pro Tyr 420 425 430 Lys Glu Val Tyr Thr Asp Met Trp Val Glu Pro Glu Ala Ala Ala Tyr 435 440 445 Ala Pro Pro Pro Pro Ala Lys Lys Pro Arg Lys Ser Thr Ala Glu Lys 450 455 460 Pro Lys Val Lys Glu Ile Ile Asp Glu Arg Thr Arg Glu Arg Leu Val 465 470 475 480 Tyr Glu Val Arg Gln Lys Cys Arg Asn Ile Glu Asp Ile Cys Ile Ser 485 490 495 Cys Gly Ser Leu Asn Val Thr Leu Glu His Pro Leu Phe Val Gly Gly 500 505 510 Met Cys Gln Asn Cys Lys Asn Cys Phe Leu Glu Cys Ala Tyr Gln Tyr 515 520 525 Asp Asp Asp Gly Tyr Gln Ser Tyr Cys Thr Ile Cys Cys Gly Gly Arg 530 535 540 Glu Val Leu Met Cys Gly Asn Asn Asn Cys Cys Arg Cys Phe Cys Val 545 550 555 560 Glu Cys Val Asp Leu Leu Val Gly Pro Gly Ala Ala Gln Ala Ala Ile 565 570 575 Lys Glu Asp Pro Trp Asn Cys Tyr Met Cys Gly His Lys Gly Thr Tyr 580 585 590 Gly Leu Leu Arg Arg Arg Glu Asp Trp Pro Ser Arg Leu Gln Met Phe 595 600 605 Phe Ala Asn Asn His Asp Gln Glu Phe Asp Pro Pro Lys Val Tyr Pro 610 615 620 Pro Val Pro Ala Glu Lys Arg Lys Pro Ile Arg Val Leu Ser Leu Phe 625 630 635 640 Asp Gly Ile Ala Thr Gly Leu Leu Val Leu Lys Asp Leu Gly Ile Gln 645 650 655 Val Asp Arg Tyr Ile Ala Ser Glu Val Cys Glu Asp Ser Ile Thr Val 660 665 670 Gly Met Val Arg His Gln Gly Lys Ile Met Tyr Val Gly Asp Val Arg 675 680 685 Ser Val Thr Gln Lys His Ile Gln Glu Trp Gly Pro Phe Asp Leu Val 690 695 700 Ile Gly Gly Ser Pro Cys Asn Asp Leu Ser Ile Val Asn Pro Ala Arg 705 710 715 720 Lys Gly Leu Tyr Glu Gly Thr Gly Arg Leu Phe Phe Glu Phe Tyr Arg 725 730 735 Leu Leu His Asp Ala Arg Pro Lys Glu Gly Asp Asp Arg Pro Phe Phe 740 745 750 Trp Leu Phe Glu Asn Val Val Ala Met Gly Val Ser Asp Lys Arg Asp 755 760 765 Ile Ser Arg Phe Leu Glu Ser Asn Pro Val Met Ile Asp Ala Lys Glu 770 775 780 Val Ser Ala Ala His Arg Ala Arg Tyr Phe Trp Gly Asn Leu Pro Gly 785 790 795 800 Met Asn Arg Pro Leu Ala Ser Thr Val Asn Asp Lys Leu Glu Leu Gln 805 810 815 Glu Cys Leu Glu His Gly Arg Ile Ala Lys Phe Ser Lys Val Arg Thr 820 825 830 Ile Thr Thr Arg Ser Asn Ser Ile Lys Gln Gly Lys Asp Gln His Phe 835 840 845 Pro Val Phe Met Asn Glu Lys Glu Asp Ile Leu Trp Cys Thr Glu Met 850 855 860 Glu Arg Val Phe Gly Phe Pro Val His Tyr Thr Asp Val Ser Asn Met 865 870 875 880 Ser Arg Leu Ala Arg Gln Arg Leu Leu Gly Arg Ser Trp Ser Val Pro 885 890 895 Val Ile Arg His Leu Phe Ala Pro Leu Lys Glu Tyr Phe Ala Cys Val 900 905 910 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 gccaagguca uugcaggaa 19

Claims (5)

1. DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 항체 또는 siRNA를 유효성분으로 포함하는 HBV 감염으로 인한 B형 간염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물
2. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 HBV 감염으로 인한 B형 간염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물
3. 제 1항에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 siRNA는 서열번호 2의 염기서열 또는 그의 상보적인 서열인 것을 특징으로 하는 HBV 감염으로 인한 B형 간염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물
4. DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 저해제를 유효성분으로 포함하는 HBV 감염으로 인한 B형 간염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물
5. 제 4항에 있어서, 상기 DNA 메틸트랜스퍼레이즈(methyltransferase)3A2에 대한 저해제는 5-아자-2'-디옥시시티딘인 것을 특징으로 하는 HBV 감염으로 인한 B형 간염에 의한 간 손상 재생용 약학 조성물

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