JP3274143B2

JP3274143B2 - ｐ２１により癌及び再狭窄を治療する方法

Info

Publication number: JP3274143B2
Application number: JP51351997A
Authority: JP
Inventors: ゲアリージェイネイベル; ツィヨンヤン; エリザベスジーネイベル
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブミシガン
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 2002-04-15
Anticipated expiration: 2016-09-26
Also published as: EP0859639A4; WO1997011720A1; US5863904A; JP2001278795A; EP0859639A1; CA2232985A1; US6218372B1; JPH11513379A; CA2232985C; JP2007314582A; US6057300A

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景発明の属する技術分野本発明は、p21をコードする遺伝子を含有する発現ベ
クターと医薬担体とを含有する組成物を投与することに
より、in vivoで再狭窄及び癌を治療及び予防する方法
を提供する。

背景の説明細胞増殖と関係のある異常性を有する変異体イースト
菌株の研究により、細胞周期調節タンパク質の同定は非
常に容易になった。イーストにおいて規定されている遺
伝子産生物の中で、Fer 1（１）の哺乳類相同体、p21は
サイクリン依存キナーゼの活性を変化させ、かつ細胞周
期プログレッション及び配列と関連づけられている（２
〜13）。WAF1、CIP1又はSDI1としても公知のp21は（1
1、12、14、15）、p53腫瘍サプレッサー遺伝子の下流タ
ーゲットであり、悪性トランスフォーメーションと間接
的な関係があった（15〜18）。DNAダメージへの応答に
おけるp53の誘発により、G1チェックポイントは静止す
るが（16〜19）、そのときDNA修復はＳ相におけるDNA複
製の前に達成されている。p53の下流エフェクターとし
ての想像される役割と矛盾がなく、p21は増殖性細胞核
抗原（PCNA）依存DNA複製を抑制するがin vitroにおけ
るDNA修復は抑制しないことがわかっている（20）。

Zhangらは、in vitroにおいてp21の研究をしている
（Genes ＆ Development（1994）８:1750）。p21がキナ
ーゼ阻害剤として使用するので、これまでは正常細胞が
活性サイクリンキナーゼを実質的に全く含有しないこと
が予想されていた。p21含有サイクリンキナーゼが活性
及び不活性の両状態において存在することを示すことに
より、Zhangらは、p21が正常細胞における細胞周期プロ
グレッションをコントロールするのに含まれると説明し
ている。Zhangらは、種々の腫瘍ウイルス腫瘍性タンパ
ク質でトランスホームした線維芽細胞において、サイク
リンキナーゼは二成分状態で存在し［サイクリン/CD
K］；その一方、正常な線維芽細胞においては、p21を含
有する第四級複合体に複数のサイクリンキナーゼが存在
することを見いだした［サイクリン/CDK/増殖性細胞核
抗原（PCNA）/p21］。活性な複合体は、シングルp21分
子を含有する。対照的に、不活性な複合体は複数のp21
サブユニットを有している。化学量論におけるp21の変
化は、in vitroにおける複合体の活性から不活性への変
換を説明するには十分であるが、Zhangらは“p21とサイ
クリンキナーゼとの結合は、in vivoにおける他の調節
機序と絡み合っているに違いない”と確信している。Zh
angらは“p21の非抑制レベルと結合することにより、in
vivoにおいてこれらのCDK改質酵素にどのような影響が
あったのかは知られていない”と示している。

国際公開第94/09135号公報には、サイクリン複合体の
サブユニット成分の検出を含む、細胞のトランスフォー
メーションを診断するための方法及び診断キットが記載
されている。特に、該方法はサイクリン、PCNA、CDKs及
びp21、p19及びp16等の低分子量ポリペプチドの相互作
用と関係する。

in vitroにおけるサイクリンキナーゼ抑制活性が明ら
かであるにも関わらず、腫瘍形成におけるp21の役割及
びin vivoにおける悪性表現型を逆転するその能力はこ
れまで規定されていなかった。

発明の概要したがって、本発明の目的の一つは癌（腫瘍形成）を
in vivoで治療及び予防する方法を提供することであ
る。

本発明の第二の目的は、再狭窄をin vivoで治療及び
予防する方法を提供することである。

本発明の第三の目的は、末期分化（terminal differe
ntiation）を誘発することにより細胞における抗腫瘍効
果を誘発する方法を提供することである。この方法は、
腫瘍の免疫認識を潜在的に容易にし得る細胞表面タンパ
ク質の発現を変化させるのに、又は二次的に細胞成長を
阻害し得る因子の分泌を引き起こすのに有用である。

本発明により、腫瘍細胞成長及び再狭窄におけるp21
サイクリン依存キナーゼ阻害剤の役割を決定した。p21
はp53により誘発され（6,7,15〜18）、したがってp53腫
瘍抑制の下流エフェクターとして関係付けられていた
（23）。本発明者らは、p21発現はこれらの腫瘍及び再
狭窄抑制効果をin vivoで生ずるのに十分であることを
最初に直接的に示した。p21発現により、分化に関連し
て、p21が接着分子等の遺伝子発現に直接影響を与え得
るメカニズムをNF−κＢが提供することにより、転写活
性が容易になることを見いだした。腫瘍成長及び再狭窄
の抑制並びに分化した表現型の誘発は、遺伝子発現のパ
ターンの変化から生じ、NF−kBにより一部分媒介されて
おり、これは、末期分化及び成長静止に到るp21誘発転
写制御に起因する。末期分化の誘発により抗腫瘍効果を
誘発するこれまでの試みは、細胞毒性薬剤又はホルモン
の使用を含むものであり（25〜28）、この効果を達成す
るのに変化しやすい成功を有するものであった。

図面の簡単な説明図１（Ａ）は、悪性細胞系における細胞周期分析及び
p21発現を示すグラフであり、（Ｂ）は、アデノウイル
ス及び真核生物発現ベクターにより形質導入したRenca
細胞系のウェスタンブロットである。

図２は、ADV p21をRenca腫瘍細胞に導入し、接種後
の腫瘍成長の抑制を示すグラフである。腫瘍の存在（A,
C）と腫瘍の直径（B,D）の評価を行った。

図３は、ADV p21を樹立（established）Renca腫瘍細
胞にin vivo導入した場合に腫瘍成長を抑制する影響を
示すグラフである。腫瘍直径は、ノギスを使用して垂直
方向の大きさを２カ所測定した。

図４は、悪性細胞成長及び分化に与えるp21のin vitr
oの影響を示すグラフである。示した処置を行って５日
後の細胞を位相差顕微鏡により観察した。倍率（20
×）。

図５は、ADV p21又はコントロールベクターで処理し
た樹立腫瘍を有するマウスの生存率を示すグラフであ
る。BALB/cマウス（a,b）又はnu/nu CD−１マウス（c,
d）に、MOI300で、PBS（□、■）、ADV−p21（◇、
◆）、ADV−△E1（△、▲）でin vitroでインキュベー
トしたRenca細胞を注入した。

好ましい態様の詳細な説明本発明は、治療が必要な患者に、（ｉ）p21をコードする遺伝子を含有する発現ベクタ
ー；及び（ii）医薬的に許容できる担体を含有する組成物腫瘍抑制量を投与することを含む、癌
又は再狭窄の治療方法を提供する。

Xiong et al,Nature 366:701（1993）に記載のp21を
コードするcDNAは、本明細書に含まれるものとする。

本発明に有用な適当な発現ベクターとしては、真核生
物又はウイルスベクターがあげられる。有用な真核生物
ベクターとしては、pRcRSV及びpRcCMV又は他のRSV、CMV
又は細胞増強剤及び種々のポリアデニレート配列を有す
るp21の発現を推進するプロモーターがあげられる。ウ
イルスベクターを使用するのが好ましい。

ウイルスベクター系は、不完全遺伝子を含有する哺乳
類に遺伝子をトランスファーするのに非常に効率的とし
て示されてきた。例えば、本明細書に含まれる、Crysta
l Am.J.Med.92（6A）:44S−52S（1992）;Lemarchand et
al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89（14）:6482−6486
（1992）を参照のこと。複製及びトランスホーム能力を
付与したレトロウイルスを使用するのが好ましい。本発
明に有用なp21を発現する適当なウイルスベクターとし
ては、（本明細書に含まれる）Davidson et al.,Nature
Gen.３:219（1993）に記載されているアデノウイルス
ベクター、pAd−Bgl IIと組み合わせたAd5−360が挙げ
られる。アデノウイルスベクターを使用するのが好まし
い。

好ましいアデノウイルスベクターとしては：（本明細
書に含まれる）Davidson et al.,Nature Gen.３:219（1
993）に記載されているADV;又はタイプ7001、又はタイ
プ１又は12を含む他のアデノウイルスタイプ（Ranheim
et al.,J.Virol.67:2159（1993）;Green et al.,Ann.Re
v.Biochem.39:701（1970）に記載されている）があげら
れる。

本明細書に含まれる、Sambrook,Fritsch,and Maniati
s,"Molecular Cloning,A Laboratory Manual"（2nd e
d）:pp.E.55.（Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,N.Y.,1989）に記載されているような従来の組
換え技術を使用して、p21をこれらの発現ベクターに挿
入し、細胞トランスフェクションに使用することができ
る。また、Davidson et al.,1993,Nature Gen.3:219−2
23又はLemarchand et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 89
（14）:6482−6486（1992）に記載されている相同組換
え技術を使用して発現ベクターを調製することができ
る。

本発明の発現ベクターは、さらにプロモーター等の調
節要素及び抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを含有
することができる。

ウイルスベクターがin vivoで摂取されて組み込ま
れ、挿入された作成物（construct）を含むウイルスDNA
を発現することは詳しく確立されている。例えば、本発
明に含まれる、Yoshimura et al.J.Biol.Chem.268
（４）:2300−2303（1993）;Crystal Am.J.Med.92（6
A）:445−525（1992）;Lemarchand et al.Proc.Nat'l A
cad.Sci.USA 89（14）:6482−6486（1992）を参照のこ
と。

別の態様において、発現ベクターの他にも他の送達シ
ステムを使用してp21タンパク質を送達できることもま
た理解される。主に、リポソーム及びDNA接合体の使用
を含むこれらの技術は、上述した発現ベクターにより提
供されるものと同様の送達率を提供することが期待され
ている。すなわち、発現ベクターを介してp21遺伝子を
発現するよりも、ビヒクルにp21の治療量を混合するこ
とも可能なのである。

第二の別の態様において、p21を融合タンパク質とし
て発現することができる。この態様において、p21をコ
ードする遺伝子は、免疫療法剤、遺伝子治療剤（HLA−B
7等）、タンパク質（サイトカイン、好ましくはGM−CS
F、IL−２及び／又はIL−12等）、プロドラック変換酵
素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ及びβ−
グルクロジナーゼ）又はシス−プラチナ等の抗癌剤をコ
ードする遺伝子に融合する。

融合遺伝子は、本明細書に含まれる、Sambrook,et a
l,"Molecular Cloning,A Laboratory Manuarl"（2nd e
d）:Cold Spring Harbor Laboratory Press,特に、17章
に記載されているものから産生されるタンパク質であ
る。

チミジンキナーゼは、本明細書に含まれるAU 8776075
に記載されているようにして得ることができる。β−グ
ルクロニダーゼ及びそれらの融合タンパク質は、本明細
書に含まれる米国特許第5,268,463号及び第4,888,280号
公報に記載されている。シトシンデアミナーゼ及びそれ
らの融合タンパク質は、本明細書に含まれる国際公開第
9428143号公報に記載されている。

また、ウイルスベクターとリポソームとの複合治療
は、非常に見込みがあり、本発明における使用が予想さ
れる。Yoshimura et al.,J.biol.Chem.,268（４）:2300
−2303（1993）は、本明細書に含まれる。

リポソームは、非常に効率的に病気の組織へ活性剤を
送達することが知られている。例えば、医薬的又は他の
生物学的に活性な薬剤を効率的にリポソームに組み込ま
せて細胞に送達する。このように、本発明の作成物を適
当にリボソームに形成して、選択した組織に送達するこ
ともできる。例えば商標名LIPOFECTIN（Life Technolog
ies.Inc.,Bethesda,Md.）で入手できるカチオン性脂質
から製造されるリポソームが好ましい。リポソームベー
スの治療について特に興味深いのは、系又は代謝から通
過する前は、リポソームは比較的安定で、比較的寿命が
長いという事実である。さらに、リポソームは主要な免
疫応答を生じることはない。

したがって、本発明の一観点において、p21をコード
する遺伝子を含有するベクターをリポソームに組み入れ
て、特定の組織へ作成物を送達するのに使用する。リポ
ソームは、作成物が細胞をトランスフェクトし、該細胞
により発現され、最終的にはp21タンパク質を産生する
手助けをするであろう。

本発明の組成物は、治療上効果的な量のp21発現ベク
ター及び医薬上許容できる担体である。ウイルスベクタ
ーを投与するために、適当な担体、賦形剤、及び他の薬
剤を製剤に混合してp21の発現を向上させることができ
る。

多くの適当な製剤を、全ての薬品化学者に公知の処方
集に見いだすことができる:Remington's Pharmaceutica
l Sciences,15th Edition（1975）,MackPublishing Com
pany,Easton,Pa.18042（Chapter 87:Blaug,Seymour）。
これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト、軟膏
剤、ゼリー、ワックス、脂質、無水吸収塩基（anhydrou
s absorption bases）、水中油滴型又は油中水滴型エマ
ルション、エマルションカルボワックス（種々の分子量
のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボ
ワックスを含有する半固体混合物があげられる。

ウイルス粒子が製剤中で失活し、該製剤が生理学的に
相溶性である場合、前述した任意の製剤がウイルスベク
ターによる治療に適当である。

投与されるp21の量は、患者の大きさ及び癌の進行に
対する状態に依存する。従来技術を使用してベクターの
制御要素を変更したり、投与されるウイルスベクター力
価の量を変えることにより、p21発現量を患者の要求に
あわせて調節することができる。一般的には、治療する
細胞当たりおよそ50ウイルスベクターを送達するのが望
ましい。アデノウイルスについては、製剤は一般的に1m
L当たり10¹⁰ウイルス感染ユニットのオーダーで含有す
る。レトロウイルスについては、わずかにことなる力価
を適用できる。本明細書に含まれる、Woo et al.,Enzym
e 38:207−213（1987）を参照のこと。適当な投与量レ
ベルを決定するのに、本明細書に含まれる、Key et a
l.,Hum.Gene Ther.３:641−647（1992）;Liu et al.,So
mat.Cell Molec.Genet.18:89−96（1992）;and Ledley
et al.,Hum.Gene Ther.２:331−358（1991）をさらに参
考にできる。

発現ベクターを投与するために調製される特定の製剤
に依存して、本発明の組成物の投与は種々の方法により
達成することができる。本発明の組成物は発現ベクター
（又は発現ベクターを含有するリポソーム）を、本明細
書に含まれる米国特許第5,328,470号明細書に記載され
ているように、腫瘍に直接投与するのが好ましい。

乳房、腎臓、メラノーマ、前立腺、グリア芽腫、ヘプ
トカルシノーマ（heptocarcinoma）、大腸及び肉腫癌タ
イプを本発明により治療することができる。これらのタ
イプの癌を診断及びモニターすることは当該技術分野に
おいて周知である。

血管形成由来の動脈外傷としては、再狭窄に到り得る
一連の増殖性（proliferative）、血管作動性及び炎症
応答があげられる。この方法をin vivoで刺激する数種
の因子がこれまでに規定されてきたが、応答を制限する
特定の細胞遺伝子産生物の役割はよく理解されていな
い。本発明者らは、p21がバルーンカテーテル外傷への
増殖性応答を限定するように作用することを見いだし
た。血管内皮及び平滑筋細胞成長を、p21 CKIがサイク
リン依存キナーゼ及び細胞周期のG₁相の進行を抑制する
能力により静止させた。再狭窄は、本明細書に含まれ
る、Epstein et al.,JACC 23（６）:1278（1994）and L
andau et al.,Medical Progress 330（14）:981（199
4）に記載されているように診断及びモニターすること
ができる臨床的な状態である。

本発明の組成物を使用して全ての哺乳類、特にヒトを
治療することができる。

本発明の組成物は、免疫療法剤、遺伝子治療剤（HLA
−B7等）、タンパク質（サイトカイン、好ましくはGM−
CSF、IL−２及び／又はIL−12）等、プロドラッグ変換
酵素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ及びβ
−グルクロジナーゼ等）及びシス−プラチナ等の抗癌剤
と組み合わせて投与することができる。また、本発明の
組成物は、上述の免疫療法剤、遺伝子治療剤、タンパク
質、プロドラッグ変換酵素及び抗癌剤をコードする遺伝
子を含有する発現ベクターと組み合わせて投与すること
もできる。

また、該組成物は養子細胞移入治療中に投与すること
もできる。

これまで本発明について一般的に記載してきたが、具
体的なものとして与えたある特定の実施例を参照するこ
とによりさらに本発明を理解できる。特に規定しない限
り、本発明を限定するものではない。

実施例実施例1:in vivoで再狭窄を治療するためのp21サイクリ
ン依存キナーゼの使用本研究において、in vitroにおける内皮及び平滑筋細
胞及びin vivoにおける動脈バルーン外傷のブタモデル
においてp21発現が与える影響を分析した。

細胞培養及びトランスフェクション発達の第一段階にある（primary）ブタ血管内皮及び
平滑筋細胞を、６月齢の国産のヨークシャーブタの大動
脈からとり出し、第２と第５継代（passage）の間のも
のを使用した。内皮及び平滑筋細胞を、10％FBSと混合
した培地199で70％集密まで増殖させた。DMEM及び２％F
CS中で１時間、細胞をADV−p21又はADV−△E1（MOI300/
cell）に感染させ、普通培地を１時間後に添加した。コ
ントロール細胞は感染させないままであり、10％FBSと
混合したM199中で保有した。24時間後、１ウェルあたり
６×10⁴cellで６枚のウェルに細胞を分けた。細胞を
０、２、５、７及び10日で収集し、血球計数器で測定し
た。細胞生存力をトリパンブルーエクスクルージョンに
より評価した。

細胞周期分析上述したように、細胞を、MOI300/cellにおいてADV−
△E1又はADV−p21ベクターに感染させ、収集し、PBSで
２回洗浄し、70％エタノール（EtOH）中（King et al.,
Cell 79,563−571（1994））、４℃において30分間固定
した。その細胞を、PBS1mL中、37℃において30分間、1U
のデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌクレアーゼ
で処理し、0.05mg/mLのヨウ化プロピジウム（PBS中で10
×ストックとして調製したもの）に再懸濁した。細胞
を、FACScanモデル（Becton Dickinson）を用いてフロ
ーサイトメトリーにより分析した。蛍光測定を集積して
DNA含有量の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生
は分析前に減じた。

アデノウイルスベクター組換えアデノウイルスベクター、ADV−p21を、サブゲ
ノム360DNA、E3領域において欠失しているAd5誘導体とp
21発現プラスミド、pAd−p21との間で相同組換えにより
構成した。つまり、p21の発現を制御するラウス肉腫ウ
イルスプロモーター（RSV）を使用して、p21発現ベクタ
ーのHind III−Xba IフラグメントをpAd−Bgl IIのBgl
IIサイトに導入することにより、pAd−p21プラスミド
を調製した（Heichman ＆ Roberts,Cell 79,557−562
（1994））。これらの複製欠損E1A、E1B欠失ウイルスの
構造を、サザンブロッティングにより確認した。組換え
ウイルスは全て、上述したように293 cellで増殖させ、
精製した（Davidson et al,1993,Nature Gen.3:219−22
3）。塩化セシウム精製ウイルスをPBSに対して透析し、
13％ゲリセロール−PBS溶液中で貯蔵用に希釈し、最終
濃度１〜３×10¹²ウイルス粒子/mL（0.8〜５×10¹⁰pfu/
mL）を得た。全てのストックを0.45μｍフィルターで滅
菌し、3T3細胞上、MOI10で、感染により複製成分アデノ
ウイルスの存在について評価した。これらの実験で使用
したストックは、複製成分ウイルスを全く生じなかっ
た。

ブタ動脈外傷麻酔及び挿管後、国産ヨークシャーブタ（12〜15kg）
に腸骨大腿骨動脈の無菌外科曝露（sterile surgical e
xposure）を行い、二重バルーンカテーテル（C.R.Bard,
Inc.）を腸骨大腿骨動脈に挿入した。近位のバルーンを
500mmHg圧までふくらませて、５分間、オンライン圧力
変換器により測定した。外傷から１、７及び21日後に動
物を犠牲にした。

in vivo遺伝子トランスファー上述したように、二重バルーンカテーテルを使用して
ヨークシャーブタの腸骨大腿骨動脈において直接遺伝子
トランスファーを行った（Nabel et al.,1990,Science
249:1285−1288）。各動物において、両腸骨大腿骨動脈
を力価１×10¹⁰pfu/mLにおいて同じベクターで感染さ
せ、各動物に0.7mLを使用した（最終投与量７×10⁹pf
u）（Ohno et al,1994,Science 265:781−784;Chang et
al,1995,Science 267:518−522）。

ADV−p21（ｎ＝28 動脈）又はADV−△E1（ｎ＝28
動脈）ベクターに感染させた血管セグメントを７又は21
日後に切除した。内膜細胞増殖を評価するために、７日
で犠牲にした動物に、死の１時間前に５−ブロモ−2'−
デオキシシトシン（BrdC）（Sigma,St.Louis,MO）を全
投与量25mg/kgで静脈内注入した。各動脈は、記載され
ているようにして同じ方法で処理した（Ohno et al,199
4,Science 265:781−784）。NIHガイドラインに従い、
動物実験はすべて、動物の使用及び保護に関するミシガ
ン大学委員会の認可を得て行った。

RT−PCR分析トリゾール試薬（GIBCO/BRL）を使用し、製造業者の
手順にしたがって全RNAを調製した。つまり、動脈サン
プルをトリゾール試薬中でホモジナイズした。RNAをエ
タノール（EtOH）中で沈殿させて、冷やした75％EtOHで
３回洗浄し、乾燥及びリボヌクレアーゼフリーTE緩衝液
中に再懸濁した。逆転写酵素（RT）が存在する場合とし
ない場合とで、プライマー:5'−GAG ACA CCA CTG GAG G
GT GAC TTC G−3'（センス）;5'−GGG CAA ACA ACA GAT
GGC TGG CAA C−3'（アンチセンス）と共にp21遺伝子
についてPCRを行った（Muller et al,1994,Circ.Res.7
5:1039−1049）。アンチセンスプライマーは、内因性ブ
タp21RNAではなく組換えp21RNAに特異的であった。

細胞増殖及び形態測定細胞増殖の測定を、BrdCに対するモノクローナル抗体
を用いてバルーン外傷及びアデノウイルス感染後７日で
行った。動脈切片を固定、包埋及び切断し、モノクロー
ナル抗−５−ブロモ−2'−デオキシシチジン抗体を使用
して免疫組織化学を行い（Ohno et al.1994,Science 26
5:781−784）、増殖性細胞の核をラベルした。各動脈に
ついて、内膜のラベルした核及びラベルしていない核の
数を、顕微鏡ベースのビデオイメージ分析システム（Im
age One System,Universal Imaging Cororation,Westch
ester,PA）を使用して測定した。増殖指数を、全細胞数
に対するラベルした細胞の比として計算した。

内膜及び内側の横断面積を、イメージ分析システムを
使用して動脈外傷及びアデノウイルス感染の2cm領域に
わたる各動脈からの４つの切片について測定した（Ohno
et al,1994,Science 265:781−784）。各動脈について
培地に対する内膜（I/M）面積比を、４つの切片の平均I
/M面積比として測定した。

免疫組織化学記載された方法（Ohno et al,1994,Science 265:781
−784;Muller et al,1994,Circ.Res.75:1039−1049）を
使用して、BrdC、平滑筋α−アクチン及びp21に対する
抗体について免疫組織化学的研究を行った。以下の発達
の第一段階にある（primary）抗体を使用した：モノク
ローナルマウス抗−BrdC抗体、1:1000希釈（Amersham L
ife Sciences）；モノクローナルマウス抗−平滑筋αア
クチン抗体、1:1500希釈（Boehringer Mannheim Bioche
mical）；及びポリクローナルマウス抗−ヒトp21抗体、
1:1500希釈（Santa Cruz）。動脈片を染色しない、精製
したマウスIgG_2b抗体、1:100希釈（Promega）を使用し
てコントロール実験を行った。スライドをストレプトア
ビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体（Vector L
aboratories）又はベクタステインABC−アルカリホスフ
ァターゼ試薬（Vector Laboratories）のいずれかによ
り展開し、メチルグリーンで対比染色した。

統計学的分析 ADV−p21及びADV−△E1動脈間の内膜BrdCラベル指数
及びI/M面積比を、２つの尾状、不対のｔ−試験により
比較した。0.05レベルにおいて仮説が拒否され得ないと
き、統計学的に有意であった。

結果 p21の発現が血管細胞増殖を抑制し、かつin vitroにお
ける細胞周期静止を誘発する p21が血管細胞成長及び細胞周期分布に与える影響を
検討するために、静止状態のブタ血管内皮及び平滑筋細
胞に、in vitroでアデノウイルスベクター、ADV−p21す
なわちE1欠失を含有するコントロールベクター、ADV−
△E1を感染させ、10％FBS中でインキュベーションによ
り刺激して増殖させた。未感染又はADV−△E1感染細胞
を血清に曝露することにより、内皮及び平滑筋細胞の増
殖が早くなった。対照的に、血管内皮及び平滑筋細胞に
おけるp21の発現は、＞90％で細胞増殖が抑制された；
これらの細胞は、トリパンブルーエクスクルージョンに
より評価されたように、なお生存可能であった（＞95
％）。血管内皮及び平滑筋細胞におけるp21の発現はま
た、ヨウ化プロピジウム染色により評価されたように、
G₀/G₁において細胞を集積させた。これらのデータか
ら、細胞は、p21が引き起こす細胞死よりもp21発現によ
る細胞周期において抑制されることが示唆される。

p21はin vivoにおけるバルーン外傷動脈において誘発さ
れる p21がin vivoで血管細胞成長を調節する能力を検討す
るために、まず、p21発現が外傷動脈において誘発され
るかどうかを測定した。ブタ腸骨大腿骨動脈を、傷つけ
ないか又はバルーン血管形成により傷つけて、p21発現
後、１、７及び21日に外傷セグメントを分析し、p21抗
体により免疫組織化学により評価した。この動脈外傷の
ブタモデルは、３週間で内膜肥厚となった（Ohno et a
l,1994,Science 265:781−784）。外傷の特徴は、動脈
に傷をつけてから最初の７日間は平滑筋細胞増殖が早
く、次の２週間で細胞外基質の生成のため内膜が拡大す
ることである。通常の、傷をつけていないタブ動脈はp2
1を全く発現しなかった。動脈に傷をつけて１日後、p21
タンパク質は内膜に存在していなかった；しかしなが
ら、７日で、内膜平滑筋細胞のおよそ50％にp21タンパ
ク質が存在した。21日で、p21発現は内弾性薄膜の隣
の、内膜の低領域に存在するが、その領域では細胞増殖
は存在しなかった（Ohno et al,1994,science 265:781
−784）。実際、p21発現は一般的に平滑筋細胞増殖と逆
の相関関係を有した。これらの知見から、p21発現は外
傷動脈における血管細胞増殖の静止と関連することが示
唆される。

外傷動脈におけるp21発現は内膜肥厚化の発達を制限す
る p21がin vivoで血管細胞成長に直接与える影響を評価
するために、p21ベクターを、外傷直後のブタ動脈に導
入した。国産ブタの右及び左の腸骨大腿骨動脈をバルー
ン外傷させ、二重バルーンカテーテルを用いて、ADV−p
21又はADV−△E1で感染させた（全投与量、１×10¹⁰pfu
/mL、0.7×10¹⁰pfu）。in vivoにおけるADV−p21の遺伝
子移入を、外傷を与えたブタ動脈において、感染して７
日後にRT−PCR分析により実験した。p21RNAを、感染さ
せた左及び右腸骨大腿骨動脈においてRT−PCRにより検
出したが、同じ動物からの未感染の頸動脈及びADV−△E
1未感染及び感染させた動脈においては検出されなかっ
た。

次に、p21発現がin vivoにおける内膜細胞成長に与え
る影響を、遺伝子移入から７日後にBrdCの内膜細胞への
導入量を測定し、３週間でI/M面積比を測定することに
より２月評価した。遺伝子移入から７日後、ADV−△E1
動脈と比較して、ADV−p21感染動脈において内膜BrdC導
入が35％減少した（5.3±0.9％vs.8.1±0.4％,p＝0.035
％）。これらのBrdCラベル内膜細胞を、平滑筋αアクチ
ンに対するモノクローナル抗体で共染色（costain）し
たが、これは内膜平滑筋細胞増殖の抑制はADV−p21動物
に存在することを示唆している。ADV−△E1動脈と比較
して、ADV−p21感染動脈においてI/M面積比が有意に37
％減少した（0.37±0.06vs.0.59±0.06,p＝0.015）。こ
れらの結果から、バルーン外傷時のADV−p21による動脈
感染により、内膜平滑筋細胞の増殖が抑制され、かつネ
オ内膜（neointima）の発達を有意に制限することが示
唆される。

実施例2:p21サイクリン依存キナーゼ阻害剤を使用してi
n vivoでの腫瘍形成能を抑制するこの研究において、p21発現がin vitro及びin vivoで
のマウスモデルにおける腫瘍成長に与える影響を分析し
た。

細胞周期分析細胞を、MOI200〜300においてAVD−△E1又はADV−P21
ベクターに感染させるか、又はDNA/リポソーム複合体に
よりp21発現ベクターでトランスフェクトした。上述し
たように、細胞を感染、収集し、PBSで２回洗浄し、70
％EtOH中、４℃において30分間固定した。その細胞を、
PBS1mL中、37℃において30分間、1Uのデオキシリボヌク
レアーゼ−フリーリボヌクレアーゼで処理し、最終的
に、0.05mg/mLのヨウ化プロピジウム（PBS中で10×スト
ックとして調製したもの）に再懸濁し、細胞を、FACSca
nモデル（Becton Dickinson）を用いてフローサイトメ
トリーにより分析した。蛍光測定を集積してDNA含有量
の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生は分析前に
減じた。

p21のウェスタンブロット検出３〜５×10⁶cellを示した時間において収集し、1mLの
50mMトリス−HCl（pH6.8）、100mM DTT、２％SDS、0.1
％ブロモフェノールブルー、10％グリセロールで溶解
し、５分間煮沸した。最終的に、サンプルを10,000rpm
において５分間回転させ、上澄みを捕集した。20μＬを
15％SDS−PAGEに装入し、ニトロセルロース膜にブロッ
トした。抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体
及び二次（subsequent）ECL化学発行検出器（Amersha
m）と共に抗タンパク質ウサギポリクローナル抗体（San
ta Cruz）を使用してp21タンパク質を目に見えるように
した。

p21の遺伝子移入 10％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改質イーグル
培地（DMEM）において細胞を維持した。組換えアデノウ
イルスベクター、ADV−p21を、サブ360ゲノムDNA、E3領
域において欠失しているAd5誘導体と、p21発現プラスミ
ド、pAd−p21との間で相同組換えにより構成した。これ
らの組換えアデノウイルスベクターは、欠失したE1A及
びE1B領域に配列を有し、このウイルスに非許容細胞を
複製及びトランスホームする能力を付与する。つまり、
D.Beach博士及びG.Hannon博士から親切にも提供され
た、pRc/CMV−p21由来のNru I及びDra IIIフラグメント
（Xiong et al,Nature 366,701（1993）;Saranoet al,N
ature 366,704（1993））を、Ad5ゲノムの左手側の配列
は有するが、E1A及びE1Bは有しない、pAd−Bgl IIのBgl
IIサイト（Davidson et al,Nature Genet.3,219（199
4））に導入することにより、pAd−p21プラスミドを調
製した。上述したようにしてウイルスを調製した（Ohno
et al,Science 265,781（1994））。これらのウイルス
の構造は、サザンブロッティングにより確認した。組換
えウイルスは全て293細胞で増殖させ、記載されている
ようにして精製した（Davidson et al,Nature Genet.3,
219（1994））。塩化セシウム精製ウイルスをPBSに対し
て透析し、13％グリセロール−PBS溶液中で貯蔵用に希
釈し、最終濃度１〜３×10¹²ウイルス粒子/mL（0.8〜５
×10¹⁰pfu/mL）を得た。ストックは全て0.45μｍフィル
ターで滅菌し、3T3細胞上、MOI10で、感染により複製成
分アデノウイルスの存在について評価した。これらの実
験で使用したストックは、複製成分ウイルスを全く生じ
なかった。

pRc/CMV−p21由来のp21 cDNAをpRC/RSV（Invitroge
n）に導入することにより真核生物発現プラスミド、pRC
/RSV p21を調製し、カルシウムホスフェートトランスフ
ェクションを使用することにより293細胞のトランスフ
ェクトを行った（Perkins et al,提出原稿）。

バイスタンダー（bystander）アッセイ Dr.K.Murazkoにより親切にも提供された、U373ヒトグ
リア芽腫細胞を、ADV−p21で感染させた（MOI200）。１
日後、細胞をトリプシン処理し、計測し、示した数の未
感染のU373細胞と共に混合した。混合した集合それぞれ
について10,000cellを96ウェルディスクに置いた。５日
後、MTTアッセイ（Mosman,J.Immunol.Methods 65,55（1
983））を行って、これらの細胞集団の増殖率を測定し
た。

悪性細胞におけるp21の遺伝子移入及び細胞周期プログ
レッションに与える影響 p21が細胞周期分布に与える影響を、アデノウイルス
ベクター、ADV−p21、又は組換えp21を有しない同様のE
1欠失ウイルス、ADV−△E1で感染させることにより腫瘍
細胞系において検討した。アデノウイルスベクターにお
けるp21の発現は、CMVエンハンサー／プロモーター及び
ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列により調節した。
典型的な悪性腫瘍細胞系、B16BL6メラノーマ内でのp21
の発現により、細胞周期のG₀/G₁相における細胞の集積
となり、これは、G₁/S境界において優勢的に静止するこ
とを示唆している（図1a）。組換えp21発現を、マウス
（Renca）又はヒト（293）腎細胞癌ライン、及びマウス
（B16BL6）メラノーマ細胞系において、ウェスタンブロ
ット分析を使用することにより確認した。アデノウイル
スベクター由来の容易に検出できるタンパク質発現は、
遺伝子を導入後、〜１日で達成された（図1b、レーン
４、５、13、14vs.1〜3,10〜12）。また、ラウス肉腫ウ
イルス（RSV）エンハンサー／プロモーター及びウシ成
長ホルモンポリアデニル化部位により調節した真核生物
発現プラスミドは、293細胞に匹敵する発現を示した
（図1b、レーン７、9vs.6,8）。どちらの場合も、細胞
分裂の抑制と相関関係がある組換えタンパク質及び同じ
調節要素を有する他のベクターの発現は、本明細書にお
いて記載したp21の効果を示さなかった。

p21の分化及び形態学的影響細胞成長に与えるp21の影響をin vitroで検討したと
き、ADV−p21に感染した腫瘍細胞は、細胞質比に対して
核が増加したり、接着及び成長静止が増加したような、
分化した表現型と矛盾のない形態学的変化を示した（図
２、３）。ヒトメラノーマ細胞、UM−316は、核凝縮及
びADV−p21に感染後の電子顕微鏡によるメラノソーム形
成において４倍よりも多く増加した（図２、ｐ≦0.00
5、Wilcoxon rank sum test）。これらの細胞におい
て、メラニン生成における〜５倍の増加は、細胞及びin
vitroでの上澄み画分において、遺伝子を移入後２日内
に観察された（図３）。

２、３の系において、長期の細胞培養後の末期分化の
結果として細胞死が観察されたが、DNA断片化のパター
ン（図4a）、ヨウ化プロピジウム染色又はTdT免疫染色
により決定されるようにアポトーシスの形跡は全くなか
った。また、未感染及び感染した細胞の混合物は、バイ
スタンダー効果がないことがわかったが（図4b）、これ
はレシピエント細胞における遺伝子移入及び発現が必要
とされており、かつp21の効率的な感染が樹立腫瘍の成
長を撲滅するのに必要とされることを示唆している。

in vivoにおける腫瘍細胞成長の抑制 p21がin vivoで悪性細胞に与える影響を評価するため
に、Renca細胞をADV−p21、ADV−△E1コントロールに感
染させ、又はリン酸緩衝食塩水（PBS）と共にインキュ
ベートし、レシピエントマウスに接種した。p21発現
は、２×10⁵cellを接種した全ての動物において腫瘍の
成長を完全に抑制した（図5a、ｂ）。p21の発現が感染
した細胞の免疫原性を変化させ、その結果、免疫機構を
通して作動することが可能であるため、CD−１ nu/nu
免疫不完全マウスにおいて同様の研究は行なわなかっ
た。腫瘍成長の同様の抑制がこれらの動物において観察
され（図5c、ｄ）、これは細胞増殖に直接影響を与える
ことと矛盾がない。

ADV−p21が樹立腫瘍の成長を変化し得るかどうかを検
討するために、Renca腫瘍小結節（〜0.5cm）を、PBS、A
DV−△E1又はADV−p21のいずれかと共に注入した。ヒト
胎盤アルカリホスファターゼレポーターをコードするア
デノウイルスベクターの樹立腫瘍への直接移入により、
毎日５回繰り返す10⁹PFUの注入後、定量的な形態計測に
より確立された細胞の95％まで感染を引き起こした。こ
の処置もまた腫瘍成長を抑制し、注入を繰り返して行う
とき（毎日５回、１週間後に繰り返した）、生存及び予
め検出し得る小結節と共にマウスに肉眼でみえる腫瘍を
検出する能力がないことにより決定した長期間の治療
（＞40日）に到り得る。いずれの場合も、これらの結果
は統計学的に有意であった。

REFERENCES 1. Chang ＆ Herskowitz,Cell 63,999（1990）． 2. Jiang et al,Oncogene 9,3397（1994）． 3. Steinman et al,Oncogene 9,3389（1994）． 4. Zhang et al,Mol.Biol.Cell 4,897（1993）． 5. Halevy et al,Science 267,1018（1995）． 6. Peter ＆ Herskowitz,Cell 79,181（1994）． 7. Hunter ＆ Pines,Cell 79,,573（1994）． 8. Noda et al,Exp.Cell Res,211,90（1994）． 9. Skapek et al,Science 267,1022（1995）． 10. Parkar et al,Science 267,1024（1995）． 11. Xiong et al,Nature 366,701（1993）． 12. Harper et al,Cell 75,805（1993）． 13. Zhang et al,Genes Dev.8,1750（1994）． 14. Gu et al,Nature 366,707（1993）． 15. el−Deiry et al,Cell 75,817（1993）． 16. Li et al,Oncogene 9,2261（1994）． 17. el−Deiry et al,Cancer Res.54,1169（1994）． 18. Di Leonardo et al,Genes Dev.8,2540（1994）． 19. Dulic et al,Cell 76,1013（1994）． 20. Li et al,Nature 371,534（1994）． 23. Symonds et al,Cell 78,703（1994）． 25. Christman et al,Cencer Res.43,763（1983）． 26. Samid et al,Cancer Res.52,1988（1992）． 27. Pierce ＆ Speers,Cencer Res.48,1996（1988）． 28. Leftwich ＆ Hall,Cancer Res.46,3789（1986）． 29. Davidson et al,Nature Gen.3,219（1993）． 30. Ohno et al,Science 265,781（1994）これまで十分に本発明を説明してきたが、本件明細書
に記載した本発明の趣旨又は範囲から離れずに多くの変
更及び修飾が可能であることは当業者にとって明らかで
あろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645）Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者ヤンツィヨンアメリカ合衆国ミシガン州 48105 アンアーバーマッキンタイアードライヴ 1740 (72)発明者ネイベルエリザベスジーアメリカ合衆国ミシガン州 48105 アンアーバーアンドーヴァー 3390 (56)参考文献特表平７−502651（ＪＰ，Ａ) 特表平10−506526（ＪＰ，Ａ) 特表平10−507626（ＪＰ，Ａ) 特表平11−506315（ＪＰ，Ａ) 特表平10−512559（ＪＰ，Ａ) 国際公開95／6486（ＷＯ，Ａ１) 国際公開94／24297（ＷＯ，Ａ１) ＣＵＬＶＥＲ，Ｋ．Ｗ．，ｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙｆｏｒｃａｎｃｅｒ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，10（５），ｐｐ. 174−178（1994) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 48/00 A61K 35/00 - 35/76 A61P 1/00 - 43/00 C12N 15/00 - 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】治療が必要な再狭窄患者をin vivoで処置
するための組成物であって、（ｉ）治療に有効な量の、p21をコードする遺伝子を含
む発現ベクター；および（ii）医療担体を含有する、組成物。
【請求項２】前記発現ベクターが、真核生物ベクターま
たはウイルスベクターである、請求項１に記載の組成
物。
【請求項３】前記ウイルスベクターがアデノウイルスベ
クターである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】前記発現ベクターがリポソームに包まれて
いる、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】前記患者がヒトである、請求項１に記載の
組成物。
【請求項６】1mL当たり10¹⁰の発現ベクターを含有す
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】再狭窄の部位にある前記患者の血管中に、
カテーテルまたは直接注射によって導入される、請求項
１に記載の組成物。
【請求項８】免疫療法剤、遺伝子治療剤、またはサイト
カインもしくはプロドラッグ変換酵素をさらに含有す
る、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】免疫療法剤、遺伝子治療剤、またはサイト
カインもしくはプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝
子を含有する第２の発現ベクターをさらに含有する、請
求項１に記載の組成物。
【請求項１０】前記プロドラッグ変換酵素が、チミジン
キナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβグルクロジナ
ーゼである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】治療が必要な再狭窄患者をin vivoで処
置するための組成物であって、治療に有効な量の、p21
をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含有する、組
成物。
【請求項１２】前記発現ベクターが、真核生物ベクター
またはウイルスベクターである、請求項11に記載の組成
物。
【請求項１３】前記ウイルスベクターがアデノウイルス
ベクターである、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】再狭窄の部位にある前記患者の血管中
に、カテーテルまたは直接注射によって導入される、請
求項11に記載の組成物。
【請求項１５】前記発現ベクターが1mL当たり10¹⁰の濃
度である、請求項11に記載の組成物。