JP2001278795A - ｐ２１をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含有する、癌および再狭窄を治療する組成物 - Google Patents

ｐ２１をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含有する、癌および再狭窄を治療する組成物

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JP2001278795A JP2001053229A JP2001053229A JP2001278795A JP 2001278795 A JP2001278795 A JP 2001278795A JP 2001053229 A JP2001053229 A JP 2001053229A JP 2001053229 A JP2001053229 A JP 2001053229A JP 2001278795 A JP2001278795 A JP 2001278795A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 癌および再狭窄を治療する組成物を提供す
る。 【解決手段】 治療が必要な癌患者をインビボで処置す
るための組成物であって、（ｉ）治療に有効な量の、ｐ
２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；およ
び（ｉｉ）医薬担体を含有し、該発現ベクターが、免疫
療法剤、遺伝子治療剤、サイトカインまたはプロドラッ
グ変換酵素をコードする第二遺伝子をさらに含み；該第
二遺伝子が、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠
にある組成物。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｐ２１をコードす
る遺伝子を含有する発現ベクターと医薬担体とを含有す
る組成物に関し、この組成物を投与することにより、ｉ
ｎ ｖｉｖｏで再狭窄および癌を治療および予防する方
法を提供する。
【０００２】
【従来の技術】細胞増殖と関係のある異常性を有する変
異体イースト菌株の研究により、細胞周期調節タンパク
質の同定は非常に容易になった。イーストにおいて規定
されている遺伝子産生物の中で、Ｆａｒ １（１）の哺
乳類相同体、ｐ２１はサイクリン依存キナーゼの活性を
変化させ、かつ細胞周期プログレッションおよび配列と
関連づけられている（２〜１３）。
【０００３】ＷＡＦ１、ＣＩＰ１またはＳＤＩ１として
も公知のｐ２１は（１１、１２、１４、１５）、ｐ５３
腫瘍サプレッサー遺伝子の下流ターゲットであり、悪性
トランスフォーメーションと間接的な関係があった（１
５〜１８）。ＤＮＡダメージへの応答におけるｐ５３の
誘発により、Ｇ１チェックポイントは静止するが（１６
〜１９）、そのときＤＮＡ修復はＳ相におけるＤＮＡ複
製の前に達成されている。ｐ５３の下流エフェクターと
しての想像される役割と矛盾がなく、ｐ２１は増殖性細
胞核抗原（ＰＣＮＡ）依存ＤＮＡ複製を抑制するがｉｎ
ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ修復は抑制しないことがわ
かっている（２０）。
【０００４】Ｚｈａｎｇらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおい
てｐ２１の研究をしている（Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ（１９９４）８：１７５０）。ｐ２１が
キナーゼ阻害剤として作用するので、これまでは正常細
胞が活性サイクリンキナーゼを実質的に全く含有しない
ことが予想されていた。ｐ２１含有サイクリンキナーゼ
が活性および不活性の両状態において存在することを示
すことにより、Ｚｈａｎｇらは、ｐ２１が正常細胞にお
ける細胞周期プログレッションをコントロールするのに
含まれると説明している。
【０００５】Ｚｈａｎｇらは、種々の腫瘍ウイルス腫瘍
性タンパク質でトランスホームした線維芽細胞におい
て、サイクリンキナーゼは二成分状態で存在し［サイク
リン／ＣＤＫ］；その一方、正常な線維芽細胞において
は、ｐ２１を含有する第四級複合体に複数のサイクリン
キナーゼが存在することを見いだした［サイクリン／Ｃ
ＤＫ／増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）／ｐ２１］。活性
な複合体は、シングルｐ２１分子を含有する。対照的
に、不活性な複合体は複数のｐ２１サブユニットを有し
ている。
【０００６】化学量論におけるｐ２１の変化は、ｉｎ
ｖｉｔｒｏにおける複合体の活性から不活性への変換を
説明するには十分であるが、Ｚｈａｎｇらは「ｐ２１と
サイクリンキナーゼとの結合は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る他の調節機序と絡み合っているに違いない」と確信し
ている。Ｚｈａｎｇらは「ｐ２１の非抑制レベルと結合
することにより、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてこれらのＣＤ
Ｋ改質酵素にどのような影響があったのかは知られてい
ない」と示している。
【０００７】国際公開第９４／０９１３５号公報には、
サイクリン複合体のサブユニット成分の検出を含む、細
胞のトランスフォーメーションを診断するための方法お
よび診断キットが記載されている。特に、該方法はサイ
クリン、ＰＣＮＡ、ＣＤＫｓおよびｐ２１、ｐ１９およ
びｐ１６などの低分子量ポリペプチドの相互作用と関係
する。
【０００８】ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるサイクリンキナ
ーゼ抑制活性が明らかであるにも関わらず、腫瘍形成に
おけるｐ２１の役割およびｉｎ ｖｉｖｏにおける悪性
表現型を逆転するその能力はこれまで規定されていなか
った。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的の一つは癌（腫瘍形成）をｉｎ ｖｉｖｏで治療お
よび予防する方法を提供することである。
【００１０】本発明の第二の目的は、再狭窄をｉｎ ｖ
ｉｖｏで治療および予防する方法を提供することであ
る。
【００１１】本発明の第三の目的は、末期分化（ｔｅｒ
ｍｉｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を誘発
することにより細胞における抗腫瘍効果を誘発する方法
を提供することである。この方法は、腫瘍の免疫認識を
潜在的に容易にし得る細胞表面タンパク質の発現を変化
させるのに、または二次的に細胞成長を阻害し得る因子
の分泌を引き起こすのに有用である。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明により、腫瘍細胞
成長および再狭窄におけるｐ２１サイクリン依存キナー
ゼ阻害剤の役割が決定された。ｐ２１はｐ５３により誘
発され（６，７，１５〜１８）、したがってｐ５３腫瘍
抑制の下流エフェクターとして関係付けられていた（２
３）。本発明者らは、ｐ２１発現はこれらの腫瘍および
再狭窄抑制効果をｉｎ ｖｉｖｏで生ずるのに十分であ
ることを最初に直接的に示した。
【００１３】ｐ２１発現により、分化に関連して、ｐ２
１が接着分子等の遺伝子発現に直接影響を与え得るメカ
ニズムをＮＦ−κＢが提供することにより、転写活性が
容易になることを見いだした。腫瘍成長および再狭窄の
抑制並びに分化した表現型の誘発は、遺伝子発現のパタ
ーンの変化から生じ、ＮＦ−ｋＢにより一部分媒介され
ており、これは、末期分化および成長静止に到るｐ２１
誘発転写制御に起因する。末期分化の誘発により抗腫瘍
効果を誘発するこれまでの試みは、細胞毒性薬剤または
ホルモンの使用を含むものであり（２５〜２８）、この
効果を達成するのに変化しやすい成功を有するものであ
った。
【００１４】本発明は、治療が必要な癌患者をｉｎ ｖ
ｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組成物は、
（ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を
含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担体を含有
し、ここで、該発現ベクターは、免疫療法剤、遺伝子治
療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコー
ドする第二遺伝子をさらに含み；そして、ここで、該第
二遺伝子は、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠
にある。
【００１５】本発明はまた、治療が必要な再狭窄患者を
ｉｎ ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組
成物は、（ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする
遺伝子を含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担
体を含有し、ここで、該発現ベクターは、免疫療法剤、
遺伝子治療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵
素をコードする第二遺伝子をさらに含み；そして、ここ
で、該第二遺伝子は、該ｐ２１をコードする遺伝子と同
じ読み枠にある。
【００１６】本発明はまた、治療が必要な再狭窄患者を
ｉｎ ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組
成物は、治療に有効な量の、プロドラッグ転換酵素をコ
ードする遺伝子に融合させたｐ２１をコードする遺伝子
を含む発現ベクターを含む。
【００１７】好ましくは、前記プロドラッグ変換酵素
は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβ
−グルクロジナーゼである。
【００１８】好ましくは、前記組成物は、医薬上許容で
きる担体をさらに含む。
【００１９】好ましくは、前記発現ベクターは、ウイル
スベクターである。
【００２０】本発明はまた、治療が必要な再狭窄患者を
ｉｎ ｖｉｖｏで処置するための組成物に関し、この組
成物は、治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子
を含有する発現ベクターを含み、ここで、該ｐ２１をコ
ードする遺伝子は、プロドラッグ変換酵素をコードする
遺伝子に融合している。
【００２１】好ましくは、前記プロドラッグ変換酵素
は、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβ
−グルクロジナーゼである。
【００２２】好ましくは、前記組成物は、医薬上許容で
きる担体をさらに含む。
【００２３】好ましくは、前記発現ベクターは、真核生
物ベクターまたはウイルスベクターである。
【００２４】好ましくは、前記ウイルスベクターは、ア
デノウイルスベクターである。
【００２５】
【発明の実施の形態】本発明は、治療が必要な患者に、
（ｉ）ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクタ
ー；および（ｉｉ）医薬的に許容できる担体を含有する
組成物の腫瘍抑制量を投与することを含む、癌または再
狭窄の治療方法を提供する。
【００２６】Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ
３６６：７０１（１９９３）に記載のｐ２１をコードす
るｃＤＮＡは、本明細書に含まれるものとする。
【００２７】本発明に有用な適当な発現ベクターとして
は、真核生物またはウイルスベクターがあげられる。有
用な真核生物ベクターとしては、ｐＲｃＲＳＶおよびｐ
ＲｃＣＭＶまたは他のＲＳＶ、ＣＭＶまたは細胞増強剤
および種々のポリアテニレート配列を有するｐ２１の発
現を推進するプロモーターがあげられる。ウイルスベク
ターを使用するのが好ましい。
【００２８】ウイルスベクター系は、不完全遺伝子を含
有する哺乳類に遺伝子をトランスファーするのに非常に
効率的として示されてきた。例えば、本明細書に含まれ
る、Ｃｒｙｓｔａｌ Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（６
Ａ）：４４Ｓ−５２Ｓ（１９９２）； Ｌｅｍａｒｃｈ
ａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１４）：６４８２−６４８
６（１９９２）を参照のこと。複製およびトランスホー
ム能力を付与したレトロウイルスを使用するのが好まし
い。
【００２９】本発明に有用なｐ２１を発現する適当なウ
イルスベクターとしては、（本明細書に含まれる）Ｄａ
ｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．
３：２１９（１９９３）に記載されているアデノウイル
スベクター、ｐＡｄ−ＢｇｌＩＩと組み合わせたＡｄ５
−３６０が挙げられる。アデノウイルスベクターを使用
するのが好ましい。
【００３０】好ましいアデノウイルスベクターとして
は：（本明細書に含まれる）Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．３：２１９（１９９
３）に記載されているＡＤＶ；またはタイプ７００１、
またはタイプ１または１２を含む他のアデノウイルスタ
イプ（Ｒａｎｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏ
ｌ．６７：２１５９（１９９３）； Ｇｒｅｅｎ ｅｔ
ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：７
０１（１９７０）に記載されている）があげられる。
【００３１】本明細書に含まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，“Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ”（２ｎｄ ｅｄ）：ｐｐ．Ｅ．５
５．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．
Ｙ．，１９８９）に記載されているような従来の組換え
技術を使用して、ｐ２１をこれらの発現ベクターに挿入
し、細胞トランスフェクションに使用することができ
る。また、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．３：２１９−２２３または
Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９（１４）：６
４８２−６４８６（１９９２）に記載されている相同組
換え技術を使用して発現ベクターを調製することができ
る。
【００３２】本発明の発現ベクターは、さらにプロモー
ター等の調節要素および抗生物質耐性遺伝子等の選択マ
ーカーを含有することができる。
【００３３】ウイルスベクターがｉｎ ｖｉｖｏで摂取
されて組み込まれ、挿入された作成物（ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔ）を含むウイルスＤＮＡを発現することは詳しく確
立されている。例えば、本発明に含まれる、Ｙｏｓｈｉ
ｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
８（４）：２３００−２３０３（１９９３）；Ｃｒｙｓ
ｔａｌ Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．９２（６Ａ）：４４５−５
２５（１９９２）；Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄ ｅｔ ａ
ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９（１４）：６４８２−６４８６（１９９２）を参
照のこと。
【００３４】別の態様において、発現ベクターの他にも
他の送達システムを使用してｐ２１タンパク質を送達で
きることもまた理解される。主に、リポソームおよびＤ
ＮＡ接合体の使用を含むこれらの技術は、上述した発現
ベクターにより提供されるものと同様の送達率を提供す
ることが期待されている。すなわち、発現ベクターを介
してｐ２１遺伝子を発現するよりも、ビヒクルにｐ２１
の治療量を混合することも可能なのである。
【００３５】第二の別の態様において、ｐ２１を融合タ
ンパク質として発現することができる。この態様におい
て、ｐ２１をコードする遺伝子は、免疫療法剤、遺伝子
治療剤（ＨＬＡ−Ｂ７等）、タンパク質（サイトカイ
ン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２および／または
ＩＬ−１２等）、プロドラッグ変換酵素（チミジンキナ
ーゼ、シトシンデアミナーゼおよびβ−グルクロジナー
ゼ）またはシス−プラチナ等の抗癌剤をコードする遺伝
子に融合する。
【００３６】融合遺伝子は、本明細書に含まれる、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｒｌ”（２ｎｄ ｅｄ）：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，特
に、１７章に記載されているものから産生されるタンパ
ク質である。
【００３７】チミジンキナーゼは、本明細書に含まれる
ＡＵ ８７７６０７５に記載されているようにして得る
ことができる。β−グルクロニダーゼおよびそれらの融
合タンパク質は、本明細書に含まれる米国特許第５，２
６８，４６３号および第４，８８８，２８０号公報に記
載されている。シトシンデアミナーゼおよびそれらの融
合タンパク質は、本明細書に含まれる国際公開第９４２
８１４３号公報に記載されている。
【００３８】また、ウイルスベクターとリポソームとの
複合治療は、非常に見込みがあり、本発明における使用
が予想される。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８（４）：２３００−
２３０３（１９９３）は、本明細書に含まれる。
【００３９】リポソームは、非常に効率的に病気の組織
へ活性剤を送達することが知られている。例えば、医薬
的または他の生物学的に活性な薬剤を効率的にリポソー
ムに組み込ませて細胞に送達する。このように、本発明
の作成物を適当にリポソームに形成して、選択した組織
に送達することもできる。例えば商標名ＬＩＰＯＦＥＣ
ＴＩＮ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎ
ｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）で入手できるカチオ
ン性脂質から製造されるリポソームが好ましい。リポソ
ームベースの治療について特に興味深いのは、系または
代謝から通過する前は、リポソームは比較的安定で、比
較的寿命が長いという事実である。さらに、リポソーム
は主要な免疫応答を生じることはない。
【００４０】したがって、本発明の一観点において、ｐ
２１をコードする遺伝子を含有するベクターをリポソー
ムに組み入れて、特定の組織へ作成物を送達するのに使
用する。リポソームは、作成物が細胞をトランスフェク
トし、該細胞により発現され、最終的にはｐ２１タンパ
ク質を産生する手助けをするであろう。
【００４１】本発明の組成物は、治療上効果的な量のｐ
２１発現ベクターおよび医薬上許容できる担体である。
ウイルスベクターを投与するために、適当な担体、賦形
剤、および他の薬剤を製剤に混合してｐ２１の発現を向
上させることができる。
【００４２】多くの適当な製剤を、全ての薬品化学者に
公知の処方集に見いだすことができる：Ｒｅｍｉｎｇｔ
ｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎ
ｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５），Ｍａ
ｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔ
ｏｎ，Ｐａ．１８０４２（Ｃｈａｐｔｅｒ ８７：Ｂｌ
ａｕｇ，Ｓｅｙｍｏｕｒ）。これらの製剤としては、例
えば、散剤、ペースト、軟膏剤、ゼリー、ワックス、脂
質、無水吸収塩基（ａｎｈｙｄｒｏｕｓａｂｓｏｒｐｔ
ｉｏｎ ｂａｓｅｓ）、水中油滴型または油中水滴型エ
マルション、エマルションカルボワックス（種々の分子
量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、およびカ
ルボワックスを含有する半固体混合物があげられる。
【００４３】ウイルス粒子が製剤中で失活し、該製剤が
生理学的に相溶性である場合、前述した任意の製剤がウ
イルスベクターによる治療に適当である。
【００４４】投与されるｐ２１の量は、患者の大きさお
よび癌の進行に対する状態に依存する。従来技術を使用
してベクターの制御要素を変更したり、投与されるウイ
ルスベクター力価の量を変えることにより、ｐ２１発現
量を患者の要求にあわせて調節することができる。一般
的には、治療する細胞当たりおよそ５０ウイルスベクタ
ーを送達するのが望ましい。アデノウイルスについて
は、製剤は一般的に１ｍＬ当たり１０10ウイルス感染ユ
ニットのオーダーで含有する。レトロウイルスについて
は、わずかにことなる力価を適用できる。本明細書に含
まれる、Ｗｏｏｅｔ ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ ３８：２
０７−２１３（１９８７）を参照のこと。適当な投与量
レベルを決定するのに、本明細書に含まれる、Ｋａｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４
１−６４７（１９９２）；Ｌｉｕｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍ
ａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１８：８９
−９６（１９９２）； ａｎｄ Ｌｅｄｌｅｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：３３１−３
５８（１９９１）をさらに参考にできる。
【００４５】発現ベクターを投与するために調製される
特定の製剤に依存して、本発明の組成物の投与は種々の
方法により達成することができる。本発明の組成物は発
現ベクター（または発現ベクターを含有するリポソー
ム）を、本明細書に含まれる米国特許第５，３２８，４
７０号明細書に記載されているように、腫瘍に直接投与
するのが好ましい。
【００４６】乳房、腎臓、メラノーマ、前立腺、グリア
芽腫、ヘプトカルシノーマ（ｈｅｐｔｏｃａｒｃｉｎｏ
ｍａ）、大腸および肉腫癌タイプを本発明により治療す
ることができる。これらのタイプの癌を診断およびモニ
ターすることは当該技術分野において周知である。
【００４７】血管形成由来の動脈外傷としては、再狭窄
に到り得る一連の増殖性（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖ
ｅ）、血管作動性および炎症応答があげられる。この方
法をｉｎ ｖｉｖｏで刺激する数種の因子がこれまでに
規定されてきたが、応答を制限する特定の細胞遺伝子産
生物の役割はよく理解されていない。本発明者らは、ｐ
２１がバルーンカテーテル外傷への増殖性応答を限定す
るように作用することを見いだした。血管内皮および平
滑筋細胞成長を、ｐ２１ ＣＫＩがサイクリン依存キナ
ーゼおよび細胞周期のＧ１相の進行を抑制する能力によ
り静止させた。再狭窄は、本明細書に含まれる、Ｅｐｓ
ｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＣ ２３（６）：１２
７８（１９９４）ａｎｄ Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ３３０（１
４）：９８１（１９９４）に記載されているように診断
およびモニターすることができる臨床的な状態である。
【００４８】本発明の組成物を使用して全ての哺乳類、
特にヒトを治療することができる。
【００４９】本発明の組成物は、免疫療法剤、遺伝子治
療剤（ＨＬＡ−Ｂ７等）、タンパク質（サイトカイン、
好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２および／またはＩＬ
−１２）等、プロドラッグ変換酵素（チミジンキナー
ゼ、シトシンデアミナーゼおよびβ−グルクロジナーゼ
等）およびシス−プラチナ等の抗癌剤と組み合わせて投
与することができる。また、本発明の組成物は、上述の
免疫療法剤、遺伝子治療剤、タンパク質、プロドラッグ
変換酵素および抗癌剤をコードする遺伝子を含有する発
現ベクターと組み合わせて投与することもできる。ま
た、該組成物は養子細胞移入治療中に投与することもで
きる。
【００５０】これまで本発明について一般的に記載して
きたが、具体的なものとして与えたある特定の実施例を
参照することによりさらに本発明を理解できる。特に規
定しない限り、本発明を限定するものではない。
【００５１】
【実施例】（実施例１：ｉｎ ｖｉｖｏで再狭窄を治療
するためのｐ２１サイクリン依存キナーゼの使用）本研
究において、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける内皮および平滑
筋細胞およびｉｎｖｉｖｏにおける動脈バルーン外傷の
ブタモデルにおいてｐ２１発現が与える影響を分析し
た。
【００５２】（細胞培養およびトランスフェクション）
発達の第一段階にある（ｐｒｉｍａｒｙ）ブタ血管内皮
および平滑筋細胞を、６月齢の国産のヨークシャーブタ
の大動脈からとり出し、第２と第５継代（ｐａｓｓａｇ
ｅ）の間のものを使用した。内皮および平滑筋細胞を、
１０％ＦＢＳと混合した培地１９９で７０％集密まで増
殖させた。ＤＭＥＭおよび２％ＦＣＳ中で１時間、細胞
をＡＤＶ−ｐ２１またはＡＤＶ−△Ｅ１（ＭＯＩ３００
／ｃｅｌｌ）に感染させ、普通培地を１時間後に添加し
た。コントロール細胞は感染させないままであり、１０
％ＦＢＳと混合したＭ１９９中で保有した。２４時間
後、１ウェルあたり６×１０4ｃｅｌｌで６枚のウェル
に細胞を分けた。細胞を０、２、５、７および１０日で
収集し、血球計数器で測定した。細胞生存力をトリパン
ブルーエクスクルージョンにより評価した。
【００５３】（細胞周期分析）上述したように、細胞
を、ＭＯＩ３００／ｃｅｌｌにおいてＡＤＶ−△Ｅ１ま
たはＡＤＶ−ｐ２１ベクターに感染させ、収集し、ＰＢ
Ｓで２回洗浄し、７０％エタノール（ＥｔＯＨ）中（Ｋ
ｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７９，５６３−５７
１（１９９４））、４℃において３０分間固定した。そ
の細胞を、ＰＢＳ１ｍＬ中、３７℃において３０分間、
１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌクレア
ーゼで処理し、０．０５ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウ
ム（ＰＢＳ中で１０×ストックとして調製したもの）に
再懸濁した。細胞を、ＦＡＣＳｃａｎモデル（Ｂｅｃｔ
ｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフローサイトメト
リーにより分析した。蛍光測定を集積してＤＮＡ含有量
の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生は分析前に
減じた。
【００５４】（アデノウイルスベクター）組換えアデノ
ウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１を、サブゲノム３６
０ ＤＮＡ、Ｅ３領域において欠失しているＡｄ５誘導
体とｐ２１発現プラスミド、ｐＡｄ−ｐ２１との間で相
同組換えにより構成した。つまり、ｐ２１の発現を制御
するラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）を使用
して、ｐ２１発現ベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩ−Ｘｂａ
Ｉ フラグメントをｐＡｄ−Ｂｇｌ ＩＩのＢｇｌＩＩ
サイトに導入することにより、ｐＡｄ−ｐ２１プラスミ
ドを調製した（Ｈｅｉｃｈｍａｎ ＆ Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ， Ｃｅｌｌ ７９，５５７−５６２（１９９
４））。これらの複製欠損Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠失ウイルス
の構造を、サザンブロッティングにより確認した。組換
えウイルスは全て、上述したように２９３ｃｅｌｌで増
殖させ、精製した（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１
９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ．３：２１９−２２
３）。塩化セシウム精製ウイルスをＰＢＳに対して透析
し、１３％グリセロール−ＰＢＳ溶液中で貯蔵用に希釈
し、最終濃度１〜３×１０12ウイルス粒子／ｍＬ（０．
８〜５×１０10ｐｆｕ／ｍＬ）を得た。全てのストック
を０．４５μｍフィルターで滅菌し、３Ｔ３細胞上、Ｍ
ＯＩ１０で、感染により複製成分アデノウイルスの存在
について評価した。これらの実験で使用したストック
は、複製成分ウイルスを全く生じなかった。
【００５５】（ブタ動脈外傷）麻酔および挿管後、国産
ヨークシャーブタ（１２〜１５ｋｇ）に腸骨大腿骨動脈
の無菌外科曝露（ｓｔｅｒｉｌｅ ｓｕｒｇｉｃａｌ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ）を行い、二重バルーンカテーテル
（Ｃ．Ｒ．Ｂａｒｄ，Ｉｎｃ．）を腸骨大腿骨動脈に挿
入した。近位のバルーンを５００ｍｍＨｇ圧までふくら
ませて、５分間、オンライン圧力変換器により測定し
た。外傷から１、７および２１日後に動物を犠牲にし
た。
【００５６】（ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子トランスファー）
上述したように、二重バルーンカテーテルを使用してヨ
ークシャーブタの腸骨大腿骨動脈において直接遺伝子ト
ランスファーを行った（Ｎａｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１
９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１２８５−１２８
８）。各動物において、両腸骨大腿骨動脈を力価１×１
０10ｐｆｕ／ｍＬにおいて同じベクターで感染させ、各
動物に０．７ｍＬを使用した（最終投与量７×１０9ｐ
ｆｕ）（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２６５：７８１−７８４；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：５１８−５２
２）。
【００５７】ＡＤＶ−ｐ２１（ｎ＝２８ 動脈）または
ＡＤＶ−△Ｅ１（ｎ＝２８ 動脈）ベクターに感染させ
た血管セグメントを７または２１日後に切除した。内膜
細胞増殖を評価するために、７日で犠牲にした動物に、
死の１時間前に５−ブロモ−２’−デオキシシトシン
（ＢｒｄＣ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
を全投与量２５ｍｇ／ｋｇで静脈内注入した。各動脈
は、記載されているようにして同じ方法で処理した（Ｏ
ｈｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６
５：７８１−７８４）。ＮＩＨガイドラインに従い、動
物実験はすべて、動物の使用および保護に関するミシガ
ン大学委員会の認可を得て行った。
【００５８】（ＲＴ−ＰＣＲ分析）トリゾール試薬（Ｇ
ＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用し、製造業者の手順にしたが
って全ＲＮＡを調製した。つまり、動脈サンプルをトリ
ゾール試薬中でホモジナイズした。ＲＮＡをエタノール
（ＥｔＯＨ）中で沈殿させて、冷やした７５％ＥｔＯＨ
で３回洗浄し、乾燥およびリボヌクレアーゼフリーＴＥ
緩衝液中に再懸濁した。逆転写酵素（ＲＴ）が存在する
場合としない場合とで、プライマー：５’−ＧＡＧ Ａ
ＣＡ ＣＣＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＧＴ ＧＡＣ ＴＴ
Ｃ Ｇ−３’（センス）；５’−ＧＧＧ ＣＡＡ ＡＣ
Ａ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＡＡ Ｃ−
３’（アンチセンス）と共にｐ２１遺伝子についてＰＣ
Ｒを行った（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｃ
ｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：１０３９−１０４９）。アンチ
センスプライマーは、内因性ブタｐ２１ＲＮＡではなく
組換えｐ２１ＲＮＡに特異的であった。
【００５９】（細胞増殖および形態測定）細胞増殖の測
定を、ＢｒｄＣに対するモノクローナル抗体を用いてバ
ルーン外傷およびアデノウイルス感染後７日で行った。
動脈切片を固定、包埋および切断し、モノクローナル抗
−５−ブロモ−２’−デオキシシチジン抗体を使用して
免疫組織化学を行い（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９
４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−７８４）、増殖
性細胞の核をラベルした。各動脈について、内膜のラベ
ルした核およびラベルしていない核の数を、顕微鏡ベー
スのビデオイメージ分析システム（Ｉｍａｇｅ Ｏｎｅ
Ｓｙｓｔｅｍ，Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ
Ｃｏｒｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ，Ｐ
Ａ）を使用して測定した。増殖指数を、全細胞数に対す
るラベルした細胞の比として計算した。
【００６０】内膜および内側の横断面積を、イメージ分
析システムを使用して動脈外傷およびアデノウイルス感
染の２ｃｍ領域にわたる各動脈からの４つの切片につい
て測定した（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２６５： ７８１−７８４）。各動脈につい
て培地に対する内膜（Ｉ／Ｍ）面積比を、４つの切片の
平均Ｉ／Ｍ面積比として測定した。
【００６１】（免疫組織化学）記載された方法（Ｏｈｎ
ｏ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：
７８１−７８４； Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，１９９
４，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：１０３９−１０４９）を
使用して、ＢｒｄＣ、平滑筋α−アクチンおよびｐ２１
に対する抗体について免疫組織化学的研究を行った。以
下の発達の第一段階にある（ｐｒｉｍａｒｙ）抗体を使
用した：モノクローナルマウス抗−ＢｒｄＣ抗体、１：
１０００希釈（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）；モノクローナルマウス抗−平滑筋αアクチ
ン抗体、１：１５００希釈（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）；およびポ
リクローナルマウス抗−ヒトｐ２１抗体、１：１５００
希釈（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）。動脈片を染色しない、
精製したマウスＩｇＧ２ｂ抗体、１：１００希釈（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を使用してコントロール実験を行った。ス
ライドをストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダ
ーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ）またはベクタステインＡＢＣ−アルカリホスファタ
ーゼ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
のいずれかにより展開し、メチルグリーンで対比染色し
た。
【００６２】（統計学的分析）ＡＤＶ−ｐ２１およびＡ
ＤＶ−△Ｅ１動脈間の内膜ＢｒｄＣラベル指数およびＩ
／Ｍ面積比を、２つの尾状、不対のｔ−試験により比較
した。０．０５レベルにおいて仮説が拒否され得ないと
き、統計学的に有意であった。
【００６３】（結果） （ｐ２１の発現が血管細胞増殖を抑制し、かつｉｎ ｖ
ｉｔｒｏにおける細胞周期静止を誘発する）ｐ２１が血
管細胞成長および細胞周期分布に与える影響を検討する
ために、静止状態のブタ血管内皮および平滑筋細胞に、
ｉｎ ｖｉｔｒｏでアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−
ｐ２１すなわちＥ１欠失を含有するコントロールベクタ
ー、ＡＤＶ−△Ｅ１を感染させ、１０％ＦＢＳ中でイン
キュベーションにより刺激して増殖させた。未感染また
はＡＤＶ−△Ｅ１感染細胞を血清に曝露することによ
り、内皮および平滑筋細胞の増殖が早くなった。対照的
に、血管内皮および平滑筋細胞におけるｐ２１の発現
は、＞９０％で細胞増殖が抑制された；これらの細胞
は、トリパンブルーエクスクルージョンにより評価され
たように、なお生存可能であった（＞９５％）。血管内
皮および平滑筋細胞におけるｐ２１の発現はまた、ヨウ
化プロピジウム染色により評価されたように、Ｇ０／Ｇ
１において細胞を集積させた。これらのデータから、細
胞は、ｐ２１が引き起こす細胞死よりもｐ２１発現によ
る細胞周期において抑制されることが示唆される。
【００６４】（ｐ２１はｉｎ ｖｉｖｏにおけるバルー
ン外傷動脈において誘発される）ｐ２１がｉｎ ｖｉｖ
ｏで血管細胞成長を調節する能力を検討するために、ま
ず、ｐ２１発現が外傷動脈において誘発されるかどうか
を測定した。ブタ腸骨大腿骨動脈を、傷つけないかまた
はバルーン血管形成により傷つけて、ｐ２１発現後、
１、７および２１日に外傷セグメントを分析し、ｐ２１
抗体により免疫組織化学により評価した。この動脈外傷
のブタモデルは、３週間で内膜肥厚となった（Ｏｈｎｏ
ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７
８１−７８４）。外傷の特徴は、動脈に傷をつけてから
最初の７日間は平滑筋細胞増殖が早く、次の２週間で細
胞外基質の生成のため内膜が拡大することである。通常
の、傷をつけていないブタ動脈はｐ２１を全く発現しな
かった。動脈に傷をつけて１日後、ｐ２１タンパク質は
内膜に存在していなかった；しかしながら、７日で、内
膜平滑筋細胞のおよそ５０％にｐ２１タンパク質が存在
した。２１日で、ｐ２１発現は内弾性薄膜の隣の、内膜
の低領域に存在するが、その領域では細胞増殖は存在し
なかった（Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２６５：７８１−７８４）。実際、ｐ２１発現
は一般的に平滑筋細胞増殖と逆の相関関係を有した。こ
れらの知見から、ｐ２１発現は外傷動脈における血管細
胞増殖の静止と関連することが示唆される。
【００６５】（外傷動脈におけるｐ２１発現は内膜肥厚
化の発達を制限する）ｐ２１がｉｎ ｖｉｖｏで血管細
胞成長に直接与える影響を評価するために、ｐ２１ベク
ターを、外傷直後のブタ動脈に導入した。国産ブタの右
および左の腸骨大腿骨動脈をバルーン外傷させ、二重バ
ルーンカテーテルを用いて、ＡＤＶ−ｐ２１またはＡＤ
Ｖ−△Ｅ１で感染させた（全投与量、１×１０10ｐｆｕ
／ｍＬ、０．７×１０10ｐｆｕ）。ｉｎ ｖｉｖｏにお
けるＡＤＶ−ｐ２１の遺伝子移入を、外傷を与えたブタ
動脈において、感染して７日後にＲＴ−ＰＣＲ分析によ
り実験した。ｐ２１ＲＮＡを、感染させた左および右腸
骨大腿骨動脈においてＲＴ−ＰＣＲにより検出したが、
同じ動物からの未感染の頸動脈およびＡＤＶ−△Ｅ１未
感染および感染させた動脈においては検出されなかっ
た。
【００６６】次に、ｐ２１発現がｉｎ ｖｉｖｏにおけ
る内膜細胞成長に与える影響を、遺伝子移入から７日後
にＢｒｄＣの内膜細胞への導入量を測定し、３週間でＩ
／Ｍ面積比を測定することにより２月評価した。遺伝子
移入から７日後、ＡＤＶ−△Ｅ１動脈と比較して、ＡＤ
Ｖ−ｐ２１感染動脈において内膜ＢｒｄＣ導入が３５％
減少した（５．３±０．９％ ｖｓ．８．１±０．４
％，ｐ＝０．０３５）。これらのＢｒｄＣラベル内膜細
胞を、平滑筋αアクチンに対するモノクローナル抗体で
共染色（ｃｏｓｔａｉｎ）したが、これは内膜平滑筋細
胞増殖の抑制はＡＤＶ−ｐ２１動物に存在することを示
唆している。ＡＤＶ−△Ｅ１動脈と比較して、ＡＤＶ−
ｐ２１感染動脈においてＩ／Ｍ面積比が有意に３７％減
少した（０．３７±０．０６ ｖｓ．０．５９±０．０
６，ｐ＝０．０１５）。これらの結果から、バルーン外
傷時のＡＤＶ−ｐ２１による動脈感染により、内膜平滑
筋細胞の増殖が抑制され、かつネオ内膜（ｎｅｏｉｎｔ
ｉｍａ）の発達を有意に制限することが示唆される。
【００６７】（実施例２：ｐ２１サイクリン依存キナー
ゼ阻害剤を使用してｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍形成能を抑
制する）この研究において、ｐ２１発現がｉｎ ｖｉｔ
ｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのマウスモデルにおける腫
瘍成長に与える影響を分析した。
【００６８】（細胞周期分析）細胞を、ＭＯＩ２００〜
３００においてＡＤＶ−△Ｅ１またはＡＤＶ−ｐ２１ベ
クターに感染させるか、またはＤＮＡ／リポソーム複合
体によりｐ２１発現ベクターでトランスフェクトした。
上述したように、細胞を感染、収集し、ＰＢＳで２回洗
浄し、７０％ＥｔＯＨ中、４℃において３０分間固定し
た。その細胞を、ＰＢＳ１ｍＬ中、３７℃において３０
分間、１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌ
クレアーゼで処理し、最終的に、０．０５ｍｇ／ｍＬの
ヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中で１０×ストックとして
調製したもの）に再懸濁し、細胞を、ＦＡＣＳｃａｎモ
デル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてフ
ローサイトメトリーにより分析した。蛍光測定を集積し
てＤＮＡ含有量の分布曲線を作成した。細片のため蛍光
発生は分析前に減じた。
【００６９】（ｐ２１のウェスタンブロット検出）３〜
５×１０6ｃｅｌｌを示した時間において収集し、１ｍ
Ｌの５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍ
Ｍ ＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブ
ルー、１０％グリセロールで溶解し、５分間煮沸した。
最終的に、サンプルを１０，０００ｒｐｍにおいて５分
間回転させ、上澄みを捕集した。２０μＬを１５％ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥに装入し、ニトロセルロース膜にブロット
した。抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体お
よび二次（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ）ＥＣＬ化学発光検出
器（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に抗タンパク質ウサギポリ
クローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用してｐ
２１タンパク質を目に見えるようにした。
【００７０】（ｐ２１の遺伝子移入）１０％ウシ胎児血
清を含有するダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）
において細胞を維持した。組換えアデノウイルスベクタ
ー、ＡＤＶ−ｐ２１を、サブ３６０ゲノムＤＮＡ、Ｅ３
領域において欠失しているＡｄ５誘導体と、ｐ２１発現
プラスミド、ｐＡｄ−ｐ２１との間で相同組換えにより
構成した。これらの組換えアデノウイルスベクターは、
欠失したＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域に配列を有し、このウ
イルスに非許容細胞を複製およびトランスホームする能
力を付与する。つまり、Ｄ．Ｂｅａｃｈ博士およびＧ．
Ｈａｎｎｏｎ博士から親切にも提供された、ｐＲｃ／Ｃ
ＭＶ−ｐ２１由来のＮｒｕ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩ
フラグメント（Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ
３６６，７０１（１９９３）；Ｓｅｒａｎｏ ｅｔ
ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７０４（１９９３））
を、Ａｄ５ゲノムの左手側の配列は有するが、Ｅ１Ａお
よびＥ１Ｂは有しない、ｐＡｄ−Ｂｇｌ ＩＩのＢｇｌ
ＩＩサイト（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ
ｕｒｅＧｅｎｅｔ．３，２１９（１９９４））に導入す
ることにより、ｐＡｄ−ｐ２１プラスミドを調製した。
上述したようにしてウイルスを調製した（Ｏｈｎｏ ｅ
ｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５，７８１（１９９
４））。これらのウイルスの構造は、サザンブロッティ
ングにより確認した。組換えウイルスは全て２９３細胞
で増殖させ、記載されているようにして精製した（Ｄａ
ｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅ
ｔ．３，２１９（１９９４））。塩化セシウム精製ウイ
ルスをＰＢＳに対して透析し、１３％グリセロール−Ｐ
ＢＳ溶液中で貯蔵用に希釈し、最終濃度１〜３×１０12
ウイルス粒子／ｍＬ（０．８〜５×１０10ｐｆｕ／ｍ
Ｌ）を得た。ストックは全て０．４５μｍフィルターで
滅菌し、３Ｔ３細胞上、ＭＯＩ１０で、感染により複製
成分アデノウイルスの存在について評価した。これらの
実験で使用したストックは、複製成分ウイルスを全く生
じなかった。
【００７１】ｐＲｃ／ＣＭＶ−ｐ２１由来のｐ２１ ｃ
ＤＮＡをｐＲＣ／ＲＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導
入することにより真核生物発現プラスミド、ｐＲＣ／Ｒ
ＳＶｐ２１を調製し、カルシウムホスフェートトランス
フェクションを使用することにより２９３細胞のトラン
スフェクトを行った（Ｐｅｒｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ，提
出原稿）。
【００７２】（バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）
アッセイ）Ｄｒ．Ｋ．Ｍｕｒａｚｋｏにより親切にも提
供された、Ｕ３７３ヒトグリア芽腫細胞を、ＡＤＶ−ｐ
２１で感染させた（ＭＯＩ２００）。１日後、細胞をト
リプシン処理し、計測し、示した数の未感染のＵ３７３
細胞と共に混合した。混合した集合それぞれについて１
０，０００ｃｅｌｌを９６ウェルディスクに置いた。５
日後、ＭＴＴアッセイ（Ｍｏｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５，５５（１９８３））を行
って、これらの細胞集団の増殖率を測定した。
【００７３】（悪性細胞におけるｐ２１の遺伝子移入お
よび細胞周期プログレッションに与える影響）ｐ２１が
細胞周期分布に与える影響を、アデノウイルスベクタ
ー、ＡＤＶ−ｐ２１、または組換えｐ２１を有しない同
様のＥ１欠失ウイルス、ＡＤＶ−△Ｅ１で感染させるこ
とにより腫瘍細胞系において検討した。アデノウイルス
ベクターにおけるｐ２１の発現は、ＣＭＶエンハンサー
／プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化
配列により調節した。典型的な悪性腫瘍細胞系、Ｂ１６
ＢＬ６メラノーマ内でのｐ２１の発現により、細胞周期
のＧ０／Ｇ１相における細胞の集積となり、これは、Ｇ
１／Ｓ境界において優勢的に静止することを示唆してい
る（図１Ａ）。組換えｐ２１発現を、マウス（Ｒｅｎｃ
ａ）またはヒト（２９３）腎細胞癌ライン、およびマウ
ス（Ｂ１６ＢＬ６）メラノーマ細胞系において、ウェス
タンブロット分析を使用することにより確認した。アデ
ノウイルスベクター由来の容易に検出できるタンパク質
発現は、遺伝子を導入後、〜１日で達成された（図１
Ｂ、レーン４、５、１３、１４ｖｓ．１〜３、１０〜１
２）。また、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサ
ー／プロモーターおよびウシ成長ホルモンポリアデニル
化部位により調節した真核生物発現プラスミドは、２９
３細胞に匹敵する発現を示した（図１Ｂ、レーン７、９
ｖｓ．６、８）。どちらの場合も、細胞分裂の抑制と
相関関係がある組換えタンパク質および同じ調節要素を
有する他のベクターの発現は、本明細書において記載し
たｐ２１の効果を示さなかった。
【００７４】（ｐ２１の分化および形態学的影響）細胞
成長に与えるｐ２１の影響をｉｎ ｖｉｔｒｏで検討し
たとき、ＡＤＶ−ｐ２１に感染した腫瘍細胞は、細胞質
比に対して核が増加したり、接着および成長静止が増加
したような、分化した表現型と矛盾のない形態学的変化
を示した（図２、図３Ａおよび図３Ｂ）。ヒトメラノー
マ細胞、ＵＭ−３１６は、核凝縮およびＡＤＶ−ｐ２１
に感染後の電子顕微鏡によるメラノソーム形成において
４倍よりも多く増加した（図２、ｐ≦０．００５、Ｗｉ
ｌｃｏｘｏｎ ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）。これら
の細胞において、メラニン生成における〜５倍の増加
は、細胞およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの上澄み画分におい
て、遺伝子を移入後２日内に観察された（図３Ａおよび
図３Ｂ）。
【００７５】２、３の系において、長期の細胞培養後の
末期分化の結果として細胞死が観察されたが、ＤＮＡ断
片化のパターン（図４）、ヨウ化プロピジウム染色また
はＴｄＴ免疫染色により決定されるようにアポトーシス
の形跡は全くなかった。また、未感染および感染した細
胞の混合物は、バイスタンダー効果がないことがわかっ
たが（図４）、これはレシピエント細胞における遺伝子
移入および発現が必要とされており、かつｐ２１の効率
的な感染が樹立腫瘍の成長を撲滅するのに必要とされる
ことを示唆している。
【００７６】（ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞成長の
抑制）ｐ２１がｉｎ ｖｉｖｏで悪性細胞に与える影響
を評価するために、Ｒｅｎｃａ細胞をＡＤＶ−ｐ２１、
ＡＤＶ−△Ｅ１コントロールに感染させ、またはリン酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共にインキュベートし、レシピ
エントマウスに接種した。ｐ２１発現は、２×１０5ｃ
ｅｌｌを接種した全ての動物において腫瘍の成長を完全
に抑制した（図５のＡ、Ｂ）。ｐ２１の発現が感染した
細胞の免疫原性を変化させ、その結果、免疫機構を通し
て作動することが可能であるため、ＣＤ−１ ｎｕ／ｎ
ｕ免疫不完全マウスにおいて同様の研究は行わなかっ
た。腫瘍成長の同様の抑制がこれらの動物において観察
され（図５のＣ、Ｄ）、これは細胞増殖に直接影響を与
えることと矛盾がない。
【００７７】ＡＤＶ−ｐ２１が樹立腫瘍の成長を変化し
得るかどうかを検討するために、Ｒｅｎｃａ腫瘍小結節
（〜０．５ｃｍ）を、ＰＢＳ、ＡＤＶ−△Ｅ１またはＡ
ＤＶ−ｐ２１のいずれかと共に注入した。ヒト胎盤アル
カリホスファターゼレポーターをコードするアデノウイ
ルスベクターの樹立腫瘍への直接移入により、毎日５回
繰り返す１０9ＰＦＵの注入後、定量的な形態計測によ
り確立された細胞の９５％まで感染を引き起した。この
処置もまた腫瘍成長を抑制し、注入を繰り返して行うと
き（毎日５回、１週間後に繰り返した）、生存および予
め検出し得る小結節と共にマウスに肉眼でみえる腫瘍を
検出する能力がないことにより決定した長期間の治療
（＞４０日）に到り得る。いずれの場合も、これらの結
果は統計学的に有意であった。
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Ｒｅｓ．４３，７６３（１９８３）． ２６．Ｓａｍｉｄ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．５２，１９８８ （１９９２）． ２７．Ｐｉｅｒｃｅ ＆ Ｓｐｅｅｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４８，１９９６ （１９８８）． ２８．Ｌｅｆｔｗｉｃｈ ＆ Ｈａｌｌ，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．４６，３７８９ （１９８６）． ２９． Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎ．３，２１９（１９９３）． ３０．Ｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
５，７８１ （１９９４） これまで十分に本発明を説明してきたが、本件明細書に
記載した本発明の趣旨または範囲から離れずに多くの変
更および修飾が可能であることは当業者にとって明らか
であろう。
【００７９】
【発明の効果】ｐ２１遺伝子は、細胞周期プログレッシ
ョンに影響を与えるサイクリン依存キナーゼ阻害剤をコ
ードするが、腫瘍成長を変えることにおけるこの遺伝子
産生物の役割はこれまで確立されていなかった。本発明
により、ｉｎ ｖｉｖｏにおける悪性細胞の成長は、ｐ
２１の発現により抑制されることが見いだされた。ｐ２
１の発現により、Ｇ０／Ｇ１における細胞の蓄積は、形
態変化およびおよび細胞分化となる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】悪性細胞系における細胞周期分析およびｐ２
１発現を示すグラフである。
【図１Ｂ】アデノウイルスおよび真核生物発現ベクター
により形質導入したＲｅｎｃａ細胞系のウェスタンブロ
ットを示す電気泳動ゲルの写真である。
【図２】ＡＤＶ ｐ２１をＲｅｎｃａ腫瘍細胞に導入
し、接種後の腫瘍成長の抑制を示すグラフである。腫瘍
の存在（Ａ、Ｃ）と腫瘍の直径（Ｂ、Ｄ）の評価を行っ
た。
【図３Ａ】ＡＤＶ ｐ２１を樹立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｅｄ）Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞にｉｎｖｉｖｏ導入した場合
に腫瘍成長を抑制する影響を示すグラフである。腫瘍直
径は、ノギスを使用して垂直方向の大きさを２カ所測定
した。
【図３Ｂ】ＡＤＶ ｐ２１を樹立（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ
ｅｄ）Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞にｉｎｖｉｖｏ導入した場合
に腫瘍成長を抑制する影響を示すグラフである。腫瘍直
径は、ノギスを使用して垂直方向の大きさを２カ所測定
した。
【図４】悪性細胞成長および分化に与えるｐ２１のｉｎ
ｖｉｔｒｏの影響を示す写真である。示した処置を行
って５日後の細胞を位相差顕微鏡により観察した。倍率
（２０×）。
【図５】ＡＤＶ ｐ２１またはコントロールベクターで
処理した樹立腫瘍を有するマウスの生存率を示すグラフ
である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ａ、Ｂ）またはｎｕ／ｎ
ｕ ＣＤ−１マウス（Ｃ、Ｄ）に、ＭＯＩ３００で、Ｐ
ＢＳ（白四角、黒四角）、ＡＤＶ−ｐ２１（白菱形、黒
菱形）、ＡＤＶ−△Ｅ１（白三角、黒三角）でｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでインキュベートしたＲｅｎｃａ細胞を注入し
た。
【配列表】SEQUENCE LISTING <110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MICHIGAN. <120> A pharmaceutical composition for treating a
cancer or restenosis,comprising an expression vect
or containing a gene encoding p21. <130> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <300> <400> 1 gagacaccac tggagggtga cttcg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 2 gggcaaacaa cagatggctg gcaac 25
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 597015922 Ｗｏｌｖｅｒｉｎｅ Ｔｏｗｅｒ， Ｒｏ ｏｍ 2071， 3003 Ｓ． Ｓｔａｔｅ Ｓｔｒｅｅｔ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ 48109−1280， Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 ゲアリー ジェイ ネイベル アメリカ合衆国 ミシガン州 48105 ア ンアーバー アンドーヴァー 3390 (72)発明者 ツィ ヨン ヤン アメリカ合衆国 ミシガン州 48105 ア ンアーバー マッキンタイアー ドライヴ 1740 (72)発明者 エリザベス ジー ネイベル アメリカ合衆国 ミシガン州 48105 ア ンアーバー アンドーヴァー 3390

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 治療が必要な癌患者をｉｎ ｖｉｖｏで
    処置するための組成物であって、 （ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を
    含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担体を含有
    し、ここで、該発現ベクターが、免疫療法剤、遺伝子治
    療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコー
    ドする第二遺伝子をさらに含み；そして、ここで、該第
    二遺伝子が、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠
    にある、組成物。
  2. 【請求項２】 治療が必要な再狭窄患者をｉｎ ｖｉｖ
    ｏで処置するための組成物であって、 （ｉ）治療に有効な量の、ｐ２１をコードする遺伝子を
    含有する発現ベクター；および（ｉｉ）医薬担体を含有
    し、ここで、該発現ベクターが、免疫療法剤、遺伝子治
    療剤、サイトカインまたはプロドラッグ変換酵素をコー
    ドする第二遺伝子をさらに含み；そして、ここで、該第
    二遺伝子が、該ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠
    にある、組成物。
  3. 【請求項３】 治療が必要な再狭窄患者をｉｎ ｖｉｖ
    ｏで処置するための組成物であって、治療に有効な量
    の、プロドラッグ転換酵素をコードする遺伝子に融合さ
    せたｐ２１をコードする遺伝子を含む発現ベクターを含
    む、組成物。
  4. 【請求項４】 前記プロドラッグ変換酵素が、チミジン
    キナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβ−グルクロジ
    ナーゼである、請求項３に記載の組成物。
  5. 【請求項５】 医薬上許容できる担体をさらに含む、請
    求項４に記載の組成物。
  6. 【請求項６】 前記発現ベクターがウイルスベクターで
    ある、請求項４に記載の組成物。
  7. 【請求項７】 治療が必要な再狭窄患者をｉｎ ｖｉｖ
    ｏで処置するための組成物であって、治療に有効な量
    の、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター
    を含み、ここで、該ｐ２１をコードする遺伝子が、プロ
    ドラッグ変換酵素をコードする遺伝子に融合している、
    組成物。
  8. 【請求項８】 前記プロドラッグ変換酵素が、チミジン
    キナーゼ、シトシンデアミナーゼまたはβ−グルクロジ
    ナーゼである、請求項７に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 医薬上許容できる担体をさらに含む、請
    求項７に記載の組成物。
  10. 【請求項１０】 前記発現ベクターが、真核生物ベクタ
    ーまたはウイルスベクターである、請求項８に記載の組
    成物。
  11. 【請求項１１】 前記ウイルスベクターが、アデノウイ
    ルスベクターである、請求項１０に記載の組成物。
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