JPH11513379A

JPH11513379A - ｐ２１により癌及び再狭窄を治療する方法

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Publication number: JPH11513379A
Application number: JP9513519A
Authority: JP
Inventors: ゲアリージェイネイベル; ツィヨンヤン; エリザベスジーネイベル
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティーオブミシガン
Priority date: 1995-09-26
Filing date: 1996-09-26
Publication date: 1999-11-16
Anticipated expiration: 2016-09-26
Also published as: EP0859639A1; WO1997011720A1; CA2232985C; US6218372B1; JP3274143B2; CA2232985A1; JP2001278795A; US5863904A; EP0859639A4; US6057300A; JP2007314582A

Abstract

(57)【要約】ｐ２１遺伝子は、細胞周期プログレッションに影響を与えるサイクリン依存キナーゼ阻害剤をコードするが、腫瘍成長を変えることにおけるこの遺伝子産生物の役割はこれまで確立されていなかった。本発明により、in vivoにおける悪性細胞の成長は、ｐ２１の発現により抑制されることが見いだされた。ｐ２１の発現により、Ｇ₀／Ｇ₁における細胞の蓄積は、形態変化及び及び細胞分化となる。

Description

【発明の詳細な説明】ｐ２１により癌及び再狭窄を治療する方法発明の背景発明の属する技術分野本発明は、ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクターと医薬担体とを含有する組成物を投与することにより、in vivoで再狭窄及び癌を治療及び予防する方法を提供する。背景の説明細胞増殖と関係のある異常性を有する変異体イースト菌株の研究により、細胞周期調節タンパク質の同定は非常に容易になった。イーストにおいて規定されている遺伝子産生物の中で、Far 1(1)の哺乳類相同体、ｐ２１はサイクリン依存キナーゼの活性を変化させ、かつ細胞周期プログレッション及び配列と関連づけられている（２〜１３）。ＷＡＦ１、ＣＩＰ１又はＳＤＩ１としても公知のｐ２１は（１１、１２、１４、１５）、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子の下流ターゲットであり、悪性トランスフォーメーションと間接的な関係があった(１５〜１８) 。ＤＮＡダメージへの応答におけるｐ５３の誘発により、Ｇ１チェックポイントは静止するが（１６〜１９）、そのときＤＮＡ修復はＳ相におけるＤＮＡ複製の前に達成されている。ｐ５３の下流エフェクターとしての想像される役割と矛盾がなく、ｐ２１は増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）依存ＤＮＡ複製を抑制するがin vitroにおけるＤＮＡ修復は抑制しないことがわかっている（２０）。 Zhangらは、in vitroにおいてｐ２１の研究をしている(Genes & Development （1994）8:1750)。ｐ２１がキナーゼ阻害剤として作用するので、これまでは正常細胞が活性サイクリンキナーゼを実質的に全く含有しないことが予想されていた。ｐ２１含有サイクリンキナーゼが活性及び不活性の両状態において存在することを示すことにより、Zhangらは、ｐ２１が正常細胞における細胞周期プログレッションをコントロールするのに含まれると説明している。Zhangらは、種々の腫瘍ウイルス腫瘍性タンパク質でトランスホームした線維芽細胞において、サイクリンキナーゼは二成分状態で存在し［サイクリン／ＣＤＫ］；その一方、正常な線維芽細胞においては、ｐ２１を含有する第四級複合体に複数のサイクリンキナーゼが存在することを見いだした［サイクリン／ＣＤＫ／増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）／ｐ２１］。活性な複合体は、シングルｐ２１分子を含有する。対照的に、不活性な複合体は複数のｐ２１サブユニットを有している。化学量論におけるｐ２１の変化は、in vitroにおける複合体の活性から不活性への変換を説明するには十分であるが、Zhangらは“ｐ２１とサイクリンキナーゼとの結合は、in vivoにおける他の調節機序と絡み合っているに違いない”と確信している。Zhangらは“ｐ２１の非抑制レベルと結合することにより、in vivoにおいてこれらのＣＤＫ改質酵素にどのような影響があったのかは知られていない”と示している。国際公開第94/09135号公報には、サイクリン複合体のサブユニット成分の検出を含む、細胞のトランスフォーメーションを診断するための方法及び診断キットが記載されている。特に、該方法はサイクリン、ＰＣＮＡ、ＣＤＫｓ及びｐ２１、ｐ１９及びｐ１６等の低分子量ポリペプチドの相互作用と関係する。 in vitroにおけるサイクリンキナーゼ抑制活性が明らかであるにも関わらず、腫瘍形成におけるｐ２１の役割及びin vivoにおける悪性表現型を逆転するその能力はこれまで規定されていなかった。発明の概要したがって、本発明の目的の一つは癌（腫瘍形成）をin vivoで治療及び予防する方法を提供することである。本発明の第二の目的は、再狭窄をin vivoで治療及び予防する方法を提供することである。本発明の第三の目的は、末期分化(terminal differentiation)を誘発することにより細胞における抗腫瘍効果を誘発する方法を提供することである。この方法は、腫瘍の免疫認識を潜在的に容易にし得る細胞表面タンパク質の発現を変化させるのに、又は二次的に細胞成長を阻害し得る因子の分泌を引き起こすのに有用である。本発明により、腫瘍細胞成長及び再狭窄におけるｐ２１サイクリン依存キナーゼ阻害剤の役割を決定した。ｐ２１はｐ５３により誘発され（６，７，１５〜１８）、したがってｐ５３腫瘍抑制の下流エフェクターとして関係付けられていた（２３）。本発明者らは、ｐ２１発現はこれらの腫瘍及び再狭窄抑制効果をin v ivoで生ずるのに十分であることを最初に直接的に示した。ｐ２１発現により、分化に関連して、ｐ２１が接着分子等の遺伝子発現に直接影響を与え得るメカニズムをＮＦ−κＢが提供することにより、転写活性が容易になることを見いだした。腫瘍成長及び再狭窄の抑制並びに分化した表現型の誘発は、遺伝子発現のパターンの変化から生じ、ＮＦ−ｋＢにより一部分媒介されており、これは、末期分化及び成長静止に到るｐ２１誘発転写制御に起因する。末期分化の誘発により抗腫瘍効果を誘発するこれまでの試みは、細胞毒性薬剤又はホルモンの使用を含むものであり（２５〜２８）、この効果を達成するのに変化しやすい成功を有するものであった。図面の簡単な説明図１（Ａ）は、悪性細胞系における細胞周期分析及びｐ２１発現を示すグラフであり、（Ｂ）は、アデノウイルス及び真核生物発現ベクターにより形質導入したRenca細胞系のウェスタンブロットである。図２は、ＡＤＶｐ２１をRenca腫瘍細胞に導入し、接種後の腫瘍成長の抑制を示すグラフである。腫瘍の存在（Ａ，Ｃ）と腫瘍の直径（Ｂ，Ｄ）の評価を行った。図３は、ＡＤＶｐ２１を樹立(established)Renca腫瘍細胞にin vivo導入した場合に腫瘍成長を抑制する影響を示すグラフである。腫瘍直径は、ノギスを使用して垂直方向の大きさを２カ所測定した。図４は、悪性細胞成長及び分化に与えるｐ２１のin vitroの影響を示すグラフである。示した処置を行って５日後の細胞を位相差顕微鏡により観察した。倍率（２０×）。図５は、ＡＤＶｐ２１又はコントロールベクターで処理した樹立腫瘍を有するマウスの生存率を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ａ，ｂ）又はｎｕ／ｎｕＣＤ−１マウス（ｃ，ｄ）に、ＭＯＩ３００で、ＰＢＳ（□、■）、ＡＤＶ−ｐ２１（◇、◆）、ＡＤＶ−△Ｅ１（△、▲）でin vitroでインキュベートしたRenca細胞を注入した。好ましい態様の詳細な説明本発明は、治療が必要な患者に、 (i) ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；及び (ii)医薬的に許容できる担体を含有する組成物の腫瘍抑制量を投与することを含む、癌又は再狭窄の治療方法を提供する。 Xiong et al，Nature 366:701(1993)に記載のｐ２１をコードするｃＤＮＡは、本明細書に含まれるものとする。本発明に有用な適当な発現ベクターとしては、真核生物又はウイルスベクターがあげられる。有用な真核生物ベクターとしては、pRcRSV及びpRcCMV又は他のRS V、CMV又は細胞増強剤及び種々のポリアテニレート配列を有するｐ２１の発現を推進するプロモーターがあげられる。ウイルスベクターを使用するのが好ましい。ウイルスベクター系は、不完全遺伝子を含有する哺乳類に遺伝子をトランスファーするのに非常に効率的として示されてきた。例えば、本明細書に含まれる、 Crystal Am.J．Med．92(6A): 44S-52S(1992); Lemarchand et al.，Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 89(14): 6482-6486（1992）を参照のこと。複製及びトランスホーム能力を付与したレトロウイルスを使用するのが好ましい。本発明に有用なｐ２１を発現する適当なウイルスベクターとしては、（本明細書に含まれる）Da vidson et al.，Nature Gen．3:219（1993）に記載されているアデノウイルスベクター、pAd-BglIIと組み合わせたAd5-360が挙げられる。アデノウイルスベクターを使用するのが好ましい。好ましいアデノウイルスベクターとしては：（本明細書に含まれる）Davidson et al.，Nature Gen．3:219（1993）に記載されているADV ；又はタイプ7001、又はタイプ１又は12を含む他のアデノウイルスタイプ（Ranheim et al.，J. Vir ol．67:2159(1993); Green et al.，Ann．Rev．Biochem．39:701(1970)に記載されている）があげられる。本明細書に含まれる、Sambrook，Fritsch，and Maniatis，"Molecular Clonin g,A Laboratory Manual" (2nd ed): pp．E.55.（Cold Spring Harbor Press，Co ld Spring Harbor，N.Y.，1989）に記載されているような従来の組換え技術を使用して、ｐ２１をこれらの発現ベクターに挿入し、細胞トランスフェクションに使用することができる。また、Davidson et al.，1993，Nature Gen.3:219-223 又はLemarchand et al.，Proc．Nat'l Acad.Sci．USA 89(14):6482-6486（1992 ）に記載されている相同組換え技術を使用して発現ベクターを調製することができる。本発明の発現ベクターは、さらにプロモーター等の調節要素及び抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを含有することができる。ウイルスベクターがin vivoで摂取されて組み込まれ、挿入された作成物(cons truct)を含むウイルスＤＮＡを発現することは詳しく確立されている。例えば、本発明に含まれる、Yoshimura et al．J.Biol.Chem．268(4):2300-2303(1993); Crystal Am．J．Med．92(6A): 445-525(1992); Lemarchand et al．Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 89(14): 6482-6486（1992）を参照のこと。別の態様において、発現ベクターの他にも他の送達システムを使用してｐ２１タンパク質を送達できることもまた理解される。主に、リポソーム及びＤＮＡ接合体の使用を含むこれらの技術は、上述した発現ベクターにより提供されるものと同様の送達率を提供することが期待されている。すなわち、発現ベクターを介してｐ２１遺伝子を発現するよりも、ビヒクルにｐ２１の治療量を混合することも可能なのである。第二の別の態様において、ｐ２１を融合タンパク質として発現することができる。この態様において、ｐ２１をコードする遺伝子は、免疫療法剤、遺伝子治療剤（ＨＬＡ−Ｂ７等）、タンパク質（サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２等）、プロドラッグ変換酵素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ及びβ−グルクロジナーゼ）又はシス−プラチナ等の抗癌剤をコードする遺伝子に融合する。融合遺伝子は、本明細書に含まれる、Sambrook et al，"Molecular Cloning， A Laboratory Manuarl" (2nd ed): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 特に、17章に記載されているものから産生されるタンパク質である。チミジンキナーゼは、本明細書に含まれるAU 8776075に記載されているようにして得ることができる。β−グルクロニダーゼ及びそれらの融合タンパク質は、本明細書に含まれる米国特許第5,268,463号及び第4,888,280号公報に記載されている。シトシンデアミナーゼ及びそれらの融合タンパク質は、本明細書に含まれる国際公開第9428143号公報に記載されている。また、ウイルスベクターとリポソームとの複合治療は、非常に見込みがあり、本発明における使用が予想される。Yoshimura et al.，J．Biol.Chem.，268(4): 2300-2303（1993）は、本明細書に含まれる。リポソームは、非常に効率的に病気の組織へ活性剤を送達することが知られている。例えば、医薬的又は他の生物学的に活性な薬剤を効率的にリポソームに組み込ませて細胞に送達する。このように、本発明の作成物を適当にリポソームに形成して、選択した組織に送達することもできる。例えば商標名LIPOFECTIN（Li fe Technologies．Inc.，Bethesda，Md.）で入手できるカチオン性脂質から製造されるリポソームが好ましい。リポソームベースの治療について特に興味深いのは、系又は代謝から通過する前は、リポソームは比較的安定で、比較的寿命が長いという事実である。さらに、リポソームは主要な免疫応答を生じることはない。したがって、本発明の一観点において、ｐ２１をコードする遺伝子を含有するベクターをリポソームに組み入れて、特定の組織へ作成物を送達するのに使用する。リポソームは、作成物が細胞をトランスフェクトし、該細胞により発現され、最終的にはｐ２１タンパク質を産生する手助けをするであろう。本発明の組成物は、治療上効果的な量のｐ２１発現ベクター及び医薬上許容できる担体である。ウイルスベクターを投与するために、適当な担体、賦形剤、及び他の薬剤を製剤に混合してｐ２１の発現を向上させることができる。多くの適当な製剤を、全ての薬品化学者に公知の処方集に見いだすことができる：Remington's Pharmaceutical Sciences，15th Edition(1975)，Mack Publis hing Company，Easton，Pa．18042(Chapter 87: Blaug，Seymour)。これらの製剤としては、例えば、散剤、ペースト、軟膏剤、ゼリー、ワックス、脂質、無水吸収塩基(anhydrous absorption bases)、水中油滴型又は油中水滴型エマルション、エマルションカルボワックス(種々の分子量のポリエチレングリコール) 、半固体ゲル、及びカルボワックスを含有する半固体混合物があげられる。ウイルス粒子が製剤中で失活し、該製剤が生理学的に相溶性である場合、前述した任意の製剤がウイルスベクターによる治療に適当である。投与されるｐ２１の量は、患者の大きさ及び癌の進行に対する状態に依存する。従来技術を使用してベクターの制御要素を変更したり、投与されるウイルスベクター力価の量を変えることにより、ｐ２１発現量を患者の要求にあわせて調節することができる。一般的には、治療する細胞当たりおよそ５０ウイルスベクターを送達するのが望ましい。アデノウイルスについては、製剤は一般的に１ｍＬ当たり10¹⁰ウイルス感染ユニットのオーダーで含有する。レトロウイルスについては、わずかにことなる力価を適用できる。本明細書に含まれる、Woo et al.， Enzyme 38:207-213(1987)を参照のこと。適当な投与量レベルを決定するのに、本明細書に含まれる、Kay et al.，Hum．Gene Ther．3:641-647(1992); Liu et al.，Somat．Cell Molec．Genet．18:89-96(1992); and Ledley et al.，Hum．G ene Ther．2:331-358(1991)をさらに参考にできる。発現ベクターを投与するために調製される特定の製剤に依存して、本発明の組成物の投与は種々の方法により達成することができる。本発明の組成物は発現ベクター（又は発現ベクターを含有するリポソーム）を、本明細書に含まれる米国特許第5,328,470号明細書に記載されているように、腫瘍に直接投与するのが好ましい。乳房、腎臓、メラノーマ、前立腺、グリア芽腫、ヘプトカルシノーマ(heptoca rcinoma)、大腸及び肉腫癌タイプを本発明により治療することができる。これらのタイプの癌を診断及びモニターすることは当該技術分野において周知である。血管形成由来の動脈外傷としては、再狭窄に到り得る一連の増殖性(prolifera tive)、血管作動性及び炎症応答があげられる。この方法をin vivoで刺激する数種の因子がこれまでに規定されてきたが、応答を制限する特定の細胞遺伝子産生物の役割はよく理解されていない。本発明者らは、ｐ２１がバルーンカテーテル外傷への増殖性応答を限定するように作用することを見いだした。血管内皮及び平滑筋細胞成長を、ｐ２１ＣＫＩがサイクリン依存キナーゼ及び細胞周期のＧ₁相の進行を抑制する能力により静止させた。再狭窄は、本明細書に含まれる、Epstein et al.，JACC 23(6):1278（1994）and Landau et al.，Medical Prog ress 330(14):981（1994）に記載されているように診断及びモニターすることができる臨床的な状態である。本発明の組成物を使用して全ての哺乳類、特にヒトを治療することができる。本発明の組成物は、免疫療法剤、遺伝子治療剤（ＨＬＡ−Ｂ７等）、タンパク質（サイトカイン、好ましくはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１２）等、プロドラッグ変換酵素（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ及びβ− グルクロジナーゼ等）及びシス−プラチナ等の抗癌剤と組み合わせて投与することができる。また、本発明の組成物は、上述の免疫療法剤、遺伝子治療剤、タンパク質、プロドラッグ変換酵素及び抗癌剤をコードする遺伝子を含有する発現ベクターと組み合わせて投与することもできる。また、該組成物は養子細胞移入治療中に投与することもできる。これまで本発明について一般的に記載してきたが、具体的なものとして与えたある特定の実施例を参照することによりさらに本発明を理解できる。特に規定しない限り、本発明を限定するものではない。実施例実施例１：in vivo で再狭窄を治療するためのｐ２１サイクリン依存キナーゼの使用本研究において、in vitroにおける内皮及び平滑筋細胞及びin vivoにおける動脈バルーン外傷のブタモデルにおいてｐ２１発現が与える影響を分析した。細胞培養及びトランスフェクション発達の第一段階にある(primary)ブタ血管内皮及び平滑筋細胞を、６月齢の国産のヨークシャーブタの大動脈からとり出し、第２と第５継代(passage)の間のものを使用した。内皮及び平滑筋細胞を、１０％ＦＢＳと混合した培地１９９で７０％集密まで増殖させた。ＤＭＥＭ及び２％ＦＣＳ中で１時間、細胞をＡＤＶ −ｐ２１又はＡＤＶ−△Ｅ１（ＭＯＩ３００／cell）に感染させ、普通培地を１時間後に添加した。コントロール細胞は感染させないままであり、１０％ＦＢＳと混合したＭ１９９中で保有した。２４時間後、１ウェルあたり６×10⁴cellで６枚のウェルに細胞を分けた。細胞を０、２、５、７及び１０日で収集し、血球計数器で測定した。細胞生存力をトリパンブルーエクスクルージョンにより評価した。細胞周期分析上述したように、細胞を、ＭＯＩ３００／cellにおいてＡＤＶ−△Ｅ１又はＡＤＶ−ｐ２１ベクターに感染させ、収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％エタノール（ＥｔＯＨ）中(King et al.，Cell 79，563-571(1994))、４℃において３０分間固定した。その細胞を、ＰＢＳ１ｍＬ中、３７℃において３０分間、１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌクレアーゼで処理し、0.05ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（ＰＢＳ中で１０×ストックとして調製したもの）に再懸濁した。細胞を、FACScanモデル（Becton Dickinson）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。蛍光測定を集積してＤＮＡ含有量の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生は分析前に減じた。アデノウイルスベクター組換えアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１を、サブゲノム360 ＤＮＡ、Ｅ３領域において欠失しているＡｄ５誘導体とｐ２１発現プラスミド、ｐＡｄ− ｐ２１との間で相同組換えにより構成した。つまり、ｐ２１の発現を制御するラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）を使用して、ｐ２１発現ベクターのHi nd III-XbaI フラグメントをｐＡｄ−ＢｇｌＩＩのＢｇｌＩＩサイトに導入することにより、ｐＡｄ−ｐ２１プラスミドを調製した(Heichman & Roberts, C ell 79，557-562(1994))。これらの複製欠損Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ欠失ウイルスの構造を、サザンブロッティングにより確認した。組換えウイルスは全て、上述したように293 cellで増殖させ、精製した(Davidson et al，1993，Nature Gen．3:219 -223)。塩化セシウム精製ウイルスをＰＢＳに対して透析し、１３％グリセロール−ＰＢＳ溶液中で貯蔵用に希釈し、最終濃度１〜３×10¹²ウイルス粒子／ｍＬ（0.8〜５×10¹⁰ｐｆｕ／ｍＬ）を得た。全てのストックを0.45μｍフィルターで滅菌し、３Ｔ３細胞上、ＭＯＩ１０で、感染により複製成分アデノウイルスの存在について評価した。これらの実験で使用したストックは、複製成分ウイルスを全く生じなかった。ブタ動脈外傷麻酔及び挿管後、国産ヨークシャーブタ（１２〜１５ｋｇ）に腸骨大腿骨動脈の無菌外科曝露(sterile surgical exposure)を行い、二重バルーンカテーテル( C.R．Bard，Inc.)を腸骨大腿骨動脈に挿入した。近位のバルーンを500mmHg圧までふくらませて、５分間、オンライン圧力変換器により測定した。外傷から１、７及び２１日後に動物を犠牲にした。in vivo 遺伝子トランスファー上述したように、二重バルーンカテーテルを使用してヨークシャーブタの腸骨大腿骨動脈において直接遺伝子トランスファーを行った(Nabel et al.，1990，S cience 249:1285-1288)。各動物において、両腸骨大腿骨動脈を力価１×10¹⁰ｐｆｕ／ｍＬにおいて同じベクターで感染させ、各動物に0.7ｍＬを使用した（最終投与量７×10⁹ｐｆｕ）(Ohno et al，1994，Science 265:781-784; Chang et al，1995，Science 267:518-522)。ＡＤＶ−ｐ２１（ｎ＝28 動脈）又はＡＤＶ−△Ｅ１（ｎ＝２８動脈）ベクターに感染させた血管セグメントを７又は２１日後に切除した。内膜細胞増殖を評価するために、７日で犠牲にした動物に、死の１時間前に５−ブロモ−２’− デオキシシトシン（ＢｒｄＣ）(Sigma，St.Louis，MO)を全投与量２５ｍｇ／ｋｇで静脈内注入した。各動脈は、記載されているようにして同じ方法で処理した (Ohno et al，1994，Science 265:781-784)。ＮＩＨガイドラインに従い、動物実験はすべて、動物の使用及び保護に関するミシガン大学委員会の認可を得て行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析トリゾール試薬(GIBCO/BRL)を使用し、製造業者の手順にしたがって全ＲＮＡを調製した。つまり、動脈サンプルをトリゾール試薬中でホモジナイズした。ＲＮＡをエタノール（ＥｔＯＨ）中で沈殿させて、冷やした７５％ＥｔＯＨで３回洗浄し、乾燥及びリボヌクレアーゼフリーＴＥ緩衝液中に再懸濁した。逆転写酵素（ＲＴ）が存在する場合としない場合とで、プライマー：5'-GAG ACA CCA C TG GAG GGT GAC TTC G-3' (センス);5'-GGG CAA ACA ACA GAT GGC TGG CAA C-3' （アンチセンス）と共にｐ２１遺伝子についてＰＣＲを行った(Muller et al，1 994，Circ．Res．75: 1039-1049)。アンチセンスプライマーは、内因性ブタｐ２１ＲＮＡではなく組換えｐ２１ＲＮＡに特異的であった。細胞増殖及び形態測定細胞増殖の測定を、ＢｒｄＣに対するモノクローナル抗体を用いてバルーン外傷及びアデノウイルス感染後７日で行った。動脈切片を固定、包埋及び切断し、モノクローナル抗−５−ブロモ−２’−デオキシシチジン抗体を使用して免疫組織化学を行い(Ohno et al．1994，Science 265 : 781-784)、増殖性細胞の核をラベルした。各動脈について、内膜のラベルした核及びラベルしていない核の数を、顕微鏡ベースのビデオイメージ分析システム(Image One System，Universal Imaging Cororation，Westchester，PA)を使用して測定した。増殖指数を、全細胞数に対するラベルした細胞の比として計算した。内膜及び内側の横断面積を、イメージ分析システムを使用して動脈外傷及びアデノウイルス感染の２ｃｍ領域にわたる各動脈からの４つの切片について測定した(Ohno et al，1994，Science 265: 781-784)。各動脈について培地に対する内膜（Ｉ／Ｍ）面積比を、４つの切片の平均Ｉ／Ｍ面積比として測定した。免疫組織化学記載された方法(Ohno et al，1994，Science 265:781-784; Muller et al，19 94，Circ．Res．75:1039-1049)を使用して、ＢｒｄＣ、平滑筋α−アクチン及びｐ２１に対する抗体について免疫組織化学的研究を行った。以下の発達の第一段階にある(primary)抗体を使用した：モノクローナルマウス抗−ＢｒｄＣ抗体、１：１０００希釈（Amersham Life Sciences）；モノクローナルマウス抗−平滑筋αアクチン抗体、１：１５００希釈(Boehringer Mannheim Biochemical)；及びポリクローナルマウス抗−ヒトｐ２１抗体、１：１５００希釈(Santa Cruz)。動脈片を染色しない、精製したマウスＩｇＧ_2b抗体、１：１００希釈(Promega) を使用してコントロール実験を行った。スライドをストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ複合体(Vector Laboratories)又はベクタステインＡＢＣ −アルカリホスファターゼ試薬(Vector Laboratories)のいずれかにより展開し、メチルグリーンで対比染色した。統計学的分析ＡＤＶ−ｐ２１及びＡＤＶ−△Ｅ１動脈間の内膜ＢｒｄＣラベル指数及びＩ／Ｍ面積比を、２つの尾状、不対のｔ−試験により比較した。0.05レベルにおいて仮説が拒否され得ないとき、統計学的に有意であった。結果ｐ２１の発現が血管細胞増殖を抑制し、かつin vitroにおける細胞周期静止を誘発するｐ２１が血管細胞成長及び細胞周期分布に与える影響を検討するために、静止状態のブタ血管内皮及び平滑筋細胞に、in vitroでアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１すなわちＥ１欠失を含有するコントロールベクター、ＡＤＶ−△Ｅ１を感染させ、１０％ＦＢＳ中でインキュベーションにより刺激して増殖させた。未感染又はＡＤＶ−△Ｅ１感染細胞を血清に曝露することにより、内皮及び平滑筋細胞の増殖が早くなった。対照的に、血管内皮及び平滑筋細胞におけるｐ２１の発現は、＞９０％で細胞増殖が抑制された；これらの細胞は、トリパンブルーエクスクルージョンにより評価されたように、なお生存可能であった（＞９５％）。血管内皮及び平滑筋細胞におけるｐ２１の発現はまた、ヨウ化プロピジウム染色により評価されたように、Ｇ₀／Ｇ₁において細胞を集積させた。これらのデータから、細胞は、ｐ２１が引き起こす細胞死よりもｐ２１発現による細胞周期において抑制されることが示唆される。ｐ２１はin vivoにおけるバルーン外傷動脈において誘発されるｐ２１がin vivoで血管細胞成長を調節する能力を検討するために、まず、ｐ２１発現が外傷動脈において誘発されるかどうかを測定した。ブタ腸骨大腿骨動脈を、傷つけないか又はバルーン血管形成により傷つけて、ｐ２１発現後、１、７及び２１日に外傷セグメントを分析し、ｐ２１抗体により免疫組織化学により評価した。この動脈外傷のブタモデルは、３週間で内膜肥厚となった(Ohno et a l，1994，Science 265:781-784)。外傷の特徴は、動脈に傷をつけてから最初の７日間は平滑筋細胞増殖が早く、次の２週間で細胞外基質の生成のため内膜が拡大することである。通常の、傷をつけていないブタ動脈はｐ２１を全く発現しなかった。動脈に傷をつけて１日後、ｐ２１タンパク質は内膜に存在していなかった；しかしながら、７日で、内膜平滑筋細胞のおよそ５０％にｐ２１タンパク質が存在した。２１日で、ｐ２１発現は内弾性薄膜の隣の、内膜の低領域に存在するが、その領域では細胞増殖は存在しなかった(Ohno et al，1994，Science 2 65:781-784)。実際、ｐ２１発現は一般的に平滑筋細胞増殖と逆の相関関係を有した。これらの知見から、ｐ２１発現は外傷動脈における血管細胞増殖の静止と関連することが示唆される。外傷動脈におけるｐ２１発現は内膜肥厚化の発達を制限するｐ２１がin vivoで血管細胞成長に直接与える影響を評価するために、ｐ２１ベクターを、外傷直後のブタ動脈に導入した。国産ブタの右及び左の腸骨大腿骨動脈をバルーン外傷させ、二重バルーンカテーテルを用いて、ＡＤＶ−ｐ２１又はＡＤＶ−△Ｅ１で感染させた（全投与量、１×10¹⁰ｐｆｕ／ｍＬ、0.7×10¹⁰ ｐｆｕ）。in vivoにおけるＡＤＶ−ｐ２１の遺伝子移入を、外傷を与えたブタ動脈において、感染して７日後にＲＴ−ＰＣＲ分析により実験した。ｐ２１ＲＮＡを、感染させた左及び右腸骨大腿骨動脈においてＲＴ−ＰＣＲにより検出したが、同じ動物からの未感染の頸動脈及びＡＤＶ−△Ｅ１未感染及び感染させた動脈においては検出されなかった。次に、ｐ２１発現がin vivoにおける内膜細胞成長に与える影響を、遺伝子移入から７日後にＢｒｄＣの内膜細胞への導入量を測定し、３週間でＩ／Ｍ面積比を測定することにより２月評価した。遺伝子移入から７日後、ＡＤＶ−△Ｅ１動脈と比較して、ＡＤＶ−ｐ２１感染動脈において内膜ＢｒｄＣ導入が３５％減少した（5.3±0.9％ vs．8.1±0.4％，ｐ＝0.035）。これらのＢｒｄＣラベル内膜細胞を、平滑筋αアクチンに対するモノクローナル抗体で共染色(costain)したが、これは内膜平滑筋細胞増殖の抑制はＡＤＶ−ｐ２１動物に存在することを示唆している。ＡＤＶ−△Ｅ１動脈と比較して、ＡＤＶ−ｐ２１感染動脈においてＩ／Ｍ面積比が有意に３７％減少した(0.37±0.06 vs.0.59±0.06，ｐ＝0.015) 。これらの結果から、バルーン外傷時のＡＤＶ−ｐ２１による動脈感染により、内膜平滑筋細胞の増殖が抑制され、かつネオ内膜(neointima)の発達を有意に制限することが示唆される。実施例２：ｐ２１サイクリン依存キナーゼ阻害剤を使用してin vivoでの腫瘍形成能を抑制するこの研究において、ｐ２１発現がin vitro及びin vivoでのマウスモデルにおける腫瘍成長に与える影響を分析した。細胞周期分析細胞を、ＭＯＩ200〜300においてＡＤＶ−△Ｅ１又はＡＤＶ−ｐ２１ベクターに感染させるか、又はＤＮＡ／リポソーム複合体によりｐ２１発現ベクターでトランスフェクトした。上述したように、細胞を感染、収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、７０％ＥｔＯＨ中、４℃において３０分間固定した。その細胞を、ＰＢＳ１ｍＬ中、３７℃において３０分間、１Ｕのデオキシリボヌクレアーゼ−フリーリボヌクレアーゼで処理し、最終的に、0.05ｍｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム(ＰＢＳ中で１０×ストックとして調製したもの)に再懸濁し、細胞を、FACScanモデル（Becton Dickinson）を用いてフローサイトメトリーにより分析した。蛍光測定を集積してＤＮＡ含有量の分布曲線を作成した。細片のため蛍光発生は分析前に減じた。ｐ２１のウェスタンブロット検出３〜５×10⁶cellを示した時間において収集し、１ｍＬの50ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ6.8）、100ｍＭＤＴＴ、２％ＳＤＳ、0.1％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロールで溶解し、５分間煮沸した。最終的に、サンプルを10,000 rpmにおいて５分間回転させ、上澄みを捕集した。２０μＬを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに装入し、ニトロセルロース膜にブロットした。抗ウサギ西洋わさびペルオキシダーゼ二次抗体及び二次(subsequent)ＥＣＬ化学発行検出器(Amersham)と共に抗タンパク質ウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz)を使用してｐ２１タンパク質を目に見えるようにした。ｐ２１の遺伝子移入１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）において細胞を維持した。組換えアデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１を、サブ 360ゲノムＤＮＡ、Ｅ３領域において欠失しているＡｄ５誘導体と、ｐ２１発現プラスミド、ｐＡｄ−ｐ２１との間で相同組換えにより構成した。これらの組換えアデノウイルスベクターは、欠失したＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域に配列を有し、このウイルスに非許容細胞を複製及びトランスホームする能力を付与する。つまり、D.Beach博士及びG.Hannon博士から親切にも提供された、pRc/CMV-p21由来のNr u I及びDra III フラグメント(Xiong et al，Nature 366，701(1993); Serano e t al，Nature 366，704(1993))を、Ａｄ５ゲノムの左手側の配列は有するが、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂは有しない、pAd-Bgl IIのBgl IIサイト(Davidson et al，Natur e Genet．3，219(1994))に導入することにより、ｐＡｄ−ｐ２１プラスミドを調製した。上述したようにしてウイルスを調製した(Ohno et al，Science 265，78 1(1994))。これらのウイルスの構造は、サザンブロッティングにより確認した。組換えウイルスは全て293細胞で増殖させ、記載されているようにして精製した( Davidson et al，Nature Genet．3，219(1994))。塩化セシウム精製ウイルスをＰＢＳに対して透析し、１３％グリセロール−ＰＢＳ溶液中で貯蔵用に希釈し、最終濃度１〜３×10¹²ウイルス粒子／ｍＬ（0.8〜５×10¹⁰ｐｆｕ／ｍＬ）を得た。ストックは全て0.45μｍフィルターで滅菌し、３Ｔ３細胞上、ＭＯＩ１０で、感染により複製成分アデノウイルスの存在について評価した。これらの実験で使用したストックは、複製成分ウイルスを全く生じなかった。 pRc/CMV-p21由来のｐ２１ｃＤＮＡをpRC/RSV(Invitrogen)に導入することにより真核生物発現プラスミド、pRC/RSV p21を調製し、カルシウムホスフェートトランスフェクションを使用することにより293細胞のトランスフェクトを行った(Perkins et al，提出原稿)。バイスタンダー(bystander)アッセイ Dr.K.Murazkoにより親切にも提供された、Ｕ３７３ヒトグリア芽腫細胞を、ＡＤＶ−ｐ２１で感染させた（ＭＯＩ２００）。１日後、細胞をトリプシン処理し、計測し、示した数の未感染のＵ３７３細胞と共に混合した。混合した集合それぞれについて10,000cellを96ウェルディスクに置いた。５日後、ＭＴＴアッセイ (Mosman，J．Immunol．Methods 65，55(1983))を行って、これらの細胞集団の増殖率を測定した。悪性細胞におけるｐ２１の遺伝子移入及び細胞周期プログレッションに与える影響ｐ２１が細胞周期分布に与える影響を、アデノウイルスベクター、ＡＤＶ−ｐ２１、又は組換えｐ２１を有しない同様のＥ１欠失ウイルス、ＡＤＶ−△Ｅ１で感染させることにより腫瘍細胞系において検討した。アデノウイルスベクターにおけるｐ２１の発現は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列により調節した。典型的な悪性腫瘍細胞系、Ｂ１６ＢＬ６メラノーマ内でのｐ２１の発現により、細胞周期のＧ₀／Ｇ₁相における細胞の集積となり、これは、Ｇ₁／Ｓ境界において優勢的に静止することを示唆している（図１ａ）。組換えｐ２１発現を、マウス(Renca)又はヒト(293)腎細胞癌ライン、及びマウス（Ｂ１６ＢＬ６）メラノーマ細胞系において、ウェスタンブロット分析を使用することにより確認した。アデノウイルスベクター由来の容易に検出できるタンパク質発現は、遺伝子を導入後、〜１日で達成された（図１ｂ、レーン４、５、１３、１４ vs.１〜３、１０〜１２）。また、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー／プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化部位により調節した真核生物発現プラスミドは、293細胞に匹敵する発現を示した（図１ｂ、レーン７、９ vs.６、８）。どちらの場合も、細胞分裂の抑制と相関関係がある組換えタンパク質及び同じ調節要素を有する他のベクターの発現は、本明細書において記載したｐ２１の効果を示さなかった。ｐ２１の分化及び形態学的影響細胞成長に与えるｐ２１の影響をin vitroで検討したとき、ＡＤＶ−ｐ２１に感染した腫瘍細胞は、細胞質比に対して核が増加したり、接着及び成長静止が増加したような、分化した表現型と矛盾のない形態学的変化を示した（図２、３）。ヒトメラノーマ細胞、ＵＭ−３１６は、核凝縮及びＡＤＶ−ｐ２１に感染後の電子顕微鏡によるメラノソーム形成において４倍よりも多く増加した（図２、ｐ ≦0.005、Wilcoxon rank sum test）。これらの細胞において、メラニン生成における〜５倍の増加は、細胞及びin vitroでの上澄み画分において、遺伝子を移入後２日内に観察された（図３）。２、３の系において、長期の細胞培養後の末期分化の結果として細胞死が観察されたが、ＤＮＡ断片化のパターン（図４ａ）、ヨウ化プロピジウム染色又はＴｄＴ免疫染色により決定されるようにアポトーシスの形跡は全くなかった。また、未感染及び感染した細胞の混合物は、バイスタンダー効果がないことがわかったが（図４ｂ）、これはレシピエント細胞における遺伝子移入及び発現が必要とされており、かつｐ２１の効率的な感染が樹立腫瘍の成長を撲滅するのに必要とされることを示唆している。in vivo における腫瘍細胞成長の抑制ｐ２１がin vivoで悪性細胞に与える影響を評価するために、Renca細胞をＡＤＶ−ｐ２１、ＡＤＶ−△Ｅ１コントロールに感染させ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共にインキュベートし、レシピエントマウスに接種した。ｐ２１発現は、２×10⁵cellを接種した全ての動物において腫瘍の成長を完全に抑制した（図５ａ、ｂ）。ｐ２１の発現が感染した細胞の免疫原性を変化させ、その結果、免疫機構を通して作動することが可能であるため、ＣＤ−１ｎｕ／ｎｕ免疫不完全マウスにおいて同様の研究は行わなかった。腫瘍成長の同様の抑制がこれらの動物において観察され（図５ｃ、ｄ）、これは細胞増殖に直接影響を与えることと矛盾がない。ＡＤＶ−ｐ２１が樹立腫瘍の成長を変化し得るかどうかを検討するために、Re nca腫瘍小結節（〜0.5ｃｍ）を、ＰＢＳ、ＡＤＶ−△Ｅ１又はＡＤＶ−ｐ２１のいずれかと共に注入した。ヒト胎盤アルカリホスファターゼレポーターをコードするアデノウイルスベクターの樹立腫瘍への直接移入により、毎日５回繰り返す 10⁹ＰＦＵの注入後、定量的な形態計測により確立された細胞の９５％まで感染を引き起した。この処置もまた腫瘍成長を抑制し、注入を繰り返して行うとき（毎日５回、１週間後に繰り返した）、生存及び予め検出し得る小結節と共にマウスに肉眼でみえる腫瘍を検出する能力がないことにより決定した長期間の治療（＞４０日）に到り得る。いずれの場合も、これらの結果は統計学的に有意であった。 REFERENCES １． Chang & Herskowitz，Cell 63，999 (1990)．２． Jiang et al，Oncogene 9，3397 (1994)．３． Steinman et al，Oncogene 9，3389 (1994)．４． Zhang et al，Mol．Biol．Cell 4，897 (1993)．５． Halevy et al，science 267，1018 (1995)．６． Peter & Herskowitz，Cell 79，181 (1994)．７． Hunter & Pines，Cell 79,, 573 (1994)．８． Noda et al，Exp．Cell Res．211，90 (1994)．９． Skapek et al，Science 267，1022 (1995)． 10． Parker et al，Science 267，1024 (1995)． 11． Xiong et al，Nature 366，701 (1993)． 12． Harper et al，Cell 75，805 (1993)． 13． Zhang et al，Genes Dev．8，1750 (1994)． 14． Gu et al，Nature 366，707 (1993)． 15． el-Deiry et al，Cell 75，817 (1993)． 16． Li et al，Oncogene 9，2261 (1994)． 17． el-Deiry et al，Cancer Res．54，1169 (1994)． 18． Di Leonardo et al，Genes Dev．8，2540 (1994)． 19． Dulic et al，Cell 76，1013 (1994)． 20． Li et al，Nature 371，534 (1994)． 23． Symonds et al，Cell 78，703 (1994)． 25． Christman et al，Cancer Res．43，763 (1983)． 26． Samid et al，Cancer Res．52，1988 (1992)． 27． Pierce & Speers，Cancer Res．48，1996 (1988)． 28． Leftwich & Hall，Cancer Res．46，3789 (1986)． 29． Davidson et al，Nature Gen．3，219 (1993)． 30． Ohno et al，Science 265，781 (1994) これまで十分に本発明を説明してきたが、本件明細書に記載した本発明の趣旨又は範囲から離れずに多くの変更及び修飾が可能であることは当業者にとって明らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (72)発明者ヤンツィヨンアメリカ合衆国ミシガン州 48105 アンアーバーマッキンタイアードライヴ 1740 (72)発明者ネイベルエリザベスジーアメリカ合衆国ミシガン州 48105 アンアーバーアンドーヴァー 3390

Claims

【特許請求の範囲】１．治療が必要な癌患者に、 (i) ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；及び (ii)医薬担体を含有する組成物の治療上効果的な量をin vivo投与することを含む治療方法。２．前記発現ベクターが真核生物又はウイルスベクターである請求項１記載の方法。３．前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである請求項２記載の方法。４．前記癌がメラノーマである請求項１記載の方法。５．前記癌が腎細胞癌である請求項１記載の方法。６．前記発現ベクターがリポソームに包まれている請求項１記載の方法。７．前記患者がヒトである請求項１記載の方法。８．前記組成物が１ｍＬ当たり10¹⁰発現ベクターを含有する請求項１記載の方法。９．前記組成物がさらに、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカイン、プロドラック変換酵素又は抗癌剤を含有する請求項１記載の方法。 10．前記組成物がさらに、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカイン又はプロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子を含有する第二の発現ベクターを含有する請求項１記載の方法。 11．前記発現ベクターがさらに、免疫療法剤、遺伝子治療剤、サイトカイン又はプロドラッグ変換酵素をコードする第二遺伝子を含有し、前記第二遺伝子が、前記ｐ２１をコードする遺伝子と同じ読み枠にある請求項１記載の方法。 12．治療が必要な再狭窄患者に、 (i)ｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクター；及び (ii)医薬担体を含有する組成物の治療上効果的な量をin vivo投与することを含む治療方法。 13．治療が必要な癌患者に、 (i)プロドラッグ変換酵素をコードする遺伝子に融合させたｐ２１をコードする遺伝子を含有する発現ベクターを含有する組成物の治療上効果的な量をin vivo投与することを含む治療方法。 14．前記プロドラッグ変換酵素がチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ又は β−グルクロジナーゼである請求項１３記載の方法。 15．前記組成物がさらに医薬上許容できる担体を含有する請求項１４記載の方法。 16．前記発現ベクターがウイルスベクターである請求項１４記載の方法。