CN108925136B - 特异于糖基化的btla（b和t淋巴细胞衰减因子）的抗体 - Google Patents

特异于糖基化的btla（b和t淋巴细胞衰减因子）的抗体 Download PDF

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Abstract

本文提供了相对于未糖基化的BTLA选择性地结合糖基化的BTLA(B和T淋巴细胞衰减因子)的分子，如抗体。还提供了制造和使用这样的分子的方法，包括治疗或诊断癌症的方法。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以免疫特异性地结合糖基化的野生型BTLA(WT)。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以免疫特异性结合一种或更多种BTLA双突变体，其仅保留了BTLA N75、N94或N110处的单个糖基化位点。在某些实施方式中，对于没有保留BTLA的N75、N94或N110‑O糖基化位点的BTLA三突变体，本文提供的抗糖基化BTLA抗体仅显示了背景结合，如果有结合的话。

Description

特异于糖基化的BTLA（B和T淋巴细胞衰减因子）的抗体
1.相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月2日提交的美国临时申请系列号No. 62/262,293的优先权，通过完全引用将其合并在本文中。
2.序列表
本申请含有序列表，它已经以ACSII格式电子提交，通过完全引用合并在本文中。该ASCII拷贝于2016年11月30日创建，命名为 604556-228009_SL.txt，大小为48,346字节。
3.领域
本发明一般地涉及药物、分子生物学和肿瘤学领域。更具体地，涉及用于治疗癌症的抗体。
4.背景
人类和其他哺乳动物的免疫系统保护他们对抗感染和疾病。肿瘤细胞或肿瘤浸润性淋巴细胞对共抑制分子的增量调节减弱了抗癌T细胞反应，看起来是肿瘤发挥的逃避免疫应答的机制。目前，多种共抑制分子，包括T 淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)已经与癌细胞的免疫逃避关联起来。开发了拮抗性抗体来克服免疫逃避，迄今为止，已经在临床试验中测试了抗CTLA-4和抗PD1抗体，获得了令人鼓舞的结果。然而，通过调节免疫系统来安全有效地治疗疾病的新治疗剂的开发仍然是急需的。本文描述的组合物和方法满足了这些需求，并提供了其他相关的优点。
5.概述
本文提供的是分离的单克隆抗体，其中所述抗体相对于未糖基化的 BTLA选择性地结合糖基化的B和T淋巴细胞衰减因子(attenuator) (“BTLA”)。在某些方面，相对于未糖基化的BTLA，所述抗体选择性地结合在位置N75、N94和/或N110处糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，相对于未糖基化的BTLA，本文提供的分离的抗体选择性地结合在位置N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75糖基化的人 BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N94糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N110 糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75和N94糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N94和N110糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75和N110糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75、N94和N110糖基化的人BTLA。
在某些方面，所述抗体选择性地结合一个或更多个糖基化基序。在某些方面，所述抗体结合包含糖基化基序的糖肽和邻近的肽。在某些方面，所述抗体结合在三维空间中位置靠近一个或更多个糖基化基序的肽序列。在某些方面，所述抗体以小于相对未糖基化的BTLA展现的Kd的一半的 Kd结合糖基化的BTLA。在进一步的方面，所述抗体以小于相对未糖基化的BTLA展现的Kd的至少10倍的Kd结合糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，所述抗体特异性地遮蔽包含BTLA位置N75、N94、 N110或其任何组合的BTLA的糖基化基序。
在某些实施方式中，所述抗体对糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过相比与未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍的荧光强度来表明。
在某些实施方式中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体包含(a)重链可变(VH)区，其包含(1) 具有选自(i)SEQ ID NO：6、34或62，(ii)SEQ ID NO：9、37或65，(iii) SEQ ID NO：12、40或68，和(iv)SEQID NO：15、43或71的氨基酸序列的VH CDR1；(2)具有选自(i)SEQ ID NO：7、35或63，(ii)SEQID NO：10、38或66，(iii)SEQ ID NO：13、41或69，和(iv)SEQ ID NO：16、44或72的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)具有选自(i)SEQ ID NO： 8、36或64，(ii)SEQ ID NO：11、39或67，(iii)SEQ ID NO：14、42 或70，和(iv)SEQ ID NO：17、45或73的氨基酸序列的VH CDR3；和/ 或(b)轻链可变(VL)区，其包含(1)具有选自(i)SEQ ID NO：18、 46或74，(ii)SEQ ID NO：21、49或77，(iii)SEQ ID NO：24、52或80，和(iv)SEQ ID NO：27、55或83的氨基酸序列的VL CDR1；(2)具有选自(i)SEQ ID NO：19、47或75，(ii)SEQ ID NO：22、50或78，(iii) SEQ ID NO：25、53或81，和(iv)SEQ ID NO：28、56或84的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)具有选自(i)SEQ IDNO：20、48或76，(ii)SEQ ID NO：23、51或79，和(iii)SEQ ID NO：26、54或82的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，所述抗体与命名为STC613的抗体、命名为STC626 的抗体或命名为STC635的抗体竞争结合糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含SEQ IDNO：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的五个或更多个连续氨基酸的序列。
在某些实施方式中，所述抗体特异性结合BTLA表位，所述表位包含与SEQ ID NO：86的BTLA的R12、H16、K51、T57、S82或S86相应的一个或更多个氨基酸。
在某些实施方式中，所述抗体以不超过1μM的解离常数(Kd)结合糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，所述抗体以不超过100nM、不超过10nM或不超过5nM的解离常数(Kd)结合糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，所述抗体以不超过5nM的解离常数(Kd)结合糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，所述抗体抑制HVEM与BTLA的结合。
在某些实施方式中，所述抗体以不超过1μg/ml的IC50抑制HVEM结合。
在某些实施方式中，所述抗体以不超过0.8μg/ml、不超过0.6μg/ml、不超过0.4μg/ml、不超过0.2μg/ml的IC50抑制HVEM结合。
在某些实施方式中，所述抗体以不超过0.2μg/ml的IC50抑制HVEM 结合。
在某些方面，所述抗体是重组的。在某些方面，所述抗体是IgG、IgM、 IgA或其抗原结合片段。在其他方面所述抗体是Fab'、F(ab’)2、F(ab’)3、单价scFv、二价scFv、双特异性抗体、双特异性scFv、或单结构域抗体。在某些方面，所述抗体是人类的或人源化抗体。在进一步的方面，所述抗体缀合到成像试剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。
在进一步的实施方式中，本文提供的是组合物，其包含处于药学可接受的载体中的所述实施方式的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的BTLA 选择性地结合糖基化的BTLA)。
在再进一步的实施方式中，提供了分离的多肽，其包含人BTLA的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13 14、15、16、17、18、19、20 个或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个相应于人BTLA 的位置N75、N94或N110的氨基酸。在进一步的方面中，所述实施方式的分离的多肽包含人BTLA的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，以及其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的。在某些方面，所述实施方式的多肽融合或缀合到免疫原性多肽(例如，钥孔血蓝素，KLH)。在某些方面，所述多肽进一步包含处在C-末端或 N-末端的Cys残基。例如，在某些方面，所述多肽通过Cys残基处的二硫键缀合到免疫原性多肽。
在又进一步的实施方式中，提供了组合物，其包含多肽，所述多肽包含人BTLA的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的，其中所述多肽被配制在药学上可接受的载体中。
在又进一步的实施方式中，提供了包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含人BTLA的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的，其中所述多肽被配制在药学上可接受的载体中。在某些方面，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂，例如白矾或弗氏佐剂。
在再进一步的实施方式中，本文提供的是治疗患有癌症的对象的方法，包括向所述对象施用有效量的所述实施方式的抗体或分离的多肽。在某些方面，治疗癌症的方法包括向对象施用有效量的多肽(例如，糖基化的BTLA 多肽)。在进一步的方面中，治疗癌症的方法包括向对象施用有效量的所述实施方式的抗体(例如，抗体相对于未糖基化的BTLA选择性地结合糖基化的BTLA)。在某些方面，所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌症、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，所述癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、成人的脑/CNS肿瘤、儿童的脑/CNS肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、青少年癌症、儿童的癌症、青年的癌症、未知原发性的癌症、Castleman病、子宫颈癌症、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、Ewing家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉或下咽癌、白血病(例如、成人急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、儿童白血病)、肝癌、肺癌(例如、非小细胞的、小细胞的)、肺类癌瘤、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、海军腔癌、鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、儿童非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如、成人软组织癌)、皮肤癌(例如、基底和鳞状细胞、黑素瘤、merkel细胞)、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症或肾母细胞瘤。在某些方面，所述抗体处于药学上可接受的组合物中。在进一步的方面中，所述抗体全身地施用。在特定的方面，所述抗体静脉内地、皮内地、肿瘤内地、肌肉内地、腹膜内地、皮下地或局部地施用。
在某些方面，所述方法进一步包括向所述对象施用至少第二种抗癌治疗。在某些方面，其中所述第二种抗癌治疗是手术治疗、化疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗、免疫治疗或细胞因子治疗。
在又进一步的实施方式中，本文提供的是评估BTLA糖基化、N-连接的糖基化或N-糖基化的方法，包括用所述实施方式的抗体(例如，相对于未糖基化的BTLA选择性结合糖基化的BTLA的抗体)接触含有BTLA的样品。在某些方面，所述方法是体外方法。在某些方面，所述样品是细胞样品。
在又进一步的实施方式中，提供了制造抗体的方法，包括向动物施用根据所述实施方式的多肽(例如，具有人BTLA的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或 N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或 N110的氨基酸是糖基化的)以及从所述动物分离所述抗体。例如，所述动物可以是小鼠、大鼠、兔或人。在某些方面，方法进一步包括鉴定所述抗体的CDR并将围绕所述CDR的序列人源化来产生人源化抗体。在再进一步的方面，所述方法包括重组地表达所述人源化抗体。因而，在进一步的实施方式中，本文提供的是通过上述方法产生的分离的抗体。因而，在某些实施方式中，本文提供的是相对于未糖基化的BTLA选择性结合所述实施方式的多肽(例如，包含人BTLA的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的)的分离的抗体。
6.附图的简要说明
以下附图形成了本说明书的部分，被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考一个或多个这些附图并结合在此呈现的特定实施方式的详细说明，可以更好地理解本发明。
附图1A—抗BTLA mAb的斑点印迹分析；实验布置。附图1A显示了说明斑点印迹分析中测试的抗BTLA mAb样品(STC601-STC636)和对照 (IgG对照抗体；通过Biolegend,SanDiego,CA,US商业上可获得的BTLA 抗体)的排布的示意图。“PNGase F+”表示内切糖苷酶处理的BTLA；“PNGase F-”表示未处理的糖基化的BTLA。
附图1B—抗BTLA mAb的斑点印迹分析；实验结果。附图1B显示了评估抗BTLA mAbSTC601-STC636的糖-特异性BTLA结合的斑点印迹分析的示范性结果。
附图2—抗BTLA mAb的Western印迹分析。附图2显示了示范性的 Western印迹结果，说明了BTLA mAb与野生型(WT)BTLA和与保留单个N-糖基化位点(N75/2NQ、N94/2NQ、N116/2NQ)或没有N-糖基化位点(3NQ)的BTLA突变体的结合。
附图3A—表面等离子体共振BTLA结合分析；附图3A显示了传感图，说明了BTLA滴定实验和与命名为STC613的固定的抗BTLA mAb结合的 BTLA。
附图3B—表面等离子体共振BTLA结合分析；附图3B显示了传感图，说明了BTLA滴定实验和与命名为STC626的固定的抗BTLA mAb结合的 BTLA。
附图3C—表面等离子体共振BTLA结合分析；附图3C显示了传感图，说明了BTLA滴定实验和与命名为STC636的固定的抗BTLA mAb结合的 BTLA。
附图4A—抗BTLA mAb与STC613的结合。附图4A显示了表面等离子体共振实验的示范性的结果，说明了抗BTLA mAb与BTLA-STC613复合物的结合。
附图4B—抗BTLA mAb与STC636的结合。附图4B显示了表面等离子体共振实验的示范性的结果，说明了抗BTLA mAb与BTLA-STC636复合物的结合。
附图5—抗BTLA mAb的中和活性。附图5显示了柱形图，说明了分析在存在5μg/ml或0.5μg/ml抗BTLA mAb的情况下BTLA:HVEM复合物形成的ELISA分析的示范性结果。
附图6—STC613和STC626的中和活性。附图6是说明基于ELISA的 BTLA:HVEM竞争分析中STC613和STC626的滴定曲线的图形。
附图7—STC613的BTLA表位作图。附图7显示了图形，说明被发现在BTLA-STC613复合物中与STC613交联的BTLA区域和氨基酸位置。
7.详细说明
7.1.概述
BTLA被鉴定为含有免疫球蛋白结构域的糖蛋白，具有两个基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序。BTLA是T淋巴细胞上的抑制性受体，其不被初始T细胞表达，但是在T细胞的活化期间被诱导。Watanabe et al,Nature Immunology 4,670-679(2003)。
N-糖基化是在内质网(ER)中启动并随后在高尔基体中加工的翻译后修饰(Schwarz&Aebi,Current Opinion in Structural Biology 21,576-582 (2011))。这种类型的修饰首先由膜相关的寡糖基转移酶(OST)复合物催化，其将包含寡糖的预先形成的聚糖转移到位于NXT基序 (-Asn-X-Ser/Thr-)内的天冬酰胺(Asn)侧链接受体(Cheung andReithmeier, Methods 41(4):451-59(2007)；Helenius and Aebi,Science 291(5512):2364-69(2001))。从预先形成的聚糖中加入或除去糖分别由一组糖基转移酶和糖苷酶介导，它们以细胞和位置依赖性方式严格调节N-糖基化级联。
如本文使用的，除非另作说明，术语“B和T细胞系衰减因子”或“BTLA”是指来自任何脊椎动物来源的BTLA，包括哺乳动物，例如灵长类(例如，人类、食蟹猴(cyno))、犬、和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。除非另作说明，BTLA还包括各种BTLA同种型、相关的BTLA多肽，包括其SNP 变体，以及BTLA的不同修饰形式，包括但不限于磷酸化的BTLA、糖基化的BTLA和遍在化的BTLA。
人BTLA的示范性的氨基酸序列在下文提供，其中N-连接的糖基化的位点是粗体下划线的(N75、N94和N110)：
Figure BDA0001750882220000071
如下表中显示的，所有三个N-糖基化位点都位于BTLA的细胞外结构域中。
特征词 位置 长度 说明
拓扑结构域 31-157 127 细胞外的
穿膜 158-178 21 螺旋的
拓扑结构域 179-289 111 细胞质的
特定BTLA同种型或变体的具体糖基化位点可以不同于该特定BTLA 同种型或变体的氨基酸75、94和110。在那些情况下，本领域的普通技术人员将能够基于序列比对和本领域的其他常识确定与上文例示的人BTLA 的N75N94和N110相应的、任何特定BTLA同种型或变体的糖基化位点。因而，本文提供的还有相对于未糖基化的BTLA同种型或变体选择性结合 BTLA同种型或变体的糖基化形式的抗体。BTLA同种型或变体的糖基化位点可以是上文提供的人BTLA序列的N75、N94和N110的相应位点。本文提供的还有多肽，其包含BTLA同种型或变体的至少7个(例如，至少8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含相应于上文提供的人BTLA的位置N75、N94或 N110的至少一个氨基酸。
如本文使用的，除非另作说明，词语“一”和“所述”是指一个或超过一个的所述词语的语法对象。举例来说，一抗体是指一个抗体或超过一个抗体。
如本文使用的，除非另作说明，术语“或”与“和/或”可互换地使用，除非明确地表明是指仅为可选择的，或所述选择性是互相排斥的。如本文使用的，除非另作说明，“另一个(another)”是指至少第二个或更多个。
如本文使用的，除非另作说明，术语“约”表明数值包括误差的固有变异，来自设备、用于测定所述值的方法、或在研究对象之间存在的变异。
7.2抗体和多肽
如本文使用的，除非另作说明，术语“抗体”是指在多肽的免疫球蛋白 (或“Ig”)类别内B细胞的多肽产物，其能够结合特定的分子抗原，例如， IgG、IgM、IgA、IgD、IgE以及具有抗原结合片段的其他分子。抗体可以包含两个相同的多肽链配对，其中每个配对具有一条重链(约50-70kDa) 和一条轻链(约25kDa)，每条链的每个氨基末端部分包括约100个到约 130个或更多个氨基酸的可变区，每条链的每个羧基末端部分包括恒定区 (参见Borrebaeck(ed.)(1995)Antibody Engineering,Second Edition, Oxford UniversityPress.；Kuby(1997)Immunology,Third Edition,W.H. Freeman and Company,New York)。在此，所述特定的分子抗原包括糖基化的人BTLA。本文提供的抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、合成的抗体、重组生产的抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、内体(intrabodies)、抗独特性(抗-Id) 抗体。
如本文使用的，除非另作说明，当提及抗体、抗原结合片段或多核苷酸时使用的术语“分离的”是指所提及的分子没有自然中存在的至少一种成分。该术语包括从其自然环境中的某些或所有其他成分中移出的抗体、抗原结合片段或多核苷酸。抗体的自然环境的成分包括，例如，红血球、白细胞、血小板、血浆、蛋白、核酸、盐和营养物。抗原结合片段或多核苷酸的自然环境的成分包括，例如，脂质膜、细胞器、蛋白、核酸、盐和营养物。本发明的抗体、抗原结合片段或多核苷酸还可以没有或自始至终实质上没有所有这些成分或细胞的任何其他成分，从所述细胞中分离或重组地生产它们。
如本文使用的，除非另作说明，术语“单克隆抗体”是指一种抗体，其是单个细胞克隆或杂交瘤、或衍生自单个细胞的细胞群体的产物。单克隆抗体还意图指通过重组方法、从编码重链和轻链的免疫球蛋白基因生产的抗体，产生单一分子的免疫球蛋白物质。单克隆抗体制品内抗体的氨基酸序列是实质上同质的，这样的制品内的抗体的结合活性实质上展现了相同的抗原结合活性。相比之下，多克隆抗体是从群体内不同的B细胞获得的，它们是结合特定抗原的免疫球蛋白分子的组合。多克隆抗体的每个免疫球蛋白可以结合同一抗原的不同表位。生产单克隆抗体和多克隆抗体的方法都是本领域公知的(Harlow and Lane.,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)andBorrebaeck(ed.),Antibody Engineering:A Practical Guide,W.H.Freeman and Co.,Publishers,New York, pp.103-120(1991))。
如本文使用的，除非另作说明，术语“人抗体”是指具有人可变区和/或人恒定区、或其与人种系免疫球蛋白序列相应的部分的抗体。Kabat et al. (1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S. Department of Healthand Human Services,NIH Publication No.91-3242描述了这样的人类种系免疫球蛋白序列。在此，人抗体可以包括结合糖基化的人BTLA并由核酸序列编码的抗体，所述核酸序列是人类种系免疫球蛋白核酸序列的天然发生的体细胞变体。
如本文使用的，除非另作说明，术语“嵌合抗体”是指一种抗体，其重链和/或轻链的一部分相同于或同源于衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列，而链的其余部分相同于或同源于衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列，以及这样的抗体的片段，只要它们展现了期望的生物学活性(参见美国专利No.4,816,567；和 Morrison et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))。
如本文使用的，除非另作说明，术语“人源化抗体”是指包括人免疫球蛋白(例如，接受体抗体)的嵌合抗体，其中天然的互补决定区(“CDR”) 残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的、非人物种(例如，供体抗体) 的相应CDR的残基替代，所述非人物种例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类。在某些情况下，人免疫球蛋白的一个或更多个FR区残基被相应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以具有接受体抗体或供体抗体中不存在的残基。进行这些修饰以进一步提高抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以实质上具有所有的至少一个或更多个可变区，其中所有的或基本上所有的 CDR相应于非人类免疫球蛋白的CDR，以及所有的或基本上所有的FRs是人免疫球蛋白序列的FRs。所述人源化抗体可以具有至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般地是人免疫球蛋白的恒定区。进一步的细节参见Jones etal,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann et al,Nature,332:323-329 (1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol,2:593-596(1992)；Carter et al,Proc.Natl.Acd.Sci.USA 89:4285-4289(1992)；以及美国专利Nos:6,800,738、 6,719,971、6,639,055、6,407,213和6,054,297。
如本文使用的，除非另作说明，术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、创造或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染入宿主细胞的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合抗体文库分离的抗体、从人免疫球蛋白基因的转基因的和/或转染色体的动物(例如，小鼠或奶牛)分离的抗体(参见，例如，)，或通过涉及免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列的剪接的任何其他方式制备、表达、创造或分离的抗体。这样的重组抗体可以具有可变区和恒定区，包括衍生自人类种系免疫球蛋白序列的那些(参见，Kabat, E.A.et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest Fifth Edition, U.S.Departmentof Health and Human Services,NIH Publication No. 91-3242)。所述重组抗体还可以经历体外诱变(或当使用人类Ig序列转基因的动物时，体内的体细胞诱变)，因而在衍生自或相关于人类种系VH和 VL序列时，所述重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可以是不天然地存在于体内的人类抗体种系全集中的序列。
如本文使用的，除非另作说明，“中和抗体”是指一种抗体，其阻断BTLA 与它的天然配体例如疱疹病毒进入介体(herpesvirus-entry mediator，HVEM) 的结合，并且抑制BTLA介导的信号转导途径和/或它的其他生理学活性。中和抗体的IC50是指在中和分析，例如分析BTLA-HVEM复合物形成的 ELISA分析中中和50％的BTLA所需的抗体浓度。中和抗体的IC50可以在中和分析中介于0.01-10μg/ml之间。
如本文使用的，除非另作说明，术语“抗原结合片段”和类似的术语是指抗体的一部分，其包括免疫特异性地结合抗原、并为抗体赋予其对抗原的特异性和亲和性的氨基酸残基。抗原结合片段可以称为抗体的功能性片段。抗原结合片段可以是单价的、二价的、或多价的。
具有抗原结合片段的分子包括例如Fd、Fv、Fab、F(ab’)、F(ab)2、F(ab’)2、 F(ab)3、F(ab’)3、单链Fv(scFv)、二抗体(diabody)、三抗体(triabody)、四抗体(tetrabody)、迷你抗体(minibody)、或单结构域抗体。scFv可以是单价的scFv或二价的scFv。具有抗原结合片段的其他分子包括，例如，重链或轻链多肽、可变区多肽或CDR多肽或其部分，只要这样的抗原结合片段保持了结合活性。这样的抗原结合片段可以见于，例如，Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory,New York (1989)；Myers(ed.),Molec.Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,NewYork:VCH Publisher,Inc.；Huston et al,Cell Biophysics, 22:189-224(1993)；Pluckthun and Skerra,Meth.Enzymol,178:497-515(1989) 以及Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,Second Ed.,Wiley-Liss,Inc.,New York,NY(1990)。抗原结合片段可以是具有至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50 个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少100个连续氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少 175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。
抗体的重链是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端包括约120到130 个或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区。所述恒定区可以是五种不同的类型之一，称为alpha(α)、delta(δ)、epsilon(ε)、gamma (γ)和mu(μ)，基于重链恒定区的氨基酸序列。不同的重链在大小上不同：α、δ和γ含有大约450个氨基酸，而μ和ε含有大约550个氨基酸。当与轻链组合时，这些不同的重链类型产生五种公知的抗体类别，分别为 IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括四种IgG的子类，即IgG1、IgG2、IgG3 和IgG4。重链可以是人类重链。
抗体的轻链是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端包括约100到约110 个或更多个氨基酸的可变区，羧基末端部分包括恒定区。轻链的大约长度是211到217个氨基酸。基于恒定区的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为kappa(κ)和lambda(λ)。轻链氨基酸序列是本领域公知的。轻链可以是人类轻链。
抗体的可变域或可变区是指抗体的轻链或重链的一部分，其一般位于轻链或重链的氨基末端，重链中长度约120到130个氨基酸，轻链中长度约100到110个氨基酸，用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。在不同的抗体之前可变域在序列上广泛地不同。序列中的变异性集中在 CDR中，可变域中较少变化的部分称为框架区(FR)。轻链和重链的CDR 主要负责抗体与抗原的相互作用。本文使用的氨基酸位置的编号是根据EU 索引，见Kabat et al.(1991)Sequences of proteins of immunological interest.(U.S.Department of Health and Human Services,Washington,D.C.)5th ed。可变区可以是人类可变区。
CDR是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VHβ-片层框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VLβ-片层框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因而，CDR是框架区序列内散布的可变区序列。CDR区是本领域技术人员已知的，已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最为高变性的区域(Kabat et al,J.Biol.Chem. 252:6609-6616(1977)；Kabat,Adv.Prot.Chem.32:1-75(1978))。CDR区序列还由Chothia在结构上定义为不属于保守的β-片层框架部分的那些残基，因而能够采取不同的构象(Chothia andLesk,J.Mol.Biol.196:901-917 (1987))。两种术语学都是本领域公知的。典型的抗体可变域内CDR的位置已经通过比较大量结构来确定(Al-Lazikani et al,J.Mol.Biol.273:927-948 (1997)；Morea et al,Methods 20:267-279(2000))。由于在不同的抗体中高变区内的残基数目不同，相对于典型位置的额外残基通常用a、b、c等紧接着典型可变域编号方案中的残基号来编号(Al-Lazikani et al.,supra (1997))。这样的命名法类似地是本领域技术人员公知的。
例如，根据标准命名定义的CDR在下文表1中列出。
表1：CDR定义
Figure BDA0001750882220000121
Figure BDA0001750882220000131
一个或更多个CDR还可以共价地或非共价掺入分子中使得它成为免疫粘附素。免疫粘附素可以整合CDR(s)作为更大的多肽链的部分，可以将 CDR(s)共价地连接到另一个多肽链，或可以非共价地整合CDR(s)。CDR 允许免疫粘附素结合特定的目标抗原。
“框架”或“FR”残基是指CDR侧翼的那些可变域残基。FR残基存在于例如嵌合的、人源化的、人类的结构域抗体，双抗体、线性抗体和双特异性抗体中。FR残基是与本文定义的高变区残基不同的那些可变域残基。
如本文使用的，除非另作说明，术语“分离的”在提及抗体使用时是指所述抗体基本上没有来自细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白，和/或来自衍生所述抗体的其他污染成分，或在化学合成时基本上没有化学前体或其他化学物质。用语“基本上没有细胞材料”包括抗体的制品，其中抗体从细胞的细胞组分分离，所述抗体分离自所述细胞或由所述细胞重组产生。因而，基本上没有细胞材料的抗体包括抗体的制品，其具有小于约30％、20％、10％或5％(干重)的异源蛋白质(本文也称为“污染蛋白质”)。在某些实施方式中，当所述抗体是重组产生的时，它基本上没有培养基，例如，培养基低于所述蛋白制品的体积的约20％、10％或5％。在某些实施方式中，当所述抗体通过化学合成产生时，它基本上没有化学前体或其他化学物质，例如，它与蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。因而，这样的抗体制品具有小于约30％、20％、10％、5％>(按干重)的目标抗体以外的化学前体或化合物。污染物成分还可以包括，但不限于，将干扰所述抗体的治疗用途的材料，可以包括酶、激素以及其他蛋白的或非蛋白的溶质。在某些实施方式中，所述抗体将被纯化至(1)根据Lowry方法(Lowry et al.J.Bio.Chem.193:265-275,1951)测量的按抗体的重量计算大于95％，例如按重量计算99％，(2)达到通过使用旋转杯测序仪足以获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)达到通过使用考马斯亮蓝或优选的银黄染色在还原或非还原条件下SDS-PAGE的同质性。分离的抗体包括重组细胞内原位的抗体，因为不存在抗体的天然环境的至少一种成分。然而，通常，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。在具体的实施方式中，本文提供的抗体是分离的。
如本文使用的，除非另作说明，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”、“核酸分子”和其他类似的术语可互换的使用，包括DNA、RNA、mRNA等。
如本文使用的，除非另作说明，术语“分离的”在提及核酸分子使用时意味着所述核酸分子是与核酸分子的天然来源中存在的其他核酸分子分离的核酸。此外，“分离的”核酸分子，例如cDNA分子，当通过重组技术产生时可以基本上不含其他细胞材料、或培养基，或当化学合成时可以基本上不含化学药品前体或其他化学药品。在具体的实施方式中，编码本文提供的抗体的核酸分子是分离的或纯化的。
本文使用的和除非另作说明，术语“结合(bind)”或“结合(binding)”是指分子之间的相互作用。相互作用可以是，例如，非共价的相互作用，包括氢键、离子键、疏水性相互作用、和/或范德华相互作用。抗体与目标分子如糖基化的人BTLA的单个表位之间总和的非共价相互作用的强度是抗体对该表位的亲和力。“结合亲和性”一般是指分子(例如，结合蛋白，如抗体)的单个结合位点与它的结合配体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。
结合分子X，例如抗体，对它的结合配体Y，例如抗体的相应抗原的亲和力一般可以通过解离常数(KD)来表示。低亲和力抗体一般缓慢地结合抗原，倾向于容易离解，而高亲和力抗体一般更快地结合抗原并倾向于保持结合更久。测量结合亲和性的各种方法是本领域已知的，它们的任一个都可以用于当前的公开内容。“KD”或“KD值”可以通过本领域已知的分析来测量，例如通过结合分析。KD可以在放射性标记的抗原结合分析(RIA) 中测量，例如，用目标抗体的Fab版本和它的抗原来进行(Chen,et al,(1999) J.Mol.Biol.293:865-881)。KD或KD只还可以使用Biacore的表面等离子体共振分析来测量，使用例如BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc.,Piscataway,NJ)，或通过生物层干扰素计，使用例如OctetQK384系统 (ForteBio,Menlo Park,CA)来测量。如本文使用的，除非另作说明，如果抗体以比第二分子抗原更高的亲和力结合第一分子抗原，抗体被称为能够相对于第二分子抗原“选择性地结合”第一分子抗原。抗体一般不结合完全不相关的抗原。
如本文使用的，除非另作说明，本文使用的术语“多肽”包括具有2到 30个氨基酸(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、 25或30个氨基酸)的寡肽，以及更长的氨基酸链，例如，超过30个氨基酸、超过50个氨基酸、超过100个氨基酸、超过150个氨基酸、超过200 个氨基酸、超过300个氨基酸、超过400个氨基酸、超过500个氨基酸、或超过600个氨基酸。多肽可以例如通过重组表达或通过化学合成来产生。本公开内容的多肽可以翻译后修饰或化学修饰(例如，糖基化、氨甲酰化、磷酸化、生物素化、附着荧光染料，等等)。多肽可以在特定位点被糖基化。多肽可以包括不由天然遗传密码编码的非天然氨基酸。例如，多肽可以包括甲基化的主链结构、类肽主链结构(聚-N-取代的甘氨酸)、L-氨基酸、 R-氨基酸，等等。多肽可以具有野生型序列、天然发生的变体序列、突变序列(例如，点突变、删除突变)等。
如本文使用的，除非另作说明，术语“载体”是指用于将核酸分子导入宿主细胞的物质。适合使用的载体包括，例如，表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、游离体和人工染色体，它们可以包括可操作的选择序列或标志物用于稳定整合到宿主细胞的染色体中。另外，所述载体可以包括一个或更多个可选择标记物基因和适当的表达控制序列。例如，可以包括的可选择标记物基因提供了抗生素的抗药性或毒素，补充营养缺陷性缺陷、或补充培养基中不存在的关键营养物。表达控制序列可以包括组成型和可诱导启动子、转录增强子、转录终止子等，这些是本领域公知的。当共表达两种或更多种核酸分子时(例如，抗体重链和轻链两者)，两种核酸分子可以被插入例如单个表达载体中，或独立的表达载体中。对于单载体表达，编码核酸可以可操作地连接到一个共同的表达控制序列，或连接到不同的表达控制序列，例如，一个可诱导启动子和一个组成型启动子。核酸分子导入宿主细胞可以使用本领域公知的方法来确认。这样的方法包括，例如，核酸分析，如Northern印迹或聚合酶链式反应(PCR)、mRNA扩增、或基因表达产物的免疫印迹、或其他测试导入的核酸的表达或它的相应基因产物的适合的分析方法。本领域技术人员理解的是，核酸分子以足够的数量表达以产生期望的产物(例如，本文提供的抗BTN1A1抗体)，进一步理解的是表达水平可以使用本领域公知的方法进行优化以获得足够的表达。
如本文使用的，除非另作说明，术语“宿主细胞”是指转染核酸分子的特定接受细胞，以及这样的细胞的子代或可能的子代。这样的细胞的子代可能由于可能存在于后续世代中的突变或环境影响、或核酸分子向宿主基因组中的整合而不相同于所述核酸分子转染的亲本细胞
7.2.1.抗糖基化的BTLA抗体
本文提供的是分离的抗体，其相对于未糖基化的BTLA选择性地结合糖基化的BTLA。所述BTLA可以是人BTLA。糖基化的BTLA可以是BTLA 的特定N-聚糖结构或BTLA的糖肽。在某些实施方式中，本文提供的抗体是相对于未糖基化的BTLA选择性地结合糖基化的BTLA的抗原结合片段。
在某些实施方式中，相对于未糖基化的BTLA，本文提供的分离的抗体选择性地结合在位置N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75糖基化的人 BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N94糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N110 糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有 N75和N94糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N94和N110糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75和N110糖基化的人BTLA。在某些实施方式中，所述分离的抗体选择性地结合具有N75和N110糖基化的人BTLA。
在某些实施方式中，本文提供的所述分离的抗体特异性地遮蔽包含 BTLA位置N75、N94、N110或其任何组合的BTLA的糖基化基序。、在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N75的 BTLA的糖基化基序。在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N94的BTLA的糖基化基序。在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N110的BTLA的糖基化基序。在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N75和N94的BTLA的糖基化基序。在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N75和N110的BTLA的糖基化基序。在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N94 和N110的BTLA的糖基化基序。在某些实施方式中，所述分离的抗体特异性地遮蔽包含人BTLA的位置N75、N94和N110的BTLA的糖基化基序。
在某些实施方式中，本文提供的抗体选择性地结合BTLA的一个或更多个糖基化基序。在某些实施方式中，所述抗体选择性地结合具有糖基化基序的糖肽和邻近的肽。在某些实施方式中，所述抗体选择性地结合糖基化的BTLA，KD小于相对未糖基化的BTLA展现的KD的至少30％、40％、 50％、60％、70％、80％、或90％。在某些实施方式中，所述抗原结合片段以小于相对未糖基化的BTLA展现的KD的50％的KD结合抗原结合片段。在某些实施方式中，所述抗体结合糖基化的BTLA，KD小于相对未糖基化的BTLA展现的KD的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％9％、10％、 15％、20％、30％、40％、50％在进一步的方面，所述抗体以小于相对未糖基化的BTLA展现的Kd的至少10倍的Kd结合糖基化的BTLA。
在某些实施方式中，本文提供的抗体相对于未糖基化的BTLA对糖基化的BTLA的选择性结合使用荧光强度(例如，MFI)测量来确定，例如，在FACS分析或ELISA分析中。参见，例如，实施例1和3。在某些实施方式中，测量的荧光强度(例如，MFI)表明本文提供的荧光标记的抗体(例如，FITC标记的抗体)与糖基化或未糖基化的BTLA(例如，细胞表面表达的BTLA、固定在表面或珠子上的BTLA、或溶液中的BTLA)的结合。在某些实施方式中，在荧光分析中通过比未糖基化的BTLA展现的荧光强度更高至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍、至少120倍、至少140倍、至少160倍、至少180倍、或至少200倍的荧光强度，表明抗体与糖基化的BTLA的结合。参见，例如，表10。在某些实施方式中，所述抗体对糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过相比与未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍的荧光强度来表明。在某些实施方式中，所述抗体对糖基化的BTLA 的结合在荧光分析中通过比未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少10 倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍、或至少20倍的荧光强度来表明。在某些实施方式中，所述抗体与糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过比未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少10倍、至少20 倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50 倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、或至少100倍的荧光强度来表明。在某些实施方式中，所述抗体对糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过比未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少100倍、至少120倍、至少140倍、至少160倍、至少180倍、或至少200倍的荧光强度来表明。
在某些实施方式中，本文提供的所述抗糖基化BTLA抗体可以是IgG、 IgM、IgA、IgD或IgE。所述抗糖基化BTLA抗体还可以是嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体、或人抗体。所述抗糖基化BTLA抗体还可以上骆驼化抗体、内抗体、抗独特型(抗-Id)抗体。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体是相对于未糖基化的BTLA选择性地结合糖基化的BTLA的抗原结合片段。所述抗原结合片段可以是Fd、 Fv、Fab、F(ab’)、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、F(ab’)3、单链Fv(scFv)、二抗体、三抗体、四抗体、迷你抗体、或单结构域抗体。scFv可以是单价的scFv 或二价的scFv。
生产并表征了相对于未糖基化的BTLA选择性地结合糖基化的BTLA 的几种示范性的小鼠单克隆抗体(mAb)。参见，例如，实施例1-7。示范性的抗BTLA mAb包括IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3和IgGM同种型。参见，例如，表8。例如，称为STC604、STC605、STC606、STC608、STC610、 STC613、STC618、STC622、STC626、STC627、STC628、STC630和STC636 的抗体显示了对BTLA的糖基化特异性结合。参见，例如，附图1和附图2。例如，称为STC604、STC610、STC613、STC618、STC622、STC626和STC635 的抗体以高亲和力结合BTLA，KD从0.256nM(STC613)到5.61nM (STC635)。参见，例如，表11。例如，称为STC613和STC626的抗体抑制BTLA与它的天然配体HVEM的结合，IC50为1.088μg/ml(STC613) 和0.416μg/ml(STC626)。参见，例如，附图6。本文还提供了一种命名为 STC613的示范性抗BTLA mAb的BTLA表位。因而，本文提供的是具有特定序列特征的中和性抗BTLA mAb，糖特异性结合BTLA的抗BTLA mAb、特定的BTLA表位、以及其在癌症治疗中的用途。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体包含本文描述的任一个单克隆抗体(例如，STC613、STC626或STC635)的VH区、VL 区、VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3，例如，表2-7中描述的氨基酸序列。因而，在某些实施方式中，本文提供的抗体包含来自(a)命名为STC613的所述；(b)命名为STC626的抗体或 (c)命名为STC635的抗体的一个两个和/或三个重链CDR和/或一个两个和/或三个轻链CDR，如表3、5和7所示。
命名为STC613的抗体包含SEQ ID NO：2的VH序列和SEQ ID NO： 3的VL序列。
命名为STC626的抗体包含SEQ ID NO：30的VH序列和SEQ ID NO： 32的VL序列。
命名为STC635的抗体包含SEQ ID NO：58的VH序列和SEQ ID NO： 60的VL序列。
表2：小鼠单克隆抗人BTLA抗体STC613的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的序列
Figure BDA0001750882220000181
Figure RE-GDA0003300377470000011
表3：小鼠单克隆抗人BTLA抗体STC613的CDR序列
Figure RE-GDA0003300377470000012
表4：小鼠单克隆抗人BTLA抗体STC626的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的序列
Figure BDA0001750882220000201
表5：小鼠单克隆抗人BTLA抗体STC626的CDR序列
Figure BDA0001750882220000202
Figure BDA0001750882220000211
表6：小鼠单克隆抗人BTLA抗体STC635的重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区的序列
Figure BDA0001750882220000212
表7：小鼠单克隆抗人BTLA抗体STC635的CDR序列
Figure BDA0001750882220000213
Figure BDA0001750882220000221
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体包含VH区或 VH结构域。在其他实施方式中，本文提供的抗体包含VL区或VL链。在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(i)VH结构域或VH区；和/或(ii) VL结构域或VL区的组合。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体包含或由六个 CDR组成，例如，表3、4或7中鉴定的VH CDR1、VH CDR2 VH CDR3、 VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，本文提供的抗体可以包含少于六个CDR。在某些实施方式中，所述抗体包含或由一个、两个、三个、四个或五个CDR组成，所述CDR选自表3、5或7中鉴定的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和/或VL CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含或由一个、两个、三个、四个或五个CDR 组成，所述CDR选自鼠单克隆抗体的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2,and/or VL CDR3，所述鼠单克隆抗体选自本文描述的(a)命名为STC613的抗体；(b)命名为STC626的抗体；或(c)命名为STC635的抗体。因而，在某些实施方式中，所述抗体包含或由表3、 5或7中鉴定的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2 和/或VL CDR3的任一的一个、两个、三个、四个或五个CDR组成。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含表3、5或7中列出的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR。在其他实施方式中，本文提供的抗体包含表3、5或7中列出的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR。在又其他的实施方式中，本文提供的抗体包含表3、5和7 中列出的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR以及表3、5 或7中列出的一个或更多个VL CDR。因而在某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NOs：6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71 的任一个的氨基酸序列的VH CDR1。在另一个实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NOs：7、10、13、16 35、38、41、44、63、66、69或72的任一个的氨基酸序列的VH CDR2。在另一个实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NOs：8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73的任一个的氨基酸序列的VH CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含VH CDR1和/或VH CDR2和/或VH CDR3，它们独立地选自表3、5或7中描述的氨基酸序列的任一个中描述的VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NOs：18、21、24 27、46、49、 52、55、74、77、80或83的任一个的氨基酸序列的VHCDR1。在另一个实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NOs：19、22、25、28、47、50、 53、56、75、78、81或84的任一个的氨基酸序列的VL CDR2。在另一个实施方式中，所述抗体包含具有SEQ ID NOs：20、23、26、29、48、51、 54、57、76、79、82或85的任一个的氨基酸序列的VLCDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含VL CDR1和/或VL CDR2和/或VL CDR3，它们独立地选自表3、5或7中描述的氨基酸序列的任一个中描述的VL CDR1、 VL CDR2、VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含重链可变(VH)区，其包含： (1)VH CDR1，其具有选自(i)SEQ ID NO：6、34或62，(ii)SEQ ID NO：9、37或65，(iii)SEQ ID NO：12、40或68，和(iv)SEQ ID NO： 15、43或71的氨基酸序列；(2)VH CDR2，其具有选自(i)SEQ ID NO：7、35或63，(ii)SEQ ID NO：10、38或66，(iii)SEQ ID NO：13、41 或69，和(iv)SEQ ID NO：16、44或72的氨基酸序列；和(3)VH CDR3，其具有选自(i)SEQ ID NO：8、36或64，(ii)SEQ IDNO：11、39或67， (iii)SEQ ID NO：14、42或70，和(iv)SEQ ID NO：17、45或73的氨基酸序列；和/或轻链可变(VL)区，其包含：(1)VL CDR1，其具有选自 (i)SEQ ID NO：18、46或74；(ii)SEQ ID NO：21、49或77；(iii)SEQ ID NO：24、52或80，和(iv)SEQ ID NO：27、55或83的氨基酸序列； (2)VL CDR2，其具有选自(i)SEQ ID NO：19、47或75，(ii)SEQ ID NO：22、50或78，(iii)SEQ ID NO：25、53或81，和(iv)SEQ ID NO： 28、56或84的氨基酸序列；和(3)VL CDR3，其具有选自(i)SEQ ID NO： 20、48或76，(ii)SEQ ID NO：23、51或79，(iii)SEQ ID NO：26、54或82，和(iv)SEQ ID NO：29、57或85的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含重链可变(VH)区，其包含： (1)VH CDR1，其具有选自(i)SEQ ID NO：6、34或62，(ii)SEQ ID NO：9、37或65，(iii)SEQ ID NO：12、40或68，和(iv)SEQ ID NO： 15、43或71的氨基酸序列；(2)VH CDR2，其具有选自(i)SEQ ID NO：7、35或63，(ii)SEQ ID NO：10、38或66，(iii)SEQ ID NO：13、41 或69，和(iv)SEQ ID NO：16、44或72的氨基酸序列；和(3)VH CDR3，其具有选自(i)SEQ ID NO：8、36或64，(ii)SEQ IDNO：11、39或67， (iii)SEQ ID NO：14、42或70，和(iv)SEQ ID NO：17、45或73的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含轻链可变(VL)区，其包含： (1)VL CDR1，其具有选自(i)SEQ ID NO：18、46或74；(ii)SEQ ID NO：21、49或77；(iii)SEQ ID NO：24、52或80，和(iv)SEQ ID NO： 27、55或83的氨基酸序列；(2)VL CDR2，其具有选自(i)SEQ IDNO： 19、47或75，(ii)SEQ ID NO：22、50或78，(iii)SEQ ID NO：25、53 或81，和(iv)SEQ IDNO：28、56或84的氨基酸序列；和(3)VL CDR3，其具有选自(i)SEQ ID NO：20、48或76，(ii)SEQ ID NO：23、51或 79，(iii)SEQ ID NO：26、54或82，和(iv)SEQ ID NO：29、57或85 的氨基酸序列。
本文还提供的是抗体，其包含表3、5或7中所列的一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VH CDR以及一个或更多个(例如，一个、两个或三个)VL CDR。特别是，本文提供的是抗体，其包含：表3、5和7所列的VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、 68或71)和VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、 74、77、80或83)；VH CDR1(SEQID NOS:6、9、12、15、34、37、40、 43、62、65、68或71)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、 50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、 34、37、40、43、62、65、68或71)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、 26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR2(SEQID NOS:7、 10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)和VL CDR1(SEQ ID NOS: 18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)和VL CDR2 (SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)； VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69 或72)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)和VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、 52、55、74、77、80或83)；VHCDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、 39、42、45、64、67、70或73)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、 28、47、50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、 14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)和VL CDR3(SEQ ID NOS: 20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)和VL CDR1 (SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)； VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或 71)、VHCDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、 69或72)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、 75、78、81或84)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、 41、44、63、66、69或72)和VLCDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、 48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、 16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、 14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)和VL CDR1(SEQ ID NOS: 18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)、VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)和VL CDR2 (SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)； VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69 或72)、VHCDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、 67、70或73)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、 57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、 40、43、62、65、68或71)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、 46、49、52、55、74、77、80或83)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、 25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、 9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VL CDR1(SEQ ID NOS: 18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1 (SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VL CDR2 (SEQ IDNOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和 VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82 或85)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、 66、69或72)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、 74、77、80或83)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、 53、56、75、78、81或84)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、 38、41、44、63、66、69或72)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、 27、46、49、52、55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、 23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VHCDR2(SEQ ID NOS: 7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和VL CDR3 (SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)； VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70 或73)、VLCDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、 77、80或83)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、 56、75、78、81或84)；VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、 46、49、52、55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、 26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR3(SEQ IDNOS:8、 11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR2(SEQ ID NOS: 19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1 (SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2 (SEQ IDNOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73) 和VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、 80或83)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、 65、68或71)、VH CDR2(SEQ IDNOS:7、10、13、16、35、38、41、44、 63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、 45、64、67、70或73)和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、 50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、 34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ IDNOS:7、10、13、 16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、 14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)和VL CDR3(SEQ ID NOS: 20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ IDNOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VL CDR1 (SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)和 VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、 65、68或71)、VH CDR2(SEQ IDNOS:7、10、13、16、35、38、41、44、 63、66、69或72)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、 52、55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、 48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、 15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ IDNOS:7、10、 13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VL CDR2(SEQ ID NOS:19、 22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和VL CDR3(SEQ ID NOS: 20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR3(SEQ IDNOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR1 (SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)和 VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、 68或71)、VH CDR3(SEQ IDNOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、 67、70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、 55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、 51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、 34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR3(SEQ IDNOS:8、11、14、 17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR2(SEQ ID NOS:19、 22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和VL CDR3(SEQ ID NOS: 20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ IDNOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR1 (SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)和 VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、 66、69或72)、VH CDR3(SEQ IDNOS:8、11、14、17、36、39、42、45、 64、67、70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、 52、55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、 48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、 16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ IDNOS:8、11、 14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR2(SEQ ID NOS:19、 22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和VL CDR3(SEQ ID NOS: 20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ IDNOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3 (SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83) 和VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、 81或84)；VH CDR1(SEQID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、 65、68或71)、VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、 63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、 45、64、67、70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、 49、52、55、74、77、80或83)和VL CDR3(SEQ IDNOS:20、23、26、 29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、 12、15、34、37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR2(SEQ ID NOS:7、 10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS: 8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR2(SEQ IDNOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84)和VL CDR3 (SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)； VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或 71)、VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、 69或72)、VL CDR1(SEQID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、 77、80或83)、VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、 75、78、81或84),和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、 54、57、76、79、82或85)；VH CDR1(SEQ ID NOS:6、9、12、15、34,
37、40、43、62、65、68或71)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、 17、36、39、42、45、64、67,70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、 24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)、VL CDR2(SEQ ID NOS:19、 22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84),和VL CDR3(SEQ ID NOS: 20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85)；VH CDR2(SEQ ID NOS:7、10、13、16、35、38、41、44、63、66、69或72)、VH CDR3(SEQ ID NOS:8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73)、VL CDR1(SEQ ID NOS:18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83)、 VL CDR2(SEQ ID NOS:19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81 或84),和VL CDR3(SEQ ID NOS:20、23、26、29、48、51、54、57、76、 79、82或85)；或VH CDR(SEQ ID NOS:6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73)和VL CDR(SEQ ID NOS:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、74、75、76、77、78、79、80、81、 82、83、84或85)的任何组合。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NOS：6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或 71的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ IDNOS：7、10、13、16、 35、38、41、44、63、66、69或72的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3) 包含SEQ ID NOS：8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73 的氨基酸序列的VH CDR3。在某些实施方式中，所述重链可变(VH)区包含(1)包含SEQ ID NOS：6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71的氨基酸序列的VH CDR1；和(2)包含SEQ ID NOS：7、10、 13、16、35、38、41、44、63、66、69或72的氨基酸序列的VH CDR2。在某些实施方式中，所述重链可变(VH)区包含(1)包含SEQ ID NOS： 6、9、12、15、34、37、40、43、62、65、68或71的氨基酸序列的VH CDR1；和(2)包含SEQ ID NOS：8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70 或73的氨基酸序列的VH CDR3。在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NOS：7、10、13、16、 35、38、41、44、63、66、69或72的氨基酸序列的VH CDR2；和(3)包含SEQ ID NOS：8、11、14、17、36、39、42、45、64、67、70或73的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含具有VH CDR1的重链可变(VH)区，所述VHCDR1包含SEQ ID NOS：6、9、12、15、34、37、 40、43、62、65、68或71的氨基酸序列。所述VHCDR1可以包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。所述VH CDR1 可以包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列。所述VHCDR1可以包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含 SEQ ID NO：62的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：65 的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ IDNO：68的氨基酸序列。所述VH CDR1可以包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体包含具有VH CDR2的重链可变 (VH)区，所述VH CDR2包含SEQ ID NOS：7、10、13、16 35、38、41、 44、63、66、69或72的氨基酸序列。所述VHCDR2可以包含SEQ ID NO： 7的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列。所述VH CDR2 可以包含SEQ IDNO：16的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含 SEQ ID NO：63的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：66 的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQID NO：69的氨基酸序列。所述VH CDR2可以包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区具有VH CDR3，所述VH CDR3包含SEQ ID NOS：8、11、 14、17、36、39、42、45、64、67、70或73的氨基酸序列。所述VH CDR3 可以包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQID NO：11的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含 SEQ ID NO：39的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列。所述VH CDR3 可以包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列。所述VHCDR3可以包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列。所述VH CDR3可以包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：6的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 7的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：9的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 10的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：12的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 13的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：15的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 16的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有抗原结合片段，所述抗原结合片段具有重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含：(1)具有SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VHCDR1；(2)具有SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)具有SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：37的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 38的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：40的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 41的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：43的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 44的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：62的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 63的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：65的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 66的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：67的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：68的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 69的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，其包含： (1)包含SEQID NO：71的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO： 72的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VH CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，其包含：包含SEQ IDNOS：18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83 的氨基酸序列的VL CDR1；和(2)包含SEQID NOS：19、22、25、28、 47、50、53、56、75、78、81或84的氨基酸序列的VL CDR2。在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含SEQ ID NOS：18、21、24、27、46、49、52、55、74、77、80或83的氨基酸序列的VL CDR1；和(3)包含SEQ ID NOS：20、23、26、29、48、51、 54、57、76、79、82或85的氨基酸序列的VL CDR3。在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，其包含：(2)包含SEQ ID NOS： 19、22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84的氨基酸序列的VL CDR2；和(3)包含SEQ ID NOS：20、23、26、29、48、51、54、57、76、79、 82或85的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有VL CDR1，所述VL CDR1包含18、21、24 27、46、 49、52、55、74、77、80或83的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQID NO：27的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含 SEQ ID NO：46的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：49 的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO： 77的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列。所述VL CDR1可以包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有VL CDR2，所述VL CDR2包含SEQ ID NOS：19、 22、25、28、47、50、53、56、75、78、81或84的氨基酸序列。所述VL CDR2 可以包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列。所述VLCDR2可以包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列。所述VL CDR2 可以包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ IDNO：53的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列。所述VL CDR2 可以包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列。所述VL CDR2可以包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有VL CDR3，所述VL CDR3包含SEQ ID NOS：20、 23、26、29、48、51、54、57、76、79、82或85的氨基酸序列。所述VL CDR3 可以包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列。所述VLCDR3可以包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列。所述VL CDR3 可以包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ IDNO：54的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列。所述VL CDR3 可以包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列。所述VL CDR3可以包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：25的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的分子具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：78的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区具有(1)包含SEQ ID NO：83的氨基酸序列的VL CDR1； (2)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的VL CDR3。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：19的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的VL CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含 SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO： 14的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：25 的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：27的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：29的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：34的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：36的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：47的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：48的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：49的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：50的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：51的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：40的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：42的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：52的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：53的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的分子具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：43的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：44的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：45的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：55的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：56的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的分子具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：62的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：63的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：74的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：75的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：76的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：65的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含 SEQ ID NO：66的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO： 67的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：78 的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：79的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：69的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：80的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：81的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：82的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有(a)重链可变(VH)区，其包含：(1)包含SEQ ID NO：71的氨基酸序列的VH CDR1；(2)包含SEQ ID NO：72的氨基酸序列的VH CDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：73的氨基酸序列的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，其包含：(1)包含 SEQ ID NO：83的氨基酸序列的VL CDR1；(2)包含SEQ ID NO：84的氨基酸序列的VLCDR2；和/或(3)包含SEQ ID NO：85的氨基酸序列的VL CDR3。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有VH区和VL区，所述VH区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述VL区具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有VH区和VL区，所述VH区具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列，所述VL区具有SEQ ID NO：32的氨基酸序列。所述分子可以是抗体。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗体具有VH区和VL区，所述VH区具有SEQ ID NO：58的氨基酸序列，所述VL区具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是单克隆抗体。所述抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的是抗体是命名为STC613的小鼠单克隆抗体，或其人源化抗体版本。人源化的STC613抗体可以包括本文描述的 STC613的VH区、VL区、或VH与VL区两者。人源化的STC613抗体还可以包含本文描述的STC613的六个CDR区(VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)。所述人源化的STC613抗体还可以包含少于STC613的六个CDR区。在某些实施方式中，所述人源化的 STC613抗体还可以包含STC613的一个、两个、三个、四个或五个CDR 区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3)。
在某些实施方式中，本文提供的是抗体是命名为STC626的小鼠单克隆抗体，或其人源化抗体版本。人源化的STC626抗体可以包括本文描述的 STC626的VH区、VL区、或VH与VL区两者。人源化的STC626抗体还可以包含本文描述的STC626的六个CDR区(VH CDR1、VHCDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)。所述人源化的STC626抗体还可以包含少于STC626的六个CDR区。在某些实施方式中，所述人源化的 STC626抗体还可以包含STC626的一个、两个、三个、四个或五个CDR 区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3)。
在某些实施方式中，本文提供的是抗体是命名为STC635的小鼠单克隆抗体，或其人源化抗体版本。人源化的STC635抗体可以包括本文描述的STC635的VH区、VL区、或VH与VL区两者。人源化的STC635抗体还可以包含本文描述的STC635的六个CDR区(VH CDR1、VHCDR2、 VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)。所述人源化的STC635抗体还可以包含少于STC635的六个CDR区。在某些实施方式中，所述人源化的STC635抗体还可以包含STC635的一个、两个、三个、四个或五个 CDR区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3)。
在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体是IgG、IgM、IgA、IgD 或IgE。在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体是IgG1、IgG2A、 IgG2B、IgG3或IgGM。
本领域技术人员已知的标准技术可以用于在编码本文提供的抗原结合片段或抗体的核苷酸序列中引入突变，包括，例如，定点诱变和产生氨基酸取代的PCR介导的诱变。在某些实施方式中，所述衍生物包括相对于原始分子的少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、或少于2个氨基酸取代。在具体的实施方式中，所述衍生物具有保守性氨基酸取代，其在一个或更多个预定的非关键氨基酸残基处进行。“保守性氨基酸替换”是在其中氨基酸残基被替换为具有相似电荷的侧链的氨基酸残基的一种替换。本领域已经定义了具有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括带有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链 (例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸) 的氨基酸。做为选择，可以沿着全部或部分编码序列随机地导入突变，例如，通过饱和诱变，可以筛选产生的突变体的生物学活性来鉴定保持了活性的突变体。在诱变之后，可以表达编码的蛋白质并且可以测定该蛋白质的活性。
在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体特异性地结合BTLA，并且具有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少 95％、或至少99％相同于鼠单克隆抗体STC613、STC626或STC635、或其抗原结合片段，例如，VH结构域或VL结构域的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体可以具有至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于SEQ ID NOS：2、4、30、32、58或60中描述的氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体具有VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列，所述VH CDR和/或VL CDR氨基酸序列至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少 75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％相同于上文表3、5或7中描述的VH CDR氨基酸序列和/或VL CDR氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体可以具有由一核苷酸序列编码的VH结构域的氨基酸序列和/或VL结构域的氨基酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下(例如，在大约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC) 中与滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)、或在本领域技术人员已知的其他严格条件下与编码表2、4或6 中描述的任一VH和/或VL结构域的核苷酸序列的互补物杂交(参见，例如，Ausubel,F.M.et al,eds.,1989,CurrentProtocols in Molecular Biology,Vol. I,Green Publishing Associates,Inc.andJohn Wiley&Sons,Inc.,New York at pages 6.3.1-6.3.6and 2.10.3)。
在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体可以具有由一核苷酸序列编码的VHCDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，所述核苷酸序列在严格条件下(例如，在大约45℃下在6×SSC中与滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)、或在本领域技术人员已知的其他严格条件下与编码表2、4或6中描述的任一VH CDR和 /或VL CDR的核苷酸序列的互补物杂交(参见，例如，Ausubel,F.M.et al, eds.,1989,Current Protocols in MolecularBiology,Vol.I,Green Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,NewYork at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3)。
在某些实施方式中，本文提供的还有分离的核酸，其编码表2、4或6 中描述的VHCDR的氨基酸序列或VL CDR的氨基酸序列，或在严格条件下(例如，在大约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤器结合的 DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)、或在本领域技术人员已知的其他严格条件下与编码表2、4或6中描述的任一VH CDR 和/或VL CDR的核苷酸序列的互补物杂交。
在某些实施方式中，本文提供的还有分离的核酸，其编码表2、4或6 中描述的VH结构域的氨基酸序列或VL结构域的氨基酸序列，或在严格条件下(例如，在大约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中与滤器结合的 DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)、或在本领域技术人员已知的其他严格条件下与编码表2、4或6中描述的任一VH和/或 VL结构域的核苷酸序列的互补物杂交。
在某些实施方式中，所述分离的核酸可以具有SEQ ID NO：3、31或 59的序列，或在严格条件下(例如，在大约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)中与滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％ SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC 中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)、或在本领域技术人员已知的其他严格条件下与SEQ ID NO：3、31或59的核苷酸序列的互补物杂交。
在某些实施方式中，所述分离的核酸可以具有SEQ ID NO：5、33或 61的序列，或在严格条件下(例如，在大约45℃下在6×氯化钠/柠檬酸钠 (SSC)中与滤器结合的DNA杂交，随后在约50-65℃下在0.2×SSC/0.1％ SDS中一次或更多次洗涤)、在高度严格条件下(例如，在约45℃下在6×SSC 中与滤器结合的核酸杂交，随后在约68℃下在0.1×SSC/0.2％SDS中一次或更多次洗涤)、或在本领域技术人员已知的其他严格条件下与SEQ ID NO： 5、33或61的核苷酸序列的互补物杂交。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以被化学修饰，例如，通过将任何类型的分子共价附着到所述抗体上。例如，而不是限制，抗体衍生物包括已经被化学修饰的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、PEG 化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解性裂解、连接到细胞配体或其他蛋白，等等。可以通过已知的技术进行各种化学修饰，包括但不限于特异性化学裂解、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成，等等。此外，所述抗体可以含有一个或多个非典型的氨基酸。
本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以具有本领域技术人员已知的框架区(例如，人类或非人类片段)。所述框架区可以是，例如，天然发生的或共有的框架区。在具体的实施方式中，本文提供的抗体的框架区是人类的 (人类框架区的列表参见，例如，Chothia et al,1998,J.Mol.Biol. 278:457-479，通过引用将其全部合并在本文中)。还参见Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest(U.S.Department ofHealth and Human Services,Washington,D.C.)5th ed。
通过交联分析绘制了STC613的BTLA表位。参见实施例7。表8概述了BTLA和STC613的交联的肽，其代表了STC613的BTLA表位(SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166)。附图6显示了STC613的BTLA 抗原(SEQ ID NO：86)的合成的表位：
IKRQSEHSILA(SEQ ID NO:167)—VKLEDRQTSWK(SEQ ID NO： 168)-NGSYRCSANFQ(SEQ ID NO：169)
表8：通过nLC-orbitrap MS/MS分析的BTLA(SEQ ID NO：86)与 STC613的交联的肽
Figure BDA0001750882220000421
*肽序列位置相对于SEQ ID NO：2和4的STC613氨基酸序列(蛋白质1)、以及SEQ IDNO：86的BTLA氨基酸序列(蛋白质2)标明。
因而，本文提供的还有竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文描述的BTLA表位的抗糖基化BTLA抗体。在某些实施方式中，本文提供的是竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)本文描述的STC613的 BTLA表位的抗糖基化BTLA抗体。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体特异性地结合本文描述的BTLA的表位。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体特异性地结合STC613的BTLA表位。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)BTLA表位，其中所述BTLA表位具有SEQ ID NOS： 161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸。所述BTLA的表位可以具有SEQ IDNOS：161、162、163、 164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个或至少十五个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少六个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少七个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、 166、167、168或169的氨基酸序列的至少八个连续氨基酸。所述BTLA 表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、167、168 或169的氨基酸序列的至少九个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少十个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、 163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少十一个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、 166、167、168或169的氨基酸序列的至少十二个连续氨基酸。所述BTLA 表位可以具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、167、168 或169的氨基酸序列的至少十三个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有 SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少十四个连续氨基酸。所述BTLA表位可以具有SEQ ID NOS： 161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的至少十五个连续氨基酸。所述抗糖基化BTLA抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体竞争地阻断(例如，以剂量依赖性方式)BTLA表位，其中所述BTLA表位具有SEQ ID NOS：161、 162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列。在某些实施方式中，本文提供的抗BTLA抗体具有特异性结合BTLA的表位的抗原结合片段，其中所述BTLA表位具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、 166、167、168或169的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO： 161的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO：162的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO：163的氨基酸序列。所述 BTLA的表位可以具有SEQ ID NO：164的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO：165的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有 SEQ ID NO：166的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO： 167的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列。所述BTLA的表位可以具有SEQ ID NO：169的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)BTLA表位，其中所述BTLA表位具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12、H16、K51、T57、S82或S86的一个或更多个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12、H16、K51、 T57、S82或S86的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12、H16、K51、T57、S82或 S86的一个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86) 的R12、H16、K51、T57、S82或S86的两个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12、H16、K51、T57、S82或S86 的三个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的 R12、H16、K51、T57、S82或S86的四个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12、H16、K51、T57、S82或S86的五个氨基酸。所述抗糖基化BTLA抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性方式)BTLA表位，其中所述BTLA表位具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12、H16、K51、T57、S82或S86的一个或更多个氨基酸。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的R12。所述BTLA 的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的H16。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ IDNO：86)的K51。所述BTLA的表位可以具有BTLA (SEQ ID NO：86)的T57。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO： 86)的S82。所述BTLA的表位可以具有BTLA(SEQ ID NO：86)的S86。所述抗糖基化BTLA抗体可以是人源化抗体。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有对糖基化 BTLA或其多肽、或多肽片段或表位的高亲和力。在一个实施方式中，本文提供的分子可以是抗BTLA抗体，其具有比已知抗体(例如，本文其它地方讨论的商业上可获得的单克隆抗体)更高的对BTLA的亲和力。在某些实施方式中，通过本文描述的技术或本领域技术人员已知的技术(例如，BIAcore分析)评估的，本文提供的抗BTLA抗体具有比已知的抗BTLA 抗体更高的2到10倍(或更多)的对BTLA抗原的亲和力。根据这些实施方式，在一个实施方式中，所述抗体的亲和力通过BIAcore分析来评估。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以以不超过1 μM、不超过100nM、不超过10nM、不超过1nM或不超过0.1nM的解离常数(KD)特异性结合糖基化BTLA或其糖基化的多肽片段或表位。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过500nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过200nM的 KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过100nM 的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过50 nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过20nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过10nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过5nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA 抗体具有不超过2nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化 BTLA抗体具有不超过1nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过0.5nM的KD。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体具有不超过0.1nM的KD。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以阻断或中和 BTLA的活性。所述抗糖基化BTLA抗体可以是中和抗体。所述中和抗体可以阻断BTLA与天然配体例如HVEM的结合，并抑制BTLA介导的信号途径和/或它的其他生理学活性。在中和分析(例如，ELISA)中，中和抗体的IC50可以在0.01-10μg/ml之间。中和抗体的IC50可以不超过10μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过8μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过6μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过4μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过2μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过1μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.8 μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.6μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.4μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.2μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.1μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.08μg/ml。中和抗体的 IC50可以不超过0.06μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.04μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.02μg/ml。中和抗体的IC50可以不超过0.01 μg/ml。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体特异性地结合糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75处糖基化的 BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置 N94处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N110处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75和N94处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75和N110处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N94和N110处糖基化的BTLA。在某些实施方式中和所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75、N94和N110处糖基化的 BTLA。
本文提供的抗糖基化BTLA抗体包括但不限于，合成的抗体、单克隆抗体、重组生产的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、内体、抗独特性(抗-Id)抗体，以及上述任一种的功能性片段。功能性片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv) (例如，包括单特异性、双特异性，等)、Fab片段、F(ab’)片段、F(ab)片段、F(ab’)2片段、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、Fd片段、Fv片段、二抗体、三抗体、四抗体和迷你抗体。
特别是，本文提供的抗糖基化BTLA抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有特异性结合BTLA或糖基化的 BTLA的抗原结合片段的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是任何类型 (例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子类。
本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性的抗体，或更多特异性的抗体。多特异性抗体可以特异于本文描述的 BTLA的不同表位，或可以特异于BTLA多肽以及异源表位，例如，异源多肽或固相支持物材料。在具体的实施方式中，本文提供的抗体是对BTLA 多肽的给定表位单特异性的，并且不结合其他表位。
通过已知的方式和如本文描述的，可以产生多克隆或单克隆抗体、抗原结合片段、以及结合结构域和CDR(包括任何上述的工程化的形式)，其特异于糖基化的BTLA、一个或更多个它的相应表位、或任一上述的缀合物，无论这样的抗原或表位是分离自天然来源还是所述天然化合物的合成衍生物或变体。
抗体可以产自任何动物来源，包括禽类和哺乳动物。在某些实施方式中，所述抗体是羊、鼠(例如，小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的。另外，更新的技术允许开发和筛选来自人类组合抗体文库的人类抗体。例如，噬菌体抗体表达技术容许在没有动物免疫的情况下产生特定的抗体，如美国专利No.6,946,546中描述的，通过引用将其完全合并在本文中。在Marks et al,Bio/Technol.,10:779-783(1992)；Stemmer,Nature, 370:389-391(1994)；Gram et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580 (1992)；Barbas et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)；和 Schier et al,Gene,169(2):147-155(1996)中进一步描述了这些技术，通过引用将它们完全合并在本文中。
在各种动物物种中生产多克隆抗体的方法，以及生产各种类型的单克隆抗体，包括人源化、嵌合或完全人类的单克隆抗体的方法是本领域公知的。例如，以下的美国专利提供了这些方法的实现说明，通过引用合并在文本中：美国专利Nos.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345； 4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855； 4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778； 5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332； 5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157； 6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572； 6,875,434；6,891,024；7,407,659；以及8,178,098，通过引用将它们完全合并在本文中。
在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体可以是单克隆抗体。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体可以是多克隆抗体。动物可以用抗原，例如，糖基化BTLA多肽接种以产生特异于糖基化的BTLA多肽的抗体。通常，抗原结合或缀合到另一种分子以增强免疫应答。缀合物可以是结合于抗原的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白物质，用于引发动物中的免疫应答。响应于抗原接种在动物中产生的抗体具有多种的不相同的分子 (多克隆抗体)，产自多个单独的抗体生产B淋巴细胞。给予动物中用于多克隆抗体生产的正确条件，动物的血清中的大部分抗体识别用来免疫动物的抗原性化合物上的集合表位。
这种特异性可以通过亲和力纯化、仅选择识别感兴趣的抗原或表位的那些抗体来进一步增强。产生单克隆抗体(MAb)的方法可以沿着制备多克隆抗体的相同路线开始。在某些实施方式中，啮齿动物例如小鼠和大鼠被用于产生单克隆抗体。在某些实施方式中，兔、绵羊、或蛙细胞被用于产生单克隆抗体。使用大鼠是公知的，可以提供某些优势。小鼠(例如， BALB/c小鼠)是常规使用的，一般得到更高百分比的稳定融合物。
杂交瘤技术涉及来自早先用糖基化BTLA多肽免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生的骨髓瘤细胞(通常为小鼠骨髓瘤)的融合。这种技术提供了一种方法来将单一的抗体生产细胞增殖到无数的世代，从而可以生产无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构上相同的抗体(单克隆抗体)。
抗糖基化BTLA抗体可以通过本领域已知的用于生产多肽的任何方法，例如，体外合成、重组DNA生产等来产生。人源化的抗体可以通过重组 DNA技术来产生。本文描述的抗体还可以使用重组免疫球蛋白表达技术来产生。免疫球蛋白分子，包括人源化抗体的重组生产在美国专利No. 4,816,397(Boss et al)、美国专利Nos.6,331,415和4,816,567(都为Cabilly et al)、英国专利GB 2,188,638(Winter et al)和英国专利GB 2,209,757中描述；通过引用将它们完全合并在本文中。免疫球蛋白，包括人源化免疫球蛋白的重组表达的技术还可见于Goeddel et al,Gene Expression Technology Methods in EnzymologyVol.185Academic Press(1991)和 Borreback,Antibody Engineering,W.H.Freeman(1992)通过引用将它们完全合并在本文中。关于重组抗体的产生、设计和表达的其他信息可以在 Mayforth,Designing Antibodies,Academic Press,San Diego(1993)中找到。
已经开发了一些方法来用人类来源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定区，保留完整的外源抗体的可变区。做为选择，在人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或大鼠中生产完全的人类单克隆抗体。通过重组地构建具有啮齿动物和人类氨基酸序列两者的抗体可变域，还开发了一些方法来将单克隆抗体的可变域转变为更为人类的形式。在人源化单克隆抗体中，仅有高变的CDR来源于非人类(例如，小鼠、大鼠、鸡、美洲驼)单克隆抗体，框架区来源于人类氨基酸序列。据认为，用在人抗体的相应位置中发现的氨基酸序列替换抗体中具有啮齿动物特征的氨基酸序列将降低治疗使用期间不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可以经历遗传突变或其他变化，其可以改变或不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
通过使用单克隆和其他抗体和重组DNA技术，可以产生工程化抗体，以产生保留原始抗体的抗原或表位特异性的其他抗体或嵌合分子，即该分子具有结合结构域。这样的技术可以涉及将编码免疫球蛋白可变区或抗体的 CDR的DNA导入不同抗体的框架区、恒定区或恒定区加框架区的遗传材料中。参见，例如，美国专利No.5,091,513和6,881,557，通过引用合并在本文中。
在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体是人类抗体。人类抗体可以通过本领域已知的各种方法产生，包括如上所述使用来源于人免疫球蛋白序列的抗体库的噬菌体展示方法(参见，美国专利Nos.4,444,887和 4,716,111；和国际公开Nos.WO 98/46645、WO98/50433、WO 98/24893、 WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、以及WO 91/10741)。也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白、但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来产生人类抗体。例如，人类重链和轻链免疫球蛋白复合体可以随机地或通过同源重组导入小鼠胚胎干细胞中。做为选择，除了人类重链和轻链基因之外，人类可变区、恒定区和多变区可以被导入小鼠胚胎干细胞。小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因可以通过同源重组导入人免疫球蛋白基因座来单独地或同时地变得无功能。特别地，JH区域的纯合删除防止内源抗体产生。修饰的胚胎干细胞被扩增并微注射到胚泡中来产生嵌合的小鼠。然后培育嵌合小鼠来产生表达人类抗体的纯合后代。以常规的方法用选定的抗原，例如糖基化BTLA多肽的全部或一部分，来免疫转基因小鼠。针对所述抗原的单克隆抗体可以利用常规的杂交瘤技术从所述免疫的转基因小鼠获得(参见，例如，美国专利No.5,916,771)。由转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重排，随后经历种类转变和体细胞突变。因而，利用这种技术，可以产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE 抗体。对于生产人类抗体的这种技术的综述，参见Lonberg和Huszar(1995， Int.Rev.Immunol.,13:65-93，通过引用将其全部合并在本文中)。对于生产人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术和生产这种抗体的方案的详细论述，参见，例如国际公开WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利No.5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、 5,814,318和5,939,598，通过引用将它们完全合并在本文中。此外，可以雇佣例如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)公司使用类似上述的技术来提供针对选定抗原的人类抗体。
在一个实施方式中，所述抗体是嵌合抗体，例如，包含移植到异源非人类、人类或人源化序列(例如，框架和/或恒定区序列)的、来自非人类供体的抗原结合序列的抗体。在一个实施方式中，所述非人类供体是大鼠。在一个实施方式中，抗原结合序列是合成的，例如，通过诱变获得的(例如，人类噬菌体文库的噬菌体展示筛选，等)。在一个实施方式中，本文提供的嵌合抗体具有鼠的V区和人类的C区。在一个实施方式中，所述鼠的轻链V区融合到人类的kappa轻链。在一个实施方式中，所述鼠的重链V 区融合到人类的IgG1C区。
产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison,Science 229:1202(1985)；Oi et al,BioTechniques 4:214(1986)；Gillies et al,J.Immunol. Methods125:191-202(1989)；以及美国专利Nos.6,311,415、5,807,715、 4,816,567和4,816,397；所有这些通过完全引用合并在本文中。包含来自非人类物种的一个或更多个CDR以及来自人免疫球蛋白分子的框架区的嵌合抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生，例如，CDR移植(EP 239,400；国际公开No.WO 91/09967；以及美国专利Nos.5,225,539、5,530,101和5,585,089)，饰面或表面重修(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,Molecular Immunology28(4/5):489-498(1991)；Studnicka et al,Protein Engineering 7:805(1994)；和Roguska et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969(1994))，以及链混洗(美国专利No.5,565,332)；所有这些通过完全引用合并在本文中。
生产重组的嵌合抗糖基化BTLA抗体的示范性的过程可以包括以下的：a)通过常规的分子生物学方法构建表达载体，所述表达载体编码并表达抗体重链，其中鼠抗糖基化BTLA单克隆抗体的CDR和可变区融合到衍生自人免疫球蛋白的Fc区，从而产生用于表达嵌合抗体重链的载体；b) 通过常规的分子生物学方法构建表达载体，所述表达载体编码并表达鼠抗糖基化BTLA单克隆抗体的抗体轻链，从而产生用于表达嵌合抗体轻链的载体；c)通过常规的分子生物学方法将所述表达载体传递给宿主细胞，产生用于表达嵌合抗体的转染的宿主细胞；以及d)通过常规的细胞培养技术培养所述转染的细胞以产生嵌合抗体。
生产重组的人源化抗糖基化BTLA抗体的示范性的过程可以包括以下的：a)通过常规的分子生物学方法构建表达载体，所述表达载体编码并表达抗体重链，其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变区框架的最小部分来源于非人类免疫球蛋白，例如，鼠抗糖基化BTLA单克隆抗体，抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体重链的载体；b)通过常规的分子生物学方法构建表达载体，所述表达载体编码并表达抗体轻链，其中保持供体抗体结合特异性所需的CDR和可变区框架的最小部分来源于非人类免疫球蛋白，例如，鼠抗糖基化BTLA单克隆抗体，抗体的其余部分来源于人免疫球蛋白，从而产生用于表达人源化抗体轻链的载体；c)通过常规的分子生物学方法将所述表达载体传递给宿主细胞，产生用于表达人源化抗体的转染的宿主细胞；以及d)通过常规的细胞培养技术培养所述转染的细胞以产生人源化抗体。
对于任一种示范性的方法，宿主细胞可以用这样的表达载体共转染，所述表达载体可以含有不同的可选择标记，但是除了所述重链和轻链编码序列之外，所述表达载体优选地是相同的。这一过程提供了重链和轻链多肽的相等的表达。做为选择，可以使用单一载体，其编码重链和轻链多肽两者。重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA或两者。用于表达重组抗体的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌，或更优选的是真核细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK-293细胞)。表达载体的选择取决于宿主细胞的选择，可以被选择以具有在选定宿主细胞中期望的表达和调节特征。可以使用其他细胞系包括但不限于CHO-K1、NSO 和PER.C6(Crucell,Leiden,Netherlands)。此外，在选择宿主细胞时可以优化密码子利用率以应对物种特异性密码子利用率偏差和增强蛋白质表达。例如，对于CHO细胞表达，编码抗体的DNA可以掺入Cricetulus griseus (中国仓鼠卵巢细胞由其衍生)优先使用的密码子。可以采用密码子优化方法来促进期望的宿主细胞的改善的表达(参见，例如，Wohlgemuth et al, Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.366(1580):2979-2986(2011)；Jestin et al,J.Mol.Evol.69(5):452-457(2009)；Bollenbach et al,Genome Res.17 (4):401-404(2007)；Kurland et al,Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.31:191-219(1984)；Grosjean et al.,Gene 18(3):199-209(1982))。
在一个实施方式中，所述抗体是衍生自骆驼抗体的免疫球蛋白单可变域，优选地来自缺乏轻链的重链骆驼抗体，其被称为VHH结构域序列或 NanobodiesTM。NanobodyTM(Nb)是天然发生的单链抗体的最小的功能性片段或单可变域(VHH)，是本领域的技术人员已知的。它们衍生自骆驼中存在的仅有重链的抗体(Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448 (1993)；Desmyter et al,Nat.Struct.Biol,803-811(1996))。在“骆驼”的科中，存在缺乏轻多肽链的免疫球蛋白。“骆驼”包括旧世界的骆驼(Camelus bactrianus和Camelus dromedarius)，以及新世界的骆驼(例如，Lama paccos、 Lama glama、Lamaguanicoe和Lama vicugna)。单可变域重链抗体在本文中称为NanobodyTM或VHH抗体。对于识别罕有的或隐藏的表位，以及对于结合到蛋白质靶点的腔内或活性位点，Nbs的小体积和独特的生物物理学性质超越的常规的抗体片段。进一步的，Nbs可以被设计为多特异性和多价的抗体、附着于报告分子、或人源化。Nbs是稳定的，在胃肠系统中存活，可以容易地制造。
将不同特异性的两个抗原结合位点统一到单个构建体中，双特异性抗体具有将两种不同的抗原以精巧的特异性集合在一起的能力，因而具有作为治疗试剂的很大潜力。双特异性抗体可以通过融合两个杂交瘤来原初地制备，每个杂交瘤能够产生不同的免疫球蛋白。双特异性抗体还可以通过连接两个scFv抗体片段同时省略完整免疫球蛋白中存在的Fc部分来产生。这样的构建体中每个scFv单位可以由来自每条重(VH)和轻(VL)抗体链的一个可变域组成，通过合成的多肽接头相互连接，接头常常进行遗传工程化以具有最小的免疫原性同时保持对蛋白水解的最大抗性。相应的 scFv单元可以通过许多技术来连接，包括掺入短的(通常小于10个氨基酸) 多肽间隔区桥接两个scFv单元，从而产生双特异性单链抗体。因而，产生的双特异性单链抗体是在单个多肽链上含有不同特异性的两个VH/VL配对的物质，其中相应scFv单元中的VH和VL结构域被足够长的多肽接头分隔，以容许这两个结构域之间的分子内缔合，并且其中由此形成scFv单元通过保持足够短的多肽间隔区彼此连续地拴系在一起，以防止例如一个 scFv单元的VH结构域与另一个scFv单元的VL之间不希望的缔合。
抗原结合片段的实例无限制地包括：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的“Fv”片段；(iv)由VH结构域组成的“dAb”片段；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，一种包含两个连接的Fab 片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，容许两个结构域缔合形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(美国专利No.5,091,513)；以及(ix)双抗体，通过基因融合构建的多价或多特异性的片段(美国专利申请公开No.20050214860)。 Fv、scFv或双抗体分子可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫键来稳定化。还可以制备迷你抗体，其具有连接到CH3结构域的scFv(Hu et al, CancerRes.,56:3055-3061(1996))。
抗体样结合肽模拟物也是一些实施方式中期待的。Liu et al,Cell Mol. Biol,49:209-216(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiPs ABiPs)，其是作为弱化抗体起作用的肽，具有血清半衰期更长的某些优点，以及较不麻烦的合成方法。
7.2.2.糖基化的BTLA多肽
在又进一步的实施方式中，提供了组合物，其包含多肽，所述多肽包含人BTLA的至少7个(例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20个或更多个)连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的，其中所述多肽被配制在药学上可接受的载体中。
在某些实施方式中，本文提供的还有人BTLA的至少7个连续氨基酸的多肽，其具有至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的。在某些实施方式中，所述多肽具有人BTLA的至少7个连续氨基酸，其具有相应于糖基化的位置N75的氨基酸。在某些实施方式中，所述多肽具有人BTLA的至少7个连续氨基酸，其具有相应于糖基化的位置N94的氨基酸。在某些实施方式中，所述多肽具有人BTLA的至少7个连续氨基酸，其具有相应于糖基化的位置N110的氨基酸。
例如，所述多肽可以是人BTLA的氨基酸70-76的片段，其中N75是糖基化的。另一个例子，所述多肽可以是人BTLA的氨基酸90-100的片段，其中N94是糖基化的。又一个例子，所述多肽可以是人BTLA的氨基酸 90-115的片段，其中N94和N110是糖基化的。本领域的普通技术人员将理解本文期待的多肽包括任何和全部多肽，所述多肽具有包括至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸的、人BTLA的至少7个连续氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的。
在某些实施方式中，所述多肽具有人BTLA的至少8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19或20个连续氨基酸。在某些实施方式中，所述多肽具有人BTLA的至少25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、或270、280个连续氨基酸。在某些实施方式中，本文提供的是具有至少两种本文提供的多肽的组合物。所述至少两种多肽可以是独立的分子，或被连接为一个分子。在某些实施方式中，所述组合物具有至少三种多肽、至少四种多肽、或至少五种多肽。在某些实施方式中，所述组合物具有两种多肽、三种多肽、四种多肽、或五种多肽。
在某些实施方式中，本文提供的多肽包括非天然氨基酸。在某些实施方式中，所述非天然氨基酸是在α-氨基基团处甲基化的，以产生具有甲基化主干的肽。在某些实施方式中，所述非天然氨基酸是R-氨基酸。在某些实施方式中，所述非天然氨基酸可以包括染料(例如，荧光染料)或亲和标签。在某些实施方式中，本文提供的多肽包括化学修饰。化学修饰包括，例如，用生物素、荧光染料化学修饰。熟练技术人员将认识到，向多肽中导入非天然氨基酸的方法以及化学修饰多肽的方法是本领域公知的。
在某些实施方式中，所述实施方式的多肽融合或缀合到免疫原性多肽 (例如，钥孔血蓝素，KLH)。在某些方面，所述多肽进一步包含处在C- 末端或N-末端的Cys残基。例如，在某些方面，所述多肽通过Cys残基处的二硫键缀合到免疫原性多肽。
在又进一步的实施方式中，本文提供了包含多肽的免疫原性组合物，所述多肽包含人BTLA的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段包含至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的，其中所述多肽被配制在药学上可接受的载体中。在某些实施方式中，以及在某些方面，所述免疫原性组合物进一步包含佐剂，例如白矾或弗氏佐剂。
在某些实施方式中，提供了制造抗体的方法，其包括向动物施用多肽并从所述动物分离所述抗体，其中所述多肽具有人BTLA的至少7个连续氨基酸的片段，所述片段具有至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94 或N110的氨基酸，以及其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、 N94或N110的氨基酸是糖基化的。所述动物可以是小鼠、大鼠、兔或人。在某些方面，方法进一步包括鉴定所述抗体的CDR并将围绕所述CDR的序列人源化来产生人源化抗体。在再进一步的方面，所述方法包括重组地表达所述人源化抗体。因而，在进一步的实施方式中，提供了通过上述方法产生的分离的抗体。因而，在某些实施方式中，本文提供的是相对于未糖基化的BTLA选择性结合所述实施方式的多肽(例如，包含人BTLA的至少7个连续氨基酸的片段的多肽，所述片段包含至少一个相应于人BTLA 的位置N75、N94或N110的氨基酸，其中所述至少一个相应于人BTLA的位置N75、N94或N110的氨基酸是糖基化的)的分离的抗体。
本文提供的多肽可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，所述多肽可以通过化学合成或重组生产制备。表达和纯化重组多肽的示范性的方法可见于，例如，ScopesR.K.,Protein Purification-Principles and Practice, Springer Advanced Texts inChemistry,3r Edition(1994)；Simpson R.J.et al, Basic Methods in ProteinPurification and Analysis:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1st Edition(2008)；Green M.R.and Sambrook J.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,4st Edition(2012)；JensenK.J.et al,Peptide Synthesis and Applications(Methods in Molecular Biology),Humana Press,2nd Edition (2013)。多肽的化学合成可以使用本领域公知的方法实现(参见Kelley and Winkler,1990,In:Genetic Engineering Principles and Methods,Setlow J.K, ed.,Plenum Press,N.Y.,Vol.12,pp 1-19；Stewart et al,1984,J.M.Young,J.D., Solid Phase Peptide Synthesis,Pierce Chemical Co.,Rockford,111；Marglin and Merrifield,Ann.Rev.Biochem,39:841-866,at 862(1970).Merrifield,R.B., 1963,J.Am.Chern.Soc.85:2149-2154；Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,Williams et al,Eds.,1997,CRC Press,BocaRaton Fla.；Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,Atherton&Sheppard, Eds.,1989,IRL Press,Oxford,England；还参见USPNs.4,105,603；3,972,859；3,842,067；和3,862,925)。
7.2.3修饰物和衍生物
针对糖基化BTLA的抗体可以具有中和或对抗糖基化BTLA的作用的能力，与动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源无关。对于产生治疗抗体某些动物物种可能是较不优选的，因为由于通过抗体的Fc部分的补体系统活化，它们可能更可能导致过敏反应。然而，完整抗体可以酶消化成 Fc(补体结合)片段，和具有结合结构域或CDR的抗体片段。除去Fc部分降低了抗体片段引发不希望的免疫反应的可能性，因而，没有Fc的抗体可以用于预防或治疗处理。如上所述，抗体还可以构建为嵌合的、部分或完全人类的，以降低或消除有害的免疫学后果，所述后果来自向动物施用产自其他物种或具有来自其他物种的序列的抗体。
抗糖基化BTLA抗体的结合性质可以通过筛选展现期望性质的变体来进一步改进。例如，可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来进行这样的改进。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在噬菌体颗粒的表面，噬菌体颗粒携带编码它们的多核苷酸序列。在特定的实施方式中，可以利用这样的噬菌体来展示从全集或组合抗体文库(例如，人类或鼠的) 表达的抗原结合片段，例如，Fab和Fv或二硫键稳定的Fv。表达与目标抗原结合的抗原结合片段的噬菌体可以用抗原来选择或鉴定，例如，使用标记的抗原或者结合或捕获在固体表面或珠子上的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是丝状噬菌体，包括fd和M13。所述抗原结合片段作为与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合的蛋白来表达。可以用于制造本文描述的抗体或多肽的噬菌体展示方法的实例包括在Brinkman et al,JImmunol Methods,182:41-50(1995)；Ames et al,J.Immunol.Methods,184:177-186(1995)；Kettleborough et al,Eur.J.Immunol,24:952-958(1994)；Persic et al, Gene,187:9-18(1997)；Burton et al,Adv.Immunol.57:191-280(1994)；PCT 公开WO 92/001047；WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；以及美国专利Pat. Nos.5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753； 5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743 和5,969,108；中公开的那些，所有这些通过完全引用合并在本文中。
如在上述参考文献中描述的，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并用于产生完整的抗体，包括人源化抗体、或任何其他希望的片段，并在任何希望的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，使用本领域已知的方法，还可以采用重组地产生Fab、Fab'和F(ab’)2片段的技术，例如，在PCT公开WO 92/22324；Mullinax,R.L.et al,BioTechniques,12 (6):864-869(1992)；和Sawai et al,Am.J.Reprod.Immunol.34:26-34(1995)；以及Better,M.etal.Science 240:1041-1043(1988)；中公开的那些，所有这些通过完全引用合并在本文中。可以用于产生单链Fv和抗体的技术的实例包括在美国专利Nos.4,946,778和5,258,498；Huston,J.S.et al,Methods in Enzymology 203:46-88(1991)；Shu,L.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) 90:7995-7999；以及Skerra.A.et al,Science 240:1038-1040(1988)中公开的那些；所有这些通过完全引用合并在本文中。
噬菌体展示技术可以用于提高本文描述的抗糖基化BTLA抗体的亲和力。这种技术可以用于获得可在本文描述的组合方法中使用的高亲和力抗体。称为亲合成熟的这种技术采用诱变或CDR行走，并使用这样的受体或配体(或它们的细胞外结构域)或其抗原性片段重新选择，来鉴定与初始或亲本抗体相比以更高亲和力结合抗原的抗体(参见，例如，Glaser,S.M.et al,J.Immunol.149:3903-3913(1992))。诱变整个密码子而不是单个核苷酸产生半随机化的氨基酸突变全集。可以构建由变体克隆的池组成的文库，每个克隆在单个CDR中相差单个氨基酸改变，其含有代表每个CDR残基的每种可能的氨基酸取代的变体。具有对抗原的提高的结合亲和性的突变体可以通过使固定化的突变体与标记的抗原接触来筛选。本领域已知的任何筛选方法可以用于鉴定具有对抗原提高的亲和性的突变抗体(例如， ELISA)(参见，例如，Wu,H.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)95 (11):6037-6042(1998)；Yelton,D.E.et al,J.Immunol.155:1994-2004 (1995)。还可以使用使得轻链随机化的CDR行走(参见，Schier et al,J.Mol Biol.263:551-567(1996))。
随机诱变可以与噬菌体展示方法一起使用来鉴定改进的CDR和/或可变区。通过直接诱变(例如，亲合成熟或“CDR行走”)，噬菌体展示技术做为选择可以用于提高(或降低)CDR亲和力。这种技术使用目标抗原或其抗原性片段来鉴定具有CDR的抗体，当与初始或亲本抗体相比时其以更高 (或更低)的亲和力结合抗原(参见，例如，Glaser,S.M.et al,J.Immunol. 149:3903-3913(1992))。
实现这种亲合成熟的方法描述于，例如：Krause,J.C.et al,MBio.2(1) pii:e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10(2011)；Kuan,C.T.et al,Int.J. Cancer10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.et al,J.Mol.Biol.401(1):84-96 (2010)；Montgomery,D.L.et al,MAbs l(5):462-474(2009)；Gustchina, E.et al,Virology 393(1):112-119(2009)；Finlay,W.J.et al,J.Mol.Biol.388 (3):541-558(2009)；Bostrom,J.et al,Methods Mol.Biol.525:353-376 (2009)；Steidl,S.et al,Mol.Immunol.46(1):135-144(2008)；和Barderas, R.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)105(26):9029-9034(2008)；所有这些通过完全引用合并在本文中。
本文提供的还由抗糖基化BTLA抗体糖基化BTLA多肽的衍生物，其具有相对于“亲本”(或野生型)分子的一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代、添加、删除或修饰。这样的氨基酸取代或添加可以导入天然发生的(即，DNA编码的)或非天然发生的氨基酸残基。这样的氨基酸可以是糖基化的(例如，具有改变的甘露糖、2-N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖、唾液酸、5-N-乙酰神经氨酸、5-羟乙酰神经氨酸等的含量)、乙酰化的、聚乙二醇化的、磷酸化、酰胺化的、通过已知的保护/封闭基团衍生化的、蛋白水解裂解的、与细胞配体或其他蛋白连接的，等。在某些实施方案中，改变的碳水化合物修饰调节以下一种或多种：抗体的溶解、促进亚细胞转运和抗体的分泌、促进抗体装配、构象完整性和抗体介导的效应物功能。在一些实施方案中，相对于缺乏碳水化合物修饰的抗体，改变的碳水化合物修饰增强抗体介导的效应物功能。引起改变的抗体介导的效应物功能的碳水化合物修饰是本领域公知的(例如，参见，Shields,R.L. et al,J.Biol.Chem.277(30):26733-26740(2002)；Davies J.et al. Biotechnology&Bioengineering 74(4):288-294(2001)；所有这些通过完全引用合并在本文中)。改变碳水化合物含量的方法是本领域技术人员已知的，参见，例如，Wallick,S.C.et al,J.Exp.Med.168(3):1099-1109(1988)； Tao,M.H.et al,J.Immunol.143(8):2595-2601(1989)；Routledge,E.G.et al,Transplantation 60(8):847-53(1995)；Elliott,S.et al,Nature Biotechnol 21:414-21(2003)；Shields,R.L.etal,J.Biol.Chem.277(30):26733-26740 (2002)；所有这些通过完全引用合并在本文中。
取代变体可以含有处于本文提供的抗体或多肽内的一个或更多个位点处一个氨基酸对另一个氨基酸的改变，可以被设计以调节所述抗体或多肽的一种或更多种性质，有或者没有其他功能或性质的损失。取代可以是保守的，也就是说，一个氨基酸被替换为具有类似形状和电荷的氨基酸。保守性替换是本领域公知的，包括，例如：丙氨酸变为丝氨酸；精氨酸变为赖氨酸；天冬酰胺变为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸变为谷氨酸；半胱氨酸变为丝氨酸；谷氨酰胺变为天冬酰胺；谷氨酸变为天冬氨酸；甘氨酸变为脯氨酸；组氨酸变为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸变为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸变为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸变为精氨酸；甲硫氨酸变为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸变为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸变为苏氨酸；苏氨酸变为丝氨酸；色氨酸变为酪氨酸；酪氨酸变为色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸变为异亮氨酸或亮氨酸。做为选择，取代可以是非保守的，从而影响所述多肽的功能或活性。非保守的改变一般涉及用化学上不同的残基取代残基，例如，极性或带电的氨基酸取代非极性或不带电的氨基酸，反之亦然。
在某些实施方式中，人源化抗体是衍生的抗体。这样的人源化抗体包括一个或更多个非人类CDR中的氨基酸残基取代、删除或添加。当与非衍生的人源化抗体相比时，人源化抗体衍生物基本上具有相同的结合、更好的结合或更差的结合。在某些实施方式中，CDR的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被突变，例如，取代、删除或添加。
在某些实施方式中，多肽是衍生的多肽。这样的多肽包括相比野生型人BTLA的氨基酸残基取代、删除或添加。与非衍生的多肽相比，衍生的多肽基本上具有对抗糖基化BTLA抗体的相同的结合、更好的结合或更差的结合。在某些实施方式中，人BTLA的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被突变，例如，取代、删除或添加。
本文描述的抗体或多肽可以使用本领域技术人员已知的技术通过化学修饰来修饰，包括但不限于，特异性化学裂解、乙酰化、配制、衣霉素的代谢合成，等。在一个实施方式中，衍生多肽或衍生抗体具有与亲本多肽或抗体相似或相同的功能。在另一个实施方式中，衍生多肽或衍生抗体展现了相对于亲本多肽或亲本抗体改变的活性。例如，衍生抗体(或其片段) 可以比亲本抗体更紧密地结合它的表位或对蛋白水解作用更有抗性。
衍生抗体中的取代、添加或删除可以在抗体的Fc区中，因而可以用来修饰抗体对一种或更多种FcγR的结合亲和性。修饰抗体以修改对一种或更多种FcyR的结合的方法是本领域已知的，参见，例如，PCT公开Nos.WO 04/029207,WO 04/029092、WO 04/028564、WO99/58572、WO 99/51642、 WO 98/23289、WO 89/07142、WO 88/07089,和美国专利Nos.5,843,597和 5,642,821；所有这些通过完全引用合并在本文中。在某些实施方式中，所述抗体或其他分子可以具有对于活化FcγR例如FcγRIIIA的改变的亲和力。优选地，这样的修饰还具有改变的Fc介导的效应物功能。影响Fc介导的效应物功能的修饰是本领域公知的(参见美国专利No.6,194,551和 WO00/42072)。在某些实施方式中，Fc区的修饰产生的抗体具有改变的抗体介导的效应物功能、对其他Fc受体(例如，Fc活化受体)的改变的结合、改变的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ACDD)活性、改变的C1q结合活性、改变的补体依赖性细胞毒性活性(CDC)、吞噬活性、或其任何组合。
衍生抗体或多肽还可以具有在哺乳动物，优选的人类中亲本分子或抗体的改变的半衰期(例如，血清半衰期)。在某些实施方式中，这样的改变产生大于15天、优选的大于20天、大于25天、大于30天、大于35天、大于40天、大于45天、大于2个月、大于3个月、大于4个月或大于5 个月的半衰期。人源化抗体或多肽在哺乳动物优选人类中提高的半衰期，产生在所述哺乳动物中所述抗体或多肽的更高的血清滴度，降低施用所述抗体或多肽的频率，和/或降低要施用的所述抗体或多肽的浓度。具有提高的体内半衰期的抗体或多肽可以通过本领域技术人员已知的技术产生。例如，具有提高的体内半衰期的抗体或多肽可以通过修饰(例如，取代、删除或添加)被鉴定为涉及Fc结构域与FcRn受体之间相互作用的氨基酸残基来产生。本文描述的人源化抗体可以被工程化以提高生物学半衰期(参见，例如，美国专利No.6,277,375)。例如，本文描述的人源化抗体可以在 Fc-铰链结构域中工程化以具有提高的体内或血清半衰期。
具有提高的体内半衰期的本文描述的抗体或多肽可以通过在所述抗体或多肽上附着聚合物分子例如高分子量聚乙二醇(PEG)来产生。通过PEG 与所述分子或抗体的N-或C-末端的位点特异性结合，或通过赖氨酸残基上存在的epsilon-氨基基团，使用或不使用多功能接头，PEG可以附着到所述抗体或多肽上。可以使用线性或分枝的聚合物衍生化，其产生最小的生物学活性损失。结合的程度可以通过SDS-PAGE和质谱来紧密地监视，以确保PEG分子与所述抗体的适当的结合。通过例如分子排阻或离子交换层析，未反应的PEG可以从抗体-PEG缀合物中分离。
本文描述的抗体或多肽还可以通过Davis等(参见美国专利No. 4,179,337)描述的方法和偶联试剂来修饰，以提供可以被注入哺乳动物循环系统而基本上没有免疫原性反应的组合物。除去Fc部分可以降低抗体片段引发不希望的免疫反应的可能性，因而，没有Fc的抗体可以用于预防或治疗处理。如上所述，抗体还可以构建为嵌合的、部分或完全人类的，以降低或消除有害的免疫学后果，所述后果来自向动物施用产自其他物种或具有来自其他物种的序列的抗体。
7.2.4.融合物和缀合物
本文提供的抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽还可以与其他蛋白一起表达为融合蛋白，或化学地缀合到另一个部分。
在某些实施方式中，本文提供的是具有Fc部分的抗体或多肽，其中所述Fc部分可以在同种型或子类上不同，可以是嵌合的或杂合的，和/或可以被修饰，例如，以改善效应物功能、半衰期控制、组织可接近性，增大生物物理学特性，例如，稳定性，以及改善生产效率(以及更低成本)。构建所公开的融合蛋白中有用的许多修饰以及制造它们的方法是本领域已知的，参见，例如，Mueller,J.P.et al,Mol.Immun.34(6):441-452(1997), Swann,P.G.,Curr.Opin.Immun.20:493-499(2008),and Presta,L.G.,Curr. Opin.Immun.20:460-470(2008)。在某些实施方式中，所述Fc区是天然的 IgG1、IgG2或IgG4Fc区。在某些实施方式中，所述Fc区是杂合体，例如，具有IgG2/IgG4Fc恒定区的嵌合的。对Fc区的修饰包括但不限于，修饰的IgG4以防止与Fc gamma受体和补体结合，修饰的IgG1以改善与一种或更多种Fcgamma受体的结合，修饰的IgG1以最小化效应物功能(氨基酸改变)，改变的或没有聚糖的IgG1(一般通过改变表达宿主)，以及具有对FcRn的改变的pH值依赖性结合的IgG1。所述Fc区可以包括整个绞链区，或少于整个的绞链区。
另一个实施方式包括降低了对FcR的结合的IgG2-4杂合物以及IgG4 突变体，这提高了它们的半衰期。代表性的Ig2-4杂合物以及IgG4突变体在Angal et al,Molec.Immunol.30(1):105-108(1993)；Mueller et al,Mol. Immun.34(6):441-452(1997)和美国专利No.6,982,323中描述，所有这些通过完全引用合并在本文中。在某些实施方式中，IgG1和/或IgG2结构域被删除，例如，Angal等人描述了丝氨酸241替换为脯氨酸的IgG1和IgG2。
在某些实施方式中，本文提供的是具有至少10个、至少20个、至少 30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个或至少100个氨基酸的融合蛋白或多肽。
在某些实施方式中，本文提供的是抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA 多肽，其与至少一种部分连接或共价结合或形成复合物。这样的这样的可以是，但不限于，提高分子作为诊断试剂或治疗试剂的效力的部分。在某些实施方式中，所述部分可以是成像试剂、毒素、治疗性的酶、抗生素、放射性标记的核苷酸，等。
本文提供的分子可以包括治疗部分(或一个或更多个治疗部分)。本文提供的分子可以缀合或重组地融合到治疗部分的抗体，所述治疗部分例如细胞毒素，例如细胞抑制性或杀细胞性试剂，治疗试剂或放射性金属离子，例如α-发射体。细胞毒素或细胞毒试剂包括对细胞有害的的任何试剂。治疗部分包括但不限于，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)；烷化剂(例如，甲二氯二乙胺、噻替派、苯丁酸氮芥、米尔法兰、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺合铂(II)(DDP)、和顺铂)；蒽环类(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素)和多柔比星)；抗生素(例如，d放线菌素(以前的纳霉素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))；Auristatin分子(例如，auristatin PHE、 auristatin F、单甲基auristatin E、苔藓抑素(bryostatin)1和solastatin 10；参见，Woyke et al,Antimicrob.Agents Chemother.46:3802-8(2002),Woyke et al,Antimicrob.AgentsChemother.45:3580-4(2001),Mohammad et al, Anticancer Drugs 12:735-40(2001),Wall et al,Biochem.Biophys.Res. Commun.266:76-80(1999),Mohammad et al,Int.J.Oncol.15:367-72(1999)，所有这些通过引用合并在本文中)；激素(例如，糖皮质素、孕酮、雄激素和雌激素)、DNA修复酶抑制物(例如，依托泊苷或托泊替康)、激酶抑制物(例如，化合物ST1571、imatinib mesylate(Kantarjian et al,Clin Cancer Res. 8(7):2167-76(2002))；细胞毒性试剂(例如，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、萘心安和嘌呤霉素，以及类似物或同源物，和在美国专利No.6,245,759、6,399,633、6,383,790、6,335,156、6,271,242、6,242,196、 6,218,410、6,218,372、6,057,300、6,034,053、5,985,877、5,958,769、5,925,376、 5,922,844、5,911,995、5,872,223、5,863,904、5,840,745、5,728,868、5,648,239、 5,587,459中公开的那些化合物)；法呢基转移酶抑制物(例如，R115777、 BMS-214662，和例如美国专利No.6,458,935、6,451,812、6,440,974、 6,436,960、6,432,959、6,420,387、6,414,145、6,410,541、6,410,539、6,403,581、 6,399,615、6,387,905、6,372,747、6,369,034、6,362,188、6,342,765、6,342,487、6,300,501、6,268,363、6,265,422、6,248,756、6,239,140、6,232,338、6,228,865、 6,228,856、6,225,322、6,218,406、6,211,193、6,187,786、6,169,096、6,159,984、 6,143,766、6,133,303、6,127,366、6,124,465、6,124,295、6,103,723、6,093,737、 6,090,948、6,080,870、6,077,853、6,071,935、6,066,738、6,063,930、6,054,466、 6,051,582、6,051,574、和6,040,305中公开的那些)；拓扑异构酶抑制物(例如，喜树碱；伊立替康；SN-38；托泊替康；9-氨基喜树碱；GG-211(G1147211)； DX-895If；IST-622；鲁比替康；吡唑啉吖啶；XR-5000；saintopin；UCE6； UCE1022；TAN-1518A；TAN 1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506； ED-110；NB-506和蝴蝶霉素)；bulgarein；DNA小沟结合剂例如Hoescht 染料33342和Hoechst染料33258；两面针碱；花椒宁碱；表小檗碱；甲氧檗因；beta-拉帕醌；BC-4-1；二磷酸盐(例如，阿仑膦酸盐、英卡膦酸盐、氯曲磷酸盐、替鲁膦酸盐、依替膦酸盐、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、olpandronate、利塞膦酸、吡膦酸盐、帕米膦酸盐、唑来膦酸盐)HMG-CoA 还原酶抑制物(例如，洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、statin、西立伐他汀、来适可、立普妥、瑞舒伐他汀和阿托伐他汀)；反义寡核苷酸(例如，美国专利No.6,277,832、5,998,596、5,885,834、5,734,033 和5,618,709中公开的那些)；腺嘌呤核苷脱氨酶抑制物(例如，氟达拉滨磷酸和2-氯脱氧腺苷)；替伊莫单抗
Figure BDA0001750882220000611
托西莫单抗
Figure BDA0001750882220000612
)，以及其药学上可接受的盐、溶剂化物、笼形物和前体药物。
进一步的，本文提供的分子是缀合或重组融合到修饰给定生物学反应的治疗部分或药物部分的抗体。治疗部分或药物部分不应被认为限于标准的化学治疗试剂。例如，所述药物部分可以是具有期望的生物学活性蛋白质、肽或多肽。这样的蛋白质可以包括，例如，毒素如相思豆毒蛋白、篦麻蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活物、细胞凋亡试剂，例如，TNF-γ、TNF-γ、AIM I(参见，国际公开No.WO 97/33899)、AIMII(参见，国际公开No.WO97/34911)、 Fas配体(Takahashi et al,1994,J.Immunol.,6:1567-1574)和VEGF(参见，国际公开No.WO 99/23105)、抗血管生成试剂，例如，血管抑素、内皮抑素，或凝血途径的成分(例如，组织因子)；或，生物反应修饰物，例如，淋巴因子(例如，干扰素γ、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-5(“IL-5”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、白细胞介素-7(“IL-7”)、白细胞介素9(“IL-9”)、白细胞介素-10(“IL-10”)、白细胞介素-12(“IL-12”)、白细胞介素-15(“IL-15”)、白细胞介素-23(“IL-23”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))，或生长因子(例如，生长激素(“GH”))，或凝血试剂(例如，钙、维生素K、组织因子，例如但不限于哈格曼因子(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、激肽释放酶原(PK)、凝血蛋白-因子II(凝血酶原)、因子V、Xlla、VIII、 XHIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂和纤维蛋白单体)。
此外，本文提供的抗体可以缀合到治疗部分，例如，放射性金属离子，例如，α-发射体，如213Bi，或对将金属离子缀合至多肽有用的大环螯合剂，所述金属离子包括但不限于，131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm。在某些实施方式中，所述大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸 (DOTA)，其可以经由接头分子附着到抗体上。这种接头分子是本领域一般已知的，在Denardo et al,1998,Clin Cancer Res.4(10):2483-90；Petersonet al,1999,Bioconjug.Chem.10(4):553-7；和Zimmerman et al,1999,Nucl.Med.Biol.26(8):943-50中描述，通过完全引用将它们每一个合并在本文中。
缀合或重组融合到本文提供的免疫特异性结合BTN1A1的抗体的治疗部分或药物应当被选择以实现期望的预防或治疗效果。在某些实施方式中，所述抗体是修饰的抗体。当决定哪些治疗部分或药物将缀合或重组融合到本文提供的抗体时，临床医师或其他医务人员应当考虑以下的：疾病的性质、疾病的严重度、以及对象的状况。
在某些实施方式中，所述部分可以是酶、激素、细胞表面受体、毒素 (例如，相思豆毒蛋白(abrin)、篦麻蛋白A、假单胞菌外毒素(即，PE-40)、白喉毒素、蓖麻蛋白、白树毒蛋白(gelonin)或商陆抗病毒蛋白)，蛋白质 (例如，肿瘤坏死因子、干扰素(例如，α-干扰素、β-干扰素)、神经生长因子、血小板衍生的生长因子、组织纤溶酶原激活物或细胞凋亡剂(例如，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β))，生物反应修饰物(例如，淋巴因子(例如，白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子 (“G-CSF”)或巨噬细胞集落刺激因子(“M-CSF”))或生长因子(例如，生长激素(“GH”)))，细胞毒素(例如，细胞抑制剂或杀细胞剂，例如，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、道诺霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、萘心安、单甲基auristatin F(MMAF)、单甲基auristatin E(MMAE；例如，vedotin)和嘌呤霉素，以及其类似物或同源物)，抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)，烷化剂(例如，甲二氯二乙胺、噻替派苯丁酸氮芥、米尔法兰、BiCNU？(卡莫司汀；BSNU)以及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红霉素(之前的道诺霉素) 以及多柔比星)，抗生素(例如，放线菌素(以前的纳霉素)、博来霉素、光辉霉素和氨茴霉素(AMC))，或抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
将这种治疗部分结合到抗体的技术是公知的；参见；例如；Amon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",inMONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Reisfeld et al. (eds.),1985,pp.243-56,Alan R.Liss,Inc.)；Hellstrom et al,"Antibodies For Drug Delivery",inCONTROLLED DRUG DELIVERY(2nd Ed.),Robinson et al.(eds.),1987,pp.623-53,MarcelDekker,Inc.)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",in MONOCLONAL ANTIBODIES’84:BIOLOGICAL AND CLINICAL APPLICATIONS,Pinchera et al.(eds.),1985,pp.475-506)；"Analysis,Results,And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy",in MONOCLONAL ANTIBODIES FOR CANCER DETECTION AND THERAPY,Baldwin etal.(eds.),1985,pp.303-16,Academic Press；Thorpe et al,Immunol.Rev.62:119-158(1982)；Carter et al,Cancer J.14(3):154-169 (2008)；Alley et al,Curr.Opin.Chem.Biol.14(4):529-537(2010)；Carter et al,Amer.Assoc.CancerRes.Educ.Book.2005(1):147-154(2005)；Carter et al,Cancer J.14(3):154-169(2008)；Chad,Ace.Chem Res.41(1):98-107 (2008)；Doronina et al,Nat.Biotechnol.21(7):778-784(2003)；Ducry et al,Bioconjug Chem.21(1):5-13(2010)；Senter,Curr.Opin.Chem.Biol.13 (3):235-244(2009)；and Teicher,Curr Cancer DrugTargets.9(8):982-1004 (2009)。
在某些实施方式中，本文描述的抗体和多肽可以缀合到标志物，例如，肽，来方便纯化。在某些实施方式中，所述标志物是六组氨酸肽，血细胞凝集素“HA”标签，其相应于衍生自流感血细胞凝集素蛋白的表位(Wilson, I.A.et al,Cell,31:161-11％(1984))，或“flag”标签(Knappik,A.et al, Biotechniques 17(4):754-761(1994))。
在某些实施方式中，所述部分可以是可在分析中被检测的成像试剂。这样的成像试剂可以是酶、辅基、放射性标记、非放射性顺磁性金属离子、半抗原、荧光标签、发磷光的分子、化学发光的分子、发色团、发冷光的分子、生物发光分子、磷亲和性分子、有色颗粒或配体，例如生物素。
在某些实施方式中，所述酶包括但不限于，辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；所述辅基复合物包括但不限于链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；所述荧光材料包括但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红素；所述发冷光材料例如但不限于鲁米诺；所述生物发光材料包括但不限于荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；所述放射性材料包括但不限于铋(213Bi)、碳(14C)、铬(51Cr)、钴(57Co)、氟(18F)、钆(153Gd、159Gd)、镓(68Ga、67Ga)、锗(68Ge)、钬(166Ho)、铟(115In、113In、112In、mIn)、碘(131I、125I、123I、121I)、镧(140La)、镥(177Lu)、锰(54Mn)、钼(99Mo)、钯(103Pd)、磷(32P)、镨(142Pr)、钷(149Pm)、铼(186Re、188Re)、铑(105Rh)、钌(97Ru)、钐(153Sm)、钪(47Sc)、硒(75Se)、锶(85Sr)、硫(35S)、锝(99Tc)、铊 (201Ti)、锡(113Sn、117Sn)、氚(3H)、氙(133Xe)、镱(169Yb、175Yb)、钇(90Y)、锌(65Zn)；利用各种正电子发射断层照相的正电子发射金属，以及非放射性的顺磁性金属离子。
使用本领域已知的技术，所述成像试剂可以直接地、或通过中间物(例如，本领域已知的接头)间接地缀合到本文描述的抗体或多肽。可以结合到本文描述的抗体和其他分子用于诊断的金属离子参见，例如，美国专利 No.4,741,900。一些缀合方法涉及使用金属螯合复合物，采用了例如与抗体附着的有机螯合剂，如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)；乙烯三胺四乙酸；N- 氯-对甲苯磺酰胺；和/或四氯-3,6a-二苯基甘氨酸-3。单克隆抗体还可以在存在偶联剂例如戊二醛或高碘酸的情况下与酶反应。与荧光素标志物的缀合物可以在存在这些偶联剂的情况下、或通过与异硫氰酸酯反应来制备。
在某些实施方式中，本文描述的抗体或多肽可以缀合到第二抗体，以形成Segal在美国专利No.4,676,980中描述的抗体杂缀合物。这样的杂缀合抗体可以另外结合半抗原(例如，荧光素)，或细胞标志物(例如，4-1-BB、 B7-H4、CD4、CD8、CD14、CD25、CD27、CD40、CD68、CD163、CTLA4、 GITR、LAG-3、OX40、TIM3、TIM4、TLR2、LIGHT、ICOS、B7-H3、 B7-H7、B7-H7CR、CD70、CD47)或细胞因子(例如，IL-7、IL-15、IL-12、 IL-4TGF-beta、IL-10、IL-17、IFNγ、Flt3、BLys)或趋化因子(例如，CCL21)。
在某些实施方式中，本文描述的抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA 多肽还可以附着到固相支持物，其对于免疫分析或目标抗原纯化或能够结合目标抗原的其他分子的纯化是有用的，所述目标抗原通过与本文描述的抗体或抗原结合片段结合而已经固定在所述支持物上。这种固相支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
7.2.5.蛋白质纯化
蛋白质纯化技术是本领域技术人员公知的。这些技术在一个层面上涉及将细胞、组织或器官均质化和粗分级成多肽和非多肽级分。除非另作说明，目标蛋白质或多肽可以进一步使用层析和电泳技术纯化，来实现部分或完全纯化(或纯化到同质)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、尺寸排阻层折、反相层析、羟磷灰石层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦。纯化肽的特别有效的方法是快速液相色谱(FPLC)或甚至高效液相色谱(HPLC)。如本领域公知的，相信的是进行各个纯化步骤的顺序可以变化，或可以省略某些步骤，仍然产生制备基本上纯化的多肽的合适方法。
纯化的多肽意图是指一种可与其他成分分离的组合物，其中所述多肽被纯化至相对于它的天然可获得状态的任何程度。因而，分离的或纯化的多肽还指从其天然发生的环境中游离的多肽。一般地，“纯化的”是指多肽组合物，其经历了分级来除去各种其他成分，所述组合物基本上保持了它的表现的生物学活性。当使用术语“基本上纯化的”时，这一指示将是指一种组合物，其中所述多肽形成了该组合物的主要成分，例如，构成所述组合物中蛋白质的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、或更多。
定量所述多肽的纯化程度的各种方法是本领域技术人员根据当前的公开内容已知的。这些包括，例如，测定活性级分的比活性，或通过SDS/PAGE 分析评估级分中多肽的数量。评估级分纯度的优选方法是计算所述级分的比活性，将其与初始提取物的比活性进行比较，从而计算其纯度，表示为“纯化倍数”。当然，用于代表活性数量的实际单位将取决于纯化之后选择的具体分析技术，以及表达的多肽是否展现可检测的活性。
一般不要求多肽总是以其最纯化的状态提供。实际上，期待的是较少基本上纯化的产物可能在某些实施方式中具有功用。部分纯化可以使用组合中较少的纯化步骤来实现，或通过利用相同的一般纯化方案的不同形式来实现。例如，理解的是，与使用低压层析系统的相同技术相比，利用HPLC 装置进行阳离子交换柱层析一般将产生更大“倍数”的纯化。展现较低程度的相对纯化的方法可能在蛋白质产物的总回收率方面或在维持表达的蛋白质的活性方面具有优势。
亲和层析是一种层析过程，其依靠要分离的物质与它可以特异性结合的分子之间的特异性亲和力。这是一种受体-配体类型的相互作用。通过将结合配体之一共价偶联在不溶的基质上来合成柱材料。然后所述柱材料能够从溶液中特异性地吸附物质。通过将条件改变为不会发生结合的条件(例如，改变pH值、离子强度、温度等)，发生洗脱。所述基质应当是不在任何显著程度上吸附分子、具有大范围的化学、物理和热稳定性的物质。所述配体应当以不影响它的结合性质的方式进行偶联。所述配体还应当提供相对紧密的结合。有可能的是洗脱所述物质而不破坏样品或配体。
尺寸排阻层折(SEC)是一种层析方法，其中溶液中的分子根据它们的大小，或以更技术性的术语，根据它们的流体动力学体积被分离。它通常被应用于大分子或宏分子复合物，例如，蛋白质和工业的聚合物。一般地，当使用水性溶液来将样品转运穿过柱时，这种技术被称为凝胶过滤层析，而名称凝胶渗透层析是在有机溶剂用作移动相时使用。SEC的基础原理是不同大小的颗粒将以不同的速率通过静止相被洗脱(滤出)。这引起基于尺寸的颗粒的溶液的分离。条件是所有的颗粒被同时地或接近同时地加载，相同大小的颗粒应当被一起洗脱。
高性能液相色谱(或高压液相色谱，HPLC)是生物化学和分析化学中常用的一种柱层析形式，用来分离、鉴定和定量化合物。HPLC利用了容纳色谱填充材料(静止相)的柱子、使移动相穿过柱子的泵、以及显示分子的滞留时间的检测器。滞留时间取决于静止相、要分析的分子和使用的溶剂之间的相互作用而变化。
本文还提供了评估BTLA糖基化、N-连接的糖基化或N-糖基化的方法，包括用所述实施方式的抗体(例如，相对于未糖基化的BTLA选择性结合糖基化的BTLA的抗体)接触含有BTLA的样品。在某些方面，所述方法是体外方法。在某些方面，所述样品是细胞样品。
7.2.6核酸
当前的公开还期待核酸分子(DNA或RNA)，其编码本文描述的任何抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽。变为还提供的是能够传递或复制这样的核酸分子的载体分子(例如质粒)。所述核酸可以是单链的、双链的，可以含有单链部分和双链部分两者。
7.3.药物制备
当进行含有抗体的药物组合物的临床应用时，一般有益的是制备适合于预期的应用的药物或治疗组合物。一般地，药物组合物可以具有有效量的本文描述的抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽，或其他试剂，溶解或分散于药学上可接受的载体中。
本文提供的还有具有本文描述的抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA 多肽的组合物。在某些实施方式中，所述组合物可以具有按重量计算至少 0.1％的所述抗体或多肽。在某些实施方式中，所述组合物可以具有按重量计算至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、 20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或更多的抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽。在其他实施方式中，例如，抗糖基化BTLA或糖基化BTLA多肽可以构成所述组合物的重量的约2％到约75％之间，约25％到约60％之间，约30％到约 50％之间，或其中的任何范围。在每种治疗有用的组合物中活性化合物的数量可以以这样的方式制备，从而在任何给定的化合物单位剂量中获得适合的剂量。例如，溶解度、生物利用率、生物半衰期、给药途径、产品货架寿命的因素以及其他药理学上的考虑将是制备这种药物组合物的本领域技术人员预期的，因而，各种剂量和治疗方案是希望的。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表2描述的鼠单克隆抗体STC613的VH或VL结构域。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表4描述的鼠单克隆抗体STC626的VH或VL结构域。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表6描述的鼠单克隆抗体STC635的VH或VL结构域。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表2描述的鼠单克隆抗体STC613的VH和VL结构域两者。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表4描述的鼠单克隆抗体STC626的VH和VL结构域两者。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表6描述的鼠单克隆抗体STC635的VH和VL结构域两者。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含一个或更多个VH CDR，所述VH CDR具有如表3描述的鼠单克隆抗体STC613的VH CDR的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含一个或更多个VH CDR，所述VH CDR具有如表5描述的鼠单克隆抗体STC626 的VH CDR的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含一个或更多个VH CDR，所述VH CDR具有如表7描述的鼠单克隆抗体STC635的VH CDR的任一个的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含一个或更多个VL CDR，所述VL CDR具有如表3描述的鼠单克隆抗体STC613的VL CDR的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含一个或更多个VL CDR，所述VL CDR具有如表5描述的鼠单克隆抗体STC626 的VL CDR的任一个的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含一个或更多个VL CDR，所述VL CDR具有如表7描述的鼠单克隆抗体STC635的VL CDR的任一个的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表3描述的鼠单克隆抗体STC613的至少一个VH CDR和至少一个VL CDR。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化 BTLA抗体，所述抗体包含如表5描述的鼠单克隆抗体STC626的至少一个 VH CDR和至少一个VL CDR。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有抗糖基化BTLA抗体，所述抗体包含如表7描述的鼠单克隆抗体STC635 的至少一个VHCDR和至少一个VL CDR。
在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性的方式)本文描述的BTLA表位的抗糖基化BTLA抗体。所述BTLA表位可以是本文描述的STC613的表位。在某些实施方式中，所述药物组合物可以具有特异性结合本文描述的BTLA的表位的抗糖基化 BTLA抗体。所述BTLA表位可以是本文描述的STC613的表位。在某些实施方式中，所述BTLA表位具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、 166、167、168或169的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸。
所述组合物可以是具有抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽作为活性成分以及药学上可接受的载体的药物组合物。所述药物组合物可以进一步包括一种或更多种其他活性成分。药学上可接受的载体可以是由联邦或州政府的管理机构批准的，或在美国药典、欧洲药典或其他一般公认的药典中列出的用于动物、更特别地用于人类的载体。
如本文使用的，除非另作说明，术语“载体”是指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的或不完全的))、赋形剂、稳定剂或运载体，治疗试剂与它们一起施用。“药学上可接受的载体”是在所采用的剂量和浓度下对暴露于它的细胞或哺乳动物无毒的载体，其可以是无菌的液体，例如，水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药学上可接受的分子实体或组合物在视情况施用给动物例如人类时不产生不利的、过敏的或其他不良的反应。具有抗体或其他活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员根据当前的公开内容已知的，如 Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,1990所列举的，通过引用合并在本文中。此外，对于动物(例如人类)施用，要理解的是，制品应当满足FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。
期待的是所述组合物包括每ml约0.001mg和约10mg的总抗体或多肽。因而，所述组合物中的抗体或多肽的浓度可以是大约、至少约或最多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、 9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或可从中得出的任何范围)。对此，大约、至少约或最多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、 12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、 24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、 36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、 48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、 72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、 84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或100％可以是抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA 多肽。
具有本文描述的抗体或其他多肽作为活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员根据当前的公开内容已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences,18thEd.,1990所列举的，通过引用合并在本文中。此外，对于动物(包括人类)施用，要理解的是，制品应当满足FDA生物学标准办公室所要求的无菌性、热原性和一般安全性和纯度标准。
所述药学上可接受的载体包括液体的、半固体的，即糊剂，或固体的载体。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、结合剂、填料等，或其组合。所述药学上可接受的载体可以包括水溶剂(例如，水、醇/水性溶液、乙醇、盐水溶液、胃肠外的运载体，例如，氯化钠、Ringer’s葡萄糖等)、非水性溶剂(例如，丙烯甘醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如，油酸乙酯)、分散介质、包衣(例如，卵磷脂)、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体、对羟苯甲酸(例如，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞)、等渗试剂(例如，糖类、氯化钠)、吸收延迟剂(例如，单硬脂酸铝、明胶)、盐、药物、药物稳定剂(例如，缓冲液、氨基酸，例如甘氨酸和赖氨酸，碳水化合物，例如，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇,等等)、凝胶、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、液体和养营素补充物，这类材料及其组合，这将是本领域普通技术人员已知的。除非任何常规的介质、试剂、稀释剂或载体对于接受者或对于其中含有的组合物的治疗有效性是有害的，它在用于实践本方法的可施用组合物中的运用是适当的。药物组合物中的pH值和各种成分的确切浓度根据公知的参数来调整。根据当前的公开的某些方面，所述组合物可以以任何方便的和实际的方式与所述载体组合，即，通过溶解、悬浮、乳化、混合、封装、吸收、磨碎，等。这样的过程对于本领域技术人员而言是常规的。
在某些实施方式中，药学上可接受的载体可以是水性的pH值缓冲的溶液。实例包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(例如，小于也10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如 EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成盐平衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、聚乙二醇(PGE)和PLURONICSTM。
在某些实施方式中，药学上可接受的载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水可以是载体，特别是当静脉内地施用药物组合物时。盐水溶液与葡萄糖和甘油水溶液可以被用作液体载体，特别是对于可注射的溶液。适和的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、聚山梨酯-80等。所述组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、药丸、胶囊、粉未、持续释放制剂等的形式。
当前的公开的某些实施方式可以具有不同类型的，取决于它是将以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及对于施用途径例如注射它是否需要是无菌的。所述组合物可以被配制用于静脉内地、皮内地、穿表皮地、鞘内地、动脉内地、腹膜内地、鼻内地、阴道内地、直肠内地、肌肉内地、皮下地、粘膜地、口服地、表面地、局部地、通过吸入(例如，气雾吸入)、通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接浸浴靶细胞的局部灌注、通过导管、通过灌洗、在脂质组合物(例如脂质体)中、或通过其他方法或上述的任何组合来施用，这将是本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,1990，通过应用合并在本文中)。一般地，这样的组合物可以制备为液体溶液或混悬液；还可以制备适用于在注射之前添加液体制备溶液或混悬液的固体形式；以及，所述制品还可以被乳化。
所述抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽可以以游离的碱性、中性或盐形式配制中组合物中。药学上可接受的盐包括加酸盐，例如，与蛋白性组合物的游离氨基酸形成的那些，或者其与无机酸，例如，盐酸或磷酸，或这样的有机酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成。与游离羧基形成的盐也可以来自无机碱，例如，钠、钾、铵、钙或氢氧化铁；或这样的有机碱如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸；或普鲁卡因等等。
在进一步的实施方式中，本文提供的是具有脂质的药物组合物。脂质可以广泛地包括一类物质，其特征在于不溶于水和可用有机溶剂提取。实例包括含有长链脂肪族烃的化合物和它们的衍生物。脂质可以是天然发生的或合成的(即，由人设计或生产的)。脂质可以是生物物质。生物脂质是本领域公知的，包括例如，中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂、糖鞘脂、糖脂，硫酸酯，具有醚-和酯-连接的脂肪酸的脂质，可聚合的脂质，及其组合。还可以使用与本文特别描述的那些不同的、作为脂质本领域技术人员理解的化合物。
本领域普通技术人员将熟悉用于将组合物分散在脂质运载体中的技术的范围。例如，抗体或多肽可以分散在含有脂质的溶液中、用脂质溶解、用脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价键合、作为混悬液含有在脂质中、含有在胶粒团或脂质体中或与胶粒团或脂质体混合，或另外通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构缔合。所述分散可以或可以不引起脂质体形成。
一般地，在单位剂型中分别地或混合地提供组合物的成分，例如，在密闭容器例如标明了活性试剂数量的安瓿瓶或者小袋中，作为冻干的粉末或无水的浓缩物。当通过输注施用组合物时，可用含有无菌的药学级水或盐水的输液瓶进行配药。当通过注射施用所述组合物时，可以提供灭菌注射水或盐水的安瓿瓶以便在施用前将成分混合。
在每个治疗有用的组合物中活性成分的数量可以以这样的方式制备，从而在任何给定的化合物单位剂量中获得适合的剂量。例如，溶解度、生物利用率、生物半衰期、给药途径、产品货架寿命的因素以及其他药理学上的考虑可以是制备这种药物组合物的本领域技术人员预期的，因而，各种剂量和治疗方案是希望的。
单位剂量是指适用于对象的物理上分离的单位，每个单位含有预定数量的药物组合物，计划在与它的施用相关联时，即，适合的途径和治疗方案，产生上文讨论的期望的反应。根据治疗的次数和单位剂量，要施用的数量取决于期望的效果。施用给患者或对象的本实施方式的组合物的试剂剂量数可以通过物理和生理学因素，例如体重、年龄、健康、对象的性别、要治疗的疾病类型、疾病渗透的程度、早先的或并行的治疗介入、患者的自发病、施用途径以及特定治疗物质的效价、稳定性和毒性来确定。在其他非限制性实例中，剂量可以是每次施用约1微克/kg/体重、约5微克/kg/ 体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约 200微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/ 体重、约5毫克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100 毫克/kg/体重、约200毫克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/ 体重，到约1000毫克/kg/体重或更高，以及可从中得出的任何范围。在从此处列出的数字可得出的范围的非限制性实例中，根据上文描述的数字，可以使用约5毫克/kg/体重到约100毫克/kg/体重，约5微克/kg/体重到约 500毫克/kg/体重的范围等。在任何情况下，负责施用的医师将确定组合物中活性成分的浓度以及对个体对象适合的剂量。
本领域的普通技术人员将理解，本文描述的组合物不受治疗性制品的特别性质的限制。例如，这样的组合物可以与生理学地可耐受的液体、凝胶或固体载体、稀释剂和赋形剂一起在制剂中提供。这些治疗制品可以施用给哺乳动物用于兽医学用途，例如，用于家畜，以及与其他治疗试剂类似的方式在人类中的临床使用。一般地，治疗效力所需的剂量根据运用的类型和施用方式、以及个体对象的特别化需求而变化。施用给动物患者包括人类患者的组合物的实际剂量数量可以由物理和生理学因素决定，例如，体重、状况的严重度、要治疗的疾病类型、早先的或并行的治疗介入、患者的自发病、以及施用途径。取决于剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可以根据对象的反应而变化。在任何情况下，负责施用的医师将确定组合物中活性成分的浓度以及对单个对象适合的剂量。
7.4.疾病的治疗
如本文使用的，除非另作说明，术语“对象”是指作为治疗、观察和/或实验的对象的动物。"“动物”包括脊椎动物和无脊椎动物，例如，鱼类、贝类、爬行动物、禽类，和特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、犬、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类，例如，猴、黑猩猩、猿和人类。在某些实施方式中，所述对象是人类。
如本文使用的，除非另作说明，术语“癌症”或“癌的”是指特征一般在于对象中不受调节的细胞生长的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括但不限于血液癌症和实体肿瘤。
如本文使用的，除非另作说明，术语“治疗”是指为了获得对疾病或健康相关状况的治疗效益的目的向对象施用或应用治疗试剂，或对对象执行流程或用药程式。例如，治疗可以包括向对象施用治疗有效量的抗糖基化BTLA抗体。当提及癌症患者使用时，术语“治疗”是指潜在地降低癌症严重度、延迟或减慢癌症发展的活动，包括(a)抑制癌症生长、降低癌症生长速度、阻滞发展、降低癌症侵入性或防止癌症转移，和(b)引起癌症衰退、延缓或最小化与癌症存在相关的一种或更多种症状、或延长癌症患者的存活。
如本文使用的，除非另作说明，术语“治疗有效量”是指试剂(例如，本文描述的抗体或多肽或本文描述的任何其他试剂)的数量，其足以降低和/ 或改善给定疾病、失调或状况和/或与之相关的症状的严重度和/或持续时间。包括治疗试剂的试剂的治疗有效量可以是(1)降低或改善给定疾病、失调或状况的进展或发展，(ii)降低或改善给定疾病、失调或状况的复发、发展或发作，和/或(iii)改善或增强另一种治疗(例如，不同于施用本文提供的抗体的治疗)的预防或治疗效果所必需的数量。本文公开的物质/分子/试剂(例如，抗糖基化BTLA抗体)的治疗有效量可以根据一些因素而变化，例如，个体的疾病状况、年龄、性别和体重，所述物质/分子/试剂在个体中引发期望的反应的能力。治疗有效量涵盖一种数量，其中所述物质/ 分子/试剂的任何毒性或不利影响不超过治疗有益的效果。
如本文使用的，除非另作说明，术语“施用”是指将存在于身体外部的物质注射或物理上递送进入患者的动作，例如，通过粘膜的、真皮内的、静脉内的、肌肉内的递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其他物理递送的方法。当疾病、失调或状况或其症状被治疗时，施用物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之后进行。当疾病、失调或状况或其症状被预防时，施用物质一般在疾病、失调或状况或其症状发作之前进行。
本文提供的还有所述抗糖基化BTLA抗体(例如，STC613、STC626 或STC635)以及糖基化BTLA多肽的治疗用途。这些抗体或多肽可以用于调节BTLA信号传导的活性。通过抑制BTLA在T细胞活化或增殖方面的活性，这些抗体或多肽还可以用于治疗疾病。因而，本文提供的是这样的抗体或多肽通过抑制或阻断BTLA信号在上调对象的免疫系统方面的用途。
在某些实施方式中，本文提供的还有所述抗糖基化BTLA抗体(例如， STC613、STC626或STC635)以及糖基化BTLA多肽在治疗癌症方面的用途。在治疗癌方面，上调免疫系统是特别期望的，因而本文提供的还有癌症治疗的方法。癌症是指由异常的不受控制的细胞生长引起的赘生物或肿瘤。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。
在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体(例如，STC613、 STC626或STC635或其人源化变体)可以调节对象中的免疫应答。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以促进T细胞活化。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以促进T细胞增殖。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体可以提高细胞因子生产。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体还可以增强表达BTLA 的细胞的T细胞依赖性细胞凋亡或抑制表达BTLA的细胞的增殖。
因而本文提供的是通过施用有效量的本文提供的抗糖基化BTLA抗体 (例如，STC613、STC626或STC635或其人源化变体)调节对象中的免疫应答的方法。调节免疫应答可以包括(a)提高T细胞活化；(b)提高T细胞增殖；和/或(c)提高细胞因子生产。
在某些实施方式中，本文提供的是具有抗原结合片段的抗糖基化BTLA 抗体的治疗用途，所述抗原结合片段包含表2描述的鼠单克隆抗体STC613、表4描述的鼠单克隆抗体STC626、或表6描述的鼠单克隆抗体STC635的 VH或VL结构域。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体可以具有抗原结合片段，所述抗原结合片段包含表2描述的鼠单克隆抗体STC613、表4描述的鼠单克隆抗体STC626或表6描述的鼠单克隆抗体STC635的 VH和VL结构域两者。在某些实施方式中，本文提供的是包含一个或更多个VH CDR的抗糖基化BTLA抗体的治疗用途，所述一种或更多种VH CDR 具有表2描述的鼠单克隆抗体STC613、表4描述的鼠单克隆抗体STC626 或表6描述的鼠单克隆抗体STC635的任一个VH CDR的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体包含一个或更多个VL CDR，所述一个或更多个VLCDR具有表2描述的鼠单克隆抗体STC613、表4描述的鼠单克隆抗体STC626或表6描述的鼠单克隆抗体STC635的任一个 VL CDR的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体包含表2描述的鼠单克隆抗体STC613、表4描述的鼠单克隆抗体STC626或表6描述的鼠单克隆抗体STC635的至少一个VH CDR和至少一个VL CDR。
在某些实施方式中，本文提供的是竞争性地阻断(例如，以剂量依赖性的方式)本文描述的BTLA表位的抗糖基化BTLA抗体的治疗用途。所述 BTLA表位可以是本文描述的STC613的表位。在某些实施方式中，本文提供的是特异性结合本文描述的BTLA的表位的抗糖基化BTLA抗体的治疗用途。所述BTLA表位可以是本文描述的STC613的表位。在某些实施方式中，所述BTLA表位具有SEQ ID NOS：161、162、163、164、165、166、 167、168或169的氨基酸序列的至少五个连续氨基酸。
本文提供的还有本文提供的抗糖基化BTLA抗体的治疗用途。在某些实施方式中，本文提供的抗糖基化BTLA抗体特异性地结合糖基化的 BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置 N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N94处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N110处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA 抗体特异性地结合在位置N75和N94处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N75和N110处糖基化的BTLA。在某些实施方式中，所述抗糖基化BTLA抗体特异性地结合在位置N94和N110处糖基化的BTLA。在某些实施方式中和所述抗糖基化 BTLA抗体特异性地结合在位置N75、N94和N110处糖基化的BTLA。
在某些方面，所述实施方式的多肽或抗体(例如，糖基化BTLA多肽或结合糖基化BTLA的抗体，例如，STC613、STC626或STC635)可以被施用来治疗癌症。当前的治疗方法有用的癌包括任何恶性细胞类型，例如，在实体肿瘤或血液学肿瘤中存在的那些。示范性的实体肿瘤可以包括但不限于选自胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头部、颈部、卵巢、肾脏、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑素瘤、前列腺和乳腺的器官的肿瘤。示范性的血液学肿瘤包括骨髓的肿瘤、T细胞或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、胚细胞瘤、骨髓瘤，等。可以使用本文提供的方法治疗的癌症的进一步的实例包括但不限于恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、扁平细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部的腺癌和肺部的鳞状细胞癌)、腹膜的癌症、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌和胃肠间质癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜的或子宫的恶性肿瘤、唾液腺恶性肿瘤、肾脏或肾癌症、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、各种类型的头颈癌症、黑素瘤、浅表传播的黑素瘤、斑点恶性黑色素瘤、肢端雀斑痣性黑素瘤、结节黑素瘤以及B 细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL) NHL；中间级别/滤泡性NHL；中间级别弥散性NHL；高级别免疫母细胞 NHL；高级别成淋巴细胞性NHL；高级别小非核裂细胞NHL；bulkydisease NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；和Waldenstrom’s巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、毛细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病(AML)和慢性成髓细胞白血病。
所述癌症可以具体为以下组织学类型，然而不限于这些：恶性赘生物；癌；未分化的癌；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌；转移细胞癌；乳头状转移细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管细胞癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管细胞癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；家族性结肠息肉的腺癌；实性癌；恶性类癌肿瘤；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性粒细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；琥珀酸腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺癌；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性卵泡膜细胞瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性成骨细胞瘤；足细胞癌；恶性睾丸间质细胞瘤；恶性脂质细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；皮肤丝球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素瘤；浅表传播的黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；肉瘤；恶性间质瘤；恶性卵巢布伦纳氏瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢甲状腺瘤；恶性合胞体瘤；恶性中肾瘤；血管内皮瘤；恶性血管内皮瘤；皮肤多发性出血性肉瘤；恶性血管外皮瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质的骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性成软骨细胞瘤；间胚叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因肉瘤；恶性牙原性肿瘤；造釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；造釉细胞性纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维型星形细胞瘤；成星形细胞瘤；成胶质细胞瘤；寡枝神经胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原发性神经外胚层；小脑的肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；成视网膜细胞瘤；嗅觉神经原性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；何杰金病；霍奇金病；类肉芽肿；小淋巴细胞的恶性淋巴瘤；大细胞、弥散性恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样真菌病；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠病；白血病；淋巴细胞性白血病；浆细胞性白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞性白血病；骨髓性白血病；嗜碱性细胞白血病；嗜酸粒性白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓肉瘤；和毛细胞白血病。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或多肽可以用于治疗癌症，所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
所述多肽或抗体在此可以用作多种用药程式中的抗肿瘤试剂。在特定的实施方式中，本文提供的是作为抗肿瘤试剂使用多肽或抗体的方法，因而包括使肿瘤细胞的群体与治疗有效量的多肽或抗体接触持续足以抑制肿瘤细胞生长的时间期。
各种递送系统也是已知的，可以用于施用所述抗糖基化BTLA抗体或相关的分子、或相关的药物组合物，例如，封装在脂质体、微粒、微囊中，能够表达所述抗体或融合蛋白的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见，例如，Wu and Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建核酸作为逆转录病毒载体或其他载体的部分，等。
本文提供的施用方法包括但不限于，注射，如通过胃肠外施用(例如，真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的和皮下的)、硬膜外的和粘膜的 (例如，鼻内的和口腔途径)。在某些实施方式中，本文提供的抗体、其他分子或药物组合物肌内地、静脉内地、皮下地、静脉内地、腹膜内地、口服地、肌肉内地、皮下地、腔内地、穿表皮地或表皮地施用。可以通过任何便利的途径施用所述组合物，例如，通过输注或弹丸注射，通过上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜，等)的吸收，并且可以与其他生物活性试剂一同施用。施用可以是全身性或局部的。此外，也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化试剂的制剂。参见，例如，美国专利No.6,019,968；5,985,20；5,985,309；5,934,272； 5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开No.WO 92/19244； WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，通过完全引用将它们每一个合并在本文中。在某些实施方式中，本文提供的抗体、其他分子或药物组合物局部地施用到需要治疗的区域，这可以通过例如局部输注、通过注射、或通过植入物的方式来实现，所述植物物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，例如，弹性膜或纤维。在某些实施方式中，当施用本文描述的抗体或其他分子时，注意使用抗体或其他分子不吸收的材料。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或多肽被配制在脂质体中用于靶向递送。脂质体是密封了水相、包含同心方向的磷脂双层的泡囊。脂质体一般具有各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂。脂质体的组分通常排列成双分子层结构，类似于生物膜的脂质分布。部分地由于它们的生物相容性、低免疫原性和低毒性，脂质体可能是有用的递送运载体。制备脂质体的方法是本领域已知的以及是本文提供的，参见，例如Epstein et al,1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688；Hwang et al,1980 Proc.Natl.Acad.Sci. USA,77:4030-4；美国专利Nos.4,485,045和4,544,545；所有这些通过完全引用合并在本文中。
本文提供的还有制备具有延长的血清半衰期，即增强的循环时间的脂质体的方法，例如，在美国专利No.5,013,556中公开的那些。在某些实施方式中，本文提供的方法中使用的脂质体不从循环中快速清除，即，不被单核吞噬细胞系统(MPS)摄入。本文提供的还有空间稳定的脂质体，其使用本领域技术人员已知的常见方法制备。空间稳定的脂质体可含有具有庞大且高度柔性的亲水部分的脂质组分，其降低脂质体与血清蛋白的不希望的反应，降低与血清组分的调理作用并降低MPS的识别。可以使用聚乙二醇制备空间稳定的脂质体。为了制备脂质体和空间稳定的脂质体，参见，例如，Bendas et al,2001 BioDrugs,15(4):215-224；Allen et al,1987 FEB*S Lett.223:42-6；Klibanov et al,1990FEBSLett,268:235-7；Blum et al,1990, Biochim.Biophys.Acta.,1029:91-7；Torchilin et al,1996,J.Liposome Res.6: 99-116；Litzinger et al,1994,Biochim.Biophys.Acta,1190:99-107；Maruyama et al,1991,Chem.Pharm.Bull.,39:1620-2；Klibanov et al,1991,Biochim Biophys Acta,1062；142-8；Allen et al,1994,Adv.Drug Deliv.Rev,13: 285-309，通过引用将它们完全合并在本文中。
本文提供的还有适合于靶向特定器官，参见例如美国专利No. 4,544,545，或适合于靶向特定细胞，参见例如美国专利公开No. 2005/0074403的脂质体，通过完全引用将它们合并在本文中。可以通过反相蒸发法，用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺 (PEG-PE)的脂质组合物来产生在本文提供的组合物和方法中特别有用的脂质体。可以通过规定孔径大小的过虑材料挤出脂质体来产生具有期望直径的脂质体。在某些实施方式中，具有抗原结合片段的分子，例如F(ab’) 可以使用早先描述的方法缀合到脂质体，参见，例如，Martin et al,1982,J. Biol.Chem.257:286-288，通过引用将其完全合并在本文中。
本文描述的人源化或嵌合抗体还可以被配制为免疫脂质体。免疫脂质体是指一种脂质体组合物，其中抗体或其片段共价地或非共价地连接到所述脂质体表面。将抗体连接到脂质体表面的化学作用是本领域已知的，参见，例如，美国专利No.6,787,153；Allen etal,1995,Stealth Liposomes,Boca Rotan:CRC Press,233-44；Hansen et al,1995,Biochim.Biophys.Acta,1239: 133-144，通过引用将它们完全合并在本文中。在某些实施方式中，在本文提供的方法和组合物中使用的免疫脂质体被进一步空间稳定化。在某些实施方式中，本文描述的人源化抗体共价地或非共价地连接到疏水的锚，所述锚稳定地根植于脂质体的脂质双分子层中。疏水锚的实例包括但不限于磷脂，例如，磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)。为了实现抗体与疏水性锚之间的共价连接，可以使用任何本领域已知的生物化学策略，参见，例如，J.Thomas August ed.,1997,Gene Therapy:Advances in Pharmacology, Volume 40,Academic Press,San Diego,Calif,p.399-435，通过引用将它们完全合并在本文中。例如，抗体分子上的功能基团可以与缔合于脂质体的疏水性锚上的活性基团反应，例如，抗体上的赖氨酸侧链的氨基基团可以与用水溶性碳二亚胺活化的、脂质体缔合的N-戊二酰磷脂酰乙醇胺偶联；或还原抗体的硫醇基团可以通过硫醇反应性锚，例如吡啶基巯基丙酰基磷脂酰乙醇胺与脂质体偶联。参见，例如，Dietrich et al,1996,Biochemistry,35: 1100-1105；Loughrey et al,1987,Biochim.Biophys.Acta,901:157-160；Martin et al.,1982,J.Biol.Chem.257:286-288；Martin et al,1981,Biochemistry,20: 4429-38，通过完全引用将它们合并在本文中。具有抗糖基化BTLA抗体的免疫脂质体制剂作为治疗试剂是特别有效的，因为它们将活性成分递送到靶细胞的细胞质，即，包含所述抗体要结合的受体的细胞。在某些实施方式中，所述免疫脂质体可以具有提高的血液中半衰期，特异性地靶向细胞，以及可以被内在化于靶细胞的细胞质中，从而避免治疗试剂损失或内溶酶体途径的降解。
本文提供的免疫脂质体组合物可以具有一种或更多种成泡囊脂质、本发明的抗体或其他分子或其片段或衍生物，以及，任选的，亲水性聚合物。成泡囊脂质可以是具有两个烃链的脂质，例如，酰基链和极性的头部基团。成泡囊脂质的实例包括磷脂，例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇、神经磷脂和糖脂，例如，脑苷脂类、神经节苷脂类。在本文提供的制剂中有用的对其他脂质是本领域技术人员已知的，被涵盖在本说明书中。在某些实施方式中，所述免疫脂质体组合物进一步包括亲水性聚合物，例如，聚乙二醇和神经节苷脂GM1，其提高了脂质体的血清半衰期。将亲水性聚合物缀合到脂质体的方法是本领域公知的，被涵盖在本说明书之内。其他示范性的免疫脂质体和制备它们的方法可以在例如美国专利申请公开No.2003/0044407；PCT国际公开No.WO 97/38731,Vingerhoeads etal,1994,Immunomethods,4:259-72；Maruyama,2000,Biol.Pharm.Bull.23 (7):791-799；Abra et al,2002,Journal of Liposome Research,12(1&2):1-3； Park,2002,Bioscience Reports,22(2):267-281；Bendas et al,2001 BioDrugs, 14(4):215-224,J.Thomas August ed.,1997,Gene Therapy:Advances in Pharmacology,Volume 40,Academic Press,San Diego,Calif.,p.399-435中找到，通过完全引用将它们合并在本文中。
本文提供的还有通过向患者施用单位剂量的抗糖基化BTLA抗体来治疗癌症患者的方法。本文提供的还有通过向患者施用单位剂量的糖基化 BTLA多肽来治疗癌症患者的方法。单位剂量是指适合于作为对象的单元剂量的物理上离散的单位，每个单元含有与需要的稀释剂即载体或运载体相关联的预定数量的活性物质，其被计算产生期望的治疗效果。
所述抗体、多肽或组合物按照与所述剂量制剂相容的方式、以治疗有效量施用。要施用的数量取决于要治疗的对象、对象的系统利用活性成分的能力、以及期望的治疗效果程度。需要施用的活性成分的精确数量取决于医师的判断并且对于每个个体对象是特定的。然而，全身性应用的适合的剂量范围是本文公开的，取决于施用途径。开始和强化施用的适合的方式也是期待的，一般包括起始的施用，以及之后以一个或多个小时的间隔时间通过随后的注射或其他施用重复给药。示范性的多次施用是本文描述的，对于维持多肽或抗体的持续高血清水平和组织水平是有用的。做为选择，足以将血液中的浓度维持在体内治疗指定的范围的连续静脉内输注是期待的。
治疗有效量是计划实现期望的效果的预定数量。一般地，剂量将取决于患者的年龄、状况、性别和疾病程度而变化，可以由本领域技术人员确定。在有任何并发症的情况下，剂量可以由独立的医师来调整。
在某些实施方式中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物被包装在密闭容器中，例如，安瓿瓶或小袋。在一个实施方式中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物作为干燥的灭菌冻干粉剂或无水浓缩物在密闭容器中提供，可以用例如水或盐水重构到适当的浓度向对象施用。在某些实施方式中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物以至少5mg，更优选的至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75 mg的单位剂量作为干燥的无菌冻干粉剂在密闭容器中提供。本文提供的冻干的抗体、多肽或药物组合物应当在2℃到8℃之间保存在它们的原始容器中，应当在重构后12小时之内，优选的6小时内、5小时内、3小时内或1 小时内施用。在可选择的实施方式中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物以液体形式在标明了所述抗体、多肽或药物组合物的数量和浓度的密闭容器中提供。在某些实施方式中，本文提供的抗体、多肽或药物组合物的液体形式以至少1mg/ml,更优选的至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8 mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml、至少150mg/ml、至少200mg/ml在密闭容器中提供。
在制剂中采用的准确剂量也将取决于给药途径、状况的严重度，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。有效的剂量可以从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。对于所述抗糖基化BTLA 抗体或糖基化BTLA多肽，施用给患者的剂量一般是0.01mg/kg到100 mg/kg患者体重。在某些实施方式中，向患者施用的剂量在0.01mg/kg到 20mg/kg、0.01mg/kg到10mg/kg、0.01mg/kg到5mg/kg、0.01到2mg/kg、 0.01到1mg/kg、0.01mg/kg到0.75mg/kg、0.01mg/kg到0.5mg/kg、0.01 mg/kg到0.25mg/kg、0.01到0.15mg/kg、0.01到0.10mg/kg、0.01到0.05 mg/kg或0.01到0.025mg/kg患者体重之间。特别地，向患者施用的剂量可以是0.2mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg。预计低至0.01mg/kg的剂量显示明显的药效。预计0.10-1mg/kg的剂量水平是最合适的。预计更高的剂量(例如，1-30mg/kg)也是有活性的。一般地，由于对外源多肽的免疫反应，人类抗体在人体内比来自其他物种的抗体具有更长的半衰期。因而，更低剂量的人类抗体和更低频率的施用可能是实际的。进一步的，通过修饰例如脂质化来增强抗体的摄取和组织穿透性，可以降低本文提供的抗体或多肽的施用剂量和频率。
在又一个实施方式中，组合物可以在控释或持续释放系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术可以用于产生具有本文提供的一种或更多种抗体、分子或药物组合物的持续释放制剂。参见，例如，美国专利No. 4,526,938；PCT公开WO 91/05548；PCT公开WO 96/20698；Ning et al, Radiotherapy&Oncology 39:179-189(1996),Song et al,PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397(1995)；Cleek et al,Pro.Int'l. Symp.Control.Re I.Bioact.Mater.24:853-854(1997)；和Lam et al,Proc.Int'l. Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760(1997)，通过完全引用将它们合并在本文中。在一个实施方式中，泵可以用于控制释放系统(参见Langer, supra；Sefton,1987,CRC Crit.RefBiomed.Eng.14:20；Buchwald et al,1980, Surgery 88:507；和Saudek et al,1989,iV.Engl.J.Med.321:574)。在另一个实施方式中，聚合材料可以用于实现抗体或多肽的控制释放(参见例如， Medical Applications of ControlledRelease,Langer and Wise(eds.),CRC Pres., Boca Raton,Fla.(1974)；ControlledDrug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen and Ball(eds.),Wiley,New York(1984)；Ranger and Peppas,1983,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61；还参见Levy et al.,1985,Science 228:190；During et al,1989,Ann.Neurol.25:351；Howard et al,1989,J.Neurosurg 7 1:105)；美国专利No.5,679,377；美国专利No. 5,916,597；美国专利No.5,912,015；美国专利No.5,989,463；美国专利No. 5,128,326；PCT公开No.WO 99/15154；和PCT公开No.WO 99/20253)；通过引用将它们完全合并在本文中。
可以用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，聚(－羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯－co－乙烯基醋酸酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚(交酯-co-乙交酯)(PLGA)，和聚正酯。在又一个实施方式中，控制释放系统可以放置于接近治疗目标(例如，肺部)，因而仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,inMedical Applications of Controlled Release, supra,vol.2,pp.115-138(1984))。在另一个实施方式中，根据Dunn et al. (参见美国专利No.5,945,155)使用作为控释植入物有用的聚合组合物,通过引用将其完全合并在本文中。基于来自聚合物系统的生物活性材料的原位控制释放的治疗效果，植入一般可以在需要治疗的患者体内的任何地方进行。
在另一个实施方式中，使用非聚合的持续释放系统，其中对象体内的非聚合的植入物被用作药物递送系统。在植入体内之时，植入物的有机溶剂将从组合物中消散、分散或浸出到周围的组织液，非聚合材料将逐渐地凝结或沉淀来形成固体的、多微孔的基质(参见美国专利No.5,888,533)。在Langer的综述(1990，Science 249:1527-1533)中讨论了其他控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可以用于产生包含本文提供的一种或更多种治疗试剂的持续释放制剂。参见，例如，美国专利No.4,526,938；国际公开Nos.WO 91/05548和WO 96/20698；Ning et al,1996,Radiotherapy& Oncology 39:179-189；Song et al,1995,PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek et al,1997,Pro.Int'l.Symp.Control. Rel.Bioact.Mater.24:853-854；以及Lam et al,1997,Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760；所有这些通过完全引用合并在本文中。
本文提供的还有实施方式，其中所述组合物具有编码本文提供的抗体或多肽的核酸，其中所述核酸可以被体内施用以促进它编码的抗体或多肽的表达，通过将它构建为适合的核酸表达载体的部分，并施用它使得它成为细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利No.4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic,Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染试剂覆盖，酮通过与已知进入核中的同源框样肽连接来施用(参见例如Joliot et al,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868)。做为选择，可以通过同源重组将核酸细胞内地导入并掺入宿主细胞DNA中用于表达。
此外，使用治疗有效量的本文提供的抗体、多肽或药物组合物治疗对象可以包括单次治疗或一系列的治疗。期待的是本文提供的抗体、多肽或药物组合物可以全身地或局部地施用来治疗疾病，例如，抑制患有局部进展或转移癌症的癌症患者内的肿瘤细胞生长或杀死癌细胞。可以静脉内地、鞘内地和/或腹膜内施用它们。它们可以单独地或与抗增殖药物组合地施用。在一个实施方式中，施用它们以在手术或其他操作之前降低患者的癌症负荷。做为选择，可以在手术之后施用它们以确保任何残余的癌症(例如，手术未能除去的癌症)不存活。在某些实施方式中，可以在原发癌症的衰退之后施用它们以防止转移。
7.5.组合治疗
在某些实施方式中，实施方式的组合物和方法涉及与第二治疗或其他治疗组合地施用糖基化BTLA多肽或选择性结合糖基化BTLA的抗体。这样的治疗可以应用于与BTLA或糖基化BTLA相关的任何疾病的治疗。例如，所述疾病可以是癌症，所述第二治疗是抗癌治疗或抗超量增殖治疗。
所述方法和组合物，包括组合治疗，增强了治疗或保护效果，和/或提高了另一种抗癌治疗或抗超量增殖治疗的治疗效果。治疗和预防方法以及组合物可以在组合的有效量中提供，以实现期望的效果，例如，杀死癌细胞和/或抑制细胞的超量增殖。这种过程可以涉及施用多肽或抗体以及第二治疗。所述第二治疗可以或可以不具有直接的细胞毒性效果。例如，所述第二治疗可以是上调免疫系统而没有直接的细胞毒性效果的试剂。组织、肿瘤或细胞可以暴露于包含一种或更多种所述试剂(例如，抗体或抗癌试剂)的一种或更多种组合物或药学制剂，或通过将所述组织、肿瘤和/或细胞暴露于两种或更多种不同的组合物或制剂，其中一种组合物提供1)多肽或抗体，2)抗癌试剂，或3)多肽或抗体以及抗癌试剂两者。并且，还期待的是，这样的组合治疗可以用于与化疗、放疗、手术治疗或免疫治疗结合。
当应用于细胞时，术语“接触”和“暴露”在此用于描述一种过程，通过该过程治疗性多肽或抗体以及化学治疗试剂或放射冶疗试剂被递送给靶细胞，或置于与靶细胞直接邻近。为了实现细胞杀灭，例如，两种试剂都以组合的有效量递送给细胞以杀死细胞或防止它分裂。
所述抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽可以相对于第二或其他抗癌治疗在之前、期间或之后或以各种组合来施用。所述施用的间隔可以是从同时到数分钟到数天或数周。在所述抗体或多肽与抗癌剂独立地提供给患者的实施方式中，一般应确保每次递送的时间之间不超出显著的时间段，使得两种化合物仍能对患者发挥有益的组合效果。在这种情况下，期待的是，可以在相互间约12到24或72小时内向患者提供抗糖基化BTLA 抗体或糖基化BTLA多肽与第二治疗，更特别地，在相互间6-12小时之内。在某些情况下，治疗的时间周期可以显著地延展，其中在各个施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
在某些实施方式中，疗程可以持续1-90天或更久(这一范围包括间隔的天数)。期待的是，一种试剂可以在第1天到第90天(这个范围包括间隔的天数)的任一天或其任何组合给予，另一种试剂在第1天到第90天(这个范围包括间隔的天数)的任一天或其任何组合给予.在一天内(24小时)，可以给予患者所述试剂的一次或多次施用。此外，在疗程之后，期待的是有一不施用抗癌治疗的时间期。这一时间期可以持续1-7天，和/或1-5周，和/或1-12个月或更久(这一范围包括间隔的天数)，取决于患者的状况，例如，他们的预后、力量、健康，等。根据需要可以重复治疗周期。
可以采用各种组合。以下列出的是一些实例，抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽的治疗为“A”，第二抗癌治疗为“B”：
Figure BDA0001750882220000841
与第二治疗组合地向患者施用本文提供的任何抗体、多肽或药物组合物将遵循施用这样的第二治疗的一般方案，如果有的话，考虑所述第二治疗的毒性。因此，在某些实施方式中，存在一监视可归因于组合治疗的毒性的步骤。
化疗
各种各样的化学治疗剂可以根据当前的实施方式作为第二治疗使用。化学治疗剂可以是在癌治疗中施用的化合物或组合物。这些试剂或药物可以通过它们在细胞内的活性的方式来分类，例如，它们是否和在什么阶段影响细胞周期。做为选择，试剂可以根据它直接交联DNA的能力、插入 DNA的能力、或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变来表征。
化学治疗剂的实例包括烷化剂，例如，塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如，白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如，苯佐替哌 (benzodopa)、卡巴醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基乙烯亚胺，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺 (triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫化磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺 (trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)(特别是布拉他辛 (bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素类(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素2)；多拉司他丁(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin) (包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)； pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑制素；氮芥类，例如，苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、盐酸甲二氯二乙胺氧化物、米尔法兰、新氮芥(novembichin)、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼莫司汀、曲磷胺和尿嘧啶氮芥；亚硝基脲(nitrosurea)，例如，卡莫司汀、吡葡亚硝脲、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，例如，烯二炔抗生素类(例如，卡奇霉素,特别是卡奇霉素gammall 和卡奇霉素omegall)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，，例如，氯屈膦酸盐(clodronate)；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素发色团和相关色素蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素 (aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、争光霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycini)、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素、地托比星 (detorubicin)、6-重氮基-5-侧氧基-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代- 多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(诸如丝裂霉素C)、霉酚酸 (mycophenolicacid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、奎那霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，诸如氨甲蝶呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如迪诺特宁(denopterin)、蝶罗呤 (pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、噻咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如，环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，诸如卡芦睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇 (epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药，例如，米托坦、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；贝斯布西(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfomithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素 (epothilone)；乙环氧啶(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；类美登素(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine) 和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他汀(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺 (spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)； 2,2',2-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecene)(特别是T-2毒素、粘液霉素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷 (pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷("Ara-C")；环磷酰胺；类紫杉醇，例如紫杉醇和多西他赛吉西他滨(docetaxelgemcitabine)6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂配位络合物，例如，顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙；柔红霉素；氨基喋呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸 (DMFO)；类视黄素，例如，视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；卡铂、甲基苄肼(procarbazine)、林可霉素(Lincomycin)、吉西他滨、诺维本 (navelbine)、法呢基蛋白质转移酶抑制物、反铂(transplatinum)；和以上任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
放疗
可以与本文描述的方法和组合物组合使用的其他常规的抗癌治疗是放疗，或放射治疗。放疗包括使用γ-射线、X-射线，和/或放射性同位素向肿瘤细胞的直接递送。其他形式的DNA破坏因素也是期待的，例如，微波、质子束辐射(美国专利No.5,760,395和4,870,287；它们所有通过引用全部合并在本文中)，和UV-照射。最可能的是所有这些因素对DNA、对DNA 的前体、对DNA的复制和修复、以及对染色体的组装和维持起到广泛的破坏。
由于存在骨髓衍生的抑制细胞和调节性T细胞，它们浸润肿瘤并起作用来抑制免疫反应，肿瘤微环境内在地是抑制性的。此外，T细胞和抗原递呈细胞(APCs)上某些抑制分子的表达可能限制有效的免疫反应。辐射通过诱导肿瘤细胞细胞凋亡、衰老、自体吞噬来介导抗肿瘤效应，在某些情况下，可以刺激更有效的免疫反应。
远隔效应是一种生理过程，其中原发性肿瘤的靶向辐射在不在辐射场的远处部位诱导抗肿瘤反应。负责远隔效应的机制被认为是免疫介导的并且涉及肿瘤抗原向T细胞的增强呈递，以及刺激局部和全身性免疫反应的细胞因子和其他前炎性因子的是否。由于远隔效应影响远离接受放射治疗的原发肿瘤的肿瘤，可以引发远隔效应的药物在治疗转移性肿瘤方面特别有利，转移性肿瘤一旦扩散到体内的继发部位，通常更难以治疗。
本文描述的抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽可以刺激局部和全身性免疫应答。在某些实施方式中，治疗有效量的本文描述的抗体、多肽或药物组合物在放疗之前、同时或之后施用以实现协同的远隔效应。
在某些实施方式中，施用治疗有效量的本文描述的抗体、多肽或药物组合物，其有效地使宿主中的肿瘤对辐射敏感。辐射可以是电离辐射，特别是gamma辐射。在某些实施方式中，gamma辐射通过线性加速器或通过放射性核素发出。放射性核素对肿瘤的辐射可以是外部的或内部的。
在某些实施方式中，在辐射肿瘤之前，开始施用本文描述的抗体、多肽或药物组合物达到一个月，特别地达到10天或一周。另外，辐射肿瘤被分开，施用本文描述的抗体、多肽或药物组合物维持在第一次和最后一次辐射期间之间的间隔中。
辐射还可以是X-射线辐射。X-射线的剂量范围从50到200伦琴的每日剂量持续延长的时间(3到4周)，到2000到6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很大，取决于同位素的半衰期、发出的辐射的强度和类型，以及赘生性细胞的摄取。
免疫治疗
熟练技术人员将理解，免疫治疗可以与所述实施方式的方法组合地或共同地使用。在癌症治疗的情境下，免疫治疗一般依靠运用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0001750882220000871
是这样的实例。检查点抑制物，例如，伊匹单抗是另一种这样的实例。免疫效应物可以是例如特异于肿瘤细胞的表面上的某些标志物的抗体。单独的抗体可以充当治疗的效应物，或它可以征募其他细胞来实际上影响细胞杀灭。抗体还可以缀合到药物或毒素(例如，化学治疗剂、放射性核素、篦麻蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素)，仅充当靶向剂。做为选择，效应物可以是带有表面分子的淋巴细胞，其直接或间接地与肿瘤细胞目标相互作用各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
在免疫治疗的一个方面，肿瘤细胞带有某些标志物，其可被靶向，即，不存在于大部分其他细胞上。已有许多肿瘤标志物，它们中的任何可以适合于在当前实施方式的情况下靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、Sialyl Lewis抗原、MucA、 MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫治疗的可选择的方面是组合抗癌效应和免疫刺激效应。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，例如，IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN、趋化因子，例如，MIP-1、 MCP-1、IL-8和生长因子，例如，FLT3配体。
当前处于研究中或在用的免疫治疗的实例有免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物(美国专利Nos.5,801,005 and 5,739,169；Hui andHashimoto,Infect Immun.,66(11):5329-36(1998)； Christodoulides et al,Microbiology,66(11):5329-36(1998))；细胞因子治疗，例如干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski et al,Clin Cancer Res.,4(10):2337-47(1998)；Davidson et al,JImmunother.,21(5):389-98 (1998)；Hellstrand et al.,Acta Oncol.37(4):347-53(1998))；基因治疗，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin et al,Proc Natl Acad Sci USA,95(24): 14411-6(1998)；Austin-Ward and Villaseca,Rev Med Chil,126(7):838-45(1998)；美国专利Nos.5,830,880和5,846,945)；以及单克隆抗体，例如，抗-PDl、抗-PDLl、抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-pl85(Topalian et al, The New England journal ofmedicine,366:2443-2454(2012)；Brahmer et al, The New England journal ofmedicine 366:2455-2465(2012)；Hollander,Front Immunol(2012):3:3.doi:10.3389/fimmu.2012.00003；Hanibuchi et al,Int J Cancer,78(4):480-5(1998)；美国专利No.5,824,311)；所有这些通过完全引用合并在本文中。期待的是，一种或更多种抗癌治疗可以与涉及使用抗糖基化BTLA抗体或糖基化BTLA多肽的本文描述的治疗一起采用。
手术
大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除，其中全部或部分癌组织被物理移除、切除和/或破坏，并且可以与其他疗法结合使用，例如本实施方式的治疗、化疗，放疗，激素治疗，基因治疗，免疫治疗和/或可选择的治疗。肿瘤切除是指至少部分肿瘤的物理移除。除肿瘤切除外，手术治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和显微外科手术(莫氏手术)。
在切除部分或所有癌细胞、组织或肿瘤时，可能在体内形成空腔。治疗可以伴随有使用其他抗癌治疗的灌注、直接注射或区域的局部应用。例如，这样的治疗可以每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5 周，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月重复。这些治疗也可以是不同的剂量。
其他试剂
期待的是其他试剂可以与当前实施方式的某些方面组合使用来改善治疗的治疗效力。这些另外的试剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的上调的试剂、细胞抑制和分化试剂、细胞粘附抑制剂、提高超量增殖细胞对凋亡诱导物的敏感性的试剂、或其他生物试剂。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导可以提高对邻近的超量增殖细胞群的抗超量增殖作用。在其他实施方式中，细胞抑制剂或分化剂可以与当前实施方式的某些方面组合使用，以改善治疗的抗超量增殖功效。预期细胞粘附的抑制剂改善当前实施方式的效力。细胞粘附抑制物的实例有粘附斑激酶(FAK)抑制物和洛伐他汀。进一步预期提高超量增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其他试剂，例如抗体c225，可以与当前实施方式实的某些方面组合使用以改善治疗效力。
7.6.试剂盒和诊断剂
在各个方面，本文提供的是含有治疗试剂和/或其他治疗剂和递送剂的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒预期用于准备和/或施用本文提供的治疗。试剂盒可以包括一个或更多个密封的小瓶，其含有本文提供的任一种药物组合物。所述试剂盒可以包括，例如，至少一种抗糖基化BTLA抗体、或糖基化BTLA多肽，以及试剂，以制备、配制和/或施用本文提供的成分或进行一个或更多个本文提供的方法的步骤。
在某些实施方式中，所述试剂盒可以包括抗糖基化BTLA抗体和至少一种辅助试剂。在某些实施方式中，所述试剂盒可以包括糖基化BTLA多肽和至少一种辅助试剂。
在某些实施方式中，所述试剂盒进一步包括第二抗癌试剂。所述第二抗癌试剂可以是化学治疗剂、免疫治疗剂、激素治疗剂、或细胞因子。
在某些实施方式中，所述试剂盒还可以包括适合的容器装置，其是不与试剂盒的成分反应的容器，例如，eppendorf管、分析平板、注射器、瓶子或管。所述容器可以由可灭菌材料例如塑料或玻璃制成。
所述试剂盒可以进一步包括说明页，其列出了本文阐述的方法的过程步骤，将充分地遵循本文描述的相同过程，或是本领域普通技术人员已知的。说明信息可以处于含有计算机可读指令的计算机可读介质中，当使用计算机执行所述指令时，使得显示递送有效量的本文提供的抗体或多肽的真实的或虚拟的操作。所述试剂盒还可以包括管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构所规定形式的注意事项，所述注意事项反映了所述制造、使用或销售的机构对用于人类施用的批准。
8.实施例
要理解的是，不实质上改变本文描述的各种实施方式的性质和精神的修改也是期待的。因而，以下实施例意图进行说明而无论如果不是进行限制。
实施例1—糖基化BTLA结合抗体的生产
使用标准技术针对重组的糖基化BTLA多肽产生一组单克隆抗体(例如，通过将包含糖基化表位的多肽作为免疫原注射入大鼠(Aurrand-Lions et al,Immunity,5,391-405(1996)))。简要地说，与100μg KLH载体蛋白(钥孔血蓝素，Pierce)偶联，冰浴佐剂S6322(Sigma)混合的人类糖基化BTLA 多肽可以用于免疫雌性Wister大鼠。每9天总计进行三次注射。人糖基化 BTLA多肽的最后一次s.c.注射后两天，来自导液淋巴结的胚细胞与Sp2/0细胞融合，选择杂交瘤。针对特异性识别人糖基化BTLA的单克隆抗体生产，通过ELISA筛选生长的克隆。阳性克隆将进行亚克隆、再筛选和进一步测试。根据厂家的指导在蛋白G-Sepharose柱(GE Healthcare)上纯化抗体。单克隆抗体被用于体内肿瘤移植模型研究。对抗体的VH和VL链进行测序，通过EVIGT编号系统(Lefranc et al,Nuc.Acids Res.,27:209-212 (1999))确定互补决定区(CDR)。
如上文指出的，为了某些目的，包括例如，用于人类疾病的体内治疗，优选的是采用小鼠单克隆抗体的人源化衍生物。为了形成这样的人源化抗体，小鼠单克隆抗体的框架序列(“亲本”序列)首先与一组“接受体”人抗体的框架序列比对，以鉴定框架序列中的差异。通过取代亲本和接受体之间不匹配的框架残基实现人源化。分析潜在重要位置上的取代，例如Vernier 区，VH/VL链间界面或CDR规范类别决定位置的取代，以预期回复突变(参见Foote,J.et al,J.Molec.Biol.224:487-499(1992))。
保守结构域数据库(Conserved Domain Database，COD)(Marchler-Bauer, etal.(2011)Nucleic Acids Res.39:D225-D229)可以用于确定每个氨基酸链的结构域内容以及每个结构域的大约边界。根据几种常用的定义，可变域边界可以沿着CDR的边界精确确定(Kabat,E.A.et al.(1991)"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Fifth Edition.NIH Publication No. 91-3242；Chothia,C.et al,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Honegger,A.et al,J.Molec.Biol.309(3):657-670(2001))。
使用MAFFT(Katoh,K.et al,Nucleic Acids Res.30:3059-3066(2002)) 产生亲本序列与小鼠和人类种系序列的多重比对，每个比对中的条目根据与亲本序列中、的序列同一性进行排序。通过以100％序列同一性聚类并排除冗余条目，将参考集简化为唯一的序列集。
最佳的接受体框架选择基于在两条链的框架上与接受体的总体亲本抗体序列同一性；然而，组成VH/VL链间界面的位置特别令人感兴趣。另外，对已经为5个CDR定义的规范结构离散集负责的CDR环长度和CDR位置 (Chothia,C.et al,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Martin,A.C.et al,J. Molec.Biol 263:800-815(1996)；Al-Laziniki,B.et al,J.Molec.Biol. 273:927-948(1997))与种系比较，以确定哪个种系框架兼备相同的界面残基，并且已知支持类似的CDR环构象。
根据亲本抗体与人类种系的序列比对，鉴定最接近的匹配条目。优选的人类种系的选择基于有序的指标：(1)整个框架的序列同一性；(2)相同或相容的链间界面残基；(3)具有亲本CDR规范构象的支持环；(4)在表达的抗体中存在重和轻的种系的组合；以及(5)必须除去的N-糖基化位点的存在。
产生人源化抗体的Fv区的结构模型。FR和CDR以及完整Fv的候选结构模板片段进行计分、排列和从抗体数据库中选择，基于它们与目标的序列同一性，以及模板结构的定性晶体学测量，例如，在埃(A)的分辨率下。
为了在结构上将CDR与FR模板对准，将CDR两侧的5个残基包括在 CDR模板中。片段的对准根据重叠片段和所产生的结构序列对准来产生。模板片段和对准由MODELLER(Sail,A.et al.；J.Molec.Biol.234:779-815 (1993))处理。这种方案产生了来自一组对准的结构模板的构象约束。满足所述约束的结构整体通过共轭梯度和模拟退火优化过程来创建。在从蛋白质结构计分和对构象约束的满足性得出的能量计分的基础上，从这种整体中选择模型结构。检查模型，目标和模板之间有差异的位置的侧链使用侧链最优化算法和能量最小化来优化。使用一套可视化和计算工具来评估 CDR构象变异性、局部包装和表面分析，以选择一个或更多个优选的模型。
构建亲本抗体的结构模型并检查缺陷，例如，不良的原子排列、键长度的张力、键角或二面角。这些缺陷可能表面抗体结构稳定性的潜在问题。建模方案试图最小化这样的缺陷。人源化Fv的起始结构模型含有所有安全的取代(即，不应影响结合亲和性或稳定性的取代)和谨慎的取代(即，进行位置取代，但是所述位置对于结合亲和性可能是重要的)。在被认为与降低结合亲和性或降低稳定性的风险相关的位置处的取代不做改变。与亲本模板搜索独立地进行模板搜索，以创造良好的自立模型，而不是亲本的紧密匹配的变体模型。随着对潜在取代进行评估，模型被更新以反映优选的取代和回复突变的效果。
基本上如上所述针对人糖基化BTLA多肽产生小鼠单克隆抗体(mAb)。简言之，根据标准方案，通过用与100μg KLH载体蛋白联结的人糖基化 BTLA多肽免疫BALB/c小鼠，融合SP2/0鼠骨髓瘤细胞和分离自BALB/c 小鼠的脾脏细胞，获得针对BTLA的抗体生产杂交瘤。在融合之前，使用 FACS验证来自免疫小鼠的血清对免疫原的结合。过量表达BTLA WT(完全糖基化的)的T293细胞用生物素标记，然后混合过量表达完全未糖基化的BTLA的T293细胞。混合的细胞与针对BTLA的初级抗体孵育，进一步用缀合了FITC的二级抗体洗涤。在洗涤之后，测量荧光强度(MFI)来评估抗体与膜结合的糖基化或未糖基化BTLA的相对结合。相对未糖基化的 BTLA在糖基化BTLA上展现显著更高的MFI的抗体被鉴定为“糖特异性”抗体。产生了几个生产单克隆抗体的杂交瘤，包括产生命名为STC601到 STC636的小鼠mAb的36个杂交瘤。
实施例2-糖基化BTLA结合抗体的同种分型
使用Sigma-Aldrich IS02 SIGMA小鼠单克隆抗体同种分型试剂，通过杂交瘤上清液的ELISA测试确定STC601到STC636 mAb的同种型。
简而言之，100μL杂交瘤上清液(1：20)或纯化的抗体(1μg/mL) 在白色NuncMaxisorp 96孔板中在37℃下吸附1小时，随后在21℃下用PBS 中的1％BSA洗涤和阻断30分钟，洗涤，在21℃下添加PBS中1:1000稀释的100μl同种分型溶液(Sigma Aldrich,St.Louis,MO,US)持续30分钟，处于21℃下的1:5000抗山羊IgG-HRP，用BioRad ClarityWestern ECL底物 (BioRad,Hercules,CA,US)和Victor X3(PerkinElmer,Hopkinton,MA,US) 发展。
表9显示了同种型测定的结果。发现STC601-STC636包括IgG1、 IgG2A、IgG2B和IgG3/M同种型。
表9：抗BTLA mAb STC601-STC636的同种型
抗BTLA mAb 同种型
STC601 G2a
STC602 G1/2a
STC603 G2a
STC604 G1
STC605 G1
STC606 G1
STC607 G2a
STC608 G1
STC609 G2a
STC610 G1
STC611 G1
STC612 G3/M
STC613 G1
STC614 G1
STC615 G1
STC616 G2b
STC617 G1
STC618 G1
STC619 G2b
STC620 G1
STC621 G1
STC622 G1
STC623 G1
STC624 G1
STC625 G1
STC626 G2B
STC627 G1
STC628 G1
STC629 G1
STC630 G1
STC631 G1
抗BTLA mAb 同种型
STC632 G1
STC633 G1
STC634 M
STC635 G1
STC636 G1
实施例3-糖基化BTLA结合抗体的FACS分析
通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析抗BTLA mAb STC601-STC636 结合细胞表面表达的BTLA的能力。
简要地说，在293T细胞中重组地过量表达BTLA，通过FACS反之 STC601-STC636对BTLA-293T细胞和293T载体对照的结合。
细胞培养物、稳定的转染子和转染.所有细胞获自美国典型培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA,US)。这些细胞在补充有10％胎牛血清的 DMEM/F12或RPMI 1640培养基中生长。使用10μg/mL嘌呤霉素 (InvivoGen,San Diego,CA,US)选择BTLA稳定转染子293T细胞。对于瞬时转染，使用SN脂质体(Hu,M.C.et al.,2004,Cell,117:225-237)、 Lipofectamine2000、Lipofectamine LTX(Life Technologies,Carlsbad,CA, US)或PEL，用编码BTLA的质粒DNA转染细胞。
流式细胞计。过量表达BTLA或空载体的细胞通过胰蛋白酶消化分离，以2×106个细胞/mL采集在细胞染色缓冲液(Cell Staining Buffer，CSB) (BioLegend,San Diego,CA,US)中。50μL的细胞等分到96孔圆底平板中，向其中添加50μL的20μg/mL初级抗体，随后轻柔混合，在暗处4℃下孵育1小时。细胞用CSB洗涤，与抗小鼠IgG-PE缀合物(10μg/mL)和DAPI(1:100)在暗处21℃下孵育30分钟。洗涤细胞，使用Guava EasyCyte HT(MilliporeDarmstadt,DE)或FACS Celesta(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,US)流式细胞计获取数据。
表10显示了示范性的FACS分析结果，说明了抗BTLA mAb结合细胞表面表达的BTLA。发现STC601-STC636抗BTLA mAb都与细胞表面表达的BTLA结合，由相对于293T空载体对照用表达BTLA的293T细胞观察到的更强结合FACS信号(提高的门选％，提高的MR)所指示。
表10：抗BTLA mAb STC601-STC636的FACS分析
Figure BDA0001750882220000941
Figure BDA0001750882220000951
实施例4-糖基化BTLA结合抗体的糖特异性
通过斑点印迹和Western印迹分析分析了抗BTLA mAb的糖特异性。
斑点印迹
在斑点印迹分析中测试了STC601-STC636抗BTLA mAb对糖基化 BTLA和脱糖基化的(N-糖苷酶F(PGNaseF)处理)BTLA的糖特异性结合。
简而言之，0.5μg/孔(5μg/ml；100μl每孔)的糖基化BTLA或脱糖基化的BTLA固定在96孔斑点印迹装置(Bio-Dot BioRad,Hercules,CA,US) 的硝化纤维膜上。封闭膜，然后与杂交瘤上清液(5μg/mL；100μl每孔) 或纯化的小鼠单克隆抗体(1μg/mL，100μl每孔)在4℃孵育12小时。通过二级抗体(例如1:5,000-1:20,000抗小鼠HRP二抗；Jackson Labs,BarHarbor,ME,US)检测抗体对硝化纤维膜上固定的BTLA的结合，并成像(例如SuperSignalWest Femto,ThermoFisher Waltham,MA,US或Chemdoc imager,BioRad,Hercules,CA,US)。
附图1A和1B显示了抗BTLA mAb STC601-STC636的示范性的斑点印迹分析。测试了每种抗BTLA mAb(加载0.5μg/孔)与糖基化BTLA (PNGaseF“-”)或脱糖基化的BTLA(PNGaseF“+”)的结合。非特异性抗体对照(“IgG”，加载0.25μg/孔)和商业上可获得的BTLA参考抗体(BioLegend,San Diego,CA,US,"BioLegend"，加载5μg/孔)也被包括在该分析中。附图1A显示了测试抗体和对照的实验配置。附图1B描绘了用 STC601-STC636 mAb和对照获得的实验斑点印迹分析的结果。几种单克隆抗体，包括STC602、STC604、STC605、STC606、STC607、STC608、STC609、 STC610、STC611、STC612、STC613、STC614、STC616、STC617、STC618、STC619、STC620、STC621、STC622、STC623、STC624、STC626、STC627、 STC628、STC629、STC630、STC631、STC632、STC634、STC635和STC636 显示了对糖基化BTLA的糖特异性结合。
Western印迹
通过免疫沉淀/Western印迹分析进一步分析了抗BTLA mAb的糖特异性结合。
免疫印迹分析。如早先描述的进行免疫印迹分析(Lim et al.,2008,Gastroenterology,135:21 28-40；and Lee et al.,2007,Cell,130:440-455)。使用Chemdoc Imager(BioRad,Hercules,CA,US)进行图象获取和条带强度的定量。二级抗体是抗小鼠或抗兔Alexa Fluor 488或594，核用4'，6-二脒基-2- 苯基吲哚(DAPI)(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，US)染色。
附图2显示了抗BTLA mAb STC604、STC605、STC606、STC608、 STC610、STC613、STC618、STC622、STC626、STC627、STC628、STC630、 STC635、和STC636的示范性的Western印迹分析结果。在Western印迹分析中，测试了抗BTLA mAb识别完全糖基化的野生型BTLA的能力，以及识别缺乏两个(N75/2NQ、N94/2NQ、N116/2NQ)或全部三个(3NQ)BTLA 的糖基化位点的某些BTLA突变体的能力。发现所有测试的抗体识别糖基化的野生型BTLA(WT)。此外，发现所有测试的抗BTLA mAb识别仅在 BLTA N75、N94或N110处保留单个糖基化位点的一种或更多种BTLA双突变体。一般地，在附图2的Western印迹中显示的条带强度表明每种测试的抗体识别的特定糖基化基序，以及测试的抗体对所识别的糖基化基序的结合强度。相反，对于没有保留BTLA的N75、N94或N110糖基化位点的 BTLA三突变体，发现所有测试的抗体仅显示了背景结合，如果有结合的话。
实施例5-糖基化BTLA结合抗体的结合亲和力和分箱(binning)
包括STC601-STC636的抗BTLA mAb根据它们对BTLA的各自的结合亲和力来表征，在竞争结合分析和表位分箱实验中进一步评估。
KD测定和分箱。20nM溶液中的抗体/BTLA复合物加载到ForteBio's APC传感器上，在具有1mg/mL BSA的PBS(分析缓冲液)中建立基线。通过将传感器浸入分析缓冲液中的抗BTLA抗体中进行缔合。在新鲜的分析缓冲液中进行解离。所有实验均在传感器以1,000rpm振荡下进行。来自ForteBio的数据分析软件用于将数据拟合至1:1结合模型，来映射缔合和解离速率。使用kd/ka比值来计算kD。在典型的表位分箱分析中，在21℃下将10nM BTLA-His与His抗体(10nM)预孵育1小时。对照抗体(20nM) 加载到AMC传感器(ForteBio,MenloPark,CA,US)上，传感器上剩余的 Fc结合位点用全长小鼠IgG抗体(Jackson,Bar Harbor,ME,US)封闭。将传感器暴露于预孵育的抗原/二级抗体混合物。使用Data AnalysisSoftware 7.0(ForteBio,Menlo Park,CA,US)处理原始数据，评估抗体对的竞争性结合。第二抗体的额外结合表面未占据的表位(非竞争剂)，而没有结合表明表位阻断(竞争剂)。SPRBiacore X-100还用于kD测定。蛋白A芯片或固定了小鼠IgG捕获抗体的CM5芯片(BIAcore,Zilina,SK)以600个响应单位(RU)用抗体包被，将BTLA ECD注射到微流通道中。使用BIAevaluation 软件(BIAcore,Zilina,SK)的拟合工具获得kD值。
表11概述了抗BTLA mAb STC604、STC610、STC613、STC618、 STC622、STC626和STC635对BTLA的动力学结合常数(ka和kd率)以及结合亲和力(KD值)。附图3A-C说明了测试抗BTLA mAb STC613、 STC626和STC635对BTLA的动力学结合常数和结合亲和力的示范性的SPR(BIAcore)实验的结果。
表11：抗BTLA mAb对BTLA的结合亲和力。
Figure BDA0001750882220000971
附图4A和表12说明了STC613的示范性的竞争分析和分箱实验的结果。附图4B和表13说明了STC636的示范性的竞争分析和分箱实验的结果。表14提供了分箱结果的概述。发现STC613和STC636相互间不竞争 BTLA结合。发现STC605、STC608、STC626、STC627、STC628、STC630、 STC631和STC636与STC636竞争BTLA结合，但不与STC613竞争。发现STC604、STC606、STC610、STC613、STC618、STC622和STC635与 STC613竞争BTLA结合，但不与STC636竞争。
表12：抗BTLA mAb与STM613的分箱
Figure BDA0001750882220000972
Figure BDA0001750882220000981
表13：抗BTLA mAb与STM636的分箱
抗BTLA mAb 加载的样品ID 响应 配对/阻断
STC605 STC636 0.0033 阻断
STC608 STC636 0.0129 阻断
STC613 STC636 0.4355 配对
STC626 STC636 -0.02 阻断
STC627 STC636 0.0305 阻断
STC628 STC636 0.0347 阻断
STC630 STC636 0.0346 阻断
STC631 STC636 0.0216 阻断
表14：分箱结果的概述
Figure BDA0001750882220000982
实施例6：糖基化BTLA结合抗体的中和活性
利用ELISA分析，针对抗BLTA mAb抑制BTLA-HVEM蛋白质相互作用的能力来评估它们。
通过ELISA的BTLA与HVEM相互作用抑制。通过BTLA:HVEM抑制物筛选分析试剂盒(Cat.#72008,BPS Bioscience,San Diego,CA,US)，厂家的说明使用，评估抗体中和活性。将BTLA包被在96孔平板上，随后首先添加0.5或5μg/mL抗体，然后添加生物素化的HVEM到反应中，随后是链霉抗生物素蛋白-HRP。在添加HRP底物之后测量化学发光。
表15提供了示范性的ELISA结果，说明了抗BTLA mAb抑制 BTLA-HVEM蛋白质相互作用的能力，表示为相对于对照的抑制百分比，对照反映了未抑制的BTLA-HVEM相互作用。例如，在5μg/ml的浓度下，发现STC613抑制99.0％的BTLA-HVEM相互作用，发现STC626抑制96.8％的BTLA-HVEM相互作用，发现STC635抑制97.3％的BTLA-HVEM相互作用。附图5和附图6说明了BTLA-HVEM竞争性ELISA的示范性的结果。发现STC613以1.088μg/ml的IC50抑制BTLA-HVEM相互作用。发现 STC626以0.416μg/ml的IC50抑制BTLA-HVEM相互作用。
表15：抗BTLA mAb对BTLA:HVEM相互作用的抑制
Figure BDA0001750882220000991
Figure BDA0001750882220001001
实施例7-STC613的表位作图
抗BTLA mAb STC613的表位作图使用化学交联的高质量MALDI质谱和nLC-Orbitrap质谱(CovalX AG,Zurich,Switzerland)进行。
用于STC613表位作图的BTLA抗原具有以下氨基酸序列：
Figure BDA0001750882220001002
表16-20提供了在Asp-N、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的蛋白水解之后鉴定的单独的肽的序列。在组合中，所有五种蛋白水解样品中鉴定出的BTLA肽覆盖了100％的BTLA氨基酸序列SEQ ID NO：86。
表16提供了在胰蛋白酶蛋白水解之后鉴定的34种BTLA肽，覆盖了 SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列的84.3％。
表16:胰蛋白酶蛋白水解之后鉴定的BTLA肽
Figure BDA0001750882220001003
Figure BDA0001750882220001011
Figure BDA0001750882220001021
*肽位置相对于SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列标出。
表17提供了在糜蛋白酶蛋白水解之后鉴定的75种BTLA肽，覆盖了SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列的96.88％。
表17：糜蛋白酶蛋白水解之后鉴定的BTLA肽
Figure BDA0001750882220001022
Figure BDA0001750882220001031
Figure BDA0001750882220001041
*肽位置相对于SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列标出。
表18提供了在Asp-N蛋白水解之后鉴定的7种BTLA肽，覆盖了SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列的26.56％。
表18：Asp-N蛋白水解之后鉴定的BTLA肽
Figure BDA0001750882220001051
*肽位置相对于SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列标出。
表19提供了在弹性蛋白酶蛋白水解之后鉴定的4种BTLA肽，覆盖了SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列的21.09％。
表19：弹性蛋白酶蛋白水解之后鉴定的BTLA肽
Figure BDA0001750882220001052
*肽位置相对于SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列标出。
表20提供了在嗜热菌蛋白酶蛋白水解之后鉴定的18种BTLA肽，覆盖了SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列的50.00％。
表20：嗜热菌蛋白酶蛋白水解之后鉴定的BTLA肽
Figure BDA0001750882220001053
Figure BDA0001750882220001061
*肽位置相对于SEQ ID NO：86的BTLA氨基酸序列标出。
为了以高分辨率测定STC613的BTLA表位，BTLA/STC613复合物与氘化的交联接头孵育并经历多酶裂解(Asp-N、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶)，使用nLC-Orbitrap质谱分析样品。胰蛋白酶、ASP-N和弹性蛋白酶消化不引起交联的BTLA和STC613肽的检出。表12提供了在糜蛋白酶蛋白水解之后鉴定的五个交联的STC613和 BTLA肽。表22提供了在嗜热菌蛋白酶蛋白水解之后鉴定的一个交联的 STC613-BTLA肽。
表21：在糜蛋白酶蛋白水解之后用氘化的交联接头鉴定的BTLA肽
Figure BDA0001750882220001062
Figure BDA0001750882220001071
*肽位置相对于SEQ ID NO：2和4(蛋白质1)以及SEQ ID NO ：86(蛋白质2)的BTLA氨基酸序列标出。
表22：在嗜热菌蛋白酶蛋白水解之后用氘化的交联接头鉴定的BTLA 肽
Figure BDA0001750882220001072
*肽位置相对于SEQ ID NO：2和4(蛋白质1)以及SEQ ID NO： 86(蛋白质2)的BTLA氨基酸序列标出。
附图7显示了说明BTLA/STC613分子界面的更高分辨率分析的结果的图形。分析显示，STC613的BTLA表位包括BTLA的三个区域，包括氨基酸序列
IKRQSEHSILA(SEQ ID NO：167),
VKLEDRQTSWK(SEQ ID NO：168),和
NGSYRCSANFQ(SEQ ID NO：169)。
发现STC613的表位包括BTLA(SEQ ID NO：86)的氨基酸R12、H16、 K51、T57、S82和S86。
***
在整个本申请中，已经参考了各种出版物。这些出版物的完整的公开内容通过引用合并到本申请中，以更完整地描述本公开内容所属领域的现有水平。虽然本文提供了某些特定实施方式的实施例，对于本领域技术人员显而易见的是可以进行各种改变和修饰。这种修改也将落在附随的权利要求的范围之中。
参考文献
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美国专利5,801,005
美国专利5,821,337
美国专利5,824,311
美国专利5,830,880
美国专利5,844,091
美国专利5,846,945
美国专利5,858,657
美国专利5,861,155
美国专利5,871,907
美国专利5,969,108
美国专利6,054,297
美国专利6,165,464
美国专利6,365,157
美国专利6,406,867
美国专利6,709,659
美国专利6,709,873
美国专利6,753,407
美国专利6,814,965
美国专利6,849,259
美国专利6,861,572
美国专利6,875,434
美国专利6,881,557
美国专利6,891,024
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序列表
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<120> 特异于糖基化的BTLA的抗体及其使用方法
<130> 604556-228009
<140>
<141>
<150> 62/262,293
<151> 2015-12-02
<160> 169
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 289
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Lys Thr Leu Pro Ala Met Leu Gly Thr Gly Lys Leu Phe Trp Val
1 5 10 15
Phe Phe Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Ile Trp Asn Ile His Gly Lys Glu
20 25 30
Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
35 40 45
Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala
50 55 60
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val
65 70 75 80
Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser
85 90 95
Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser
100 105 110
Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Val Thr Asp Val Lys Ser Ala Ser Glu Arg Pro Ser
130 135 140
Lys Asp Glu Met Ala Ser Arg Pro Trp Leu Leu Tyr Arg Leu Leu Pro
145 150 155 160
Leu Gly Gly Leu Pro Leu Leu Ile Thr Thr Cys Phe Cys Leu Phe Cys
165 170 175
Cys Leu Arg Arg His Gln Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala
180 185 190
Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp Ala His Leu Lys Ser Glu Gln Thr
195 200 205
Glu Ala Ser Thr Arg Gln Asn Ser Gln Val Leu Leu Ser Glu Thr Gly
210 215 220
Ile Tyr Asp Asn Asp Pro Asp Leu Cys Phe Arg Met Gln Glu Gly Ser
225 230 235 240
Glu Val Tyr Ser Asn Pro Cys Leu Glu Glu Asn Lys Pro Gly Ile Val
245 250 255
Tyr Ala Ser Leu Asn His Ser Val Ile Gly Pro Asn Ser Arg Leu Ala
260 265 270
Arg Asn Val Lys Glu Ala Pro Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Cys Val Arg
275 280 285
Ser
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 2
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Asp
20 25 30
Tyr Val His Trp Leu Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Glu Gly Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 3
gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt taacattaga gacgactatg tgcactggtt gaaacagagg 120
cctgatcagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtaa aactaaatat 180
gacccgaagt tccaggacaa ggccactata actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct atttctgtgt tagagagggg 300
ggtagtaact acgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 4
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Ile His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 5
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 5
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtct gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tgtgggagtt tattattgct ggcaaggtat tcattttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 6
Gly Phe Asn Ile Arg Asp Asp
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 7
Asp Pro Ala Asn Gly Lys
1 5
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 8
Glu Gly Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 9
Gly Phe Asn Ile Arg Asp Asp Tyr Val His
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 10
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 11
Glu Gly Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 12
Asp Asp Tyr Val His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 13
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 14
Glu Gly Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 15
Arg Asp Asp Tyr Val His
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 16
Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 17
Val Arg Glu Gly Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Ala Met Asp
1 5 10
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 18
Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 19
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 19
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 20
Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 21
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 21
Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
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Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
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Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
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Lys Ser Ser Leu Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
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Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
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Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Arg Thr
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
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Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu
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<211> 10
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<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 28
Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
1 5 10
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成
肽"
<400> 29
Trp Gln Gly Ile His Phe Pro Arg
1 5
<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 30
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 31
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct 120
ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaacatat 180
gctgaagagt tcaagggacg gattgccttc tctttggaat cctctgccag cactgcctat 240
ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggccacat atttctgtgc aagagaggga 300
gtgcgacggg gggggtactt ttttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tca 363
<210> 32
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Tyr His Cys Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
100 105
<210> 33
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 33
gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctatctgtat ctgtgggaga aactgtcacc 60
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agcaatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaatctc ctcagctcct ggtctatgct gcaacaaact tagcagatgg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tattccctca agatcaacag cctgcagtct 240
gaagattttg ggagttatca ctgtcaacat ttttggggtt ttccattcac gttcggcgcg 300
gggacaaagt tggaaataaa acgggct 327
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 34
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 35
Asn Thr Asn Thr Gly Glu
1 5
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 36
Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 37
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 38
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr
1 5 10
<210> 39
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 39
Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 40
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 41
Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 42
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 42
Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Phe Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 43
Thr Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 44
Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr
1 5 10
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 45
Ala Arg Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Phe Phe Asp
1 5 10
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 46
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 47
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 48
Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 49
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 50
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 51
Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 52
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 53
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 54
Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Phe Thr
1 5
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 55
Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
1 5
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 56
Leu Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 57
Gln His Phe Trp Gly Phe Pro Phe
1 5
<210> 58
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 58
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Leu Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 59
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 59
gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaagc caggggcctc agtcaagttg 60
tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata tgcactgggt gaggcagagg 120
cctgaacagg gcctggagtg gattggaagg attgatcctg cgaatggtta tactaaatat 180
gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagcagaca catcctccaa cacagcctac 240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtct catctatgat 300
ggttactacg actcctttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多肽"
<400> 60
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Pro Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Val
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成多核苷酸"
<400> 61
gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggttc ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaagttac acattttcct 300
cggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 62
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 63
Asp Pro Ala Asn Gly Tyr
1 5
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 64
Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 65
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
1 5 10
<210> 66
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 66
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys
1 5 10
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 67
Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 68
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 69
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 70
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 70
Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Ser Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 71
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 71
Lys Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 72
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 72
Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Tyr Thr Lys
1 5 10
<210> 73
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 73
Leu Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Asp Ser Phe Asp
1 5 10
<210> 74
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 74
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 75
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 76
Trp Gln Val Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 77
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 77
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 78
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 79
Trp Gln Val Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 80
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 80
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 81
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 82
Trp Gln Val Thr His Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 83
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 83
Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu
1 5 10
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 84
Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
1 5 10
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列描述: 合成肽"
<400> 85
Trp Gln Val Thr His Phe Pro Arg
1 5
<210> 86
<211> 128
<212> PRT
<213> 智人
<400> 86
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His
1 5 10 15
Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
20 25 30
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr
35 40 45
Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
50 55 60
Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn
65 70 75 80
Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser
85 90 95
His Ser Thr Thr Leu Tyr Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp
100 105 110
Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp His His His His His His
115 120 125
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys
1 5 10
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys
1 5 10
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 90
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 92
<211> 32
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu
1 5 10 15
Cys Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys
20 25 30
<210> 93
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 93
Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu
1 5 10 15
Cys Pro Val Lys
20
<210> 94
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu
1 5 10 15
Cys Pro Val Lys
20
<210> 95
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 95
Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys
1 5 10 15
Pro Val Lys
<210> 96
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<400> 96
Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys
1 5 10 15
Pro Val Lys
<210> 97
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 97
Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys
1 5 10 15
Pro Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys
20 25 30
<210> 98
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 98
Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys
1 5 10
<210> 99
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 99
Asn Ile Ser Phe Phe Ile Leu His Phe Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp
1 5 10 15
Asn Gly Ser Tyr Arg
20
<210> 100
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<400> 100
Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr
1 5 10 15
Leu Tyr Val Thr Gly Lys
20
<210> 101
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 101
Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg
1 5 10
<210> 102
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 102
Glu Ile Asn Leu Val Asp His His His His His His
1 5 10
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Cys(脲基甲基)
<400> 103
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 104
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu
1 5
<210> 105
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Cys(脲基甲基)
<400> 105
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr
1 5
<210> 106
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 106
Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu
1 5 10
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 107
Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe
1 5 10 15
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 108
Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
1 5
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala Gly Asp Pro Phe Glu
1 5 10 15
Leu
<210> 110
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Cys(脲基甲基)
<400> 110
Ala Gly Asp Pro Phe Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
1 5 10
<210> 111
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp
1 5
<210> 112
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr
1 5
<210> 113
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Cys(脲基甲基)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asn(脱酰胺基)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Cys(脲基甲基)
<400> 113
Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr
1 5 10 15
Ser Trp
<210> 114
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Cys(脲基甲基)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Cys(脲基甲基)
<400> 114
Cys Lys Leu Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr
1 5 10 15
Ser Trp
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 115
Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp
1 5 10 15
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe Phe
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr
1 5
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn
1 5 10 15
Phe
<210> 120
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu
1 5
<210> 121
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 122
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu
1 5
<210> 123
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<400> 123
Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu
1 5 10
<210> 124
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
Lys Glu Glu Lys Asn Ile Ser Phe
1 5
<210> 125
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 125
Gln Ser Asn Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr
1 5 10
<210> 126
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr
1 5
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 127
Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
1 5
<210> 128
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 128
Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asn Leu
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
Cys Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp
1 5
<210> 130
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 130
Glu Cys Pro Val Lys Tyr
1 5
<210> 131
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 131
Glu Leu Glu Cys Pro Val Lys Tyr
1 5
<210> 132
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 132
Val Asp His His His His His His
1 5
<210> 133
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asn Leu Val Asp His His His His His His
20 25
<210> 134
<211> 26
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> Asn(脱酰胺基)
<400> 134
Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asn Leu Val Asp His His His His His His
20 25
<210> 135
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu
1 5 10
<210> 136
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln Leu Tyr
1 5
<210> 137
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
Ser Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp His His His His
1 5 10 15
His His
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 138
Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp
1 5
<210> 139
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 140
Tyr Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu Leu
1 5
<210> 141
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 141
Asp Val Gln Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala
1 5 10 15
Gly
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 142
Asp Thr Ala Gly Arg Glu Ile Asn Leu Val Asp His His His His His
1 5 10 15
His
<210> 143
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 143
Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His Val
1 5
<210> 144
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 144
Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys Leu
1 5 10
<210> 145
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
Lys Gln Asn Glu Leu
1 5
<210> 146
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser
1 5 10
<210> 147
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
Leu Ile Glu Ser His Ser Thr Thr
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 148
Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser
1 5
<210> 149
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
Lys Glu Ser Cys Asp Val Gln
1 5
<210> 150
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 150
Val Thr Gly Lys Gln Asn Glu
1 5
<210> 151
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
1 5
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 152
Val Lys Tyr Cys Ala Asn Arg Pro His
1 5
<210> 153
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
Ala Asn Arg Pro His Val Thr Trp Cys Lys
1 5 10
<210> 154
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys Glu Glu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Ile Glu Ser His Ser Thr Thr Leu Tyr
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 156
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
1 5
<210> 157
<211> 18
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 157
Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ser Leu
<210> 158
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 158
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
1 5 10 15
<210> 159
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 159
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr
1 5 10
<210> 160
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus sp.
<400> 160
Ile Ser Cys Lys Ser Ser Leu Ser Leu
1 5
<210> 161
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu
1 5 10
<210> 162
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp
1 5
<210> 163
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln Ser Asn Leu
1 5 10
<210> 164
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Asn Gly Thr Thr Cys Val Lys Leu
1 5
<210> 165
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Glu Pro Val Leu Pro Asn Asp Asn Gly Ser Tyr
1 5 10
<210> 166
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Leu Tyr Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile
1 5 10
<210> 167
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Ile Lys Arg Gln Ser Glu His Ser Ile Leu Ala
1 5 10
<210> 168
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Val Lys Leu Glu Asp Arg Gln Thr Ser Trp Lys
1 5 10
<210> 169
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Asn Gly Ser Tyr Arg Cys Ser Ala Asn Phe Gln
1 5 10

Claims (66)

1.一种结合BTLA的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：6的氨基酸序列组成的VH互补决定区1(CDR1)，
(2)由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：8的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：18的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：20的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(ii)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：10的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：22的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(iii)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：12的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：14的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：25的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(iv)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：16的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：27的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：29的氨基酸序列组成的VL CDR3。
2.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
3.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
5.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相对于未糖基化的BTLA选择性结合糖基化的BTLA。
6.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中相对于未糖基化的BTLA，所述抗体或抗原结合片段选择性地结合在位置N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的BTLA。
7.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性遮蔽BTLA的糖基化基序，所述BTLA的糖基化基序包含BTLA位置N75、N94、N110或其任何组合。
8.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段对糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过相比与未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍的荧光强度来表明。
9.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含SEQ ID NO：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的五个或更多个连续氨基酸的序列。
10.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含与SEQ ID NO：86的BTLA的R12、H16、K51、T57、S82或S86相应的一个或更多个氨基酸。
11.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制HVEM与BTLA的结合。
12.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是重组的。
13.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
14.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、单价的scFv、二价的scFv或单结构域抗体。
15.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
16.权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体缀合到成像试剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。
17.一种组合物，包含处于药学上可接受的载体中的权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段。
18.权利要求1至4的任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的用途。
19.权利要求18的用途，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌症、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
20.权利要求19的用途，进一步包括向所述对象施用至少第二种抗癌治疗。
21.权利要求20的用途，其中所述第二种抗癌治疗是手术治疗、化疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗、免疫治疗或细胞因子治疗。
22.一种评估BTLA糖基化的方法，包括使含有BTLA的样品与根据权利要求1到4的任一项的抗体或抗原结合片段接触。
23.一种结合BTLA的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：34的氨基酸序列组成的VH互补决定区1(CDR1)，
(2)由SEQ ID NO：35的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：46的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：47的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：48的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(ii)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：38的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：39的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：49的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：50的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：51的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(iii)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：40的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：41的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：42的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：52的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：53的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：54的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(iv)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：43的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：44的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：45的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：55的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：56的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：57的氨基酸序列组成的VL CDR3。
24.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列。
25.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
26.权利要求23的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：32的氨基酸序列。
27.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相对于未糖基化的BTLA选择性结合糖基化的BTLA。
28.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中相对于未糖基化的BTLA，所述抗体或抗原结合片段选择性地结合在位置N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的BTLA。
29.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性遮蔽BTLA的糖基化基序，所述BTLA的糖基化基序包含BTLA位置N75、N94、N110或其任何组合。
30.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段对糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过相比与未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍的荧光强度来表明。
31.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含SEQ ID NO：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的五个或更多个连续氨基酸的序列。
32.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含与SEQ ID NO：86的BTLA的R12、H16、K51、T57、S82或S86相应的一个或更多个氨基酸。
33.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制HVEM与BTLA的结合。
34.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是重组的。
35.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
36.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、单价的scFv、二价的scFv或单结构域抗体。
37.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
38.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体缀合到成像试剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。
39.一种组合物，包含处于药学上可接受的载体中的权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段。
40.权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的用途。
41.权利要求40的用途，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌症、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
42.权利要求40的用途，进一步包括向所述对象施用至少第二种抗癌治疗。
43.权利要求42的用途，其中所述第二种抗癌治疗是手术治疗、化疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗、免疫治疗或细胞因子治疗。
44.一种评估BTLA糖基化的方法，包括使含有BTLA的样品与根据权利要求23到26的任一项的抗体或抗原结合片段接触。
45.一种结合BTLA的抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
(i)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：62的氨基酸序列组成的VH互补决定区1(CDR1)，
(2)由SEQ ID NO：63的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：64的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：74的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：75的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：76的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(ii)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：65的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：66的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：67的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：77的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：78的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：79的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(iii)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：68的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：69的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：70的氨基酸序列组成的VH CDR3；和(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：80的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：81的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：82的氨基酸序列组成的VL CDR3；
或
(iv)(a)重链可变(VH)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：71的氨基酸序列组成的VH CDR1，
(2)由SEQ ID NO：72的氨基酸序列组成的VH CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：73的氨基酸序列组成的VH CDR3；和
(b)轻链可变(VL)区，包含：
(1)由SEQ ID NO：83的氨基酸序列组成的VL CDR1，
(2)由SEQ ID NO：84的氨基酸序列组成的VL CDR2，和
(3)由SEQ ID NO：85的氨基酸序列组成的VL CDR3。
46.权利要求45的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列。
47.权利要求45的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含轻链可变(VL)区，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。
48.权利要求45的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述重链可变(VH)区包含SEQ ID NO：58的氨基酸序列，所述轻链可变(VL)区包含SEQ ID NO：60的氨基酸序列。
49.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段相对于未糖基化的BTLA选择性结合糖基化的BTLA。
50.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中相对于未糖基化的BTLA，所述抗体或抗原结合片段选择性地结合在位置N75、N94、N110或其任何组合处糖基化的BTLA。
51.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段特异性遮蔽BTLA的糖基化基序，所述BTLA的糖基化基序包含BTLA位置N75、N94、N110或其任何组合。
52.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段对糖基化的BTLA的结合在荧光分析中通过相比与未糖基化的BTLA展现的荧光强度更大至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、或至少10倍的荧光强度来表明。
53.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含SEQ ID NO：161、162、163、164、165、166、167、168或169的氨基酸序列的五个或更多个连续氨基酸的序列。
54.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体特异性结合BTLA表位，所述BTLA表位包含与SEQ ID NO：86的BTLA的R12、H16、K51、T57、S82或S86相应的一个或更多个氨基酸。
55.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体抑制HVEM与BTLA的结合。
56.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是重组的。
57.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。
58.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是Fab’、F(ab’)2、F(ab’)3、单价的scFv、二价的scFv或单结构域抗体。
59.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
60.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体缀合到成像试剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素。
61.一种组合物，包含处于药学上可接受的载体中的权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段。
62.权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的用途。
63.权利要求62的用途，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、头颈癌、前列腺癌、食道癌、气管癌、皮肤癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌症、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
64.权利要求62的用途，进一步包括向所述对象施用至少第二种抗癌治疗。
65.权利要求64的用途，其中所述第二种抗癌治疗是手术治疗、化疗、放射治疗、冷冻治疗、激素治疗、免疫治疗或细胞因子治疗。
66.一种评估BTLA糖基化的方法，包括使含有BTLA的样品与根据权利要求45到48的任一项的抗体或抗原结合片段接触。
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