ES2247204T3 - Bancos de anticuerpos policlonales. - Google Patents
Bancos de anticuerpos policlonales.Info
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Abstract
Un método para generar un banco de vectores de expresión que comprenden una diversidad de pares de elementos genéticos que codifican regiones variables de proteínas receptoras específicas a una diana particular, comprendiendo dicho método las etapas de: a) obtener una diversidad de segmentos de ácido nucleico que comprenden pares de elementos genéticos que codifican regiones variables de proteínas receptoras, b) insertar dicha diversidad de segmentos en un primer vector, adecuado para rastrear regiones variables codificadas por dichos insertos, y obtener un primer banco, c) preparar, mediante rastreo de dicho primer banco, un sub-banco de vectores que comprenden una diversidad de segmentos de ácido nucleico, en que cada segmento codifica un par de regiones variables de una proteína receptora específica a una diana particular, d) transferir en masa los segmentos desde dicho sub- banco a un segundo vector capaz de mediar en la expresión de dichas regiones variables de la proteína receptora, en donde en masa implica hacer reaccionar, en la misma reacción, todos los segmentos con moléculas de un segundo vector, dando como resultado la formación de un banco de vectores de expresión capaces de codificar una diversidad de proteínas receptoras o fragmentos de las mismas, que comprenden pares de regiones variables específicas a una diana particular, en donde la diversidad de dichos pares de regiones variables se reduce en menos del 50% en comparación con el sub-banco.
Description
Bancos de anticuerpos policlonales.
La invención se refiere a la creación,
interconversión y uso de bancos de anticuerpos policlonales,
receptores de la superficie celular y otras proteínas con regiones
variables. Estas regiones variables se unen, se clonan en vectores
de expresión que pueden mantenerse, seleccionarse y amplificarse
cuando se desee, y los bancos o sub-bancos de
regiones variables pueden transferirse a otros vectores de
expresión sin que se pierda la diversidad o complejidad global. Los
bancos resultantes de regiones variables y las bibliotecas de
proteínas enteras pueden usarse para tratar, prevenir o diagnosticar
enfermedades y trastornos específicos incluyendo neoplasias,
malignidades, infecciones y defectos y deficiencias genéticas.
Los linfocitos constituyen aproximadamente el 20%
de los leucocitos sanguíneos y son los componentes principales del
sistema de reconocimiento de antígenos de mamífero que existe
predominantemente en dos formas, células B y células T. Las células
T se diferencian en el timo, y posiblemente en otros tejidos, en
células T citotóxicas (T_{C}), células T adyuvantes (T_{H}) y
células supresoras (T_{S}). Estas células T reconocen antígenos
extraños en asociación con los antígenos del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) a través de un receptor específico de
células T (TcR). Este receptor es muy polimórfico y se distribuye
clonalmente. El TcR típico es un heterodímero unido por enlaces
disulfuro que consta de un polipéptido \alpha y un polipéptido
\beta, que se expresa en la superficie de células T maduras. Las
dos cadenas son de tamaño similar, poseyendo una porción
transmembrana incluida dentro de una región constante y una región
variable polimórfica que posee una homología estructural
considerable con las inmunoglobulinas. Cada región variable se
compone de un segmento variable (V), un segmento de unión (J) y un
segmento de diversidad (D) (sólo en la cadena \beta) que se
ensamblan formando la región polimórfica. Tal diversidad es
necesaria para que las células T respondan a una amplia diversidad
de antígenos.
Las células B se diferencian en la médula ósea de
mamíferos adultos desarrollándose a partir de
pre-células B a células plasmáticas productoras de
anticuerpos. La importancia de las células B en el sistema inmune se
realza por las enfermedades inmunodeficientes raras en las que el
paciente sólo puede sobrevivir por inyecciones repetidas de gamma
globulina. Uno de los aspectos fascinantes de las células B es su
heterogeneidad de expresión de anticuerpos. A partir de las
observaciones, se ha estimado que no más de dos de cada 10^{8}
anticuerpos diferentes pueden ser idénticos. No es sorprendente que
los mecanismos responsables de tal diversidad no se entiendan
completamente. Los anticuerpos y los TcR, teniendo ambos regiones
constantes y variables, se clasifican dentro de lo que se denomina
la superfamilia de las inmunoglobulinas.
El proceso de expresión de las inmunoglobulinas
se inicia con la activación de células B en reposo. En la ruta
independiente de células T, el mitógeno se une a receptores
superficiales de células B estimulando la expresión de monómeros de
IgM con una afinidad bastante baja. Tras el reconocimiento del
antígeno extraño, estos monómeros de IgM experimentan
entrecruzamientos en la superficie celular y se internalizan. La
expresión del anticuerpo después cambia a la transcripción y
traducción de IgG, IgE, IgA o IgM pentamérica de mayor afinidad. En
la ruta dependiente de células T, de nuevo se requiere que el
mitógeno estimule la célula B en reposo, sin embargo, después de la
internalización, el antígeno se procesa dentro de la célula para
volver a aparecer en la superficie celular en asociación con
moléculas del MHC de clase II. Como células presentadoras de
antígenos (APC), los complejos antígeno-MHC se
reconocen por las células T y estimulan su activación y la
producción de varios mediadores solubles de células T y B. La
información recibida a partir de estos complejos superficiales se
transmite al núcleo de las células B a través de segundos mensajeros
que, entre otros efectos, aumentan el metabolismo de nucleótidos
cíclicos y la actividad de la proteína quinasa C. Tanto en la ruta
dependiente de células T como en la ruta independiente de células
T, las células B se desarrollan para dar células productoras de
anticuerpos, funcionalmente maduras.
Los anticuerpos son moléculas bifuncionales que
comprenden dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) unidas
con enlaces disulfuro intercatenarios. Cada cadena contiene
regiones constantes (C) y variables (V), que pueden fragmentarse en
dominios denominados C_{H1}, C_{H2}, C_{H3} y V_{H}, y
C_{L} y V_{L}. La IgM existe como monómeros de la superficie
celular o pentámeros circulantes que se mantienen juntos con un
péptido de 137 aminoácidos denominado cadena J. Las moléculas de IgA
también circulan, pero en pares asociados con la cadena J, y
contienen un componente secretor pequeño (SC) que está implicado en
el transporte a través de membranas epiteliales. El anticuerpo se
une al antígeno a través de dominios de región variable contenidos
en la porción Fab y, después de la unión, interacciona con el resto
del sistema inmune a través de las funciones efectoras del dominio
de la región constante principalmente a través de la porción Fc.
Las funciones efectoras incluyen la activación de la cascada del
complemento, la interacción con células efectoras tales como
linfocitos, y la compartimentalización de inmunoglobulinas. También
se cree que ciertas regiones constantes influyen sobre las
estabilidades de las diferentes inmunoglobulinas. Por ejemplo, la
IgG es relativamente estable, con una vida media circulante de
aproximadamente 23 días. La IgG también es la inmunoglobulina
respondedora asociada con la respuesta inmune secundaria. Esta
inmunoglobulina se fija al complemento a través de la cascada
clásica del complemento y tiene la capacidad de reclutar macrófagos
y neutrófilos. La IgM pentamérica es otro activador muy fuerte de
la cascada clásica del complemento y tiene una vida media en suero
de aproximadamente 5 días. La IgA tiene una vida media en suero de
5-6 días, activa el complemento a través de una
ruta alternativa y es el anticuerpo principal en las secreciones
mucosas.
Los dominios de unión a antígenos, las regiones
variables, se codifican en los genes de la región variable que están
algo dispersos en el genoma y deben agruparse por un proceso
denominado recombinación somática. En este proceso, los segmentos
V, D y J (no relacionados con la cadena J) del genoma del hospedador
se agrupan para formar una región génica. Esta región se une al
ARNm que codifica el dominio de la región constante del anticuerpo
para expresarse conjuntamente como un polipéptido y finalmente como
una molécula de anticuerpo.
Las regiones constantes de los anticuerpos son
las características determinantes principales de la clase de
anticuerpo tanto en el caso de las cadenas pesadas como en el caso
de las cadenas ligeras, y se codifican en aproximadamente 15 genes
diferentes. Las cinco clases de genes de cadena pesada se denominan
alfa (\alpha), gamma (\gamma), delta (\delta), mu (\mu) y
épsilon (\varepsilon), y los dos genes de cadena ligera, kappa
(\kappa) y lambda (\lambda). Las regiones variables, que
contienen el sitio de unión al antígeno, se codifican en más de mil
regiones genéticas diferentes. Estas regiones se recombinan
selectivamente para crear la combinación de aminoácidos requerida
para reconocer y unirse al antígeno diana. La variabilidad del sitio
de unión no está distribuida uniformemente, sino que cada dominio
contiene varias porciones muy variables denominadas regiones
hipervariables (HVR), o regiones determinantes de complementariedad
(CDR), y son estas regiones las que interaccionan realmente con el
antígeno.
La generación de diversidad en el sitio de unión
es una combinación de varios factores; (1) la combinación de
diferentes dominios V_{H} y V_{L}, (2) la combinación de
diferentes regiones V, D y J para formar el dominio variable, (3)
la generación de una nueva diversidad en las uniones de dominios,
denominada diversidad de unión, y (4) la diversidad debida a
mutaciones somáticas. La mutación somática, en una gran medida,
también es responsable de la maduración de la respuesta inmune,
teniendo los clones de células B que proliferan durante el
desarrollo de la respuesta humoral una afinidad cada vez mayor por
el antígeno. La combinación de estos procesos, en teoría, permite
que un organismo genere una respuesta inmune específica contra casi
cualquier antígeno.
La estimulación de una respuesta de anticuerpos
es la base de la mayoría de las formas de terapia y profilaxis con
vacunas. Como profilaxis, al paciente se le administra el antígeno
en forma del microorganismo inactivado o atenuado o como una
proteína purificada. Es de esperar que la administración de esta
vacuna prepare al sistema inmune del paciente para el posible
reconocimiento posterior de ese mismo antígeno en forma de una
infección. Si la infección puede cogerse pronto, en otras palabras,
si los anticuerpos anti-antígeno están circulando a
lo largo del cuerpo tras la exposición inicial o precoz al
organismo, el organismo puede eliminarse del cuerpo antes de que
tenga posibilidad de instalarse o de producir una infección sólida.
Este aspecto se reconoce desde hace mucho tiempo, incluso antes de
apreciar la estructura básica del anticuerpo. Los tratamientos con
anticuerpos implican vacunaciones pasivas de suero reunido en forma
de gamma globulinas. Se recoge plasma sanguíneo de individuos o
animales convalecientes que se recuperaron de la enfermedad
particular, y se purifica la fracción proteica o de gamma globulina,
denominada así porque contiene predominantemente moléculas de IgG.
Se administran inyecciones de esta gamma globulina muchas veces
durante un período de horas o días, normalmente inmediatamente
después de la exposición al organismo infeccioso o sustancia
tóxica, para proporcionar al paciente protección a corto plazo
contra la infección. Por ejemplo, a los individuos mordidos por un
animal que se sospecha que es portador del virus de la rabia, un
rabdovirus, se les administra un régimen de tratamientos con gamma
globulina para prevenir la infección del virus, porque una vez que
se ha instalado la infección, el resultado inevitablemente es
bastante malo. Sin embargo, si los tratamientos se inician
precozmente, el pronóstico puede ser bastante optimista.
El uso de anticuerpos para la terapia (o
profilaxis) del cáncer se basa en la premisa de que el perfil
antigénico de una célula cancerígena es diferente del de las
células normales. Como se representa esquemáticamente en la Figura
1, estas diferencias podrían incluir potencialmente (1)
determinantes antigénicos que están presentes exclusivamente en la
superficie de células tumorales, (2) moléculas intracelulares
encontradas exclusivamente en células tumorales que se presentan
como péptidos sobre la superficie celular en asociación con
moléculas del MHC, (3) antígenos que están presente sólo en algunas
células normales, y (4) diferencias cuantitativas en la cantidad de
expresión de ciertos antígenos sobre la superficie de las células
tumorales en comparación con otros tipos de células no tumorales.
Esta premisa se ha sustanciado por el descubrimiento de los
denominados antígenos asociados a tumores, que no se expresan en
cantidades significativas o medibles sobre las superficies de
células normales (M. Herlyn y H. Koprowski, Ann. Rev. Immunol.
6:283-308, 1988). Estos péptidos específicos de
tumores se presentan en la superficie celular en asociación con
antígenos del MHC de clase I.
Los anticuerpos monoclonales, a diferencia de los
anticuerpos policlonales, comprenden una colección de moléculas
idénticas producidas por un clon común de células B que se dirigen
contra un solo determinante antigénico. Los anticuerpos monoclonales
pueden distinguirse de los anticuerpos policlonales en que los
anticuerpos monoclonales deben seleccionarse de forma individual,
mientras que los anticuerpos policlonales se seleccionan en grupos
de más de uno o, en otras palabras, en masa. Pueden producirse
grandes cantidades de anticuerpos monoclonales por inmortalización
de una población de células B policlonales usando la tecnología de
hibridomas. Cada célula B inmortalizada puede dividirse,
presumiblemente de forma indefinida, y dar lugar a una población
clonal de células que expresan moléculas de anticuerpo idénticas.
Los clones de células B inmortalizados individuales, los
hibridomas, se segregan y se cultivan por separado.
La terapia con anticuerpos monoclonales se ha
usado cada vez más en la terapia y el diagnóstico del cáncer, pero
tiene varias limitaciones (H. Thomas y K. Sikora, Rev. Oncol.
4:107-120, 1991). A menudo aparecen variantes de
células tumorales, que carecen del único determinante antigénico
reconocido por el anticuerpo monoclonal, que escapan al
tratamiento. Como cada anticuerpo monoclonal se dirige a un solo
determinante antigénico de la célula cancerígena diana, la densidad
de ese determinante en la superficie celular normalmente no es
suficientemente alta como para permitir la destrucción de la célula.
Además, no se activan los mecanismos efectores mediados por las
regiones Fc de las moléculas de anticuerpo unidas, tales como la
unión al complemento y la producción concomitante de C3b, la
opsonización/fagocitosis y la citotoxicidad mediada por células
dependiente de anticuerpos (ADCC). Sólo a altas densidades de
anticuerpo se activa el complemento, o se ocupan suficientes
receptores Fc como para que las células efectoras se activen para
realizar sus funciones preordenadas. Por consiguiente, los
anticuerpos monoclonales antitumorales normalmente son ineficaces
para la eliminación completa de las células diana.
En un esfuerzo por evitar algunos de estos
problemas, se han desarrollado métodos para probar y reforzar la
eficacia de destrucción de anticuerpos monoclonales con isótopos
radiactivos, toxinas o fármacos. Sin embargo, estas señales a su
vez pueden producir efectos secundarios perjudiciales (T. A.
Waldmann, Sci. 252:1657-62, 1991). Aunque un
anticuerpo monoclonal (con señal o sin señal) sea razonablemente
eficaz para eliminar células cancerosas, y se hayan documentado
remisiones, en la mayoría de los casos se producen recaídas del
cáncer debido a que las variantes de células tumorales que han
perdido el determinante antigénico diana escapan y proliferan (R.A.
Miller et al., N. Engl. J. Med. 306:517-22,
1982). Este problema podría solucionarse parcialmente con el uso de
colecciones de anticuerpos monoclonales antitumorales que tuvieran
el efecto beneficioso de usar el mismo reactivo preexistente en
muchos pacientes. Aunque esto sería una ventaja, porque los tumores
individuales presentan esta variabilidad, no es de esperar que sea
común el descubrimiento de múltiples antígenos específicos para un
tipo de cáncer presente en todos los cánceres de ese tipo (D. Berd
et al., Cancer Res. 49:6840-44, 1989). Aunque
se encuentre un tratamiento eficaz usando colecciones de
anticuerpos monoclonales para pacientes con algunos tipos de
cáncer, es poco probable que sea un tratamiento eficaz para muchas
formas de neoplasia.
La tecnología de anticuerpos monoclonales, en su
fase actual, se ha centrado en el uso de anticuerpos monoclonales no
humanos. A menudo, esto supone un problema porque los pacientes
desarrollan anticuerpos contra las regiones no humanas de las
proteínas, incluyendo tanto las regiones constantes como las
regiones variables. Los anticuerpos reactivos contra el sitio de
unión a antígenos, las regiones variables, de otro anticuerpo se
denominan anticuerpos anti-idiotípicos. Se ha
demostrado que los anticuerpos monoclonales murinos, los más
fáciles de producir y los más prevalentes, inducen una respuesta
humoral en humanos que se denomina respuesta de anticuerpos humanos
anti-ratón o la respuesta HAMA (D.L. Sawler et
al., J. Immunol. 135:1530-35, 1985). Las
respuestas HAMA significativas en pacientes que reciben tal terapia,
aparte de destruir cualquier efecto beneficioso posible del
tratamiento, introducen numerosas complicaciones, incluyendo
trastornos del complejo inmune.
En los últimos años, estos problemas se han
solucionado parcialmente por la generación y uso de anticuerpos
quiméricos. Los anticuerpos quiméricos tienen regiones V derivadas
del anticuerpo monoclonal de ratón con especificidad por el tumor,
pero regiones C humanas (S.L. Morrison y V.T. Oi, Adv. Immunol.
44:65-92, 1989). En tales formas, la respuesta HAMA
se reduce significativamente (aunque no se elimina), pero sigue
teniéndose que hacer frente a la respuesta
anti-idiotípica. Los esfuerzos por eliminar la
respuesta anti-idiotípica han implicado la
obtención por ingeniería genética de anticuerpos en los que sólo
las CDR proceden del anticuerpo el ratón y la estructura y las
regiones C son de origen human. Estos son los denominados
anticuerpos humanizados (P.C. Caron et al., Cancer Res.
52:6761-67, 1992). Estos anticuerpos son muy
difíciles de crear, implicando múltiples sucesos de clonación, y
también pueden inducir anticuerpos anti-idiotípicos
(The Third Annual IBC International Conference on Antibody
Engineering, 14-16 de diciembre de 1992, San Diego).
Actualmente se están desarrollando anticuerpos monoclonales
completamente humanos con la esperanza de que no induzcan
anticuerpos anti-idiotípicos (C.J. Fisher et
al., Critical Care Med. 18:1311-15, 1990). Sin
embargo, como los ratones son perfectamente capaces de generar
anticuerpos anti-idiotípicos contra anticuerpos
procedentes de la misma especie e incluso de la misma cepa
endogámica, la generación de anticuerpos
anti-idiotípicos después de la inyección de grandes
cantidades de anticuerpos con regiones V idénticas seguirá siendo un
problema siempre que se usen anticuerpos monoclonales.
El uso de anticuerpos policlonales solucionaría
algunos de los inconvenientes asociados con la terapia de
anticuerpos monoclonales. A diferencia de los anticuerpos
monoclonales, los anticuerpos policlonales se dirigen a muchos
determinantes antigénicos diferentes presentes en la superficie de
la célula diana y se unirían con suficiente densidad como para
permitir que los mecanismos efectores del sistema inmune
funcionaran eficazmente, posiblemente eliminando la necesidad de
cualquier señal radiactiva o tóxica. Además, la probabilidad de que
aparezcan variantes de células tumorales de escape que han perdido
la reactividad con todos los anticuerpos policlonales es muy
pequeña. No es de esperar que sea un problema la reactividad
anti-idiotípica en los pacientes, porque ninguna
combinación de regiones V debe estar presente en una cantidad
suficiente como para inducir una respuesta significativa.
Hay varios problemas asociados con el uso de
anticuerpos policlonales convencionales. En primer lugar, los
anticuerpos policlonales en forma de gamma globulina están
disponibles en un suministro muy limitado, insuficiente para los
tratamientos generalizados en los seres humanos. En segundo lugar,
cuando se usan en un paciente, muchos de los anticuerpos
policlonales se absorberán por las células y los tejidos normales
del paciente. El número de anticuerpos diferentes que permanecen
después de la absorción sería excepcionalmente pequeño,
posiblemente demasiado pequeño como para tener algún efecto
beneficioso. En tercer lugar, este suministro, además de ser
inadecuado, requiere mucha purificación para retirar los materiales
indeseados, tales como citoquinas u otras proteínas
inmunorreguladoras, que pueden inducir respuestas inmunes
indeseables y efectos secundarios. También existe un riesgo
sustancial de contaminación asociada con organismos infecciosos
tales como VIH o toxinas tales como lipopolisacáridos, que pueden
estar presentes en la fuente. Estos problemas son difíciles de
solucionar debido a la variabilidad de la composición, ya que el
material se recoge a partir de muchas fuentes biológicas
diferentes. La producción recombinante de anticuerpos policlonales
solucionaría ciertos de estos asuntos, pero los genes que codifican
estos anticuerpos no se pueden identificar fácilmente y aún no se
ha desarrollado la tecnología para trabajar eficazmente con
colecciones de genes de anticuerpos.
Recientemente, se han expresado fragmentos de
anticuerpos de unión a antígenos en la superficie de fagos
filamentosos (G.P. Smith, Sci. 228:1315, 1985). Se han obtenido
bancos de ADN_{c} de regiones variables de cadenas H y L a partir
de células B animales y humanas y se han clonado en pares en
combinaciones aleatorias de H-L en vectores de
presentación de fagos para producir bancos combinatorios que
presenten fragmentos Fab o Fv monocatenarios (W.D. Huse et
al., Sci, 246:1275-81, 1989). El Fab se forma
por la asociación de la cadena L con los dominios V_{H} y
C_{H1} de la cadena H, la región Fd. En los bancos de
presentación de fagos, el extremo carboxilo terminal de la región
Fd o Fv se encadena a un fragmento de una proteína de recubrimiento
del fago, tal como cpIII o cpVIII, que ancla el fragmento Fab a la
superficie del fago. Tanto en los fragmentos Fab y Fv como en los
anticuerpos intactos, el sitio de unión al antígeno se forma por la
combinación de los dominios V_{H} y V_{L}.
Los bancos de presentación de fagos pueden
seleccionarse para unirse a antígenos específicos por cromatografía
de afinidad (R.E. Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889,
1992) o presentando el fago sobre superficies recubiertas de
antígeno (C.F. Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
88:4363, 1991). Cuando los segmentos de ADN que codifican los
fragmentos de anticuerpo seleccionados se transportan por
partículas de fago, las partículas de fago seleccionadas que
codifican fragmentos de anticuerpo monoclonal pueden aislarse y
propagarse indefinidamente. Los clones de fagos seleccionados pueden
modificarse para producir fragmentos de anticuerpo que carezcan del
resto de la proteína de la cubierta que también puede secretarse a
partir de las células bacterianas. Se han recuperado fragmentos de
anticuerpo específicos para haptenos, proteínas y varios virus
humanos a partir de tales bancos combinatorios de presentación de
fagos (J.D. Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581, 1991; R.A.
Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4141,
1993).
Un inconveniente principal de estos bancos
combinatorios es que las regiones V_{H} y V_{L} que forman el
dominio de unión a antígenos están asociados aleatoriamente. Las
combinaciones originales de cadenas H y L que se seleccionaron de
forma tan eficaz in vivo por el antígeno se pierden (J.
McCafferty et al., Nature 348:552-54,
1990). La probabilidad de encontrar combinaciones de H y L con alta
afinidad por el antígeno de interés es muy pequeña. El número de
clones que se necesitaría seleccionar con respecto a la presencia de
la unión específica al antígeno se aumenta en órdenes de
magnitud.
Hace muy poco se ha informado sobre un método
para amplificar y unir los genes de la región V_{H} y V_{L}
expresados dentro de células individuales en una población de
células (M.J. Embleton et al., Nuc. Acids Res.
20:3831-37, 1992). Este método se ejemplificó con
dos líneas de células de hibridoma de ratón, produciendo cada una
un producto de inmunoglobulina (Ig) conocido y distinto. Las dos
poblaciones de células se mezclaron, se fijaron con formaldehído y
se permeabilizaron con el detergente NP-40. Los ADNc
se sintetizaron usando transcriptasa inversa y cebadores
complementarios a los extremos 3' de los ARNm de V_{H} y V_{L}.
Después, los ADNc se amplificaron por PCR y se unieron a la misma
reacción usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador del
extremo 3' del gen de V_{H} y un cebador del extremo 5' del gen
de V_{L}. Estos cebadores también contenían colas complementarias
de secuencia extra para el auto-montaje de los genes
de V_{H} y V_{L}. En una segunda PCR, después de lavar las
células, los genes de las regiones V_{H} y V_{L} unidos se
amplificaron con cebadores anidados terminales produciendo una
población de fragmentos de ADN que codificaban las secuencias
V_{H} y V_{L} en una orientación transcripcional de cabeza a
cola. Estos fragmentos de ADN se recuperaron de los sobrenadantes
celulares.
Aunque este informe afirmó que casi todas las
combinaciones V_{H}-V_{L} examinadas procedían
de una sola de las líneas de células de hibridoma, el método
produce combinaciones mixtas de V_{H}-V_{L}
donde V_{H}y V_{L} pueden proceder de diferentes células.
También es evidente que debe producirse esta mezcla de
V_{H}-V_{L} por consideraciones teóricas. Como
las combinaciones V_{H}-V_{L} unidas se
recuperan del sobrenadante de las células fijadas/permeabilizadas y
los poros presentes en las membranas de estas células permiten el
paso libre de tales moléculas de ADN unidas, sería de esperar que
las moléculas de ADN de V_{H} y V_{L} más pequeñas salieran de
las células y se unieran y amplificaran adicionalmente fuera de las
células, donde se produciría la mezcla libre de V_{H} y V_{L}
de diferentes células.
La presente invención soluciona los problemas e
inconvenientes asociados con las estrategias y diseños actuales y
proporciona nuevas composiciones y métodos para la profilaxis y
tratamiento de ciertas enfermedades y trastornos.
Los bancos de anticuerpos policlonales tienen una
mayor complejidad que los anticuerpos monoclonales o los cócteles de
anticuerpos, dirigiéndose contra muchos determinantes antigénicos
diferentes, y llevan la opción de usar señales radiactivas, de
toxinas y otras señales tanto para la terapia como para el
diagnóstico. Una realización de la invención se refiere a métodos
para tratar trastornos neoplásicos usando bancos de anticuerpos
policlonales dirigidos específicamente a una enfermedad o a un
trastorno. Se obtiene una muestra de tejido neoplásico a partir de
un paciente. La muestra se introduce en una población celular capaz
de producir anticuerpos, tal como células de bazo de un mamífero.
La población celular se fija, se permeabiliza y las moléculas de
ARNm de V_{H} y V_{L} se transcriben de forma inversa para dar
secuencias de ADNc de V_{H} y V_{L}. Las secuencias de ADNc se
amplifican por PCR y las secuencias amplificadas se unen,
preferiblemente en una orientación transcripcional de cabeza a
cabeza. Las secuencias unidas se amplifican de nuevo por PCR para
crear una población de fragmentos de ADN que codifican las regiones
de anticuerpo V_{H} y V_{L}. Estos fragmentos de ADN se clonan
en vectores de expresión y las diferentes poblaciones de vectores
de expresión se expanden en el hospedador transfectado. Se
seleccionan vectores de expresión que codifiquen un banco de
anticuerpos anti-neoplásicos recombinantes y se
expanden de nuevo las subpoblaciones o sub-bancos.
Los anticuerpos anti-neoplásicos recombinantes
producidos por estos vectores después se administran al paciente.
Los trastornos neoplásicos que pueden tratarse incluyen leucemias,
linfomas, sarcomas, carcinomas, tumores de células neurales,
carcinomas de células escamosas, tumores de células germinales,
metástasis, tumores indiferenciados, seminomas, melanomas,
neuroblastomas, tumores de células mixtas, neoplasias producidas
por agentes infecciosos y otras malignidades.
Otra realización de la invención se refiere al
diagnóstico in vivo de un trastorno neoplásico por medio de
la obtención de imágenes del tejido enfermo en un paciente. Se crea
un banco de anticuerpos anti-neoplásicos específicos
para el paciente, como se describe en este documento, y se marcan
con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
enteros o fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab. El
banco marcado se administra al paciente y el marcador se detecta
usando, por ejemplo, detectores radiactivos, inspección visual,
detección por resonancia magnética nuclear (RMN) u otros medios
para detectar la aparición de un marcador en un tejido o residuo
corporal, o dentro del propio cuerpo entero. Por medio de estos
métodos pueden percibirse neoplasias no identificadas hasta ahora,
que escapaban a la detección por otros medios. Además, una vez
detectada, la neoplasia puede controlarse eficazmente durante los
regímenes de tratamiento.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para crear bancos con especificidad de paciente o con
especificidad de antígeno de anticuerpos policlonales. Estos
bancos, creados como se ha descrito anteriormente, son útiles para
el tratamiento o profilaxis de varias enfermedades incluyendo
neoplasias, malignidades, infecciones, defectos genéticos y
deficiencias genéticas. Los bancos pueden comprender vectores que
contienen ADN que codifica las regiones variables, ADN que codifica
el anticuerpo entero, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Una
vez aislado y clonado, el banco puede expandirse para asegurar la
representación de todos los miembros del perfil antigénico y
también puede transferirse fácilmente a otros vectores.
Otra realización de la invención se refiere a
composiciones que contienen bancos de anticuerpos policlonales o
vectores de expresión genética que codifican estos anticuerpos. El
banco o el sub-banco seleccionado de anticuerpos
puede marcarse con un marcador detectable y/o contener un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Las composiciones pueden administrarse
a pacientes para protocolos de diagnóstico o tratamiento. Como
alternativa, pueden administrarse bancos de vectores a pacientes
para la expresión in vivo de anticuerpos o fragmentos de
anticuerpo.
Otra realización de la invención se refiere a
adyuvantes de diagnóstico o kits y a métodos para usar estos kits
para la detección de enfermedades y trastornos. Los adyuvantes de
diagnóstico o kits comprenden un banco de anticuerpos policlonales
que pueden marcarse con un marcador detectable al que se añade una
muestra que se sospecha que contiene el antígeno diana. La muestra
puede ser una muestra de un fluido corporal tal como sangre, suero,
plasma, fluido espinal, linfa u orina. La presencia o ausencia del
antígeno diana indica la presencia de una enfermedad, trastorno o
contaminante particular. Las muestras pueden ser muestras
biológicas de un paciente o muestras biológicas de una fuente
ambiental que se sospecha que lleva un contaminante. La muestra se
mezcla con el banco y la presencia del antígeno se confirma por la
unión de un número significativo de anticuerpos y la detección del
marcador.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para crear y utilizar bancos de proteínas receptoras que
poseen regiones variables. Las proteínas receptoras que pueden
utilizarse para crear un banco incluyen receptores de células T,
receptores de células B, receptores de células destructoras
naturales y receptores de macrófagos. Una muestra de tejido
biológico se introduce en una población de células capaces de
producir proteínas receptoras. Los ARNm de la proteína receptora de
la región variable se transcriben de forma inversa para dar
secuencias de ADNc que se amplifican por PCR, y los fragmentos de
ADN resultantes se clonan en vectores de expresión. Se seleccionan
los vectores de expresión que codifican las proteínas receptoras
recombinantes y se expande una subpoblación seleccionada para
producir el banco. Estos bancos pueden usarse para diagnosticar,
obtener imágenes o tratar enfermedades y trastornos incluyendo
neoplasias, infecciones y defectos y deficiencias genéticas. Además,
usando los mismos métodos, también pueden crearse y utilizarse
bancos de proteínas quiméricas que contienen tanto anticuerpos
como porciones de proteínas receptoras.
Otra realización de la invención se refiere a
vectores de ácido nucleico que pueden usarse para crear los bancos
de anticuerpo policlonal con especificidad de antígeno. Estos
vectores comprenden sitios de reconocimiento de enzimas de
restricción convenientes para la clonación de fragmentos de ácido
nucleico y secuencias para amplificar eficazmente por PCR los
fragmentos de ADNc. Los vectores se diseñan para tener uno o más
pares de fragmentos genéticos insertados en una orientación de
transcripción de cabeza a cabeza y, opcionalmente, también
comprenden secuencias controladoras de la transcripción y de la
traducción tales como cajas TATA, cajas CAT, sitios de unión a
ribosomas, sitios de iniciación y terminación de la ARN polimerasa,
secuencias líder, promotores fuertes de la transcripción que pueden
regularse diferencialmente o partes o combinaciones de los
mismos.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para transferir un banco de fragmentos de ácido nucleico
entre diferentes vectores sin una pérdida significativa de
diversidad del banco. El banco de fragmentos se inserta en primeros
vectores en una orientación transcripcional de cabeza a cabeza para
formar vectores recombinantes. Los insertos de estos vectores
recombinantes se transfieren a segundos vectores, por ejemplo, por
amplificación por PCR de las secuencias insertadas o clonación con
enzimas de restricción, y los fragmentos se reinsertan en segundos
vectores sin una pérdida significativa de diversidad del banco.
Otras realizaciones y ventajas de la invención se
indican, en parte, en la descripción que se presenta a continuación
y, en parte, serán evidentes por esta descripción o pueden
aprenderse por la práctica de la invención.
Figura 1. Comparación esquemática de las
diferencias en densidad y diversidad de antígenos en la superficie
de células normales frente a células tumorales.
Figura 2. Representación esquemática de la
construcción de (a)
pUC19-C\kappa-CH1, (b)
pUC119-C\kappa-CH1, (c)
plPPl2, y (d) pJS.
Figura 3. Mapas parciales de vectores de
expresión de fagémidos (a) pComb3, (b) phh3, (c) plPPl, y
(d) phh3mu o phh3hu, que no se muestran a escala. Los aminoácidos
aportados por los vectores se muestran en el código de una letra
delante de Fd y de los genes de la cadena L. P = promotor; l =
secuencia líder; lmod = secuencia líder con la secuencia de
nucleótidos modificada.
Figura 4. Diagrama esquemático de (a) un vector
doble murino, pMDV, (b) un vector doble quimérico, pCDV; donde: P =
promotor; E = potenciador; 1 = secuencia líder; s = sitio de
empalme; hum = humano; y (c) la transferencia en masa de secuencias
de región variable entre vectores bacterianos y de mamífero.
Figura 5. Representación esquemática de la
síntesis de ADNc y reacciones de PCR.
Figura 6. Análisis en gel de agarosa de productos
de PCR.
Figura 7. Transferencia de combinaciones de
V_{H}-V_{L} unidas dentro de las células a un
vector de expresión murino.
Figura 8. Análisis del sobrenadante celular por
(a) transferencia de Western y (b) ELISA.
Figura 9. Análisis de unión de fagos a
Ars-BSA por (a) ELISA de unión directa y (b) ELISA
de inhibición.
Figura 10. Generación de vectores (a) bacterianos
y (b) de mamífero para la expresión de bancos de presentación de
fagos de Fab o de anticuerpos intactos derivados de combinaciones
de V_{H}-V_{L} unidas cabeza con cabeza.
Como se realiza y se describe ampliamente en este
documento, la presente invención comprende métodos para la creación
y uso de bancos de proteínas relacionadas tales como anticuerpos,
receptores que incluyen receptores de células T, y otras proteínas
inmunes relacionadas.
Durante una respuesta inmune, se generan y
proliferan muchos miles de clones diferentes de células B,
específicos para cada determinante antigénico, creando una gran
diversidad de anticuerpos. Esta diversidad se aumenta adicionalmente
por mecanismos de hipermutación somáticos que funcionan sobre las
células B estimuladas por antígenos. Estos procesos tan eficaces,
que funcionan durante la maduración de la respuesta inmune,
ocasionan una selección muy grande de anticuerpos con una mayor
afinidad por los antígenos. Sin embargo, la terapia actual con
anticuerpos se ha centrado en el uso de anticuerpos monoclonales, y
cuando los clones de células B se inmortalizan por la formación de
hibridomas, sólo se representa una pequeña fracción de los clones
de células B. Además, como sólo las células que se dividen pueden
participar en la formación de híbridos celulares estables,
probablemente, en la población no están representadas células
plasmáticas diferenciadas terminalmente que producen anticuerpos de
alta afinidad.
Una realización de la invención se refiere a
métodos para tratar trastornos neoplásicos usando bancos
antitumorales de anticuerpos policlonales con especificidad de
paciente o con especificidad de enfermedad. Es de esperar que tales
bancos realicen el espectro entero de una respuesta de anticuerpo a
células tumorales mucho más eficazmente que los cócteles de
anticuerpos monoclonales o anticuerpos monoclonales producidos por
hibridomas. Estos bancos también se pueden reproducir más
fácilmente y pueden crearse y mantenerse dejando intacta toda la
diversidad asociada con una respuesta inmune natural. Aunque la
complejidad de cada banco de anticuerpo policlonal no se conoce
inmediatamente, es de esperar que sea muy alta y que lleve asociada
la capacidad de activar todas las funciones efectoras asociadas con
una respuesta inmune.
Un banco se crea obteniendo una muestra de tejido
neoplásico de un paciente con un trastorno particular. El tejido
neoplásico puede obtenerse a partir de tejidos tumorales, sangre y
tejidos relacionados con la sangre, tejidos de biopsia, tejidos
cancerosos, tejidos malignos, tejidos con metástasis y
combinaciones de los mismos.
Pueden obtenerse muestras de biopsias de tejidos
enfermos, cultivos de células primarias o inmortalizadas de tipos
celulares relacionados, o células que se estimulan artificialmente
para presentar un perfil antigénico particular. El tejido
neoplásico también puede propagarse primero en un animal
inmunodeficiente, tal como un modelo de ratón, para reforzar la
expresión no impedida del antígeno. Los modelos de ratón útiles
incluyen el ratón desnudo, el ratón SCID y el ratón irradiado. Los
ratones desnudos atímicos congénitos, con deficiencias en la
función de las células T, permiten el crecimiento in vivo de
tumores humanos. También se ha demostrado que los ratones con
inmunodeficiencia combinada severa (SCID), que carecen de células B
y T funcionales, y los ratones irradiados
sub-letalmente, donde las células T y B se han
destruido, permiten el crecimiento de tumores alogénicos y
xenogénicos. Los ratones desnudos y los ratones SCID permiten el
crecimiento de células humanas normales y pueden reconstituirse con
leucocitos de sangre periférica humana (Hu-PBL),
por ejemplo, por inyección intraperitoneal (i.p.) de aproximadamente
1-5 x 10^{7} células.
Como alternativa, el tejido neoplásico puede
someterse a una purificación para obtener un solo antígeno diana, un
grupo de antígenos o un extracto que contiene antígenos. Esta
estrategia es especialmente útil cuando existe riesgo de llevar
componentes indeseados o peligrosos de células vivas o inactivadas
en el procedimiento, o simplemente por consideraciones de
conveniencia o de almacenamiento. Por ejemplo, cuando se utilizan
células sanguíneas humanas, existe riesgo de que éstas leven virus
infecciosos, tales como VIH-1 o el virus de la
hepatitis, y sería deseable eliminar este riesgo. Los extractos se
preparan a partir de las células que tienen una concentración muy
reducida de antígenos normales y/o una mayor concentración de
antígenos neoplásicos. Generalmente se prefieren extractos de la
superficie celular, de la membrana o de células enteras, y pueden
prepararse y almacenarse a 4ºC, a -20ºC, a -80ºC o en nitrógeno
líquido, o liofilizarse y almacenarse a aproximadamente la
temperatura ambiente. Los métodos para la purificación de proteínas
y la preparación de extractos son bien conocidos para los
especialistas habituales. Muchos de estos procedimientos se
describen en Guide to Protein Purification (Methods in
Enzymology, vol. 182, M.P. Deutscher editor, Academic Press, San
Digo, CA, 1990). Finalmente, también pude obtenerse un antígeno de
muestra sintéticamente usando técnicas de química orgánica cuando
sea apropiado o conveniente.
La muestra de tejido neoplásico o antígeno
después se introduce, in vitro o in vivo, en una
población celular capaz de producir anticuerpos. Las poblaciones de
células útiles in vitro incluyen células murinas, células
ovinas, células porcinas, células de primate, células humanas,
células transformadas, fusionadas o inmortalizadas, y combinaciones
de las mismas. Se retiran células productoras de anticuerpos de un
animal o cultivo celular y se exponen a un antígeno. Las células
estimuladas con el antígeno pueden usarse directamente o pueden
fusionarse con una línea celular inmortalizada tal como un mieloma
para generar una población de hibridomas productores de anticuerpos.
Se prefieren las técnicas de cultivo in vivo e implican la
inyección directa de la muestra en un animal que contiene una
población respondedora de células productoras de anticuerpos. El
animal puede ser un ser humano u otro primate, un ratón, cabra,
conejo u otro mamífero. Cuando se usan animales, el procedimiento
preferido son inyecciones múltiples de un adyuvante, ya que esto a
menudo conduce a una alta concentración de células productoras de
anticuerpos con especificidad de antígeno con una afinidad muy
fuerte por el antígeno. Después pueden aislarse fácilmente por un
procedimiento quirúrgico, de forma no quirúrgica o de otra forma,
cuando sea apropiado, las células productoras de anticuerpo,
normalmente obtenidas a partir del bazo, pero posiblemente
procedentes de sangre periférica o linfa.
Las células productoras de anticuerpos
estimuladas con antígeno, obtenidas a partir de fuentes in
vitro o in vivo, tal como después de la fusión con una
línea de células de mieloma o de hibridoma, se fijan con una
solución de fijación tal como Sreck Tissue Fixative (Streck Labs;
Omaha, NE), o una solución que contiene un agente químico tal como
carbohidrazida, glutaraldehído, o tetróxido de osmio, pero
preferiblemente formaldehído o combinaciones de estos agentes
químicos. Por ejemplo, se suspenden entre 10^{4} y 10^{8}
células sedimentadas en 0,1 a 2,0 ml de solución de formaldehído al
10% más NaCl 0,15 M. Las células se mantienen en hielo durante un
período de tiempo, se lavan y se sedimentan. Estas células fijadas
después se permeabilizan con una solución de permeabilización que
comprende agentes químicos tales como Nonidet P-40
(NP-40), Brij, Tween, por ejemplo
tween-20, polisorbato, Triton X-100
(TX-100), CHAPS, sorbitán o combinaciones de los
mismos. Por ejemplo, la solución de permeabilización puede
comprender aproximadamente 0,5% de NP-40 que se
añade al sedimento de células fijadas, y la mezcla se incuba en
hielo durante un período de tiempo, se lava, se sedimenta y el
sedimento se dispersa en PBS que contiene glicina 0,1 M para
mantener la estructura celular global. Como alternativa, la
permeabilización puede comprender el tratamiento de las células
fijadas con enzimas tales como proteinasa K. La fijación y
permeabilización deben proporcionar una porosidad adecuada a las
células para permitir la entrada de enzima sin la destrucción
indebida del compartimento celular o de los ácidos nucleicos
presentes dentro del compartimento. La permeabilización permite que
enzimas, nucleótidos y otros reactivos necesarios entren en las
células individuales, ahora compartimentos celulares fijados, para
realizar la transcripción inversa del ARNm de V_{H} y V_{L} en
secuencias de ADNc de V_{H} y V_{L}. El soporte sólido puede
ser cualquier soporte que sea adecuado y no perjudicial para el
procedimiento, tal como una superficie de vidrio o de plástico, o un
polímero de membrana. Las células deben estar en un espacio tan
concentrado como sea posible para minimizar el volumen total. El
pequeño volumen permite añadir cantidades más pequeñas y soluciones
más concentradas de enzimas.
La transcripción inversa puede realizarse en una
sola etapa o en un procedimiento combinado opcional de
transcripción inversa/PCR. La primera solución enzimática
comprende, por ejemplo, una transcriptasa inversa tal como la
transcriptasa inversa de AMV o MMTV, una solución salina equilibrada
incluyendo Tris-HCl, pH 8-8,5,
ditiotreitol (DTT), cloruro potásico (KCl) y cloruro de magnesio
(MgCl_{2}), cantidades suficientes de los cuatro dNTP, y
cebadores que se unen al ARNm proporcionando un grupo
3'-hidroxilo para que la transcriptasa inversa
inicie la polimerización. Opcionalmente, puede añadirse un
inhibidor de RNasa tal como RNasin (Promega; Madison, WI) para
prevenir la ruptura del ARN. Aunque puede usarse cualquier
secuencia de cebador que sea complementaria al ARNm para facilitar
la selección de mensajeros de región variable, se prefieren los
cebadores complementarios al extremo 3' de las moléculas de ARNm de
V_{H} y V_{L}. La síntesis de la primera cadena se realiza, por
ejemplo, a una temperatura de aproximadamente 42ºC durante
aproximadamente 60 minutos. En Current Protocols in Molecular
Biology (F.M. Ausubel et al. editors, John Wiley &
Sons, NY, 1989) se describen procedimientos de biología molecular
para optimizar procedimientos enzimáticos tales como estos y otros
descritos en este documento en la práctica de la invención. Después
de terminar la reacción, las células se sedimentan, se lavan para
retirar los reactivos de reacción y se resuspenden en PBS.
Las secuencias de ADNc resultantes se amplifican
por PCR usando cebadores específicos para genes de inmunoglobulina
y, preferiblemente, para las regiones terminales de los ácidos
nucleicos de V_{H} y V_{L}. En la patente de Estados Unidos
número 4.683.195 se describen métodos para la amplificación por
PCR. Preferiblemente, los ADNc se amplifican por PCR y se unen en la
misma reacción usando, además de los cebadores de ADNc, un cebador
para el extremo 5' del gen de la región V_{H} y otro para el
extremo 5' del gen V_{L}. Estos cebadores también contienen colas
complementarias de secuencia extra, para permitir el automontaje de
los genes de V_{H} y V_{L}. Después de la amplificación por PCR
y de la unión, la probabilidad de conseguir productos mixtos, en
otras palabras, regiones variables mixtas, es mínima, debido a que
las reacciones de amplificación y de unión se realizaron dentro de
cada célula. El riesgo de mezcla puede reducirse adicionalmente
utilizando reactivos voluminosos tales como nucleótidos marcados
con digoxigenina para asegurar adicionalmente que los pares de ADNc
de la región V no dejan el compartimento celular y se mezclan entre
ellos, sino que permanecen dentro de la célula para la
amplificación por PCR y la unión. Las secuencias amplificadas se
unen por hibridación de secuencias terminales complementarias.
Después de la unión, las secuencias pueden recuperarse de las
células. Por ejemplo, después de la unión, las células pueden
lavarse en una solución de dodecilsulfato sódico (SDS). El SDS
precipita de las células después de la incubación en hielo y el
sobrenadante puede someterse a electroforesis en un gel de agarosa
o de acrilamida. Como alternativa, o en combinación con el proceso
de SDS, usando un reactivo tal como nucleótidos unidos a
digoxigenina, los productos de ADN sintetizados permanecerán dentro
de la célula y se amplificarán. El producto unido se recupera tras
la electroforesis del sobrenadante.
Después de la electroforesis del sobrenadante, se
retira el corte de gel correspondiente al peso molecular apropiado
del producto unido y el ADN se aísla, por ejemplo, en perlas de
sílice. El ADN recuperado puede amplificarse por PCR usando
cebadores terminales, si es necesario, y clonarse en vectores que
pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagémidos, vectores virales o
combinaciones de los mismos. En las secuencias hibridadas pueden
incorporarse sitios de enzimas de restricción convenientes para
facilitar la clonación. Estos vectores también pueden guardarse
como un banco de regiones variables unidas para un uso
posterior.
Como alternativa, después de recuperar las
secuencias de las células lavadas, los genes de la región V_{H} y
V_{L} unidos se amplifican por PCR una segunda vez usando
cebadores anidados terminales, produciendo una población de
fragmentos de ADN que codifican las regiones genéticas V_{H} y
V_{L} unidas. Estos fragmentos de ADN se recuperan de los
sobrenadantes celulares. El agrupamiento de combinaciones de
V_{H} y V_{L} es una ventaja de este proceso y permite la
transferencia en masa o en lotes de todos los clones y todos los
fragmentos de ADN durante este y todos los procedimientos de
clonación. Preferiblemente, los ADNc de V_{H} y V_{L} se unen en
una orientación transcripcional de cabeza a cabeza (\leftarrow
\rightarrow), en oposición a una orientación de cabeza a cola
(\rightarrow \rightarrow o \leftarrow \leftarrow). Esta
orientación transcripcional facilita la transferencia de pares de
región V entre vectores y la producción de anticuerpos intactos o
fragmentos de anticuerpo tales como fragmentos Fab sin perder las
combinaciones originales de cadena H y L que estaban presentes en la
población original de anticuerpos policlonales.
Además, esta orientación de clonación permite el
agrupamiento de secuencias de control de la transcripción en una
sola región y la expresión controlada de cada gen. La región de
control única puede crearse como un cassette obtenido por
ingeniería genética con múltiples sitios de enzimas de restricción
para transferirse fácilmente entre diferentes vectores. Además, al
tener las secuencias unidas en una orientación transcripcional de
cabeza a cabeza, se permite la transferencia en masa en una sola
etapa de fragmentos de ADN que incluyen las dos regiones variables
en un vector de expresión. Las orientaciones de cabeza a cola
generalmente requieren múltiples etapas de clonación.
Algunas veces, puede ser deseable tratar las
secuencias génicas de región variable con un agente mutante. Los
agentes mutantes crean mutaciones puntuales, huecos, deleciones o
adiciones en la secuencia genética, que pueden ser generales o
específicas, aleatorias o de localización dirigida. Los agentes
mutantes útiles incluyen luz ultravioleta, irradiación gamma,
agentes químicos tales como bromuro de etidio, psoraleno y análogos
de ácido nucleico, o enzimas modificadoras del ADN tales como
enzimas de restricción, transferasas, quinasas y nucleasas y
polimerasas específicas y no específicas. En particular, pueden
introducirse mutaciones aleatorias en las CDR de los genes de las
regiones V_{H} y V_{L} por mutagénesis dirigida a
oligonucleótidos. Las mutaciones introducidas en la secuencia génica
finalmente aumentarán la complejidad y diversidad del banco así
como la afinidad por antígenos, lo cual puede aumentar
adicionalmente la utilidad del banco en el tratamiento. Además, tal
mutagénesis puede usarse en un solo par
V_{H}-V_{L} o en un grupo definido de tales
pares para generar un banco de novo.
La clonación se realiza, por ejemplo, escindiendo
el ADNc y las secuencias del vector con una enzima de restricción,
si es necesario aislando ciertos fragmentos de ácido nucleico,
mezclando los fragmentos entre sí en presencia de ligasa en una
solución salina equilibrada adecuada, e incubando la mezcla en
condiciones enzimáticamente aceptables durante un período de tiempo
prescrito. Usando diferentes sitios de reconocimiento de enzimas en
cada extremo de los ADNc, puede predeterminarse la orientación de
la clonación. Los vectores se usan para transformar cultivos de
células hospedadoras aceptables y los cultivos se amplifican para
expandir las diferentes poblaciones de vectores que constituyen el
banco. Las células hospedadoras para vectores procariotas pueden
ser un cultivo de bacterias tales como Escherichia coli. Las
células hospedadoras para vectores eucariotas pueden ser un cultivo
de células eucariotas tales como cualquier línea celular de
mamífero, insecto o levadura adaptada al cultivo de tejidos. Las
células bacterianas se transforman con vectores por cloruro
cálcico-choque térmico o electroporación. Las
células eucariotas se transfectan con precipitación con fosfato
cálcico o electroporación, aunque también serían aceptables muchos
procedimientos de transformación diferentes. Los fragmentos de ADN
pueden clonarse en vectores de expresión procariotas o eucariotas,
vectores quiméricos o vectores dobles. El vector de expresión puede
ser un plásmido, cósmido, fago, vector viral, fagémido y
combinaciones de los mismos, pero preferiblemente es un vector de
presentación de fagos donde el producto recombinante se expresa en
la superficie del fago para facilitar el examen y la selección. En
el vector de expresión pueden ponerse sitios de transcripción y
traducción útiles que incluyen regiones de reconocimiento de la ARN
polimerasa tales como un sitio de caja TATA, un sitio CAT, un
potenciador, sitios de empalme apropiados, si es necesario, una
región terminal rica en AT y un sitio de inicio de la
transcripción. Los sitios útiles para facilitar la traducción
incluyen sitios de inicio y de detención de la traducción y sitios
de unión a ribosomas. Típicamente, algunos de los sitios más útiles
para una expresión eucariota eficaz, tales como la región
promotora/potenciadora de SV40, CMV, HSV o baculovirus, proceden de
virus. El anticuerpo recombinante resultante puede ser de la clase
murina IgG_{1}, IgG_{2A}, IgG_{2B}, IgM, IgA, IgD o IgE, de
las clases humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM,
IgA_{1}, IgA_{2}, IgD o IgE, o combinaciones o fragmentos de
las mismas. Preferiblemente, el banco de anticuerpo quimérico se
compone principalmente de anticuerpos IgG o de fragmentos de
anticuerpos Fab.
La amplificación de la población de vectores se
realiza por medio de la incubación y expansión de los cultivos de
células recombinantes. Los cultivos de células bacterianas se
desarrollan, por ejemplo, en caldo L a 37ºC, durante una noche. Las
células eucariotas se incuban, por ejemplo, a 37ºC en un incubador
de CO_{2} de alta humedad durante 1-7 días o más
por paso. En este punto, es de esperar que la complejidad del banco
sea bastante alta, con grandes números de vectores para cada
población de vectores diferente. La población contiene una
secuencia de ácido nucleico representativa para todas o casi todas
las regiones variables que se crearon en respuesta al antígeno
inicial.
Una característica de la invención es la
facilidad con la que los pares de elementos genéticos, que contienen
regiones variables intactas y expresables, pueden transferirse
dentro y entre vectores tales como vectores procariotas, eucariotas
y de mamífero. Pueden transferirse con igual eficacia bancos enteros
o sub-bancos. La transferencia se realiza abriendo,
preferiblemente con enzimas de restricción con especificidad de
sitio, el vector entre las regiones codificantes para el extremo
amino de las proteínas de la región variable. En este área pueden
insertarse cassettes que contienen secuencias promotoras y líder en
una orientación de cabeza a cabeza
(líder-promotor-promotor-líder;
lPPl), que pueden ser procariotas o de mamífero, para
reemplazar la región de control existente o como primera región de
control. Los tramos de ADN que constituyen los genes de la región
variable y el cassette lPPl después se amplifican por PCR
usando cebadores apropiados y se transfieren entre vectores. Cuando
se desee, pueden transferirse rápida y fácilmente lotes de regiones
V unidas con o sin las regiones promotor-líder,
tales como bancos enteros o partes de bancos. Estos segmentos de
ADN pueden incorporarse en el ADN de vectores de presentación de
fagos para un análisis rápido, de cósmidos para el almacenamiento a
largo plazo, o de vectores de expresión de mamífero para la
expresión posterior. La expresión puede realizarse para la
producción de anticuerpos policlonales o para la selección de
bancos de presentación en superficie, que pueden ser procariotas o
eucariotas, para aislar uno o más sub-bancos. Otra
característica de la invención es la capacidad de incorporar
secuencias extra en los vectores para facilitar la manipulación, tal
como con sitios de enzimas de restricción adicionales, o regiones
reguladoras de la transcripción o la traducción adicionales para
facilitar o controlar adicionalmente la expresión de proteínas.
Los bancos de vectores de expresión, de mamífero
o bacterianas que codifican anticuerpos
anti-neoplásicos recombinantes, o fragmentos de
anticuerpos, pueden seleccionarse en sub-bancos por
adsorción de la partícula recombinante, que puede ser una célula
procariota o eucariota o un virus, contra un tejido neoplásico o no
neoplásico. La selección reducirá la complejidad global del banco,
pero la complejidad específica de antígeno del
sub-banco no debe verse afectada
significativamente. El tejido puede ser otra muestra del mismo
tejido en el que se expusieron las células productoras de
anticuerpo u otro tejido de un paciente diferente o del mismo
paciente. Por ejemplo, puede ser muy útil un tejido no neoplásico
del mismo paciente para retirar anticuerpos de unión a antígenos no
neoplásicos expresados en la superficie del fago de presentación.
Como alternativa, puede ser muy útil un tejido neoplásico del mismo
paciente o de un paciente diferente con el mismo trastorno para
aislar los anticuerpos anti-neoplásicos
específicos. En cualquier situación, el tejido o el antígeno puede
fijarse a un soporte sólido y los vectores de expresión en masa
someterse, por ejemplo, a técnicas de cromatografía de afinidad,
aislando el flujo de líquido que pasa a su través o los lavados
cuando se desee. Además, la población de vectores puede
seleccionarse, por ejemplo, por transferencia de Western del
antígeno expresado, o por transferencia de Southern o de Northern
para identificar el ácido nucleico. Los vectores seleccionados
resultantes, o sub-bancos, se amplifican por cultivo
y expansión de la población del organismo hospedador. Si es
necesario, los fragmentos de ADN en los vectores de expresión
bacterianos pueden transferirse a vectores de expresión de
mamíferos tales como, por ejemplo, cassettes, porque las regiones
unidas creadas están flanqueadas con sitios de enzimas de
restricción. Una característica de este aspecto de la invención es
que más de 99,9% del banco puede retirarse durante la selección,
pero el resto de la población de vectores, la subpoblación, aún
puede amplificarse para crear grandes números de vectores o
cantidades de proteína. En efecto, no se pierde nada de la
complejidad específica del sub-banco seleccionado y,
además, este sub-banco puede transferirse intacto y
en masa entre vectores tan fácilmente como el banco original.
Las poblaciones expandidas y amplificadas de
vectores de expresión seleccionados pueden almacenarse para un uso
posterior, administrarse a un paciente directamente, si lo permiten
las condiciones de seguridad, o los productos pueden transcribirse
y traducirse y los anticuerpos antineoplásicos expresados pueden
administrarse al paciente. La administración puede realizarse por
vía parenteral, sublingual, rectal o entérica. Normalmente se
prefiere la administración parenteral, que incluye inyección
intravenosa (i.v.), inyección subcutánea (s.c.), inyección
intramuscular (i.m.), inyección intra-arterial,
inyección intratecal, inyección intraperitoneal (i.p.) o inyección
directa en un sitio del neoplasma. Pueden administrarse anticuerpos
o vectores, pero se prefiere la administración de anticuerpos
porque una expresión eficaz del vector puede ser una complicación
adicional, o puede haber problemas de seguridad asociados con la
introducción de un ADN de vector recombinante en el animal.
Los trastornos neoplásicos que se pueden tratar
por estos métodos son muchos e incluyen leucemias, linfomas,
sarcomas, carcinomas, tumores de células neurales, carcinomas de
células escamosas, tumores de células germinales, metástasis,
tumores indiferenciados, seminomas, melanomas, neuroblastomas,
tumores de células mixtas, neoplasias causadas por agentes
infecciosos y otras malignidades. La naturaleza ubicua del método
se debe, en parte, a su capacidad de utilizar muestras de casi
cualquier antígeno. Preferiblemente, el paciente tratado es un ser
humano, pero también se puede tratar cualquier mamífero con un
sistema inmune humoral funcional. Los pacientes pueden tratarse
terapéutica o profilácticamente, cuando sea necesario, de acuerdo
con protocolos prescritos. Por ejemplo, ciertos cánceres pasan a
través de ciclos sucesivos de progresión y regresión durante meses o
años. Los bancos pueden prepararse y administrarse poco antes de la
fase progresiva para inhibir el crecimiento del cáncer, la invasión
de otros tejidos o el proceso de metástasis. Los bancos también
pueden administrarse como una inyección en embolada para eliminar el
cáncer en una sola dosis o con varias dosis.
El banco también puede administrarse junto con un
agente antineoplásico que estimule el propio sistema inmune del
paciente, tal como un factor de crecimiento de células T, factor de
crecimiento de células B, factor de crecimiento de
granulocitos/macrófagos, factor de crecimiento de granulocitos,
factor de crecimiento de macrófagos, factor de crecimiento de
células madre, factor de crecimiento de trasformación,
eritropoyetina, factor de steel, proteína morfogénica de hueso,
agente de diferenciación, interleuquina, interferón, hormona,
componente del sistema de complemento, o una combinación de los
mismos. El protocolo de tratamiento del paciente también puede
implicar otras formas de terapia tales como quimioterapia,
radioterapia, dieta o terapia con inmunotoxinas. Los agentes
quimioterapéuticos útiles incluyen agentes alquilantes, análogos de
purinas y pirimidinas, vinca alcaloides y alcaloides parecidos a
éstos, etopósidos y fármacos parecidos a etopósido, antibióticos,
corticosteroides, nitrosoureas, antimetabolitos, fármacos
citotóxicos basados en platino, antagonistas hormonales,
anti-andrógenos y anti-estrógenos.
Estos tratamientos pueden incorporarse en un protocolo global para
el tratamiento de la neoplasia del paciente.
La terapia inmunotóxica puede facilitarse por los
métodos descritos en este documento. Por ejemplo, pueden clonarse
fragmentos de ADN recombinante que codifican los fragmentos de
anticuerpo tanto V_{H} como V_{L} en vectores de expresión que
codifican la región constante del anticuerpo y una sustancia
tóxica. Por lo tanto, los productos de fusión expresados tendrán un
alto número de anticuerpos diferentes contra la neoplasia diana,
uniéndose cada uno de ellos a una sustancia tóxica tal como una
toxina animal, vegetal, bacteriana, fúngica, viral o parasitaria.
La administración del banco de anticuerpos al paciente, además de
reclutar las defensas inmunes del hospedador, pondrá a la toxina en
contacto directo con la célula enferma, lo cual puede facilitar la
destrucción de la neoplasia. Las sustancias tóxicas especialmente
útiles incluyen toxinas derivadas de ciertas plantas y bacterias
tales como las toxinas de Pseudomonas, toxinas de
Diphtheria, toxinas de Escherichia y ricina.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para obtener imágenes de un trastorno neoplásico en un
paciente. Se crea un banco de anticuerpos
anti-neoplásicos con especificidad de paciente como
se ha descrito anteriormente, y se mezcla con un vehículo
farmacéuticamente aceptable tal como agua, una sal o solución
tamponada, glicerol, aceite, un sacárido o polisacárido, celulosa o
almidón, alcohol o combinaciones de los mismos. Los anticuerpos del
banco se marcan con un marcador detectable y se administran al
paciente. Los anticuerpos migran a lo largo del cuerpo y se unen a
la diana, que puede ser la neoplasia o metástasis neoplásica, y se
forma una imagen del marcador en el paciente. Los marcadores
detectables que pueden ser útiles para este procedimiento incluyen
radioisótopos, isótopos estables, enzimas, compuestos
fluorescentes, compuestos luminiscentes, compuestos cromáticos,
metales o cargas eléctricas. La neoplasia ahora marcada puede
detectarse por medios adecuados para el marcador, tales como con un
contador de radiaciones iónicas Geiger, un formador de imágenes de
resonancia magnética nuclear (RMN), detectores visuales o a simple
vista, o por autorradiografía.
Otra realización de la invención se refiere a una
composición que comprende un banco con especificidad de paciente de
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
anti-neoplásicos y un vehículo farmacéuticamente
aceptable. La composición se administra a pacientes con la
neoplasia característica contra la que se dirigieron los
anticuerpos creados. El vehículo farmacéuticamente aceptable es un
compuesto o medio que facilita la administración, aumenta la vida en
almacenamiento de la composición o aumenta la utilidad de la
composición en el paciente, tal como aumentando la vida media
circulante o en suero. Los vehículos útiles incluyen agua, solución
salina, alcohol, glicoles incluyendo polietilenglicol, aceite,
polisacáridos, sales, glicerol, estabilizadores, emulsionantes y
combinaciones de los mismos. La composición puede comprender
anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, preferiblemente fragmentos
Fab, seleccionados entre el grupo compuesto por las clases murinas
IgG_{1}, IgG_{2A}, IgG_{2B}, IgM, IgA, IgD e IgE, las clases
humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA,
IgA_{2}, IgD e IgE, y combinaciones o fragmentos de las mismas.
La composición también puede conservarse durante largos períodos de
tiempo por diálisis o liofilización de las proteínas para retirar
todo el líquido. Los anticuerpos liofilizados pueden ser estables a
temperatura ambiente durante años.
Otra realización de la invención se refiere a
métodos para crear y utilizar un banco de anticuerpos policlonales o
fragmentos de anticuerpos con especificidad de antígeno o de tejido
como se ha descrito anteriormente. Se obtiene una muestra de tejido
biológico o antígeno, aislado de forma natural, recombinante o
sintética, posiblemente a partir del paciente a tratar o de un
paciente con un trastorno relacionado. El tejido biológico o
antígeno usado para estimular las células productoras de anticuerpo
puede obtenerse a partir de tejidos tumorales, de sangre y de
tejidos relacionados con la sangre, tejidos de biopsia, tejidos
infectados, bacterias, virus, hongos, parásitos, tejidos malignos,
tejidos genéticamente anormales o combinaciones de los mismos, o de
una fuente ambiental tal como una masa de agua, suelo, residuos
naturales o hechos por el hombre o biomasa. La muestra se introduce
en una población celular capaz de producir anticuerpos. El ARNm de
V_{H} y V_{L} de la población celular se transcribe de forma
inversa en secuencias de ADNc de V_{H} y V_{L} que se
amplifican por PCR, uniéndose las secuencias amplificadas
resultantes. Las secuencias unidas se amplifican por PCR para crear
una población de fragmentos de ADN que codifican fragmentos de
anticuerpo de V_{H} y V_{L} que se clonan en vectores de
expresión, y la población de vectores de expresión clonados se
expande. Los vectores de expresión que codifican anticuerpos o
fragmentos de anticuerpo con especificidad de antígeno o de tejido
pueden seleccionarse y la subpoblación seleccionada puede
expandirse para producir el banco. El banco de fragmentos
policlonales puede clonarse en fase en otros vectores de expresión
que codifican secuencias génicas de región constante de anticuerpo
para expresar anticuerpos policlonales o fragmentos de anticuerpos.
Después, estos anticuerpos pueden inyectarse por vía intravenosa o
subcutánea en el caso de infecciones sistémicas, pueden aplicarse
directamente a una herida para un tratamiento localizado, o pueden
administrarse de otra manera al paciente cuando sea necesario.
Los bancos con especificidad de enfermedad o con
especificidad de antígeno pueden usarse en métodos para tratar o
prevenir trastornos tales como infecciones virales, fúngicas,
parasitarias o bacterianas, anormalidades genéticas e
intoxicaciones. Por ejemplo, pueden crearse bancos de anticuerpos
contra la proteína gp120 del virus VIH-1, que
produce el síndrome de deficiencia autoinmune (SIDA), y pueden
administrarse a pacientes con SIDA para reducir la muerte celular
inducida por el virus, la carga viral o la infectividad, o como
profilaxis para prevenir una posible infección después de una
exposición o cuando existe riesgo de exposición. Pueden usarse
bancos para reemplazar o suplementar otras formas de inmunoterapia
pasiva tales como tratamientos con gamma globulina en el caso de
enfermedades tales como la rabia, la hepatitis, el virus
varicela-zoster, el herpes o la rubéola. Por
ejemplo, puede administrarse periódicamente un banco
anti-rubéola cuando sea necesario a mujeres
embarazadas con riesgo de contraer la rubéola por contagio de otro
miembro de la familia. Esta estrategia carece de efectos secundarios
perjudiciales y es eficaz. Podrían administrarse anticuerpos
anti-herpes a individuos no infectados con parejas
infectadas. La meningitis puede ser una enfermedad amenazadora para
la vida, especialmente en niños, porque no siempre puede
determinarse un tratamiento eficaz y administrarse rápidamente. Por
el contrario, los bancos de anticuerpos policlonales
anti-meningitis pueden almacenarse y usarse cuando
se sospechen casos porque el riesgo de las complicaciones del
tratamiento es muy bajo. Los anticuerpos policlonales creados por
estos métodos pueden suplementar vacunas de influenza convencionales
proporcionando protección contra la influenza durante un corto
período de tiempo hasta que el propio sistema inmune del hospedador
pueda crear una respuesta de anticuerpos suficiente contra el
antígeno.
Los bancos policlonales también pueden ser útiles
como profilaxis o tratamiento en pacientes con quemaduras que son
susceptibles de una amplia diversidad de infecciones adquiridas en
el hospital debidas a, por ejemplo, Staphylococcus,
Streptococcus, Hemophilus, Neisseria, Pseudomonas y los
actinomicetes. Los bancos pueden usarse para tratar o
prevenir, o mejorar los síntomas asociados con sepsis bacterianas,
por medio de la creación y administración de bibliotecas dirigidas
contra lipopolisacáridos (LPS), lípido A, factor de necrosis tumoral
o proteínas de unión a LPS. También pueden tratarse con bancos de
anticuerpos policlonales otras intoxicaciones tales como trastornos
gastrointestinales inducidos por microorganismos bacterianos o
virales, toxicosis producidas por levaduras u otras infecciones
micóticas, o una intoxicación inducida ambientalmente por metales
perjudiciales tales como plomo o aluminio, pesticidas, residuos
industriales, carcinógenos y otros compuestos orgánicos o
inorgánicos perjudiciales.
Otra realización de la invención se refiere a un
kit de diagnóstico para la detección de una enfermedad o trastorno
en un paciente, o de un contaminante en el medio, que comprende un
banco de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con especificidad
de antígeno, tejido o paciente. El kit de diagnóstico puede usarse
para detectar enfermedades tales como infecciones bacterianas,
virales, parasitarias o micóticas, neoplasias, o defectos o
deficiencias genéticas. La muestra biológica puede ser sangre,
orina, bilis, líquido cefalorraquídeo, fluido linfático, fluido
amniótico o fluido peritoneal, preferiblemente obtenido a partir de
un ser humano. Los bancos preparados a partir de muestras obtenidas
del medio pueden usarse para detectar contaminantes en muestras
recogidas en ríos y corrientes, masas de agua salada o de agua
dulce, de suelo o de rocas, o muestras de biomasa. El anticuerpo
puede ser un anticuerpo entero, tal como una IgG, o un fragmento de
anticuerpo tal como un fragmento Fab. El banco puede marcarse con
un marcador detectable o el kit puede comprender además un
anticuerpo secundario marcado que reconoce y se une a complejos de
antígeno-anticuerpo. Preferiblemente, el marcador
detectable es detectable visualmente, tal como una enzima, un
agente químico fluorescente, un agente químico luminiscente o un
agente químico cromático, lo cual facilitaría la determinación de
los resultados de ensayo al usuario o al médico. El diagnóstico
puede comprender además agentes para aumentar la estabilidad y la
vida media, para inhibir o prevenir la contaminación del producto y
para aumentar la velocidad de detección. Los agentes
estabilizadores útiles incluyen agua, solución salina, alcohol,
glicoles incluyendo polietilenglicol, aceite, polisacáridos, sales,
glicerol, estabilizadores, emulsionantes y combinaciones de los
mismos. Los agentes antibacterianos útiles incluyen antibióticos,
agentes químicos bacteriostáticos y agentes químicos tóxicos para
las bacterias. Los agentes para optimizar la velocidad de detección
pueden aumentar la velocidad de reacción, tales como sales y
tampones.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para crear un banco de proteínas receptoras o de cualquier
proteína que muestre variabilidad. Las proteínas receptoras que
pueden utilizarse en este método pueden ser cualquier proteína
eucariota o procariota que tenga regiones variables, incluyendo
receptores de células T tales como los TcR, receptores de células B
incluyendo inmunoglobulinas, receptores de células destructoras
naturales (NK), receptores de macrófagos, y partes y combinaciones
de los mismos. En resumen, una muestra de tejido biológico, tal
como un tejido normal, un tejido neoplásico, un tejido infectado,
tejidos que contienen proteínas de la matriz extracelular (ECM), o
cualquier tejido anormal, se introduce en una población celular
capaz de producir las proteínas receptoras. La población celular se
fija y las células se permeabilizan. Los ARNm de región variable de
las proteínas receptoras se transcriben de forma inversa en
secuencias de ADNc usando una transcriptasa inversa. Las secuencias
de ADNc se amplifican por PCR y se unen, preferiblemente por
hibridación de secuencias complementarias, a las regiones
terminales de estos ADNc. Las secuencias unidas se amplifican por
PCR para crear una población de fragmentos de ADN que codifican las
regiones variables de las proteínas receptoras. Estos fragmentos de
ADN contienen las regiones variables unidas, preferiblemente, en
una orientación de transcripción de cabeza a cabeza, y se clonan en
masa en vectores de expresión. Los vectores de expresión útiles
incluyen fagos tales como fagos de presentación, cósmidos, vectores
virales, fagémidos o combinaciones de los mismos, y estos vectores
se utilizan para transformar organismos hospedadores, expandiéndose
posteriormente las diferentes poblaciones de organismos. Se
seleccionan los vectores de expresión que codifican las proteínas
receptoras recombinantes y la subpoblación se expande. Si es
necesario, la subpoblación puede subclonarse en vectores de
expresión que contienen genes de región constante de receptores en
fase y el banco puede expandirse de nuevo y expresarse para
producir el sub-banco de proteínas receptoras
seleccionadas. Pueden crearse fácilmente bancos quiméricos por
clonación de los genes de región variable seleccionados en vectores
de expresión que contienen genes de región constante de otras
proteínas, tales como genes de región constante de anticuerpos o
genes de receptores de células T. Los sub-bancos
seleccionados pueden usarse directamente o transferirse a otros
vectores de expresión antes de utilizarse para transfectar a las
células hospedadoras. Las células hospedadoras pueden ser células T
procedentes del paciente que, cuando se introducen de nuevo en el
paciente, expresan el banco de receptores en su superficie. Este
tipo de terapia de células T puede usarse para estimular una
respuesta inmune para tratar las mismas enfermedades que se han
descrito para la terapia con anticuerpos.
Usando los métodos descritos anteriormente para
la creación de bancos de anticuerpos policlonales y de bancos de
receptores de células T, pueden crearse bancos de proteínas de
fusión quiméricas que contengan las regiones variable de
anticuerpos unidas a las regiones constantes de receptores de
células T. Tales bancos pueden ser útiles para tratar o prevenir
enfermedades y trastornos como los descritos anteriormente, por
medio de la estimulación o potenciación de la respuesta inmune de
un paciente. Por ejemplo, la unión de un antígeno al receptor de
células T es una parte integral de la respuesta inmune. Al
proporcionar un banco de anticuerpo quimérico/proteína TcR y por
medio de la transfección de una población de células T del paciente
con este banco, se puede potenciar la propia respuesta inmune del
paciente para eliminar una enfermedad o trastorno que no podría
superarse satisfactoriamente de otra forma.
Otra realización de la invención se refiere a
vectores de ácido nucleico que pueden usarse para crear los bancos y
sub-bancos de anticuerpos policlonales con
especificidad de antígeno. Estos vectores comprenden sitios de
reconocimiento de enzimas de restricción convenientes para la
clonación y secuencias para amplificar por PCR de forma eficaz
fragmentos de ácido nucleico recombinantes. Los vectores adecuados
incluyen plásmidos, fagos, fagémidos, fagos de presentación,
cósmidos, vectores virales y combinaciones de los mismos. Se
diseñan vectores que tengan uno o más pares de fragmentos genéticos,
tales como fragmentos de ADNc, insertados en una orientación
transcripcional de cabeza a cabeza. Preferiblemente, los vectores
son vectores de expresión y pueden ser procariotas, eucariotas o
combinaciones o partes de los mismos. Estos vectores también
contienen preferiblemente secuencias controladoras de la
transcripción y la traducción tales como cajas TATA, cajas CAT,
sitios de unión a ribosomas, sitios de iniciación y terminación de
la ARN polimerasa, secuencias líder, promotores fuertes de la
transcripción, que pueden regularse, o partes o combinaciones de los
mismos.
A modo de ejemplo, un vector útil puede
construirse como se representa gráficamente en la Figura 2. En
primer lugar, la cadena principal del vector puede obtenerse a
partir de un vector de fagémido disponible en el mercado tal como
pUC119 (United States Biochemical; Cleveland, OH) como se muestra en
la Figura 2B. Se usan dos cebadores para amplificar una cadena
principal de pUC119 comenzando en el extremo de un lacZ' y
terminando al principio de lacI. El cebador de avance es
complementario al extremo del lacZ' y tiene una cola que no hibrida
que contiene un sitio BglII. El cebador inverso es complementario al
principio de lacI y tiene una cola que no hibrida que contiene un
sitio BstEII. Después de la amplificación por PCR, esta cadena
principal se digiere con BglII y BstEII y se une a un inserto
BstEII (Figura 2B). El inserto BstEII se obtiene como se indica a
continuación (Figura 2A): En primer lugar, el polienlazador de
pUC19 (New England Biolabs; Beverly, MA) se reemplaza por un
polienlazador que contiene
BglII-EcoRI-HindIII-BstEII,
donde cada sitio de restricción está separado por seis nucleótidos.
El reemplazo se consigue digiriendo pUC19 con EcoRI y HindIII,
retirando los salientes con nucleasa S1 y uniendo la cadena
principal a un enlazador sintético de doble cadena que contiene los
sitios
BglII-EcoRI-HindIII-BstEII
para generar pUC19 modificado (pUC19mod). (Obsérvese que pUC19 sólo
se usa para proporcionar un polienlazador que contiene sitios de
enzimas de restricción. En su lugar podría usarse cualquier otro
vector, existente o creado fácilmente que contenga un
polienlazador con los sitios de restricción apropiados.) Un gen
C\kappa se transcribe de forma inversa a partir de ARN procedente
de leucocitos humanos, y se amplifica por PCR usando un cebador
inverso que comprende una cola 5' que no hibrida que contiene un
sitio de restricción BstEII, un sitio de terminación de la
traducción (sitio stop) y un sitio XbaI, y un cebador de avance que
comprende una cola 5' que no hibrida que contiene un sitio de
restricción HindIII. Este producto de PCR se digiere con BstEII y
HindIII y se une a una cadena principal de pUC19mod
BstEII-HindIII para generar
pUC19-C\kappa. Se sintetiza un fragmento de ADN
EcoRI-BglII que contiene el gen CH1 de \gamma1
humano encadenado al segmento génico gIII que codifica un fragmento
de la proteína de recubrimiento del fago cpIII (aminoácidos
198-407). En resumen, se amplifica un fragmento
génico de la proteína de recubrimiento de cpIII a partir de un
vector M13 tal como M13mp18 (New England BioLabs; Beverly MA)
usando un cebador inverso complementario a la secuencia terminal del
fragmento de cpIII, pero con una cola 5' que no hibrida que
contiene un sitio BglII, un sitio de terminación de la traducción
(sitio stop) y un sitio NheI. El cebador de avance para la
amplificación del fragmento de cpIII es complementario a cpIII y
tiene una cola 5' que no hibrida que contiene secuencias
complementarias al extremo del gen CH1 y un sitio SpeI. El gen CH1
humano se transcribe de forma inversa a partir de ARN procedente de
leucocitos humanos y se amplifica por PCR usando un cebador inverso
complementario al extremo del gen CH1 de \gamma1 con una cola 5'
que no hibrida que contiene un sitio SpeI. El cebador de avance es
complementario al principio del gen CH1 con una cola 5' que no
hibrida que contiene un sitio EcoRI. Como los cebadores de avance e
inverso contienen extremos complementarios, los productos de PCR de
cpIII y CH1 se encadenan por PCR de extensión solapante usando el
cebador inverso de cpIII y el cebador de avance de CH1. El producto
de PCR resultante se corta con EcoRI y BglII y se une a una cadena
principal EcoRI-BglII derivada de
pUC19-C\kappa, para generar
pUC19-C\kappa-CH1. El inserto
BglII-BstEII se retira y se une a la cadena
principal BglII-BstEII derivada de pUC119 para
generar el vector de tipo phh3hu,
pUC119-C\kappa-CH1 (Figura
2B).
También puede generarse fácilmente un cassette de
tipo lPPl (Figura 2C). Un fragmento
BamHI-XhoI se monta a partir del promotor tac (Ptac)
y secuencias líder pelB. La secuencia líder pelB se obtiene por
amplificación por PCR a partir del vector pET-22b
(Norvagen, Inc.; Madison, WI) usando un cebador de avance, y un
cebador inverso con una cola 5' que no hibrida que contiene un
sitio XhoI y codones para LKVQA. La secuencia Ptac se obtiene por
amplificación por PCR a partir del vector pDR540 (Pharmacia
Biotech; Piscataway, NJ) usando un cebador de avance con una cola
5' que no hibrida que contiene un sitio BamHI y un cebador inverso
con una cola 5' que no hibrida que es complementaria a la secuencia
del principio del líder pelB en pET-22b. El líder
pelB y los productos de PCR de Ptac pueden hibridar a través de sus
extremos complementarios y se encadenan por PCR de extensión
solapante usando los cebadores que contienen BamHI y XhoI. El
producto de PCR resultante se digiere con XhoI y BamHI y se une a
una cadena principal XhoI-BamHI derivada de pUC19Xho
para generar pPl. (La cadena principal de pUC19Xho se forma
digiriendo pUC19 con HindIII, rellenando los salientes con Klenow y
uniendo la cadena principal con un enlazador XhoI.) Se monta un
fragmento BamHI-SacI a partir del promotor lacZ
(PlacZ) y la secuencia líder de gIII de la proteína de recubrimiento
cpIII de M13. La secuencia líder de gIII se obtiene por
amplificación por PCR a partir de M13mp18 usando un cebador de
avance y un cebador inverso que tiene una cola 5' que no hibrida
que contiene un sitio SacI y los codones para EA. La secuencia PlacZ
se obtiene por amplificación por PCR a partir de pUC119 usando un
cebador de avance con una cola 5' que no hibrida que contiene un
sitio BamHI y un cebador inverso con una cola 5' que no hibrida que
es complementaria a la secuencia del principio del líder de gIII.
El líder de gIII y los productos de PCR de PlacZ pueden hibridar a
través de sus extremos complementarios y se encadenan por PCR de
extensión solapante usando los cebadores terminales que contienen
BamHI y SacI. El producto de PCR resultante se digiere con SacI y
BamHI y se une a una cadena principal SacI-BamHI
derivada de pPl para generar el vector de tipo plPPl
plPPl2. Como se muestra en la Figura 2D, pueden
insertarse genes de región V_{H}-V_{L} unidos
cabeza a cabeza en el vector
pUC119-C\kappa-CH1. Los vectores
resultantes pueden abrirse con XhoI y SacI para insertar un
cassette lPPl del vector plPPl2 para generar pJS.
Otra realización de la invención se refiere a un
método para transferir un banco de fragmentos de ácido nucleico
entre diferentes vectores sin una pérdida significativa de
diversidad del banco. El banco puede ser un banco de fragmentos de
ADNc, fragmentos de ADN genómico, ácidos nucleicos recombinantes,
ARN o una combinación de los mismos. Los fragmentos se insertan en
primeros vectores en una orientación transcripcional de cabeza a
cabeza. La inserción puede realizarse por unión de los ácidos
nucleicos a vectores abiertos por escisión con enzimas de
restricción. Los fragmentos pueden modificarse antes de la
inserción, tal como por la adición de enlazadores y enzimas de
restricción u otros sitios, o por la unión a secuencias
codificantes adicionales. El primero y el segundo vectores pueden
ser vectores procariotas o eucariotas y preferiblemente son
vectores de expresión. Las secuencias insertadas se obtienen a
partir de los primeros vectores y se reinsertan en segundos vectores
sin una pérdida significativa de la diversidad de banco. Los
fragmentos pueden obtenerse por escisión de los primeros vectores
recombinantes, en masa, con enzimas de restricción apropiadas. Como
alternativa, las secuencias de los fragmentos pueden obtenerse por
amplificación por PCR de las secuencias insertadas. La reinserción
se realiza por unión de las secuencias a los segundos vectores,
pero las secuencias pueden modificarse si se desea antes de la unión
como se ha descrito. La diversidad global del banco comprende más
de al menos diez fragmentos diferentes, preferiblemente 100
fragmentos diferentes, más preferiblemente 1000 fragmentos
diferentes, incluso más preferiblemente al menos 10.000 fragmentos
diferentes y posiblemente muchos más, tal como 10^{5}, 10^{6},
10^{7}, 10^{8} y 10^{9} fragmentos diferentes. Después de la
transferencia, es de esperar que la diversidad del banco, como la
que puede medirse analizando los recombinantes resultantes, se
reduzca en menos de 90%, preferiblemente en menos de 50%, más
preferiblemente en menos de 10% e incluso más preferiblemente en
menos de 1%, y aún más preferiblemente en menos de 0,1%, aunque
esto puede depender en mayor medida del tipo particular de banco
que se vaya a crear.
Los siguientes ejemplos ilustran realizaciones de
la invención, pero no deben considerarse limitantes del alcance de
la invención.
Se obtuvieron desechos patológicos de tumores
humanos y tejidos normales del Departamento de Patología Quirúrgica
del Centro Médico de la Universidad de Boston. De los tumores
procesados, tres fueron carcinomas de ovarios, dos fueron
adenocarcinomas de útero, uno fue un mesotelioma del peritoneo, y
uno procedía del suelo oral de un tumor de boca. Se congelaron
rápidamente dos piezas del tejido tumoral y dos piezas de cualquier
tejido normal disponible en OCT (poli(alcohol vinílico),
cloruro de benzalconio, polietilenglicol, todos en H_{2}O
destilada; Miles Laboratories; Kankakee, IL) para la preparación
posterior de secciones congeladas (criostato). Si se disponía de
suficiente tejido normal, algunas muestras se congelaron
rápidamente sin OCT para la preparación posterior de membranas para
la absorción posterior de anticuerpo.
Los tejidos tumorales se trituraron en piezas de
aproximadamente 1 mm^{3} y se digirieron durante 45 minutos a 37ºC
con una mezcla de enzimas que constaba de 1 mg/ml de colagenasa de
tipo IA, 1 mg/ml de colagenasa de tipo IV, 200 pg/ml de DNasa, y 100
unidades/ml de hialuronidasa en Medio de Dulbecco Modificado de
Iscove (IMDM). La mezcla se filtró a través de nitex para eliminar
las piezas no digeridas y para recoger suspensiones celulares que
se inyectaron por vía subcutánea (s.c.) en ratones desnudos BALB/c
para desarrollar tumores, para prepararse en cultivos de explantes
en medio suplementado con D-Val, y para congelarse
como alícuotas en 90% de suero humano/10% de dimetilsulfóxido
(DMSO).
Las células suspendidas se lavaron con IMDM y se
introdujeron en gradientes por etapas de Percoll/solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Se aislaron células tumorales de la
interfase entre 1,07 g/ml de Percoll y la PBS. Las células
tumorales aisladas se inyectaron en ratones BALB/c i.p. para obtener
anticuerpos anti-tumor, se inyectaron s.c. en
ratones desnudos BALB/c para desarrollar tumores, se prepararon en
cultivo en medio D-Val suplementado con 30% de una
mezcla dializada de partes iguales de suero humano, suero bovino
fetal (FBS) y sobrenadante de células de cultivo de fibroblastos de
rata, para establecer las líneas celulares, y se congelaron en
alícuotas con 90% de suero humano/10% de DMSO para un uso
posterior.
Uno de los tumores de ovarios procesados se
diagnosticó como un adenocarcinoma moderadamente diferenciado. En
el día de la cirugía, se obtuvieron las siguientes muestras a
partir de la paciente; una muestra de tumor del ovario, una
metástasis de ganglio linfático, y miometrio normal, endometrio e
intestino delgado. Las muestras de tejido tumoral y normal se
procesaron como se ha descrito anteriormente. La fracción
enriquecida en células tumorales, aislada en el gradiente de
Percoll, constaba principalmente de pequeños cúmulos de células
grandes y no pudo realizarse un recuento directo de las células. Los
números de células se estimaron después de la centrifugación,
basándose en la experiencia con células de tamaño similar. Se
estimó una recuperación de 2 x 10^{8} células del tumor de
ovario. Se analizó una preparación posterior en citospin de las
células y se determinó que contenía principalmente células
tumorales. A cada uno de cuatro ratones BALB/c se les inyectaron
i.p. 0,25 ml de esta suspensión celular en IMDM (con una estimación
de 10^{7} células por ratón) para producir anticuerpos
antitumorales.
A un ratón desnudo se le inyectaron s.c. 0,2 ml
de tumor triturado en IMDM procedente del ovario. A otro ratón
desnudo se le inyectaron s.c. 0,2 ml de tumor triturado procedente
del ganglio linfático. Los dos ratones desnudos desarrollaron
tumores subcutáneos. Los tumores fueron evidentes
15-18 días después de la inyección. El ratón al que
se le inyectó el tumor procedente de ovario fue sacrificado un mes
después de la inyección, momento en el que el tumor tenía unas
dimensiones de aproximadamente 1,5 cm x 1 cm x 0,5 cm. Un análisis
de una preparación en citospin de células aisladas de este tumor por
centrifugación con gradiente de Percoll demostró que era de origen
humano y del mismo tipo que el tumor ovárico original. Este tumor
pudo propagarse adicionalmente tanto en ratones desnudos como en
ratones SCID por inyección s.c. de piezas de tumor recién
trituradas o de piezas de tumor que se habían congelado en 90% de
suero humano/10% de DMSO y descongelado para la inyección.
El tumor que se desarrolló en el ratón desnudo al
que se le habían inyectado piezas de tumor derivadas de la
metástasis de ganglio linfático se procesó adicionalmente. Después
de congelar rápidamente una muestra en nitrógeno líquido, el tumor
se trituró en piezas de 1 cm. La mitad de las piezas trituradas se
congelaron en alícuotas de aproximadamente 0,4 ml (piezas de tumor
empaquetadas) en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenaron
en nitrógeno líquido. La otra mitad se usó para preparar una
suspensión de células tumorales por centrifugación en gradiente de
densidad de Percoll como se ha descrito anteriormente. Las células
recuperadas se congelaron en dos alícuotas de aproximadamente 4 x
10^{7} células, cada una en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se
almacenaron en nitrógeno líquido. Se usaron suspensiones de células
aisladas en Percoll del tumor OC2 para generar tumores i.p. y s.c.
en un ratón desnudo. Los tumores OC2 tanto en los ratones BALB/c
como en los ratones SCID se propagaron por inyección i.p. de piezas
de tumor (0,25 ml). Los tejidos de tumor OC2 pudieron propagarse en
ratones inmunodeficientes y se desarrollaron tanto tumores
subcutáneos como intraperitoneales en un ratón desnudo y un ratón
SCID.
Debido a la propagación satisfactoria del tumor
OC2 tanto en ratones desnudos como en ratones SCID, se obtuvo una
muestra de 10 cc de sangre heparinizada a partir de la paciente
OC2. Se aisló la fracción de leucocitos (1,4 x 10^{7} células),
se congeló en 90% de suero humano/10% de DMSO, y se almacenó en
nitrógeno líquido. También se obtuvieron muestras de sangre
adicionales a partir de la paciente. La muestra de miometrio normal
obtenida a partir de la paciente en el día de la cirugía y
congelada en nitrógeno líquido se procesó para obtener
preparaciones de membranas. El tejido congelado se trituró con un
mortero y su mano en nitrógeno líquido, se homogeneizó en un tampón
que contenía los inhibidores de proteasa leupeptina, aprotinina,
pepstatina y PMSF, y se centrifugó durante 10 minutos a 1.200 x g
para retirar el desecho celular. Se obtuvieron sedimentos que
contenían membrana por centrifugación a 150.000 x g durante 90
minutos, y se almacenaron a -80ºC en alícuotas que contenían 10% de
glicerol.
El carcinoma OC2 se propagó tanto en ratones
desnudos BALB/c como en ratones SCID, por inyección s.c. o i.p. de
piezas de tumor trituradas recientes o congeladas previamente.
Además de un suministro constante de tumor humano reciente
propagado en el ratón denudo o SCID, se prepararon alícuotas
congeladas de tumor triturado y de células tumorales aisladas en
gradiente de Percoll procedentes del primer paso de la metástasis
de ganglio linfático OC2 a través de un ratón desnudo. Las células
y las piezas de tejido obtenidas directamente de la paciente se
congelaron en 90% de suero humano/10% de DMSO y se almacenaron en
nitrógeno líquido. Esto incluyó catorce alícuotas con una estimación
de 10^{7} células cada una de células tumorales OC2 separadas por
Percoll derivadas del ovario de la paciente, tres alícuotas de
aproximadamente 0,75 ml cada una de metástasis de ganglio linfático
de OC2 triturado de la paciente, cinco alícuotas de 2,8 x 10^{6}
PBL de la paciente cada una y muestras del tumor de ovario. La
metástasis de ganglio linfático, el miometrio, el endometrio y el
intestino delgado se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido con
o sin OCT, y se almacenaron a -80ºC.
Cuatro ratones BALB/c se inmunizaron una vez i.p.
con aproximadamente 10^{7} células OC2 procedentes de ovario. Los
ratones se sometieron a un refuerzo i.p. en el día 30 con
aproximadamente 5 x 10^{6} células tumorales OC2 de la
preparación original que se había congelado en 90% de suero
humano/10% de DMSO, se había almacenado en nitrógeno líquido y se
había descongelado y lavado antes del uso. Se obtuvieron antisueros
en los días 12 y 30 después de la inmunización primaria y en el día
11 después de la inmunización secundaria. Pueden administrarse
refuerzos adicionales a los ratones, tanto i.p. como i.v., hasta
que ya no se obtenga ningún aumento adicional en la respuesta. La
reactividad del antisuero con las células tumorales OC2, en
comparación con la reactividad del suero preinmune, se determina
por ELISA en fase sólida usando placas recubiertas con
preparaciones de membrana de tumor OC2 e inmunoglobulina de cabra
anti-ratón marcada con fosfatasa alcalina y nitro
azul tetrazolio (NBT) más indolil-fosfato (BCIP)
como sustrato (Promega; Madison, WI), como reactivos de
revelado.
La reactividad de los antisueros con secciones de
criostato de cuatro micrómetros del tumor OC2 puede determinarse
por inmunohistoquímica. Se tratan muestras fijadas con acetona con
H_{2}O_{2} al 0,3% en metanol para destruir la actividad
peroxidasa endógena y después se rehidratan en PBS/1% de FBS.
Después se incuban con el antisuero durante un periodo de
aproximadamente 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, se aclaran
y se incuban con Ig de conejo anti-ratón
biotinilada. Se desarrollan tinciones con
avidina-peroxidasa de rábano picante y
diaminobencidina. Se cuentan las secciones teñidas con verde de
metilo.
Se prepararon vectores de expresión, tanto de
mamífero como bacterianos, en los que podían transferirse
combinaciones unidas de genes de regiones V_{H} y V_{L}, en
masa, desde las células B en las que se expresan en el caso de los
vectores bacterianos, y sin perder las combinaciones, en el caso de
los vectores de expresión de mamífero. Las cadenas H y L, en los
dos tipos de vectores, se disponen en orientaciones
transcripcionales opuestas con promotores de cabeza a cabeza. De
esta manera, la combinación del gen de la región V podía
transferirse como una unidad entre vectores. Además, como todos los
vectores son circulares, los vectores pueden abrirse por enzimas de
restricción entre los genes de la región V_{H} y V_{L} para
insertar fragmentos de ADN de intervención tales como promotores,
sin perder la combinación V_{H}-V_{L}, que
permanece en la misma pieza de ADN.
Pueden expresarse proteínas quiméricas en la
superficie de fagos filamentosos (M13) si se fusionan a una proteína
de la cubierta del fago tal como cpIII o cpVIII. En estos estudios
se usó el vector de expresión de fagémidos circular pComb3, que
contiene un sitio insertable en fase con cpIII, aunque también
pueden usarse otros vectores similares disponibles comúnmente. Se
creó un ADN de vector de fagémido pComb3 que codificaba una porción
Fd (dominios V_{H} y C_{H1}) de un anticuerpo. La región
genética que codificaba la porción de anticuerpo se fusionó al gen
gIII, que codificaba el extremo carboxilo terminal de cpIII (Figura
3). El vector es circular y la digestión con SpeI y NheI, que
produce extremos cohesivos compatibles, ocasiona la eliminación del
fragmento de la proteína de la cubierta gIII, y después de volverse
a unir, permite la producción de Fab libre. Pueden obtenerse bancos
de presentación de fagos de 10^{7} miembros después de la
co-infección de E. Coli
XLI-Blue con el fago adyuvante, y pueden
seleccionarse con respecto a la unión al antígeno por medio de la
presentación en superficies recubiertas con antígeno. Los genes que
codifican los fragmentos Fab seleccionados se transportan en las
partículas de fago y, de esta manera, están inmediatamente
disponibles para la clonación y secuenciación.
\newpage
El vector pComb3 también codifica una cadena L
libre (dominios kappa de V_{L} y C_{L}) que se asocia con la
región Fd fusionada a la proteína de la cubierta para formar
fragmentos Fab presentados en la superficie del fago. La proteína de
fusión Fd-cpIII y la cadena L se expresan a partir
de sus propios promotores (lacZ) en orientaciones transcripcionales
de cabeza a cola. Para obtener una serie de fagos que expresen
anticuerpos de alta afinidad dirigidos contra una diversidad de
antígenos tales como los presentes en la superficie de una célula
tumoral, es más eficaz tener las combinaciones de cadenas H y L
generadas in vivo en respuesta a la inmunización.
Para obtener un vector bacteriano en el que
puedan disponerse los genes de región V_{H} y V_{L} en
orientaciones transcripcionales opuestas, se modificó el vector de
presentación de fagos pComb3. Este vector pComb3 modificado (phh3,
Figura 3b), contiene el lacZ y los promotores tac en orientaciones
transcripcionales de cabeza a cabeza, dirigiendo la transcripción
de los genes kappa y Fd de ratón, respectivamente. El dominio
C_{H1} del gen Fd procede de la IgG_{2b}. Aunque las secuencias
líder para las dos cadenas tienen la secuencia de aminoácidos líder
de pelB, las secuencias de nucleótidos difieren en muchas
posiciones. Se tomó esta precaución para proteger contra las
deleciones. La integridad de este vector de fagémido, tanto en forma
bicatenaria como en forma monocatenaria, se verificó por un análisis
de diagnóstico con enzimas de restricción, por secuenciación y por
amplificación por PCR de segmentos específicos.
El segmento de ADN que contenía el promotor
bacteriano cabeza a cabeza y las secuencias líder de phh3, un
cassette bacteriano lPPl, se generó por subclonación en
pBluescript II KS (Stratagene; La Jolla, CA), para generar
plPPl (Figura 3c). El vector phh3 se modificó reemplazando
los genes de la región variable y las secuencias líder y promotora
por un tramo de ADN irrelevante para producir phh3mu que contenía
los genes C\kappa y CH1 de \gamma_{2b} murinos (Figura 3d).
Se obtuvo un vector de presentación de fagos bidireccional adicional
que contenía los genes C\kappa y CH1 de \gamma_{1} humanos
(phh3hu; Figura 3d) a partir de phh3mu reemplazando los genes C
murinos por genes C humanos.
Tanto phh3mu como phh3hu son útiles para la
clonación de pares V_{L}-V_{H} unidos en una
orientación transcripcional de cabeza a cabeza. Estos vectores
circulares pueden abrirse entre los extremos amino de los genes de
la región V_{L} y V_{H} para insertar el cassette lPPl
derivado de plPPl y generar un banco de presentación de
fagos bidireccional. Como se representa en la Figura 4c, los pares
V_{L}-V_{H}, unidos en una orientación
transcripcional de cabeza a cabeza, pueden transferirse fácilmente,
en masa, entre un vector de presentación de fagos bidireccional
funcional y un vector de expresión de mamífero circular. La
transferencia requiere la apertura del vector entre los extremos
amino de V_{L} y V_{H} y el intercambio de cassettes que
contienen secuencias líder y promotores procariotas o de mamífero,
los cassettes lPPl. Los pares
V_{L}-V_{H} que incluyen los cassettes
lPPl se expanden en un vector, por PCR, y se insertan en
otro vector. Para la inserción en el vector de mamífero, las colas
que no hibridan de los cebadores de PCR contienen sitios de empalme
(ss = sitio de empalme; Figura 3c).
Se obtuvo por ingeniería genética un vector doble
murino, pMDV (Figura 4a), capaz de expresar una cadena H de
IgG_{2b} de ratón y una cadena L kappa de ratón, y se usó para
expresar anticuerpos IgG_{2b} por transfección en la línea de
células de hibridoma nula sp2/0-Ag14, que no produce
ninguna cadena H o L endógena. El gen de la región C de IgG_{2b}
se reemplaza por el gen de la región C de IgG_{2a} por
manipulaciones enzimáticas como se describe en Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (J. Sambrook et al. editors,
Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY, 1989). El
vector doble murino también puede modificarse reemplazando los
genes C_{\gamma 2b} y C\kappa murinos por los genes C_{\gamma
1} y C\kappa humanos respectivamente, para generar el vector
doble quimérico (pCDV) mostrado en la Figura 4b. El marcador
selectivo Eco gpt confiere a las células de mamífero resistencia al
ácido micofenólico cuando está presente xantina en el medio.
Las células se fijaron básicamente como se
describe por M.J. Embleton et al. (Nuc. Acids Res.
20:3831-37, 1992) con modificaciones minoritarias.
Se lavaron células a una concentración de 3-5 x
10^{7} en un tubo cónico de 50 ml (Costar; Cambridge, MA) tres
veces en 10 ml de PBS, pH 7,2, a temperatura ambiente. El sedimento
celular se resuspendió en 1,0 ml de NaCl 150 mM, seguido de la
adición de 1,0 ml de formaldehído al 20% enfriado con hielo (Sigma
Chemical; St. Louis, MO)/NaCl 150 mM gota a gota con agitación
vorticial suave. Las células se mantuvieron en hielo y se agitaron
con vórtice a intervalos de 10 minutos durante un total de una
hora, y después se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo a
350 x g durante tres minutos a 4ºC. El tubo se golpeó ligeramente
para dispersar el sedimento entre los lavados. El sedimento se
resuspendió en 1,0 ml de NP-40 (Sigma Chemical; St.
Louis, MO) al 0,5% en agua. Las células se mantuvieron en hielo
durante una hora con agitación vorticial ocasional, y después se
transfirieron a un tubo de microcentrífuga y se centrifugaron a
14.000 rpm a 4ºC durante 3 minutos. A continuación se realizaron
tres lavados con PBS enfriado con hielo y un lavado con PBS enfriado
con hielo/glicina 100 mM. Entre los lavados, el sedimento se
dispersó por agitación vigorosa de la microcentrífuga. Las células
se resuspendieron en PBS/glicina 100 mM con una micropipeta para
dispersar el sedimento celular y retirar los cúmulos de células
visibles. Se congelaron alícuotas de 10^{6} células en
PBS/glicina 100 mM en hielo seco y se almacenaron a -80ºC durante
un período de hasta tres semanas.
Se estableció un procedimiento de PCR dentro de
las células en el que se sintetizaron ADNc de las regiones V_{H} y
V_{L} in situ en una población de células
fijadas/permeabilizadas. Se generaron dos líneas celulares
transfectantes, produciendo una línea celular un anticuerpo
IgG_{2b}(\kappa) de ratón específico para el hapteno
p-azofenilarsonato (Ars; J. Sharon et al.,
J. Immunol. 142:596-601, 1989). La otra línea
celular produce un anticuerpo IgG_{2b}(\kappa) quimérico
que es idéntico al anticuerpo anti-Ars tanto a
nivel de los aminoácidos como a nivel de los nucleótidos, con la
excepción de las regiones determinantes de complementariedad (CDR),
que proceden de un anticuerpo anti-dextrano. Se
usaron estas dos líneas celulares porque los cebadores para la
síntesis de ADNc y para la PCR, que no incluyen las CDR, tienen la
misma complementariedad con los genes H y L de las dos líneas
celulares, aunque las combinaciones V_{H}-V_{L}
unidas resultantes podrían distinguirse por secuenciación en las
CDR.
La síntesis de ADNc y las amplificaciones por PCR
en células fijadas/permeabilizadas se realizó básicamente como se
describe por M.J. Embleton et al. (Nuc. Acids Res.
20:3831-37, 1992) con modificaciones minoritarias.
Se lavaron 2 x 10^{6} células fijadas/permeabilizadas una vez con
agua y se usaron en una reacción de 50 \mul para la síntesis de
ADNc. Se usaron cuarenta unidades de transcriptasa inversa
SuperScript (Gibco/BRL; Grand Island, NY), tampón de primera cadena
(Gibco/BRL; Grand Island, NY) y 25 pmoles de cada uno de los
cebadores de avance 3A-CL y 1A-CH1
(Operon Technologies; Alameda, CA). Después de la síntesis de ADNc,
las células se sometieron a una microcentrifugación (14.000 rpm
durante 3 minutos a 4ºC), se lavaron en 200 \mul de PBS/glicina
100 mM y se resuspendieron en 10 \mul del mismo tampón. Las PCR
se realizaron con el kit de ADN polimerasa AmpliTaq
(Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT) en un DNA Thermal
Cycler 480 (Perkin-Elmer Cetus; Norwalk, CT)
durante 30 ciclos. Cada ciclo constaba de 30 segundos a 90ºC, 30
segundos a 65ºC y 30 segundos a 72ºC. La concentración final de
MgCl_{2} fue de 2,5 mM. Se incluyó un control de PCR de 20 \mul
que produce un producto de 1,2 kilopares de bases.
En la primera PCR, se usaron 10 pmoles de cada
uno de los cebadores de unión 4L y 2H junto con 25 pmoles de cada
uno de los cebadores de avance 3A-CL y
1A-CH1.
Cebadores de Avance:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores de Unión:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Cebadores Anidados:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador de Secuenciación:
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores de Promotor/Líder:
Después de la primera PCR, las células se
sometieron a una microcentrifugación y se recogió el sobrenadante.
Para la segunda PCR, después de dos lavados de 200 \mul de
PBS/glicina 100 mM, se añadieron 25 pmoles de cada uno de los
cebadores anidados 3L y 1H. Después de completar los 30 ciclos como
se ha indicado anteriormente, las células se sometieron a
microcentrifugación y se recogieron los sobrenadantes. Los
productos de reacción obtenidos después de la primera y segunda PCR
se muestran en la Figura 6. Se observó una banda de 777 pb
correspondiente a la combinación V_{H}-V_{L}
unida (indicada por una flecha) después de la segunda PCR. Los
productos obtenidos como primer y segundo producto de PCR se
muestran en las bandas 1 y 2, respectivamente. m y M son una escala
de 123 pb y un producto de digestión Hind III de ADN del fago kappa,
respectivamente, indicándose los tamaños en pares de bases (pb) de
algunas de las bandas. La banda observada tenía el tamaño correcto
esperado para la combinación V_{H}-V_{L}. Esta
banda se purificó en gel y se clonó, después de la digestión con
EcoRI y HindIII, en los sitios EcoRI-HindIII de
M13mp19.
En la Figura 5 se muestra una representación
esquemática de las reacciones de PCR y de transcriptasa inversa
dentro de las células, y de los productos obtenidos. Después de la
síntesis de ADNc usando cebadores 1A-CH1 y
3A-CL (ambos anti-sentido),
complementarios al principio de los genes C_{H1} y C\kappa para
los ARNm de cadena H y L, respectivamente, se usaron los mismos
cebadores más dos cebadores de unión, 2H y 4L (ambos con sentido),
en una primera reacción de PCR. Además de proporcionar una forma
para unir la combinación V_{H}- V_{L} dentro de las células, los
cebadores de unión introducen sitios de restricción (XhoI y SacI)
para la posterior clonación de las secuencias promotoras entre
V_{H} y V_{L}. El cebador 2H hibrida con el principio de la
secuencia V_{H} que incluye parte de la secuencia líder, tiene un
sitio de enzimas de restricción Xho I correspondiente a las
posiciones de aminoácidos 5 y 6 de la región V_{H}, y contiene
una cola de 30 nucleótidos de longitud de secuencia aleatoria. El
cebador 4L hibrida con el principio de la secuencia V\kappa que
incluye parte de la secuencia líder, tiene un sitio de restricción
Sac I correspondiente a los aminoácidos 1 y 2 de la región V\kappa
y contiene una cola de 30 nucleótidos de longitud que es el
complemento inverso de la cola del cebador 2H.
Como las colas de los cebadores 2H y 4L son
complementarias, los fragmentos amplificados de V_{H} y V_{L} se
unieron durante la PCR por extensión solapante. Después de lavar
las células para retirar los cebadores no incorporados
extracelulares y cualquier producto de PCR que pueda haber salido
de las células, se preparó una segunda PCR usando cebadores anidados
1H y 3L, ambos anti-sentido y no solapantes con los
cebadores 1A-CHI y 3A-CL. El cebador
1H es complementario al principio del dominio C_{H1} de
IgG\gamma_{2b} y a parte de JH2. Además, contiene un sitio de
restricción Hind III y un sitio de empalme. El cebador 3L es
complementario al principio del dominio C\kappa y a parte de
J\kappa1. Contiene un sitio de restricción EcoRI y un sitio de
empalme. Los sitios de empalme y los sitios de restricción en los
cebadores 1H y 3L están destinados a facilitar la clonación
posterior de las combinaciones V_{H}-V_{L}
unidas en el vector de expresión de mamífero doble mostrado en la
Figura 4a.
Para determinar si las combinaciones de
V_{H}-V_{L} amplificadas dentro de las células
pueden expresarse como anticuerpos IgG en células de mieloma o
hibridoma, se proporcionaron promotores de mamífero de cabeza a
cabeza (Figura 7). Un clon que contenía una combinación
V_{H}-V_{L} unida, que codificaba las regiones
V de los anticuerpos anti-Ars, se digirió con XhoI y
SacI y se unió a un fragmento de ADN XhoI-SacI que
contenía un promotor de cadena H, un secuencia líder, y un ADN que
codificaba los cuatro primeros aminoácidos de la cadena H madura,
en una orientación de cabeza a cabeza con un promotor de cadena
kappa y una secuencia líder. Se aisló un fragmento de ADN
EcoRI-HindIII de 2,25 kb que incluía los promotores
y los genes de la región V a partir del vector resultante, y se
unió a la cadena principal EcoRI-HindIII derivada
del vector doble murino IgG_{2b}. El vector de expresión
resultante (Figura 7) se utilizó para transfectar células de
hibridoma nulas Sp2/0-Ag14 por electroporación.
Los transfectantes mostraron la producción de
anticuerpos IgG intactos como se determina por análisis de
transferencia de Western de sus sobrenadantes (Figura 8a) realizado
como se describe por H. Towbin et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 76:4350-54, 1979). La posición del producto IgG
de 150 KDa se indica por una flecha. También se indican las
posiciones de los marcadores de peso molecular en KDa, así como: E
= el transfectante experimental derivado de la combinación
V_{H}-V_{L} unida dentro de las células; -C =
control negativo (línea celular Sp2/0-Ag14
parental); M = marcadores de peso molecular
pre-teñidos; +C, control positivo (transfectante
IgG_{2b} anti-Ars); -A = un transfectante que
produce un anticuerpo IgG_{2b} mutante que ha perdido la unión a
Ars. Los transfectantes unidos a Ars se evalúan por inmunoensayo
unido a enzima en fase sólida (ELISA) usando placas recubiertas con
Ars-BSA e IgG de cabra anti- ratón marcada con
fosfatasa alcalina (específica de Fc, Figura 8b) en el sistema
ProtoBlot (Promega, Madison, WI).
En un experimento adicional, se amplificó un par
V_{H}-V_{L} derivado de un anticuerpo murino
contra p-azofenilarsonato (Ars) junto con el
cassette lPPl de intervención de mamífero por PCR a partir
del vector de expresión de mamífero y se transfirió a phh3mu. El
cassette lPPl de mamífero después se cambió por el cassette
lPPl procariota que contenía los promotores de lacZ y tac de
cabeza a cabeza y las dos secuencias líder de pelB para generar
phh3-Ars. Como se muestra en la Figura 9, el fago
producido a partir del vector phh3-Ars (Figura 9A,
ELISA directo) se unía específicamente a una placa recubierta con
Ars-albúmina de suero bovino
(Ars-BSA). Además, la unión a la placa recubierta
con Ars-BSA pudo inhibirse específicamente por
Ars-BSA soluble, pero no por BSA soluble (Figura
9B).
Estos resultados demuestran que las combinaciones
V_{H}-V_{L} amplificadas y unidas por PCR
dentro de las células pueden transferirse satisfactoriamente a un
vector de expresión. Las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas también pudieron
transferirse primero al vector de presentación de superficie de
fagémido phh3 y a los vectores de expresión dobles murino o
quimérico (Figura 4), y el vector de presentación de fagos
bidireccional puede usarse satisfactoriamente para transferir un
par V_{H}-V_{L} unido cabeza a cabeza para
producir partículas de fago que presenten fragmentos Fab de unión a
antígenos.
Se preparan células de bazo y células de ganglio
linfático de ratones inmunizados después de la lisis de glóbulos
rojos, se combinan, se fijan en formaldehído al 10%, se
permeabilizan con NP-40 al 0,1% y se mantienen
congeladas a -80ºC en alícuotas de 10^{7} células hasta el uso
para la PCR dentro de las células. Otros ratones se inmunizan
posteriormente con células OC2 aisladas con Percoll de un paciente,
procedentes de las alícuotas congeladas. Una alícuota de células de
bazo fijadas/permeabilizadas más células de ganglio linfático
derivadas del ratón inmune OC2 se somete a la síntesis de ADNc y a
la amplificación por PCR y a la unión, pero con grupos de cebadores
para asegurar la amplificación de todos o de la mayoría de los
genes de la región V, y con cebadores anidados. Los cebadores
usados para estas reacciones se diseñan para amplificar el
repertorio entero de inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos
contra epítopos proteicos, epítopos de carbohidrato y epítopos
lipídicos.
Para la síntesis de ADNc de regiones V_{H}, se
usa un grupo de cebadores (1A-CH1,
anti-sentido) complementarios al principio de los
dominios CH1 de cada uno de los isotipos de suero de ratón (Figura
5). El grupo consta de siete cebadores 1A-CH1:
1A-CH1-\gammal,
1A-CH1-\gamma2A,
1A-CH1-\gamma2B,
1A-CH1-\gamma3,
1A-CH1-\mu,
1A-CH1-\varepsilon y
1A-CH1-\alpha. Para la síntesis
de ADNc de regiones V_{L}, se usa un grupo de cebadores
(3A-CL, anti-sentido)
complementarios al principio de los dominios C\kappa y C\lambda.
Los cuatro cebadores 3A-CL son:
3A-CL-\kappa,
3A-CL-\lambda1,
3A-CL-\lambda2 y
3A-CL-\lambda3.
Para la primera PCR se usan los mismos grupos de
cebadores (1A-CH1 y 3A-CL) junto con
cebadores de unión. Los cebadores de unión para las regiones V_{H}
(2H, con sentido) son complementarios al principio de la secuencia
V_{H} que incluye parte de la secuencia líder, tienen un sitio de
enzima de restricción XhoI correspondiente a las posiciones de
aminoácidos 5 y 6 de la región V_{H}, y contienen además una cola
de 30 nucleótidos de longitud de secuencia aleatoria. Los nueve
cebadores 2H, basados en los cebadores usados por A.S. Kang et
al. (Methods 2:111-18, 1991) se denominan 2H1 a
2H9. Los cebadores de unión para las regiones V_{L} (4L, con
sentido) son complementarios al comienzo de las secuencias
V\kappa o V\lambda que incluyen parte de la secuencia líder,
tienen un sitio Sac I correspondiente a los aminoácidos 1 y 2 de la
región V_{L}, y contienen además una cola de 30 nucleótidos de
longitud que es el complemento inverso de la cola del cebador 2H.
Los cebadores 4L, que también se basan en los cebadores usados por
A.S. Kang et al. (Methods 2:111-18, 1991)
para V\kappa y en E.A. Kabat et al. (Sequences of
Proteins of Immunological Interest, 5ª edición, National
Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) para V\kappa (sólo hay
dos genes V\kappa en el ratón) son: 4L-V\kappal
a 4L-V\kappa7, 4L-V\lambda1 y
4L-V\lambda2.
Las colas complementarias de los cebadores 2H y
4L se unen a los fragmentos amplificados de la región V_{H} y
V_{L} por PCR de extensión solapante (H.A. Erlich, PCR
Technology: Principles and Applications for DNA Amplification,
W.H. Freeman & Co., NY, NY, 1992). Los sitios XhoI y SacI
introducidos por estos cebadores permiten la clonación posterior de
las secuencias promotoras entre secuencias V_{H} y V_{L}.
Después de lavar las células para retirar los cebadores y cualquier
producto de PCR que pueda haber salido de las células, se prepara
una segunda PCR para amplificar adicionalmente las combinaciones de
región V_{H}-V_{L} unidas usando cebadores
anidados (JH y JL, todos anti-sentido). Estos
cebadores se diseñaron para la posterior clonación de las
combinaciones V_{H}-V_{L} unidas en el vector de
fagémido phh3mu o phh3hu (Figura 3). Los cebadores JH, denominados
JH1-JH4, son complementarios a parte de un gen JH
(hay cuatro genes JH en el ratón), y contienen un sitio de
restricción EcoRI adicional en sus extremos 5'. El otro grupo de
cebadores (JL) son complementarios a parte del gen J\kappa o
J\lambda (hay cuatro genes funcionales J\kappa y tres genes
funcionales J\lambda en el ratón), y contienen un sitio de
restricción HindIII adicional en sus extremos 5'. Estos cebadores
son J\kappa1, J\kappa2, J\kappa4, J\kappa5, J\lambda1,
J\lambda2 y J\lambda3.
El primer y el segundo productos de PCR se
ensayan con respecto a la presencia de fragmentos de ADN por
electroforesis en gel de agarosa. Se espera un fragmento de 0,8 kb
después de la segunda PCR. Esta banda, que contiene las
combinaciones V_{H}-V_{L} amplificadas, se aísla
en gel usando Geneclean II (Bio101; La Jolla, CA).
Las combinaciones V_{H}-V_{L}
aisladas en gel se digieren con EcoRI y HindIII y se unen con la
cadena principal EcoRI-HindIII del vector de
fagémido phh3 (o el vector parecido a phh3hu) para generar una
población de vectores de expresión de fagémido
phh3/VH-VL como se muestra en las Figuras 2D y 10.
La transformación de las bacterias y la generación del banco del
fago se realiza como se ha descrito (C.F. Barbas y R.A. Lerner,
Methods 2:119-24, 1991). Como estos vectores son
fagémidos, se propagan por transformación y crecimiento de E.
coli XLI-Blue en medio de cultivo que contiene
carbenicilina y tetraciclina. Las colonias que contienen los
fagémidos se cultivan en agar por cultivo de una alícuota de
cultivo. Para obtener fagos, las bacterias se superinfectan con
exceso del fago adyuvante VCSM13, después de lo cual, se obtienen
fagémidos empaquetados que infectan E. coli
XLI-Blue.
La mezcla de unión phh3/VH-VL se
utiliza para transformar por electroporación células bacterianas
XLI-Blue SURE competentes, con una eficacia de
transformación de 5 x 10^{9} unidades formadoras de colonias (cfu)
por \mug de ADN (Stratagene; La Jolla, CA), y se extraen
alícuotas del cultivo celular transformado para cultivarlas y
determinar el tamaño del banco y el número de miembros originales.
Un buen banco generalmente tiene al menos 10^{7} cfu. Después de
expandir el resto del cultivo bacteriano, se prepara ADN de fagémido
bicatenario y se digiere con SacI y XhoI. El fragmento grande se
une a un fragmento SacI-XhoI que contiene los
promotores bacterianos de cabeza a cabeza derivados de phh3 para
generar phh3B/VH-VL (Figura 10).
Se obtienen vectores de tipo
phh3B/VH-VL por transformación de células
electrocompetentes SURE con la mezcla de unión. Se cultivan
alícuotas para asegurar una eficacia de transformación de al menos
10^{7} cfu totales. El resto de las bacterias transformadas se
superinfectan con el fago adyuvante VCSM13 a 10^{12} unidades
formadoras de placas (pfu) para producir fagémidos empaquetados que
presentan fragmentos Fab. Esta última etapa amplifica el banco
aumentando la representación de cada miembro original. Las placas se
precipitan en el sobrenadante celular con polietilenglicol y se
resuspenden en PBS. Ésta es el banco original.
Se prepara Fab soluble a partir del banco de
fagémido por digestión con las enzimas de restricción SpeI y NheI
para retirar el segmento de ADN de la proteína de la cubierta gIII,
y volviendo a unir los fragmentos (Figura 10). La digestión con
SpeI y NheI produce extremos cohesivos compatibles que se unen. El
fragmento de ADN que carece de la porción de la proteína de cubierta
gIII se purifica en gel, se autoune y se utiliza para transformar
células electrocompetentes SURE. Las titulaciones del banco se
determinan por el cultivo de alícuotas. Es de esperar que el banco
conste de al menos 10^{7} cfu. Se induce la expresión de Fab en
el cultivo con IPTG (tanto para el promotor de lacZ como para el
promotor de tac) y las células se lisan por tres ciclos de
congelación/descongelación entre -80ºC y 37ºC para producir lisados
que contienen Fab.
Se ensaya la reactividad del banco de
presentación de fagos de Fab con el tumor OC2 y con tejidos de
paciente normal/humano por inmunohistoquímica. Se preparan secciones
de criostato (de 4 micrómetros de espesor) a partir del tumor OC2
usando tanto el tumor derivado de ovario como la metástasis de
ganglio linfático, y a partir de muestras de miometrio, endometrio
e intestino delgado que se habían obtenido a partir del paciente
OC2. Se ensayan preparaciones de citospin fijadas con acetona de
los PBL del paciente y de PBL de otro ser humano como se describe
en Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et
al. editors, John Wiley & Sons, NY, NY, 1992). Se preparan
otras secciones de criostato de tejidos humanos, tales como hígado,
riñón, corazón, pulmón, piel, bazo, esófago y yeyuno, a partir de
muestras quirúrgicas y/o de autopsias realizadas de 6 a 18 horas
después de la muerte. Se realiza una inmunohistoquímica en
preparaciones de criostato y de citospin, con la excepción de que
se usa anti-M13 de oveja seguido de anticuerpos de
burro anti-oveja biotinilados (5 Prime - 3 Prime;
Boulder, CO) como se ha indicado anteriormente, usando
avidina-peroxidasa para detectar las partículas de
fago Fab unidas (M13). Como alternativa, se tratan cortes con Fab
soluble preparado a partir de la biblioteca de presentación de
fagos Fab, seguido de anticuerpo kappa de conejo
anti-ratón biotinilado antes de la adición de
avidina-peroxidasa. En esta fase, los bancos son
reactivos con las células tumorales así como con células
normales.
Cuando se amplifiquen las combinaciones
V_{H}-V_{L} a partir de ratones inmunes a los
tumores OC2, también se representarán anticuerpos no dirigidos
contra las células tumorales o contra cualquier otro tejido humano.
Para eliminar los anticuerpos irrelevantes del banco, así como los
anticuerpos anti-tumorales sobrerrepresentados, el
banco de presentación de fagos de Fab se selecciona con respecto a
la reactividad con células tumorales OC2 aisladas por gradiente de
Percoll. Se usan células tumorales no fijadas intactas para
conservar la integridad de los determinantes antigénicos en las
membranas celulares.
Una alícuota de 100 \mul del banco que contiene
10^{11} cfu se agita con 10^{7} células OC2 lavadas durante 3
horas a temperatura ambiente. Las células se sedimentan por
centrifugación, el sobrenadante se retira y las células se lavan 3
veces con PBS para retirar el fago no unido. El fago unido se eluye
de las células con glicina 0,1 M/HCl pH 2,2 que contiene 1 mg/ml de
BSA. Después de 5 minutos, la suspensión celular se neutraliza con
6 \mul de base Trizma 2 M y se diluye a 1:10 con medio SOC. Este
tratamiento no ocasiona la lisis de células de mamífero. La inmensa
mayoría permanecen intactas durante el procedimiento, pero puede
observarse algún hinchamiento de las células. Las células se
sedimentan por centrifugación y el sobrenadante que contiene el fago
eluido se usa para infectar células E. coli
XLI-Blue. Se retiran alícuotas de los cultivos
celulares transformados, que se cultivarán en placas para determinar
el número de fagémidos empaquetados que se eluyeron de la placa. Los
cultivos se infectan con el fago adyuvante VCSM13 para generar más
fagémidos empaquetados. Éstos se agitan con un número limitante de
células tumorales OC2 - el número limitante predeterminado a partir
de la retitulación de las partículas de fago no unidas. La
amplificación del fago eluido y la unión adicional a números
limitantes de células OC2 seguido de elución, se repiten tres o
cuatro veces para asegurar la especificidad de tumor de la
biblioteca seleccionada. En este banco seleccionado se ensaya la
reactividad con el tumor OC2 y con tejido normal por
inmunohistoquímica. Esto muestra una mayor reactividad, pero con un
modelo similar al observado para el banco original.
El banco seleccionado para el tumor muestra una
fuerte reactividad cruzada con tejido humano normal. La mayor parte
de esta reactividad cruzada podría absorberse por un tejido normal
derivado de cualquier fuente humana, porque la inmensa mayoría de
los antígenos humanos son idénticos cuando se comparan individuos
diferentes (Molecular Biology of the Cell, B. Alberts et
al. editors, Garland Publishing, Inc., NY, NY, 1989). Sin
embargo, los antígenos de histocompatibilidad difieren entre
individuos debido a la existencia de determinantes polimórficos.
Aunque las reactividades contra los determinantes no polimórficos
de antígenos de histocompatibilidad pueden absorberse por tejidos
de cualquier ser humano, es necesario que los tejidos procedentes
del paciente absorban cualquier fago de Fab que reaccione con
determinantes polimórficos de estos antígenos. Los leucocitos de
sangre periférica son especialmente adecuados para este fin porque
expresan colectivamente todos los antígenos de histocompatibilidad,
incluyendo los antígenos del MHC de clase I, que se encuentran en
todas las células nucleadas del cuerpo, y los antígenos del MHC de
clase II, que se encuentran principalmente en células B, monocitos y
células dendríticas.
El banco de presentación de fagos de Fab se
absorbe primero con PBL humanos normales, y después con una mezcla
de preparaciones de tejidos sólidos de origen humano en general y
del paciente OC2 en particular. Por último, el banco se absorbe con
PBL del paciente OC2. Después de cada absorción, el banco se
reamplifica y se ensaya con respecto a la reactividad contra el
tumor OC2 y contra tejidos de humano normal/paciente y PBL por
inmunohistoquímica usando secciones de criostato y preparaciones de
citospin. Las reabsorciones con nuevas preparaciones de los tejidos
sólidos o PBL seguidas de reamplificaciones del banco se continúan
hasta que el banco absorbido reacciona con el tumor OC2 con mucha
más fuerza que con cualquier célula o tejido de humano
normal/paciente ensa-
yado.
yado.
Para la absorción con PBL humanos normales, se
usan células enteras recién preparadas. Una alícuota del banco de
presentación de fagos de Fab seleccionada para el tumor se agita a
temperatura ambiente durante 3 horas con 1 x 10^{8} PBL. El
exceso de células se retira para asegurar que se retira la mayoría
de las partículas de fago reactivas.
Para la absorción con tejidos sólidos, se usan
membranas. Ya se preparó una fracción de membrana a partir de la
muestra de miometrio obtenida de la paciente OC2, y se mantuvo
congelada a -80ºC. Las muestras de endometrio y de intestino
delgado de la paciente OC2, que se habían congelado rápidamente en
nitrógeno líquido y almacenado a -80ºC, se procesaron de la misma
manera para preparar membranas. Además, se obtienen otras muestras
de tejido humano normal a partir de muestras quirúrgicas y de
autopsias, y las fracciones de membrana se preparan y se almacenan
en alícuotas que contienen un 10% de glicerol a -80ºC. Después de
la descongelación, se combinan alícuotas de membrana aproximadamente
iguales de todos los tejidos y se agitan a temperatura ambiente
durante 3 horas con una alícuota del banco de presentación de fagos
de Fab absorbido en PBL humanos. El sobrenadante que contiene el
fago no absorbido se recupera después de la sedimentación de las
membranas a 150.000 x g.
La absorción final del banco de presentación de
fagos de Fab con PBL del paciente OC2 se realiza como se ha descrito
anteriormente para los PBL humanos normales, con la excepción de que
sólo se usan 5 x 10^{6} células por absorción debido a que el
suministro es limitado. Como el banco ya se habrá absorbido con
tejido normal tal como endometrio, miometrio e intestino delgado
derivado del paciente OC2, y el fago de Fab específico de MHC de
clase I/específico de paciente ya se habrá reducido
espectacularmente, la absorción con los PBL del paciente pretende
reducir sólo el fago de Fab con especificidad de paciente y con
especificidad de MHC de clase II.
El banco óptimo (absorbido) se dirige a muchos
epítopos (determinantes antigénicos) diferentes. Aunque las células
tumorales usadas para la inmunización de ratones presentan muchos
epítopos contra el sistema inmune, es probable que algunos sean
inmunodominantes, de tal forma que los anticuerpos contra ellos
estén sobrerrepresentados en el banco original. Por lo tanto, los
anticuerpos contra otros epítopos estarán infrarrepresentados en el
banco original. Aunque esto sería un problema importante en el caso
de un antisuero policlonal convencional, la estrategia del banco de
presentación de fagos de Fab soluciona este problema. La unión del
banco a concentraciones limitantes de células tumorales OC2,
seguido de la reamplificación de las partículas de fago de Fab
unidas, aumenta la representación de los epítopos menos
inmunogénicos. La posterior absorción del banco seleccionado para
el tumor con tejidos normales y PBL reduce espectacularmente la
representación de algunos epítopos en el banco de presentación de
fagos de Fab.
La evaluación del número de epítopos diferentes
dirigidos por el banco absorbido por tejido seleccionado para el
tumor/normal se consigue por clonación de algunos de los miembros
del banco. Se cultivan alícuotas de E. coli
XLI-Blue infectadas con el banco de presentación de
fagos de Fab absorbido y se seleccionan colonias individuales. Se
aíslan los vectores de fagémido bicatenarios y se determina su
secuencia de nucleótidos de la región V. Las secuencias se analizan
por el programa de búsqueda de homología BLAST (S.F. Atltschul et
al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 199) disponibles
en el Molecular Biology Computer Research Resource, para determinar
el subgrupo de región V, el uso del gen D y del gen J. Este
análisis produce una primera medición de la complejidad del banco,
porque indica si los clones analizados procedían de muchos o de muy
pocos clones de células B originales.
Como segunda medida de la complejidad, se
determina la capacidad de los fragmentos Fab de diferentes clones de
competir de forma cruzada por la unión a las células tumorales OC2
por medio de un ELISA, usando placas recubiertas con preparaciones
de membrana OC2 y/o por inmunohistoquímica. Los fragmentos Fab
solubles de diferentes clones compiten con la unión de los
fragmentos Fab unidos al fago de uno de los clones, detectándose la
unión del fago con anticuerpos anti-M13 de oveja
seguidos de anticuerpos de burro anti-oveja
biotinilados y avidina-peroxidasa. Si dos clones no
presentan competición cruzada, se asume que se dirigen a epítopos
diferentes. Basándose en el número de clones con competición
cruzada en una serie dada de clones, y en el número de cfu en el
banco, se estima la complejidad del banco. Este tipo de análisis
sólo proporciona una indicación del número de epítopos o
determinantes antigénicos que se están dirigiendo por el banco. No
describirá cuántos antígenos diferentes se dirigen. Sin embargo,
puede obtenerse una estimación haciendo reaccionar el banco con
componentes celulares separados por electroforesis
bidimensional.
Para determinar cuál de los isótopos de IgG
murinos es el más eficaz en la mediación de las funciones efectoras
para eliminar las células CD4+, se ensayaron anticuerpos quiméricos
con respecto a su capacidad de mediar la citotoxicidad dependiente
del complemento in vitro, la reducción de células in
vivo y la prolongación de la supervivencia de injertos de piel
alogénicos y la supresión de la producción de
alo-anticuerpos. En general, se descubrió que el
isotipo de ratón más eficaz en estos ensayos era IgG_{2a}. Otros
autores también han demostrado que IgG_{2a} es el mejor isotipo
de ratón en funciones efectoras mediadas por Fc. El isotipo humano
IgG_{1}, que probablemente es el isotipo más análogo a la
IgG_{2a} de ratón, ha demostrado ser uno de los dos mejor
isotipos humanos en las funciones efectoras mediadas por Fc (J.L.
Dangl et al., EMBO J. 7:1989:94, 1988).
Se expresan combinaciones de regiones variables
de H y L a partir del banco de fagémido como anticuerpos murinos
IgG_{2a}. Antes de la transferencia de las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas al vector doble IgG_{2a}
murino (Figura 4a), el fragmento de ADN SacI-XhoI
que contiene los promotores bacterianos y las secuencias líder de
cabeza a cabeza en el vector de fagémido phh3B/VH-VL
(Figura 10a) se sustituye con un fragmento de ADN
SacI-XhoI que contiene promotores H y L murinos y
secuencias líder en orientaciones transcripcionales de cabeza a
cabeza para generar phh3M/VH-VL (Figura 10b). Las
combinaciones V_{H}-V_{L} unidas, que incluyen
los promotores de mamífero, se extraen del vector
phh3M/VH-VL por amplificación por PCR usando grupos
de cebadores 3L y 1H (Figura 3).
El grupo de cebadores 1H
(anti-sentido) es complementario al principio del
dominio CH1 de IgG_{\gamma 2b} y a parte de un gen JH (cuatro
cebadores, uno para cada uno de los genes JH murinos). Además, este
conjunto de cebadores contiene un sitio de restricción HindIII y un
sitio de empalme y elimina el sitio EcoRI preexistente del vector
phh3B/VH-VL (Figura 10a). Los cebadores 3L
(anti-sentido) son complementarios al principio del
dominio C\kappa y a parte del gen JL (7 cebadores, para los 4
genes J\kappa funcionales y para 3 genes J\lambda funcionales).
Además, este grupo de cebadores contiene un sitio de restricción
EcoRI y un sitio de empalme y elimina el sitio HindIII preexistente
del vector phh3B/VH-VL (Figura 10a).
Los fragmentos de ADN amplificados por PCR se
aíslan en gel, se digieren con EcoRI e HindIII y se unen con la
cadena principal EcoRI-HindIII del vector doble
IgG_{2a} murino (Figura 4a). La mezcla de unión se utiliza para
transformar células DH101B electrocompetentes con una frecuencia de
transformación mayor de 10^{10} por \mug de ADN (Gibco/BRL;
Grand Island, NY) para generar un banco de expresión de IgG_{2a}
(vector IgG_{2a}/lib). Para conservar la complejidad del banco
durante estas manipulaciones, se usan células bacterianas de alta
eficacia de transformación y células de mamífero de alta eficacia de
transfección.
Después de la linealización por digestión con
enzimas de restricción en el único sitio SalI, el vector
IgG_{2a}/lib se utiliza para transfectar la línea de células de
hibridoma nula Sp2/0Ag14 por electroporación, con la excepción de
que se usan alícuotas de 1 ml que contienen 2 x 10^{7} células
cada una por cubeta. Los transfectantes se recuperan en medio
selectivo que contiene xantina y ácido micofenólico. La frecuencia
de transfección de la línea celular Sp2/0-Ag14 es
de aproximadamente 1 en 10^{4} células, y aproximadamente 50% de
los transfectomas produce cantidades significativas de
inmunoglobulina, como se evalúa por análisis de transferencia de
Western.
Para la transfección del banco, se usan 5 x
10^{8} células Sp2/0-Ag14 y un total de
500-1.000 \mug de ADN de vector del banco
IgG_{2a}, con la expectativa de obtener un banco de
aproximadamente 25.000 clones. Las células transfectadas se
cultivan durante 20 horas, después de lo cual se añade un medio
selectivo que contiene xantina y ácido micofenólico. Se retiran
alícuotas y se cultivan en medio selectivo en agarosa blanda para
titular el banco. El resto se cultiva en frascos cilíndricos de 4
litros en medio selectivo para dejar tiempo para que se mueran
todas excepto las células transfectadas de forma estable y
conseguir una densidad celular de 2 x 10^{6} células/ml.
Se purifican anticuerpos a partir del
sobrenadante de cultivo en Proteína A o Proteína G Sepharose
(Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) y la pureza se ensaya por
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Basándose en la
experiencia previa con estos tipos de transfectantes, es de esperar
que la recuperación sea de 5-10 \mug de IgG por
ml de sobrenadante de cultivo, de forma que se prevé la obtención
de 60 mg de anticuerpos de banco IgG_{2a} a partir de 8 litros de
sobrenadante de cultivo.
Aunque no hay ninguna estimación de la
complejidad del banco de presentación de fagos de Fab absorbida,
tiene que ser menor que 10^{7}, el tamaño del banco de
presentación de fagos de Fab original (no absorbida). Usando un
banco de mamífero 400 veces más pequeña que el banco de
presentación de fagos de Fab original (25.000), es posible que no
se representen todos los miembros únicos del banco de presentación
de fagos de Fab absorbida en el banco IgG_{2a} de ratón. Esto no
es probable porque se elimina un porcentaje muy alto de los
miembros del banco durante la absorción con tejidos de humano
normal/paciente y PBL. Además, el banco de presentación de fagos de
Fab original de 10^{7} miembros contiene múltiples miembros
derivados del mismo clon de células B, reduciéndose de esta manera
su complejidad real. Además, como la transfección estable por
electroporación ocasiona la integración de varias copias del vector
transfectado por célula, es probable que el tamaño de la biblioteca
de mamífero sea mayor de 25.000. Sin embargo, existe una
probabilidad no cero de que los bancos de mamífero sean menos
complejos que el banco de presentación de fagos de Fab de la que
proceden. No obstante, la complejidad de los bancos de mamífero no
puede aumentarse realmente más de la mitad de un orden de magnitud,
antes de que la magnitud del experimento de transfección haga que
esto no sea técnicamente factible.
Debido a las consideraciones anteriores, y lo que
es más importante, como los transfectantes de células de hibridoma
individuales dentro de una población tienden a crecer a diferentes
velocidades, producen diferentes cantidades de inmunoglobulina y,
algunas veces, pierden la producción de inmunoglobulina, las
bibliotecas de IgG de mamífero ya no se propagan por amplificación
de una alícuota de células pequeña. En su lugar, los bancos se
generan de novo a partir del banco de presentación de fagos
de Fab absorbido. La expansión inicial del banco de mamífero para
posibles aplicaciones clínicas futuras tendrá una mayor escala.
Después de la expansión de los bancos de
mamífero, se obtiene una evaluación de su complejidad a partir de la
secuencia de nucleótidos de los genes de la región V expresados. Se
realiza una síntesis de ADNc dentro de las células y la unión de
los genes de la región V de la cadena H y L expresados, seguido de
amplificación por PCR. Las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas después se transfieren a
phh3, determinándose las secuencias de nucleótidos de 30 a 40
clones de fagémido.
La capacidad de anticuerpos con regiones C
murinas de mediar funciones efectoras en un ratón que conducen a la
eliminación de células diana de un tumor humano particular, es
indicativa de la capacidad de esos mismos anticuerpos, si se
proporcionan con regiones C humanas, de mediar funciones efectoras
en un ser humano que conduzcan a la eliminación de células diana de
ese tumor. Por lo tanto, como modelo para ensayar la capacidad del
banco anti-tumoral de eliminar células tumorales
diana in vivo, se usa el ratón desnudo. A ratones BALB/c
desnudos se les inyectan 0,25 ml de piezas de tumor OC2 o 10^{7}
células de tumor OC2, tanto s.c. como i.p. También se usa la
inyección intravenosa de suspensiones de células tumorales cuando
es demostrable el crecimiento del tumor OC2 en cualquier órgano,
por ejemplo, el bazo o el ovario, después de tales inyecciones. A
los ratones se les inyecta simultáneamente o posteriormente el
banco de anticuerpos IgG_{2a}, o una cantidad equivalente de
IgG_{2a} de ratón para el grupo de control. El efecto del
tratamiento con anticuerpos se determina por inspección visual y
táctil para determinar el desarrollo de un tumor subcutáneo. Sus
dimensiones se miden a diversos tiempos después del tratamiento con
anticuerpos en comparación con el grupo de control. Los ratones con
tumor que han recibido inyecciones por vía intraperitoneal se
sacrifican a un tiempo predeterminado desde el examen de los
ratones de control para producir un tumor visible en la cavidad
peritoneal, aproximadamente 3-5 semanas, y se
comprueba el crecimiento tumoral. Después del sacrificio, se
examinan todos los ratones, incluyendo cualquier ratón al que se le
hayan inyectado i.v. suspensiones de células tumorales, para
determinar la metástasis y la necrosis tumoral.
El crecimiento de los tumores subcutáneos puede
ser más difícil de inhibir que el crecimiento de los tumores
intraperitoneales o los tumores en otros sitios, porque estos
últimos pueden ser más accesibles a los anticuerpos y a las células
efectoras. Se ensayan tanto tumores s.c. como i.p. porque si los
tumores s.c. son más difíciles de inhibir, su inhibición constituye
una medida añadida de la potencia del banco de anticuerpos.
Se administran 100 \mug de banco de anticuerpos
anti-tumorales IgG_{2a} por inyección i.p. 3 días
después de la inyección de las piezas tumorales. Para optimizar el
proceso, dependiendo de los resultados, se inyecta anticuerpo a un
tiempo posterior o anterior. De nuevo, dependiendo de los
resultados, se administran diferentes dosis de banco de anticuerpo
IgG_{2a}, mayor o inferior a 100 \mug por ratón, con
inyecciones repetidas y con una vía de inyección i.v. También
pueden administrarse diferentes dosis de piezas tumorales y de
células tumorales OC2. Al principio, sólo se usan dos ratones para
cada protocolo experimental y tres ratones para el control
(IgG_{2a} de ratón no específica). Después, si es eficaz, los
protocolos se ensayan en un grupo de 5 ratones con 5 ratones en el
grupo de control.
Una porción de la preparación de fragmentos de
ADN EcoRI-HindIII que contiene las combinaciones
V_{H}-V_{L} unidas, incluyendo los promotores de
mamífero y los sitios de empalme, se une a la cadena principal
EcoRI-HindIII del vector doble IgG_{1} quimérico
(Figura 4b) y se utiliza para transformar células
electrocompetentes DH101B para generar un banco de expresión de
IgG_{1} quimérica de ratón/humana. La capacidad del banco de
IgG_{1} quimérica de ratón/humana para afectar al crecimiento del
tumor OC2 se ensaya tanto en ratones desnudos como en ratones SCID,
sin y con reconstitución del ratón SCID con PBL humanos. Se ha
demostrado que las regiones Fc humanas se unen a receptores Fc
murinos y, por lo tanto, es posible que el banco de IgG_{1}
quimérica inhiba el crecimiento del tumor OC2. Se ensayan tanto
tumores subcutáneos como tumores intraperitoneales.
La capacidad del banco de anticuerpos IgG_{1}
quiméricos de inhibir el crecimiento del tumor OC2 en ratones
HU-PBL-SCID se ensaya para
determinar si las células efectoras humanas confieren una ventaja
añadida. Para generar ratones
HU-PBL-SCID, a ratones SCID se les
transplantan por vía intraperitoneal 2-5 x 10^{7}
PBL adultos separados de sangre entera por centrifugación con
gradiente de densidad de Ficoll-Paque al mismo
tiempo que se realiza la primera inyección del banco de anticuerpos
quiméricos IgG_{1}. La mayoría de los PBL humanos permanecen en
la cavidad peritoneal y aparecen en el bazo y en la sangre (como
1-10% de las células totales después de la lisis de
glóbulos rojos) sólo de 3 a 6 semanas después de la reconstitución
y, por lo tanto, el ensayo sólo es para la inhibición del
crecimiento de tumores intraperitoneales. Las complicaciones
debidas a la aparición de linfomas inducidos por el virus de
Epstein-Barr (EBV) en ratones reconstituidos con PBL
de algunos donantes seropositivos para EBV se eliminan al terminar
las muestras y/o tumores EBV positivos. El tiempo de aparición de
estos linfomas varía entre 6 y 20 semanas después de la
reconstitución, pero es reproducible para un donante
EBV-seropositivo dado. Los PBL de algunos donantes
EBV positivos nunca producen linfomas. Se preensayan los PBL de
algunos donantes y sólo se usan los donantes cuyos PBL no conducen
a un desarrollo prematuro de linfomas en los ratones
reconstituidos. Además, en los experimentos se incluye un grupo de
control al que no se le ha inyectado el tumor OC2. La estrategia
para las dosis de anticuerpo, y el orden y programa de inyección
del banco de anticuerpos y del tumor OC2, es como se ha descrito
para el banco de IgG_{2a} de ratón.
Otras realizaciones y usos de la invención serán
evidentes para los especialistas en la técnica tras la
consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la
invención descrita en este documento.
Claims (18)
1. Un método para generar un banco de vectores de
expresión que comprenden una diversidad de pares de elementos
genéticos que codifican regiones variables de proteínas receptoras
específicas a una diana particular, comprendiendo dicho método las
etapas de:
- a)
- obtener una diversidad de segmentos de ácido nucleico que comprenden pares de elementos genéticos que codifican regiones variables de proteínas receptoras,
- b)
- insertar dicha diversidad de segmentos en un primer vector, adecuado para rastrear regiones variables codificadas por dichos insertos, y obtener un primer banco,
- c)
- preparar, mediante rastreo de dicho primer banco, un sub-banco de vectores que comprenden una diversidad de segmentos de ácido nucleico, en que cada segmento codifica un par de regiones variables de una proteína receptora específica a una diana particular,
- d)
- transferir en masa los segmentos desde dicho sub-banco a un segundo vector capaz de mediar en la expresión de dichas regiones variables de la proteína receptora, en donde en masa implica hacer reaccionar, en la misma reacción, todos los segmentos con moléculas de un segundo vector, dando como resultado la formación de un banco de vectores de expresión capaces de codificar una diversidad de proteínas receptoras o fragmentos de las mismas, que comprenden pares de regiones variables específicas a una diana particular, en donde la diversidad de dichos pares de regiones variables se reduce en menos del 50% en comparación con el sub-banco.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha diversidad se reduce en menos del 10%.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que dicha diversidad se reduce en menos del 1%.
4. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que los segmentos de ácido nucleico
comprendidos en el banco de primeros vectores contienen al menos
una cassette que contiene al menos un elemento promotor adecuado
para controlar la expresión a partir del primer vector.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4,
en el que una o más cassettes que contienen el elemento promotor,
adecuadas para controlar la expresión a partir del primer vector,
es/son reemplazadas por una o más cassettes, adecuadas para
controlar la expresión a partir del segundo vector.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que dicha o dichas cassettes que contienen el elemento
promotor, adecuadas para controlar la expresión a partir del primer
vector, es/son reemplazadas antes de la transferencia en masa.
7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que dicha o dichas cassettes que contienen el elemento
promotor, adecuadas para controlar la expresión a partir del primer
vector, es/son reemplazadas antes de la transferencia en masa al
segundo vector.
8. Un método de acuerdo con una de las
reivindicaciones 5 a 7, en el que la o las cassettes que contienen
el elemento promotor, adecuadas para controlar la expresión a
partir del primer vector, comprenden elementos promotores
bacterianos y la o las cassettes, adecuadas para controlar la
expresión a partir del segundo vector, que reemplazan a la o las
primeras cassettes, comprenden elementos promotores de
mamíferos.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que el segmento de ácido nucleico
está compuesto por dos fragmentos de ácido nucleico independientes,
cada uno de los cuales codifica una región variable, que están
enlazados en orientaciones transcripcionales opuestas y
divergentes.
10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que una cassette que contiene el elemento promotor, que
comprende dos promotores en orientaciones opuestas y divergentes, se
introduce entre dichos fragmentos de ácido nucleico.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el segundo vector codifica
regiones constantes de la proteína receptora.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación
11, en el que las regiones constantes se seleccionan de clases de
inmunoglobulina humana IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD
o IgE.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que todas las regiones constantes procedentes de una de
las clases de inmunoglobulinas están presentes en el vector de
expresión que codifica un anticuerpo de longitud completa.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que la diversidad de regiones
variables de proteínas receptoras se seleccionan del grupo que
consiste en anticuerpos, receptores de células T, receptores de
células B, receptores de células citotóxicas naturales, receptores
de macrófagos y sus combinaciones.
15. Un método in vitro para producir una
composición que comprende proteínas receptoras policlonales
recombinantes o fragmentos de las mismas, con especificidad a una
diana deseada, donde cada proteína receptora contiene un par de
regiones variables, comprendiendo dicho método las etapas de:
- (a)
- obtener un banco de vectores de expresión de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes,
- (b)
- transferir dicho banco de vectores de expresión en un hospedador, siendo dicho hospedador adecuado para la expresión de dichas proteínas receptoras,
- (c)
- cultivar dicho hospedador en condiciones adecuadas, y
- (d)
- obtener dicha composición que comprende proteínas receptoras policlonales.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que el hospedador adecuado para la expresión de dichas
proteínas receptoras es eucariótico.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación 15
ó 16, en el que las proteínas receptoras policlonales recombinantes
expresadas o fragmentos de las mismas comprenden regiones V_{H} o
V_{L} de anticuerpo.
18. Un método de acuerdo con la reivindicación
17, en el que las proteínas receptoras policlonales recombinantes
son anticuerpos de longitud completa.
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