CN102851338A - 利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法。实验证明，在序列表序列4所示的ScFv-Fc蛋白上引入三个突变位点K435D/K452D/D442K时，与同一宿主细胞中同时表达Fc蛋白后，经非还原条件下SDS-PAGE电泳检测，蛋白是以ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc同二聚体蛋白混合物的形式存在。本发明所提供的方法可在增加同二聚体含量的同时降低其他不需要的产物如异源二聚体的含量。同二聚体蛋白混合物可以同时作用于同一靶标的不同表位，也可以通过不同形式的抗体结合不同来源的抗体同时抑制多个抗原的作用等，为肿瘤的免疫诊断及免疫治疗方面提供新的方法和途径。

Description

利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法
技术领域
本发明涉及一种利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法。
背景技术
单克隆抗体药物在近十五年内增长迅速，成为制药行业的成长点。自1996年起，一共有30个左右单抗药物被批准上市。其中有九个单抗药物年销售超过十亿美元。2010年单抗药物总销售超过300亿美元，并且年增长率超过10％。由于单克隆抗体的靶标特异性强，只能抑制单一靶点。而在肿瘤、自体免疫等多种疾病中，需要抑制多重信号通路来避免代偿效应。对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率，往往需要抑制多抗原位点来防止逃逸。因此，有以下几种备选方案可以解决此类问题。一种备选方案是使用多克隆抗体，或通过改造抗体Fc段获得异二聚体如双特异抗体。还有一种方案是使用抗体混合物来治疗，抗体混合物可包含两种或更多种针对同一靶物上不同表位的抗体，或针对不同靶物的抗体的混合物。
US7262028记载了一种通过表达一种轻链和不同重链从单一宿主细胞克隆生成二价抗体或者二价抗体混合物的方法。US7262028中披露的发明提供了一种用于生成抗体组合的方法，可以对该抗体组合筛选在多种应用中的有用性。
WO/2010/084197则描述了一种从单一宿主细胞克隆生产包含两种或者更多种不同抗体混合物的方法。其中一个实施方案中，为不同单价抗体的混合物。另外一种实施方案中，则为单价和二价抗体的混合物。
US5789208和US6335163曾描述过一种表达多克隆抗体文库的方法，用噬菌体展示载体表达抗体Fab片段的多克隆文库，然后选择对抗原的反应性。所选择的重链和轻链可变区基因组合被以链接配对的方式大量转移至提供恒定区基因的真核表达载体，以获得完整多克隆抗体的子文库。这一子文库转染入骨髓瘤细胞后，稳定克隆便可以产生能被混合以获得单克隆抗体混合物的多克隆抗体。尽管使用这一方法通过培养转染细胞的混合群在理论上有可能直接从一个重组生产过程中获得多克隆抗体，但在混合细胞群的稳定性以及因此带来的所产生的多克隆抗体的一致性方面可能存在潜在的问题。在药学上可接受的大规模(工业)的方法中对整群不同细胞进行控制是一项艰巨的任务。例如，细胞生长速率和抗体产生速率等特性对非克隆群中所有单个克隆来说应保持稳定，才能使多克隆抗体混合物中的抗体比率多少保持恒定。因此，尽管在本领域可能已经认识到混合抗体的需求，但还不存在可接受的解决方案以用药学可接受的方式经济地制造抗体混合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或多种同二聚体蛋白或抗体混合物的方法，包括在所述宿主细胞中表达至少两种编码具有不同CH3区的多肽的核酸构建体；所述具有不同CH3区的多肽之间不含有形成二硫键或共价或稳定非共价多肽链间键的氨基酸残基；具有相同CH3区的所述多肽通过稳定非共价多肽链间键形成所述同二聚体蛋白或抗体；所述稳定非共价多肽链间键包括离子键。
在上述方法中，所述多肽的CH3区均来源于人免疫球蛋白Fc段的CH3区，且其中最多有一种所述多肽的CH3区未经改造，其余所述多肽的CH3区均经过改造。
在上述方法中，所述改造按照包括如下步骤的方法进行：
1)获得所述人免疫球蛋白Fc段CH3区第一链和/或第二链的界面氨基酸；
2)从步骤1)获得的所述界面氨基酸中选择正负电荷配对的带电氨基酸；
3)从步骤2)获得的所述正负电荷配对的带电氨基酸中任选一对、两对、三对或三对以上，将具有同一种CH3区的所述多肽上所选中的所述正负电荷配对的带电氨基酸替换为带相反电荷的带电氨基酸；所述带电氨基酸为Lys(K)、Arg(R)、Asp(D)或Glu(E)。
在上述方法中，所述人免疫球蛋白的类型为IgG1。
在上述方法中，所述人免疫球蛋白Fc段的CH3区的所述正负电荷配对的带电氨基酸为如下a)-h)的8对氨基酸：
a)第一链的第356位Glu(E)与第二链的第439位Lys(K)；
b)第一链的第357位Glu(E)与第二链的第370位Lys(K)；
c)第一链的第370位Lys(K)与第二链的第357位Glu(E)；
d)第一链的第392位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
e)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第392位Lys(K)；
f)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第409位Lys(K)；
g)第一链的第409位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
h)第一链的第439位Lys(K)与第二链的第356位Glu(E)；
上述8对氨基酸的位置是根据抗体Fc的KABAT编号所命名的。
在上述方法中，所述人免疫球蛋白Fc段的CH3区的所述正负电荷配对的带电氨基酸在序列表序列2中的位置为如下a1)-h1)的8对氨基酸：
a1)第一链的第161位Asp(D)与第二链的第244位Lys(K)；
b1)第一链的第162位Asp(D)与第二链的第175位Lys(K)；
c1)第一链的第175位Lys(K)与第二链的第163位Glu(E)；
d1)第一链的第197位Lys(K)与第二链的第204位Asp(D)；
e1)第一链的第204位Asp(D)与第二链的第197位Lys（K)；
f1)第一链的第204位Asp(D)与第二链的第214位Lys(K)；
g1)第一链的第214位Lys(K)与第二链的第204位Asp(D)；
h1)第一链的第244位Lys(K)与第二链的第161位Glu(E)。
在上述方法中，所述人免疫球蛋白Fc段的CH3区的所述正负电荷配对的带电氨基酸在序列表序列4中的位置为如下a2)-h2)的8对氨基酸：
a2)第一链的第482位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
b2)第一链的第413位Lys(K)与第二链的第400位Asp(D)；
c2)第一链的第400位Glu(E)与第二链的第413位Lys(K)；
d2)第一链的第442位Asp(D)与第二链的第435位Lys(K)；
e2)第一链的第435位Lys(K)与第二链的第442位Asp(D)；
f2)第一链的第452位Lys(K)与第二链的第442位Asp(D)；
g2)第一链的第442位Asp(D)与第二链的第452位Lys(K)；
h2)第一链的第399位Glu(E)与第二链的第482位Lys(K)。
在上述方法中，所述具有不同CH3区的多肽具体可为序列表序列2所示的多肽和序列表序列4中的第435位Lys(K)替换为Asp(D)、第452位Lys(K)替换为Asp(D)和第442位Asp(D)替换为Lys(K)的多肽。
本发明保护利用上述任一所述方法获得的同二聚体蛋白或抗体混合物。
所述的同二聚体FC包括人免疫球蛋白FC。
同二聚体蛋白分子可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。例如，当同二聚体蛋白包含了FC，蛋白则可以用蛋白A来纯化。纯化方法包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法。本发明的同二聚体混合物的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。
所述的同二聚体蛋白包括FC，优选人免疫球蛋白FC。在一般情况下，人免疫球蛋白FC区域的CH3区域多肽来源于野生型的人免疫球蛋白FC区域。野生型的人免疫球蛋白FC指发生在人群中的氨基酸序列，当然FC序列在个体中会有一些细微的差异。本发明中人免疫球蛋白FC也包括对于野生型人免疫球蛋白FC序列的氨基酸个别的改变，比如，FC区域局部某些氨基酸的改变，如包括某些在糖基化位点突变的氨基酸，或者其他无义的突变；
术语“人免疫球蛋白FC”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白FC区可包括重链CH1、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-1和IgA-2。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白FC区在本领域技术人员所掌握的范围之内。
在具体实施方式中，本发明所用的人免疫球蛋白FC包括至少一个免疫球蛋白绞链区，一个CH2结构域和一个CH3结构域，具体为人IgG1 FC(图1)。
本发明涉及的宿主细胞为人上皮细胞系如293H，也可为中国仓鼠卵巢细胞系(DHO)、骨髓瘤细胞、酵母细胞或原核细胞如E.Coli。
本发明所述的用于生成同二聚体蛋白混合物的抗体原型，不仅仅是双特异性抗体，也可以是双特异性多肽抗体，双特异性多肽等(见图2)。
本发明还涉及按照上述方法突变产生的同二聚体蛋白混合物，以及组成同二聚体抗体FC的单独的多肽。
本发明还进一步涉及编码这些多肽的核酸序列。
本发明更进一步涉及包含突变产生的组成同二聚体FC抗体混合物的单独的多肽的药物组合物。
安验证明，在序列表序列4所示的ScFv-Fc蛋白上引入三个突变位点K435D/K452D/D442K时，与同一宿主细胞中同时表达Fc蛋白后，经非还原条件下SDS-PAGE电泳检测，蛋白是以ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc同二聚体蛋白混合物的形式存在。本发明所提供的方法可在增加同二聚体含量的同时降低其他不需要的产物如异源二聚体的含量。同二聚体蛋白混合物可以同时作用于同一靶标的不同表位，也可以通过不同形式的抗体结合不同来源的抗体同时抑制多个抗原的作用等，为肿瘤的免疫诊断及免疫治疗方面提供新的方法和途径。
附图说明
图1.IgG1抗体结构及不同区域示意图。
图2.包含FC单链的不同异二聚体蛋白组合现象。
图3为重组载体pcDNA3.1-SP-Fc的结构示意图。
图4为重组载体pcDNA3.1-ScFv-Fc的结构示意图。
图5为电泳检测同二聚体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体((ScFv-Fc/Fc)的结果。其中，泳道M为分子量标准(最上面的3个片段从上到下依次为104KD、78KD、50KD)，泳道WT为表5中的组合1(未经突变)，泳道1-5分别为表5中组合2-6。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、抗体Fc段上CH3区域突变氨基酸的选择
1、序列及结构获得
从蛋白质数据库(PDB，www.pdb.org)中共获得48个包含Fc区域的人IgG1抗体晶体结构，通过结构相似性搜索算法(参考文献：Yuzhen Ye and Adam Godzik.FATCAT：a web server for flexible structure comparison and structure similaritysearching.Nucleic Acids Res.，2004，32(Web Server issue)：W582-585.)，得出这48个抗体的Fc段的来自1DN2(PDB编号)。
2、界面氨基酸获取
用蛋白质接触氨基酸识别软件CMA(网址为：http://ligin.weizmann.ac.il/cma/)，根据氨基酸作用的距离筛选并识别抗体(PDB编号：1DN2)中CH3-CH3之间的氨基酸接触。根据氨基酸接触规则，界面氨基酸指侧链重原子与另外一条链的任何一个氨基酸的重原子之间的距离小于一个阈值的一些氨基酸。本实施例的阈值选择为也可以选择(如文献：B.Erman，I.Bahar andR.L.Jernigan.Equilibrium states of rigid bodies with multiple interactionsites.Application to protein helices.J.Chem.Phys.1997，107：2046-2059.)。表1为通过氨基酸接触筛选(即氨基酸距离小于
Figure BSA00000754104300053
)的抗体1DN2的34个界面氨基酸，其中，链A和链B分别代表抗体1DN2的第一链和第二链。以下氨基酸位置是根据抗体Fc的KABAT编号所命名的。
表1.抗体1DN2的CH3-CH3界面氨基酸列表
 链A中的接触氨基酸   链B中的接触氨基酸
  Gln347A   Lys360B
  Val348A   Glu356B
  Tyr349A   Ser354B，Glu356B，Glu357B，Lys360B
  Thr350A   Ser354B，Glu356B
  Leu351A   Leu351B，Pro352B，Pro353B，Ser354B，Thr366B
  Pro352A   Leu351B，Pro352B
  Pro353A   Leu351B
  Ser354A   Tyr349B，Thr350B，Leu351B
 Glu356A   Val348B，Tyr349B，Thr350B，Lys439B
  Glu357A   Tyr349B，Leu368B，Lys370B
  Lys360A   Gln347B，Tyr349B，Lys370B
  Gln362A   Lys370B
  Val363A   Lys370B
  Ser364A   Leu368B，Lys370B，Tyr407B
  Leu365A   Tyr407B
  Thr366A   Leu351B，Leu368B，Tyr407B
  Leu368A   Glu357B，Ser364B，Thr366B，Lys409B
  Lys370A   Glu357B，Lys360B，Gln362B，Ser364B，Lys409B，Thr411B
  Asn390A   Ser400B
  Lys392A   Val397B，Leu398B，Asp399B，Ser400B，Phe405B
  Thr393A   Val397B
  Thr394A   Thr394B，Val397B，Phe405B，Tyr407B
  Pro395A   Pro395B，Val 397B
  Val397A   Lys392B，Thr393B，Thr394B，Pro395B
  Leu398A   Lys392B
  Asp399A   Lys392B，Lys409B，Thr411B
  Ser400A   Asn390B，Lys392B
  Phe405A   Lys392B，Thr394B，Tyr407B，Lys409B
  Leu406A   Thr394B
  Tyr407A   Thr366B，Thr394B，Phe405B，Tyr407B，Lys409B
  Ser408A   Tyr407B
  Lys409A   Leu368B，Lys370B，Asp399B，Phe405B，Tyr407B
  Thr411A   Lys370B，Asp399B
  Lys439A   Glu356B
3、寻找电荷氨基酸配对
在表1所列出的CH3-CH3界面氨基酸的基础上，根据氨基酸的电性，寻找电荷氨基酸配对，配对结果见表2，共有8对电荷氨基酸配对。
表2、抗体1DN2的电荷氨基酸配对
 链A中的接触氨基酸  链B中的接触氨基酸
  Glu356A   Lys439B
  Glu357A   Lys370B
  Lys370A   Glu357B
  Lys392A   Asp399B
  Asp399A   Lys392B
  Asp399A   Lys409B
  Lys409A   Asp399B
  Lys439A   Glu356B
4、突变电荷氨基酸
根据表2的结果，由于抗体1DN2的Fc两链为对称的两链，突变任一链的配对氨基酸在同一链上相同位置的氨基酸为相反电荷氨基酸，如配对氨基酸Glu356A-Lys439B，突变的两种类型为：
1)将Glu356A突变为Lys356A或Arg356A，和/或将Lys439A突变为Glu439A或Asp439A；
2)将Glu356B突变为Lys356B或Arg356B，和/或将Lys439B突变为Glu439B或Asp439B。
其中，相反电荷是指将正电氨基酸(赖氨酸(Lys，K)或精氨酸(Arg，R))突变为负电氨基酸(天冬氨酸(Asp，D)或谷氨酸(Glu，E))或者将负电氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸)突变为正电氨基酸(赖氨酸或精氨酸)。详细突变位置如表3和表4所示。
表3.A链中的突变氨基酸
 链A中的氨基酸   突变的氨基酸电性  链A中的氨基酸   突变的氨基酸电性
  Glu356A   +   Lys439A
  Glu357A   +   Lys370A
  Lys392A   Asp399A   +
  Asp399A   +   Lys409A
注：+代表正电荷，-代表负电荷。
表4.B链中的突变氨基酸
 链B中的氨基酸   突变的氨基酸电性  链B中的氨基酸   突变的氨基酸电性
  Glu356B   +   Lys439B
  Glu357B   +   Lys370B
  Lys392B   Asp399B   +
  Asp399B   +   Lys409B
注：+代表正电荷，-代表负电荷。
此外，在更为复杂的情况下，可以根据本发明的方法，也可以是根据上述描述的配对氨基酸的不同突变种类的组合。根据本发明方案对制备FC混合物的FC进行改造，并制备抗体混合物的方法，并不局限于上文所述的单链双点配对氨基酸突变或者各种突变的组合。
实施例2、改造抗体Fc段上CH3区域的氨基酸获得同二聚体蛋白混合物
1、构建表达人IgG1的Fc片段的重组载体pcMVβ-SP-Fc
根据基因库中搜索到的人IgG1的Fc片段(hing-CH2-CH3)基因序列，人工合成获得序列表序列1所示的两端含有Hind III和EcoRI的识别序列及保护碱基的人的Fc基因(全长780bp，名称为SP-Fc)，用EcoRI和Hind III双酶切，与经EcoR I和HindIII双酶切的哺乳动物细胞表达载体pcMVβ(Invitrogen)的载体骨架连接，获得重组载体pcMVβ-SP-Fc(其结构示意图如图5所示)，并经测序证实该重组载体pcMVβ-Fc为载体pcMVβ的EcoR I和Hind III位点间插入了序列表序列1中第16位至第771位核苷酸序列所示的DNA片段。
序列表序列1中第16位至第771位核苷酸序列编码的Fc蛋白氨基酸序列如下(如序列表序列2所示)：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLysKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
2、构建表达ScFv-Fc融合蛋白的重组载体pcDNA3.1-ScFv-Fc
人工合成获得序列表序列3所示的两端含有Hind III和EcoR I的识别序列及保护碱基的ScFv-Fc融合蛋白编码基因，用EcoRI和Hind III双酶切，与经EcoRI和HindIII双酶切的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-zeo(Invitrogen)的载体骨架连接，获得重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc(其结构示意图如图4所示)，并经测序证实该重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc为载体pcDNA3.1-zeo的EcoRI和Hind III位点间插入了序列表序列3中第16位至第1488位核苷酸序列所示的DNA片段。
序列表序列3中第16位至第1488位核苷酸序列编码的ScFv-Fc融合蛋白氨基酸序列如下(如序列表序列4所示)：
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCIASGFTFSSYPMTWVRQAPGKGLEWVASISYDGSYKYKADSMKGRLTISRDNSKNTLYLEMNSLTAEDTAVYYCARTAFFNAYDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNEWFRTSGQGTKVEIKRDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLysKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
序列表序列2和序列表序列4中划线部分的氨基酸序列相同。
3、选择氨基酸的突变位点获得改造的重组载体
从实施例1的表3和表4中选择在本实施例中融合蛋白ScFv-Fc的相应氨基酸突变位点(如表5中的突变组合2-6所示)，利用重叠PCR法对编码突变氨基酸的序列表序列3中的核苷酸进行突变，分别获得5种经过改造的重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc；SP-Fc蛋白的氨基酸不进行任何突变，载体为未经改造的pcMVβ-SP-Fc。
表5.突变体的具体突变位点及其位置
  突变组合  ScFv-Fc蛋白上的突  突变氨基酸在序列表序列4中的位置   Fc蛋白
  变氨基酸
  1   WT   WT
  2   D356K/K439E   D399K/K482E   NA
  3   E357K/K370E   E400K/K413E   NA
  4   K392D/D399K   K435D/D442K   NA
  5   K409D/D399K   K452D/D442K   NA
  6   K392D/K409D/D399K   K435D/K452D/D442K   NA
注：WT表示未进行突变的野生型，NA表示在配对氨基酸位点未进行任何突变，“/”表示“和”的关系，“D356K”中356表示突变氨基酸的位置，356前的字母D表示突变前的氨基酸为D，356后的字母K表示突变后的氨基酸为K，其它同理。
4、转染细胞及抗体混合物的检测
将步骤3的6种突变组合相应的表达载体分别转染至悬浮培养的293H细胞(ATCCCRL-1573)，培养3-4天后，收集细胞上清。与proteinA琼脂糖树脂进行免疫沉淀反应，通过非还原条件下SDS-PAGE电泳检测同二聚体蛋白或抗体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体蛋白或抗体((ScFv-Fc/Fc)的组成情况，电泳检测结果如图5所示，当在ScFv-Fc上引入D356K/K439E或E375K/K370E或K392D/D399K或K409D/D399K突变位点后，ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc同二聚体的比例有大幅度的上升，而异二聚体(ScFv-Fc/Fc)比例则大幅度下降；当在ScFv-Fc上引入三个突变位点K392D/K409D/D399K时候，表达后蛋白是以ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc同二聚体的形式存在，进一步证明电荷排斥作用对于增强同二聚体和抑制异二聚体的形成至关重要。
蛋白或抗体混合物组成的检测原理：融合蛋白ScFv-Fc比Fc具有更大的分子量，那么在ScFv-Fc和Fc混合过程中，同二聚体(ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc)和异二聚体(ScFv-Fc/Fc)在SDS-PAGE则具有不同的条带位置，通过这个原理就可以检测同二聚体与异二聚体的比例情况，ScFv-Fc和Fc的表达载体共转染，最终会同时出现同二聚体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体(ScFv-Fc/Fc)，在野生型的情况下是ScFv-Fc/ScFv-Fc、ScFv-Fc/Fc和Fc/Fc的理论值比例接近1∶2∶1。
Figure ISA00000754104500011
Figure ISA00000754104500021
Figure ISA00000754104500031
Figure ISA00000754104500041
Figure ISA00000754104500051
Figure ISA00000754104500061
Figure ISA00000754104500071
Figure ISA00000754104500081
Figure ISA00000754104500091

Claims (7)

1.一种用于在单一重组宿主细胞中生成包含两种或多种同二聚体蛋白或抗体混合物的方法，包括在所述宿主细胞中表达至少两种编码具有不同CH3区的多肽的核酸构建体，所述具有不同CH3区的多肽之间不含有形成二硫键或共价或稳定非共价多肽链间键的氨基酸残基；具有相同CH3区的所述多肽通过稳定非共价多肽链间键形成所述同二聚体蛋白；所述稳定非共价多肽链间键包括离子键。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多肽的CH3区均来源于人免疫球蛋白Fc段的CH3区，且其中最多有一种所述多肽的CH3区未经改造，其余所述多肽的CH3区均经过改造。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述改造按照包括如下步骤的方法进行：
1)获得所述人免疫球蛋白Fc段CH3区第一链和第二链的界面氨基酸；
2)从步骤1)获得的所述界面氨基酸中选择正负电荷配对的带电氨基酸；
3)从步骤2)获得的所述正负电荷配对的带电氨基酸中任选一对、两对、三对或三对以上，将具有同一种CH3区的所述多肽上所选中的所述正负电荷配对的带电氨基酸替换为带相反电荷的带电氨基酸；所述带电氨基酸为Lys(K)、Arg(R)、Asp(D)和Glu(E)。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述人免疫球蛋白的类型为IgG1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述人免疫球蛋白Fc段的CH3区的所述正负电荷配对的带电氨基酸为如下a)-h)的8对氨基酸：
a)第一链的第356位Glu(E)与第二链的第439位Lys(K)；
b)第一链的第357位Glu(E)与第二链的第370位Lys(K)；
c)第一链的第370位Lys(K)与第二链的第357位Glu(E)；
d)第一链的第392位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
e)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第392位Lys(K)；
f)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第409位Lys(K)；
g)第一链的第409位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
h)第一链的第439位Lys(K)与第二链的第356位Glu(E)；
上述8对氨基酸的位置是根据抗体Fc的保守位置编号所命名的。
6.根据权利要求4或5述的方法，其特征在于：所述具有不同CH3区的多肽为序列表序列2所示的多肽和序列表序列4中的第435位Lys(K)替换为Asp(D)、第452位Lys(K)替换为Asp(D)和第442位Asp(D)替换为Lys(K)的多肽。
7.利要求1-6任一所述方法获得的同二聚体蛋白或抗体混合物。
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