CN103388013B - 利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法，所述方法包括将部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸的步骤，使得不同种蛋白或抗体之间由于相同电荷的排斥作用而不容易形成异二聚体，而同种蛋白或抗体之间由于相反电荷的吸引作用而更容易形成同二聚体。根据本发明方法获得的同二聚体蛋白混合物可以同时作用于同一靶标的不同表位，也可以通过结合不同来源的抗原同时抑制多个抗原的作用，为肿瘤等多种疾病的免疫诊断及治疗提供了新的方法和途径。

Description

利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法
技术领域
本发明涉及制备同二聚体蛋白混合物的方法，具体涉及利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法。本发明还涉及利用所述方法制备得到的同二聚体蛋白混合物，以及所述方法制备同二聚体蛋白混合物的用途。
背景技术
单克隆抗体药物在近十五年内增长迅速，成为制药行业的成长点。自1996年起，一共有30个左右单抗药物被批准上市。其中有九个单抗药物年销售超过十亿美元。2010年单抗药物总销售超过300亿美元，并且年增长率超过10%。由于单克隆抗体的靶标特异性强，只能抑制单一靶点。而在肿瘤、自体免疫等多种疾病中，需要抑制多重信号通路来避免代偿效应。对于病毒感染疾病，由于病毒的高突变率，往往需要抑制多抗原位点来防止逃逸。因此，有以下几种备选方案可以解决此类问题。一种备选方案是使用多克隆抗体，或通过改造抗体Fc段获得异二聚体如双特异抗体。还有一种方案是使用抗体混合物来治疗，抗体混合物可包含两种或更多种针对同一靶物上不同表位的抗体，或针对不同靶物的抗体的混合物。
US7262028记载了一种通过表达一种轻链和不同重链从单一宿主细胞克隆生成二价抗体或者二价抗体混合物的方法，并提供了一种用于生成抗体组合的方法，可以对该抗体组合筛选在多种应用中的有用性。
WO/2010/084197则描述了一种从单一宿主细胞克隆生产包含两种或者更多种不同抗体混合物的方法。其中一个实施方案中，为不同单价抗体的混合物。另外一种实施方案中，则为单价和二价抗体的混合物，该方法通过IgG4天然的Fab两臂之间交换的现象，最终改变引起该现象的铰链区和CH3的部分氨基酸，稳定了同二聚体，但是该专利没有提及是否完全解决了异二聚体存在的问题。
US5789208和US6335163曾描述过一种表达多克隆抗体文库的方法，用噬菌体展示载体表达抗体Fab片段的多克隆文库，然后选择对抗原的反应性。所选择的重链和轻链可变区基因组合被以链接配对的方式大量转移至提供恒定区基因的真核表达载体，以获得完整多克隆抗体的子文库。这一子文库转染入骨髓瘤细胞后，稳定克隆便可以产生能被混合以获得单克隆抗体混合物的多克隆抗体。尽管使用这一方法通过培养转染细胞的混合群在理论上有可能直接从一个重组生产过程中获得多克隆抗体，但在混合细胞群的稳定性以及因此带来的所产生的多克隆抗体的一致性方面可能存在潜在的问题。在药学上可接受的大规模（工业）的方法中对整群不同细胞进行控制是一项艰巨的任务。例如，细胞生长速率和抗体产生速率等特性对非克隆群中所有单个克隆来说应保持稳定，才能使多克隆抗体混合物中的抗体比率多少保持恒定。因此，尽管在本领域可能已经认识到混合抗体的需求，但还不存在可接受的解决方案以用药学可接受的方式经济地制造抗体混合物。
日前，默克与丹麦的Symphogen A/S公司签署了Sym004的独家全球授权协议。Sym004是一种靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）的新型在研抗体混合物。
Sym004由两种抗体组成，可阻断配体结合、受体活化和下游信号传导，亦被认为可通过诱导EGFR内陷和降解而诱导EGFR从癌细胞表面清除。在目前对该药开展的Ⅰ/Ⅱ期试验中，研究者针对既往接受标准化疗和市售抗EGFR单克隆抗体治疗后疾病发生进展的晚期KRAS基因野生型转移性结直肠癌（mCRC）患者进行了评价。此外，目前还有一项针对抗EGFR治疗失败的头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）患者的Ⅱ期试验。
Symphogen A/S公司的抗体混合物技术，首先通过抗体筛选平台的筛选获得多个针对同一靶标的抗体，然后进行各个抗体的分子构建，分别细胞摇瓶培养，并进行混合，最后进行混合物逐步扩大培养，并进行纯化工艺优化获得最终的产品。但该方法是用多个重组宿主细胞生成多个同二聚体蛋白混合物，仍然存在细胞生长速率和抗体产生速率不稳定的问题。由于该方法通过单独的细胞表达单独的抗体，因此不存在异二聚体的问题。
如果能在一种重组细胞中生成两种或多种蛋白或抗体，将是更理想的生产蛋白或抗体混合物的方法。
发明内容
本发明的发明人通过大量实验，令人惊奇地发现了在一种重组细胞中同时制备两种或多种蛋白或抗体的方法，由此完成了本发明，具体包括以下几个方面：
本发明第一方面涉及利用一种重组宿主细胞获得包含两种或两种以上的蛋白的混合物的方法，所述蛋白以单体链与单体链聚合的二聚体形式存在，并且所述两种或两种以上的蛋白含有相同的结构域，其特征在于，所述方法包括将其中一种或一种以上蛋白相同结构域中两条单体链的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸的步骤，使得不同种蛋白的单体链之间由于相同电荷的排斥作用而不容易形成异二聚体，而同种蛋白的单体链之间由于相反电荷的吸引作用而更容易形成同二聚体。
在本发明的实施方案中，所述蛋白为抗体或抗体的一部分组成的融合蛋白。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中最多有一种蛋白的氨基酸未被替换。在本发明的实施方案中，其中一种蛋白的氨基酸未被替换，另一种蛋白的氨基酸被替换。在本发明的另一个实施方案中，两种蛋白的氨基酸均被替换。
当有多种（两种或两种以上）蛋白的氨基酸被替换时，不同种蛋白之间所替换的氨基酸至少有一种位置不同，优选地，不同种蛋白之间所替换的氨基酸位置均不同。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述的相同结构域是指抗体的CH3结构域。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述的相同结构域是指抗体的Fc区域。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述的抗体来源于哺乳动物，例如人、小鼠或大鼠。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述的抗体选自IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3）、IgA（例如IgA1、IgA2）、IgE、IgD、IgM（例如IgM1、IgM2）。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述的将相同结构域中的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸，包括以下步骤：
（1）获得所述蛋白的两条单体链的相同结构域之间的界面氨基酸；
（2）从步骤（1）获得的界面氨基酸中挑选正负电荷配对的带电氨基酸；
（3）从步骤（2）获得的正负电荷配对的带电氨基酸中任选一对或数对（例如两对、三对、四对）氨基酸，将所选带电氨基酸替换为带相反电荷的带电氨基酸。
在本发明的实施方案中，其中所述的带电氨基酸选自赖氨酸（lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）。
在本发明的实施方案中，所述相同结构域是指抗体的Fc区域或CH3结构域，此时所述的正负电荷配对的带电氨基酸选自如下a)-h)所示的配对氨基酸：
a）第一链的第356位Glu（E）与第二链的第439位Lys（K）；
b）第一链的第357位Glu（E）与第二链的第370位Lys（K）；
c）第一链的第370位Lys（K）与第二链的第357位Glu（E）；
d）第一链的第392位Lys（K）与第二链的第399位Asp（D）；
e）第一链的第399位Asp（D）与第二链的第392位Lys（K）；
f）第一链的第399位Asp（D）与第二链的第409位Lys（K）；
g）第一链的第409位Lys（K）与第二链的第399位Asp（D）；
h）第一链的第439位Lys（K）与第二链的第356位Glu（E）；
上述8对氨基酸的位置是根据抗体KABAT中EU索引的编号确定的。
在本发明的实施方案中，其中所述的将其中一种或一种以上蛋白相同结构域中两条单体链的的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸是指以下情况中的一种或将几下情况进行组合：
（1）其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
（2）将其中一种蛋白的356位的Glu替换为Lys，439位Lys替换为Glu。
（3）将其中一种蛋白的357位Glu替换为Lys，370位Lys替换为Glu。
（4）将其中一种蛋白的357位Glu替换为Lys，370位Lys替换为Glu，392位Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
（5）将其中一种蛋白的392位Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
（6）将其中一种蛋白的399位Asp替换为Lys，409位的Lys替换为Asp。
（7）将其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys，同时将另一种蛋白的357位Glu替换为Lys，370位Lys替换为Glu。
（8）将其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys，同时将另一种蛋白的356位的Glu替换为Lys，439位Lys替换为Glu。
在本发明的实施方案中，所述的正负电荷配对的带电氨基酸在SEQ IDNO：2所示的序列中的位置为如a1）-h1）的所示的8对氨基酸：
a1）第一链的第161位Glu（E）与第二链的第244位Lys（K）；
b1）第一链的第162位Glu（E）与第二链的第175位Lys（K）；
c1）第一链的第175位Lys（K）与第二链的第163位Glu（E）；
d1）第一链的第197位Lys（K）与第二链的第204位Asp（D）；
e1）第一链的第204位Asp（D）与第二链的第197位Lys（K）；
f1）第一链的第204位Asp（D）与第二链的第214位Lys（K）；
g1）第一链的第214位Lys（K）与第二链的第204位Asp（D）；
h1）第一链的第244位Lys（K）与第二链的第161位Glu（E）。
在本发明的实施方案中，所述的正负电荷配对的带电氨基酸在SEQ IDNO：4所示的序列中的位置为如a2）-h2）所示的8对氨基酸：
a2）第一链的第399位Glu（E）与第二链的第482位Lys（K）；
b2）第一链的第400位Glu（E）与第二链的第413位Lys（K）；
c2）第一链的第413位Lys（K）与第二链的第400位Glu（E）；
d2）第一链的第435位Lys（K）与第二链的第442位Asp（D）；
e2）第一链的第442位Asp（D）与第二链的第435位Lys（K）；
f2）第一链的第442位Asp（D）与第二链的第452位Lys（K）；
g2）第一链的第452位Lys（K）与第二链的第442位Asp（D）；
h2）第一链的第482位Lys（K）与第二链的第399位Glu（E）。
根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述的将相同结构域中的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸的方法包括：获得氨基酸替换后的蛋白的编码核苷酸序列，用重组宿主细胞表达该编码核苷酸序列，得到氨基酸替换后的蛋白。
在本发明中，可以将不同的蛋白分别克隆入表达载体中，再将不同表达载体共转染宿主细胞，培养重组宿主细胞，表达蛋白，得到蛋白混合物；也可以将不同的蛋白通过可操作地连接克隆入同一表达载体中，再转入宿主细胞，培养得到蛋白混合物。
在本发明中，根据替换后的氨基酸序列获得编码的核苷酸序列为本领域所公知。
本发明第二方面涉及包含两种或两种以上的蛋白的混合物，所述蛋白以单体链与单体链聚合的二聚体形式存在，并且所述两种或两种以上的蛋白含有相同的结构域，其特征在于，其中一种或一种以上蛋白相同结构域中两条单体链的部分氨基酸被替换为带相反电荷的氨基酸，使得不同种蛋白的单体链之间由于相同电荷的排斥作用而不容易形成异二聚体，而同种蛋白的单体链之间由于相反电荷的吸引作用而更容易形成同二聚体。
在本发明的实施方案中，所述蛋白为抗体或抗体的一部分组成的融合蛋白。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中最多有一种蛋白或抗体的氨基酸未被替换。在本发明的实施方案中，其中一种蛋白的氨基酸未被替换，另一种蛋白的氨基酸被替换。在本发明的另一个实施方案中，两种蛋白的氨基酸均被替换。
当有多种（两种或两种以上）蛋白的氨基酸被替换时，不同种蛋白之间所替换的氨基酸至少有一种位置不同，优选地，不同种蛋白之间所替换的氨基酸位置均不同。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的相同结构域是指抗体的CH3结构域。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的相同结构域是指抗体的Fc区域。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的抗体来源于哺乳动物，例如人、小鼠或大鼠。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的抗体选自IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3）、IgA（例如IgA1、IgA2）、IgE、IgD、IgM（例如IgM1、IgM2）。
根据本发明第二方面任一项的混合物，其中所述的部分氨基酸为所述蛋白的两条单体链的相同结构域之间的界面氨基酸，优选地，所述界面氨基酸为正负电荷配对的带电氨基酸；更优选地，其中的一对或数对（例如两对、三对、四对）配对氨基酸被替换为带相反电荷的带电氨基酸。
在本发明的实施方案中，其中所述的带电氨基酸选自赖氨酸（lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）。
在本发明的实施方案中，所述相同结构域是指抗体的Fc区域或CH3结构域，此时所述的正负电荷配对的带电氨基酸选自如下a)-h)所示的配对氨基酸：
a）第一链的第356位Glu（E）与第二链的第439位Lys（K）；
b）第一链的第357位Glu（E）与第二链的第370位Lys（K）；
c）第一链的第370位Lys（K）与第二链的第357位Glu（E）；
d）第一链的第392位Lys（K）与第二链的第399位Asp（D）；
e）第一链的第399位Asp（D）与第二链的第392位Lys（K）；
f）第一链的第399位Asp（D）与第二链的第409位Lys（K）；
g）第一链的第409位Lys（K）与第二链的第399位Asp（D）；
h）第一链的第439位Lys（K）与第二链的第356位Glu（E）；
上述8对氨基酸的位置是根据抗体KABAT中EU索引的编号确定的。
在本发明的实施方案中，其中所述的一种或一种以上蛋白相同结构域中两条单体链的部分氨基酸被替换为带相反电荷的氨基酸是指以下情况中的一种或将几下情况进行组合：
（1）其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
（2）将其中一种蛋白的356位的Glu替换为Lys，439位Lys替换为Glu。
（3）将其中一种蛋白的357位Glu替换为Lys，370位Lys替换为Glu。
（4）将其中一种蛋白的357位Glu替换为Lys，370位Lys替换为Glu，392位Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
（5）将其中一种蛋白的392位Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
（6）将其中一种蛋白的399位Asp替换为Lys，409位的Lys替换为Asp。
（7）将其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys，同时将另一种蛋白的357位Glu替换为Lys，370位Lys替换为Glu。
（8）将其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys，同时将另一种蛋白的356位的Glu替换为Lys，439位Lys替换为Glu。
在本发明的实施方案中，所述的正负电荷配对的带电氨基酸在SEQ IDNO：2所示的序列中的位置为如a1）-h1）的所示的8对氨基酸：
a1）第一链的第161位Glu（E）与第二链的第244位Lys（K）；
b1）第一链的第162位Glu（E）与第二链的第175位Lys（K）；
c1）第一链的第175位Lys（K）与第二链的第163位Glu（E）；
d1）第一链的第197位Lys（K）与第二链的第204位Asp（D）；
e1）第一链的第204位Asp（D）与第二链的第197位Lys（K）；
f1）第一链的第204位Asp（D）与第二链的第214位Lys（K）；
g1）第一链的第214位Lys（K）与第二链的第204位Asp（D）；
h1）第一链的第244位Lys（K）与第二链的第161位Glu（E）。
在本发明的实施方案中，所述的正负电荷配对的带电氨基酸在SEQ IDNO：4所示的序列中的位置为如a2）-h2）所示的8对氨基酸：
a2）第一链的第399位Glu（E）与第二链的第482位Lys（K）；
b2）第一链的第400位Glu（E）与第二链的第413位Lys（K）；
c2）第一链的第413位Lys（K）与第二链的第400位Glu（E）；
d2）第一链的第435位Lys（K）与第二链的第442位Asp（D）；
e2）第一链的第442位Asp（D）与第二链的第435位Lys（K）；
f2）第一链的第442位Asp（D）与第二链的第452位Lys（K）；
g2）第一链的第452位Lys（K）与第二链的第442位Asp（D）；
h2）第一链的第482位Lys（K）与第二链的第399位Glu（E）。
本发明第三方面涉及根据本发明第一方面任一项所述的方法获得的蛋白的混合物。
在本发明的实施方案中，描述了一种包含CH3区域的多肽由于氨基酸之间的相互作用力形成相互作用界面并形成二聚体，利用电荷排斥效应修改CH3区域相互作用界面上的氨基酸减少CH3区域之间自身结合的能力（形成异二聚体），从而获得同二聚体混合物的方法。一般来说，在CH3-CH3接触面，修改相关氨基酸为带电荷氨基酸就会形成电荷排斥效应，在某些情况下突变接触面上某个带正电氨基酸（赖氨酸，精氨酸，组氨酸）为负电氨基酸（天冬氨酸，谷氨酸）或相反，就能形成排斥作用。
在本发明的实施方案中，通过建立CH3-CH3作用表面的氨基酸相互作用配对，获得配对中电荷氨基酸之间的作用情况，选择任意一个或者多个氨基酸，分析所选氨基酸对同二聚体及异二聚体的影响情况，将所选氨基酸突变为带电氨基酸，考察突变后对于同二聚体及异二聚体的影响情况，将突变后与突变前进行对比，如果突变合适，那么将会产生增强同二聚体及削弱异二聚体形成的作用。最后选择合理的氨基酸突变，最大化的增强同二聚体及削弱异二聚体的作用。
以上所描述的方法，在具体的方法中则定义为突变CH3区域配对带电氨基酸在同一链上的氨基酸为相反电荷氨基酸，则两链Fc在形成同二聚体的过程中由于依旧是相反电荷氨基酸所导致的电荷吸引作用而维持相互作用能力不变，而Fc在形成异二聚体过程中，因为配对氨基酸在其中一链的电荷电性互换，导致相同电荷排斥的作用，而无法形成异二聚体，最终获得只具有同二聚体的Fc抗体或者蛋白的混合物。
在本发明中，所述蛋白也被称为多肽，其含有10个以上氨基酸，优选含有50个以上氨基酸，更优选含有100个以上氨基酸。在本发明的实施方案中，所述蛋白为抗体或包含抗体的一部分。在本发明的具体实施方案中，所述蛋白为IgG1的Fc片段。在本发明的另一个实施方案中，所述蛋白为单链抗体（ScFv）与IgG1的Fc片段的融合蛋白。
在本发明中，所述宿主细胞是适合表达所述蛋白或抗体的细胞，例如为原核细胞或真核细胞。所述原核细胞例如为大肠杆菌；所述真核细胞例如为酵母细胞或哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞例如为人上皮细胞系（如293H）、中国仓鼠卵巢细胞系（CHO）或骨髓瘤细胞。
在本发明中，所述不同种蛋白之间包含有相同的结构域。在本发明的实施方案中，所述相同的结构域是指抗体的CH3区域或抗体的Fc区域。
在本发明中，所述单体链也称做单独的多肽，是指组成二聚体蛋白中的其中一条单体或者一个亚基。在本发明的实施方案中，所述组成二聚体的两条单体链是对称的，即两条单体链的序列是相同的。
在本发明中，所述氨基酸的替换是指将组成二聚体蛋白的两条单体链的相应位置氨基酸均进行替换。
在本发明中，所述二聚体是指蛋白质或者核酸在形成过程中，由两个亚基（subunit）或单体所形成的结合体，可以由共价键结合，也可以由非共价键结合；所述同二聚体是指二聚体的两个亚基相同；所述异二聚体是指二聚体的两个亚基不同。
在本发明中，所述结构域是指生物大分子中特别是蛋白质所具有特异结构和独立功能的区域。在本发明的实施方案中，所述结构域是指抗体的CH3区域或抗体的Fc区域。
在本发明中，所述界面氨基酸是指结构域与结构域之间相互接触，形成接触界面的氨基酸。界面氨基酸可以由两个氨基酸组成，也可以由多个氨基酸组成。
在本发明中，所述“一种蛋白”或“同种蛋白”是指一种核苷酸序列表达所形成的蛋白，即同二聚体形成的蛋白。
通过本发明方法获得的抗体混合物，可以是两个同二聚体的蛋白或抗体混合物，也可以是两个以上同二聚体的蛋白或抗体混合物，优选两个同二聚体的蛋白或抗体混合物。
在本发明的实施方案中，包含CH3的结构域可以为单独的CH3区域，也可以为包含CH3区域的人免疫球蛋白Fc区域。在一般情况下，人免疫球蛋白Fc区域的CH3区域多肽来源于野生型的人免疫球蛋白Fc区域。野生型的人免疫球蛋白Fc指发生在人群中的氨基酸序列，当然Fc序列在个体中会有一些细微的差异。本发明中人免疫球蛋白Fc也包括对于野生型人免疫球蛋白Fc序列的氨基酸有个别改变的片段，比如，Fc区域局部某些氨基酸的改变，如包括某些在糖基化位点突变的氨基酸，或者其他无义的突变。CH3结构域的序列例如可以为SEQ ID NO：2中第148-252位氨基酸所示的序列。Fc区域的序列例如可以为SEQ ID NO：2中第26-252位氨基酸所示的序列。
在本发明中，术语“人免疫球蛋白Fc”指的是人免疫球蛋白链恒定区，特别是免疫球蛋白重链恒定区的羧基端或其中的一部分。例如，免疫球蛋白Fc区可包括重链CHl、CH2、CH3、CH4的两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区的组合。在本文中，IgG的Fc区对应于“下铰合部”-CH2-CH3结构域(对于IgG，CH2和CH3也称为Cγ2和Cγ3结构域)。在人IgG1的背景中，根据Kabat中的EU索引，下铰合部指位置226-236，CH2结构域指位置237-340，而CH3结构域指位置341-447。根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-l，IgG-2，IgG-3，IgG-4，IgA-l和IgA-2。可以从该IgG亚类的重链或重链片段与人IgG1的重链或重链片段的氨基酸序列比对测定其他IgG亚类的类似结构域。从特定的免疫球蛋白类别和亚类中选择特定的免疫球蛋白Fc区在本领域技术人员所掌握的范围之内。因为人和鼠的氨基酸相互作用界面氨基酸非常保守，电荷排斥作用用于制备同二聚体蛋白或者抗体混合物也同样适用于人或鼠的IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。相关方法也同样适用于在CH3区域将非电荷氨基酸突变为电荷氨基酸。
在本发明中，Fc区中残基的编号是根据在此明确引用作为参考的Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991)中的EU索引的免疫球蛋白重链编号。“Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号。抗体Fc区的氨基酸序列中的氨基酸位置，都是根据Kabat等的EU索引表示的。
在本发明中，所述的用于生成同二聚体蛋白混合物的抗体原型，可以是抗体、免疫球蛋白、Fc融合多肽、Fc缀合物（见图2），此列表并非限制性的。
在本发明中，所述同二聚体蛋白可以是包含Fc区的多肽同二聚体蛋白。包括但不限于抗体、Fc融合蛋白质、Fc缀合物、Fc衍生的多肽、分离的Fc及其片段。因此，该同二聚体蛋白可以是天然存在的多肽、天然存在的多肽的变体、天然存在的多肽的改造形式、合成多肽或包含非蛋白质片段的多肽。天然存在的多肽的改造形式是并非由天然存在的基因编码的多肽。例如，改造的多肽可以是嵌合抗体或人源化抗体。
在本发明中，同二聚体蛋白混合物可以用标准的实验手段从宿主细胞中纯化。例如，当同二聚体蛋白包含了Fc区域，则可以用蛋白A来纯化。纯化方法包括但不限于色谱技术如体积排阻、离子交换、亲和色谱法及超滤法。本发明的同二聚体混合物的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。
本发明还涉及经过改造的组成同二聚体蛋白或抗体的单体链或单独的多肽。
本发明还进一步涉及编码经过改造的组成同二聚体蛋白或抗体（或单体链或单独的多肽）的核酸序列。
本发明更进一步涉及包含经过改造的组成同二聚体蛋白或抗体（或单体链或单独的多肽）的药物组合物。
发明的有益效果
由于不同蛋白的相同结构域（例如抗体的Fc和Fc）之间的相互作用，导致形成同二聚体和异二聚体的形成是一个动态的、复杂的过程，其中包括了同二聚体本身由于界面氨基酸的相互作用，形成稳定的同二聚体，也包括了异二聚体本身由于界面氨基酸的相互作用，形成稳定的异二聚体，更包括了由于同二聚体的存在，导致的异二聚体本身含量动态变化，反之亦然。本发明提供了利用一种重组宿主细胞制备两种或两种以上蛋白或抗体混合物的方法，所述方法可以增加蛋白或抗体的同二聚体含量，同时降低其它不需要的产物如异二聚体的含量。实验结果表明，本发明所获得的蛋白或抗体混合物组分纯净，稳定性可靠。本发明制备的蛋白或抗体混合物可以同时作用于同一靶标的不同表位，也可以通过结合不同抗原来同时抑制多个抗原的作用，为肿瘤等疾病的治疗提供了新的方法和途径。
附图说明
图1为重组载体pcMVβ-SP-Fc的结构示意图。
图2为重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc的结构示意图。
图3人(a)和鼠(b)IgG亚型序列比对。此图中对重链的CH3进行了比对。其中星型（*）氨基酸是根据IgG1人Fc晶体结构表示的CH3-CH3相互作用区域内的氨基酸，方形框表示的是优选的形成同二聚体混合物的氨基酸突变。这里值得注意的是在大多数IgGs内带电氨基酸是高度保守的。(c)其他抗体亚型(IgA,IgE,IdD和IgM)的CH3序列比较。星号（*）在(b)和(c)内是根据人IgG1表示的CH3-CH3相互作用区域内的氨基酸。
图4野生型电荷相互作用效应及突变型中电荷相互作用阻止异二聚体并支持同二聚体形成示意图例子。（a）野生型中，电荷相互作用同时支持异二聚体和同二聚体形成。(b)其中一链Fc CH3区域D399K和K409D双突变，由于电荷排斥效应而无法形成异二聚体，同时由于电荷吸引容易形成同二聚体混合物。
图5为电泳检测同二聚体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体((ScFv-Fc/Fc)的结果。其中，泳道M为分子量标准（最上面的3个片段从上到下依次为104KD、78KD、50KD），泳道1-9分别为表5中突变组合0-8。
图6为31天加速稳定性试验的SDS-PAGE图。其中Control为野生型，scFv-Fc/Fc-mix1为突变组合1，scFv-Fc/Fc-mix13为突变组合4，scFv-Fcmix1/Fc-mix2为突变组合6。
图7为31天加速稳定性试验的CE-SDS图。其中Control为野生型，Mix1为突变组合1，Mix2为突变组合6。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、抗体Fc段上CH3区域突变氨基酸的选择
1、序列及结构获得
从蛋白质数据库（PDB,www.pdb.org）中共获得48个包含Fc区域的人IgG1抗体晶体结构，通过结构相似性搜索算法（参考文献：Yuzhen Ye andAdam Godzik.FATCAT:a web server for flexible structure comparison andstructure similarity searching.Nucleic Acids Res.,2004，32(Web Serverissue):W582-585.）,得出这48个抗体的Fc段的来自1DN2(PDB编号)。
2、界面氨基酸获取
用蛋白质接触氨基酸识别软件CMA(网址为：http://ligin.weizmann.ac.il/cma/)，根据氨基酸作用的距离筛选并识别抗体(PDB编号:1DN2)中CH3-CH3之间的氨基酸接触。根据氨基酸接触规则，界面氨基酸指侧链重原子与另外一条链的任何一个氨基酸的重原子之间的距离小于一个阈值的一些氨基酸。本实施例的阈值选择为也可以选择5.5(如文献：B.Erman,I.Bahar and R.L.Jernigan.Equilibrium states of rigidbodies with multiple interaction sites.Application to protein helices.J.Chem.Phys.1997,107:2046-2059.）。人和鼠IgG亚型氨基酸接触界面的保守情况可以通过图3的序列多重比对得到。表1为通过氨基酸接触筛选（即氨基酸距离小于的抗体1DN2的34个界面氨基酸，其中，链A和链B分别代表抗体1DN2的第一链和第二链。以下氨基酸位置是根据抗体Fc的KABAT编号的EU索引所命名的。
表1.抗体1DN2的CH3-CH3界面氨基酸列表
3、寻找电荷氨基酸配对
在表1所列出的CH3-CH3界面氨基酸的基础上，根据氨基酸的电性，寻找电荷氨基酸配对，配对结果见表2，共有8对电荷氨基酸配对。
表2、抗体1DN2的电荷氨基酸配对
链A中的接触氨基酸 链B中的接触氨基酸
Glu356A Lys439B
Glu357A Lys370B
Lys370A Glu357B
Lys392A Asp399B
Asp399A Lys392B
Asp399A Lys409B
Lys409A Asp399B
Lys439A Glu356B
4、突变电荷氨基酸
根据表2的结果，由于抗体1DN2的Fc两链为对称的两链，突变任一链的配对氨基酸在同一链上相同位置的氨基酸为相反电荷氨基酸，则抗体的两条链的氨基酸都得到了突变，如配对氨基酸Glu356A—Lys439B，突变的两种类型为：
1）将Glu356A突变为Lys356A或Arg356A，和/或将Lys439A突变为Glu439A或Asp439A；
2）将Glu356B突变为Lys356B或Arg356B，和/或将Lys439B突变为Glu439B或Asp439B。
其中，相反电荷是指将正电氨基酸（赖氨酸（Lys，K）或精氨酸（Arg，R）或组氨酸（His，H））突变为负电氨基酸（天冬氨酸（Asp，D）或谷氨酸（Glu，E））或者将负电氨基酸（天冬氨酸或谷氨酸）突变为正电氨基酸（赖氨酸或精氨酸）。详细突变位置如表3和表4所示。
表3.A链中的突变氨基酸
注:+代表正电荷，-代表负电荷。
表4.B链中的突变氨基酸
注:+代表正电荷，-代表负电荷。
此外，在更为复杂的情况下，可以根据本发明的方法，也可以是根据上述描述的配对氨基酸的不同突变种类的组合。根据本发明方案对制备Fc混合物的Fc进行改造，并制备抗体混合物的方法，并不局限于上文所述的单链双点配对氨基酸突变或者各种突变的组合。
实施例2、改造抗体Fc段上CH3区域的氨基酸获得同二聚体蛋白混合物
1、构建表达人IgG1的Fc片段的重组载体pcMVβ-SP-Fc
根据基因库中搜索到的人IgG1的Fc片段（hing-CH2-CH3）基因序列，人工合成获得如SEQ ID NO：1所示的两端含有HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列及保护碱基的人的Fc基因（全长780bp，名称为SP-Fc），用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，与经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的哺乳动物细胞表达载体pcMVβ（Invitrogen）的载体骨架连接，获得重组载体pcMVβ-SP-Fc（其结构示意图如图1所示），并经测序证实该重组载体pcMVβ-Fc为载体pcMVβ的EcoRⅠ和HindⅢ位点间插入了SEQ ID NO：1中第16位至第771位核苷酸序列所示的DNA片段。
SEQ ID NO：1中第16位至第771位核苷酸序列编码的Fc蛋白氨基酸序列如下（如SEQ ID NO：2所示）：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHENPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：2）
2、构建表达ScFv-Fc融合蛋白的重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc
人工合成获得如SEQ ID NO：3所示的两端含有HindⅢ和EcoRⅠ的识别序列及保护碱基的ScFv-Fc融合蛋白编码基因，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，与经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-zeo（Invitrogen）的载体骨架连接，获得重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc（其结构示意图如图2所示），并经测序证实该重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc为载体pcDNA3.1-zeo的EcoRⅠ和HindⅢ位点间插入了SEQ ID NO：3中第16位至第1488位核苷酸序列所示的DNA片段。
SEQ ID NO：3中第16位至第1488位核苷酸序列编码的ScFv-Fc融合蛋白氨基酸序列如下（如SEQ ID NO：4所示）：
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCIASGFTFSSYPMTWVRQAPGKGLEWVASISYDGSYKYKADSMKGRLTISRDNSKNTLYLEMNSLTAEDTAVYYCARTAFFNAYDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNEWFRTSGQGTKVEIKRDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHENPEVKFNWYVDGVEVHNA KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ ID NO：4）
SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4中划线部分的氨基酸序列相同。
3、选择氨基酸的突变位点获得改造的重组载体
根据实施例1的表3和表4中的氨基酸突变位置，利用重叠PCR法对scFV-Fc及Fc编码的核苷酸（SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3）进行突变及组合突变，如表5中的突变组合1-8所示，分别获得8种经过改造的重组载体pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc和pcMVβ-SP-Fc。
表5.突变体的具体突变位点及其位置
注：WT表示未进行突变的野生型，NA表示在配对氨基酸位点未进行任何突变，“/”表示“和”的关系，“E356K”中356表示突变氨基酸的位置，356前的字母E表示突变前的氨基酸为E，356后的字母K表示突变后的氨基酸为K，其它同理。
4、转染细胞及抗体混合物的检测
将步骤3的8种突变组合相应的表达载体分别用PEI转染至悬浮培养的293H细胞（ATCC CRL-1573），pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc和pcMVβ-SP-Fc质粒共转比例为1:1，培养3-4天后，收集细胞上清。与protein A琼脂糖树脂进行免疫沉淀反应，通过非还原条件下SDS-PAGE电泳检测同二聚体蛋白或抗体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体蛋白或抗体((ScFv-Fc/Fc)的组成情况，同时用Media Cybernetics公司推出的Gel-Pro专业图像分析软件进行同二聚体蛋白或抗体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体蛋白或抗体((ScFv-Fc/Fc)比例的分析，电泳检测结果如图5及表6所示，当在ScFv-Fc上引入表5相关突变位点后，ScFv-Fc/ScFv-Fc,Fc/Fc同二聚体的比例有大幅度的上升，而异二聚体(ScFv-Fc/Fc)比例则大幅度下降；当在Fc上引入三个突变位点K392D/K409D/D399K（突变组合2）或突变组合4,5,6的时候，表达后蛋白是以ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc同二聚体的形式存在（总体比例超过96%），进一步证明电荷排斥作用对于增强同二聚体和抑制异二聚体的形成至关重要。，这里值得注意的是，在ScFv-FC上更多的突变(E357K/K370E或E356K/K439E)并没有显著提升同二聚体地含量，在一定程度上反而增加了异二聚体的含量。此外在Fc引入E357K/K370E/K392D/K409D/D399K（突变组合4）的时候，出现了Fc的部分单体（大约有6%），稳定性有待进一步考察。
蛋白或抗体混合物组成的检测原理：融合蛋白ScFv-Fc比Fc具有更大的分子量，那么在ScFv-Fc和Fc混合过程中，同二聚体(ScFv-Fc/ScFv-Fc和Fc/Fc)和异二聚体(ScFv-Fc/Fc)在SDS-PAGE具有不同的条带位置，通过这个原理就可以检测同二聚体与异二聚体的比例情况，ScFv-Fc和Fc的表达载体共转染，最终会同时出现同二聚体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体(ScFv-Fc/Fc)。
表6.各突变体在SDS-PAGE上同二聚体和异二聚体的比例
为了考察pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc和pcMVβ-SP-Fc质粒共转比例对于同二聚体和异二聚体比例的影响。用突变组合1将pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc和pcMVβ-SP-Fc质粒分别用4:1,1:1及1:4的比例用PEI转染至悬浮培养的293H细胞（ATCC CRL-1573），培养3-4天后，收集细胞上清。与proteinA琼脂糖树脂进行免疫沉淀反应，通过非还原条件下SDS-PAGE电泳检测同二聚体蛋白或抗体(ScFv-Fc/ScFv-Fc，Fc/Fc)和异二聚体蛋白或抗体((ScFv-Fc/Fc)的组成情况。具体结果见表7。从结果可以看出，ScFV-Fc及Fc共转比例的改变，导致了不同同二聚体本身比例的改变，但是对于异二聚体的比例始终保持在5%以内，表明突变组合1能够稳定排除异二聚体。
表7.不同共转比例对于同二聚体和异二聚体的比例的影响
本发明通过改变Fc不同两链质粒的共转比例，在一定程度上能够改变同二聚体本身的比例，但是并不能显著改变同二聚体整体的比例，也不能显著改变异二聚体的比例，表明即使通过改变质粒共转比例，同二聚体整体的比例也相对比较稳定。
5、抗体混合物的加速稳定性检测
在考察步骤4中SDS-PAGE的各种突变组合的结果基础上，我们选择了突变组合1，4，6及组合0（野生型,这里只有scFV-Fc野生型进行了转染）的抗体混合物进行了加速稳定性的实验，实验周期31天，温度45℃，于第0天，第4天，第8天，第16天，第21天和第31天进行SDS-PAGE的检测。同样我们选择了突变组合1(mix1)，组合6(mix2)及组合0（野生型，control）的抗体混合物第0天，第8天，第21天和第31天进行CE-SDS（毛细管电泳）的检测。
31天加速稳定性SDS-PAGE结果表明，突变组合1和突变组合6同野生型（scFV/scFV同二聚体，control）抗体混合物一样均表现出非常高的稳定性，至16天开始，ScFV-Fc/ScFV-Fc同二聚体具有部分降解，而Fc/Fc同二聚体至31天都保持了优越的稳定性，考虑ScFV本身的不稳定性，我们可以认为突变组合1、突变组合6抗体混合物与野生型的Fc稳定性无异。在这里值得注意的是，突变组合4产生的抗体混合物具有比较明显的降解，且溶液中具有沉淀析出。推测可能是由于该突变组合在Fc单链存在了5个突变，Fc二聚体则存在了10个突变，对结构产生了很大的影响，因此稳定性发生了变化。相关结果见图6。
CE-SDS相比于传统的SDS-PAGE具有上样量小，能够获得准确的分子量标准，可利用紫外等进行柱上检测，以及可以实现定量分析等，因此可以更准确的衡量混合物同二聚体的降解情况。从图7及表6可以看出突变组合1和突变组合6同野生型（control）抗体混合物同样表现出足够好的稳定性，至16天开始才具有较明显ScFV-Fc/ScFV-Fc同二聚体降解峰，相关结果与SDS-PAGE加速稳定性结果一致。
表6.抗体混合物的加速稳定性CE-SDS结果
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (20)

1.利用一种重组宿主细胞获得包含两种或两种以上的蛋白的混合物的方法，所述蛋白以单体链与单体链聚合的二聚体形式存在，并且所述两种或两种以上的蛋白含有相同的结构域，其特征在于，所述方法包括将其中一种或一种以上蛋白相同结构域中两条单体链的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸的步骤，使得不同种蛋白的单体链之间由于相同电荷的排斥作用而不容易形成异二聚体，而同种蛋白的单体链之间由于相反电荷的吸引作用而更容易形成同二聚体，其中最多有一种蛋白的氨基酸未被替换，其中所述的相同结构域是指抗体的CH3结构域或者抗体的Fc区域；
其中所述的将相同结构域中的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸，包括以下步骤：
(1)获得所述蛋白的两条单体链的相同结构域之间的界面氨基酸；
(2)从步骤(1)获得的界面氨基酸中挑选正负电荷配对的带电氨基酸；
(3)从步骤(2)获得的正负电荷配对的带电氨基酸中任选一对或数对氨基酸，将所选带电氨基酸替换为带相反电荷的带电氨基酸；
其中所述的带电氨基酸选自赖氨酸(lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
所述的正负电荷配对的带电氨基酸选自如下a)-h)所示的配对氨基酸：
a)第一链的第356位Glu(E)与第二链的第439位Lys(K)；
b)第一链的第357位Glu(E)与第二链的第370位Lys(K)；
c)第一链的第370位Lys(K)与第二链的第357位Glu(E)；
d)第一链的第392位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
e)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第392位Lys(K)；
f)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第409位Lys(K)；
g)第一链的第409位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
h)第一链的第439位Lys(K)与第二链的第356位Glu(E)；
上述8对氨基酸的位置是根据抗体KABAT中EU索引的编号确定的；
所述的一对或数对氨基酸选自以下组合：
一种蛋白上的d)和e)和g)、或d)和f)和g)；或者一种蛋白上的d)和e)和g)、或d)和f)和g)再加上第二种蛋白上的b)和c)、或a)和h)。
2.权利要求1的方法，其中所述的相同结构域中两条单体链的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸是指：将其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
3.权利要求1的方法，其中所述的将相同结构域中的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸的方法包括：获得氨基酸替换后的蛋白的编码核苷酸序列，用重组宿主细胞表达该编码核苷酸序列，得到氨基酸替换后的蛋白。
4.权利要求1的方法，其中所述的蛋白为抗体。
5.权利要求1的方法，其中所述的抗体来源于哺乳动物。
6.权利要求1的方法，其中所述的抗体来源于人、小鼠或大鼠。
7.权利要求1的方法，其中所述的抗体选自IgG、IgA、IgE、IgD、IgM。
8.权利要求7的方法，其中所述的IgG选自IgG1、IgG2、IgG3。
9.权利要求7的方法，其中所述的IgA选自IgA1、IgA2。
10.权利要求7的方法，其中所述的IgM选自IgM1、IgM2。
11.包含两种或两种以上的蛋白的混合物，所述蛋白以单体链与单体链聚合的二聚体形式存在，并且所述两种或两种以上的蛋白之间含有相同的结构域，其特征在于，其中一种或一种以上蛋白相同结构域中两条单体链的部分氨基酸被替换为带相反电荷的氨基酸，使得不同种蛋白的单体链之间由于相同电荷的排斥作用而不容易形成异二聚体，而同种蛋白的单体链之间由于相反电荷的吸引作用而更容易形成同二聚体，其中最多有一种蛋白的氨基酸未被替换，其中所述的相同结构域是指抗体的CH3结构域或者抗体的Fc区域；
其中所述的部分氨基酸为所述蛋白的两条单体链的相同结构域之间的界面氨基酸，所述界面氨基酸为正负电荷配对的带电氨基酸；其中的一对或数对配对氨基酸被替换为带相反电荷的带电氨基酸；
其中所述的带电氨基酸选自赖氨酸(lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；
所述的正负电荷配对的带电氨基酸选自如下a)-h)所示的配对氨基酸：
a)第一链的第356位Glu(E)与第二链的第439位Lys(K)；
b)第一链的第357位Glu(E)与第二链的第370位Lys(K)；
c)第一链的第370位Lys(K)与第二链的第357位Glu(E)；
d)第一链的第392位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
e)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第392位Lys(K)；
f)第一链的第399位Asp(D)与第二链的第409位Lys(K)；
g)第一链的第409位Lys(K)与第二链的第399位Asp(D)；
h)第一链的第439位Lys(K)与第二链的第356位Glu(E)；
上述8对氨基酸的位置是根据抗体KABAT中EU索引的编号确定的；
所述的一对或数对氨基酸选自以下组合：
一种蛋白上的d)和e)和g)、或d)和f)和g)；或者一种蛋白上的d)和e)和g)、或d)和f)和g)再加上第二种蛋白上的b)和c)、或a)和h)。
12.权利要求11的混合物，其中所述的蛋白为抗体。
13.权利要求11的混合物，其中所述的抗体来源于哺乳动物。
14.权利要求11的混合物，其中所述的抗体来源于人、小鼠或大鼠。
15.权利要求11的混合物，其中所述的抗体选自IgG、IgA、IgE、IgD、IgM。
16.权利要求15的混合物，其中所述的IgG选自IgG1、IgG2、IgG3。
17.权利要求15的混合物，其中所述的IgA选自IgA1、IgA2。
18.权利要求15的混合物，其中所述的IgM选自IgM1、IgM2。
19.权利要求11的混合物，其中所述的相同结构域中两条单体链的部分氨基酸替换为带相反电荷的氨基酸是指：将其中一种蛋白的392位的Lys替换为Asp，409位的Lys替换为Asp，399位的Asp替换为Lys。
20.根据权利要求1-10任一项所述的方法获得的蛋白的混合物。
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