JP7444381B2 - Ｃｈ３ドメインに基づくヘテロダイマー分子、その調製方法及び用途 - Google Patents

Ｃｈ３ドメインに基づくヘテロダイマー分子、その調製方法及び用途 Download PDF

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Description

本願に記載の発明は、抗体工学の分野に属し、具体的には、ＣＨ３ドメインに基づくヘ
テロダイマー分子、その調製方法及び用途に関する。
モノクローナル抗体薬は、この１５年間で大きな進歩を遂げ、製薬業界の推進力となっ
ている。１９９６年以降、合計３０個前後のモノクローナル抗体薬が認可され、市販され
ており、このうち９つのモノクローナル薬の年間売上高は１０億ＵＳドルを超えている。
２０１０年のモノクローナル薬の販売総額は３００億ＵＳドルを超えており、年間成長率
が１０％を超えている。モノクローナル抗体は標的特異性が高いので、単一の標的のみ抑
制することができる。しかしながら、腫瘍、自己免疫疾患等を含む複数の疾患では、多重
シグナル経路を抑制して補償作用を回避する必要がある。ウイルス感染疾患については、
ウイルスの変異率が高いので、一般に、複数の抗原部位を抑制して漏れがないようにする
必要がある。また、二重特異性抗体、二重特異性タンパク質は、人体の免疫系を特異的に
活性化するのに用いられている（非特許文献１）。
周知のように、抗体の結晶性フラグメント（Ｆｃ）領域はホモダイマーを形成しており
、また、Ｆｃは抗体及びＦｃ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ安定性に重要な役割を果た
している。Ｆｃの改変によってこれにヘテロダイマーを形成させることが、多機能性抗体
、多機能性タンパク質を産生し、そのｉｎ ｖｉｖｏ安定性を維持する効果的な方法であ
る。
ヘテロダイマーの１つの典型的な適用例が二重特異性抗体であり、二重特異性抗体（Ｂ
ｓＡｂ：Bispecific antibody）は２つの異なるリガンド結合部位を含む免疫グロブリン
分子である。二重特異性抗体は少なくとも２つの異なる抗原に対して活性を有するように
することができ（非特許文献２）、これは代表的な抗体のＦａｂの両腕が同じ配列である
のに対し、異なる配列を持つＦａｂの両腕の形態を用いているので、Ｙ字型の両腕が異な
る抗原に結合することができるものである。癌治療における二重特異性抗体の適用は既に
複数の文献で概要が述べられている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献３）。
二重特異性抗体は自然の状態では存在せず、特殊な方法によってしか調製することがで
きない。従来、二重特異性抗体の調製方法には、化学架橋法、Ｆ（ａｂ’）２分子ハイブ
リダイゼーション法及びマウスハイブリドーマ法等がある。化学架橋法により産生された
二重特異性抗体の不均一性、各ロット間の製品の不安定性、及び抗体の特異性は何らかの
修飾又は不適正な連結により変更されやすいという特性により、この方法で産生された二
重特異性抗体はｉｎ ｖｉｖｏの使用に適していない。タンパク質の酵素分解フラグメン
トＦ（ａｂ’）をスルフヒドリル基で架橋して産生された二重特異性ハイブリダイズ分子
は、成分は比較的均一であるが、時間も手間もかかり、生産量が少ない。ハイブリドーマ
法で産生された二重特異性抗体は、由来は確かなものであるが、軽鎖と重鎖とのランダム
対合により抗体の形態が複数種類発生する可能性があり、二重特異性抗体の産生、精製が
非常に困難になる。
既に１９９０年代にCarter他が「ノブ・イントゥ・ホール」（knob into hole）モデル
によって抗体重鎖の一部のアミノ酸を改変しており、二重特異性抗体の調製実現に成功し
ている（非特許文献４、非特許文献２）。「ノブ・イントゥ・ホール」モデルは最初Cric
kによって提示されたものであり、これにより、隣り合うαヘリックス間のアミノ酸側鎖
が折り畳まれるという問題が解決された（非特許文献５）。Carter他は、Ｆｃ領域の１本
目の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて側鎖の小さい１つのアミノ酸を側鎖の大きい１つのア
ミノ酸に変異させることによって１つの「ノブ」（例えば、Ｔ３６６Ｙ）を作り出し、２
本目の重鎖のＣＨ３における或るいくつかのアミノ酸を側鎖の小さいアミノ酸に変異させ
て「ホール」（Ｙ４０７Ｔ等）を作り出した。「ノブ・イントゥ・ホール」モデルの原理
は「ノブ・イントゥ・ホール」の相互作用でヘテロダイマーの形成をサポートするという
ものであるが、「ノブ－ノブ」モデル及び「ホール－ホール」モデルはホモダイマーの形
成を阻害する。彼らはさらに、「ノブ・イントゥ・ホール」の変異を基礎としてＣＨ３ド
メイン内のジスフィルド結合を導入することでヘテロダイマーの結合能を強化した。しか
しながら、彼らの研究結果では、「ホール－ホール」モデルにおけるホモダイマーの形成
阻害能力は依然として不十分である。その後、この研究グループはランダム変異－ファー
ジディスプレイ等の方法によってヘテロダイマーの含有率を更に向上させようと試みてい
るが、問題は依然として根本的に解決されていない。ヘテロダイマーの比率を高めるため
に、さらに、２種類の抗体をそれぞれ調製することによってｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて分
子間のジスフィルド結合の還元－再対合の方法でヘテロダイマーを形成する研究があるが
、その調製工程は明らかに複雑すぎるものである。
したがって、この分野では依然として、さらにヘテロダイマータンパク質の形成を強化
すると共にホモダイマータンパク質の形成を弱める好適な変異を探求する必要がある。
Wolf, Hofmeister et al. 2005 Carter 2001 Chames and Baty 2009 Ridgway, Presta et al. 1996 Crick 1952
本願に記載の発明は、イオン作用、疎水性相互作用及び空間作用等の界面アミノ酸間の
種々の相互作用を総合的に考慮することによって、ホモダイマーを形成せずにヘテロダイ
マーを形成する傾向がより一層ある有益なＣＨ３変異配列をスクリーニングしており、こ
れにより、ヘテロダイマー分子の生産量が大幅に向上した。
一態様では、本願に記載の発明は、抗体の重鎖定常領域の第１のＣＨ３ドメインを含む
第１のポリペプチド鎖と、抗体の重鎖定常領域の第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリ
ペプチド鎖とを含み、
上記第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメインとが、対応する野生型ヒト抗体の
重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに比べて、以下の（１）～（３）に示される位置のアミノ
酸の変異、すなわち、
（１）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９及びＴ３６６に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＤ３５６、Ｔ３６６、Ｌ３６８及びＹ４０７に変異が生じ、さらに、該第１のＣＨ
３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ドメインが、Ｆ４０５、Ｋ４０９、Ｋ３６０、Ｑ３４
７及びＬ３６８から選択される１つ～３つのアミノ酸の位置に変異があることと、
（２）第１のＣＨ３ドメインのＴ３６６及びＫ４０９に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＴ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７及びＦ４０５に変異が生じ、さらに、任意選択によ
り、該第１のＣＨ３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ドメインが、Ｋ３９２、Ｄ３９９、
Ｙ３４９、Ｓ３５４及びＥ３５７から選択される１つ～２つのアミノ酸の位置に変異があ
ることと、
（３）第１のＣＨ３ドメインのＴ３６６及びＦ４０５に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＴ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７及びＫ４０９に変異が生じ、さらに、任意選択によ
り、該第１のＣＨ３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ドメインが、Ｋ３９２、Ｄ３９９、
Ｙ３４９、Ｓ３５４及びＥ３５７から選択される１つ～２つのアミノ酸の位置に変異があ
ることと、
から選択されるいずれかを含み、
上述したアミノ酸の位置が、抗体ＦｃのＫＡＢＡＴがナンバリングしたＥＵインデック
スに基づいて確定される、ヘテロダイマー分子に関する。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメイン
とが、上述した第（２）項又は第（３）項の変異を含み、Ｙ３４９Ｃ及びＤ３５６Ｃの変
異を含んでいない。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ド
メインが、以下の変異、すなわち、
１ａ）第２のＣＨ３ドメインのＦ４０５に変異が生じたことと、
１ｂ）第１のＣＨ３ドメインのＦ４０５に変異が生じたことと、
１ｃ）第１のＣＨ３ドメインのＫ４０９に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメインのＦ４０
５に変異が生じたことと、
１ｄ）第１のＣＨ３ドメインのＦ４０５、Ｋ３６０及びＱ３４７に変異が生じ、第２の
ＣＨ３ドメインのＱ３４７に変異が生じたことと、
１ｅ）第１のＣＨ３ドメインのＦ４０５及びＱ３４７に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＫ３６０及びＱ３４７に変異が生じたことと、
１ｆ）第１のＣＨ３ドメインのＫ４０９、Ｋ３６０及びＱ３４７に変異が生じ、第２の
ＣＨ３ドメインのＦ４０５及びＱ３４７に変異が生じたことと、
１ｇ）第１のＣＨ３ドメインのＫ４０９及びＱ３４７に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＦ４０５、Ｋ３６０及びＱ３４７に変異が生じたことと、
１ｈ）第１のＣＨ３ドメインのＫ４０９及びＬ３６８に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＦ４０５に変異が生じたことと、
から選択されるいずれかを更に含んでいる。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ド
メインが、任意選択により、以下の変異、すなわち、
２ａ）第１のＣＨ３ドメインのＫ３９２に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメインのＤ３９
９に変異が生じたことと、
２ｂ）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５
７に変異が生じたことと、
２ｃ）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９及びＳ３５４に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメ
インのＥ３５７に変異が生じたことと、
から選択されるいずれかを更に含んでいる。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ド
メインが、任意選択により、以下の変異、すなわち、
３ａ）第１のＣＨ３ドメインのＤ３９９に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメインのＫ３９
２に変異が生じたことと、
３ｂ）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９に変異が生じ、第２のＣＨ３ドメインのＥ３５
７に変異が生じたことと、
３ｃ）第１のＣＨ３ドメインのＹ３４９及びＳ３５４Ｄに変異が生じ、第２のＣＨ３ド
メインのＥ３５７に変異が生じたことと、
から選択されるいずれかを更に含んでいる。
或るいくつかの実施の形態では、上記各変異が、それぞれ独立に、非荷電アミノ酸から
荷電アミノ酸への変異、荷電アミノ酸から非荷電アミノ酸への変異、及び荷電アミノ酸か
ら反対の電荷を持つアミノ酸への変異から選択される。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメイン及び／又は第２のＣＨ３ド
メインにおける変異が、Ｙ３４９Ｃ、Ｙ３４９Ｄ、Ｄ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ
、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ｇ、Ｆ４０５Ｋ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、Ｋ４０
９Ｅ、Ｋ４０９Ａ、Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｋ３９２Ｄ、Ｄ３９９Ｓ、Ｅ
３５７Ａ及びＳ３５４Ｄから選択される１つ以上の変異を含んでいる。例えば、上記変異
は、Ｙ３４９Ｃ、Ｙ３４９Ｄ、Ｄ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３
６８Ｅ、Ｌ３６８Ｇ、Ｆ４０５Ｋ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ａ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ａ、
Ｋ３６０Ｅ、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｋ３９２Ｄ、Ｄ３９９Ｓ、Ｅ３５７Ａ及びＳ３５
４Ｄから選択される１つ以上の変異とすることができる。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインには、Ｙ３４９、Ｔ３６６
、Ｆ４０５、Ｋ４０９、Ｌ３６８、Ｋ３９２、Ｓ３４５及び／又はＤ３９９の群から選択
される１つ以上における（例えば、少なくとも１つにおける、少なくとも２つにおける、
少なくとも３つにおける、少なくとも４つにおける、少なくとも５つにおける、少なくと
も６つにおける、少なくとも７つにおける又は少なくとも８つにおける）変異が含まれて
いる。
或るいくつかの実施の形態では、上記第２のＣＨ３ドメインには、Ｄ３５６、Ｔ３６６
、Ｌ３６８、Ｙ４０７、Ｆ４０５、Ｄ３９９、Ｅ３５７、Ｋ４０９及び／又はＫ３９２の
群から選択される１つ以上における（例えば、少なくとも１つにおける、少なくとも２つ
における、少なくとも３つにおける、少なくとも４つにおける、少なくとも５つにおける
、少なくとも６つにおける、少なくとも７つにおける、少なくとも８つにおける又は少な
くとも９つにおける）変異が含まれている。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインには、Ｙ３４９、Ｔ３６６
、Ｆ４０５、Ｋ４０９、Ｌ３６８、Ｋ３９２、Ｓ３４５及び／又はＤ３９９の群から選択
される１つ以上における（例えば、少なくとも１つにおける、少なくとも２つにおける、
少なくとも３つにおける、少なくとも４つにおける、少なくとも５つにおける、少なくと
も６つにおける、少なくとも７つにおける又は少なくとも８つにおける）変異が含まれ、
上記第２のＣＨ３ドメインには、Ｄ３５６、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７、Ｆ４０５、
Ｄ３９９、Ｅ３５７、Ｋ４０９及び／又はＫ３９２の群から選択される１つ以上における
（例えば、少なくとも１つにおける、少なくとも２つにおける、少なくとも３つにおける
、少なくとも４つにおける、少なくとも５つにおける、少なくとも６つにおける、少なく
とも７つにおける、少なくとも８つにおける又は少なくとも９つにおける）変異が含まれ
ている。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインには、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６
６Ｗ、Ｆ４０５Ｋ、Ｋ４０９Ａ、Ｌ３６８Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｙ３４９Ｄ、Ｓ３４５Ｄ及び
／又はＤ３９９Ｓの群から選択される１つ以上（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２
つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７
つ、少なくとも８つ又は少なくとも９つ）の変異が含まれている。
或るいくつかの実施の形態では、上記第２のＣＨ３ドメインには、Ｄ３５６Ｃ、Ｔ３６
６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｆ４０５Ｋ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３６８Ｇ、Ｙ４０７Ａ、Ｅ
３５７Ａ、Ｋ４０９Ａ及び／又はＫ３９２Ｄの群から選択される１つ以上（例えば、少な
くとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少な
くとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個又は
少なくとも１１個）の変異が含まれている。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインには、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６
６Ｗ、Ｆ４０５Ｋ、Ｋ４０９Ａ、Ｌ３６８Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｙ３４９Ｄ、Ｓ３４５Ｄ及び
／又はＤ３９９Ｓの群から選択される１つ以上（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２
つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７
つ、少なくとも８つ又は少なくとも９つ）の変異が含まれ、上記第２のＣＨ３ドメインに
は、Ｄ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｆ４０５Ｋ、Ｄ３９９Ｓ、Ｌ３
６８Ｇ、Ｙ４０７Ａ、Ｅ３５７Ａ、Ｋ４０９Ａ及び／又はＫ３９２Ｄの群から選択される
１つ以上（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ
、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ
、少なくとも１０個又は少なくとも１１個）の変異が含まれている。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメイン
とが、
１）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５
６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋと、
２）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ、第２のＣＨ３ドメ
イン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖと、
３）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ｅ、第２のＣＨ３ドメ
イン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋと、
４）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ、第２のＣＨ３ドメ
イン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋと、
５）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｋ３６０Ｅ＋Ｑ３
４７Ｅ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｑ
３４７Ｒと、
６）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｑ３４７Ｒ、第２
のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ３６０Ｅ＋Ｑ
３４７Ｅと、
７）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｋ３６０Ｅ＋Ｑ３
４７Ｅ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ
４０５Ｋ＋Ｑ３４７Ｒと、
８）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｑ３４７Ｒ、第２
のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｋ
３６０Ｅ＋Ｑ３４７Ｅと、
９）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｌ３６８Ｅ、第２
のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋと、
１０）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｋ３９２Ｄ、第２のＣＨ３ド
メイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｄ３９９Ｓ＋Ｆ４０５Ｋと、
１１）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３
６６Ｓ＋Ｌ３６８Ｇ＋Ｙ４０７Ａ＋Ｆ４０５Ｋと、
１２）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｙ３４９Ｄ、第２のＣＨ３ド
メイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｅ３５７Ａと、
１３）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｙ３４９Ｄ＋Ｓ３４５Ｄ、第
２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｅ３５７Ａと
、
１４）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３
６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ４０９Ａと、
１５）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｄ３９９Ｓ、第２のＣＨ３ド
メイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｋ３９２Ｄと、
１６）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３
６６Ｓ＋Ｌ３６８Ｇ＋Ｙ４０７Ａ＋Ｋ４０９Ａと、
１７）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｙ３４９Ｄ、第２のＣＨ３ド
メイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｅ３５７Ａと、
１８）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｙ３４９Ｄ＋Ｓ３４５Ｄ、第
２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｅ３５７Ａと
、
の群から選択される変異を含んでいる。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメイン
とが、
２）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ、第２のＣＨ３ドメ
イン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖと、
４）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ、第２のＣＨ３ドメ
イン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋと、
９）第１のＣＨ３ドメイン：Ｙ３４９Ｃ＋Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｌ３６８Ｅ、第２
のＣＨ３ドメイン：Ｄ３５６Ｃ＋Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋと、
１０）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｋ３９２Ｄ、第２のＣＨ３ド
メイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｄ３９９Ｓ＋Ｆ４０５Ｋと、
１１）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３
６６Ｓ＋Ｌ３６８Ｇ＋Ｙ４０７Ａ＋Ｆ４０５Ｋと、
１３）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｙ３４９Ｄ＋Ｓ３４５Ｄ、第
２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｅ３５７Ａと
、
１５）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｄ３９９Ｓ、第２のＣＨ３ド
メイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｋ３９２Ｄと、
１６）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３
６６Ｓ＋Ｌ３６８Ｇ＋Ｙ４０７Ａ＋Ｋ４０９Ａと、
１８）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｙ３４９Ｄ＋Ｓ３４５Ｄ、第
２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｅ３５７Ａと
、
の群から選択される変異を含んでいる。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖
とが、それぞれ抗体の重鎖定常領域のＣＨ２ドメインを更に含んでいる。或るいくつかの
実施の形態では、上記ＣＨ２ドメインが、ＣＨ３ドメインのＮ末端に位置しており、ＣＨ
３ドメインのＮ末端と直接連結されるか、又はＣ－ペプチドによって連結されている。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖
とが、それぞれ抗体の重鎖定常領域のヒンジ領域又はヒンジ領域の一部を更に含んでいる
。或るいくつかの実施の形態では、上記ヒンジ領域の一部が、Ｄ２２１－Ｐ２３０である
。
或るいくつかの実施の形態では、上記ヒンジ領域又はヒンジ領域の一部が、ＣＨ３ドメ
インのＮ末端に位置しており、ＣＨ２ドメインが存在する場合には、上記ヒンジ領域又は
ヒンジ領域の一部が、さらに、ＣＨ２ドメインのＮ末端に位置しており、ＣＨ２ドメイン
又はＣＨ３ドメインと直接連結されるか、又はＣ－ペプチドによって連結されている。
或るいくつかの実施の形態では、上記野生型ヒト抗体の重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン
が、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）の重鎖定常領域
のＣＨ３ドメイン、ヒトＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）の重鎖定常領域のＣＨ３
ドメイン、ヒトＩｇＤの重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン、ヒトＩｇＥの重鎖定常領域のＣ
Ｈ３ドメイン、及びヒトＩｇＭの重鎖定常領域のＣＨ３ドメインから選択される。
或るいくつかの実施の形態では、上記野生型ヒト抗体の重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン
が、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域のＣＨ３ドメインである。
或るいくつかの実施の形態では、上記第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプ
チド鎖が、例えば抗原結合領域、受容体結合領域又は酵素結合領域のような分子結合領域
を更に含んでいる。或るいくつかの実施の形態では、上記抗原結合領域が、抗体の可変領
域を含んでいる。
或るいくつかの実施の形態では、上記ヘテロダイマー分子が、二重特異性抗体、二重特
異性融合タンパク質、又は抗体－融合タンパク質キメラである。
別の態様では、本願は、本願に記載のいずれかのヘテロダイマー分子と、任意選択の薬
学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む、組成物（例えば、医薬組成物）に関する。
本願は更に、本願に記載のヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖若しくは第２の
ポリペプチド鎖をコードするか、又は本願に記載のヘテロダイマー分子の第１のポリペプ
チド鎖及び第２のポリペプチド鎖をコードする、核酸分子に関する。
本願は更に、本願に記載の核酸分子を含む、ベクターに関する。
本願は更に、本願に記載のベクターを含む、宿主細胞に関する。
本願は更に、上記ヘテロダイマー分子、組成物、核酸分子、ベクター又は宿主細胞の、
二重特異性抗体、二重特異性融合タンパク質、及び抗体－融合タンパク質キメラの調製に
おける用途に関する。
本願は更に、本願に記載の宿主細胞を用いて上記ヘテロダイマー分子を発現させる工程
を含む、ヘテロダイマー分子の調製方法に関する。
上記ヘテロダイマー分子の調製方法の或るいくつかの実施の形態では、上記宿主細胞が
、上記ヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖をコードするベクターと、第２のポリ
ペプチド鎖をコードするベクターとを同時に含んでおり、該方法は、上記宿主細胞を用い
て上記ヘテロダイマー分子を発現させ、回収し、取得することを含んでいる。
上記ヘテロダイマー分子の調製方法の或るいくつかの実施の形態では、上記宿主細胞が
、第１群の細胞と、第２群の細胞とを含み、上記第１群の細胞と、第２群の細胞とが、上
記ヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖をコードするベクター及び第２のポリペプ
チド鎖をコードするベクターをそれぞれ含んでおり、該方法は、上記第１のポリペプチド
鎖及び第２のポリペプチド鎖をそれぞれ上記第１群の細胞及び上記第２群の細胞で発現さ
せて上記第１のポリペプチド鎖のホモダイマー及び上記第２のポリペプチド鎖のホモダイ
マーを形成し、その後、上記第１のポリペプチド鎖のホモダイマーと、上記第２のポリペ
プチド鎖のホモダイマーとを適切な条件で混合し、上記ヘテロダイマー分子を調製して取
得することを含んでいる。或るいくつかの実施の形態では、該方法は、上記第１のポリペ
プチド鎖のホモダイマーと、上記第２のポリペプチド鎖のホモダイマーとを還元してモノ
マーに解離し、混合し、酸化させ、その後、精製し、上記ヘテロダイマー分子を調製して
取得することを更に含んでいる。或るいくつかの実施の形態では、上記宿主細胞が、上記
ヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖をコードするベクター及び第２のポリペプチ
ド鎖をコードするベクターをそれぞれ含んでおり、第１のポリペプチド鎖及び第２のポリ
ペプチド鎖が、それぞれ２つの宿主細胞で発現して第１のポリペプチド鎖のホモダイマー
及び第２のポリペプチド鎖のホモダイマーを形成し、その後、上記第１のポリペプチド鎖
のホモダイマーと、上記第２のポリペプチド鎖のホモダイマーとを適切な条件で還元し、
混合し、酸化させ、その後、精製し、上記ヘテロダイマー分子を調製して取得する。
上記ヘテロダイマー分子の調製方法の或るいくつかの実施の形態では、それぞれ上記第
１群の細胞と、上記第２群の細胞とに対して、上記第１のポリペプチド鎖又は上記第２の
ポリペプチド鎖を含む構築体又はベクターをトランスフェクションする。上記トランスフ
ェクションは、一過性トランスフェクションとすることができる。トランスフェクション
では、上記第１のポリペプチド鎖を含む構築体又はベクターと、上記第２のポリペプチド
鎖を含む構築体又はベクターとのモル比を１：４～４：１、例えば１：２～２：１、例え
ば約１：１とすることができる。
以下の詳細な説明から、当業者は、本開示の他の態様及び利点を容易に理解することが
できる。以下の詳細な説明には、単に本開示の例示的な実施形態が示され、記載されてい
るにすぎない。当業者に理解されるように、本開示の内容は、本願に係る発明の趣旨及び
範囲を逸脱しない限り、開示される具体的な実施形態を当業者が改変することができる。
これに対応して、本願の図面及び明細書の記載は、単に例示的なものにすぎず、限定する
ものではない。
ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマーの一過性発現の電気泳動分析結果を示す図である。４％～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動を用いた。レーンは、１から７まで順に、タンパク質分子量マーカー、変異の組合せＫＨ、変異の組合せ１、変異の組合せ２、変異の組合せ３、変異の組合せ４、野生型陰性対照の組合せである。各産物に含まれるホモダイマー及びヘテロダイマーは、分子量の違いによりゲル電気泳動における泳動距離が異なっている。図には、それぞれのホモダイマー又はヘテロダイマーのタンパク質の所在位置が示されている。 ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマーの一過性発現の電気泳動分析結果を示す図である。１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質ゲル電気泳動を用いた。レーンは、１から９まで順に、変異の組合せ９、変異の組合せ８、変異の組合せ７、変異の組合せ４、変異の組合せ６、変異の組合せ５、変異の組合せ２、ブランク対照（細胞上清）及びタンパク質分子量マーカーである。各産物に含まれるホモダイマー及びヘテロダイマーは、分子量の違いによりゲル電気泳動における泳動距離が異なっている。図１と同様に、上から下へ、それぞれＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃホモダイマー、ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマー、及びＦｃ／Ｆｃホモダイマーである。 変異の組合せ４におけるヘテロダイマーＦｃのＣＨ３－ＣＨ３界面の部分的結晶構造図である。変異したアミノ酸残基は短い棒で示されており、具体的に含まれる、互いに接触した変異アミノ酸残基対は、Ｔ３６６Ｗ／Ａ鎖－Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ／Ｂ鎖、Ｋ４０９Ａ／Ａ鎖－Ｆ４０５Ｋ／Ｂ鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ａ鎖－Ｙ３４９Ｃ／Ｂ鎖である。Ａ鎖（左側の色がやや薄い鎖）は緑色で示され、Ｂ鎖（右側の色がやや濃い鎖）はベビーブルーで示されている。 Ｆ４０５Ｋ－Ｋ４０９Ａ対の変異アミノ酸残基において、Ｄ３９９Ｓ－Ｋ３９２Ｄ対の新たな変異を近傍に導入して、より一層ヘテロダイマー間の相互吸引を増強すると共に、ホモダイマー間の相互反発の力を増加させることができることを示す図である。図４Ａは、新たな変異の導入の際の、Ｆ４０５Ｋ－Ｋ４０９Ａの変異の近傍の界面アミノ酸に対する相互作用を示している。図４Ｂは、新たな変異の導入後にもたらされた相互作用の変化を示している。
以下、特定の具体的な実例により本発明の実施形態を説明するが、当業者は本明細書に
開示の内容を通じて本発明の他の利点及び効果を理解し得る。
本願において、上記第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖とが、いずれも抗
体ＦｃフラグメントのＣＨ３ドメインを含んでおり、２本のポリペプチド鎖間では、ＣＨ
３ドメイン又はＣＨ３ドメインを含むＦｃフラグメントによって相互作用が生じて、二量
体、特にヘテロダイマーが形成される。ヘテロダイマーの２本のポリペプチド鎖は、異な
る組合せ、例えば、第１のポリペプチド鎖が抗体であり、第２のポリペプチド鎖が融合タ
ンパク質である組合せ、２本のポリペプチド鎖がいずれも融合タンパク質である組合せ、
又は２本のポリペプチド鎖がいずれも抗体である組合せ（例えば、異なる抗原又は抗原エ
ピトープを標的とする抗体）であってもよい。融合タンパク質が抗体のＦｃフラグメント
と細胞接着分子の細胞外ドメインとを含む場合には、イムノアドヘシンともいう。上記細
胞接着分子は、主に特異的リガンドの細胞表面受容体を同定することができる分子をいい
、例えば、カドヘリン、セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、インテグリン
及びヒアルアドヘリンが含まれる。
本願において、上記ＣＨ３ドメインは、抗体Ｆｃフラグメントに由来し、例えば、ヒト
の抗体Ｆｃフラグメント（例えば、ヒト抗体の重鎖定常領域のＦｃフラグメント）に由来
する。或るいくつかの実施形態では、上記ＣＨ３ドメインは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ
）の重鎖定常領域のＦｃフラグメントに由来し、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ（例えば、Ｉｇ
Ｇ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、Ｉｇ
Ｅ及び／又はＩｇＤの重鎖定常領域のＦｃフラグメントに由来する。或るいくつかの実施
形態では、本願に記載のＣＨ３ドメイン（例えば、上記野生型ヒト抗体の重鎖定常領域の
ＣＨ３ドメイン）は、野生型ヒトＩｇＧ１に由来し、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１抗体の
重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに由来する。通常の場合、上記ヒト抗体Ｆｃフラグメント
のＣＨ３ドメインは、対応する野生型ヒト抗体Ｆｃフラグメントに由来する。野生型ヒト
抗体Ｆｃフラグメントとは、ヒトの自然個体群における抗体Ｆｃフラグメント、例えば、
人為突然変異又は人工修飾されていないヒト抗体Ｆｃフラグメントをいう。或るいくつか
の実施形態では、本願に記載のヒト抗体Ｆｃフラグメントには、対応する野生型ヒト抗体
Ｆｃ配列における個々のアミノ酸の変更も含まれ、例えば、グリコシル化部位で変異した
或るいくつかのアミノ酸又は他のナンセンス突然変異が含まれ、「ノブ・イントゥ・ホー
ル」モデルにより変異した個々のアミノ酸の変更も含まれる。例えば、ＣＨ３ドメイン及
びＣＨ２ドメインについては、本願で提示した変異のほか、抗体（特に、Ｆｃフラグメン
ト）の機能に影響しない他の変異が更に含まれていてもよい。
本願において、第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖にヒンジ領域が
含まれる場合には、当該ヒンジ領域は、柔軟なフラグメントとして２つのポリペプチド間
を連結し、それによって、各ポリペプチド鎖の機能を確保する。当業者は、必要に応じて
ヒンジ領域の長さを選択することができ、例えば、全長の配列又はそのうちの一部の配列
を選択することができる。
本願において、上記Ｆｃ又はそのＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン若しくはヒンジ領域
におけるアミノ酸の位置の番号は、いずれもＫａｂａｔのＥＵナンバリングインデックス
の位置に基づいて特定される。当業者に知られるように、上述領域では、アミノ酸の挿入
、欠失又は他の変異によりアミノ酸配列が変化しても、ＫａｂａｔのＥＵナンバリングイ
ンデックスに基づいて特定される、標準配列に対応した各アミノ酸の位置番号は、依然と
して変わらない。
本願において、ヒト抗体の重鎖定常領域は、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４のう
ちの２つ以上のドメインと抗体のヒンジ領域との組合せを含むことができる。或るいくつ
かの実施形態では、上記ヒト抗体Ｆｃフラグメントには、少なくとも１つの抗体ヒンジ領
域と、１つのＣＨ２ドメインと、１つのＣＨ３ドメインとが含まれる。或るいくつかの実
施形態では、上記ＣＨ２ドメインは、ＥＵナンバリングシステムによるアミノ酸２２８～
３４０に対応したヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域のＣＨ２ドメインである。或るいくつかの
実施形態では、上記ＣＨ２ドメインは、本願に記載の他のいずれかの抗体アイソタイプの
該当する領域に対応している。或るいくつかの実施形態では、上記ＣＨ３ドメインは、Ｅ
Ｕナンバリングシステムによるアミノ酸３４１～４４７に対応したヒトＩｇＧ１の重鎖定
常領域のＣＨ３ドメインである。或るいくつかの実施形態では、上記ＣＨ３ドメインは、
本願に記載の他のいずれかの抗体アイソタイプの該当する領域に対応している。
本願において、上記荷電アミノ酸には、アルギニン、リシン、アスパラギン酸及びグル
タミン酸が含まれる。
本願において、ヘテロダイマー分子は、標準的実験手段によって宿主細胞から精製する
ことができる。例えば、ヘテロダイマータンパク質に抗体Ｆｃフラグメントが含まれてい
る場合には、プロテインＡを用いて精製することができる。精製方法は、クロマトグラフ
ィー法、例えばサイズ排除法、イオン交換法、アフィニティークロマトグラフィー法及び
限外濾過法、又は上記種々の方法の適切な組合せを含むが、これらに限定されるものでは
ない。
本願において、上記ＥＵインデックスは、例えば、Kabat他、Sequences of Proteins o
f Immunological Interest、第５版、Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD.(1991)に記載されている。
本願に記載の発明は、イオン作用、疎水性相互作用及び空間作用等の界面アミノ酸間の
種々の相互作用を総合的に考慮することによって、ホモダイマーを形成せずにヘテロダイ
マーを形成する傾向がより一層ある好適なＣＨ３変異配列をスクリーニングしており、こ
れにより、ヘテロダイマー分子の生産量が大幅に向上した。また、本願のいくつかの実施
形態では、Ｆｃフラグメントを含むヘテロダイマータンパク質の結晶を調製し、結晶構造
に対する解析及び３次元構造モデリングによって、界面アミノ酸間の直接的な相互作用を
より一層理解すると共に、Ｙ３４９ＣとＤ３５６Ｃとの両システイン間に安定したジスフ
ィルド結合が必然的に形成されるという従来考えられていた見方を排除しており、これを
基にして行われる変異の組合せは、ヘテロダイマーの形成にはより有利であり、ホモダイ
マーの形成にはより不利であり、ヘテロダイマーの比率が大幅に向上すると同時にホモダ
イマーの比率が大幅に低減された。
以下、実施例を参照して本願に記載の発明の実施形態を詳細に説明するが、以下の実施
例は単に本願に記載の発明を例示的に説明しているにすぎず、本願に記載の発明の範囲を
限定するものとみなすべきでないことが当業者には理解されよう。具体的な条件が与えら
れていない実施例は、従来の条件又は製造者により提示された条件に従って実施される。
製造業者が与えられていない試薬又は機器は、全て従来の市販製品である。
実施例１：１回目の変異における組合せの配列候補の取得
１、Ｆｃの構造モデリング及び界面アミノ酸の取得
タンパク質構造データバンク（ＰＤＢ、www.pdb.org）からＦｃ領域を含む４８個のヒ
トＩｇＧ１抗体の結晶構造を取得し、構造類似性検索アルゴリズム（参考文献：Yuzhen Y
e and Adam Godzik. FATCAT: a web server for flexible structure comparison and st
ructure similarity searching. Nucleic Acids Res., 2004, 32(Web Server issue):W58
2-585.）によって、４８個の抗体のＦｃフラグメントが１ＤＮ２（ＰＤＢ番号）に由来し
ていることを得た。
タンパク質接触アミノ酸認識ソフトウェアＣＭＡ（ＵＲＬ：http://ligin.weizmann.ac
.il/cma/）を用い、アミノ酸が作用する距離に基づいてスクリーニングし、抗体（ＰＤＢ
番号：１ＤＮ２）におけるＣＨ３－ＣＨ３間のアミノ酸接触を認識した。アミノ酸接触ル
ールに基づいて、界面アミノ酸とは、側鎖の重原子と、別の１本の鎖のいずれか１つのア
ミノ酸の重原子との間の距離が或る閾値よりも低いいくつかのアミノ酸を指す。本実施例
の閾値として４．５オングストロームを選択したが、５．５オングストロームを選択する
こともできる（文献：B. Erman, I. Bahar and R. L. Jernigan. Equilibrium states of
rigid bodies with multiple interaction sites. Application to protein helices. J
. Chem. Phys. 1997, 107:2046-2059.）。ヒト及びマウスのＩｇＧサブタイプのアミノ酸
接触界面の保存状況は多重整列によって取得することができる。表１は、アミノ酸接触に
よってスクリーニングした（すなわち、アミノ酸の距離が４．５オングストローム未満の
）抗体１ＤＮ２の３４個の界面アミノ酸であり、なお、Ａ鎖及びＢ鎖は、それぞれ抗体１
ＤＮ２の第１鎖及び第２鎖を示している。以下のアミノ酸の位置は、抗体ＦｃのＫＡＢＡ
ＴがナンバリングしたＥＵインデックスに基づいて命名されたものである。
Figure 0007444381000001
２、アミノ酸の変異によるイオン作用の変化
表１の結果に基づき、接触アミノ酸対のうちの荷電アミノ基が含まれるアミノ酸対を選
択し、このうちの一方の鎖における１つのアミノ基を変異させ（非荷電アミノ酸から荷電
アミノ酸への変更、荷電アミノ酸から非荷電アミノ酸への変更、又は荷電アミノ酸の持つ
電荷の性質の変更）、それによって、ＦｃのＡ鎖とＦｃのＢ鎖との間のイオン作用を不均
衡にして、ホモダイマー形成の確率を低減させ、及び／又はヘテロダイマー形成の確率を
向上させた。
例示として、例えば、Ａ鎖のＰｈｅ４０５を変異させてＰｈｅ４０５Ｌｙｓ（Ｆ４０５
Ｋと書いてもよい）にするが、Ｂ鎖はそのままにする。４０５位のアミノ酸残基の周りで
Ｂ鎖に位置する接触アミノ酸残基にはＬｙｓが２つ含まれており、いずれも正電荷を帯び
たアミノ酸であるので、Ａ鎖とＡ鎖とが対になると、２本の鎖におけるＦ４０５Ｋの変異
による正電荷が極めて大きい斥力を引き起こすが、Ａ鎖とＢ鎖とが対になると、一方の鎖
（Ａ）でしかＦ４０５Ｋの変異により引き起こされる斥力がなく、他方の鎖（Ｂ）はＰｈ
ｅ４０５のままであり、斥力が引き起こされない。この場合、ＡＡ間の２本の鎖の相互反
発は、十分顕著であり、ＡＢ又はＢＢよりもはるかに大きいので、ＡＡのホモダイマーの
形成を効果的に低減させることができる。
Ａ鎖にＦ４０５Ｋの変異を導入すると共に、Ｂ鎖におけるＡ鎖のＦ４０５Ｋの変異残基
に対応した接触アミノ酸残基Ｌｙｓ４０９をＫ４０９Ｅ又はＫ４０９Ａに変異させた場合
、Ａ鎖とＡ鎖とが対になると、２本のＡ鎖におけるＦ４０５Ｋの変異による正電荷が依然
として極めて大きい斥力を引き起こすが、Ａ鎖とＢ鎖とが対になると、Ａ鎖にはＦ４０５
Ｋの変異があり、Ｂ鎖におけるＫ４０９Ｅ又はＫ４０９Ａの変異と作用して、斥力がなく
なり、さらには引力までも有するようになる（Ｋ４０９Ｅ）。しかしながら、Ｂ鎖とＢ鎖
とが対になると、斥力も引力も引き起こされない。この場合、ＡＡ間の２本の鎖の相互反
発は十分に顕著であり、ＡＢ間の斥力は低下するか、又は引力が引き起こされるので、Ａ
Ａのホモダイマーの形成を効果的に低減させると共に、ＡＢのヘテロダイマーの形成を促
進することができる。
このことから類推すると、本実施例で得られた変異の組合せは、次の表に示す通りであ
る。
Figure 0007444381000002
実施例２：ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマーの調製及び考察
１、変異したヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント及びＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を発現
させる組換えベクターの構築
タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔにおけるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（Ｉ
ｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列（Ｐ０１８５７）に基づいて、ヒトＩｇＧ１－Ｆｃの
領域のアミノ酸配列（配列番号１）を取得し、逆転写ＰＣＲによってヒトＰＢＭＣの全Ｒ
ＮＡからヒトＩｇＧ１－Ｆｃをコードする核酸断片（配列番号２、「Ｆｃ遺伝子」と命名
する）を取得し、オーバーラップＰＣＲによって、その５’末端にマウスｋａｐｐａＩＩ
Ｉシグナルペプチドのコード配列（配列番号３に示す）を加え、その後、ベクターｐｃＤ
ＮＡ４（Invitrogen、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）にサブクローニングして、ヒトＩｇＧ１－
Ｆｃ（「Ｆｃ」と略称する）タンパク質を哺乳動物細胞で発現させるための組換え発現ベ
クターを取得した。
配列番号５に示されるＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質のコード遺伝子（なお、ＳｃＦｖ
とは、抗ＨＥＲ２の一本鎖抗体をいう）を人工合成して取得した。当該遺伝子によりコー
ドされるＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質の配列は、配列番号４を参照されたい。その後、
哺乳動物細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ４（Invitrogen、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）にサブ
クローニングして、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を哺乳動物細胞で発現させるための組
換え発現ベクターを取得した。
実施例１の表２に基づき、オーバーラップＰＣＲ法によって、ｓｃＦＶ－Ｆｃ及びＦｃ
のコード遺伝子に対して組合せ突然変異誘発を行った。なお、Ａ鎖に対する変異はｓｃＦ
Ｖ－Ｆｃ融合タンパク質に位置し、Ｂ鎖に対する変異はＦｃタンパク質に位置している。
ｐｃＤＮＡ４（Invitrogen、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）に変異後の遺伝子をサブクローニン
グして、最終的にそれぞれ、変異したｓｃＦＶ－Ｆｃ融合タンパク質及び変異したＦｃタ
ンパク質を哺乳動物細胞で発現させるための組換え発現ベクターを取得した。
２、ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマーの一過性発現、及びヘテロダイマーの含有量に
対するそれぞれの変異の組合せの影響の検出
ステップ１の４つの変異の組合せ、ＫＨの組合せ（対照群とする）、それに加えて野生
型の組合せ（すなわち、変異していないＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質及びＦｃタンパク
質、陰性対照群とする）に対応する発現ベクターを、懸濁培養した２９３Ｈ細胞（ATCC、
ＣＲＬ－１５７３）にＰＥＩを用いてトランスフェクションした。変異の組合せ毎に、そ
れに対応するＡ鎖（ｓｃＦＶ－Ｆｃ融合タンパク質鎖をいう）及びＢ鎖（Ｆｃタンパク質
鎖をいう）の組換え発現ベクターの共トランスフェクションが含まれており、Ａ鎖及びＢ
鎖の組換え発現ベクターの共トランスフェクションの比率を１：１とした。５日～６日培
養した後に一過性発現培養上清を集め、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー
によって、予備精製された４組の変異の組合せ、ＫＨの変異の組合せ及び野生型の陰性対
照群の一過性トランスフェクション産物を取得した。これらの一過性トランスフェクショ
ン産物にはいずれも、それぞれの比率のホモダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｓｃ
Ｆｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）が含
まれている。この３つのタンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ、及
びＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の分子量のサイズが異なっているので、各産物におけるホモダ
イマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマー
タンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の構成状況を非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気
泳動によって検出することができ、また、ホモダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｓ
ｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の
比率をBioRad社から出されている画像解析専門ソフトウェアＩｍａｇｅＬａｂで解析した
。電気泳動の検出結果は、図１及び表３に示す通りである。
Figure 0007444381000003
野生型の陰性対照の組合せに対して、４組の変異の組合せ候補、及びＫＨの組合せにお
けるヘテロダイマー（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の比率は、いずれも顕著に増加している。
また、ＫＨを基にして新たな変異を導入した後にもヘテロダイマーの比率に変化が生じて
おり、あるものは格段に増加し（例えば、組合せ２、４）、あるものはほどほどに向上し
た（例えば、組合せ１、３）。なお、この数組の新たな変異の組合せには、接触面の側鎖
基の空間作用及びイオン作用の２つの主要な相互作用に対する調整が含まれているので、
ヘテロダイマーの含有量に対する影響の大きさは、単純に２つの作用の重畳を考えるだけ
ではいけない。例えば、Ｆ４０５Ｋという変異が導入されたことでホモダイマー間の斥力
が増大するのは同じだが、変異の組合せ２におけるヘテロダイマーの増加に対する効果は
変異の組合せ１よりもはるかに大きい（変異の組合せ２におけるヘテロダイマー含有量は
約７０％であるが、変異の組合せ１は約５８％である）。また、Ｋ４０９の部位に導入さ
れた変異については、変異の組合せ４に位置する非荷電の変異によるヘテロダイマー含有
量の増加（７７％）は、変異の組合せ３における反対の電荷の変異（５７％）よりもはる
かに優れている。しかしながら、２つの相互作用の重畳を単に理論的に考えると、この２
つの変異による効果は似ているはずである。
Ａ鎖及びＢ鎖の組換え発現ベクターの共トランスフェクションの比率のホモダイマー及
びヘテロダイマーの比率に対する影響を更に考察するために、比較的優れている２つの変
異の組合せ（２及び４）及びＫＨの組合せで用いる共トランスフェクション発現ベクター
を、懸濁培養した２９３Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）にそれぞれ４：１及び１：４
の比率でＰＥＩを用いてトランスフェクションし、５日～６日培養した後に細胞上清を集
めた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって、それぞれの一過性トラ
ンスフェクション産物を取得した。ホモダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ
－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の構成状
況を非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって検出した。具体的な結果は、表４
を参照されたい。結果からわかるように、組換え発現ベクターの共トランスフェクション
の比率は、産物におけるホモダイマー及びヘテロダイマーの比率に対して比較的明らかな
影響をもたらし得る。共トランスフェクションの比率が４：１であるか、１：４であるか
にかかわらず、その産物におけるヘテロダイマーの含有量はいずれも顕著に低下した。こ
の３つの組合せは、Ａ鎖とＢ鎖との発現が相対的に平衡である場合には、産物におけるヘ
テロダイマーの比率を極めて大きく増加させ、ホモダイマーの比率を低下させることがで
きるが、産物においてＡ鎖とＢ鎖との発現が平衡しておらず、Ａ鎖又はＢ鎖が過剰になる
場合には、過剰な方のその産物は、ホモダイマーの形成比率が増加し、ヘテロダイマーの
含有量が相対的に低下することがこの結果からわかる。なお、ＫＨの組合せでは、いずれ
の鎖が過剰であるかにかかわらず、ヘテロダイマーの含有量が顕著に低くなった。変異の
組合せ２では、Ｂ鎖（Ｆｃ）の過剰による影響が比較的大きかった。変異の組合せ４では
、Ａ鎖（ＳｃＦｖ－Ｆｃ）の過剰による影響が比較的大きかった。ただし、変異の組合せ
２におけるＢ鎖又は変異の組合せ４におけるＡ鎖が過剰であっても、ヘテロダイマーの形
成比率は、いずれも依然として対照のＫＨの組合せよりも顕著に高かった。この結果を更
に分析するとわかるように、この３つの変異の組合せにおいて、Ａ鎖とＢ鎖との間の相互
作用は大幅に強化されたが、Ａ鎖とＡ鎖との間又はＢ鎖とＢ鎖との間の相互作用を弱める
程度は依然として十分でなく、だからこそ、このうちの一方の成分が発現過剰である場合
には、ホモダイマー及びヘテロダイマーの形成の平衡が破られて、より多くのホモダイマ
ーを産生させることになっている。なお、新たな変異の組合せ２及び変異の組合せ４はい
ずれも、ＫＨの組合せに比べて、ホモダイマーの形成を阻害する点では明らかに優れてい
る。
Figure 0007444381000004
実施例３：２回目の変異における組合せの配列候補の取得
実施例１及び実施例２で言及した好適なＦｃの変異の組合せ（変異の組合せ２及び変異
の組合せ４）を基に、既に開示されている野生型Ｆｃの３次元結晶構造に基づいて、界面
アミノ酸の変異を更に導入した。そのねらいは、更にＡ鎖－Ａ鎖間及びＢ鎖－Ｂ鎖間の相
互吸引を低減させ、ホモダイマータンパク質の形成を阻害することにある。
表１の結果に基づき、さらに、変異の組合せ２及び変異の組合せ４における変異部位近
傍に近い接触アミノ酸のうち、荷電アミノ酸が含まれる、対になるアミノ酸を選択し、こ
のうちの一方の鎖における１つのアミノ酸を変異させ（非荷電アミノ酸から荷電アミノ酸
への変更、荷電アミノ酸から非荷電アミノ酸への変更、又は荷電アミノ酸の持つ電荷の性
質の変更）、Ａ鎖とＢ鎖との間のイオン作用の不均衡性をより一層増大させて、ホモダイ
マー形成の確率を低減させるか、又は同時にヘテロダイマー形成の確率を向上させた。
例えば、Ａ鎖のＬｙｓ３６０とＢ鎖のＧｌｎ３４７との一対の接触アミノ酸を変異させ
て、それらの間のイオン作用を変化させた。このうちの一方の鎖（例えば、Ａ鎖）では、
この２つのアミノ酸残基を、負電荷を帯びたアミノ酸残基に変異させ、例えば、Ｋ３６０
Ｅ及びＱ３４７Ｅの２つの変異を導入した。また、他方の鎖（例えば、Ｂ鎖）では、この
うちの電荷を帯びていないアミノ酸残基を、正電荷を帯びたアミノ酸残基に変異させ、例
えば、Ｑ３４７Ｒの変異を導入した。この場合、Ａ鎖－Ａ鎖の相互作用の場合は３６０位
、３４７位で帯びた負電荷が相互に反発し、Ｂ鎖－Ｂ鎖の相互作用の場合はこの２つの部
位における正電荷が相互に反発し、Ａ鎖とＢ鎖との相互作用の場合にしか、それぞれの正
電荷、負電荷は相互吸引作用を生じない。この変異により、ＡＡ間及びＢＢ間の２本の鎖
の相互反発が増加し、同時にＡＢの２本の鎖の間の相互吸引が増加すると推測される。
また、Ｌｅｕ３６８というアミノ酸残基を考察した。この残基の周りには２つの荷電ア
ミノ酸残基Ｇｌｕ３５７及びＬｙｓ４０９がある。これまでに変異の組合せ４にＫ４０９
Ａの変異を導入したことを考慮して、この場合、Ｋ４０９Ａの変異が導入されたのと同じ
Ｆｃ鎖（実施例２に基づいてここではＡ鎖を指定する）において、さらに、Ｌｅｕ３６８
を、負電荷を帯びたアミノ酸残基（例えば、３６８Ｅ）に変異させた。このとき、Ａ鎖と
Ａ鎖とが対になると、２本の鎖におけるＬ３６８Ｅで帯びている負電荷がＥ３５７におけ
る負電荷と相互に作用し、斥力が引き起こされる。一方、Ａ鎖とＢ鎖とが対になると、Ａ
鎖におけるＬ３６８Ｅで帯びている負電荷とＢ鎖におけるＥ３５７の負電荷とが相互に反
発するが、同時にＢ鎖におけるＫ４０９と相互に吸引し、総合的には斥力又は引力が過度
に大きく引き起こされることはない。この変異により、ＡＡ間の２本の鎖の相互反発を増
大させるものの、ＡＢ又はＢＢの２本の鎖の間の相互作用に影響することはないと推測さ
れる。
実施例１及び実施例２で言及した好適なＦｃの変異の組合せ（変異の組合せ２及び変異
の組合せ４）を基に新たに導入される変異の組合せを加えて得られた変異の組合せは、表
５に示す通りである。
Figure 0007444381000005
実施例４：新たなＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマーの変異の組合せの調製及び考察
１、変異したヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント及びＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を発現
させる組換えベクターの構築
実施例２で構築された野生型ｓｃＦＶ－Ｆｃ及びＦｃタンパク質の発現組換えベクター
をテンプレートとし、実施例３の表５に基づき、オーバーラップＰＣＲ法によって、ｓｃ
ＦＶ－Ｆｃ及びＦｃのコード遺伝子に対して組合せ突然変異誘発を行った。なお、Ａ鎖に
対する変異はｓｃＦＶ－Ｆｃ融合タンパク質に位置し、Ｂ鎖に対する変異はＦｃタンパク
質に位置している。ｐｃＤＮＡ４（Invitrogen、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）に変異後の遺伝
子をサブクローニングして、最終的に、新たに変異したｓｃＦＶ－Ｆｃ融合タンパク質及
び変異したＦｃタンパク質を哺乳動物細胞で発現させるための組換え発現ベクターを取得
した。
２、ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃヘテロダイマーの一過性発現、及びヘテロダイマーの含有量に
対するそれぞれの変異の組合せの影響の検出
実施例２－２に記載の方法に従って、新たな５つの変異の組合せ（５～９）、及び１回
目の好適な変異の組合せ（２及び４）を２９３Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）で一過
性発現させた。なお、Ａ鎖及びＢ鎖の組換え発現ベクターの共トランスフェクションの比
率を１：１とした。５日～６日培養した後に、一過性発現培養上清を集め、プロテインＡ
アフィニティークロマトグラフィーによって、予備精製された新たな５組の変異の組合せ
、１回目の好適な２組の組合せの一過性トランスフェクション産物を取得した。これらの
一過性トランスフェクション産物にはいずれも、それぞれの比率のホモダイマータンパク
質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（Ｓ
ｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）が含まれている。この３つのタンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦ
ｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ、及びＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の分子量のサイズが異なっているの
で、各産物におけるホモダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／
Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の構成状況を非還元条件
でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動によって検出することができ、また、ホモダイマータンパ
ク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（
ＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｆｃ）の比率をBioRad社から出されている画像解析専門ソフトウェアＩ
ｍａｇｅＬａｂで解析した。電気泳動の検出結果は、図２及び表６に示す通りである。
Figure 0007444381000006
１回目の変異の好適な組合せと比べて、新たに導入された変異では、例えば、組合せ５
が組合せ２に対するように、ヘテロダイマーの生成比率がわずかに向上したものがいくつ
かあり、例えば、組合せ６が組合せ２に対し、組合せ７、８が組合せ４に対するように、
変化が少ないものが数組ある。また、組合せ９は新たな変異が導入されると却ってヘテロ
ダイマーの生成比率が大幅に低減し、これは、Ａ鎖に新たに導入されたＬ３６８Ｅによる
負電荷とＢ鎖におけるＥ３５７の負電荷との相互反発が、Ｂ鎖におけるＫ４０９との相互
吸引を上回って、ヘテロダイマーが不安定になるからであると推測される。総体的には、
新たに導入された変異は、ヘテロダイマーの形成を適切に助けるものが数組あるが、格段
に向上するわけではない。
Ａ鎖－Ａ鎖及びＢ鎖－Ｂ鎖のホモダイマーに対する新たに導入された変異の影響を更に
考察するために、Ａ鎖のタンパク質又はＢ鎖のタンパク質を個別に一過性発現させ、同じ
一過性トランスフェクション条件でのホモダイマータンパク質を発現させることによって
、そのホモダイマーの形成傾向を考察した。組換え発現ベクターは、懸濁培養した２９３
Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）にそれぞれＰＥＩを用いてトランスフェクションし、
５日～６日培養した後に細胞上清を集めた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフ
ィーによって、それぞれの一過性トランスフェクション産物を取得して、ＯＤ２８０でそ
の発現レベルを検出した。結果は、表７を参照されたい。発現レベルからみると、組合せ
４のＡ鎖に導入された一部の変異（組合せ８、組合せ９）は、そのホモダイマーの形成傾
向を低減することができ、組合せ２のＢ鎖に導入された一部の変異（組合せ５）は、その
ホモダイマーの形成傾向を低減することができ、その他の新たな変異は、ホモダイマーの
形成に対して影響が少なかった。また、この結果から更にわかるように、組合せ２及び組
合せ２から誘導された変異の組合せ（５、６）は、組合せ４及び組合せ４から誘導された
変異の組合せ（７、８、９）よりも、そのＡ鎖のホモダイマーの形成傾向が小さくなって
おり、後者のＢ鎖のホモダイマーの形成傾向は、前者よりも小さくなっている。この結果
は、実施例２で得られた結果と一致しており、この方法でホモダイマーの形成傾向を予備
考察することのフィージビリティも更に証明された。また、発現レベルからみると、全て
のＢ鎖がＡ鎖よりもはるかに低くなっている。野生型Ａ鎖及び野生型Ｂ鎖の個別の一過性
発現も行ったが、いずれの変異も導入されていない場合には、野生型Ｂ鎖のホモダイマー
の発現レベルは野生型Ａ鎖の発現レベルよりも低いことがわかった（前者は後者の約半分
である）。これにより、Ａ鎖におけるＦｃ配列のＮ末端にＳｃＦｖ配列が融合するとその
発現レベルの向上に有益であり、また、Ａ鎖とＢ鎖との発現レベルの違いがＡ鎖とＢ鎖と
のそれぞれのホモダイマーの形成傾向の違いに直接影響することはないと推定される。
Figure 0007444381000007
実施例５：３回目の変異における組合せの配列候補の取得
１、これまでの変異の組合せ（例えば、変異の組合せ２又は４）を基に更にホモダイマー
タンパク質の形成を阻害するか、又はヘテロダイマータンパク質の形成を促進するように
、変異の組合せ４の結晶構造に基づき、構造モデリングと突き合わせて、新たな接触界面
アミノ酸の変異の配列候補を探し出した。
変異の組合せ４のヘテロダイマータンパク質の結晶構造の解析
変異の組合せ４を選択し、２９３Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）で一過性発現させ
、精製して変異の組合せ４のヘテロダイマータンパク質を取得し、結晶構造を解析した。
ここで、変異の組合せ４のＢ鎖のＣ末端にＨｉｓタグ配列を分子クローニングによって挿
入することによって、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後にＩＭＡＣ法に
よってより純粋なＡ鎖－Ｂ鎖のヘテロダイマータンパク質を結晶化用に取得した。
結晶構造の解析プロセスは、次の通りである。
ヘテロダイマーのＦｃ結晶を次の条件で形成した。２μＬの結晶緩衝液（１５％のＰＥ
Ｇ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、０．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０）を２μＬのタンパク質溶
液（１０ｍｇ／ｍＬの目的タンパク質、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．４）に混合し、２２℃、静置した液滴で結晶化させた。約３日後に結晶が成長した
。その後、結晶を以下の溶液、すなわち、１７％のＰＥＧ３３５０、１ＭのＬｉＣｌ、０
．１ＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、及び２０％のグリセリンに置いた。続いて、液体窒素で急
速に湿潤させ冷凍した。Ｘ線回折データをＳＳＲＦ ＢＬ１７Ｕによって収集した。野生
型Ｆｃの構造（ＰＤＢアクセッション番号：３ＡＶＥ）をフレームワークとして分子置換
構造解析を行った。
結晶構造によると、変異後のＦｃヘテロダイマーは、その全体構造は野生型Ｆｃと類似
しているが、変異が導入されたＣＨ３界面ではそれぞれの基の相互作用によりやや変化し
ていた。ＣＨ３界面の具体的な結晶構造は、図３を参照されたい。
２、新たな変異における組合せ候補の取得
変異の組合せ４の結晶構造の結果に基づき、新たな変異候補を更にスクリーニングした
。
まず、結晶の３次元構造によって、Ａ鎖のＹ３４９ＣとＢ鎖のＤ３５６Ｃとが２つのＣ
ｙｓ側鎖基の方向の問題によりジスフィルド結合を形成することができず、一対の遊離ス
ルフヒドリル基となっていることがわかった。この結果に基づいて、３回目の変異ではこ
の対の変異を取り消し、これを変異前の野生型アミノ酸配列に還元させた。
第２に、３次元構造モデリングの比較によって、Ｆ４０５Ｋ－Ｋ４０９Ａの対の変異ア
ミノ酸残基対近傍に更に変異を導入して、イオン結合及び水素結合を変化させた。Ｋ４０
９ＡがＡ鎖に位置し、Ｆ４０５ＫがＢ鎖に位置していると仮定する。そこで、Ａ鎖にＫ３
９２Ｄの変異を導入し、Ｂ鎖にＤ３９９Ｓの変異を導入する。図４に示すように、Ａ鎖と
Ｂ鎖との間の相互作用については、新たに導入された変異対には、Ｋ３９２Ｄ－Ｆ４０５
Ｋの対のイオン結合と、Ｋ３９２Ｄ－Ｄ３９９Ｓの対の水素結合とがあり、ヘテロダイマ
ーの形成傾向を効果的に向上させることができると推測される。一方、Ａ鎖－Ａ鎖の相互
作用では、Ｋ３２９Ｄ－Ｄ３９９間の静電反発力が導入されて、Ａ鎖のホモダイマーの形
成が阻害される。Ｂ鎖－Ｂ鎖の相互作用では、これまでのＫ４０９－Ｄ３９９間のイオン
結合はＤ３９９Ｓの変異の導入により消失し、Ｂ鎖のホモダイマーの形成傾向が低減する
。
第３に、変異の組合せ４の結晶構造と野生型Ｆｃタンパク質の結晶構造とを比較して、
変異の組合せ４におけるＡ鎖に外側への移動がある（すなわち、Ｂ鎖から離れる）ことが
わかり、これはおそらくＡ鎖のＴ３６６Ｗの変異では大きくなった側鎖基により或る程度
立体障害がもたらされたからであると推測される。これを基に、さらに、Ｂ鎖におけるＡ
鎖のＴ３６６Ｗ残基に接触するアミノ酸残基を、より小さい側鎖基を有するアミノ酸残基
に変異させ、例えば、Ｂ鎖において、これまでのＹ４０７Ｖ及びＬ３６８Ａの変異をＹ４
０７Ａ及びＬ３８６Ｇの２つの変異に置換して、Ｔ３６６Ｗの変異のために十分な空間を
残すようにし、このようにすると、ヘテロダイマー構造がより安定する可能性がある。
第４に、Ｆ４０５Ｋ－Ｋ４０９Ａの対の変異アミノ酸残基対の周囲において他の接触界
面アミノ酸対を変異させて、界面の静電作用を変化させた。ここで、Ｙ３４９とＥ３５７
との対の接触アミノ酸を考察した。Ａ鎖にＹ３４９Ｄの変異を導入し、Ｂ鎖にＥ３５７Ａ
を導入する。すると、Ａ－Ａ間のＹ３４９ＤとＥ３５７Ａとの間で引き起こされた静電反
発力がＡ－Ａのホモダイマー形成を阻害し、Ａ－Ｂ間及びＢ－Ｂ間では新たな作用力は引
き起こされない。これを基に、Ａ鎖にＳ３５４Ｄの変異を更に導入し、Ｅ３５７Ａとの間
の静電反発力を強化して、Ａ－Ａのホモダイマーの形成を更に阻害する。
まず、変異の組合せ４を基に上述の変異を導入して得られた変異の組合せは、表８に示
す通りである。
Figure 0007444381000008
続いて、変異の組合せ２を基に上述の変異を導入すると共に変異の組合せ４を参考にし
て得られた変異の組合せは、表９に示す通りである。
Figure 0007444381000009
実施例６：３回目のＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃヘテロダイマーの変異の組合せの調製
及び考察
１、変異したヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント及びＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質を発現
させる組換えベクターの構築
単純なＦｃフラグメントの発現レベルがｓｃＦｖ－Ｆｃよりも低いことを考慮して、２
本の鎖の発現比率をより良く把握するために、元のＢ鎖（単純なＦｃ鎖）のＮ末端にラク
ダ単一ドメイン抗体の可変領域の配列（ＶｈＨと表記する）を融合した。配列番号３６に
示されるＶｈＨ－Ｆｃ融合タンパク質のコード遺伝子を人工合成して取得した。当該遺伝
子によりコードされるＶｈＨ－Ｆｃ融合タンパク質の配列は、配列番号３５を参照された
い。その後、哺乳動物細胞の発現ベクターｐｃＤＮＡ４（Invitrogen、Ｃａｔ Ｖ８６２
２０）にサブクローニングして、ＶｈＨ－Ｆｃ融合タンパク質を哺乳動物細胞で発現させ
るための組換え発現ベクターを取得した。
実施例２で構築された野生型ｓｃＦＶ－Ｆｃタンパク質の発現組換えベクター及び上述
のＶｈＨ－Ｆｃ融合タンパク質の組換え発現ベクターをテンプレートとし、実施例５の表
８に基づき、オーバーラップＰＣＲ法によって、ｓｃＦＶ－Ｆｃ及びＶｈＨ－Ｆｃのコー
ド遺伝子（配列番号５及び配列番号３６）に対して組合せ突然変異誘発を行った。なお、
Ａ鎖に対する変異はｓｃＦＶ－Ｆｃ融合タンパク質に位置し、Ｂ鎖に対する変異はＶｈＨ
－Ｆｃタンパク質に位置している。ｐｃＤＮＡ４（Invitrogen、Ｃａｔ Ｖ８６２２０）
に変異後の遺伝子をサブクローニングして、最終的に、３回目で変異したｓｃＦＶ－Ｆｃ
融合タンパク質及び変異したＶｈＨ－Ｆｃタンパク質（配列番号４～配列番号３５）を哺
乳動物細胞で発現させるための組換え発現ベクターを取得した。
２、ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃヘテロダイマーの一過性発現、及びヘテロダイマーの
含有量に対するそれぞれの変異の組合せの影響の検出
実施例２－２に記載の方法に従って、表８の４つの変異の組合せ（１０～１３）、及び
変異の組合せ４を、２９３Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）で一過性発現させた。なお
Ａ鎖及びＢ鎖の組換え発現ベクターの共トランスフェクションの比率を４：１、１：１及
び１：４とした。５日～６日培養した後に、一過性発現培養上清を集め、プロテインＡア
フィニティークロマトグラフィーによって、予備精製された新たな４組の変異の組合せ、
及び変異の組合せ４の一過性トランスフェクション産物を取得した。これらの一過性トラ
ンスフェクション産物にはいずれも、それぞれの比率のホモダイマータンパク質（ＳｃＦ
ｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク
質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）が含まれている。この３つのタンパク質（ＳｃＦｖ
－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ、及びＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－
Ｆｃ）の分子量のサイズが異なっているので、各産物におけるホモダイマータンパク質（
ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）及びヘテロダイマータ
ンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）の構成状況を非還元条件でのＳＤＳ－ＰＡＧ
Ｅ電気泳動によって検出することができ、また、ホモダイマータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆ
ｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質（Ｓ
ｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）の比率をBioRad社から出されている画像解析専門ソフトウ
ェアＩｍａｇｅＬａｂで解析した。電気泳動の検出結果は、表１０に示す通りである。
Figure 0007444381000010
Ａ鎖－Ａ鎖及びＢ鎖－Ｂ鎖のホモダイマーに対する新たに導入された変異の影響を更に
考察するために、Ａ鎖のタンパク質又はＢ鎖のタンパク質を個別に一過性発現させ、同じ
一過性トランスフェクション条件でのホモダイマータンパク質を発現させることによって
、そのホモダイマーの形成傾向を考察した。組換え発現ベクターは、懸濁培養された２９
３Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）にそれぞれＰＥＩを用いてトランスフェクションし
、５日～６日培養した後に細胞上清を集めた。プロテインＡアフィニティークロマトグラ
フィーによって、それぞれの一過性トランスフェクション産物を取得して、ＯＤ２８０で
その発現レベルを検出した。結果は、表１１を参照されたい。
Figure 0007444381000011
上述した結果をまとめると、次のことがわかる。変異の組合せ４に３回目の変異を導入
すると、Ａ鎖のホモダイマーの形成阻害のプロセスで顕著な効果が示されているわけでは
ないが、Ｂ鎖のホモダイマーの形成がいずれも顕著に阻害されており、ヘテロダイマーの
形成が効果的に促進されている。２本の鎖の発現が平衡（１：１）に近いとき、数組の新
たな変異の組合せにおいてヘテロダイマーの含有量がいずれも８０％以上になり、変異の
組合せ４に比べて明らかに向上している。なお、変異の組合せ１１では、B鎖に対する新
しい変異を用いて、B鎖ホモダイマーの形成を完全に阻害することができた。１：４（Ａ
：Ｂ）の一過性トランスフェクションの比率でも、Ｂ鎖のホモダイマーが観察されず、ヘ
テロダイマーの含有量が８９％に達していることがわかった。
組合せ１０～１３の結果により、さらに、変異の組合せ１５、１６、１８を選択し、一
過性発現によって、そのヘテロダイマーの形成促進効果を考察した。
実施例２－２に記載の方法に従って、表９の３つの変異の組合せ（１５、１６、１８）
、及び変異の組合せ２を２９３Ｈ細胞（ATCC、ＣＲＬ－１５７３）で一過性発現させた。
なお、Ａ鎖及びＢ鎖の組換え発現ベクターの共トランスフェクションの比率を４：１、１
：１及び１：４とした。５日～６日培養した後に、一過性発現培養上清を集め、プロテイ
ンＡアフィニティークロマトグラフィーによって、予備精製された３組の新たな変異の組
合せ及び変異の組合せ２の一過性トランスフェクション産物を取得した。これらの一過性
トランスフェクション産物にはいずれも、それぞれの比率のホモダイマータンパク質（Ｓ
ｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）及びヘテロダイマータン
パク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）が含まれている。この３つのタンパク質（Ｓｃ
Ｆｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ、及びＳｃＦｖ－Ｆｃ／Ｖｈ
Ｈ－Ｆｃ）の分子量のサイズが異なっているので、各産物におけるホモダイマータンパク
質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）及びヘテロダイマ
ータンパク質（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）の構成状況を非還元条件でのＳＤＳ－Ｐ
ＡＧＥ電気泳動によって検出することができ、また、ホモダイマータンパク質（ＳｃＦｖ
－Ｆｃ／ＳｃＦｖ－Ｆｃ、ＶｈＨ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質
（ＳｃＦｖ－Ｆｃ／ＶｈＨ－Ｆｃ）の比率をBioRad社から出されている画像解析専門ソフ
トウェアＩｍａｇｅＬａｂで分析した。電気泳動の検出結果は、表１２に示す通りであり
、次のことがわかる。変異の組合せ２に３回目の変異を導入すると、同様に、Ｂ鎖のホモ
ダイマーの形成阻害において更に顕著な効果が示されると共に、ヘテロダイマーの形成が
効果的に促進されている。２本の鎖の発現が平衡（１：１）に近いとき、数組の新たな変
異の組合せにおいてヘテロダイマーの含有量がいずれも８０％以上になり、変異の組合せ
４に比べて明らかに向上している。なお、変異の組合せ１６及び１８は、一過性トランス
フェクションのベクターの比率を適宜変更した（Ｂ鎖のプラスミドが過剰であるか、又は
２つのプラスミドが平衡である）場合にも、依然としてそのヘテロダイマーの比率が８０
％以上に達している。
Figure 0007444381000012
実施例７：ヘテロダイマーのその他の指標の検査
１、ヘテロダイマーの加速安定性の検出
変異の組合せ４、１１及び１６のヘテロダイマーを選択し、試験期間を３１日とし、温
度を４５℃とし、バッファーをＰＢＳとして加速安定性試験を行った。０日目、８日目、
１８日目及び３１日目に非還元でＣＥ－ＳＤＳにより検出し、対応する野生型Ｆｃタンパ
ク質と比較した。３１日間の加速安定性のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果から、３つの変異サンプ
ル及び野生型の対照サンプルは、３１日目までそのメインピークの含有量の減少がいずれ
も２％を超えないことがわかった。これにより、ヘテロダイマーが野生型と同じ熱安定性
を有していると考えられる。
本願に記載の具体的な実施形態を詳細に説明したが、既に開示されたあらゆる教示に基
づいてこれらの詳細に対して種々の変更及び置換をすることができ、これらの変更はいず
れも本願に記載の発明の請求の範囲内であることが当業者には理解されよう。本願に記載
の発明の全ての範囲は、添付の請求項及びそれらのあらゆる均等物により定められる。

Claims (15)

  1. 抗体の重鎖定常領域の第１のＣＨ３ドメインを含む第１のポリペプチド鎖と、抗体の重鎖定常領域の第２のＣＨ３ドメインを含む第２のポリペプチド鎖とを含み、
    前記第１のＣＨ３ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインは、対応する野生型ヒト抗体の重鎖定常領域のＣＨ３ドメインに比べて、下記１０）～１３）よりなる群から選択されるいずれかのアミノ酸変異を生ぜしめてなるものであり：
    １０）前記第１のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｋ４０９及びＫ３９２に変異が生じ、前記第２のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７、Ｄ３９９及びＦ４０５に変異が生じること、
    １１）前記第１のＣＨ３ドメインのＴ３６６及びＫ４０９のアミノ酸に変異が生じ、前記第２のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７及びＦ４０５のアミノ酸に変異が生じること、
    １２）前記第１のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｋ４０９及びＹ３４９のアミノ酸に変異が生じ、前記第２のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７、Ｆ４０５及びＥ３５７のアミノ酸に変異が生じること、及び
    １３）前記第１のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｋ４０９、Ｙ３４９及びＳ３５４のアミノ酸に変異が生じ、前記第２のＣＨ３ドメインのＴ３６６、Ｌ３６８、Ｙ４０７、Ｆ４０５及びＥ３５７のアミノ酸に変異が生じること、
    前記野生型ヒト抗体の重鎖定常領域のＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域のＣＨ３ドメインであり、
    前記第１のＣＨ３ドメインにおける
    Ｔ３６６の変異は、Ｔ３６６Ｗであり、
    Ｋ４０９の変異は、Ｋ４０９Ａであり、
    Ｋ３９２の変異は、Ｋ３９２Ｄであり、
    Ｙ３４９の変異は、Ｙ３４９Ｄであり、
    Ｓ３５４の変異は、Ｓ３５４Ｄであり；
    前記第２のＣＨ３ドメインにおける
    Ｔ３６６の変異は、Ｔ３６６Ｓであり、
    Ｌ３６８の変異は、Ｌ３６８Ａ又はＬ３６８Ｇであり、
    Ｙ４０７の変異は、Ｙ４０７Ｖ又はＹ４０７Ａであり、
    Ｄ３９９の変異は、Ｄ３９９Ｓであり、
    Ｆ４０５の変異は、Ｆ４０５Ｋであり、
    Ｅ３５７の変異は、Ｅ３５７Ａである、 上述したアミノ酸の位置が、抗体ＦｃのＫＡＢＡＴがナンバリングしたＥＵインデックスに基づいて確定される、ヘテロダイマー分子。
  2. 前記第１のＣＨ３ドメインと、第２のＣＨ３ドメインとが、
    １０）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｋ３９２Ｄ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｄ３９９Ｓ＋Ｆ４０５Ｋと、
    １１）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ｇ＋Ｙ４０７Ａ＋Ｆ４０５Ｋと、
    １２）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｙ３４９Ｄ、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｅ３５７Ａと、
    １３）第１のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｗ＋Ｋ４０９Ａ＋Ｙ３４９Ｄ＋Ｓ３５４Ｄと、第２のＣＨ３ドメイン：Ｔ３６６Ｓ＋Ｌ３６８Ａ＋Ｙ４０７Ｖ＋Ｆ４０５Ｋ＋Ｅ３５７Ａと、
    の群から選択される変異を含む、請求項１に記載のヘテロダイマー分子。
  3. 前記第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖とが、それぞれ抗体の重鎖定常領域のＣＨ２ドメインを更に含む、請求項１又は２に記載のヘテロダイマー分子。
  4. 前記第１のポリペプチド鎖と、第２のポリペプチド鎖とが、それぞれ抗体の重鎖定常領域のヒンジ領域又はヒンジ領域の一部を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヘテロダイマー分子。
  5. 前記第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖が、抗原結合領域、受容体結合領域及び酵素結合領域から選択される分子結合領域を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヘテロダイマー分子。
  6. 前記抗原結合領域が、抗体の可変領域を含む、請求項５に記載のヘテロダイマー分子。
  7. 二重特異性抗体、二重特異性融合タンパク質、又は抗体－融合タンパク質キメラである、請求項１～６のいずれか一項に記載のヘテロダイマー分子。
  8. 請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロダイマー分子と、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む、組成物。
  9. 請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖をコードする、核酸分子。
  10. 請求項９に記載の核酸分子を含む、ベクター。
  11. 請求項１０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  12. 請求項１～７のいずれか一項に記載のヘテロダイマー分子、請求項８に記載の組成物、請求項９に記載の核酸分子、請求項１０に記載のベクター、又は請求項１１に記載の宿主細胞の、二重特異性抗体、二重特異性融合タンパク質、又は抗体－融合タンパク質キメラの調製における使用。
  13. 請求項１１に記載の宿主細胞を用いて前記ヘテロダイマー分子を発現させる工程を含む、ヘテロダイマー分子の調製方法。
  14. 前記宿主細胞が、前記ヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖をコードするベクターと第２のポリペプチド鎖をコードするベクターとを同時に含み、
    前記宿主細胞を用いて前記ヘテロダイマー分子を発現させ、回収し、取得することを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記宿主細胞が、第１群の細胞と、第２群の細胞とを含み、
    前記第１群の細胞及び第２群の細胞が、前記ヘテロダイマー分子の第１のポリペプチド鎖をコードするベクター及び第２のポリペプチド鎖をコードするベクターをそれぞれ含み、
    前記第１のポリペプチド鎖及び第２のポリペプチド鎖をそれぞれ前記第１群の細胞及び前記第２群の細胞で発現させて前記第１のポリペプチド鎖のホモダイマー及び前記第２のポリペプチド鎖のホモダイマーを形成し、その後、前記第１のポリペプチド鎖のホモダイマーと、前記第２のポリペプチド鎖のホモダイマーとを適切な条件で混合し、前記ヘテロダイマー分子を調製して取得することを含む、請求項１４に記載の方法。
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3035681A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof
EP3533804A4 (en) 2016-11-18 2020-06-17 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODY TYPE ANTI-PD -1 / ANTI-HER2 NATURAL ANTIBODY HETERODIMERIC FORM AND PREPARATION THEREOF
CN110719920B (zh) * 2017-06-14 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 蛋白质异二聚体及其用途
EP3643726A4 (en) * 2017-06-20 2021-09-01 Nanomab Technology Limited ANTI-HER2 NANOCBODIES, CODING SEQUENCE AND ASSOCIATED USE
WO2019014912A1 (zh) * 2017-07-21 2019-01-24 赵磊 一种异二聚体蛋白及其制备方法
CN111051350B (zh) * 2017-09-07 2022-11-01 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 包含信号调节蛋白α的免疫缀合物
JP7356726B2 (ja) * 2017-09-25 2023-10-05 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド タンパク性ヘテロ二量体及びその使用
US11883503B2 (en) 2017-09-25 2024-01-30 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Methods and compositions for cancer treatment
JP7231641B2 (ja) * 2017-12-04 2023-03-01 北京韓美薬品有限公司 天然抗体様構造を有し、ヘテロ二量体形態の抗ｐｄ－ｌ１／抗ｃｄ４７二重特異性抗体、ならびにその製造方法
WO2019153200A1 (zh) 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
EP3750920A4 (en) * 2018-02-11 2021-11-10 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. BISPECIFIC ANTIBODY IN HETERODIMER FORM SIMILAR TO A NATURAL ANTI-PD-1 / ANTI-VEGF ANTIBODY STRUCTURE AND PRODUCTION OF IT
CN108640997A (zh) * 2018-05-22 2018-10-12 蔡毓旻 一种双特异性抗体
WO2020192648A1 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Proteinaceous heterodimer and use thereof
EP3946354A4 (en) * 2019-03-28 2023-01-11 Ab Studio Inc. HETEROMULTIMER PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF
EP3959238A1 (en) * 2019-04-25 2022-03-02 F. Hoffmann-La Roche AG Activatable therapeutic multispecific polypeptides with extended half-life
CA3132275A1 (en) * 2019-04-25 2020-10-29 Ulrich Brinkmann Generation of antibody-derived polypeptides by polypeptide chain exchange
TW202106715A (zh) * 2019-04-25 2021-02-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 藉由多肽鏈交換活化之治療性多特異性多肽
CA3149939A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Stephen J. Demarest Proteins comprising t-cell receptor constant domains
CN113121697B (zh) * 2019-12-31 2023-06-09 周易 Ch3结构域改造诱导形成的异源二聚体及其制备方法和应用
CN113121696A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 周易 Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途
WO2022031871A1 (en) * 2020-08-05 2022-02-10 Synthekine, Inc. Compositions and methods related to il27 receptor binding
WO2022093857A1 (en) * 2020-10-26 2022-05-05 City Of Hope Oncolytic virus compositions and methods for the treatment of cancer
CN112977908B (zh) * 2021-03-02 2022-12-02 康宁杰瑞(吉林)生物科技有限公司 灌装加塞机及其灌装的方法
CA3223534A1 (en) * 2021-07-02 2023-01-05 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating cancer
KR20240038008A (ko) * 2021-07-28 2024-03-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 암 치료 방법 및 조성물
WO2023085779A1 (ko) * 2021-11-09 2023-05-19 한양대학교 산학협력단 Fc 변이체를 포함하는 이종이합체 및 이의 제조방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014504265A (ja) 2010-11-05 2014-02-20 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
JP2015515275A (ja) 2012-04-20 2015-05-28 メルス・ベー・フェー Ｉｇ様分子の生産方法および生産手段

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) * 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO2009089004A1 (en) * 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
EA201791693A1 (ru) 2011-03-25 2018-05-31 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гетеродимерные иммуноглобулины
PL2773671T3 (pl) * 2011-11-04 2022-01-24 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerycznego z mutacjami w domenie fc
CN102558355B (zh) * 2011-12-31 2015-02-25 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 基于电荷网络的异二聚体fc改造方法及异二聚体蛋白的制备方法
JP6351572B2 (ja) * 2012-05-10 2018-07-04 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメインに突然変異を有する免疫グロブリン重鎖のヘテロ多量体構築物
US20140154253A1 (en) * 2012-07-13 2014-06-05 Zymeworks Inc. Bispecific Asymmetric Heterodimers Comprising Anti-CD3 Constructs
CN102851338A (zh) 2012-07-25 2013-01-02 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 利用电荷排斥作用制备同二聚体蛋白混合物的方法
US9951145B2 (en) * 2012-11-27 2018-04-24 Ajou University Industry—Academic Cooperation Foundation CH3 domain variant pair inducing formation of heterodimer of heavy chain constant region of antibody at high efficiency, method for preparing same, and use thereof
CN110719920B (zh) * 2017-06-14 2024-01-30 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 蛋白质异二聚体及其用途
CN111051350B (zh) * 2017-09-07 2022-11-01 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 包含信号调节蛋白α的免疫缀合物
US11883503B2 (en) * 2017-09-25 2024-01-30 Dingfu Biotarget Co., Ltd. Methods and compositions for cancer treatment
JP7356726B2 (ja) * 2017-09-25 2023-10-05 ディンフー バイオターゲット カンパニー リミテッド タンパク性ヘテロ二量体及びその使用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014504265A (ja) 2010-11-05 2014-02-20 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｆｃドメイン中に突然変異を有する、安定したヘテロ二量体抗体の設計
JP2015515275A (ja) 2012-04-20 2015-05-28 メルス・ベー・フェー Ｉｇ様分子の生産方法および生産手段

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hye-Ji Choi et al.，Molecular Cancer Therapeutics，2013年12月，Vol. 12, No. 12，p. 2748-2759
Nature Biotechnology，1998年，Vol.16，p.677-681
Shane Atwell et al.，J. Mol. Biol.，1997年，vol. 270，p. 26-35

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