JP6185584B2 - 電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法 - Google Patents
電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法 Download PDFInfo
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Description
本発明の第1の態様は、単一の組換え細胞クローンを使用することにより2種以上のタンパク質を含有する混合物を得るための方法であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、2種以上のタンパク質は同じドメインを含有しており、前記方法は、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、1種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける2つのモノマー鎖の残基の一部を反対荷電アミノ酸(単数又は複数)と置換する工程を含む、上記方法に関する。
(1)タンパク質の2つのモノマー鎖の同じドメイン間の界面残基を得る工程、
(2)工程(1)で得られた界面残基から、対になる正電荷及び負電荷を有する対になる残基を選択する工程、並びに
(3)工程(2)で得られた対になる正電荷及び負電荷を有する対になる残基から、残基の1つ又は複数の対(例えば2つの対、3つの対又は4つの対)を選択し、選択された対の残基を反対荷電残基と置換する工程
を含む。
a)第1鎖の356位のGlu(E)及び第2鎖の439位のLys(K)、
b)第1鎖の357位のGlu(E)及び第2鎖の370位のLys(K)、
c)第1鎖の370位のLys(K)及び第2鎖の357位のGlu(E)、
d)第1鎖の392位のLys(K)及び第2鎖の399位のAsp(D)、
e)第1鎖の399位のAsp(D)及び第2鎖の392位のLys(K)、
f)第1鎖の399位のAsp(D)及び第2鎖の409位のLys(K)、
g)第1鎖の409位のLys(K)及び第2鎖の399位のAsp(D)、並びに
h)第1鎖の439位のLys(K)及び第2鎖の356位のGlu(E)
に示す対になる残基からなる群から選択され、
上の8つの残基対の位置は、抗体のKABATシステムのEUナンバリングインデックスにより決定される。
(1)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、
(2)1種のタンパク質について、356位のGluをLysと置換すること、及び439位のLysをGluと置換すること、
(3)1種のタンパク質について、357位のGluをLysと置換すること、及び370位のLysをGluと置換すること、
(4)1種のタンパク質について、357位のGluをLysと置換すること、370位のLysをGluと置換すること、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、
(5)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、
(6)1種のタンパク質について、399位のAspをLysと置換すること、及び409位のLysをAspと置換すること、
(7)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、同時に、もう1種のタンパク質について、357位のGluをLysと置換すること、及び370位のLysをGluと置換すること、並びに
(8)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、同時に、もう1種のタンパク質について、356位のGluをLysと置換すること、及び439位のLysをGluと置換すること。
a1)第1鎖の161位のGlu(E)及び第2鎖の244位のLys(K)、
b1)第1鎖の162位のGlu(E)及び第2鎖の175位のLys(K)、
c1)第1鎖の175位のLys(K)及び第2鎖の163位のGlu(E)、
d1)第1鎖の197位のLys(K)及び第2鎖の204位のAsp(D)、
e1)第1鎖の204位のAsp(D)及び第2鎖の197位のLys(K)、
f1)第1鎖の204位のAsp(D)及び第2鎖の214位のLys(K)、
g1)第1鎖の214位のLys(K)及び第2鎖の204位のAsp(D)、
h1)第1鎖の244位のLys(K)及び第2鎖の161位のGlu(E)。
a2)第1鎖の399位のGlu(E)及び第2鎖の482位のLys(K)、
b2)第1鎖の400位のGlu(E)及び第2鎖の413位のLys(K)、
c2)第1鎖の413位のLys(K)及び第2鎖の400位のGlu(E)、
d2)第1鎖の435位のLys(K)及び第2鎖の442位のAsp(D)、
e2)第1鎖の442位のAsp(D)及び第2鎖の435位のLys(K)、
f2)第1鎖の442位のAsp(D)及び第2鎖の452位のLys(K)、
g2)第1鎖の452位のLys(K)及び第2鎖の442位のAsp(D)、
h2)第1鎖の482位のLys(K)及び第2鎖の399位のGlu(E)。
a)第1鎖の356位のGlu(E)及び第2鎖の439位のLys(K)、
b)第1鎖の357位のGlu(E)及び第2鎖の370位のLys(K)、
c)第1鎖の370位のLys(K)及び第2鎖の357位のGlu(E)、
d)第1鎖の392位のLys(K)及び第2鎖の399位のAsp(D)、
e)第1鎖の399位のAsp(D)及び第2鎖の392位のLys(K)、
f)第1鎖の399位のAsp(D)及び第2鎖の409位のLys(K)、
g)第1鎖の409位のLys(K)及び第2鎖の399位のAsp(D)、並びに
h)第1鎖の439位のLys(K)及び第2鎖の356位のGlu(E)
に示す対になる残基からなる群から選択され、
上の8つの残基対の位置は、抗体のKABATシステムのEUナンバリングインデックスにより決定される。
(1)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、
(2)1種のタンパク質について、356位のGluをLysと置換すること、及び439位のLysをGluと置換すること、
(3)1種のタンパク質について、357位のGluをLysと置換すること、及び370位のLysをGluと置換すること、
(4)1種のタンパク質について、357位のGluをLysと置換すること、370位のLysをGluと置換すること、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、
(5)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、
(6)1種のタンパク質について、399位のAspをLysと置換すること、及び409位のLysをAspと置換すること、
(7)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、同時に、もう1種のタンパク質について、357位のGluをLysと置換すること、及び370位のLysをGluと置換すること、並びに
(8)1種のタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、及び399位のAspをLysと置換すること、同時に、もう1種のタンパク質について、356位のGluをLysと置換すること、及び439位のLysをGluと置換すること。
a1)第1鎖の161位のGlu(E)及び第2鎖の244位のLys(K)、
b1)第1鎖の162位のGlu(E)及び第2鎖の175位のLys(K)、
c1)第1鎖の175位のLys(K)及び第2鎖の163位のGlu(E)、
d1)第1鎖の197位のLys(K)及び第2鎖の204位のAsp(D)、
e1)第1鎖の204位のAsp(D)及び第2鎖の197位のLys(K)、
f1)第1鎖の204位のAsp(D)及び第2鎖の214位のLys(K)、
g1)第1鎖の214位のLys(K)及び第2鎖の204位のAsp(D)、
h1)第1鎖の244位のLys(K)及び第2鎖の161位のGlu(E)。
a2)第1鎖の399位のGlu(E)及び第2鎖の482位のLys(K)、
b2)第1鎖の400位のGlu(E)及び第2鎖の413位のLys(K)、
c2)第1鎖の413位のLys(K)及び第2鎖の400位のGlu(E)、
d2)第1鎖の435位のLys(K)及び第2鎖の442位のAsp(D)、
e2)第1鎖の442位のAsp(D)及び第2鎖の435位のLys(K)、
f2)第1鎖の442位のAsp(D)及び第2鎖の452位のLys(K)、
g2)第1鎖の452位のLys(K)及び第2鎖の442位のAsp(D)、
h2)第1鎖の482位のLys(K)及び第2鎖の399位のGlu(E)。
1.配列及び構造の取得
Fc領域を含有する48のヒトIgG1抗体の結晶構造を、タンパク質データベース(PDB、www.pdb.org)から取得し、これら48の抗体のFcフラグメントは、構造類似性検索アルゴリズム上で1DN2(PDB番号)に由来していた(参照文献:Yuzhen Ye及びAdam Godzik.FATCAT:柔軟な構造比較及び構造類似性検索のためのウェブサーバ(FATCAT: a web server for flexible structure comparison and structure similarity searching).Nucleic Acids Res.、2004年、32(Web Server issue):W582〜585頁.)。
界面アミノ酸予測ソフトウェアCMA(URL:http://ligin.weizmann.ac.il/cma/)を、残基相互作用の距離に基づき、抗体(PDB番号:1DN2)におけるCH3−CH3間の接触残基をスクリーニング及び認識するために使用した。アミノ酸残基の接触規則に従い、界面残基は、限界よりも短い距離(側鎖の重原子から他の鎖の残基の任意の重原子まで)を有するものを指す。この実施例において、距離限界は、4.5Å又は5.5Åのいずれかに設定された(B.Erman、I.Bahar及びR.L.Jernigan.複数の相互作用部位を有する剛体の平衡状態 タンパク質らせんへの応用(Equilibrium states of rigid bodies with multiple interaction sites.Application to protein helices.)J.Chem.Phys.1997年、107:2046〜2059頁を参照のこと)。ヒト及びマウスIgGサブタイプの残基の接触界面の保存は、図3の配列の多重アラインメントにより決定できた。表1は、残基の接触規則(すなわち、残基間の距離が4.5Åよりも短い)でのスクリーニングにより同定される抗体1DN2の34の界面残基を示し、A鎖及びB鎖はそれぞれ、抗体1DN2の第1鎖及び第2鎖を表した。以下の残基の位置は、抗体FcのためのKABATナンバリングシステムのEUインデックスにより指定された。
表1に挙げたCH3−CH3界面残基に基づき、対になる荷電残基を、残基の電荷に従い選択し、結果を表2に示し、8対の荷電残基が存在した。
表2の結果によれば、抗体1DN2の2つのFc鎖は、2つの対称的な鎖である。したがって、任意の鎖の対になる残基について、1つの鎖の所定の位置の残基を反対電荷を有する残基に変異させると、抗体の2つの鎖の同じ位置の残基は両方とも変異し、例えば、対になる残基Glu356A−Lys439Bについては、変異の2つのタイプは次のとおりである。すなわち、
1)Glu356AがLys356A若しくはArg356Aに変異するか、及び/又はLys439AがGlu439A若しくはAsp439Aに変異する、
2)Glu356BがLys356B若しくはArg356Bに変異するか、及び/又はLys439BがGlu439B若しくはAsp439Bに変異する。
1.ヒトIgG1のFcフラグメントを発現させるための組換えベクターpcMVβ−SP−Fcの構築
遺伝子データベースにおけるヒトIgG1のFcフラグメント(ヒンジ−CH2−CH3)の遺伝子配列により、2つの末端に認識配列としてHind III及びEcoRI並びに保護塩基をそれぞれ含有する配列番号1に示されるヒトFc遺伝子(780bpの長さ、SP−Fcと命名)を人工合成により得た。Fc遺伝子をEcoRI及びHind IIIで二重消化し、得られた断片を、EcoRI及びHind IIIで二重消化した哺乳動物細胞のための発現ベクターpcMVβ(Invitrogen)のベクター主鎖に結合して、組換えベクターpcMVβ−SP−Fc(その構造の概略図は図1に示すとおりである)を得た。組換えベクターpcMVβ−Fcが、pcMVβのEcoRI部位とHind III部位との間に配列番号1の16位から771位のヌクレオチド配列に示されるDNA断片が挿入されたベクターであることが、配列決定で判明した。
METDTLLLWVLLLWVPGSTGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHENPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号2)。
両端に認識配列としてHind III及びEcoRI並びに保護塩基をそれぞれ含有する配列番号3に示すScFv−Fc融合タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子合成により得た。ScFv−Fc融合タンパク質をコードするORFをEcoRI及びHind IIIで二重消化し、得られた断片を、EcoRI及びHind IIIで二重消化した哺乳動物細胞のための発現ベクターpcDNA3.1−zeo(Invitrogen)の主鎖に結合して、組換えベクターpcDNA3.1−zeo−ScFv−Fc(その構造の概略図は図2に示すとおりである)を得た。組換えベクターpcDNA3.1−zeo−ScFv−Fcが、pcDNA3.1−zeoのEcoRI部位とHind III部位との間に配列番号3の16位から1488位のヌクレオチド配列に示されるDNA断片が挿入されたベクターであることが、配列決定で判明した。
MGWSLILLFLVAVATRVLSEVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCIASGFTFSSYPMTWVRQAPGKGLEWVASISYDGSYKYKADSMKGRLTISRDNSKNTLYLEMNSLTAEDTAVYYCARTAFFNAYDFWGQGTLVTVSSASTKGPSVGGGGSGGGGSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNEWFRTSGQGTKVEIKRDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHENPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号4)。
例1の表3及び表4の変異させられる残基に従い、scFV−Fc及びFcをコードするヌクレオチド配列(配列番号1及び配列番号3)の変異及び組合せ変異のため、オーバーラップPCR法を使用した。表5の変異組合せ1〜8に示すとおり、改変後、8つの組換えベクターpcDNA3.1−zeo−ScFv−Fc及びpcMVβ−SP−Fcを得た。
工程3における8つの変異組合せを有する発現ベクターを、PEIで懸濁適応293H細胞(ATCC CRL−1573)内に別々にトランスフェクトさせ、プラスミドpcDNA3.1−zeo−ScFv−FcのpcMVβ−SP−Fcに対する同時トランスフェクション比は1:1であり、3〜4日後、細胞培養上清を回収した。プロテインAアガロース樹脂で免疫沈降を実施し、ホモダイマータンパク質又は抗体(ScFv−Fc/ScFv−Fc及びFc/Fc)及びヘテロダイマータンパク質又は抗体(ScFv−Fc/Fc)の含有量を、非還元条件下でSDS−PAGEにより検出した。Gel−Proプロフェッショナル画像解析ソフトウェア(Media Cybernetics社)を、ホモダイマータンパク質又は抗体(ScFv−Fc/ScFv−Fc及びFc/Fc)及びヘテロダイマータンパク質又は抗体(ScFv−Fc/Fc)の割合を解析するために使用した。結果は、図5及び表6に示すとおりであった。表5における関連する変異組合せをScFv−Fcに導入したとき、ホモダイマーScFv−Fc/ScFv−Fc及びFc/Fcの割合が大きく増加し、一方でヘテロダイマー(ScFv−Fc/Fc)は大きく減少した。3つの変異K392D/K409D/D399K(変異組合せ2)又は変異組合せ4、5若しくは6がFcに導入されたときは、発現タンパク質は主にScFv−Fc/ScFv−Fc及びFc/Fcホモダイマーの形態で存在し(>96%)、電荷の斥力相互作用が、ホモダイマーの形成を増進させ、ヘテロダイマーの形成を阻害するために重要であることを示唆する。ScFv−Fc上の追加の変異(E357K/K370E又はE356K/K439E)が、ホモダイマーの含有量を有意には増加させなかったが、ヘテロダイマーの含有量を一定の範囲で増加させたことに留意すべきである。加えて、E357K/K370E/K392D/K409D/D399K(変異組合せ4)がFcに導入されたときには、Fcモノマーが現れる(約6%)ので、安定性を更に調査すべきである。
工程4におけるSDS−PAGEでの様々な変異組合せの結果に基づき、本発明者らは、変異組合せ1、4、6及び0(野生型、scFv−Fc野生型のみがトランスフェクトされる)の抗体混合物を選択し、31日間にわたり、45℃未満で加速安定性研究を実施し、SDS−PAGE解析を、0、4、8、16、21及び31日目に実施した。同様に、本発明者らは、変異組合せ1(ミックス1)、組合せ6(ミックス2)及び組合せ0(野生型、対照)の抗体混合物を選択し、CE−SDS(キャピラリー電気泳動)解析を0、8、21及び31日目に実施した。
Claims (21)
- 単一の組換え細胞クローンを使用することにより2種のタンパク質からタンパク質混合物を得るための方法であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、2種のタンパク質は同じドメインを含有しており、前記方法は、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、一方及び/又は他方のタンパク質の同じドメインにおける2つのもノマー鎖の1つ以上のアミノ酸残基を反対荷電残基と置換する工程を含み、
前記同じドメインは、抗体のCH3ドメイン又は抗体のFc領域であり;及び
反対荷電残基は、以下を置換して導入され:
1)1種のタンパク質の392位のLys(K)、409位のLys(K)及び399位のAsp(D);
2)1種のタンパク質の392位のLys(K)、409位のLys(K)及び399位のAsp(D)、並びに別のタンパク質の357位のGlu(E)及び370位のLys(K);又は
3)1種のタンパク質の392位のLys(K)、409位のLys(K)及び399位のAsp(D)、並びに別のタンパク質の356位のGlu(E)及び439位のLys(K);及び
ここで残基の位置は、KABATシステムのEUナンバリングインデックスに従って決定される、上記方法。 - 同じドメインにおける2つのモノマー鎖の1つ以上のアミノ酸残基を反対荷電残基と置換する工程が、1つのタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、399位のAspをLysに置換することを意味する、請求項1に記載の方法。
- 同じドメインにおける1つ以上のアミノ酸残基を反対荷電残基と置換するプロセスが、残基の置換から得られるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を得る工程、及びヌクレオチド配列を組換え宿主細胞で発現させ、残基の置換から得られるタンパク質を得る工程を含む、請求項1に記載の方法。
- タンパク質が抗体である請求項1に記載の方法。
- 抗体が哺乳動物に由来する請求項1に記載の方法。
- 抗体が、ヒト、マウス又はラットに由来する、請求項1に記載の方法。
- 抗体が、IgG、IgA、IgE、IgD及びIgMからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- IgGが、IgG1、IgG2及びIgG3から選択される、請求項7に記載の方法。
- IgAがIgA1及びIgA2から選択される、請求項7に記載の方法。
- IgMがIgM1及びIgM2から選択される、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで同じドメインにおける2つのモノマー鎖の1つ以上のアミノ酸残基を反対荷電残基と置換することは、以下を指す、上記方法:
1)1種のタンパク質の392位のLysをAspで置換すること、409位のLysをAspで置換すること、及び399位のAspをLysで置換すること;
2)1種のタンパク質の392位のLysをAspで置換すること、409位のLysをAspで置換すること、及び399位のAspをLysで置換すること;及び別のタンパク質の357位のGluをLysで置換すること、及び370位のLysをGluで置換すること;又は
3)1種のタンパク質の392位のLysをAspで置換すること、409位のLysをAspで置換すること、及び399位のAspをLysで置換すること;及び同時に、別のタンパク質の356位のGluをLysで置換すること、及び439位のLysをGluで置換すること;及び
ここで残基の位置は、KABATシステムのEUナンバリングインデックスに従って決定される。 - 2種のタンパク質からのタンパク質混合物であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、2種のタンパク質は同じドメインを含有しており、一方及び/又は他方のタンパク質の同じドメインにおける2つのモノマー鎖の1つ以上のアミノ酸残基は反対荷電残基と置換されていて、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいようになっており;
前記同じドメインは、抗体のCH3ドメイン又は抗体のFc領域であり;及び
以下の残基は、反対荷電残基で置換され:
1)1種のタンパク質の392位のLys(K)、409位のLys(K)及び399位のAsp(D);
2)1種のタンパク質の392位のLys(K)、409位のLys(K)及び399位のAsp(D)、並びに別のタンパク質の357位のGlu(E)及び370位のLys(K);又は
3)1種のタンパク質の392位のLys(K)、409位のLys(K)及び399位のAsp(D)、並びに別のタンパク質の356位のGlu(E)及び439位のLys(K);及び
ここで残基の位置は、KABATシステムのEUナンバリングインデックスに従って決定される、上記混合物。 - タンパク質が抗体である請求項12に記載の混合物。
- 抗体が哺乳動物に由来する請求項12に記載の混合物。
- 抗体が、ヒト、マウス又はラットに由来する、請求項12に記載の混合物。
- 抗体が、IgG、IgA、IgE、IgD及びIgMからなる群から選択される、請求項12に記載の混合物。
- IgGが、IgG1、IgG2及びIgG3から選択される、請求項16に記載の混合物。
- IgAがIgA1及びIgA2から選択される、請求項16に記載の混合物。
- IgMがIgM1及びIgM2から選択される、請求項16に記載の混合物。
- 同じドメインにおける2つのモノマー鎖の1つ以上のアミノ酸残基の反対荷電残基との置換が、1つのタンパク質について、392位のLysをAspと置換すること、409位のLysをAspと置換すること、399位のAspをLysに置換することを意味する、請求項12に記載の混合物。
- 同じドメインにおける2つのモノマー鎖の1つ以上のアミノ酸残基が、以下によって反対荷電残基で置換される、請求項12に記載の混合物:
1)1種のタンパク質の392位のLysをAspで置換すること、409位のLysをAspで置換すること、及び399位のAspをLysで置換すること;
2)1種のタンパク質の392位LysをAspで置換すること、409位のLysをAspで置換すること、及び399位のAspをLysで置換すること;及び同時に、別のタンパク質の357位のGluをLysで置換すること、及び370位のLysをGluで置換すること;又は
3)1種のタンパク質の392位のLysをAspで置換すること、409位のLysをAspで置換すること、及び399位のAspをLysで置換すること;及び同時に、別のタンパク質の356位のGluをLysで置換すること、及び439位のLysをGluで置換すること;及び
ここで、残基の位置は、KABATシステムのEUナンバリングインデックスに従って決定される、上記混合物。
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