ES2710936T3

ES2710936T3 - Método para preparar una mezcla de proteínas homodiméricas usando efecto de repulsión de carga

Info

Publication number: ES2710936T3
Application number: ES13822582T
Authority: ES
Inventors: Ting Xu; Tao Xu; Xiaoxiao Wang; Xinglu Sun; Ying Fan; Yan Zeng
Original assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd; Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Suzhou Alphamab Co Ltd; Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2013-07-25
Publication date: 2019-04-29
Anticipated expiration: 2033-07-25
Also published as: JP2015522295A; US9708389B2; CN103388013B; JP6185584B2; US20150274807A1; EP3444280A1; EP2889313A4; EP2889313B1; HUE041454T2; CN103388013A; HRP20190272T1; EP2889313A1; CN102851338A; DK2889313T3; WO2014015804A1

Abstract

Un método para obtener una mezcla que contiene dos o más proteínas usando un único clon celular recombinante, en donde las proteínas están en forma de un dímero que se forma por polimerización entre cadenas monoméricas, y las dos o más proteínas contienen el mismo dominio, en donde el método comprende la etapa de reemplazar parte de los restos de aminoácidos de las dos cadenas monoméricas en el mismo dominio de una o más proteínas con los restos de carga opuesta, de modo que las cadenas monoméricas de diferentes proteínas son desfavorables para formar un heterodímero debido a la interacción repulsiva entre cargas iguales, mientras que la cadena monomérica de la misma proteína es más favorable para formar un homodímero debido a la interacción atrayente entre cargas opuestas; en donde el mismo dominio se refiere a dominio CH3 de un anticuerpo o región Fc de un anticuerpo; en donde reemplazar parte de los restos de aminoácidos de las dos cadenas monoméricas en los mismos dominios de una o más proteínas con el resto de carga opuesta se refiere a: 1) reemplazar Lys en la posición 392 con Asp, reemplazar Lys en la posición 409 con Asp y reemplazar Asp en la posición 399 con Lys de una proteína; 2) reemplazar Lys en la posición 392 con Asp, reemplazar Lys en la posición 409 con Asp y reemplazar Asp en la posición 399 con Lys de una proteína; y, simultáneamente, reemplazar Glu en la posición 357 con Lys y reemplazar Lys en la posición 370 con Glu de otra proteína; o 3) reemplazar Lys en la posición 392 con Asp, reemplazar Lys en la posición 409 con Asp y reemplazar Asp en la posición 399 con Lys de una proteína, y, simultáneamente, reemplazar Glu en la posición 356 con Lys y reemplazar Lys en la posición 439 con Glu de otra proteína; y en donde las posiciones de los restos se determinan según el índice de numeración de EU del sistema KABAT para anticuerpos.

Description

DESCRIPCION

Método para preparar una mezcla de protemas homodimericas usando efecto de repulsion de carga

Campo de la invencion

La invencion se refiere a un metodo para preparar una mezcla de protemas homodimericas, en particular a un metodo para preparar una mezcla de protemas homodimericas usando interaccion repulsiva de cargas. La invencion se refiere ademas a una mezcla de protemas homodimericas obtenida por el metodo y los usos del metodo para preparar la mezcla de protemas homodimericas.

Antecedentes de la invencion

Los farmacos de anticuerpos monoclonales han realizado progresos significativos en los ultimos 15 anos y se han convertido en un impulsor de la industria farmaceutica. Desde 1996, se han aprobado en total aproximadamente 30 farmacos de anticuerpos monoclonales, en donde las ventas anuales para nueve farmacos han alcanzado mas de mil millones de dolares. En 2010, las ventas globales de farmacos de anticuerpos monoclonales fueron de mas de 30 mil millones de dolares y la tasa anual de crecimiento fue de mas del 10 %. El anticuerpo monoclonal solamente inhibe una unica diana debido a la alta especificidad contra la diana del mismo. Sin embargo, puede ser necesario inhibir multiples dianas/rutas de senal para evitar un efecto compensatorio para tumores, enfermedades autoinmunitarias y otras enfermedades. Para la infeccion vmca, debido a la alta tasa de mutacion de virus, en general, es necesario inhibir multiples sitios antigenicos para evitar el escape. Existen varias soluciones alternativas. Una es usar anticuerpos policlonales, u obtener un heterodfmero, por ejemplo un anticuerpo biespedfico, modificando fragmentos Fc de anticuerpos. Otra solucion es usar una mezcla de anticuerpos para el tratamiento, en donde la mezcla de anticuerpos comprende dos o mas anticuerpos contra diferentes epftopos en la misma diana, o contra diferentes dianas.

El documento US7262028 desvela un metodo para producir un anticuerpo bivalente o una mezcla de anticuerpos bivalentes a partir de un unico clon de celula hospedadora mediante expresion de una cadena ligera y diferentes cadenas pesadas, y tambien proporciona un metodo para producir una combinacion de anticuerpos que puede explorarse para determinar la utilidad en diversas aplicaciones.

El documento WO/2010/084197 describe un metodo para producir una mezcla que comprende dos o mas anticuerpos diferentes de un unico clon de celula hospedadora. En una realización, se produce una mezcla de diferentes anticuerpos monovalentes. En otra realización, se produce una mezcla de anticuerpos monovalentes y bivalentes. En el metodo, los homodfmeros se estabilizan en virtud del fenomeno de intercambio natural entre dos ramas Fab de lgG4, en donde algunos restos de la region bisagra y el dominio CH3 que provocaron el fenomeno se cambian. Sin embargo, la patente no menciona si el problema de la existencia de heterodfmeros esta completamente resuelto.

Los documentos US5789208 y US6335163 han descrito un metodo para expresar una biblioteca de anticuerpos policlonales, en donde se expreso una biblioteca de fragmentos Fab policlonales en un vector de presentacion en fagos y despues se exploro para determinar la reactividad a antfgenos. Las combinaciones seleccionadas de genes de region variable de cadenas pesadas y cadenas ligeras se transfieren de una manera emparejada a un vector de expresion eucariota que comprende genes de regiones constantes para obtener una subbiblioteca de anticuerpos policlonales completos. Despues la subbiblioteca se transfecta a celulas de mieloma, los clones estables producinan anticuerpos que pueden mezclarse para obtener una mezcla de anticuerpos monoclonales. Usando el metodo, aunque es teoricamente posible obtener directamente anticuerpos policlonales de un proceso de produccion recombinante cultivando un grupo de celulas transfectadas mixtas, puede haber problemas potenciales con respecto a la estabilidad del grupo de las celulas mixtas y de este modo la consistencia de los anticuerpos policlonales producidos. En un metodo de produccion a gran escala (industrial) farmaceuticamente aceptable, es una tarea ardua controlar diferentes celulas en un grupo completo. Por ejemplo, las propiedades tales como la tasa de crecimiento de celulas y la tasa de produccion de anticuerpos debenan mantenerse estables para todos los clones individuales en el grupo no clonal, de modo que la relacion de los anticuerpos en la mezcla de anticuerpos policlonales puede mantenerse constante. Por lo tanto, aunque la produccion para anticuerpos mixtos puede haberse realizado en la tecnica, aun no hay soluciones factibles que sean fiables desde un punto de vista economico y practico para fabricacion a gran escala.

Recientemente, la comparua Merck and Symphogen A/S de Dinamarca firmo un acuerdo de licencia global exclusivo para Sym004. Sym004 es una nueva mezcla de anticuerpos que se esta desarrollando ahora y se dirige al receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR).

Sym004 consiste en dos anticuerpos, puede bloquear la union a ligando, activacion del receptor y senalizacion corriente abajo, y tambien se considera que induce retirada de los receptores EGFR de la superficie de celulas cancerosas induciendo internalizacion y degradacion de EGFR. Sym004 se esta evaluando en la actualidad en un ensayo de Fase I/II para el tratamiento de pacientes con cancer colorrectal metastasico (mCRC) KRAS de tipo silvestre avanzado que han progresado previamente tras el tratamiento con quimioterapia convencional y un anticuerpo monoclonal anti EGFR disponible en el mercado. Ademas, se esta realizando en la actualidad un ensayo de Fase II en pacientes con carcinoma de celulas escamosas de la cabeza y cuello (SCCHN) que han fracasado en la terapia basada en anti EGFR.

La tecnologfa de mezclas de anticuerpos de la comparua Symphogen A/S implica los siguiente: en primer lugar obtener una pluralidad de anticuerpos contra la misma diana por una plataforma de exploracion de anticuerpos, despues realizar construccion molecular para cada anticuerpo, cultivar celulas en matraz de agitacion y mezclar las celulas, y cultivar la mezcla celular de un modo de cultivo de amplificacion gradual, realizando despues una purificacion optimizada para obtener el producto final. Sin embargo, el metodo aun implica los problemas provocados por tasa de crecimiento celular y tasa de produccion de anticuerpos inestables, ya que se usan celulas hospedadoras recombinantes en el metodo para producir una mezcla de diversos homodfmeros. Debido a que un unico anticuerpo se expresa en una unica celula en el metodo, el metodo no implica el problema de heterodfmeros. En todos los casos, sena mas conveniente producir una mezcla de protemas o anticuerpos, si pueden producirse dos o mas protemas o anticuerpos en un unico clon celular recombinante.

Contenidos de la invencion

Basandose en un gran volumen de experimentos, los inventores han desarrollado un metodo para preparar simultaneamente dos o mas protemas o anticuerpos de un unico clon celular recombinante. La invencion comprende espedficamente los siguientes aspectos:

El primer aspecto de la invencion se refiere a un metodo para obtener una mezcla que contiene dos o mas protemas usando un unico clon celular recombinante, en donde la protema esta en forma de un dfmero que se forma por polimerizacion entre cadenas monomericas, y las dos o mas protemas contienen el mismo dominio, en donde el metodo comprende la etapa de reemplazar parte de restos de las dos cadenas monomericas en el mismo dominio de una o mas protemas con el aminoacido o los aminoacidos de carga opuesta, de modo que las cadenas monomericas de diferentes protemas son desfavorables para formar heterodfmeros debido a la interaccion repulsiva entre cargas iguales, mientras que la cadena monomerica de la misma protema es mas favorable para formar homodfmeros debido a la interaccion atrayente entre cargas opuestas; en donde el mismo dominio se refiere a dominio CH3 de un anticuerpo o region Fc de un anticuerpo; en donde reemplazar parte de los restos de aminoacidos de las dos cadenas monomericas en los mismos dominios de una o mas protemas con el resto de carga opuesta se refiere a:

1) reemplazar Lys en la posicion 392 con Asp, reemplazar Lys en la posicion 409 con Asp y reemplazar Asp en la posicion 399 con Lys de una protema;

2) reemplazar Lys en la posicion 392 con Asp, reemplazar Lys en la posicion 409 con Asp y reemplazar Asp en la posicion 399 con Lys de una protema; y, simultaneamente, reemplazar Glu en la posicion 357 con Lys y reemplazar Lys en la posicion 370 con Glu de otra protema; o

3) reemplazar Lys en la posicion 392 con Asp, reemplazar Lys en la posicion 409 con Asp y reemplazar Asp en la posicion 399 con Lys de una protema, y, simultaneamente, reemplazar Glu en la posicion 356 con Lys y reemplazar Lys en la posicion 439 con Glu de otra protema; y en donde las posiciones de los restos se determinan segun el mdice de numeracion de EU del sistema KABAt para anticuerpos.

En una realización de la invencion, la protema es un anticuerpo o una protema de fusion que comprende una parte de los anticuerpos.

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, en particular no se reemplazan los restos de como maximo una protema. En una realización de la invencion, los restos de una protema no se reemplazan mientras que los restos de la otra protema se reemplazan. En otra realización de la invencion, se reemplazan los restos de ambas protemas.

Cuando los restos de multiples (dos o mas) protemas se reemplazan como se detalla en las reivindicaciones, al menos una posicion de los restos reemplazados entre diferentes protemas son diferentes, preferentemente, todas las posiciones de los restos reemplazados entre diferentes protemas son diferentes.

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, el mismo dominio se refiere en particular a un dominio CH3 de un anticuerpo.

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, el mismo dominio se refiere en particular a la region Fc de un anticuerpo.

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, los anticuerpos proceden en particular de mairnferos, tales como seres humanos, ratones o ratas.

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, los anticuerpos se seleccionan en particular del grupo que consiste en IgG (tal como IgG1, lgG2, lgG3), IgA (tal como lgA1, lgA2), IgE, IgD e IgM (tal como lgM1, lgM2).

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, reemplazar parte de los restos en los mismos dominios con los restos con carga opuesta comprende en particular las siguientes etapas:

(1) obtener los restos de interfaz entre los mismos dominios de las dos cadenas monomericas de la protema; (2) seleccionar restos emparejados con cargas positivas y negativas emparejadas de los restos de interfaz obtenidos en la etapa (1); y

(3) seleccionar uno o mas pares (tales como dos pares, tres pares o cuatro pares) de restos de los restos emparejados con las cargas positivas y negativas emparejadas obtenidas en la etapa (2) y reemplazar restos de los pares seleccionados con los restos de carga opuesta.

En la invencion, el aminoacido con carga se selecciona del grupo que consiste en lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), acido aspartico (Asp) y acido glutamico (Glu).

Las posiciones de los pares de restos se determinan segun el mdice de numeracion de EU del sistema KABAT para anticuerpos.

En la invencion, reemplazar la parte de restos de las dos cadenas monomericas en los mismos dominios de una o mas protemas con los restos de carga opuesta se refiere a una o cualquier combinacion de las siguientes situaciones:

(1) reemplazar Lys en la posicion 392 con Asp, reemplazar Lys en la posicion 409 con Asp y reemplazar Asp en la posicion 399 con Lys para una protema;

(2) reemplazar Lys en la posicion 392 con Asp, reemplazar Lys en la posicion 409 con Asp y reemplazar Asp en la posicion 399 con Lys para una protema; y, simultaneamente, reemplazar Glu en la posicion 357 con Lys y reemplazar Lys en la posicion 370 con Glu para la otra protema; y

(3) reemplazar Lys en la posicion 392 con Asp, reemplazar Lys en la posicion 409 con Asp y reemplazar Asp en la posicion 399 con Lys para una protema; y, simultaneamente, reemplazar Glu en la posicion 356 con Lys y reemplazar Lys en la posicion 439 con Glu para la otra protema.

Los restos con carga emparejados con las cargas positivas y negativas emparejadas en la secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 2 son 8 pares de restos como se muestra en a1)-h1):

a1) Glu (E) en la posicion 161 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 244 de la segunda cadena; b1) Glu (E) en la posicion 162 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 175 de la segunda cadena; c1) Lys (K) en la posicion 175 de la primera cadena y Glu (E) en la posicion 163 de la segunda cadena; d1) Lys (K) en la posicion 197 de la primera cadena y Asp (D) en la posicion 204 de la segunda cadena; e1) Asp (D) en la posicion 204 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 197 de la segunda cadena;

f1) Asp (D) en la posicion 204 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 214 de la segunda cadena; g1) Lys (K) en la posicion 214 de la primera cadena y Asp (D) en la posicion 204 de la segunda cadena; h1) Lys (K) en la posicion 244 de la primera cadena y Glu (E) en la posicion 161 de la segunda cadena.

Los restos con carga emparejados con las cargas positivas y negativas emparejadas en la secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 4 son 8 pares de restos como se muestra en a2)-h2):

a2) Glu (E) en la posicion 399 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 482 de la segunda cadena; b2) Glu (E) en la posicion 400 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 413 de la segunda cadena; c2) Lys (K) en la posicion 413 de la primera cadena y Glu (E) en la posicion 400 de la segunda cadena; d2) Lys (K) en la posicion 435 de la primera cadena y Asp (D) en la posicion 442 de la segunda cadena; e2) Asp (D) en la posicion 442 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 435 de la segunda cadena;

f2) Asp (D) en la posicion 442 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 452 de la segunda cadena; g2) Lys (K) en la posicion 452 de la primera cadena y Asp (D) en la posicion 442 de la segunda cadena; h2) Lys (K) en la posicion 482 de la primera cadena y Glu (E) en la posicion 399 de la segunda cadena.

En el metodo segun una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion, el proceso de reemplazar parte de los restos en los mismos dominios con los restos de carga opuesta comprende en particular las etapas de obtener una secuencia de nucleotidos que codifica la protema resultante del remplazo de los restos, y expresar la secuencia de nucleotidos con la celula hospedadora recombinante para obtener la protema resultante del reemplazo de los restos.

En la invencion, la mezcla de protemas puede obtenerse clonando por separado las diferentes protemas en vectores de expresion, cotransfectando los diferentes vectores de expresion en una celula hospedadora y cultivando la celula hospedadora recombinante para expresar las protemas; o conectando operativamente y clonando las diferentes protemas en un vector de expresion y transfiriendo ademas el vector de expresion a la celula hospedadora para cultivo.

En la invencion, el proceso para obtener la secuencia de nucleotidos codificante basada en la secuencia de aminoacidos resultante de reemplazo se conoce bien en la tecnica.

El segundo aspecto de la invencion se refiere a una mezcla que contiene dos o mas protemas, en donde las protemas estan en forma de un dfmero que se forma por polimerizacion entre cadenas monomericas, y las dos o mas protemas contienen el mismo dominio, en donde parte de los restos de las dos cadenas monomericas en el mismo dominio de una o mas protemas se reemplazan con el aminoacido o aminoacidos de carga opuesta, de modo que las cadenas monomericas de las diferentes protemas son desfavorables para formar un heterodfmero debido a la interaccion repulsiva entre cargas iguales, mientras que la cadena monomerica de la misma protema es mas favorable para formar un homodfmero debido a la interaccion atrayente entre cargas opuestas-; en donde el mismo dominio se refiere a dominio CH3 de un anticuerpo o region Fc de un anticuerpo; en donde reemplazar parte de los restos de aminoacidos de las dos cadenas monomericas en los mismos dominios de una o mas protemas con el resto de carga opuesta se refiere a:

En una realización de la invencion, las protemas son anticuerpos o protemas de fusion que comprenden una parte de los anticuerpos.

En la mezcla segun una realización cualquiera del segundo aspecto de la invencion, en particular no se reemplazan los restos de como maximo una protema o anticuerpo. En una realización de la invencion, los restos de una protema no se reemplazan y los restos de la otra protema se reemplazan. En otra realización de la invencion, se reemplazan los restos de ambas protemas.

Cuando los restos de multiples (dos o mas) protemas se reemplazan, al menos una posicion de los restos reemplazados entre diferentes protemas es diferente; preferentemente, todas las posiciones de los restos reemplazados entre diferentes protemas son diferentes.

En la mezcla segun una realización cualquiera del segundo aspecto de la invencion, el mismo dominio se refiere en particular a un dominio CH3 de un anticuerpo.

En la mezcla segun una realización cualquiera del segundo aspecto de la invencion, el mismo dominio se refiere en particular a la region Fc de un anticuerpo.

En la mezcla segun una realización cualquiera del segundo aspecto de la invencion, los anticuerpos proceden en particular de mairnferos, tales como seres humanos, ratones o ratas.

En la mezcla segun una realización cualquiera del segundo aspecto de la invencion, los anticuerpos se seleccionan en particular del grupo que consiste en IgG (tal como IgG1, lgG2, lgG3), IgA (tal como lgA1, lgA2), IgE, IgD e IgM (tal como lgM1, lgM2).

En la mezcla segun una realización cualquiera del segundo aspecto de la invencion, en donde la parte de los restos son restos de interfaz entre los mismos dominios de las dos cadenas monomericas de la protema, preferentemente, los restos de interfaz son los restos cargados con cargas positivas y negativas emparejadas; y, mas preferentemente, uno o mas pares (tales como dos pares, tres pares o cuatro pares) de restos emparejados se reemplazan con los restos de carga opuesta.

En una realización de la invencion, el aminoacido con carga se selecciona del grupo que consiste en lisina (Lys), arginina (Arg), histidina (His), acido aspartico (Asp) y acido glutamico (Glu).

Los restos con carga emparejados con las cargas positivas y negativas emparejadas en una secuencia como se muestra en la SEQ ID NO: 2 son 8 pares de restos como se muestra en a1)-h1):

a1) Glu (E) en la posicion 161 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 244 de la segunda cadena; b1) Glu (E) en la posicion 162 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 175 de la segunda cadena;

c l) Lys (K) en la posicion 175 de la primera cadena y Glu (E) en la posicion 163 de la segunda cadena; d1) Lys (K) en la posicion 197 de la primera cadena y Asp (D) en la posicion 204 de la segunda cadena; e1) Asp (D) en la posicion 204 de la primera cadena y Lys (K) en la posicion 197 de la segunda cadena;

El tercer aspecto de la invencion se refiere a la mezcla de protemas obtenida segun el metodo de una realización cualquiera del primer aspecto de la invencion.

Los polipeptido que contienen dominios CH3 forman interfaces de interaccion debido a interaccion entre restos y por lo tanto forman dfmeros, por lo tanto, en una realización de la invencion, se describe un metodo para obtener una mezcla de homodfmeros, en donde la interaccion atrayente entre dos dominios CH3 en un heterodfmero puede reducirse modificando los restos en las interfaces de interaccion de dominios CH3 mediante el efecto repulsivo de las cargas, dando como resultado una mezcla de homodfmeros. En general, en la interfaz CH3-CH3 del heterodfmero, el efecto repulsivo de las cargas puede formarse modificando los restos relacionados como restos con carga. En algunos casos, cuando un aminoacido determinado con cargas positivas (lisina, arginina, histidina) en la interfaz se muta a uno con cargas negativas (acido aspartico, acido glutamico), puede formarse el efecto repulsivo, y viceversa.

En una realización de la invencion, tras interaccion de los restos en la interfaz CH3-CH3, se determina la interaccion entre los restos con carga en los pares, se seleccionan uno cualquiera o mas de los restos y se analiza el efecto de los restos seleccionados en la formacion de homodfmeros, despues se mutan los restos seleccionados a restos con carga y se investiga el efecto de restos mutados en la formacion de homodfmeros y heterodfmeros despues de la mutacion, despues se comparan los efectos despues y antes de las mutaciones y una mutacion apropiada dana como resultado el efecto de reforzar la formacion de homodfmeros y debilitamiento de la formacion de heterodfmeros. Por ultimo, se seleccionan mutaciones razonables de los restos para maximizar el efecto del fortalecimiento de la formacion de homodfmeros y debilitamiento de la formacion de heterodfmeros.

En una realización espedfica, el metodo descrito anteriormente se define de la siguiente manera: los restos con carga emparejados en los dominios CH3 de las protemas homodimericas se mutan a los restos con carga opuesta, de modo que pueden formarse homodfmeros entre Fc de las dos cadenas monocatenarias, debido a la interaccion resultante de la interaccion atrayente de los restos con carga opuesta emparejados, mientras que no pueden formarse heterodfmeros debido a la interaccion repulsiva de cargas iguales resultante del intercambio de las propiedades electricas de las cargas de los aminoacidos emparejados en una cadena y se obtiene de este modo el anticuerpo Fc o la mezcla de protemas de fusion de Fc que solamente comprende los homodfmeros.

En la invencion, la protema, tambien denominada polipeptido, contiene mas de 10 restos, preferentemente mas de 50 restos y mas preferentemente mas de 100 restos. En una realización de la invencion, la protema es un anticuerpo o comprende una parte de un anticuerpo. En otra realización espedfica de la invencion, la protema es fragmento Fc de lgG1. En otra realización de la invencion, la protema es una protema de fusion de fragmento variable monocatenario (scFv) y fragmento Fc de lgG1.

En la invencion, la celula hospedadora es una celula adecuada para expresar protemas o anticuerpos, tal como una celula procariota o una celula eucariota. Un ejemplo de una celula procariota es E. coli; los ejemplos para una celula eucariota son una celula de levadura o una celula de mairnfero; y los ejemplos para una celula de mairnfero son una celula epitelial humana (tal como 293H), una celula de ovario de hamster chino (CHO) o una celula de mieloma. En la invencion, la protema diferente contiene el mismo dominio. En una realización de la invencion, los mismos dominios se refieren a dominios CH3 de anticuerpos o regiones Fc de anticuerpos.

En la invencion, la cadena monomerica, tambien denominada el polipeptido individual, se refiere a un monomero o una subunidad para formar la protema dimerica. En una realización de la invencion, las dos cadenas monomericas que forman el dfmero son simetricas, concretamente las secuencias de las dos cadenas monomericas son iguales. En la invencion, reemplazar los restos se refiere a reemplazar los restos en las posiciones correspondientes de las dos cadenas monomericas que forman la protema dimerica.

En la invencion, el dfmero se refiere a una combinacion formada por dos subunidades o dos monomeros durante la formacion de protema o acido nucleico y las subunidades o monomeros pueden combinarse mediante enlaces covalentes o enlaces no covalentes; el homodfmero significa que la secuencia de dos subunidades que forman el dfmero son iguales; y el heterodfmero significa que las dos subunidades del dfmero son diferentes.

En la invencion, el dominio se refiere a la region con estructura espedfica y funcion independiente en biomacromoleculas, particularmente en protemas. En una realización de la invencion, el dominio se refiere a dominio CH3 de un anticuerpo o region Fc de un anticuerpo.

En la invencion, los restos de interfaz se refieren a los restos que forman interfaces de contacto entre los dominios. Los restos de interfaz consisten en dos o mas restos.

En la invencion, la protema o la misma protema se refiere a la protema expresada a partir de una secuencia de nucleotidos, concretamente la protema formada como homodfmero.

La mezcla de protemas o anticuerpos obtenida usando el metodo de la invencion puede ser una mezcla de dos o mas homodfmeros de protemas o anticuerpos, preferentemente una mezcla de dos homodfmeros de protemas o anticuerpos.

En una realización de la invencion, el dominio que contiene CH3 puede ser solamente dominio CH3 o region Fc de inmunoglobulina humana que contiene dominio CH3. En general, los polipeptidos de dominios CH3 de region Fc de inmunoglobulina humana proceden de region Fc de inmunoglobulina humana de tipo silvestre. La Fc de inmunoglobulina humana de tipo silvestre se refiere a una secuencia de aminoacidos que aparece en la poblacion humana. Por supuesto, la secuencia de Fc puede variar ligeramente entre individuos. El Fc de inmunoglobulina humana en la invencion tambien puede contener fragmentos con varias alteraciones de restos en comparacion con la secuencia de Fc de inmunoglobulina humana de tipo silvestre, tales como alteraciones de algunos restos en la region Fc, que comprende algunos restos mutados en sitios de glucosilacion u otras mutaciones. La secuencia de dominio CH3 puede ser por ejemplo la secuencia como se muestra en las posiciones 148-252 de la SEQ ID NO: 2. La secuencia de region Fc puede ser por ejemplo la secuencia como se muestra en las posiciones 26-252 de la SEQ ID NO: 2.

En la invencion, la expresion "Fc de inmunoglobulina humana" se refiere a fragmento de inmunoglobulina humana cristalizable, es la parte C-terminal de una region constante de cadena de inmunoglobulina humana, en particular la region constante de cadena pesada de inmunoglobulina. Por ejemplo, la region Fc de inmunoglobulina puede comprender la combinacion de dos o mas dominios de CH2, CH3 y CH4 de cadenas pesadas con una region bisagra de inmunoglobulina. En el presente documento, la region Fc de IgG corresponde al dominio de region bisagra inferior -CH2-CH3 (para IgG, CH2 y CH3 tambien se denominan dominios C^y2 y C^y3). En el fondo de lgG1 humana, segun indices de EU en el sistema Kabat, la region bisagra inferior se refiere a las posiciones 226-236, el dominio CH2 se refiere a las posiciones 237-340 y el dominio CH3 se refiere a las posiciones 341-447. Segun la secuencia de aminoacidos de la region constante de cadena pesada, las inmunoglobulinas se pueden dividir en diferentes tipos. Hay cinco tipos principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, en donde algunas de las inmunoglobulinas puede dividirse adicionalmente en subtipos (isotipos): tales como IgG-1, lgG-2, lgG-3, lgG-4, IgA-1 e IgA-2. Los dominios similares de otros subtipos de IgG pueden determinarse comparando cadenas pesadas o fragmentos de cadena pesada de los subtipos de IgG con la secuencia de aminoacidos de cadena pesada o fragmentos de cadena pesada de lgG1 humana. La seleccion de regiones Fc de inmunoglobulina de tipos y subtipos de inmunoglobulina espedficos esta dentro del alcance de los expertos en la materia. Debido a que la interfaz interactiva de restos de monomeros de inmunoglobulina esta altamente conservada entre humanos y murinos, el metodo para preparar una mezcla de protemas o anticuerpos homodimericos usando la interaccion repulsiva de cargas tambien es adecuado para IgA, IgD, IgE, IgG e IgM tanto humanas como murinas. El metodo relacionado tambien es adecuado para mutar los restos sin carga de dominios CH3 a los restos con carga.

En la invencion, los restos en la region Fc se numeran segun los indices de EU para la cadena pesada de inmunoglobulina (Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), que se cita aqu para referencia). Los indices de EU del sistema de Kabat se refieren a la numeracion de restos de EU para anticuerpo lgG1 humano. Las posiciones en la secuencia de aminoacidos de la region Fc de anticuerpo se indican con los indices de EU mencionados en Kabat, et al.

En la invencion, los prototipos de anticuerpos para producir mezcla de protemas homodimericas pueden ser anticuerpos, inmunoglobulinas, polipeptidos de fusion de Fc, conjugados de Fc (vease Fig. 2), pero no se pretende que la lista sea limitante.

En la invencion, las protemas homodimericas pueden ser una protema homodimerica de un polipeptido que contiene regiones Fc, que incluyen, pero sin limitacion, anticuerpos, protemas de fusion Fc, conjugados de Fc, polipeptidos procedentes de Fc, Fc aislados y fragmentos de los mismos. Por lo tanto, la protema homodimerica puede ser un polipeptido natural, variantes del polipeptido natural, formas modificadas por ingeniena genetica de los polipeptidos naturales, polipeptidos sinteticos o polipeptidos que contienen fragmentos no proteicos. Las formas modificadas por ingeniena genetica de los polipeptidos naturales son polipeptidos que no estan codificados por genes naturales. Por ejemplo, los polipeptidos modificados por ingeniena genetica pueden ser anticuerpos quimericos o anticuerpos humanizados.

En la invencion, la mezcla homodimerica puede purificarse a partir de las celulas recombinantes con una tecnica experimental convencional. Por ejemplo, cuando la protema homodimerica comprende una region Fc, la protema puede purificarse usando protema A. Los metodos de purificacion incluyen, pero sin limitacion, metodos cromatograficos tales como cromatograffa de exclusion por tamanos, de intercambio ionico, basada en afinidad y ultrafiltracion. Los metodos de separacion y purificacion de la mezcla homodimerica de la invencion tambien incluye cualquier combinacion apropiada de los metodos anteriores.

La invencion se refiere ademas a una cadena monomerica modificada por ingeniena genetica o un unico polipeptido modificado por ingeniena genetica para constituir la protema o el anticuerpo homodimerico.

La invencion se refiere ademas a una secuencia de acido nucleico que codifica la protema o el anticuerpo homodimerico modificado por ingeniena genetica (o la cadena monomerica o el polipeptido individual).

La invencion se refiere ademas a una composicion farmaceutica que comprende la protema o el anticuerpo homodimerico modificado por ingeniena genetica (o la cadena monomerica o el polipeptido individual).

Ventajas de la invencion

Debido a la interaccion entre los mismos dominios de diferentes protemas (tales como Fc de anticuerpos), la formacion de los homodfmeros y heterodfmeros es un proceso dinamico y complejo, que implica la formacion de homodfmeros estables debido a la interaccion de los restos de interfaz de los homodfmeros y la formacion de heterodfmeros estables debido a la interaccion de los restos de interfaz de los heterodfmeros, asf como los cambios dinamicos en el contenido de los heterodfmeros debido a la existencia de homodfmeros y los cambios dinamicos en el contenido de los homodfmeros debido a la existencia de heterodfmeros. La invencion proporciona un metodo para preparar una mezcla de dos o mas protemas o anticuerpos con un unico clon celular recombinante, que puede aumentar el contenido de los homodfmeros de las protemas o anticuerpos y puede reducir el contenido de otros productos no deseados, tales como los heterodfmeros. Los resultados experimentales muestran que la mezcla de protemas o anticuerpos obtenida por la invencion tiene componentes puros y estabilidad deseada. La mezcla de protemas o anticuerpos preparada por la invencion puede actuar simultaneamente en diferentes epftopos de la misma diana o inhibir simultaneamente las funciones de diferentes antfgenos, proporcionando de este modo un nuevo metodo y rutina para el tratamiento de tumores y otras enfermedades.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama esquematico de la estructura de un vector recombinante pcMVp-SP-Fc.

La Fig. 2 es un diagrama esquematico de la estructura de un vector recombinante pcDNA3.1 -zeo-ScFv-Fc. La Fig. 3 es un alineamiento de secuencias de subtipo IgG humano (a) y murino (b). En la figura, se realiza el alineamiento de CH3 de cadenas pesadas, en donde los restos indicados con asterisco (*) son los restos de regiones de interaccion CH3-CH3 segun la estructura cristalina de un Fc lgG1 humano, y los restos indicados con un marco cuadrado representan mutaciones de aminoacidos preferentes para formar una mezcla homodimerica. Debena observarse que la mayona de los restos con carga en IgG estan altamente conservados, (c) representa la comparacion de secuencias de CH3 de otros subtipos de anticuerpos (IgA, IgE, IgD e IgM). Los asteriscos (*) en (b) y (c) representan los restos en las regiones interactivas CH3-CH3 segun lgG1 humana. La Fig. 4 es un diagrama esquematico de la interaccion de cargas en tipo silvestre y la interaccion de cargas en mutante; el ultimo obstaculiza la formacion de heterodfmero y potencia la formacion de homodfmero. (a) En el caso de tipo silvestre, la interaccion de cargas facilita la formacion tanto de heterodfmero como de homodfmero. (b) En el caso de mutaciones dobles (D399K y K409D) en el dominio CH3 de la region Fc de una cadena, el heterodfmero no puede formarse debido a una interaccion repulsiva de las cargas y puede formarse facilmente una mezcla homodimerica debido a la interaccion atrayente de las cargas.

La Fig. 5 es el resultado de analisis de electroforesis de los homodfmeros (scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc) y el heterodfmero (scFv-Fc/Fc), en donde el carril M muestra marcadores de peso molecular (los tres fragmentos superiores representan 104 KD, 78 KD y 50 KD de arriba a abajo), y los carriles 1-9 son las combinaciones de mutaciones 0-8 en la Tabla 5, respectivamente.

La Fig. 6 es el resultado de un analisis de SDS-PAGE en ensayos de estabilidad acelerada de 31 dfas, en donde el Control es de tipo silvestre, scFv-Fc/Fc-mix1 es la combinacion de mutaciones 1, scFv-Fc/Fc-mix13 es la combinacion de mutaciones 4 y scFv-Fcmix1/Fc-mix2 es la combinacion de mutaciones 6.

La Fig. 7 es el resultado de un analisis de CE-SDS en ensayos de estabilidad acelerada de 31 dfas, en donde el Control es de tipo silvestre, Mix1 es la combinacion de mutaciones 1 y Mix2 es la combinacion de mutaciones 6.

Modelos especificos para llevar a cabo la invencion

Las realizaciónes de la invencion se ilustran en detalle haciendo referencia a los ejemplos, pero los expertos en la materia entendenan que los siguientes ejemplos son unicamente para ilustrar la invencion y no debenan considerarse como restriccion de la invencion. Los ejemplos en los que no se proporcionan condiciones espedficas se realizan segun condiciones convencionales o condiciones sugeridas por los fabricantes. Los reactivos o instrumentos para los que no se proporcionan fabricantes son todos productos convencionales disponibles en el mercado.

A menos que se especifique de otro modo, los metodos experimentales usados en los siguientes ejemplos son metodos convencionales.

A menos que se especifique de otro modo, materiales, reactivos y similares usados en los siguientes ejemplos estan disponibles en el mercado.

Ejemplo 1: Seleccion de restos mutados en dominio CH3 de fragmentos Fc de anticuerpo

1. Obtencion de secuencias y estructuras

Se obtienen estructuras cristalinas de 48 anticuerpos lgG1 humanos que contienen regiones Fc de una base de datos de protemas (PDB, www.pdb.org) y los fragmentos Fc de los 48 anticuerpos procedieron de 1DN2 (numero de PDB) mediante un algoritmo de busqueda de similitud estructural (Referencia: Yuzhen Ye y Adam Godzik. FATCAT: a web server for flexible structure comparison and structure similarity searching. Nucleic Acids Res., 2004, 32 (numero de servidor web): W582-585.).

2. Determinacion de restos de interfaz

Se uso software de prediccion de aminoacidos de interfaz CMA (URL: http://ligin.weizmann.ac.il/cma/) para explorar y reconocer restos de contacto entre CH3-CH3 en los anticuerpos (numero de PDB: 1DN2) basandose en las distancias de interaccion de restos. Segun las normas de contacto de restos de aminoacidos, los restos de interfaz se refieren a los que tienen distancias (de los atomos pesados de una cadena lateral a los atomos pesados de cualquiera de los restos de otra cadena) menores que un lfmite. En este ejemplo, el lfmite de distancia se establecio como 4,5 A o 5,5 A (vease B. Erman, I. Bahar y R. L. Jernigan. Equilibrium states of rigid bodies with multiple interaction sites. Application to protein helices. J. Chem. Phys. 1997,107:2046-2059.). La conservacion de interfaces de contacto de restos de subtipo IgG humano y murino podna determinarse mediante alineamientos multiples de secuencias en la Fig. 3. La Tabla 1 mostro 34 restos de interfaz del anticuerpo 1DN2 identificados mediante exploracion con las normas de contacto de restos (concretamente la distancia entre los restos es menor de 4,5 A), en donde la cadena A y la cadena B representaron la primera cadena y la segunda cadena del anticuerpo 1DN2, respectivamente. Las posiciones de los siguientes restos se designaron mediante el mdice de EU del sistema de numeracion de KABAT para Fc de anticuerpo.

Tabla 1. Lista de restos de interfaz CH3-CH3 del anticuerpo 1DN2

3. Busqueda de restos con carga emparejados

Basandose en los restos de interfaz CH3-CH3 enumerados en la Tabla 1, los restos con carga emparejados se seleccionaron segun las cargas de los restos, los resultados se muestran en la Tabla 2 y hubo 8 pares de restos con carga.

Tabla 2. Restos con car a^ em areados del anticuer o 1DN2

4. Mutacion de restos con carga

Segun los resultados de la Tabla 2, las dos cadenas Fc del anticuerpo 1DN2 son dos cadenas simetricas. Por lo tanto, para los restos emparejados de cualquier cadena, si el resto en una posicion determinada de una cadena se muta al resto con carga opuesta, entonces el resto en la misma posicion de las dos cadenas del anticuerpo esta en ambos casos mutado y, por ejemplo, para los restos emparejados Glu356A-Lys439B, los dos tipos de mutacion son los siguientes:

1) el Glu356A se muta a Lys356A o Arg356A, y/o el Lys439A se muta a Glu439A o Asp439A; y

2) el Glu356B se muta a Lys356B o Arg356B, y/o el Lys439B se muta a Glu439B o Asp439B.

En este caso, las cargas opuestas significan que los restos con carga positiva (lisina (Lys, K) o arginina (Arg, R) o histidina (His, H)) se mutan a los restos con carga negativa (acido aspartico (Asp, D) o acido glutamico (Glu, E)) o los restos con carga negativa (acido aspartico o acido glutamico) se mutan a los restos con carga positiva (lisina o arginina). Las posiciones de mutaciones espedficas son como se muestra en la Tabla 3 y la Tabla 4.

Tabla 3. Restos mutados en la cadena A

Tabla 4. Restos mutados en la cadena B

Ademas, en casos mas complicados, la operacion tambien puede basarse en el metodo anterior o las combinaciones de mutaciones de los restos emparejados descritos anteriormente. El metodo para modificar Fc (para la preparacion de mezcla de Fc) y preparar una mezcla de anticuerpos segun la solucion de la invencion no estuvo limitada por mutaciones dobles de restos emparejados de la cadena sencilla como se ha mencionado anteriormente o cualquier combinacion de las mutaciones.

Ejemplo 2: Preparacion de una mezcla de protemas homodimericas modificando restos en un dominio CH3 de un fragmento Fc de anticuerpo

1. Construccion de un vector recombinante pcMVp-SP-Fc para expresar un fragmento Fc de lgG1 humana

Segun la secuencia genica del fragmento Fc (bisagra-CH2-CH3) de lgG1 humana en una base de datos genica, un gen de Fc humano como se muestra en la SEQ ID NO: 1, que contema en dos extremos Hind III y EcoRI como secuencia de reconocimiento y bases protectoras respectivamente (780 pb de longitud y denominada SP-Fc), se obtuvo mediante smtesis artificial. El gen de Fc se digirio por duplicado con EcoRI y Hind III, y el fragmento resultante se conecto con la cadena principal de vector del vector de expresion pcMVp para celulas de mairnferos (Invitrogen) que se habfa digerido por duplicado con EcoRI y Hind III, y se obtuvo el vector recombinante pcMVp-SP-Fc (el diagrama esquematico de su estructura es como se muestra en la Fig. 1). Se demostro tras la secuenciacion que el vector recombinante pcMVp-Fc era un vector en donde un fragmento de ADN como se muestra por la secuencia de nucleotidos de las posiciones 16 a 771 en la SEQ ID NO: 1 se inserto entre los sitios EcoRI y Hind III de pcMVp.

La secuencia de aminoacidos de la protema de Fc codificada por la secuencia de nucleotidos de las posiciones 16 a 771 en la SEQ ID NO: 1 es la siguiente (como se muestra en la SEQ ID NO: 2):

2. Construccion de un vector recombinante pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc para expresar una protema de fusion scFv-Fc

El gen que codifica la protema de fusion scFv-Fc como se muestra en la SEQ ID NO: 3 que contema Hind III y EcoRI en ambos extremos como secuencia de reconocimiento y bases protectoras respectivamente se obtuvo mediante smtesis genica. La ORF que codificaba la protema de fusion scFv-Fc se digirio por duplicado con EcoRI y Hind III, y el fragmento resultante se conecto con la cadena principal del vector de expresion pcDNA3.1-zeo para celulas de m ai^eras (Invitrogen) que se habfa digerido por duplicado con EcoRI y Hind III, y se obtuvo el vector recombinante pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc (el diagrama esquematico de la estructura es como se muestra en la Fig. 2). Se demostro tras la secuenciacion que el vector recombinante pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc era un vector en donde el fragmento de ADN como se muestra por una secuencia de nucleotidos de las posiciones 16 a 1488 en la SEQ ID NO: 3 se inserto entre los sitios EcoRI y Hind III de pcDNA3.1-zeo.

La secuencia de aminoacidos de la protema de fusion scFv-Fc codificada por la secuencia de nucleotidos de las posiciones 16 a 1488 en la SEQ ID NO: 3 es la siguiente (como se muestra en la SEQ ID NO: 4):

La secuencia de aminoacidos de las partes subrayadas en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4 son iguales.

3. Preparacion de un vector recombinante modificado por ingeniena genetica seleccionando posiciones de aminoacidos para mutagenesis

Segun los restos para mutar en la Tabla 3 y la Tabla 4 del Ejemplo 1, se uso un metodo de PCR solapante para mutacion y mutacion combinada de secuencias de nucleotidos (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3) que codifican scFV-Fc y Fc. Como se muestra en las combinaciones de mutaciones 1-8 en la Tabla 5, se obtuvieron 8 vectores recombinantes pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc y pcMVp-SP-Fc despues de modificacion por ingeniena genetica.

Nota: WT representa el tipo silvestre (sin mutacion), NA representa que no se realiza mutacion en el aminoacido emparejado, "I" representa la relacion “y”, 365 en “E356K” representa la posicion del aminoacido mutado, la letra E antes de 365 representa que el aminoacido antes de la mutacion es E, la letra K despues de 365 representa que el aminoacido despues de la mutacion es K. El mismo principio se aplica para otras situaciones.

4. Deteccion de celulas transfectadas y la mezcla de anticuerpos

Los vectores de expresion albergan 8 combinaciones de mutaciones en la etapa 3 se transfectaron por separado con PEI en celulas 293H adaptadas a suspension (ATCC CRL-1573), la relacion de cotransfeccion de plasmidos pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc con respecto a pcMVp-SP-Fc fue 1: 1, y despues de 3-4 dfas, se recogio el sobrenadante de cultivo celular. Se realizo inmunoprecipitacion con resina de agarosa de la protema A, y el contenido de las protemas o los anticuerpos homodimericos (scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc) y la protema o el anticuerpo heterodimerico (scFv-Fc/Fc) se detecto mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Se uso software de analisis de imagenes profesional Gel-Pro (comparMa Media Cybernetics) para analizar la proporcion de las protemas o los anticuerpos homodimericos (scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc) y la protema o el anticuerpo heterodimerico (scFv-Fc/Fc). Los resultados fueron como se muestra en la Figura 5 y la Tabla 6. Cuando la combinacion de mutaciones relacionadas en la Tabla 5 se introdujeron en scFv-Fc, la proporcion de los homodfmeros scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc aumento en gran medida, mientras que el heterodfmero (scFv-Fc/Fc) se redujo en gran medida; y cuando se introdujeron tres mutaciones K392D/K409D/D399K (combinacion de mutaciones 2) o las combinaciones de mutaciones 4, 5 o 6 se introdujeron en el Fc, las protemas expresadas existieron principalmente en las formas de homodfmeros scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc (>96 %), lo que sugiere que la interaccion repulsiva de cargas es crucial para potenciar la formacion de los homodfmeros y obstaculizar la formacion del heterodfmero. Debena observarse que mutaciones adicionales (E357K/K370E o E356K/K439E) en scFv-FC no aumentaron significativamente el contenido de los homodfmeros, sino que aumentaron el contenido del heterodfmero en un grado determinado. Ademas, cuando se introdujo E357K/K370E/K392D/K409D/D399K (combinacion de mutaciones 4) en Fc, la estabilidad debena investigarse adicionalmente debido a la aparicion de monomeros de Fc (aproximadamente 6 %).

El metodo usado para analizar la composicion de mezcla de protemas o anticuerpos es la siguiente: la protema de fusion scFv-Fc tiene un mayor peso molecular que Fc, por lo tanto tras la combinacion de scFv-Fc y Fc, los homodfmeros (scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc) y el heterodfmero (scFv-Fc/Fc) mostranan diferentes bandas en posiciones en el SDS-PAGE. Puede detectarse la proporcion de los homodfmeros y el heterodfmero. Los vectores de expresion de scFv-Fc y Fc se cotransfectan y los homodfmeros (scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc) y el heterodfmero (scFv-Fc/Fc) pueden visualizarse simultaneamente.

Tabla 6. Pro orcion de homodimeros heterodimero de diversos mutantes en SDS-PAGE

Para investigar la influencia de la relacion de cotransfeccion de plasmidos pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc con respecto a pcMVp-SP-Fc en las relaciones de los homodimeros con respecto al heterodimero,, los plasmidos pcDNA3.1-zeo-ScFv-Fc y pcMVp-SP-Fc con la combinacion de mutaciones 1 se cotransfectaron con PEl en celulas 293H (ATCC CRL-1573) en cultivo en suspension en las relaciones de 4:1, 1: 1 y 1:4, y despues de cultivar durante 3-4 dfas, se recogio el sobrenadante de cultivo celular. Se realizo inmunoprecipitacion con resina de agarosa de la protema A, y el contenido de las protemas o los anticuerpos homodimericos (scFv-Fc/scFv-Fc y Fc/Fc) y la protema o el anticuerpo heterodimerico (scFv-Fc/Fc) se detecto mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. Los resultados se muestran en la Tabla 7. Puede verse a partir de los resultados que, cambiando la relacion de cotransfeccion de scFV-Fc con respecto a Fc, la proporcion de los diferentes homodfmeros cambia, pero la proporcion del heterodfmero siempre es menor del 5 %, lo que sugiere que la combinacion de mutaciones 1 puede excluir de forma estable el heterodfmero.

Tabla 7. Influencia de diferentes relaciones de cotransfeccion en proporciones de homodimero y heterodimeros

Segun la invencion, cambiando la relacion de cotransfeccion de dos plasmidos que comprenden diferentes cadenas de Fc, la relacion de diferentes homodfmeros se puede ajustar hasta un grado determinado, pero la proporcion general del homodimero asf como la proporcion de los heterodimeros no puede cambiarse significativamente, lo que indica que la proporcion general de los homodfmeros se mantiene estable mientras que la relacion de cotransfeccion de los plasmidos se cambia.

5. Estudio de estabilidad acelerada de las mezclas de anticuerpos

Basandose en los resultados de las diversas combinaciones de mutaciones en SDS-PAGE en la etapa 4, los inventores seleccionaron las mezclas de anticuerpos de combinacion de mutaciones 1, 4, 6 y 0 (tipo silvestre, solamente se transfecta la scFV-Fc de tipo silvestre) para realizar estudio de estabilidad acelerada durante 31 dfas a 45 °C, y el analisis de SDS-PAGE se realiza el dfa 0, 4, 8, 16, 21 y 31. De forma similar, los inventores seleccionaron mezclas de anticuerpos de la combinacion de mutaciones 1 (mix 1), combinacion 6 (mix 2) y combinacion 0 (tipo silvestre, control) para realizar analisis de CE-SDS (electroforesis capilar) el dfa 0, 8, 21 y 31.

Los resultados de SDS-PAGE de estabilidad acelerada de 31 dfas indicaron que la combinacion de mutaciones 1 y 6 mostro estabilidad muy alta, como las mezclas de anticuerpos de tipo silvestre (homodimero scFV/scFV, control). Desde el Dfa 16, los homodfmeros scFV-Fc/scFV-Fc se degradaron parcialmente, mientras que los homodfmeros Fc/Fc mostraron estabilidad excelente hasta el Dfa 31. Teniendo en cuenta la inestabilidad de scFV, se considera que las mezclas de anticuerpos de combinacion de mutaciones 1 y 6 no tuvieron diferencias en la estabilidad en comparacion con Fc de tipo silvestre. Debena observarse que la mezcla de anticuerpos producida por la combinacion de mutaciones 4 mostro degradacion relativamente significativa con precipitacion observada. Se especula que con cinco mutaciones en cadena de Fc individual (es decir, 10 mutaciones en dfmero de Fc), se vio afectada la estructura que provoca la inestabilidad. Los resultados relacionados son como se muestran en la Fig. 6. A diferencia de SDS-PAGE tradicional, CE-SDS tiene ventajas tales como cantidad pequena de carga de muestras, capacidad de obtener marcadores de peso molecular precisos, deteccion en lmea con ultravioleta y similares y analisis cuantitativo, etc. Por lo tanto este metodo puede usarse para medir la degradacion de las mezclas homodimericas con mas precision. Pudo verse a partir de la Fig. 7 y la Tabla 6 que la combinacion de mutaciones 1 y 6 mostro la misma buena estabilidad que mezclas de anticuerpos de tipo silvestre (control). Aparece un pico de degradacion relativamente evidente de muestras de homodfmeros scFV-Fc/scFV-Fc a partir del Dfa 16. Los resultados relacionados son coherentes con el analisis por SDS-PAGE de resultados de estabilidad.

Tabla 6. Analisis de CE-SDS de mezclas de anticuer os en estudio de estabilidad acelerada

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para obtener una mezcla que contiene dos o mas protemas usando un unico clon celular recombinante, en donde las protemas estan en forma de un d^e ro que se forma por polimerizacion entre cadenas monomericas, y las dos o mas protemas contienen el mismo dominio, en donde el metodo comprende la etapa de reemplazar parte de los restos de aminoacidos de las dos cadenas monomericas en el mismo dominio de una o mas protemas con los restos de carga opuesta, de modo que las cadenas monomericas de diferentes protemas son desfavorables para formar un heterodfmero debido a la interaccion repulsiva entre cargas iguales, mientras que la cadena monomerica de la misma protema es mas favorable para formar un homodfmero debido a la interaccion atrayente entre cargas opuestas;

en donde el mismo dominio se refiere a dominio CH3 de un anticuerpo o region Fc de un anticuerpo; en donde reemplazar parte de los restos de aminoacidos de las dos cadenas monomericas en los mismos dominios de una o mas protemas con el resto de carga opuesta se refiere a:

2. El metodo de la reivindicación 1, en donde el proceso de reemplazar parte de los restos de aminoacidos de las dos cadenas monomericas en el mismo dominio de una o mas protemas con los restos de carga opuesta comprende las etapas de obtener una secuencia de nucleotidos que codifica la protema resultante del remplazo de los restos, y expresar la secuencia de nucleotidos con una celula hospedadora recombinante para obtener la protema resultante del reemplazo de los restos.

3. El metodo de la reivindicación 1, en donde la protema es un anticuerpo.

4. El metodo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo proviene de mairnferos, preferentemente de un ser humano, ratones o ratas.

5. El metodo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA, IgE, IgD e IgM.

6. El metodo de la reivindicación 5, en donde la IgG se selecciona entre lgG1, lgG2 e lgG3 y/o la IgA se selecciona entre lgA1 y lgA2 y/o la IgM se selecciona entre lgM1 y lgM2.

7. Una mezcla que contiene dos o mas protemas, en donde las protemas estan en forma de un dfmero que se forma por polimerizacion entre cadenas monomericas, y las dos o mas protemas contienen el mismo dominio, en donde parte de los restos de las dos cadenas monomericas en el mismo dominio de una o mas protemas se reemplazan con los restos de carga opuesta, de modo que las cadenas monomericas de las diferentes protemas son desfavorables para formar un heterodfmero debido a la interaccion repulsiva entre cargas iguales, mientras que la cadena monomerica de la misma protema es mas favorable para formar un homodfmero debido a la interaccion atrayente entre cargas opuestas;

8. La mezcla de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la protema es un anticuerpo.

9. La mezcla de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo proviene de marnfferos, preferentemente de un ser humano, ratones o ratas.

10. La mezcla de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgA, IgE, IgD e IgM.

11. La mezcla de la reivindicación 10, en donde la IgG se selecciona entre lgG1, IgG2 e lgG3 y/o la IgA se selecciona entre lgA1 y lgA2 y/o la IgM se selecciona entre lgM1 y lgM2.