JP2023526630A - Ig様分子の製造のための方法および手段 - Google Patents
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Abstract
Description
過去10年間、二重特異性抗体は、2つの抗体の組合せの使用に代わるものとして発表された。同様に、3つ以上の同じかまたは異なる抗原またはエピトープに結合できる多価多量体が、発展途上の技術分野として発表された。2つの抗体の組合せは、同じかまたは異なる標的上の異なるエピトープに結合する2つの異なる免疫グロブリンの混合物であるが、二重特異性抗体では、これは単一の免疫グロブリンによって達成される。多価多量体では、同じかまたは異なる標的上の3つ以上の異なるエピトープへの結合が達成され得る。
本発明は、Ig様分子、二重特異性抗体および多価多量体などの生物学的治療薬を産生および精製するための新規手段を提供する。これは、例えば単一細胞によって生成された混合物中に複数のCH3ドメインが存在するとき、目的の少なくとも2つのCH3ドメイン間の相互作用を改善するための新規手段を提供する(例えば、WO2013157954およびWO2013157953を参照のこと)。
以下の議論では、文字の後に数字が続く場合、これはEU番号付けによる一次アミノ酸配列の残基番号の位置のアミノ酸を示す。たとえば、K351は位置351のリシンを示す。文字の後に数字が続き、別の文字が続く場合、これはEU番号付けによる残基の本来の位置(例えば、野生型ヒトFc)のアミノ酸と、その位置に操作される残基を示す(例えば、K409Sは、リシンが野生型Fcの位置409に存在する場合、操作されたバリエーションはセリンであることを示す)。
本発明は、二重特異性抗体または多価多量体などのヘテロ二量体ポリペプチドを製造する方法を提供する。また、単一細胞から生成されたCH3ドメインポリペプチドの混合物からヘテロ二量体分子を生成するための改善された方法も提供する。対応するヘテロ二量体タンパク質、組成物、核酸および宿主細胞も本明細書で提供される。本発明は、高収量を有する主に(および特定の態様では、ほぼ独占的に)ヘテロ二量体ポリペプチドの生成、およびハーフボディまたはホモ二量体などの望ましくない種の低減を可能にする。本発明の方法は、ヘテロ二量体ポリペプチドのCH3界面における変異に基づいて、ヘテロ二量体の安定性を高め、ホモ二量体形成を減少させる。方法および組成物の詳細は、本明細書に提供される。
第1のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第1の核酸、および
第2のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第2の核酸、
ここで、第1の核酸は、位置K360、S364および/またはK409でCH3ドメインバリアント残基の1以上をコードし、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2つの核酸の発現を可能にし、培養物から前記ヘテロ二量体分子を回収する工程をさらに含む。
a)第1のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第1の核酸、
b)第2のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第2の核酸、
c)第3のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第3の核酸、および
d)第4のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第4の核酸、
ここで、前記核酸の少なくとも2つは、前記第1および第2のCH3ドメイン含有ポリペプチドと前記第3および第4のCH3ドメインとの優先的な対合のための手段を備え、前記第1のCH3ドメインをコードする核酸は、位置K360、S364および/またはK409にCH3ドメイン変異残基を含み、前記第3のCH3ドメインをコードする核酸は、位置K360、S364および/またはK409に1以上のCH3ドメイン変異残基を含み、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記少なくとも4つの核酸の発現を可能にし、前記培養物から前記少なくとも2つの異なるIg様分子を回収する工程をさらに含む。
a.第1のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第1の核酸、
b.第2のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第2の核酸、
ここで、第1のCH3ドメイン含有ポリペプチドは、位置K360、S364および/またはK409に変異を含み、前記方法は、前記宿主細胞を培養し、前記2つの核酸の発現を可能にし、そして前記培養物から前記ヘテロ二量体Ig様ポリペプチドを回収する工程をさらに含む。
a.第1のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第1の核酸、
b.第2のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖をコードする第2の核酸、
ここで、第1のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖は、位置K360、S364および/またはK409にDEおよびさらなるアミノ酸変異を含み、
ここで、第2のCH3ドメイン含有ポリペプチド鎖はKKを含み、
前記方法は、該宿主細胞を培養し、該2つの核酸の発現を可能にし、そして該培養物から該ヘテロ二量体Ig様ポリペプチドを回収する工程をさらに含む。
ここで、位置364のアミノ酸はバリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり、位置409のアミノ酸はイソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸である。
実施例1:インシリコ(In silico)予測
DEKK(L351D、L368E/L’351K、T’366 K)を含むヒトIgG Fc変異体を開始モデルとして用いた。WO2013/157954;De Nardis et al, J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706-14717。CH3 DEKK/DEDE界面の重要な接触残基を特定するために、インシリコで構造検討が行われた。これらの残基は、High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing(HADDOCK;タンパク質または核酸などの生体分子複合体のドッキングをモデル化する情報駆動型ドッキング アプローチ)を用いて分析し、DEDEホモ二量体の形成を大幅に減少させる変異を特定したが、有意ではなかった。DEKK界面の安定性に悪影響を及ぼしたり、安定性を向上させたりする。合計18個のヒトIgG CH3変異体がインビトロ分析用に選択され、すべてDEKK骨格であった。18個の変異体の各々は、ヒトIgG DE CH3ドメイン内の以下の位置:K360、S354、S364またはK409、の1つに異なるアミノ酸変異を有していた。
L351D、L368E (DE)変異に加えて、CH3にすべての提案された変異を含むIgGベクターを産生した。この目的のために、18個の構築物が作製された。産生は、単一のDE*重鎖、およびDE*およびKK重鎖を組み合わせたトランスフェクションを用いて実施された(ここで、*は、上記の18個の変異体の1つを示す)。BspEIおよびAflII制限酵素を用いて、構築物をMG1122C1708(図1)にクローニングした。すべての変異体を取得するために、ライゲーション産物に対してコロニー/シーケンスPCRを実施した。確認されたすべての変異体はミニプレップされ、次いで配列決定が行われ、CH2、CH3およびVHの同一性が確認された。単一のDE*構築物(PGxxxx IgGと標識)および異なるVHを有するKK構築物(PBxxxxx二重特異性IgGと標識)と組み合わせたDE*構築物の293FF細胞へのトランスフェクションを実施した。7日間のインキュベーション(37℃、8% CO2、155rpm)後、細胞上清を回収し、プロテインA精製(酸性溶出)およびPBS pH7.4へのバッファー交換を行った。その結果、サンプルのIgG濃度をOctetによって測定した。
産生および精製されたすべてのIgGを、非還元SDS-PAGEで分析した。各産生プレートについて、同量のIgGサンプルを各ウェルに、通常は1μgを添加した(これが不可能な場合は、量が最も低い濃度のサンプルに調整した)。これにより、サンプル間で直接比較を行うことができた。ゲルは、それらの完全なIgGおよびハーフボディ含有量について肉眼で検査した。Chemidoc MP Imagerソフトウェアを用いて、各ゲルの完全なIgGおよびハーフボディの相対量を定量することもできる。
シングル(PGxxxx)トランスフェクションでのハーフボディの量が多いことは、バリアント ホモ二量体が不安定であることを示した。二重トランスフェクション(PBxxxxx)のIgGバンドは、ヘテロ二量体が形成されていることを確認した。
選択された15の個の変異体は、DE:KK比1:1および3:1を含む二重特異性(CD137(MF6744 -米国公開番号2020/0017595A1;米国公開番号2019/00352401A2で以前に公開された) xフィブリノーゲン(MF1122))として産生され、ここで、DEアームを過剰発現させてそのホモ二量体形成を試験した。
修飾IgGにストレスを与えることにより、少量の安定性アッセイを行った。これらのアッセイはすべてPBS中で行った。
各サンプルの3つの100μLアリコートを300μg/mLで生成した(表3を参照)。
- 5xFT(凍結融解)(サンプルを-80℃で少なくとも1時間繰り返し保存した後、室温で完全に解凍);
- 50℃で2日間(サンプルを50℃のウォーターバスまたはインキュベーターに入れ、2日間インキュベート);
・4℃保存(ノンストレス対照として)。
生成されたIgGを、当技術分野で知られている標準的な方法に従ってHP-SECで分析した。Agilent 1260シリーズHPLCシステム、Tosoh TSK-gel G3000SWxl カタログ番号808541、Tosoh TSKガードカラムSWXL カタログ番号808543、泳動バッファー:200mM NaPO4、50mM NaCl、pH7.0、20μgのサンプルを添加。HP-SEC分析を、DLS分析(表5)と比較して小さい凝集体を検出するために実施し、-80℃で保存された後に試験で通常用いられるサンプルを表すために、1x F/Tサイクル後に実施した。
生成されたIgGをCIEX-HPLCで分析した。Agilent 1260シリーズHPLCシステム、Tosoh TSKgel SP-STATカラム、カタログ番号21964、用いたバッファー:A) 25mM NaPO4、pH6.0およびB) 25mM NaPO4、1M NaCl、pH
、0~30%バッファーBの線形勾配による分析(1mLあたり2% Bの増加)、0.5mL/分、10μgのサンプルを添加。生成されたプロファイルを、ピーク形状、保持時間、二重特異性/汚染物質の比率、および二重特異性物質と混入物質の分離について分析した(3:1トランスフェクトサンプルで最も顕著であった)。wt PG1122およびwt PG6744の間の分離は約3.7分で、KK/DEおよびその他の変異体によって増加する。WT DEKK 対照(ctrl.)は、予想どおり、10.25分(biclonic)および7.8分(DEDEホモ二量体)にピークを示した。比率が1:1または1:3のいずれの製品でも、保持時間(RT)値はほぼ同じである。
Biclonic製品のサンプル中のIgG(DEKK+DEDE)およびハーフボディの量を決定するために、LabChipを使用した。Perkin Elmer LabCihp GXII Touch HT、Protein Clear HR Reagent キット(カタログ番号CLS960014)およびProtein Express Assay LabChip (カタログ番号760499)を用いyr、製造者の指示に従って、サンプル濃度0.3μg/μLで分析した。DEハーフボディの形成は変異体間で大きく異なることが観察され、予想どおり、3:1の生産にはより多くのDEハーフボディが含まれていることが観察された(表10)。
生成されたすべてのIgGについて、100μg/サンプルをnMS分析で分析した(Rosati et al, Anal Chem. 2012 Aug 21;84(16):7227-32の方法論を参照)。さまざまな種(二重特異性、ホモ二量体、ハーフボディ)間の相対比率を調べた。
ハーフボディの検出には、LabChip、HP-SECおよびnMSなどの様々な方法が用いられた。得られた値は絶対的に異なり、nMSは他の方法よりも少ないハーフボディを検出するが、DEDEホモ二量体形成の減少における変異体の有用性に関する最終的な結論は一貫していた(表12)。DEKK、IgG由来混入物(contaminant)および凝集体の存在についてサンプルを特徴付けるためにさまざまな手法が用いられ、数値は厳密には異なるが、得られたデータから一貫した結論を導き出すことができた(表13~15)。
収量、純度およびDE混入物の形成に関して、表16に示された変異体のDEKKヘテロ二量体形成への影響をさらに調査した。この特定の例では、DE重鎖に変異を有する二重特異性タンパク質を、上記のようにさまざまなDE:KK比でKKを含む重鎖とともに生成し、プロテインAを用いて精製し、CIEXで分析し、LabChip/SDS-PAGEで分析した。
DE側の抗TTおよびKK側の抗CD3のVH配列を、SfiIおよびXhoIを用いて、以下の変異体を含むベクターにクローニングした:K360D_K409E(配列番号12)、S364L_K409L(配列番号14)、S364L(配列番号2)およびS364T_K409E(配列番号13)。すべての変異体を取得するために、ライゲーション産物に対してコロニー/シーケンスPCRを実施した。確認されたすべての変異体をミニプレップし、次いで配列決定した。IgGは、293FF細胞への様々なDE:KK比(表16)での単一のDE*構築物(PGxxxx IgGと標識される)およびKK構築物と組み合わせたDE*構築物(PBxxxxx二重特異性IgGと標識される)のトランスフェクションによって産生された。7日間のインキュベーション(37℃、8% CO2、155rpm)後、細胞上清を回収し、プロテインA精製(酸性溶出)およびPBS pH7.4へのバッファー交換を行った。サンプルのIgG濃度を測定した。その後、タンパク質を、HP-SEC、CIEXおよびLab-Chip/SDS-PAGEによって特徴付けた。
実施例3に記載のプロトコールに従って、単一アーム生成物をHP-SECによって分析した。同量の各IgGを用いたが、10μg以上を用いた。すべての変異体について、DEアームは、自然条件下で、75%を超えるハーフボディ、約10~20%のホモ二量体、およびいくつかの凝集体として実行される(表17)。
IgGタンパク質をCIEX(実施例3に記載のプロトコール)によって分析した。対照として、二重特異性サンプルで検出されたピークを割り当てることができるように、単一アームの生成物を分析した。注入されたタンパク質の量は、すべてのサンプルで調整された。単一アームを含むサンプルのタンパク質量は、各サンプルで5μgに調整された。濃度が低すぎる場合は、可能な最大量(100μL)を注入した。抗TT重鎖(VH;配列番号16)を有するWT-DEホモ二量体の予測保持時間(RT)は13分である。抗CD3重鎖(VH;配列番号17)を有するKKハーフボディのRTは26分である。KK-KK二量体の保持時間は、溶出が遅すぎて検出できない。サンプル中の成分の定量化では、プレピークは考慮しなかった。同じ種(PB、DEまたはKK)に属するピークを合計し、1つの値として追加した。CIEXカラムから溶出するサンプルの組成は、各ピークの面積のパーセンテージに基づいている。
各サンプルに存在する二重特異性タンパク質の量を、CIEXの結果を用いて推定し、二重特異性タンパク質の純度に関して考察した。ヘテロ二量体PBタンパク質の純度は、プロテインA精製を含むこの実施例で改善される。DE:KK比を大きくすることで純度が向上する(表20)。
>MV1708_DE_S364V [配列番号1]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCGTCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>MV1708_DE_S364L [配列番号2]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCCTCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>MV1708_DE_S364I [配列番号3]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCATCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>MV1708_DE_S364T [配列番号4]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCACACTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>MV1708_DE_S364Q [配列番号5]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCCAGCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCATCCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>MV1708_DE_K409L [配列番号7]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCCTGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>MV1708_DE_K409E [配列番号8]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCGAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>CH2-3_DE_K360D-S364I [配列番号9]
Tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccgacaaccaggtcatcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
>CH2-3_DE_K360D-S364T [配列番号10]
Tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcctgctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
Tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcctgctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
>CH2-3_DE_K360D-K409E [配列番号12]
Ccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccgacaaccaggtcagcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
>CH2-3_DE_S364T-K409E [配列番号13]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcacactgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcgagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
>CH2-3_DE_S364L-K409L [配列番号14]
tccggaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtttcgaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccgaccccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcctcctgacctgcgaggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcctgctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgagtttaacggatcttaattaatccgagctcggtaccaagcttaag
>MV1708_DE_K360D [配列番号15]
TCCGGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTTTCGAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCGACCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCGACAACCAGGTCAGCCTGACCTGCGAGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTTTAACGGATCTTAATTAATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTAAG
>抗TT FabのVH配列 [配列番号16]
EVQLVETGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSQYAMHWVRQAPGKGLEWVAIISHDERNKYYVDSGMGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRSEDTAVYYCARDMRKGGYYYGFDVWGQGTTVTVSS
>抗CD3 FabのVH配列 [配列番号17]
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGSKKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
Claims (15)
- 第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドおよび第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドを含む単離ヘテロ二量体タンパク質であって、前記第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、アミノ酸変異L351DおよびL368Eを含み、前記第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、アミノ酸変異T366KおよびL351Kを含み、かつ前記第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、位置S364、K409および/またはK360にアミノ酸変異をさらに含む、単離ヘテロ二量体タンパク質。
- a) 位置364のアミノ酸が、バリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり;および/または
b)位置409のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり;および/または
c) 位置360のアミノ酸がアスパラギン酸である、
請求項1に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。 - ヘテロ二量体タンパク質が、ヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 CH3領域を含む、請求項1または2に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。
- ヘテロ二量体タンパク質がヒト免疫グロブリンFc領域を含み、要すればヒト免疫グロブリンFc領域がIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。
- a) 第1のCH3含有ポリペプチドが抗体重鎖であり;および/または
b) 第2のCH3含有ポリペプチドが抗体重鎖であり;および/または
c) ヘテロ二量体タンパク質が、1以上の抗体軽鎖をさらに含み;および/または
d) 抗体軽鎖が一般的な抗体軽鎖である、
請求項1から4のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質を含む医薬組成物。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の第1および第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドをコードする単離核酸。
- 請求項7に記載の単離核酸を含む組換え宿主細胞。
- 第1および第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドの発現を可能にする条件下で、請求項8に記載の組換え宿主細胞を培養することを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離ヘテロ二量体タンパク質の製造方法。
- アミノ酸変異L351DおよびL368Eを含む第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチド、およびアミノ酸変異T366KおよびL351Kを含む第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドを含む、ヘテロ二量体タンパク質の安定性を改善する方法であって、ここで、該方法が、第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドの位置S364、K409および/またはK360にアミノ酸変異を導入することを含む、方法。
- アミノ酸変異L351DおよびL368Eを含む第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドを含む、ホモ二量体タンパク質の安定性を低下させる方法であって、ここで、該方法が、第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドの位置S364、K409および/またはK360にアミノ酸変異を導入することを含む、方法。
- 第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドおよび第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の収量を改善する方法であって、ここで、前記第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、アミノ酸変異L351DおよびL368Eを含み、かつ前記第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、アミノ酸変異T366KおよびL351Kを含み、そして該方法が、第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドの位置S364、K409および/またはK360にアミノ酸変異を導入することを含む、方法。
- 第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドおよび第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドを含むヘテロ二量体タンパク質の純度を高める方法であって、ここで、前記第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、アミノ酸変異L351DおよびL368Eを含み、かつ前記第2のヒトIgG CH3含有ポリペプチドが、アミノ酸変異T366KおよびL351Kを含み、そして該方法が、(a)第1のヒトIgG CH3含有ポリペプチドの位置S364、K409および/またはK360にアミノ酸変異を導入し;そして(b)ヘテロ二量体タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに付すことを含む、方法。
- a) 位置364のアミノ酸が、バリン、イソロイシン、スレオニン、グルタミンまたはロイシンであり;および/または
b) 位置409のアミノ酸が、イソロイシン、ロイシンまたはグルタミン酸であり;および/または
c) 位置360のアミノ酸がアスパラギン酸である、
請求項10から13のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項9に記載の方法によって産生されるヘテロ二量体タンパク質。
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