TW202208425A - 製造類ｉｇ分子之方法及手段 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於適用於治療人類疾病之異二聚體蛋白質及其製造及收集之方法。

Description

製造類Ig分子之方法及手段
本發明係關於分子生物學、醫藥學及生物治療學之領域。其尤其關於用於治療各種疾病之治療抗體之領域。
在過去十年中，雙特異性抗體已成為使用兩種抗體之組合的替代方案。類似地，能夠結合相同或不同抗原或抗原決定基中之三者或更多者之多價多聚體已成為科技之發展領域。兩種抗體之組合表示結合至相同或不同標靶上之不同抗原決定基之兩種不同免疫球蛋白之混合物，但在雙特異性抗體中此係經由單一免疫球蛋白實現。在多價多聚體中，可實現與相同或不同標靶上之三個或更多個不同抗原決定基結合。
藉由與相同或不同標靶上之兩個抗原決定基結合，相較於結合至相同抗原決定基之兩種抗體之組合，雙特異性抗體可具有類似效果或更佳效果。此亦可適用於產生能夠結合三個或更多個標靶之多價多聚體。此外，因為IgG型式之雙特異性抗體結合單一分子中之兩個不同單價結合區，且兩種IgG抗體之混合物在單次製備中使兩種不同二價結合分子組合，且多價多聚體可使三個或更多個結合區組合，故而亦已觀測到此等型式之不同效果。從科技及監管角度來看，若可以大體上純淨之方式有效生成及分離此等雙特異性或多價多聚體，則此降低單一雙特異性抗體或多價多聚體之研發複雜度，此係因為製造、臨床前及臨床測試涉及單一分子。因此，基於單一雙特異性抗體或多價多聚體之療法係由複雜度較低且成本有效之藥物研發過程所推動，其同時提供更有效之抗體療法。
已藉由各種方法製造基於IgG型式、由兩條重鏈及兩條輕鏈組成之雙特異性抗體。舉例而言，可藉由使兩種分泌抗體之細胞株融合以生成新細胞株或藉由使用重組DNA技術在單一細胞中表現兩種抗體以製造雙特異性抗體。此等途徑產生多個抗體種類，此係因為來自各抗體之各別重鏈可形成含有兩種具有相同特異性之相同成對重鏈之單特異性二聚體(亦稱為同二聚體)及含有兩種具有不同特異性之不同成對重鏈之雙特異性二聚體(亦稱為異二聚體)，且稱為半體之不成對重鏈或輕鏈可產生細胞產物之混合物。此外，來自各抗體之輕鏈及重鏈可隨機配對以形成非官能性組合。此稱為重鏈及輕鏈誤配之問題可藉由選擇共享一條共用輕鏈以表現為雙特異性之抗體而解決。近來，申請者已展示生成包含三條或更多條重鏈及三條或更多條輕鏈之多價多聚體之能力，其中重鏈或輕鏈係共用鏈，但較佳輕鏈係共用鏈。
但即使在使用共用輕鏈時，單一細胞中兩條或更多條含有促使異二聚體形成之變體的重鏈及一條共用輕鏈之表現仍可產生三個不同抗體種類及半體雜質。Fc中具有殘基之基因改造變體之重鏈的表現可促進異二聚體形成，但仍可產生殘餘半體、同二聚體，或產生因基因改造變體而具有較低穩定性之異二聚體。雙特異性抗體之表現仍可導致兩種單特異性『親代』抗體及含有匹配Fc區之雙特異性抗體的表現。所形成之半體及/或單特異性抗體愈多，細胞表現系統之總體效率愈低，且可能需要更昂貴且更費時之製程以分離相關雙特異性或多價多聚體。相應地，若需要單一雙特異性或多價多聚體產物，則需要自所得混合物純化相關雙特異性抗體或多價多聚體。
在臨床前、臨床及商業製造之情況下，回收雙特異性抗體或多價多聚體之需求係重要的。儘管已採用科技以進一步提高親代抗體與雙特異性抗體之混合物中之雙特異性抗體的百分比且降低誤配重鏈及輕鏈之百分比，但仍需要消除或使上文提及之一些缺點最小化且提高所製造之目標部分之量的雙特異性型式及多價多聚體型式。儘管先前已在本領域中描述提高雙特異性或多價多聚體之異二聚化配對之百分比的技術，但在表現產物之混合物中仍可存在非所需雜質。此外，取決於分離之手段及相關目標部分之組成，異二聚化產物(其係雙特異性抗體或多價多聚體)之分離可具有挑戰性、效率較低或較為昂貴。
因此，仍需要用於製造及純化生物治療物之改良及/或替代性科技。
本發明提供用於製造及純化諸如類Ig分子、雙特異性抗體及多價多聚體之生物治療物之新穎手段。舉例而言，當多個CH3域存在於單一細胞生成之混合物中時，其提供用於提昇至少兩個相關CH3域之間的相互作用之新穎手段(參見例如WO2013157954及WO2013157953)。
本文提供一種分離之異二聚體蛋白質，其包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364、K409及/或K360處。
適當地，364胺基酸可為纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸。
適當地，409胺基酸可為異白胺酸、白胺酸或麩胺酸。
適當地，360胺基酸可為天門冬胺酸。
適當地，異二聚體蛋白質可包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3-區。
適當地，異二聚體蛋白質可包含人類免疫球蛋白Fc區。視情況，人類免疫球蛋白Fc區可包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。
適當地，第一含CH3多肽可為抗體重鏈。
適當地，第二含CH3多肽可為抗體重鏈。
適當地，異二聚體蛋白質可進一步包含一或多條抗體輕鏈。
適當地，抗體輕鏈可為共用抗體輕鏈。
亦提供一種醫藥組合物，其包含本文所述之分離之異二聚體蛋白質。
亦提供一種分離之核酸，其編碼本文所述之第一及第二含人類IgG CH3之多肽。
亦提供一種重組宿主細胞，其包含本文所述之分離之核酸。
亦提供一種製造本文所述之分離之異二聚體蛋白質的方法，其包含在允許表現第一及第二含人類IgG CH3之多肽之條件下培養本發明之重組宿主細胞。
亦提供一種用於提高異二聚體蛋白質之穩定性的方法，該異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽，該多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，及第二含人類IgG CH3之多肽，該多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，該方法包含在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入第一含人類IgG CH3之多肽中。
亦提供一種用於降低同二聚體蛋白質之穩定性的方法，該同二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽，該多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，該方法包含在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入第一含人類IgG CH3之多肽中。
亦提供一種用於提高異二聚體蛋白質之產率的方法，該異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，該方法包含在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入第一含人類IgG CH3之多肽中。
亦提供一種用於提高異二聚體蛋白質之純度的方法，該異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，該方法包含(a)在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入第一含人類IgG CH3之多肽中；及(b)對異二聚體蛋白質進行離子交換層析法。
適當地，離子交換層析法可為陽離子交換層析法。
適當地，364胺基酸可為纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸。
適當地，409胺基酸可為異白胺酸、白胺酸或麩胺酸。
適當地，360胺基酸可為天門冬胺酸。
適當地，異二聚體蛋白質可包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3-區。
適當地，異二聚體蛋白質可包含人類免疫球蛋白Fc區。視情況，人類免疫球蛋白Fc區可包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。
適當地，第一含CH3多肽可為抗體重鏈。
適當地，第二含CH3多肽可為抗體重鏈。
適當地，異二聚體蛋白質可進一步包含一或多條抗體輕鏈。
適當地，抗體輕鏈可為共用抗體輕鏈。
亦提供一種藉由本文所述之方法製造之異二聚體蛋白質。
在此說明書之描述內容及申請專利範圍中，詞語「包含」及「含有」及其變化形式意謂「包括(但不限於)」，且其不意欲(且不)排除其他部分、添加劑、組分、整體或步驟。
在此說明書之描述內容及申請專利範圍中，除非上下文另外要求，否則單數涵蓋複數。特定而言，當使用不定冠詞時，說明書應理解為考慮複數以及單數。
結合本發明之特定態樣、實施例或實例描述之特點、整體、特徵、化合物、化學部分或基團應理解為適用於本文所描述之任何其他態樣、實施例或實例，除非與之不相容。
在下文中更詳細地描述本發明之各種態樣。
本發明提供用於製造諸如雙特異性抗體或多價多聚體之異二聚體多肽之方法。其亦提供用於自由單一細胞生成之CH3域多肽之混合物製造異二聚體分子的經改良之方法。本文亦提供相應異二聚體蛋白質、組合物、核酸及宿主細胞。本發明能夠生成具有高產率之主要(且在特定實施例中，幾乎完全)異二聚體多肽及減少諸如半體或同二聚體之非所需種類。本發明之方法基於異二聚體多肽之CH3界面處之變體而提高異二聚體穩定性及減少同二聚體形成。本文提供方法及組合物之細節。
術語「異二聚體」、「異二聚體複合物」或「異二聚體分子」在本文中可互換使用以指代包含至少一個第一多肽及一個第二多肽之分子，其中第二多肽因至少一個胺基酸殘基而在胺基酸序列上不同於第一多肽。異二聚體可包含由第一及第二多肽形成之「異二聚體」或可形成高階三級結構，其中存在除第一及第二多肽之外的多肽。
除上下文另外指示之處外，術語「第一」多肽及「第二」多肽及其變化形式僅係一般標識符，且不應用作識別本發明之異二聚體之具體或特定多肽或組分。
本領域中描述各種途徑以促進相關之特定抗體之形成，由此減少非所需抗體或所得混合物中之副產物之含量。
關於抗體，眾所周知，CH3-CH3相互作用係Fc二聚化之主要推動力(Ellerson JR.等人, J. Immunol 1976 (116) 510-517; Deisenhofer J. biochemistry 1981 (20) 2361-2370)。進一步熟知的是，當兩個CH3域相互作用時，其在蛋白質-蛋白質界面中相遇，該界面包含「接觸」殘基(亦稱為接觸胺基酸、界面殘基或界面胺基酸)。第一CH3域之接觸胺基酸與第二CH3域之一或多個接觸胺基酸相互作用。在抗體之三維結構中，接觸胺基酸通常在彼此之5.5 Å內(較佳在4.5 Å內)。來自一個CH3域之接觸殘基與來自不同CH3域之接觸殘基之間的相互作用可例如經由以下實現：范德華力(Van der Waals force)、氫鍵、水介導之氫鍵、鹽橋或其他靜電力、芳族側鏈之間的相互吸引、雙硫鍵或熟習此項技術者所已知的其他力。先前顯示，人類IgG1 CH3域界面處之大約三分之一的接觸胺基酸側鏈可對域摺疊及結合作出主要貢獻。可進一步設想，其他(相鄰)胺基酸殘基可影響蛋白質-蛋白質界面中之相互作用。
本領域中已採用途徑干擾抗體重鏈之二聚化。本領域中已描述大量對CH3域進行基因改造以選擇異二聚化而非同二聚化之手段。用於製造指定之相關雙特異性抗體之途徑係基於CH3-CH3界面內之接觸殘基的靜電基因改造。
舉例而言，用於基於CH3-CH3界面內之接觸殘基的靜電基因改造而製造指定之相關雙特異性抗體或多價多聚體之途徑係描述於美國專利第9,248,182號；第9,358,286號；第9,248,182號；及第9,758,805號中。使用組合之計算模型及迭代實驗驗證策略以識別新穎電荷-電荷配對構築體(稱為「DEKK」)，藉由以下識別接觸殘基：引入改變之電荷極性以支持促成異二聚體形成之靜電相互作用，同時減少因電荷排斥而產生之同二聚化。特定而言，L351D/T366K對導致異二聚體及極少同二聚體之有效形成。使用進一步計算分析以在異二聚體CH3界面之核心處引入其他靜電相互作用，產生L351D、L368E/L351K、T366K變體或DEKK，其顯示高產率異二聚體形成。此外，聚集、解摺疊及體內半衰期之水平係與天然抗體之水平類似。DEKK雙特異性抗體之結構分析揭示意外之相互作用。如計算模型所預測，殘基Asp-351及Glu-368與相對CH3域中之殘基Lys-366相互作用。然而，因IgG主鏈形成中之局部轉移使鹽橋相互作用穩定化，故而殘基Lys-351不像預期一樣與Asp-351相互作用，而與殘基Pro-352、Ser-354及Glu-357形成相互作用。此等相互作用可使異二聚體分子具有穩定性，使其成為研發新穎雙特異性抗體之極具吸引力的平台。
本發明係基於異二聚體雙特異性或多價多聚體，其包含變體胺基酸殘基於雙特異性或多價多聚體之CH3界面內，該等殘基可與先前描述之DEKK變體胺基酸殘基結合使用或與促進本領域中先前描述之異二聚化之其他手段結合使用，諸如Fc (CH2及/或CH3域)之旋鈕入孔技術(knob-in-hole)或電荷改造。舉例而言，使用上文提及之DEKK科技及在位置K360、S364及/或K409處將其他胺基酸殘基變體包括於包含DE變體之重鏈中，相較於同二聚體配對(例如，DEDE CH3配對)，可能進一步提高生成異二聚體配對之效率。
此外，在過度表現包含所需異二聚體之兩個重鏈臂中之一者的條件下，此可導致該臂之同二聚體之產生。舉例而言，視條件而定，當使用DEKK異二聚體基因改造時，與KK鏈之量相關之DE鏈的過度表現可能生成DEDE同二聚體。在位置K360、S364及/或K409處使用變體(如本文所述)使同二聚體失去穩定，生成半體或單一重鏈臂(例如，DE鏈而非DEDE同二聚體)，其為更簡單及更有效之純化步驟作準備，且在以與雙特異性抗體或多價多聚體之混合物形式存在時，其在測試該分子之分析中產生較少干擾。
此外，相較於同二聚體，優先製造半體，此係因為半體更容易藉助於凝膠過濾法自用於研究之蛋白質批次中分離出來，相反，同二聚體在該過濾下可能無法自異二聚體中分離或分離之難度更大。此外，相較於同二聚體及異二聚體峰，半體在相對於異二聚體峰之陽離子交換層析法(CIEX)上趨向於具有較大峰分離，使其更易於選擇與純淨雙特異性或多價多聚體相關之滯留。
本文所述之胺基酸變體中之一或多者的另一特點在於，該變體促進異二聚體形成、穩定及/或使同二聚體失去穩定性，由此提高表現系統之總體效率。
在一個態樣中，本文中所揭示之發明提供一種製造包含兩個CH3域之異二聚體分子(例如，雙特異性抗體或多價多聚體)之方法，其中一個CH3域包含CH3變體殘基於位置K360、S364及/或K409處，該方法包含提供宿主細胞中之以下物質： 第一核酸，其編碼包含第一CH3域之多肽鏈，及 第二核酸，其編碼包含第二CH3域之多肽鏈， 其中第一核酸編碼位置K360、S364及/或K409處之CH3域變體殘基中之一或多者；該方法進一步包含以下步驟：培養該宿主細胞，及允許表現該等兩種核酸，及自培養物採收該異二聚體分子。
在另一態樣中，本文中所揭示之發明提供一種製造包含至少兩種來自單一宿主細胞之不同類Ig分子之異二聚體分子(例如，雙特異性抗體或多價多聚體)之方法，其中該等兩種類Ig分子中之每一者包含兩個能夠形成界面之CH3域，且其中各異二聚體分子之CH3域包含CH3域變體殘基中之一或多者於位置K360、S364及/或K409處，該方法包含提供宿主細胞中之以下物質： a)第一核酸，其編碼包含第一CH3域之多肽鏈， b)第二核酸，其編碼包含第二CH3域之多肽鏈， c)第三核酸，其編碼包含第三CH3域之多肽鏈，及 d)第四核酸，其編碼包含第四CH3域之多肽鏈， 其中使用用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽及該等包含第三與第四CH3域之多肽之手段提供該等核酸中之至少兩者，且其中編碼該第一CH3域之該核酸包含CH3域變體殘基中之一或多者於位置K360、S364及/或K409處，且編碼該第三CH3域之該核酸包含CH3域變體殘基中之一或多者於位置K360、S364及/或K409處，該方法進一步包含以下步驟：培養該宿主細胞，及允許表現該等至少四種核酸，及自培養物採收該等至少兩種不同類Ig分子。
另一態樣包含上文之本發明，其中該優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽的手段不同於優先配對該第三與第四CH3域之手段。
在另一態樣中，本文所揭示之發明提供編碼包含第一CH3域之多肽鏈之第一核酸，其進一步分別包含DE於位置351及368處，及編碼包含第二CH3域之多肽鏈之第二核酸，其包含KK於位置351及366處，其中該等位置K360、S364及/或K409處之CH3域變體殘基中之一或多者係存在於包含第一CH3域之多肽鏈上，其進一步包含DE於位置351及368處。
在另一態樣中，本文所揭示之發明提供編碼包含第一CH3域之多肽鏈之第一核酸，其包含促進與由第二核酸編碼之包含第二CH3域之多肽鏈的異二聚化之變體，該第二核酸包含促進異二聚化之互補變體，其中該第一核酸進一步編碼(位置K360、S364及/或K409處之) CH3域變體殘基中之一或多者。
短語「陽離子交換樹脂」係指帶負電且具有與掠過或穿過固相之水溶液中之陽離子交換的游離陽離子之固相。可藉由使一或多個帶電配體附接至固相(例如，藉由共價連接)提供電荷。或者說另外，電荷可為固相之固有特性(例如，如二氧化矽之情況，其總體帶負電)。
如本文所用，術語「宿主細胞蛋白質(HCP)」意謂不同於重組細胞產物之蛋白質，諸如異二聚體多肽(例如，雙特異性抗體或多價多聚體)，其係衍生自抗體製造源(亦即，宿主細胞)之蛋白質。關於可用作治療物之雙特異性抗體，較佳自初始抗體試劑中移除HCP。如本文所用，表述「經移除之宿主細胞蛋白質」旨在包括除相關產物或目標分子(亦即，待純化之雙特異性抗體或多價多聚體)外之所有雜質，除宿主細胞蛋白質本身外，其包括衍生自宿主細胞之DNA及細胞生長因子。因此，當移除宿主細胞蛋白質時，可明顯提高目標分子之純度。
常希望製造多於一種異二聚體蛋白質，例如為了更有效地干擾疾病過程中所涉及之多個生物途徑或干擾病原體之入侵、複製及/或擴散。
多於一種異二聚體蛋白質的混合物亦尤其適用於治療特定疾病。舉例而言，在使用抗體或小分子藥物治療期間，腫瘤細胞使用許多不同策略產生抗性。抗性可涉及多個細胞表面受體及可溶性分子，且認為其有利於研發基於抗體之癌症療法，該等療法同時解決多個該等與疾病相關及與逃逸相關之機制。在涉及多於兩個該等與疾病相關及與逃逸相關之機制的情況下，雙特異性、多價多聚體或異二聚體蛋白質之混合物可提供創新及具有吸引力之治療型式。較佳地，由單一細胞製造該等異二聚體蛋白質之混合物以促成從監管角度看複雜度較低及從藥物製造及臨床研發角度看成本有效及切實可行之藥物研發過程。在基於單一細胞之途徑中，需要使用允許可控及有效製造雙特異性抗體之方法，因此減小或甚至完全放棄自非所需單特異性IgG多肽中分離雙特異性IgG多肽之所需混合物之需求。在先前技術中，已由單一細胞製造單特異性與雙特異性抗體之混合物(WO2004/009618)，但此等混合物代表若干不同雙特異性與單特異性抗體種類之複合調合物。本發明之另一目標係提供在單一細胞中製造異二聚體蛋白質(例如，雙特異性抗體)之規定混合物之手段及方法。較佳地，提供產生(雙特異性)抗體之混合物的方法，不考慮單體副產物之量，混合物具有至少95%、至少97%或甚至多於99%之比例的二聚體IgG多肽，參見本文下文。通常，在製造多個完整IgG多肽之細胞中，可能存在半多肽(單體副產物)，其可藉由本領域中已知的粒徑篩析層析法簡單移除。
在一個實施例中，本發明提供用於在單一細胞中製造規定異二聚體多肽(例如，雙特異性抗體或多價多聚體)或至少兩種不同類Ig分子之混合物而非相關單一(雙特異性)抗體的方法，其中較佳在使用表現產物高通量篩選之情況下，其他非所需二聚體抗體種類之形成減少或甚至消失，在該情況下無法使用CIEX純化，且相對於半體之同二聚體之存在可顯著打亂實驗方案及影響實驗結果之準確性。藉由在CH3界面處(在位置K360、S364及/或K409處)引入變體以減少或消除同二聚體，其提高類CH3域之斥力且可提高非類CH3域之吸引力。
在使用DEKK CH3科技時，可將此等變體引入DE鏈中。或者，可使用其他異二聚化科技引入此等變體，該科技促使不同重鏈(異二聚體形成)之配對優先於相同重鏈(同二聚體形成)之配對，例如旋鈕入孔技術或Fc (例如，CH2及/或CH3域)之電荷改造。明確規定所得混合物，且藉由設計CH3域變體控制其組成。
此外，對表現水平及/或用於表現之不同轉染比之調節影響混合物之組成。在本發明之方法中，第一核酸編碼優先與由第二核酸編碼之CH3域配對之CH3域，或者，第一核酸編碼優先與由第二核酸編碼之CH3域配對之CH3域，且第三核酸編碼優先與由第四核酸編碼之CH3域配對之CH3域。本發明亦提供可藉由本發明之方法獲得之至少兩種不同類Ig分子之混合物。
如本文所用，術語「優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽」意謂含有包含第一CH3域之多肽及/或包含第二CH3域之多肽的所得二聚體應係由與一個包含第二CH3域之多肽配對之一個包含第一CH3域之多肽組成的二聚體，以下二聚體之形成係有限的：其包含與另一包含第一CH3域之多肽配對之包含第一CH3域之多肽，及與另一包含第二CH3域之多肽配對之包含第二CH3域之多肽。同樣地，術語「優先配對該等包含第三與第四CH3域之多肽」意謂含有包含第三CH3域之多肽及/或包含第四CH3域之多肽的所得二聚體應係與一個包含第四CH3域之多肽配對之一個包含第三CH3域之多肽組成的二聚體，以下二聚體之形成係有限的：其包含與另一包含第三CH3域之多肽配對之包含第三CH3域之多肽，及與另一包含第四CH3域之多肽配對之包含第四CH3域之多肽。因此，在將編碼四個不同包含CH3域之多肽(A、B、C、D)的核酸引入單一細胞中時，製造主要係兩種雙特異性類Ig分子之混合物，而非10種不同類Ig二聚體之混合物(AA、AB、AC、AD、BB、BC、BD、CC、CD及DD)。使用本文列舉之變體的一般熟習此項技術者應理解，亦可使用此科技生成其他所需組合。
在本發明之方法中，上文所述之包含CH3域之多肽鏈中之每一者較佳進一步包含識別標靶抗原決定基之可變區或兩個或更多個可變區。作為包含CH3域之多肽鏈之部分的可變區較佳共享共用輕鏈及與共用輕鏈配對。在此情況下，只有可變區之VH不同，而所有可變區中之VL均基本相同。因此，在一個態樣中，提供本發明之方法，其進一步包含提供該宿主細胞，該細胞具有編碼共用輕鏈之核酸。在一個實施例中，包含CH3域之多肽鏈之各可變區識別不同標靶抗原決定基。在一個實施例中，4個包含CH3域之多肽鏈之該等4個可變區中之每一者識別不同標靶抗原決定基。舉例而言，若第一核酸編碼進一步含有對抗原A具有特異性之可變域的重鏈，第二核酸編碼進一步含有對抗原B具有特異性之可變域的重鏈，第三核酸編碼進一步含有對抗原C具有特異性之可變域的重鏈，且第四核酸編碼進一步含有對抗原D具有特異性之可變域的重鏈，則隨後將製造一種含有對AB具有特異性之雙特異性類Ig分子及對CD具有特異性之雙特異性類Ig分子的混合物。單特異性抗體(具有AA、BB、CC或DD特異性)或對AC、AD、BC或BD具有特異性之雙特異性抗體的形成減少或甚至消失，其歸因於用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽及該等包含第三與第四CH3域之多肽的手段。在將不同異二聚化基因改造用於該等包含第一及第二CH3域之多肽及該等包含第三及第四CH3域之多肽時，出現此情況。當然，亦可能使用其他核酸，例如編碼包含第五及第六CH3域之多肽的核酸，以便製造包含多於兩種不同類Ig分子(例如AB及CD)之規定混合物。
或者，包含對抗原A及B具有特異性之可變域的該等重鏈可包含對抗原C或D具有特異性之其他可變域，其經由連接子連接，由此形成多價多聚體，其中重鏈A及B可經由諸如DEKK之異二聚化基因改造而二聚化，且藉由將上文變體包括於一條重鏈中而減少同二聚體，其使同二聚體形成去穩定化，產生半體。
值得注意的是，用於本發明之方法的核酸之比無需為1:1:1:1，且所表現之所得類Ig分子之比無需為1:1。可能使用本領域中已知的手段製造最佳比例之抗體混合物。舉例而言，可藉由以下調節核酸之表現水平及由此調節所製造之所得類Ig分子之比：使用諸如啟動子、強化子及抑制子之不同遺傳因子，或控制編碼抗體之拷貝數之DNA構築體的基因整合位點。較佳地，如表述包含胺基酸變體L351D及L368E及變體殘基於位置S364、K409及/或K360處之第一含人類IgG CH3之多肽的量高於包含胺基酸變體T366K及L351K之第二含人類IgG CH3之多肽的量。較佳地，第一含人類IgG CH3之多肽與第二含人類IgG CH3之多肽的重量比係在1:1與10:1之間。更佳地，含有DE之多肽之量係在1:1與5:1之間，更佳在1:1與3:1之間或1:1與2:1之間。
本發明之一個態樣提供一種本發明之方法，其中用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽的該手段不同於用於優先配對該等包含第三與第四CH3域之多肽的該手段。「不同」意謂用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽的手段經設計以支持第一與第二鏈之優先配對。該設計使得包含第一與第三及/或第四CH3域之多肽鏈之間基本上不發生相互作用。換言之，該包含第一CH3域之多肽與該第三或第四多肽之間的二聚化基本上降低至零，等等。包含第三及第四CH3域之多肽可為野生型，或可包含不同於用於優先配對第一與第二CH3域之手段的優先配對手段。
本發明提供用於有效及可控製造明確規定之類Ig分子之混合物的方法，混合物中存在高比例之雙特異性抗體。在需要兩種雙特異性抗體之系統中，甚至獲得至少95%、至少97%或更大之(兩種)雙特異性抗體之比例。此意謂僅獲得至多5%、至多3%或更少之單特異性二價副產物。值得注意的是，單體副產物、半分子之量不太重要，此係因為使用半分子之尺寸差異自二聚體輕易分離此等半分子，且例如無法交聯受體。相應地，本文所述之發明提供CH3變體在重鏈臂中之用途，其在表現雙特異性抗體時，減少有利於半體之同二聚體的產生，同時保護雙特異性抗體之穩定性，其促進雙特異性抗體之純化及減少同二聚體對高通量篩選及所需雙特異性抗體之分析的干擾。較佳地，CH3域中所提供之本發明之變體減少同二聚體副產物之量，且促使異二聚體目標分子之形成，且減少所製造之半體的量，由此提高表現系統之總體效率，且簡化目標分子自HCP之下游分離。
在另一實施例中，包含第一及第二CH3域之多肽鏈之可變區識別不同標靶抗原決定基，而包含第三及第四CH3域之多肽鏈之可變區識別相同標靶抗原決定基。此將導致主要產生一種雙特異性類Ig分子及一種單特異性類Ig分子。舉例而言，若包含第一及第二CH3域之多肽鏈之可變區識別不同標靶抗原決定基且若包含第三及第四CH3域之多肽鏈之可變區均識別不同於第一及第二CH3域所識別之標靶抗原決定基的相同標靶抗原決定基，則將形成具有針對AB或CC之特異性的類Ig分子之混合物。因此，進一步提供本發明之方法，其中包含第三及第四CH3域之多肽鏈之可變區所識別之標靶抗原決定基係相同的，但其不同於包含第一或第二CH3域之多肽鏈之可變區所識別之標靶抗原決定基。
或者，在包含第一及第二CH3域之多肽鏈之可變區識別不同標靶抗原決定基時且在包含第三及第四CH3域之多肽鏈之可變區均識別與包含第一或第二CH3域之多肽鏈相同之抗原決定基時，將形成具有針對AB及AA或AB及BB之特異性的類Ig分子之混合物。因此，亦隨同本文提供本發明之方法，其中包含第三及第四CH3域之多肽鏈之可變區所識別之標靶抗原決定基係與包含第一或第二CH3域之多肽鏈之可變區所識別之標靶抗原決定基相同。
在一些實施例中，本發明之異二聚體多肽係類免疫球蛋白(類Ig)多肽。如本文所用之術語「類Ig多肽」意謂具有至少一個免疫球蛋白(Ig)域之蛋白質部分。該類Ig多肽包含含有至少一個免疫球蛋白CH3域之功能的序列，該序列較佳包含IgG1 CH3域。具有至少一個CH3域之蛋白質部分可進一步配備有特定結合部分。因此，含有用於優先配對之手段的本發明之CH3域可用於優先配對包含兩個CH3域之蛋白質部分以設計所需異二聚體結合分子或結合分子之混合物。可經改造至包含CH3域之蛋白質部分的結合部分可為任何結合劑，包括(但不限於)單鏈Fv、單鏈或串列二體(TandAb®)、VHH、Anticalins®、Nanobodies®、BiTE®、Fab、錨蛋白重複蛋白或DARPINs®、Avimers®、DART、類TCR抗體、Adnectins®、Affilins®、Trans-bodies®、Affibodies®、TrimerX®、微生物蛋白質、Fynomers®、Centyrins®或KALBITOR®。在一個實施例中，結合部分係抗體可變區(VH/VL組合)。作為包含CH3域之多肽鏈之部分的可變區較佳共享共用輕鏈。在此情況下，只有可變區之VH不同，而所有可變區中之VL均基本相同。
或者說另外，其他多肽可經基因改造至本發明之CH3域，包括細胞因子、荷爾蒙、可溶性配體、受體及/或肽。
在一個實施例中，該類Ig多肽包含全長Fc主鏈。在另一實施例中，類Ig多肽係抗體。此等抗體之可變區較佳共享共用輕鏈，但其VH區可能不同。如本文所用之術語「抗體」意謂屬於免疫球蛋白類蛋白質的蛋白質分子，其含有一或多個結合抗原上之抗原決定基的域，其中該等域係衍生自抗體之可變區或與抗體之可變區共享序列同源性。抗體係本領域中已知的且包括若干同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE及IgM。本發明之抗體可為此等同型中之任一者或此等同型之功能衍生物及/或部分。在一個實施例中，製造之類Ig分子係IgG、IgA、IgD、IgE或IgE同型之抗體。在一個實施例中，製造之類Ig分子係IgG同型之抗體，此係因為相較於其他同型之抗體，IgG抗體例如具有較長半衰期。
使用本發明之方法製造之抗體可具有任何來源之序列，包括鼠類、諸如雞之禽類及人類序列。抗體可由僅來自一種來源之序列組成，諸如全部係人類抗體，或其可具有多於一種來源之序列，該等序列例如產生嵌合或人源化抗體。可關於特異性及親和性表現抗體結合。特異性決定結合域結合何種抗原或其抗原決定基。親和性係與特定抗原或抗原決定基結合之強度之量度。如本文所用之術語「抗原」意謂可由抗體之抗原結合位點結合之物質或分子。抗原之混合物亦可稱為「抗原」；技術者應理解，腫瘤細胞之溶解產物或病毒粒子可表示為「抗原」，而該腫瘤細胞溶解產物或病毒粒子製備存在許多抗原性決定因素。抗原包含至少一個，但通常更多個抗原決定基。如本文所用之術語「抗原決定基」意謂由免疫系統，特定由抗體B細胞或T細胞識別之一部分抗原。
術語「CH3域」係本領域中所熟知的。IgG結構具有四條鏈，兩條輕鏈及兩條重鏈；各輕鏈具有兩個域，可變及恆定輕鏈(VL及CL)，且各重鏈具有四個域，可變重鏈(VH)及三個恆定重鏈域(CH1、CH2、CH3)。重鏈之CH2及CH3域區係稱為Fc (可結晶片段)部分、Fc片段、Fc主鏈或僅稱為Fc。IgG分子係異四聚體，其具有兩條在鉸鏈區經雙硫鍵(-S-S-)結合在一起之重鏈及兩條經由-S-S-雙硫鍵附接至重鏈之輕鏈。重鏈經由CH3-CH3域界面處之相互作用及經由鉸鏈區處之相互作用二聚化。在免疫球蛋白子類別中，鉸鏈雙硫鍵之數目不同(Papadea及Check 1989)。免疫球蛋白分子之Fc部分係重鏈之兩個C端恆定區(CH2及CH3域)之二聚體。其生理性功能係與互補系統相互作用及與各種細胞之表面上的特定受體相互作用。已知兩條獨立重鏈之CH3域之間的相互作用在驅動重鏈二聚化中發揮重要作用。因此，CH3域指導抗體重鏈之結合(Deisenhofer J., Biochemistry 1981(20)2361-2370; Miller S., J. Mol. Biol. 1990(216)965-973; Padlan, Advances in Protein Chemistry 1996 (49) 57-133)。因此，本發明之CH3變體可與其他抗體域組合使用以生成雙特異性或單特異性全長抗體。VH/VL組合所規定之抗體之特異性通常不影響由CH3域所驅動之重鏈二聚化行為。
CH3-CH3界面中之接觸殘基可為帶電胺基酸或在生理條件下係中性之胺基酸殘基。如本文所用之術語「帶電胺基酸殘基」或「帶電殘基」意謂具有帶電側鏈的胺基酸殘基。此等帶電側鏈可為諸如精胺酸(Arg，R)、組胺酸(His，H)及離胺酸(Lys，K)中所存在之帶正電側鏈，或可為諸如天門冬胺酸(Asp，D)及麩胺酸(Glu，E)中所存在之帶負電側鏈。如本文所用之術語「中性胺基酸殘基」或中性殘基係指所有其他不攜帶帶電側鏈之胺基酸。此等中性殘基包括絲胺酸(Ser，S)、蘇胺酸(Thr，T)、天門冬醯胺酸(Asn，N)、麩醯胺酸(Glu，Q)、半胱胺酸(Cys，C)、甘胺酸(Gly，G)、脯胺酸(Pro，P)、丙胺酸(Ala，A)、纈胺酸(Val，V)、異白胺酸(Ile，I)、白胺酸(Leu，L)、甲硫胺酸(Met，M)、苯丙胺酸(Phe，F)、酪胺酸(Tyr，Y)以及色胺酸(Trp，T)。
如本文所用之術語「CH3-CH3域界面」或「CH3界面」、「CH3-CH3配對」、「域界面」或僅「界面」係指胺基酸殘基相互作用所產生之包含單獨CH3域之多肽的兩個CH3域之間的結合，其包含第一CH3域之胺基酸與第二CH3域之胺基酸之間的至少一次相互作用。該相互作用例如經由以下實現：范德華力、氫鍵、水介導之氫鍵、鹽橋或其他靜電力、芳族側鏈之間的相互吸引、雙硫鍵之形成或熟習此項技術者所已知的其他力。
本發明進一步提供一種用於生成用於製造至少兩種不同類Ig多肽之宿主細胞的方法，該方法包含以下步驟：向該宿主細胞中引入編碼包含至少一個第一及一個第二CH3域之多肽鏈的核酸序列，其中使用用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽的手段提供該等核酸序列中之至少兩者，其中依序或同時引入該等核酸序列。類似地，宿主細胞可能已具有引入至該宿主細胞中之編碼包含至少一個第一及一個第二CH3域之多肽鏈的核酸序列，其中編碼可變區之核酸係整合於編碼CH3域之核酸旁，從而宿主細胞可用作整合不同可變區以製造不同異二聚體分子之主細胞，其中編碼至少一個第一及一個第二CH3域之該等核酸序列中之至少兩者提供用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽的手段。
本發明之另一態樣提供一種用於生成用於製造異二聚體多肽之宿主細胞的方法，該方法包含以下步驟：向該宿主細胞中引入編碼包含至少一個第一及一個第二CH3域之多肽鏈的核酸序列，其中該包含第一CH3域之多肽鏈包含帶正電胺基酸殘基，其中野生型CH3通常在該位置處具有中性胺基酸殘基，且其中該包含第二CH3域之多肽鏈包含帶負電胺基酸殘基，其中野生型CH3通常在該位置處具有中性胺基酸殘基，其中依序或同時引入該等核酸序列。用於生成該等宿主細胞之該等方法較佳進一步包含以下步驟：將編碼共用輕鏈之核酸序列併入該宿主細胞中，或者，該等方法將該等核酸序列暫時整合至已具有編碼共用輕鏈之核酸序列的宿主細胞中，但較佳穩定整合至宿主細胞中。
本文亦提供一種重組宿主細胞，其包含編碼包含至少一個第一、一個第二、一個第三及一個第四CH3域之多肽鏈的核酸序列，其中使用用於優先配對該等包含第一與第二CH3域之多肽及該等包含第三與第四CH3域之多肽的手段提供該等核酸中之至少兩者。
本發明進一步提供一種重組宿主細胞，其包含編碼包含至少一個第一及一個第二CH3域之多肽鏈的核酸序列，其中該包含第一CH3域之多肽鏈包含帶正電胺基酸殘基，其中野生型CH3通常在該位置處具有中性胺基酸殘基，且其中該包含第二CH3域之多肽鏈包含帶負電胺基酸殘基，其中野生型CH3通常在該位置處具有中性胺基酸殘基。
本發明之重組宿主細胞可進一步包含編碼共用輕鏈之核酸。
本發明之「宿主細胞」可為任何能夠表現重組DNA分子之宿主細胞，包括細菌，例如埃氏菌屬(Escherichia) (例如，大腸桿菌)、腸桿菌屬、沙氏桿菌屬(Salmonella)、桿菌屬、假單胞菌屬、鏈絲菌屬、諸如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母(K. lactis)、畢赤酵母(P. pastoris)、念珠菌或耶氏酵母(Yarrowia)之酵母菌屬；絲狀真菌，諸如紅黴屬、綠麴菌、小巢狀麴菌及黑麴菌；昆蟲細胞，諸如草地夜蛾SF-9或SF-21細胞；及較佳哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、BHK細胞、包括SP2/0細胞及NS-0骨髓瘤細胞之小鼠細胞、諸如COS及Vero細胞、MDCK細胞、BRL 3A細胞、雜交瘤、腫瘤細胞、不死原生細胞之靈長類細胞、諸如W138、HepG2、HeLa、HEK293、HT1080或胚胎視網膜細胞(諸如PER. C6)之人類細胞等。所選表現系統常應涉及哺乳動物細胞表現載體及宿主，從而可使抗體適當糖基化。可使用人類細胞株以獲得具有完全人類糖基化型態之抗體。用於細胞生長或增殖之條件(參見例如，Tissue Culture, Academic Press, Kruse及Paterson編(1973))與用於表現重組產物之條件可略有差異，且通常根據熟習此項技術者普遍已知的方法進行製程之最佳化以提高產物比例及/或提昇細胞相對於彼此之生長。一般而言，用於使哺乳動物細胞培養物之生產率最大化之原則、方案及實用技術可見於Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler編, IRL Press, 1991)中。重組宿主細胞中抗體之表現已廣泛描述於本領域中。編碼輕鏈及重鏈之核酸可以染色體外複製物之型式存在及/或穩定整合於宿主細胞之染色體中。
本發明之另一態樣提供一種本發明之重組宿主細胞之培養物或可藉由或藉由本發明之方法獲得之重組宿主細胞之培養物，該培養物製造一或多種異二聚體多肽。
為了獲得編碼包含CH3域之多肽之核酸序列的表現，彼等熟習此項技術者熟知能夠促成該表現之序列可與編碼包含CH3域之多肽之核酸序列功能性連接。功能性連接旨在描述編碼包含CH3域之多肽或其前體之核酸序列係與能夠促成表現之序列連接，從而此等序列可促成包含CH3域之多肽或其前體的表現。適用之表現載體可獲自本領域，例如英傑公司(Invitrogen)之pcDNA載體系列。當編碼相關多肽之序列參照控制經編碼之多肽的轉錄及轉譯之序列合理整合時，所得表現盒適用於製造相關多肽，其稱為表現。促成表現之序列可包括啟動子、強化子及類似物，及其組合。此等序列應能夠在宿主細胞中起作用，由此促成與其功能性連接之核酸序列的表現。啟動子可為組成性的或受調控，且可獲自各種來源，包括病毒、原核來源或真核來源，或為人工設計的。相關核酸之表現可來自天然啟動子或其衍生物或來自完全異源啟動子。真核細胞中一些熟知及常用之表現啟動子包含衍生自諸如腺病毒之病毒的啟動子，例如E1A啟動子；衍生自細胞巨大病毒(CMV)之啟動子，諸如CMV即早(IE)啟動子；衍生自猿猴病毒40 (SV40)之啟動子及類似啟動子。合適啟動子亦可衍生自真核細胞，諸如金屬硫蛋白(MT)啟動子、延長因子1a (EF-1a)啟動子、肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱震啟動子及類似啟動子。任何能夠促成宿主細胞中相關序列之表現的啟動子或強化子/啟動子均適用於本發明。在一個實施例中，能夠促成表現之序列包含來自CMV啟動子之區，該區較佳包含CMV即早基因強化子/啟動子之核苷酸–735至+95。技術者應理解，本發明所用之表現序列可適當與可使表現穩定化或提昇表現之要素組合，諸如絕緣體、基質結合區、STAR要素(WO 03/004704)及類似要素。由此可提昇表現之穩定性及/或水平。
重組宿主細胞中之蛋白質生成已廣泛描述於例如Current Protocols in Protein Science, 1995, Coligan JE, Dunn BM, Ploegh HL, Speicher DW, Wingfield PT, ISBN 0-471-11184-8; Bendig, 1988中。進行細胞培養以允許其代謝及/或生長及/或分裂及/或製造相關重組蛋白質。此可藉由熟習此項技術者所熟知的方法實現，且包括(但不限於)向細胞提供營養劑。該等方法包含附著於表面生長、於懸浮液中生長或其組合。可藉由本領域中所熟知的方法使若干培養條件最佳化以使蛋白質生產率最佳化。可例如使用分批、分批饋料、連續系統、空心纖維及類似物在盤、燒瓶、滾瓶或在生物反應器中進行培養。為了經由細胞培養大規模(連續)製造重組蛋白質，使用能夠生長於懸浮液中之細胞，且細胞能夠在無衍生自動物或人類之血清或衍生自動物或人類之血清組分之條件下培養。因此，無其他衍生自培養基之動物或人類蛋白質使得純化更簡單且提昇安全性，同時亦因合成培養基之再現性最佳而使系統十分可靠。
類免疫球蛋白多肽係表現於宿主細胞中，且藉由熟習此項技術者一般已知的方法自細胞或較佳自細胞培養基採收。採收後，可藉由使用本領域中已知的方法分離此等類Ig多肽。該等方法可包括沈澱、離心、過濾、粒徑篩析層析法、親和層析法、陽離子及/或陰離子交換層析法、疏水相互作用層析法及類似方法。關於包含IgG多肽之抗體混合物，可適當使用蛋白質A或蛋白質G親和層析法(參見例如美國專利4,801,687及5,151,504)。
在使用親和層析法捕獲後，使用垂直精煉步驟移除任何與製程相關之殘餘雜質，雜質可包括同二聚體、電荷變體、HCP及DNA。一般而言，為了獲得經分離之雙特異性抗體或多價多聚體，進行以下步驟，其包括培養宿主細胞，淨化採收物，隨後捕獲蛋白質，包括陰離子交換層析法以移除宿主細胞DNA，隨後使用CIEX移除宿主細胞蛋白質、浸出蛋白質A及潛在聚集物，接著諸如病毒過濾之其他步驟。熟習此項技術者知道可改變該等步驟之順序或替換個別步驟或刪除個別步驟。舉例而言，第二精煉步驟之替代步驟包括疏水相互作用層析法及混合模式層析法。
使用本發明之方法製造之類免疫球蛋白多肽及/或其混合物較佳具有共用輕鏈。因此，進一步提供本發明之方法，其進一步包含提供該具有編碼共用輕鏈之核酸的宿主細胞。此係能夠與至少兩條不同重鏈配對，由此形成功能性抗原結合域之輕鏈。功能性抗原結合域能夠特定結合至抗原。在一個實施例中，使用能夠與採用本發明之方法所製造的所有重鏈配對，由此形成功能性抗原結合域之共用輕鏈，從而避免非匹配重鏈與輕鏈之誤配。在一個態樣中，僅使用具有一種相同胺基酸序列之共用輕鏈。或者，熟悉此項技術者應認識到，「共用」亦指代胺基酸序列不相同之輕鏈的功能等效物。該輕鏈存在許多變體，其中存在不會顯著影響功能結合區之形成的突變(刪除、取代、添加)。因此，該等變體亦能夠結合不同重鏈且形成功能性抗原結合域。因此，如本文所用之術語「共用輕鏈」係指可能相同或具有一些胺基酸序列差異但在與重鏈配對後保留所得抗體之結合特異性的輕鏈。舉例而言，可能製備或發現不相同但功能仍等效之輕鏈，例如藉由引入並測試保守胺基酸變化及/或在與重鏈配對時不影響或僅部分影響結合特異性之區中的胺基酸變化而實現。特定共同輕鏈及該等功能等效變體之組合涵蓋在術語「共同輕鏈」內。關於共同輕鏈使用之詳細描述，參考WO 2004/009618。較佳地，用於本發明之共用輕鏈係類生殖系列輕鏈，更佳係生殖系列輕鏈，較佳係重新排列之生殖系列人類κ輕鏈，最佳係重新排列之生殖系列人類κ輕鏈IgVκ1-39/Jκ或IGVκ3-20/Jκ。共用輕鏈較佳包含如上文所述具有0-5個胺基酸插入、刪除、取代、添加或其組合之輕鏈可變區。另一較佳共用輕鏈係人類κ輕鏈IgVκ1-39/IGJκ5。較佳地，本發明之抗體包含人類κ輕鏈IgVκ1-39/IGJκ5之可變區。其他較佳共用輕鏈係人類κ輕鏈IgVκ3-15/IGJκ1。較佳地，本發明之抗體包含人類κ輕鏈IgVκ3-15/IGJκ1之可變區。其他較佳共用輕鏈係人類κ輕鏈IgVκ3-20/IGJκ1。較佳地，本發明之抗體包含人類κ輕鏈IgVκ3-20/IGJκ1之可變區。其他較佳共用輕鏈係人類λ輕鏈IgVλ3-21/IGJλ3。較佳地，本發明之抗體包含人類λ輕鏈IgVλ3-21/IGJλ3之可變區。
或者，技術者可選擇例如WO2009/080251、WO2009/080252及/或WO2009/080253中所述之用於強制配對重鏈與輕鏈之手段作為使用共用輕鏈及避免非匹配重鏈與輕鏈之誤配的替代方案。
本發明人已在先前描述具有帶電殘基之CH3胺基酸之表現，其中野生型CH3在該位置處具有中性胺基酸殘基，因此兩個CH3域之交替電荷產生穩定相互作用(例如，第一CH3具有帶正電殘基於位置351及366處，且第二CH3具有帶負電殘基於位置351及368處)。可使用上文促進異二聚化之手段或熟習此項技術者已知的促進異二聚化之其他手段引入本發明之變體及經修飾之重鏈。本文所揭示之發明進一步能夠基於CH3界面處之胺基酸殘基變體而促進CH3域之異二聚化，且亦可而提高異二聚化之穩定性或降低同二聚體之穩定性，且較佳實現前述優勢之組合。
相較於野生型二聚體(野生型二聚體係規定為與其同二聚體(AA或BB)相反之不含CH3基因改造之雙特異性IgG (AB))，本發明之異二聚體更穩定且更易於自混合物及雜質中分離。出人意料地，已能夠更進一步提高混合物中相關一或多種類Ig多肽之比例。用於優先製造異二聚體(例如，雙特異性抗體)之本領域中已知的方法通常涉及製造一些非所需二聚體副產物。舉例而言，使用熟習此項技術者已知的旋鈕入孔科技之相關雙特異性抗體之比例最佳報導為87%，而其中帶電接觸胺基酸經相反電荷之胺基酸取代之靜電改造途徑亦導致報導為至多96%之比例。本發明人已成功引入進一步提高相關異二聚體多肽之比例的變體。
本發明係關於包含至少一個變體殘基於位置K360、S364及/或K409處之CH3域。此等變體殘基更詳細地描述於下文。若字母後接數字再接另一字母，則此表示根據EU編號之殘基之原生位置(例如，野生型人類Fc)中之胺基酸及經基因改造至彼位置中之殘基(例如，K409S表示若賴胺酸存在於位置409處之野生型Fc中，則基因改造變體係絲胺酸)。EU編號參見例如：http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/ Hu_IGHGnber.html。
本發明之一個實施例提供一種用於自單一細胞製造異二聚體多肽之方法，其中該異二聚體多肽包含胺基酸變體於位置K360、S364及/或K409處，該方法包含提供該細胞中之以下物質： a. 第一核酸，其編碼包含第一CH3域之多肽鏈， b. 第二核酸，其編碼包含第二CH3域之多肽鏈， 其中包含第一CH3域之多肽包含變體於位置K360、S364及/或K409處，該方法進一步包含以下步驟：培養該宿主細胞，及允許表現該等兩種核酸，及自培養物採收該等異二聚體類Ig多肽。
因此，本發明之一個實施例提供一種異二聚體多肽，其中該異二聚體多肽包含兩個CH3域，其中該包含第一CH3域之多肽鏈包含DE胺基酸變體，且其中該包含第二CH3域之多肽鏈包含KK胺基酸變體，且其中該包含第一CH3域之多肽鏈中之一或多個位置K360、S364及/或K409處之一或多個殘基係相對於人類野生型殘基之變體。
本發明之一個實施例提供一種用於自單一細胞製造異二聚體多肽之方法，其包含提供該細胞中之以下物質： a. 第一核酸，其編碼包含第一CH3域之多肽鏈， b. 第二核酸，其編碼包含第二CH3域之多肽鏈， 其中包含第一CH3域之多肽鏈包含DE及其他胺基酸變體於位置K360、S364及/或K409處，其中包含第二CH3域之多肽鏈包含KK，及 該方法進一步包含以下步驟：培養該宿主細胞，及允許表現該等兩種核酸，及自培養物採收該等異二聚體類Ig多肽。
在另一實施例中，位置K360、S364及/或K409處之變體殘基係與其他異二聚化變體組合，包含例如旋鈕入孔技術、CH3區處之相反電荷置換或一般熟習此項技術者所已知的其他技術。
在一個實施例中，該方法進一步包含提供該具有編碼共用輕鏈之核酸的宿主細胞之步驟，其具有如本文先前陳述之優勢。
如本文別處所陳述，描述一種包含第一含CH3多肽及第二含CH3多肽的異二聚體蛋白質，其中該第一含CH3多肽包含另一胺基酸變體於位置S364、K409及/或K360處。視情況，第一及第二CH3多肽係人類的。
舉例而言，本文所述之第一含CH3多肽可包含S364V胺基酸。
或者，本文所述之第一含CH3多肽可包含S364I胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含CH3多肽可包含S364T胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含CH3多肽可包含S364Q胺基酸。
或者，本文所述之第一含CH3多肽可包含S364L胺基酸。
本文所述之第一含CH3多肽可包含胺基酸變體於位置K409處作為替代物，或除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
相應地，本文所述之第一含CH3多肽可包含K409I胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
或者，本文所述之第一含CH3多肽可包含K409L胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
在另一實例中，本文所述之第一含CH3多肽可包含K409E胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
本文所述之第一含CH3多肽可包含胺基酸變體於位置K360處作為替代物，或除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)及/或變體於位置K409處(例如，如上文詳細描述之K409I、K409L或K409E)。
相應地，本文所述之第一含CH3多肽可包含K360D胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)及/或視情況除胺基酸外亦包含變體於位置K409處(例如，如上文詳細描述之K409I、K409L或K409E)。
在一個實例中，異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364、K409及/或K360處。視情況，該第一含人類IgG CH3之多肽進一步包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K。
舉例而言，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V胺基酸。
或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q胺基酸。
或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L胺基酸。
本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含胺基酸變體於位置K409處作為替代物，或除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
相應地，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K409I胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K409L胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K409E胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)。
本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含胺基酸變體於位置K360處作為替代物，或除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)及/或變體於位置K409處(例如，如上文詳細描述之K409I、K409L或K409E)。
相應地，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K360D胺基酸，視情況除胺基酸外亦包含變體於位置S364處(例如，如上文詳細描述之S364V、S364I、S364T、S364Q或S364L)及/或視情況除胺基酸外亦包含變體於位置K409處(例如，如上文詳細描述之K409I、K409L或K409E)。
在一個實例中，所述之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364、K409及/或K360處。
相應地，在一個實例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364處。
在一特定實例中，364胺基酸係纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸。
在一個實施例中，364胺基酸係纈胺酸。
在一個實施例中，364胺基酸係異白胺酸。
在一個實施例中，364胺基酸係蘇胺酸。
在一個實施例中，364胺基酸係麩醯胺酸。
在一個實施例中，364胺基酸係白胺酸。
在另一實施例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置K409處。
在特定實例中，409胺基酸係異白胺酸、白胺酸或麩胺酸。
在一個實施例中，409胺基酸係異白胺酸。
在一個實施例中，409胺基酸係白胺酸。
在一個實施例中，409胺基酸係麩胺酸。
在另一實施例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置K360處。
在特定實例中，360胺基酸係天門冬胺酸。
本文所述之胺基酸變體可指本發明之異二聚體蛋白質之「DE」臂中之位置S364、位置K409或位置K360處的單一變體。在本發明之其他實施例中，異二聚體蛋白質具有至少兩個變體於選自以下之位置處：S364、K409或K360。在本發明之其他實施例中，異二聚體蛋白質具有至少三個其他變體於位置S364、K409及K360處。
因此，在一個實施例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364及K409處，其中364胺基酸係纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸，且409胺基酸係異白胺酸、白胺酸或麩胺酸。
舉例而言，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V胺基酸及K409I胺基酸。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V胺基酸及K409L胺基酸。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V胺基酸及K409E胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I胺基酸及K409I胺基酸。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I胺基酸及K409L胺基酸。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I胺基酸及K409E胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T胺基酸及K409I胺基酸。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T胺基酸及K409L胺基酸。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T胺基酸及K409E胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q胺基酸及K409I胺基酸。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q胺基酸及K409L胺基酸。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q胺基酸及K409E胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L胺基酸及K409I胺基酸。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L胺基酸及K409L胺基酸。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L胺基酸及K409E胺基酸。
在另一實施例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364及K360處，其中364胺基酸係纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸，且360胺基酸係天門冬胺酸。
舉例而言，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實施例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置K409及K360處，其中409胺基酸係異白胺酸、白胺酸或麩胺酸，且360胺基酸係天門冬胺酸。
舉例而言，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K409I胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K409L胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含K409E胺基酸及K360D胺基酸。
在另一實施例中，所提供之異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364、K409及K360處，其中364胺基酸係纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸；409胺基酸係異白胺酸、白胺酸或麩胺酸，且360胺基酸係天門冬胺酸。
舉例而言，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V、K409I及K360D。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V、K409L及K360D。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364V、K409E及K360D。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I、K409I及K360D。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I、K409L及K360D。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364I、K409E及K360D。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T、K409I及K360D。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T、K409L及K360D。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364T、K409E及K360D。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q、K409I及K360D。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q、K409L及K360D。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364Q、K409E及K360D。
在另一實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L、K409I及K360D。或者，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L、K409L及K360D。在一個實例中，本文所述之第一含人類IgG CH3之多肽可包含S364L、K409E及K360D。
在一特定實施例中，360胺基酸係天門冬胺酸，且364胺基酸係異白胺酸。
在另一實施例中，360胺基酸係天門冬胺酸，且364胺基酸係蘇胺酸。
在另一實施例中，360胺基酸係天門冬胺酸，且364胺基酸係纈胺酸。
在又另一實施例中，360胺基酸係天門冬胺酸，且409胺基酸係麩胺酸。
在另一實施例中，364胺基酸係白胺酸，且409胺基酸係白胺酸。
在又另一實施例中，364胺基酸係蘇胺酸，且409胺基酸係麩胺酸。
可藉由本領域中已知的任何合適手段製造變體多肽。本文所述之變體可基於人類IgG CH3域，但隨後具有一或多個親代胺基酸(於位置360、364及/或409處)，其隨本文所述之人類IgG CH3胺基酸之相應位置而變。
人類IgG CH3域之序列係本領域中廣為人知的。藉由改變多肽中之一或多個胺基酸，彼等位置處之側鏈發生變化。可經由各種手段將本文所述之胺基酸變體引入至編碼CH3域之核酸中或引入CH3域本身中，包括使用分子生物學之基因手段或經由酶手段或化學手段。用於生成本文所述之變體的合適方法係本領域中廣為人知的。舉例而言，可經由編碼變體序列且經由任意數目之供應商訂購之核酸合成重新生成變體核酸。類似地，可經由本領域中廣為人知的定位突變技術生成變體核酸。視需要表現及分析該等編碼可隨後選殖至宿主細胞中之變體多肽的核酸。使用熟知程序進行此等實踐，且各種可使用之方法係描述於Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 第三版(Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 紐約(New York), 2001)及Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)中，兩種文獻均以引用方式全文併入。編碼變體之核酸可併入表現載體中以表現蛋白質。表現載體通常包括與控制或調節序列、可選標記、任何融合伴侶及/或其他元素連接之啟動子。可藉由以下製造變體：在引發或導致蛋白質表現之合適條件下，培養經核酸轉化之宿主細胞，較佳係表現載體，其含有編碼變體之核酸。可使用廣泛多種合適宿主細胞，其包括(但不限於)哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞及酵母。舉例而言，各種可使用之細胞株係描述於ATCC細胞株目錄中，其可獲自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，該文獻係以引用方式全文併入。將外源性核酸引入至宿主細胞中之方法係本領域中廣為人知的，且將視所用宿主細胞而改變。
在本發明之一個態樣中，提供一種用於製造至少兩種不同類Ig分子或用於製造異二聚體類Ig分子之本發明的方法，其中包含CH3域之多肽鏈中之每一者進一步包含識別不同標靶抗原決定基之可變區，其中標靶抗原決定基位於相同分子上。相較於其中僅靶向一個抗原決定基之情況，此情況通常更有效地抵消該標靶分子之(生物)功能。舉例而言，異二聚體類免疫球蛋白分子可同時結合至存在於例如對腫瘤細胞增殖至關重要之生長因子受體或可溶性分子上的2個抗原決定基，由此有效阻斷導致不可控增殖之若干獨立傳訊通路，且至少兩種類Ig分子之任意組合可同時結合至存在於該等生長因子受體或可溶性分子上的2個或甚至3個或4個抗原決定基。
在一個實施例中，標靶分子係可溶性分子。在另一實施例中，標靶分子係膜結合分子。
在本發明之另一態樣中，提供一種用於製造一或多種異二聚體類免疫球蛋白分子之本發明的方法，其中包含CH3域之多肽鏈中之每一者進一步包含識別不同標靶抗原決定基之可變區，其中標靶抗原決定基位於不同分子上。在此情況下，不同標靶分子中之每一者可為可溶性分子或膜結合分子。在一個實施例中，不同標靶分子係可溶性分子。或者，一個標靶分子係可溶性分子，而第二標靶分子係膜結合分子。在又另一替代方案中，標靶分子均係膜結合分子。在一個實施例中，不同標靶分子係表現於相同細胞上，而在其他實施例中，不同標靶分子係表現於不同細胞上。作為非限制性實例，任何異二聚體類免疫球蛋白分子或至少兩種類免疫球蛋白分子之任意組合可適用於同時阻斷多種膜結合受體，中和多種可溶性分子，諸如用於腫瘤細胞或用於中和不同病毒血清型或病毒株之細胞因子或生長因子。
一個實施例提供一種用於製造一或多種異二聚體類免疫球蛋白分子之本發明的方法，其中該等標靶抗原決定基中之至少一者係位於腫瘤細胞上。或者說另外，該等抗原決定基中之至少一者係位於效應子細胞之表面上。此例如適用於募集T細胞或NK細胞進行腫瘤細胞滅殺。舉例而言，使用本發明之方法製造至少一種類Ig分子，該方法能夠藉由與位於免疫效應子細胞上之標靶分子特異性結合而募集免疫效應子細胞，較佳人類免疫效應子細胞。在另一實施例中，該免疫效應子細胞係在類免疫球蛋白分子與標靶分子結合時激活。舉例而言，效應子機制之募集可涵蓋藉由投與藉由本發明之方法所製造、能夠結合至諸如T細胞受體或Fc γ受體之細胞毒性觸發分子的類免疫球蛋白分子而對免疫調節之細胞毒性重新定向，由此激活下游免疫效應子路徑。如本文所用之術語「免疫效應子細胞」或「效應子細胞」係指哺乳動物免疫系統中天然細胞庫中之細胞，其可經激活以影響標靶細胞之存活力。免疫效應子細胞包括諸如天然殺手(NK)細胞、包括細胞毒性T細胞之T細胞或B細胞之淋巴譜系細胞，但骨髓譜系細胞亦可視為諸如單核細胞或巨噬細胞、樹狀細胞及嗜中性顆粒細胞之免疫效應子細胞。因此，該效應子細胞較佳係NK細胞、T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹狀細胞或嗜中性顆粒細胞。
因此，在一個態樣中，本發明提供用於製造異二聚體類免疫球蛋白多肽之本發明的方法，其中包含CH3域之多肽鏈中之每一者進一步包含識別標靶抗原決定基之可變區。在一個實施例中，包含CH3域之多肽鏈之2個可變區中之每一者識別具有不同親和力之相同標靶抗原決定基。在另一實施例中，包含CH3域之多肽鏈之2個可變區中之每一者識別不同標靶抗原決定基。在另一實施例中，不同標靶抗原決定基係位於相同標靶分子上，其可係膜結合分子或可溶性分子。在另一實施例中，不同標靶抗原決定基係位於不同標靶分子上，其可表現於相同細胞或不同細胞上。或者，不同標靶分子可為可溶性分子，或一個標靶分子可為可溶性分子，而第二標靶分子係膜結合分子。在一個實施例中，異二聚體類免疫球蛋白多肽之標靶分子中之至少一者係位於腫瘤細胞上。在又另一實施例中，異二聚體類Ig多肽之標靶分子中之至少一者係位於效應子細胞上。
在一個實施例中，提供用於製造一或多種異二聚體類免疫球蛋白多肽之本發明的方法，其中該等多肽係抗體。在一個實施例中，抗體係IgG、IgA、IgD、IgE或IgM同型。在一個實施例中，抗體係IgG同型。在另一實施例中，抗體係IgG1同型。
進一步提供一種異二聚體類免疫球蛋白多肽或至少兩種類Ig多肽之混合物，其可藉由本發明之方法獲得。該異二聚體多肽或多肽之混合物包含兩個CH3域，其中該等兩個CH3域中之一者包含胺基酸變體L351D及L368E，且其中該等兩個CH3域中之另一者包含胺基酸變體T366K及L351K，包括一或多種野生型CH3序列之抗體，其促進異二聚化及/或使同二聚體形成失去穩定，且較佳實現此等效益之組合，包含根據EU編號位於360、364及409位置處之變體。
如先前所闡釋，此等胺基酸變體促使該等兩個CH3域之優先配對。該等兩個CH3域中之一者中的胺基酸變體L351D及L368E以及該等兩個CH3域中之另一者中的胺基酸變體T366K及L351K在本文中一同稱為DEKK。攜載胺基酸變體L351D及L368E之CH3域亦稱為「DE側」、「DE臂」或「DE」，且攜載胺基酸變體T366K及L351K之CH3域亦稱為「KK側」、「KK臂」或「KK」。本文所述之胺基酸變體(位置K360、S364及/或K409處)可單獨引入或較佳與其他變體一同引入以促進異二聚化，且更佳位於DEKK主鏈上，且更佳位於DE側上。而胺基酸位置360、364及409處之變體能夠增強異二聚體之穩定性及/或使同二聚體失去穩定。
亦提供一種包含異二聚體類免疫球蛋白多肽或至少兩種多肽之混合物的醫藥組合物，其可藉由本發明之任何方法獲得。在一個實施例中，異二聚體多肽係一或多種抗體或多價多聚體。該醫藥組合物可包含異二聚體類免疫球蛋白多肽或至少兩種多肽之混合物，該混合物包含單特異性或雙特異性類Ig分子或單特異性與雙特異性類Ig多肽之組合。此外，本發明之醫藥組合物包含醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，該「醫藥學上可接受之載劑」包括生理學上可相容之溶劑、鹽、分散介質、包衣、抗菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及類似試劑。視投與途徑而定(例如，靜脈內、皮下、關節內及類似途徑)，類Ig多肽可包於一種材料中以保護類Ig多肽免受可使類Ig多肽失活之酸及其他自然條件之作用的影響。
在一個實施例中，本發明提供一種異二聚體抗體，其包含具有第一人類IgG CH3區之第一重鏈及具有不同於第一人類IgG CH3區之第二人類IgG CH3區之第二重鏈，其中第一人類CH3區包含IgG CH3胺基酸變體L351D及L368E，且第二人類CH3區包含人類IgG CH3胺基酸變體T366K及L351K，且其中第一人類IgG CH3區包含另一胺基酸變體於位置K360、S364或K409處。異二聚體抗體較佳包含一或多條抗體輕鏈。第一及第二人類IgG CH3區較佳係人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4區。第一及第二人類IgG CH3區較佳係IgG1 CH3區。第一重鏈可包含不同於第二重鏈之重鏈可變區之重鏈可變區。包含與合適輕鏈結合之不同重鏈可變區之抗體可變域可結合不同抗原決定基及/或抗原。第一重鏈及/或第二重鏈可包含多於一個可變區。包含一或兩條具有多於一個可變區之重鏈的異二聚體抗體可與合適互補可變區一同形成三個或更多個可變域。具有兩個或更多個結合不同抗原決定基及/或抗原之可變域的異二聚體抗體亦稱為雙特異性、三特異性、四特異性等抗體。該等抗體亦統稱為多特異性抗體。
出於清楚且簡潔描述之目的，特徵在本文中描述為相同或獨立實施例之一部分，然而，應瞭解，本發明之範疇可包括具有所述特徵中之全部或一些之組合的實施例。
藉由以下實例進一步闡釋本發明。此等實例不以任何方式限制本發明，且僅用於闡明本發明。
除非本文中另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。同時，如本文所用，單數術語「一(a/an)」包括複數指示物。除非另外指示，否則分別以5'至3'方向自左向右書寫核酸；以胺基至羧基方向自左向右書寫胺基酸序列。應理解，本發明不限於所述特定方法論、方案及試劑，此係因為此等要素可視彼等熟悉此項技術者使用之情況而變化。
藉由以下非限制性實例說明本發明之態樣。
實例 實例 1 ：電腦模擬預測 包含DEKK之人類IgG Fc變體(L351D、L368E/L'351K、T'366K)係用作初始模型。WO2013/157954; De Nardis等人, J. Biol. Chem. (2017) 292(35) 14706–14717。經由電腦模擬進行結構研究以識別CH3 DEKK/DEDE界面中之關鍵接觸殘基。使用高度模糊驅動之蛋白質-蛋白質對接(High Ambiguity Driven protein-protein DOCKing，HADDOCK；將例如蛋白質或核酸之生物分子複合物之對接作成模型之資訊驅動型對接途徑)分析此等殘基以識別明顯減少DEDE同二聚體之形成同時未對DEKK界面之穩定性產生明顯負面影響或顯著提高穩定性之變體。總計選擇18種人類IgG CH3變體進行體外分析，其均處在DEKK背景中。18種變體中之每一者在人類IgG DE CH3域中之一個以下位置處具有不同的變體胺基酸：K360、S354、S364或K409。
實例 2 ：體外 SDS-PAGE 實驗 產生除L351D、L368E (DE)突變外，於CH3中還具有全部所提出之變體之IgG載體。出於此目的，生成18種構築體。使用單一DE*重鏈以及DE*與KK重鏈之組合轉染進行製造，其中*表示上文所述之18種變體中之一者。使用BspEI及AflII限制酶將構築體選殖至MG1122C1708中(圖1)。對連接產物進行菌落/序列PCR以收回所有變體。小量製備所有確定變體，隨後定序以確定CH2、CH3及VH同一性。將單一DE*構築體(標記為PGxxxx IgG)及與攜帶不同VH之KK構築體組合之DE*構築體(標記為PBxxxxx雙特異性IgG)轉染至293FF細胞中。培育7日後(37℃，8% CO2 ，155 rpm)，採收細胞上清液，隨後進行蛋白質A純化(酸性溶離)，且將緩衝液更換為PBS pH 7.4。此後，藉由Octet量測樣本之IgG濃度。
SDS-PAGE 分析 使用非還原性SDS-PAGE分析所有製造及純化之IgG。對於各製造盤，將相同量之IgG樣本載入各孔中，通常載入1 µg (若此不可能，則根據最低濃度之樣本對量進行調節)。此允許直接進行樣本之間的比較。藉由目測檢驗凝膠之完整IgG及半體含量。亦可使用Chemidoc MP Imager軟體量化各凝膠中之完整IgG及半體的相對量。單一(PGxxxx)轉染中半體之量較大表示變體同二聚體不穩定。雙重轉染(PBxxxxx)中之IgG帶證明形成了異二聚體。
選擇顯示單一轉染中形成大多數半體(與含有KK CH3區之MG4539C1452對照樣本係相當的)且在雙特異性轉染中形成大多數完整IgG之DE*-CH3變體以在後續研究中進一步確定特徵(圖2至4及表1)。相較於對照樣本，電腦模擬中所識別之四個位置中總共三個位置具有改良之體外特性(K360、S364及K409)。總共選擇9種變體用於進一步研究。
變體名稱 備註 是否選用於進一步分析？
K360D 雙特異性，較少半體見於SDS-page上(相較於對照組之0.7 ug，0.6 µg之較少載入量) 是
S364V 相較於原始DE，單一製造中半體較多 是
S364I 相較於原始DE，單一製造中半體較多 是
S364T 相較於原始DE，單一製造中半體較多 是
S364Q 相較於原始DE，單一製造中半體可能較多 是
K409I 相較於原始DE，單一製造中半體較多 是
S364L 額外泳帶見於SDS-page上約140/160/＞200Kda處(單一製造) 是
K409L 額外泳帶見於SDS-page上，單一製造 是
K409E 額外泳帶見於SDS-page上，單一及雙特異性製造，藉由雙重轉染發現稍多半體 是
表1：SDS-PAGE實驗中所觀測到之結果的概述。所有均在CH3含有DE之情況下產生。
在SDS-PAGE實驗後，進行進一步電腦模擬HADDOCK分析以識別相較於對照物可進一步改良之具有潛在前景之雙變體(表2，第10至15行)。
實驗結果
# DEKK 參考物
1 K360D 雙特異性製造中半體較少
2 S364I 單一製造中半體較多
3 S364Q 單一製造中半體可能較多
4 S364T 單一製造中半體較多
5 S364V 單一製造中半體較多
6 S364L 額外泳帶於單一製造中
7 K409I 單一製造中半體較多
8 K409L 額外泳帶於單一製造中
9 K409E 額外泳帶於單一製造中
10 S364I/K360D 下文所述之後續實驗
11 S364T/K360D 下文所述之後續實驗
12 S364T/K409E 下文所述之後續實驗
13 K360D/K409E 下文所述之後續實驗
14 S364V/K360D 下文所述之後續實驗
15 S364L/K409L 下文所述之後續實驗
表2：選用於進一步研究之突變體之概述
總的來說，在CH3之DE臂中之3個位置處製造總計18種變體。進行單轉染以獲得同二聚體，且使用共用KK臂進行雙重轉染以獲得雙特異性IgG。SDS-PAGE分析顯示，相較於DEKK對照樣本，5種DEKK變體於單臂製造中顯示較多半體污染物。儘管單一製造中出現異常SDS-PAGE結果，仍選擇其他3種變體，此歸因於雙重轉染實驗中之雙特異性IgG之結果。使用HADDOCK分析表現良好之突變之組合，另外自其中選擇6種組合進行進一步分析。
實例 3 ：體外穩定性結果及生物物理特徵化 以1:1及3:1之DE:KK比製造呈雙特異物(CD137 (MF6744 – 先前公開於美國公開案第2020/0017595 A1號；美國公開案第2019/00352401 A2號中) × 血纖維蛋白原(MF1122))之15種所選變體，其中過度表現DE臂以研究其同二聚體形成。
使用CIEX-HPLC (陽離子交換-高效液相層析法)、HP-SEC (高效粒徑篩析層析法)及nMS (天然質譜法)技術進一步確定IgG之特徵。此外，進行穩定性分析以分析熔融及聚集溫度Tm及Tagg。選擇如高Tm/Tagg所指示顯著減少同二聚體形成且顯示良好Fc穩定性之變體進行較大規模蛋白質製造。
所用VH之重量不同(單株IgG MF1122重量係144905 kDa且MF6744係145932 kDa)，且因此可在nMS上分離同二聚體及異二聚體。其CIEX RT不同(13.3分鐘及9.7分鐘)，且因此可在CIEX中分離同二聚體及異二聚體，尤其因為其將分別與KK及DE組合。Fab具有高Tm。高Tm Fab允許變體CH3之熔融溫度(Tm)得以被識別。
使用UNcle儀器(UNchained Labs產品號200-1037)在Tm/Tagg分析中分析所生成之具有1:1 DNA比之IgG。藉由在溫度升高時改變胺基酸之固有螢光(光譜範圍250-720 nM)之後確定熔融溫度(Tm)。使用具有266 nm及473 nm波長之雷射且在90°角度下偵測散射光，藉由量測靜態光散射(SLS)測定聚集溫度(Tagg)，同時測定Tm。使用用於測定Tm/Tagg、以0.3℃/分鐘之速率自25℃至95℃之線性溫度攀升藉由螢光及SLS獲取技術(Blue&UV，暴露時間1000毫秒，UV266：濾光器4，Blue473：濾光器3)進行DLS (動態光散射)分析。
此允許使用1:1之KK:DE比測定無壓力樣本之Tm/Tagg。如表4中所示，所有樣本均係300 µg/mL。
壓力測試 藉由向經修飾之IgG施加壓力進行小型穩定性分析，此等分析均在PBS中進行。
以300 µg/mL生成各樣本之三份100 µL等分式樣(如表3中所示)。
向樣本施加以下壓力： - 5 × FT (凍融) (將樣本重複儲存於-80℃下至少1小時，隨後在室溫下完全融解)； - 置於50℃下2日(將樣本置於50℃水浴或培育器中，且培育2日)； - 儲存於4℃下(作為無壓力對照物)。
隨後與無壓力樣本(儲存於4℃下)直接比較，使用DLS分析受力樣本以確定樣本中存在聚集物。
儘管在變體之Tm/Tagg中觀測到一些差異，但仍將其全部視為穩定分子(表3及4)。
         50℃    F/T    4℃
孔 樣本 變體 T (℃) Pk 1模式Dia (nm) Pk 1 質量(%) Pk 2模式Dia (nm) Pk 2質量(%)    T (℃) Pk 1模式Dia (nm) Pk 1質量(%) Pk 2模式Dia (nm) Pk 2質量(%)    T (℃) Pk 1模式Dia (nm) Pk 1質量(%) Pk 2模式Dia (nm) Pk 2質量(%)
A1 0.3 mg/ml PB31852p33 DE+S364V 24.95 10.72 100 -       24.97 9.53 100          25 9.9 100 -   
B1 0.3 mg/ml PB31852p34 DE+S364L 25.05 10.75 100 -       24.97 10.33 100          24.96 9.89 100 -   
C1 0.3 mg/ml PB31852p35 DE+S364I 25 11.2 100 -       24.95 10.32 100          24.97 9.89 99.98 94.83   
D1 0.3 mg/ml PB31852p36 DE+S364T 24.97 12.13 99.81 60.39 0.19    24.96 10.33 100          25.02 9.91 99.97 94.95   
E1 0.3 mg/ml PB31852p37 DE+K409I 25.04 10.35 100 -       24.95 10.72 100          24.98 9.54 99.97 83.28   
F1 0.3 mg/ml PB31852p38 DE+K409L 24.97 10.33 100 -       24.99 10.34 100          25 10.34 100 -   
G1 0.3 mg/ml PB31852p39 DE+K409E 25.01 11.64 100 -       25.07 10.75 100          24.99 10.34 99.93 60.42   
H1 0.3 mg/ml PB31852p40 DE+S354Q 24.97 14.24 100 -       25.02 9.91 100          25 9.9 100 -   
I1 0.3 mg/ml PB31852p47 DE+S364T_K409E 24.99 11.2 100 -       24.98 9.54 100          25 9.54 99.97 76.89   
J1 0.3 mg/ml PB31852p42 DE+K360D_S364I 24.97 11.19 100 -       25 9.9 100          24.99 9.54 100 -   
K1 0.3 mg/ml PB31852p43 DE+K360D_S364T 24.95 10.32 99.92 76.8       24.97 10.33 100          25 10.34 100 -   
L1 0.3 mg/ml PB31852p44 DE+K360D_S364V 24.99 10.73 100 -       24.99 9.9 100          24.99 9.54 100 -   
M1 0.3 mg/ml PB31852p45 DE+K360D_K409E 25.07 11.66 100 -       25 9.54 100          25 10.34 100 -   
N1 0.3 mg/ml PB31852p46 DE+S364L_K409L 24.97 10.72 100 -       25.01 10.34 100          24.99 10.34 100 -   
A2 0.3 mg/ml PB31852p47 DE+S364T_K409E 24.98 10.33 100 -       25 9.9 100          24.98 10.33 100 -   
B2 0.3 mg/ml PB31852p48 僅DE 24.96 11.19 100 -       24.99 10.34 100          24.99 10.34 100 -   
表3：DLS結果之概述，Pk1 = 峰1，Pk2 = 峰2，Dia = 直徑。
孔 樣本 Tm1 (℃) Tm2 (℃) Tm3 (℃) Tagg 266 (℃)  
A1 0.3 mg/ml PB31852p33_4C 64 74.9    75.19  
B1 0.3 mg/ml PB31852p34_4C 63 74.9    75.15  
C1 0.3 mg/ml PB31852p35_4C 64.11 75 83.06 74.56  
D1 0.3 mg/ml PB31852p36_4C 54.17 65.7 75.06 74.64  
E1 0.3 mg/ml PB31852p37_4C 65 75.07    74.74  
F1 0.3 mg/ml PB31852p38_4C 66.03 75    74.8  
G1 0.3 mg/ml PB31852p39_4C 62.5 75.14    74.84  
H1 0.3 mg/ml PB31852p40_4C 54.56 64.5 74.59 74.65  
I1 0.3 mg/ml PB31852p47_4C 62.5 75 93.04 75.13  
J1 0.3 mg/ml PB31852p42_4C 64.67 75.16    74.82  
K1 0.3 mg/ml PB31852p43_4C 65.5 75.18 90 74.86  
L1 0.3 mg/ml PB31852p44_4C 64.24 75.5 83.5 75.51  
M1 0.3 mg/ml PB31852p45_4C 62.5 76 85.12 75.95  
N1 0.3 mg/ml PB31852p46_4C 65.08 76 84.5 75.66  
A2 0.3 mg/ml PB31852p47_4C 64 77.5    77.55  
B2 0.3 mg/ml PB31852p48_4C (僅DE) 67.66 77.5    76.75  
O2 0.25 mg/ml PG1122p113 72 80.54    81.59   
表4：使用UNcle儀器生成之Tm結果之概述。注意，此處所有受測樣本均具有PB碼PB31852作為其唯一識別碼之前綴(例如，p33、p34等)。在實例部分中，例如在表5中為簡單起見，此命名亦縮寫為唯一識別碼(例如，PB31852p33縮寫為p33)。與各唯一識別碼對應之變體胺基酸之細節可見於例如表3中。
HP-SEC 根據本領域中已知的標準方法在HP-SEC上分析所生成之IgG。使用Agilent 1260系列HPLC系統、具有Tosoh TSK保護管柱SWXL cat#808543之Tosoh TSK-凝膠G3000SWxl cat#808541、電泳緩衝液：200 mM NaPO4 、50 mM NaCl、pH 7.0載入20 µg樣本。進行HP-SEC分析以偵測相較於DLS分析之較小聚集物(表5)，且在1× F/T週期後進行以代表通常在已儲存於-80℃下後用於實驗之樣本。
1:1 1:3 總計1:1之主峰% 主峰3:1 總計1:1之較遲溶離峰% 較遲溶離峰3:1
p33 p49 74.82 57.65 25.18 41.63
p34 p50 86.75 77.41 12.19 20.6
p35 p51 79.38 60 20.62 38.87
p36 p52 82.32 68.92 17.68 30.36
p37 p53 75.51 54.53 22.18 44.85
p38 p54 92.7 83.82 5.84 14.94
p39 p55 88.31 81.81 11.16 16.58
p40 p56 91.68 90.54 7.12 7.66
p47 p63 79.21 59.09 20.28 40.26
p42 p58 77.77 54.51 21.48 44.37
p43 p59 80.59 67.75 17.21 31.01
p44 p60 73.86 55.59 24.57 44.11
p45 p61 88.9 85.64 9.07 13.39
p46 p62 94.4 89.18 4.88 9.96
p47 p63 80.98 57.93 18.6 40.85
p48 p64 94.08 87.76 4.42 11.02
表5：HP-SEC結果之概述(其中p48及p64係對照DE臂)，主峰代表雙克隆及/或同二聚體IgG，較遲溶離峰含有半體。
壓力測試顯示，DEKK變體相當穩定，且僅在強烈壓力下顯示聚集。
      4 ℃
1:1 變體 早早期 (%) 聚集物 早期 (%) 聚集物 主峰 (%) IgG 較遲峰 (%) 半體 晚晚期 (%) 片段
p33 DE+S364V    0.55 74.61 24.84   
p34 DE+S364L    0.53 86.81 12.66   
p35 DE+S364I 0.89 0.60 78.09 20.42   
p36 DE+S364T 0.76 0.72 81.05 17.46   
p37 DE+K409I 0.82 0.92 76.42 21.84   
p38 DE+K409L 0.24 0.57 93.23 5.96   
p39 DE+K409E 0.78 0.66 86.74 11.83   
p40 DE+S354Q 0.32 1.02 91.50 7.16   
p47 DE+S364T_K409E    0.52 79.14 20.34   
p42 DE+K360D_S364I    0.35 78.38 21.26   
p43 DE+K360D_S364T 0.28 0.63 81.25 17.84   
p44 DE+K360D_S364V 0.69 1.02 73.50 24.79   
p45 DE+K360D_K409E       90.43 9.57   
p46 DE+S364L_K409L 0.29 0.71 93.71 5.29   
p47 DE+S364T_K409E    1.22 80.58 18.20   
p48 僅DE 0.3 1.47 93.46 4.76   
表6：將樣本保存於4℃下後之HP-SEC結果的概述。
   50 ℃
1:1 早早期 (%) 聚集物 早期 (%) 聚集物 主峰 (%) IgG 較遲峰 (%) 半體 晚晚期 (%) 片段
p33 1.01 – 7.32 - 4.51 66.07 20.49 0.60
p34 0.28 7.83 81.13 10.76   
p35 0.37 - 5.76 – 4.18 72.75 16.39 0.54
p36 0.61 12.63 71.35 15.41   
p37 0.31 – 5.09 – 3.56 71.08 19.53 0.44
p38 0.37 5.25 88.88 5.50   
p39    14 76.90 9.10   
p40 7.20 22.33 64.57 5.07 0.82
p47 9.18 6.72 66.44 16.76 0.91
p42 0.48 7.48 72.40 18.84 0.80
p43 0.72 7.54 74.55 16.52 0.67
p44    7.86 68.75 22.44 0.94
p45    9.81 81.37 7.48 1.34
p46    4.84 90.43 4.16 0.57
p47 0.52 11.71 70.80 16.02 0.95
p48 0.94 3.72 90.12 4.33 0.88
表7：將樣本加熱至50℃持續2日後之HP-SEC結果的概述
   凍 / 融 (5 次 )
1:1 早早期 (%) 聚集物 早期 (%) 聚集物 主峰 (%) IgG 較遲峰 (%) 半體 晚晚期 (%) 片段
p33 0.60 1.05 73.71 24.64   
p34    0.32 87.59 12.08   
p35 0.57 – 0.70 – 0.33 78.25 20.15   
p36 0.95 1.70 79.88 17.47   
p37 0.68 1.45 76.54 21.33   
p38    1.24 93.24 5.52   
p39    1.34 85.48 11.58 1.60
p40    1.59 91.46 6.95   
p47 0.26 0.56 78.60 20.58   
p42    1.86 75.89 22.25   
p43 0.56 1.40 80.45 17.59   
p44    0.44 74.64 24.92   
p45    1.05 89.82 9.13   
p46    1.03 93.71 5.26   
p47 0.73 0.92 79.73 18.61   
p48 0.36 1.97 93.66 4.01   
表8：樣本5×凍-融後之HP-SEC結果的概述
CIEX-HPLC 在CIEX-HPLC上分析所生成之IgG。載入10 µg樣本，使用Agilent 1260系列HPLC system、Tosoh TSKgel SP-STAT管柱cat#21964、緩衝液：A) 25 mM NaPO4 ，pH 6.0及B) 25 mM NaPO4 ，1M NaCl，pH 6.0，採用0.5毫升/分鐘之0-30%線性梯度之緩衝液B (每毫升提高2% B)分析。分析所生成之圖像的峰形狀、滯留時間、雙特異性抗體/雜質比及雙特異性抗體與雜質之間的分離(在3:1經轉染之樣本中最明顯)。wt PG1122與wt PG6744之間的分離係~3.7分鐘，其係由KK/DE及其他變體提高。如預計，WT DEKK對照物在10.25 (雙克隆)及7.8分鐘(DEDE同二聚體)處顯示峰。1:1或1:3製造比具有幾乎相同之滯留時間(RT)值。
儘管一些樣本在一次或兩次製造中顯示由DEDE同二聚體組成之早期溶離物質，但其他樣本不具有任何可偵測之早期溶離物質。
最顯著的是，在S354Q變體(兩次製造)、S364T變體及WT (3:1製造)中觀測到較大量之早期溶離物質，但所有其他樣本具有＜ 10%。
所有樣本均顯示預峰。在1:3製造中觀測到較大預峰，相較於主峰之高度，其比1:1製造中所觀測到的峰大約3倍。在不意欲受限於理論之情況下，本發明人相信，因一些變體中存在其他負電荷，故而DE*半體物質未結合至管柱及「預峰」中之溶離物(管柱之死體積)。
許多變體十分成功地阻止同二聚體形成，且早期溶離峰之缺乏證實此點。
總之，對於所製造之18種IgG中之15種，即使在(經修飾之)DE臂之3:1過度表現中，根據CIEX-HPLC，僅形成極小量或不形成DEDE同二聚體。此表示，相較於DEKK對照物，多數其他抗體成功地阻止或減少同二聚體形成(表9)。
1:1製造 3:1製造 變體 1:1 % DEDE 3:1 % DEDE 1:1 % DEKK 3:1 % DEKK 電荷差 RT雙克隆 1:1 (分鐘) RT雙克隆 3:1 (分鐘) 早期RT 1:1 (分鐘) 早期RT 3:1 (分鐘) 預/最高比 1:1 預/最高比 1:3 比率之比
PB31852p33 PB31852p49 DE+S364V 2.16 18.98 96.35 79.3 0 10.56 10.54 7.28 7.24 1.41 3.52 2.5
PB31852p34 PB31852p50 DE+S364L 0 0 97.86 96.91 0 10.73 10.72     0.33 0.85 2.6
PB31852p35 PB31852p51 DE+S364I 0 2.7 97.77 94.8 0 10.73 10.71   7.38 0.87 2.91 3.3
PB31852p36 PB31852p52 DE+S364T 11.45 49.57 86.57 48.87 0 10.28 10.3 7.38 7.38 1.11 4.29 3.9
PB31852p37 PB31852p53 DE+K409I 2.59 22.31 95.34 76.39 -1 9.88 9.85 6.63 6.62 1.82 6.85 3.8
PB31852p38 PB31852p54 DE+K409L 1.64 9.76 97.43 89.66 -1 9.84 9.82 7.05 7.05 0.21 0.59 2.8
PB31852p39 PB31852p55 DE+K409E 0 0 99.34 97.81 -2 9.77 9.75     0.45 0.86 1.9
PB31852p40 PB31852p56 DE+S354Q 26.55 62.84 71.78 36.21 0 10.36 10.32 7.14 7.13 0.12 0.18 1.5
PB31852p47 PB31852p63 DE+S364T_K409E 0 0 98.68 98.76 -2 9.8 9.8     1.29 4.11 3.2
PB31852p42 PB31852p58 DE+K360D_S364I 0 2.46 99.05 97.08 -2 9.46 9.46   7.04 1.79 6.26 3.5
PB31852p43 PB31852p59 DE+K360D_S364T 2.38 9.26 96.78 60.3 -2 9.51 9.48 5.9 5.85 1.52 5.67 3.7
PB31852p44 PB31852p60 DE+K360D_S364V 0 4.02 98.40 70.34 -2 9.51 9.51   5.66 2.18 7.19 3.3
PB31852p45 PB31852p61 DE+K360D_K409E 0 0 96.7 97.35 -4 9.25 9.23     0.34 0.72 2.1
PB31852p46 PB31852p62 DE+S364L_K409L 0 0 98.64 98.96 -1 10.18 10.21     0.16 0.52 3.2
PB31852p47 PB31852p63 DE+S364T_K409E 0 0 97.2 97.43 -2 9.79 9.82     1.07 4.35 4.0
PB31852p48 PB31852p64 僅 DE 2.27 62.89 95.76 34.66 0 10.25 10.24 7.8 7.76 0.10 0.39 3.8
                                            
   未偵測到 DEDE 同二聚體                              
   較小同二聚體峰 (0-5%)                              
   明顯同二聚體峰 (5-25%)                              
         較大同二聚體峰(＞25%)                              
表9：CIEX-HPLC結果之概述；RT = 滯留時間，電荷差 = 相較於原始DE構築體之其他(負)電荷，空白區域：未偵測到峰(1%閾值)。
LabCHIP 使用LabChip測定雙克隆製造之樣本中IgG (DEKK + DEDE)及半體的量。使用採用蛋白質澄清HR試劑套組(cat# CLS960014)之Perkin Elmer LabCihp GXII Touch HT及蛋白質表現分析LabChip (cat# 760499)，根據製造商指示進行分析，樣本濃度係0.3 µg/µL。據觀測，變體之間的DE半體形成明顯不同，且如預計，3:1製造含有更多DE半體(表10)。
1:1 3:1 變體 1:1 IgG (%) 1:1半體(%) 3:1 IgG (%) 3:1半體 半體比
p33 p49 DE+S364V 77.1 22.9 44.1 38.28 1.67
p34 p50 DE+S364L 91.1 8.9 21.5 20.16 2.27
p35 p51 DE+S364I 83.4 16.6 41.2 33.3 2.01
p36 p52 DE+S364T 86.5 13.5 30 27.78 2.06
p37 p53 DE+K409I 82.6 17.4 48.9 42.78 2.46
p38 p54 DE+K409L 96.9 3.1 12.6 10.85 3.50
p39 p55 DE+K409E 91.7 8.3 14.4 14.31 1.72
p40 p56 DE+S354Q 95.8 4.2 5.7 6.36 1.51
p47 p63 DE+S364T_K409E 82.2 17.8 43.9 37.44 2.10
p42 p58 DE+K360D_S364I 82.2 17.8 47.3 35.3 1.98
p43 p59 DE+K360D_S364T 86.1 13.9 29.8 22.62 1.63
p44 p60 DE+K360D_S364V 78.7 21.3 45.2 41.84 1.96
p45 p61 DE+K360D_K409E 93.1 6.9 10.5 12.5 1.81
p46 p62 DE+S364L_K409L 97 3 8.1 20.87 6.96
p47 p63 DE+S364T_K409E 83.3 16.7 43.1 39.42 2.36
p48 p64 僅DE 100 0 7.9 8.51 N/A
表10：LabChip資料之概述
nMS 對於所有產生之IgG，在nMS分析中分析100 µg/樣本(參見Rosati等人, Anal Chem. 2012八月21日; 84(16):7227-32中之方法)。研究各種物質(雙特異性抗體、同二聚體、半體)之間的相對比率。
成功分析所有16種樣本，且可藉由此技術識別IgG物質。對照DEKK樣本在1:1製造中產生95%雙特異性。1:1生產中DEKK變體異二聚體形成之百分比在74%至100%之間變化。總計12種樣本含有＞90% DEKK異二聚體。相較於DEKK對照物，14種樣本中之同二聚體形成顯著減少。對於樣本中之8種，在3:1製造中形成≤ 2% DEDE同二聚體。
總之，變體中之14種在3:1製造中顯著減少同二聚體形成(相較於DEKK對照物)，且對於8種變體，幾乎不形成同二聚體(表11)。
1:1製造 3:1製造 變體 1:1 DEKK (總%) 3:1 DEKK (總%) 1:1 DEDE (總%) 3:1 DEDE (總%) 1:1 DE (總%) 3:1 DE (總%)
PB31852p33 PB31852p49 DE+S364V 85 57 4 9 10 34
PB31852p34 PB31852p50 DE+S364L 98 93 2 2 0 5
PB31852p35 PB31852p51 DE+S364I 93 82 1 2 6 16
PB31852p36 PB31852p52 DE+S364T 85 51 7 31 8 18
PB31852p37 PB31852p53 DE+K409I 87 59 2 7 11 34
PB31852p38 PB31852p54 DE+K409L 93 93 7 2 0 5
PB31852p39 PB31852p55 DE+K409E 99 97 1 1 0 2
PB31852p40 PB31852p56 DE+S354Q 74 44 26 55 0 1
PB31852p47 PB31852p63 DE+S364T_K409E 90 78 2 1 8 22
PB31852p42 PB31852p58 DE+K360D_S364I 92 61 2 5 6 34
PB31852p43 PB31852p59 DE+K360D_S364T 83 46 8 20 9 34
PB31852p44 PB31852p60 DE+K360D_S364V 83 62 5 5 12 34
PB31852p45 PB31852p61 DE+K360D_K409E 99 94 1 1 0 5
PB31852p46 PB31852p62 DE+S364L_K409L 100 96 0 2 0 2
PB31852p47 PB31852p63 DE+S364T_K409E 95 79 0 2 5 20
PB31852p48 PB31852p64 僅DE 95 42 5 56 0 2
                          
            DEDE 之 % ：不可偵測 / 幾乎不可偵測之峰 (~ ≤ 5%)   
            DEDE 之 % ：明確可偵測之峰 (~5-10%)   
            DEDE 之 % ：明顯峰 (10-25%)   
            DEDE之%：明顯/較大峰(~ ＞25%)   
表11：nMS結果之概述
結果概述 使用不同方法偵測半體：LabChip、HP-SEC及nMS。儘管所獲得之值絕對項不同，且nMS偵測之半體少於其他方法，但關於在減少DEDE同二聚體形成之情況下使用變體的最終結論係一致的(表12)。針對DEKK、IgG衍生之雜質及聚集物之存在，使用不同技術確定樣本之特徵，且儘管該等值的絕對項不同，亦可自所獲得之資料得出一致結論(表13至15)。
變體 LabChip半體% 3:1 HP-SEC半體% 3:1 nMS ~ 半體% 3:1
DE+S364V 38.28 41.63 27.7
DE+S364L 20.16 20.6 16.8
DE+S364I 33.3 38.87 25.0
DE+S364T 27.78 30.36 21.7
DE+K409I 42.78 44.85 30.0
DE+K409L 10.85 14.94 9.8
DE+K409E 14.31 16.58 12.5
DE+S354Q 6.36 7.66 6.0
DE+S364T_K409E 37.44 40.26 27.2
DE+K360D_S364I 35.3 44.37 26.1
DE+K360D_S364T 22.62 31.01 18.4
DE+K360D_S364V 41.84 44.11 29.5
DE+K360D_K409E 12.5 13.39 11.1
DE+S364L_K409L 20.87 9.96 17.3
DE+S364T_K409E 39.42 40.85 28.3
僅DE 8.51 11.02 7.8
表12：不同實驗方法測定之半體形成之綜述
1:1 1:3 變體 1:1 % DEKK (nMS) 1:1 % DEKK (CIEX) 3:1 % DEKK (nMS) 3:1 % DEKK (CIEX)
p33 p49 DE+S364V 85 96.35 57 79.3
p34 p50 DE+S364L 98 97.86 93 96.91
p35 p51 DE+S364I 93 97.77 82 94.8
p36 p52 DE+S364T 85 86.57 51 48.87
p37 p53 DE+K409I 87 95.34 59 76.39
p38 p54 DE+K409L 93 97.43 93 89.66
p39 p55 DE+K409E 99 99.34 97 97.81
p40 p56 DE+S354Q 74 71.78 44 36.21
p47 p63 DE+S364T_K409E 90 98.68 78 98.76
p42 p58 DE+K360D_S364I 92 99.05 61 97.08
p43 p59 DE+K360D_S364T 83 96.78 46 60.3
p44 p60 DE+K360D_S364V 83 98.40 62 70.34
p45 p61 DE+K360D_K409E 99 96.7 94 97.35
p46 p62 DE+S364L_K409L 100 98.64 96 98.96
p47 p63 DE+S364T_K409E 95 97.2 79 97.43
p48 p64 僅 DE 95 95.76 42 34.66
表13：如CIEX及nMS所測定之同二聚體形成的綜述
   1:1 1:3 %DEDE於1:1製造中(CIEX-HPLC) %DEDE於1:1製造中(nMS) %DEDE於3:1製造中(CIEX-HPLC) %DEDE於3:1製造中(nMS)
DE+S364V p33 p49 2.2 4 19.0 9
DE+S364L p34 p50 0.0 2 0.0 2
DE+S364I p35 p51 0.0 1 2.7 2
DE+S364T p36 p52 11.5 7 49.6 31
DE+K409I p37 p53 2.6 2 22.3 7
DE+K409L p38 p54 1.6 7 9.8 2
DE+K409E p39 p55 0.0 1 0.0 1
DE+S354Q p40 p56 26.6 26 62.8 55
DE+S364T_K409E p47 p63 0.0 2 0.0 1
DE+K360D_S364I p42 p58 0.0 2 2.5 5
DE+K360D_S364T p43 p59 2.4 8 9.3 20
DE+K360D_S364V p44 p60 0.0 5 4.0 5
DE+K360D_K409E p45 p61 0.0 1 0.0 1
DE+S364L_K409L p46 p62 0.0 0 0.0 2
DE+S364T_K409E p47 p63 0.0 0 0.0 2
僅DE p48 p64 2.3 5 62.9 56
                   
       無同二聚體峰 不可偵測 / 幾乎不可偵測之峰 無同二聚體峰 不可偵測 / 幾乎不可偵測之峰
       同二聚體峰 0-5% 可偵測之峰 (~5-10%) 同二聚體峰 0-5% 可偵測之峰 (~5-10%)
       同二聚體峰5-25% 明顯峰(~10-25%) 同二聚體峰 5-25% 明顯峰 (~10-25%)
       同二聚體峰 ＞25% 較大峰 (＞25%) 同二聚體峰 ＞25% 較大峰 (＞25%)
表14：如CIEX及nMS測定之同二聚體形成之綜述
變體 1:1 1:3 TM (Uncle, 1:1製造) DLS (Uncle，受壓力之樣本) HP-SEC (1:1, 1× FT 聚集物) HP-SEC 2日於50℃下(聚集物%) HP-SEC, 5× FT (聚集物%)
DE+S364V p33 p49 64.0 偵測之聚集物/片段(僅強度) 0 12.8 1.7
DE+S364L p34 p50 63.0 未偵測到聚集物 0 8.1 0.3
DE+S364I p35 p51 64.1 未偵測到聚集物 0 10.3 1.6
DE+S364T p36 p52 65.7 偵測之聚集物/片段(僅強度) 0 13.2 2.7
DE+K409I p37 p53 65.0 未偵測到聚集物 2.3 9.0 2.1
DE+K409L p38 p54 66.0 未偵測到聚集物 0.5 5.6 1.2
DE+K409E p39 p55 62.5 未偵測到聚集物 0.5 14.0 1.3
DE+S354Q p40 p56 64.5 未偵測到聚集物 1.2 29.5 1.6
DE+S364T_K409E p47 p63 62.5 未偵測到聚集物 0.5 15.9 0.8
DE+K360D_S364I p42 p58 64.7 未偵測到聚集物 0.8 8.0 1.9
DE+K360D_S364T p43 p59 65.5 偵測之聚集物/片段(僅強度) 2.2 8.3 2.0
DE+K360D_S364V p44 p60 64.2 未偵測到聚集物 1.6 7.9 0.4
DE+K360D_K409E p45 p61 62.5 未偵測到聚集物 2.0 9.8 1.1
DE+S364L_K409L p46 p62 65.1 未偵測到聚集物 0.7 4.8 1.0
DE+S364T_K409E p47 p63 64.0 未偵測到聚集物 0.4 12.2 1.7
僅 DE p48 p64 67.7 未偵測到聚集物 1.5 4.7 2.3
表15：如DLS及HP-SEC測定之穩定性分析之綜述
總之，基於異二聚體多肽之CH3界面處之變體，本文提供之變體提高異二聚體穩定性且減少同二聚體形成。
實例 4 ： 進一步研究表16中所列變體對DEKK異二聚體形成之產率、純度及DE雜質之形成(若存在)的影響。在此特定實例中，以如所提及之不同DE:KK比製造DE重鏈中攜載變體之雙特異性蛋白質以及包含KK之重鏈，使用蛋白質A純化，且藉由CIEX分析且藉由LabChip/SDS-PAGE分析。
選殖： 使用SfiI及XhoI將DE側上之抗TT及KK側上之抗CD3的VH序列選殖至含有以下變體之載體中：K360D_K409E (SEQ ID NO: 12)、S364L_K409L (SEQ ID NO: 14)、S364L (SEQ ID NO: 2)及S364T_K409E (SEQ ID NO: 13)。對連接產物進行菌落/序列PCR以收回所有變體。小量製備所有確定變體，隨後定序。藉由以不同DE:KK比(表16)將單一DE*構築體(標記PGxxxx IgG)及與KK構築體組合之DE*構築體(標記PBxxxxx雙特異性IgG)轉染至293FF細胞中而製造IgG。培育7日後(37℃，8% CO2 ，155 rpm)，採收細胞上清液，隨後進行蛋白質A純化(酸性溶離)，且將緩衝液更換為PBS pH7.4。量測樣本之IgG濃度。隨後，藉由HP-SEC、CIEX及Lab-Chip/SDS-PAGE確定蛋白質之特徵。
# 變體 DE:KK比
1 DEKK  
2 DEKK 2:1
3 DEKK 1:1
4 DEKK 1:2
5 DEKK   
6 K360D K409E  
7 K360D K409E 2:1
8 K360D K409E 1:1
9 K360D K409E 1:2
10 S364L K409L  
11 S364L K409L 2:1
12 S364L K409L 1:1
13 S364L K409L 1:2
14 S364L  
15 S364L 2:1
16 S364L 1:1
17 S364L 1:2
18 S364T K409E  
19 S364T K409E 2:1
20 S364T K409E 1:1
21 S364T K409E 1:2
表16：在24孔型式上製造雙特異性及單一臂.
HP-SEC: 根據實例3中所述之方案，藉由HP-SEC分析單一臂製造。使用類似量之各IgG，但量不超過10 ug。關於所有變體，在原位條件下，以＞75%半體、~10-20%同二聚體及一些聚集物之形式操作DE臂(表17)。
變體 HP-SEC %
半體 同二聚體 聚集物
WT-DE 8.8 88.9 2.2
S364T K409E 75.6 23.5 0.9
K360D K409E 76.0 23.3 0.6
S364L 81.4 16.6 2.0
S364L K409L 85.9 12.5 1.6
表17：單一臂製造之HP-SEC分析
CIEX 分析： 藉由CIEX (實例3中所述之方案)分析IgG蛋白質。作為對照物，分析單一臂製造以能夠指定雙特異性樣本中所偵測之峰。調整所有樣本之蛋白質注射量。將各樣本之含有單一臂之樣本的蛋白質量調整至5 ug。若濃度過低，則注射最大合適體積(100 uL)。具有抗TT重鏈之WT-DE同二聚體(VH；SEQ ID NO: 16)之預計滯留時間(RT)係13分鐘；具有抗CD3重鏈之KK半體(VH；SEQ ID NO: 17)之RT係26分鐘。KK-KK二聚體之滯留時間使其溶離過遲，從而無法偵測。對於樣本中之組分的量化，不考慮預峰。概括屬於相同種類(PB、DE或KK)之峰且加為一個值。自CIEX管柱溶離之樣本的組成係基於各峰之面積百分比。
在比較相同比率時，測試條件下所有研究之變體之異二聚體的純度提高(表18)。改變DE:KK比之影響係提高KK DNA，且由此提高KK多肽之轉譯，導致DE雜質減少。
變體 DE:KK比 %PB %DE %KK
DEKK 2:1 64 36 0
1:1 76 17 7
1:2 73 7 20
K360D K409E 2:1 92 0 8
1:1 75 0 24
1:2 59 0 40
S364L K409L 2:1 95 0 5
1:1 86 0 14
1:2 58 0 40
S364L  2:1 88 0 12
1:1 73 0 27
1:2 53 0 46
S364T K409E 2:1 92 0 8
1:1 77 0 22
1:2 54 0 46
表18.單一臂製造之CIEX分析
在單一臂製造中，變體之DEDE同二聚體減少，且DE半體增加(表19)。結果係與使用HP-SEC生成之資料一致。
CH3 樣本 變體 半體 同二聚體
DE PG1516p47 WT 11.7 88.3
DE PG1516p46 S364T K409E 82.2 17.8
DE PG1516p43 K360D K409E 83.9 16.1
DE PG1516p45 S364L 89.2 10.8
DE PG1516p44 S364L K409L 91.8 8.2
KK PG3896p12 WT 100 0
表19：單一臂製造之LabChip/SDS-PAGE
變體對純度之影響 使用CIEX結果評估各樣本中存在之雙特異性蛋白質的量以獲得雙特異性蛋白質之純度資料。在此包括蛋白質A純化之實例中，異二聚體PB蛋白質之純度提高。藉由提高DE:KK比提高純度(表20)。
變體 DE:KK 比 %PB %DE %KK
DEKK 2:1 64 36 0
1:1 76 17 7
1:2 73 7 20
K360D K409E 2:1 92 0 8
1:1 75 0 24
1:2 59 0 40
S364L K409L 2:1 95 0 5
1:1 86 0 14
1:2 58 0 40
S364L  2:1 88 0 12
1:1 73 0 27
1:2 53 0 46
S364T K409E 2:1 92 0 8
1:1 77 0 22
1:2 54 0 46
表20：受測變體對純度之影響
所用序列：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
＞抗-TT Fab之VH序列 [SEQ ID NO: 16]
Figure 02_image011
＞抗-CD3 Fab之VH序列 [SEQ ID NO: 17]
Figure 02_image013
讀者注意到與本發明相關之與此說明書同時申請或先於此說明書申請之所有文章及文件，且其與此說明書一起可供公共查閱，且所有該等文章及文件之內容均以引用方式併入於此。
本說明書(包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式)中所揭示之所有特徵及/或如此揭示之任何方法或製程之所有步驟可以任何組合形式組合，該等特徵及/或步驟中之至少一些相互排斥之組合除外。
除非另外明確陳述，否則本說明書(包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式)中所揭示之各特徵可由出於相同、等效或類似目的之替代性特徵取代。因此，除非另外明確說明，否則所揭示各特徵僅為一系列通用等效或類似特徵之一個實例。
本發明不限於任何前述實施例之細節。本發明延伸至本說明書(包括任何隨附申請專利範圍、摘要及圖式)中所揭示之特徵中之任何新穎的一者或任何新穎組合，或延伸至如此揭示之任何方法或製程之步驟的任何新穎的一者或任何新穎組合。
關於後續論述，若字母後接數字，則此表示位於根據EU編號之一級胺基酸序列中之殘基編號之位置處的胺基酸，例如，K351表示位置351處之賴胺酸。若字母後接數字再接另一字母，則此表示根據EU編號之殘基之原生位置(例如，野生型人類Fc)中之胺基酸及經基因改造至彼位置中之殘基(例如，K409S表示若賴胺酸存在於位置409處之野生型Fc中，則基因改造變體係絲胺酸)。 在下文中參考附圖進一步描述本發明之實施例，其中：圖 1 ： 用於表現重鏈變體之向量圖。圖 2 ： K360變體之單轉染(A)及雙重轉染(B)之SDS-PAGE結果。非還原性SDS-Page上所見之泳帶尺寸對應於：150 KDa (IgG)；75 KDa (半體)；50 KDa (重鏈)及25 KDa (輕鏈)。圖 3 ： S364變體之單轉染(A)及雙重轉染(B)之SDS-PAGE結果。非還原性SDS-Page上所見之泳帶尺寸對應於：150 KDa (IgG)；75 KDa (半體)；50 KDa (重鏈)及25 KDa (輕鏈)。圖 4 ： K409變體之單轉染及雙重轉染之SDS-PAGE結果。非還原性SDS-Page上所見之泳帶尺寸對應於：150 KDa (IgG)；75 KDa (半體)；50 KDa (重鏈)及25 KDa (輕鏈)。 本文中所提及之專利、科學及技術文獻確立在申請時可供熟習此項技術者使用之專業知識。發表之專利、公開申請案及待定專利申請案及本文中所引述之其他申請案的全部揭示內容係以引用方式併入於此，其程度如每一者特定及單獨經指示藉由引用方式併入相同。在任何不一致之情況下，應以本發明為準。 在下文中更詳細地描述本發明之各種態樣。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013

Claims (15)

  1. 一種經分離之異二聚體蛋白質，其包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，且其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含另一胺基酸變體於位置S364、K409及/或K360處。
  2. 如請求項1之經分離之異二聚體蛋白質，其中： a) 364胺基酸係纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸；及/或 b) 409胺基酸係異白胺酸、白胺酸或麩胺酸；及/或 c) 360胺基酸係天門冬胺酸。
  3. 如請求項1或2之經分離之異二聚體蛋白質，其中該異二聚體蛋白質包含人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3區。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離之異二聚體蛋白質，其中該異二聚體蛋白質包含人類免疫球蛋白Fc區，視情況其中該人類免疫球蛋白Fc區包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離之異二聚體蛋白質，其中： a) 該第一含CH3多肽係抗體重鏈；及/或 b) 該第二含CH3多肽係抗體重鏈；及/或 c) 該異二聚體蛋白質進一步包含一或多條抗體輕鏈；及/或 d) 該抗體輕鏈係共用抗體輕鏈。
  6. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至5中任一項之經分離之異二聚體蛋白質。
  7. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至5中任一項之第一及第二含人類IgG CH3之多肽。
  8. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項7之經分離之核酸。
  9. 一種製造如請求項1至5中任一項之經分離之異二聚體蛋白質的方法，其包含在允許表現該等第一及第二含人類IgG CH3之多肽的條件下培養如請求項8之重組宿主細胞。
  10. 一種用於提高異二聚體蛋白質之穩定性的方法，該異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽，該多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，及第二含人類IgG CH3之多肽，該多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，該方法包含在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入該第一含人類IgG CH3之多肽中。
  11. 一種用於降低同二聚體蛋白質之穩定性的方法，該同二聚體蛋白質含有第一含人類IgG CH3之多肽，該多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，該方法包含在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入該第一含人類IgG CH3之多肽中。
  12. 一種用於提高異二聚體蛋白質之產率的方法，該異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，該方法包含在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入該第一含人類IgG CH3之多肽中。
  13. 一種提高異二聚體蛋白質之純度的方法，該異二聚體蛋白質包含第一含人類IgG CH3之多肽及第二含人類IgG CH3之多肽，其中該第一含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體L351D及L368E，且該第二含人類IgG CH3之多肽包含胺基酸變體T366K及L351K，該方法包含(a)在位置S364、K409及/或K360處將胺基酸變體引入該第一含人類IgG CH3之多肽中；及(b)對該異二聚體蛋白質進行離子交換層析法。
  14. 如請求項10至13中任一項之方法，其中： a) 364胺基酸係纈胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸或白胺酸；及/或 b) 409胺基酸係異白胺酸、白胺酸或麩胺酸；及/或 c) 360胺基酸係天門冬胺酸。
  15. 一種藉由如請求項9之方法製造之異二聚體蛋白質。
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