CN109415435B - 新型抗体形式 - Google Patents

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Abstract

本文报道了重组融合多肽，其包含抗体重链可变结构域，多聚化结构域和抗体轻链可变结构域，其中所述抗体重链可变结构域(直接或通过第一(肽)接头)融合到所述多聚化结构域的一个末端，所述抗体轻链可变结构域(直接或通过第二(肽)接头)融合到所述多聚化结构域的相应另一个末端，并且所述抗体重链可变结构域或所述抗体轻链可变结构域具有与所述多聚化结构域的(肽内)二硫键。

Description

新型抗体形式
本文描述了一种新的抗体形式(其特别地具有与全长抗体相比降低的分子量并且包含两个抗原结合位点)及其用途。
技术背景
年龄相关性黄斑变性是最常见的眼病，在工业化国家中对50岁以上的人造成不可逆转的失明。目前的疗法基于例如抗体/抗体形式的VEGF抑制，并且需要以4至6周的间隔重复玻璃体内注射。此外，一些患者对可用的抗VEGF单一疗法没有应答。正在对基于已经证明的抗VEGF药物和/或新靶标分子的组合疗法进行深入研究，其目的是提高治疗效率和安全性并降低注射频率。
推动药物从眼睛中清除的因素之一是扩散。药物的扩散性质主要由药物的大小决定，最终与Fc-受体结合相组合。
从眼睛中清除后，可以在体循环中发现药物。因此，高剂量应用和伴随的高眼药物清除导致全身性药物暴露，这增加了潜在副作用的风险。
在过去几年中已经开发了衍生自野生型四链Y形抗体形式的新抗体形式。这些形式主要是双特异和多特异形式。有关评论，请参阅例如Kontermann，R.，mAbs 4(2012)182-197。
例如，在US 2009/0175867中公开了具有效应子功能的单链多价结合蛋白。在WO2014/131711中公开了双特异性抗体，其中第二和第三抗原结合部分可以直接或通过免疫球蛋白铰链区与Fc结构域融合。在WO 2011/117329中公开了双特异性二价抗VEGF/ANG-2抗体。WO 2009/080253公开了二价双特异性抗体。
发明概述
本文报道了一种新型双链低分子量二价抗体，其可用作产生新型治疗剂的基础。这种抗体能用于例如眼科疾病，例如年龄相关性黄斑变性，因为它具有改善的眼科应用性质。同样，这种形式可以应用于肿瘤疾病，神经疾病(包括穿过血脑屏障)和抗炎疾病。
已经发现，特别地，引入链内二硫键增加本文报道的新型二价抗体的稳定性。更详细地，在抗体可变结构域之一和抗体恒定结构域之间引入链内二硫键导致该新型抗体(形式)的结构稳定性的改善，如例如通过抗体解链温度的增加所证明的。
本文报道的一个方面是(二价)抗体，其包含
a)第一多肽，其从N末端至C末端方向包含
i)第一结合位点的第一部分，
ii)第一多聚化结构域，和
iii)第二结合位点的第一部分，
和
b)第二多肽，其从N末端至C末端方向包含
i)所述第一结合位点的第二部分，
ii)第二多聚化结构域，和
iii)所述第二结合位点的第二部分，
其中第一结合结构域的第一部分和第一结合结构域的第二部分一起形成第一结合位点，第二结合结构域的第一部分和第二结合结构域的第二部分一起形成第二结合位点，
其中第一结合位点和第二结合位点彼此独立地特异性结合(不同的)表位/靶标/抗原，并且
其中第一多肽和第二多肽通过多聚化结构域彼此非共价或共价缀合。
本文报道的一个方面是(二价)抗体，其包含
a)第一多肽，其从N末端至C末端方向包含
i)第一结合位点的第一部分，
ii)第一多聚化结构域，和
iii)所述第一结合位点的第二部分，
和
b)第二多肽，其从N末端至C末端方向包含
i)第二结合位点的第一部分，
ii)第二多聚化结构域，和
iii)所述第二结合位点的第二部分，
其中第一结合位点的第一部分和第一结合位点的第二部分一起形成(功能性)第一结合位点，并且第二结合位点的第一部分和第二结合位点的第二部分一起形成第二(功能性)结合位点，
其中第一结合位点和第二结合位点彼此独立地特异性结合(不同的)表位/靶标/抗原，并且
其中第一多肽和第二多肽通过多聚化结构域彼此非共价或共价缀合/缔合。
在一个实施方案中，所述第一和第二多聚化结构域不包含/不含抗体铰链区或其变体或其片段。
在一个实施方案中，所述第一和第二多聚化结构域各自是抗体CH3结构域或其变体或其片段。在一个实施方案中，CH3结构域是人CH3结构域。在一个优选的实施方案中，CH3结构域是人IgG1 CH3结构域。在一个实施方案中，每个多聚化结构域是一对人CH2-CH3结构域，优选是人IgG1同种型的。
在一个实施方案中，所述第一或第二多聚化结构域是抗体CH1结构域或其变体或其片段，并且相应的另一个多聚化结构域是抗体CL结构域或其变体或其片段。在一个实施方案中，CH1结构域和CL结构域是人CH1结构域和人CL结构域。在一个优选的实施方案中，CH1结构域是人IgG1 CH1结构域，CL结构域是人κ或λCL结构域。
在一个实施方案中，结合位点的部分是抗体可变结构域。在一个实施方案中，结合位点的第一部分是抗体重链可变结构域，结合位点的第二部分是抗体轻链可变结构域，反之亦然。在一个实施方案中
-抗体重链可变结构域(直接或通过第一(肽)接头)融合到多聚化结构域的一个末端，
-抗体轻链可变结构域(直接或通过第二(肽)接头)融合到多聚化结构域的相应另一个末端，并且
-抗体重链可变结构域或抗体轻链可变结构域具有与多聚化结构域的(肽内/链内)二硫键。
本文报道的一个方面是(重组)融合多肽，其包含抗体重链可变结构域，多聚化结构域和抗体轻链可变结构域，
其中，
-抗体重链可变结构域(直接或通过第一(肽)接头)融合到多聚化结构域的一个末端，
-抗体轻链可变结构域(直接或通过第二(肽)接头)融合到多聚化结构域的相应另一个末端，以及
-抗体重链可变结构域或抗体轻链可变结构域具有与多聚化结构域的(肽内/链内)二硫键。
在所有方面的一个实施方案中，二硫键位于抗体重链可变结构域和多聚化结构域之间。
在所有方面的一个实施方案中，重链可变结构域在位置82b(根据Kabat)包含半胱氨酸氨基酸残基，并且二硫键在重链可变结构域的位置82b的半胱氨酸残基和多聚化结构域之间。
在一个实施方案中，多聚化结构域是(衍生自)抗体CH3结构域，或抗体CH1结构域，或抗体CL结构域，或其各自的片段或变体。
在所有方面的一个优选实施方案中，多聚化结构域是在位置433(根据Kabat EU索引编号)具有半胱氨酸氨基酸残基的抗体CH3结构域或其片段或变体，并且二硫键位于重链可变结构域的位置82b的半胱氨酸残基和CH3结构域的位置433的半胱氨酸残基之间。
在一个实施方案中，多肽或融合多肽从N末端至C末端方向包含抗体重链可变结构域，多聚化结构域和抗体轻链可变结构域。
在一个实施方案中，多肽或融合多肽在N末端至C末端方向包含抗体轻链可变结构域，多聚化结构域和抗体重链可变结构域。
在所有方面的一个实施方案中，抗体可变结构域通过肽接头与多聚化结构域的各个末端融合。
本文报道的一个方面是(二价)抗体，其由两个如本文报道的融合多肽组成。
本文报道的一个方面是(二价)抗体，其包含
a)第一多肽，其包含
-第一抗体重链可变结构域，
-第一抗体轻链可变结构域，和
-第一多聚化结构域，
和
b)第二多肽，其包含
-第二抗体重链可变结构域，
-第二抗体轻链可变结构域，和
-第二多聚化结构域，
其中第一和第二抗体可变结构域是形成第一(功能性)抗原/靶标结合位点的(同源)VH/VL对，并且第三和第四抗体可变结构域是形成第二(功能)抗原/靶标结合位点的(同源)VH/VL对，
其中第一和第二多肽在多聚化结构域内彼此共价或非共价缀合，
并且
条件是第一和第二多聚化结构域不包含免疫球蛋白铰链区)。
本文报道的一个方面是(二价)抗体，其包含
a)第一多肽，其包含
-第一抗体重链可变结构域，
-第一抗体轻链可变结构域，和
-第一多聚化结构域，
和
b)第二多肽，其包含
-第二抗体重链可变结构域，
-第二抗体轻链可变结构域，和
-第二多聚化结构域，
其中第一多肽的可变结构域形成特异性结合第一靶标的第一(功能性)结合位点，第二多肽的可变结构域形成特异性结合第二靶标的第二(功能性)结合位点，
其中第一和第二多肽在多聚化结构域内/通过多聚化结构域彼此共价或非共价缀合。
在((二价)抗体的)一个实施方案中
-第一和第二多聚化结构域是抗体CH3结构域或其片段或变体，或
-所述多聚化结构域之一是抗体CH1结构域或其片段或变体，并且相应的另一个多聚化结构域是抗体CL结构域或其片段或变体。
在((二价)抗体的)一个实施方案中
-CH3结构域之一具有突变T366W，并且另一个CH3结构域具有突变T366S，L368A和Y407V(根据Kabat EU索引编号)，
并且
-其中CH3结构域之一还具有突变Y349C，并且另一个CH3结构域还具有突变E356C或S354C(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在一个实施方案中，融合多肽或抗体特异性结合选自由VEGF，ANG2，PDGF和IL-1β组成的组的一种抗原。
在一个实施方案中，抗体特异性结合彼此独立地选自由VEGF，ANG2，PDGF和IL-1β组成的组的两种抗原。
在一个实施方案中，多聚化结构域不包含/不含或所有多聚化结构域不包含/不含抗体铰链区或其变体或其片段。
在一个实施方案中，CH3结构域是人CH3结构域。在一个优选的实施方案中，CH3结构域是人IgG1 CH3结构域。在一个实施方案中，每个多聚化结构域是一对人IgG1 CH2-CH3结构域。
在一个实施方案中，CH1结构域是人CH1结构域，CL结构域是人CL结构域。在一个优选的实施方案中，CH1结构域是人IgG1 CH1结构域，CL结构域是人κ或λCL结构域。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，每个多聚化结构域是含有非天然半胱氨酸残基的抗体CH3结构域。在一个实施方案中，每个CH3结构域含有突变H433C(根据KabatEU Index编号)。在一个实施方案中，每个多肽的重链可变结构域(的N末端部分)在框架区3(FR3)中包含半胱氨酸残基。在一个实施方案中，每个多肽的重链可变结构域(的N-末端部分)在位置82b(根据Kabat编号)包含半胱氨酸残基。在一个实施方案中，第一结合位点的第一部分(第一结合位点的重链可变结构域)在位置82b包含半胱氨酸残基，第二结合位点的第一部分(第二结合位点的重链可变结构域)在位置82b(根据Kabat编号)包含半胱氨酸残基，并且每个CH3结构域在位置433(根据Kabat EU index编号)包含半胱氨酸残基。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，结合位点的每个部分和相应的多聚化结构域之间存在肽接头。在一个实施方案中，每个多肽在N末端至C末端方向上包含结合位点的一部分，第一肽接头，多聚化结构域，第二肽接头和结合位点的一部分。在一个实施方案中，第一和第二肽接头具有氨基酸序列SEQ ID NO：01和SEQ ID NO：02。在一个实施方案中，第一和第二肽接头具有氨基酸序列SEQ ID NO：03和SEQ ID NO：04。在一个实施方案中，第一和第二肽接头具有氨基酸序列SEQ ID NO：05和SEQ ID NO：06。在一个实施方案中，第一和第二肽接头具有氨基酸序列SEQ ID NO：07和SEQ ID NO：08。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，第一结合位点和第二结合位点各自是抗体结合位点(成对的重链可变结构域和轻链可变结构域)。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，第一结合位点的第一部分是抗体轻链可变结构域并且第一结合位点的第二部分是抗体重链可变结构域，并且第二结合位点的第一部分是抗体轻链可变结构域并且第二结合位点的第二部分是抗体重链可变结构域。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，第一结合位点的第一部分是抗体轻链可变结构域并且第一结合位点的第二部分是抗体重链可变结构域，第二结合位点的第一部分是抗体重链可变结构域并且第二结合位点的第二部分是抗体轻链可变结构域。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，第一结合位点的第一部分是抗体重链可变结构域并且第一结合位点的第二部分是抗体轻链可变结构域，第二结合位点的第一部分是抗体重链可变结构域并且第二结合位点的第二部分是抗体轻链可变结构域。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，抗体轻链和/或重链可变结构域是全长抗体可变结构域。全长抗体可变结构域包含以下子结构域(在N末端至C末端方向上)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，抗体轻链和/或重链可变结构域是短抗体可变结构域。短抗体可变结构域至少包含以下子结构域(在N末端至C末端方向上)：CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3。短抗体可变结构域可另外包含子结构域FR1的片段(C末端片段)和/或子结构域FR4的片段(N末端片段)。在一个实施方案中，短抗体可变结构域是全长抗体可变结构域，其中不存在/缺失二至六个C端氨基酸残基(即，FR4子结构域的二至六个C端氨基酸残基不存在)。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，多聚化结构域衍生自抗体CH3结构域。在一个实施方案中，多聚化结构域是抗体CH3结构域或其变体或其片段。在一个优选的实施方案中，CH3结构域之一含有突变T366W，而另一个CH3结构域含有突变T366S，L368A和Y407V(根据Kabat EU Index编号)。在另一个实施方案中，CH3结构域之一还含有突变Y349C，另一个CH3结构域还含有突变E356C或S354C(根据Kabat EU Index编号)。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，多聚化结构域是衍生自抗体CH1结构域-CL结构域对的结构域对。在一个优选的实施方案中，多聚化结构域之一是抗体CH1结构域或其变体，并且相应的另一个多聚化结构域是抗体CL结构域或其变体。
在本文报道的所有方面的一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。
在本文所述所有方面的一个实施方案中，抗体特异性结合选自由VEGF，ANG2，PDGF和IL-1β组成的组中的抗原之一。
在本文所述所有方面的一个实施方案中，抗体特异性结合选自VEGF，ANG2，PDGF和IL-1β的两种抗原。
在本文所述所有方面的一个实施方案中，抗体特异性结合抗原VEGF和ANG2，或VEGF和PDGF，或VEGF和IL-1β。
本文报道的一个方面是本文报道的(二价)抗体，其用作药物。
本文报道的一个方面是含有本文报道的(二价)抗体的药物制剂。
在一个实施方案中，药物制剂用于治疗眼血管疾病。
在一个实施方案中，眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
本文报道的一个方面是如本文报道的(二价)抗体用于制备药物的用途。
本文报道的一个方面是本文报道的(二价)抗体，其用作药物。
在一个实施方案中，所述用途是用于治疗眼血管疾病。
在一个实施方案中，眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
本文报道的一个方面是本文报道的(二价)抗体在制备药物中的用途。
在一个实施方案中，所述用途是用于制备用于治疗眼血管疾病的药物。
在一个实施方案中，眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
本文报道的一个方面是本文报道的(二价)抗体，其用于治疗眼血管疾病。
在一个实施方案中，眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
本文报道的一个方面是本文报道的(二价)抗体，其用于治疗眼血管疾病。
在一个实施方案中，眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
本文报道的一个方面是通过将本文报道的(二价)抗体施用给需要治疗的患者来治疗患有眼血管疾病的患者的方法。
在一个实施方案中，眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
本文报道的一个方面是治疗患有眼血管疾病的个体的方法，其包括向个体施用有效量的本文报道的抗体。
本文报道的一个方面是抑制个体眼中新生血管形成的方法，其包括向个体施用有效量的本文报道的抗体以抑制新生血管形成。
发明详述
本文报道了一种新型抗体形式，其可以用作生产针对年龄相关性黄斑变性的新型治疗剂的基本形式，并且通常具有改善的眼科学性质。
本文报道的抗体形式，即Ophthabody，是一种新型二价双特异性结合分子，其与传统的四链全长抗体相比具有降低的分子量，并且与其他低分子量抗体形式相比具有改善的性质。
I.定义
本文中，根据Kabat的编号系统(Kabat，等.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991))表示所有恒定抗体结构域(CH1，铰链，CH2，CH3)的氨基酸位置，并且所述编号被称为“根据Kabat编号”。特别地，Kabat编号系统(参见Kabat，等.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)第647-660页)用于编号κ和λ同种型的轻恒定抗体结构域(CL)，并且Kabat EU编号索引用于重抗体链的恒定结构域(参见第661-723页；CH1，铰链，CH2和CH3)。
在此明确指出，如本文所用的术语“包含”包括术语“由...组成”。因此，含有术语“包含”的所有方面和实施方案同样以术语“由...组成”公开。
术语“约”表示此后的数值的+/-20％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示此后的数值的+/-10％的范围。在一个实施方案中，术语“约”表示此后的数值的+/-5％的范围。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体，三特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所期望的抗原-和/或蛋白质A和/或FcRn结合活性。
术语“抗体结合位点”表示负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。通常，这是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。抗体的抗原结合位点包含来自“高变区”或“HVR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区域是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N末端至C末端包含区域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4(免疫球蛋白框架)。特别地，重链的CDR3区域是对抗原结合贡献最大并且限定抗体的区域。
术语“与抗原结合”是指在体外测定中抗体与其抗原的结合，在一个实施方案中，在结合测定中，抗体与表面结合，并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原与抗体的结合。结合意指结合亲和力(KD)为约10-8M或更低，在一些实施方案中为10-13M至10-8M，在一些实施方案中为10-13至10-9M。
可以通过BIAcore测定法(GE Healthcare Biosensor AB，Uppsala，Sweden)研究结合。结合的亲和力由术语ka(抗体自抗体/抗原复合物的结合速率常数)，kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。
如本文所用的术语“结合位点”表示包含显示对靶标的结合特异性的两个独立结构域的任何蛋白质实体。例如，抗体结合位点包含至少三个HVR，例如在天然存在的抗体，即常规抗体的情况下，六个HVR。
术语“人IgG1 CH1结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大约从EU位置118延伸至EU位置215(根据Kabat的EU编号系统)。在一个实施方案中，CH1结构域具有SEQ ID NO：25的氨基酸序列：ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV。
术语“人IgG1 CH2结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大约从EU位置231延伸至EU位置340(根据Kabat的EU编号系统)。在一个实施方案中，CH2结构域具有SEQ ID NO：23的氨基酸序列：APELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQE STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAK。
术语“人IgG1 CH3结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大约从EU位置341延伸至EU位置445。在一个实施方案中，CH3结构域具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列：GQPREPQVYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSP。
术语“人κ CL结构域”表示抗体轻链多肽的一部分，其大约从位置108延伸至位置214(Kabat和Kabat EU索引)。在一个实施方案中，CL结构域具有SEQ ID NO：21的氨基酸序列：RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC。
术语“人λCL-结构域”表示抗体重链多肽的一部分，其大约从位置108延伸至位置215(根据Kabat)。在一个实施方案中，CL结构域具有SEQ ID NO：22的氨基酸序列：QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTTPSKQ SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKTVA PTECS。
抗体的“类别”是指其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五种主要类别的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ和μ。
术语“同源VH/VL-对”表示一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域，它们一起形成特异性结合抗原的抗体结合位点。同源VH/VL对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域来自单抗体。该单抗体可以例如从分泌单抗体的B细胞中分离，或衍生自单个人或人源化抗体或来自噬菌体展示。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1，FR2，FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常以下列顺序出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”表示具有与天然抗体结构基本相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。全长抗体可以包含其他结构域，例如，与全长抗体的一条或多条链缀合的scFv或scFab。术语全长抗体也包括这些缀合物。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其中包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而不考虑传代次数。子代可能与亲本细胞的核酸含量不完全相同，可能含有突变。本文包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。
“人源化”抗体是指嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个，通常两个可变结构域中的基本上全部，其中全部或基本上全部HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，并且全部或基本上全部FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”，例如非人抗体，是指已经历人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列方面是高变的每个区域(“互补决定区”或“CDR”)并且形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)。通常，抗体包含六个HVR；VH中的三个(H1，H2，H3)和VL中的三个(L1，L2，L3)。如本文所示的HVR包含：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高变环(Chothia，C.和Lesk，A.M.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35b(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)处发生的CDR(Kabat，E.A.等.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)，NIH Publication 91-3242.)；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)，46-55(L2)，89-96(L3)，30-35b(H1)，47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触(MacCallum等.J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)，(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)，47-56(L2)，48-56(L2)，49-56(L2)，26-35(H1)，26-35b(H1)，49-65(H2)，93-102(H3)和94-102(H3)。
在一个实施方案中，HVR残基包括在说明书中其他地方鉴定的那些。
除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat EU索引编号系统(Kabat等，同上)编号。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如人和非人灵长类动物如猴)，兔和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体是与其天然环境的组分分离的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或色谱(例如，尺寸排阻色谱法或离子交换或反相HPLC)测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman，S.等.，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸是指已经与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的所述核酸分子，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。
术语“单克隆抗体”是指是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体，例如，包含天然存在的突变或在单克隆抗体制剂生产期间产生，这些变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，用于制备本文所述单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“眼血管疾病”包括但不限于眼内新生血管综合征，例如糖尿病视网膜病，糖尿病黄斑水肿，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，视网膜静脉阻塞，视网膜中央静脉阻塞，黄斑变性，年龄相关性黄斑变性，色素性视网膜炎，视网膜血管瘤增生，黄斑毛细血管扩张(macular telangectasia)，缺血性视网膜病，虹膜新生血管形成，眼内新生血管形成，角膜新生血管形成，视网膜新生血管形成，脉络膜新生血管形成和视网膜变性(参见例如Garner，A.，Vascular diseases，In：Pathobiology of ocular disease，A dynamicapproach，Garner，A.，和Klintworth，G.K.，(eds.)，2nd edition，Marcel Dekker，NewYork(1994)，pp.1625-1710)。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其所处的形式使得其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的其他成分。
“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除活性成分外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂或防腐剂。
如本文所用的术语“肽接头”表示具有氨基酸序列的肽，其在合成来源的一个实施方案中。“肽接头”代表氨基酸残基的线性链。该氨基酸残基的线性链长度为1至30个残基。
在一个实施方案中，肽接头富含甘氨酸，谷氨酰胺和/或丝氨酸残基。这些残基例如以多至5个氨基酸的小重复单元(例如GS，GGS，GGGS，和GGGGS)排列。小的重复单元可以重复一到五次。在多聚体单元的氨基和/或羧基末端，可加入多达六个另外的任意的天然存在的氨基酸。
在一个实施方案中，肽接头是具有长度为多达30个氨基酸残基(在一个实施方案中具有5至20个氨基酸残基的长度)的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝2，3，4或5)或(x＝4且n＝2，3或4)，在一个实施方案中，x＝3，n＝2，在一个实施方案中，x＝4，n＝2。然而，该肽接头可以在其一个或两个末端包含额外的甘氨酸和/或丝氨酸残基。
其他合成肽接头由单一氨基酸构成，其重复10至20次，并且可以在氨基和/或羧基末端包含多达六个另外的任意的天然存在的氨基酸。
除了合成的富含GS的肽接头外，还可以使用天然存在的肽接头，例如IgG铰链，人P-糖蛋白的接头，人复制蛋白A的C-末端接头，甲状旁腺激素相关蛋白的接头。
所有肽接头可以由核酸分子编码，因此可以重组表达。由于接头本身是肽，通过接头连接的多肽经由在两个氨基酸之间形成的肽键与接头连接。
术语“重组”或“重组产生的”表示通过重组方法制备，表达，产生或分离的多肽。这包括从宿主细胞(例如NS0或CHO细胞)分离的多肽，或来自转基因动物(例如小鼠)的多肽，或使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽。
如本文所用，“治疗”(及其语法变体，例如“进行治疗”)是指试图改变所治疗个体的自然病程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理期间进行。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，症状的缓解，疾病的任何直接或间接病理后果的减少，预防转移，疾病进展速度的降低，疾病状态的改善或减轻，预后的缓解或改善。在一些实施方案中，如本文报道的抗体或Fc区融合多肽用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
本申请中使用的术语“价”表示在(抗体)分子中存在指定数量的结合位点。因此，术语“二价”，“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点，四个结合位点和六个结合位点。本文报道的双特异性抗体在一个优选实施方案中是“二价的”。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的结构域，其参与抗体与其抗原的结合。抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见例如Kindt，T.J.等.KubyImmunology，6th ed.，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(2007)，第91页)。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域分离，以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano，S.等.，J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson，T.等.，Nature 352(1991)624-628)。
如本文所用，术语“载体”是指能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到其中已导入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
II.玻璃体液/玻璃体
填充眼中大部分空间的基质表示为玻璃体液/玻璃体。
人体玻璃体液是一种清澈的水溶液，其填充位于晶状体和视网膜之间的眼后房。其占眼球体积的约80％，含有99％的水，但由于胶原原纤维和大分子透明质酸的网络，在出生时具有凝胶状结构。其体积约为4-5ml(Beauthier，J.P.，(2008)Quelques aspectsbiochimiques de l’e′volution post mortem.In：De Boeck Universite′[Ed].Traite′de me′de-cine le′gale.Bruxelles：715-725.)。玻璃体液含有若干种低分子量溶质，包括无机盐，糖和抗坏血酸。人玻璃体中蛋白质的总浓度约为1200μg/ml，其中胶原占180μg/ml(参见例如Aretz，S.，等.，Prot.Sci.11(2013)22；Theocharis，A.D.，等.，Biochim.84(2002)1237-1243)。Angi，M.等(Hindawi Publishing Corporation，Mediators ofInflammation，Volume 2012，Article ID 148039)报道了健康玻璃体液的平均蛋白质浓度为0.5mg/mL，主要由白蛋白(60-70％)组成。此外，据报道，玻璃体液的组分是球蛋白，凝血蛋白，补体因子和低分子量蛋白(Ulrich，J.N.等，Clin.Exp.Ophthalmol.36(2008)431-436)。睫状体通过扩散，超滤和水性流体主动输送到后段而提供恒定的流体交换(Bishop，P.N.，Eye，16(2002)454-460)。蛋白质可通过局部分泌(例如糖蛋白)，血液过滤(例如白蛋白)或来自周围组织的扩散积聚在玻璃体中(Wu，C.W.，Am.J.Ophthalmol.，137(2004)655-661)。由于玻璃体和内部视网膜之间的紧密接触，视网膜的生理和病理状况影响玻璃体液的蛋白质组和生化特性。
III.黄斑变性
眼科学是涉及眼疾病及其治疗的医学分支。在眼科领域，存在许多严重影响受影响人的视力的经常导致失明的严重疾病。糖尿病性黄斑水肿(DME)，糖尿病视网膜病(DR)和年龄相关性黄斑变性(AMD)仅在德国就影响了近500万人，并且受影响人数不断增加([1])。AMD是全球第三大常见眼病。它导致视力严重受损，8.7％的病例甚至导致完全失明([2]，[3])。在工业化国家，它是50岁以上人群中最常见的眼病，导致不可逆转的失明([4]，[5])。预计到2020年将有1.96亿人受到AMD的影响([6])。
AMD是一种慢性进行性疾病，可分为几个阶段。在早期阶段，发生由于衰老过程导致视网膜色素上皮细胞(RPE)的变化，以及视网膜色素上皮细胞和布鲁赫膜(Bruch′smembrane，其代表脉络膜(脉络膜组织)和RPE之间的限制性膜)之间的分解代谢物(腺体)的视网膜下沉积。在进展中，可能出现AMD的两个晚期阶段。在一定阶段，该疾病可能导致缓慢的进行性干性AMD，也称为地图状萎缩。这导致RPE在“黄斑”(拉丁语：macula lutea，视力最清晰的点)中降解，并且脉络膜中血管破裂。较不常见的阶段是快速，进展性湿性AMD，其特征在于脉络膜新生血管形成，视网膜下空间中新血管的向内生长。这导致血浆和血液逃逸到周围组织中[[4]，[7])。干性AMD和湿性AMD均导致光感受器死亡，引起中心视力丧失。
有各种可疑的AMD病因。除了布鲁赫膜的、视网膜色素上皮的和光感受器的非特异性、年龄相关性变化，已经主要地讨论了氧化应激，补体系统的功能障碍，局部炎症，溶酶体降解的减少以及伴随的视网膜毒素的积累，以及血管内皮生长因子(VEGF)过度表达的发生。已经在具有脉络膜新生血管形成的患者的房水和视网膜中检测到VEGF浓度增加。此外，许多体内模型显示脉络膜新生血管形成和VEGF表达之间的关系[4]。
VEGF代表了当前AMD疗法的主要焦点([7])。VEGF抑制可能会停止或至少延缓疾病的进展([8])。这通常需要每月玻璃体内(进入玻璃体)注射VEGF抑制剂进入玻璃体。尽管可用的疗法有时会导致患者的情况大大改善，但仍然非常需要新颖的优化疗法。
目前的临床研究集中于抑制VEGF和其他血管生成生长因子例如血管生成素-2(ANG2)的分子。研究还表明体内出血的风险增加，这是抗VEGF疗法的潜在副作用([9])。
IV.玻璃体内的半衰期
药物的玻璃体内半衰期以及由此玻璃体内注射的次数通过药物在眼睛中的扩散特性及其稳定性来确定。
扩散特性主要由分子量和分子的流体动力学半径决定。这些影响分子从眼睛到体循环的迁移速度。这对于AMD患者特别相关，其中血液-视网膜屏障不再完全完整。尽管如果注射具有较高分子量的分子，则在眼睛中的停留时间将更长，但同时全身暴露于药物的持续时间将增加。这可能会促进副作用的发生。全身暴露时间主要是注射分子的分子量的函数。分子量小于60kDa的分子通过肾脏迅速排出体外；较大的分子在体循环中花费较长时间。观察到分子量＜30kDa的最有效过滤([10])。
热稳定性决定了化合物在体内条件下保持正确折叠状态的时间。比较仅在热稳定性方面不同的两个分子的半衰期将表明具有较高热稳定性的分子在较长时间内保持其活性。
在玻璃体内半衰期长的情况下，需要较少的注射，在体循环中半衰期短的情况下，可以实现低系统暴露，并且在两者组合的情况下预期增加的功效和降低的副作用。
玻璃体内长半衰期可以通过以下方式实现：
-高分子量(IgG，添加例如PEG至更小的形式，例如双抗体，Fab等)，
-对靶标的高亲和力和亲合力(较低的有效药物浓度导致较低频率的给药)，
-在37℃时具有高热稳定性，
-减少分子跨玻璃体液和血液视网膜屏障(BRB)的扩散，
-最佳电荷或pI。
快速全身清除可以通过以下实现：
-对Fc区进行工程化以降低FcRn结合，
-低(较低)分子量(Fab，双抗体，DARPIN)，
-低施用剂量(剂量也取决于亲和力)。
药物的玻璃体内半衰期和持久性可以通过不同方式增加，如其中例如药物的流体动力学半径的增加(从而减缓从眼的扩散)，药物对其靶标的高亲和力(从而减少药物-靶标复合物的解离)，眼中的高(热)降解稳定性和高注射剂量。
影响持久性的主要因素是剂量(可施用剂量的增加对持久性有积极作用)，半衰期(半衰期的增加对持久性有积极作用)和对靶标的亲和力(以KD表示)(亲和力的增加对持久性有积极作用)。
V.抗体形式
单价单特异性片段抗原结合(Fab)包括完整的轻链以及重链的VH和CH1结构域。Fab的分子量约为50kDa。
单价单特异性单链可变片段(scFv)是包含VL和VH结构域和其间的柔性接头的单一多肽链。scFv的分子量约为28kDa。
分子量约为50kDa的双抗体是衍生自scFv的二价双特异性分子形式。
分子量小于全长单克隆抗体(分子量约150kDa)的片段具有更好的组织穿透性。然而，由于较低的分子量的其他因素方面，这些分子的全身半衰期大大降低。双抗体和scFv都具有短的全身半衰期，因为其低于肾过滤阈值([11]，[12]，[13])。
各种分子特性在眼科领域中是重要的。一方面，为了将尽可能多的分子引入眼，需要高剂量水平。这很重要，因为目前只能玻璃体内注射50μL体积。还希望从体循环中快速清除。此外，对抗原的高亲和力和玻璃体内半衰期是重要的。
VI.本文描述的抗体形式
本文报道的(二价)抗体是称为“Ophthabody”的新型抗体形式。它的分子量略高于Fab片段，因此推测其玻璃体内半衰期也稍更长。另一方面，它应该仍然足够小，以便通过肾脏迅速从体循环中清除。低分子量和分子结构与高热稳定性相结合，产生改善的特性。不受该理论的束缚，与IgG相比较低的分子量也可导致组织穿透性的改善。
Ophthabody由两种不同的多肽链组成。其中的每一个包含三个结构域，其可以彼此直接缀合或通过肽接头缀合。每种多肽的N-末端和C-末端结构域或多肽的相应结构域形成结合位点。因此，Ophthabody具有两个结合位点，即它是二价的。因此，Ophthabody可以是单特异性的或双特异性的。每个链的第三个和中心结构域是多聚化结构域。通过该结构域，两种多肽彼此缔合。这种多聚化结构域可以是，例如，亮氨酸拉链结构域，螺旋-环-螺旋结构域，PB1结构域，一对CH1-CL结构域和一对CH3结构域([14])。在任何情况下，二聚化结构域都不是一对抗体铰链区多肽。
表：比较不同抗体形式的特性(也参见[15]，[16])。
在一个实例中，选择血管生成素-2作为抗原1，并选择VEGF作为抗原2。设计了本文报道的Ophthabody形式的不同抗体变体，产生7种不同的蛋白质，其中蛋白质I代表基础变体。
HA(第一多肽，特异性结合血管生成素2)和KV(第二多肽，特异性结合VEGF)的相应的对通过其CH3结构域彼此缔合并形成Ophthabody。在变体VII中，引入另外的半胱氨酸残基以形成稳定的链内二硫键。二硫键在一个多肽内的N端结构域和多聚化结构域之间形成。同样，它也可以被改造成在C端结构域和多聚化结构域之间。
使用荧光素酶测定(报告基因测定)，进行测试以确定Ophthabody变体防止由VEGF触发的信号级联的程度如何(EC50＝半最大有效浓度；达到最大效果的50％时的浓度)。
表：在荧光素酶测定中，与双特异性参比IgG相比，蛋白质变体的测定的相对活性。
变体 EC50 Ophthabody[nM] EC50参比[nM]
I 1.8 2.0
II 1.8 2.0
III 2.7 2.6
IV 3.0 2.6
V 2.4 2.6
VI 2.2 2.6
VII 2.1 2.6
使用激酶受体激活测定，进行测试以确定Ophthabody变体防止由ANG2触发的抗原受体的自磷酸化的程度如何(EC50＝半最大有效浓度；达到最大效果的50％时的浓度)。
表：在激酶受体活化测定中，与双特异性参比IgG相比，蛋白质变体的测定的相对活性。
变体 EC50 Ophthabody[nM] EC50参比[nM]
I 21 63
II 18 63
III 19 47
IV 13 47
V 14 47
VI 18 47
VII 23 47
所有Ophthabody变体可同时结合两个抗原。
已经通过确定聚集起始温度(Tagg)和解链温度(Tm)来评估不同抗体的热稳定性(参见下表)。还已经确定了使用与Ophthabody构建体中相同的VH和VL序列的scFv-CH3-微抗体(minibody)，双抗体和串联_双-scFv(tandem_di-scFv)的各自值。
表：测定的解链和聚集温度
蛋白质 Tm[℃] Tagg[℃]
I 46 42
II 46 42
III 46 41
IV 46 41
V 46 39
VI 46 42
VII 59 50
scFv-CH3-微抗体 53 50
双抗体 50 42
串联_双-scFv 46 38
可以看出，二硫化物稳定的Ophthabody具有增加的热稳定性。
所有Ophthabody变体都产生了良好的结果
表：制备结果总结
文献引用
[1]Wolfram，C.and Pfeiffer，N.：Weiβbuch zur Situation derophthalmologischen Versorgung in Deutschland[White Paper on the Situation ofOphthalmological Care in Germany]，Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft[German Ophthalmological Society]，Munich 2012.
[2]World Health Organization：Causes of blindness and visualimpairment http：//www.who.int/blindness/causes/priority/en/，reviewed on June10,2015at 1：44p.m.
[3]McHarg，S.，et al.(2015).″Age-related macular degeneration and therole of the complement system.″Mol Immunol，67(1)：43-50.
[4]Holz，F.G.，et al.(2014).″Recent developments in the treatment ofage-related macular degeneration.″J Clin Invest，124(4)，1430-1438.
[5]Fernandez-Robredo，P.，et al.(2014).″Current treatment limitationsin age-related macular degeneration and future approaches based on celltherapy and tissue engineering.″J Ophthalmol，2014,510285,13pages.
[6]Wong，W.L.，et al.(2014).″Global prevalence of age-related maculardegeneration and disease burden projection for 2020 and 2040：a systematicreview and meta-analysis.″The Lancet Global Health，2(2)，e106-e116.
[7]Ishikawa，M.，et al.(2015).″Future therapies of wet age-relatedmacular degeneration.″J Ophthalmol，2015，138070，10pages.
[8]Amstutz，C.A.，et al.(2015).″Long-Term Outcome in Patients withIntravitreal Anti-VEGF Therapy for Exudative AMD.″Klin Monbl Augenheilkd 232(4)：533-537.
[9]Grassmann，F.，et al.(2015).″The genetics of age-related maculardegeneration(AMD)-Novel targets for designing treatment options？″Eur J PharmBiopharm，http：//dx.doi.org/10.1016/j.ejpb.2015.04.039.
[10]Crommelin，D.J.A.，et al.：Pharmaceutical Biotechnology-Fundamentalsand Applications，Springer Verlag New York 2013，4th Edition，pp.107-109.
[11]Holliger，P.and P.J.Hudson(2005).″Engineered antibody fragmentsand the rise of single domains.″Nat Biotechnol 23(9)：1126-1136.
[12]Wu，A.M.and P.D.Senter(2005).″Arming antibodies：prospects andchallenges for immunoconjugates.″Nat Biotechnol 23(9)：1137-1146.
[13]Nelson，Aaron L.(2010).″Antibody Fragments：Hope and Hype.″mAbs 2(1)：77-83.
[14]McLennan，A.，et al.：Molekularbiologie für Biologen，Biochemiker，Pharmazeuten und Mediziner[Molecular Biology for Biologists，Biochemists，Pharmacists，and Physicians]，Wiley-VCH Verlag&Co.KGaA Weinheim 2013，1st Ed.，p.146.
[15]Chames，Patrick et al.(2009)″Therapeutic Antibodies：Successes，Limitations and Hopes for the Future.″British Journal of Pharmacology 157(2)：220-233.
[16]Strohl，W.R.，et al.：Therapeutic Antibody Engineering-Current andFuture Advances Driving the Strongest Growth Area in the PharmaceuticalIndustry，Woodhead Publishing 2012，pp.227-232，265-286.
VII.生产
本文报道的(二价)抗体通过重组方法产生。因此，本文报道的一个方面是编码本文报道的(二价)抗体的核酸，另一方面是包含编码本文报道的(二价)抗体的核酸的细胞。用于重组产生的方法在现有技术中是众所周知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，随后分离(二价)抗体并通常纯化至药学上可接受的纯度。为了在宿主细胞中表达如上所述的(二价)抗体，通过标准方法将编码各(经修饰的)轻链和重链的核酸插入表达载体中。表达在适当的原核或真核宿主细胞例如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母或大肠杆菌细胞中进行，并从所述细胞(培养上清液或裂解后的细胞)中回收(二价)抗体。用于重组产生抗体的一般方法在现有技术中是公知的，并且描述于例如Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202，Geisse，S.，等.，ProteinExpr.Purif.8(1996)271-282，Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-160，和Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中。还可以使用例如如US 4,816,567中所述的重组方法和制剂产生抗体。
在一个实施方案中，提供了编码如本文所述的(二价)抗体的分离的核酸。这种核酸可编码包含(二价)抗体的第一多肽的氨基酸序列和/或包含(二价)抗体的第二多肽的氨基酸序列。在进一步的实施方案中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在进一步的实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含以下(例如，已用以下转化)：(1)载体，其包含编码包含(二价)抗体的第一多肽的氨基酸序列和包含(二价)抗体的第二多肽的氨基酸序列的核酸，或(2)第一载体，其包含编码包含(二价)抗体的第一多肽的氨基酸序列的核酸，和第二载体，其包含编码包含(二价)抗体的第二多肽的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备如本文报道的(二价)抗体的方法，其中所述方法包括在适于表达(二价)抗体的条件下培养如上所述包含编码(二价)抗体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收(二价)抗体。
因此，本文报道的一个方面是制备本文报道的(二价)抗体的方法，其包括步骤：
a)用包含编码所述(二价)抗体的一种或多种核酸分子的载体转化宿主细胞，
b)在允许合成所述(二价)抗体的条件下培养所述宿主细胞，和
c)从培养物中回收所述(二价)抗体。
在一个实施方案中，c)下的回收步骤包括使用Fc区特异性捕获试剂。在一个实施方案中，Fc区特异性捕获试剂以结合-洗脱模式使用。这种Fc区特异性捕获试剂的实例是例如基于葡萄球菌蛋白A的亲和色谱材料。
(二价)抗体通过常规免疫球蛋白纯化方法适当地与培养基分离，所述方法是例如亲和色谱(蛋白A-琼脂糖凝胶)，羟磷灰石色谱，凝胶电泳或透析。
编码单克隆抗体结合位点的DNA和RNA易于使用常规方法分离和测序。B细胞或杂交瘤细胞可以作为这种DNA和RNA的来源。一旦分离，可将DNA插入表达载体中，然后将其转染到宿主细胞(例如HEK 293细胞，CHO细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞)中，以获得宿主细胞中重组单克隆(二价)抗体的合成。
本文报道的一些分子通过包含差异修饰的Fc区提供容易的分离/纯化，其中至少一个修饰导致i)分子对(葡萄球菌)蛋白A的差异亲和力和ii)分子对人FcRn的差异亲和力，并且所述分子可以基于其对蛋白A的亲和力从破坏的细胞，培养基或分子混合物中分离。
通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl条带，柱色谱，琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其它技术(参见例如Ausubel，F.，等.，ed.Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987))，进行(二价)抗体的纯化以消除细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质。不同的方法已经很好地建立并广泛用于蛋白质纯化，例如用微生物蛋白质的亲和色谱(例如蛋白A或蛋白G亲和色谱)，离子交换色谱(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附色谱(例如用苯基琼脂糖，氮杂-嗜酸树脂或间氨基苯硼酸)，金属螯合亲和色谱(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻色谱和电泳方法(例如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。
用于克隆或表达编码二价抗体的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，(二价)抗体可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于在细菌中表达多肽，参见例如US 5,648,237，US 5,789,199，和US 5,840,523(还参见Charlton，K.A.，In：Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(ed.)，HumanaPress，Totowa，NJ(2003)，pp.245-254，描述了大肠杆菌中抗体片段的表达)。表达后，(二价)抗体可以从可溶性级分中的细菌细胞糊中分离，并可以进一步纯化。
除了原核生物之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母也是编码(二价)抗体的载体的合适克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”的真菌和酵母菌株(导致产生具有部分或完全人糖基化模式的(二价)抗体)。参见Gerngross，T.U.，Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；和Li，H.等.，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
用于表达糖基化(二价)抗体的合适宿主细胞也衍生自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可以与昆虫细胞一起使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，US 5,959,177，US 6,040,498，US 6,420,548，US 7,125,978和US 6,417,429(描述用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK293或293细胞，如描述于例如Graham，F.L.，等.，J.Gen Virol.36(1977)59-74；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠睾丸支持细胞(TM4细胞，如描述于Mather，J.P.，Biol.Reprod.23(1980)243-252)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如描述于例如Mather，J.P.，等.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其包括DHFR-CHO细胞(Urlaub，G.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；和骨髓瘤细胞系，例如Y0，NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki，P.和Wu，A.M.，Methods in Molecular Biology，Vol.248，Lo，B.K.C.(ed.)，Humana Press，Totowa，NJ(2004)，pp.255-268。
VIII.药物制剂
如本文报道的(二价)抗体可具有有价值的功效/安全性特征，并且可为需要相应治疗的患者提供益处。
在一个方面，提供了本文报道的(二价)抗体，其用作药物。
在另一方面，本发明提供(二价)抗体在制造或制备药物中的用途。根据任何实施方案的“个体”可以是人。
在另一方面，本发明提供药物制剂，其包含本文提供的任何(二价)抗体，其例如用于本文概述的任何治疗方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何(二价)抗体和药学上可接受的载体。
本文报道的一个方面是包含本文报道的(二价)抗体的药物制剂。
通过将具有所需纯度的(二价)抗体与一种或多种任选的药学上可接受的载体混合来制备如本文所述的(二价)抗体的药物制剂(以冻干制剂或水溶液的形式)(Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.(ed.)(1980))。药学上可接受的载体通常在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚，丁基或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂例如EDTA；糖类，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子例如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rhuPH20(Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGP(包括rhuPH20)和使用方法描述于US 2005/0260186和US 2006/0104968中。在一个方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体制剂描述于US 6,267,958中。水性抗体制剂包括US 6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些，后者制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(分别例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中，在胶体药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳液，纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。这些技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.(ed.)(1980)中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有(二价)抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质是成形制品的形式，例如薄膜或微胶囊。
用于体内施用的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤可以容易地实现无菌。
本文报道的另一方面是如本文报道的(二价)抗体在制备药物制剂中的用途。本文报道的另一方面是制备包含本文报道的(二价)抗体的药物制剂的方法。在另一方面，提供了制剂，例如，含有与药物载体一起配制的本文报道的(二价)抗体的药物制剂。
本发明的制剂可以通过本领域已知的各种方法施用。如本领域技术人员所理解的，施用途径和/或方式将根据所期望的结果而变化。为了通过某些施用途径施用本文报道的(二价)抗体，可能需要用材料涂覆(二价)抗体或与材料共同施用(二价)抗体以防止其失活。例如，(二价)抗体可以在合适的载体(例如脂质体或稀释剂)中施用于受试者。药学上可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这些用于药物活性物质的介质和试剂的用途是本领域已知的。
可以使用许多可能的递送模式，包括但不限于眼内应用或局部应用。在一个实施方案中，所述应用是眼内的并且包括但不限于，结膜下注射，颅内注射，经由颞颥缘(termporai limbus)注射进入前房，基质内注射，角膜内注射，视网膜下注射，房水注射，眼球下注射或持续递送装置，玻璃体内注射(例如，前，中或后玻璃体注射)。在一个实施方案中，该应用是局部的并且包括但不限于滴眼剂到角膜。
在一个实施方案中，本文报道的(二价)抗体或药物制剂经由玻璃体内应用而施用，例如经由玻璃体内注射施用。这可以按照本领域已知的标准程序进行(参见，例如，Ritter等.，J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276，Russelakis-Carneiro等.，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206，和Wray等.，Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
在一些实施方案中，如本文所报道的治疗试剂盒含有一个或多个剂量的存在于本文所述的药物制剂中的(二价)抗体，用于玻璃体内注射药物制剂的合适装置，以及详细说明用于进行注射的合适受试者和方案的说明书。在这些实施方案中，通常将制剂经由玻璃体内注射施用给需要治疗的受试者。这可以按照本领域已知的标准程序进行(参见，例如，Ritter等，J.Clin.Invest.116(2006)3266-3276，Russelakis-Carneiro等，Neuropathol.Appl.Neurobiol.25(1999)196-206，和Wray等.，Arch.Neurol.33(1976)183-185)。
制剂还可含有佐剂，例如防腐剂，润湿剂，乳化剂和分散剂。通过上文的灭菌程序和通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸等)可以确保防止微生物的存在。还希望的是在制剂中包含等渗剂，例如糖，氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
无论选择何种施用途径，本文报道的(二价)抗体(其可以以合适的水合形式使用)和/或如本文报道的药物制剂通过本领域技术人员已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
可以改变本文报道的药物制剂中活性成分的实际剂量水平，以便获得以下活性成分的量，所述活性成分的量有效实现特定患者，制剂和施用方式的所需治疗应答，而不对患者有毒。选择的剂量水平取决于多个药代动力学因素，包括所用特定制剂的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排泄速率，治疗持续时间，用于与所用特定制剂组合使用的其他药物，化合物和/或材料，所治疗患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康状况和既往病史，以及医学领域中众所周知的相似因素。
制剂必须是无菌的和流动的，以使制剂可通过注射器递送。除水之外，载体优选是等渗缓冲盐水溶液。
例如，通过使用涂层(例如卵磷脂)通过在分散的情况下维持所需的粒度和使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选在制剂中包含等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇或山梨糖醇，和氯化钠。
所述制剂可包含眼用贮库制剂，其包含用于结膜下施用的活性剂。眼用贮库制剂包含基本上纯的活性剂(例如本文报道的双特异性抗体)的微粒。包含本文报道的双特异性抗体的微粒可以包埋在生物相容的药学上可接受的聚合物或脂质包封剂中。贮库制剂可以适于在延长的时间段内释放所有基本上所有的活性物质。如果存在，聚合物或脂质基质可以适于在释放所有或基本上所有活性剂后充分降解以从给药部位转运。贮库制剂可以是液体制剂，包含药学上可接受的聚合物和溶解的或分散的活性剂。注射后，聚合物例如通过凝胶化或沉淀在注射部位形成贮库。
本文报道的另一个方面是本文报道的(二价)抗体，其用于治疗眼血管疾病。
本文报道的另一方面是本文报道的药物制剂，其用于治疗眼血管疾病。
本文报道的另一方面是如本文报道的(二价)抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的用途。
本文报道的另一方面是通过向需要治疗眼血管疾病的患者施用本文报道的(二价)抗体来治疗患有眼血管疾病的患者的方法。
IX.治疗方法
在治疗方法中可用本文提供的任何(二价)抗体。
在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的(二价)抗体。根据任何上述实施方案的“个体”在一个优选实施方案中是人。
在某些实施方案中，提供了用于治疗方法的(二价)抗体。根据任何实施方案的“个体”在一个优选实施方案中是人。
本文报道的(二价)抗体将以符合良好医学实践的方式配制，分配剂量和施用。在此背景下考虑的因素包括所治疗的特定疾病，所治疗的特定哺乳动物，个体患者的临床状况，疾病的原因，药剂的递送部位，施用方法，施用方案，以及医生所知的其他因素。(二价)抗体不必是，但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述疾病的药剂一起配制。这些其他药剂的有效量取决于制剂中存在的(二价)抗体的量，疾病或治疗的类型，以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和给药途径使用，或者以本文所述剂量的约1％至99％使用，或以通过经验/临床确定为合适的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本文报道的(二价)抗体的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用时)将取决于待治疗的疾病类型，(二价)抗体的类型，疾病的严重程度和病程，是否施用(二价)抗体用于预防或治疗目的，既往治疗，患者的临床病史和对(二价)抗体的应答，以及主治医师的自由裁量权。(二价)抗体适合一次或在一系列治疗中施用给患者。这些剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周(例如，使患者接受约2至约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可施用初始较高负荷剂量，然后施用一个或多个较低剂量。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。
X.制品
在本文报道的另一方面，提供了含有有用于治疗，预防和/或诊断上述疾病的材料的制品。制品包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶子，药瓶，注射器，IV溶液袋等。容器可以由多种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器容纳制剂，所述制剂本身或与另一种制剂组合有效治疗，预防和/或诊断病症。制剂中的至少一种活性剂是本文报道的(二价)抗体。标签或包装说明书表明该制剂用于治疗所选择的病症。此外，制品可包括(a)其中含有制剂的第一容器，其中所述制剂包含本文报道的(二价)抗体；(b)含有制剂的第二容器，其中所述制剂包含另外的治疗剂。如本文报道的该实施方案中的制品还可包含包装说明书，其指示制剂可用于治疗特定病症。备选地或另外地，制品还可包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲液。它还可以包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头和注射器。
XI.修饰
在另一方面，根据任何上述实施方案的(二价)抗体可以结合如以下第1-5节中所述的任何单独或组合的特征：
1.抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的(二价)抗体对于其任何靶标具有≤100nM，≤10nM(例如10-7M或更低，例如10-7M至10-13M，例如10-8M至10-13M)的平衡解离常数(KD)。
在一个实施方案中，使用表面等离子体共振测定法测量KD。例如，使用-2000或-3000(GE Healthcare Inc.，Piscataway，NJ)的测定在25℃以约10个应答单元(RU)用固定化抗原CM5芯片进行。在一个实施方案中，根据供应商的说明，用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，GE Healthcare Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠pH 4.8稀释至5μg/mL(～0.2μM)，然后以5μL/分钟的流速注射，以获得偶联蛋白的约10个应答单元(RU)。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)在25℃以大约25μL/min的流速注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)计算为比率koff/kon(参见，例如，Chen，Y.等.，J.Mol.Biol.293(1999)865-881)。如果上述表面等离子体共振测定的缔合速率超过106 M- 1s-1，那么可以通过使用荧光淬灭技术测定结合速率，该技术在增加浓度的抗原存在下在25℃测量在PBS(pH7.2)中的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在光谱仪中测量的，例如带有停流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅拌比色皿的8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic)。
2.嵌合和人源化结合位点
在某些实施方案中，本文提供的(二价)抗体包含嵌合或人源化抗体的一个或两个抗体结合位点。
某些嵌合抗体描述于例如US 4,816,567；和Morrison，S.L.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855)。在一个实施例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠，大鼠，仓鼠，兔或非人灵长类动物的可变区，例如猴)和人恒定区。在另一个实施例中，嵌合抗体是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中HVR(例如CDR)(或其部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列。人源化抗体任选还包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生HVR残基的抗体)的相应残基置换，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备它们的方法综述于例如Almagro，J.C.和Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633，并且进一步描述于例如Riechmann，I.，等.，Nature332(1988)323-329；Queen，C.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；US5,821,337，US 7,527,791，US 6,982,321，和US 7,087,409；Kashmiri，S.V.，等.，Methods36(2005)25-34(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan，E.A.，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面再塑”)；Dall′Acqua，W.F.等.，Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；Osbourn，J.等.，Methods 36(2005)61-68；和Klimka，A.等.，Br.J.Cancer 83(2000)252-260(描述FR改组的“引导选择”方法)。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区域(参见，例如，Sims，M.J.，等.，J.Immunol.151(1993)2296-2308；从具有特定亚组的轻链或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的框架区(参见，例如Carter，P.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289)；以及Presta，L.G.，等.，J.Immunol.151(1993)2623-2632)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见，例如，Almagro，J.C.and Fransson，J.，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；和从筛选FR文库衍生的框架区(参见，例如，Baca，M.等.，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684和Rosok，M.J.等.，J.Biol.Chem.271(1996922611-22618)。
3.人抗体结合位点
在某些实施方案中，本文提供的(二价)抗体包含人抗体的一个或两个抗体结合位点。
可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体。人抗体一般描述于van Dijk，M.A.和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-374和Lonberg，N.，Curr.Opin.Immunol.20(2008)450-459。
可以通过将免疫原施用于转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这些动物通常含有全部或部分人免疫球蛋白基因座，它们取代内源性免疫球蛋白基因座，或者在染色体外存在或随机整合到动物的染色体中。在这种转基因小鼠中，内源性免疫球蛋白基因座通常已被失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg，N.，Nat.Biotech.23(2005)1117-1125。还参见例如描述XENOMOUSETM技术的US 6,075,181和US 6,150,584；描述了技术的US 5,770,429；描述K-M技术的US 7,041,870和描述技术的US 2007/0061900。可以进一步修饰由这些动物产生的完整抗体的人可变区，例如通过与不同的人恒定区组合。
人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(参见例如Kozbor，D.，J.Immunol.133(1984)3001-3005；Brodeur，B.R.，等.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，Marcel Dekker，Inc.，New York(1987)，pp.51-63；和Boerner，P.，等.，J.Immunol.147(1991)86-95)。通过人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体还描述于Li，J.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103(2006)3557-3562。其他方法包括例如US 7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni，J.，Xiandai Mianyixue 26(2006)265-268(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(Trioma技术)描述于Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Histology and Histopathology 20(2005)927-937和Vollmers，H.P.和Brandlein，S.，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology27(2005)185-191。
还可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生人抗体。然后可以将这种可变结构域序列与期望的人恒定结构域组合。从抗体文库中选择人抗体的技术描述如下。
4.文库衍生的抗体结合位点
如本文报道的(二价)抗体可包含通过筛选具有所需活性的抗体的组合文库而分离的抗体的一个或两个抗体结合位点。
例如，本领域已知多种方法用于产生噬菌体展示文库并筛选这些文库以获得具有期望结合特征的抗体。这些方法综述于例如Hoogenboom，H.R.等.，Methods in MolecularBiology 178(2001)1-37并且进一步描述于例如McCafferty，J.等.，Nature348(1990)552-554；Clackson，T.等.，Nature 352(1991)624-628；Marks，J.D.等.，J.Mol.Biol.222(1992)581-597；Marks，J.D.和Bradbury，A.，Methods in Molecular Biology 248(2003)161-175；Sidhu，S.S.等.，J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee，C.V.等.，J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse，F.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；和Lee，C.V.等.，J.Immunol.Methods 284(2004)119-132。
在某些噬菌体展示方法中，VH和VL基因的组库通过聚合酶链反应(PCR)分别克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter，G.，等.，Ann.Rev.Immunol.12(1994)433-455中所述筛选抗原结合噬菌体。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。备选地，可以克隆天然组库(例如，来自人)以提供针对广泛的非自身抗原和自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫，如Griffiths，A.D.，等.，EMBO J.12(1993)725-734所述。最后，通过克隆来自干细胞的非重排V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区域并在体外完成重排，也可以合成地制备原始文库，如Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388所述。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括，例如：US 5,750,373和US 2005/0079574，US 2005/0119455，US 2005/0266000，US 2007/0117126，US 2007/0160598，US 2007/0237764，US 2007/0292936。和US 2009/0002360。
从人抗体文库分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
5.二价抗体变体
在某些实施方案中，预期本文提供的(二价)抗体的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善(二价)抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。(二价)抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码(二价)抗体的核苷酸序列中，或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如(二价)抗体氨基酸序列内残基的缺失，和/或插入和/或置换。可以进行缺失，插入和置换的任何组合达到最终构建体，条件是最终构建体具有期望的特征例如抗原结合。
a)置换，插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的(二价)抗体变体。用于置换诱变的目标位点包括HVR和FR。保守置换显示在下表中“优选置换”的标题下。在下表中在“示例置换”的标题下提供了更实质的变化，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述。可以将氨基酸置换引入目标(二价)抗体中，并针对期望活性(例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC)筛选产物。
表
氨基酸可根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性：Asp，Glu；
(4)碱性：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族：Trp，Tyr，Phe。
非保守置换将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。
一种类型的置换变体涉及置换亲本(二价)抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体(二价)抗体具有某些生物学特性的修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)和/或将基本上保留了亲本抗体的某些生物学特性。示例性的置换变体是亲和力成熟的(二价)抗体，其可以方便地产生，例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术，例如本文所述的那些。简而言之，突变一个或多个HVR残基并在噬菌体上展示变体(二价)抗体并针对特定生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，置换)，例如，以改善(二价)抗体亲和力。这种改变可以在HVR“热点”(即由在体细胞成熟过程中经历高频突变的密码子编码的残基)(参见，例如Chowdhury，P.S.，Methods Mol.Biol.207(2008)179-196)和/或接触抗原的残基中进行，测试所得变体VH或VL的结合亲和力。通过构建二级文库并从中重新选择的亲和力成熟已经描述在例如Hoogenboom，H.R.等.in Methods in Molecular Biology 178(2002)1-37中。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR，链改组(shuffling)或寡核苷酸定向诱变)将多样性引入选择用于成熟的可变基因中。然后创建二级文库。然后筛选文库以鉴定具有期望亲和力的任何(二价)抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR定向方法，其中若干个HVR残基(例如，每次4-6个残基)被随机化。参与抗原结合的HVR残基可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模特异性地被鉴定。通常特别靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，置换，插入或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要这种改变不会显著降低(二价)抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守置换)。例如，这种改变可以在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变，或含有不超过一个，两个或三个氨基酸置换。
用于鉴定可以靶向诱变的(二价)抗体的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science 244(1989)1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或靶残基组(例如带电残基，如arg，asp，his，lys和glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)代替以确定(二价)抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入另外的置换，证明对初始置换的功能敏感性。备选地或者另外地，可以使用抗原-(二价)抗体复合物的晶体结构用于鉴定(二价)抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除这些作为置换候选物的接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的性质。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的(二价)抗体。(二价)抗体分子的其他插入变体包括(二价)抗体的N末端或C末端与酶(例如对于ADEPT)或多肽的融合。
b)糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文提供的(二价)抗体以增加或降低(二价)抗体糖基化的程度。向(二价)抗体添加或缺失糖基化位点可以通过改变氨基酸序列以便产生或除去一个或多个糖基化位点而方便地完成。
在一些实施方案中，可以对本文报道的抗体中的寡糖进行修饰以产生具有某些改善的性质的抗体变体。
由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的二分支寡糖，其通常通过N-连接附接至Fc区的CH2结构域的Asn297。参见例如Wright，A.和Morrison，S.L.，TIBTECH 15(1997)26-32。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及附着于二分支寡糖结构的“茎”中的GlcNAc的岩藻糖。
抗体变体进一步具有二等分型寡糖，例如，其中附着于(二价)抗体的二分支寡糖被GlcNAc二等分。此类(二价)抗体变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。
抗体变体的实例描述于例如WO 2003/011878；US 6,602,684；US 2005/0123546。还提供了其中寡糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这种抗体变体可具有改善的CDC功能。这种抗体变体描述于例如WO 1997/30087；WO 1998/58964；WO 1999/22764。
c)多聚化结构域变体
在某些实施方案中，可以将一个或多个其他氨基酸修饰引入本文提供的(二价)抗体的多聚化结构域中，从而产生多聚化结构域变体。变体可包含至少人CH3结构域序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4CH3结构域)，其在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如置换/突变)。
在某些实施方案中，本发明考虑具有一些但不是所有效应子功能的(二价)抗体变体，这使其成为以下应用的期望候选者：其中(二价)抗体在体内的半衰期很重要，但某些效应子功能(如CDC和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/消耗。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII和FcγRIII。Ravetch，J.V.和Kinet，J.P.，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。用于评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于US 5,500,362(参见例如Hellstrom，I.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom，I.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann，M.等.，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)。备选地，可以使用非放射性测定方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，WI)。用于这种测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或者另外地，可以在体内(例如在Clynes，R.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公布的动物模型中)评估目标分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如，Gazzano-Santoro，H.等.，J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg，M.S.等.，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg，M.S.和M.J.Glennie，Blood 103(2004)2738-2743)。还可以使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见，例如，Petkova，S.B.等.，Int.Immunol.18(2006)1759-1769)。
具有降低的效应子功能的二价抗体包括具有残基238，265，269，270，297，327和329(如果存在，根据Kabat EU索引编号，参见US6,737,056)中的一个或多个的置换的那些。这种变体包括在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个或更多个(如果存在，根据Kabat EU索引编号)处具有置换的变体，包括所谓的“DANA”Fc区突变体，其残基265和297(如果存在)(根据Kabat EU索引编号；参见US 7,332,581)被置换为丙氨酸。
描述了具有与FcR的改善或减弱的结合的某些抗体变体(参见，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312，和Shields，R.L.等.，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，(二价)抗体变体包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换(例如Fc区的第298，333和/或334位(EU残基编号)的置换)的CH3结构域。
在一些实施方案中，例如，如US 6,194,551，WO 99/51642，和Idusogie，E.E.等.，J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述，进行改变，其导致改变的(即，改善或减少的)C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。
具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer，R.L.等.，J.Immunol.117(1976)587-593，和Kim，J.K.等.，J.Immunol.24(1994)2429-2434)的结合的抗体在US 2005/0014934中描述。那些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这种Fc区变体包括在Fc区残基中的以下一个或多个处具有置换的那些：238，256，265，272，286，303，305，307，311，312，317，340，356，360，362，376，378，380，382，413，424或434，例如，Fc区残基434的置换(US 7,371,826)。
涉及Fc区变体的其他实例另见Duncan，A.R.和Winter，G.，Nature 322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821；和WO 94/29351。
d)异二聚化
存在若干种用于CH3修饰以实施异二聚化的方法，其已被充分描述于例如，WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO 2009/089004，WO2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012058768，WO 2013157954，WO2013096291。通常在所有这些方法中，第一CH3结构域和第二CH3结构域都以互补的方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含其的重链)不能与其自身同源二聚化，而是被迫与互补的经工程化的其他CH3结构域异二聚化(使得第一和第二CH3结构域异二聚化并且在两个第一CH3结构域或两个第二CH3结构域之间不形成同源二聚体)。这些用于改善重链异二聚化的不同方法被认为是减少Bence-Jones型副产物的轻链错配的与根据本发明的(二价)抗体中的重-轻链修饰(在一个结合臂中的VH和VL交换/替换以及在CH1/CL界面中引入具有相反电荷的带电氨基酸的置换)相组合的不同替代方案。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的所述(二价)抗体的CH3结构域可以通过“突起-入-孔(knob-into-hole)”技术改变，所述技术在例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.，等.，Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等.，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO 98/050431中用若干个实例详细描述。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。两个CH3结构域(两个重链)中的任一个可以是“突起”，而另一个是“孔”。二硫键的引入进一步稳定了异二聚体(Merchant，A.M.，等.，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产率。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述(二价)抗体(在每个多肽中包含CH3结构域)的进一步特征在于：
(二价)抗体的第一多肽的第一CH3结构域和(二价)抗体的第二多肽的第二CH3结构域各自在界面处相遇，所述界面包含CH3结构域之间原始界面。
其中改变所述界面以促进(二价)抗体的形成，其中所述改变的特征在于：
i)改变一个多肽的CH3结构域，
以便在(二价)抗体内在一个多肽的CH3结构域与另一多肽的CH3结构域的原始界面相遇的原始界面内，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替代，从而在一个多肽的CH3结构域的界面内产生突起，其可位于另一多肽的CH3结构域的界面内的空腔中。
和
ii)改变另一多肽的CH3结构域，
以便在(二价)抗体内在第二CH3结构域与第一CH3结构域的原始界面相遇的原始界面内，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替代，从而在第二CH3结构域的界面内产生空腔，第一CH3结构域的界面内的突起定位在所述空腔中。
优选地，具有较大侧链体积的所述氨基酸残基选自精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
优选地，具有较小侧链体积的所述氨基酸残基选自丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
在本发明的一个方面，通过引入半胱氨酸(C)作为在每个CH3结构域的相应位置的氨基酸进一步改变本发明的两个CH3结构域，从而可以形成两个CH3结构域之间的二硫键。
在一个优选的实施方案中，所述(二价)抗体在“突起链”的第一CH3结构域中包含氨基酸T366W突变并且在“孔链”的第二CH3结构域中包含氨基酸T366S，L368A，Y407V突变。例如通过将氨基酸Y349C突变引入“孔链”的CH3结构域并且将氨基酸E356C突变或氨基酸S354C突变引入“突起链”的CH3结构域，还可以使用CH3结构域之间的另外的链间二硫桥(Merchant，A.M.，等.，Nature Biotech.16(1998)677-681)。
在一个实施方案中，所述(二价)抗体(其在每个重链中包含CH3结构域)在两个CH3结构域之一中包含氨基酸S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域的另一个中包含氨基酸Y349C，T366S，L368A，Y407V突变(一个CH3结构域中的另外氨基酸S354C突变和另一个CH3结构域中的另外的氨基酸Y349C突变形成链间二硫桥)(根据Kabat编号)。
用于实施异二聚化的CH3修饰的其他技术被认为是本发明的备选方案，并且描述于例如WO 96/27011，WO 98/050431，EP 1870459，WO 2007/110205，WO 2007/147901，WO2009/089004，WO 2010/129304，WO 2011/90754，WO 2011/143545，WO 2012/058768，WO2013/157954，WO 2013/096291。
在一个实施方案中，备选地使用EP 1870459A1中描述的异二聚化方法。该方法基于通过在两个多肽之间的CH3/CH3结构域界面中的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷氨基酸的置换/突变。所述(二价)抗体的一个优选实施方案是(二价)抗体的第一CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和(二价)抗体的第二CH3结构域中的氨基酸D399K；E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在另一个实施方案中，所述(二价)抗体包含在“突起链”的CH3结构域中的氨基酸T366W突变和在“孔链”的CH3结构域中的氨基酸T366S，L368A，Y407V突变以及另外地在“突起链”的CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和在“孔链”的CH3结构域中的氨基酸D399K；E357K突变。
在另一个实施方案中，所述(二价)抗体在两个CH3结构域之一中包含氨基酸S354C，T366W突变并且在两个CH3结构域中另一个中包含氨基酸Y349C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述(二价)抗体在两个CH3结构域之一中包含氨基酸Y349C，T366W突变并且在两个CH3结构域中另一个中包含氨基酸S354C，T366S，L368A，Y407V突变，以及另外地在“突起链”的CH3结构域中的氨基酸R409D；K370E突变和在“孔链”的CH3结构域中的氨基酸D399K；E357K突变。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2013/157953中描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变，第二CH3结构域多肽包含氨基酸L351D突变。在进一步的实施方案中，第一CH3结构域包含另外的氨基酸L351K突变。在进一步的实施方案中，第二CH3结构域包含选自Y349E，Y349D和L368E(优选L368E)的另外的氨基酸突变。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2012/058768中描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y，Y407A突变，第二CH3结构域包含氨基酸T366A，K409F突变。在进一步的实施方案中，第二CH3结构域在位置T411，D399，S400，F405，N390或K392处包含选自以下的另一个氨基酸突变：a)T411 N，T411 R，T411Q，T411 K，T411D，T411E或T411W，b)D399R，D399W，D399Y或D399K，c S400E，S400D，S400R，或S400KF405I，F405M，F405T，F405S，F405V或F405W N390R，N390K或N390D K392V，K392M，K392R，K392L，K392F或K392E。在进一步的实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y，Y407A突变，第二CH3结构域包含氨基酸T366V，K409F突变。在进一步的实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸Y407A突变，第二CH3结构域包含氨基酸T366A，K409F突变。在进一步的实施方案中，第二CH3结构域包含另一氨基酸K392E，T411E，D399R和S400R突变。
在一个实施方案中，WO 2011/143545中描述的异二聚化方法可以备选地例如在选自由368和409组成的组的位置处的氨基酸修饰情况下使用。
在一个实施方案中，可以备选地使用WO 201I/090762中描述的异二聚化方法，其也使用上述的突起-入-孔技术。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366W突变，第二CH3结构域包含氨基酸Y407A突变。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突变，第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
在一个实施方案中，多聚化结构域属于IgG2同种型，并且备选地可使用WO 2010/129304中描述的异二聚化方法。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2009/089004中描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)对K392或N392进行的氨基酸置换，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K，E356K，D356K或E357K，更优选D399K和E356K)对D399，E356，D356或E357进行的氨基酸置换。在另一个实施方案中，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)对K409或R409进行的氨基酸置换。在另一个实施方案中，第一CH3结构域进一步或备选地包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370进行的氨基酸置换。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2007/147901中描述的异二聚化方法。在一个实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E，D282K和K322D突变，第二CH3结构域包含氨基酸D239K，E240K和K292D突变。
在一个实施方案中，备选地使用WO 2007/110205中描述的异二聚化方法。
提供以下实施例，序列和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在所附权利要求中阐述。应理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可以在程序中进行修改。
附图说明
图1使用BIAcore经275秒的时间测定各Ophthabody变体与抗原2(VEGF)的结合。亲和力由“缔合速率”和“解离速率”组成。对于“缔合速率”，确定抗体结合抗原的时间。“解离速率”表示抗体保持结合直到它与抗原解离的时间长短。此外，还测量了阴性对照(基线)。
图2使用BIAcore经350秒的时间测定蛋白质1与抗原1和抗原2的结合亲和力。将抗原1固定在芯片上，连续注射蛋白质1和抗原2。蛋白质1对抗原的亲和力由“缔合速率”和“解离速率”组成。对于“缔合速率”，确定抗体结合抗原的时间。“解离速率”表示抗体保持结合直到它与抗原解离的时间长短。测量阴性对照(基线)作为参考。
实施例
材料和方法
制备性限制酶切消化
最初，用20U限制酶HindIII-HF和NheI-HF切割3μg克隆载体。同样地，用20U限制酶HindIII-HF和NheI-HF切割待插入的2μg合成基因片段(Geneart，Regensburg，Germany)。随后将各批次在37℃孵育60分钟。然后通过凝胶电泳分析各批次。
分析性限制酶切消化
将5U限制酶和构建体的等分试样(约500ng)用于分析性限制酶切消化的各批次。随后将各批次在37℃孵育60分钟。然后通过凝胶电泳分析各批次。
凝胶电泳
在每种情况下，使用1％琼脂糖凝胶和0.5μg大小标准品来分析制备性消化和分析性限制酶切消化。将预先与10x上样缓冲液混合的整个消化批次在制备性消化的范围内应用。将1x TBE缓冲液与溴化乙锭组合用作运行缓冲液。凝胶电泳在100V的电压下进行约45分钟。随后使用UV系统分析凝胶并记录。
施加100ng消化物用于分析性限制酶切消化的分析。另外，遵循已经针对制备性消化描述的相同程序。
凝胶提取
使用X-TRACTA第II代切割器(其去除约120mg凝胶)用于切除。根据制造商的说明书使用来自Roche的高纯度PCR产物纯化试剂盒(High Pure PCR Product PurificationKit)，以从琼脂糖凝胶切片获得目标片段的DNA。使用类似的方法获得切割克隆载体。
连接
根据制造商的克隆载体和插入物的连接规范使用快速DNA连接试剂盒(Rapid DNALigation Kit)。使用rAPid碱性磷酸酶试剂盒(rAPid Alkaline Phosphatase Kit)预先将克隆载体去磷酸化，以防止自身连接。该试剂盒同样根据制造商的说明书使用。对于重新连接对照，向连接批次中仅添加克隆载体。
转化
根据制造商的说明书尽最大程度地进行转化。然而，由细胞和连接批次组成的批次在冰上仅孵育15分钟。在热休克和在冰上孵育后，根据转化批次的大小添加300μL-600μLS.O.C培养基。随后将各批次在37℃和300rpm在Thermomixer中孵育1小时。然后将批次的30μL-50μL接种在营养琼脂平板(含有100μg/mL氨苄青霉素)上，将其在37℃孵育过夜。
质粒分离
根据制造商的说明书使用Roche的高纯度质粒分离试剂盒(High Pure PlasmidIsolation Kit)。通过从构建体的营养琼脂平板中挑选菌落形成单位(CFU)预先接种微型培养物(miniculture)，并因此接种4mL与氨苄青霉素组合的LB培养基。将该批次在37℃和200rpm孵育过夜。为了产生大型培养物，使用200μL的微型培养物接种350mL与氨苄青霉素组合的LB培养基。将该批次同样在37℃和200rpm孵育过夜。
根据制造商的说明书将来自Qiagen的HiSpeed Plasmid Maxi Kit用于150mL过夜培养物。然而，对于洗脱，将添加的TE缓冲液以1∶4稀释，使得EDTA以低浓度用于随后的实验。在方案的最后一步之后，将洗脱液用5mL注射器第三次吸收，并通过过滤器洗脱到Eppendorf管中。将管在台式离心机中以13,000rpm离心2分钟。将上清液转移到新的Eppendorf管中。随后使用Nanodrop装置测定质粒DNA浓度。
DNA沉淀
将使用来自Qiagen的HiSpeed Plasmid Maxi Kit分离的特定体积的重组DNA沉淀。为此，将1/10体积的pH 5.2的3M乙酸钠溶液加入到分离的DNA中并涡旋。随后加入2 1/2体积的100％乙醇并混合。将该批次在室温孵育5分钟。随后将该批次在台式离心机中以13,000rpm离心5分钟。弃去上清液。将DNA沉淀与1mL 70％乙醇合并，来回摇动该批次，然后在室温孵育5分钟。将该批次在台式离心机中再次以13,000rpm离心5分钟。为了获得用于转染的无菌DNA，将管转移到洁净工作台下，小心地除去上清液。将沉淀物(pellet)在敞开的Eppendorf管中干燥。最后，在4℃将干燥的沉淀物溶解在双蒸水中过夜。为了测定DNA浓度，将溶解在双蒸水中的DNA在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中1∶10稀释，并使用Nanodrop装置测量稀释液。
细胞培养
用保持在来自Gibco的F17培养基(该培养基预先已经与6mL/L PenStrep合并)中的HEK293F悬浮培养物进行该程序。每隔三至四天将细胞分开。将细胞在培养箱中以135rpm在37℃的温度，7％的CO2饱和度，和80％的相对室内湿度的条件下摇动。
活力和细胞计数确定
使用CASY Model TT细胞计数器和分析仪测定HEK293F悬浮培养物的活力和细胞计数。在电解质溶液(ton)中测量细胞。[32]
哺乳动物细胞中的瞬时转染
使用来自Novagen的无293的转染试剂(293-Free Transfection Reagent)根据制造商的说明书进行转染。仅插入一个转染后步骤。转染后第1天向细胞中加入20mL/L 45％葡萄糖和20mL/L L-谷氨酰胺。在第6天或第7天收获表达的分泌蛋白质。对此，将整个转染批次在4℃和500xg离心20分钟。随后将上清液转移到新容器中并在4℃和3452xg再离心20分钟。最后，将上清液与表达的分泌蛋白一起进行无菌过滤。
CaptureSelect C标签亲和色谱
在CaptureSelect C标签亲和色谱中，固定在柱基质上的骆驼抗体片段识别C-cap肽EPEA。因此，从上清液中结合并纯化所期望的蛋白质。
表面共振测量
表面共振测量涉及非细胞相互作用测定。表面共振测量允许确定抗体结合抗原的亲和力。亲和力由“缔合速率”和“解离速率”组成。对于“缔合速率”，确定抗体结合抗原的时间。“解离速率”表示抗体保持结合直到它与抗原解离的时间长短。为了测量两个抗原的同时结合，将一种抗原固定在芯片上，并相继注射抗体和第二抗原。
细胞测定
在细胞测定中，进行测试以确定待分析的分子阻止涉及待结合分子的特定信号级联的程度如何。在细胞测定的范围内，使用HEK细胞，其表达特异性受体作为稳定转染的结果。该受体结合抗原，该抗原被待检测的抗体识别和结合。
荧光素酶测定(报告基因测定)
在该测定中，待结合的抗原1在其与匹配受体结合时触发信号级联。该信号级联导致荧光素酶的表达。荧光素酶催化5′-氟荧光素反应为氧氟荧光素，产生发光。相对发光单位(RLU)与荧光素酶信号相关。当抗体结合抗原1，使抗原1不再与受体结合时，不触发信号级联，并且不存在发光信号。
激酶受体激活测定
该测定基于抗原2结合期间抗原受体的自磷酸化。通过ELISA测定磷酸化程度。多滴度平板覆盖有针对抗原受体的“捕获抗体”。将细胞与抗原2和抗体一起孵育，裂解，并置于平板上。来自裂解物的抗原受体与平板上的捕获抗体结合。通过与生物素偶联的抗磷酸酪氨酸抗体检测受体的磷酸化的酪氨酸。生物素基团又与链霉抗生物素蛋白结合，链霉抗生物素蛋白与辣根过氧化物酶偶联。最后，加入辣根过氧化物酶底物TMB并通过过氧化物酶转化，产生吸光物质。终止反应，测量光密度。
重组DNA技术
如Sambrook，J.等.，Molecular Cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中所述，使用标准方法操作DNA。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
基因合成
在Geneart(Regensburg，Germany)根据给定说明对所需基因区段进行订购。
DNA序列测定
通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，Germany)或SequiServe GmbH(Vaterstetten，Germany)进行的双链测序测定DNA序列。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包10.2版和Infomax′sVector NT1 Advance套件8.0版用于序列创建，定位，分析，注释和说明。
表达载体
为了表达所述抗体，使用基于具有或不具有CMV-内含子A启动子的cDNA组织或具有CMV启动子的基因组组织的用于瞬时表达(例如在HEK293-F细胞中)的表达质粒。
抗体基因的转录单位由以下要素构成：
-5′末端的独特限制性位点，
-来自人巨细胞病毒的即刻早期增强子和启动子，
-在cDNA组织的情况下，内含子A序列，
-人免疫球蛋白基因的5′非翻译区，
-编码免疫球蛋白重链信号序列的核酸，
-编码人抗体链(野生型或具有结构域交换)的核酸，作为cDNA或在具有免疫球蛋白外显子-内含子组织的基因组组织中，
-具有多腺苷酸化信号序列的3′非翻译区，和
-3′末端的独特限制性位点。
除抗体表达盒外，质粒还包含：
-复制起点，其允许质粒在大肠杆菌中复制，
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因，和
-来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因作为真核细胞中的选择标记。
编码抗体链的核酸通过PCR和/或基因合成产生，并通过已知的重组方法和技术通过例如在相应的载体中使用独特的限制性位点连接相应的核酸区段组装。通过DNA测序验证亚克隆的核酸序列。对于瞬时转染，通过质粒制备从转化的大肠杆菌培养物(NucleobondAX，Macherey-Nagel)制备更大量的质粒。
细胞培养技术
如Current Protocols in Cell Biology(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(eds.)，John Wiley&Sons，Inc.所述使用标准细胞培养技术。
如下所述，通过在悬浮培养的HEK293-F细胞中瞬时共转染各表达质粒来表达双特异性抗体。
实施例1
转染和蛋白质纯化
在每种情况下使用纯化的无菌重组DNA进行HEK293-F细胞中两种DNA构建体的共转染。随后通过亲和色谱和SEC从上清液中纯化蛋白质。
在每种情况下纯化特定共转染的400mL上清液。首先，通过CaptureSelect C标签亲和色谱纯化蛋白质(参见下表)。随后根据大小通过SEC分离或纯化洗脱液的蛋白质，并分离所期望的分子形式。
表：通过CaptureSelect C标签亲和色谱和制备型与分析型SEC在蛋白质纯化后HEK293F细胞中表达的蛋白质的蛋白质产量
实施例2
质谱分析
使用电喷雾电离(ESI)质谱仪分析蛋白质的分子量，并与基于氨基酸序列确定的理论分子量进行比较。确认所有表达的蛋白质变体的质量和特性。
实施例3
热稳定性测定
使用Avacta Optim装置检查蛋白质的热稳定性，并测定解链温度和聚集温度。
表：测定纯化的蛋白质的解链温度和聚集温度
蛋白质 Tm[℃] Tagg[℃]
I 46 42
II 46 42
III 46 41
IV 46 41
V 46 39
VI 46 42
VII 59 50
实施例4
结合测定
使用表面共振方法在BIAcore装置上进行结合测定。BIAcore测定用于确定Ophthabody变体与抗原1和2结合的亲和力。亲和力由“缔合速率”和“解离速率”组成。双特异性IgG再次用作参考标准。
经425秒的时间测定各种Ophthabody变体与抗原1的结合亲和力。使用BIAcore装置经275秒的时间测定各种Ophthabody变体与抗原2的结合。
实施例5
荧光素酶测定(报告基因测定)
表：在荧光素酶测定中与双特异性参比IgG相比蛋白质变体的测定的相对活性
变体 EC50Ophthabody[nM] EC50参比[nM]
I 1.8 2.0
II 1.8 2.0
III 2.7 2.6
IV 3.0 2.6
V 2.4 2.6
VI 2.2 2.6
VII 2.1 2.6
实施例6
抑制huANG-2与Tie-2的结合(ELISA)
在室温下在384孔微量滴定板(MicroCoat，DE，Cat.No.464718)进行相互作用ELISA。每次孵育步骤后，用PBST洗涤板3次。用5μg/mlTie-2蛋白包被ELISA板1小时(h)。然后用补充有0.2％Tween-20和2％BSA(Roche Diagnostics GmbH，DE)的PBS封闭孔1小时。将在PBS中的纯化的抗体的稀释液与0.2μg/ml人抗血管生成素-2(R&D Systems，UK，Cat.No.623-AN)在室温下孵育1小时。洗涤后，加入0.5μg/ml生物素化的抗血管生成素-2克隆BAM0981(R&D Systems，UK)和1∶3000稀释的链霉抗生物素蛋白HR(Roche DiagnosticsGmbH，DE，Cat.No.11089153001)的混合物1小时。然后将板用PBST洗涤3次。用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH，DE，缓冲液#204 530 001，片剂#11 112 422 001)在室温下将板显色30分钟。在405nm处测量吸光度并测定IC 50。
表：在激酶受体活化测定中与双特异性参比IgG相比蛋白质变体的测定的相对活性
变体 EC50 Ophthabody[nM] EC50参比[nM]
I 21 63
II 18 63
III 19 47
IV 13 47
V 14 47
VI 18 47
VII 23 47
实施例7
动力学表征
ANG2：
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振研究双特异性抗体与人ANG2-RBD-小鼠Fc区融合物的结合。通过使用由GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，在pH 5.0在Series S CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上偶联约4000RU的抗小鼠Fc区抗体(10μg/ml抗小鼠(Fc)抗体)。在固定过程中使用HBS-N(10mM HEPES，150mM NaClpH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GE Healthcare)。将流动池设定为25℃-并将样品块设定为12℃-并且在动力学表征之前用运行缓冲液引发两次。
通过以流速5μl/min注射1μg/ml溶液30秒捕获人ANG2-RBD-鼠Fc区融合物。通过以90μl/min的流速注射在溶液中各种浓度(以300nM开始连续1∶3稀释)的双特异性抗体90秒来测量缔合。解离期被监测最多600秒并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。所有表面再生60秒，用3M MgCl2溶液以5μl/min的流速洗涤。通过减去从抗小鼠IgG抗体(Fc)表面获得的应答来校正体积折射率差异。还减去空白注射(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，Langmuir 1∶1模型是
VEGF：
使用BIACORE T200仪器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振研究双特异性抗体与人VEGF同种型121的结合。根据制造商的说明，通过使用GE Healthcare提供的胺偶联试剂盒，将抗六组氨酸抗体偶联在CM5芯片(GE Healthcare BR-1005-30)上。在固定过程中使用HBS-N(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，GE Healthcare)作为运行缓冲液。对于以下动力学表征，样品和运行缓冲液是HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl pH 7.4，0.05％表面活性剂P20；GE Healthcare)。将流动池设定为25℃-并将样品块设定为12℃-并且在动力学表征之前用运行缓冲液引发两次。
通过以流速5μl/min注射溶液30秒捕获包含组氨酸标签的人VEGF同种型121。通过以90μl/min的流速注射在溶液中的各种浓度(以300nM开始连续1∶3稀释)的双特异性抗体90秒来测量缔合。解离期被监测最多600秒并通过从样品溶液切换到运行缓冲液来触发。所有表面再生60秒，用3M MgCl2溶液以5μl/min的流速洗涤。通过减去从抗六组氨酸抗体表面获得的应答来校正体积折射率差异。还减去空白注射(＝双重参比)。为了计算KD和其他动力学参数，使用Langmuir 1∶1模型。
实施例8
通过动态光散射(DLS)的聚集温度
通过动态光散射(DLS)测定发生热诱导的蛋白质聚集的温度。DLS产生关于溶液中大分子的尺寸分布的信息，其源自微秒级的散射光强度的波动。当样品逐渐加热时，聚集在一定温度开始，从而导致粒径增大。粒径开始增加的温度定义为聚集温度。聚集和变性温度不一定必须相同，因为变性可能不一定是聚集的先决条件。
对于聚集温度测量，使用DynaPro DLS读板器(Wyatt技术)。在测量之前，将样品通过384孔过滤板(Millipore MultiScreen 384-孔过滤系统，0.45μm)过滤到光学384孔板(Corning#3540)中。使用35μL的样品体积，在配制缓冲液(20mM柠檬酸盐，180mM蔗糖，20mM精氨酸，0.02％聚山梨醇酯20)中的蛋白质浓度约为1mg/mL。每个孔用20μL石蜡油(Sigma)覆盖以避免蒸发。将样品以0.05℃/min的速率从25℃加热至80℃，并连续获得DLS数据，每次运行最多15个样品。

Claims (21)

1.融合多肽，其包含抗体重链可变结构域，作为多聚化结构域的抗体CH3结构域和抗体轻链可变结构域，
其中，
-所述抗体重链可变结构域通过第一肽接头融合到所述抗体CH3多聚化结构域的一个末端，
-所述抗体轻链可变结构域通过第二肽接头融合到所述抗体CH3多聚化结构域的相应另一个末端，并且
-所述抗体重链可变结构域具有与所述抗体CH3多聚化结构域结合的肽内二硫键，
其中根据Kabat，在位置82b处，所述重链可变结构域包含半胱氨酸氨基酸残基，
其中根据Kabat EU索引编号，在位置433处，所述抗体CH3结构域具有半胱氨酸氨基酸残基，
其中所述二硫键在所述重链可变结构域的位置82b处的半胱氨酸残基和所述CH3结构域的位置433处的半胱氨酸残基之间，和
其中所述融合多肽的N末端和C末端结构域形成结合位点。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽从N-端至C-端方向包含抗体重链可变区结构域，抗体CH3多聚化结构域和抗体轻链可变结构域。
3.根据权利要求1所述的融合多肽，其中所述融合多肽从N-端至C-端方向包含抗体轻链可变区结构域，抗体CH3多聚化结构域和抗体重链可变区结构域。
4.根据权利要求1-3任一项所述的融合多肽，其中所述第一和第二肽接头具有SEQ IDNO:01和SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-3任一项所述的融合多肽，其中所述第一和第二肽接头具有SEQ IDNO:03和SEQ ID NO:04的氨基酸序列。
6.根据权利要求1-3任一项所述的融合多肽，其中所述第一和第二肽接头具有SEQ IDNO:05和SEQ ID NO:06的氨基酸序列。
7.根据权利要求1-3任一项所述的融合多肽，其中所述第一和第二肽接头具有SEQ IDNO:07和SEQ ID NO:08的氨基酸序列。
8.抗体，其由两个根据权利要求1至7中任一项的融合多肽组成。
9.根据权利要求8的抗体，其中
-所述CH3结构域之一含有突变T366W，并且另一个CH3结构域含有突变T366S，L368A和Y407V，根据Kabat EU索引编号，
并且
-其中所述CH3结构域之一还含有突变Y349C，并且另一个CH3结构域还含有突变E356C或S354C，根据Kabat EU索引编号。
10.权利要求8至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的融合多肽或根据权利要求8至9中任一项的抗体，其中所述融合多肽或所述抗体特异性结合选自由以下组成的组的一种抗原：VEGF，ANG2，PDGF和IL-1β。
12.根据权利要求8至9中任一项所述的抗体，其中所述抗体特异性结合彼此独立地选自由以下组成的组的两种抗原：VEGF，ANG2，PDGF和IL-1β。
13.根据权利要求8至9中任一项所述的抗体，其用作药物。
14.根据权利要求8至9中任一项所述的抗体，其用于治疗眼血管疾病。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中所述眼血管疾病是年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
16.药物制剂，其含有根据权利要求1至7中任一项所述的融合多肽或根据权利要求8至12中任一项的抗体。
17.根据权利要求8至12中任一项所述的抗体在制备用于治疗眼血管疾病的药物中的应用。
18.根据权利要求1至7中任一项所述的融合多肽或根据权利要求8至12中任一项的抗体在制备药物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述药物用于治疗年龄相关性黄斑变性或糖尿病视网膜病。
20.有效量的根据权利要求8至12中任一项所述的抗体在制备用于治疗患有眼血管疾病的个体的药物中的应用。
21.有效量的根据权利要求8-12中任一项所述的抗体在制备用于抑制个体眼内新生血管形成的药物中的应用。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ571300A (en) 2006-04-07 2011-12-22 Warner Chilcott Co Llc Antibodies that bind human protein tyrosine phosphatase beta (HPTPBeta) and uses thereof
CN104039351A (zh) 2011-10-13 2014-09-10 阿尔皮奥治疗学股份有限公司 用于治疗血管渗漏综合征和癌症的方法
EP3464345A1 (en) * 2016-06-06 2019-04-10 F. Hoffmann-La Roche AG Fusion proteins for ophthalmology with increased eye retention
CN110267977A (zh) 2016-08-10 2019-09-20 亚洲大学校产学协力团 细胞因子免疫球蛋白Fc融合异二聚体和包含其的药物组合物
EP3704150A1 (en) 2017-11-01 2020-09-09 F. Hoffmann-La Roche AG The compbody - a multivalent target binder
US10894824B2 (en) 2018-09-24 2021-01-19 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antibodies that target HPTP-β (VE-PTP) and VEGF
JP2022505871A (ja) 2018-10-23 2022-01-14 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヘテロ二量体ｆｃ融合タンパク質
CN115772544B (zh) * 2021-09-06 2024-04-26 合肥星眸生物科技有限公司 抗vegf-a和ang-2的aav载体
CN116925234B (zh) * 2022-04-02 2024-05-31 合肥星眸生物科技有限公司 一种编码抗vegf-a和ang-2双特异性抗体的aav载体

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009018386A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
WO2010040508A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
WO2012069466A1 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 Novartis Ag Multispecific molecules
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2016087416A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies

Family Cites Families (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992009690A2 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
EP0714409A1 (en) 1993-06-16 1996-06-05 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ATE296315T1 (de) 1997-06-24 2005-06-15 Genentech Inc Galactosylierte glykoproteine enthaltende zusammensetzungen und verfahren zur deren herstellung
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DK1068241T3 (da) 1998-04-02 2008-02-04 Genentech Inc Antistofvarianter og fragmenter deraf
AU3657899A (en) 1998-04-20 1999-11-08 James E. Bailey Glycosylation engineering of antibodies for improving antibody-dependent cellular cytotoxicity
US20030175884A1 (en) 2001-08-03 2003-09-18 Pablo Umana Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR101155191B1 (ko) 1999-01-15 2012-06-13 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
IL149809A0 (en) 1999-12-15 2002-11-10 Genentech Inc Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
EP1513879B1 (en) 2002-06-03 2018-08-22 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
EP2301966A1 (en) 2002-12-16 2011-03-30 Genentech, Inc. Immunoglobulin variants and uses thereof
CA2510003A1 (en) 2003-01-16 2004-08-05 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
LT2348051T (lt) 2003-11-05 2019-02-25 Roche Glycart Ag Cd20 antikūnai su padidintu fc receptoriaus prisijungimo giminingumu ir efektorine funkcija
WO2005097832A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Genentech, Inc. Humanized anti-tgf-beta antibodies
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
EP2357201B1 (en) 2004-04-13 2017-08-30 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-P-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
EP1870459B1 (en) 2005-03-31 2016-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
EP2465870A1 (en) 2005-11-07 2012-06-20 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences
US20070237764A1 (en) 2005-12-02 2007-10-11 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
JP5474531B2 (ja) 2006-03-24 2014-04-16 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 操作されたヘテロ二量体タンパク質ドメイン
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
KR101571027B1 (ko) 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
US20090182127A1 (en) 2006-06-22 2009-07-16 Novo Nordisk A/S Production of Bispecific Antibodies
CN100592373C (zh) 2007-05-25 2010-02-24 群康科技(深圳)有限公司 液晶显示面板驱动装置及其驱动方法
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
US9067986B2 (en) 2009-04-27 2015-06-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
PL2519543T3 (pl) 2009-12-29 2016-12-30 Białka wiążące heterodimery i ich zastosowania
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
EP2794905B1 (en) 2011-12-20 2020-04-01 MedImmune, LLC Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
EA035344B1 (ru) 2012-04-20 2020-05-29 Мерюс Н.В. Способ получения двух антител из одной клетки-хозяина
MX2015010843A (es) 2013-02-26 2016-04-04 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union al antigeno que activan celulas t.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009018386A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
WO2010040508A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies
WO2012069466A1 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 Novartis Ag Multispecific molecules
WO2014009465A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
WO2016087416A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies

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