CN110267977A - 细胞因子免疫球蛋白Fc融合异二聚体和包含其的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Fc异二聚体融合蛋白，包含免疫球蛋白Fc对的第一Fc区和第二Fc区以及包含两个以上不同亚基的生理活性蛋白，其中生理活性蛋白的一个以上亚基分别与第一Fc区和/或第二Fc区的一个以上N端或C端连接，并且突变第一Fc区和第二Fc区的CH3结构域以促进Fc异二聚体形成。此外，本发明涉及一种包含Fc异二聚体融合蛋白的药物组合物。根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白的优点在于，它可以保留自然生成的生理活性蛋白的活性，其两个以上不同亚基通过形成蛋白复合物来展现生理活性，因为生理活性蛋白可与免疫球蛋白Fc异二聚体连接，从而维持其融合蛋白的自然生成的形式和结构。当使用根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白时，其优点在于，异二聚体融合蛋白中所含生理活性蛋白的体内半衰期可因FC介导的长半衰期而显著延长，从而使其在体内的多种生理活性能够持久。
Description
技术领域
本发明涉及Fc异二聚体融合蛋白，包含免疫球蛋白Fc对的第一Fc区和第二Fc区，以及生理活性蛋白，其中生理活性蛋白的一个以上亚基连接至第一Fc区和/或第二Fc区的一个以上N端或C端，并且突变第一Fc区和第二Fc区的CH3结构域以促进Fc异二聚体形成，以及包含所述Fc异二聚体融合蛋白的药物组合物。
根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白的优点在于，它可以保留由两个以上不同亚基蛋白组成的自然生成的生理活性蛋白的活性，从而通过形成组装蛋白来展现完整的生物活性，因为蛋白质的每个亚基可以单独融合到免疫球蛋白的Fc异二聚体的每一个链上，这样融合的蛋白质就可以最大程度地维持自然生成的形式和结构。
当使用根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白时，其优点在于，异二聚体融合蛋白中所含生理活性蛋白的体内半衰期可因FC介导的长半衰期而显著延长，从而使其在体内的生理活性能够持久。
此外，根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白具有一种结构，其中生理活性蛋白的一个以上亚基与免疫球蛋白Fc异二聚体的N端或C端融合，并且Fc异二聚体融合蛋白在表达后较野生型Fc融合蛋白容易纯化。
背景技术
自然产生的人抗体(免疫球蛋白G(IgG)、IgM、IgD、IgE和IgA)均以具有相同氨基酸序列的两条重链和具有相同序列的两条轻链的组合存在。在这方面，两个相同重链之间的同二聚化是由恒定区终端域(IgG，IgD和IgA中的CH3结构域、IgM中的CH4结构域和IgE中的CH2和CH4结构域)之间的非共价相互作用和铰链域之间的二硫键引起的。
抗体Fc异二聚体技术是通过改变CH3结构域界面，使免疫球蛋白重链恒定区的异二聚体片段可结晶(Fc)，每个结构域的不同突变使得携带CH3变异对的工程Fc片段在自然生成的抗体IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)中优先形成Fc异二聚体，而不是Fc同二聚体。更具体地说，这是一种通过基因工程诱导Fc的两个不同CH3域突变的技术，使得这两个Fc片段形成具有最小序列变异的异二聚体，而它们具有与自然产生的抗体非常相似的三级结构(美国专利号7,695,936；韩国专利号1,522,954)。Fc异二聚体技术是制备双特异性抗体的平台技术，目前已知的诱导Fc异二聚体形成的CH3域突变体主要是通过基于结构的抗体合理设计将不对称突变对引入CH3域界面而产生的(Spreter Von Kreudenstein et al.,2014)。开创性的研究包括Genentech的杵臼结构技术(Ridgway et al.,1996)，许多跨国制药公司包括Zymeworks(ZW1；Von Kreudenstein et al.,2013)、Xencor(HA-TF；Moore GL et al.,2011)和EMD Serono(SEEDbody；Davis JH et al.,2010)已经开发并报导了平台技术。
综上所述，本发明中使用的A107变体是从使用酵母细胞表面展示系统构建的人抗体Fc异二聚体库中筛选出的高产Fc异二聚体，是一种Fc异二聚体变体，可通过诱导带电氨基酸的突变形成形成空间互补疏水相互作用(K409WCH3A-D399V/F405TCH3B)，以及形成氢键(K370ECH3A-E357NCH3B)，同时在CH3结构域界面保留疏水芯完整性来促进异二聚体形成(Choiet al.2016；韩国专利申请号2015-0142181)。
迄今为止报道的Fc异二聚体变异体，包括A107变异体，均基于占人抗体亚型比例最大的IgG1，除IgG1外，还没有报道其他同种亚型(IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM和IgE)。
这是因为在美国食品药品监督管理局(FDA)批准下销售的治疗性抗体大多采用IgG1亚型(Irani et al.2015)。近年来，对于免疫调节抗体或受体激动剂融合蛋白，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)等不需要具有很好的抗体效应功能的，已开发出基于IgG2或IgG4这些效应功能显著低于IgG1效应功能的治疗性抗体。
同时，生理活性蛋白大多体积小，因而具有体内半衰期短的缺点。为了解决这个缺点，有人尝试将PEG(聚乙二醇)或类似物结合，或融合到抗体Fc(可结晶片段)区域。然而，还没有可能开发出能足够有效地维持很长一段时间活性的生理活性蛋白。
具体地说，对于由两个以上不同亚基组成的蛋白质，其中两个以上不同亚基形成一个蛋白质复合物以展现出生理活性，由于野生型Fc因Fc的同二聚体性质而形成同二聚体，还没有可能开发出Fc融合的蛋白质，这些蛋白质与野生型Fc形成自然的蛋白质复合物结构。因此，野生型Fc不适合异源二聚体或异源寡聚体蛋白的Fc融合，不能适当地表现出原蛋白质的活性并长期保持其活性。
在此技术背景下，本发明者已构建异二聚体变体，其包含不仅来源于IgG1，而且来源于其他亚型(如IgG2、IgG3和IgG4)的Fc区域，这些同型抗体以前未被报道，并且已使用这些异二聚体变体以Fc异二聚体融合蛋白的形式开发出一种新的治疗融合蛋白,其中，蛋白质的一个以上亚基基因融合到Fc区末端，该蛋白质由两个以上不同的亚基组成，其中两个以上亚基通过形成蛋白质复合物表现出生理活性，从而完成本发明。
具体地说，在本发明中，优选地，白细胞介素-12(IL-12)可作为由两个不同亚基p35和p40组成的蛋白质，其中两个亚基通过形成IL-12蛋白而表现出生理活性。
IL-12可通过增加免疫细胞(诸如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或免疫细胞间的自然杀伤细胞(NKS)的活性直接杀死肿瘤，或通过在免疫响应被抑制的肿瘤微环境中分泌促炎性细胞因子(如干扰素γ(IFN-γ))通过激活免疫反应来抑制肿瘤的发生。因此，IL-12作为一种抗癌细胞因子被大量研究(Lasek et al.,2014)。然而，在使用IL-12的治疗方法的发展中，细胞因子本身的短半衰期要求频繁的给药，可能引起毒性。为此，已经开展了将IL-12与抗体或Fc融合的研究，以将其用作长效IL-12(Tugues et al.,2015)。然而，在这些研究中，出现了一个问题，由于野生型基于的Fc抗体通过CH3域之间的相互作用形成同二聚体，融合的IL12蛋白是二价的，不像内源性的IL-12单价形式，因此，野生型Fc抗体融合的IL-12展现出较差的生理活性,或由于亲和力驱动的IL-12与免疫细胞的结合增加，野生型Fc抗体融合的IL-12出现了非所需定位(Tzeng et al.,2015；Dumont et al.,2006)。
因此，为了使用野生型抗体或Fc区制备单价融合蛋白，如图1(A)到1(C)所示,可使用一种通过如经在单个Fc区的C端融合选择性标签进行额外纯化或分别提纯Fc区和蛋白质后将其融合的策略来构建融合蛋白的方法。然而，这种方法不仅生产大量蛋白质的成本很高，而且还需要研究优化额外的纯化工艺。
然而，使用根据本发明的Fc异源二聚体蛋白可轻松生产如图2所示的单价Fc异源二聚体融合蛋白，而无需优化额外的纯化工艺。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种新的Fc异二聚体融合蛋白，其蛋白质由一个、两个以上不同的亚基组成，从而通过形成的组装蛋白表现出完整的生物活性，从而能够在体内很长一段时间维持其融合蛋白的自然生理活性。
具体地说，根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白的形成使得其能够保留自然生成的生理活性蛋白的活性，其中两个以上亚基组装在一起形成一种蛋白质以展现生理活性，从而使融合蛋白能够维持尽可能最高程度的自然生成的形式和结构。
此外，根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白的优点在于，由于Fc介导的半衰期较长，其体内生理活性可持久，Fc异二聚体融合蛋白中包含的生理活性蛋白的体内半衰期可显著延长。
本发明的另一个目的是提供包含上述Fc异二聚体融合蛋白的药物组合物，和使用其治疗疾病，特别是癌症的组合物和治疗方法。
技术解决方案
为了实现上述目的，本发明提供一种异二聚体融合蛋白，其包括免疫球蛋白Fc对的第一Fc区和第二Fc区以及生理活性蛋白，
其中生理活性蛋白包含两个以上不同亚基，其中所述两个以上不同亚基通过形成蛋白质复合物展现生理活性，
其中生理活性蛋白的亚基连接或基因连接到第一Fc区和/或第二Fc区的一个以上N端或C端，
其中突变第一Fc区和第二Fc区的CH3结构域以促进Fc异二聚体形成。
本发明还提供一种包含上述Fc异二聚体融合蛋白的药物组合物，和使用其治疗疾病，特别是癌症的组合物和治疗方法。
附图说明
图1(A)到1(C)说明利用野生型人IgG抗体获得单体和异二聚体融合蛋白的常规策略。
图1(D)示出根据先前文献通过将单体细胞因子(IL2)融合到包含杵臼结构(KiH)Fc异二聚体变体的IgG型抗体来构建抗体细胞因子(免疫细胞因子)的实施例。
图2(A)和2(B)说明可使用Fc异二聚体构建单体和异二聚体融合蛋白形式，可以利用Fc异二聚体产生Fc融合单体或异二聚体蛋白，从而以自然生成的形式展现融合耦联蛋白。
图2(C)说明通过将异二聚体融合至包含Fc异二聚体的人IgG亚型抗体形成的融合蛋白。
图3示出了人IgG同型抗体(hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4)的CH3结构域的序列比对，A107Fc异二聚体变异体突变残基(K370E/K409WCH3A–E357N/D399V/F405TCH3B)已被高亮。
图4示出使用在图3中选择的位置上具有诱导突变的序列对每个同型的Fc异二聚体变体进行结构建模的结果，并分析了与基于野生型IgG1的A107变体相比所得到的建模结构。
图5示出在动物细胞中通过序列和结构分析构建的表达每种同型的Fc异二聚体载体的示意图。利用限制性酶(NotI/HindIII)将每个同型的包含突变的铰链区的Fc异二聚体变体克隆到载体中。
图6示意性地示出了scFv-FcCH3A/FcCH3B表达系统，通过表达蛋白之间的二聚体大小差异来评估Fc异二聚体变体形成异二聚体的能力。
图7示出将融合到单链可变片段(scFv)的scFv-Fc克隆到动物细胞表达载体pcDNA3.1载体中的示意图，其构建目的是通过图6所示的CH3突变体对评估Fc抗体的异二聚化形成量。
图8示出将根据图5和7所示的表达系统构建的引入CH3突变对的动物细胞表达载体共转染至HEK293F以评价如图6所示的异二聚化形成的结构，瞬时表达和纯化载体，然后，然后再非还原条件下在SDS-PAGE上分离5μg蛋白质以评价异二聚化形成，并通过考马斯蓝染色根据大小和组合分析蛋白质。使用有野生型CH3的野生型Fc作为阴性对照。
图9示出用SDS-PAGE按照图8所示方法分离蛋白质，然后用抗人IgG-AP缀合抗体进行免疫印迹的结果。
图10(A)示出本发明中用作对照的，Fc未与之融合的内源性IL-12细胞因子的形式示意图。
图10(B)示出通过氨基酸连接体将IL-12细胞因子与野生型IgG4Fc融合而获得的bi-IL-12-Fc融合蛋白的形式的示意图，并将其用作比较例列在本发明中。
图10(C)示出根据本发明的每种同种型的异二聚体Fc变体中IL-12细胞因子与基于IgG4的γ4-A107变体融合而获得的单-IL-12-Fc融合蛋白形式的示意图。
图11(A)和11(B)示出用于表达和纯化本发明一个实施例的融合蛋白的载体示意图。
图12示出用于表达和纯化本发明一个实施例的融合蛋白的载体示意图。
图13示出将图11(A)和11(B)的动物细胞表达载体共转染至HEK293F细胞中，表达载体使用人和小鼠细胞因子基因构建，瞬时表达和纯化载体，然后再非还原条件下在SDS-PAGE上分离5μg蛋白质，通过考马斯蓝染色根据大小和组合分析蛋白质的结果。
图14示出图13融合蛋白的粒度排除色谱法(SEC)分析结果。
图15示出分析单hIL-12-Fc和野生型双-hIL-12-Fc与无IL-12受体的正常PMBCs和PHA激活的PBMCs的结合亲和力的FACS分析结果，其中IL-12受体是通过用丝裂原PHA(植物血凝素)处理诱导的。
图16示出不同浓度的Fc Fc(A107)、重组人IL-12(rhIL-12)、双hIL-12-Fc和单hIL-12-Fc对PHA激活的PBMC增殖效果的WST-1细胞增殖试验分析结果，其中IL-12受体是通过用丝裂原PHA处理诱导的。
图17示出如图16所示获得的培养上清液中的IFN-γ浓度的ELISA测量结果。
图18示出单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc对无IL-12受体的正常PMBC和PHA激活的PBMC的结合亲和力的流式细胞分析结果，其中由于在活化的人T细胞和NK细胞上mIL-12与人IL-12R发生交叉反应，故用丝裂原PHA处理诱导IL-12受体。
图19示出不同浓度的Fc(A107)、重组小鼠IL-12(rmIL-12)、双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc对PHA激活的PBMC增殖效果的WST-1细胞增殖试验分析结果，其中IL-12受体是通过用丝裂原PHA处理诱导的。
图20(A)示出接种了CT26HER2/Neu肿瘤的Balb/c小鼠中在腹腔注射Fc(A107)、rmIL-12、双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc时的肿瘤体积变化，和给药结束后处死的荷瘤小鼠图片。在肿瘤细胞接种11天后，当肿瘤体积达到100mm3时开始注射mIL12-Fc蛋白。
图20(B)示出在图20(A)所示的实验过程中指定时间点的小鼠体重变化测量图。
图21(A)示出当用CT26HER2/Neu移植的Balb/c小鼠的肿瘤体积达到300mm3时，每周两次注射腹腔注射不同浓度的双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc时肿瘤体积变化的测量结果。
图21(B)是在图21(A)所示的实验过程中，在指定时间点用mIL12-Fc蛋白处理的单个小鼠的肿瘤体积变化图。
图21(C)示出图21(A)中最后给药后3天荷瘤小鼠肿瘤图片。
图21(D)示出在图21(A)所示的实验过程中在指定时间点测量的小鼠体重变化的图。
图21(E)示出在图21(A)中最后给药后1天小鼠面部静脉采集的血液中丙氨酸转氨酶(ALT)(肝毒性标志物)的测量结果图。
图22(A)示出在图21(A)中最后给药后3天处死的小鼠脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞数量增加的测量结果图。
图22(B)示出在图21(A)中最后给药后3天处死的小鼠中浸润肿瘤的总免疫细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量图。
图23(A)示出用mIL-12-Fc蛋白处理的CT26HER2/neu肿瘤小鼠血清IFN-γ水平的ELISA测量结果。在图21(A)最后给药后24小时，从小鼠面部静脉收集的血液凝固后，分离小鼠血清。
图23(B)示出当用CT26HER2/Neu癌细胞移植Balb/c小鼠的肿瘤体积达到300mm3时，腹腔注射浓度与1μg rmIL-12等摩尔量的双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc在1、3和5天后，ELISA测量从小鼠面部静脉血中分离出的血清IFN-γ浓度的结果。
图23(C)示出细胞毒性T细胞对CT26HER2/Neu癌细胞的细胞毒性作用的测量结果，细胞从图21(A)中最后给药后3天处死的小鼠脾脏中进行分离。
图23(D)示出从用mIL-12-Fc蛋白处理的CT26-HER2/neu荷瘤小鼠分离的脾CD8+T细胞的细胞毒性活性，在图21(A)中第三次给药后3天进行分析，随后与表达肿瘤抗原的CT26HER2/Neu癌细胞和不表达肿瘤抗原的4T1细胞培养4小时。
图23(E)是示出从图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏中分离的自然杀伤细胞对CT26HER2/Neu癌细胞的细胞毒性作用测量图。
图24(A)是示出从图21(A)中第三次给药后3天处死的荷瘤小鼠脾脏中分离的效应CD8+T细胞的数量测量图。
图24(B)示出从图21(A)中第三次给药后3天处死的荷瘤小鼠脾脏中分离的效应记忆CD8+T细胞的数量测量图。
图24(C)是示出从图21(A)中第三次给药后3天处死的荷瘤小鼠脾脏中分离的中心记忆CD8+T细胞的数量测量图。
图24(D)示出在图21(A)中1μg单IL-12-Fc给药后120天将CT26HER2/Neu癌细胞重新移植到存活的Balb/c小鼠中并测量小鼠中的肿瘤体积变化所获得的结果。
图24(E)示出图21(A)中第三次给药后3天处死的荷瘤小鼠脾脏CD8+T细胞中记忆前体效应细胞(KLRG1-IL-7R+)和短寿命效应细胞(KLRG1+IL-7R-)比例流式细胞分析的结构。
图25(A)示出测量在图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏细胞中分离的CD8+T细胞(表现出抑制记忆细胞分化的转录因子T-bet的高表达)比例的流式细胞分析结果图。
图25(B)示出测量在图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏细胞中分离的CD8+T细胞(表现出Eomes的高表达和T-bet的低表达)比例的流式细胞分析结果图。
图25(C)示出当用CT26HER2/Neu癌细胞移植的Balb/c小鼠肿瘤体积达到300mm3时，在腹腔注射1μg rmIL-12等摩尔浓度的双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc后24小时从肿瘤引流(腹股沟)淋巴结分离的CD8+细胞中测量磷酸化STAT4的表达水平的流式细胞分析结果图。
图25(D)示出测量图25(C)中单次腹腔注射后72小时肿瘤引流(腹股沟)淋巴结中CD8+T细胞(表达抑制记忆细胞分化的T-bet)比例的流式细胞分析结果图。
图25(E)示出当从正常Balb/c小鼠的脾脏和腹股沟淋巴结分离的CD8+T细胞被与抗Fc抗体交叉反应的单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc刺激后，测量pSTAT4表达水平的流式细胞分析结果图。
图25(F)示出当从正常Balb/c小鼠的脾脏和腹股沟淋巴结分离的CD8+T细胞被与抗Fc抗体交叉反应的单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc刺激后，测量表达T-bet的CD8+T细胞比例的流式细胞分析结果图。
图26示出通过单mIL-12-Fc诱导记忆前体效应细胞分化的机制和通过双mIL-12-Fc诱导短寿命效应细胞分化的机制的总体示意图。
实施本发明的最佳方式
除非另有定义，本文所用所有技术及科学术语均具有普通熟练此技术者通常理解相同的含义。一般而言，本文所用的术语和将在下文中描述的实验方法是本领域内众所周知和常用的方法。
一方面，本发明涉及Fc异二聚体融合蛋白,包含免疫球蛋白Fc对的第一Fc区和第二Fc区以及生理活性蛋白，
其中生理活性蛋白包含两个以上亚基，其中所述两个以上不同亚基通过形成蛋白质复合物展现生理活性，其中生理活性蛋白的亚基连接或基因融合到第一Fc区和/或第二Fc区的一个以上N端或C端，
其中突变第一Fc区和第二Fc区的CH3结构域以促进Fc异二聚体形成。
如本文中所使用，术语“Fc区”或“重链恒定区”指包含免疫球蛋白CH2结构域、CH3结构域和铰链结构域的区域。然而，对IgE而言，该术语指包含CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域和铰链结构域的区域。
如本文中所使用，词句“突变第一Fc区和第二Fc区以促进异二聚体形成”指一种自然生成的抗体具有同二聚体形式，其中两个Fc区域具有相同的序列，并且这些Fc区域序列的一部分发生突变，以便通过第一个Fc区域和第二个Fc区域之间特定的非共价相互作用促进异二聚体形成，或者降低同二聚体形成，或者优选地不形成。
优选地“突变第一Fc区和第二Fc区以促进异二聚体形成”可包括“突变免疫球蛋白第一Fc区和第二Fc区包含的每一个CH3结构域以促进Fc异二聚体形成”。
在本发明中，“异二聚化Fc或Fc异二聚体”包含第一Fc区和第二Fc区，并且第一Fc区和第二Fc区指异二聚体，其中突变第一Fc区和第二Fc区的CH3结构域以促进Fc异二聚体形成。
在本发明中，每一个第一Fc区和第二Fc区都可衍生自选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD和IgE组成的组中的Fc区，并且优选地，每一个第一Fc区和第二Fc区都衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
另外，第一Fc区和第二Fc区可衍生自同型抗体。
另一方面，CH3结构域的突变可以包括从以下组别中选择的一个以上突变(其中，本发明中的所有突变位点均按照欧盟索引编号)：
(1)第一Fc区CH3结构域K370位点氨基酸残基的取代；和第二Fc区CH3结构域E357和/或S364位点氨基酸残基的取代；和/或
(2)第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的取代；和第二Fc区CH3结构域F405和/或D399位点氨基酸残基的取代。
优选地，第一Fc区CH3结构域K370位点氨基酸残基的取代可以是K370E、K370R、K370M、K370D或K370H，第二Fc区CH3结构域E357位点氨基酸残基的取代可以是E357N、E357D、E357A、E357I、E357G或E357M，以及第二Fc区CH3结构域S364位点氨基酸残基的取代可以是S364T或S364W。
另外，第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的取代可以是K409W，第二Fc区CH3结构域F405位点氨基酸残基的取代可以是F405T，以及第二Fc区CH3结构域D399位点氨基酸残基的取代可以是D399V。
氨基酸残基突变如K370E指第370位点K被突变成E，本发明中所有氨基酸残基的突变的含义与上述相同。
更优选地，第一Fc区或第二Fc区的CH3结构域的突变可包括从以下组别中选择的一个以上突变(其中突变位点根据欧盟索引进行编号)：
(1)在第一Fc区CH3结构域K370位点氨基酸残基的K370E、K370R、K370M、K370D或K370H的取代；
(2)在第二Fc区CH3结构域E357位点氨基酸残基的E357N、E357D、E357A、E357I、E357G或E357M的取代，以及在第二Fc区CH3结构域S364位点氨基酸残基的S364T或S364W的取代；
(3)在第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的K409W的取代；以及
(4)在第二Fc区CH3结构域F405位点氨基酸残基的F405T的取代，以及在第二Fc区CH3结构域D399位点氨基酸残基的D399V的取代。
在第一Fc区和第二Fc区中的CH3结构域可以进一步包括以下残基：
(i)第一Fc区CH3结构域Y349位点被半胱氨酸(C)取代；以及
(ii)第二Fc区CH3结构域S354位点被半胱氨酸(C)取代。
另一方面，CH3结构域的突变可包括从以下组别中选择的一个以上突变：
(1)第一Fc区CH3结构域K360位点氨基酸残基的取代；和第二Fc区CH3结构域E347位点氨基酸残基的取代；和/或
(2)第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的取代；和第二Fc区CH3结构域F405和D399位点氨基酸残基的取代。
优选地，第一Fc区CH3结构域K360位点氨基酸残基的取代可以是K360E，以及第二Fc区CH3结构域E347位点氨基酸残基的取代可以是E347R。
第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的取代可以是K409W，第二Fc区CH3结构域F405位点氨基酸残基的取代可以是F405T，以及第二Fc区CH3结构域D399位点氨基酸残基的取代可以是D399V。
最优选地，CH3结构域的突变可以包括从以下组中选择的一个以上突变(其中，本发明中的所有突变位点均按照欧盟索引编号)：
(1)在第一Fc区CH3结构域K360位点氨基酸残基的K360E的取代；
(2)在第二Fc区CH3结构域E347位点氨基酸残基的E347R的取代；
(3)在第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的K409W的取代；以及
(4)在第二Fc区CH3结构域F405位点氨基酸残基的F405T的取代，以及在第二Fc区CH3结构域D399位点氨基酸残基的D399V的取代。
在第一Fc区和第二Fc区中的CH3结构域可以进一步包括以下残基：
(i)第一Fc区CH3结构域Y349位点被半胱氨酸(C)取代；以及
(ii)第二Fc区CH3结构域S354位点被半胱氨酸(C)取代。
优选地，包含在根据本发明的免疫球蛋白的第一Fc区和第二Fc区的每一个CH3结构域可以具有氨基酸序列，其选自由以下序列标识号表示的氨基酸序列组成的组：
(1)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
(2)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
(3)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
(4)SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9；
(5)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12；以及
(6)SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15。
具体地，根据本发明的免疫球蛋白的第一Fc区和第二Fc区优选具有下表1所示的IgG4CH3结构域的序列。
表1
在根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白中，生理活性蛋白的亚基仅可与第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端连接，并且单个生理活性蛋白的一个以上不同亚基可与每个第一Fc区和第二Fc区的每个N端和C端连接(见图2(B)和2(C))。
“生理活性蛋白的亚基仅连接于第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端”指生理活性蛋白的一个亚基仅与第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的四端中的任何一个连接,生理活性蛋白的其余亚基与生理活性蛋白的亚基通过连接体连接，该亚基与第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端连接。连接体优选地是氨基酸连接体，但不限于此。
另外，“单个生理活性蛋白的一个以上不同亚基可与每个第一Fc区和第二Fc区的每个N端和C端连接”指单个生理活性蛋白的一个以上不同亚基可与每个第一Fc区和第二Fc区的N端连接，单个生理活性蛋白的一个以上不同亚基可与每个第一Fc区和第二Fc区的C端连接，或者单个生理活性蛋白的一个以上不同亚基可分别与每个第一Fc区和第二Fc区的N端和C端连接。
在根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白中，生理活性蛋白的亚基可通过基因融合与第一Fc区和/或第二Fc区的N端和/或C端连接。
另一方面，生理活性蛋白的亚基可通过连接体与第一Fc区和第二Fc区连接。连接体优选地是氨基酸连接体，但不限于此。
另一方面，在根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白中，生理活性蛋白的特征在于由两个以上不同的亚基组成，其中两个以上不同的亚基通过形成蛋白质复合物展现出生理活性。
“生理活性蛋白由两个以上不同的亚基组成，其中两个以上不同的亚基通过形成蛋白质复合物展现出生理活性”指当两个以上亚基形成一个蛋白质复合物时，生理活性蛋白展现出所需的生理活性。
生理活性蛋白选自由白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-27(IL-27)、白细胞介素-35(IL-35)和促卵泡激素(FSH)组成的组，但不限于此。此外，对于本领域技术人员来说，显而易见的是，本发明中可以使用适合于本发明目的的任何生理活性蛋白。
最优选地，根据本发明的生理活性蛋白是IL-12。
现在将通过作为优选地生理活性蛋白IL-12的实施例来详细描述一种由两个以上不同亚基组成的蛋白质，其中两个以上不同亚基通过形成本发明的蛋白质复合物而展现出生理活性。
IL-12由两个亚基组成，p35(IL-12A)和p40(IL-12B)，并且IL-12的生理活性形式是p70，p70是p35和p40的异二聚体。IL-12应以p70的形式存在，p70是p35和p40的异二聚体，以使IL-12在自然系统中表现出其活性。
在本发明中，为了尽可能模拟自然生成的IL-12的形式，使用了根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白的形式。
具体地说，如上所述，在根据本发明的由第一Fc区和第二Fc区组成的Fc异二聚体融合蛋白中，其中，生理活性蛋白的一个以上亚基连接于第一Fc区和第二Fc区的一个以上的N端或C端，
(i)构成生理活性蛋白的一个以上亚基仅连接于第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端，并且生理活性蛋白的其余亚基可通过连接体连接，或
(ii)单个生理活性蛋白的一个以上不同亚基可分别与每个第一Fc区和第二Fc区的N端和/或C端连接。
在上述情况下，下文将描述IL-12的实施例。
在(i)的情况中，IL-12的p35或p40亚基仅连接于第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端，并且其余亚基可通过连接体与跟第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端连接的p35或p40亚基连接以形成Fc异二聚体融合蛋白(见图2(B)和2(C))。
在(ii)的情况中，选自IL-12的p35和p40亚基中的任何一个仅与连接第一Fc区的N端或C端，并且另一个亚基可与第二Fc区的N端或C端连接以形成Fc异二聚体融合蛋白(见图2(B)和2(C))。
研究发现，这种形式在保持自然生成的原始异二聚体形式的同时，在体外表现出类似于传统IL-12蛋白的生理活性(见图2(B)、2(C)和10(C))。
因此，根据本发明优选地免疫球蛋白Fc异二聚体融合蛋白的特征在于所述生理活性蛋白为IL-12，并且在于IL-12的p35或p40亚基连接于第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端，并且其余亚基通过连接体与第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端的亚基连接，或者在于IL-12的p35和p40亚基与第一Fc区和第二Fc区的每个N端和C端相连。
另一方面，在根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白中，包含在每个第一Fc区和第二Fc区的N端的铰链结构域的特征在于，包含在铰链结构域中的半胱氨酸残基发生突变。
优选地，铰链结构域中的半胱氨酸残基的突变的特征在于上铰链区的半胱氨酸残基，而非用于异二聚体形成的核心铰链区的半胱氨酸残基，均被丝氨酸残基取代，但本发明的范围不限于此。
此外，本发明中，第一Fc区和第二Fc区可包括在由人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD和IgE组成的全抗体形式中。
在本发明中，术语“全抗体形式”指一种完整的抗体，其进一步包括CH1结构域、VH结构域、CL结构域和VL结构域，以及用于IgG、IgA和IgD的Fc区域中的CH2结构域、CH3结构域和铰链结构域(还包括IgE的CH4域)。
另一方面，本发明涉及包含根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白的药物组合物。根据本发明的药物组合物的用途可能取决于Fc异二聚体融合蛋白中包含的生理活性蛋白的用途。
优选地，根据本发明的Fc异二聚体融合蛋白中包含的生理活性蛋白可以是IL-12或其一个以上亚基。因此，本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含一种Fc异二聚体融合蛋白，该融合蛋白包含作为生理活性蛋白的IL-12。
一种可被用于治疗癌症的药物组合物治疗的癌症，所述药物组合物包含一种Fc异二聚体融合蛋白，所述Fc异二聚体融合蛋白包含IL-12或一个以上亚基作为生理活性蛋白，所述癌症可以从结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、小肠癌、食管癌、宫颈癌、肺癌、淋巴瘤和血癌组成的组中选择，但不限于此。
根据本发明的药物组合物可进一步包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指可加入活性成分，帮助配制或稳定制剂，对患者无明显不良毒理作用的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指在不刺激患者的情况下不损害根据本发明的异二聚体融合蛋白的生物活性和特性的载体或稀释剂。作为在配制在液体溶液的组合物中的药学上可接受的载体，可使用无菌和生物相容的载体。药学上可接受的载体可为生理盐水、无菌水、林格溶液、缓冲盐水、白蛋白注射溶液、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇或其两种以上的混合物。此外，如有必要，本发明的组成可包含其他常规添加剂，包括抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，在稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂的帮助下，本发明的组成可以配制成可注射形式，例如水溶液、悬浮液或乳液。此外，根据本发明的组合物可以丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂的形式配制。文献《雷明顿药学(E.W.Martin)》中描述了其他载体。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。本领域已知将所述介质和试剂用于药学活性物质。所述组合物优选用于静脉注射。该组合物可以配制成适合高药物浓度的固体、溶液、微乳液、脂质体或其他的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其适当混合物的溶剂或分散介质。在某些情况下，该组合物可含有等渗剂，例如糖、多元醇、例如山梨醇或氯化钠。无菌注射溶液可由Fc异二聚体融合蛋白在适当的溶剂中与上述一种以上成分的组合按要求量制备，然后按要求进行无菌微滤。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中来制备分散体，所述载体包含基本分散介质和上述所述材料中所需的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选地制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌的过滤溶液中产生活性成分粉末和任何其他所需成分。
此外，根据本发明的药物组合物可经口或非静脉给予遭受痛苦的患者，其剂量和频率可随遭受痛苦的患者的严重程度而变化。所述组合物可作为给丸剂或连续输注给需要的患者。在另一实施例中，本发明药物组合物可经直肠、静脉、皮下、子宫内或脑血管给予，但不限于此。
此外，包括IL-12的包含免疫球蛋白Fc异二聚体融合蛋白的用于癌症治疗的药物组合物可用于与其他抗癌药物的联合治疗。其他抗癌药物优选细胞毒性T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞，但不限于此，可用于本发明所属领域的所有抗癌药物可用于联合治疗。
具体而言，当包含Fc免疫球蛋白异二聚体融合蛋白(包括IL-12)的用于癌症治疗的药物组合物用于与细胞毒性T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞联合治疗时，其可诱导：
(1)通过刺激T细胞或自然杀伤(NK)细胞增加细胞因子分泌；
(2)抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的增加；
(3)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或自然杀伤细胞数量的增加；
(3)肿瘤周围淋巴细胞引入的增加；或
(4)体内淋巴细胞IL-12R beta1和IL-12R beta2信号的增加。
另一方面，本发明涉及治疗或预防疾病的方法，其包含向需要治疗的患者施用包含本发明Fc异二聚体融合蛋白的药物组合物。
与组合物的情况类似，可以治疗或预防的疾病取决于使用的Fc异二聚体融合蛋白中包含的生理活性蛋白。优选地，当根据本发明的Fc异源二聚体融合蛋白中包含的生理活性蛋白的一个以上亚基是IL-12的一个以上亚基时，本发明提供了一种治疗或预防癌症的方法，用于患有癌症的患者，特别是选自由大肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、小肠癌、食道癌、宫颈癌、肺癌、淋巴瘤和血癌组成的组。
实施例
在下文中，将参照实例进一步详细描述本发明。对于在本领域具有普通技能的人来说，显而易见的是，这些示例仅用于说明目的，不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：设计抗体Fc CH3结构域变体以用于每个人免疫球蛋白同型(测序)异二
聚体的形成
为了通过诱导利于异二聚体形成的CH3结构域突变制备每个人源免疫球蛋白同型的Fc异二聚体片段，首先分析了在异二聚体形成相互作用中起主要作用的CH3结构域之间的氨基酸序列相似性，如下所述。在这方面，Fc异二聚体变体(A107)是通过在CH3同二聚体界面引入不对称突变来产生异二聚体CH3A:CH3B对(在本发明中，CH3A和CH3B分别指第一Fc区域的CH3域和第二Fc区域的CH3域)，这一策略已在以前的文献或专利文件(Choi etal.2016；韩国专利申请号2015-0142181)中发表，从而使得CH3A:CH3B的异二聚体化驱动Fc变体以高产率形成异二聚体。图3对每个人抗体免疫球蛋白G(IgG)同型的CH3结构域序列进行了比对。每个氨基酸序列都是从国际免疫遗传学信息系统(IMGT；URL:http://www.imgt.org/)中获得的。具体地，在各种同种异体中，在各种异型中，G3m(s,t)的序列被用于IgG3(Stapleton NM et al.,2011)，其血清半衰期据报道维持在与其他IgG同种型相似的水平。
测序结果表明，除A107突变位点中409位氨基酸为精氨酸外，IgG4在所有同型中均具有保守序列，而IgG1、IgG2和IgG3位点的氨基酸不同。因此，选择具有相同氨基酸序列号的位置作为将A107突变对引入IgG1以外的同型的位置。根据欧盟索引对本发明中的所有氨基酸位置进行编号。
实施例2：设计免疫球蛋白Fc CH3结构域变体以用于每个人源免疫球蛋白同型(结
构建模)异二聚体的形成
在实际构建每个同型的CH3结构域变体之前，利用如图3所示的引入每个突变的变体序列(如图3所示)，通过结构建模预测A107突变对能否稳定地引入实施例1中所选择的位点，从而形成异二聚体。通过在线建模服务器(URL:https://swissmodel.expasy.org/；Biasini M et al.,2014)，利于已知的免疫球蛋白Fc异二聚体变异结构(PDB ID:4X98)为模板，预测结构建模。利用pymol软件对每一个获得的结构进行重叠，可以直观地观察到蛋白质结构，从而观察到CH3结构域的结构变化和A107突变在引入突变后的位点。在重叠结构上，我们发现，即使在每个等型中引入了A107突变，与基于IgG1等型构建并形成CH3A:CH3BFc异二聚体的传统A107变体的模型结构相比，这些结构仍保持不变。具体地，结果表明，所引入的A107突变氨基酸残基的方向基本一致，突变氨基酸之间的相互作用距离也保持在相似的水平(见图4)。
实施例3：构建每个人源免疫球蛋白同型的A107Fc异二聚体同型变体
通过实施例1中的测序和实施例2中的结构模型设计的A107 Fc异二聚体同型变体由本领域技术人员整码克隆到动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)中(美国英潍捷基)，使用NotI/HindIII限制酶和合成寡核苷酸(韩国千年基因)通过定点诱变方法获得信号序列-铰链-CH2-CH3(见图5)。
在所用的铰链域中，用丝氨酸残基取代上铰链区的半胱氨酸残基，而不是核心铰链区形成异二聚体的半胱氨酸残基，以防止蛋白质融合过程中产生二硫键。具体地，针对IgG3，文献中发现，在G3m(s,t)异型铰链域的47个氨基酸中，即使只有核心铰链结构域的C端15个氨基酸即可维持IgG3的高抗体效应器功能(ADCC和CDC)(Dall'Acqua WF et al.,2006)。因此，仅使用了如图5中所示序列的C端15个氨基酸。
下面的表2示出了本发明野生型和A107Fc异二聚体变体对中CH3结构域的氨基酸序列信息。
表2
实施例4：评估每个人源免疫球蛋白同型的A107Fc异二聚体变体的异二聚体能力
为了检验实施例3中构建的A107Fc异二聚体同型变异体是否具有与野生型A107变异体相似的异二聚体能力，采用了一种主要用于评价同类型研究中Fc变异体异二聚化能力的scFv-FcCH3A/FcCH3B表达系统(Choi et al.,2013)。图6示出了所述scFv-FcCH3A/FcCH3B表达系统的示意图。由于在scFv-FcCH3A/FcCH3B表达系统中纯化的抗体显示了scFv-FcCH3A同二聚体(103kDa)、scFv-FcCH3A/FcCH3B异二聚体(78kDa)和FcCH3B同二聚体(53kDa)之间的分子量的不同，因此可以在SDS-PAGE上比较异二聚体的形成程度。
使用实施例3中构建的载体作为FcCH3B载体。此外，通过仅将scFv引入FcCH3A的N-端，即提供pcDNA3.1(+)-scFv-铰链-CH2-CH3A(scFv-FcCH3A)的形式来克隆载体。图7示出了在scFv-FcCH3A/FcCH3B表达系统中使用的动物细胞表达载体pcDNA3.1(+)-scFv-铰链-CH2-CH3A(scFv-FcCH3A)的示意图。所用scFv抗体是通过连接hAY4a的VH和VL区获得的抗体，hAY4a是一种特异性结合到DR4的亲和力增强型人源化AY4a抗体(Lee,Park et al.2010)。用位于铰链域正前方的NotI限制酶和BsiWI限制酶进行克隆。构建同样形式的野生型Fc(scFv-Fc/Fc)作为变异体的对照。
实施例5：表达和纯化含有每个人源免疫球蛋白同型的A107
Fc异二聚体变体的抗
体
通过将表达载体(1:1比率)的混合物和聚乙烯亚胺(PEI)(Polyscience)瞬时转染到HEK293-F细胞(英潍捷基)中并在含有无血清FreeStyle 293表达培养基的摇瓶中培养细胞来完成构建的scFv-FcCH3A和FcCH3B的共表达。具体方法如下。
在摇瓶(康宁)中进行200mL的转染时，将HEK293-F细胞以2.0×106细胞/mL的密度接种到100mL培养基中，并在8％CO2下以150rpm培养。为了产生每种人源化抗体，将每种抗体的重链和轻链质粒稀释在10mL FreeStyle 293表达培养基(英潍捷基)中，总稀释量为250μg(2.5μg/mL)(轻链125μg，重链125μg)，并将培养基与其中稀释的含有750μg PEI的10mL培养基(7.5μg/mL)混合。在室温中孵育培养基混合物10分钟。随后，将培养基混合物添加到100mL的接种细胞中，并在8％CO2下以150rpm的速度孵育4小时，之后将剩余的100mLFreestyle 293表达培养基添加到其中，然后孵育5到7天。在此孵育过程中，细胞产生的蛋白质，即包含Fc变异体的抗体，从细胞中分泌出来并积聚在培养基中。因此，在细胞培养后，以2500rpm的速度离心20分钟收集上清液，并用蛋白质A琼脂糖柱(GE医疗)从其中提纯出蛋白质。在这种情况下，纯化过程参照蛋白质A柱公司提供的标准方案进行。通过使用BCA蛋白质分析试剂盒(赛默飞)中的溶液在562nm波长处测量吸光度并根据制备的标准曲线测定其量来定量纯化的蛋白。
实施例6：评估每个人免疫球蛋白同型的A107Fc异二聚体变体的异二聚体能力
在非还原条件下，在12％的SDS-PAGE上分析在实施例5中纯化并包含每个同型的A107Fc异二聚体变体的5μg抗体(图8)。在103kD观察到CH3A变体的同二聚体；在53kD观察到CH3B变体的同二聚体；在25kD观察到CH3B变体的单体；在78kD观察到CH3A变体和CH3B变体的异二聚体。为了更准确地检测同二聚体的程度，还进行了蛋白质印迹。通过在非还原条件下分离0.1μg蛋白质，其小于12％SDS-PAGE中分析的蛋白质，然后按照本领域已知的常规方法用抗人IgG-AP结合抗体(Sigma)处理蛋白质来进行蛋白质印迹(图9)。
如图8和9所示，对于以野生型CH3结构域作为对照引入的IgG1异二聚体，在SDS-PAGE上均观察到CH3A和CH3B的同二聚体和CH3A:CH3B异二聚体，然而，通过将A107异二聚体突变引入IgG2、IgG3和IgG4获得的每个人源免疫球蛋白同型的A107Fc异二聚体变体，除IgG1外，均形成了与先前报道的基于IgG1的A107变体相似或更高的异二聚体。此时，对于IgG4变体，还观察到包含CH3A或CH3B的Fc单体(半Fc)，其是天然存在的IgG4的性质之一，并且由相对于铰链结构域形成半Fc的性质产生(特别是在核心铰链区228位的丝氨酸)在血液中Fab臂交换发生之前(Liu H et al.,2012)
实施例7：构建人/小鼠IL-12融合蛋白
实施例1至6中的同型变体保持其异二聚化能力的水平与先前报道的基于IgG1的A107Fc异二聚体变体相似。在这些同型变异体中，基于IgG4的变异体(γ4-A107)被用来构建一种持久的IL-12融合蛋白。自然生成的IL-12由两个亚基组成，一个p35亚基(p35；IL-12A)和一个p40亚基(p40；IL-12B)，两个亚基相互作用形成具有活性的异二聚体。这种异二聚体的形成是因为两个亚基通过亚基之间的一个二硫键更加牢固和稳定地结合在一起。因此，IL12的两个亚基(p35和p40)基因融合至每个异二聚体Fc链的N端，以维持自然生成的细胞因子的异二聚体形式。
γ4-A107被用作构建融合蛋白的Fc异二聚体变体，其基于IgG4，通过引入A107突变可形成异二聚体。如前所述，在构建抗体和细胞因子融合的免疫细胞因子时，IgG1的抗体效应器功能(诸如ADCC/CDC)反而促进体内清除。因此，与IgG1相比，用几乎不显示ADCC/CDC功能的IgG4同型构建融合蛋白(ADCC/CDC)(Gillies SD et al.,1999)。
图10示出了在本发明中用γ4-A107获得的单价IL-12融合蛋白(单IL-12-Fc)和用野生型Fc获得的二价IL-12融合蛋白(双IL-12-Fc)的示意图。具体地，图10(C)示出了在本发明中通过引入CH3变体对构建的融合蛋白。扩增编码不包括信号序列的成熟形式的人IL-12(hIL-12,Uniprot条目名称P29460,P29459；SEQ ID NO:17-18)和小鼠IL-12(mIL-12,Uniprot条目名称P43432,P43431；SEQ ID NO:19-20)的DNA序列，并使用NotI/BsiWI限制酶将每个扩增产物克隆到含有γ4-A107变体的动物细胞表达载体中，如图11(A)和11(B)所示。产生的蛋白被分别命名为单hIL-12-Fc和单mIL-12-Fc。具体地，在p35亚基和铰链结构域之间加入一个由15个氨基酸组成的柔性肽连接体(柔性(G4S)3连接体)，使人/小鼠p35亚基能够与p40亚基充分相互作用。作为图10(C)所示蛋白的对照实例，通过将每个人源IL-12(hIL-12)和小鼠IL-12(mIL-12)融合到野生型IgG4Fc(wt IgG4)中来构建双hIL-12-Fc和双mIL-12-Fc。为了将单个Fc与仅在异二聚体形式具有活性的IL-12相融合，用15个氨基酸肽连接体连接IL-12的两个亚基，然后利用NotI/BsiWI限制酶整码克隆到含有γ4-A107变体的动物细胞表达载体中，如图12所示。对照实例是以前研究中用来生成IL-12融合蛋白的融合蛋白(Lisan S.Peng et al.,1999)。
下表3示出了用于构建融合蛋白的成熟形式的人和小鼠IL-12亚基的氨基酸序列。
表3
实施例8：表达/纯化IL-12融合蛋白
图10(C)中的单IL-12-Fc融合蛋白根据实施例5中所述方法从人/小鼠IL-12.p40-γ4-A107A和人/小鼠IL-12.p35-γ4-A107B表达载体(1:1比率)中表达/纯化。图10(B)中的双IL-12-Fc融合蛋白通过单转人/小鼠scIL-12-IgG4Fc(wt)表达载体表达/纯化。所有融合蛋白的表达/纯化量是每100mL的HEK293F培养细胞中12到13mg。
在非还原条件下用12％的SDS-PAGE分析5μg的纯化单IL-12-Fc和双IL-12-Fc融合蛋白(图13)。在60kD处观察到IL-12.p40-CH3A变体的单体；在120kD处观察到IL-12.p40-CH3A变体的同二聚体；在50kD处观察到IL-12.p35-CH3B变体的单体；在100kD处观察到IL-12.p35-CH3B变体的同二聚体；并且在110kD处观察到IL-12.p40-CH3A变体和IL-12.p35-CH3B变体的异二聚体。然而，通过人和小鼠白细胞介素亚基的连接获得的蛋白质，其条带大小略有不同，文献中发现这些条带是由不同的糖基化形式引起的(Lo et al.,2007)。此外，以与上述实施例6中所述的相同方式，在基于IgG4的所有IL-12融合蛋白中观察到了单体。与先前的报告类似，p35亚基在没有p40亚基的帮助下不能自然地以单体形式表达，在使用Fc异二聚体变体获得的单IL-12-Fc融合蛋白中只观察到p40亚基连接的CH3A单体(Gillieset al.,1998b)。
图14示出了融合蛋白的粒度排阻色谱法(SEC)分析结果。从单克隆hIL-12-Fc融合蛋白中可部分观察到寡聚体。
实施例9：评估单hIL-12-Fc融合蛋白对IL-12受体的结合亲和力
将实施例8中表达和纯化的单hIL-12-Fc对IL-12受体的结合亲和力与双hIL-12-Fc的结合亲和力进行比较分析。
图15示出了与双hIL-12-Fc相比，测定构建的单hIL-12-Fc对IL-12受体的结合亲和力的FACS-Calibur(BD生物科学)分析结果。
具体地，为了从人体外周血中分离出免疫细胞(PBMCs)，在15-mL试管中注入5毫升的Ficoll(GE医疗)。将样品血液与PBS(pH7.4)1:1混合并摇匀，然后取10mL血液，并在含Ficoll的试管中以“不间断”状态在750g离心20分钟，以免与Ficoll混合。然后，回收在Ficoll上形成的黄色涂层，用PBS(pH7.4)漂洗两次，得到包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞在内的PBMCs。分离的正常PBMCs不表达大量的IL-12R来观察到IL-12的结合。因此，用有丝分裂原PHA(西格玛奥德里奇)刺激细胞72小时，使T细胞和NK细胞活化。据报道当用PHA处理细胞时，免疫细胞分裂的同时会在T细胞和NK细胞中表达IL-12受体。当细胞在37℃的5％CO2培养箱中培养72小时后，将PBMCs以1x 106细胞/mlL的密度加入到含有10％FBS的RPMI1640培养基中，并以10μg/mL的浓度在其中加入有丝分裂原PHA。用冷PBS(pH7.4)漂洗正常PBMCs和PHA激活的PBMCs，每个样品制备5x 105个细胞。将每个Fc(A107)、双hIL-12-Fc和单hIL-12-Fc以1μM的浓度加入到每个样品中，在4℃下孵育30分钟，然后用冷PBS(pH7.4)漂洗。每个样本在4℃下用FITC缀合的人抗IgG4二抗(西格玛奥德里奇)孵育30分钟，用PBS(pH7.4)漂洗，然后用流式细胞仪分析(FACS Calibur,BD生物科学)。分析后得到每个样本的柱状图，并评价单hIL-12-Fc对IL-12受体的结合亲和力。
分析结果表明，双hIL-12-Fc和单hIL-12-Fc不与正常的不表达IL-12受体的PBMCs结合，只与表达IL-12受体的PHA激活的PBMCs结合。因此，我们发现单hIL-12-Fc与IL-12受体的结合亲和力与双hIL-12-Fc相当。
实施例10：评估单hIL-12-Fc融合蛋白诱导PBMC增殖的能力
以重组人IL-12(rhIL-12，赛默飞世尔科技)作为对照，检测IL-12融合蛋白中的IL-12部分是否通过与IL-12受体结合而保持与实际重组人IL-12(rIL-12)相当的生理活性。
图16示出了用于检查Fc(A107)、rhIL-12、双hIL-12-Fc和单hIL-12-Fc在PHA激活的PBMCs中的细胞增殖能力的WST-1细胞增殖测试的结果。
具体地，将实施例9中所述的相同方式用PHA激活的PBMCs(2x104细胞，50μL)添加到96孔板(SPL，韩国)，然后添加用含10％FBS的RPMI1640培养基连续稀释的50μL的50-0.4pM Fc(A107)、rhIL-12、双hIL-12-Fc和单hIL-12-Fc。然后，在37℃，5％CO2下培养细胞72小时。对于细胞增殖试验，将10μL的WST-1(水溶性四唑盐，西格玛奥德里奇)试剂添加到每个孔中，在37℃下孵育4小时，并使用微孔板阅读器(美谷分子仪器，Molecular Devices)测量570nm处的吸光度。
结果表明，单hIL-12-Fc具有与rhIL-12相似或更高的PBMC增殖能力。
实施例11：评估单hIL-12-Fc融合蛋白诱导PBMC分泌IFN-γ的能力
图17示出用以测定Fc(A107)、rhIL-12、双hIL-12-Fc和单hIL-12-Fc处理的PHA激活的PBMCs的IFN-γ分泌量的ELISA结果。
具体地，为测定实施例10中培养72小时的细胞上清液中的IFN-γ浓度，用人IFN-γ捕获抗体(赛默飞世尔科技)包被96孔板(赛默飞世尔科技，韩国)12小时，用PBST漂洗，并用1％BSA(1％牛血清白蛋白的PBS)在室温下封闭1小时。在用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗后，用1％BSA将实施例2中获得的培养上清液稀释5倍，并将100μl稀释液添加到每个孔中并在室温下孵育2小时。在用PBST漂洗后，每个孔用生物素缀合的IFN-γ检测抗体(赛默飞世尔科技)在室温下孵育1小时。在用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗后，每个孔用亲和素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)(赛默飞世尔科技)在室温下孵育30分钟，用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗，然后用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物(TMB，西格玛奥德里奇)处理。用微孔板阅读器测定405nm处的吸光度。
结果表明，单hIL-12-Fc诱导PBMCs分泌IFN-γ的能力与rhIL-12相似或更高。
实施例12：评估单mIL-12-Fc融合蛋白对IL-12受体的结合亲和力
将在实施例8中表达/纯化的单mIL-12-Fc对IL-12受体的结合亲和力与双mIL-12-Fc的结合亲和力进行比较分析。
图18示出了与双mIL-12-Fc相比，测定构建的单hIL-12-Fc对IL-12受体的结合亲和力的流式细胞结果。
具体地，据报道小鼠IL-12不仅与小鼠IL-12受体相结合，也与人IL-12受体结合。因此，以与实施例9中所述的相同方式进行分析。分析结果表明，双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc不与不表达IL-12受体的正常PBMCs结合，只与表达IL-12受体的PHA激活的PBMCs结合。因此，结果表明，单mIL-12-Fc与IL-12受体的结合亲和力与双mIL-12-Fc相同。
实施例13：评估单mIL-12-Fc诱导PBMC增殖的能力
图19示出了用于检查Fc(A107)、重组小鼠IL-12(rmIL-12)、双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc在PHA激活的PBMCs中的细胞增殖能力的WST-1细胞增殖测试的结果。
具体地，将实施例9中所述的相同方式用PHA激活的PBMCs(2x104细胞，50μL)添加到96孔板(SPL，韩国)，然后添加用含10％FBS的RPMI1640培养基连续稀释的50μL 50-0.4pMFc(A107)、rmIL-12、双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc。然后，在37℃，5％CO2下培养细胞72小时，以实施例10中所述相同方式进行WST测试。结果表明，单hIL-12-Fc具有与rmIL-12相似的PBMC增殖能力。
实施例14：评估单mIL-12-Fc抑制体内肿瘤生长的能力
在实施例13中评估了单mIL-12-Fc诱导PHA激活的PBMCs细胞增殖的能力。我们也检测了单mIL-12-Fc在体内是否也会出现同样的效果。
图20(A)和20(B)示出了单mIL-12-Fc对活体小鼠中100mm3肿瘤的肿瘤生长抑制活性的测量结果。
具体地，将4周大的雌性Balb/c小鼠(奈良生物技术，韩国)剃毛，将稀释在150μL的PBS中的CT26HER2/Neu结直肠癌细胞(1x 106细胞/小鼠)皮下移植到小鼠体内。将具有相似肿瘤体积(平均体积：100至120mm3)的小鼠随机分组，分别将Fc(A107)、rmIL-12(赛默飞世尔科技)、双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc腹腔注射到小鼠内，共注射6次(每周两次)，剂量相当于1μg的IL-12的等摩尔量。每周测量两次肿瘤，肿瘤体积(V)用以下公式计算：V＝长度x宽度2/2。
如图20(A)所示，与对照组相比，1μg的rmIL-12给药对肿瘤生长的抑制没有影响，但等摩尔浓度的单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc抑制了肿瘤生长。此外，如图20(B)所示，与对照组相比，单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc给药的小鼠体重几乎没有变化或没有变化，表明单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc没有毒性。
图21(A)、21(B)和21(C)示出了不同浓度的单mIL-12-Fc对活体小鼠中300mm3的肿瘤的肿瘤生长抑制活性的测量结果。
具体地，将4周大的雌性Balb/c小鼠(奈良生物技术，韩国)剃毛，将稀释在150μL的PBS中的CT26HER2/Neu结直肠癌细胞(1x 106细胞/小鼠)皮下移植到小鼠体内。将具有相似肿瘤体积(平均体积：300mm3)的小鼠随机分组，分别将双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc腹腔注射到小鼠内，共注射6次(每周两次)，剂量相当于0.1-2μg的rmIL-12的等摩尔浓度。每周测量两次肿瘤，肿瘤体积(V)用以下公式计算：V＝长度x宽度2/2。
如图21(A)、21(B)和21(C)所示，与双IL-12-Fc相比，单IL-12-Fc在剂量等于或小于1μg的IL-12时显示出抑制大肿瘤生长的高效果。在相当于0.25μg的IL-12等摩尔量的浓度下，双IL-12-Fc显示出抑制肿瘤生长的效果，但没有去除肿瘤。然而，在相同的给药方案下，单IL-12-Fc在40％的小鼠中显示出肿瘤去除效果。此外，在相当于0.5μg的IL-12等摩尔量的浓度下，双IL-12-Fc未能清除肿瘤，单IL-12-Fc即使只给药5次在73％的小鼠中清除了肿瘤。
实施例15：评估单mIL-12-Fc的体内毒性
图21(D)示出了测量体重变化的结果，以确定不同浓度单mIL-12-Fc给药的体内毒性。
具体地，如图21(A)所示，通过每周两次测量单mIL-12-Fc给药的小鼠的体重，观察体重是否会降低。结果表明，对照组中体重随着肿瘤体积的增加而增加，但所有浓度的双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc给药的小鼠体重与给药前相比没有下降。因此，我们确定单mIL-12-Fc不会导致体重下降，因此在体内没有明显毒性。
图21(D)示出了作为肝毒性标志物的丙氨酸转氨酶(ALT)的测量结果。
具体地，在最后一次给药后24小时，从图21(A)小鼠的面部静脉中取样血液。将血液在室温下放置2小时以诱导凝血，然后在8000rpm离心10分钟，收集上清液。为了测定血清中ALT的浓度，在末次IL-12Fc融合蛋白给药后24小时，从小鼠面部静脉取样血液。将血液在室温下放置2小时以诱导凝血，然后在8000rpm离心10分钟，收集上清液。为了测定血清中ALT的浓度，将用于ALT测量的底物溶液(丙氨酸和α-酮戊二酸的混合物)置于15mL试管中，在37℃恒温水浴中孵育5分钟。将从双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc给药的肿瘤移植小鼠中分离的血清稀释10倍，将200μL稀释液加入底物溶液中摇晃，在37℃恒温水浴中孵育30分钟。从恒温水浴中取出的试管加入1mL显色剂(2,4-二硝基苯-1-肼)，试管在室温下静置20分钟。然后，向试管中加入10mL 0.4N氢氧化钠溶液并混合，然后试管在室温下静置10分钟。用光电分光光度计(GeneQuant100，GE医疗)测量505nm处的吸光度。用添加标准曲线试剂代替血清制备标准曲线，将ALT转换成单位。结果表明，从双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc给药的肿瘤移植小鼠血液样品中的血清显示ALT活性与对照组或正常Balb/c小鼠血液样品中分离的血清相似。这表明，当将双mIL-12-Fc或单mIL-12-Fc以0.5μg或1μg IL-12的等摩尔浓度给予肿瘤移植小鼠时，不会引起肝毒性。
实施例16：评估单mIL-12-Fc体内诱导免疫细胞增殖的能力
如实施例15中所示，当将双mIL-12-Fc或单mIL-12-Fc以2μg IL-12的等摩尔浓度给药时，双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc都可以清除肿瘤，但当其以1μg的IL-12的等摩尔浓度给药时，单mIL-12-Fc对肿瘤生长的抑制作用明显高于双mIL-12-Fc。事实上，我们进行了分析以确定单mIL-12-Fc的高肿瘤生长抑制作用是否与具有IL-12受体的内在效应细胞(诸如NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞)数量的增加有关。
图22(A)示出了在图21(A)中最后一次给药后3天处死的小鼠脾脏中CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞数量增加的测量结果。
具体地，如图21(A)所示的处理后，在肿瘤移植后34天解剖小鼠脾脏，在培养皿中用宽网压碎，然后用10mL含2％FBS的培养基漂洗。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS漂洗所得细胞以制备脾细胞悬浮液，并用血球计对细胞数量进行计数。在脾淋巴细胞中加入APC、FITC、PE或PE-cy5缀合的抗CD45、抗CD3、抗CD4、抗CD8和抗CD49b抗体，4℃染色30分钟，冷PBS(pH7.4)漂洗，然后用流式细胞仪(FACS Calibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析。用点图法分析每个样本，将CD45+CD3+CD4+细胞群、CD45+CD3+CD8+细胞群和CD45+CD3-CD49b+细胞群分别定义为CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞，并计算其与总脾细胞的比例，并乘以血球仪计数的细胞数，分析单mIL-12-Fc给药后增加的CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞数。
因此，可以看出，与对照组相比，单mIL-12-Fc以浓度依赖的方式增加了肿瘤移植小鼠的CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量。然而，双mIL-12-Fc仅在与0.5μg的IL-12的等摩尔量对应的浓度下给药的组中增加了CD8+T细胞的数量，并且在与1μg的IL-12的等摩尔量对应的浓度下给药的组中没有增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量。与先前的研究结果(Cerwenkaand Lanier,2016；Schreiber et al.,2011)一致，在肿瘤移植小鼠中，NK细胞不形成记忆性细胞，在肿瘤移植后34天，单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc给药组的NK细胞数量与对照组相似。结果表明，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc引起了更大的CD4+T细胞和CD8+T细胞的扩张，从而导致了更强的肿瘤生长抑制作用。
根据报告(Schreiber et al.,2011)，浸润肿瘤的适应性免疫细胞(CD4+T细胞和CD8+T细胞)数量的增加对抑制肿瘤生长很重要，因此我们分析了单mIL-12-Fc是否会增加浸润肿瘤的适应性免疫细胞数量。当单mIL-12-Fc给药6次时，许多小鼠没有肿瘤，因此，将单mIL-12-Fc给药3次，然后分析浸润小鼠肿瘤的免疫细胞数。
图22(B)显示了在图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠中浸润肿瘤的总免疫细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞数量的测量结果。
具体地，如图21(A)所示的处理后，在肿瘤移植后24天解剖小鼠肿瘤并称重。然后在培养皿中用宽网压碎并用胶原酶(100μg/mL)消化，在10mL含2％FBS的培养基中以50g离心5分钟以去除薄壁组织。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS漂洗所得细胞以制备细胞悬浮液，并用血球计对细胞数量进行计数。向从肿瘤中分离的细胞内加入APC、FITC或PE-cy5缀合的抗CD45、抗CD3、抗CD4和抗CD8，4℃染色30分钟，冷PBS(pH7.4)漂洗，然后用流式细胞仪(FACS Calibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析。用点图法分析每个样本，将CD45+细胞群、CD45+CD3+CD4+细胞群、CD45+CD3+CD8+细胞群和CD45+CD3-CD49b+细胞群分别定义为总肿瘤浸润免疫细胞、肿瘤浸润CD4+T细胞和肿瘤浸润CD8+T细胞。计算这些细胞与整个肿瘤中分离的细胞比例，并乘以血球仪计数的细胞数，分析单mIL-12-Fc给药后增加的肿瘤浸润CD4+T细胞和肿瘤浸润CD8+T细胞数。
因此，可以看出，与对照组相比，双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc以浓度依赖的方式增加了浸润肿瘤的总免疫细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量。在等摩尔浓度下，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc显著增加了浸润肿瘤的总免疫细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量。结果表明，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc造成了肿瘤中的CD4+T细胞和CD8+T细胞的更大的浸润，说明其具有更强的肿瘤生长抑制作用。
实施例17：评估单mIL-12-Fc对体内免疫细胞细胞因子分泌和增加细胞毒性的作
用
已知IL-12可通过增加T细胞和NK细胞的IFN-γ分泌来抑制癌细胞的生长(Trinchieri,2003)。此外，IL-12通过增强细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞对癌细胞的直接细胞毒性作用，显示出抗癌作用。因此，我们分析以确定单IL-12-Fc的高抗癌作用是否归因于肿瘤移植小鼠血清中IFN-γ浓度的增加以及细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞对癌细胞的直接细胞毒作用的增强。
图23(A)示出了在图21(A)中最后给药后24小时从小鼠面部静脉收集的血液样本中分离的血清IFN-γ浓度的ELISA测量结果。
具体地，在图20(A)中的mIL-12融合蛋白最后一次给药后24小时，从小鼠的面部静脉中取样血样。血液在室温下放置2小时以诱导凝血，然后在8000rpm离心10分钟，收集上清液。为测定血清中的IFN-γ浓度，用小鼠IFN-γ捕获抗体包被96孔板(赛默飞世尔科技)12小时，用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗，并用1％BSA(1％牛血清白蛋白的PBS)在室温下封闭1小时。在用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗后，用1％BSA将血清稀释10倍，并在室温下孵育2小时。在用PBST漂洗后，每个孔用生物素缀合的小鼠IFN-γ检测抗体(赛默飞世尔科技)在室温下孵育1小时。在用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗后，每个孔用亲和素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)(赛默飞世尔科技)在室温下孵育30分钟，用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗，然后用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物(TMB，西格玛奥德里奇)处理。用微孔板阅读器测定450nm处的吸光度。如图23(A)所示，与对照组相比，双mIL-12-Fc给药的小鼠血清IFN-γ浓度并未上升。然而，可以观察到，与对照组相比，接受1mg rmIL12等摩尔量的剂量的单mIL12-Fc治疗的小鼠血清IFN-γ水平有增加。此外，结果表明，单mIL12-Fc的肿瘤形成抑制作用是因为单mIL12-Fc增加了已知具有抑制某些癌细胞增殖作用的IFN-γ的分泌。
在双mIL12-Fc治疗的肿瘤移植小鼠中，IFN-γ的血清水平低(图23(A))。因此，为了确定双mIL12-Fc是否具有较低的诱导NK细胞和T细胞分泌IFN-γ的能力，我们在单次单mIL12-Fc和双mIL12-Fc给药后，在指定时间点测定了血清IFN-γ的浓度。
图23(B)示出了用CT26HER2/Neu结直肠癌细胞移植的Balb/c小鼠在单次单mIL12-Fc和双mIL12-Fc给药后，在不同的指定时间点测定血清中IFN-γ浓度ELISA测量结果。
具体地，当用CT26HER2/Neu结直肠癌细胞移植的Balb/c小鼠的肿瘤体积达到300mm3时，将与1μg rmIL-12等摩尔浓度的单mIL12-Fc和双mIL12-Fc进行腹腔给药。1、3和5天后，从小鼠的面部静脉中抽取血样。血液在室温下放置2小时以诱导凝血，然后在8000rpm离心10分钟，收集上清液。为测定血清中的IFN-γ浓度，用小鼠IFN-γ捕获抗体包被96孔板(赛默飞世尔科技)12小时，用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗，并用1％BSA(1％牛血清白蛋白的PBS)在室温下封闭1小时。在用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗后，用1％BSA将血清稀释10倍，并在室温下孵育2小时。在用PBST漂洗后，每个孔用生物素缀合的小鼠IFN-γ检测抗体(赛默飞世尔科技)在室温下孵育1小时。在用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗后，每个孔用亲和素缀合的辣根过氧化物酶(HRP)(赛默飞世尔科技)在室温下孵育30分钟，用PBST(0.1％Tween-20的PBS)漂洗，然后用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺底物(TMB，西格玛奥德里奇)处理。用微孔板阅读器测定450nm处的吸光度。如图23(B)所示，在肿瘤移植小鼠中，5天内双mIL12-Fc给药组显示血清IFN-γ浓度与单mIL12-Fc组相似，表明双mIL12-Fc在诱导效应细胞分泌IFN-γ的能力上没有内在缺陷。
图23(C)示出了细胞毒性T细胞对CT26HER2/Neu癌细胞的细胞毒性作用的测量结果，细胞从图21(A)中最后给药后3天处死的小鼠脾脏中进行分离。
具体地，图21(A)中用细胞因子末次给药后72小时，处死小鼠解剖小鼠脾脏，在含有70微米宽网和PBS的60mm培养皿中压碎。向离心分离得到的细胞中加入红细胞溶解缓冲液溶解红细胞。随后，用PBS漂洗细胞，并用APC缀合的抗CD3抗体(赛默飞世尔科技)和PE缀合的抗CD8抗体在4℃孵育30分钟。用PBS漂洗细胞后，用FACS Aria III(BD生物科学，韩国)分离细胞毒性T细胞(CD3+CD8+)。为了测定细胞毒性T细胞对靶向CT26HER2/Neu癌细胞的细胞毒性作用，用钙黄绿素AM(赛默飞世尔科技公司，10μM)对CT26HER2/Neu癌细胞进行染色。CT26HER2/Neu(2x 106)用2mL DPBS悬浮，与2μL的钙黄绿素AM(10mM)混合，然后在37℃、5％CO2下孵育45分钟。用10mL含有10％FBS的RPMI1640漂洗后，以每孔2x 104细胞的密度将细胞添加到96孔板的每个孔中，并将细胞毒性T细胞(1x 105/100μL/孔)添加到每个孔中，并在37℃、5％CO2下孵育4小时。用流式细胞术分析呈绿色荧光的CT26HER2/Neu癌活细胞和不呈绿色荧光的CT26HER2/Neu癌死细胞，并以百分比表示细胞毒性T细胞的细胞毒性效应。结果表明，与双mIL-12-Fc给药的肿瘤移植小鼠或从对照组分离的细胞毒性T细胞相比，单mIL-12-Fc给药的肿瘤移植小鼠分离的细胞毒性T细胞对靶向CT26HER2/Neu癌细胞具有更高的细胞毒性作用。此外，结果显示单mIL-12-Fc对肿瘤形成的抑制作用是由于某些细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用。
图23(D)示出了用表达肿瘤抗原的CT26HER2/Neu癌细胞和不表达肿瘤抗原的4T1细胞测量从图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏中分离出的细胞毒性T细胞的细胞毒性效应的结果，以确定通过向肿瘤移植小鼠进行单IL-12-Fc给药增加的细胞毒性T细胞的细胞毒性作用是否具有肿瘤抗原特异性。
具体地，图20(A)中用单IL-12-Fc第三次给药后72小时，处死小鼠解剖小鼠脾脏，在含有70微米宽网和PBS的60mm培养皿中压碎。为了测定细胞毒性T细胞对靶向CT26HER2/Neu癌细胞和非靶向4T1细胞的细胞毒性作用，用钙黄绿素AM(赛默飞世尔科技公司，10μM)对CT26HER2/Neu癌细胞和4T1细胞按照图21(C)中使用的方法进行染色。用10mL含有10％FBS的RPMI1640漂洗后，以每孔2x 104细胞的密度将细胞添加到96孔板的每个孔中，并将细胞毒性T细胞(1x 105/100μL/孔)添加到每个孔中，并在37℃、5％CO2下孵育4小时。用流式细胞术分析呈绿色荧光的CT26HER2/Neu癌活细胞和不呈绿色荧光的CT26HER2/Neu癌死细胞，并以百分比表示细胞毒性T细胞的细胞毒性效应。结果表明，单IL-12-Fc给药增加的细胞毒性T细胞的细胞毒性效应是靶细胞特异的。
图23(E)示出了从图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏中分离的自然杀伤细胞对CT26HER2/Neu癌细胞的细胞毒性作用测量结果。
具体地，图21(A)中用细胞因子第三次给药后3天，处死小鼠解剖小鼠脾脏，在含有70微米宽网和PBS的60mm培养皿中压碎。向离心分离得到的细胞中加入红细胞溶解缓冲液溶解红细胞。随后，用PBS漂洗细胞，并用APC缀合的抗CD3抗体(赛默飞世尔科技)和PE缀合的抗CD8抗体在4℃孵育30分钟。用PBS漂洗细胞后，用FACS Aria III(BD生物科学，韩国)分离自然杀伤细胞(CD3-CD49b+)。为了测定自然杀伤细胞对靶向CT26HER2/Neu癌细胞的细胞毒性作用，用钙黄绿素AM(赛默飞世尔科技公司，10μM)对CT26HER2/Neu癌细胞进行染色。CT26HER2/Neu(2x 106)用2mL的DPBS悬浮，与2μL的钙黄绿素AM(10mM)混合，然后在37℃、5％CO2下孵育45分钟。用10mL含有10％FBS的RPMI1640漂洗后，以每孔2x 104细胞的密度将细胞添加到96孔板的每个孔中，并将自然杀伤细胞(1x 105/100μL/孔)添加到每个孔中，并在37℃、5％CO2下孵育4小时。用流式细胞术分析呈绿色荧光的CT26HER2/Neu癌活细胞和不呈绿色荧光的CT26HER2/Neu癌死细胞，并以百分比表示自然杀伤细胞的细胞毒性效应。结果表明，与双mIL-12-Fc给药的肿瘤移植小鼠或从对照组分离的细胞毒性T细胞相比，单mIL-12-Fc给药的肿瘤移植小鼠分离的自然杀伤细胞对靶向CT26HER2/Neu癌细胞具有更高的细胞毒性作用。此外，结果显示单mIL-12-Fc对肿瘤形成的抑制作用是由于某些自然杀伤细胞对肿瘤细胞的直接细胞毒性作用。
实施例18：评估单mIL-12-Fc在体内形成效应性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的
能力
通过效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的产生来评价肿瘤移植小鼠的适应性免疫的生成。我们测量了单mIL-12-Fc对肿瘤的清除作用是否与效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的产生有关。
图24(A)、24(B)和24(C)示出了测量荷瘤小鼠用单mIL-12-Fc给药时产生的效应性CD8+T细胞、效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量的结果。
具体地，如图21(A)所示的处理后，在肿瘤移植后34天解剖小鼠脾脏，在培养皿中用宽网压碎，然后用10mL含2％FBS的培养基漂洗。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS漂洗所得细胞以制备脾细胞悬浮液，并用血球计对细胞数量进行计数。在脾淋巴细胞中加入APC、FITC、PE或PE-cy5缀合的抗CD3、抗CD8、抗CD62L和抗IL-7受体(IL-7R)抗体，4℃染色30分钟，冷PBS(pH7.4)漂洗，然后用流式细胞仪(FACS Calibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析。用点图法分析每个样本，将CD3+CD8+CD62LlowIL-7Rlow细胞群、CD3+CD8+CD62LlowIL-7Rhi细胞群和CD3+CD8+CD62LhiIL-7Rhi细胞群分别定义为效应性CD8+T细胞、效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞，并计算其与总脾细胞的比例，并乘以血球仪计数的细胞数，分析单mIL-12-Fc给药后增加的效应性CD8+T细胞、效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞数。
因此，可以看出，与对照组相比，单mIL-12-Fc以浓度依赖的方式增加了肿瘤移植小鼠的效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量。然而，双mIL-12-Fc仅在与0.5μgIL-12的等摩尔量对应的浓度下给药的组中增加了效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量，并且在与1μg IL-12的等摩尔量对应的浓度下给药的组中没有增加效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量。因此，结果表明，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc对肿瘤形成的抑制作用更高，这是由于效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量增加所致。
图24(D)示出了在图21(A)中1μg单IL-12-Fc给药后120天将CT26HER2/Neu癌细胞重新移植到存活的小鼠中并测量小鼠中的肿瘤体积变化所获得的结果。
具体地，在图21(A)中的雌性Balb/c小鼠(奈良生物技术，韩国)在1μg单IL-12-Fc末次给药后120天，将存活小鼠剃毛，将稀释在150μl PBS中的CT26HER2/Neu结直肠癌细胞(1x106细胞/小鼠)皮下移植到小鼠体内。在不进行1μg单IL-12-Fc额外给药的同时，每周测量两次肿瘤，肿瘤体积(V)用以下公式计算：V＝长度x宽度2/2。因此，可以看出，与对照组相比，1μg单IL-12-Fc给药后存活的小鼠中的肿瘤从11天开始减少。因此，我们发现，当对肿瘤移植的小鼠使用单IL-12-Fc给药时，它会产生效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞，因此即使肿瘤再次移植到小鼠体内，也会被清除。
实施例19：评估单mIL-12-Fc在体内形成记忆前体效应性CD8+T细胞的能力
在实施例16和18中，观察到双mIL-12-Fc对肿瘤移植小鼠增加CD8+T细胞、效应记忆性CD8+T细胞和中央记忆性CD8+T细胞数量的作用低于单mIL-12-Fc。据报道，在激活的CD8+T细胞直接破坏肿瘤细胞的效应器阶段后，效应性CD8+T细胞部分分化为记忆前体效应细胞(MPECs)，然后分化为记忆性CD8+T细胞，大部分分化为短寿命效应细胞(SLECs)。因此，我们进行了分析，以确定双mIL-12-Fc给药激活的CD8+T细胞是否会分化为短寿命效应细胞，因此产生的记忆性CD8+T细胞的数量很小以致它们无法清除肿瘤。
图24(E)示出了图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏CD8+T细胞中记忆前体效应细胞(KLRG1-IL-7R+)和短寿命效应细胞(KLRG1+IL-7R-)比例的分析结果。
具体地，如图21(A)所示的处理后，在肿瘤移植后24天解剖小鼠脾脏，在培养皿中用宽网压碎，然后用10mL含2％FBS的培养基漂洗。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS漂洗所得细胞以制备脾细胞悬浮液。在脾淋巴细胞中加入APC、FITC、PE或PE-cy5缀合的抗CD3、抗CD8、抗KLRG1和抗IL-7受体(IL-7R)抗体，4℃染色30分钟，冷PBS(pH7.4)漂洗，然后用流式细胞仪(FACS Calibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析。用点图法分析每个样本，将CD3+CD8+KLRG1-IL-7R+细胞群和CD3+CD8+KLRG1_+IL-7R-细胞群分别定义为记忆前体效应细胞和短寿命效应细胞，并分析其与总脾细胞的比例。
因此，可以看出，与对照组相比，单mIL-12-Fc以浓度依赖的方式增加了肿瘤移植小鼠的记忆前体效应细胞的比例。然而，与对照相比，双mIL-12-Fc没有增加的记忆前体效应细胞的比例，而是增加短寿命效应细胞的数量。因此，结果表明，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc通过促进记忆前体效应细胞的生成，显著增加了效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量，说明其对清除肿瘤有较高的作用。
实施例20：评估单mIL-12-Fc对涉及诱导记忆细胞分化诱导的转录因子表达的影
响
据报道，当CD8+T细胞被高浓度的IL-12给药或通过频繁IL-12给药激活2天或更长时间后，使CD8+T细胞分化为短寿命效应细胞的转录因子T-bet的表达增加，使CD8+T细胞分化为记忆前体效应细胞的转录因子脱中胚蛋白(Eomes)的表达降低。因此，我们进行了分析，以确定单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc是否能差异性调节CD8+T细胞中T-bet和Eomes的表达，从而改变CD8+T细胞分化为短寿命效应细胞的比例。
图25(A)和25(B)示出了测量在图21(A)中第三次给药后3天处死的小鼠脾脏细胞中CD8+T细胞(表现出抑制记忆细胞分化的T-bet的高表达)和CD8+T细胞(表现出促进记忆细胞分化的Eomes的低表达)比例的流式细胞分析结果图。
具体地，如图21(A)所示的处理后，在肿瘤移植后24天解剖小鼠脾脏，在培养皿中用宽网压碎，然后用10mL含2％FBS的培养基漂洗。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS漂洗所得细胞以制备脾细胞悬浮液。脾淋巴细胞用PE-cy5或FITC缀合的抗CD3和抗CD8抗体在4℃染色30分钟，并用冷PBS(pH7.4)漂洗。细胞随后用Foxp3/转录因子染色缓冲液套装(赛默飞世尔科技)(是一种核内转录因子染色试剂)固定和透膜。然后细胞用PE或efluor 660缀合的抗T-bet或抗Eomes抗体在4℃染色30分钟，并在透膜缓冲液中用流式细胞仪(FACS Calibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析流式细胞数据。用点图法分析每个样本，并分析CD3+CD8+T-bethigh细胞群和CD3+CD8+Eomes+T-betlow细胞群的比例。因此，可以看出，与对照组相比，单mIL-12-Fc以浓度依赖的方式降低了CD3+CD8+T-bethigh细胞群比例，并增加了CD3+CD8+Eomes+T-betlow细胞群比例。肿瘤移植小鼠的记忆前体效应细胞的比例。然而，双mIL-12-Fc仅在与0.5μgIL-12的等摩尔量对应的浓度下给药的组中降低了CD3+CD8+T-bethigh细胞群比例并增加了组内CD3+CD8+Eomes+T-betlow细胞群比例。此外，在用与0.5μg IL-12的等摩尔量对应的浓度的双mIL-12-Fc给药的组中，双mIL-12-Fc并未显示降低CD3+CD8+T-bethigh细胞群比例或增加CD3+CD8+Eomes+T-betlow细胞群比例的效果。因此，可以看出，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc通过降低CD3+CD8+T-bethigh细胞群的比例，增加CD3+CD8+Eomes+T-betlow细胞群的比例，从而显著增加效应记忆性CD8+T细胞和记忆性CD8+T细胞的数量，具有更高的肿瘤去除效果。
已知在T细胞受体信号和共刺激信号存在的情况下，当用炎症细胞因子如IL-12刺激CD8+T细胞时，STAT4的磷酸化增加，磷酸化的STAT4(pSTAT4)迁移到细胞核并与T-bet增强子结合，从而增加T-bet的表达。因此，我们进行了分析，以确定当以1μg IL-12等摩尔量的对应浓度给予双mIL-12-Fc时发生的CD8+T细胞分化为短寿命效应细胞是否是因为与单mIL-12-Fc相比，当以1μg IL-12等摩尔量的对应浓度给予双mIL-12-Fc，肿瘤移植小鼠的肿瘤引流淋巴结中T细胞被活化增加了pSTAT4和T-bet的表达。
图25(C)示出了当用CT26HER2/Neu癌细胞移植的Balb/c小鼠肿瘤体积达到300mm3时，在腹腔注射1μg rmIL-12等摩尔浓度的双mIL-12-Fc和单mIL-12-Fc后24小时从肿瘤引流(腹股沟)淋巴结分离的CD8+细胞中测量磷酸化STAT4的表达水平的流式细胞分析结果。
具体地，如图23(B)所述，当用CT26HER2/Neu结直肠癌细胞移植的Balb/c小鼠的肿瘤体积达到300mm3时，将与1μg rmIL-12等摩尔浓度的双mIL12-Fc和单mIL12-Fc进行腹腔给药。24小时后，分离小鼠肿瘤引流淋巴结，在培养皿中用宽网粉碎，然后用10mL含2％FBS的培养基漂洗。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS漂洗所得细胞以制备细胞悬浮液。引流淋巴结细胞用PE-cy5或FITC缀合的抗CD3和抗CD8抗体在4℃染色30分钟，用冷PBS(pH7.4)漂洗，并用冷甲醇固定。细胞随后冷PBS(pH7.4)漂洗，用APC缀合的抗pSTAT4抗体在4℃染色30分钟，用冷PBS(pH7.4)漂洗，随后用流式细胞仪(FACSCalibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析。用点图法分析每个样本，并比较CD3+CD8+T细胞中pSTAT4的表达水平。因此，与单mIL-12-Fc相比，双mIL-12-Fc在当肿瘤移植小鼠的肿瘤引流淋巴结中的CD8+T细胞被激活时，显示了增加pSTAT4表达的作用。
图25(D)示出测量图25(C)中单次腹腔注射后72小时肿瘤引流淋巴结中CD8+T细胞(表达抑制记忆细胞分化的T-bet)比例的流式细胞结果。
具体地，如图23(B)所述，当用CT26HER2/Neu结直肠癌细胞移植的Balb/c小鼠的肿瘤体积达到300mm3时，将与1μg rmIL-12等摩尔浓度的双mIL12-Fc和单mIL12-Fc进行腹腔给药。72小时后，分离小鼠肿瘤引流淋巴结，在培养皿中用宽网粉碎，然后用10mL含2％FBS的培养基洗涤。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS洗涤所得细胞以制备细胞悬浮液。引流淋巴结细胞用PE-cy5或FITC缀合的抗CD3和抗CD8抗体在4℃染色30分钟，用冷PBS(pH7.4)漂洗，用Foxp3/转录因子染色缓冲液套装(赛默飞世尔科技)(是一种核内转录因子染色试剂)固定和透膜。然后细胞用PE或APC缀合的抗T-bet抗体在4℃染色30分钟，并在透膜缓冲液中用流式细胞仪(FACS Calibur，BD生物科学)和Flow jo(赛默飞世尔科技)分析。用点图法分析每个样本，并分析表达T-bet的CD3+CD8+T细胞群的比例。因此，与单mIL-12-Fc相比，双mIL-12-Fc在当肿瘤移植小鼠的肿瘤引流淋巴结中的CD8+T细胞被激活时，显示了增加T-bet表达的作用。因此，我们发现，当以1μg IL-12等摩尔量的对应浓度给予双mIL-12-Fc时发生的CD8+T细胞分化为短寿命效应细胞是因为单mIL-12-Fc相比，当肿瘤移植小鼠的肿瘤引流淋巴结中T细胞被活化时，双mIL-12-Fc给药增加了pSTAT4和T-bet的表达。
图25(E)和25(F)示出了是否当单mIL-12-Fc和抗Fc抗体交叉反应时，如表达两个L-12分子的双mIL-12-Fc，两个L-12分子可以刺激CD8+T细胞，而细胞中pSTAT4和T-bet的表达将增加到类似于用双mIL-12-Fc处理细胞时所显示的水平的测量结果。
具体地，从正常Balb/c小鼠上分离脾脏和肿瘤引流淋巴结，在培养皿中用宽网粉碎，然后用10mL含2％FBS的培养基洗涤。随后，向其中添加1mL红细胞溶解缓冲液以溶解红细胞，并且用PBS洗涤所得细胞以制备细胞悬浮液。引流淋巴结细胞用PE-cy5或FITC缀合的抗CD3和抗CD8抗体在4℃染色30分钟，用冷PBS(pH7.4)漂洗，用抗PE微珠(美天旎生物技术)孵育15分钟，用MACS分离器和LS柱(美天旎生物技术)分离CD8+T细胞。将100μL的0.5μg/mL的抗CD3抗体添加到96孔圆底板的每个孔中，然后在4℃孵育12小时，并用PBS漂洗以去除未附于该板上的抗CD3抗体，并且将50μL的2μg/mL的抗CD28抗体添加到每个孔中。随后，将单mIL-12-Fc和双mIL-12-Fc与不同浓度的抗Fc抗体在4℃下反应30分钟，然后以20pM IL-12的等摩尔浓度添加到每个孔中。随后，向每个孔中加入CD8+T细胞(4x 104/孔)并在37℃孵育3小时以测量pSTAT4的表达，孵育3天以测量T-bet的表达。为测量pSTAT4和T-bet的表达，根据图25(C)和25(D)所述方法对细胞进行染色，然后通过流式细胞术进行分析。用点图法分析每个样本，并比较CD8+T细胞中pSTAT4或T-bet的表达水平。结果表明，当单mIL-12-Fc与抗Fc抗体交叉反应使得两个IL-12分子可以刺激CD8+T细胞时，细胞中pSTAT4和T-bet的表达水平可提高到用双mIL-12-Fc处理时的水平。
综上所述，如图26所示，与双mIL-12-Fc相比，单mIL-12-Fc诱导CD8+T细胞中pSTAT4和T-bet的低表达，使CD8+T细胞能够分化为记忆前体效应性细胞，然后分化为效应记忆性细胞和中央记忆性细胞。因此，单mIL-12-Fc即使在低浓度(相当于0.5μg IL-12的等摩尔量)下也能从肿瘤移植小鼠中清除肿瘤，从而延长小鼠的寿命。然而，双mIL-12-Fc诱导CD8+T细胞中pSTAT4和T-bet的高表达，从而使细胞分化为短寿命效应细胞，从而阻止记忆性细胞的发展。因此，当双mIL-12-Fc以与单mIL-12-Fc等摩尔浓度给药时，它不能完全从肿瘤移植小鼠中清除肿瘤。因此，只有当双mIL-12-Fc以更高浓度(相当于2μgIL-12的等摩尔量)给药，并且细胞毒性CD8+T细胞在直接破坏肿瘤细胞的效应物阶段扩张时，双mIL-12-Fc才能清除肿瘤。
工业实用性
根据本发明的异二聚体融合蛋白的优点在于，它可以保留由两个以上不同亚基蛋白组成的自然生成的生理活性蛋白的活性，从而通过形成组装蛋白来表现生理活性。因为蛋白质的每个亚基可以单独融合到免疫球蛋白Fc异二聚体的每条链上，这样融合的蛋白质就可以最大程度地保持自然生成的形式和结构。此外，由于Fc异二聚体介导的长半衰期，使得Fc异二聚体融合蛋白中所含生理活性蛋白的体内半衰期显著延长，从而使其在体内的生理活性得以持久。
此外，本发明的Fc异二聚体融合蛋白的优点在于，无需优化额外的纯化工艺，即可很容易地产生自然结构的Fc异二聚体融合蛋白。
尽管已参照具体特征对本发明进行了详细描述，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅用于优选实施例，并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求和其等效物来界定。
Claims (17)
1.一种Fc异二聚体融合蛋白，包含免疫球蛋白Fc(片段可晶体化)对的第一Fc区和第二Fc区，以及生理活性蛋白，
其中所述生理活性蛋白包含两个以上亚基，其中所述两个以上不同亚基通过形成蛋白质复合物展现生理活性，
其中所述生理活性蛋白的两个以上亚基连接于第一Fc区和/或第二Fc区的一个以上N端或C端，
其中突变第一Fc区和第二Fc区的CH3结构域以促进Fc异二聚体形成。
2.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述生理活性蛋白的两个以上亚基中的一个仅连接于第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端，生理活性蛋白的其余亚基连接于所述第一和第二Fc区的另一个N端或C端。
3.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述生理活性蛋白的两个以上不同亚基分别连接于每个第一Fc区和第二Fc区的每个N端和/或C端。
4.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述生理活性蛋白选自由白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-23(IL-23)、白细胞介素-27(IL-27)、白细胞介素-35(IL-35)和促卵泡激素(FSH)组成的组。
5.如权利要求4中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述生理活性蛋白是IL-12。
6.如权利要求5中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述IL-12的p35或p40亚基仅连接于所述第一Fc区或第二Fc区的N端或C端的任何一端，另一个亚基通过连接体与所述第一Fc区和第二Fc区的另一个的N末端或C末端的任一末端连接。
7.如权利要求5中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述IL-12的p35或p40亚基分别连接于每个第一Fc区和第二Fc区的每个N端和/或C端。
8.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中每个第一Fc区和第二Fc区衍生自选自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD和IgE组成的组中的Fc区。
9.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述第一Fc区和第二Fc区包含在由人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD和IgE组成的全抗形式中。
10.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述第一Fc区或第二Fc区CH3结构域的突变包括从以下组中选择的一个以上突变(其中突变位点按照欧盟索引编号)：
(1)第一Fc区CH3结构域K370位点氨基酸残基的K370E、K370R、K370M、K370D或K370H的取代；
(2)第二Fc区CH3结构域E357位点氨基酸残基的E357N、E357D、E357A、E357I、E357G或E357M的取代，以及第二Fc区CH3结构域S364位点氨基酸残基的S364T或S364W的取代；
(3)第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的K409W的取代；以及
(4)第二Fc区CH3结构域F405位点氨基酸残基的F405T的取代，和第二Fc区CH3结构域D399位点氨基酸残基的D399V的取代。
11.如权利要求1中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述第一Fc区或第二Fc区CH3结构域的突变包括从以下组中选择的一个以上突变(其中突变位点按照欧盟索引编号)：
(1)第一Fc区CH3结构域K360位点氨基酸残基的K360E的取代；
(2)第二Fc区CH3结构域E347位点氨基酸残基的E347R的取代；
(3)第一Fc区CH3结构域K409位点氨基酸残基的K409W的取代；以及
(4)第二Fc区CH3结构域F405位点氨基酸残基的F405T的取代，和第二Fc区CH3结构域D399位点氨基酸残基的D399V的取代。
12.如权利要求10或11中所述Fc异二聚体融合蛋白，其中所述第一Fc区和第二Fc区中的所述CH3结构域进一步包括下述残基(其中位点按照欧盟索引编号)：
(i)第一Fc区CH3结构域Y349位点被半胱氨酸(C)取代；以及
(ii)第二Fc区CH3结构域S354位点被半胱氨酸(C)取代。
13.一种药物组合物，其包含如权利要求1至12中任一项所述的Fc异二聚体融合蛋白。
14.如权利要求13中所述的药物组合物，其中包含在Fc异二聚体融合蛋白中的生理活性蛋白是IL-12(IL-12)。
15.如权利要求14中所述的药物组合物，其被用于治疗癌症。
16.如权利要求15中所述的药物组合物，其中所述癌症选自由结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、小肠癌、食管癌、宫颈癌、肺癌、淋巴瘤和血癌组成的组。
17.如权利要求15中所述的药物组合物，其被用于与其他抗癌药物的联合治疗。
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