CN105229032A - 人源化抗cd134(ox40)抗体及其应用 - Google Patents

人源化抗cd134(ox40)抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105229032A
CN105229032A CN201480028619.1A CN201480028619A CN105229032A CN 105229032 A CN105229032 A CN 105229032A CN 201480028619 A CN201480028619 A CN 201480028619A CN 105229032 A CN105229032 A CN 105229032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
seqidno
people
human
aminoacid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480028619.1A
Other languages
English (en)
Inventor
P·J·西蒙斯
L·布恩
J·罗
R·布雷斯基
M·戈德伯格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BIOCEROS BV
Janssen Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
BIOCEROS BV
Ortho McNeil Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47891522&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN105229032(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by BIOCEROS BV, Ortho McNeil Janssen Pharmaceuticals Inc filed Critical BIOCEROS BV
Publication of CN105229032A publication Critical patent/CN105229032A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/74—Inducing cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明提供了特异性结合人CD134的抗体。抗人CD134抗体特异性结合人CD134的胞外结构域，包括人CD134上的非-OX40配体(OX40L)结合结构域，其在例如激活的人常规效应CD4和/或CD8？T淋巴细胞(Teff)及在激活的人抑制性调节性CD4？T淋巴细胞(Treg)上表达。人源化抗人CD134抗体对于癌症治疗是有效的(例如赋予Teff抗癌效应功能和/或抑制Treg抑制性功能)。

Description

人源化抗CD134(OX40)抗体及其应用
本申请要求2013年3月18日递交的EP13159794.0的优先权。
技术领域
本发明涉及抗体、这些抗体的应用，特别涉及结合CD134的人源化抗体，用于治疗癌症。
背景技术
增强抗肿瘤T细胞功能代表一种独特的治疗癌症的方法。有显著证据表明肿瘤细胞通过诱导主要由调节性T淋巴细胞(Treg；Quezdaetal.ImmunolRev2011；241:104-118)介导的主动免疫耐受性，“逃避”免疫系统。因此，效应(即直接或间接摧毁肿瘤细胞)T淋巴细胞(Teff)与致耐受性(即阻抑Teff效应子功能和存活)的Treg之间的平衡看起来是有效抗肿瘤免疫治疗的关键。换句话说，有效的抗肿瘤免疫应答可以通过增强肿瘤特异性Teff的效应子功能和/或通过减弱肿瘤特异性Treg的阻抑功能而获得。已经示出介导这些应答的关键受体是CD134(OX40)受体。(Sugamura,K,Ishii,N,Weinberg,A.TherapeutictargetingoftheeffectorT-cellco-stimulatorymoleculeOX40.NatureRevImm2004；4:420-431)。
CD134(也称作OX40、TNFRSF4和ACT35)是肿瘤坏死因子受体超家族的成员。这种CD134表面共刺激受体在激活的T淋巴细胞上表达，并在它们的存活和功能中发挥重要作用。在各种人恶性肿瘤中及在癌症患者的引流淋巴结中已经证实表达T淋巴细胞的CD134的存在(Ramstadetal.AmJSurg2000；179:400-406；Vettoetal.AmJSurg1997；174:258-265)。
携带肿瘤的小鼠中的小鼠CD134受体的体内连接(通过可溶的小鼠OX40配体(OX40L)-免疫球蛋白融合蛋白或者小鼠OX40L模拟物如抗小鼠CD134-特异性抗体)增强抗肿瘤免疫性，在各种鼠恶性肿瘤细胞系的小鼠模型中导致无肿瘤存活，所述鼠恶性肿瘤细胞系例如淋巴瘤、黑素瘤、肉瘤、结肠癌、乳腺癌和神经胶质瘤(Sugamuraetal.NatureRevImm2004；4:420-431)。
已经建议通过使用OX40R结合剂结合OX40R而增强哺乳动物对抗原的免疫应答(国际专利公开No.WO99/42585)。尽管文献通常称作OX40-结合剂，但是重点是使用OX40L或其一部分；抗-OX40抗体的公开是在其等价于OX40L的背景中。事实上，当Weinberg小组(Weinbergetal.JImmunther2006；29:575-585)将研究转化为使用非人灵长目动物研究时，他们再次有意地选择结合OX40L-结合位点及通常模拟OX40L的抗体。
Al-Shamkhani等(EurJChem1996；26:1695-1699)使用称作OX86的不阻断OX40L结合的抗-OX40抗体，以研究OX40在激活的小鼠T细胞上的不同表达；Hirschhorn-Cymerman等(JExpMed2009；206:1103-1116)在小鼠模型中同时使用OX86及环磷酰胺作为潜在的化学免疫治疗。然而，预期OX86不结合人OX40，并且当选择在人体有效的抗体时，鉴于Weinberg的研究人们会选择确实在OX40L-结合位点结合的抗体。
在严重联合免疫缺陷(SCID)鼠中人CD134受体的体内连接(通过与人CD134上OX40L结合结构域相互作用的抗人CD134特异性抗体；US2009/0214560A1)增强抗肿瘤免疫性，导致各种人恶性肿瘤细胞系如淋巴瘤、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌的肿瘤生长抑制。
人体中人CD134连接-介导的抗肿瘤免疫应答的精确机制仍未阐明，但是据认为是通过与OX40L相互作用而刺激的CD134跨膜信号途径而介导。这种相互作用是通过三聚体的OX40L与CD134的结合而介导。在目前的抗癌治疗中，提议使用三聚体的OX40配体作为比抗-OX40抗体更有效的物质(Morrisetal.MolImmunol2007；44:3112-3121)。
发明概述
本发明提供了结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含图27的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含图27的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
本发明进一步提供了结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含图26的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其含图26的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一些实施方案中，分离的结合分子结合人CD134。本发明的结合分子可以不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。
这类结合分子包括合适的抗CD134抗体、抗CD134抗体的抗原结合片段，及抗CD134抗体的衍生物。在一些实施方案中，结合分子结合人CD134的Kd是1×10-7M或更低。结合分子对于在T-效应细胞上的人CD134具有激动剂活性，和/或对于在T-调节细胞上的人CD134具有拮抗剂活性。在一些进一步的实施方案中，结合分子是特异性结合人CD134的人单克隆抗体，Kd为100nM或更低，例如低于50nM或者低于20nM。
本发明还提供了一种组合物，其包含一或多个结合分子及药物学可接受的载体。在一些实施方案中，结合分子是人单克隆抗CD134抗体或者其抗原结合片段。所述组合物可进一步包含另外的药剂，如免疫治疗剂、化疗剂及激素治疗剂。
本发明进一步提供了使用结合分子的诊断和治疗方法。在一些实施方案中，提供了治疗或预防哺乳动物癌症的方法，包括给予该哺乳动物治疗有效量的本发明公开的结合分子或者包含结合分子的组合物。在一些其它的实施方案中，本发明提供了一种增强哺乳动物免疫应答的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的结合分子或者包含结合分子的组合物。在一些实施方案中，所述方法中使用的结合分子是人单克隆抗CD134抗体或其抗原结合片段，其结合人CD134，其中所述抗体不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。
本发明进一步提供了编码结合分子的氨基酸序列的核酸分子，包含这种核酸的载体，包含载体的宿主细胞，以及制备所述结合分子的方法。
本发明还提供了其它方面，这些从全文包括权利要求书中可显而易见。
附图描述
图1：暴露于PHA-M对人T淋巴细胞的表面人CD134表达的时程和剂量效应。
图2：静息和PHA-M-激活的人CD4T淋巴细胞上的人CD134表达。
图3：小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35、克隆12H3和克隆20E5在PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的结合特性。
图4：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5在PHA-M-刺激的表达人CD134的CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞上的结合。
图5：未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5与PE缀合的商业化小鼠抗CD134抗体克隆ACT35或克隆L106在PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的交叉竞争。
图6：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5与人OX40L在PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的同时结合。
图7：暴露于抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠对于人效应T淋巴细胞(Teff)和调节性T淋巴细胞(Treg)的表面人CD134表达的时程效应。
图8：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5或者暴露于人OX40L对于PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的剂量效应。
图9：组合小鼠抗人CD134抗体克隆12H3与人OX40L，或者小鼠抗人CD134抗体克隆20E5与人OX40L对于PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的效应。
图10：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5，或者暴露于人OX40L对于抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激的表达人CD134的人效应T淋巴细胞的增殖的效应。
图11：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5，或者暴露于人OX40L对于抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激的表达人CD134的人调节性T淋巴细胞增殖的影响。
图12：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3对于人OX40L介导的抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激的表达人CD134的人效应T淋巴细胞(A)和调节性T淋巴细胞(B)增殖的影响。
图13：暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5，或者暴露于人OX40L对于表达人CD134的人调节性T淋巴细胞介导的对表达人CD134的人效应T淋巴细胞增殖的抑制作用的影响。
图14：嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在(没有及有IL-2)CD3/CD28珠-刺激的表达人CD134的CD4T淋巴细胞和CD8T淋巴细胞上没有及有的结合。
图15：嵌合的IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或人OX40L对于PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的影响。
图16：暴露于嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者暴露于人OX40L对于PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的影响。
图17：组合嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5与人OX40L对于PHA-M-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的影响。
图18：嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或人OX40L对(没有及有IL-2)CD3/CD28珠没有及有-刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的影响。
图19：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5与非还原的和还原的重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的结合。(A)检验的非还原(a，b)和还原(c，d)条件。(B)使用考马斯亮蓝染色，重组人CD134:人Fcγ融合蛋白(rhuCD134)在非还原(a，b)和还原(c，d)条件下的电泳迁移模式。(C)暴露于小鼠IgG1κ同种型对照抗体(mIgG1)或者暴露于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5(分别为m12H3和m20E5)，非还原(a，b)和还原(c，d)的重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的Western印迹。
图20：全长人CD134(表示为CRD1)及各种截短的人CD134形式(表示为CRD2、CRD3、CRD4，及截短的(tc)CRD4)中半胱氨酸富集结构域(CRD)的示意图。
图21：用全长人CD134构建体(表示为CRD1)或者用各种截短的人CD134构建体(表示为CRD2、CRD3、CRD4及截短的(tc)CRD4)瞬时转染的293-F细胞系上小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5的结合。
图22：用全长人CD134构建体(表示为CRD1)或者用各种截短的人CD134构建体(表示为CRD2、CRD3、CRD4及截短的(tc)CRD4)瞬时转染的293-F细胞系上嵌合的人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134抗体克隆12H3和20E5的结合。
图23：小鼠抗人CD134抗体克隆12H3(A)及嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3(B)与人CD134-衍生的肽的结合，所述肽相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块的氨基酸序列(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677683的定义)。
图24：单克隆抗体20E5的可变区。
鼠可变区(m20E5VH和m20E5VL)；人源化20E5可变重链(hu20E5_h1、hu20E5_h2和hu20E5_h3)及人源化20E5可变轻链(hu20E5_l1和hu20E5_l2)。m20E5VH:SEQIDNO:4；m20E5VL:SEQIDNO5。
图25：单克隆抗体12H3的可变区。
鼠可变区(m12H3VH和m12H3VL)；人源化12H3可变重链(hu12H3_h1、hu12H3_h2和hu12H3_h3)及人源化12H3可变轻链(hu12H3_l1和hu12H3_l2)。m12H3VH:SEQIDNO:12；m12H3VL:SEQIDNO:13。
图26：人源化20E5可变区。
图27：人源化12H3可变区。
图28：人源化人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)针对平板结合的重组人CD134的结合特性。
图29：人源化人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)针对平板结合的重组人CD134的结合特性。
图30：生物素化的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3针对平板结合的重组人CD134的结合特性。
图31：人源化人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)与生物素化的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3(EC50为20ng/mL)结合平板结合的重组人CD134的竞争特性。
图32：稳定转染的293-F细胞系克隆no.5(A)及克隆no.23(B)上人全长CD134的表达水平。
图33：人源化的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)针对稳定转染的293-F细胞系克隆no.5上表面人CD134的结合特性。
图34：人源化的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)针对稳定转染的293-F细胞系克隆no.5上表面人CD134的结合特性。
图35：人源化的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)针对稳定转染的293-F细胞系克隆no.23上表面人CD134的结合特性。
图36：用全长人CD134构建体(表示为CRD1)或者用各种截短的人CD134构建体(表示为CRD3和CRD4)瞬时转染的293-F细胞系上人源化人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3、VL2H1、VL2VH2、VL2VH3的结合。
图37：用全长人CD134构建体(表示为CRD1)或者用各种截短的人CD134构建体(表示为CRD3和CRD4)瞬时转染的293-F细胞系上人源化人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5版本VL1H1的结合。
图38：生物素化的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3针对稳定转染的293-F细胞系克隆no.5上的表面人CD134的结合特性。
图39：人源化的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3版本VL1H1、VL1VH2、VL1VH3(A)和VL2H1、VL2VH2、VL2VH3(B)与生物素化的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3(EC50为700ng/mL)对于结合稳定转染的293-F细胞系克隆no.5上表面人CD134的竞争特性。
图40：通过可溶的OX40L和可溶的小鼠抗人CD13412H3IgG1抗体在指定浓度对在扩增的Treg(CD4+CD25+CD127dim/-)中FOXP3表达的下调。Y轴示出使用与PE结合的抗-FOX3P抗体检测的FOXP3几何平均荧光强度(GeoMFI)。m12H3＝小鼠12H3IgG1。数据代表来自一个供体的一式三份样品。
图41：FACS分析柱状图，示出当与同种型对照对比时，平板结合的人源化抗人CD13412H3VL1VH1抗体减弱(dampen)Treg对Teff增殖的抑制作用。Teff细胞使用CelltraceTMViolet染料检测。Treg:Teffector比率为1:2。
图42：指定的平板结合的抗人CD134抗体对分离自供体7015的Teff细胞增殖的影响，Treg:Teff比率为0:1(无Treg)(图42A)或者为1:4(图42B)，与复制指数(replicationindex)成函数绘图。M＝小鼠；ch＝嵌合的；h＝人。与MIgG1同种型对照相比，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。人OX40L与抗-His抗体(OX40L)或不与抗-His抗体(OX40LnoHis)一起使用。
图43：衍生自亲代小鼠抗人CD13420E5抗体的人源化重链可变区(VH)的比对。SEQIDNO:在序列名称的末端针对每个序列示出(20E5_VH1_64＝SEQIDNO:64的氨基酸序列等)。
图44：衍生自亲代小鼠抗人CD13412H3抗体的人源化重链可变区(VH)的比对。SEQIDNO:在序列名称的末端针对每个序列示出(12H3_VH1_69＝SEQIDNO:69的氨基酸序列等)。
发明描述
T细胞激活不仅是通过T细胞受体的抗原刺激而介导，而且还经共刺激分子通过共刺激信号而介导。在一些共刺激分子中，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员OX40(CD134)在效应和记忆T细胞的存活和稳态中起关键作用。根据对OX40共刺激的传统理解，当激活的T细胞结合专门的抗原呈递细胞(APC)时，发生OX40与OX40配体(OX40L)之间的相互作用。然后通过OX40共刺激信号增强T细胞的功能，包括细胞因子产生、扩增和存活。在抗原识别2-3天后，在T细胞-树突细胞(DC)相互作用期间发生OX40与OX40L之间的相互作用。表达OX40的T细胞也可以与除了DC之外的表达OX40L的细胞相互作用，并接受来自该细胞的OX40信号，其可提供记忆T细胞产生、Th2应答增强及炎症应答延长的基本信号。因此，OX40与OX40L之间的最佳相互作用可以在两个步骤形成：在激活的CD4T细胞上表达的OX40L与在其它应答CD4T细胞上表达的OX40相互作用，导致记忆CD4T细胞的最佳产生(Sorooshetal.JImmunol2006；176:5975-87)，或者在CD4+佐细胞上表达的OX40L可通过与Th2细胞上OX40相互作用而促进Th2细胞存活(Kimetal.Immunity2003；18:643-54)。此外，在B细胞上OX40L表达是体内Th2发育而非Th1发育所必要的(Lintonetal.JExpMed2003；197:875-83)，并且表达OX40L的肥大细胞通过T细胞上OX40与肥大细胞上OX40L之间的相互作用直接增强效应T细胞功能(Kashiwakuraetal.JImmunol2004；173:5247-5257；Nakaeetal.JImmunol2006；176:2238-2248)。此外，内皮细胞也表达OX40L(Imuraetal.JExpMed1996；183:2185-95)，OX40与内皮细胞结合可能参与血管炎症。对于应答T细胞和T调节性细胞而言过量的OX40信号，抑制Treg-介导的免疫抑制。OX40信号进入应答T细胞，使其对于Treg-介导的抑制作用有抗性。另一方面，OX40信号进入Treg细胞直接抑制Treg-抑制性功能，但是还存在OX40信号是否可控制Treg细胞中Foxp3表达水平的争议。此外，有意的OX40刺激抑制iTreg细胞(可诱导的Treg细胞)的TGF-β-依赖性分化。所述抑制可以部分通过效应细胞因子，如用OX40刺激的效应T细胞产生的IL-4和IFN-γ介导。重要的是，阻断OX40L显著地促进iTreg分化及诱导移植耐受性，这可以由Treg细胞介导。因此，OX40是控制T细胞介导的自身免疫的可能的分子靶。此外，近来的研究报道了由肥大细胞表达的OX40L与由Treg细胞表达的OX40之间的相互作用可以相互地抑制肥大细胞功能及Treg抑制性功能(Grietal.Immunity2008；29:771-81；Piconeseetal.Blood2009；114:2639-48)。
小鼠是免疫学者选择的实验工具，对其免疫应答的研究提供了对人体免疫系统运行方式的极大洞察力。小鼠与人系统的一般结构似乎非常相似，然而，也存在显著差异。例如，在小鼠中，Teff激活时表达CD134，而Treg组成型表达CD134(Piconeseetal.JExpMed2008；205:825-839)。在人体中，CD134在Teff和Treg上均表达，但是只在Teff和Treg激活时(见下文例如实施例2(g)，“在用抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激后人效应T淋巴细胞和调节T淋巴细胞上的CD134表达”)。此外，小鼠Treg诱导小鼠Teff的凋亡以实现抑制作用(Pandiyanetal.NatImmunol2007；8:1353；Scheffoldetal.NatImmunol2007；8:1285-1287)，而人Treg在人Teff中不诱导凋亡实现抑制作用(Vercoulenetal.PlosONE2009；4:e7183)。总之，这些数据表明在人与小鼠免疫系统之间CD134在Treg抑制性功能中的不同作用。
术语“结合分子”涵盖：(1)抗体，(2)抗体的抗原结合片段，及(3)抗体的衍生物，各自均如本文所定义。术语“结合CD134”或者“与CD134结合”是指在体外测定如BIAcore测定或Octet(表面等离子共振)中如本文定义的结合分子与CD134受体的结合。结合分子的结合亲和性(Kd)为大约1×10-6M或更低，例如大约5×10-7M或更低，大约1×10-7M或更低、大约1×10-8M或更低、大约1×10-9M或更低、大约1×10-10M或更低、大约1×10-11M或更低，或者大约1×10-12M或更低。
术语“分离的抗体”或者“分离的结合分子”是指这样的抗体或结合分子，其：(1)与其自然状态中伴随其的自然结合的成分不是结合的；(2)不含来自相同物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；或者(4)在自然界不存在。举例的分离的抗体包括经使用CD134亲和性纯化的抗CD134抗体，通过杂交瘤或其他细胞系在体外产生的抗CD134抗体，人源化的抗CD134抗体及衍生自转基因动物的人抗CD134抗体。
术语“激动剂”是指结合分子，如本文所定义，其在结合CD134时：(1)刺激或激活CD134，(2)增强、促进、诱导、增加或延长CD134的活性、存在或功能，或者(3)增强、促进、增加或诱导CD134的表达。术语“拮抗剂”是指结合分子，如本文所定义，其在结合CD134时：(1)抑制(inhibit)或阻抑(suppress)CD134，(2)抑制或阻抑CD134的活性、存在或功能，或者(3)抑制或阻抑CD134的表达。
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其典型由两个相同的成对多肽链组成，每对均具有一个“重链(H)”和一个“轻链(L)”。人轻链分为kappa(κ)和lambda(λ)链。重链分为mu(μ)、delta(δ)、gamma(γ)、alpha(α)或epsilon(ε)，分别定义抗体的同种型IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每个重链由重链可变区(缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。IgD、IgG和IgA的重链恒定区由三个结构域组成，即CH1、CH2和CH3，IgM和IgE的重链恒定区由四个结构域组成，即CH1、CH2、CH3和CH4。每个轻链由轻链可变区(缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域组成，即CL。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)。VH和VL区可进一步分为超变区，称作互补决定区(CDR)，由更保守的称作构架区(FR)的区域间隔。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以如下顺序从氨基末端排列至羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个重链/轻链对(VH和VL)的可变区分别典型地组成抗体结合位点。每个区域或结构域的氨基酸排布是根据KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987and1991))或者根据Chothiaetal.Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions(Nature1989；342(6252):877-83)的定义。术语“抗体”涵盖鼠、人源化、人和嵌合的抗体，及抗体的多聚体形式，如单体抗体的二聚体、三聚体或者更高的多聚体形式。抗体还涵盖单一特异性、双重特异性或多重特异性抗体，及任何其它修饰的免疫球蛋白分子构型，其包含所需特异性的抗原识别位点。其也涵盖了与非抗体部分连接或附着的抗体。进一步地，术语“抗体”不由任何特定的生产抗体的方法限制。例如，其包括单克隆抗体、重组抗体和多克隆抗体。
术语“抗体衍生物”或抗体“衍生物”是指能结合所述抗体结合的抗原相同的抗原(即人CD134)及包含与另外的分子实体连接的抗体的氨基酸序列的分子。包含于抗体衍生物中的抗体的氨基酸序列可以是全长抗体，或者可以是全长抗体的任何部分。另外的分子实体可以是生物或化学分子。举例的另外的分子实体包括化学基团、肽、蛋白质(如酶、抗体)、氨基酸和化学化合物。另外的分子实体可用作检测剂、标志物标记、治疗剂或药剂。抗体的氨基酸序列可以通过非共价结合、化学偶联、遗传融合或其他方式附着或者连接于另外的实体。术语“抗体衍生物”还涵盖了嵌合抗体、人源化抗体，以及衍生自CD134的氨基酸序列修饰的分子，如保守氨基酸取代、插入和添加。
术语抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体的一或多个部分，其保留结合所述抗体结合的抗原相同的抗原(即CD134)的能力。术语“抗原结合片段”还涵盖了这样的抗体部分，其是由抗体部分与一或多个其它分子实体非共价或共价结合形成的较大分子的一部分。举例的其它分子实体包括氨基酸、肽或蛋白质，如链霉亲和素核心区，其可用于产生四聚体scFv分子(Kipriyanovetal.HumAntibodiesHybridomas1995；6(3):93-101)。举例的抗原结合片段是抗体的VH和/或VL。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其包含衍生自两个不同物种如人和小鼠的氨基酸序列，典型地是小鼠可变(来自重链和轻链)区和人恒定(来自重链和轻链)区的组合。
术语“表位”是指抗原的一部分，其能特异性结合抗体或者T细胞受体或者与分子相互作用。在本领域中“表位”也指“抗原决定簇”。表位通常由分子的化学活性表面基团组成，如氨基酸或碳水化合物或糖侧链。表位可以是“线性的”或者“非线性/构象的”。一旦确定了希望的表位(例如通过表位作图)，则可以产生该表位的抗体。抗体的产生和鉴定也可以提供关于希望的表位的信息。从这种信息中，然后可以筛选与相同表位结合的那些抗体，例如通过进行交叉竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，即竞争结合所述抗原的抗体。
术语“宿主细胞”是指其中已经导入表达载体的细胞。该术语不仅涵盖特定对象细胞，也包括这种细胞的后代。由于环境影响或突变导致某些修饰可以在连续的世代中发生，因此这种后代与亲代细胞可以不相同，但是仍包括在术语“宿主细胞”的范围内。
术语“人抗体”是指仅由人免疫球蛋白序列的氨基酸序列组成的抗体。人抗体如果在小鼠、小鼠细胞或者在衍生自小鼠细胞的杂交瘤中产生，则可以含有小鼠碳水化合物链。人抗体可以以本领域已知的各种方式制备。
术语“人源化抗体”是指含有来自非人动物抗体的一些或全部CDR的抗体，而抗体的构架和恒定区含有衍生自人抗体序列的氨基酸残基。人源化抗体典型地通过将来自小鼠抗体的CDR移植入人构架序列中，随后用一些人构架区残基回代(backsubstitution)来自来源抗体的相应小鼠残基而产生。术语“人源化抗体”也指非人来源的抗体，其中典型地在一或多个可变区中，已经除去具有组成人T细胞和/或B细胞表位的高度倾向的一或多个表位，以降低免疫原性。所述表位的氨基酸序列可以全部或部分除去。然而，典型地氨基酸序列是通过将组成表位的一或多个氨基酸用一或多个其它氨基酸取代而改变，从而将所述氨基酸序列改变为不组成人T细胞和/或B细胞表位的序列。根据情况，所述氨基酸是由在相应的人可变重链或可变轻链中在相应位置存在的氨基酸取代的。
术语“哺乳动物”是指哺乳动物纲的任何动物物种。举例的哺乳动物包括：人；实验室动物如大鼠、小鼠、猿猴和豚鼠；家畜如兔、牛、绵羊、山羊、猫、狗、马和猪等等。
术语“分离的核酸”是指cDNA的核酸分子，或者合成的来源，或者其组合，其与所述核酸的天然来源中存在的其它核酸分子分离。
术语“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，用于描述配体(如抗体)与蛋白质(如CD134)之间的结合亲和性。平衡解离常数越小，则配体结合更紧密，或者配体与蛋白质之间的亲和性越高。Kd可以通过表面等离子共振测量，例如使用BIACORE1或者Octet系统测量。术语“抗CD134抗体”是指如本文定义的能结合人CD134的抗体。
术语“OX40受体”、“CD134受体”和“CD134”在本说明书中可互换使用，包括人CD134及其变体、同种型及其物种同系物。相应地，在某些情况中，本文公开的人CD134结合分子也结合来自除了人之外的物种的CD134。例如，本发明的结合分子可具有与其它相关抗原的交叉反应性，所述其它相关抗原例如是其它物种如人或猴例如Macacafascicularis(猕猴，cyno)或Pantroglodytes(黑猩猩，chimp)的CD134。在其它情况中，结合分子可以完全特异于人CD134，并且可以不呈现出物种或其它类型交叉反应性。例如，它们不结合小鼠或大鼠CD134。
术语“特异性结合人CD134”是指使用本文描述的或本领域已知的测定确定(例如BIAcore测定)，结合分子结合人CD134的Kd比其结合例如人CD40的Kd低大约10倍、50倍、100倍。
确定特定物质特异性结合OX40受体或者可以便利地通过使用或调整常规方法进行。一种合适的体外测定使用Western印迹法(在许多标准教科书中描述，包括Harlow和Lane所著的"Antibodies,ALaboratoryManual")。为了确定指定的OX40受体结合剂特异性结合人OX40蛋白质，从用编码OX40的核酸分子转化的不表达OX40抗原的哺乳动物细胞如非淋巴细胞(例如COS细胞或CHO细胞)中提取总细胞蛋白质。作为阴性对照，也从相应的非转化的细胞中提取总细胞蛋白质。然后将这些蛋白质制备物在非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳。之后，将蛋白质通过Western印迹转移至膜(例如硝化纤维膜)，将待检测的物质与该膜一起保温。在洗涤该膜以除去非特异性结合的物质之后，结合的物质的存在通过使用与检测剂如碱性磷酸酶缀合的针对测试物质产生的抗体检测；应用底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝导致通过免疫定位的碱性磷酸酶产生致密蓝色化合物。通过这种技术，在OX40转化的细胞的提取物中，特异性结合人OX40的物质示出结合人OX40条带(其位于凝胶上指定位置，通过其分子量确定)，而在非转化细胞的提取物中观测到很少或无结合。所述物质与其它蛋白质可以发生非特异性结合，在Western印迹上可以检测到微弱信号。这种结合的非特异性性质由本领域技术人员通过在Western印迹上获得的与在特异性物质/人OX40蛋白质结合中产生的强主要信号相比微弱信号而识别。理想地，OX40受体结合剂不结合从非转化的细胞中提取的蛋白质。除了使用提取的蛋白质的结合测定之外，通过将该物质与荧光标签(如FITC)缀合并通过荧光激活细胞分选法(FACS)分析其与抗原激活的CD4+T细胞及非激活的T细胞群的结合，可以测试推定的OX40受体结合剂以证实其在体内仅主要结合OX40受体的能力。仅特异性结合OX40受体的物质只染色激活的CD4+T细胞。
术语“载体”是指在宿主细胞中能运送另一核酸分子的核酸分子。举例的载体包括质粒、病毒载体、粘粒或者噬菌体载体，以及裸DNA或RNA表达载体。一些载体在导入的宿主细胞中能自主复制。一些载体在导入宿主细胞中时可以整合进宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。某些载体能指导其可操纵地连接的基因表达，因此可以称作“表达载体”。
如本文所用，20种常规氨基酸及其缩写是根据其常规用法。
本发明提供了结合人CD134的分离的抗体，其包含SEQIDNO:100所示轻链可变区(VL)及包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，任选在SEQIDNO:100所示VL中具有1、2或3个氨基酸取代。
SEQIDNO:100：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPX11RFSGX12GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYINYPLTFGGGTKVEIKR；其中
X11是D或S；及
X12是G或S。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含如下的VH，所述VH包含SEQIDNO:152所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:152所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
SEQIDNO:152：
QVQLVQSGAEX1KKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWX2GGIYPNX3GGSTYNQNFKDRX4TX5TX6DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARX7GYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS；其中
X1是V或L；
X2是M或I；
X3是N、Q、A或E；
X4是V或A；
X5是I或L；
X6是A或V；及
X7是M、L或I。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含如下的VH，所述VH包含SEQIDNO:99所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:99所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
SEQIDNO:99：
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFKDYTMHWVRQAPGQGLEWX7GGIYPNNGGSTYNQNFKDRX8TX9TX10DKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMGYHGPHLDFDVWGQGTTVTVSS；其中
X7是I或M；
X8是A或V；
X9是L或I；及
X10是V或A。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含SEQIDNO:100所示VL及SEQIDNO:152所示VH。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:16、144或145所示氨基酸序列的HCDR3。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:15、141、142或143所示氨基酸序列的HCDR2。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:14所示氨基酸序列的HCDR1。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含：
a)包含SEQIDNO:67或68所示氨基酸序列的VL；及包含SEQIDNO:69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147或148所示氨基酸序列的VH，任选在VH线性氨基酸残基位置11、55或99具有1、2或3个氨基酸取代；或者
b)包含如下氨基酸序列的VL和VH：
i.分别为SEQIDNO:67和69；
ii.分别为SEQIDNO:67和70；
iii.分别为SEQIDNO:67和71；
iv.分别为SEQIDNO:68和69；
v.分别为SEQIDNO:68和70；或者
vi.分别为SEQIDNO:68和71。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含分别如SEQIDNO:67和119、67和120、67和121、67和122、67和123、67和124、67和125、67和126、67和127、67和128、67和129、67和130、67和131、67和132、67和133、67和146、67和147.67和148、68和119、68和120、68和121、68和122、68和123、68和124、68和125、68和126、68和127、68和128、68和129、68和130、68和131、68和132、68和133、68和146、68和147或者68和148所示的VL和VH。
在本文描述的一些实施方案中，抗体是CD134的激动剂。
在本文描述的一些实施方案中，抗体包含在Fc区域中的取代。
在本文描述的一些实施方案中，取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号根据EU索引(EUIndex)编号。
重链、轻链、VH或VL氨基酸序列与在本文描述的那些无实质差异的抗体包含在本发明范围内。无实质差异是在抗体可变区序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代，其对于抗体的性质无不利影响。与本文公开的可变区序列基本相同的氨基酸序列包含在本发明范围内。在一些实施方案中，序列相同性可以是大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。百分比相同性可以例如使用VectorNTIv.9.0.0(Invitrogen,Carlsbad,CA)的AlignX模块的默认设置，通过成对比对确定。本发明的蛋白质序列可以用作询问序列以针对公开的或专利数据库进行检索，以例如鉴别相关序列。用于进行这种检索的程序例如是XBLAST或BLASTP程序(http_//www_ncbi_nlm/nih_gov)，或者GenomeQuestTM(GenomeQuest,Westborough,MA)套件，使用默认设置进行。
典型地，这包括在抗原结合位点或在构架中用具有相似电荷、疏水性或者立体化学特性的氨基酸的一或多个保守氨基酸取代，而不会不利地改变抗体的性质。也可以进行保守取代以改良抗体性质，例如稳定性或亲和性。可以在VH或VL序列进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸取代。在一些实施方案中，对本文描述的抗体的VH或VL进行1、2或3个取代。举例的保守氨基酸取代在表1中示出。进一步地，多肽中的任何天然残基也可以用丙氨酸取代，如先前针对丙氨酸扫描诱变所述(MacLennanetal(1998)ActPhysiol.Scand.Suppl.643:55-67；Sasakietal(1998)Adv.Biopsy’s.35:1-24)。
被修饰以改良其稳定性、选择性、交叉反应性、亲和性、免疫原性或其它希望的生物学或生物物理学性质的本文描述的抗CD134抗体包含在本发明范围内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的个体结构域的核心堆积(corepacking)，(2)对于HC和LC配对有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电荷残基的包埋，(4)极性和带电荷残基的H-键合网络，及(5)其它分子内和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(Wornetal.,J.Mol.Biol.,305:989-1010,2001)。潜在的结构不稳定残基可以基于抗体的晶体结构鉴别，残基对抗体稳定性的影响可以通过产生和评估在鉴别的残基中具有突变的变体而检测。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含在VH线性残基位置11、55或99的1、2或3个氨基酸取代。
在本文描述的一些实施方案中，在VH线性残基位置的1、2或3个氨基酸取代是V11L、N55Q、N55A、N55E、M99L或M99I。
在VH线性残基位置11、55或99的取代可以改良抗体稳定性和/或增强其拮抗活性。
氨基酸取代可以例如通过PCR诱变进行(美国专利No.4,683,195)。变体的文库可以使用熟知的方法产生，例如使用随机(NNK)或非随机密码子，例如DVK密码子，其编码11种氨基酸(Ala、Cys、Asp、Glu、Gly、Lys、Asn、Arg、Ser、Tyr、Trp)，以及筛选文库中具有希望性质的变体。
尽管在实施例中举例的实施方案包括成对的可变区，一个来自重链及一个来自轻链，但是技术人员会意识到另外的实施方案可包含单一的重链或轻链可变区。单一的可变区可用于筛选能形成两个结构域特异性抗原结合片段的可变结构域，其能够例如结合具有SEQIDNO:1所示序列的人CD134。所述筛选可以通过噬菌体展示筛选方法完成，使用例如国际专利公开No.WO1992/01047中公开的分级双重组合方法。在这种方法中，含有H或L链克隆的个体集落用于感染编码另一链(L或H)的克隆的完整文库，所得双链特异性抗原结合结构域根据所述噬菌体展示技术选择。因此，个体VH和VL多肽链可用于鉴别特异性结合具有SEQIDNO:1所示序列的人CD134的另外的抗体，使用如国际专利公开No.WO1992/01047公开的方法进行。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列：
a.分别为SEQIDNO:14、15和144；
b.分别为SEQIDNO:14、15和145；
c.分别为SEQIDNO:14、141和16；
d.分别为SEQIDNO:14、141和144；
e.分别为SEQIDNO:14、141和145；
f.分别为SEQIDNO:14、142和16；
g.分别为SEQIDNO:14、142和144；
h.分别为SEQIDNO:14、142和145；
i.分别为SEQIDNO:14、143和16；
j.分别为SEQIDNO:14、143和144；或者
k.分别为SEQIDNO:14、143和145。
在本文描述的一些实施方案中，包含如本文所述某些重链和轻链CDR序列的抗体是人源化的、人或DeImmunizedTM抗体。
人抗体或deImmunizedTM抗体可以如本文所述制备。人源化抗体典型是指这样的抗体，其中抗原结合位点衍生自非人物种，可变区构架衍生自人免疫球蛋白序列。人源化抗体在构架区中可包含取代，这样该构架可以不是表达的人免疫球蛋白或种系基因序列的精确拷贝。CD134的人源化抗体可以例如在Balb/c小鼠中使用标准方法产生。在Balb/c小鼠或其它非人动物中产生的抗体可以使用各种技术人源化，以产生更多的人样序列。包括选择人接受体构架的举例的人源化技术为本领域技术人员已知，包括CDR移植(美国专利No.5,225,539)、SDR移植(美国专利No.6,818,749)、表面重塑(Resurfacing)(Palin,MolImmunol28:489-499,1991)、特异性确定残基表面重塑(美国专利公开No.2010/0261620)、人-适应(或者人构架适应)(美国专利公开No.US2009/0118127)、超级人源化(美国专利No.7,709,226)及经指导的选择(Osbornetal.,Methods36:61-68,2005；美国专利No.5,565,332)。
通过如在国际专利公开No.WO1990/007861及在国际专利公开No.WO1992/22653中公开的技术，人源化抗体可以通过掺入改变的构架支持残基以保持结合亲和性(回复突变(backmutations))而进一步优化以改善其对于希望的抗原的选择性或亲和性。
利用本领域技术人员已知的技术，本发明抗体的免疫效应性质可以通过Fc修饰调整。例如，通过与激活的Fcγ受体(FcγR)FcγRI、FcγRIIa或FcγRIII结合或者与抑制性受体FcγRIIb结合，Fc效应功能如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体的下调(例如B细胞受体；BCR)等可以通过修饰Fc中负责这些活性的残基而调整。也可以通过突变Fc结构域中的残基而增强药物动力学性质，所述残基通过调整Fc与新生儿Fc受体FcRn的结合亲和性延长抗体半衰期。举例的Fc修饰是IgG4S228P/L234A/L235A、IgG2M252Y/S254T/T256E(Dall’Acquaetal.,JBiolChem281:23514–24,2006)；或者IgG2V234A/G237A/P238S、V234A/G237A/H268Q、H268A/V309L/A330S/P331或者V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S(Intl.Pat.Publ.No.WO2011/066501)，或者在美国专利No.6,737,056中描述的那些(残基编号根据EU索引编号)。可以加强抗体Fc与抑制性FcγRIIb的亲和性以增强抗体交联及激动信号。增强Fc与FcγRIIb结合的举例的Fc修饰是S267E/L328F和E233D/G237D/H268D/P271G/A330R(残基编号根据EU索引编号)。
本发明的另一实施方案是结合人CD134的分离的抗体，其包含SEQIDNO:98所示轻链可变区(VL)和包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，任选在SEQIDNO:98所示VL中具有1、2或3个氨基酸取代。
SEQIDNO:98:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAX5KLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYX6CQQGNTLPWTFGQGTKVEIKR，
其中X5是V或P；及
X6是F或Y。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:134所示氨基酸序列的VH，任选在SEQIDNO:134所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
SEQIDNO:134
QVQLVQSGAEX1KKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWX2GYINPYNX3GTKYNEKFKGRX4TX5TSDX6SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSX7DYWGQGTLVTVSS；
其中
X1是V或L；
X2是M或I；
X3是D、G、A、S或E；
X4是V或A；
X5是L或I；
X6是T或K；及
X7是M、L或I。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:97所示氨基酸序列的VH，任选在SEQIDNO:97所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
SEQIDNO:97:
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYVMHWVRQAPGQRLEWX1GYINPYNDGTKYNEKFKGRX2TX3TSDX4SASTAYMELSSLRSEDTAVYYCANYYGSSLSMDYWGQGTLVTVSS；
其中
X1是I或M；
X2是A或V；
X3是L或I；及
X4是K或T。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含SEQIDNO:99所示VL及SEQIDNO:134所示VH。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:8、139或140所示氨基酸序列的HCDR3。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:7、135、136、137或138所示氨基酸序列的HCDR2。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含具有SEQIDNO:6所示氨基酸序列的HCDR1。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含：
a.包含SEQIDNO:62或63所示氨基酸序列的VL；及
包含SEQIDNO:64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150或151所示氨基酸序列的VH，任选在VH线性氨基酸残基位置11、56或106具有1、2或3个氨基酸取代；或者
b.包含如下氨基酸序列的VL和VH：
i.分别为SEQIDNO:62和64；
ii.分别为SEQIDNO:62和65；
iii.分别为SEQIDNO:62和66；
iv.分别为SEQIDNO:63和64；
v.分别为SEQIDNO:63和65；或者
vi.分别为SEQIDNO:63和66。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含分别由SEQIDNO:62和64、62和65、62和66、62和101、62和102、62和103、62和104、62和105、62和106、62和107、62和108、62和109、62和110、62和111、62和112、62和113、62和114、62和115、62和116、62和117、62和118、62和149、62和150、62和151.63和64、63和65、63和66、63和101、63和102、63和103、63和104、63和105、63和106、63和107、63和108、63和109、63和110、63和111、63和112、63和113、63和114、63和115、63和116、63和117、63和118、63和149、63和150、63和151所示的VL和VH。
在本文描述的一些实施方案中，分离的抗体包含在VH线性残基位置11、56或106的1、2或3个氨基酸取代。
在本文描述的一些实施方案中，在VH线性残基位置的1、2或3个氨基酸取代是V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106L或M106I。
在VH线性残基位置11、55或99的1、2或3个氨基酸取代可改善抗体稳定性和/或增强其激动活性。
本发明提供了结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含图27(SEQIDNO:99)的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，包含图27(SEQIDNO:100)的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
本发明还提供了结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含图26(SEQIDNO:97)的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含图26(SEQIDNO:98)的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一些实施方案中，结合分子结合人CD134。在一些实施方案中，结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。
在一些实施方案中，在与所述CD134分子结合是饱和状态的浓度或在此之上的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过50％。
在一些实施方案中，在70nM结合分子的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过70％。
在一些实施方案中，结合分子结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38和/或SEQIDNO:92所示氨基酸序列。
在一些实施方案中，结合分子是Fab-片段、单链Fv(scFv)片段或者抗体。
在一些实施方案中，抗体是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或者IgG4抗体。在一些实施方案中，抗体是IgG1或IgG4抗体。
本发明进一步提供了编码本发明的结合分子或抗体的核酸分子。本发明进一步提供了编码本发明的人源化抗体的重链可变区、重链、轻链可变区或者轻链的核酸分子。举例的人源化抗体是本发明的人源化12H3或者人源化20E5抗体。
在一些实施方案中，核酸分子编码：
(a)重链可变区，其包含图27(SEQIDNO:99)的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含图27(SEQIDNO:100)的氨基酸序列，或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在另一个实施方案中，核酸分子编码12H3亲代小鼠抗体的人源化抗体的可变区。可变区选自抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2或者12H3_VL2VH3的可变区。举例的可变区的氨基酸序列在SEQIDNO:67、68、69、70和71中示出。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码SEQIDNO:69、70和71所示人源化12H3重链可变区的氨基酸序列的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了编码SEQIDNO:67和68所示人源化12H3轻链可变区的氨基酸序列的核酸分子。
在另一实施方案中，核酸分子编码20E5亲代小鼠抗体的人源化抗体的可变区。举例的可变区是抗体20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2、20E_VL2VH3的可变区。举例的可变区的氨基酸序列在SEQIDNO:62、63、64、65和66中示出。
在另一实施方案中，本发明提供了核酸分子，其编码SEQIDNO:64、65和66所示人源化20E5重链可变区的氨基酸序列。在另一实施方案中，本发明提供了核酸分子，其编码SEQIDNO:62或63所示人源化20E5轻链可变区的氨基酸序列。
本发明还提供了核酸分子，其编码抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区，包括选自抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3、20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2或者20E_VL2VH3的人源化可变区的人源化可变区(如在先前段落和实施例中所示)。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:90所示人源化12H3抗体轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)或者SEQIDNO:87所示人源化重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:90所示人源化12H3轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)或者SEQIDNO:88所示人源化重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:90所示人源化12H3轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)或者SEQIDNO:89所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:91所示人源化12H3轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)或者SEQIDNO:87所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:91所示人源化12H3轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)或者SEQIDNO:88所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:91所示人源化12H3轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)或者SEQIDNO:89所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:85所示人源化20E5轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)或者SEQIDNO:82所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:85所示人源化20E5轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)或者SEQIDNO:83所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:85所示人源化20E5轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)或者SEQIDNO:84所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:86所示人源化20E5轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)或者SEQIDNO:82所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:86所示人源化20E5轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)或者SEQIDNO:83所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)的核酸分子。
在一些实施方案中，编码人源化抗体重链或轻链或者人源化抗体重链或轻链可变区的核酸分子是编码SEQIDNO:86所示人源化20E5轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)或者SEQIDNO:84所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)的核酸分子。
编码SEQIDNO:62-71和/或SEQIDNO:82-91所示氨基酸序列的核酸分子是具有SEQIDNO:72-81所示序列的核酸分子。
SEQIDNO:72所示核酸序列编码SEQIDNO:82所示氨基酸序列。SEQIDNO:72的核酸58-414编码SEQIDNO:64所示氨基酸序列。
SEQIDNO:73所示核酸序列编码SEQIDNO:83所示氨基酸序列。SEQIDNO:73的核酸58-414编码SEQIDNO:65所示氨基酸序列。
SEQIDNO:74所示核酸序列编码SEQIDNO:84所示氨基酸序列。SEQIDNO:74的核酸58-414编码SEQIDNO:66所示氨基酸序列。
SEQIDNO:75所示核酸序列编码SEQIDNO:85所示氨基酸序列。SEQIDNO:75的核酸58-381编码SEQIDNO:62所示氨基酸序列。
SEQIDNO:76所示核酸序列编码SEQIDNO:86所示氨基酸序列。SEQIDNO:76的核酸58-381编码SEQIDNO:63所示氨基酸序列。
SEQIDNO:77所示核酸序列编码SEQIDNO:87所示氨基酸序列。SEQIDNO:77的核酸58-420编码SEQIDNO:69所示氨基酸序列。
SEQIDNO:78所示核酸序列编码SEQIDNO:88所示氨基酸序列。SEQIDNO:78的核酸58-420编码SEQIDNO:70所示氨基酸序列。
SEQIDNO:79所示核酸序列编码SEQIDNO:89所示氨基酸序列。SEQIDNO:79的核酸58-420编码SEQIDNO:71所示氨基酸序列。
SEQIDNO:80所示核酸序列编码SEQIDNO:90所示氨基酸序列。SEQIDNO:80的核酸67-390编码SEQIDNO:67所示氨基酸序列。
SEQIDNO:81所示核酸序列编码SEQIDNO:91所示氨基酸序列。SEQIDNO:81的核酸67-390编码SEQIDNO:68所示氨基酸序列。
本发明的一些实施方案提供了核酸分子，其包含SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80和/或SEQIDNO:81所示核酸序列。在优选的实施方案中，核酸分子包含无编码信号肽的核酸序列的序列。这是因为可以使用许多不同的信号肽。本发明因此提供了核酸分子，其包含SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80和/或SEQIDNO:81所示核酸序列，其中编码信号肽的核酸序列不存在或者由编码适于指导编码的多肽分泌的不同信号肽的核酸序列置换。
在一些实施方案中，本发明提供了核酸分子，其包含：
SEQIDNO:72的核酸残基58-414；
SEQIDNO:73的核酸残基58-414；
SEQIDNO:74的核酸残基58-414；
SEQIDNO:75的核酸残基58-381；
SEQIDNO:76的核酸残基58-381；
SEQIDNO:77的核酸残基58-420；
SEQIDNO:78的核酸残基58-420；
SEQIDNO:79的核酸残基58-420；
SEQIDNO:80的核酸残基67-390；或者
SEQIDNO:81的核酸残基67-390。
在一些实施方案中，本发明提供了核酸分子，其编码包含SEQIDNO:101-133或146-148所示氨基酸序列的重链可变区。
本发明进一步提供了包含本发明的核酸的基因输送运载体(vehicle)或载体(vector)。
本发明进一步提供了分离的或重组的细胞，或者体外细胞培养细胞，其包含本发明的核酸或载体。所述细胞优选是如本文定义的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞是通常用于产生抗体的细胞，如CHO细胞、CHO-K1SV细胞(LonzaBiologics,Walkersville,MD)、CHO-K1细胞(ATCCCRL-61)、NSO细胞(EuropeanCollectionofCellCultures(ECACC),Salisbury,Wilthsire,UK,ECACCN.85110503)、SP2/0细胞(AmericanTypeCultureCollection(ATCC),Manassas,VA,CRL-1581)、HEK293-F细胞、PER.C6细胞、FO细胞(ATCCCRL-1646)、Ag653细胞(ATCCCRL-1580)，或者杂交瘤。在另一实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。
本发明进一步提供了一种产生结合分子的方法，特征在于产生权利要求的结合分子或抗体。从细胞培养物、细胞培养上清/培养基或者其组合中收集产生的抗体。将收集的抗体进行纯化并包装进容器中，优选贮存或运输容器。
本发明进一步提供了本发明的结合分子或抗体，用于治疗需要增强其免疫应答的个体。
本发明还提供了本发明的结合分子或抗体，用于预防或治疗有需要的个体中的癌症。
本发明进一步提供了本发明的结合分子或抗体，用于治疗患有或处于患有慢性病毒和/或细胞内细菌感染风险中的个体。
本发明进一步提供了药物组合物，其包含本发明的结合分子或抗体及药物学可接受的载体。
本发明提供了结合人CD134的分离的结合分子，包括抗CD134抗体、抗CD134抗体的抗原结合片段及抗CD134抗体的衍生物。所述结合分子特征在于如下至少一种功能性质：(a)结合人CD134，Kd为1×10-6M或更低，及(b)不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)；(c)对T-效应细胞上人CD134具有激动活性和/或对T-调节细胞上人CD134具有拮抗活性；(d)在直至500nM浓度不结合CD40受体；(e)在直至500nM浓度不结合CD137受体；(f)在直至500nM浓度不结合CD271受体；(g)能增强分离的人T细胞产生IL-2；(h)能增强免疫应答；(i)能抑制肿瘤细胞生长；及(j)对于癌症具有治疗作用。在一些实施方案中，所述结合分子结合人CD134，Kd为1×10-7M或更低，或者1×10-8M或更低，或者5×1×10-9M或更低。
本发明的抗体或其它结合分子可以通过常规技术制备，然后筛选以鉴别和获得不阻止OX40L与CD134结合的结合分子。例如，可以选择甚至当CD134已经暴露于饱和浓度的OX40L时仍结合CD134的结合分子。
本发明的一些实施方案提供了结合人CD134的小鼠、人或人源化抗体。在一些实施方案中，小鼠、人或人源化抗体是单克隆抗体，其特异性结合人CD134，Kd为100nM或更低或者10nM或更低，和/或对于人CD134具有激动活性，导致T-效应细胞的刺激和/或T-调节细胞的抑制。举例的这种抗体是单克隆抗体克隆12H3。抗体克隆12H3的完整重链可变区的氨基酸序列和重链可变区(VH)的三个CDR的氨基酸序列分别在SEQIDNO:12和14-16中示出。抗体克隆12H3的完整轻链可变区的氨基酸序列和轻链可变区(VL)的三个CDR的氨基酸序列分别在SEQIDNO:13和17-19中示出。另一举例的抗体是单克隆抗体克隆20E5。抗体克隆20E5的完整重链可变区的氨基酸序列和重链可变区(VH)的三个CDR的氨基酸序列分别在SEQIDNO:4和6-8中示出。抗体克隆20E5的完整轻链可变区的氨基酸序列和轻链可变区(VL)的三个CDR的氨基酸序列分别在SEQIDNO:5和9-11中示出。再一举例的抗体是人源化抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3及人源化抗20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2、20E5_VL2VH3，以及包含重链可变区的那些抗体的优化的变体，如实施例14所述。这些抗体包含SEQIDNO:67(12H3_VL1)、SEQIDNO:68(12H3_VL2)、SEQIDNO:69(12H3_VH1)、SEQIDNO:70(12H3_VH2)、SEQIDNO:71(12H3_VH3)、SEQIDNO:62(20E5_VL1)、SEQIDNO:63(20E5_VL2)、SEQIDNO:64(20E5_VH1)、SEQIDNO:65(20E5_VH2)、SEQIDNO:66(20E5_VH3)的可变区序列，及表6和9中示出的具有SEQIDNO:101-133和146-151所示氨基酸序列的可变区。
本发明还提供了包含人源化可变区的抗体，选自抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3、20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2或者20E_VL2VH3的人源化可变区(如在先前的段落和实施例中所示)，或者SEQIDNO:101-133和146-151所示重链可变区。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化12H3抗体，其包含SEQIDNO:90所示轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)和SEQIDNO:87所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化12H3抗体，其包含SEQIDNO:90所示轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)和SEQIDNO:88所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化12H3抗体，其包含SEQIDNO:90所示轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)和SEQIDNO:89所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化12H3抗体，其包含SEQIDNO:91所示轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)和SEQIDNO:87所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化12H3抗体，其包含SEQIDNO:91所示轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)和SEQIDNO:88所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化12H3抗体，其包含SEQIDNO:91所示轻链(没有N末端信号序列MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC)和SEQIDNO:89所示重链(没有信号序列MELGLSWIFLLAILKGVQC)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化20E5抗体，其包含SEQIDNO:85所示轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)和SEQIDNO:82所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化20E5抗体，其包含SEQIDNO:85所示轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)和SEQIDNO:83所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化20E5抗体，其包含SEQIDNO:85所示轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)和SEQIDNO:84所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化20E5抗体，其包含SEQIDNO:86所示轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)和SEQIDNO:82所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化20E5抗体，其包含SEQIDNO:86所示轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)和SEQIDNO:83所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)。
在一些实施方案中，人源化抗体是人源化20E5抗体，其包含SEQIDNO:86所示轻链(没有N末端信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)和SEQIDNO:84所示重链(没有信号序列MEWSGVFMFLLSVTAGVHS)。
本发明的抗体可包含一或多个这些CDR，或者每个CDR具有1、2或3个氨基酸取代的一或多个这些CDR。所述取代可以是“保守”取代。提供功能相似的氨基酸的保守取代为本领域熟知，例如在WO2010/019702的表1中描述，其并入本文作参考。举例的保守取代在表1中示出。氨基酸以熟知的三个字母代码表示。
表1
原始氨基酸 举例的保守取代
Ala Val,Ile,Leu,Gly,Ser
Arg Lys,His,Glu,Asn
Asn Glu,His,Lys,Arg
Asp Glu,Asn
Cys Ser,Ala
Gln Asn
Glu Asp,Glu
Gly Pro,Ala
His Asn,Gln,Lys,Arg
Ile Leu,Val,Met,Ala,Phe,Nle
Leu Nle,Ile,Val,Met,Ala,Phe
Lys Arg,Glu,Asn,His
Met Leu,Phe,Ile
Phe Leu,Val,Ile,Ala,Tyr
Pro Ala,Gly
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr,Phe
Tyr Trp,Phe,Thr,Ser
Val Ile,Met,leu,Phe,Ala,Nle
鉴于克隆12H3和克隆20E5结合人CD134，其VH和VL序列可以与其它抗CD134抗体“混合并匹配”，产生另外的抗体。这种“混合并匹配”的抗体与人CD134的结合可以使用本领域已知的结合测定检测，包括在实施例中描述的测定。在一种情况中，当VH和VL区混合并匹配时，来自特定的成对VH/VL的VH序列用结构相似的VH序列置换。同样地，在另一情况中，来自特定的成对VH/VL的VL序列用结构相似的VL序列置换。
含有仅一或两个CDR区的分子(在一些情况中，甚至仅一个CDR或其一部分，特别是CDR3)能保留CDR来源抗体的抗原结合活性。见例如Launeetal.JBC1997；272:30937-44；Monnetetal.JBC1999；274:3789-96；Qiuetal.NatureBiotechnology2007；25:921-9；Ladneretal.NatureBiotechnology2007；25:875-7；Heapetal.JGenVirol2005；86:1791-1800；Nicaiseetal.ProteinScience2004；13:1882-91；VaughanandSollazzoCombinatorialChemistry&HighThroughputScreening2001；4:417-430；QuiochoNature1993；362:293-4；Pessietal.Nature1993；362:367-9；Bianchietal.JMolBiol1994；236:649-59；及Gaoetal.JBiolChem1994；269:32389-93所述。
因此，本发明的一个实施方案是分离的抗人CD134抗体，其包含：(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:12所示氨基酸序列；(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:13所示氨基酸序列。
在本发明的进一步的实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQIDNO:14所示氨基酸序列的重链CDR1；和/或(b)包含SEQIDNO:15所示氨基酸序列的重链CDR2；和/或(c)包含SEQIDNO:16所示氨基酸序列的重链CDR3。
在本发明的进一步的实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQIDNO:17所示氨基酸序列的轻链CDR1；和/或(b)包含SEQIDNO:18所示氨基酸序列的轻链CDR2；和/或(c)包含SEQIDNO:19所示氨基酸序列的轻链CDR3。
因此，本发明的一个实施方案是分离的抗人CD134抗体，其包含：(a)包含SEQIDNO:4所示氨基酸序列的重链可变区；(b)包含SEQIDNO:5所示氨基酸序列的轻链可变区。
在本发明的进一步的实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQIDNO:6所示氨基酸序列的重链CDR1；和/或(b)包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的重链CDR2；和/或(c)包含SEQIDNO:8所示氨基酸序列的重链CDR3。
在本发明的进一步的实施方案中，提供了分离的CD134结合分子，其包含：(a)包含SEQIDNO:9所示氨基酸序列的轻链CDR1；和/或(b)包含SEQIDNO:10所示氨基酸序列的轻链CDR2；和/或(c)包含SEQIDNO:11所示氨基酸序列的轻链CDR3。
鉴于克隆12H3和克隆20E5结合人CD134，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、CDR2和CDR3区提供，VHCDR1、CDR2和CDR3序列与VLCDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”，产生另外的抗CD134抗体。例如，可以混合并匹配来自不同抗CD134抗体的CDR，尽管每个抗体典型含有VHCDR1、CDR2和CDR3及VLCDR1、CDR2和CDR3。这种“混合与匹配”的抗体与CD134的结合可以使用上述及在实施例中描述的结合测定(例如ELISA、Biacore分析)检测。在一种情况中，当混合与匹配VHCDR序列时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列用结构相似的CDR序列置换。同样，当混合并匹配VLCDR序列时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列典型由结构相似的CDR序列置换。技术人员显而易见新的VH和VL序列可以通过用来自本文公开的CDR序列的结构相似的序列置换一或多个VH和/或VLCDR区序列而产生。
抗CD134抗体的类别(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)和亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)可以通过任何合适的方法确定，如通过ELISA或Western印迹以及其它技术。或者，所述类别和亚类可以通过对全部或部分抗体的重链和/或轻链的恒定区测序，将其氨基酸序列与免疫球蛋白的各种类别和亚类的已知氨基酸序列对比，确定抗体的类别和亚类。抗CD134抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或者IgD分子。例如，抗CD134抗体可以是IgG，其是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。因此，本发明的另一方面提供了将抗CD134抗体的类别和亚类转化为另一类别或亚类的方法。
在一些实施方案中，抗CD134抗体是IgG4同种型。根据本发明的一个实施方案的结合分子包括单克隆抗体、其片段、肽及其它化学实体。单克隆抗体可以通过常规方法产生，即对哺乳动物进行免疫，随后分离产生感兴趣的单克隆抗体的血浆B细胞并与骨髓瘤细胞融合。
在各种实施方案中，代替实际的抗体，结合部分可以是抗体模拟物(例如基于非抗体支架)、RNA适体、小分子或者CovX-体。
应意识到抗体模拟物(例如具有高度稳定性但在某些位置仍可以导入可变性的非抗体支架结构)可用于产生分子文库，从中可以获得结合部分。生物化学技术领域的技术人员熟知许多这种分子。这种分子可用作本发明物质中的结合部分。
举例的抗体模拟物在Skerraetal.(2007,Curr.Opin.Biotech.,18:295-304)中论述，包括：affibodies(也称作Trinectins；Nygrenetal.,2008,FEBSJ,275,2668-2676)；CTLDs(也称作Tetranectins；etal.,InnovationsPharmac.Technol.(2006),27-30；adnectins(也称作单体；Koideetal.,Meth.Mol.Biol.,352(2007),95-109)；anticalins(Schlehuberetal.,DrugDiscoveryToday(2005),10,23-33)；DARPins(ankyrins；Binzetal.,Nat.Biotechnol.(2004),22,575-582)；avimers(Silvermanetal.,Nat.Biotechnol.(2005),23,1556-1561)；微体(Krauseetal.,FEBSJ,(2007),274,86-95)；肽适配体(Borghoutsetal.,Expert.Opin.Biol.Ther.(2005),5,783-797)；Kunitz结构域(Attuccietal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.(2006)318,803-809)；affilins(Heyetal.,Trends.Biotechnol.(2005),23,514-522)。
因此，优选抗体模拟物选自如下一组：affibodies、tetranectins(CTLDs)、adnectins(单体)、anticalins、DARPins(ankyrins)、avimers、iMabs、微体、肽适配体、Kunitz结构域、aptamers和affilins。
“小分子”是指900道尔顿或更低的低分子量有机化合物。尽管大的生物聚合物如核酸、蛋白质和多糖(如淀粉或纤维素)不包括在“小分子”中，但其组成单体(分别为核糖或脱氧核糖核苷酸、氨基酸及单糖)和寡聚体(即短的聚合物如二核苷酸、肽如抗氧化剂谷胱甘肽，和二糖如蔗糖)包括在内。小分子的产生在Mayes&Whitcombe,2005,Adv.DrugDeliv.Rev.57:1742-78和Root-Bernstein&Dillon,2008,Curr.Pharm.Des.14:55-62中描述。
CovX-体是通过接头将药效团与特别设计的抗体的结合位点共价连接，有效地重编程抗体而产生(Tryderetal.,2007,Bioorg.Med.Chem.Lett.,17:501-6)。结果是形成新类别的化学实体，其中每个成分均为完整CovX-体提供希望的性状，特别是该实体具有所述肽的生物作用及延长的抗体半衰期。
人抗体可以通过一些不同的方法产生，包括使用人免疫球蛋白表达文库(StratageneCorp.,LaJolla,California；CambridgeAntibodyTechnologyLtd.,London,England)以产生人抗体的片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或(Fab')2)，及使用与产生嵌合抗体相似的那些技术，使用这些片段通过将适当部分与其融合而构建完整的人抗体。例如，人抗体可分离自表达抗体重链和轻链可变区的噬菌体展示文库，其作为与噬菌体pIX外壳蛋白的融合蛋白，如Shietal(2010)J.Mol.Biol.397:385-96和PCTIntl.Publ.No.WO09/085462)所述。人抗体也可以在具有人免疫球蛋白基因组的转基因小鼠中产生。这种小鼠可得自例如Abgenix,Inc.,Fremont,Regeneron(http://_www_regeneron_com)、HarbourAntibodies(http://_www_harbourantibodies_com)、OpenMonoclonalTechnology,Inc.(OMT)(http://_www_omtinc_net)、KyMab(http://_www_kymab_com)、Trianni(http://_www.trianni_com)和Ablexis(http:_//_www_ablexis.com)。除了连接重链和轻链Fv区以形成单链肽之外，也可以通过相似方式构建及表达Fab(M.J.Evansetal.JImmunolMeth1995；184:123-138)。
DelmmunizedTM抗体是其潜在的免疫原性T细胞表位已经去除的抗体，如国际专利申请PCT/GB98/01473所述。因此，当其应用于体内时，预期在人体内的免疫原性被消除或者显著降低。本发明的基于免疫球蛋白的结合分子可通过这种方式去除其免疫原性T细胞表位(如果存在)。
上述所有完全或部分人抗体与完全鼠或非人来源的抗体相比均具有较低的免疫原性，片段和单链抗体也如此。因此所有这些分子(或其衍生物)不太可能引起免疫或过敏反应。因此，其比完全非人抗体更适于人的体内给予，特别是在需要重复或长期给予时。
双特异性抗体可用作相同人靶细胞上的人CD134之间或者两个不同人靶细胞上的人CD134之间的交联剂。这种双特异性抗体对于人CD134上的两个不同表位的每一个均具有特异性。这些抗体和产生其的方法在美国专利No.5,534,254(CreativeBiomolecules,Inc.)中描述。该专利中描述的双特异性抗体的不同实施方案包括单链Fv与肽偶联物(coupler)连接，所述肽偶联物包括Ser-Cys、(Gly)4-Cys、(His)6-(Gly)4-Cys、螯合剂及化学或二硫键偶联，包括二马来酰亚胺己烷和二马来酰亚胺己酰。
本发明抗体的VL和/或VH区可以被工程化进其它实施方案的双特异性全长抗体，其中每个抗体的臂结合不同的抗原或表位。这种双特异性抗体可以例如通过调节两个抗体重链之间CH3的相互作用以形成双特异性抗体而产生，其使用如在美国专利No.7,695,936、国际专利公开No.WO2004/111233、美国专利公开No.US2010/0015133、美国专利公开No.US2007/0287170、国际专利公开No.WO2008/119353、美国专利公开No.US2009/0182127、美国专利公开No.US2010/0286374、美国专利公开No.US2011/0123532、国际专利公开No.WO2011/131746、国际专利公开No.WO2011/143545或者美国专利公开No.US2012/0149876中描述的那些技术。其中可以掺入本发明抗体的VL和/或VH区的另外的双特异性结构是例如DualVariableDomainImmunoglobulins(国际专利公开No.WO2009/134776)，或者包括各种二聚体化结构域以连接具有不同特异性的两个抗体臂的结构，如亮氨酸拉链或者胶原蛋白二聚体化结构域(国际专利公开No.WO2012/022811、美国专利No.5,932,448、美国专利No.6,833,441)。
非抗体分子可以通过常规方式从化合物文库中分离或筛选。一种产生和筛选化合物文库的自动化系统在美国专利No.5,901,069和5,463,564中描述。更精确的方法包括结合位点的三维建模，然后产生适合该模型的分子家族。然后筛选具有最佳结合特性的那些分子。
另一方法是产生重组肽文库，然后筛选结合感兴趣的人CD134的表位的那些分子。见例如美国专利No.5,723,322所述。这个表位与如下实施例中描述的单克隆抗体结合的表位相同。一旦已知表位，可以根据本领域熟知的技术相对容易地产生或分离分子。
进一步的实施方案提供了如上述任何抗CD134抗体的衍生物。在一个特别方面，抗体衍生物衍生自克隆12H3和/或克隆20E5氨基酸序列的修饰。抗体链的任何区域的氨基酸序列均可以被修饰，如构架区、CDR区或者恒定区。所述修饰可以通过本领域已知的标准技术导入，如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包括天然以及非天然氨基酸。修饰的类型包括抗CD134抗体的一或多个氨基酸的插入、缺失、取代或者其组合。在一些实施方案中，抗体衍生物包含在重链CDR中的1、2、3或4个氨基酸取代和/或在轻链CDR中的一个氨基酸取代。在一些实施方案中，抗CD134抗体的衍生物包含相对于人基因的种系氨基酸序列的一或多个氨基酸取代。在特别的实施方案中，来自种系的一或多个那些取代是在重链的CDR2区。在另一特别的实施方案中，相对于种系的氨基酸取代是在与相对于抗体克隆12H3和克隆20E5中种系取代的一或多个相同位置。在另一个实施方案中，氨基酸取代是将抗体中的一或多个半胱氨酸改变为另一残基，例如但不限于丙氨酸或丝氨酸。半胱氨酸可以是规范或非规范半胱氨酸。所述取代可以在抗体可变结构域的CDR或构架区或者在恒定结构域中产生。另一类型的氨基酸取代是通过改变一或两个残基消除天冬酰胺-甘氨酸对，其形成潜在的去酰胺化位点。在再其它的实施方案中，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一个实施方案中，抗体衍生物相对于克隆12H3和/或克隆20E5的氨基酸序列在重链CDR中具有1、2、3或4个保守氨基酸取代。抗CD134抗体的另一类型修饰是改变抗体的原始糖基化模式。术语“改变”是指缺失在抗体中发现的一或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一或多个糖基化位点。
抗体的糖基化是典型N-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分附着于天冬酰胺残基的侧链。举例的其它修饰包括酰化、酰胺化、乙酰化、交联、环化、甲酰化、羟基化、碘化、甲基化、十四酰化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、半胱氨酸形成、氧化、磷酸化、异戊烯化、PEG化、蛋白酶解和硫化。
进一步的实施方案提供了抗体衍生物，其包含与另外的分子实体连接的本文所述的抗CD134抗体或其抗原结合片段。举例的另外的分子实体包括药剂、肽或蛋白质，以及检测剂或标记。可以与抗CD134抗体连接的药剂的特别实例包括细胞毒性剂或其它癌症治疗剂，以及放射性同位素。可以与抗CD134抗体连接的肽或蛋白质的特别实例包括抗体，其可以是相同的抗CD134抗体或不同的抗体。可以与抗CD134抗体连接的检测剂或标记的特别实例包括(1)荧光化合物，如荧光素、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、罗丹明、5-二甲胺-l-萘-磺酰氯和镧系元素磷光体(lanthanidephosphors)；(2)酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶和葡萄糖氧化酶；(3)生物素；(4)由二级报道蛋白识别的预定的多肽表位，如亮氨酸拉链成对序列、金属结合结构域、表位标签及二级抗体的结合位点。进一步的实施方案提供了抗体衍生物，其是抗CD134抗体的多聚体形式，如抗体二聚体、三聚体或者单体抗体的较高级别多聚体。抗体多聚体内的各个单体可以相同或不同，即其可以是杂聚或同聚抗体多聚体。抗体的多聚体化可以通过天然聚集实现。例如，一些百分比的纯化的抗体制备物(例如纯化的IgG1分子)自发地形成含有抗体同源二聚体的蛋白质聚集体，以及其它更高级别抗体多聚体。或者，抗体同源二聚体可以通过本领域已知的化学连接技术形成。合适的交联剂包括异源双功能交联剂，如m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代-乙酸酯和4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)或者同源双功能交联剂(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)。这种接头可商购。抗体也可以通过本领域已知的重组DNA技术多聚体化。
进一步的实施方案提供了抗体衍生物，其是包含上述抗人CD134抗体的氨基酸序列的嵌合的抗体。在另一实施例中，嵌合抗体的所有CDR均衍生自抗人CD134抗体。在另一实施例中，在嵌合抗体中组合来自一个以上抗人CD134抗体的CDR。进一步地，嵌合抗体可包含衍生自一个抗人CD134抗体的构架区及来自一或多个不同人抗体的一或多个CDR。嵌合抗体可以使用本领域已知的常规方法产生。在一些特定的实施方案中，嵌合抗体包含选自抗体克隆12H3和/或克隆20E5的抗体的重链可变区或轻链可变区的1、2或3个CDR。
本发明提供的其它抗体衍生物的实例包括单链抗体、diabodies、结构域抗体、nanobodies及unibodies。在一些实施方案中，单克隆抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、DeImmunizedTM抗体、双特异性抗体、单链抗体、包括Fab、F(ab')2、Fv的片段或保留亲代抗体的抗原结合功能的其它片段。单链抗体(ScFv)及其构建方法在美国专利No.4,946,778中描述。
“单链抗体”(scFv)由包含与VH结构域连接的VL结构域的单一多肽链组成，其中VL结构域与VH结构域配对形成单价分子。单链抗体可以根据本领域已知方法制备(见例如Birdetal.,(1988)Science242:423-426和Hustonetal.,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。“diabodies”由两个链组成，每个链均包含与轻链可变区连接的重链可变区，其在同一多肽链上通过短肽接头连接，其中同一链上的两个区彼此不配对，但是与另一链上的互补结构域配对，形成双特异性分子。制备diabodies的方法为本领域已知(见例如HolligerP.etal.,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448和PoljakR.J.etal.,(1994)Structure2:1121-1123)。结构域抗体(dAbs)是抗体的小的功能结合单位，相应于抗体重链或轻链的可变区。结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中充分表达。关于结构域抗体及产生其的方法的进一步详细描述为本领域已知(见例如美国专利No.6,291,158、6,582,915、6,593,081、WO04/003019和WO03/002609)。Nanobodies衍生自抗体的重链。Nanobody典型包含一个可变结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)，并保留原始抗体的抗原结合能力。Nanobodies可以通过本领域已知方法制备(见例如美国专利No.6,765,087、美国专利No.6,838,254、WO06/079372)。Unibodies由IgG4抗体的一个轻链和一个重链组成。Unibodies可以通过除去IgG4抗体的铰链区而产生。关于unibodies及制备其的方法的进一步详细描述可见于WO2007/059782。
除了结合部分之外，本发明的分子可进一步包含延长分子体内半衰期的组分，例如但不限于聚乙二醇(PEG)、人血清白蛋白、糖基化基团、脂肪酸和葡聚糖。这种进一步的组分可以使用本领域熟知的方法与所述结合部分缀合或另外组合。
本发明的另一方面提供了编码根据本发明第一方面的结合CD134的结合分子的氨基酸序列的核酸分子。由该核酸分子编码的氨基酸序列可以是完整抗体的任何部分，如CDR，包含1、2或3个CDR的序列，或者重链或轻链的可变区，或者可以是全长重链或轻链。在一些实施方案中，核酸分子编码氨基酸序列，其包含：(1)抗体克隆12H3和/或克隆20E5的CDR3区，特别是重链CDR3区；(2)抗体克隆12H3和/或克隆20E5的重链可变区或者轻链可变区；或者(3)抗体克隆12H3和/或克隆20E5的重链或轻链。在其它实施方案中，核酸分子编码多肽，其包含选自SEQIDNO:12、13、14、15、16、17、18或19或者选自SEQIDNO:4、5、6、7、8、9、10或11的氨基酸序列。
本发明提供的核酸分子可以得自产生本发明的CD134抗体的任何来源。来自产生抗CD134抗体的细胞的mRNA可以通过标准技术分离，使用PCR和文库构建技术克隆和/或扩增，以及使用标准方案筛选以获得编码抗CD134抗体的氨基酸序列的核酸分子。所述mRNA可用于产生cDNA以用于聚合酶链反应(PCR)中或者抗体基因的cDNA克隆。在一个实施方案中，核酸分子得自表达如上所述的抗CD134抗体的杂交瘤，优选具有作为其融合配体之一的表达人免疫球蛋白基因的非人转基因动物细胞的杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤衍生自非人、非转基因动物。
编码抗CD134抗体重链的核酸分子可以通过融合编码重链可变区的核酸分子与编码重链恒定区的核酸分子而构建。相似地，编码抗CD134抗体的轻链的核酸分子可以通过融合编码轻链可变区的核酸分子与编码轻链恒定区的核酸分子而构建。编码VH和VL链的核酸分子可以转化为全长抗体基因，通过将其插入已经分别编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，由此VH节段与载体内重链恒定区(CH)节段可操纵地连接，及VL节段与载体内轻链恒定区(CL)节段可操纵地连接。或者，通过使用标准分子生物学技术连接例如连接(ligating)编码VH链的核酸分子与编码CH链的核酸分子，编码VH和VL链的核酸分子被转化为全长抗体基因。使用编码VL和CL链的核酸分子可以实现相同结果。编码全长重链和/或轻链的核酸分子继而可以从其已经导入之中的细胞中表达，并分离抗CD134抗体。
核酸分子可用于重组表达大量的抗CD134抗体，如下文所述。核酸分子也可以用于产生本发明提供的其它结合分子，如嵌合抗体、单链抗体、免疫粘附素、diabodies、突变抗体、双特异性抗体，及抗体衍生物，如本文所述。在一个实施方案中，使用核酸分子作为特异性抗体序列的探针或PCR引物。例如，核酸分子探针可以用于诊断方法中，或者核酸分子PCR引物可用于扩增可以使用的DNA区域，以分离用于产生抗CD134抗体可变区的核酸序列。
一旦获得编码抗CD134抗体的VH和VL区段的DNA分子，这些DNA分子可通过重组DNA技术进一步操作，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因、scFv基因，或者其可以掺入双特异性抗体中。
本发明的再一方面提供了载体，其包含上文描述的核酸分子。核酸分子可编码轻链或重链的一部分(如CDR或可变区)、全长轻链或重链、包含部分或全长重链或轻链的多肽，或者抗体衍生物或抗原结合片段的氨基酸序列。
合适的表达载体的实例是编码功能完全的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，具有工程化的合适的限制位点，以便可以插入及表达任何VH或VL序列。表达载体可编码信号肽，促进抗体链的氨基酸序列从宿主细胞中分泌。编码抗体链的氨基酸序列的DNA可以克隆进载体中，由此信号肽符合读框地与抗体链的氨基酸序列的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者异源信号肽(即非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。除了编码抗CD134抗体的氨基酸序列的核酸序列之外(抗体VH、VL、全长重链和/或全长轻链基因)，表达载体携带控制抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。表达载体的设计，包括调节序列的选择，可依赖于选择被转化的宿主细胞、希望的蛋白质表达水平等因素。哺乳动物宿主细胞表达的调节序列包括病毒元件，其指导哺乳动物细胞中高水平蛋白表达，如衍生自逆转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))、多瘤病毒的启动子和/或增强子，以及强哺乳动物启动子如天然免疫球蛋白和肌动蛋白启动子。
宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物、细菌或酵母细胞。适合作为宿主细胞的哺乳动物细胞系例如包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NS0细胞、PER-C6细胞、SP2/0细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(例如HepG2)、人肺细胞、A549细胞，以及许多其它细胞系。昆虫细胞系例如包括Sf9或Sf21细胞。
植物宿主细胞例如包括烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦、马铃薯等。细菌宿主细胞包括大肠杆菌和链霉菌种。
酵母宿主细胞例如包括酿酒酵母和毕赤酵母。
由不同细胞系或者在转基因动物中表达的结合分子的氨基酸序列可具有不同的糖基化。然而，无论结合分子的糖基化如何，由本发明提供的核酸分子编码的或者包含本发明提供的氨基酸序列的所有结合分子均是本发明的一部分。
本发明的另一方面提供了使用噬菌体展示技术产生上述CD134-结合分子的方法。所述方法包括：(a)合成在噬菌体上的人抗体文库，(b)用CD134或其一部分筛选所述文库，(c)分离结合CD134或其一部分的噬菌体，及(d)从所述噬菌体中获得抗体。制备抗体文库的一种示例性方法包括如下步骤：(a)用CD134或其抗原性部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫应答；(b)从免疫的动物中提取产生抗体的细胞；(c)从提取的细胞中分离编码抗CD134抗体的重链和轻链的RNA；(d)逆转录RNA以产生cDNA；(e)扩增该cDNA；及(f)将该cDNA插入噬菌体展示载体中，以便抗体在噬菌体上表达。重组抗人CD134抗体或其抗原结合片段可以通过筛选重组组合抗体文库而分离。所述文库可以是scFv噬菌体展示文库，使用从分离自B细胞的mRNA制备的人VL和VHcDNA产生。制备和筛选这种文库的方法为本领域已知。产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购。
在本发明的一些实施方案中提供了组合物，例如药物组合物，其含有如本文所述的一种结合分子或结合分子的组合，及任选药物学可接受的载体。所述组合物可以通过本领域已知的常规方法制备。在一些实施方案中，所述组合物包含抗CD134抗体或其抗原结合片段。在一特别的实施方案中，所述组合物包含抗体克隆12H3和/或克隆20E5或者任一抗体的抗原结合片段。在再其它的实施方案中，所述组合物包含抗体克隆12H3和/或克隆20E5的衍生物。在其它的实施方案中，药物组合物包含人源化抗体12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2、12H3_VL2VH3,20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、20E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2或20E5_VL2VH3。在其它实施方案中，药物组合物包含上述人源化抗体的变体，其包含SEQIDNO:101-133或146-151所示重链可变区。术语“药物学可接受的载体”是指任何无活性的物质，其适用于配制物中以输送结合分子。载体可以是抗粘附剂、结合剂、涂层、分解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或者抗真菌剂)、甜味剂、延缓吸收剂、湿润剂、乳化剂、缓冲液等。
本发明的非肽分子可以口服给予，包括通过悬浮液、片剂等形式。液体配制物可以通过吸入冻干或气雾状微囊剂给予。也可以使用栓剂。另外的药物学运载体可用于控制本发明分子的作用持续时间。选择的配制物的剂量和给予方案可以通过本领域熟知的标准程序确定。这种程序包括从动物模型中推断估计的剂量方案，然后确定在人体临床给药剂量范围研究中的最佳剂量。
组合物可以是任何合适形式，如液体、半固体和固体剂型。各种剂型的组合物可以通过本领域已知的常规技术制备。
组合物中包含的结合分子的相对量根据许多因素而不同，如希望的释放和药效学特性、使用的特异的结合分子和载体及剂型。单一剂量形式中的结合分子的量通常是产生治疗作用的量，但是也可以是较低的量。通常地，这个量的范围是相对于该剂型总重的大约0.001％至大约99％，大约0.1％-70％，或大约1％-30％。
除了结合分子之外，组合物中可包含一或多种另外的治疗剂，或者单独作为同一治疗方案的一部分。另外的治疗剂的实例在下文描述。组合物中包含的另外的治疗剂的合适量可以由本领域技术人员容易地选择，并会根据许多因素而不同，如使用的特定的物质和载体、剂型，及希望的释放和药效学特性。单剂量形式中包含的另外的治疗剂的量通常是该物质产生治疗作用的量，但是可以较低。
本发明的结合分子及包含本发明提供的结合分子的药物组合物可用于治疗、诊断或其它目的，如增强免疫应答、治疗癌症、增强其它癌症治疗方法的效力，或者增强疫苗效力，以及具有许多用途，例如用作药物或诊断剂。因此，在本发明优选的方面提供了使用所述结合分子或药物组合物的方法。
本发明的再一方面提供了调节人CD134-介导的抗-肿瘤免疫应答的方法，包括增强表达人CD134的人Teff效应细胞功能和/或减弱表达人CD134的人Treg抑制功能，使用与人CD134结合的结合分子，包括抗人CD134抗体，其(1)避免天然发生的人OX40L与人CD134受体的相互作用，和/或(2)在用其天然发生的人OX40L占据后不阻断人CD134-介导的细胞发信号。
本发明的再一方面提供了调节人CD134-介导的抗肿瘤免疫应答的方法，包括使用如本发明所述与人CD134结合的结合分子，增强表达人CD134的人Teff细胞效应功能和/或减弱表达人CD134的人Treg细胞的抑制功能。
本发明的另一方面提供了调节人CD134-介导的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法不包括结合人CD134的结合分子，包括抗人CD134抗体，如人OX40L模拟物，其与人CD134受体上OX40L结合结构域相互作用和/或阻断人OX40L-人CD134细胞发信号。
本发明公开了结合人CD134的结合分子，包括抗人CD134抗体，其用于抗肿瘤治疗目的。抗人CD134抗体结合人CD134的胞外结构域。在一些实施方案中，抗人CD134抗体结合激活的人Teff和人Treg上人CD134的胞外结构域上的非-OX40L-结合区(即抗人CD134抗体不完全阻断人OX40L与人CD134的结合)。
在一特定方面，本发明提供了增强哺乳动物中免疫应答的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的本发明的结合分子。在一些实施方案中，结合分子是抗CD134抗体或者其抗原结合片段，哺乳动物是人。在进一步的实施方案中，结合分子是抗体克隆12H3和/或克隆20E5，或者人源化12H3或人源化20E5抗体之任一抗体的抗原结合片段。术语“增强免疫应答”是指刺激、激发、增加、改善或增大哺乳动物免疫系统的任何应答。免疫应答可以是细胞应答(即细胞介导的，如细胞毒性T淋巴细胞介导的)或者体液应答(即抗体介导的应答)，以及可以是初级或二级免疫应答。增强免疫应答的实例包括增加CD4+辅助T细胞活性及产生细胞毒性T细胞。增强免疫应答可以使用本领域技术人员已知的许多体外或体内测量方法评定，包括但不限于细胞毒性T淋巴细胞测定、细胞因子释放(例如产生IL-2)、肿瘤衰退、带瘤动物存活、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标记表达，以及细胞毒性。在一个实施方案中，所述方法增强细胞免疫应答，特别是细胞毒性T细胞应答。
本发明的一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中在所述结合分子的饱和浓度或之上，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过70％，通过基于荧光的流式细胞计量术测定，如实施例2(f)所述。更优选地，对OX40L与CD134结合的作用被降低不超过大约60％、或大约50％或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，或者优选其结合根本不降低。
本发明的另一方面提供了结合分子，其中在70nM结合分子的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过70％，通过基于荧光的流式细胞计量术测定，如实施例2(f)所述。更优选地，对OX40L与CD134结合的作用被降低不超过大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，或者优选结合根本不降低。
本发明的另一方面提供了结合分子，其与人CD134竞争结合抗体，所述抗体包含(1)包含SEQIDNO:12所示氨基酸序列的重链可变区，及(2)包含SEQIDNO:13所示氨基酸序列的轻链可变区，如通过在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上未标记的所述结合分子与荧光标记的所述抗体之间的交叉竞争示出，通过流式细胞计量术测量(在实施例2(e)中进一步描述)。当针对所述结合分子进行交叉竞争测定时，所述抗体在其饱和浓度或之上浓度的结合降低至少大约50％、或大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％或更多，或者结合消除。
本发明另一方面提供了结合分子，其与人CD134竞争结合抗体，所述抗体包含(1)包含SEQIDNO:4所示氨基酸序列的重链可变区，及(2)包含SEQIDNO:5所示氨基酸序列的轻链可变区，如通过在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上未标记的所述结合分子与荧光标记的所述抗体之间的交叉竞争示出，通过流式细胞计量术测量(在实施例2(e)中进一步描述)。当针对所述结合分子进行交叉竞争测定时，所述抗体在其饱和浓度或之上浓度的结合降低至少大约50％、或大约60％、或大约70％、或大约80％、或大约90％或更多，或者结合消除。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，及其中所述结合分子进一步不阻碍表达人CD134的T效应细胞上人OX40L的免疫刺激性和/或增殖应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)，并且其中所述结合分子进一步不阻碍表达人CD134的T效应细胞上人OX40L的免疫刺激性和/或增殖应答。
本发明的另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子增强表达人CD134的T效应细胞上人OX40L的免疫刺激性和/或增殖应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)，并且其中所述结合分子增强表达人CD134的T效应细胞上人OX40L的免疫刺激性和/或增殖应答。
本发明的另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子进一步不阻碍表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的阻抑功能应答(suppressorfunctionresponse)。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)，并且其中所述结合分子进一步不阻碍表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的阻抑功能应答。
本发明的另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子增强表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的阻抑功能应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)，并且其中所述结合分子增强表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的阻抑功能应答。
本发明的另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子进一步不阻碍表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的增殖应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不抑制或阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)，并且其中所述结合分子进一步不阻碍表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的增殖应答。
本发明的另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低，并且其中所述结合分子抑制表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的增殖应答。
本发明另一方面提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不抑制或阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)，并且其中所述结合分子抑制表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的增殖应答。
一种测量OX40L与抗CD134抗体同时结合的合适方法如下文所述。在不存在抗人CD134抗体条件下，PHA刺激的表达人CD134的PBMC上人OX40L结合的FITC荧光信号(几何平均或平均荧光强度(MFI))设定为100％。在不存在人OX40L条件下，PHA刺激的表达人CD134的PBMC上抗人CD134抗体结合的PE荧光信号(MFI)设定为100％。当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入PHA刺激的表达人CD134的PBMC时，这个FITC荧光信号和PE荧光信号的降低优选不超过大约70％、或大约60％、或大约50％、或大约40％、或大约30％、或大约20％、或大约10％或更低。
一种测量Teff的OX40L介导的增殖应答的阻碍缺失的合适方法如下文所述。在人OX40L处理后，表达人CD134的Teff中氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入设定为100％。当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入激活的(例如PHA刺激的或抗-CD3/抗-CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff中时，这种氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入的改变(即缩减或增加)优选不超过大约30％、或大约20％、或大约10％或更低。
一种测量Teff的OX40L-介导的增殖应答增强的合适方法如下文所述。在人OX40L处理后，表达人CD134的Teff中氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入设定为100％。当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入激活的(例如PHA刺激的或抗-CD3/抗-CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff中时，这种氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入的增强优选高于大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％，或者更高。
一种测量Treg的OX40L-介导的阻抑功能的阻碍缺失的合适方法如下文所述。在人OX40L处理后，与表达人CD134的Treg共培养的表达人CD134的Teff(例如Teff/Treg比率＝1:1)中的氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入设定为100％。当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入与表达人CD134的Treg共培养(例如Teff/Treg比率＝1:1)的激活的(例如PHA刺激的或抗-CD3/抗-CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff中时，这种氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入的改变(缩减或增加)优选不超过大约30％、或大约20％、或大约10％或更低。
一种测量Treg的OX40L-介导的阻抑功能增强的合适方法如下文所述。在人OX40L处理后，与表达人CD134的Treg共培养的表达人CD134的Teff中(例如Teff/Treg比率＝1:1)的氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入设定为100％。当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入与表达人CD134的Treg共培养(例如Teff/Treg比率＝1:1)的激活的(例如PHA刺激的或抗-CD3/抗-CD28珠刺激的)表达人CD134的Teff中时，这种氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入增强优选高于大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％，或者更高。
一种测量对Treg的OX40L-介导的增殖应答的阻碍缺失的合适方法如下文所述。在人OX40L处理后，表达人CD134的Treg中的氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入设定为100％。当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入激活的(例如PHA刺激的或抗-CD3/抗-CD28珠刺激的)表达人CD134的Treg中时，这种氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入的改变(缩减或增加)优选不超过大约30％、或大约20％、或大约10％或更低。
一种测量Treg的OX40L-介导的增殖应答的抑制作用的合适方法如下文所述。在人OX40L处理后，当将人OX40L和抗人CD134抗体同时加入激活的(例如PHA刺激的或抗-CD3/抗-CD28珠刺激的)表达人CD134的Treg中时，这种氚标记胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入降低优选高于大约30％、或大约40％、或大约50％、或大约60％、或大约70％，或者更高。
本发明的另一方面提供了治疗哺乳动物中癌症的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的本发明的结合分子。
在本发明的一些实施方案中，结合分子是抗体克隆12H3和/或克隆20E5，或者任一抗体的抗原结合片段。在进一步的实施方案中，哺乳动物是人。
在本发明的一些实施方案中，结合分子是抗体12H3_VL1VH1，其具有SEQIDNO:69所示VH及SEQIDNO:67所示VL。
在本发明的一些实施方案中，结合分子是抗体12H3_VL1VH2，其具有SEQIDNO:70所示VH和SEQIDNO:67所示VL。
在本发明的另一优选的实施方案中，提供了一种预防哺乳动物中癌症的方法，包括给予哺乳动物治疗有效量的本发明的结合分子。
术语“预防癌症”或者“癌症的预防”是指延缓、抑制或者预防哺乳动物中癌症的发生，其中哺乳动物中无证据表明肿瘤形成或肿瘤发生，但是通过例如遗传筛查或其它方法鉴别具有癌症倾向。该术语还涵盖了治疗具有癌前病变的哺乳动物，以终止癌前病变向恶性程度的进展或者导致其衰退。癌前病变例如包括增生、发育异常和组织转化。在一些实施方案中，结合分子是如本文所述的抗CD134抗体或其片段。在本发明进一步的实施方案中，提供了选自抗体克隆12H3和/或克隆20E5或者任一抗体的抗原结合片段的结合分子。在进一步的实施方案中，哺乳动物是人。
术语“治疗”或“处理”是指治疗性处理和预防性措施，其中目标是阻止或减缓(减少)不希望的生理学改变或失调，如肿瘤或肿瘤细胞的进展或传播。有益或希望的临床结果包括症状减轻、疾病程度减弱、疾病处于稳定状态(即不恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测。“治疗”也可以是指与不接受治疗的对象预期的存活时间相比延长存活。需要治疗的那些对象包括已经具有病变或失调的那些对象以及有该倾向的那些对象，或者其中所述病变或失调被预防的那些对象。任何本发明的抗体均可用于本发明的方法中。
本发明的另一实施方案是治疗癌症的方法，包括给予有需要的患者足够时间的抗CD134抗体以治疗癌症，所述抗体包含SEQIDNO:152所示VH及SEQIDNO:100所示VL。
本发明的另一实施方案是治疗癌症的方法，包括给予有需要的患者足够时间的抗CD134抗体以治疗癌症，所述抗体包含SEQIDNO:134所示VH及SEQIDNO:98所示VL。
本发明的另一实施方案是治疗癌症的方法，包括给予有需要的患者足够时间的抗CD134抗体以治疗癌症，所述抗体包含：
SEQIDNO:67所示VH及SEQIDNO:69所示VL；
SEQIDNO:67所示VH及SEQIDNO:70所示VL
SEQIDNO:67所示VH及SEQIDNO:71所示VL；
SEQIDNO:68所示VH及SEQIDNO:69所示VL；
SEQIDNO:68所示VH及SEQIDNO:70所示VL；或者
SEQIDNO:68所示VH及SEQIDNO:71所示VL。
许多癌症，包括恶性或良性和/或原发或继发的，均可以用本发明的方法治疗或预防。这种癌症的实例为本领域技术人员已知，并列于标准教科书如MerckManualofDiagnosisandTherapy(Merck出版)中。在一些实施方案中，癌症是典型应答免疫治疗的癌症，但是也可以是迄今为止与免疫治疗不相关的癌症。举例的癌症是黑素瘤(例如转移的恶性黑素瘤)、肾癌(例如透明细胞癌)、前列腺癌(例如激素难治性前列腺腺癌)、胰腺腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、食管癌、头颈鳞状细胞癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、甲状腺癌、恶性胶质瘤、神经胶质瘤、白血病、淋巴瘤，及其它恶性肿瘤。癌症可以是难治性或复发的恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤，及白血病、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌，及肺鳞状细胞癌)、腹膜癌症、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴道癌、甲状腺癌、肝癌及各种类型的头颈癌，以及B细胞淋巴瘤(包括低级别/滤泡性非-Hodgkin's淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级扩散性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级成淋巴细胞性NHL；高级小无裂细胞性NHL；巨大肿块NHL；套细胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma)；AIDS-相关的淋巴瘤；及Waldenstrom's巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；毛细胞性白血病；慢性成髓细胞白血病；多发性骨髓瘤和移植后淋巴细胞增殖性疾病(PTLD)。
在本发明的另一实施方案中，结合分子可以作为单一疗法单独给予，或者与一或多种另外的治疗剂或治疗方法组合给予。因此，在本发明的另一实施方案中，提供了一种通过组合疗法治疗或预防癌症的方法，该方法包括给予本发明所述结合分子，组合一或多种另外的治疗方法或治疗剂。术语“另外的治疗方法”是指不应用本发明提供的结合分子作为治疗剂的治疗方法。术语“另外的治疗剂”是指除了本发明提供的结合分子之外的任何治疗剂。在一些实施方案中，结合分子是抗人CD134抗体克隆12H3和/或克隆20E5，任一抗体的抗原结合片段，或者人源化12H3或人源化20E5抗体。在一特别方面，本发明提供了一种组合治疗以治疗哺乳动物中癌症，其包括给予该哺乳动物治疗有效量的本发明提供的结合分子，组合一或多种另外的治疗剂。在进一步的实施方案中，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺癌、血液恶性肿瘤(haematologicalmalignancy)、黑素瘤或膀胱癌。
在一些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌。
在一些实施方案中，所述癌症是肺癌。
在一些实施方案中，所述癌症是血液恶性肿瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
在一些实施方案中，所述癌症是膀胱癌。
在一些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌，或者肺鳞状细胞癌。
许多癌症治疗剂可以与结合分子组合使用。本领域技术人员可识别可以与本发明的方法和结合分子组合使用的其它癌症治疗方法的存在和进展，不限于本文所述的那些治疗形式。可用于治疗癌症的组合治疗中的另外的治疗剂的类别例如包括(1)化疗剂，(2)免疫治疗剂，及(3)激素治疗剂。
术语“化疗剂”是指化学或生物学物质，其可导致癌细胞死亡，或者干扰癌细胞的分裂、修复、生长和/或功能。举例的化疗剂包括在WO2006/088639、WO2006/129163和US20060153808中公开的那些物质，所述专利并入本文作参考。
术语“免疫治疗剂”是指化学或生物学物质，其可增强哺乳动物的免疫应答。举例的免疫治疗剂包括：卡介苗(BCG)；细胞因子如干扰素；疫苗如MyVax个体化免疫治疗，Onyvax-P，Oncophage，GRNVACl，Favld，Provenge，GVAX，LovaxinC，BiovaxID，GMXX和NeuVax；以及抗体如alemtuzumabbevacizumab，cetuximabgemtuzunabozogamicinibritumomabtiuxetanpanitumumabrituximab trastuzumabtositumomabtremelimumab，CAT-3888，以及CD40受体的激动抗体，如在WO2003/040170中公开。
术语“激素治疗剂”是指化学或生物学物质，其抑制或消除激素的产生，或者抑制或中和激素对于癌细胞生长和/或存活的影响。适于本发明方法的这种物质的实例包括在US20070117809中公开的那些物质。特别的激素治疗剂例如包括tamoxifentoremifene(Fareston)、fulvestrantanastrozoleexemestaneletrozolemegestrolacetategoserelin和leuprolide本发明的结合分子也可以用于与非药物激素治疗组合，如(1)手术方法，其除去参与激素产生的全部或部分器官或腺体，如卵巢、睾丸、肾上腺及垂体，及(2)放射治疗，其中患者的器官或腺体接受足以抑制或消除靶激素产生的量的放射。
在本发明的另一实施方案中，提供了通过组合治疗治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给予本发明的结合分子及手术除去肿瘤。所述结合分子可以在手术之前、期间或之后给予哺乳动物。
治疗癌症的组合治疗也包括组合本发明提供的结合分子与放射治疗，如电离(电磁性)放疗(例如X-射线或γ射线)及粒子束流放射治疗(例如高线性能量放射)。放射来源对于哺乳动物可以是外部或内部的。所述结合分子可以在放疗之前、期间或之后给予哺乳动物。
本发明提供的结合分子和组合物可以通过任何合适的肠道途径或肠道外途径给予。术语“肠道途径”给予是指通过胃肠道的任何部分给予。肠道途径例如包括经口服、粘膜、含服和直肠途径，或者肠道内途径。“肠道外途径”给予是指除了肠道途径之外的给予途径。合适的给予途径和方法可根据许多因素而变化，如使用的特异性抗体、希望的吸收速度、使用的特定配方或剂型、治疗的疾病的类型或严重度、特定的作用部位，及患者病况，这些因素可以由本领域技术人员选择。
术语“治疗有效量”的结合分子是指对于指定的治疗目的有效的量。例如，在增强免疫应答的情况中，“治疗有效量”是有效刺激、激发、增加、改善或者增大哺乳动物免疫系统的任何应答的任何量。在治疗癌症的情况中，“治疗有效量”是足以导致治疗的哺乳动物中任何希望的或有益的作用的任何量，如抑制癌细胞的进一步生长或扩散、癌细胞死亡、抑制癌症复发、降低与癌症相关的疼痛，或者改善哺乳动物的存活。在预防癌症的方法中，“治疗有效量”是有效延迟、抑制或预防给予了该结合分子的哺乳动物中癌症发生的任何量。
结合分子的治疗有效量的范围通常是哺乳动物体重的大约0.001至大约500mg/kg，更通常是大约0.05至大约100mg/kg。例如，所述量可以是哺乳动物体重的大约0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、50mg/kg或者100mg/kg。在一些实施方案中，抗人CD134抗体的治疗有效量是哺乳动物体重的大约0.1-30mg/kg。给予的精确剂量水平可以由本领域技术人员确定，依赖于许多因素，如治疗的疾病的类型和严重度、应用的特定结合分子、给予途径、给予时间、治疗持续时间、应用的特定的另外的治疗方法、治疗患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康状况和既往病史等本领域熟知的因素。
结合分子或组合物通常多次给予。单个剂量之间的间隔可以例如是每周、每月、每三个月或每年给予一次。举例的治疗方案需要每周、每两周、每三周、每四周、每个月、每三个月或者每3-6个月给予一次。抗人CD134抗体的典型给药方案包括通过静脉内给予1mg/kg体重或者3mg/kg体重，使用如下剂量方案之一：(i)每四周给予六剂，然后每三个月给予一次；(ii)每三周给予一次；(iii)给予3mg/kg体重一次，随后每三周给予1mg/kg体重一次。
本发明提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。在一些实施方案中，在所述分子的饱和浓度或之上，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过50％。在一些实施方案中，在70nM结合分子的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过70％。本发明进一步提供了结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:12所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:13所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一些实施方案中，结合分子包含：
(a)重链CDR1，其包含SEQIDNO:14所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；
(b)重链CDR2，其包含SEQIDNO:15所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(c)重链CDR3，其包含SEQIDNO:16所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一优选的实施方案中，结合分子包含：
(a)轻链CDR1，其包含SEQIDNO:17所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；
(b)轻链CDR2，其包含SEQIDNO:18所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(c)轻链CDR3，其包含SEQIDNO:19所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
本发明进一步提供了结合分子，其与抗体竞争结合人CD134，所述抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:12所示氨基酸序列的重链可变区；及
(b)包含SEQIDNO:13所示氨基酸序列的轻链可变区。
本发明还提供了结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含SEQIDNO:4所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含SEQIDNO:5所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一个实施方案中，本发明的结合分子包含：
(a)重链CDR1，其包含SEQIDNO:6所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；
(b)重链CDR2，其包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(c)重链CDR3，其包含SEQIDNO:8所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一个实施方案中，本发明的结合分子包含：
(a)轻链CDR1，其包含SEQIDNO:9所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；
(b)轻链CDR2，其包含SEQIDNO:10所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(c)轻链CDR3，其包含SEQIDNO:11所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
在一个实施方案中，结合分子与抗体竞争结合人CD134，所述抗体包含：
(a)包含SEQIDNO:4所示氨基酸序列的重链可变区；及
(b)包含SEQIDNO:5所示氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，结合分子特异性结合人CD134的胞外结构域的氨基酸序列中的表位。在一些实施方案中，结合分子结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含如下氨基酸序列：
(a)SEQIDNO:34；
(b)SEQIDNO:35
(c)SEQIDNO:36；
(d)SEQIDNO:38；和/或
(d)SEQIDNO:92.
在一些实施方案中，结合分子不阻止参与抑制人肿瘤细胞生长的表达人CD134的人免疫活性细胞(例如激活的Teff和/或激活的Treg)上人CD134受体结合OX40配体(OX40L)。
在一些实施方案中，结合分子增强参与抑制人肿瘤细胞生长的表达人CD134的人免疫活性细胞(例如激活的Teff和/或激活的Treg)上OX40配体(OX40L)的结合和/或免疫刺激应答。
在一些实施方案中，结合分子不阻止人CD134结合OX40配体(OX40L)，并且不阻碍表达人CD134的T-效应细胞上人OX40L的免疫刺激和/或增殖应答。
本发明还提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134结合OX40配体(OX40L)，并且增强表达人CD134的T-效应细胞上人OX40L的免疫刺激和/或增殖应答。
本发明进一步提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134结合OX40配体(OX40L)，并且不阻碍表达人CD134的T-调节细胞上人OX40L的阻抑功能应答。
本发明还提供了结合人CD134的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134结合OX40配体(OX40L)，并且增强表达人CD134的T调节细胞上人CD134的阻抑功能应答。
本发明还提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子不阻止人CD134结合OX40配体(OX40L)，但是不阻碍表达人CD134的T-调节细胞上人OX40L的增殖应答。
本发明进一步提供了结合人CD134的结合分子，其中结合分子不阻止人CD134结合OX40配体(OX40L)，但是抑制表达人CD134的T调节细胞上人OX40L的增殖应答。
本发明的结合分子优选是这样的结合分子，其中在所述分子的饱和浓度或之上，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过50％。
本发明的结合分子优选是这样的结合分子，其中在70nM结合分子的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过70％。
在一个实施方案中，本发明的结合分子是人源化抗体。在另一实施方案中，本发明的结合分子是嵌合的、人源化或者DeImmunizedTM抗体，或者其片段。
在再一个实施方案中，本发明的结合分子是抗体、抗体模拟物(例如基于非抗体支架)、RNA适配体、小分子或者CovX-体。
在一些实施方案中，本发明的结合分子是IgG、IgA、IgD、IgE或者IgM抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
在一些实施方案中，结合抗体是IgG4抗体。
在一些实施方案中，所述抗体是抗体的抗原结合片段，例如选自Fv片段(例如单链Fv和二硫键合的Fv)；Fab样片段(例如Fab片段、Fab’片段和F(ab’)2片段)；及结构域抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段或结合部分是scFv。在一些实施方案中，结合部分是重组抗体。在一些实施方案中，结合部分是单克隆抗体。
本发明还提供了编码前述权利要求任一项的结合分子的核酸分子，只要所述结合部分是多肽。
本发明还提供了载体，其包含本发明的至少一种核酸分子。
本发明进一步提供了宿主细胞，其包含本发明的载体或核酸。宿主细胞优选衍生自哺乳动物或昆虫。
本发明进一步提供了一种制备本发明结合分子的方法，包括如下步骤：(i)制备CD134-结合分子，及(ii)筛选所述分子以鉴别和获得不阻止OX40L与CD134结合的结合分子。步骤(ii)优选包括当所述结合分子是单克隆抗体时，鉴别在CD134暴露于饱和浓度OX40L之后结合CD134的结合分子，制备结合分子的方法包括用人CD134免疫动物，制备分泌抗CD134抗体的杂交瘤及筛选产生抗CD134抗体的杂交瘤。本发明进一步提供了本发明或根据本发明产生的结合分子用于在有需要的对象中预防或治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、血癌(haematologicalcancer)、黑素瘤，或者特征在于不受控制的细胞生长的任何其它疾病或病症。
本发明进一步提供了一种增强人对象中免疫应答的方法，包括给予该人对象治疗有效量的本发明的或者根据本发明产生的结合分子，及任选药物学可接受的载体。增强的免疫应答可包含T-效应细胞的免疫刺激/效应功能增加，任选是这些细胞增殖的结果，和/或T-调节细胞的免疫抑制功能下调，任选这些细胞的数目不扩大。
本发明还提供了一种在有需要的人对象中治疗癌症的方法，包括给予该人对象治疗有效量的本发明的或根据本发明产生的结合分子。在一些实施方案中，所述癌症是肺癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈癌、食管癌、胃癌、结肠癌、结肠直肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肝癌、血癌、黑素瘤，或者特征在于不受控制的细胞生长的任何疾病或病症。
本发明还提供了一种在对象中降低肿瘤大小或者抑制癌细胞生长或者在患有癌症的对象中降低或抑制转移癌发展的方法，包括给予所述人对象本发明的或者根据本发明产生的结合分子。
本发明进一步提供了本发明的或者根据本发明产生的结合分子在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的或者根据本发明产生的结合部分以及一或多种药物学可接受的稀释剂或赋形剂。所述组合物优选适于肠道外给予人体，例如通过静脉内、肌肉、皮内、腹膜内、肿瘤内、膀胱内、动脉内、鞘内、囊内、框内、心脏内、经气管、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外、胸骨内或者皮下给予。
本发明进一步的实施方案
下文是本发明的一些进一步的编号的实施方案。在上文关于本发明描述的本发明实施方案的特征也涉及每一个这些进一步的编号的实施方案。
1.结合人CD134的分离的抗体，其包含SEQIDNO:100所示轻链可变区(VL)及包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，任选在SEQIDNO:100所示VL中具有1、2或3个氨基酸取代。
2.实施方案1的抗体，其中VH包含SEQIDNO:152所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:152所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
3.实施方案1或2的抗体，其中VH包含SEQIDNO:99所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:99所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
4.实施方案1-3任一项的抗体，其中HCDR3包含SEQIDNO:16、144或145所示氨基酸序列。
5.实施方案4的抗体，其中HCDR2包含SEQIDNO:15、141、142或143所示氨基酸序列。
6.实施方案5的抗体，其中HCDR1包含SEQIDNO:14所示氨基酸序列。
7.实施方案1-6任一项的抗体，其中：
a.VL包含SEQIDNO:67或68所示氨基酸序列；及
b.VH包含SEQIDNO:69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147或148所示氨基酸序列，任选在线性氨基酸残基位置11、55或99具有取代；或者
c.VL和VH包含如下氨基酸序列：
i.分别为SEQIDNO:67和69；
ii.分别为SEQIDNO:67和70；
iii.分别为SEQIDNO:67和71；
iv.分别为SEQIDNO:s68和69；
v.分别为SEQIDNO:68和70；或者
vi.分别为SEQIDNO:68和71。
8.实施方案1-7任一项的抗体，其中在线性氨基酸残基位置的取代是V11L、N55Q、N55A、N55E、M99L或M99I。
9.实施方案1-8任一项的抗体，其中结合分子结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38或SEQIDNO:92所示氨基酸序列。
10.实施方案1-9任一项的抗体，其中所述抗体是人源化或DeImmunizedTM抗体。
11.实施方案1-10任一项的抗体，其中所述抗体是CD134的激动剂。
12.实施方案1-11任一项的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
13.实施方案1-12任一项的抗体，其中所述抗体在Fc区中包含取代。
14.实施方案13的抗体，其中所述取代调节所述抗体与Fcγ受体(FcγR)或者与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。
15.实施方案14的抗体，其中所述取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号是根据EU索引编号。
16.编码实施方案1-3或7任一项的VH或VL的分离的核酸分子。
17.包含实施方案16的核酸分子的载体。
18.包含实施方案17的载体的宿主细胞。
19.实施方案1-15、23-37、41-45或49任一项的抗体，用于治疗需要增强免疫应答的对象。
20.实施方案1-15、23-37、41-45或49任一项的抗体，用于治疗癌症。
21.实施方案20的抗体，用于治疗癌症，其中所述癌症是前列腺癌、结肠癌、肺癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤或者膀胱癌。
22.药物组合物，其包含实施方案1-15、23-37或41-45任一项的的抗体和药物学可接受的载体。
23.结合人CD134的分离的抗体，其包含SEQIDNO:98所示轻链可变区(VL)及包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，任选在SEQIDNO:98所示VL中具有1、2或3个氨基酸取代。
24.实施方案23的抗体，其中VH包含SEQIDNO:134所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:134所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
25.实施方案23或24的抗体，其中VH包含SEQIDNO:97所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:97所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
26.实施方案23-25任一项的的抗体，其中HCDR3包含SEQIDNO:8、139或140所示氨基酸序列。
27.实施方案26的抗体，其中HCDR2包含SEQIDNO:7、135、136、137或138所示氨基酸序列。
28.实施方案27的抗体，其中HCDR1包含SEQIDNO:6所示氨基酸序列。
29.实施方案23-29任一项的抗体，其中：
a.VL包含SEQIDNO:62或63所示氨基酸序列；及
b.VH包含SEQIDNO:64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150或151所示氨基酸序列，任选在VH线性氨基酸残基位置11、56或106具有氨基酸取代；或者
c.VL和VH包含如下氨基酸序列：
i.分别为SEQIDNO:62和64；
ii.分别为SEQIDNO:62和65；
iii.分别为SEQIDNO:62和66；
iv.分别为SEQIDNO:63和64；
v.分别为SEQIDNO:63和65；或者
vi.分别为SEQIDNO:63和66。
30.实施方案23-29任一项的抗体，其中在线性氨基酸残基位置的取代是V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106L或M106I。
31.实施方案23-30任一项的抗体，其中所述抗体结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38或SEQIDNO:92所示氨基酸序列。
32.实施方案23-31任一项的抗体，其中所述抗体是人源化或DeImmunizedTM抗体。
33.实施方案23-32的抗体，其中所述抗体是CD134的激动剂。
34.实施方案23-33任一项的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
35.实施方案23-34任一项的抗体，其中抗体在Fc区中包含取代。
36.实施方案35的抗体，其中所述取代调节所述抗体与Fcγ受体(FcγR)或者与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。
37.实施方案36的抗体，其中所述取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号是根据EU索引编号。
38.编码实施方案23-37任一项的VH或VL的分离的核酸分子。
39.包含实施方案38的核酸分子的载体。
40.包含实施方案39的载体的宿主细胞。
41.结合人CD134的分离的激动性抗体，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL和VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3及轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
a.HCDR1包含SEQIDNO:14所示氨基酸序列；
b.HCDR2包含SEQIDNO:15、141、142或143所示氨基酸序列；
c.HCDR3包含SEQIDNO:16、144或145所示氨基酸序列；
d.LCDR1包含SEQIDNO:17所示氨基酸序列；
e.LCDR2包含SEQIDNO:18所示氨基酸序列；及
f.LCDR3包含SEQIDNO:19所示氨基酸序列
条件是所述抗体不包含如下的VH和VL，所述VH包含SEQIDNO:14、15和16所示HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，所述VL包含SEQIDNO:17、18和19所示LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
42.实施方案41的分离的抗体，其中所述抗体包含如下所示HCDR1、HCDR2和HCDR3序列：
a.分别为SEQIDNO:14、15、144；
b.分别为SEQIDNO:14、141、16；
c.分别为SEQIDNO:14、142、16；
d.分别为SEQIDNO:14、141、144；或者
e.分别为SEQIDNO:14、142、144。
43.实施方案41或42的分离的抗体，其中所述抗体是人源化的、DeImmunizedTM或人抗体。
44.实施方案41-43任一项的分离的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
45.实施方案41-44任一项的分离的抗体，其中所述抗体包含在Fc区域中的取代，所述取代调节所述抗体与Fcγ受体(FcγR)或者与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，其中所述取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号根据EU索引编号。
46.编码实施方案41的VH或VL的分离的核酸分子。
47.包含实施方案46的核酸分子的载体。
48.包含实施方案47的载体的宿主细胞。
49.分离的结合人CD134的激动性抗体，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL和VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3及轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
a.HCDR1包含SEQIDNO:6所示氨基酸序列；
b.HCDR2包含SEQIDNO:7、135、136、137或138所示氨基酸序列；
c.HCDR3包含SEQIDNO:8、139或140所示氨基酸序列；
d.LCDR1包含SEQIDNO:9所示氨基酸序列；
e.LCDR2包含SEQIDNO:10所示氨基酸序列；及
f.LCDR3包含SEQIDNO:11所示氨基酸序列；
g.条件是所述抗体不包含如下的VH和VL，所述VH包含SEQIDNO:6、7和8所示HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，所述VL包含SEQIDNO:9、10和11所示LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
本发明进一步提供了如下实施方案：
Z1.结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含图27所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含图27所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体。
Z2.结合分子，其包含：
(a)重链可变区，其包含图26所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体；和/或
(b)轻链可变区，其包含图26所示氨基酸序列或者具有1、2或3个氨基酸取代的该序列的变体.
Z3.实施方案Z1或实施方案Z2的结合分子，其结合人CD134。
Z4.实施方案Z1-3任一项的结合分子，其中所述结合分子不阻止人CD134(OX40)受体结合OX40配体(OX40L)。
Z5.实施方案Z1-4任一项的结合分子，其中在与所述CD134分子结合是饱和状态的浓度或在此之上的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过50％。
Z6.实施方案Z1-5任一项的结合分子，其中在70nM结合分子的浓度，对OX40L在表达人CD134的T细胞上与CD134结合的作用被降低不超过70％。
Z7.实施方案Z1-6任一项的结合分子，其中结合分子结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38和/或SEQIDNO:92所示氨基酸序列。
Z8.实施方案Z1-7任一项的结合分子，其是Fab片段、单链Fv(scFv)片段或者抗体。
Z9.实施方案Z8的抗体，其是人源化或DeImmunizedTMIgG、IgA、IgD、IgE或IgM抗体，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
Z10.编码实施方案Z1-9任一项的结合分子或抗体的核酸分子。
Z11.包含实施方案Z10的核酸的基因输送运载体或载体。
Z12.分离的或重组的细胞，或者体外细胞培养细胞，其包含实施方案Z10或Z11的核酸或载体。
Z13.一种产生结合分子的方法，特征在于产生实施方案Z1-8任一项的结合分子或者实施方案Z9的抗体。
Z14.实施方案Z1-9任一项的结合分子或抗体，用于治疗需要增强其免疫应答的个体。
Z15.实施方案Z1-9任一项的结合分子或抗体，用于预防或治疗有需要的个体中的癌症。
Z16.药物组合物，其包含实施方案Z1-9任一项的结合分子或抗体及药物学可接受的载体。
本发明通过如下实施例进一步例证，所述实施例不以任何方式限制本发明的范围。相反，已经了解在阅读本文的描述后，本领域技术人员在不偏离本发明精神和/或所附权利要求书的范围的前提下可以实施本发明的各种其它实施方案、修改及其等价物。
实施例
实施例1：小鼠抗人CD134(＝OX40)单克隆抗体的产生
(a).表达表面CD134的Sf9昆虫细胞的产生
将编码人CD134蛋白的cDNA(GenBankrefCAB96543.1；见SEQIDNO:1)针对昆虫细胞(Spodoterafrugiperda)表达进行优化并由德国Regensburg的GENEART合成(见SEQIDNO:2；目录号0904551(BCinternalcodeV076))。将该cDNA亚克隆在杆状病毒转移质粒pVL1393(BD转染试剂盒目录号560129；BDBiosciences)中。随后，将Sf9昆虫细胞(ATCC)用含有编码人CD134的cDNA的转移质粒pVL1393及BaculoGoldBaculovirusDNA(BD转染试剂盒)共转染，然后在27℃保温4-5天。在这个共转染步骤后，收集上清并在4℃贮存，以用于感染更多的Sf9昆虫细胞扩增病毒。为此，将Sf9昆虫细胞用扩增的重组杆状病毒转染，然后在27℃保温3-5天。收获这些Sf9昆虫细胞，用无菌PBS洗涤，等份为≈2×106细胞/250μlPBS并在-80℃贮存，获得细胞裂解物。在贮存之前，使用1:10藻红蛋白(PE)-缀合的小鼠抗人CD134(克隆ACT35；BDBiosciences)和流式细胞计量术证实在转染的Sf9昆虫细胞上人CD134的表面表达。
(b).小鼠抗人CD134单克隆抗体的免疫和产生
在第0天为BALB/c小鼠(雌性，6周龄；CharlesRiverLaboratories)皮下注射≈400μL的人CD134转染的Sf9昆虫细胞裂解物(250μL细胞裂解物等份+250μL完全弗氏佐剂；Sigma)。在第21天和第42天使用人CD134转染的Sf9昆虫细胞裂解物和不完全弗氏佐剂(Sigma)进行相似的皮下注射。在第61和第62天，用无佐剂的人CD134转染的Sf9昆虫细胞裂解物(250μL/小鼠)经腹膜内加强注射。在第65天，使用最初由andMilstein(Nature1975；256:p495-497)描述的标准杂交瘤技术将免疫的小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞(DSMZ)融合。简而言之，处死免疫的小鼠。从脾中挑取脾细胞，在无血清的具有GlutaMax培养基的opti-MEMI(SF培养基；Invitrogen)中洗涤。将对数生长的SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞在SF培养基中洗涤，加入脾细胞中产生5:1比率的脾细胞:骨髓瘤细胞。然后将细胞沉淀，除去上清。在60秒时间滴加1ml的37％(v/v)聚乙二醇4000(Merck)溶液，之后将细胞在37℃再保温60秒。然后缓慢加入8ml的SF培养基，随后加入5ml具有GlutaMax/10％(v/v)胎牛血清的opti-MEMI(FCS；Bodinco)，轻轻搅动。在室温30分钟后，沉淀细胞，在具有GlutaMax/10％FCS的opti-MEMI中洗涤以除去剩余的聚乙二醇，最后以105个细胞/200μl/孔的浓度铺板于具有GlutaMax/10％FCS/50xHybri-MaxTM氨蝶呤(denovoDNA合成抑制剂；Sigma)的opti-MEMI中。从第7天开始，每2-3天补充氨蝶呤选择培养基，在第14天将其用具有GlutaMax/10％FCS的opti-MEMI更换。将杂交瘤扩增、冷藏保存及通过有限稀释亚克隆，所述杂交瘤产生抗人CD134的抗体(小鼠IgG类别)(用常规的ELISA和流式细胞计量术筛选，分别使用重组的人CD134:人Fcγ融合蛋白(R&DSystems；见下文实施例11(a))及表达人CD134的PHA(Roche)刺激的CD4T细胞胚细胞(见下文实施例2(a))作为靶)。抗人CD134特异性单克隆抗体使用蛋白质G柱(GEHealthcare)纯化，获得小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和克隆20E5。
实施例2：小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的流式细胞术表征
(a).在PHA刺激的人T淋巴细胞上的CD134表达
将来自健康供体(知情同意)的人外周血单核细胞(PBMC)通过在Lymphoprep(1.077g/mL；Nycomed)上经密度离心分离。随后，将在含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基(Gibco)中的1-2×106PBMC/mL用0、0.1、1.0或10.0μg/mL植物血细胞凝集素-M(PHA-M；Roche)在37℃/5％CO2条件下刺激1-3天。在培养后，收获PBMC并以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水中，其中含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma)/0.05％NaN3(PBS/BSA/NaN3)，补加10％人混合血清(HPS；阻断Fcγ受体；BioWhittaker)。将细胞与10μg/mL可商购的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(小鼠IgG1同种型；BDBiosciences,AlphenaandeRijn,TheNetherlands)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:20稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的小鼠抗人CD3抗体(BDBiosciences)在4℃保温30分钟以检测T淋巴细胞。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中2％的甲醛中在4℃固定30分钟。使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量抗体的结合。
如图1所示(n＝1，来自每个供体)，外周血来源的未刺激的/静息人T淋巴细胞不表达任何CD134，然而，PHA剂量依赖性刺激人CD3+T淋巴细胞表达表面CD134。当暴露于10μg/mLPHA时，在激活的人CD3+T淋巴细胞上CD134表达水平在“第1天”与“第2天”之间似乎达到平稳状态，然而在实验期间，人CD134+/CD3+T淋巴细胞的百分比时间依赖性增加。
(b).在PHA刺激的人CD4T淋巴细胞亚群上的CD134的表达
产生PHA刺激的(0和10μg/mL，1天；见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)。将细胞与1:10稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD4抗体(BDBiosciences)或者与1:10稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD8抗体(BDBiosciences)组合1:10稀释的可商购的PE缀合的小鼠抗人CD134克隆ACT35(BDBiosciences)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中的2％甲醛中在4℃固定30分钟。使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量抗体的结合。
如图2所示，在PHA刺激的人CD4+T淋巴细胞上观测到CD134表达，在静息的人CD4+T淋巴细胞上未观测到。在PHA激活的人CD8+T淋巴细胞上发现较低的CD134表达，在静息人CD8+T淋巴细胞上未观测到(数据未示出)。
(c).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的结合
产生PHA刺激的(10μg/mL，2天；见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)。将细胞与0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg/mL可商购的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(小鼠IgG1同种型；BDBiosciences)和小鼠抗人CD134抗体克隆12H3或克隆20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:20稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD3抗体(BDBiosciences)在保温30分钟以检测T淋巴细胞。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中的2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量。
如图3所示(平均值±SD；在两个供体中观测的结果)，在大约5.0-10.0μg/mL，小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35、克隆12H3和克隆20H5饱和PHA刺激的CD3+T淋巴细胞上的人CD134表面分子。使用这两种供体，观测到对于小鼠抗人CD134抗体克隆12H3的半数最大结合为≈0.5μg/mL，对于小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35和20E5观测到为≈2.5μg/mL。
(d).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在PHA刺激的表达人CD134的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上的结合
产生PHA刺激的(20μg/mL，1天；见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)。将细胞与20.0μg/mL小鼠IgG1κ同种型对照(BDBiosciences)或者与20.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或克隆20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:100稀释的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:20稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD4抗体(BDBiosciences)或者与1:20稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD8抗体(BDBiosciences)在4℃保温30分钟，以检测T淋巴细胞亚群。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量抗体的结合。
如图4所示，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和克隆20E5证实在激活的人CD4+淋巴细胞亚群上是阳性染色，在激活的人CD8+T淋巴细胞亚群上是低阳性染色。
(e).在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5与PE缀合的商业小鼠抗CD134抗体的交叉竞争
产生PHA(10μg/mL或20μg/mL，分别4天或1天；见上述)刺激的表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)。将细胞与20μg/mL未标记的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或者与10μg/mL未标记的克隆20E5在4℃保温30分钟。随后将细胞与1:20稀释的PE-缀合的可商购小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35(BDBiosciences)或者克隆L106(BDBiosciences；也见Godfrey的专利)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。PE-缀合的可商购的抗CD134抗体的结合使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量。
如图5所示，与未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3预保温部分阻断商业的PE-缀合的针对人CD134的小鼠抗人CD134抗体克隆L106在PHA刺激的T淋巴细胞上的结合。与未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆20E5预保温轻度阻断商业的PE-缀合的针对人CD134的小鼠抗人CD134抗体克隆L106在PHA刺激的T淋巴细胞上的结合。与未标记的小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5预保温示出对于商业的PE-缀合针对人CD134的小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35在PHA刺激的T淋巴细胞上的结合无影响。
这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3特异性识别PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134(部分阻断克隆L106结合)，及结合(ii)由商业化的小鼠抗人CD134抗体克隆L106识别的人CD134上不同的表位。这些结果还表明小鼠抗人CD134抗体克隆20E5：(i)特异性识别PHA刺激的T淋巴细胞上的人CD134(轻度阻断克隆L106结合)，及(ii)结合由商业化的小鼠抗人CD134抗体克隆L106识别的不相同的表位。此外，这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5似乎识别PHA刺激的T淋巴细胞上与由商业化小鼠抗人CD134抗体克隆ACT35识别的表位不同的人CD134表位。另外，这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5似乎识别PHA刺激的T淋巴细胞上不同的人CD134表位(通过分别是部分阻断对比轻度阻断L106结合而表明)。
(f).PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上重组人OX40配体与小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5的同时结合
产生PHA刺激的(10μg/mL，1天；见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了10％HPS(阻断Fcγ受体；BioWhittaker)。将细胞与10.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40配体(OX40L；R&DSystems)组合50.0μg/mL抗-聚组氨酸抗体(小鼠IgG1，克隆AD1.1.10；R&DSystems)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:100稀释的FITC-缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与10.0μg/mL生物素化的(使用来自Pierce的N-羟基琥珀酰亚胺-生物素)小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或克隆20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:100稀释的PE-缀合的链霉亲和素(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。人OX40L与抗人CD134抗体的结合使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量。
如图6所示，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5同时结合PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的人OX40L。这表明小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和克隆20E5与人CD134受体上OX40L结合区内的表位不相互作用。这个发现与可商购的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆L106(StanfordUniversity/Godfrey专利EP0726952B1)相反，后者识别CD134受体的人OX40L结合区内的表位(TaylorandSchwarz.JImmunolMethods2001；255:67-72；Kirin&LaJollaInstitute/CroftpatentWO2007/062235A2)。
(g).在用抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激后人效应T细胞和调节T细胞上的CD134表达
使用微珠缀合的小鼠抗人CD4抗体(MiltenyiBiotec)和VarioMACSTMMagnet/LS柱(MiltenyiBiotec)，通过阳性选择方法从PBMC中纯化人CD4T淋巴细胞。随后，将这些CD4T淋巴细胞用FITC-缀合的小鼠抗人CD4抗体(Dako)和PE缀合的小鼠抗人CD25抗体(BDBiosciences)染色。使用Altra流式细胞分选仪(BeckmanCoulter)，分选CD4+/CD25-常规效应T淋巴细胞(Teff)和CD4+/CD25high调节T淋巴细胞(Treg)。这样获得>95％Teff和>95％Treg的富集。将Teff和Treg以2.5×105个细胞/mL浓度置于RPMI-1640/glutamax培养基(Gibco)中，培养基中补加了0.02mM丙酮酸盐(Gibco)、100U/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)和10％热失活的HPS(HPSi；来自LMI)。然后，将细胞以2.5×104个细胞/200μL/孔接种在96孔圆底平板(Greiner)中，在存在25U/mL重组人白细胞介素-2(来自英国NovartisPharmaceuticals公司的条件下用小鼠抗人CD3/小鼠抗人CD28抗体刺激物珠(CD3/CD28珠；Invitrogen)在37℃/5％CO2刺激2-8天。在培养后，收获细胞，以1-2×106个细胞/mL浓度置于冰冷的PBS/0.2％BSA中，同时用1:50稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD4抗体(Dako)、1:10稀释的PE-缀合的小鼠抗人CD25抗体(BDBiosciences)、1:50稀释的ECDTM-缀合的小鼠抗人CD3抗体(Beckman-Coulter)、1:10稀释的PE-CyTM5-缀合的小鼠抗人CD134抗体(克隆ATC35；BDBiosciences)和1:10稀释的PE-CyTM7-缀合的小鼠抗人CD127抗体(eBiosciences)染色。抗体的结合使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量。
如图7所示(每个供体n＝1)，外周血纯化的未刺激的/静息的(第0天)人Teff和人Treg不表达任何CD134，然而，CD3/CD28珠刺激的人Teff和人Treg表达表面CD134。激活的人Teff和人Treg上的CD134表达在培养2天后达到峰值，在培养5天和8天后减弱。
实施例3：小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的生物学表征
(a).在用小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
产生PHA刺激的(0和10μg/mL，1天；见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以2×106个细胞/mL悬浮于RPMI培养基(Gibco)中，其中含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)。将细胞以0.1×106个细胞/100μL/孔(即1×106个细胞/mL)接种于96孔平底平板(Corning)中，及在37℃/5％CO2条件下暴露于0、0.025、0.25、2.5或25.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5或者组合0、0.01、0.1或1.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40L(在存在1:5摩尔比率的小鼠抗-聚组氨酸抗体；R&DSystems)6天。6天后，细胞增殖使用比色(BrdUincorporation)CellProliferationELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量。
如图8所示(平均值±SD，n＝4，使用一个供体)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5剂量依赖性诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在0.25、2.5和25μg/mL剂量诱导增殖。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在2.5和25μg/mL剂量诱导增殖。此外，人OX40L也剂量依赖性诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖。人OX40L在0.1和1.0μg/mL剂量诱导增殖。静息(未用PHA刺激)的人CD134-T淋巴细胞在用小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3、小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5或者人OX40L处理后未示出任何增殖应答(数据未示出)。
如图9所示(平均值±SD，n＝2，使用一个供体)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3(2.5和25μg/mL)、小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5(2.5和25μg/mL)和人OX40L(1.0μg/mL)诱导PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖。未处理的(仅培养基)或者用小鼠IgG1κ同种型对照(2.5和25μg/mL；BDBiosciences)处理未表明对PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的任何作用。组合2.5和25μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3(或者在更低浓度；数据未示出)或者2.5和25μg/mL的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5(或者较低浓度；数据未示出)与1.0μg/mL的人OX40L(或者更低浓度；数据未示出)，未表明对PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的任何相互作用(即协同或累加或者甚至抑制作用)。
(b).在用小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后，抗人CD3/抗CD28珠刺激的表达人CD134的T效应细胞和T调节细胞的增殖
使用针对人CD8(克隆RPA-T8)、CD14(克隆M5E2)、CD16(克隆3G8)、CD19(克隆4G7)、CD33(克隆P67.6)、CD56(克隆B159)和CD235a(HIR2)的小鼠抗体(BDBioSciences)的混合物，通过阴性选择方法从PBMC中纯化人CD4T淋巴细胞。在与-缀合的绵羊抗小鼠IgG(Invitrogen)保温后，从Dynal磁性粒子浓缩仪MPCTM-6(Invitrogen)中收集未结合的CD4T淋巴细胞。从这些富集的CD4T淋巴细胞中，使用10μL微珠-缀合的小鼠抗人CD25抗体(MiltenyiBiotec)/107个细胞及MiniMACSTMMagnet/MS柱(MiltenyiBiotecVarioMACSTMMagnet/LS柱(MiltenyiBiotec)，通过MACS分选分离CD25highTreg与CD25-Teff。这样获得>90％Teff和>90％Treg的富集。将Teff和Treg以0.25×106个细胞/mL置于RPMI-1640/glutamax培养基(Gibco)中，所述培养基中补加了0.02mM丙酮酸盐(Gibco)、100U/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)和10％HPSi。然后，将Teff和Treg以2.5x104个细胞/200μL/孔(即0.125×106个细胞/mL)接种于96孔圆底平板(Greiner)中，用如下物质在37℃/5％CO2条件下刺激4或5天：1个珠/5个细胞的CD3/CD28珠(Invitrogen)，存在或不存在5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3，5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5，1.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40L(存在1:5摩尔比率的小鼠抗-聚组氨酸抗体；R&DSystems)，5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3与1.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40L的组合(存在1:5摩尔比率的小鼠抗聚组氨酸抗体)，或者5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5与1.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40L的组合(存在1:5摩尔比率的小鼠抗-聚组氨酸抗体)。在4或5天后，细胞增殖情况使用0.5μCi氚标记胸腺嘧啶核苷(Perkin&Elmer)掺入和β-计数仪(Canberra-Packard)测量。
如图10所示(平均值±SD)，尽管单独的CD3/CD28刺激物珠在表达人CD134的Teff中诱导明显的增殖(即培养基)，但是小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中诱导额外的增殖。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中不诱导额外的增殖。
如图11所示(平均值±SEM，来自5个供体)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Treg中不诱导或诱导低水平增殖，而人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Treg中诱导极强的增殖。
如图12A所示(平均值±SD)，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3组合人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中未表明任何相互作用(即抑制、协同或累加作用)。此外，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5组合人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中未表明任何相互作用(即抑制、协同或累加作用)(数据未示出)。
如图12B所示(平均值±SD)，与在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Teff中观测到的人OX40L-介导的增殖应答作用(缺乏任何作用)相反，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的Treg中强烈抑制人OX40L介导的增殖应答。
(c).在用小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后，抗人CD3/抗-CD28珠刺激的表达人CD134的T调节性淋巴细胞的功能抑制
如上文实施例3(b)所述，从PBMC中纯化人CD4T淋巴细胞及富集Teff和Treg。将Teff和Treg以0.25×106个细胞/mL置于RPMI1640/glutamax培养基(Gibco)中，所述培养基中补加了0.02mM丙酮酸盐(Gibco)、100U/mL青霉素(Gibco)、100μg/mL链霉素(Gibco)和10％HPSi。然后，将Teff以2.5×104个细胞/200μL/孔接种(即0.125×106Teff/mL)，并与2.5×104抑制性Treg/200μL/孔(即0.125×106Treg/mL；Teff/Treg比率＝1:1)在96孔圆底平板(Greiner)中共培养。将这些Teff/Treg共培养物用CD3/CD28珠(Invitrogen)以1个珠/10个细胞及存在或不存在5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3、5.0μg/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和1.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40L(存在1:5摩尔比率的小鼠抗-聚组氨酸抗体；R&DSystems)在37℃/5％CO2条件下刺激5天。5天后，细胞增殖情况使用0.5μCi氚标记胸腺嘧啶核苷(Perkin&Elmer)掺入及β-计数仪(Canberra-Packard)测量。
如图13所示(平均值±SD)，人Treg抑制CD3/CD28珠诱导的人Teff增殖应答(即培养基)。人Treg的这种抑制功能在存在小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或者在存在人OX40L条件下被抑制。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5示出对人Treg抑制功能无影响。
实施例4：小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的分子遗传学表征
(a).分型及Edman降解
使用IsoStripTM小鼠单克隆抗体同种型试剂盒(Roche)确定蛋白质G纯化的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的小鼠免疫球蛋白类别、同种型和轻链类型，示出小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3均由IgG1重链和kappa(κ)轻链组成。
在标准SDS-PAGE电泳后，使用预制的凝胶NuPageTMNovexTM系统(Invitrogen)在还原的(DTT和70℃加热)条件下，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5被电印迹在聚偏二氟乙烯(PDVF/Immobilon-P)转移膜(Millipore)上，用考马斯亮蓝染色(BioRad)。然后，从PVDF膜中切除重链和轻链条带(分别为50kDa和25kDa)，用于Edman降解分析(由荷兰Groningen的EuroSequence进行)，以确定N-末端氨基酸序列。对于小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5，结果示于SEQIDNO.3和SEQIDNO.61。确定重链N末端的11个氨基酸及轻链N末端的11个氨基酸。
(b).RTPCR
从细胞培养物中收获克隆20E5和12H3的杂交瘤细胞。将细胞用PBS洗涤，等份于含有5×106个细胞的小瓶中，以沉淀形式在-80℃贮存。使用RNeasyMini分离试剂盒(QIAGEN)将沉淀用于分离RNA。确定RNA浓度(A260nm)并将RNA在-80℃贮存。对于克隆20E5和克隆12H3，分离RNA的总产量分别为27.3μg和58.4μg(A260/A280比率均为1.9)。使用RevertAidTMHMinusFirstStrandcDNA合成试剂盒(Fermentas)，通过逆转录酶，从1μg的RNA中合成cDNA，在-20℃贮存。
基于小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的同种型(小鼠kappa/IgG1)和Edman降解分析，设计如下引物以扩增小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的V区：
*no.根据Bioceros内部编码系统；
**简并引物：N＝A、C、G或T，Y＝C或T，R＝A或G，W＝A或T，S＝G或C。
基于小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的同种型(小鼠kappa/IgG1)及与编码小鼠信号肽的cDNA退火的有义引物(部分基于AntibodyEngineeringVolume1Kontermann,RolandE.；Dübel,Stefan(Eds.),SpringerLabManuals,2nded.,2010),设计如下引物以扩增小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的V区：
*no.根据Bioceros内部编码系统；
**简并引物：N＝A、C、G或T，Y＝C或T，R＝A或G，W＝A或T，及S＝G或C，M＝C或A，及K＝G或T。
引物201和266是反义引物，设计为分别在小鼠kappa基因的恒定区内位置214-232和236-255退火(基于登记号V00807[版本V00807.1])。
引物203和204是反义引物，设计为分别在小鼠IgG1的恒定区内位置115-134和221-240退火(基于登记号J00453[版本J00453.1])。
引物259和260是有义简并引物(简并性分别为512和256)，基于Edman降解在小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的重链N末端(分别为氨基酸1-8和2-9)退火。
引物265是有义简并引物(简并性为16)，基于Edman降解在小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的轻链N末端(氨基酸1-7)退火。
引物416是反义引物，设计为在小鼠IgG1的恒定区内在位置111-131退火(基于登记号J00453[版本J00453.1])。
引物394是反义引物，设计为在小鼠kappa基因的恒定区内在位置235-254退火(基于登记号V00807[版本V00807.1])。
引物389、405和410是简并引物(简并性分别为2、8和8)，与鼠抗体的信号肽序列退火。引物389针对轻链设计，引物405和410针对重链设计。
引物201、266、203、204、259、260和265以各种组合使用，以扩增小鼠抗人CD134抗体克隆20E5的可变区，引物416、394、405、410和389以各种组合使用，以扩增小鼠抗人CD134抗体克隆12H3的可变区。使用产生的这两个克隆的cDNA作为模板进行各种不同的PCR。
AccuprimeTMPfxDNA聚合酶(Invitrogen)用于扩增小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和克隆12H3的重链和轻链的可变区。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上分析。PCR反应的产物经凝胶纯化并在pCR-BluntII-载体中克隆以进行序列分析。从含有PCR插入体的质粒中，使用T7通过DNA测序分析克隆的插入物(由ServicXSB.V.,Leiden,TheNetherlands或Macrogen,Amsterdam,TheNetherlands进行)，以获得小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和12H3的V区的共有序列。针对小鼠抗CD134抗体克隆20E5获得11个信息序列重链反应和3个信息轻链序列反应。针对小鼠抗CD134抗体克隆12H3获得5个信息序列重链反应和3个信息轻链序列反应。基于这个信息，确定这两种抗体的V区的共有序列(见SEQIDNO.4、5、12和13)。
实施例5：嵌合的人IgG4/kappa和/或人IgG1/kappa(即将小鼠恒定区换成人IgG/kappa结构域)抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的产生
基于确定的小鼠抗CD134抗体克隆20E5和12H3的鼠V-区(见上述实施例4(b))，设计产生嵌合的人抗体形式。为此，在GENEART(Regensburg,Germany)订购CHO细胞优化的cDNA序列(见SEQIDNO.20(编码嵌合的人重链IgG4克隆20E5)，SEQIDNO.21(编码嵌合的人轻链κ克隆20E5)，SEQIDNO.22(编码嵌合的人重链IgG1克隆20E5)，SEQIDNO.23(编码嵌合的人重链IgG4克隆12H3)及SEQIDNO.24(编码嵌合的人轻链κ克隆12H3))，其编码鼠信号肽，随后是与人kappa恒定区连接的任一可变轻链，或者随后是与人IgG恒定区连接的可变重链。对于这两种抗体进行这种设计：对于克隆20E5，将可变区重链与人IgG4或者与人IgG1恒定区连接；对于克隆12H3，将可变区重链与人IgG4恒定区连接。使用合适的限制酶，将产生的cDNA亚克隆在pcDNA3.1-衍生的表达质粒中。嵌合的抗体使用FreeStyleTMMAXCHO(CHO-Scells)表达系统(Invitrogen)表达。表达的抗体使用亲和性层析蛋白质A柱(GEHealthcare)纯化。关于嵌合的氨基酸序列，见SEQIDNO.25、26、27、28和29。
实施例6：嵌合的人IgG4/kappa和/或IgG1/kappa抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的结合表征
(a).在PHA刺激的表达人CD134的CD4阳性T淋巴细胞上人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的结合特性
产生PHA刺激的(10μg/mL，1天，见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。将细胞与0、0.007、0.02、0.07、0.2、0.6、1.9、5.6、16.7、50.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:50稀释的FITC-缀合的小鼠抗人IgG4抗体(Sigma)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:10稀释的PE-缀合的小鼠抗人CD4抗体(BDBiosciences)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在大约5.0-10.0μg/mL浓度饱和PHA刺激的CD4+T淋巴细胞上的人CD134表面分子(数据未示出)。在≈1.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5时观测到半数最大结合(数据未示出)。
(b).在PHA刺激的表达人CD134的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的结合
产生PHA刺激的(10μg/mL，1天；见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以1-2×106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。将细胞与或者不与20.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:10稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD4抗体(BDBiosciences)或者与1:10稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD8抗体(BDBiosciences)保温以检测T淋巴细胞亚群。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3在2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5表明在PHA激活的人CD4阳性T淋巴细胞亚群上的阳性染色，及在PHA激活的人CD8阳性T淋巴细胞亚群上的低阳性染色(数据未示出)。
(c).抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激的表达人CD134的CD4阳性和CD8阳性T淋巴细胞上嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的结合
来自健康供体(知情同意)的人外周血单核细胞(PBMC)在Lymphoprep(1.077g/mL；Nycomed)上通过密度离心分离。随后，将在含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基(Gibco)中的1×106PBMC/mL用小鼠抗人CD3/小鼠抗人CD28抗体刺激物珠(CD3/CD28珠；Invitrogen)以1个珠/4个细胞密度在不存在或存在25U/mL重组人白细胞介素-2(PeproTech)条件下在37℃/5％CO2刺激1天。在培养后，收获PBMC并以1-2x106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。将细胞与或不与20.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞与1:10稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD4抗体(BDBiosciences)或者与1:10稀释的FITC-缀合的小鼠抗人CD8抗体(BDBiosciences)在4℃保温30分钟，以检测T淋巴细胞亚群。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)抗体的结合。
如图14所示，嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5表明在CD3/CD28珠激活的人CD4+T淋巴细胞亚群上阳性染色，及在CD3/CD28珠激活的人CD8+T淋巴细胞亚群上低阳性染色。使用重组人IL-2补充物观测到无显著影响。
实施例7：嵌合的人IgG4/kappa抗人CD134单克隆抗体克隆20E5的生物学表征
(a).在用嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5处理后PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
产生PHA刺激的(10μg/mL，1天，见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以2×106个细胞/mL浓度悬浮于含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)。将细胞以0.1×106个细胞/100μL/孔(即1×106个细胞/mL)密度接种于96孔平底平板(Corning)中，在37℃/5％CO2条件下暴露于25.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者25.0μg/mL对照人IgG4κ抗人CD40抗体(PG102；Pangenetics)，或者暴露于1.0μg/mL聚组氨酸-标签的重组人OX40L(存在1:5摩尔比率的小鼠抗-聚组氨酸抗体；R&DSystems)6天。6天后，细胞增殖使用比色法(BrdU掺入)细胞增殖ELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量。
如图15所示(平均值±SD)，嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)和人OX40L在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞中诱导增殖。未处理(仅培养基)或者用对照人IgG4κ抗人CD40抗体(huIgG4)处理未表明对于PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖的任何作用。
(b).在用嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5组合重组人OX40L处理后，PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
产生PHA刺激的(10μg/mL，1天，见上述)表达人CD134的T淋巴细胞。收获细胞并以2×106个细胞/mL悬浮于含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)中。将细胞以0.1×106个细胞/100μL/孔(即1×106个细胞/mL)接种于96孔平底平板(Corning)中，在37℃/5％CO2条件下暴露于0、0.025、0.25、2.5或者25.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5，或者/和组合0、0.01、0.1或1.0μg/mL聚组氨酸标签的重组人OX40L(存在1:5摩尔比率的小鼠抗-聚组氨酸抗体；R&DSystems)6天。6天后，细胞增殖使用测量比色法(BrdU掺入)细胞增殖ELISATM(Roche)和ELISA分析仪(BioRad)在A450nm测量。
如图16所示(平均值±SD)，嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)和人OX40L以剂量依赖形式在PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞中诱导增殖。嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5在2.5和25μg/mL(供体1)或者在0.25、2.5和25μg/mL(供体2)以供体依赖性形式诱导增殖。另外，人OX40L在0.1和1.0μg/mL(供体1)或者在0.01、0.1和1.0μg/mL(供体2)以供体依赖性形式诱导增殖。
如图17所示17(平均值±SD)，2.5和25μg/mL(或更低浓度；数据未示出)的嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)与0.1和1.0μg/mL(或者更低浓度；数据未示出)的人OX40L对于PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞增殖未表明有任何相互的作用(即协同或累加，或者甚至抑制性作用)。
(c).在用嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5处理后，抗人CD3/抗人CD28抗体刺激物珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞的增殖
来自健康个体(知情同意)的人外周血单核细胞(PBMC)在Lymphoprep(1.077g/mL；Nycomed)上通过密度离心分离。随后，将PBMC以0.1×106个细胞/100μL/孔(即1×106个细胞/mL)接种在96孔平底平板(Corning)中的含有10％胎牛血清(Bodinco)和50μg/mL庆大霉素(Gibco)的RPMI-1640培养基(Gibco)中，用小鼠抗人CD3/小鼠抗人CD28抗体刺激物珠(CD3/CD28珠；Invitrogen)以1个珠/2个细胞在不存在或存在25U/mL重组人白细胞介素-2(PeproTech)条件下在37℃/5％CO2刺激。在1天或2天后，将这些(没有和有白细胞介素-2)CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞在37℃/5％CO2条件下暴露于25.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者暴露于1.0μg/mL聚组氨酸-标签的重组人OX40L(存在1:5摩尔比率小鼠抗-聚组氨酸抗体；R&DSystems)6天或5天。将最初用CD3/CD28珠加上重组人白细胞介素-2组合刺激的细胞再刺激1天，之后使用25U/mL重组人白细胞介素-2测量细胞增殖。暴露于嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或者暴露于人OX40L在6天或5天后，使用比色法(BrdU掺入)细胞增殖ELISATM(Roche)和ELISATM分析仪(BioRad)在A450nm测量细胞增殖。
如图18所示(平均值±SD，使用一个供体n＝3)，尽管单独CD3/CD28刺激物珠在表达人CD134的T淋巴细胞诱导明显的增殖(即培养基)，但是嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5(hu20E5)和人OX40L在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞中诱导额外的增殖。加入白细胞介素-2在CD3/CD28珠刺激的表达人CD134的T淋巴细胞中似乎只增强基础增殖。
(d).在用人(嵌合的)抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理后，恒河猴中免疫刺激性应答
非人灵长目动物恒河猴可以用猿猴免疫缺陷病毒蛋白gp130免疫，如Weinbergetal.(JImmunother2006；29:575-585)所述。
预期来自用人(例如嵌合的或人源化的或去免疫的(deimmunized)；例如亚类人IgG1或IgG4)抗人CD134抗体克隆12H3和20E5处理的免疫的猴的引流淋巴结与对照免疫的猴相比示出增大的淋巴结。预期用小鼠或人源化12H3或20E5抗体处理的动物与对照组相比示出增加的gp130-特异性抗体效价及增加的长期存活的T细胞应答。在经过处理的猴中应没有明显的毒性证据。
实施例8：由小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的人CD134结构域和表位的表征
(a).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与非还原的和还原的重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的结合(western印迹)
将1300或650ng/泳道(考马斯亮蓝染色)或250ng/泳道(western印迹)的重组人CD134:人Fcγ(IgG1)融合蛋白(R&DSystems)使用4-12％Tris-Bis凝胶和MOPS电泳缓冲液(Invitrogen)在多种非还原和还原条件下电泳(见图19-A)，在预制的LDS-PAGE变性电泳系统中进行。然后，将重组人CD134:人Fcγ融合蛋白用考马斯亮蓝(BioRad)染色或者电印迹在聚偏二氟乙烯(PDVF)转移膜(Millipore)上。在用在PBS/0.05％Tween20/1％BSAfractionV(Roche)室温封闭20分钟之后，将PDVF膜与100ng/mL小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或20E5在室温保温1小时。平行地，将100ng/mL小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BDBiosciences)用作阴性对照。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或20E5的结合使用1:5000稀释的辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗-小鼠Fcγ-特异性抗体(JacksonImmunoResearch)在室温1小时确定，随后通过现成的TMB底物(Sigma)溶液进行比色检测。
如图19-B所示，在非还原(及无或有热变性的LDS变性，分别为条件a和b)条件下，重组人CD134:人Fcγ融合蛋白证实分子量为≈130-140kDa。无加热的非还原条件(条件a)示出紧密相邻的两个条带，提示一小部分重组人CD134:人Fcγ融合蛋白不完全变性/展开。加热的非还原条件(条件b)示出一个条带，提示重组人CD134:人Fcγ融合蛋白完全变性/展开。重组人CD134:人Fcγ融合蛋白在还原条件(及无或有热变性的LDS变性，分别为条件c和d)下获得条带≈110kDa(条件c)和≈60-65kDa(条件d)。前一观测结果提示重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的不完全还原，后一观测结果提示每个重组人CD134:人Fcγ融合蛋白分子内连接两个人IgG1-衍生的Fcγ-片段的二硫键的完全还原/破坏。
如图19-C所示，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5在非还原条件(及无和有热变性的LDS变性，分别为条件a和b)下识别重组人CD134:人Fcγ融合蛋白主要是≈130kDa。相反，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3示出在还原(及无或有热变性的LDS变性，分别为条件c和d)条件下与重组人CD134:人Fcγ融合蛋白仅轻度结合，而小鼠抗人CD134抗体克隆20E5示出在还原条件(及无或有热变性的LDS变性，分别为条件c和d)下与重组融合蛋白的强结合。
这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5特异性识别人CD134。此外，这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和克隆20E5似乎识别不同的人CD134表位，这通过在还原条件(及无或有热变性的LDS变性)下与重组人CD134:人Fcγ融合蛋白分别的轻度结合(克隆12H3)vs.强结合(克隆20E5)而表明。这些结果提示小鼠抗人CD134抗体克隆12H3识别人CD134上的一个表位，其对于变性(LDS和热处理)不敏感，对于还原(即通过DTT破坏二硫键，更可能是半胱氨酸富集的结构域(CRD)相关的)敏感。这些结果提示小鼠抗人CD134抗体克隆20E5识别人CD134上的一个表位，其对于变性(LDS及热处理)不敏感，对于还原(即通过DTT破坏二硫键，更可能是CRD相关的)不敏感。
(b).小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与在293-F细胞系上表达的全长人CD134构建体和各种截短的人CD134构建体的结合(结构域作图)
为了分析小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的精细特异性，通过结构域作图确定由小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的表位的位置。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5结合在(HEK-衍生的)297-F细胞表面上表达的截短的人CD134构建体的能力通过FACS分析确定。
基于文献所述(Swiss-Prot:P43489.1；Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683；Bodmeretal.TrendsBiochemSci2002；27:19-26；Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330；USPatentPubl.No.2011/0028688A1)，鉴别了人CD134的胞外区中半胱氨酸富集的结构域(CRD)和铰链样结构。CRD是编码的CRD1、CRD2、(截短的)CRD3、(截短的)CRD4(见图20)。CRD含有拓扑学不同类型的模块，称作A-模块和B模块(也见图20)。A模块是C-形结构，B模块是S-形结构。典型的CRD通常由A1-B2-模块或者A2-B1-模块组成(或者不太常见的不同配对的模块，如A1-B1)，具有6个保守的半胱氨酸残基，其中数字表示每个模块内二硫键的数目(也见图20)。如图20所示，产生并表达5个不同的人CD134构建体：(1)全长人CD134构建体，其以N末端CRD1起始(即CRD1A1-B2-模块，覆盖氨基酸29-65)，并因此表示为“CRD1”，包含氨基酸1-277(见SEQIDNO.1)；(2)“CRD2”构建体，以N末端CRD2起始(即CRD2A1B2-模块，覆盖氨基酸66-107)，及包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸66-277(见SEQIDNO.30)；(3)“CRD3”构建体，以N末端CRD3起始(即CRD3A1-B1-模块，覆盖氨基酸108-146(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330)或者截短的CRD3A1-模块，覆盖氨基酸108-126(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683))，及包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸108-277(见SEQIDNO.31)；(4)“CRD4”构建体，其包括N末端的CRD4或CRD3亚结构域B1模块/截短的CRD4A1-模块(即CRD4A1-B1-模块，覆盖氨基酸127-167(Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683)或者CRD3亚结构域B1-模块与截短的CRD4A1-模块的组合(在图20中未示出)，分别覆盖氨基酸127-146及氨基酸147-167(Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330))，以及包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸127-277(见SEQIDNO.32)；以及(5)“截短的(tc)CRD4”构建体，其包括N末端截短的CRD4或CRD4亚结构域B1-模块(即截短的CRD4A1模块，覆盖氨基酸147-167(Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330)或者CRD4亚结构域B1-模块(在图20中未示出；Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683)，覆盖氨基酸147-167)，以及包含与信号肽氨基酸1-28连接的氨基酸147-277(见SEQIDNO.33)。通过使用AccuprimeTMPfxDNA聚合酶(Invitrogen)的装配PCR，产生这5个人CD134构建体，使用下表中的引物进行：
*引物No.：根据Bioceros内部编码系统
简而言之，分别使用引物对362/365和364/363，在PCR反应中用全长人CD134作为模板扩增编码信号肽的氨基酸1-28的cDNA及编码人CD134的氨基酸66-277的cDNA。随后，使用引物对362/363，通过使用这两个PCR产物在装配PCR中产生“CRD2”构建体。使用合适的限制位点将编码CRD2构建体的cDNA亚克隆进pcDNA3.1-衍生的表达质粒中。相似地，使用上表中示出的相应引物，产生“CRD3”构建体(信号肽的氨基酸1-28，与人CD134的氨基酸108-277连接)、“CRD4”构建体(信号肽的氨基酸1-28，与氨基酸127-277连接)，及“截短的CRD4”构建体(信号肽的氨基酸1-28，与氨基酸147-277连接)，并亚克隆进pcDNA3.1-衍生的表达质粒中。此外，将全长人CD134(SEQIDNO.1)也再克隆进pcDNA3.1-衍生的表达质粒中。
使用FreeStyleTM293表达系统(Invitrogen)，将FreeStyleTM293-F细胞(Invitrogen)用5个产生的人CD134变体瞬时转染。48-72小时后，通过FACS分析转染的细胞上表面人CD134表达。最后，收获转染的细胞，并以1-2×106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。将细胞与20.0μg/mL的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在4℃保温30分钟。平行地，20.0μg/mL小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BDBiosciences)用作阴性对照。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图21所示，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5均识别转染的293-F细胞上的全长(表示为“CRD1”构建体)人CD134，而小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5示出在模拟转染的293-F细胞上无结合。此外，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5识别转染的293-F细胞上缺少CRD1和CRD1-CRD2的截短的人CD134变体(分别表示为“CRD2”构建体和“CRD3”构建体)。相反，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1模块的截短的人CD134变体(表示为“CRD4”构建体)的结合非常弱，小鼠抗人CD134抗体克隆12H3与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1B1模块(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330定义)的截短的人CD134变体(表示为“tcCRD4”构建体)的结合完全不存在，而小鼠抗人CD134抗体克隆20E5示出与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(表示为“CRD4”构建体)及与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677683的定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330的定义，表示为“tcCRD4”)的截短的人CD134变体构建体的强结合。
这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5特异性识别人CD134(全长人CD134转染与模拟转染的对比)。此外，这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5似乎识别不同的人CD134表位，这通过与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块(表示为“CRD4”构建体)的截短的人CD134变体及与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677683定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330定义；表示为“tcCRD4”构建体)的截短的人CD134变体的分别的不结合(使用克隆12H3)及强结合(使用克隆20E5)而证明。这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3似乎不识别CRD1和CRD2中的人CD134表位，小鼠抗人CD134抗体克隆20E5似乎不识别CRD1、CRD2和截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1B1模块(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330定义)中的人CD134表位。这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3似乎识别胞外人CD134上截短的CRD3A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)中的线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列108-126(即19个氨基酸的肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQIDNO:34)，或者氨基酸序列108-126(即19个氨基酸的肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQIDNO:34)组成结合在胞外人CD134上的截短的CRD3A1-模块/CRD4A1-B1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)及可能在铰链样结构中的非线性/构象表位的一部分，所述表位具有氨基酸序列108-214(见SEQIDNO:35)。这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆20E5似乎识别胞外人CD134上截短的CRD4A1-模块(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330定义)中及可能在铰链样结构中的线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列147-214(SEQIDNO:36)。
使用结晶学，Compaanetal.(Structure2006；14:1321-1330)近来公开了人CD134上的CRD1、CRD2(特别是A1环及随后的残基)及CRD3(主要是A1环)在OX40配体(CD252)/CD134(＝OX40)相互作用期间的关键参与作用。这个公开与我们的发现一致，即(1，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆20E5似乎不识别胞外人CD134上CRD1、CRD2和截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)或者CRD1-CRD2-CRD3A1-B1-模块(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330定义)中的人CD134表位，及(2，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆20E5同时结合PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的人OX40L。这提示小鼠抗人CD134抗体克隆20E5识别人CD134上的表位，其不关键性参与人CD134与人OX40L的相互作用。此外，我们的发现(1，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆12H3似乎识别胞外人CD134上截短的CRD3A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)中的线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列108-126(即19个氨基酸的肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQIDNO:34)，或者氨基酸序列108-126(即19个氨基酸的肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCA；见SEQIDNO:34)组成结合在胞外人CD134上的截短的CRD3A1-模块/CRD4A1-B1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)及可能在铰链样结构中的非线性/构象表位的一部分，所述表位具有氨基酸序列108-214(见SEQIDNO:35)，及(2，见上述)小鼠抗人CD134抗体克隆12H3同时结合PHA刺激的表达人CD134的T淋巴细胞上的人OX40L，证实人CD134上由小鼠抗人CD134抗体克隆12H3识别的表位(如上述)不关键性参与人CD134与人OX40L的相互作用。
(c).使用人CD134-衍生的肽ELISA进行的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的表位作图(1)
为了进一步分析小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的精确特异性，由小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3识别的表位的位置通过表位作图确定。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3结合人CD134-衍生的肽的能力通过ELISA确定，所述肽相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块的氨基酸序列(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677683定义)。
在PBS中于4℃将96孔平底ELISA平板(Corning)用10ng/孔人CD134-衍生的肽(由PepscanPresto,Lelystad,TheNetherlands合成)包被过夜，所述肽相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1模块的氨基酸序列(见SEQIDNO:38)，或者用10ng/孔人纤连蛋白衍生的对照肽(由PepscanPresto,Lelystad,TheNetherlands合成)包被过夜，所述肽相应于另外的III型结构结构域的氨基酸序列(见SEQIDNO:37)。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，将平板在PBS/0.05％Tween20/1％BSAfractionV(Roche)中在室温封闭1小时。随后，将平板与0,0.00005-50.0(在封闭缓冲液中10-倍稀释系列)μg/mL的小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BDBiosciences)在室温保温1小时。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，抗体的结合用1:5000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗-小鼠IgGFcγ特异性抗体(JacksonImmunoResearch)在室温1小时进行确定，随后用现成的TMB底物溶液(Invitrogen)进行比色检测。在加入1MH2SO4之后，使用微平板分析仪(BioRad)在450nm波长测量光密度(参考波长655nm)。
如图23A(n＝1)所示，小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3剂量依赖性及特异性结合人CD134-衍生的肽，而小鼠IgG1κ同种型对照抗体表明与人CD134衍生的肽不结合。小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和IgG1κ同种型对照抗体表明与人纤连蛋白衍生的对照肽不结合。
这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3特异性识别人CD134上的表位(对比人CD134-衍生的肽vs.人纤连蛋白衍生的对照肽)。此外，这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3似乎识别胞外人CD134上截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)中的线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列108-146(即39-个氨基酸的肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN；见SEQIDNO:38)。
(d)通过Pepscan使用CLIPS表位作图技术对小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的表位作图(2)
通过Pepscan的CLIPS表位作图技术(Lelystad,TheNetherlands)可用于确定由小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5识别的表位。这种CLIPS技术使得可以确定参与二聚体或多聚体蛋白质复合物的线性、构象性、不连续的及复合的表位。为此，人CD134＝OX40的线性氨基酸序列(SEQIDNO:1)用作靶蛋白质。
实施例9：由嵌合的人IgG4/kappa和/或IgG1/kappa抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的人CD134结构域和表位的表征
(a).嵌合的人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与在293-F细胞系上表达的全长人CD134构建体及各种截短的人CD134构建体的结合(结构域作图)
为了分析嵌合的人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的精确特异性，由嵌合的人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的表位的位置通过结构域作图确定。通过FACS分析确定嵌合的人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与在(HEK-derived)297-F细胞表面上表达的截短的人CD134构建体(见实施例8(b))的结合的能力。
使用FreeStyleTM293表达系统(Invitrogen)，将FreeStyleTM293-F细胞(Invitrogen)用5个产生的人CD134变体瞬时转染(见上述)。在48-72小时之后，通过FACS分析转染的细胞上表面人CD134表达。为此，收获转染的细胞并以1-2x106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中。将细胞与或不与20.0μg/mL嵌合的人IgG4κ和/或IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术(FACSCalibur；BDBiosciences)测量。
如图22所示，嵌合的人IgG4κ和IgG1κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3以及嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5均表明与转染的细胞上各种截短的人CD134构建体的结合特性，这与其相应的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5相应物的结合特性相同(见实施例8(b)；对比见图22与图21)。
(b).使用人CD134-衍生的肽ELISA对嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的表位作图
为了进一步分析嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的精确特异性，由嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3识别的表位的位置通过表位作图确定。通过ELISA确定嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3结合人CD134-衍生的肽的能力，其相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块的氨基酸序列(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)。
在PBS中于4℃将96孔平底ELISA平板(Corning)用10ng/孔的人CD134-衍生的肽(由PepscanPresto,Lelystad,TheNetherlands合成)包被过夜，所述肽相应于截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1模块的氨基酸序列(见SEQIDNO.38)，或者用10ng/孔的人纤连蛋白对照肽(由PepscanPresto,Lelystad,TheNetherlands合成)包被过夜，所述肽相应于另外的III型结构结构域的氨基酸序列(见SEQIDNO.37)。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，将平板在PBS/0.05％Tween20/1％BSAfractionV(Roche)中在室温封闭1小时。随后，将平板用0,0.00005-50.0(在封闭缓冲液中10-倍系列稀释)μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3或对照人IgG4κ抗人CD40抗体(Biocult)在室温保温1小时。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，抗体的结合使用1:5000稀释的辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗人IgGFcγ-特异性抗体(JacksonImmunoResearch)在室温1小时进行确定，随后使用现成的TMB底物溶液(Invitrogen)进行生色检测。在加入1MH2SO4之后，使用微平板分析仪(BioRad)在450nm波长测量光密度(参考波长655nm)。
如图23B(n＝1)所示，嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3剂量依赖性及特异性结合人CD134-衍生的肽，而对照人IgG4κ抗人CD40抗体表明与人CD134-衍生的肽不结合。嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和对照人IgG4κ抗人CD40抗体均表明与人纤连蛋白衍生的对照肽不结合。
这些结果表明嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3特异性结合人CD134上的表位(对比人CD134-衍生的肽vs人纤连蛋白衍生的对照肽)。此外，这些结果表明嵌合的人IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3似乎识别胞外人CD134上截短的CRD3A1-模块-CRD4亚结构域A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)中的线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列108-146(即39个氨基酸的肽RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN；见SEQIDNO:38)。
实施例10：人源化IgG4/kappa抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的产生
基于确定的小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和12H3的鼠V-区(见实施例2(b))，产生人源化抗体形式。
小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和12H3的人源化可变轻链序列和人源化可变重链序列使用PDL技术(由PanaromaResearchInstitute,Sunnyvale,CA,USA进行)获得。人源化可变轻链和可变重链氨基酸序列见SEQIDNO:62(20E5-VL1)、63(20E5-VL2)、64(20E5-VH1)、65(20E5-VH2)、66(20E5-VH3)和SEQIDNO.67(12H3-VL1)、68(12H3-VL2)、69(12H3-VH1)、70(12H3-VH2)、71(12H3-VH3)。
在这种设计之后，在GENEART(Regensburg,Germany)订购Cricetulusgriseus-优化的cDNA序列(见SEQIDNO:72、73、74(编码全长人源化重链IgG4克隆20E5形式，即分别为VH1、VH2、VH3)，SEQIDNO.75、76(编码全长人源化轻链κ克隆20E5形式，即分别为20E5_VL1、20E5_VL2)，SEQIDNO:77、78、79(编码全长人源化重链IgG4克隆12H3形式，即分别为VH1、VH2、VH3)，及SEQIDNO.80、81(编码全长人源化轻链κ克隆12H3形式，即分别为VL1、VL2))，其编码信号肽，随后是与人IgG4恒定区连接的人源化可变重链，或者随后是与人κ恒定区连接的人源化可变轻链可变重链：(1)为了表达人源化抗人CD134抗体克隆20E5形式，小鼠免疫球蛋白重链信号肽用于人源化重链和轻链，及(2)为了表达人源化抗人CD134抗体克隆12H3形式，人免疫球蛋白重链信号肽用于人源化重链，人免疫球蛋白κ链信号肽用于人源化轻链。此外，所有人源化抗体均表达为稳定的人IgG4分子，如Angaletal.(Mol.Immunol.,Vol.30,No.1,pp.105-108,1993)所述。使用合适的限制酶，将产生的cDNA亚克隆进pcDNA3.1衍生的表达质粒中。
使用FreeStyleTMMAXCHO表达系统(LifeTechnologies)表达人源化抗人CD134抗体克隆20E5形式。使用FreeStyleTM293表达系统(LifeTechnologies)表达人源化抗人CD134抗体克隆12H3形式。产生的人源化抗体使用亲和层析蛋白质A柱(GEHealthcare)纯化。以这种方式，产生6个纯化的抗体克隆20E5人源化形式，即20E5_VL1VH1、20E5_VL1VH2、2-E5_VL1VH3、20E5_VL2VH1、20E5_VL2VH2和20E5_VL2VH3，及6个纯化的抗体克隆12H3人源化形式，即12H3_VL1VH1、12H3_VL1VH2、12H3_VL1VH3、12H3_VL2VH1、12H3_VL2VH2和12H3_VL2VH3。
对于人源化氨基酸序列，见SEQIDNO:82、83、84(编码全长人源化重链IgG4克隆20E5形式，即分别为VH1、VH2、VH3)，SEQIDNO.85、86(编码全长人源化轻链κ克隆20E5形式，即分别为VL1、VL2)，SEQIDNO.87、88、89(编码全长人源化重链IgG4克隆12H3形式，即分别为VH1、VH2、VH3)，及SEQIDNO.90、91(编码全长人源化轻链κ克隆12H3形式，即分别为VL1、VL2)。
实施例11：人源化IgG4/kappa抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的结合表征
(a).人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3与重组人CD134:人Fcγ融合蛋白的结合(ELISA)
将96孔平底ELISA平板(Corning)用50ng/孔重组人CD134:人Fcγ(IgG1)融合蛋白(R&DSystems)在PBS中于4℃包被过夜。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，将平板在PBS/0.05％Tween20/1％BSAfractionV(Roche)中在室温封闭1小时。随后，将平板与0,0.0003-20.0(在封闭缓冲液中3-倍系列稀释)μg/mL亲代小鼠抗人CD134抗体克隆120E5或12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或12H3以及6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或12H3在室温保温1小时。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，抗体的结合使用1:5000稀释的辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗-小鼠(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)或者用1:4000稀释的辣根过氧化物酶-缀合的山羊抗人κ特异性抗体(SouthernBiotech)在室温1小时进行确定，随后使用现成的TMB底物(Invitrogen)溶液进行比色检测。在加入1MH2SO4之后，使用微平板分析仪(BioRad)在450nm波长测量光密度(参考波长655nm)。
如图28(n＝2)所示，嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5及所有6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5剂量依赖性及特异性结合重组人CD134。嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5和人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2和20E5_VL2VH3示出相同滴定曲线，表明其CD134抗原结合亲和性是相同的(半数最大结合EC50≈100ng/mL)，而人源化的IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1H1和20E5_VL1H2似乎示出略低的结合亲和性(EC50≈150ng/mL)。由于使用不同的免疫球蛋白链特异性二级抗体(即小鼠抗体使用抗-Fcγ链特异性抗体检测，而嵌合的人和人源化抗体用抗-κ链特异性抗体检测)，因此不能产生亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5滴定曲线与嵌合的人和人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式的滴定曲线之间的对比(数据未示出)。
如图29(n＝2)所示，嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3剂量依赖性及特异性结合重组人CD134。嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3和人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3-所有6个形式12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2和12H3_VL2VH3-示出不同的滴定曲线，表明所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式均示出比嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3(EC50≈100ng/mL)略高的CD134抗原结合亲和性(EC50≈50ng/mL)。由于使用不同的免疫球蛋白链特异性二级抗体(即小鼠抗体使用抗-Fcγ链特异性抗体检测，而嵌合的人和人源化抗体用抗-κ链特异性抗体检测)，因此不能产生亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3滴定曲线与嵌合的人和人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式的滴定曲线之间的对比(数据未示出)。
(b).人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3与生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3竞争结合重组人CD134:人Fcγ融合蛋白(ELISA)
在进行竞争性ELISA测量之前，确定生物素化的(使用得自Pierce的N-羟基琥珀酰亚胺-生物素)亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的EC50(见下文方法)，并鉴别为大约20ng/mL(见图30，n＝3)。随后研究生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在其鉴别的EC50浓度由未标记的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3的置换。
将96孔平底ELISA平板(Corning)用50ng/孔重组人CD134:人Fcγ(IgG1)融合蛋白(R&DSystems)在PBS中于4℃包被过夜。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，将平板在PBS/0.05％Tween20/1％BSAfractionV(Roche)中在室温封闭1小时。随后，将平板与0,0.001-60.0(在封闭缓冲液中3-倍系列稀释)μg/mL未标记的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3或者6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3组合20ng/mL(EC50)生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在室温保温1小时。在PBS/0.05％Tween20中充分洗涤后，生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的结合使用1:5000稀释的辣根过氧化物酶-缀合的链霉亲和素(JacksonImmunoResearch)在室温1小时确定，随后使用现成的TMB底物(Invitrogen)溶液进行比色检测。在加入1MH2SO4之后，使用微平板分析仪(BioRad)测量在450nm波长的光密度(参考波长655nm)。
如图31(n＝2)所示，未标记的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和未标记的嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3表明相同的生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的置换，这表明亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3呈现出相同的CD134抗原结合亲和性(生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3半数最大置换或抑制(IC50)为≈750ng/mL)。所有6个未标记的人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式-12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2和12H3_VL2VH3-均表明相似的生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的置换，这表明所有6个未标记的人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式均呈现出相似的CD134抗原结合亲和性(IC50≈250-300ng/mL)。
这些结果表明所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式均示出与亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3相比较高的CD134抗原结合亲和性。
(c).人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3与在293-F细胞系上表达的全长人CD134构建体的结合(FACS)
为了详细分析人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3的结合，人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆20E5和12H3与(稳定转染的)293-F细胞系上表面人全长CD134的结合能力通过流式细胞计量术确定，并进一步与其相应亲代小鼠抗人CD134抗体配对物的结合特性对比。
将全长人CD134(SEQIDNO.1)在pcDNA3.1-衍生的表达质粒中再克隆(见实施例11(d))。使用FreeStyleTM293表达系统(LifeTechnologies)，将这个全长人CD134质粒转染进FreeStyleTM293-F细胞(LifeTechnologies)。使用125μg/mLG418(Gibco)选择稳定的人全长CD134-转染的细胞(克隆no.5，具有较高表面CD134表达水平；克隆no.23，具有中等表面CD134表达水平；见图32)，收获并以1-2×106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了50μg/mL纯化的人IgG(Sigma；封闭Fcγ受体)。将细胞与0,0.005-50μg/mL(在PBS/BSA/NaN3中10倍系列稀释；所有克隆20E5形式)或者0.002-20μg/mL(在PBS/BSA/NaN3中10倍系列稀释；所有克隆12H3形式)的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5或12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或12H3以及6个人源化形式人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5或12H3在4℃保温30分钟。平行地，将小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BDBiosciences；50.0或20.0μg/mL)及嵌合的人IgG4κ同种型对照抗体(来自PanGenetics的克隆ch5D12；50.0或20.0μg/mL)用作阴性对照。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)或者与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗人IgG(Fcγ)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中在2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图33所示(人全长CD134-转染的细胞克隆no.5，具有较高的表面CD134表达水平；n＝1)，亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5及所有6个人源化形式的IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5剂量依赖性及特异性结合细胞表面表达的人CD134。亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5及人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2和20E5_VL2VH3均示出相似的滴定曲线，这表明其CD134抗原结合亲和性是非常相似的，而人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式VL1H1和VL1H2似乎示出略低的结合亲和性。
如图34所示(人全长CD134-转染的细胞克隆no.5，具有较高的表面CD134表达水平；n＝2)，亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化形式的IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3均剂量依赖性及特异性结合细胞表面表达的人CD134。亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3和人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式12H3_VL2H1和12H3_VL2VH3均示出相同的滴定曲线，这表明其CD134抗原结合亲和性是相同的，而人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3和12H3_VL2H2似乎示出略高的结合亲和性。
如图35所示(人全长CD134-转染的细胞克隆no.23，具有中等的表面CD134表达水平；n＝2)，亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3和所有6个人源化形式的IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3均剂量依赖性及特异性结合细胞表面表达的人CD134。亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3示出相似的滴定曲线，表明其CD134抗原结合亲和性是相似的(EC50>200ng/mL)，而所有6个人源化形式的IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式-12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2和12H3_VL2VH3-似乎示出更高的结合亲和性(EC50<200ng/mL)。
总之，这些流式细胞计量结果表明人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1H3、20E5_VL2H1、20E5_VL2VH2、20E5_VL2VH3、亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5和嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5均示出相似的CD134抗原结合亲和性，而人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1H1和20E5_VL1H2似乎示出略低的CD134抗原结合亲和性。此外，这些结果表明所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式与亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3相比较高的CD134抗原结合亲和性。
(d).人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5与在293-F细胞系上表达的全长人CD134构建体及各种截短的人CD134构建体的结合(FACS结构域作图)
为了分析人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5的精确特异性，通过结构域作图确定由人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5识别的表位位置。人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5结合在(HEK-衍生的)297-F细胞表面表达的截短的人CD134构建体的能力通过流式细胞计量术分析。
基于文献(Swiss-Prot:P43489.1；Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683；Bodmeretal.TrendsBiochemSci2002；27:19-26；Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330；USPatentPubl.No.2011/0028688)，鉴别了人CD134胞外区中半胱氨酸富集结构域(CRD)和铰链样结构。CRD是编码的CRD1、CRD2、(截短的)CRD3、(截短的)CRD4(见图20)。CRD含有拓扑学独特类型的模块，称作A-模块和B-模块(也见图20)。A-模块是C形结构，B-模块是S形结构。典型的CRD通常由A1-B2-模块或A2-B1-模块组成(或者不太常见的不同配对的模块，如A1-B1)，具有6个保守半胱氨酸残基，其中数字表示每个模块内二硫键的数目(也见图20)。如图20所示，产生并表达3个不同的人CD134结构：(1)全长人CD134构建体，其以N末端CRD1起始(即CRD1A1-B2-模块，覆盖氨基酸29-65)，因此表示为“CRD1”，包含氨基酸1-277(见SEQIDNO.1)，(2)“CRD3”构建体，其以N末端CRD3起始(即CRD3A1-B1-模块，覆盖氨基酸108-146(根据Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330)，或者截短的CRD3A1-模块，覆盖氨基酸108-126(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683))，包含氨基酸108-277，与信号肽氨基酸1-28连接(见SEQIDNO:31)，(3)“CRD4”构建体，其包括N末端CRD4或CRD3亚结构域B1-模块/截短的CRD4A1-模块(即CRD4A1-B1-模块，覆盖氨基酸127-167(Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683)，或者组合(图20中未示出)CRD3亚结构域B1-模块与截短的CRD4A1-模块，分别覆盖氨基酸127-146与氨基酸147-167(Compaanetal.Structure2006；14:1321-1330))，包含氨基酸127-277，与信号肽氨基酸1-28连接(见SEQIDNO:32)。通过使用AccuprimeTMPfxDNA聚合酶(Invitrogen)及使用下表2中所示引物进行装配PCR，产生这3个人CD134构建体。
表2
*引物No.根据Bioceros内部编码系统。
简而言之，将编码信号肽的氨基酸1-28的cDNA及编码人CD134的氨基酸66-277的cDNA使用各自的引物对362/367和366/363在PCR反应中扩增，全长人CD134作为模板。随后，使用引物对362/363，通过使用这两个PCR产物，在装配PCR中产生“CRD3”构建体。使用合适的限制位点，将编码“CRD3”构建体的cDNA在pcDNA3.1-衍生的表达质粒中亚克隆。相似地，使用在上表中示出的效应引物，产生“CRD4”构建体(信号肽的氨基酸1-28，与氨基酸127-277连接)，及在pcDNA3.1-衍生的表达质粒中亚克隆。此外，将全长人CD134(SEQIDNO:1)也在pcDNA3.1-衍生的表达质粒中再克隆。
使用FreeStyleTM293表达系统(LifeTechnologies)，将FreeStyleTM293-F细胞(LifeTechnologies)用3个产生的人CD134变体瞬时转染。48小时后，通过FACS分析转染的细胞上的表面人CD134表达。为此，收获转染的细胞并以1-2×106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了50μg/mL纯化的人IgG(Sigma；封闭Fcγ受体)。将细胞与20.0μg/mL亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3和20E5、与20.0μg/mL嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3和20E5、与20.0μg/mL的6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及与20.0μg/mL人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1VH1在4℃保温30分钟。平行地，20.0μg/mL小鼠IgG1κ同种型对照抗体(BDBiosciences)和20.0μg/mL嵌合的人IgG4κ同种型对照抗体(来自PanGenetics的克隆ch5D12)用作阴性对照。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)或者与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗人IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，随后将细胞与1:200稀释的PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG(Fcγ特异性)抗体(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中彻底洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中2％甲醛中在4℃固定30分钟。抗体的结合使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图36所示，亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化的IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3均识别转染的293-F细胞上的全长(表示为“CRD1”构建体)人CD134及缺少CRD1-CRD2的截短的人CD134变体(表示为“CRD3”构建体)，而亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3均示出在模拟转染的293-F细胞上无结合。相反，亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化形式的IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(表示为“CRD4”构建体)的结合非常弱或者是阴性的，而亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5示出与这种缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(表示为“CRD4”构建体)在转染的293-F细胞上的结合较强，这表明后者293-F细胞表达这种表面截短的CD134形式。
如图37所示，亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5及人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1VH1识别转染的293-F细胞上的全长(表示为“CRD1”构建体)人CD134、缺少CRD1-CRD2的截短的人CD134变体(表示为“CRD3”构建体)及缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(表示为“CRD4”构建体)，而亲代小鼠抗人CD134抗体克隆20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5及人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5形式20E5_VL1VH1示出在模拟转染的293-F细胞上无结合。
这些结果表明亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3和20E5、所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5_VL1VH1特异性识别人CD134(对比全长人CD134转染vs模拟转染)。此外，这些结果表明抗人CD134抗体克隆12H3和20E5似乎识别不同的人CD134表位，这通过与缺少CRD1-CRD2-截短的CRD3A1-模块的截短的人CD134变体(表示为“CRD4”构建体)的分别的不结合(使用克隆12H3)vs强结合(使用克隆20E5)而证明。这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3似乎不识别CRD1和CRD2中的人CD134表位。小鼠抗人CD134抗体克隆20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5和人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5VL1VH1似乎不识别CRD1、CRD2及截短的CRD3A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)中的人CD134表位。这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3似乎识别胞外CD134上的截短的CRD3A1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)中线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列108-126(即19个氨基酸的肽rcragtqpldsykpgvdca；见SEQIDNO:34)，或者氨基酸序列108-126(即19个氨基酸的肽rcragtqpldsykpgvdca；见SEQIDNO:34)组成结合在胞外CD134上截短的CRD3A1-模块/CRD4A1-B1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)及可能在铰链样结构中的非线性/构象表位的一部分，所述表位具有氨基酸序列108-214(见SEQIDNO:35)。这些结果表明小鼠抗人CD134抗体克隆20E5、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5及人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆20E5_VL1VH1似乎识别胞外人CD134上的CRD4A1-B1-模块(根据Latzaetal.EurJImmunol1994；24:677-683定义)及可能在铰链样结构中中线性或非线性/构象表位，所述表位具有氨基酸序列127-214(SEQIDNO:92)。
(e).人源化IgG4κ抗人CD134单克隆抗体克隆12H3与生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3竞争结合在稳定转染的293-F细胞系克隆no.5上的表面人CD134(FACS)
在进行竞争性流式细胞计量术之前，确定生物素化的(使用来自Pierce的N-羟基琥珀酰亚胺-生物素)亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的EC50(见下文方法)，经鉴别为大约700ng/mL(见图38，n＝2)。随后研究生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在鉴别的EC50浓度由未标记的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及6个人源化形式IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3的置换。
将全长人CD134(SEQIDNO:1)在pcDNA3.1-衍生的表达质粒中再克隆(见上述实施例11(c))。使用FreeStyleTM293表达系统(LifeTechnologies)将这个全长人CD134质粒在FreeStyleTM293-F细胞(LifeTechnologies)中转染。使用125μg/mLG418(Gibco)选择稳定的人全长CD134-转染的细胞(克隆no.5，具有高表面CD134表达水平，见图32)，收获并以1-2×106个细胞/mL置于冰冷的PBS/BSA/NaN3中，其中补加了50μg/mL纯化的人IgG(Sigma；封闭Fcγ受体)。将细胞与0.003-50.0(在PBS/BSA/NaN3中5-倍系列稀释)未标记的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3、嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3及6个人源化形式的IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3组合700ng/mL(EC50)生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3在4℃保温30分钟。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的结合使用1:200稀释的PE-缀合的链霉亲和素(JacksonImmunoResearch)在4℃保温30分钟确定。在PBS/BSA/NaN3中充分洗涤后，将细胞在PBS/BSA/NaN3中2％甲醛中在4℃固定30分钟。生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的结合使用流式细胞计量术测量(FACSCalibur；BDBiosciences)。
如图39(n＝2)所示，未标记的亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和未标记的嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3表明相同的生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3置换，这表示亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3与嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3呈现出相同的CD134抗原结合亲和性(生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3的半数最大置换或抑制作用(IC50)为≈3.5μg/mL)。所有6个未标记的人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式-12H3_VL1H1、12H3_VL1H2、12H3_VL1H3、12H3_VL2H1、12H3_VL2VH2和12H3_VL2VH3-表明相同的生物素化的亲代小鼠抗人CD134单克隆抗体克隆12H3置换，这表示所有6个未标记的人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式呈现出相同的CD134抗原结合亲和性(IC50≈1.5μg/mL)。
这些结果表明所有6个人源化IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3形式与亲代小鼠抗人CD134抗体克隆12H3和嵌合的人IgG4κ抗人CD134抗体克隆12H3相比示出较高的CD134抗原结合亲和性。
实施例12：抗CD134抗体抑制Treg细胞中FOX3P表达
Treg分离与扩增:Leukopacks购自BiologicalSpecialties(Colamar,PA)，红细胞用ACK缓冲液(Stemcelltechnologies,Vancouver,BC,Canada)在冰上裂解。洗涤细胞并将其重悬浮于AutoMACS电泳缓冲液中。Treg通过使用均得自MiltenyiBiotech(SanDiego,CA)的CD4+CD25+CD127dim/-Treg试剂盒在AutoMACSPro和/或LD柱及QuadroMACS上根据厂商指导分离。计数Treg，并将1×106Treg/孔在24孔平板中在具有Treg扩增珠(预加载CD3和CD28抗体的MACSiBead颗粒；MiltenyiBiotech)的TexMACS培养基中根据厂商指导扩增。将细胞以4个珠/细胞的比率在存在～500IU/mL的IL-2和雷帕霉素(100nM)条件下培养。分离后5天，将细胞移至6孔/平板中，加入40μl的珠/孔及具有IL-2(500IU/ml)和雷帕霉素(100nM)的培养基。根据需要加入含有IL-2的培养基，将细胞移至10mm圆形平板中进一步扩增。30天后，在进一步使用之前用MACSiMAG除去珠。
Treg激活:将扩增的Treg用CelltraceViolet根据厂商指导标记(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。将1.5×105个扩增的Treg和3×105个Treg扩增珠(用CD3和CD28抗体预加载的MACSiBead颗粒；MiltenyiBiotech)铺板于圆底96孔平板中，于37℃在补加了5％血清、1％Pen-Strep和～500IU/mL的IL-2及有或没有12H3(0.5和5μg/ml)和/或人OX40L(1μg/ml,R&DSystems)及抗-HismAb(1μg/ml，R&DSystems)的X-VIVO15培养基中保温。3天后，将细胞用LeukocyteActivationCocktail及BDGolgiPlug(2μl/ml,BDBiosciences,SanJose,CA)再刺激5小时，洗涤并用FixableNear-IRDeadCellStainKit(LifeTechnologies)根据厂商指导染色。将细胞洗涤一次，根据固定/透化方案使用Foxp3/转录因子染色缓冲液系列(eBioscience,SanDiego,CA)根据厂商指导进行细胞内染色。使用如下抗体：CD3V500(克隆SP34-2,BDBiosciences)；FOXP3PE(克隆206D,Biolegend)；CD4PerCP(克隆OKT4,Biolegend)；及OX40(克隆ACT35,eBioscience)。将细胞在4℃保温30分钟并洗涤。将细胞在BDCanto流式细胞计量仪(BDBiosciences)中运行，使用FlowJo(Ashland,OR)分析，门控活的单峰(livesinglets)CD3+CD4+。记录得自抗-FOXP3PE(R-藻红蛋白)的几何平均荧光强度(geoMFI)。
图40示出小鼠抗人CD134抗体12H3(IgG1)和人OX40L降低扩增的Treg(CD4+CD25-CD127dim/-)中FOXP3表达。当12H3和OX40L组合使用时，对FOXP3表达的抑制作用是累加的。结果提示小鼠抗人抗体12H3直接影响Treg功能，不仅是通过其对于效应T细胞的作用。数据代表来自一个供体的一式三份样品。
实施例13：平板结合的人源化抗CD134抗体减轻Treg对Teff细胞的抑制作用
评估人源化抗CD134抗体12H3VL1VH1或12H3VL1VH2(均为IgG4/κ)对于Treg对Teff功能的抑制作用的影响。
如实施例12所述分离、扩增和激活Treg。在指定的情况中，将圆底96孔平板用在PBS中稀释的12H3VL1VH1或12H3VL1VH2抗体或者同种型对照(10μg/ml)包被。将平板在37℃保温2小时，然后漂洗及用于抑制作用测定中。分离自与Treg相同供体的CD4+效应T细胞(Teff)从冷冻的PBMC中纯化，使用MiltenyiBiotech的AutoMACSPro和CD4+分离试剂盒根据厂商指导进行。然后将Teff细胞用CelltraceTM紫色染料根据厂商指导进行标记(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)。将Teff细胞重悬浮于补加了5％血清、1％Pen-Strep的X-VIVO15培养基中。将1×105个细胞加入每个孔中。将Treg以Treg:Teff为0:1(仅Teff)、1:2、1:4和1:8比率加入每个孔中。将TregSuppressionInspector珠(MiltenyiBiotech)洗涤并以1个珠/孔(Teff或Treg)的比率加入每个孔中。每个孔中终体积调节为200μl。将平板在37℃保温4天。将细胞用LeukocyteActivationCocktail及BDGolgiPlug(2μl/ml，BDBiosciences，SanJose,CA)再刺激5小时，洗涤并用FixableNear-IRDeadCellStainKit(LifeTechnologies)根据厂商指导染色。洗涤细胞并用APC-结合的抗-OX40(别藻蓝蛋白)(克隆ACT35，eBioscience)进行表面染色，随后进行细胞内染色。使用Foxp3/转录因子染色缓冲液系列(eBioscience,SanDiego,CA)根据厂商的方案进行固定/透化。使用如下抗体：CD3V500(克隆SP34-2,BDBiosciences)，CD4FITC(克隆RPA-T4，BioLegend)。将细胞在4℃保温30分钟并洗涤。将细胞在BDCanto流式细胞计量仪(BDBiosciences)中运行，使用FlowJo(Ashland,OR)分析，门控活的单峰CD3+CD4+Celltrace+。
平板结合的人源化12H3抗体减弱Treg对Teff增殖的抑制作用。图41示出对比在存在Treg/Teff比率为1:2的Treg的条件下，用Treg抑制作用检测珠(Miltenyi,SanDiego,CA)刺激的及用平板结合的12H3VL1VH1或者同种型对照IgG4处理，Teff细胞增殖的FAC分析的柱状图。与同种型对照(hIgG4)对比，使用CelltraceTMViolet染料，通过在表示随后的细胞分裂的连续峰(较低荧光强度)中细胞数目增加表明，12H3VL1VH1减弱Treg对于Teff增殖的抑制作用。CelltraceTMViolet染料结合细胞内部激活的胺基。
图42示出在分离自一个供体的细胞上，嵌合的12H3(人IgG4/κ)、人源化12H3VL1VH1或12H3VL1VH2(均为IgG4/κ)单独或组合OX40L(5μg/mL)/抗-HismAb(5μg/mL)在Treg:Teff比率为0:1(图42A)或1:4(图42B)条件下对于Teff细胞增殖的影响。在不存在Treg条件下(图42A)，CD2/CD3/CD28刺激物珠单独诱导表达人CD134的Teff增殖(即同种型对照)。当与同种型对照相比时，嵌合的和人源化抗CD134抗体以及OX40L刺激CD4+T细胞增殖。组合2H3VL1VH2(SF2)与OX40L示出增殖轻度增加。在存在Treg条件下(图42B)，当与无Treg抑制作用的CD4T细胞增殖相比时，CD2/CD3/CD28刺激物珠单独诱导较低的CD4T细胞增殖(复制指数为大约3vs大约5)。Treg抑制作用在存在嵌合的12H3、人源化12H3VL1VH1和12H3VL1VH2以及OX40L条件下被抑制。组合12H3VL1VH1或12H3VL1VH2与OX40L的存在表明轻度的协同作用。在图中，Teff细胞增殖以复制指数表达，这是对应答刺激已经分裂至少一次的Teff细胞扩增倍数的测量(例如在培养末期经历至少一次分裂的细胞数目，以百万计数)。
表3概括了在得自5个供体的细胞中，12H3VH1VH2IgG4/κ)在Treg以0:1、1:2和1:4的Treg/Teff比率存在的条件下12H3VL1VH2(IgG4κ)对于Teff增殖作用的影响。增殖程度以复制指数表示。在不存在Treg条件下，当与同种型对照(具有使用CD2/CD3/CD28珠激活的Teff)相比时，12H3VL1VH2在所有供体细胞中均刺激Teff细胞增殖。在存在1:2或1:4Treg/Teff比率的Treg的条件下，12H3VL1VH2的存在在所有供体的细胞中均减弱Treg的抑制作用。
结果表明12H3VL1VH1和12H3VL1VH2对于CD4效应T细胞诱导其增殖具有影响，及该抗体使得Teff对Treg略有抗性或者Treg自身在存在抗体条件下抑制作用降低。
表3
实施例14：人源化抗体的优化
人源化20E5抗体的优化
人源化重链可变区(VH)20E5_VH1、20E5_VH2和20E5_VH3的HCDR2在VH残基位置56-57含有异构化基序(DG，D56G57)。为了检测在位置56取代的作用，天冬氨酸(D)残基被突变为甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或者谷氨酸(E)。
人源化重链可变区20E5_VH1、20E5_VH2和20E5_VH3的HCDR3在位置106含有甲硫氨酸(M)(M106)。然而，该甲硫氨酸倾向于很大程度掩蔽以降低氧化风险，位置106的甲硫氨酸被突变为亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
人源化可变区20E5_VH1、20E5_VH2和20E5_VH3中位置11含有缬氨酸(V)。在这个位置的取代对于抗体可具有结构影响并因此影响其功能(KleinetalmAbs5:22-33,2013)。为了检测在位置11的取代的影响，将缬氨酸(V)残基突变为亮氨酸(L)。
使用标准方法将突变掺入每个重链可变区20E5_VH1、20E5_VH2和20E5_VH3中。突变体HCDR2序列在表4中示出，突变体HCDR3序列在表5中示出。含有单一取代的优化的人源化20E5可变区在表6中示出。亲代和优化的VH区的比对在图43A和图43B中示出。优化的VH区的名称表示亲代VH和产生的取代。另外的优化的可变区可以通过使用标准方法在位置11、56和/或106同时进行取代而产生。
使用标准方法将所得VH区与轻链可变区20E5_VL1或20E5VL2配对，所得抗体表达为IgG4/κ。根据实施例11A所述方案使用ELISA检测抗体与CD134的结合。使用实施例13中描述的方案，进一步检测抗体的诱导Teff细胞增殖及减弱Treg对Teff增殖的抑制作用的能力。选择与亲代人源化20E5抗体具有类似性质的抗体进行进一步研究。
表4
SEQ ID NO: HCDR2序列 取代
135 YINPYNGGTKYNEKFKG D56G
136 YINPYNAGTKYNEKFKG D56A
137 YINPYNSGTKYNEKFKG D56S
138 YINPYNEGTKYNEKFKG D56E
表5
SEQ ID NO: HCDR3序列 取代
139 YYGSSLSLDY M106L
140 YYGSSLSIDY M106I
表6
SEQ ID NO: 优化的VH名称
101 20E5_VH1D56G
102 20E5_VH2_D56G
103 20E5_VH3_D56G
104 20E5_VH1D56A
105 20E5_VH2_D56A
106 20E5_VH3_D56A
107 20E5_VH1D56S
108 20E5_VH2_D56S
109 20E5_VH3_D56S
110 20E5_VH1D56E
111 20E5_VH2_D56E
112 20E5_VH3_D56E
113 20E5_VH1M106L
114 20E5_VH2_M106L
115 20E5_VH3_M106L
116 20E5_VH1M106I
117 20E5_VH2_M106I
118 20E5_VH3_M106I
149 20E5_VH1_V11L
150 20E5_VH2_V11L
151 20E5_VH3_V11L
人源化12H3抗体的优化
人源化重链可变区(VH)12H3_VH1、12H3_VH2和12H3_VH3的HCDR2在残基位置54-56含有脱酰胺基序(NNG)(N54N55G56)。为了使脱酰胺作用风险最小化，将在位置55的天冬酰胺(N55)突变为谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)或谷氨酸(E)。
人源化重链可变区12H3_VH1、12H3_VH2和12H3_VH3的HCDR3在位置99含有甲硫氨酸(M)(M99)。然而，该甲硫氨酸倾向于很大程度掩蔽以降低氧化风险，在位置99的甲硫氨酸被突变为亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。
人源化重链可变区12H3_VH1、12H3_VH2和12H3_VH3中位置11含有缬氨酸(V)。在这个位置的取代对于抗体可具有结构影响并因此影响其功能(KleinetalmAbs5:22-33,2013)。为了检测在位置11取代的影响，缬氨酸(V)残基被突变为亮氨酸(L)。
使用标准方法将突变掺入每个重链可变区12H3_VH1、12H3_VH2和12H3_VH3中。突变体HCDR2序列在表7中示出，突变体HCDR3序列在表8中示出。含有单一取代的优化的人源化12H3可变区在表9中示出。亲代和优化的VH区的比对在图44中示出。优化的VH区的名称表示亲代VH和产生的取代。另外的优化的可变区可以通过使用标准方法在位置11、55和/或99同时产生取代而产生。
使用标准方法将所得VH区与轻链可变区12H3_VL1或12H3VL2配对，所得抗体表达为IgG4/κ。根据实施例11A所述方案使用ELISA检测抗体与CD134的结合。使用实施例13中描述的方案，进一步检测抗体的诱导Teff细胞增殖及减弱Treg对Teff增殖的抑制作用的能力。选择与亲代人源化12H3抗体具有类似性质的抗体进行进一步研究。
表7
SEQ ID NO: HCDR2序列 取代
141 GIYPNQGGSTYNQNFKD N55Q
142 GIYPNAGGSTYNQNFKD N55A
143 GIYPNEGGSTYNQNFKD N55E
表8
SEQ ID NO: HCDR3序列 取代
144 LGYHGPHLDFDV M99L
145 IGYHGPHLDFDV M99I
表9
SEQ ID NO: 优化的VH名称
119 12H3_VH1_N55Q
120 12H3_VH2_N55Q
121 12H3_VH3_N55Q
122 12H3_VH1_N55A
123 12H3_VH2_N55A
124 12H3_VH3_N55A
125 12H3_VH1_N55E
126 12H3_VH2_N55E
127 12H3_VH3_N55E
128 12H3_VH1_M99L
129 12H3_VH2_M99L
130 12H3_VH3_M99L
131 12H3_VH1_M99I
132 12H3_VH2_M99I
133 12H3_VH3_M99I
146 12H3_VH1_V11L
147 12H3_VH2_V11L
148 12H3_VH3_V11L

Claims (56)

1.结合人CD134的分离的抗体，其包含SEQIDNO:100所示轻链可变区(VL)及包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，任选在SEQIDNO:100所示VL中具有1、2或3个氨基酸取代。
2.权利要求1的抗体，其中VH包含SEQIDNO:152所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:152所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
3.权利要求2的抗体，其中VH包含SEQIDNO:99所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:99所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
4.权利要求1的抗体，其中HCDR3包含SEQIDNO:16、144或145所示氨基酸序列。
5.权利要求4的抗体，其中HCDR2包含SEQIDNO:15、141、142或143所示氨基酸序列。
6.权利要求5的抗体，其中HCDR1包含SEQIDNO:14所示氨基酸序列。
7.权利要求2的抗体，其中：
a.VL包含SEQIDNO:67或68所示氨基酸序列；及
VH包含SEQIDNO:69、70、71、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、146、147或148所示氨基酸序列，任选在VH线性氨基酸残基位置11、55或99具有1、2或3个氨基酸取代；或者
b.VL和VH包含如下氨基酸序列：
i.分别为SEQIDNO:67和69；
ii.分别为SEQIDNO:67和70；
iii.分别为SEQIDNO:67和71；
iv.分别为SEQIDNO:68和69；
v.分别为SEQIDNO:68和70；或者
vi.分别为SEQIDNO:68和71。
8.权利要求7的抗体，其中在VH线性氨基酸残基位置的1、2或3个氨基酸取代是V11L、N55Q、N55A、N55E、M99L或M99I。
9.权利要求8的抗体，其中结合分子结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38或SEQIDNO:92所示氨基酸序列。
10.权利要求1的抗体，其中所述抗体是人源化或DeImmunizedTM抗体。
11.权利要求1的抗体，其中所述抗体是CD134的激动剂。
12.权利要求11的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体在Fc区中包含取代。
14.权利要求13的抗体，其中所述取代调节所述抗体与Fcγ受体(FcγR)或者与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。
15.权利要求14的抗体，其中所述取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号是根据EU索引编号。
16.编码权利要求2的VH或VL的分离的核酸分子。
17.包含权利要求16的核酸分子的载体。
18.包含权利要求17的载体的宿主细胞。
19.增强对象中免疫应答的方法，包括给予有需要的对象足够时间的权利要求2的抗体，以增强免疫应答。
20.治疗对象中癌症的方法，包括给予有需要的对象足够时间的权利要求2的抗体，以治疗癌症。
21.权利要求20的方法，其中癌症是前列腺癌、结肠癌、肺癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤或者膀胱癌。
22.药物组合物，其包含权利要求2的抗体和药物学可接受的载体。
23.结合人CD134的分离的抗体，其包含SEQIDNO:98所示轻链可变区(VL)及包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链可变区(VH)，任选在SEQIDNO:98所示VL中具有1、2或3个氨基酸取代。
24.权利要求23的抗体，其中VH包含SEQIDNO:134所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:134所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
25.权利要求24的抗体，其中VH包含SEQIDNO:97所示氨基酸序列，任选在SEQIDNO:97所示VH中具有1、2或3个氨基酸取代。
26.权利要求23的抗体，其中HCDR3包含SEQIDNO:8、139或140所示氨基酸序列。
27.权利要求26的抗体，其中HCDR2包含SEQIDNO:7、135、136、137或138所示氨基酸序列。
28.权利要求27的抗体，其中HCDR1包含SEQIDNO:6所示氨基酸序列。
29.权利要求24的抗体，其中：
a.VL包含SEQIDNO:62或63所示氨基酸序列；及
VH包含SEQIDNO:64、65、66、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、149、150或151所示氨基酸序列，任选在VH线性氨基酸残基位置11、56或106具有1、2或3个氨基酸取代；或者
b.VL和VH包含如下氨基酸序列：
i.分别为SEQIDNO:62和64；
ii.分别为SEQIDNO:62和65；
iii.分别为SEQIDNO:62和66；
iv.分别为SEQIDNO:63和64；
v.分别为SEQIDNO:63和65；或者
vi.分别为SEQIDNO:63和66。
30.权利要求29的抗体，其中在VH线性氨基酸残基位置的1、2或3个氨基酸取代是V11L、D56G、D56A、D56S、D56E、M106L或M106I。
31.权利要求30的抗体，其中所述抗体结合人CD134的胞外结构域的表位，所述表位包含SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38或SEQIDNO:92所示氨基酸序列。
32.权利要求23的抗体，其中所述抗体是人源化或DeImmunizedTM抗体。
33.权利要求23的抗体，其中所述抗体是CD134的激动剂。
34.权利要求33的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
35.权利要求34的抗体，其中所述抗体在Fc区中包含取代。
36.权利要求35的抗体，其中所述取代调节所述抗体与Fcγ受体(FcγR)或者与新生儿Fc受体(FcRn)的结合。
37.权利要求36的抗体，其中所述取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号是根据EUIndex编号。
38.编码权利要求24的VH或VL的分离的核酸分子。
39.包含权利要求38的核酸分子的载体。
40.包含权利要求39的载体的宿主细胞。
41.增强对象中免疫应答的方法，包括给予有需要的对象足够时间的权利要求24的抗体以增强免疫应答。
42.治疗对象中癌症的方法，包括给予有需要的对象足够时间的权利要求24的抗体以治疗癌症。
43.权利要求42的方法，其中癌症是前列腺癌、结肠癌、肺癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤或者膀胱癌。
44.药物组合物，其包含权利要求24的抗体和药物学可接受的载体。
45.结合人CD134的分离的激动性抗体，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL和VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3及轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
a.HCDR1包含SEQIDNO:14所示氨基酸序列；
b.HCDR2包含SEQIDNO:15、141、142或143所示氨基酸序列；
c.HCDR3包含SEQIDNO:16、144或145所示氨基酸序列；
d.LCDR1包含SEQIDNO:17所示氨基酸序列；
e.LCDR2包含SEQIDNO:18所示氨基酸序列；及
f.LCDR3包含SEQIDNO:19所示氨基酸序列；
条件是所述抗体不包含如下的VH和VL，所述VH包含SEQIDNO:14、15和16所示HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，所述VL包含SEQIDNO:17、18和19所示LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
46.权利要求45的分离的抗体，其中所述抗体包含如下所示HCDR1、HCDR2和HCDR3序列：
a.分别为SEQIDNO:14、15、144；
b.分别为SEQIDNO:14、141、16；
c.分别为SEQIDNO:14、142、16；
d.分别为SEQIDNO:14、141、144；或者
e.分别为SEQIDNO:14、142、144。
47.权利要求45的分离的抗体，其中所述抗体是人源化的、DeImmunizedTM或者人抗体。
48.权利要求47的分离的抗体，其中所述抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。
49.权利要求48的分离的抗体，其中所述抗体在Fc区中包含取代，所述取代调节所述抗体与Fcγ受体(FcγR)或者与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，其中所述取代包括S267E/L328F取代、E233D/G237D/H268D/P271G/A330R取代、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S取代或者M252Y/S254T/T256E取代，其中残基编号根据EUIndex编号。
50.编码权利要求45的VH或VL的分离的核酸分子。
51.包含权利要求50的核酸分子的载体。
52.包含权利要求51的载体的宿主细胞。
53.增强个体免疫应答的方法，包括给予有需要的个体足够时间的权利要求45的抗体以增强免疫应答。
54.治疗个体中癌症的方法，包括给予有需要的个体足够时间的权利要求45的抗体以治疗癌症。
55.权利要求54的方法，其中癌症是前列腺癌、结肠癌、肺癌、血液恶性肿瘤、黑素瘤或者膀胱癌。
56.分离的结合人CD134的激动性抗体，其包含轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述VL和VH包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3及轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
a.HCDR1包含SEQIDNO:6所示氨基酸序列；
b.HCDR2包含SEQIDNO:7、135、136、137或138所示氨基酸序列；
c.HCDR3包含SEQIDNO:8、139或140所示氨基酸序列；
d.LCDR1包含SEQIDNO:9所示氨基酸序列；
e.LCDR2包含SEQIDNO:10所示氨基酸序列；及
f.LCDR3包含SEQIDNO:11所示氨基酸序列；
g.条件是所述抗体不包含如下的VH和VL，所述VH包含SEQIDNO:6、7和8所示HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列，所述VL包含SEQIDNO:9、10和11所示LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
CN201480028619.1A 2013-03-18 2014-03-18 人源化抗cd134(ox40)抗体及其应用 Pending CN105229032A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13159794.0 2013-03-18
EP13159794 2013-03-18
PCT/NL2014/050162 WO2014148895A1 (en) 2013-03-18 2014-03-18 Humanized anti-cd134 (ox40) antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105229032A true CN105229032A (zh) 2016-01-06

Family

ID=47891522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480028619.1A Pending CN105229032A (zh) 2013-03-18 2014-03-18 人源化抗cd134(ox40)抗体及其应用

Country Status (32)

Country Link
US (3) US9790281B2 (zh)
EP (2) EP3409690A1 (zh)
JP (1) JP2016515544A (zh)
KR (1) KR20160006168A (zh)
CN (1) CN105229032A (zh)
AU (2) AU2014238546C1 (zh)
BR (1) BR112015023862A2 (zh)
CA (1) CA2907436A1 (zh)
CL (2) CL2015002793A1 (zh)
CR (1) CR20150498A (zh)
CY (1) CY1120752T1 (zh)
DK (1) DK2976361T3 (zh)
EA (1) EA201591495A1 (zh)
ES (1) ES2687282T3 (zh)
HK (1) HK1215035A1 (zh)
HR (1) HRP20181478T1 (zh)
HU (1) HUE040234T2 (zh)
IL (1) IL241701A0 (zh)
LT (1) LT2976361T (zh)
MD (2) MD20180107A2 (zh)
MX (2) MX2015013288A (zh)
NZ (1) NZ712903A (zh)
PE (1) PE20160690A1 (zh)
PH (1) PH12015502185A1 (zh)
PL (1) PL2976361T3 (zh)
PT (1) PT2976361T (zh)
RS (1) RS57840B1 (zh)
SG (2) SG10201708048XA (zh)
SI (1) SI2976361T1 (zh)
UA (1) UA119319C2 (zh)
WO (1) WO2014148895A1 (zh)
ZA (1) ZA201507021B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018177220A1 (zh) * 2017-03-25 2018-10-04 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN109863170A (zh) * 2016-08-12 2019-06-07 詹森生物科技公司 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
WO2019144677A1 (zh) * 2018-01-29 2019-08-01 康源博创生物科技(北京)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN110172090A (zh) * 2019-06-03 2019-08-27 北京岳昊科技发展有限公司 Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用
CN110291108A (zh) * 2016-12-19 2019-09-27 格兰马克药品股份有限公司 新型tnfr激动剂及其用途
CN110467674A (zh) * 2018-05-11 2019-11-19 上海药明生物技术有限公司 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途
CN110546162A (zh) * 2017-03-28 2019-12-06 礼进生物医药控股有限公司 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法
CN111518209A (zh) * 2020-05-09 2020-08-11 郑州航空港百桥生物科技有限公司 特异性结合人ox40的单克隆抗体及其应用

Families Citing this family (109)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201116092D0 (en) * 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
EP3435080A1 (en) 2013-03-14 2019-01-30 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Methods of detecting donor-specific antibodies
EA201591495A1 (ru) 2013-03-18 2016-05-31 Биосерокс Продактс Б.В. Гуманизированные антитела против cd134 (ox40) и применения указанных антител
US20150190506A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
MA39817A (fr) 2014-03-31 2017-02-08 Hoffmann La Roche Thérapie combinatoires comprenant des agents anti-angiogenèse et des agonistes se liant à ox40
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
AU2015343337A1 (en) 2014-11-03 2017-06-15 Genentech, Inc. Assays for detecting T cell immune subsets and methods of use thereof
EP3215637B1 (en) 2014-11-03 2019-07-03 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and biomarkers for predicting efficacy and valuation of an ox40 agonist treatment
EP3215536A1 (en) 2014-11-06 2017-09-13 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
SG10201807625PA (en) 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
PL3242890T3 (pl) * 2015-01-08 2020-04-30 BioNTech SE Czynniki agonistyczne wiążące się z receptorem TNF
PL3265123T3 (pl) 2015-03-03 2023-03-13 Kymab Limited Przeciwciała, zastosowania i sposoby
CA2981183A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Greg Lazar Antigen binding complex having agonistic activity and methods of use
HUE047146T2 (hu) * 2015-04-28 2020-04-28 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp RGMa-kötõ fehérje és alkalmazása
AU2016256911B2 (en) 2015-05-07 2022-03-31 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of use thereof
HUE061253T2 (hu) * 2015-05-29 2023-06-28 Bristol Myers Squibb Co Antitestek OX40 ellen és azok felhasználásai
US20190022092A1 (en) 2015-09-15 2019-01-24 Acerta Pharma B.V. Therapeutic Combinations of a BTK Inhibitor and a GITR Binding Molecule, a 4-1BB Agonist, or an OX40 Agonist
RU2761115C1 (ru) 2015-10-02 2021-12-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Биспецифические антитела, специфические в отношении костимуляторного tnf-рецептора
WO2017063162A1 (zh) 2015-10-15 2017-04-20 苏州丁孚靶点生物技术有限公司 抗ox40抗体及其应用
JP2018536650A (ja) * 2015-10-30 2018-12-13 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｄ因子抗体変異体コンジュゲート及びその使用
CN108473584B (zh) 2015-11-03 2022-01-14 詹森生物科技公司 特异性结合pd-1和tim-3的抗体及其用途
GB201519481D0 (en) 2015-11-04 2015-12-16 Cancer Rec Tech Ltd Immunomodulatory antibodies
US10527613B2 (en) * 2015-11-10 2020-01-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same
CA3007233A1 (en) 2015-12-02 2017-06-08 Agenus Inc. Antibodies and methods of use thereof
WO2017123673A2 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Inhibrx Lp Multivalent and multispecific ox40-binding fusion proteins
DE102016105069A1 (de) 2016-03-18 2017-09-21 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Antivirale Immuntherapie durch Membranrezeptorligation
CN115304669A (zh) * 2016-06-08 2022-11-08 上海交通大学医学院 增强激动型抗体活性的抗体重链恒定区序列
TWI784957B (zh) 2016-06-20 2022-12-01 英商克馬伯有限公司 免疫細胞介素
EP3494139B1 (en) 2016-08-05 2022-01-12 F. Hoffmann-La Roche AG Multivalent and multiepitopic anitibodies having agonistic activity and methods of use
MA45941A (fr) 2016-08-12 2019-06-19 Janssen Biotech Inc Anticorps de membres de la superfamille anti-tnfr modifiés par fc ayant une activité agoniste améliorée et leurs procédés d'utilisation
TWI788307B (zh) 2016-10-31 2023-01-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用於擴增腫瘤浸潤性淋巴細胞之工程化人造抗原呈現細胞
EP3535291A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
US11779604B2 (en) 2016-11-03 2023-10-10 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses and methods
EP3538152A4 (en) 2016-11-09 2020-09-30 Agenus Inc. ANTI-OX40 ANTIBODIES, ANTI-GITR ANTIBODIES AND METHOD OF USING THEREOF
EP3725809A1 (en) * 2016-12-15 2020-10-21 AbbVie Biotherapeutics Inc. Anti-ox40 antibodies and their uses
EP3565888A1 (en) 2017-01-06 2019-11-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with tumor necrosis factor receptor superfamily (tnfrsf) agonists and therapeutic combinations of tils and tnfrsf agonists
CA3049501A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Magenta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the depletion of cd137+ cells
JP2020506208A (ja) 2017-02-10 2020-02-27 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチドバリアントおよびそれらの使用
EP3635097A1 (en) 2017-06-05 2020-04-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of using tumor infiltrating lymphocytes in double-refractory melanoma
JP7089149B2 (ja) 2017-07-31 2022-06-22 ミツミ電機株式会社 レンズ駆動装置、カメラモジュール、およびカメラ搭載装置
WO2019040808A1 (en) * 2017-08-25 2019-02-28 Janssen Biotech, Inc. TYPE III FIBRONECTIN BINDER FCγRII DOMAINS, THEIR CONJUGATES AND MULTISPECIFIC MOLECULES COMPRISING THE SAME
CN111542544A (zh) 2017-11-01 2020-08-14 百时美施贵宝公司 用于治疗癌症的免疫刺激性激动性抗体
JP2021503281A (ja) 2017-11-17 2021-02-12 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 細針吸引及び小生検からのｔｉｌ拡大培養
SG11202003443TA (en) * 2017-11-24 2020-05-28 Eucure Beijing Biopharma Co Ltd Anti-ox40 antibodies and uses thereof
JP7057492B2 (ja) 2017-12-28 2022-04-20 ミツミ電機株式会社 レンズ駆動装置、カメラモジュール、及びカメラ搭載装置
US11713446B2 (en) 2018-01-08 2023-08-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating TIL products enriched for tumor antigen-specific T-cells
WO2019136459A1 (en) 2018-01-08 2019-07-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for generating til products enriched for tumor antigen-specific t-cells
BR112020013848A2 (pt) 2018-01-08 2020-12-01 Iovance Biotherapeutics, Inc. métodos para expandir linfócitos infiltrantes de tumor e para tratar um indivíduo com câncer, população de linfócitos infiltrantes de tumor, e, método para avaliar fatores de transcrição
US20210137930A1 (en) 2018-02-13 2021-05-13 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tumor infiltrating lymphocytes (tils) with adenosine a2a receptor antagonists and therapeutic combinations of tils and adenosine a2a receptor antagonists
TW202003565A (zh) 2018-03-23 2020-01-16 美商必治妥美雅史谷比公司 抗mica及/或micb抗體及其用途
US20210024873A1 (en) 2018-03-27 2021-01-28 Bristol-Myers Squibb Company Real-time monitoring of protein concentration using ultraviolet signal
WO2019210131A1 (en) 2018-04-27 2019-10-31 Iovance Biotherapeutics, Inc. Closed process for expansion and gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JP2021524256A (ja) * 2018-05-23 2021-09-13 ベイジーン リミテッド 抗ｏｘ４０抗体及び使用方法
EP3806848A2 (en) 2018-06-15 2021-04-21 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Increasing immune activity through modulation of postcellular signaling factors
WO2020014583A1 (en) 2018-07-13 2020-01-16 Bristol-Myers Squibb Company Ox-40 agonist, pd-1 pathway inhibitor and ctla-4 inhibitor combination for use in a mehtod of treating a cancer or a solid tumor
AU2019321490A1 (en) 2018-08-13 2021-02-18 Inhibrx, Inc. Ox40-binding polypeptides and uses thereof
TW202031273A (zh) 2018-08-31 2020-09-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 抗ｐｄ－１抗體難治療性之非小細胞肺癌（ｎｓｃｌｃ）病患的治療
IL281423B1 (en) 2018-09-20 2024-04-01 Iovance Biotherapeutics Inc Expansion of TILS from cryopreserved tumor samples
JOP20210094A1 (ar) 2018-11-05 2023-01-30 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات لإنتاج الخلايا الليمفاوية للورم الارتشاحي واستخداماتها في العلاج المناعي
WO2020096927A1 (en) 2018-11-05 2020-05-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors
MX2021004953A (es) 2018-11-05 2021-08-11 Iovance Biotherapeutics Inc Seleccion de celulas t reactivas al tumor mejoradas.
BR112021008549A2 (pt) 2018-11-05 2022-01-04 Iovance Biotherapeutics Inc Método de tratamento de carcinoma pulmonar de células não pequenas com uma população de linfócitos infiltrantes de tumor
WO2020119793A1 (en) * 2018-12-14 2020-06-18 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. Humanized antibodies against ox40, method for preparing the same, and use thereof
CA3123392A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof
WO2020142626A1 (en) * 2019-01-04 2020-07-09 Gigagen, Inc. Anti-ox40 binding proteins and methods of use thereof
WO2020172658A1 (en) 2019-02-24 2020-08-27 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating a protein
CN114269370A (zh) 2019-03-29 2022-04-01 迈斯特治疗公司 离体产生t细胞治疗剂的方法以及相关的组合物和方法
EP3962493A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity/level of irf or sting or of treating cancer, comprising the administration of a sting modulator and/or purinergic receptor modulator or postcellular signaling factor
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
WO2020237221A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Bristol-Myers Squibb Company Methods of monitoring cell culture media
KR20220016157A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 세포 국재화 시그너쳐 및 조합 요법
KR20220016155A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역-종양학 (i-o) 요법에 적합한 대상체를 확인하는 방법
EP3976831A1 (en) 2019-05-30 2022-04-06 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures for suitability to immuno-oncology therapy
WO2021081378A1 (en) 2019-10-25 2021-04-29 Iovance Biotherapeutics, Inc. Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
JP2023504042A (ja) 2019-11-27 2023-02-01 ミスト セラピューティクス リミテッド ライアビリティ カンパニー 調節物質を使用した腫瘍反応性ｔ細胞組成物の生成方法
JP2023506734A (ja) 2019-12-11 2023-02-20 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 腫瘍浸潤リンパ球（ｔｉｌ）の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法
AU2020407208A1 (en) 2019-12-17 2022-06-02 Amgen Inc. Dual interleukin-2 /tnf receptor agonist for use in therapy
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
CN113045655A (zh) * 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
MX2022010517A (es) 2020-02-27 2022-11-14 Myst Therapeutics Llc Metodos para la expansion y enriquecimiento ex vivo de celulas t reactivas a tumor y composiciones relacionadas de las mismas.
JP2023524108A (ja) 2020-05-04 2023-06-08 アイオバンス バイオセラピューティクス，インコーポレイテッド 改良された腫瘍反応性ｔ細胞の選択
EP4146794A1 (en) 2020-05-04 2023-03-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
EP4172323A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
JP2023538955A (ja) 2020-08-31 2023-09-12 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 細胞局在シグネチャーおよび免疫療法
EP4225770A1 (en) 2020-10-05 2023-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Methods for concentrating proteins
EP4225330A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022076606A1 (en) 2020-10-06 2022-04-14 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies
WO2022120179A1 (en) 2020-12-03 2022-06-09 Bristol-Myers Squibb Company Multi-tumor gene signatures and uses thereof
TW202241468A (zh) 2020-12-11 2022-11-01 美商艾歐凡斯生物治療公司 用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｂｒａｆ抑制劑及／或ｍｅｋ抑制劑組合治療癌症患者
WO2022133140A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with ctla-4 and pd-1 inhibitors
EP4262827A1 (en) 2020-12-17 2023-10-25 Iovance Biotherapeutics, Inc. Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes
CA3201348A1 (en) 2020-12-28 2022-07-07 Masano HUANG Antibody compositions and methods of use thereof
EP4267172A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Bristol-Myers Squibb Company Subcutaneous administration of pd1/pd-l1 antibodies
CA3209479A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Mozart Therapeutics, Inc. Binding agents and methods of using the same
JP2024512669A (ja) 2021-03-31 2024-03-19 フラグシップ パイオニアリング イノベーションズ ブイ，インコーポレーテッド タノトランスミッションポリペプチド及び癌の処置におけるそれらの使用
EP4314068A1 (en) 2021-04-02 2024-02-07 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
IL307800A (en) 2021-04-19 2023-12-01 Iovance Biotherapeutics Inc Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors and their use in cellular immunotherapy
KR20220160512A (ko) * 2021-05-27 2022-12-06 주식회사유한양행 Ox40 작용제 및 그의 용도
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
TW202327631A (zh) 2021-07-28 2023-07-16 美商艾歐凡斯生物治療公司 利用腫瘤浸潤性淋巴球療法與ｋｒａｓ抑制劑組合治療癌症患者
WO2023076876A1 (en) 2021-10-26 2023-05-04 Mozart Therapeutics, Inc. Modulation of immune responses to viral vectors
US20230187042A1 (en) 2021-10-27 2023-06-15 Iovance Biotherapeutics, Inc. Systems and methods for coordinating manufacturing of cells for patient-specific immunotherapy
WO2023086803A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods of expansion treatment utilizing cd8 tumor infiltrating lymphocytes
WO2023147486A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Iovance Biotherapeutics, Inc. Tumor infiltrating lymphocytes engineered to express payloads
WO2023173011A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Bristol-Myers Squibb Company Transient expression of therapeutic proteins
WO2023178329A1 (en) 2022-03-18 2023-09-21 Bristol-Myers Squibb Company Methods of isolating polypeptides
WO2023235847A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Bristol-Myers Squibb Company Antibody compositions and methods of use thereof
WO2024030758A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Iovance Biotherapeutics, Inc. Chimeric costimulatory receptors, chemokine receptors, and the use of same in cellular immunotherapies
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999042585A1 (en) * 1998-02-24 1999-08-26 Sisters Of Providence In Oregon Compositions containing an ox-40 receptor binding agent or a nucleic acid encoding the same and methods for enhancing antigen-specific immune response
WO2006119107A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Ucb Pharma S.A. Sclerostin binding agents
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
WO2008128455A1 (fr) * 2007-04-24 2008-10-30 Shanghai Cp Guojian Pharmaceutical Co. Ltd Épitopes fonctionnels d'ostéopontine, anticorps monoclonaux contre ces épitopes et leurs utilisations
US20100285036A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-11 Vaccinex, Inc. Anti-CD100 Neutralizing Antibodies and Methods of Using the Same
WO2012027328A2 (en) * 2010-08-23 2012-03-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
WO2013028231A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same

Family Cites Families (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
PT1696031E (pt) 1991-12-02 2010-06-25 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
DE69427974T2 (de) 1993-04-29 2001-12-06 Unilever Nv Herstellung von antikörpern oder funktionstüchtig gemachten teilen davon, abgeleitet von schweren ketten von immunglobulinen von camelidae
US5821332A (en) 1993-11-03 1998-10-13 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Receptor on the surface of activated CD4+ T-cells: ACT-4
US7473423B2 (en) 1994-04-29 2009-01-06 Mayo Foundation For Medical Education And Research Human IgM antibodies, and diagnostic and therapeutic uses thereof particularly in the central nervous system
US5591629A (en) 1994-04-29 1997-01-07 Mayo Foundation For Medical Education & Research Monoclonal antibodies which promote central nervous system remyelination
US5463564A (en) 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US5504004A (en) 1994-12-20 1996-04-02 Michigan Biotechnology Institute Process for making succinic acid, microorganisms for use in the process and methods of obtaining the microorganisms
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP1029048A2 (en) 1997-11-05 2000-08-23 Baylor College Of Medicine Sequences for targeting metastatic cells
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020004041A1 (en) 1999-02-19 2002-01-10 Albert Matthew L. Methods for abrogating a cellular immune response
US7666414B2 (en) 2001-06-01 2010-02-23 Cornell Research Foundation, Inc. Methods for treating prostate cancer using modified antibodies to prostate-specific membrane antigen
WO2003002609A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
US6881557B2 (en) 2001-07-12 2005-04-19 Arrowsmith Technologies Llp Super humanized antibodies
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
NZ536746A (en) 2002-06-13 2007-02-23 Crucell Holland Bv An agonistic antibody or fragment thereof that immunospecifically binds and stimulates the human OX40-receptor
CN1678634A (zh) 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
WO2004111233A1 (ja) 2003-06-11 2004-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 抗体の製造方法
US20080008719A1 (en) 2004-07-10 2008-01-10 Bowdish Katherine S Methods and compositions for the treatment of prostate cancer
US20080287309A1 (en) 2004-07-10 2008-11-20 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods for Discovering Antibodies Specific to Cancer Cells and Antibodies Discovered Thereby
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
EP2366717A3 (en) 2004-10-29 2011-12-14 University of Southern California Combination Cancer Immunotherapy with Co-Stimulatory Molecules
US20060153808A1 (en) 2004-11-17 2006-07-13 Board Of Regents, The Universtiy Of Texas System Cancer immunotherapy incorporating p53
JP2008528010A (ja) 2005-01-31 2008-07-31 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ 重鎖抗体の可変ドメイン配列を作出する方法
US7189097B2 (en) 2005-02-11 2007-03-13 Winchester Electronics Corporation Snap lock connector
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
JP2008542354A (ja) 2005-06-03 2008-11-27 ファイザー・プロダクツ・インク 癌治療におけるｅｒｂＢ２阻害剤と他の治療薬の併用
EP1951242A2 (en) 2005-11-22 2008-08-06 Incyte Corporation Combination therapy for the treatment of cancer
TWI461436B (zh) * 2005-11-25 2014-11-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 人類ｃｄ１３４（ｏｘ４０）之人類單株抗體及其製造及使用方法
SG10201600950TA (en) 2005-11-28 2016-03-30 Genmab As Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
US20070255631A1 (en) 2005-11-28 2007-11-01 Douglas Schmidt Product catalog management system and method
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
US20110028688A1 (en) 2006-06-21 2011-02-03 Genentech, Inc. Crystal structure of ox40l and ox40l complexed with ox40 receptor
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
JP2010518873A (ja) 2007-02-27 2010-06-03 ジェネンテック， インコーポレイテッド アンタゴニスト抗ｏｘ４０抗体および炎症性疾患および自己免疫性疾患の処置におけるその使用
EP2139924B1 (en) 2007-03-29 2016-07-06 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
PE20091269A1 (es) 2007-12-14 2009-09-09 Medarex Inc Moleculas de union al receptor ox40 humano
AU2008343589A1 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor Ortho Biotech Inc. Design and generation of human de novo pIX phage display libraries via fusion to pIX or pVII, vectors, antibodies and methods
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
EP2282769A4 (en) 2008-04-29 2012-04-25 Abbott Lab DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES
US8652843B2 (en) 2008-08-12 2014-02-18 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. DDR1-binding agents and methods of use thereof
US20100261620A1 (en) 2008-10-14 2010-10-14 Juan Carlos Almagro Methods of Humanizing and Affinity-Maturing Antibodies
US8137933B2 (en) 2008-11-12 2012-03-20 Schering Corporation Mammalian expression vector pUHAB
PE20120211A1 (es) * 2009-02-17 2012-03-24 Ucb Pharma Sa Anticuerpos que tienen especificidad por ox40 humana
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
US8447543B2 (en) 2009-09-08 2013-05-21 Aerovironment, Inc. Electric vehicle simulator and analyzer (EVSA) for electric vehicle supply equipment
RS55460B1 (sr) 2009-11-30 2017-04-28 Janssen Biotech Inc Mutirana fc antitela sa uklonjenom efektorskom funkcijom
MX353144B (es) 2010-04-20 2017-12-20 Genmab As Proteinas que contienen fc de anticuerpos heterodimericos y metodos para produccion de las mismas.
JP6022444B2 (ja) 2010-05-14 2016-11-09 ライナット ニューロサイエンス コーポレイション ヘテロ二量体タンパク質ならびにそれを生産および精製するための方法
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
KR101973930B1 (ko) 2010-11-05 2019-04-29 자임워크스 인코포레이티드 Fc 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이량체 항체 디자인
WO2013002831A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Ofs Fitel, Llc Fiber stretcher module for use in the 1550 nm wavelength range
AU2012282116B2 (en) * 2011-07-11 2016-07-07 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to OX40 and their uses
GB201116092D0 (en) * 2011-09-16 2011-11-02 Bioceros B V Antibodies and uses thereof
UA112203C2 (uk) 2011-11-11 2016-08-10 Юсб Фарма С.А. Злитий білок біоспецифічного антитіла, який зв'язується з ox40 людини та сироватковим альбуміном людини
EA201591495A1 (ru) 2013-03-18 2016-05-31 Биосерокс Продактс Б.В. Гуманизированные антитела против cd134 (ox40) и применения указанных антител
US20150190506A1 (en) 2013-12-17 2015-07-09 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
MA39817A (fr) 2014-03-31 2017-02-08 Hoffmann La Roche Thérapie combinatoires comprenant des agents anti-angiogenèse et des agonistes se liant à ox40
EP3632934A1 (en) 2014-03-31 2020-04-08 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-ox40 antibodies and methods of use
TW201619200A (zh) 2014-10-10 2016-06-01 麥迪紐有限責任公司 人類化抗－ｏｘ４０抗體及其用途
EP3215637B1 (en) 2014-11-03 2019-07-03 F. Hoffmann-La Roche AG Methods and biomarkers for predicting efficacy and valuation of an ox40 agonist treatment
AU2015343337A1 (en) 2014-11-03 2017-06-15 Genentech, Inc. Assays for detecting T cell immune subsets and methods of use thereof
EP3215536A1 (en) 2014-11-06 2017-09-13 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
SG10201807625PA (en) 2014-11-17 2018-10-30 Genentech Inc Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
GB201500319D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
CA2981183A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Greg Lazar Antigen binding complex having agonistic activity and methods of use
AU2016256911B2 (en) 2015-05-07 2022-03-31 Agenus Inc. Anti-OX40 antibodies and methods of use thereof
US10669344B2 (en) 2016-08-12 2020-06-02 Janssen Biotech, Inc. Engineered antibodies and other Fc-domain containing molecules with enhanced agonism and effector functions

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999042585A1 (en) * 1998-02-24 1999-08-26 Sisters Of Providence In Oregon Compositions containing an ox-40 receptor binding agent or a nucleic acid encoding the same and methods for enhancing antigen-specific immune response
WO2006119107A2 (en) * 2005-05-03 2006-11-09 Ucb Pharma S.A. Sclerostin binding agents
WO2008079849A2 (en) * 2006-12-22 2008-07-03 Genentech, Inc. Antibodies to insulin-like growth factor receptor
WO2008128455A1 (fr) * 2007-04-24 2008-10-30 Shanghai Cp Guojian Pharmaceutical Co. Ltd Épitopes fonctionnels d'ostéopontine, anticorps monoclonaux contre ces épitopes et leurs utilisations
US20100285036A1 (en) * 2009-05-08 2010-11-11 Vaccinex, Inc. Anti-CD100 Neutralizing Antibodies and Methods of Using the Same
WO2012027328A2 (en) * 2010-08-23 2012-03-01 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same
WO2013028231A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-ox40 antibodies and methods of using the same

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109863170A (zh) * 2016-08-12 2019-06-07 詹森生物科技公司 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
CN110291108A (zh) * 2016-12-19 2019-09-27 格兰马克药品股份有限公司 新型tnfr激动剂及其用途
WO2018177220A1 (zh) * 2017-03-25 2018-10-04 信达生物制药(苏州)有限公司 抗ox40抗体及其用途
US11498972B2 (en) 2017-03-25 2022-11-15 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-OX40 antibody and use thereof
CN110546162A (zh) * 2017-03-28 2019-12-06 礼进生物医药控股有限公司 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法
CN113336849A (zh) * 2017-03-28 2021-09-03 礼进生物医药科技（上海）有限公司 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法
CN110546162B (zh) * 2017-03-28 2021-09-07 礼进生物医药科技（上海）有限公司 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法
WO2019144677A1 (zh) * 2018-01-29 2019-08-01 康源博创生物科技(北京)有限公司 抗ox40抗体及其用途
CN110467674A (zh) * 2018-05-11 2019-11-19 上海药明生物技术有限公司 抗ox40的全人抗体及其制备方法和用途
CN110172090A (zh) * 2019-06-03 2019-08-27 北京岳昊科技发展有限公司 Cd134单克隆抗体及其制备方法和癌症治疗中的应用
CN111518209A (zh) * 2020-05-09 2020-08-11 郑州航空港百桥生物科技有限公司 特异性结合人ox40的单克隆抗体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CL2018003807A1 (es) 2019-03-08
CA2907436A1 (en) 2014-09-25
PH12015502185A1 (en) 2016-01-25
MD20180107A2 (ro) 2019-06-30
KR20160006168A (ko) 2016-01-18
MX2015013288A (es) 2016-04-07
PL2976361T3 (pl) 2018-12-31
DK2976361T3 (en) 2018-10-01
SG11201507781VA (en) 2015-10-29
HUE040234T2 (hu) 2019-02-28
SI2976361T1 (sl) 2018-11-30
CL2015002793A1 (es) 2016-09-23
WO2014148895A1 (en) 2014-09-25
PT2976361T (pt) 2018-10-19
US20190202928A1 (en) 2019-07-04
AU2014238546B2 (en) 2018-10-18
EP3409690A1 (en) 2018-12-05
AU2014238546A1 (en) 2015-10-01
US9790281B2 (en) 2017-10-17
MX2019004649A (es) 2019-08-05
HRP20181478T1 (hr) 2018-11-02
CR20150498A (es) 2016-03-30
AU2019200164A1 (en) 2019-01-31
MD4633B1 (ro) 2019-06-30
EP2976361A1 (en) 2016-01-27
PE20160690A1 (es) 2016-08-14
CY1120752T1 (el) 2019-12-11
EP2976361B1 (en) 2018-07-18
SG10201708048XA (en) 2017-10-30
RS57840B1 (sr) 2018-12-31
US20140377284A1 (en) 2014-12-25
US10273307B2 (en) 2019-04-30
HK1215035A1 (zh) 2016-08-12
EA201591495A1 (ru) 2016-05-31
ES2687282T3 (es) 2018-10-24
NZ712903A (en) 2018-07-27
UA119319C2 (uk) 2019-06-10
LT2976361T (lt) 2018-10-25
JP2016515544A (ja) 2016-05-30
MD20150102A2 (ro) 2016-02-29
US20170369586A1 (en) 2017-12-28
ZA201507021B (en) 2016-11-30
BR112015023862A2 (pt) 2017-10-24
AU2014238546C1 (en) 2019-01-17
IL241701A0 (en) 2015-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105229032A (zh) 人源化抗cd134(ox40)抗体及其应用
JP7320555B2 (ja) グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ｇｉｔｒ）に対する抗体およびその使用
JP7271637B2 (ja) 抗ｐｓｍａ抗体、ｐｓｍａ及びｃｄ３と結合する二重特異性抗原結合分子、ならびにその使用
JP6633032B2 (ja) Ｔｉｇｉｔに対する抗体
CN104080809B (zh) 抗cd134(ox40)抗体及其应用
ES2868330T3 (es) Composiciones de anticuerpos para el tratamiento de tumores
CN109757103A (zh) 针对tim3的抗体及其用途
CN108738324A (zh) 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
JP2020515239A (ja) 抗ｉｃｏｓアゴニスト抗体およびそれらの使用
CN109970860A (zh) 三链抗体、其制备方法及其用途
CN110305210A (zh) 新型抗体分子、其制备方法及其用途
JP2017535257A (ja) 免疫応答およびがん治療の増強に使用するための組成物および方法
JP2021525731A (ja) 多重特異性結合タンパク質及びその改善
JP7353576B2 (ja) Ｃｄ３３、ｎｋｇ２ｄ、及びｃｄ１６に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにその使用方法
CN109863170A (zh) 具有增强的激动作用和效应子功能的工程化抗体及其他含Fc结构域分子
CN105473615A (zh) 抗-CD38抗体和与致弱干扰素α-2B的融合体
KR20200037388A (ko) Nkg2d, cd16, 및 egfr, hla-e, ccr4 또는 pd-l1에 결합하는 단백질
CN113301919A (zh) 激活免疫细胞的双特异性抗体
CN113825774A (zh) 抗cd47/抗pd-l1多抗原结合蛋白及其使用方法
KR20200038530A (ko) Nkg2d, cd16 및 종양-연관 항원에 결합하는 단백질
AU2021311701A1 (en) Anti-CTLA-4 antibody and use thereof
CN111886255A (zh) 抗tim3抗体及其用途
CN114008080A (zh) 抗pd-l1/抗lag-3多抗原结合蛋白及其使用方法
TW202307003A (zh) 抗ｃｅａ和抗ｃｄ１３７多特異性抗體及其使用方法
CN116410326A (zh) 抗cd40×cldn18.2双特异性抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1215035

Country of ref document: HK

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160106

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1215035

Country of ref document: HK