CN109627340A - Cd3和prlr双特异性抗体及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CD3和PRLR双特异性抗体及其构建与应用；通过构建靶向CD3抗体融合蛋白IntC的重链和轻链质粒pM‑CD3Hc、pM‑CD3Lc和pM‑IntCFc，瞬时共转染转入细胞中，亲和纯化得到片段A抗体；构建靶向PRLR抗体融合蛋白IntN的重链和轻链质粒pM‑PRLRIntN与pM‑PRLRLc，瞬时共转染细胞，亲和纯化得到片段B抗体；片段A、B抗体体外反式剪接，即得所述CD3和PRLR双特异性抗体。本发明为目前乳腺癌HER2、ER靶点治疗提供一种新的靶点治疗策略；相比于PRLR阻断型抗体而言，PRLR‑DbsAb抑制肿瘤效果更加明显。

Description

CD3和PRLR双特异性抗体及其构建与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种CD3和PRLR双特异性抗体及其构建与应用。
背景技术
催乳素与PRLR的结合导致受体的二聚化和细胞内信号传导。通过PRLR的信号传导与各种过程相关联，所述过程诸如为乳腺发育、哺乳、生殖和免疫调节有关。除垂体前叶产生的催乳素外，局部产生的催乳素可以促进乳腺癌自分泌形式的肿瘤发生。PRLR在正常组织中乳腺组织有微量表达，乳腺癌组织表达量比正常乳腺组织高达30倍。在一项针对两种原位和高度转移性乳腺癌细胞系(小鼠4T1和人类BT-474)的研究中，在三维培养中敲除PRLR导致95％的肿瘤起始/癌症干细胞凋亡(Yonezawa,T.,et al.,Anti-metastaticoutcome of isoform-specific prolactin receptor targeting in breastcancer.Cancer Lett,2015.366(1):p.84-92)。升高的表达PRLR和催乳素的高循环水平已与肿瘤进展和侵入的风险增加相关。前瞻性研究表明高达女性乳腺肿瘤的95％和男性乳房癌的60％表达催乳素或PRLR。
此外，来自于基础与临床统计的研究发现，PRLR还参与前列腺癌发展。自分泌和/或旁分泌催乳素也可能有助于前列腺癌的发病机制。表达催乳素小鼠前列腺过度增生，这些改变可能进展为上皮内瘤变和甚至前列腺癌(Rouet,V.,et al.,Local prolactin is atarget to prevent expansion of basal/stem cells in prostate tumors.Proc NatlAcad Sci U S A,2010.107(34):p.15199-204；Wennbo,H.,et al.,Transgenic miceoverexpressing the prolactin gene develop dramatic enlargement of theprostate gland.Endocrinology,1997.138(10):p.4410-5)。在流行病学研究中，催乳素和磷酸化信号转导和转录激活因子5(STAT5)在人类前列腺癌中的存在与侵袭性肿瘤相关(Sackmann-Sala,L.and V.Goffin,Prolactin-induced prostate tumorigenesis.AdvExp Med Biol,2015.846:p.221-42)。PRLR信号转导的阻断已被建议作为治疗乳腺癌和前列腺癌的手段(Damiano,J.S.and E.Wasserman,Molecular pathways:blockade of thePRLR signaling pathway as a novel antihormonal approach for the treatment ofbreast and prostate cancer.Clin Cancer Res,2013.19(7):p.1644-50)。
Agarwal等人报道在PRLR阳性转移性乳腺癌或转移性阉割抵抗性前列腺癌(mCRPC)患者中，LFA102(一种结合并抑制催乳素受体(PRLR)信号传导的人源化单克隆抗体(mAb))的I期试验的阴性结果(Agarwal,N.,et al.,Phase I Study of the ProlactinReceptor Antagonist LFA102in Metastatic Breast and Castration-ResistantProstate Cancer.Oncologist,2016.21(5):p.535-6；Damiano,J.S.,et al.,Neutralization of prolactin receptor function by monoclonal antibody LFA102,anovel potential therapeutic for the treatment of breast cancer.Mol CancerTher,2013.12(3):p.295-305)。PRLR在一定子集乳腺癌和前列腺癌中过表达，而它本身并不同于乳腺癌靶点Her2(一种在其他大多数正常上皮细胞表达)，仅在正常乳腺组织有少量表达，而对晚期乳腺癌治疗常常采取外科手术常规切除可能浸润的乳腺组织。I期临床爬坡实验中，推荐扩充剂量至60mg/kg大剂量下仅有4％的与药物相关，3/4级全因不良事件。以上研究暗示着PRLR免疫治疗可能具有极小的严重副作用。
乳腺、前列腺和其它肿瘤类型中检测到高水平的PRLR表达，而正常组织表达主要仅限于乳腺组织；而单纯PRLR阻断在临床试验中阴性结果；综合这两点，本发明提供了通过采用靶向双特异性抗体治疗癌症的新手段的基础，本发明的双特异性抗体识别PRLR过表达肿瘤细胞并通过被该抗体的CD3结合结构域识别的细抗PRLR抗体胞毒性T细胞的再定向来杀死这些PRLR过表达肿瘤细胞。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术存在的不足，提供一种CD3和PRLR双特异性抗体及其构建与应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种CD3和PRLR双特异性抗体，所述抗体的结合抗原结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CD3胞外区，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的抗CD3抗体VH区域，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的抗CD3抗体VL区域；氨基酸序列如SEQID NO.2所示的PRLR胞外区，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的抗PRLR抗体VH区域，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的抗PRLR抗体VL区域。
所述抗CD3抗体VH区域的碱基序列如SEQ ID NO.3所示；所述抗CD3抗体VL区域的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；所述抗PRLR抗体VH区域的碱基序列如SEQ ID NO.5所示；所述抗PRLR抗体VL区域的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
第二方面，本发明涉及一种所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
S1、片段A抗体的表达获得：构建靶向CD3抗体融合蛋白IntC的重链和轻链质粒pM-CD3Hc、pM-CD3Lc和pM-IntCFc，用瞬时转染的方式将三个质粒同时转入细胞中，收集培养基上清，亲和纯化得到片段A抗体；
S2、片段B抗体的表达获得：构建靶向PRLR抗体融合蛋白IntN的重链和轻链质粒pM-PRLRIntN与pM-PRLRLc，用瞬时转染的方式将两个质粒同时转入细胞中，收集培养基上清，亲和纯化得到片段B抗体；
S3、片段A抗体和片段B抗体的体外反式剪接，即得所述CD3和PRLR双特异性抗体。
优选的，所述片段A抗体蛋白结合氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CD3胞外区；所述片段B抗体蛋白结合氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PRLR胞外区。
优选的，所述片段A抗体含有CD3Hc重链、CD3Lc轻链和IntCFc重链；所述CD3Hc重链包括依次连接的VH、CH1、CH2和CH3区域；所述CD3Lc轻链包括依次连接的VL和CL区域；所述IntCFc重链包括依次连接的Intc、CH2和CH3区域；所述CD3Hc重链的CH3区域366位的苏氨酸突变为色氨酸形成凸起结构；所述IntCFc重链的CH3区域366位苏氨酸突变为丝氨酸，368位的亮氨酸突变为丙氨酸，407位的酪氨酸突变为缬氨酸形成凹洞结构。
优选的，所述CD3Hc重链的CH3区域54位丝氨酸突变为半胱氨酸；所述IntCFc重链的CH3区域349位酪氨酸突变为半胱氨酸。
优选的，所述CD3Hc重链的CH3区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述IntCFc重链的CH3区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
优选的，所述所述CD3Hc重链的VH区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；CH1区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQID NO.18所示；CH2区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述CD3Lc轻链的VL区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示；CL区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述IntCFc重链的Intc区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.22所示；CH2区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
优选的，所述片段B抗体含有PRLRLC轻链和PRLRIntN重链；所述PRLRLC轻链包括依次连接的VL和CL区域；所述PRLRIntN重链包括依次连接的VH、CH1和IntN区域。
优选的，所述PRLRLC轻链的VL区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；CL区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.24所示；所述PRLRIntN重链的VH区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；CH1区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示；IntN区域的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
第三方面，本发明还涉及一种所述的CD3和PRLR双特异性抗体在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
优选的，所述CD3和PRLR双特异性抗体识别PRLR过表达肿瘤细胞并通过被该抗体的CD3结合结构域识别的细抗PRLR抗体胞毒性T细胞的再定向来杀死所述PRLR过表达肿瘤细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1：相对于之前针对PRLR单抗而言，针对PRLR-DbsAb双特异性抗体最大细胞杀伤率提高2倍，本课题实验条件下30％细胞杀伤PRLR-DbsAb剂量比PRLR单抗低100倍；
2：对于目前乳腺癌HER2、ER靶点治疗提供一种新的靶点治疗策略；
3：相比于PRLR阻断型抗体而言，PRLR-DbsAb抑制肿瘤效果更加明显。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1片段A与B结构；
图2片段A与B设计；
图3为利用BAPTS平台产生PRLR-DbsAb示意图；
图4为重组蛋白表达电泳示意图；(a)SDS-PAGE分析还原和非还原条件下ProteinL纯化的片段B蛋白PRLRIntN的电泳图；(b)SDS-PAGE分析片段A和B在还原条件下反应混合物的电泳图；(c)SDS-PAGE分析片段A和B在非还原条件下反应混合物的电泳图；(d)SDS-PAGE分析在还原和非还原条件下Protein A洗脱的电泳图；其中，泳道：1，片段A(CD3)和B(PRLR)反式剪接反应后的样品；2，镍柱洗脱；3，镍柱流通；4，蛋白A流通；5-14，蛋白A洗脱；需要解释的是反应混合物被稀释20倍，然后通过SDS-PAGE凝胶进行分析，所以条带太浅而不清楚；
图5为纯化的PRLR-DbsAb结合CD3T细胞和PRLR表达T47D细胞示意图，将PBMC与5μg/ml PRLR-mAb，CD3mAb或PRLR-DbsAb孵育30分钟，然后孵育APC-labeled-anti-huIgG二抗同时加入FITC标记的抗CD8和PE标记的抗CD4抗体；(a)PRLR-DbsAb与分离的PBMC结合的FACS分析，左侧灰色区域代表阴性荧光信号；右侧区域是阳性荧光信号；(b)PRLR-DbsAb与CD4和CD8阳性T淋巴细胞结合的流式细胞术分析；(c)PRLR-DbsAb结合乳腺癌细胞系T47D的流式分析直方图；
图6为PRLR-DbsAb激活T细胞示意图，将效应细胞(huPBMC)和靶细胞T47D与100ng/ml重组抗体(PRLR mAb和PRLR-DbsAb)一起温育20小时(效应-靶标比例为10:1)；(a)通过FACS抗体染色细胞以分析PBMC T细胞表面上活化标记蛋白CD69的表达；(b)通过FACS抗体染色细胞以分析CD4T细胞表面上活化标记蛋白CD69的表达；(c)通过FACS抗体染色细胞以分析CD8T细胞表面上活化标记蛋白CD69的表达；
图7为Elisa方法分别检测培养基上清IFN-γ和TNF-α水平示意图；
图8为PRLR-DbsAb细胞毒性与靶细胞PRLR表达相关示意图；(a)不同乳腺癌细胞系(MDA-MB-231，MCF-7，SKBR-3和T47D)中PRLR表达的FACS直方图，灰色直方图表示非特异性IgG抗体荧光信号；(b)由PRLR-DbsAb和对照PRLR mAb介导的细胞毒性，在不同比例的效应细胞与靶细胞(2.5：1-20：1)下具有相同剂量的100ng/ml；(c-f)将新鲜分离的PBMC与靶细胞在10：1(E：T)下在不同处理下孵育20小时后检测LDH释放，PRLR-DbsAb诱导T细胞杀伤表达PRLR T47D细胞具有剂量依赖性(f)，并且表达PRLR细胞MDA-MB-231(c)，MCF-7(d)和SKBR-3(e)的杀伤效果依次减弱；(g)通过用Graphpad Prism软件拟合剂量-反应曲线计算EC 50值和Top细胞毒性；(h)PRLR mAb和CD3mAb的组合不介导T47D细胞的T细胞杀伤；进行三次独立实验，数据表示为平均值±SEM。*表示至少P<0.05的统计学显着性差异；
图9为PRLR-DbsAb抑制体内PRLR表达肿瘤生长示意图，sc肿瘤细胞加sc效应细胞(E/T 1：4)模型；(a)接种肿瘤和治疗的示意图，将总共1×107个T47D细胞和2.5×106个未刺激的huPBMC注射到小鼠中，并且每周腹腔注射5ml/kg PBS，3mg/kg PRLR，0.33mg/kg，1mg/kg或3mg/kg PRLR-DbsAb给予接种的小鼠(n＝6-7)；(b)T47D肿瘤大小，数据表示为来自不同小鼠的测量肿瘤体积；(c)T47D肿瘤大小，数据表示为平均值±SEM；(d)剥离肿瘤的数字图像；(e)剥离肿瘤重量，Sc肿瘤细胞加ip效应细胞(1：1)模型；(f)接种肿瘤和治疗的示意图；(g)T47D肿瘤大小，数据表示为平均值±SEM(n＝3)；(h)剥离肿瘤的数字图像和重量；(i)小鼠生长曲线，*表示P<0.05具有统计学意义。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明涉及的术语解释：
抗体：抗体是机体对抗原刺激发生反应，由浆细胞产生的一种免疫球蛋白。它能特异性的识别相应的抗原并与之反应。
二价双特异性抗体：指如上所述的抗体，其中两对重链和轻链(HC/LC)中的每对特异性结合不同的抗原，即第一重链和第一轻链(源自针对A抗原的抗体)特异性共同结合抗原A，且第二重链和第二轻链(源自针对B抗原的抗体)特异性共同结合B抗原；所述二价双特异性抗体能够同时特异性结合两种不同的抗原，且不超过两种抗原，与其相对照的是，一方面仅能够结合一种抗原的单特异性抗体和另一方面例如能够同时结合四种抗原分子的四价、四特异性抗体。
断裂intein：断裂型蛋白质内含子(split intein)是由N-端蛋白质剪接区域(In,N-fragment of intein)和C-端蛋白质剪接区域(Ic,C-fragment of intein)两部分组成,表达前体蛋白质的基因被分裂在两个开放阅读框中,断裂位点是在蛋白质内含子序列的内部。N-端蛋白质外显子(En)与断裂型蛋白质内含子的N-端(In)的基因形成融合基因,翻译形成的融合蛋白称为N-端前体蛋白质。而断裂型蛋白质内含子的C-端(Ic)与C-端蛋白质外显子(Ec)的表达基因形成融合基因,翻译后产生的融合蛋白称为C-端前体蛋白质。单独的断裂型蛋白质内含子的N-端(In)或C-端(Ic)不具有蛋白质剪接功能,但是在蛋白质翻译以后,N-端前体蛋白质中的In与C-端前体蛋白质的Ic通过互相识别以非共价键结合,形成有功能的蛋白质内含子,能够催化蛋白质反式剪接反应,以肽键将两个分离的蛋白质外显子(En、EC)连接起来。
反式剪接：蛋白质反式剪接(protein/ram-splicing)是指由断裂型蛋白质内含子介导的蛋白质剪接反应。在这种类型的剪接过程中,首先是断裂蛋白质内含子的N-端片段(In)和C-端片段(Ic)相互识别并以非共价键结合(图3),一者结合后正确折脊其结构,重建活性中心的断裂行蛋白质内含子按照典型的蛋白质剪接途径完成蛋白质剪接反应,将两侧的蛋白质外显子的连接(Saleh.L.,Chemical Record(化学档案)6(2006)183-193)。
IntN：单独的断裂型蛋白内含子的N-端部分。
IntC：单独的断裂型蛋白内含子的C-端部分。
瞬时转染：瞬时转染(transient transfection)是将DNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的DNA不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞，并对溶解产物中目的基因的表达进行检测。
效应细胞：指表达一种或多种FcR并执行效应器功能的白细胞。在此，这种细胞至少表达FcγRⅢ受体并执行ADCC效应器功能。能介导ADCC的人白细胞包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤细胞(NK)、单核细胞、细胞毒T细胞和中性白细胞，优选NK细胞和PBMC。效应细胞可从天然来源如血液中分离得到或通过采用本领域的已知方法进行体外增殖。
本发明通过实验室之前建立Intein剪接生产双特异性抗体平台构建了靶向T细胞CD3抗原和乳腺癌肿瘤相关抗原PRLR的双特异性抗体PRLR-DbsAb，如图3。首先，构建了靶向PRLR抗体融合蛋白(IntN)的重链和轻链质粒pM-PRLRIntN与pM-PRLRLc，用瞬时转染的方式将两个质粒同时转入细胞中，收集培养基上清，经CaptoL亲和纯化得到抗体片段PRLRIntN，即片段B抗体。通过将PRLRIntN与靶向抗原CD3抗体片段CD3IntC(即片段A抗体)混合后经剪接反应，一系列纯化得到双效抗体PRLR-DbsAb。这是首次构建同时靶向CD3和PRLR抗原的CD3×PRLR双特异性抗体。
然后，对PRLR-DbsAb抗体进行亲和力分析、靶细胞结合测定。Biacore法检测PRLR-DbsAb对CD3E抗原和PRLR的胞外区(ECD)显示良好亲和力。此外，与CD3mAb相比，PRLR-DbsAb同样可以结合人外周血单核细胞、以及CD3阳性的CD4+和CD8+T细胞。经流式细胞术分析，T47D细胞是PRLR高表达的乳腺癌细胞株，PRLR能够很好结合靶细胞T47D。以上结果表明，构建的PRLR-DbsAb抗体能够同时结合细胞表面CD3和PRLR。
靶向CD3双效抗体介导的细胞杀伤依赖于T细胞活化，本发明设计四个实验组别：PBMC、PBMC+T47D、PBMC+PRLR-DbsAb以及PBMC+T47D+PRLR-DbsAb。结果显示PRLR-DbsAb刺激PBMC、CD4和CD8T细胞中活化标志蛋白CD69上调。将PBMC与PRLR表达的T47D细胞孵育，给予PRLR-DbsAb和对照抗体PRLR mAb；与PRLR mAb相比，PRLR-DbsAb促进Th1相关细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌。以上结果表明，PRLR-DbsAb激活T细胞。
在本研究中，首次评估了PRLR-DbsAb体内外活性，PRLR-DbsAb相对于阻断PRLR单抗而言，提高最大细胞杀伤接近2倍，而在达到对PRLR高表达细胞株杀伤30％时PRLR-DbsAb剂量仅需10ng/ml(pM)，PRLR mAb需要1000ng/ml，剂量相差100倍。体内结果表明0.33mg/kgPRLR-DbsAb接近3mg/kg PRLR mAb的抑瘤活性。这些结果暗示着PRLR-DbsAb有着比PRLR阻断更优越的抗肿瘤特性。
据本发明了解，这是第一次报道针对PRLR重定向T细胞至乳腺癌的双特异抗体，这一发现可能为围绕PRLR靶点治疗转移性乳腺癌和前列癌提供新的策略，良好的体内外抗瘤活性可能也为乳腺癌治疗的医疗需求提供一种新的选择。本发明的具体方案见以下实施例：
实施例1
1、A片段与B片段表达载体构建
A片段与B片段抗体蛋白分别结合CD3和PRLR胞外区，CD3和PRLR胞外区氨基酸序列如表一。表达载体分别按照抗体A蛋白结构(图1)，片段A蛋白由两条重链(CD3Hc和IntCFc和一条轻链(CD3Lc)组成。分别设计与三条链对应的载体。CD3抗体可变区基因重链和轻链序列，所需基因区段通过基因化学合成，CD3Hc和CD3Lc蛋白链对应基因片段通过PCR扩增的寡核苷酸退火连接装配，通过限制位点HindIII/BamH1等克隆表达载体，表达载体可以选择哺乳动物细胞表达载体。为了解决重链错配问题，引入了“Knobs-into-Holes(杵-进入-臼)”结构，在片段A中CD3Hc将366位的苏氨酸突变为色氨酸形成“Knobs”结构；同时在IntCFc重链CH3区域将366位苏氨酸突变为丝氨酸，368位的亮氨酸突变为丙氨酸，407位的酪氨酸突变为缬氨酸形成“Holes”结构，为了提高CH3区域稳定性，CD3Hc链上354位丝氨酸突变半胱氨酸，IntCFc链349位酪氨酸突变半胱氨酸引入一对二硫键增加稳定性。A片段和B片段各链设计如图2，其中对应的每段结构域的基因序列如(表2)，氨基酸序列如(表3)。
表1 CD3和PRLR抗原信息CD3和PRLR双特异性抗体及其构建与应用
表2基因信息
表3氨基酸信息
2、瞬时转染HEK239E细胞表达及纯化片段A与B
PEI(polyscine阳离子转染试剂)介导片段A三表达载体共转染HEK193E细胞，SFM4HEK293培养基(Hyclone)和Freestyle293培养基(Gibco)以1:1的比例混合培养基培养，以37℃，120rpm，5％CO2培养。转染三个载体按照总质粒1.5μg/10^6个细胞等摩尔比混匀，用Freestyle293培养基稀释DNA至40ng/μl，DNA:PEI质量比为1:5的PEI加入混和转染液中，混匀，孵育20min后加入到细胞悬液中，转染4小时后加入预热SFM4HEK293培养基继续培养7天。片段B表达，将其两个载体共转HEK293E细胞，操作同片段A转染过程。培养7天后，直接收集上清用于纯化。片段A与B经Protein L亲和纯化得到，PBS平衡Protein L柱后上样，用PH5.0的100mM柠檬酸缓冲液去除杂质组分，在PH3.0的100柠檬酸缓冲液洗脱，后用PH9.0的1M tris-HCl缓冲液立即中和样品，得到的样品经透析后用SDS-PAGE胶分析，如图4a。
3、PRLR-DbsAb获取
片段A可以被还原成三种肽CD3Lc，CD3HK和IntCFcH(图4b和c)。同样，片段B可被还原为两种肽PRLRIntN和PRLRLc(图4a)。PRLR-DbsAb通过将片段A(抗CD3)和B(抗PRLR)反式剪接纯化得到(图3)。将片段A与B按摩尔比1：1进行混合，同时加入0.05mM DTT诱导内含肽介导剪接反应片段A和B被内含肽Npu剪切并融合后，通过Protein A亲和纯化得到PRLR-DbsAb双特异抗体，SDS-PAGE可见在对应于剪接产物PRLR-DbsAb的预期大小的位置新条带(图4b)。PRLR-DbsAb通过蛋白A亲和层析纯化进而从反应混合物中除去片段B(图4d)，得到用于进行体内外活性测定的PRLR-DbsAb。
4、PRLR-DbsAb与CD3E及PRLR抗原亲和力分析
使用表面等离子体共振(SPR)(Biacore T200，GE)测定PRLR-DbsAb，PRLR mAb和CD3mAb的亲和力。使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)胺将人PRLR胞外结构域(Sino Biological)和CD3DxCD3E异二聚体(SinoBiological)的固定到CM5芯片表面。通过Biacore T200分析软件进行拟合，以时间为横坐标，信号值为纵坐标以确定结合(Ka)和解离(Kd)速率常数和平衡解离常数(KD)。如上所述将PRLR细胞外结构域偶联到CM5传感器芯片上，PRLR-DbsAb注射2分钟，然后注射CD3D×CD3E异源二聚体2分钟。使用10秒注射0.1M甘氨酸，pH1.5再生30s。通过针对重组PRLR胞外结构域(ECD)和CD3e的分析PRLR-DbsAb针对单个抗原的结合特性，结果为2.31E-9和8.36E-8M的平衡解离常数(KD)(表4)。
表4
抗体 Ka(1/Ms) Kd(1/S) K<sub>D</sub>(M)
PRLR mAb(PRLR) 3.98E+5 1.62E-4 4.07E-10
PRLR DbsAb(PRLR) 2.94E+5 6.79E-4 2.31E-9
CD3mAb(CD3) 9.92E+5 8.96E-4 9.03E-10
PRLR DbsAb(CD3) 2.47E+5 2.06E-4 8.36E-8
5、PRLR-DbsAb结合表达CD3和PRLR靶细胞
利用Ficoll等密度离心法从健康志愿者外周血分离单核细胞(PBMC)。分别用5μg/ml PRLR-DbsAb、PRLR mAb以及CD3mAb冰育30min后，用FACS buffer清洗两遍后，加入APC-labeled-anti-huIgG冰上孵育30min，用FACS缓冲液洗涤样品两次，并使CytoFLEX流式细胞仪分析。抗人CD4(BD Biosciences)和抗人CD8(BD Biosciences)的三种抗体在冰上同时温育30分钟。PRLR mAb为阴性对照，CD3mAb与PRLR-DbsAb组分别有73％和72％阳性细胞信号(图5a)。CD4与CD8阳性T细胞都表达CD3，PRLR-DbsAb同样可以结合CD4+和CD8+T细胞(图9c)。T47D细胞是PRLR高表达细胞，分别用5μg/ml PRLR mAb与PRLR-DsbAb孵育T47D细胞，结果显示PRLR单抗与双特异性抗体对靶细胞良好结合(图5b)。
6、PRLR-DbsAb激活T细胞
我们测定了PRLR-DbsAb体外激活T细胞的能力。与PRLR-DbsAb和靶细胞同时孵育下,人外周血单核细胞(PBMC)中T细胞活化标记蛋白CD69表达显著升高，阳性细胞数89.78％；然而，在没有靶细胞作用下，PRLR-DbsAb上调PBMC中CD69表达阳性率至59.89％(图6a)。提示PRLR-DbsAb显著上调CD69表达依赖靶细胞PRLR表达T47D存在。我们进一步检测了PRLR-DbsAb和靶细胞对CD4+和CD8+T细胞活化的影响。不加入PRLR-DbsAb下，加入靶细胞后CD4+CD69+细胞从0.16％增高至1.59％，CD8+CD69+从0.31％升至8.00％，表明靶细胞存在对CD8+细胞活化影响更大；不加入靶细胞下，PRLR-DbsAb刺激PBMC中CD4+CD69+细胞从0.16％至28.12％，CD8+CD69+从0.31％至14.24％，表明PRLR-DbsAb皆能独立活化CD4+和CD8+T细胞；靶细胞和PRLR-DbsAb同时存在下，CD4+CD69+和CD8+CD69+细胞分别为32.98％和23.72％；以上结果表明CD4+T细胞激活主要依赖于PRLR-DbsAb，效应杀伤细胞CD8+T细胞活化依赖于靶细胞和PRLR-DbsAb共同作用(图6b和图6c)。
7、PRLR-DbsAb促进细胞因子释放
为了测试PRLR-DbsAb激活T细胞是否导致有利细胞因子产生，我们检测PRLRmAb和PRLR-DbsAb下孵育效应细胞和靶细胞中培养基上清中IFN-γ和TNF-α，PRLRmAb中分泌这些细胞因子极少，PRLR-DbsAb极大地刺激T细胞分泌相关细胞因子(图7)。
8、PRLR-DbsAb介导PRLR表达相关的细胞杀伤
有文献报道PRLR在HER2阴性(MDA-MBA-231和MCF-7)和阳性(SKBR-3和T47D)细胞有PRLR表达。我们用PRLR-PE流式抗体检测上述四株细胞的PRLR表达，表明PRLR在不同乳腺癌细胞株表达量不同，T47D表达量最高，其次分别是SKBR-3、MCF-7和MDA-MB-231细胞(图8a)。纯化的PRLR mAb和PRLR-DbsAb对高表达T47D细胞具有良好的结合力。PRLR-DbsAb介导免疫效应细胞杀伤靶细胞T47D具有效靶比依耐性，低效靶比为5:1时，相比于PRLRmAb组，PRLR-DbsAb具有显著T细胞杀伤毒性(p<0.01)；效靶比为10:1时，PRLR-DbsAb(100ng/ml)细胞杀伤已至60％(图8b)。相比如PRLR mAb单抗，PRLR-DbsAb促进免疫细胞杀伤乳腺癌MDA-MB-231(图8d)、SKBR-3(图8e)、MCF-7(图8f)以及T47D细胞(图8g)，相同细胞杀伤率下PRLR-DbsAb剂量更低。CD3mAb降低PRLR mAb介导的细胞杀伤(图8c)。PRLR-DbsAb对不同乳腺癌细胞T47D、SKBR-3、MCF-7和MDA-MB-231最大细胞杀伤分别是56.42％、46.92％、36.54％和34.55％，且细胞杀伤EC50皆在ng/ml级别(图8h)。以上数据显著表明，PRLR-DbsAb介导T细胞杀伤与PRLR表达相关。
9、PRLR-DbsAb体内活性
为了研究PRLR-DbsAb的体内活性，我们在NOD/SCID小鼠中采用预防性和治疗性给药两种方式(图9a、f)。首先，将PRLR表达T47D细胞与来自健康供体的未激活的huPBMC一起移植至小鼠的腋下。从肿瘤细胞接种第二天开始，以每周一次的方案腹腔给药(图9a)。相比于仅仅给溶剂组而言，3mg/kg PRLR mAb轻微抑制肿瘤生长，其作用与PRLR-DbsAb低剂量0.33mg/kg差不多(图9b、c)。而PRLR-DbsAb可以显著抑制T47D乳腺癌细胞生长，抑瘤效果明显且存在剂量依赖性(图9b-e)。然后，我们先接种T47D细胞至小鼠腋下，12d后腹腔给予未激活huPBMC 1*10^7细胞，同时给予3mg/kg PRLR-DbsAb(图9g)。给予PRLR-DbsAb小鼠表现出显著地肿瘤抑制(图9g、h)和生存获益(图9i)。这些数据表明，全身施用PRLR-DbsAb可明显抑制PRLR表达T47D肿瘤生长并延长其生存期。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> CD3和PRLR双特异性抗体及其构建与应用
<130> DAG37758
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列(CD3胞外区)
<400> 1
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
100
<210> 2
<211> 104
<212> PRT
<213> 人工序列(CD3胞外区)
<400> 2
Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys Val
1 5 10 15
Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro Gly
20 25 30
Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp Glu
35 40 45
Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys Glu
50 55 60
Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly
65 70 75 80
Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg Val
85 90 95
Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp
100
<210> 3
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列(CD3VH)
<400> 3
caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180
aatcagaagg tcaaggaccg attcaccatc tccacagaca aatccaagag cacggcgttt 240
ctgcaaatgg acagcctgag acccgaggac acgggtgtgt atttctgtgc gagatattat 300
gatgatcatt actcccttga ctactggggc caaggcaccc tcgtcacagt ctcctca 357
<210> 4
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(CD3VL)
<400> 4
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtatcagca gaccccaggg 120
aaagccccta agcgctggat ctacgacaca tccaaactgg cttctggggt cccatcaagg 180
ttcagtggaa gtggatctgg gacagattat actttcacca tcagcagcct gcagcctgaa 240
gatattgcaa catattactg tcagcagtgg agtagtaacc cattcacgtt tggccagggt 300
accaaactgc agattacccg c 321
<210> 5
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列(PRLRVH)
<400> 5
gaggtgcagc tggtggagag cggaggcgac ctggtgaagc caggaggatc cctgaagctg 60
tcttgcgccg tgagcggctt cacctttagc tcctatggca tgtcctgggt gcggcagacc 120
cccgataaga ggctggagtg ggtggccaca gtgtctagcg gcggcaccta tacatactat 180
cctgactccg tgaagggcag gttcaccatc tctcgcgata acgccaagaa tacactgtac 240
ctgcagatgt cctctctgaa gtctgaggac agcgccatgt actattgtgc ccggcacaga 300
ggcaactact atgccacata ctattacgcc atggattact ggggccaggg cacctctgtg 360
acagtgagct cc 372
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(PRLRVL)
<400> 6
gacatcgtgc tgacccagtc cccagcatct ctggccgtgt ccctgggaca gggagcaaca 60
atctcttgca gggccagcaa gtccgtgtct accagcggct acacatatat gcactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaagctg ctgatctatc tggcaagcaa cctggagtcc 180
ggagtgcctg ccagattctc cggctctggc agcggcaccg actttacact gaatatccac 240
ccagtggagg aggaggatgc cgccacctac tattgtcagc actctggaga gctgccacca 300
agcttcggcg gaggaacaaa gctggagatc aagcgg 336
<210> 7
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(CH1)
<400> 7
gcgtcgacga aggggcccag cgtgttcccg ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
gggaccgccg ccctgggctg cctcgtcaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgtcg 120
tggaacagcg gcgcgctgac gagcggggtc cacaccttcc cggccgtgct gcagagcagc 180
ggcctctact cgctgagcag cgtggtcacc gtgcccagca gcagcctggg gacccagacg 240
tacatctgca acgtgaacca caagccctcg aacaccaagg tcgacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgcg acaagacc 318
<210> 8
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(CH2)
<400> 8
cacacctgcc cgccctgccc cgcccccgag ctcctgggcg ggcccagcgt gttcctgttc 60
ccgcccaagc ccaaggacac gctcatgatc agccgcaccc ccgaggtcac ctgcgtggtg 120
gtcgacgtga gccacgagga ccccgaggtg aagttcaact ggtacgtcga cggcgtggag 180
gtgcacaacg ccaagaccaa gccgcgggag gagcagtaca actcgacgta ccgcgtcgtg 240
agcgtgctga ccgtcctgca ccaggactgg ctcaacggca aggagtacaa gtgcaaggtg 300
agcaacaagg ccctgcccgc gcccatcgag aagaccatca gcaaggccaa gggg 354
<210> 9
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(CH3(Knob))
<400> 9
cagccccggg agccgcaggt gtacaccctg cccccctgcc gcgacgagct cacgaagaac 60
caggtcagcc tgtggtgcct ggtgaagggc ttctacccct cggacatcgc cgtggagtgg 120
gagagcaacg ggcagccgga gaacaactac aagaccaccc cgcccgtcct cgacagcgac 180
ggcagcttct tcctgtacag caagctgacg gtggacaagt cgcggtggca gcagggcaac 240
gtgttcagct gcagcgtcat gcacgaggcc ctccacaacc actacaccca gaagagcctg 300
agcctgagcc ccgggaag 318
<210> 10
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列(CH3(Hole))
<400> 10
cagccccggg agccgcaggt gtgcaccctg ccccccagcc gcgacgagct cacgaagaac 60
caggtcagcc tgagctgcgc cgtgaagggc ttctacccct cggacatcgc cgtggagtgg 120
gagagcaacg ggcagccgga gaacaactac aagaccaccc cgcccgtcct cgacagcgac 180
ggcagcttct tcctggtgag caagctgacg gtggacaagt cgcggtggca gcagggcaac 240
gtgttcagct gcagcgtcat gcacgaggcc ctccacaacc actacaccca gaagagcctg 300
agcctgagcc ccgggaag 318
<210> 11
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(CL)
<400> 11
accgtggccg cccccagcgt cttcatcttc ccgcccagcg acgagcagct gaagtcgggc 60
acggccagcg tggtgtgcct cctgaacaac ttctaccccc gcgaggcgaa ggtccagtgg 120
aaggtggaca acgccctgca gagcgggaac agccaggaga gcgtgaccga gcaggactcg 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaggccga ctacgagaag 240
cacaaggtct acgcctgcga ggtgacccac caggggctct cgagccccgt gaccaagagc 300
ttcaaccggg gcgagtgctg a 321
<210> 12
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(IntC)
<400> 12
atgatcaaga ttgcaaccag gaagtacctg ggcaaacaga acgtgtatga catcggagtc 60
gagcgggatc acaacttcgc cctgaaaaat gggtttattg cttccaattg cttcaacgcc 120
agc 123
<210> 13
<211> 309
<212> DNA
<213> 人工序列(IntN)
<400> 13
tgcctgtcct acgagaccga aatcctgaca gtggagtatg gcctgctgcc aatcggaaag 60
attgtcgaga aaaggatcga atgtacagtg tacagcgtcg ataacaatgg caacatctac 120
acccagcccg tggcccagtg gcacgataga ggggagcagg aagtcttcga gtactgcctg 180
gaagacggtt ctctgattag ggctactaag gaccataaat tcatgaccgt ggatggacag 240
atgctgccca tcgacgagat ttttgagagg gaactggacc tgatgcgggt ggataacctg 300
cctaattga 309
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(CD3VH)
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val
50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(CD3VL)
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg
100 105
<210> 16
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(PRLRVH)
<400> 16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Arg Gly Asn Tyr Tyr Ala Thr Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(PRLRVL)
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Gly Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Tyr Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Gly
85 90 95
Glu Leu Pro Pro Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(CH1)
<400> 18
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
100 105
<210> 19
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(CH2)
<400> 19
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
1 5 10 15
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
35 40 45
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
50 55 60
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
85 90 95
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly
115
<210> 20
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(CH3(Knob))
<400> 20
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
1 5 10 15
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
20 25 30
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
35 40 45
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
50 55 60
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
65 70 75 80
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
85 90 95
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 21
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(CH3(Hole))
<400> 21
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
1 5 10 15
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
20 25 30
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
35 40 45
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
50 55 60
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
65 70 75 80
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
85 90 95
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 22
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(IntC)
<400> 22
Met Ile Lys Ile Ala Thr Arg Lys Tyr Leu Gly Lys Gln Asn Val Tyr
1 5 10 15
Asp Ile Gly Val Glu Arg Asp His Asn Phe Ala Leu Lys Asn Gly Phe
20 25 30
Ile Ala Ser Asn Cys Phe Asn Ala Ser
35 40
<210> 23
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列(IntN)
<400> 23
Cys Leu Ser Tyr Glu Thr Glu Ile Leu Thr Val Glu Tyr Gly Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ile Gly Lys Ile Val Glu Lys Arg Ile Glu Cys Thr Val Tyr Ser
20 25 30
Val Asp Asn Asn Gly Asn Ile Tyr Thr Gln Pro Val Ala Gln Trp His
35 40 45
Asp Arg Gly Glu Gln Glu Val Phe Glu Tyr Cys Leu Glu Asp Gly Ser
50 55 60
Leu Ile Arg Ala Thr Lys Asp His Lys Phe Met Thr Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Met Leu Pro Ile Asp Glu Ile Phe Glu Arg Glu Leu Asp Leu Met Arg
85 90 95
Val Asp Asn Leu Pro Asn
100
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(CL)
<400> 24
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (10)

1.一种CD3和PRLR双特异性抗体，其特征在于，所述抗体的结合抗原结构域包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CD3胞外区，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的抗CD3抗体VH区域，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示的抗CD3抗体VL区域；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PRLR胞外区，氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示的抗PRLR抗体VH区域，氨基酸序列如SEQID NO.17所示的抗PRLR抗体VL区域。
2.一种如权利要求1所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
S1、片段A抗体的表达获得：构建靶向CD3抗体融合蛋白IntC的重链和轻链质粒pM-CD3Hc、pM-CD3Lc和pM-IntCFc，用瞬时转染的方式将三个质粒同时转入细胞中，收集培养基上清，亲和纯化得到片段A抗体；
S2、片段B抗体的表达获得：构建靶向PRLR抗体融合蛋白IntN的重链和轻链质粒pM-PRLRIntN与pM-PRLRLc，用瞬时转染的方式将两个质粒同时转入细胞中，收集培养基上清，亲和纯化得到片段B抗体；
S3、片段A抗体和片段B抗体的体外反式剪接，即得所述CD3和PRLR双特异性抗体。
3.如权利要求2所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述片段A抗体蛋白结合氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的CD3胞外区；所述片段B抗体蛋白结合氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的PRLR胞外区。
4.如权利要求2所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述片段A抗体含有CD3Hc重链、CD3Lc轻链和IntCFc重链；所述CD3Hc重链包括依次连接的VH、CH1、CH2和CH3区域；所述CD3Lc轻链包括依次连接的VL和CL区域；所述IntCFc重链包括依次连接的Intc、CH2和CH3区域；所述CD3Hc重链的CH3区域366位的苏氨酸突变为色氨酸形成凸起结构；所述IntCFc重链的CH3区域366位苏氨酸突变为丝氨酸，368位的亮氨酸突变为丙氨酸，407位的酪氨酸突变为缬氨酸形成凹洞结构。
5.如权利要求4所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述CD3Hc重链的CH3区域54位丝氨酸突变为半胱氨酸；所述IntCFc重链的CH3区域349位酪氨酸突变为半胱氨酸。
6.如权利要求5所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述CD3Hc重链的CH3区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述IntCFc重链的CH3区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示。
7.如权利要求4或6所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述所述CD3Hc重链的VH区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；CH1区域的氨基酸序列如SEQ IDNO.18所示；CH2区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述CD3Lc轻链的VL区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；CL区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述IntCFc重链的Intc区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示；CH2区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示。
8.如权利要求2所述的CD3和PRLR双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述片段B抗体含有PRLRLC轻链和PRLRIntN重链；所述PRLRLC轻链包括依次连接的VL和CL区域；所述PRLRIntN重链包括依次连接的VH、CH1和IntN区域；所述PRLRLC轻链的VL区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；CL区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示；所述PRLRIntN重链的VH区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；CH1区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；IntN区域的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
9.一种如权利要求1所述的CD3和PRLR双特异性抗体在制备治疗乳腺癌药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述CD3和PRLR双特异性抗体识别PRLR过表达肿瘤细胞并通过被该抗体的CD3结合结构域识别的细抗PRLR抗体胞毒性T细胞的再定向来杀死所述PRLR过表达肿瘤细胞。
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