CN106414497A - 三特异性结合分子和其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及三特异性结合分子，其是具备三个结合结构域的多链多肽分子，因此能够介导与三个表位的配位结合。可选择结合结构域，以使得三特异性结合分子能够结合任何三个不同表位。这样的表位可以是相同抗原的表位或两个或三个不同抗原的表位。在优选的实施方式中，一个这样的表位能够结合CD3，第二个这样的表位能够结合CD8，和第三个这样的表位能够结合疾病相关的抗原的表位。本发明也提供新的ROR1结合抗体，以及其衍生物和这样的组合物的用途。

Description

三特异性结合分子和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求美国专利申请号62/008,229(2014年6月5日提交；未决)、62/004,571(2014年5月29日提交；未决)和62/107,824(2015年1月26日提交)的优先权，其每一篇申请均通过引用以其整体并入本文。
序列表的引用：
根据37C.F.R.1.821以及下面的条款，本申请包括一个或多个序列表，所述序列表以计算机可读介质(文件名：1301_0114PCT_Sequence_Listing_ST25.txt，2015年5月18日创建，并且大小为244,021字节)的形式公开，并且通过引用将所述文件以其整体并入本文文件。
本发明的背景：
技术领域：
本发明涉及三特异性结合分子，其是具备三个结合结构域的多链多肽分子，因此能够介导与三个表位的配位结合。可选择结合结构域，使得三特异性结合分子能够结合任何三个不同表位。这样的表位可以是相同抗原的表位，或两个或三个不同抗原的表位。在优选的实施方式中，一个这样的表位能够结合CD3，第二个这样的表位能够结合CD8，和第三个这样的表位能够结合疾病相关的抗原的表位。本发明也提供新的ROR1结合抗体，以及其衍生物和这样的组合物的用途。
相关技术描述：
I.哺乳动物免疫系统
哺乳动物免疫系统用作抵抗各种病况，包括例如损伤、感染和瘤形成的防御。人和其他哺乳动物发展对病原体、外源物质和癌症抗原的免疫应答的效率取决于两个特征：对抗原识别的免疫应答的精巧的特异性，和当用相同的抗原再激活时允许更快和更强力应答的免疫记忆(Portolés,P.等(2009)“The TCR/CD3 Complex:Opening the Gate toSuccessful Vaccination,”Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300；Guy,C.S.等(2009)“Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex,”Immunol Rev.232(1):7-21)。
哺乳动物免疫系统由下述两个分开但是相互关联的系统介导：细胞和体液免疫系统。一般而言，体液系统由可溶性产物(抗体或免疫球蛋白)介导，所述可溶性产物具有结合并中和被系统识别为身体外源的产物的能力。相反，细胞免疫系统涉及动员某些细胞，称为“T细胞”，其具有各种治疗作用。T细胞是淋巴细胞，其源自胸腺，并且在组织、淋巴系统和循环系统之间循环。响应外源结构(抗原)的存在和识别，T细胞被“激活”，以启动免疫应答。在许多情况下，这些外源抗原由于瘤形成或感染而在宿主细胞上表达。尽管T细胞它们本身不分泌抗体，但是它们对于通过第二类淋巴细胞——B细胞(其源自骨髓)的抗体分泌通常是必要的。关键地，T细胞展示非凡的免疫特异性，以便能够区分一个抗原与另一个抗原)。两种类型的T细胞——“T辅助细胞”和“细胞毒性T细胞”尤其相关。
T辅助细胞特征在于它们的糖蛋白，CD4的表达(即，它们是“CD4+”)。CD4+ T细胞是大部分哺乳动物免疫和自体免疫应答的主要组织者(Dong,C.等(2003)“ImmuneRegulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48)。已经发现CD4+ T细胞的激活通过排列于抗原呈递细胞(比如B细胞、巨噬细胞或树突细胞)的表面上的抗原：II类主要组织相容性(MHC II)分子复合物和排列于初始CD4+ T细胞的表面上的两个分子——T细胞受体(“TCR”)和CD3细胞表面受体配体的复合物之间的共刺激相互作用而被介导。激活的T辅助细胞能够增殖成Th1细胞，其能够介导对靶细胞的炎症反应。
细胞毒性T细胞特征在于它们对CD8的表达(即，它们是“CD8+”以及CD3+)。已经发现CD8+ T细胞的激活通过排列于靶细胞的表面上的抗原：I类主要组织相容性(MHC I)分子复合物和排列于CD8+ T细胞表面上的CD8和T细胞受体复合物之间的共刺激相互作用而被介导。与仅仅由某些免疫系统细胞表达的MHC II分子不同，MHC I分子被非常广泛地表达。因此，细胞毒性T细胞能够结合各种细胞类型。激活的细胞毒性T细胞通过它们释放细胞毒素穿孔蛋白、粒酶和粒溶素(granulysin)而介导细胞杀伤。通过穿孔蛋白的作用，粒酶进入靶细胞的细胞质，并且它们的丝氨酸蛋白酶功能触发胱天蛋白酶级联，其是最终导致靶细胞的细胞凋亡(程序性细胞死亡)的一系列半胱氨酸蛋白酶。
T细胞受体(“TCR”)是α和β链的共价连接的异源二聚体(“TCRαβ”)。这些链是长度为259(α)和296(β)个氨基酸的I类膜多肽。CD3分子是T细胞共受体，由五条不同的多肽链组成(CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链和两条ζ链)。独立的多肽链缔合，以形成三个二聚体的复合物(εγ、εδ、ζζ)(Wucherpfennig,K.W.等(2010)“Structural Biology Of The T CellReceptor:Insights into Receptor Assembly,Ligand Recognition,And Initiation ofSignaling,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2(4):a005140；1-14页；Chetty,R.等(1994)“CD3:Structure,Function And The Role Of Immunostaining In ClinicalPractice,”J.Pathol.173:303-307；Guy,C.S.等(2009)“Organization of ProximalSignal Initiation at the TCR:CD3 Complex,”Immunol Rev.232(1):7-21；Call,M.E.等(2007)“Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating ImmuneReceptors,”Nat.Rev.Immunol.7:841-850；Weiss,A.(1993)“T Cell Antigen ReceptorSignal Transduction:A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-TyrosineKinases,”Cell 73:209-212)。CD3复合物与TCR结合以便在T淋巴细胞中产生激活信号。在缺少CD3的情况下，TCR不能适当组装，并被降解(Thomas,S.等(2010)“MolecularImmunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer,”Immunology129(2):170–177)。发现CD3结合所有成熟T细胞的膜，并且事实上不结合其他细胞类型的膜(见，Janeway,C.A.等(2005)在以下中：Immunobiology:THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTHAND DISEASE,”第6版，Garland Science Publishing,NY,214-216页；Sun,Z.J.等(2001)“Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly RevealedBy The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γHeterodimer,”Cell 105(7):913-923；Kuhns,M.S.等(2006)“Deconstructing The FormAnd Function Of The TCR/CD3Complex,”Immunity.2006年2月；24(2):133-139)。
TCR和CD3复合物以及CD3ζ链ζ链(也称为T细胞受体T3ζ链或CD247)包括TCR复合物(van der Merwe,P.A.等(2010年12月3日电子公开)“Mechanisms For T Cell ReceptorTriggering,”Nat.Rev.Immunol.11:47-55；Wucherpfennig,K.W.等(2010)“StructuralBiology Of The T Cell Receptor:Insights into Receptor Assembly,LigandRecognition,And Initiation of Signaling,”Cold Spring Harb.Perspect.Biol.2:a005140)。复合物非常重要，因为其包含大量的(十个)免疫受体酪氨酸基的激活基序(ITAMs)。
两种相互作用对于T细胞激活是必要的(Viglietta,V.等(2007)“Modulating Co-Stimulation,”Neurotherapeutics 4:666-675；Korman,A.J.等(2007)“CheckpointBlockade in Cancer Immunotherapy,”Adv.Immunol.90:297-339)。在第一相互作用中，细胞必须展示结合细胞主要组织相容性复合物的相关靶抗原，从而其可结合初始T淋巴细胞的T细胞受体(“TCR”)。在第二相互作用中，细胞的配体必须结合T淋巴细胞的共受体(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48；Lindley,P.S.等(2009)“The Clinical Utility OfInhibiting CD28-Mediated Costimulation,”Immunol.Rev.229:307-321)。经历两种刺激信号的T细胞然后能够响应细胞因子(比如白介素-2和白介素-12)。在TCR结合期间缺少两种共刺激信号的情况下，T细胞进入功能上无应答的状态，称为克隆无能(Khawli,L.A.等(2008)“Cytokine,Chemokine,and Co-Stimulatory Fusion Proteins for theImmunotherapy of Solid Tumors,”Exper.Pharmacol.181:291-328)。在病理学状态下，T细胞是各种器官特异性自身免疫性疾病，比如I型糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化症的关键参与者(Dong,C.等(2003)“Immune Regulation by Novel CostimulatoryMolecules,”Immunolog.Res.28(1):39-48)。E
认为激活T细胞需要两种信号以便它们实现适应性免疫应答提供了这样一种机制：避免对在系统中其可能被T细胞识别的位置可能存在于抗原呈递细胞上的自体抗原的应答。在T细胞与细胞的接触导致产生两种必要的信号中的仅仅一种信号的情况下，T细胞不被激活并且不发生适应性免疫应答。
II.抗体和其他表位结合分子
A.抗体
“抗体”是免疫球蛋白分子，其能够通过位于免疫球蛋白分子的可变结构域中的至少一个抗原识别位点特异性结合靶，比如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。如本文所使用，该术语不仅仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且也包括其突变体、天然存在的变体、包括具有需要的特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化的抗体、和嵌合抗体、以及包括具有必要特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰结构。遍及本申请，抗体轻链和重链的氨基酸残基的编号是根据EU索引，如在以下中：Kabat等(1992)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，国立卫生研究院公开号91-3242。如本文所使用，“抗体的抗原结合片段”是抗体的具有至少一个抗原识别位点的部分。如本文所使用，该术语包括片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2Fv)和单链分子(例如，scFv)。
天然抗体(比如IgG抗体)由与两条重链复合的两条轻链组成。每条轻链包含可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。每条重链包含可变结构域(VH)、三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和位于CH1和CH2结构域之间的铰链结构域。因此，天然存在的免疫球蛋白(例如，IgG)的基础结构单元是具有两条轻链和两条重链的四聚体，通常表示为约150,000Da的糖蛋白。每条链的氨基-末端(“N”)部分包括具有约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每条链的羧基末端(“C”)部分限定恒定区，其中轻链具有单个恒定结构域和重链通常具有三个恒定结构域和铰链区。因此，IgG分子的轻链结构是n-VL-CL-c和IgG重链的结构是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c(其中H是铰链区，并且n和c分别表示多肽的N-末端和C-末端)。
完整的、未修饰的抗体(例如，IgG抗体)结合抗原的表位的能力取决于免疫球蛋白轻链和重链上是否存在可变结构域(即，分别为VL结构域和VH结构域)。抗体轻链和抗体重链的相互作用，尤其地，其VL和VH结构域的相互作用形成抗体的表位结合位点中的一个。IgG分子的可变区由互补决定区(CDR)和非CDR区段组成，所述互补决定区(CDR)包含接触表位的残基和所述非CDR区段被称为框架区段(FR)，其一般维持结构和确定CDR环的定位，以便允许这样的接触(尽管某些框架残基也可接触抗原)。因此，VL和VH结构域具有结构n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c。作为(或可用作)抗体轻链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRL1结构域、CDRL2结构域和CDRL3结构域。类似地，作为(或可用作)抗体重链的第一、第二和第三CDR的多肽在本文分别命名为CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域。因此，术语CDRL1结构域、CDRL2结构域、CDRL3结构域、CDRH1结构域、CDRH2结构域和CDRH3结构域指多肽，其在掺入到蛋白质中时，使得该蛋白质能够结合特异性表位，无论这样的蛋白质是否是具有轻链和重链的抗体或双抗体或单链结合分子(例如，scFv，BiTe等)，或是另一类型的蛋白质。与这样的抗体相反，scFv构建物包括包含在单个多肽链中的抗体的VL和VH结构域，其中结构域被足够长的灵活接头分开，允许两个结构域自组装成功能性表位结合位点。在由于不足长度的接头(小于约12个氨基酸残基)而导致VL和VH结构域的自组装是不可能的情况下，两个scFv构建物可彼此相互作用形成二价分子，其中一条链的VL缔合另一条链的VH(在以下中综述：Marvin等(2005)“Recombinant Approaches ToIgG-Like Bispecific Antibodies,”Acta Pharmacol.Sin.26:649-658)。
除了它们在诊断中的已知用途，已经显示抗体可用作治疗剂。过去数十年已经看到对抗体治疗潜能的兴趣的复兴，并且抗体已经成为一类重要的源自生物技术的药物(Chan,C.E.等(2009)“The Use Of Antibodies In The Treatment Of InfectiousDiseases,”Singapore Med.J.50(7):663-666)。接近200种基于抗体的药物已经被批准使用或正在开发。
术语“单克隆抗体”指同质性(homogenous)抗体群体，其中单克隆抗体包括参与抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个表位(或抗原位点)。术语“单克隆抗体”不仅仅包括完整的单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且也包括其片段(比如Fab、Fab’、F(ab’)2Fv)、单链(scFv)，其突变体、包括抗体部分的融合蛋白、人源化的单克隆抗体、嵌合单克隆抗体，和包括具有必要特异性和结合抗原能力的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰结构。就抗体来源或制备其的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)而言不期望受到限制。该术语包括完整的免疫球蛋白以及上面根据定义“抗体”描述的片段。制备单克隆抗体的方法是本领域已知的。可采用的一种方法是Kohler,G.等的方法(1975)“Continuous Cultures OfFused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity,”Nature 256:495-497或其改良方法。典型地，单克隆抗体在小鼠、大鼠或兔子中开发。通过用包含期望的表位的免疫原量的细胞、细胞提取物或蛋白制品免疫动物而产生抗体。免疫原可以是，但不限于原代细胞、培养的细胞系、癌细胞、蛋白质、肽、核酸或组织。用于免疫的细胞可培养一段时间(例如，至少24小时)，然后它们用作免疫原。细胞可通过它们本身或结合非变性佐剂比如Ribi用作免疫原(见，例如，Jennings,V.M.(1995)“Review of Selected Adjuvants Usedin Antibody Production,”ILAR J.37(3):119-125)。
一般而言，当用作免疫原时，细胞应保持完整和优选地能存活。相比于破裂的细胞，完整的细胞可允许抗原被免疫的动物更好地检测。变性或烈性佐剂，例如，弗氏佐剂的使用，可使细胞破裂，因此，其应用受阻。免疫原可以周期性间隔被多次施用，诸如两周一次或一周一次，或者可以维持在动物(例如，在组织重组体中)中的生存力这样的方式被施用。可选地，对于期望的致病表位是免疫特异性的现有单克隆抗体和任意其他等价抗体可被测序并通过本领域中已知的任意手段重组产生。在一个实施方式中，对这样的抗体测序，然后将多核苷酸序列克隆至载体用于表达或增殖。编码感兴趣的抗体的序列可在宿主细胞中保持在载体中，并且，可然后扩张和冷冻宿主细胞用于将来的使用。这样的抗体的多核苷酸序列可被用于遗传操作，以产生嵌合抗体、人源化的抗体或犬源化(caninized)的抗体，或改善抗体的亲和性，或其他特征。人源化抗体的一般原理涉及保留抗体的抗原结合部分的基础序列，同时用人抗体序列交换抗体的非人剩余部分。使单克隆抗体人源化大体上有四个步骤。这些是：(1)测定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列(2)设计人源化的抗体或犬源化的抗体，即，确定在人源化或犬源化过程期间使用哪个抗体框架区(3)实际人源化或犬源化方法/技术和(4)转染和表达人源化的抗体。见，例如，美国专利号4,816,567、5,807,715、5,866,692和6,331,415。
这样的抗体的表位结合结构域可包括融合在恒定结构域上的完整可变结构域或仅仅包括移植在可变结构域中适当的框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型的或被一个或多个氨基酸取代而修饰。这消除了恒定区在人个体中作为免疫原，但是仍存在对外源可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等(1989)“Mouse/HumanChimeric Monoclonal Antibody In Man:Kinetics And Immune Response,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)86:4220-4224)。另一方法不仅仅关注提供源自人的恒定区，而且也修饰可变区以便重塑它们尽可能接近人形式。已知重链和轻链二者的可变区包含三个互补决定区(CDR)，其响应所讨论的抗原而改变并且决定结合能力，其由四个框架区(FR)侧接，所述框架区在给定的物种中相对保守并且推测为CDR提供支架材料(scaffolding)。当就具体的抗原制备非人抗体时，可变区可通过将源自非人抗体的CDR移植在待修饰的人抗体中存在的FR上被“重塑”或”人源化”。下述文献已经报道了该方法应用于各种抗体：Sato,K.等(1993)Cancer Res53:851-856.Riechmann,L.等(1988)“Reshaping HumanAntibodies for Therapy,”Nature 332:323-327；Verhoeyen,M.等(1988)“ReshapingHuman Antibodies:Grafting An Antilysozyme Activity,”Science 239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等(1991)“Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody ByCDR-Grafting:The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation,”Protein Engineering 4:773-3783；Maeda,H.等(1991)“Construction Of ReshapedHuman Antibodies With HIV-Neutralizing Activity,”Human Antibodies Hybridoma2:124-134；Gorman,S.D.等(1991)“Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)88:4181-4185；Tempest,P.R.等(1991)“Reshaping A HumanMonoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection invivo,”Bio/Technology 9:266-271；Co,M.S.等(1991)“Humanized Antibodies ForAntiviral Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)88:2869-2873；Carter,P.等(1992)“Humanization Of An Anti-p 185her2 Antibody For Human Cancer Therapy,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)89:4285-4289；和Co,M.S.等(1992)“Chimeric AndHumanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen,”J.Immunol.148:1149-1154。在一些实施方式中，人源化的抗体保留所有的CDR序列(例如，包含来自小鼠抗体的所有六个CDR的人源化的小鼠抗体)。在其他实施方式中，人源化的抗体具有序列相对于原始抗体不同的一个或多个CDR(一、二、三、四、五或六个)。
B.双特异性抗体、多特异性双抗体和DARTTM双抗体
天然抗体仅仅能够结合一个表位种类(即，它们是“单特异性的”)，尽管它们可能够结合该种类的多个拷贝(即，它们可展示二效价或多效价)。已经开发了各种重组双特异性抗体形式(见，例如，PCT公开号WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO2007/146968、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)，其大部分使用接头肽，以将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)融合至抗体核心的或其中的进一步结合的蛋白(例如，scFv，VL VH等)，或融合多个抗体部分或将(例如两个Fab片段或scFv)融合至异源二聚化-促进结构域比如CH2-CH3结构域或可选的多肽(WO 2005/070966、WO2006/107786A WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，这样的方法涉及折中和权衡。例如，PCT公开号WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公开了接头的使用可在治疗情形中引起问题，并且教导了三特异性抗体，其中CL和CH1结构域由它们各自的天然位置被交换以及VL和VH结构域已经被多样化(WO 2008/027236、WO 2010/108127)，以允许它们结合多于一个抗原。因此，这些文件中公开的分子用结合特异性换取结合另外抗原种类的能力。PCT公开号WO 2013/163427和WO 2013/119903公开了修饰CH2结构域，以包含包括结合结构域的融合蛋白加合物。文件叙述了CH2结构域可能在介导效应子功能中仅起到最小的作用。PCT公开号WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公开了重组抗体，其Fc结构域已经用另外的VL和VH结构域取代，以便形成三价结合分子。PCT公开号WO2003/025018和WO2003012069公开了重组双抗体，其单条链包含scFv结构域。PCT公开号WO2013/006544公开多价Fab分子，其作为单条多肽链被合成并且然后进行蛋白酶解以产生异源二聚结构。因此，这些文件中公开的分子用所有或一些介导效应子功能的能力换取结合另外抗原种类的能力。PCT公开号WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO2012/156430、WO 2011/086091、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO1991/003493公开了添加另外的结合结构域或官能团至抗体或抗体部分(例如，添加双抗体至抗体的轻链，或添加另外的VL和VH结构域至抗体的轻链和重链，或添加异源融合蛋白或彼此连接的多个Fab结构域)。因此，这些文件中公开的分子用天然抗体结构换取结合另外的抗原种类的能力。
现有技术已经另外叙述了产生双抗体的能力，所述双抗体与这样的天然抗体的不同之处在于能够结合两个或更多个不同表位种类(即，除了双效价或多效价之外还展示双特异性或多特异性)(见，例如，Holliger等(1993)“‘Diabodies’:Small Bivalent AndBispecific Antibody Fragments,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)90:6444-6448；US 2004/0058400(Hollinger等)；US 2004/0220388(Mertens等)；Alt等(1999)FEBS Lett.454(1-2):90-94；Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific AntibodyTo Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like GrowthFactor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672；WO 02/02781(Mertens等)；Olafsen,T.等(2004)“Covalent Disulfide-LinkedAnti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For TumorTargeting Applications,”Protein Eng Des Sel.17(1):21-27；Wu,A.等(2001)“Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20Single-chain Fv-Fv Fusion Protein IsMediated Through Variable Domain Exchange,”Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”Abstract 3P-683,J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Baeuerle,P.A.等(2009)“Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For CancerTherapy,”Cancer Res.69(12):4941-4944)。
双抗体的设计是基于单链可变结构域片段(scFv)的结构。这样的分子通过经短连接肽彼此连接轻链和/或重链可变结构域而制备。Bird等(1988)(“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)描述了连接肽的例子，其在一个可变结构域的羧基末端和另一可变结构域的氨基末端之间桥跨约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的接头(Bird等(1988)“Single-Chain Antigen-Binding Proteins,”Science 242:423-426)。接头可进而被修饰用于另外的功能，比如药物的附着或附着至固体载体。可重经组或经合成产生单链变体。对于合成产生scFv，可使用自动合成仪。对于重组产生scFv，包含编码scFv的多核苷酸的适当质粒可被引入适当的宿主细胞——真核细胞比如酵母细胞，植物细胞，昆虫细胞或哺乳细胞，或原核细胞比如大肠埃希氏菌(E.coli)大肠埃希氏菌。编码感兴趣scFv的多核苷酸可通过常规的操作比如多核苷酸的连接而制备。所得scFv可使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。
美国专利号7,585,952和美国专利公开号2010-0173978涉及对ErbB2免疫特异性的scFv分子。已经描述了双特异性T细胞连接子(engager)(“BiTEs”)，其是一类scFv分子(WO 05/061547；Baeuerle,P等(2008)“BiTE:A New Class Of Antibodies That RecruitT Cells,”Drugs of the Future 33:137-147；Bargou,等2008)“Tumor Regression inCancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody,”Science 321:974-977)。这样的分子由具有两个抗原结合结构域的单个多肽链分子组成，其中一个抗原结合结构域免疫特异性结合CD3表位和其第二个免疫特异性结合靶细胞表面上存在的抗原。
提供非单特异性双抗体提供了明显的优势：共连接和共定位表达不同表位的细胞的能力。二价双抗体因此具有宽的应用范围，包括治疗和免疫诊断。二价允许在各种应用中在设计和工程化双抗体时更大的灵活性，提供对多聚体抗原的增强的抗体亲抗原性，交联不同的抗原，和依赖于两个靶抗原的存在引导靶向特定的细胞类型。由于它们增加的效价，低解离速率和从循环的快速清除(对于～50kDa或更低的小尺寸双抗体)，本领域已知的双抗体分子也已经显示在肿瘤成像领域的具体用途(Fitzgerald等(1997)“Improved TumourTargeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,”Protein Eng.10:1221)。尤其重要的是不同细胞的共连接，例如，细胞毒性T细胞与肿瘤细胞的交联(Staerz等(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By TCells,”Nature 314:628-631，和Holliger等(1996)“Specific Killing Of LymphomaCells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305)。
双抗体表位结合结构域可以针对任何免疫效应细胞比如CD3、CD16、CD32、CD64等的表面决定簇，所述免疫效应细胞在T淋巴细胞、天然杀伤细胞(NK)细胞或其他单核细胞上表达。在许多研究中，也发现结合效应细胞决定簇例如Fcγ受体(FcγR)的双抗体激活效应细胞(Holliger等(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-CellsMediated By A Bispecific Diabody,”Protein Eng.9:299-305；Holliger等(1999)“Carcinoembryonic Antigen(CEA)-Specific T-cell Activation In Colon CarcinomaInduced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEABispecific Fusion Proteins,”Cancer Res.59:2909-2916；WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO 2012/162068)。通常，通过经Fc-FcγR相互作用使结合抗原的抗体结合效应细胞激发效应细胞激活；因此，在这方面，双抗体分子可展示Ig样功能，这不依赖于它们是否包括Fc结构域(例如，如在本领域已知的或本文列举的任何效应功能试验中所分析的(例如，ADCC试验))。通过交联肿瘤和效应细胞，双抗体不仅仅使效应细胞接近肿瘤细胞而且导致有效的肿瘤杀伤(见例如，Cao等(2003)“BispecificAntibody Conjugates In Therapeutics,”Adv.Drug.Deliv.Rev.55:171-197)。
例如，美国专利号6,171,586涉及如下产生双特异性抗体：通过蛋白酶解切割两个抗体，以获得它们的F(ab’)2片段，在用于防止分子间二硫键形成的条件下还原这样的片段，并且然后混合片段，以产生双特异性抗体)。美国专利号6,551,592、6,994,853和8,277,806和PCT公开号WO 2012/156430、WO 2002/020039、WO 2000/018806和WO 1998/003670涉及产生三特异性抗体，其能够同时结合肿瘤细胞上的T细胞和其他抗原，并且，经双特异性抗体的Fc部分结合具有这样的受体的细胞的Fc受体。PCT公开号WO 2000/018806、WO 1998/003670和WO 2006/072152涉及产生能够同时结合T细胞和其他抗原的三特异性抗体。美国专利公开号2008-0057054公开了双特异性缀合物，其对于针对淀粉状蛋白β寡聚物的结合元件和针对跨膜蛋白质端脑蛋白(telencephalin)的结合元件是特异性的。美国专利公开号2010-0291112涉及双特异性和三特异性单链Fv分子，其特异性结合一个(或两个)肿瘤抗原和效应细胞抗原(比如CD3、CD16、CD32、CD64等)。
PCT公开号WO 1999/042597和WO 1998/006749公开了抗体衍生物，其包括人主要组织相容性复合物结合结构域，有或没有结合的MHC结合肽。PCT公开号WO 02/072141涉及多特异性结合分子，其结合速率(on-rate)(它们结合靶分子的速率)和解离速率(off-rate)(它们释放靶分子的速率)不同，以便相比它们与另一这样的靶分子的结合优选结合一个靶。三特异性分子，例如这样的分子，其具有作为抗CD3或抗CD28抗体的单价第一部分和第二部分，所述第二部分包括发挥二价免疫功能的部分，其免疫特异性结合靶患病细胞或免疫细胞上的一个或多个靶配体。
美国专利号7,695,936和专利公开2007/0196363涉及由两个抗体的重链形成的双特异性抗体，其中一个抗体具有工程化至其重链的突出(protuberance)和其第二个具有工程化至其重链的互补的腔。这样互补的“杵(knob)”和“臼(hole)”的存在教导相对于包含相同抗体的两个重链的单特异性同源抗体，优选形成双特异性异源抗体(具有每个这样的抗体的一个重链)。提出了各种双特异性异源抗体，包括对CD3和肿瘤细胞抗原免疫特异性的那些。也提出了各种三特异性异源抗体，包括对下述免疫特异性的一些三特异性异源抗体：CD3、CD8和CD37(主要在参与T细胞增殖调节的B细胞上表达的跨膜蛋白质(Robak,T.等(2014)“Anti-CD37Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia,”ExpertOpin.Biol.Ther.14(5):651-661)，但是，没有提供它们产生的机制也没有公开它们的结构。
PCT公开WO2012-162561涉及双特异性、四价结合分子，其包括两个多肽，其每个多肽包括两个双抗体结构，由间插CH2-CH3结构域分开。该文件也涉及由四条多肽链组成的四价结合分子，其中多肽链中的两个包含两个抗原的轻链可变结构域和重链可变结构域，和其中其他两个多肽链包含抗原的互补的重链可变结构域和轻链可变结构域和末端CH2-CH3结构域。通过它们各自CH2-CH3结构域的缔合形成双特异性、四价结合分子。在四个多肽链构建物中，”轻”链不是共价结合至重链，因此导致不稳定(见，Lu,D.等(2005)“A FullyHuman Recombinant IgG-Iike Bispecific Antibody To Both The Epidermal GrowthFactor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For EnhancedAntitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。该文件公开了第三构建物，其中链被改变，以提供这样的共价键合，但是代价是消除了它们的双特异性(即，分子是单特异性的)。公开了对CD2、CD3、CD4、CD8、CD161、趋化因子受体、CD95、CCR5等具有特异性的分子。未公开能够结合CD3和CD8二者的双特异性分子。
但是，上述优势需要显著的成本。形成这样的非单特异性双抗体需要成功组装两个或更多个有区别的和不同多肽(即，这样的形成需要通过异源二聚化不同的多肽链种类形成双抗体)。该事实与单特异性的双抗体相反，其通过相同多肽链的同二聚化形成。因为必须提供至少两个不同的多肽(即，两个多肽种类)以便形成非单特异性双抗体，并且因为这样的多肽的同二聚化导致无活性的分子(Takemura,S.等(2000)“Construction Of ADiabody(Small Recombinant Bispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)，产生这样的多肽必须以防止相同种类的多肽之间的共价结合的方式完成(Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small RecombinantBispecific Antibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588)。所以现有技术教导了非共价缔合这样的多肽(见，例如，Olafsen等(2004)“CovalentDisulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation AndRadiolabeling For Tumor Targeting Applications,”Prot.Engr.Des.Sel.17:21-27；Asano等(2004)“A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its FunctionalEnhancement By Fusion Of Human Fc Domain,”摘要3P-683，J.Biochem.76(8):992；Takemura,S.等(2000)“Construction Of A Diabody(Small Recombinant BispecificAntibody)Using A Refolding System,”Protein Eng.13(8):583-588；Lu,D.等(2005)“AFully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The EpidermalGrowth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor ForEnhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
但是，现有技术已经认识到由非共价缔合的多肽组成的双特异性双抗体不稳定并且容易解离成非功能性单体(见，例如，Lu,D.等(2005)“A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And TheInsulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity,”J.Biol.Chem.280(20):19665-19672)。
面对该挑战，现有技术已经成功开发了稳定、共价结合的异源二聚非单特异性双抗体，称为DARTsTM(见，例如，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538；和Moore,P.A.等(2011)“ApplicationOf Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-CellKilling Of B-Cell Lymphoma,”Blood117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma ReceptorIIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；Johnson,S.等(2010)“Effector Cell RecruitmentWith Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent TumorCytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3):436-449)。这样的双抗体包括两个或更多个共价复合的多肽并且涉及将一个或多个半胱氨酸残基工程化至每个采用的多肽种类，这允许形成二硫键并且从而共价键合两个多肽链。例如，添加半胱氨酸残基至这样的构建物的C-末端已经显示允许多肽链之间的二硫键合，稳定所得异源二聚体而不干扰二价分子的结合特征。
有许多DARTTM实施方式。最简单DARTTM实施方式的两个多肽的每一个包括三个结构域(图1A)。第一多肽包括：(i)第一结构域，其包括第一免疫球蛋白的轻链可变结构域的结合区(VL1)，(ii)第二结构域，其包括第二免疫球蛋白的重链可变结构域的结合区(VH2)，和(iii)第三结构域，其包含半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)和异源二聚化-促进结构域，其用于促进与第二多肽链的异源二聚化(图1B)。第三结构域的半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)用于促进双抗体的第一多肽链与第二多肽链的共价键合。第二多肽包含：(i)互补的第一结构域(包含VL2的结构域)，(ii)互补的第二结构域(包含VH1的结构域)和(iii)第三结构域，其包含半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)和，任选地，互补的异源二聚化-促进结构域，其与第一多肽链的异源二聚化-促进结构域复合，以便促进与第一多肽链的异源二聚化。第二多肽链的第三结构域的半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)用于促进双抗体的第二多肽链与第一多肽链的共价键合。这样的分子是稳定、有效力的并且能够同时结合两个或更多个抗原。它们能够促进重定向T细胞介导的表达靶抗原的细胞的杀伤。
在一个实施方式中，第一和第二多肽的第三结构域每个包含半胱氨酸残基，其用于将多肽经二硫键结合在一起。多肽中的一个或两个的第三结构域可另外具有CH2-CH3结构域的序列，使得双抗体多肽的复合形成Fc结构域，其能够结合细胞(比如B淋巴细胞、树突细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜伊红粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)的Fc受体(图2A-2B)。
已经描述了这样的分子的许多变型(见，例如，美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP2158221和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538)。这些具有Fc的DART可包括三条多肽链(例如，图2B)。这样的双抗体的第一多肽链包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域，(ii)包含VH2的结构域和(iii)包含半胱氨酸残基的结构域(或包含半胱氨酸的结构域)和异源二聚化-促进结构域和(iv)半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域和CH2-CH3结构域。这样的DARTTM的第二多肽链包含：(i)包含VL2的结构域，(ii)包含VH1的结构域和(iii)包含半胱氨酸残基的结构域(或包含半胱氨酸的结构域)和异源二聚化-促进结构域，其促进与第一多肽链的异源二聚化。第二多肽链的第三结构域的半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)用于促进双抗体的第二多肽链与第一多肽链的共价结合。这样的DARTTM的第三多肽包括半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域)和CH2-CH3结构域。因此，这样的DARTTM的第一和第二多肽链缔合在一起形成能够结合表位的VL1/VH1结合位点以及能够结合第二表位的VL2/VH2结合位点。第一和第二多肽通过在它们各自第三结构域中涉及半胱氨酸残基的二硫键彼此结合。注意，第一和第三多肽链彼此复合形成经二硫键稳定的Fc结构域。这样的双抗体具有增强的效力。这样具有Fc的DARTTM可具有两个取向之一(表1)：
已经描述了甚至更复杂的DARTTM双抗体，称为Ig-DARTTM(图3A-3B)和Fc-DARTTM双抗体(图3C)(WO 2012/018687)。Fc-DARTsTM具有四条多肽链。这样的双抗体的第一和第三多肽链包含三个结构域：(i)包含VL1的结构域，(ii)包含VH2的结构域和(iii)包含CH2-CH3序列的结构域。Fc-DARTTM的第二和第四多肽包含：(i)包含VL2的结构域，(ii)包含VH1的结构域和(iii)促进与Fc-DARTTM的第一多肽链的异源二聚化和共价结合的结构域。第三和第四，以及第一和第二多肽链可以相同或不同，以便允许是单特异性的、双特异性的或四特异性的四价结合。这样更复杂的DARTTM分子也具有包含半胱氨酸的结构域，其用于形成共价结合的复合物。Fc-DARTTM双抗体包含CH1和CL结构域。
可选的构建物是本领域已知的，用于其中期望四价分子但是不需要Fc的应用，包括但不限于四价串联抗体，也称为“TandAbs”(见，例如美国专利公开号2005-0079170、2007-0031436、2010-0099853、2011-020667 2013-0189263；欧洲专利公开号EP 1078004、EP 2371866、EP 2361936和EP 1293514；PCT公开号WO 1999/057150、WO 2003/025018和WO2013/013700)，其通过两个相同链的同二聚化形成，每条链各具有VH1、VL2、VH2和VL2结构域。
III.重定向杀伤
如上所讨论，CD8、MHC I和T细胞受体之间的相互作用导致细胞毒性T细胞的激活和它们杀伤附近细胞的能力。结合CD3和肿瘤抗原的双特异性双抗体可用于共定位细胞毒性CD8+ T细胞至肿瘤细胞，实现这样的细胞的“重定向杀伤”(WO 2010/080538、WO 2012/018687、WO/2012/162068、US 2010/0174053、US 2013/0295121)。
但是，通过将CD3+ T细胞共定位至肿瘤或病原体细胞的基因座治疗癌症或传染性疾病的尝试还未完全成功。靶向CD3的抗体结合CD3+CD8+细胞毒性T细胞和结合CD3+CD4+ T辅助细胞，导致两种这样的细胞的激活。但是，通过激活CD3+CD4+ T辅助细胞产生的细胞因子，造成严重的副作用，例如，威胁生命的细胞因子风暴(Ferran,C.等(1990)“Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3Monoclonal Antibody:FurtherEvidence For Transient In Vivo T Cell Activation,”Eur.J.Immunol.20:509-515)。另外，这样的抗CD3抗体结合其他细胞类型，包括在激活时表达细胞因子的CD3+CD4–CD8–双阴性T细胞等(Johansson,Martina等(2003)“A Unique Population of ExtrathymicallyDerivedαβTCR+CD4–CD8–T Cells with Regulatory Functions Dominates the MouseFemale Genital Tract,”J.Immunol.170:1659-1666；Blank,C.等(2003)“Absence ofProgrammed Death Receptor 1Alters Thymic Development and Enhances Generationof CD4/CD8 Double-Negative TCR-Transgenic T Cells,”J.Immunol.171:4574-4581；McIntyre,M.S.F.等(2011)“Consequences Of Double Negative Regulatory T Cell AndAntigen Presenting Cell Interaction On Immune Response Suppression,”Intl.Immunopharmacol.11:597-603)，并且所述细胞类型抑制CD3+CD8+ T细胞介导的细胞毒性(Hillhouse,E.E.(2013)“A Comprehensive Review Of The Phenotype AndFunction Of Antigen-Specific Immunoregulatory Double Negative T Cells,”J.Autoimmun.40:58-65)。
已经建议与施用靶向CD3的抗体相关的细胞因子产生可使用靶向CD8和肿瘤抗原的双特异性抗体而避免(Michalk,I.等(2014)“Characterization of a Novel Single-Chain Bispecific Antibody for Retargeting of T Cells to Tumor Cells via theTCR Co-Receptor CD8,”PLOS One 9(4):e95517，1-8页)。所以已经研究了抗CD8抗体，以确定当单独使用时，它们是否能够诱导效应子功能。Clement,M.等报道了测试的七个抗人CD8抗体中的六个不能激活CD8+ T细胞，但是这样的激活可使用非常高浓度(10-100μg/mL)的抗人CD8抗体“OKT8”实现(Clement,M.等(2011)“Anti-CD8Antibodies Can Trigger CD8+T Cell Effector Function In The Absence Of TCR Engagement And ImprovePeptide-MHCI Tetramer Staining,”J.Immunol.187(2):654-663)。对于这样的作用协同结合两个CD8分子是必要的，因为发现OKT8F(ab)’2片段能够介导该作用，而发现OKT8Fab不能够这样做。
因此，尽管这样的研究，还未充分理解致力于抗CD4或抗CD8抗体使用的细胞因子介导的毒性。研究已经揭示了在施用抗CD3抗体时看到的细胞因子毒性未通过消耗CD3+CD4+T细胞或通过缺失CD3+CD8+ T细胞而被消除。因此，CD3+CD4+ T细胞和CD3+CD8+ T细胞造成抗CD3抗体的毒性作用，和介导完全的作用需要相对较少的细胞(Finck,B.K.等(1992)“TheRole Of T-Cell Subsets In The Response To Anti-CD3 Monoclonal Antibodies,”Clin Immunol Immunopathol.1992 Dec；65(3):234-41)。
而且，靶向CD8和肿瘤抗原的双特异性抗体对于CD3+CD8+ T细胞和肿瘤细胞不是特异的，而是仅仅对CD8+细胞和肿瘤细胞是特异性的。尤其，天然杀伤细胞(NK)的CD3–CD8+亚类被这样的抗体靶向。代表大部分NK细胞的这样的细胞是细胞因子的有效产生者并且它们的激活可能产生细胞因子风暴。CD3–CD8+NK细胞是感染HIV-1的黑猩猩中的IFN-γ的主要来源(Rodriquez,A.R.等(2007)“Influence Of Interleukin-15 On CD8+ Natural KillerCells In Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Chimpanzees,”J.Gen.Virol.88:641-651)。
从而，尽管所有之前的进步，仍需要改善的组合物，其能够更强力引导身体的免疫系统攻击癌症细胞或感染病原体的细胞，尤其以更低的治疗性浓度。如下面详细描述，本发明通过提供三特异性结合分子解决了该需要，所述三特异性结合分子结合：(1)CD3的表位、(2)CD8的表位和(3)在靶细胞(尤其癌症细胞，或感染病原体的细胞)上表达的疾病相关的抗原的表位，并且介导细胞毒性T细胞与呈递疾病相关抗原的细胞的配位结合。
发明内容：
本发明涉及三特异性结合分子，其是具有三个结合结构域的多链多肽分子，因此能够介导与三个表位的配位结合。可选择结合结构域，以便三特异性结合分子能够结合任何三个不同表位。这样的表位可以是相同抗原的表位或两个或三个不同抗原的表位。本发明也提供新的ROR1结合抗体，以及其衍生物和这样的组合物的用途。
本发明尤其涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中选择三个表位，以便这样的表位中的一个或两个是免疫系统细胞，尤其是细胞毒性淋巴细胞免疫系统细胞(CTL)的表位(一个或多个)，和其中剩余的表位(一个或多个)是疾病相关的抗原的表位(一个或多个)。这样尤其优选的三特异性结合分子能够将细胞毒性淋巴细胞定位至表达疾病相关的抗原的细胞，并且从而促进杀伤表达疾病相关的抗原的细胞。疾病相关的抗原可以是癌症抗原，或可以是以病原体(例如，细菌、真菌、病毒或原生动物)感染为特征的抗原。更具体地，本发明涉及这样的三特异性结合分子，其能够介导与以下的配位结合：(1)CD3的表位、(2)CD8的表位和(3)疾病相关的抗原的表位。通过结合CD3和CD8以及结合疾病相关的抗原，这样的分子将细胞毒性T细胞共定位至呈递疾病相关的抗原的细胞，导致激活这样的T细胞和启动针对表达疾病相关的抗原的细胞的细胞毒性应答。
详细地，本发明提供了三特异性结合分子，其能够免疫特异性结合三个不同的表位，其中结合分子包括共价复合在一起的四条不同的多肽链，并且包括：
(I)抗原结合结构域I，其能够免疫特异性结合第一抗原上存在的表位I，和抗原结合结构域II，其能够免疫特异性结合第二抗原上存在的表位II，其中抗原结合结构域I和抗原结合结构域II都是双抗体型结合结构域；
(II)非双抗体型抗原结合结构域III，其能够免疫特异性结合第三抗原上存在的表位III；和
(III)Fc结构域，其通过两个CH2-CH3结构域的彼此缔合而形成。
其中第一、第二和第三抗原是相同的抗原，或独立地与抗原中的另一个相同或不同。
本发明尤其涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中表位I、表位II或表位III之一是细胞受体的表位。
本发明另外涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中表位I、表位II或表位III之一是疾病相关的抗原的表位(尤其地，其中疾病相关的抗原是癌症抗原，其排列于癌症细胞的表面，或是病原体抗原，其排列于病原体或感染病原体的细胞的表面)。
本发明另外涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中Fc结构域能够结合排列在细胞表面上的Fc受体。
本发明尤其涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中表位I、表位II或表位III之一是CD3的表位，表位I、表位II或表位III的第二个是CD8的表位，和表位I、表位II或表位III的第三个是疾病相关的抗原的表位，和其中三特异性结合分子的抗原结合结构域I、II和III介导细胞毒性T细胞和表达疾病相关抗原的细胞的配位结合。本发明尤其涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中CD3、CD8排列在T细胞的表面上和其中疾病相关的抗原排列在癌症细胞、病原体或感染病原体的细胞的表面上，和其中免疫特异性结合足够共定位CD3和CD8以及疾病相关的抗原，从而促进针对排列疾病相关的抗原的细胞激活排列CD8的T细胞。
本发明另外涉及上述三特异性结合分子的实施方式，其中非双抗体型结合结构域III包括Fab型结合结构域(VLIII/VHIII)，其能够免疫特异性结合表位III，其中分子包括：
(A)第一多肽链：
(I)其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLI)，其能够结合三个表位中的第一个；
(2)免疫球蛋白的重链可变结构域(VHII)，其能够结合三个表位中的第二个；
(3)(a)第一包含半胱氨酸的结构域；和异源二聚体-促进结构域；或
(b)包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域；
(5)第二包含半胱氨酸的结构域；和
(6)IgG的CH2和CH3结构域；
或
(II)其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)第一包含半胱氨酸的结构域；
(2)IgG的CH2和CH3结构域；
(3)免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLI)，其能够结合三个表位中的第一个；
(4)免疫球蛋白的重链可变结构域(VHII)，其能够结合三个表位中的第二个；
(5)(a)第二包含半胱氨酸的结构域；和异源二聚体-促进结构域；或
(b)包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域；
(B)第二多肽链，其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLII)，其能够结合三个表位中的第二个；
(2)免疫球蛋白的重链可变结构域(VHI)，其能够结合三个表位中的第一个；
(3)(a)第一包含半胱氨酸的结构域；和异源二聚体-促进结构域；或
(b)包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域；
其中第二多肽链的异源二聚体-促进结构域与第一多肽链的异源二聚体-促进结构域互补；
(C)第三多肽链，其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)免疫球蛋白的重链可变结构域(VHIII)，其能够结合三个表位中的第三个；和
(2)CH1结构域、包含半胱氨酸的铰链结构域和IgG的CH2-CH3结构域；
和
(D)第四多肽链，其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLIII)，其能够结合三个表位中的第三个；和
(2)包含半胱氨酸的轻链恒定结构域(CL)；
其中：
(i)VLI和VHI结构域缔合形成能够结合表位I的结构域；
(ii)VLII和VHII结构域缔合形成能够结合表位II的结构域；
(iii)VLIII和VHIII结构域缔合形成能够结合表位III的结构域；
(iv)第一多肽链的CH2-CH3结构域和第三多肽链的CH2-CH3结构域缔合形成Fc结构域；
(v)第一和第二多肽链彼此共价结合；
(vi)第一和第三多肽链彼此共价结合；和
(vii)第三和第四多肽链彼此共价结合。
本发明另外涉及上述三特异性结合分子的实施方式，其中：
(A)异源二聚体-促进结构域是E-螺旋和互补的异源二聚体-促进结构域是K-螺旋；或
(B)异源二聚体-促进结构域是K-螺旋和互补的异源二聚体-促进结构域是E-螺旋。
本发明另外涉及上述三特异性结合分子的实施方式，其中：
(A)第一和第三多肽链的CH2-CH3结构域各具有序列SEQ ID NO:6，以便由它们缔合形成的Fc结构域展示正常的FcγR介导的效应子功能；或
(B)第一和第三多肽链的CH2-CH3结构域包括相对于SEQ ID NO:6的序列的至少一个氨基酸取代，以便由它们缔合形成的Fc结构域展示改变的FcγR介导的效应子功能。
本发明另外涉及上述三特异性结合分子的实施方式，其中第一和第三多肽链的CH2-CH3结构域彼此不同并且具有选自下述的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
本发明另外涉及上述三特异性结合分子的实施方式，其中：
(A)表位I、表位II和表位III分别是CD3的表位、CD8的表位和疾病相关的抗原的表位；
(B)表位I、表位II和表位III分别是CD3的表位、疾病相关的抗原的表位和CD8的表位；
(C)表位I、表位II和表位III分别是CD8的表位、CD3的表位和疾病相关的抗原的表位；
(D)表位I、表位II和表位III分别是CD8的表位、疾病相关的抗原的表位和CD3的表位；
(E)表位I、表位II和表位III分别是疾病相关的抗原的表位、CD3的表位和CD8的表位；或
(F)表位I、表位II和表位III分别是疾病相关的抗原的表位、CD8的表位和CD3的表位。
本发明另外涉及上述三特异性结合分子的实施方式，其中：
(A)CD3的表位是由抗体OKT3、M291、YTH12.5、CD3 mAb 1或CD3 mAb 2识别的CD3表位；或
(B)CD8的表位是由抗体TRX2或OKT8识别的CD8表位。
本发明另外涉及药学组合物，其包括上述三特异性结合分子和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明另外涉及治疗癌症的方法，其包括向需要其的个体施用有效量的上述药学组合物，其中疾病相关的抗原是癌症抗原。
本发明另外涉及治疗与病原体的存在相关的疾病方法，其包括向需要其的个体施用有效量的权利要求15的药学组合物，其中疾病相关的抗原是病原体抗原。
本发明另外涉及抗ROR1抗体，或ROR1结合片段，其中抗体包括：
(A)轻链可变结构域，其包括CDRL1，其具有序列SEQ ID NO:117，CDRL2，其具有序列SEQ ID NO:118，和CDRL3，其具有序列SEQ ID NO:119；和
(B)重链可变结构域，其包括CDRH1，其具有序列SEQ ID NO:120，CDRH2，其具有序列SEQ ID NO:121，和CDRH3，其具有序列SEQ ID NO:122。
本发明另外涉及这样的抗ROR1抗体或其ROR1结合片段的实施方式，其中抗体具有轻链可变结构域，其具有序列SEQ ID NO:51。本发明另外涉及这样的抗ROR1抗体或其ROR1结合片段的实施方式，其中抗体具有重链可变结构域，其具有序列SEQ ID NO:52，或同时具有具有序列SEQ ID NO:51的轻链可变结构域和具有序列SEQ ID NO:52的重链可变结构域＝。
本发明另外涉及双抗体、BiTe或单链抗体，其包括任何这些权利要求抗ROR1抗体的ROR1结合片段。
本发明另外涉及药学组合物，其包括任何上述抗ROR1抗体或其ROR1结合片段和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。本发明另外涉及治疗癌症的方法，其包括向需要其的个体施用有效量的这样的药学组合物。
附图说明：
图1A-1B显示DARTTM双抗体的结构域的图示。图1A显示基本的DARTTM双抗体的结构域的图示。图1B提供了由两条多肽链组成的共价结合的双抗体的示意图，每条多肽链各具有识别相同表位的异源二聚体-促进结构域VL和VH结构域——使用相同的阴影显示。
图2A-2B提供了由两条多肽链组成的共价结合的双抗体的示意图，每条多肽链具有CH2和CH3结构域(图2A)或其中仅仅一条多肽链具有CH2和CH3结构域(图2B)，以便缔合的链形成Fc结构域，其包括天然存在的Fc结构域的全部或一部分。使用相同的阴影显示识别相同表位的VL和VH结构域。
图3A-3C提供了显示由两对多肽链组成的四价双抗体的示意图。所述多肽链对是不同的，因此产生双特异性分子，其对于两个表位中的每一个而言是二价的，其中一个表位是DR5的表位和另一个表位是效应细胞的表面上存在的分子的表位。每个对的一个多肽具有CH2和CH3结构域，以便缔合的链形成Fc结构域，其包括天然存在的Fc结构域的全部或一部分。使用相同的阴影显示识别相同表位的VL和VH结构域。仅仅一对表位(用相同的阴影显示)能够结合DR5。图3A显示Ig双抗体。图3B显示Ig双抗体，其包含E-螺旋和K-螺旋异源二聚体-促进结构域。图3C显示Fc-DARTTM双抗体，其包含抗体CH1和CL结构域。符号“VL1”和“VH1”分别表示结合“第一”表位的轻链可变结构域和重链可变结构域。类似地，符号“VL2”和“VH2”分别表示结合“第二”表位的轻链可变结构域和重链可变结构域。
图4A-4L提供了优选的三特异性结合分子的结构域的图示。图4A和4B分别示意性地图示了优选的三特异性结合分子的结构域，其中三特异性结合分子的非双抗体型结合结构域是Fab型结合结构域或T细胞受体结合结构域。图4C和4D分别示意性地图示了优选的具有不同的结构域取向的三特异性结合分子的结构域，其中非双抗体型结合结构域是Fab型结合结构域或T细胞受体型结合结构域。图4E-4J描绘了具有三条多肽链的分子。分子可具有铰链和CL结构域(图4E、4H)或可包含可选的接头肽(图4F、4I)。图4K-4L描绘了具有五条多肽链的类似的分子。
图5A-5D显示B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子结合A498靶细胞(图5A)和JIMT-1靶细胞(图5B)、CD5+/CD4-门控PBMC(图5C)和CD5+/CD4+门控PBMC(图5D)的能力。
图6A-6C显示了本发明的三特异性结合分子介导重定向杀伤靶细胞的能力。图6A显示了细胞裂解JIMT-1细胞的荧光素酶试验的结果。图6B显示了JIMT-1细胞的细胞毒性的LDH试验的结果。图6C显示了A498细胞的细胞毒性的LDH试验的结果。
图7A-7D显示了本发明的三特异性结合分子在用JIMT-1细胞(图7A：CD4/CD69 T细胞；图7B：CD4/CD25 T细胞；图7C：CD8/CD69 T细胞；图7D：CD8/CD25 T细胞)温育时介导T细胞激活的能力。
图8A-8D显示了本发明的三特异性结合分子在用A498细胞(图8A：CD4/CD69 T细胞；图8B：CD4/CD25 T细胞；图8C：CD8/CD69 T细胞；图8D：CD8/CD25 T细胞)温育时介导T细胞激活的能力。
图9A-9B显示人PMBC的CD5+CD4+门控的(图9A)或CD5+CD4–门控的(图9B)细胞群，其随着增加浓度的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子或B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子而变化。B7-H3 X CD3 DARTTM(有和没有Fc结构域)用作对照。
图10A-10C显示了不同的CD8结合结构域对B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8三特异性结合分子的细胞毒性的作用。
图11A-11C显示了通过选择针对CD3结合结构域的位点A、位点B或位点C调节本发明的三特异性结合分子结合的能力。采用的三特异性结合分子能够免疫特异性结合疾病相关的抗原，B7-H3。使用荧光素酶试验测量细胞毒性。
图12A-12C使用LDH试验表明了位置选择(位点A、位点B或位点C)对由本发明的三特异性结合分子介导的细胞毒性的作用。
图13A-13E使用B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子、CD3 mAb2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特异性结合分子和B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特异性结合分子显示了位置变化对细胞毒性的作用。具有Fc结构域的B7-H3 X CD3 DARTTM用作对照。
图14A-14B，在位点C布置CD3结合结构域，大大降低了与CD5+CD4+细胞(图14A)和CD5+CD4–细胞(图14B)二者的结合。
图15A-15B显示人PMBC的CD5+CD4+门控的(图15A)或CD5+CD4–门控的(图15B)细胞群，其随着增加浓度的5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子或5T4 mAb2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子而变化。5T4 X CD3 DARTTM(有和没有Fc结构域)用作对照。
图16A-16C显示了位置变化对细胞毒性的观察作用不取决于采用的CD8结合结构域。
图17A-17C显示了本发明的三特异性结合分子介导重定向杀伤表达ROR1的靶细胞的能力。
图18A-18C显示了HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8mAb 1三特异性结合分子结合可溶性、固定的gp140蛋白质(图18A)、人CD3(图18B)和gp140蛋白质和人CD3(图18C)二者的能力。
图19A-19C显示了HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8mAb 1三特异性结合分子，与对照三特异性结合分子相比(图19C)，结合表达HIV env的HEK293/D375细胞的能力。
图20A-20B显示了HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8mAb 1三特异性结合分子结合以展示对人PBMC的CD5+/CD5–细胞群体的特异性结合的能力。
图21A-21F显示了由HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1或HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子在存在或没有四环素的情况下(图21A-21B；图21C-21D)对Jurkat细胞介导的细胞毒性活性。图21E-21F显示了对照抗RSV抗体(帕利珠单抗(Palivizumab)；RSV mAb 1)三特异性结合分子的细胞毒性活性。
图22A-22B显示了在用纯化的全(pan)T细胞和HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1或HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子温育之后1天和2天时，活的表达HIVenv的Jurkat 522 FY细胞的百分数。
图23A-23C显示了使用CD4+、CD8+或全T细胞评估HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb1三特异性结合分子对表达HIV env的Jurkat 522 FY细胞的CTL活性的结果。
图24A-24C显示了使用CD4+、CD8+或全T细胞评估HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb1三特异性结合分子对表达HIV env的Jurkat 522 FY细胞的CTL活性的结果。
图25A-25C显示了具有CD3 mAb 2结合结构域的DARTTM分子(图25A)和其CD3 mAb2Low(低)(图25B)和CD3 mAb 2Fast(快速)(图25C)亲和性变体的结合动力学。
图26A-26B显示了人PMBC的CD5+CD4+门控的(图26A)或CD5+CD4–门控的(图26B)细胞群，其随着增加浓度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的变化而变化。5T4 X CD3 DARTTM(以野生型，Low和Fast CD3特异性作为对照。
图27A-27C显示了使用LDH试验，CD3 mAb变体(CD3 mAb 2 Low和CD3 mAb 2 Fast)对5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的细胞毒性的作用。
图28A-28F显示了在存在增加浓度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的情况下，从来自供体1的PBMC释放的IFN-γ(图28A)、TNF-α(图28B)、IL-10(图28C)、IL-6(图28D)、IL-4(图28E)和IL-2(图28F)的水平。
图29A-29F显示了在存在增加浓度的5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的情况下，从来自供体2的PBMC释放的IFN-γ(图29A)、TNF-α(图29B)、IL-10(图29C)、IL-6(图29D)、IL-4(图29E)和IL-2(图29F)的水平。
发明详述：
本发明涉及三特异性结合分子，其是具有三个结合结构域的多链多肽分子，因此能够介导与三个表位的配位结合。可选择结合结构域以便三特异性结合分子能够结合任何三个不同表位。这样的表位可以是相同抗原的表位或两个或三个不同抗原的表位。本发明也提供新的ROR1结合抗体，以及其衍生物和这样的组合物的用途。
I.一般技术和一般定义
除非另外指出，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规的技术，其在本领域的技术范围内。在下述文献中充分阐释了这样的技术，比如，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第三版(Sambrook等Eds.,2001)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；OLIGONUCLEOTIDESYNTHESIS:METHODS AND APPLICATIONS(Methods in Molecular Biology),Herdewijn,P.,Ed.,Humana Press,Totowa,NJ；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(Gait,M.J.,Ed.,1984)；METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Humana Press,Totowa,NJ；CELL BIOLOGY:A LABORATORYNOTEBOOK(Cellis,J.E.,Ed.,1998)Academic Press,New York,NY；ANIMAL CELL CULTURE(Freshney,R.I.,Ed.,1987)；INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE(Mather,J.P.and Roberts,P.E.,Eds.,1998)Plenum Press,New York,NY；CELL AND TISSUECULTURE:LABORATORY PROCEDURES(Doyle,A.等,Eds.,1993-8)John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)New York,NY；WEIR’SHANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY(Herzenberg,L.A.等Eds.1997)Wiley-BlackwellPublishers,New York,NY；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(Miller,J.M.等Eds.,1987)Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY；CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,F.M.等,Eds.,1987)Greene Pub.Associates,New York,NY；PCR:THE POLYMERASE CHAIN REACTION,(Mullis,K.等,Eds.,1994)BostonMA；CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(Coligan,J.E.等,eds.,1991)John Wiley andSons,Hoboken,NJ；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(John Wiley and Sons,1999)Hoboken,NJ；IMMUNOBIOLOGY 7(Janeway,C.A.等2007)Garland Science,London,UK；Antibodies(P.Finch,1997)Stride Publications,Devoran,UK；ANTIBODIES:A PRACTICALAPPROACH(D.Catty.,ed.,1989)Oxford University Press,USA,New York NY)；MONOCLONAL ANTIBODIES:A PRACTICAL APPROACH(Shepherd,P.等Eds.,2000)OxfordUniversity Press,USA,New York NY；USING ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL(Harlow,E.等Eds.,1998)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；THEANTIBODIES(Zanetti,M.等Eds.1995)Harwood Academic Publishers,London,UK)；和DEVITA,HELLMAN,AND ROSENBERG'S CANCER:PRINCIPLES&PRACTICE OF ONCOLOGY,EIGHTHEDITION,DeVita,V.等Eds.2008,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
II.本发明优选的三特异性结合分子
A.结合能力
本发明优选的三特异性结合分子能够协同和同时结合三个不同的表位。本发明这样优选的三特异性结合分子包括：
(I)“结合结构域I”，其能够免疫特异性结合第一抗原上存在的“表位I”，和“结合结构域II”，其能够免疫特异性结合第二抗原上存在的“表位II”，其中所述结合结构域I和所述结合结构域II都是“双抗体型结合结构域”；
(II)“非双抗体型”“结合结构域III”，其能够免疫特异性结合第三抗原上存在的“表位III”；和
(III)Fc结构域，其通过两个CH2-CH3结构域彼此复合而形成。
典型地，本发明的三特异性结合分子包括四条不同多肽链，每条链各具有氨基末端和羧基末端(见图4A-4D、图5A和图5B)，但是，通过彼此融合这样的多肽链(例如，经肽键)或通过将这样的多肽链分开形成另外的多肽链，分子可包括更少或更多数量的多肽链。图4E-4J通过示意性描绘这样的具有三条多肽链的分子图示了本发明的该方面。图4K-4L通过示意性描绘具有五条多肽链的分子图示了本发明的该方面。
尽管这样的三特异性结合分子是特别优选的，但是本发明另外具体考虑这样的三特异性结合分子：其包括足以产生具有三种结合特异性的分子的结合结构域的任何组合，其中两种特异性是针对癌症抗原的结合特异性，并且，一种特异性是针对效应细胞抗原的结合特异性。因此，例如，本发明考虑：三特异性结合分子，其包括三个Fab型结合结构域；三特异性结合分子，其包括一个二价、双特异性抗体结构域(通过例如复合两个不同轻链和两个不同重链形成)和一个Fab型结合结构域；三特异性结合分子，其包括两个二价、双特异性抗体结构域(通过例如复合四个不同的轻链和两个不同的重链形成)，但是使其中一个抗体结构域无活性等。
术语“多肽”、“多肽链”和“肽”在本文中可互换使用，指任何长度——但是尤其是长度大于3、5、10、15、20或25个氨基酸残基——的氨基酸的聚合物，其中两个，更优选地，所有氨基酸残基经酰胺(肽)键(-NH-C(O)-)连接。但是，聚合物可以是线性的或分支的，其可包括修饰的氨基酸，并且其可被非氨基酸中断。该术语也包括经天然修饰的或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化(lipidation)、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，比如结合标签组分。同样包括在定义中的是，例如，多肽，其包含一个或多个氨基酸的类似物(包括，例如，非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰。本发明的多肽可作为单链或复合的链存在。
“双抗体型结合结构域”是双抗体，尤其是双抗体的表位结合结构域。术语“双抗体”和“双抗体”已经在上面讨论了，其指这样的分子：其包括优选地通过共价相互作用彼此复合的至少两条多肽链，以形成至少两个表位结合位点，其可识别相同的或不同的表位。双抗体或双抗体的多肽链中的两条均包括免疫球蛋白轻链可变区和免疫球蛋白重链可变区，但是这些区域不相互作用形成表位结合位点(即，它们不是相互“互补的”)。相反，双抗体或双抗体链中的一个(例如，第一)的免疫球蛋白重链可变区与不同的(例如，第二)双抗体或双抗体多肽链的免疫球蛋白轻链可变区相互作用，形成表位结合位点。类似地，双抗体或双抗体多肽链中的一个(例如，第一)的免疫球蛋白轻链可变区与不同的(例如，第二)双抗体或双抗体多肽链的免疫球蛋白重链可变区相互作用，形成表位结合位点。双抗体分子公开在下述文献中：美国专利公开号2013-0295121、2010-0174053和2009-0060910；欧洲专利公开号EP 2714079、EP2601216、EP 2376109、EP 2158221；和PCT公开号WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO2010/080538、WO 2006/113665、WO 2008/157379；和Moore,P.A.等(2011)“Application OfDual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-CellKilling Of B-Cell Lymphoma,”Blood 117(17):4542-4551；Veri,M.C.等(2010)“Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma ReceptorIIb(CD32B)Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold,”Arthritis Rheum.62(7):1933-1943；和Johnson,S.等(2010)“Effector CellRecruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads ToPotent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion,”J.Mol.Biol.399(3):436-449。
结合结构域III优选地是“非双抗体型”结合结构域，其旨在表示结合结构域III不具有双抗体型结合结构域的结构。优选地，结合结构域III是非双抗体型结合结构域，其是Fab型结合结构域或受体型结合结构域。如本文所使用，术语“Fab型结合结构域”指这样的表位结合结构域，其通过免疫球蛋白轻链的VL结构域和免疫球蛋白重链的互补的VH结构域的相互作用形成。Fab型结合结构域与双抗体型结合结构域的不同之处在于形成Fab型结合结构域的两个多肽链仅仅包括单个表位结合结构域，而形成双抗体型结合结构域的两个多肽链包括至少两个表位结合结构域。因此，如本文所使用Fab型结合结构域与双抗体型结合结构域不同。如本文所使用，术语“受体型结合结构域”指通过两个多肽的相互作用形成的细胞受体的表位结合结构域。本文通过参考T细胞受体型结合结构域例证了受体型结合结构域，所述T细胞受体型结合结构域通过T细胞受体α链的可变结构域和T细胞受体β链的可变结构域相互作用而形成。这样的T细胞受体结合结构域识别在MHC背景下展示的肽，因此能够识别细胞内表位。尽管本发明参考这样的受体型结合结构域得以阐释，但是应认识到也可采用T细胞受体型结合结构域之外的受体型结合结构域，并且其包括在本发明中。具有受体型结合结构域的受体的其他例子包括IL-2受体、IL-4受体、IL-7受体、IL-9受体、IL-15受体、IL-21胰岛素受体和胸腺基质淋巴细胞生成素。
因此，本发明的三特异性结合分子与四价结合分子比如由二价抗体二聚化产生的那些四价结合分子不同，并且优选地具备三个而不是四个结合结构域。如下面所讨论，本发明的三特异性分子可具有另外的结合结构域(比如白蛋白-结合结构域、FcγR-结合结构域等)。这样另外的结合结构域不旨在被视为或考虑是本发明的三特异性结合分子的三个结合结构域之一。
如本文所使用，术语“缔合(association)”或“缔合(assoiating)”，就多肽(例如，一个双抗体多肽与另一双抗体多肽缔合、免疫球蛋白轻链与免疫球蛋白重链缔合、一个CH2-CH3结构域与另一CH2-CH3结构域缔合等)而言，旨在表示多肽的非共价结合。术语”复合(complexes)”或“复合(complexing)”旨在表示多肽的共价结合。
如本文所使用，如果至少其两个结合结构域，优选地，其所有的结合结构域，能够同时结合它们各自识别的表位或结合配体，则认为本发明的三特异性结合分子的结合结构域介导“配位结合(coordinated binding)”。这样的结合可以是同时的。但是，本发明的一个方面涉及修饰这样的结合结构域结合它们识别的表位的”结合速率”和/或“解离速率”。如本文所使用，结合的“结合速率(on rate)”适对这样的结合结构域识别和启动与它们识别表位的结合的亲和性的度量。相反，结合的“解离速率”是对结合结构域：表位复合物稳定性程度的度量。结合的”结合速率”和/或“解离速率”可通过改变结合结构域的CDR的氨基酸序列修饰。如下面所讨论，不依赖于任何CDR修饰，本发明分子的配位结合的程度可通过改变它们的结合结构域的构型来调节，从而具体的结合结构域(即，VLx/VHx结构域)作为结合结构域III而存在或作为相对于结合结构域III的内部或外部双抗体型结合结构域(下面详细讨论)而存在。
本发明的三特异性结合分子的结合结构域的结合速率和解离速率可容易通过本领域熟知的方法测量，例如通过下述方法测量：分析(Jason-Moller,L.等(2006)“Overview Of Biacore Systems And Their Applications,”Curr.Protoc.ProteinSci.Chapter 19:Unit 19.13；；Swanson,S.J.(2005)“Characterization Of An ImmuneResponse,”Dev.Biol.(Basel).122:95-101；；Buijs,J.等(2005)“SPR-MS In FunctionalProteomics,”Brief Funct.Genomic Proteomic.4(1):39-47；Karlsson,R.等(2004)“SPRFor Molecular Interaction Analysis:A Review Of Emerging Application Areas,”J.Mol.Recognit.17(3):151-161；Van Regenmortel,M.H.(2003)“Improving The QualityOf BIACORE-Based Affinity Measurements,”Dev.Biol.(Basel)112:141-151；Malmqvist,M.(1999)“BIACORE:An Affinity Biosensor System For CharacterizationOf Biomolecular Interactions,”Biochem.Soc.Trans.27(2):335-340；Malmqvist,M.等(1997)“Biomolecular Interaction Analysis:Affinity Biosensor Technologies ForFunctional Analysis Of Proteins,”Curr.Opin.Chem.Biol.1(3):378-383；Fivash,M.等(1998)“Biacore For Macromolecular Interaction,”Curr.Opin.Biotechnol.9(1):97-101；Malmborg,A.C.等(1995)“Biacore As A Tool In Antibody Engineering,”J.Immunol.Methods.183(1):7-13)。本发明的三特异性结合分子的结合结构域的结合速率和解离速率可容易通过如下方式改变：编码这样的结合结构域的核酸分子的随机或定向诱变，随后针对它们编码展示这样的改变结合动力学的突变蛋白质的能力，常规筛选收获的核酸分子。
本发明的三特异性结合分子的结合结构域以“免疫特异性”方式结合表位。如本文所使用，如果其相对于可选的表位，与该表位更频繁、更快速地以更大的持续时间和/或以更大的亲和性反应或缔合，则认为抗体、双抗体或其他表位结合分子“免疫特异性”结合另一分子的区域(即，表位)。例如，免疫特异性结合病毒表位的抗体是这样的抗体：与其免疫特异性结合其他病毒表位或非病毒表位相比，所述抗体以更大的亲和性、抗体亲抗原性、更容易和/或以更持久的时间结合该病毒表位。通过阅读该定义，应理解，例如，免疫特异性结合第一靶的抗体(或部分或表位)可能或可能不特异性或优选结合第二靶。因此，“特异性结合”不一定要求(尽管其可包括)排他性结合。一般而言，但是不一定，提及结合则意味着”特异性”结合。如果，这样的结合展示受体结合它们各自配体的特异性，则认为两个分子能够彼此以“生理特异性”方式结合。
因此，在它们最简单的实施方式中，本发明优选的结合分子是至少三特异性的——能够介导与三个不同表位的配位结合。显著地，这样的分子具有能够结合抗原的至少三个“位点”：“外部”双抗体型结合结构域，其距离结合结构域III最远；“内部”双抗体型结合结构域，其距离结合结构域III最近；和结合结构域III本身。这样的结构域的位置分别命名为位点A、位点B和位点C(图4A-4D)。
选择彼此不同的结合表位I、II和III的结合结构域。但是，表位I、II和III可以是相同抗原的表位、两个不同抗原的表位或三个不同抗原的表位。因此，本发明的三特异性结合分子可能够协同结合1、2或3个不同的抗原分子。对于任何可能的表位和任何可能的抗原，可采用本发明的三特异性结合分子。例如，本发明的三特异性结合分子可具有1、2或3个结合结构域，其结合效应细胞的表位(例如，CD2、CD3、CD16、CD19、CD20、CD22、CD32B、CD64、B细胞受体(BCR)、T细胞受体(TCR)和NKG2D受体)，或结合细胞毒性T细胞的表位(例如，细胞毒性T细胞上存在的CD8)或结合疾病相关的抗原的表位，或这样的可能结合结构域的任何组合。
如本文所使用，“疾病相关的抗原”是在“感染病原体的”细胞或“癌症细胞”上特征性表达但是在正常细胞上不是特征性表达的的抗原。
如本文所使用，术语“感染病原体的”细胞指已经被下述感染的细胞：细菌(例如，大肠埃希氏菌、艰难梭菌(C.difficile)、伤寒沙门氏菌(Salmonella thyphimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Hemophilus influenzae)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和肺炎链球菌等(Streptococcus pneumonia))，真菌(例如，念珠菌属(Candida)、曲霉菌属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、球孢子菌属(Coccidioides)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺孢菌属(Pneumocystis)、葡萄穗霉菌属(Stachybotrys)等)、原生动物(变形虫类(Amoebozoa)、古虫类(Excavata)、囊泡藻类(Chromalveolata)、内变形虫类(Entamoeba)、疟原虫属(Plasmodium)、贾第虫(Giardia)、锥体虫属(Trypanosoma)、球虫亚纲(Coccidia)、贝诺属(Besnoitia)、岐腔属(Dicrocoelium)、利什曼虫属(Leishmania)等)或病毒(尤其是腺病毒、腺伴随病毒、B病毒(恒河猴疱疹病毒I型(macacine herpesvirusI))、BK病毒、布尼亚病毒、切昆贡亚(chikungunya)病毒、柯萨奇(cocksackie)病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、东部马脑炎(eastern equine encephalitis)病毒、埃博拉病毒、肠道病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、汉坦病毒(hantavirus)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，单纯性疱疹病毒1型、单纯性疱疹病毒2型、人泡沫病毒(human foamy virus)、人疱疹病毒3型、人疱疹病毒5型、人疱疹病毒6型、人疱疹病毒7型、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人β-嗜淋巴细胞病毒、人T细胞白血病病毒I型、人T细胞白血病病毒II型、流感病毒、JC病毒、JEV、卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒、拉沙病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒(Nipah virus)、诺如病毒(norovirus)、诺瓦克(Norwalk)病毒、正呼肠孤病毒(orthoreovirus)、副流感病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、狂犬病病毒、呼肠病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、裂谷热病毒、轮状病毒、风疹病毒、天花病毒、圣路易脑炎病毒、重型天花病毒(variola majorvirus)、卡菲尔痘病毒(variola minor virus)、水痘-疱疹病毒(vericella-zostervirus)、西尼罗病毒、西部马脑炎病毒或黄热病病毒)。
如本文所使用，术语“癌症细胞”指下述的恶性细胞：肾上腺肿瘤、AIDS相关的癌症、软组织腺泡状肉瘤、星形细胞肿瘤、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、乳腺癌、颈动脉体肿瘤、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、嫌色细胞肾细胞癌、透明细胞癌、结肠癌、结直肠癌、皮肤良性纤维组织细胞瘤、成纤维细胞性小圆细胞肿瘤、室管膜瘤、尤文氏肿瘤、骨外黏液样软骨肉瘤、不完全性骨纤维生成、骨纤维发育不良、胆囊或胆管癌、胃癌、妊娠滋养层疾病、生殖细胞肿瘤、头颈癌、肝细胞癌、胰岛细胞肿瘤、卡波西氏肉瘤、肾癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂肪肉瘤/恶性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神经管细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、多发性内分泌瘤形成、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、成神经细胞瘤、神经内分泌肿瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、甲状旁腺肿瘤、儿科癌症(pediatric cancer)、末梢神经鞘肿瘤、嗜铬细胞瘤(phaeochromocytoma)、垂体肿瘤、前列腺癌、后眼色素层(posteriousuveal)黑素瘤、罕见的血液疾病、肾转移性癌、杆状(rhabdoid)肿瘤、横纹肌肉瘤(rhabdomysarcoma)、肉瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲状腺转移性癌或子宫癌。
由癌症细胞特征性表达的抗原的例子包括“癌症抗原”比如乳腺癌抗原、卵巢癌抗原、前列腺癌抗原、宫颈癌抗原、胰腺癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、结肠癌抗原、睾丸癌抗原、胶质母细胞瘤癌症抗原、与B细胞恶性肿瘤相关的抗原、与多发性骨髓瘤相关的抗原、与非霍奇金淋巴瘤相关的抗原，或与慢性淋巴细胞白血病相关的抗原。由癌症细胞特征性表达的示例性抗原包括下述抗原：结肠癌抗原19.9、胃癌黏蛋白抗原4.2；结直肠癌抗原A33(Almqvist,Y.2006，Nucl Med Biol.Nov；33(8):991-998)；ADAM-9(美国专利公开号2006/0172350、PCT公开号WO 06/084075；AFP癌胚抗原-甲胎蛋白(Malaguarnera,G.等(2010)“Serum markers of hepatocellular carcinoma,”Dig.Dis.Sci.55(10):2744-2755)；ALCAM(PCT公开号WO 03/093443)；BAGE(Bodey,B.2002 Expert Opin Biol Ther.2(6):577-84)；β-联蛋白(Prange W.等2003 J Pathol.201(2):250-9)；CA125(Bast,R.C.Jr.等2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81)；羧肽酶M(美国专利公开号2006/0166291)；B1(Egloff,A.M.等2006，Cancer Res.66(1):6-9)；CD5(Calin,G.A.等2006Semin Oncol.33(2):167-73；CD19(Troussard,X.等1998 Hematol Cell Ther.40(4):139-48)；CD20(Thomas,D.A.等2006 Hematol Oncol Clin North Am.20(5):1125-36)；CD20(Cang,S.等(2012)”Novel CD20 Monoclonal Antibodies For Lymphoma Therapy,”J.Hematol.Oncol.5:64 pp.1-9)；CD22(Kreitman,R.J.2006AAPS J.18；8(3):E532-51)；CD23(Rosati，S.等2005 Curr 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可用于提供本发明的三特异性结合分子的可变轻链结构域、可变重链结构域、抗体轻链或抗体重链的、免疫特异性结合疾病相关的抗原表位的示例性抗体提供在表2中。
疾病相关的抗原可在感染病原体的细胞或癌症细胞中特征性表达并且在MHC复合物的背景下在细胞表面上被处理和展示，但是不在正常细胞中特征性表达。识别这样的肽片段的抗体是本领域已知的或可使用熟知的方法产生，包括WO 2002/014870中描述的那些。
本发明的三特异性结合分子的多肽可适于包含这样的抗体的轻链可变结构域或重链可变结构域(这样的分子的第一和第二多肽链的情况)或重链或轻链(这样的分子的第三和第四多肽链的情况)。因此，上述抗体可用于产生本发明的三特异性结合分子，其位点A、位点B或位点C能够结合这样的疾病相关的抗原的表位]。
B.优选的结构属性
典型地，本发明分子的三特异性结合分子包括四条不同的多肽链，其各具有氨基末端和羧基末端(见图4A-4D)，但是，通过彼此融合这样的多肽链(例如，经肽键)或通过将这样的多肽链分开形成另外的多肽链，或通过经二硫键缔合更少或另外的多肽链，分子可包括更少或更多数量的多肽链。图4E-4J通过示意性描绘具有三条多肽链的这样的分子阐释了本发明的该方面。图4K-4L通过示意性描绘具有五条多肽链的分子阐释了本发明的该方面。
这样的分子的各种免疫球蛋白结构域可源自任何同种型或同种异型的免疫球蛋白，包括但不限于IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。在优选的实施方式中，如下面所讨论，这样的免疫球蛋白源自IgG免疫球蛋白。在具体的实施方式中，使用的IgG同种型是IgG1，但是可采用其他同种型的IgG(例如，IgG2、IgG3或IgG4或其同种异型)。当使用IgG4Fc结构域时，本发明包括引入稳定突变比如S228P，其通过如Kabat中阐释的EU索引编号(Lu等，(2008)“TheEffect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored ByAnalytical Ultracentrifugation,”J.Pharmaceutical Sciences 97:960-969)，以减少链交换的发生。可将本领域已知的其他稳定突变引入IgG4 Fc结构域(Peters,P等，(2012)“Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide BondHeterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,”J.Biol.Chem.,287:24525-24533；PCT专利公开号：WO 2008/145142)。因为N297A、L234A、L235A和D265A取代消除了效应子功能，在期望效应子功能的情况下，优选不采用这些取代。
图4A-4D提供了优选的三特异性结合分子的结构域的图示。图4A和4B分别示意性图示了优选的三特异性结合分子的结构域，其中非双抗体型结合结构域是Fab型结合结构域或受体型结合结构域。图4C和4D，分别示意性图示了具有不同的结构域取向的优选的三特异性结合分子的结构域，其中非双抗体型结合结构域是Fab型结合结构域或受体型结合结构域。
如上面所示，由这样的示例性优选的三特异性结合分子的结合结构域结合的表位I、表位II或表位III之一可以是疾病相关的抗原的表位。最优选地，结合这样的疾病相关的抗原的表位的这样的示例性优选的三特异性结合分子的结合结构域是Fab型结合结构域。本发明的这样的三特异性结合分子的多肽可适于包含可变轻链结构域或可变重链结构域(这样的分子的第一和第二多肽链的情况)或重链或轻链(在这样的分子的第三和第四多肽链的情况下)。因此，这样的抗体可用于产生本发明的三特异性结合分子，其位点A、位点B或位点C能够结合这样的疾病相关的抗原的表位。
1.优选的第一多肽链
本发明优选的三特异性结合分子的第一多肽链包括能够结合表位I的可变轻链结构域(VLI)、能够结合表位II的可变重链结构域(VHII)、半胱氨酸残基或包含半胱氨酸的结构域和异源二聚体-促进结构域和CH2-CH3结构域。
因为第一多肽的可变轻链结构域和可变重链结构域针对不同表位，它们不能缔合在一起形成能够结合表位I或表位II的结合结构域。第一多肽的可变轻链结构域和可变重链结构域通过间插接头肽彼此间隔开，所述间插接头肽足够短以基本上防止这些结构域的缔合。示例性接头——称为“接头1”——具有序列(SEQ ID NO:1)：GGGSGGGG。
第一多肽的可变重链结构域和该多肽的异源二聚体-促进结构域优选地通过包含1、2、3或更多个半胱氨酸残基的间插接头肽而彼此间隔开。优选的包含半胱氨酸的结构域(“接头2”)具有的序列为SEQ ID NO:2：GGCGGG。可选地，或另外，可使用包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域，如下面描述的。
因此，在一些实施方式中，一个或多个半胱氨酸残基(或包含半胱氨酸的结构域，比如包含半胱氨酸的肽接头)被并入到第一多肽链(和/或并入到本发明的三特异性结合分子的第二、第三、第四或另外的多肽链)中，以便将两个这样的多肽链共价结合在一起，而在等同的实施方式中，这样的半胱氨酸残基(一个或多个)可被并入到异源二聚体-促进结构域，或并入另一结构域以便实现相同的结果。
协同选择第一多肽的异源二聚体-促进结构域和第二多肽的异源二聚体-促进结构域。结构域彼此不同并且被设计为彼此缔合以便促进第一和第二多肽链的缔合。例如，异源二聚体-促进结构域中的一个被工程化以在pH 7具有负电荷，而两条多肽链中的另一条被工程化，以在pH 7具有正电荷。这样带电荷的结构域的存在促进第一和第二多肽之间的缔合，因此促进异源二聚化。哪个异源二聚体-促进结构域被提供至哪条链不重要，只要在第一和第二多肽链上采用的结构域不同以便促进这样的链之间的异源二聚化。
在优选的实施方式中，第一多肽链的异源二聚体-促进结构域是“E-螺旋”结构域(SEQ ID NO:3)：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK，或“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:4)：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE。更优选地，第一多肽链具备“E-螺旋”结构域。第一多肽链可包含仅仅单个这样的螺旋分隔子，或其可包含大于一个这样的螺旋分隔子(例如，两个分隔子)并且可以是相同电荷，优选地具有相反电荷。
在优选的实施方式中，第一多肽链的异源二聚体-促进结构域包括四个串联“E-螺旋”螺旋状结构域(SEQ ID NO:3：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK)，其谷氨酸残基在pH7形成负电荷，或包括四个串联“K-螺旋”结构域(SEQ ID NO:4：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE)，其赖氨酸残基在pH 7形成正电荷。这样的带电荷结构域的存在促进第一和第二多肽链之间的缔合，并且因此促进异源二聚化。尤其优选的是这样的异源二聚体-促进结构域：其中四个串联的具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的“E-螺旋”螺旋状结构域之一ID NO:ID NO:已经被修饰以包含半胱氨酸残基：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:115)或其中四个串联的具有SEQ ID NO:4的“K-螺旋”螺旋状结构域ID NO:之一已经被修饰以包含半胱氨酸残基：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:116)。下面公开了根据本发明可采用的其他E-螺旋和K-螺旋结构域：Woolfson,D.N.(2005)“The Design OfCoiled-Coil Structures And Assemblies,”Adv.Prot.Chem.70:79-112；Straussman,R.等(2007)“Kinking the Coiled Coil–Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface,”J.Molec.Biol.366:1232-1242；Apostolovic,B.等(2008)“pH-Sensitivity of the E3/K3Heterodimeric Coiled Coil,”Biomacromolecules 9:3173-3180；Arndt,K.M.等(2001)“Helix-stabilized Fv(hsFv)Antibody Fragments:Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a HeterodimericCoiled-coil Domain,”J.Molec.Biol.312:221-228；Steinkruger,J.D.等(2012)“Thed′--d--d′Vertical Triad is Less Discriminating Than the a′--a--a′VerticalTriad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif,”J.Amer.Chem.Soc.134(5):2626–2633；Ghosh,T.S.等(2009)“End-To-End And End-To-Middle InterhelicalInteractions:New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures,”Acta Crystallographica D65:1032-1041；Grigoryan,G.等(2008)“StructuralSpecificity In Coiled-Coil Interactions,”Curr.Opin.Struc.Biol.18:477-483；Boucher,C.等(2010)“Protein Detection By Western Blot Via Coiled–CoilInteractions,”Analytical Biochemistry 399:138-140；Cachia,P.J.等(2004)“Synthetic Peptide Vaccine Development:Measurement Of Polyclonal AntibodyAffinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release SystemFor Surface Plasmon Resonance Spectroscopy,”J.Mol.Recognit.17:540-557；DeCrescenzo,G.D.等(2003)“Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils:Effect of Chain Length on the Kineticand Thermodynamic Constants of Binding,”Biochemistry 42:1754-1763；Tripet,B.等(2002)“Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New PeptideDelivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance,”J.Molec.Biol.323:345–362；和Zeng,Y.等(2008)“A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novoDesigned Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With AlteredTropism,”J.Gene Med.10:355-367。
优选地，采用的第一多肽链的异源二聚体-促进结构域和CH2-CH3结构域通过包含半胱氨酸的间插接头肽而彼此间隔开，所述接头肽为异源二聚体-促进结构域提供改善的稳定性。优选的包含半胱氨酸的接头肽(“接头3”)具有氨基酸序列(SEQ ID NO:5)：DKTHTCPPCP。
野生型CH2-CH3结构域的氨基酸序列如下(如在以下文献中的EU索引中进行定位：Kabat等(1992)SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，国立卫生研究院(National Institutes of Health)公开号91-3242)(SEQ ID NO:6)：
在一些表达系统中，CH3结构域的C-末端氨基酸残基可被翻译后去除。因此，CH3结构域的C-末端残基是任选的氨基酸残基。
第一多肽链的CH2-CH3结构域优选地被修饰，以促进第三多肽链的CH2-CH3结构域之间的异源二聚化(见下面)。例如，可将氨基酸取代(优选地用包括形成‘杵’的大侧基例如色氨酸的氨基酸进行取代)引入第一多肽链的CH2或CH3结构域中，以便空间干扰防止与类似突变的结构域相互作用并且迫使突变的结构域与其中已经工程化引入了互补的或适应性突变的结构域，即，‘臼’(例如，用甘氨酸进行取代)配对。这样的突变组可被工程化到任何对的包括双抗体分子的多肽中，而且，进一步地，可被工程化到所述对的多肽链的任何部分。进行蛋白质工程以相对于同二聚化更偏爱异源二聚化的方法是本领域熟知的——尤其就免疫球蛋白样分子的工程化而言，并且包括在本文中(见例如，美国专利号7,695,936和专利公开2007/0196363，Ridgway等(1996)“‘Knobs-Into-Holes’Engineering OfAntibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,”Protein Engr.9:617-621；Atwell等(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain InterfaceOf A Homodimer Using A Phage Display Library,”J.Mol.Biol.270:26-35；和Xie等(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody:Highly EfficientHeterodimerization,Expression And Tumor Cell Lysis,”J.Immunol.Methods 296:95-101；其每一篇通过引用以其整体并入本文。通过修饰天然IgG Fc结构域以包含修饰T366W而产生优选的杵。通过修饰天然IgG Fc结构域以包含修饰T366S、L368A和Y407V而产生优选的臼。为了有助于纯化本发明的三特异性结合分子，包含臼突变的多肽链另外包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A结合位点。因此，包含臼突变的多肽的同二聚体不结合蛋白A，而由于包含异源二聚体的杵和臼形成的三特异性结合分子经在包含杵突变的多肽链上的蛋白A结合位点将保持其结合蛋白A的能力。
第一多肽链的CH2-CH3结构域优选地被修饰，以减少或消除Fc与Fc受体的结合。这样的突变是本领域熟知的并且包括在234、235、265和297位的取代(见美国专利号5,624,821)。优选的取代包括L234A和L235A，D265A和N297Q中的一个或多个。
因此，优选地，第一多肽链的CH2-CH3结构域具有“携带杵的”序列(SEQ ID NO:7)：
或具有具有H435R取代以消除蛋白A结合的“携带臼的”序列(SEQ ID NO:8)：
优选地，第一多肽链具有“携带杵的”CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO:7的序列。
如将认识到，可在第一多肽链中采用“携带臼的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ IDNO:8)，在该情况下，将在第三多肽链中采用“携带杵的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:7)。
因此，总之，本发明优选的三特异性结合分子的优选的第一多肽链包括结构域和接头：(VLI结构域)─(接头1)─(VHII结构域)─(包含半胱氨酸的结构域(接头2))─(E-螺旋异源二聚体-促进结构域)─(接头3)─(携带杵的CH2-CH3结构域)或(VLI结构域)─(接头1)─(VHII结构域)─(接头2)─(包含半胱氨酸的E-螺旋异源二聚体-促进结构域)─(接头3)─(携带杵的CH2-CH3结构域或(VLI结构域)─(接头1)─(VHII结构域)─(接头2)─(包含半胱氨酸的E-螺旋异源二聚体-促进结构域)─(接头3)─(携带杵的CH2-CH3结构域)。
2.优选的第二多肽链
这样优选的三特异性结合分子的第二多肽链在N-末端至C-末端方向包括能够结合表位II的可变轻链结构域(VLII)、能够结合表位I的可变重链结构域(VHI)、半胱氨酸残基或包含半胱氨酸的结构域和异源二聚体-促进结构域。
因为第二多肽的可变轻链结构域和可变重链结构域针对不同表位，它们不能缔合在一起形成能够结合表位I或表位II的结合结构域。第二多肽的可变轻链结构域和可变重链结构域通过足够短以基本上防止这些结构域缔合的间插接头肽而彼此间隔开。具有序列(SEQ ID NO:1)：GGGSGGGG的“接头1”是用于该目的的示例性接头。
如在第一多肽链的情况下，第二多肽的可变重链结构域和该多肽的异源二聚体-促进结构域优选地通过包含1、2、3或更多个半胱氨酸残基的包含半胱氨酸的间插结构域而彼此间隔开。具有序列(SEQ ID NO:2)GGCGGG的“接头2”是用于该目的的示例性接头。这样的半胱氨酸残基可与包含半胱氨酸的间隔肽中的半胱氨酸残基形成二硫键，所述间隔肽分开第一多肽的可变重链结构域和该多肽的异源二聚体-促进结构域。因此，本发明的三特异性结合分子的第一和第二多肽彼此共价结合。可选地，可使用包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域，如上所述。
如上所讨论，选择第二多肽链的异源二聚体-促进结构域，以便与第一多肽链的异源二聚体-促进结构域协同作用。因此，在优选的实施方式中，第一多肽链的异源二聚体-促进结构域是“K-螺旋”结构域(例如，SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:116)或“E-螺旋”结构域(例如，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:115)。因为第一多肽链优选地具备“E-螺旋”结构域，所以第二多肽链优选地包含“K-螺旋”结构域。
因为第一和第二多肽链是双抗体的多肽链，它们能够缔合在一起形成识别和免疫特异性结合表位I的结构域I结合结构域(VLA/VHA)，和识别和免疫特异性结合表位II的结构域II结合结构域(VLB/VHB)。
因此，总之，本发明优选的三特异性结合分子的优选的第二多肽链包括结构域和接头：(VLII结构域)─(接头1)─(VHI结构域)─(包含半胱氨酸的结构域(接头2))─(K-螺旋异源二聚体-促进结构域)或(VLII结构域)─(接头1)─(VHI结构域)─(接头2)─(包含半胱氨酸的K-螺旋异源二聚体-促进结构域)。
3.优选的第三多肽链
本发明优选的三特异性结合分子的第三多肽链是这样的多肽：其在N-末端至C-末端方向上包括结合结构域、可任选地包括CH1-铰链结构域的包含半胱氨酸的结构域和CH2-CH3结构域。本发明优选的三特异性结合分子的第三多肽链的结合结构域可以是能够结合表位III的可变重链结构域(VHIII)，在该情况下，本发明优选的三特异性结合分子的第四多肽链(下面讨论)是包括能够结合表位III的可变轻链结构域(VLIII)的多肽，以便结合结构域能够免疫特异性结合具备表位III的抗原。可选地，本发明优选的三特异性结合分子的第三多肽链的结合结构域可包括T细胞受体型结合结构域，在该情况下，本发明优选的三特异性结合分子的第四多肽链(下面讨论)是包括互补的T细胞受体型结合结构域的多肽，以便两个多肽链的相互作用形成能够生理特异性结合排列在细胞表面上的MHC复合物中呈现的抗原分子的结合结构域。第三多肽链可从天然存在的抗体分离。可选地，其可被重组构建。示例性CH1结构域是人IgG1CH1结构域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:9)：
示例性铰链结构域是人IgG1铰链结构域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:10)：EPKSCDKTHTCPPCP。如将认识到，示例性铰链结构域包括多个半胱氨酸残基(Elkabetz等(2005)“Cysteines In CH1Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains,”J.Biol.Chem.280:14402-14412)，其可参与链间共价键合。可选地，可采用不同的包含半胱氨酸的结构域(例如，具有以下氨基酸序列的肽：VEPKSC(SEQ ID NO:12)、AEPKSC(SEQ IDNO:127)，GVEPKSC(SEQ ID NO:133)或GGCGGG(SEQ ID NO:2))。
尽管可采用野生型CH2-CH3结构域，但是，如上所述，优选采用修饰的CH2-CH3结构域，其促进与第一多肽链的CH2-CH3结构域的异源二聚化。
因此，优选地，第三多肽链的CH2-CH3结构域是“携带臼的”CH2-CH3结构域，其氨基酸序列与第一多肽中采用的“携带杵的”CH2-CH3结构域(SEQ ID NO:7)互补。如上所讨论，携带臼的CH2-CH3结构域优选地应包括在435位的取代(H435R)，以去除蛋白A结合位点。对于第三多肽，具有H435R取代的示例性“携带臼的”CH2-CH3结构域是SEQ ID NO:8。
如将认识到，在第三多肽链中可采用“携带杵的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ IDNO:7)，在该情况下，在第一多肽链中采用“携带臼的”CH2-CH3结构域(例如，SEQ ID NO:8)。
在其中本发明优选的三特异性结合分子的第三(和第四)多肽链各包括T细胞受体型结合结构域多肽链的实施方式中，其在I类MHC背景下识别在细胞表面上呈现的抗原。产生这样的T细胞受体型结合结构域的方法是本领域熟知的(例如，US2012/0294874A1)。
因此，总之，本发明优选的三特异性结合分子的第三多肽链包括结构域和接头：(VHIII结构域)─(包含半胱氨酸的结构域(任选地CH1结构域和/或铰链结构域)─(携带臼的CH2-CH3结构域)，或(受体型结合结构域；其第一或第二多肽)─(包含半胱氨酸的结构域(任选地CH1结构域和/或铰链结构域)─(携带臼的CH2-CH3结构域)。
4.优选的第四多肽链
本发明优选的三特异性结合分子的第四多肽链是受体型结合结构域的多肽(其中第三和第四多肽链形成受体型结合结构域)，或更优选地，是上述抗体的轻链的多肽部分，其免疫特异性结合表位III和/或其与第三多肽链的结合结构域互补。
因此，在第三和第四多肽形成Fab型结合结构域的情况下，这样的第四多肽链在N-末端至C-末端方向上包括能够结合表位III的可变轻链结构域(VLIII)和用于促进与第三多肽链共价结合的包含半胱氨酸的结构域，或结合结构域和用于促进与第三多肽链共价结合的这样的包含半胱氨酸的结构域。这样的包含半胱氨酸的结构域可以是CL结构域，或其包含半胱氨酸的部分，比如(SEQ ID NO:11)FNRGEC或(SEQ ID NO:128)GFNRGEC或接头比如接头2(具有序列(SEQ ID NO:2)GGCGGG。与这样的接头2形成二硫键的包含半胱氨酸的示例性结构域包括氨基酸序列VEPKSC(SEQ ID NO:12)或铰链结构域。
第四多肽链可从天然存在的抗体分离。可选地，其可被重组构建。优选的CL结构域是人IgG1CLκ结构域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:13)：
可选地，示例性CL结构域是人IgG1CLλ2结构域，其具有氨基酸序列(SEQ ID NO:14)：
如将注意到，第四多肽链的CL结构域或其他包含半胱氨酸的结构域包括半胱氨酸残基，其能够共价结合第三多肽链的包含半胱氨酸的结构域(例如，CH1结构域)的半胱氨酸残基，从而彼此共价复合本发明的三特异性结合分子的第三和第四多肽链。因此第三和第四多肽链彼此共价结合。
另外，第一多肽链的CH2-CH3结构域的半胱氨酸残基可与第三多肽链的CH2-CH3结构域的半胱氨酸残基形成二硫键。因此第一和第三多肽链彼此共价结合。
因此，总之，本发明优选的三特异性结合分子的第四多肽链包括结构域和接头：(VLIII结构域)─(包含半胱氨酸的结构域(任选地CL结构域)，或(受体型结合结构域；其第一或第二多肽)─(包含半胱氨酸的结构域(任选地CL结构域)。
C.可选的第一多肽链
在一个实施方式中，上述结构域的取向为N-末端至C-末端方向。但是，本发明也考虑其变化，其中第一多肽链的结构域的取向是：NH2-(携带杵的CH3-CH2结构域)-(VLI结构域)─(接头1)─(VHII结构域)─(包含半胱氨酸的结构域接头2)─(E-螺旋异源二聚体-促进结构域)。优选地，包含半胱氨酸的结构域存在于这样的CH2-CH3结构域的N-末端。示例性肽的序列是(SEQ ID NO:5)：DKTHTCPPCP，但是，可采用可选的接头，例如，EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:129)或LEPKSSDKTHTCPPCP；SEQ ID NO:130)。在该实施方式中，优选地，CH3结构域通过间插肽接头与VLI结构域间隔开，所述间插肽接头比如具有氨基酸序列(SEQ IDNO:15)：APSSS，更优选地，具有氨基酸序列(SEQ ID NO:16)APSSSPME的接头，但是，可采用可选的接头，例如，ASTKG(SEQ ID NO:131)、LEPKSS(SEQ ID NO:132)、GGC或GGG。
D.白蛋白-结合结构域
如WO 2012/018687中公开，为了改善双抗体的体内药物代谢动力学特性，双抗体可被修饰，以在双抗体的一个或多个末端包含血清-结合蛋白的多肽部分。这样的考虑也适合本发明的三特异性结合分子。最优选地，当期望将血清-结合蛋白的多肽部分并入本发明的三特异性结合分子时，这样的多肽部分将被安置于三特异性结合分子的一条多肽链的C-末端。
白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质并且在人中的半衰期为19天。白蛋白具有数个小分子结合位点，允许其非共价结合其他蛋白质，从而延长它们的血清半衰期。的链球菌属(Streptococcus)菌株G148的蛋白质G的白蛋白-结合结构域3(ABD3)由形成稳定的三-螺旋束的46个氨基酸残基组成，并且具有宽的白蛋白-结合特异性(Johansson,M.U.等(2002)“Structure,Specificity,And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-BindingModules,”J.Biol.Chem.277(10):8114-8120。因此，用于改善双抗体体内药物代谢动力学特性的、尤其优选的血清-结合蛋白的多肽部分是来自链球菌蛋白质G的白蛋白-结合结构域(ABD)，和更优选地，链球菌属菌株G148的蛋白质G的白蛋白-结合结构域3(ABD3)(SEQ IDNO:123)：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如WO 2012/162068(通过参考并入本文)中公开，SEQ ID NO:123的“去免疫化的(deimmunized)”变体具有减弱或消除II类MHC结合的能力。基于组合突变结果，考虑下述取代组合是用于形成这样的去免疫化的白蛋白-结合结构域的优选的取代：66S/70S+71A；66S/70S+79A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。变体ABD具有修饰L64A、I65A和D79A或修饰N66S、T70S和D79A。具有氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA 64 A 65NNAKT VEGVKALIA 79E ILAALP(SEQ ID NO:124)，
或氨基酸序列：
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS 66NAKS 70VEGVKALIA 79E ILAALP(SEQ ID NO:125)，
的变异的去免疫化的ABD是尤其优选的，因为这样的去免疫化白蛋白-结合结构域展示基本上野生型的结合，同时提供减弱的II类MHC结合。尽管这样的白蛋白-结合结构域可被并入到本发明的三特异性结合分子的任何多肽链中，但是优选将这样的结构域布置于第一或第三多肽链的E-螺旋(或K-螺旋)结构域的C-末端(经间插在E-螺旋(或K-螺旋)结构域和白蛋白-结合结构域(其优选地是去免疫化白蛋白-结合结构域)之间的接头)。对于这样的接头，优选的序列是SEQ ID NO:126：GGGS。
E.Fc结构域的功能
在一个实施方式中，第一多肽链的CH2-CH3结构域和第三多肽的CH2-CH3结构域复合形成基本上不能够结合Fc受体的Fc结构域(即，以小于10％野生型Fc结构域的程度进行结合。可选地，这样的分子的Fc结构域能够在生理学条件下结合Fc受体，从而这样的三特异性结合分子是四特异性的，能够介导与四个分子的配位结合(表位I、表位II和表位III和Fc受体)。最优选地，能够结合Fc受体的这样的分子另外介导Fc受体-依赖性效应子功能。
本发明也包括这样的分子，其包括变异的Fc结构域，相对于可比较的野生型Fc结构域，所述变异的Fc结构域包括一个或多个氨基酸取代、插入或缺失。包括变异的Fc结构域的分子相对于包括野生型Fc结构域的分子通常具有改变的表型。变异的表型可表现为改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的易感性或改变的效应子功能，如在NK依赖性或巨噬细胞依赖性试验中测定的。鉴定为改变效应子功能的Fc结构域修饰是本领域已知的，包括增加与激活受体(例如，FcγRIIA(CD16A)结合的修饰和降低与抑制受体(例如，FcγRIIB(CD32B)结合的修饰(见，例如，Stavenhagen,J.B.等(2007)“Fc Optimization OfTherapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In VitroAnd Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating FcgammaReceptors,”Cancer Res.57(18):8882-8890)。具有y与CD32B降低的结合和/或与CD16A增加的结合的人IgG1 Fc结构域的示例性变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可以任何组合出现在人IgG1 Fc结构域中。在一个实施方式中，人IgG1 Fc结构域变体包含F243L、R292P和Y300L取代。在另一实施方式中，人IgG1 Fc结构域变体包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一实施方式中，人IgG1 Fc结构域变体包含N297Q取代、L234A和L235A取代或D265A取代，因为这些突变消除了FcR结合。
III.本发明的三特异性结合分子的例证：具有结合CD3和CD8的表位和结合疾病相关的抗原的表位的结合结构域的三特异性结合分子
如上述，本发明尤其涉及这样的三特异性结合分子的实施方式，其中选择三个表位使得这样的表位中的一个或两个是免疫系统细胞的表位(一个或多个)，尤其是细胞毒性淋巴细胞免疫系统细胞(CTL)的表位(一个或多个)，并且，其中剩余的表位(一个或多个)是疾病相关的抗原的表位(一个或多个)。在这样的三特异性结合分子的尤其优选的实施方式中，选择这样的分子的结合结构域使得表位I、表位II或表位III是CD3的表位，表位I、表位II或表位III的第二个是CD8的表位，和表位I、表位II或表位III的第三个是疾病相关的抗原的表位，其中这样的三特异性结合分子的结合结构域I、II和III介导细胞毒性T细胞和表达疾病相关抗原的细胞的配位结合。这样的三特异性结合分子能够将细胞毒性淋巴细胞定位至表达疾病相关的抗原的细胞，和从而利于杀伤表达疾病相关的抗原的细胞。疾病相关的抗原可以是癌症抗原，或可以是特征为病原体(例如，细菌、真菌、病毒或原生动物)感染的抗原。更具体地，本发明涉及这样的三特异性结合分子，其能够介导与以下的配位结合：(1)CD3的表位、(2)CD8的表位和(3)疾病相关的抗原的表位。通过结合CD3和CD8和结合疾病相关的抗原，这样的分子将细胞毒性T细胞共定位至呈递疾病相关的抗原的细胞，导致这样的T细胞的激活和针对表达疾病相关的抗原的细胞的细胞毒性应答的启动。
抗CD3或抗CD8抗体的重链可被采用作为本发明这样的示例性三特异性结合分子的第三多肽链。同样地，这样的抗体的轻链可被采用作为本发明的三特异性结合分子的第四多肽链。可选地，这样的抗体的轻链可变结构域和/或重链可变结构域可结合其他免疫球蛋白恒定区以获得这样的第三和第四多肽链。因此，这样的抗体可用于产生本发明的三特异性结合分子，其位点C能够结合CD3或CD8。
类似地，这样的可变结构域可并入到本发明的三特异性结合分子的第一和第三多肽的可变结构域部分，从而产生本发明的三特异性结合分子，其位点A能够结合CD3或CD8，或其位点B能够结合CD3或CD8。
1.示例性抗CD3抗体
可采用下面提供的任何示例性抗CD3或抗CD8抗体制备本发明的三特异性结合分子的CD3或CD8结合结构域。
OKT3
OKT3轻链可变结构域(SEQ ID NO:17)(CDR以下划线显示)：
OKT3重链可变结构域(SEQ ID NO:18)(CDR以下划线显示)：
M291
M291轻链可变结构域(SEQ ID NO:19)(CDR以下划线显示)：
M291重链可变结构域(SEQ ID NO:20)(CDR以下划线显示)：
YTH12.5
YTH12.5轻链可变结构域(SEQ ID NO:21)(CDR以下划线显示)：
YTH12.5重链可变结构域(SEQ ID NO:22)(CDR以下划线显示)：
人源化的抗CD3抗体1(“CD3 mAb 1”)(US2014/0099318A1)
CD3 mAb 1轻链可变结构域(SEQ ID NO:23)变体1(CDR以下划线显示)：
CD3 mAb 1轻链可变结构域(SEQ ID NO:24)变体2(CDR以下划线显示)：
CD3 mAb 1重链可变结构域(SEQ ID NO:25)变体1(CDR以下划线显示)：
人源化的抗CD3抗体2(“CD3 mAb 2”)(US2014/0099318A1)
CD3 mAb 2轻链可变结构域(SEQ ID NO:26)(CDR以下划线显示)：
CD3 mAb 2重链可变结构域(SEQ ID NO:27)(CDR以下划线显示)：
CD3 mAb 2重链可变结构域D65G变体(SEQ ID NO:28)(CDR以下划线显示)：
2.示例性抗CD8抗体
OKT8(“CD8 mAb 1”)
OKT8轻链可变结构域(SEQ ID NO:29)(CDR以下划线显示)：
OKT8重链可变结构域(SEQ ID NO:30)(CDR以下划线显示)：
TRX2(“CD8 mAb 2”)
TRX2轻链可变结构域(SEQ ID NO:31)(CDR以下划线显示)：
TRX2重链可变结构域(SEQ ID NO:32)(CDR以下划线显示)：
3.结合疾病相关的抗原的表位的示例性结合结构域
(a)HIV gp41
示意性疾病相关的抗原是HIV gp41。示例性gp41抗体是7B2(“HIV mAb 1”)。
7B2轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:35)：
7B2重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:36)：
(b)HIV gp120
第二示意性疾病相关的抗原是HIV gp120。示例性gp120抗体是A32(“HIV mAb2”)。
A32 VL轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)：
A32 VH重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:34)：
(c)RSV糖蛋白F
另外的示意性疾病相关的抗原是RSV糖蛋白F。示例性抗RSV糖蛋白F抗体是帕利珠单抗(“RSV mAb 1”)。
帕利珠单抗轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:37)：
帕利珠单抗重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:38)：
(d)B7-H3
尤其优选的示意性疾病相关的抗原是B7-H3，其在各种癌症细胞上表达(例如，成神经细胞瘤、胃癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等)。已经在肿瘤细胞系中免疫组织学检测到B7-H3蛋白质表达(Chapoval,A.等(2001)“B7-H3:A Costimulatory Molecule For T CellActivation and IFN-γProduction,”Nature Immunol.2:269–274；Saatian,B.等(2004)“Expression Of Genes For B7-H3And Other T Cell Ligands By Nasal EpithelialCells During Differentiation And Activation,”Amer.J.Physiol.LungCell.Mol.Physiol.287:L217–L225；Castriconi等(2004)“Identification Of 4Ig-B7-H3As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From AnNK Cell-Mediated Lysis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)101(34):12640-12645)；Sun,M.等(2002)“Characterization of Mouse and Human B7-H3Genes,”J.Immunol.168:6294-6297)。已经在心脏、肾、睾丸、肺、肝、胰腺、前列腺、结肠和成骨细胞细胞中发现了mRNA表达(Collins,M.等(2005)“The B7Family Of Immune-Regulatory Ligands,”Genome Biol.6:223.1-223.7)。在蛋白质水平，在人肝、肺、膀胱、睾丸、前列腺、乳房、胎盘和淋巴器官中发现B7-H3(Hofmeyer,K.等(2008)“The Contrasting Role Of B7-H3,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)105(30):10277-10278)。结合B7-H3的示意性抗体包括人源化的“BRCA84D”、“BRCA69D”和“PRCA157”(WO 2011/109400)。示例性轻链和重链可变链具有下述序列(CDR以下划线显示)：
示例性人源化的BRCA84D-5VL轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:39)：
示例性人源化的BRCA84D-2VH重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:40)：
示例性BRCA69D(“B7-H3 mAb 1”)轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:41)：
示例性BRCA69D(“B7-H3 mAb 1”)重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:42)：
示例性PRCA157轻链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:43)：
示例性PRCA157重链可变结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)：
(e)A33肿瘤抗原
A33肿瘤抗原是另一示意性疾病相关的抗原。示例性人源化的抗A33抗体(“gpA33mAb 1”)的轻链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:45)：
这样的示例性人源化的抗A33(gpA33 mAb 1)抗体的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:46)：
(f)5T4肿瘤抗原
5T4肿瘤抗原是另一示意性疾病相关的抗原。示例性人源化的抗5T4 mAb 1抗体(“5T4 mAb 1”)的轻链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:47)：
这样的示例性人源化的5T4 mAb 1的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ IDNO:48)：
第二示例性人源化的5T4 mAb 1抗体(“5T4 mAb 2”)的轻链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:49)：
这样的第二示例性人源化的5T4 mAb 2的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQID NO:50)：
(g)ROR1抗原
ROR1肿瘤抗原是另一示意性疾病相关的抗原。示例性抗ROR1抗体包括抗体2A2(WO2010/124188)、R11(WO 2012/075158)和R12(WO 2012/075158)。
2A2抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:53)：
2A2抗体的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:54)：
R11抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:55)：
R11抗体的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:56)：
R12抗体的轻链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:57)：
R12抗体的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:58)：
本发明的一个方面(下面详细讨论)提供了更优选的人源化的抗ROR1抗体(“ROR1mAb 1”)。该更优选的ROR1 mAb 1的轻链可变结构域具有序列(SEQ ID NO:51)：
这样的更优选的人源化的ROR1 mAb 1的重链可变结构域的氨基酸序列是(SEQ IDNO:52)：
IV.结合位点：位点A、位点B和位点C的选择
如上述，本发明优选的三特异性结合分子至少是三特异性的，其具有“外部”双抗体型结合结构域(位点A)，其距离结合结构域III最远；“内部”双抗体型结合结构域(位点B)，其距离结合结构域III最近；和结合结构域III本身(位点C)。如本文所使用，三特异性结合分子比如“X/Y/Z”的描述指示X结合结构域是在位点A，Y结合结构域是在位点B和Z结合结构域是在位点C。例如，三特异性结合分子命名“B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1”指示B7-H3 mAb 1可变结构域占据三特异性结合分子的位点A，CD3 mAb 2可变结构域占据位点B和CD8 mAb 1可变结构域占据三特异性结合分子的位点C。
本发明因此允许选择这样的位点中的哪一个用于结合具体的期望的表位。指导这样选择的一个因素，尤其结合CD3、CD8和疾病相关的抗原的三特异性结合分子，涉及考虑胞啃(trogocytosis)的作用和对其的期望。“胞啃”是细胞可获取一部分接触细胞的细胞膜的过程(Masuda,S.等(2013)“Possible Implication Of FcγReceptor-MediatedTrogocytosis In Susceptibility To Systemic Autoimmune Disease,”Clin.Dev.Immunol.2013:文章ID 345745，6页)；Dhainaut,M.等(2014)“Regulation ofImmune Reactivity by Intercellular Transfer,”Front Immunol.5:112；Ahmed,K.A.等(2011)“Mechanisms Of Cellular Communication Through Intercellular ProteinTransfer,”J.Cell.Mol.Med.15(7):1458-1473；Ahmed,K.A.等(2008)“IntercellularTrogocytosis Plays An Important Role In Modulation Of Immune Responses,”Cell.Mol.Immunol.5(4):261-269；LeMaoult,J.等(2007)“Exchanges Of MembranePatches(Trogocytosis)Split Theoretical And Actual Functions Of Immune Cells,”Hum.Immunol.68(4):240-243；Caumartin.J.等(2006)“Intercellular Exchanges OfMembrane Patches(Trogocytosis)Highlight The Next Level Of Immune Plasticity,”Transpl.Immunol.17(1):20-22)。
通过胞啃采集相关的I类MHC配体诱导细胞毒性T淋巴细胞成为“获取的Treg”细胞，其介导杀伤(“残杀”)其他细胞毒性T细胞，从而有助于清除CD8+细胞(D’Acquisto,F.等(2011)“CD3+CD4–CD8–(Double Negative)T Cells:Saviours Or Villains Of The ImmuneResponse？”Biochem.Pharmacol.82:333-340；Joly,E.等(2003)“What Is TrogocytosisAnd What Is Its Purpose？”Nat.Immunol.4:815-；Hudrisier,D.等(2007)“Capture OfTarget Cell Membrane Components Via Trogocytosis Is Triggered By A SelectedSet Of Surface Molecules On T Or B Cells,”J.Immunol.178:3637-3647)。
本发明的具备CD3结合结构域作为其位点C位置的三特异性结合分子具有抗CD3抗体的属性，并且类似地具备CD8结合结构域作为其位点C位置的这样的三特异性结合分子具有抗CD8抗体的属性。已经显示具有结合抗CD8抗体(已经结合T细胞的CD8分子)的Fc结构域的Fc受体的嗜中性粒细胞、单核细胞或巨噬细胞能够经胞啃将抗体和结合的CD8分子从T细胞转移至其本身并且然后能够快速内化抗体；旁观者(bystander)分子，比如TCR和CD3也可在该过程中转移(Masuda,S.等，(2013)“Possible Implication of Fcg Receptor-Mediated Trogocytosis in Susceptibility to Systemic Autoimmune Disease,”Clin.Develop.Immunol.2013:文章ID 345745，6页)。
CD3和CD8的结构不同在于CD3靠近细胞膜，而CD8进一步从细胞膜伸展。因此预期，CD3通过抗CD3抗体的Fc受体胞啃比CD8通过抗CD8抗体的Fc受体胞啃更有效。
该现象指示，CD3结合结构域位于位点C位置上的结合CD3、CD8和疾病相关的抗原的本发明的三特异性结合分子将展示比CD3结合结构域位于位点A或位点B上的类似三特异性结合分子更少的细胞毒性。因此，通过选择将CD3结合结构域布置于位点C位置上(与位点A或B相反)，可调节细胞毒性的程度。另外，可使包含“位点C”和“位点A(或B)”CD3的混合物的药学组合物复合(compound)，以便获得优选程度的细胞毒性。
V.抗ROR1 mAb 1抗体
如上述，本申请的一个方面提供了极其优选的人源化的抗ROR1抗体(“ROR1 mAb1”)，其轻链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:51)：
和其重链可变结构域具有氨基酸序列(SEQ ID NO:52)：
这样的ROR1 mAb 1抗体的轻链可变结构域的CDRL1、CDRL2和CDRL3的序列是：
轻链可变结构域CDRL1(SEQ ID NO:117)：TLSSGHKTDTID
轻链可变结构域CDRL2(SEQ ID NO:118)：LEGSGSY
轻链可变结构域CDRL3(SEQ ID NO:119)：GTDYPGNYL
这样的ROR1 mAb 1抗体的重链可变结构域的CDRH1、CDRH2和CDRH3的序列是：
重链可变结构域CDRH1(SEQ ID NO:120)：GFTFSDYYMS
重链可变结构域CDRH2(SEQ ID NO:121)：TIYPSSGKTYYADSVKG
重链可变结构域CDRH3(SEQ ID NO:122)：DSYADDAALFDI
ROR1 mAb 1抗体介导增加的细胞毒性并且相对于现有技术抗ROR1抗体(例如，抗ROR1抗体R12)免疫原性较小。
本发明不仅仅包括这样的序列，而也包括完整的ROR1 mAb 1抗体衍生物(包括其嵌合或人源化的衍生物)，其具有这样的轻链可变结构域的CDR中的1、2或3个(SEQ ID NO:51，CDR以下划线显示)或这样的重链可变结构域的CDR中的1、2或3个(SEQ ID NO:52；CDR以下划线显示)，并且其免疫特异性结合ROR1。更优选地，这样被包括的抗体、嵌合抗体和人源化的抗体具有这样的轻链可变结构域的CDR中的1、2或3个(SEQ ID NO:51，CDR以下划线显示)并且也具备这样的重链可变结构域的CDR中的1、2或3个(SEQ ID NO:52；CDR以下划线显示)，并且免疫特异性结合ROR1。最优选地，这样被包括的抗体、嵌合抗体和人源化的抗体具有这样的轻链可变结构域的所有3个CDR，和这样的重链可变结构域的所有3个CDR，并且能够免疫特异性结合ROR1。
本发明另外包括这样被包括的ROR1 mAb 1抗体的片段和衍生物，包括Fab、Fab’、F(ab’)2Fv)、单链(ScFv)，“DARTTM”双抗体分子，其突变体、天然存在的变体和融合蛋白，其均包括轻链可变结构域CDR中的1、2或3个、或重链可变结构域CDR中的1、2或3个、或轻链可变结构域CDR中的1、2或3个以及重链可变结构域CDR中的1、2或3个，并且其能够免疫特异性结合ROR1。
在优选的实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物可具有变异的Fc结构域。Fc结构域的修饰通常导致改变的表型，例如改变的血清半衰期、改变的稳定性、改变的对细胞酶的易感性或改变的效应子功能。就效应子功能而言，可期望修饰本发明抗体，以便增强例如抗体治疗癌症的效力。在某些情况下，例如在作用机制涉及阻断或拮抗但是不杀伤携带靶抗原的细胞的抗体的情况下，期望降低或消除效应子功能。当针对非期望的细胞，比如肿瘤和外源细胞时，通常期望增加效应子功能，其中FcγRs以低水平表达，例如，具有低水平FcγRIIB的肿瘤特异性B细胞(例如，非霍奇金淋巴瘤、CLL和伯基特淋巴瘤)。在所述实施方式中，具有赋予的或增强效应子功能活性的本发明的分子可用于治疗和/或预防其中期望增强效应子功能活性的效力的疾病、病症或感染。
在某些实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物包括对Fc结构域氨基酸的一个或多个修饰，其降低这样的分子的Fc结构域对一个或多个FcγR受体的亲和性和抗体亲抗原性。在其他实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物可包括对Fc结构域的氨基酸的一个或多个修饰，其增加这样的分子的Fc结构域对一个或多个FcγR受体的亲和性和抗体亲抗原性。在其他实施方式中，分子包括变异的Fc结构域，其中所述变异相对于不包括Fc结构域或包括野生型Fc结构域的分子赋予或介导增加的ADCC活性和/或对FcγRIIA增加的结合。在可选的实施方式中，分子包括变异的Fc结构域，其中所述变异相对于不包括Fc结构域或包括野生型Fc结构域的分子，赋予或介导降低的ADCC活性(或其他效应子功能)和/或对FcγRIIB增加的结合。
在一些实施方式中，本发明包括这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物，其包括变异的Fc结构域，所述变异的Fc结构域相对于包括野生型Fc结构域的可比较的分子不显示对任何FcγR的可检测的结合。在其他实施方式中，本发明包括这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物，其包括变异的Fc结构域，所述变异的Fc结构域仅仅结合单个FcγR，优选地FcγRIIA、FcγRIIB，或FcγRIIIA中之一。
这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物可包括对激活和/或抑制Fcγ受体的改变的亲和力。在一个实施方式中，抗体或分子包括变异的Fc结构域，其相对于具有野生型Fc结构域的可比较的分子，对于FcγRIIB具有增加的亲和性和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的亲和性。在另一实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物可包括变异的Fc结构域，其相对于具有野生型Fc结构域的可比较的分子，对于FcγRIIB具有降低亲和性和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有增加的亲和性。在又另一实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物包括变异的Fc结构域，其相对于具有野生型Fc结构域的可比较的分子，对于FcγRIIB具有降低的亲和性和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的亲和性。在仍另一实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物可包括变异的Fc结构域，其相对于具有野生型Fc结构域的可比较的分子，对于FcγRIIB具有不变亲和性和对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA具有降低的(或增加)亲和性。
在某些实施方式中，本发明包括这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物，其包括变异的Fc结构域，具有对于FcγRIIIA和/或FcγRIIA改变的亲和性，使得免疫球蛋白具有增强的效应子功能，例如，ADCC。效应细胞功能的非限制性例子包括ADCC，抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)、吞噬、调理作用、调理吞噬、细胞结合、莲座(rosetting)、C1q结合和CDC。
在优选的实施方式中，相对于包括野生型Fc结构域的可比较的分子，亲和性或效应子功能的改变是至少2倍，优选地至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在本发明的其他实施方式中，相对于包括野生型Fc结构域的分子，变异的Fc结构域以至少65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、225％或250％更大的亲和性特异性结合一个或多个FcR。这样的测量可以是体内或体外试验，并且，在优选的实施方式中，是体外试验比如ELISA或表面等离子共振试验。
在不同的实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段或衍生物包括变异的Fc结构域，其中所述变异激动(agonize)FcγR受体的至少一种活性，或拮抗FcγR受体的至少一种活性。在优选的实施方式中，分子包括变体，其激动(或拮抗)FcγRIIB的一个或多个活性，例如，B细胞受体介导的信号传导、B细胞的激活、B细胞增殖、抗体产生、B细胞的细胞内钙流入、细胞周期进程、FcγRIIB介导的FcεRI信号传导的抑制、FcγRIIB的磷酸化、SHIP募集、SHIP磷酸化和与Shc的缔合，或激动(或拮抗)FcγRIIB信号转导途径中一个或多个下游分子(例如，MAP激酶、JNK、p38或Akt)的活性。在另一实施方式中，分子包括变体，其激动(或拮抗)FcεRI的一个或多个活性，例如，肥大细胞激活、钙动员、脱粒、细胞因子产生或血清素释放。
在某些实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段包括来自两个或更多个IgG同种型(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的包含Fc结构域的结构域。各种IgG同种型展示不同的物理和功能特性，包括血清半衰期，补体活化，FcγR结合亲和力和效应子功能活性(例如ADCC、CDC等)，原因是它们铰链和/或Fc结构域的氨基酸序列的差异，例如如在以下文献中描述的：Flesch,B.K.和Neppert,J.(1999)“Functions Of The Fc Receptors ForImmunoglobulin G,”J.Clin.Lab.Anal.14:141-156；Chappel,M.S.等(1993)“Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A GeneticallyEngineered Human IgG Antibody,”J.Biol.Chem.33:25124-25131；Chappel,M.S.等(1991)“Identification Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In HumanIgG Through The Use Of Recombinant IgG1/IgG2 Hybrid And Point-MutatedAntibodies,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:9036-9040；Brüggemann,M.等(1987)“Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using AMatched Set Of Chimeric Antibodies,”J.Exp.Med 166:1351-1361。该类型的变异的Fc结构域可单独使用，或结合氨基酸修饰使用，以影响Fc介导的效应子功能和/或结合活性。氨基酸修饰和IgG铰链/Fc结构域的组合可展示类似的功能(例如，对于FcγRIIA的增加的亲和性)并且可另外地或，更优选地，协同作用，以相对于本发明包括野生型Fc结构域的分子，修饰本发明分子的效应子功能。在其他实施方式中，氨基酸修饰和IgG Fc结构域可展示相反的功能(例如，分别增加和降低对于FcγRIIA的亲和性)并且可用于相对于本发明不包括Fc结构域或包括相同同种型的野生型Fc结构域的分子，选择性调和或降低本发明分子的特定功能。
在优选的具体实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段包括变异的Fc结构域，其中所述变异的Fc结构域相对于野生型Fc结构域包括至少一个氨基酸修饰，使得分子具有对于FcR改变的亲和性，前提是所述变异的Fc结构域基于Fc-FcR相互作用的晶体学和结构分析比如Sondermann,P.等(2000)“The 3.2-A Crystal Structure Of The HumanIgG1 Fc Fragment-Fc GammaRIII Complex,”Nature 406:267-273中公开的那些，在直接接触FcγR的位置没有取代。Fc结构域中直接接触FcγR的位置的例子是氨基酸残基234-239(铰链结构域)、氨基酸残基265-269(B/C环)、氨基酸残基297-299(C’/E环)和氨基酸残基327-332(F/G环)。在一些实施方式中，本发明的分子包括变异的Fc结构域，其包括基于结构和晶体学分析不直接接触FcγR——例如不在Fc-FcγR结合位点中——的至少一个残基的修饰。
变异的Fc结构域是本领域熟知的，并且和任何已知的Fc变体可在本发明中使用，以赋予或修饰这样的ROR1 mAb 1抗体或包括Fc结构域(或其部分)的它们的片段展示的效应子功能，如在功能上分析的，例如，在NK依赖性或巨噬细胞依赖性试验中。例如，鉴定为改变效应子功能的Fc结构域变体公开在下述文献中：PCT公开号WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707、WO 2008/140603，并且其中公开的任何适当的变体可用于本分子。
在某些实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段包括变异的Fc结构域，其在一个或多个位点中具有一个或多个氨基酸修饰，所述修饰(一个或多个)改变(相对于野生型Fc区)变异Fc区与激活FcγR(诸如FcγRIIA或FcγRIIIA)相对于抑制性FcγR(诸如FcγRIIB)的亲和性比：
在Fc变体的亲和力的比大于1的情况下，本发明的方法在提供期望增强FcγR介导的效应细胞功能(例如，ADCC)的效力的疾病、病症或感染——例如，癌症或感染疾病——的治疗性或预防性治疗或改善其症状方面尤其有用，。在Fc变体的亲和力的比小于1的情况下，本发明的方法在提供期望降低FcγR介导的效应细胞功能的效力疾病或病症——例如，自身免疫或炎症病症——的治疗性或预防性治疗或改善其症状方面尤其有用。表3根据它们的亲和力的比是否大于或小于1列举了示例性单、双、三、四和五个突变，并且有关这些突变的更多信息可见PCT公开号WO 04/063351、WO 06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707、WO 2008/140603。
在具体的实施方式中，在变异的Fc结构域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：235、240、241、243、244、247、262、263、269、298、328，或330，和优选地一个或多个下述残基：A240、I240、L241、L243、H244、N298、I328或V330。在不同的具体实施方式中，在变异的Fc结构域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：268、269、270、272、276、278、283、285、286、289、292、293、301、303、305、307、309、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439，和优选地一个或多个下述残基：H280、Q280、Y280、G290、S290、T290、Y290、N294、K295、P296、D298、N298、P298、V298、I300或L300。
在优选的实施方式中，在以改变的亲和性结合FcγR的变异的Fc结构域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、309、312、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438或439。优选地，变异的Fc结构域具有任何下述残基：A256、N268、Q272、D286、Q286、S286、A290、S290、A298、M301、A312、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、N326、S326、K330、T339、A333、A334、E334、H334、L334、M334、Q334、V334、K335、Q335、A359、A360或A430。
在不同的实施方式中，在以降低的亲和性结合FcγR(经其Fc结构域)的变异的Fc结构域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：252、254、265、268、269、270、278、289、292、293、294、295、296、298、300、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439。
在不同的实施方式中，在以增强的亲和性结合FcγR(经其Fc结构域)的变异的Fc结构域中，任何氨基酸修饰(例如，取代)在下述任何位置：280、283、285、286、290、294、295、298、300、301、305、307、309、312、315、331、333、334、337、340、360、378、398，或430。在不同的实施方式中，在以增强的亲和性结合FcγRIIA的变异的Fc结构域中，任何下述残基：A255、A256、A258、A267、A268、N268、A272、Q272、A276、A280、A283、A285、A286、D286、Q286、S286、A290、S290、M301、E320、M320、Q320、R320、E322、A326、D326、E326、S326、K330、A331、Q335、A337或A430。
优选的变体包括在下述任何位置的一个或多个修饰：228、230、231、232、233、234、235、239、240、241、243、244、245、247、262、263、264、265、266、271、273、275、281、284、291、296、297、298、299、302、304、305、313、323、325、326、328、330或332。
尤其优选的变体包括选自A-AI组的一个或多个修饰:
仍更尤其优选的变体包括选自1-105组的一个或多个修饰:
在一个实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段包括变异的Fc结构域，其在Fc结构域中具有至少一个修饰。在某些实施方式中，变异的Fc结构域包括选自下述的至少一个取代：L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L，其中所述编号是如在Kabat中的EU索引的编号。在具体的实施方式中，变异的Fc结构域包括：
(A)选自下述的至少一个取代：F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；
(B)选自下述的至少两个取代：
(1)F243L和P396L；
(2)F243L和R292P；和
(3)R292P和V305I；
(C)选自下述的至少三个取代：
(1)F243L、R292P和Y300L；
(2)F243L、R292P和V305I；
(3)F243L、R292P和P396L；和
(4)R292P、V305I和P396L；
(D)选自下述的至少四个取代：
(1)F243L、R292P、Y300L和P396L；和
(2)F243L、R292P、V305I和P396L；或
(E)选自下述的至少五个取代：
(1)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L；和
(2)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L。
在另一具体的实施方式中，变异的Fc结构域包括下述取代：
(A)F243L、R292P和Y300L；
(B)L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L；或
(C)F243L、R292P、Y300L、V305I和P396L。
在其他实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段可具有本领域已知的任何Fc变体，比如下述文献中公开那些：Jefferis,R.等(2002)“Interaction Sites OnHuman IgG-Fc For FcgammaR:Current Models,”Immunol.Lett.82:57-65；Presta,L.G.等(2002)“Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function,”Biochem.Soc.Trans.30:487-90；Idusogie,E.E.等(2001)“Engineered Antibodies WithIncreased Activity To Recruit Complement,”J.Immunol.166:2571-75；Shields,R.L.等(2001)“High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For FcGamma RI,Fc Gamma RII,Fc Gamma RIII,And FcRn And Design Of IgG1Variants WithImproved Binding To The Fc gamma R,”J.Biol.Chem.276:6591-6604；Idusogie,E.E.等(2000)“Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan,A Chimeric Antibody With AHuman IgG Fc,”J.Immunol.164:4178-84；Reddy,M.P.等(2000)“Elimination Of FcReceptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4Monoclonal AntibodyTo Human CD4,”J.Immunol.164:1925-1933；Xu,D.等(2000)“In Vitro Characterizationof Five Humanized OKT3Effector Function Variant Antibodies,”Cell.Immunol.200:16-26；Armour,K.L.等(1999)“Recombinant human IgG Molecules Lacking FcgammaReceptor I Binding And Monocyte Triggering Activities,”Eur.J.Immunol.29:2613-24；Jefferis,R.等(1996)“Modulation Of Fc(Gamma)R And Human ComplementActivation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions,”Immunol.Lett.54:101-04；Lund,J.等(1996)“Multiple Interactions Of IgG With Its Core OligosaccharideCan Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I AndInfluence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains,”J.Immunol.157:4963-4969；Hutchins等(1995)“Improved Biodistribution,Tumor Targeting,And ReducedImmunogenicity In Mice With A Gamma 4Variant Of Campath-1H,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)92:11980-84；Jefferis,R.等(1995)“Recognition SitesOn Human IgG For Fc Gamma Receptors:The Role Of Glycosylation,”Immunol.Lett.44:111-17；Lund,J.等(1995)“Oligosaccharide-Protein InteractionsIn IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors,”FASEB J.9:115-19；Alegre,M.L.等(1994)“A Non-Activating"Humanized"Anti-CD3Monoclonal AntibodyRetains Immunosuppressive Properties In Vivo,”Transplantation 57:1537-1543；Lund等(1992)“Multiple Binding Sites On The CH2Domain Of IgG For Mouse FcGamma R11,”Mol.Immunol.29:53-59；Lund等(1991)“Human Fc Gamma RI And Fc GammaRII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG,”J.Immunol.147:2657-2662；Duncan,A.R.等(1988)“Localization Of The Binding Site For The HumanHigh-Affinity Fc Receptor On IgG,”Nature 332:563-564；美国专利号5,624,821、5,885,573、6,194,551、7,276,586；和7,317,091；和PCT公开WO 00/42072和PCT WO 99/58572。
在一些实施方式中，这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段可进一步包括一个或多个糖基化位点，以便一个或多个碳水化合物部分共价连接至分子。优选地，相比未修饰的ROR1 mAb 1抗体或片段，在Fc结构域具有一个或多个糖基化位点和/或一个或多个修饰的这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段赋予或具有增强的抗体介导效应子功能，例如，增强的ADCC活性。在一些实施方式中，本发明进一步包括这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段，其包括一个或多个已知直接或间接与Fc结构域的碳水化合物部分相互作用的氨基酸修饰，包括但不限于在下述位置的氨基酸：241、243、244、245、245、249、256、258、260、262、264、265、296、299和301。直接或间接与Fc结构域的碳水化合物部分相互作用的氨基酸是本领域已知的，见，例如，Jefferis,R.等(1995)“Recognition Sites On Human IgG For FcGamma Receptors:The Role Of Glycosylation,”Immunol.Lett.44:111-17。
在另一实施方式中，本发明包括这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段，其已经通过将一个或多个糖基化位点引入分子的一个或多个位点而被修饰，优选地不改变分子的功能，例如，与靶抗原或FcγR的结合活性。糖基化位点可引入本发明分子的可变区和/或恒定区。如本文所使用，“糖基化位点”包括与寡糖(即，包含两个或更多个连接在一起的单糖的碳水化合物)特异性和共价连接的抗体中任何具体的氨基酸序列。寡糖侧链通常经N-或O-键连接至抗体的骨架。N-连接的糖基化指寡糖部分连接至天冬酰胺残基的侧链。O-连接的糖基化指寡糖部分连接至羟基氨基酸，例如，丝氨酸、苏氨酸。这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段可包括一个或多个糖基化位点，包括N-连接和O-连接的糖基化位点。本领域已知的用于N-连接的或O-连接的糖基化的任何糖基化位点可根据本发明使用。示例性N-连接的糖基化位点是氨基酸序列：Asn-X-Thr/Ser，其中X可以是任何氨基酸和Thr/Ser指示苏氨酸或丝氨酸。这样的一个或多个位点可使用本发明所属领域熟知的方法引入本发明的分子(见例如，In vitro Mutagenesis,Recombinant DNA:A Short Course,J.D.Watson等W.H.Freeman and Company,New York,1983,第8章,106-116页，其通过引用以其整体并入本文。用于将糖基化位点引入这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段的示例性方法可包括：修饰或突变分子的氨基酸序列从而获得期望的Asn-X-Thr/Ser序列，或表达具有这样序列的编码ROR1 mAb 1抗体的核酸分子。
在一些实施方式中，本发明包括通过添加或删除糖基化位点，修饰这样的ROR1mAb 1抗体或它们的片段的碳水化合物含量的方法。修饰抗体(和包括抗体结构域，例如Fc结构域，的分子)的碳水化合物含量的方法是本领域熟知的，并且包括在本发明内，见，例如，美国专利号6,218,149、EP 0 359 096 B1；美国公开号US 2002/0028486、WO 03/035835、美国公开号2003/0115614、美国专利号6,218,149、美国专利号6,472,511；其所有均通过引用以其整体并入本文。在其他实施方式中，本发明包括通过删除分子的一个或多个内源碳水化合物部分而修饰这样的ROR1 mAb 1抗体或它们的片段的碳水化合物含量的方法。在具体的实施方式中，本发明包括通过修饰临近297的位置而移动抗体Fc结构域的糖基化位点。在具体的实施方式中，本发明包括修饰296位以便296位而不是297位被糖基化。
可通过比如下面描述的那些技术修饰效应子功能：PCT公开号WO 04/063351、WO06/088494、WO 07/024249、WO 06/113665、WO 07/021841、WO 07/106707、WO 2008/140603，或通过其他方式。例如，可在Fc结构域中引入半胱氨酸残基(一个或多个)，从而允许在该区域中的链间二硫键形成，导致产生可具有改善的内化能力和/或增强的补体介导的细胞杀伤和ADCC的同二聚抗体。见Caron,P.C.等(1992)“Engineered Humanized Dimeric FormsOf IgG Are More Effective Antibodies,”J.Exp.Med.176:1191-1195；Shopes,B.(1992)“A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity,”J.Immunol.148(9):2918-2922。也可使用如Wolff,E.A.等(1993)“Monoclonal AntibodyHomodimers:Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice,”Cancer Research 53:2560-2565中描述的异双官能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚抗体。可选地，抗体可被工程化，其具有双Fc结构域并且可从而具有增强的补体分解和ADCC能力(Stevenson,G.T.等(1989)“A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains(bisFabFc)Prepared ByManipulations At The IgG Hinge,”Anti-Cancer Drug Design 3:219-230)。
CDR残基的单个氨基酸改变可导致丧失功能的结合的事实(Rudikoff,S.等。(1982)“Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)79(6):1979-1983)提供了系统鉴定可选的功能CDR序列的手段。在用于获得这样的变异CDR的一个优选方法中，对编码CDR的多核苷酸进行诱变(例如经随机诱变或通过位点定向方法(例如，用编码突变的基因座的引物进行聚合酶链介导的扩增))，以产生具有取代的氨基酸残基的CDR。通过比较原始(功能)CDR序列的相关残基的同一性(identity)与取代的(非功能)变体CDR序列的同一性，可鉴定该取代的BLOSUM62.iij取代分数。BLOSUM系统提供了通过分析用于可信比对的序列的数据库而产生的氨基酸取代的矩阵(Eddy,S.R.(2004)“Where Did The BLOSUM62Alignment Score Matrix ComeFrom？,”Nature Biotech.22(8):1035-1036；Henikoff,J.G.(1992)“Amino acidsubstitution matrices from protein blocks,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)89:10915-10919；Karlin,S.等(1990)“Methods For Assessing The Statistical Significance OfMolecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)87:2264-2268；Altschul,S.F.(1991)“Amino AcidSubstitution Matrices From An Information Theoretic Perspective,”J.Mol.Biol.219,555-565。目前，最先进的BLOSUM数据库是BLOSUM62数据库(BLOSUM62.iij)。表4显示了BLOSUM62.iij取代分数(分数越高取代越保守，因此取代越可能不影响功能)。例如，如果包括所得CDR的抗原结合片段不能结合ROR1，那么BLOSUM62.iij取代分数视为不足够保守，并且选择和产生具有更高取代分数的新的候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(E)，和非功能取代残基是组氨酸(H)，那么BLOSUM62.iij取代分数是0，并且更高保守的改变(比如对天冬氨酸盐、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸的改变)是优选的。
本发明因此考虑使用随机诱变鉴定改善的CDR。噬菌体展示技术可选地用于增加(或降低)CDR亲和性。称为亲和力成熟(affinity maturation)的该技术采用诱变或“CDR步移(walking)”，并且重新选择使用靶抗原或其抗原片段鉴定具有当与初始或亲代抗体比较时，以更高(或更低)亲和性结合抗原的CDR的抗体(见，例如Glaser等(1992)J.Immunology149:3903)。使整个密码子而不是单个核苷酸进行诱变导致氨基酸突变的半随机的库(repertoire)。可构建由变异克隆的库组成的文库，所述变异克隆每个通过在单一CDR中的单个氨基酸改变而不同，并且其包含表示对于每个CDR残基的每个可能的氨基酸取代的变体。可通过使固定的突变体接触标记抗原来筛选对于抗原具有增加的(或降低的)结合亲和力的突变体。本领域已知的任何筛选方法可用于鉴定对于抗原具有增加的或降低的亲和性的突变抗体(例如，ELISA)(见Wu等1998,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)95:6037；Yelton等，1995,J.Immunology 155:1994)。可能使用使轻链随机化的CDR步移(见，Schier等,1996,J.Mol.Bio.263:551)。
完成这种亲和力成熟的方法描述在例如下述中：Krause,J.C.等(2011)“AnInsertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture EnhancesFunction Of A Human Antibody,”MBio.2(1)pii：e00345-10.doi:10.1128/mBio.00345-10；Kuan,C.T.等(2010)“Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB RecombinantImmunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas,”Int.J.Cancer 10.1002/ijc.25645；Hackel,B.J.等(2010)“Stability And CDR Composition Biases EnrichBinder Functionality Landscapes,”J.Mol.Biol.401(1):84-96；Montgomery,D.L.等(2009)“Affinity Maturation And Characterization Of A Human MonoclonalAntibody Against HIV-1gp41,”MAbs 1(5):462-474；Gustchina,E.等(2009)“AffinityMaturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2Loop Of A Monoclonal FabDerived From A Synthetic Human Antibody Library And Directed AgainstThe Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41Yields A Set Of Fabs With ImprovedHIV-1Neutralization Potency And Breadth,”Virology 393(1):112-119；Finlay,W.J.等(2009)“Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGETherapy:Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of MutationalPlasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions,”J.Mol.Biol.388(3):541-558；Bostrom,J.等(2009)“Improving Antibody BindingAffinity And Specificity For Therapeutic Development,”Methods Mol.Biol.525:353-376；Steidl,S.等(2008)“In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSFAntibodies By Targeted CDR-Diversification,”Mol.Immunol.46(1):135-144；和Barderas,R.等(2008)“Affinity maturation of antibodies assisted by in silicomodeling,”Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)105(26):9029-9034。作为例子，可用选择的ROR1mAb 1抗体涂覆多孔板(例如，碳酸盐缓冲液中100ng/孔，在室温下2hrs)和随后用1/10稀释的可溶性ROR1温育并且在室温下温育16小时或在PBS-T-BSA中稀释至50ng/ml的浓度(0.05ml添加至每个孔并且在室温下温育至少2h)。然后冲洗板，并且然后添加在PBS-T-BSA中以0.5μg/ml开始的重组抗体的稀释物，并且在室温下温育1小时。然后使用，例如，抗人IgG-HRP缀合物和TMB底物测量重组抗体与捕获的抗原的结合。在使用稀释硫酸停止显色之后，在450nM下读取板并且鉴定更高的亲和性抗体(见，例如，美国专利号7,351,803)。
VI.药学组合物
在一个实施方式中，本发明包括用于治疗特征在于存在疾病相关的抗原的癌症或疾病的药学组合物。这样的组合物包括用于制造药学组合物的散装药物组合物(例如，不纯的或非无菌组合物)和可用于制备单位剂型的药学组合物(即，适于施用至受试者或患者的组合物)。这样的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的修饰双抗体，或这样的剂和药学上可接受的载体的组合。优选地，本发明的组合物包括预防或治疗有效量的本发明的一种或多种分子和药学上可接受的载体。本发明也包括药学组合物和药学上可接受的载体，所述药学组合物包括这样修饰的双抗体和对具体的疾病抗原具有特异性的第二治疗性抗体。
如本文所使用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”表示获得有益的或期望的结果的途径，所述有益的或期望的结果包括并且优选地是有益的或期望的临床结果。这样的有益的或期望的临床结果包括但不限于下述的一个或多个：减少(或破坏)受感染细胞或其他患病的细胞的增殖、减轻由于疾病产生的症状，提高遭受疾病的那些的生活质量、减少治疗疾病需要的其他药物治疗的剂量、延迟疾病的进展，和/或延长陪伴(companion)动物接受者的生存。
在具体的实施方式中，术语“药学上可接受的”表示被联邦或国家政府的管理机构批准，或列举在美国药典中或其他通常认可的用于动物，尤其是人的药典中(见，例如，Remington:The Science和Practice of Pharmacy(2012)Allen,Loyd V.,Jr。.(Ed.)22ndEdition,Pharmaceutical Press,London UK)。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全的和不完全的)、赋形剂或利用其施用治疗剂的媒介。这样的药学载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、蔬菜或合成起源的那些，比如花生油、大豆油、矿物质油、芝麻油等。当静脉内施用药学组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖和丙三醇溶液可也可用作液体载体，尤其用于可注射的溶液。适当的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、丙三醇、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果期望，组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可为下述形式：溶液、悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等。
一般而言，分别或以单位剂型混合在一起来提供本发明组合物的成分，例如，在密封容器比如指示活性剂的量的安瓿或袋(sachette)中作为干燥冻干粉末或无水浓缩物。在组合物通过输注施用的情况下，其可用包含无菌药学级的水或盐水的输注瓶进行分配。在通过注射施用组合物的情况下，可提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿，从而可混合成分然后施用。
本发明的组合物可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于用阴离子形成的那些，比如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和用阳离子形成的那些，比如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
本发明也提供了药学包装或试剂盒，其包括一个或多个包含本发明修饰的双抗体——单独的或结合这样的药学上可接受的载体——的容器。另外，用于治疗疾病的一种或多种其他预防剂或治疗剂可也包括在药学包装或试剂盒中。本发明也提供了药学包装或试剂盒，其包括填充本发明的药学组合物的一种或多种成分的一个或多个容器。任选地与这样的容器(一个或多个)结合的可以是监管药物制剂或生物制品的制造、使用或售卖的政府管理局规定的形式的公告(notice)，该公告反映管理局对用于人施用的制造、使用或售卖的批准。
本发明提供了可用于上述方法的试剂盒。在一个实施方式中，试剂盒包括本发明的一种或多种分子。在另一实施方式中，试剂盒进一步包括用于治疗特征在于存在疾病相关的抗原的癌症或疾病一种或多种其他预防剂或治疗剂，其在一个或多个容器中。在另一实施方式中，试剂盒进一步包括结合一个或多个疾病相关的抗原的一种或多种抗体或双抗体。在某些实施方式中，其他预防剂或治疗剂是化疗剂。在其他实施方式中，预防剂或治疗剂是生物或激素治疗剂。
VII.产生本发明的三特异性结合分子的方法
本发明的三特异性结合分子最优选地通过重组表达编码这样的多肽的核酸分子产生，如本领域熟知的。
本发明的多肽可便利地使用固相肽合成而被方便地制备(Merrifield,B.(1986)“Solid Phase Synthesis,”Science 232(4748):341-347；Houghten,R.A.(1985)“GeneralMethod For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides:Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual AminoAcids,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)82(15):5131-5135；Ganesan,A.(2006)“Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century,”Mini Rev.Med.Chem.6(1):3-10)。
可选地，可使用本领域已知的任何方法重组制备和表达抗体。可如下重组制备抗体：首先分离从宿主动物制备的抗体、获得基因序列和使用基因序列在宿主细胞(例如，CHO细胞)中重组表达抗体。可采用的另一方法是在植物(例如，烟草)或转基因奶中表达抗体序列。已经公开了在植物或奶中重组表达抗体的适当的方法(见，例如，Peeters等(2001)“Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,”Vaccine 19:2756；Lonberg,N.等(1995)“Human Antibodies From Transgenic Mice,”Int.Rev.Immunol 13:65-93；和Pollock等(1999)“Transgenic Milk As A Method For The Production OfRecombinant Antibodies,”J.Immunol Methods 231:147-157)。制备抗体衍生物，例如，嵌合的、人源化的，单链的等的适当的方法是本领域已知的。在另一可选方案中，抗体可通过噬菌体展示技术重组制备(见，例如，美国专利号5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter,G.等(1994)“Making Antibodies By Phage Display Technology,”Annu.Rev.Immunol.12.433-455)。
可通过Edman降解法对感兴趣的抗体或蛋白质测序，所述Edman降解法对于本领域技术人员是熟知的。由质谱或Edman降解法产生的肽信息可用于设计探针或引物，其被用于克隆感兴趣的蛋白质。
克隆感兴趣的蛋白质的可选的方法是通过使用纯化蛋白质或其部分“淘洗”表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。“淘洗”程序可如下述：从在第二细胞类型中表达或过表达期望的cDNA的组织或细胞获得cDNA文库，和筛选特异性结合期望蛋白质的第二细胞类型的转染的细胞。用于通过“淘洗”克隆编码细胞-表面蛋白质的哺乳基因的方法的详细描述可见于现有技术(见，例如，Aruffo,A.等(1987)“Molecular Cloning Of A CD28cDNA By AHigh-Efficiency COS Cell Expression System,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84:8573-8577和Stephan,J.等(1999)“Selective Cloning Of Cell Surface ProteinsInvolved In Organ Development:Epithelial Glycoprotein Is Involved In NormalEpithelial Differentiation,”Endocrinol.140:5841-5854)。
可根据现有技术的标准方法通过从具体的细胞类型逆转录mRNA获得编码抗体和其他肽激动剂、拮抗剂和调谐剂的cDNA。具体而言，可使用各种裂解酶或化学溶液根据上文Sambrook等阐释的程序分离mRNA，或通过商业上可得的核酸-结合树脂根据制造商提供的伴随说明书提取mRNA(例如，Qiagen,Invitrogen,Promega)。然后将合成的cDNA引入表达载体，以在第二类型细胞中产生感兴趣的抗体或蛋白质。暗示表达载体在宿主细胞中必须是可复制的——作为游离体(episome)或作为染色体DNA的不可缺少的部分。适当的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体，包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和黏粒。
包含感兴趣的多核苷酸的载体可通过许多适当的方式中的任意方式被引入宿主细胞，所述适当方式包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质进行转染；微弹轰击(microprojectile bombardment)；脂转染；和感染(例如，在载体是感染剂比如牛痘病毒的情况下)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
任何能够过表达异源DNA的宿主细胞均可用于分离编码感兴趣的抗体、多肽或蛋白质的基因的目的。适当的哺乳宿主细胞的非限制性例子包括但不限于COS、HeLa和CHO细胞。优选地，相比于宿主细胞中相应的感兴趣的内源抗体或蛋白质(如果存在)，宿主细胞以高约5倍，更优选地高10倍，更优选地高20倍、更优选地高50倍或更优选地高100倍的水平表达cDNA。优选地通过免疫试验或FACS实现对特异性结合期望的蛋白质的宿主细胞的筛选。由此可鉴定过表达感兴趣的抗体或蛋白质的细胞。
各种技术也是可用的，其现在可用以产生突变肽激动剂、拮抗剂和调谐剂，其相对于亲代肽激动剂、拮抗剂或调谐剂分子编码所得蛋白质的氨基酸序列中的添加、缺失或改变。
本发明包括对本发明的三特异性结合分子的修饰和具有增强的或降低的活性的变体，所述修饰不显著影响它们的特性。多肽的修饰是现有技术的常规实践。修饰的多肽的例子包括具有氨基酸残基的保守取代的多肽，不显著不利改变功能活性的氨基酸的一个或多个缺失或添加，或使用化学类似物。可彼此保守取代的氨基酸残基包括但不限于：甘氨酸/丙氨酸；缬氨酸/异亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；丝氨酸/苏氨酸；赖氨酸/精氨酸；和苯丙氨酸/酪氨酸。这些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻译后修饰的多肽，比如例如用不同糖的糖基化、乙酰化和磷酸化。优选地，氨基酸取代是保守的，即，取代的氨基酸应具备与原始氨基酸类似的化学特性。这样的保守取代是本领域已知的，并且上面已经提供了例子。氨基酸修饰的范围可从改变或修饰一个或多个氨基酸到区域，比如可变结构域的完全重新设计(redesign)。可变结构域的改变可改变结合亲和力和/或特异性。修饰的其他方法包括使用本领域已知的偶联技术，包括但不限于酶促方式、氧化取代和螯合作用。修饰可用于，例如，连接用于免疫试验的标签，比如连接用于放射免疫分析的放射性部分。使用现有技术确立的程序制备修饰的多肽并且可使用本领域已知的标准试验筛选。
本发明也包括融合蛋白，其包括来自本发明多肽和抗体的一个或多个片段或区域。在一个实施方式中，提供融合多肽，其包括可变轻链区的至少10个连续氨基酸和可变重链区的至少10个氨基酸。在另一实施方式中，融合多肽包含异源免疫球蛋白恒定区。在另一实施方式中，融合多肽包含由公共保藏的杂交瘤产生的抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域。为了本发明的目的，抗体融合蛋白包含一个或多个多肽结构域和在天然分子中未连接的另一氨基酸序列，例如，来自另一区域的异源序列或同源的序列，所述多肽结构域特异性结合期望的病毒表位或期望的免疫效应细胞的激活受体或表达这样的激活受体的免疫效应细胞表面上存在的蛋白质。
本发明包括多肽，其包括本发明抗体的氨基酸序列。本发明的多肽可通过本领域已知的程序制备。可如下产生多肽：抗体的蛋白酶解或其他降解、如上述的重组方法(即，单个或融合多肽)或化学合成。抗体的多肽，尤其多达约50个氨基酸的短多肽，便利地通过化学合成制备。化学合成的方法是本领域已知的并且是商业上可得的。例如，这样的多肽可通过采用固相方法的自动多肽合成仪产生。
VIII.本发明的组合物的用途
本发明包括组合物，包括药学组合物，其包括本发明的三特异性结合分子、源自这样的分子的多肽、包括编码这样的分子或多肽的序列的多核苷酸和如本文所描述的其他剂。
本发明的三特异性结合分子能够协同结合三个表位，因此主要用于诊断、化学分离和与这样的表位相关的疗法。例如，这样的分子可在夹心免疫测试中用作试剂。
在这样的三特异性结合分子结合疾病相关的抗原的表位的实施方式中，这样的分子可用于治疗与这样的疾病相关抗原的表达相关或特征在于这样的疾病相关抗原的表达的疾病或病况。因此，不受限制的，包括这样的分子的药学组合物可用于诊断或治疗癌症和由病原体(例如，细菌、真菌、病毒或原生动物)感染造成的疾病。
IX.施用方法
通过向受试者施用有效量的药学本发明的组合物，本发明的组合物可被提供用于治疗、预防和改善与疾病、病症或感染相关的一个或多个症状。在优选的方面中，这样的组合物基本上是纯化的(即，基本上不含限制其作用或产生非期望的副作用的物质)。在具体的实施方式中，受试者是动物，优选哺乳动物比如非灵长类(例如，牛、马、猫科动物、犬科动物、啮齿动物等)或灵长类(例如，猴比如，食蟹猴、人等)。在优选的实施方式中，受试者是人。
各种递送系统是已知的并且可用于施用本发明的组合物，例如，封装在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达抗体或融合蛋白的重组细胞、受体介导的内吞作用(见，例如，Wu等(1987)“Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNACarrier System,”J.Biol.Chem.262:4429-4432)，构建作为逆转录病毒或其他载体一部分的核酸等。
施用本发明的三特异性结合分子的方法包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在具体的实施方式中，肌内、静脉内或皮下施用本发明的分子。可通过任何方便的途径施用组合物，例如，通过输注或丸剂注射，通过经上皮或黏膜皮肤被覆(lining)(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可也采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有气雾化试剂的制剂。见，例如，美国专利号6,019,968、5,985，320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346和WO 99/66903，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
本发明也使得本发明的三特异性结合分子可包装在密封容器比如指示这样的分子的量的安瓿或袋中。在一个实施方式中，本发明的三特异性结合分子被供应作为密封容器中的干燥灭菌冻干粉末或无水浓缩物并且可，例如，用水或盐水重构至适当的浓度用于施用至受试者。优选地，本发明的三特异性结合分子被供应作为密封容器中的干燥无菌冻干粉末，单位剂量为至少5μg，更优选地至少10μg、至少15μg、至少25μg、至少50μg、至少100μg或至少200μg。
本发明的冻干的三特异性结合分子应在它们的原始容器中在2和8℃之间储存并且分子应在重构之后的12小时内，优选地6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在可选的实施方式中，本发明的三特异性结合分子以液体形式供应在指示分子、融合蛋白或缀合分子的量和浓度的密封容器中。优选地，液体形式的本发明的三特异性结合分子被供应在密封容器中，其中分子存在的浓度为至少1μg/ml，更优选地至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。
如本文所使用，在一个实施方式中，“有效量”的药学组合物是足够实现有益的或期望的结果的量，包括但不限于临床结果比如减轻由于疾病造成的症状、减轻感染的症状(例如，病毒量、发烧、疼痛，脓毒症等)或癌症的症状(例如，癌细胞的增殖、肿瘤存在、肿瘤转移等)，从而提高遭受疾病的那些的生活质量、减少治疗疾病需要的其他药物的剂量、加强另一药物的作用——比如经靶向和/或内化、延迟疾病的进展和/或延长个体的生存。
有效量可在一次或多次施用中施用。为了本发明的目的，有效量的药物、化合物或药学组合物是这样的量：所述量足够直接或间接减少病毒存在的增殖(或作用)和减轻和/或延迟病毒疾病的发展。在一些实施方式中，有效量的药物、化合物或药学组合物可能或不能实现结合另一药物、化合物或药学组合物。因此，“有效量”可在施用一种或多种化疗剂的背景下考虑，并且如果结合一种或多种其他试剂，期望的结果可以或得以实现，则单个试剂可视为以有效量给予。尽管个体需要不同，测定每种组分的有效量的最佳范围仍在现有技术的范围内。对于抗体施用，典型的剂量包括在0.1-至100mg/kg/体重之间的一个或多个单位剂量。
有效治疗、预防或改善与病症相关的一个或多个症状的本发明的三特异性结合分子的量可通过标准临床技术来测定。制剂中采用的精确剂量也取决于施用的途径和病况的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况决定。有效的剂量可从源自体外或动物模型测试系统的剂量响应曲线外推。对于本发明的三特异性结合分子，施用至患者的剂量按受试者的体重计，通常至少约0.01μg/kg/天、至少约0.05μg/kg/天、至少约0.1μg/kg/天、至少约0.2μg/kg/天、至少约0.5μg/kg/天、至少约1μg/kg/天、至少约2μg/kg/天、至少约5μg/kg/天、至少约10μg/kg/天、至少约20μg/kg/天、至少约50μg/kg/天、至少约0.1mg/kg/天或更多。
优选地，施用至患者的剂量按受试者的体重计，在约0.01μg/kg/天和约0.1mg/kg/天之间，更优选地，约0.01μg/kg/天和约50μg/kg/天之间，更优选地，约0.01μg/kg/天和约50μg/kg/天之间，更优选地，约0.01μg/kg/天和约10μg/kg/天之间，更优选地，约0.01μg/kg/天和约1μg/kg/天之间，更优选地，约0.01μg/kg/天和约0.5μg/kg/天之间，和更优选地，约0.01μg/kg/天和约0.1μg/kg/天之间。施用本发明的三特异性结合分子的剂量和频率可通过修饰比如例如脂化增强三特异性结合分子的吸收和组织渗透而降低或改变。
在另一实施方式中，患者施用的治疗方案包括一个或多个剂量的本发明包括的这样的预防或治疗有效量的三特异性结合分子，其中治疗方案在2天、3天、4天、5天、6天或7天内施用。在某些实施方式中，治疗方案包括间歇地施用预防或治疗有效量的本发明包括的三特异性结合分子的剂量(例如，在给定周的第1天、第2天、第3天和第4天施用剂量并且在相同周的第5天、第6天和第7天不施用预防或治疗有效量的本发明包括的三特异性结合分子的剂量)。典型地，有1、2、3、4、5或更多个治疗疗程。每个疗程可以是相同的方案或不同的方案。
在另一实施方式中，施用的剂量在四分之一、二分之一或三分之二或四分之三的方案(一个或多个)内(例如，在4个治疗疗程的第一、第二、或第三方案内)内逐渐上升直到实现每日预防或治疗有效量的本发明包括的三特异性结合分子。
在一个实施方式中，可计算施用至患者的本发明的三特异性结合分子的剂量用作单一试剂疗法。在另一实施方式中，本发明的三特异性结合分子结合其他治疗性组合物使用，并且施用至患者的剂量比这样的三特异性结合分子用作单一试剂疗法时更低。
在具体的实施方式中，可期望局部施用本发明的药学组合物至需要治疗的区域；这可通过，但不限于例如如下方式实现：局部输注、通过注射、或通过植入体，所述植入体是多孔的、非多孔的、或胶状材料，包括膜，比如硅橡胶膜(sialastic)或纤维。优选地，当施用本发明的分子时，必须注意使用不吸收该分子的材料。
在另一实施方式中，组合物可在小泡，尤其是脂质体中递送(见Langer(1990)“NewMethods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)；Treat等，在Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer(传染病和癌症疗法中的脂质体)中，Lopez-Berestein和Fidler(eds.),Liss,New York,353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327页；一般见上)。
在又另一实施方式中，组合物可在控释或缓释系统中递送。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包括本发明的一个或多个分子的缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938；PCT公开WO 91/05548、PCT公开WO 96/20698；Ning等(1996)“IntratumoralRadioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等(1995)“Antibody MediatedLung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,”PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric CarriersFor A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“MicroencapsulationOf Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，其各通过引用以其整体并入本文。在一个实施方式中，泵可用于控释系统中(见Langer，同上；Sefton,(1987)“ImplantablePumps,”CRC Crit.Rev.Biomed.Eng.14:201-240；Buchwald等(1980)“Long-Term,Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion PumpIn Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis,”Surgery 88:507-516；和Saudek等(1989)“A Preliminary Trial Of The Programmable ImplantableMedication System For Insulin Delivery,”N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一实施方式中，聚合物材料可用于实现抗体的控释(见例如，Medical Applications ofControlled Release,Langer and Wise(eds.),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolenand Ball(eds.),Wiley New York(1984)；Levy等(1985)“Inhibition Of CalcificationOf Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,”Science 228:190-192；During等(1989)“Controlled Release Of Dopamine From APolymeric Brain Implant:In Vivo Characterization,”Ann.Neurol.25:351-356；Howard等(1989)“Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced MemoryDeficits,”J.Neurosurg.7(1):105-112)；美国专利号5,679,377、美国专利号5,916,597、美国专利号5,912,015、美国专利号5,989,463、美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253)。在缓释制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物(poly(ethylene-co-vinyl acetate))、聚(甲基丙烯酸)、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯基醇)、聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)、聚交酯(PLA)、聚交酯-乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯(polyorthoeste)。在又另一实施方式中，控释系统可放置在治疗性靶(例如，肺)附近，因此仅仅需要一部分全身性剂量(见，例如，Goodson,在MedicalApplications of Controlled Release中，同上，vol.2,pp.115-138(1984))。在另一实施方式中，根据Dunn等使用用作控释移植物的聚合组合物(见美国5,945,155)。该具体的方法基于来自聚合物系统的生物活性材料的原位-控释的疗效。植入可一般发生在患者需要治疗性治疗的身体内的任何地方。在另一实施方式中，使用非聚合物持续递送系统，由此受试者身体中的非聚合物植入物被用作药物递送系统。当植入身体时，植入物的有机溶剂将从组合物消散，分散或渗漏到周围组织流体中，并且非聚合材料逐渐凝聚或沉淀形成固体、多微孔基质(见美国5,888,533)。
Langer的综述(1990,“New Methods Of Drug Delivery,”Science 249:1527-1533)讨论了控释系统。本领域技术人员已知的任何技术可用于产生包括本发明的一种或多种治疗剂的缓释制剂。见，例如，美国专利号4,526,938；国际公开号WO 91/05548和WO96/20698；Ning等(1996)““Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human ColonCancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy&Oncology 39:179-189；Song等(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-CirculatingEmulsions,”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50:372-397；Cleek等(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody ForCardiovascular Application,”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24:853-854；和Lam等(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody For Local Delivery,”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24:759-760，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
在其中本发明的组合物是编码本发明的三特异性结合分子的核酸的情况下的具体实施方式中，通过将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并且施用其从而其变成是细胞内的，例如，通过使用逆转录病毒载体(见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；生物弹道技术(Biolistic)，Dupont)，或用脂质或细胞-表面受体或转染试剂涂覆，或通过将其连接至已知进入核的同源框样肽施用(见例如，Joliot等(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88:1864-1868)等，核酸可被体内施用以促进其编码的三特异性结合分子的表达。可选地，可以将核酸引入细胞内并通过同源重组整合到宿主细胞DNA中，以进行表达。
用治疗或预防性有效量的本发明的三特异性结合分子治疗受试者可包括单一治疗或，优选地，可包括一系列治疗。在优选的实施例中，受试者用本发明的分子每周治疗一次，持续约1至10周，优选地2至8周，更优选地约3至7周，甚至更优选地持续约4、5或6周。在其他实施方式中，每天一次、每天两次或每天三次施用本发明的药学组合物。在其他实施方式中，每周一次、每周两次、每两周一次、每月一次、每六周一次、每两个月一次、每年两次或每年一次施用药学组合物。也认识到用于治疗的有效剂量的分子可在具体的治疗疗程内增加或降低。
现已经大体上描述了本发明，通过参考下述实施例其更容易理解。这样的实施例通过示例的方式提供，并且不旨在限制本发明，除非另外指出。
实施例1
示例性抗CD3、抗CD8、抗B7-H3三特异性结合分子的产生和特性
为了开发展示对CD8+ T细胞更大特异性和更有效的重定向杀伤的治疗性分子，构建具有能够协同结合CD3、CD8和疾病相关的抗原的三特异性结合分子。产生的三特异性结合分子另外具备Fc结构域，以增强三特异性结合分子体内的半衰期。三特异性结合分子的通式结构显示在图4A–4D中。构建了对疾病相关的抗原B7-H3特异性的示例性三特异性结合分子。三特异性结合分子称为B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb1，以表示三特异性结合分子中结合结构域的相关位置。B7-H3结合结构域占据位点A位置，CD3结合结构域占据位点B位置和CD8结合结构域占据位点C位置(图4A)。B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表5)。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:59)：
在第一多肽链中，VL(B7-H3 mAb 1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:41，VH(CD3 mAb2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:27，E-螺旋具有氨基酸序列SEQ ID NO:3和(CH2-CH3)具有SEQ ID NO:7的“携带杵的”氨基酸序列的氨基酸序列。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:60)：
在第二多肽链中，VL(CD3 mAb 2)具有氨基酸序列SEQ ID NO:26，VH(B7-H3 mAb1)具有氨基酸序列SEQ ID NO:42，和K-螺旋具有氨基酸序列SEQ ID NO:4。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:61)：
在第三多肽链中，采用的CD8 mAb 1重链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ IDNO:30的氨基酸序列、铰链结构域、CH1结构域和“携带臼的”CH2-CH3结构域，其具有H435R取代，以去除蛋白A结合位点(SEQ ID NO:8)。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:62)：
在第四多肽链中，采用CD8 mAb 1轻链可变结构域的氨基酸序列具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列和κ轻链恒定结构域。
将表达的B7H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子载入到MSA树脂上，用10mM NaPO4(pH6)；10mM NaPO4、1M NaCl(pH6)和10mM NaPO4(pH6)冲洗。用50mM甘氨酸(pH3)从树脂洗脱多肽，并且用1M Tris(pH8)中和。发现表达是1.7mg/L；三特异性结合分子制剂是0.6mg/ml，具有的终产量为0.42mg。
比较B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的特性与具有Fc结构域的B7-H3 X CD3 DART和B7-H3 X CD3 DART的特性。如图5A-5B中显示，B7-H3 mAb 1/CD3mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子相比具有Fc结构域的B7-H3 X CD3 DART和B7-H3 XCD3 DART显示类似的靶细胞结合(A498细胞(图5A)；JIMT-1(图5B))。但是，如图5C-5D中显示，B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子相比CD4+ T细胞显示对CD8+ T细胞的大大提高的结合。
为了显示本发明的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子介导重定向杀伤靶细胞的能力，在存在T细胞和JIMT-1或A498靶细胞的情况下温育这样的分子。JIMT-1细胞是曲妥珠单抗抗性癌系(Tanner,M.等(2004)“Characterization Of A NovelCell Line Established From A Patient With Herceptin-Resistant Breast Cancer,”Mol.Cancer Ther.3(12):1585-1592)。A498细胞系是肾细胞癌细胞系(Gogh,J.(1978)“Cultivation,Characterization,And Identification Of Human Tumor Cells WithEmphasis On Kidney,Testis,And Bladder Tumors,”Natl.Cancer Inst.Monogr.49:5-9)。如图6A-6C中显示，观察到了对靶细胞的重定向杀伤。出人意料地，这些杀伤实质上比针对具有Fc结构域的相应的B7-H3 X CD3 DART和B7-H3 X CD3 DART观察到的杀伤更有效。观察的重定向杀伤总结在表6中。
图7A-7D显示了B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子在用JIMT-1细胞温育之后介导T细胞激活的能力。图8A-8D显示了B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子在用A498细胞温育之后介导T细胞激活的能力。在两种情况下，这样的激活出人意料地优于用具有Fc结构域的可比较的B7-H3 X CD3 DARTTM和B7-H3 X CD3 DARTTM观察的激活。表7总结了EC50结果。
表达的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子使用CD8+效应细胞相比CD4+效应细胞展示大得多的(13倍)溶细胞活性。相比DARTTM，使用‘全’T细胞作为效应子，B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子也展示大大增加的(85倍)总体效力。
实施例2
CD8结合结构域对重定向的细胞毒性的作用
为了评估CD8特异性的作用，利用不同CD8抗体可变结构域序列构建针对疾病相关的抗原B7-H3特异性的第二个三特异性结合分子。B7-H3可变结构域特异性和CD3可变结构域特异性与用于构建B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的那些相同。三特异性结合分子称为B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2并且由四条不同的多肽链组成(表8)。
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:63)：
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:64)：
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:65)：
B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:66)：
为了比较B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1(结构和序列如上述)或B7-H3 mAb1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子结合T细胞的能力，用Ficoll纯化健康的供体的人PBMC，用PBS冲洗两次，并且再悬浮在包含10％人AB血清的FACS缓冲液中，并且在室温下温育20分钟，使细胞旋降(spin down)并且将4x 106细胞/mL细胞再悬浮在FACS缓冲液中。50μl连续滴定的B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1或B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb2三特异性结合分子或DARTTM(具有Fc结构域的B7-H3 X CD3或B7-H3 X CD3)被添加至96孔深板的孔中。然后将包含0.01％氮化钠的FACS缓冲液中50μL(4x 106细胞/mL)的充分混合的细胞添加至相应的孔并且使用移液管充分混合。在暗处2-8℃下温育板约45分钟。温育结束时，通过添加300μL的FACS缓冲液至每个孔冲洗细胞两次，在1,200rpm下使板离心5分钟，并丢弃上清液。在包含0.01％氮化钠的FACS缓冲液中，将细胞小球再悬浮在1:500稀释的PE缀合山羊抗人Fcγ、CD5-APC和CD4-PerCP5.5的100μL混合物中，并且在暗处2-8℃下温育约45分钟。温育结束时，用FACS缓冲液冲洗细胞，再悬浮，并且用BD Caliber流式细胞仪进行分析。将细胞门控(gated)至CD5+CD4+(图9A)或CD5+CD4–(图9B)。相比具备或缺少CD8特异性的结合分子，在CD5+CD4–群体上观察差别染色。
比较B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的细胞毒性与B7-H3mAb1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的细胞毒性。采用荧光素酶试验和LDH试验。两个试验的结果一致。两个三特异性结合分子在存在激活CD8+ T细胞或全T细胞群的情况下造成等同的重定向的细胞毒性。相比B7H3 X CD3 DART，具有CD8 mAb 1结合结构域的三特异性结合分子在存在CD8+细胞群或全T细胞的情况下展示更大的重定向的细胞毒性(图10A-10C)。
相比B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子，对于B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子也观察到CD8+对CD4+效应细胞的EC50的增加(60倍)。对于B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子，当全T细胞用作效应细胞时，观察导致大于100倍的EC50下降的增加的效力。
实施例3
结构域位置对重定向的细胞毒性的作用
为了评估三特异性结合分子中给定结合结构域(CD3、CD8和疾病相关抗原)的位置(位点A、位点B和位点C)的作用，构建了数个另外的三特异性结合分子。表9显示了具有各种结合结构域(CD3、CD8和疾病相关的抗原)的三特异性结合分子和位置(位点A、位点B和位点C)。
上面描述了B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的结构和序列。对于另外两个三特异性结合分子(CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1和B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2)，B7-H3可变结构域特异性，CD3可变结构域特异性和CD8可变结构域特异性与用于构建B7-H3 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的那些相同。CD3mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表10)。
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:67)：
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:68)：
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:69)：
CD3 mAb 2/CD8 mAb 1/B7-H3 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:70)：
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表11)。
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:71)：
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:72)：
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:73)：
B7-H3 mAb 1/CD8 mAb 1/CD3 mAb 2三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:74)：
该研究的结果显示在图11A-11C、图12A-12C、图13A-13E和表26中。图11A-11C和图12A-12C独立地显示了将CD3结合结构域放置在三特异性结合分子的位点C降低了分子的细胞毒性。图13A-13E显示了观察到该降低的细胞毒性，无论是采用CD4+、CD8+还是全T细胞。
如图14A-14B中所显示，在位点C布置CD3结合结构域，大大降低了与CD5+CD4+细胞(图14A)和CD5+CD4–细胞(图14B)二者的结合。但是，注意，无论CD3结合结构域的布置如何，所有的三特异性结合分子均能够介导重定向的细胞毒性。
实施例4
示例性抗CD3，抗CD8，抗5T4三特异性结合分子的产生和特性
构建了对疾病相关的抗原5T4特异性的另外的示例性三特异性结合分子。5T4 mAb2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表12)。
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:75)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:76)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:77)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:78)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表13)。
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:79)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:80)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:81)：
5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:82)：
如上述表达和纯化5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子。比较这两个三特异性结合分子结合CD5+/CD4+门控和CD5+/CD4-门控人PBMC的能力与具有Fc结构域的5T4 X CD3 DART的那些的能力。如图15A-15B中显示，相比CD4+ T细胞(图15A)，5T4/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和5T4/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子显示对CD8+ T细胞的大大增加的结合(图15B)。
为了显示5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和5T4 mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子介导重定向杀伤靶细胞的能力，这样的分子在存在T细胞和JIMT-1靶细胞的情况下被温育。如图16A-16C中所显示，观察到了靶细胞的重定向杀伤。如上述对于B7-H3三特异性结合分子观察到的，相比对于包含Fc结构域的相应5T4 X CD3 DART观察到的，杀伤实质上更有效。同样地，如对于B7-H3三特异性结合分子观察到的，使用不同的CD8可变结构域对5T4三特异性结合分子重定向CD8+ T细胞至靶细胞的能力没有作用。也发现5T4mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子非常有活性，并且使用CD8+对CD4+效应细胞显示更大的CTL活性(23倍更低的EC50)。相比5T4 X CD3 DARTTM，使用全T细胞效应子，5T4mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子为22倍更有效，并且5T4 mAb 2/CD3 mAb2/CD8 mAb 2三特异性结合分子是25倍更有效。
实施例5
示例性抗CD3、抗CD8、抗ROR1三特异性结合分子的特性
构建了对疾病相关的抗原ROR1具有特异性的另外示例性三特异性结合分子。ROR1mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表14)。
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:83)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:84)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:85)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:86)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表15)。
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:87)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:88)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:89)：
ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:90)：
比较ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子的特性与包含Fc结构域的ROR1 X CD3 DARTTM的特性。使用来自结合ROR-1抗原的抗ROR1单克隆抗体ROR1 mAb 1的Fv序列构建DARTTM和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子。
两个ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子和DART在CTL试验中都针对JIMT1-luc和A549靶细胞是有活性的。但是，ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子用CD8+ T细胞和全T细胞效应子展示明显增加的活性。
使用荧光素酶试验和LDH试验测量ROR1 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和ROR1 mAb1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 2三特异性结合分子介导重定向杀伤靶细胞的能力。在两种情况下，观察到了重定向杀伤。图17A-17C显示对靶细胞的重定向杀伤，如使用荧光素酶试验测量的。结果总结在表16中。
实施例6
示例性抗CD3、抗CD8、抗Env三特异性结合分子的特性
构建对疾病相关的抗原HIV(gp140抗原)具有特异性的另外示例性三特异性结合分子。HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表17)。
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:91)：
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子多肽的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:92)：
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:93)：
HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:94)：
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子由四条不同的多肽链组成(表18)。
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:95)：
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:96)：
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:97)：
HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:98)：
制备具有够结合人免疫缺陷病毒(HIV)的gp140抗原的结合结构域的三特异性结合分子(即，HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子)。
作为初始步骤，评估HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1和HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的能力。0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.4)中2μg/ml的JR-FL菌株gp140蛋白质被涂布在固体载体上，然后用三特异性结合分子温育(开始浓度为5μg/ml，随后1:2进行连续稀释)。试验结束时，用包含3％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)阻断结合。使用其已经缀合辣根过氧化物酶(HRP)的抗人IgG，通过ELISA(pico(ThermoScientific-Pierce)检测结合。试验也与固定的人CD3(2μg/ml)一起使用，以便评估分子结合CD3的能力。发现两个三特异性结合分子能够结合可溶的、固定的gp140蛋白质(图18A)和结合人CD3(图18B)。进行夹心ELISA，以证明三特异性结合分子能够配位结合gp140和CD3二者。为了该目的，0.2M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.4)中的2μg/ml的JR-FL菌株gp140蛋白质被涂布在固体载体上，然后用三特异性结合分子温育(开始浓度为5μg/ml，随后1:2进行连续稀释)。然后添加用生物素标记的人CD3(0.5μg/ml)。使用链霉抗生物素-HRP缀合物，通过ELISA(pico(ThermoScientific-Pierce)检测结合。图18C显示三特异性结合分子，其能够配位结合gp140和CD3二者。
发现三特异性结合分子能够结合表达HIV env蛋白质的细胞的表面。为了显示本发明的该方面，在多西环素诱导下表达HIV env的HEK293/D375细胞用三特异性结合分子温育。使用生物素化的抗人Fc抗体和链霉抗生物素-APC进行结合的检测。如图19A-19C中显示，发现与对照三特异性结合分子相反，两个三特异性结合分子都能够结合HEK293/D375细胞(图19C)。
为了显示这样的三特异性结合分子介导重定向杀伤HIV-感染细胞的能力，评估这样的分子结合PBMC的能力。用ACK裂解缓冲液裂解人血液，用PBS冲洗2X并且再悬浮在包含10％人AB血清的FACS缓冲液中，并且在室温下温育20分钟。其后，通过离心使细胞成小球，并且再悬浮(4x 106细胞/mL)在FACS缓冲液中。50μL的连续滴定的三特异性结合分子被添加至96孔深板的孔中。然后，将包含0.01％氮化钠的FACS缓冲液中50μL的细胞(4x 106细胞/mL)充分混合的细胞添加至相应的孔，并且使用移液管充分混合。在暗处2-8℃下温育板约45分钟。温育结束时，通过添加300μL的FACS缓冲液至每个孔冲洗细胞两次，板在1,200rpm下离心5分钟，并丢弃上清液。将细胞小球再悬浮于在包含0.01％氮化钠的FACS缓冲液中制备的山羊抗人IgG Fcγ-PE、CD5-APC和CD4-PerCP5.5的100μL混合物中，并且细胞在暗处2-8℃下温育约45分钟。温育结束时，冲洗细胞，用FACS缓冲液再悬浮，并且用BDCaliber流式细胞仪进行分析。如图20A-20B中所显示，发现三特异性结合分子展示对CD5+/CD4–细胞群体的特异性结合。
在存在或没有四环素的情况下，三特异性结合分子在37℃在存在表达HIV env的Jurkat 522 FY细胞和全T细胞的情况下温育24小时，并且使用LDH试验测量细胞毒性。如图21A-21F中显示，三特异性结合分子介导大量的细胞毒性。
使用纯化全T细胞和表达HIV env的Jurkat 522 FY细胞进行细胞毒性分析，并且测量活细胞的百分数。该分析的结果显示在图22A-22B中。
使用CD4+、CD8+或全T细胞，评估三特异性结合分子对表达HIV env的Jurkat 522FY细胞的CTL活性。针对HIV mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子，该评估的结果显示在图23A-23C中。针对HIV mAb 2/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子，该评估的结果显示在图24A-24C中。表19总结了结果。
评估不同比或靶：效应细胞的影响。表20总结了获得的结果。
使用CD4+、CD8+或全T细胞，也评估三特异性结合分子对表达HIV env的HEK293细胞的CTL活性。该评估的结果总结在表21中。
实施例7
CD3结合结构域亲和性变体的比较
如上述，本发明的三特异性结合分子的CD3、CD8或疾病相关的抗原结合结构域可以被突变，以便分离具有更期望的结合特征的结合结构域。使CD3 mAb 2结合结构域进行这样的诱变，并且分离两个亲和性变体(CD3 mAb 2 Low和CD3 mAb 2 Fast)。
抗人CD3 mAb 2 Low的可变轻链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:99)：
抗人CD3 mAb 2 Low的可变重链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:100)：
抗人CD3 mAb 2 Fast的可变轻链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:101)：
抗人CD3 mAb 2 Fast的可变重链结构域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:102)：
图25A-25C显示这些变体的结合的动力学。CD3 mAb 2 Low(图25A)是低亲和性变体，而CD3 mAb 2 Fast(图25B)相对于野生型CD3 mAb 2具有更快的解离速率(图25C)。
为了评估CD3结合特征的作用，使用两个CD3结合结构域突变体。利用野生型CD3mAb 2可变结构域序列、对于CD3具有低亲和性的CD3 mAb 2可变结构域序列和具有野生型亲和性但是更快的解离速率的CD3 mAb 2可变结构域序列构建了三个对疾病相关的抗原5T4具有特异性的三特异性结合分子。5T4可变结构域特异性和CD8可变结构域特异性在三个三特异性结合分子之间相同。第一个三特异性结合分子称为5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8mAb 1，并且由四条不同的多肽链组成(表22)。
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:103)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:104)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:105)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:106)：
第二个三特异性结合分子称为5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1，并且由四条不同的多肽链组成(表23)。
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:107)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:108)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:109)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:110)：
第三个三特异性结合分子称为5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1，并且由四条不同的多肽链组成(表24)。
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第一多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:111)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第二多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:112)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第三多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:113)：
5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的第四多肽链的氨基酸序列是(SEQ ID NO:114)：
如上述处理健康供体的人PBMC，并且用5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子和5T4 mAb 1/CD3mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子温育。5T4 X CD3 DARTTM(具有野生型、Low和FastCD3特异性)用作对照。5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子包含突变的CD3结合结构域，其展示对于CD3改变的亲和性和结合动力学。
相比DARTTM对照，发现三特异性结合分子展示对CD5+CD4+细胞更弱的结合(图26A)，但是对CD5+CD4–细胞更强的结合(图26B)。
使用LDH试验，图27A-27C显示CD3 mAb变体对5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的细胞毒性的作用。使用荧光素酶试验并且用使B7-H3结合结构域代替5T4mAb 1结合结构域的三特异性结合分子，获得类似的结果。结果显示，CD3 mAb 2 Low三特异性结合分子展示最小的细胞毒性，但是CD3 mAb 2 Fast三特异性结合分子用CD8+ T细胞和全T细胞比用CD4+ T细胞展示更大程度的细胞毒性。
为了评估三特异性结合分子对细胞因子特征的作用，在存在增加浓度的5T4 mAb1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子、5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子和5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的情况下温育来自两个供体的PBMC 24小时。测量六个细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-6，IL-4和IL-2)的水平。结果显示在图28A-28F(供体1)和图29A-29F(供体2)中。结果令人吃惊地显示，相比仅仅靶向CD3并且对CD8+ T细胞无选择性的DARTTM，从PBMC释放的细胞因子的急剧下降。
使用全T细胞作为效应子，5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子展示与DARTTM类似的效力，1pM EC50相比DARTTM的1.3pM。DARTTM的活性对于CD4+和CD8+ T细胞可能已经最大。三特异性结合分子的确使活性朝着CD8+群体偏移并且远离CD4+群体，就细胞因子释放，尤其是IL-2和TNFα而言，这是有益的。
尽管5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Low/CD8 mAb 1三特异性结合分子能够结合CD4+和CD8+ T细胞，但是相比非突变的CD3 mAb 2结合结构域，其重定向这些细胞的细胞溶解的能力或由这些细胞进行细胞溶解的能力大大降低。相比5T4 mAb 1/CD3 mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子(EC50的7倍差异)，5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子另一方面保持CTL活性，尤其用CD8+ T细胞相比/相对于CD4+ T细胞(EC50的75倍差异)。5T4 mAb 1/CD3 mAb 2 Fast/CD8 mAb 1三特异性结合分子的EC50与5T4 mAb 1/CD3mAb 2/CD8 mAb 1三特异性结合分子的类似(2.8对1.3pM)，但是CD8+对CD4+ T细胞靶向的显著不同实际上消除了用人PBMC培养中的5T4 X CD3 DARTTM观察的细胞因子释放。
实施例8
示例性三特异性结合分子的EC50数据总结
总之，构建了一系列的14种三特异性结合分子(表25)，每个具有两个双抗体型结合结构域(位点A和位点B)，和一个Fab型结合结构域(位点C):
这样的三特异性结合分子的EC50数据总结在表26中(靶细胞：JIMT1-luc；效应子：靶细胞比5:1)。在一些情况下(如表26中NR显示)，EC50可能无法从数据计算，因为未实现最大杀伤。
本说明书中提到的所有出版物和专利通过参考以如同每个出版物或专利申请具体和单独说明通过引用以其整体并入相同的程度并入本文。尽管已经结合其具体的实施方式描述了本发明，但是应当理解，其能够进一步修饰并且该申请旨在覆盖本发明的任何变型、用途或改编，所述变型、用途或改编大体上遵循本发明原则并且包括这样的与本公开的偏离，如同其在本发明所属领域的已知或常规实施范围内和如同其可应用于上文阐释的本质特征一样。
序列表
<110> 宏观基因股份有限公司
L•S•约翰逊
黄玲
G•齐齐李
K•沙哈
郭家颖
S•J•布尔克
刘丽勤
P•A•摩尔
E•波维尼
B•巴拉特
<120> 三特异性结合分子和其使用方法
<130> 1301.0114PCT
<150> US 62/107,824
<151> 2015-01-26
<150> US 62/008,229
<151> 2014-06-05
<150> US 62/004,571
<151> 2014-05-29
<160> 133
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头1
<400> 1
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的结构域 ("接头2")
<400> 2
Gly Gly Cys Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 3
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 4
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的接头肽("接头3")
<400> 5
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 6
<211> 219
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(218)
<223> 人野生型IgG CH2-CH3结构域
<400> 6
Ala Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
1 5 10 15
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
20 25 30
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
35 40 45
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
50 55 60
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
65 70 75 80
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
85 90 95
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
115 120 125
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
130 135 140
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
145 150 155 160
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
165 170 175
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
180 185 190
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
195 200 205
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 7
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "携带杵的" CH2-CH3结构域
<400> 7
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 8
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "携带臼的" IgG CH2-CH3结构域
<400> 8
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 9
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(98)
<223> 人IgG1 CH1结构域
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(15)
<223> 人IgG1铰链结构域
<400> 10
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 11
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 含有半胱氨酸的人CL结构域的部分
<400> 11
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> 含有半胱氨酸的人IgG铰链结构域的部分
<400> 12
Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 人IgG1 CL κ结构域
<400> 13
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 14
<211> 104
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(104)
<223> 人IgG1 CL λ2结构域
<400> 14
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
50 55 60
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
65 70 75 80
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
85 90 95
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 15
Ala Pro Ser Ser Ser
1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 16
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu
1 5
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> OKT3抗-CD3抗体轻链可变结构域
<400> 17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
100 105
<210> 18
<211> 192
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(192)
<223> OKT3抗-CD3抗体重链可变结构域
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
180 185 190
<210> 19
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> M291抗-CD3抗体轻链可变结构域
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Thr Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Asp Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 20
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> M291抗-CD3抗体重链可变结构域
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Ser Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 21
<211> 130
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(130)
<223> YTH12.5抗-CD3抗体轻链可变结构域
<400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Asn Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Leu Gly Ser Thr Val Lys Leu Ser Cys Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ile
35 40 45
Glu Asn Asn Tyr Val His Trp Tyr Gln Leu Tyr Glu Gly Arg Ser Pro
50 55 60
Thr Thr Met Ile Tyr Asp Asp Asp Lys Arg Pro Asp Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Ile Asp Arg Ser Ser Asn Ser Ala Phe Leu Thr
85 90 95
Ile His Asn Val Ala Ile Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys His Ser
100 105 110
Tyr Val Ser Ser Phe Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu Arg
130
<210> 22
<211> 138
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(138)
<223> YTH12.5抗-CD3抗体重链可变结构域
<400> 22
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Phe Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Thr Ile Ser Thr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Phe Arg Gln Tyr Ser Gly Gly Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-CD3 "mAb 1"轻链可变结构域变体1
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-CD3 "mAb 1"轻链可变结构域变体2
<400> 24
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-CD3 "mAb 1"重链可变结构域
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Ser
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Ala Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Pro Gln Val His Tyr Asp Tyr Asn Gly Phe Pro Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 26
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-CD3 "mAb 2"轻链可变结构域
<400> 26
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 27
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-CD3 "mAb 2"重链可变结构域
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 28
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-CD3 "mAb 2"重链可变结构域 D65G变体
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> OKT8抗-CD8抗体轻链可变结构域
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Asp Asn Ser Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Val Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> OKT8抗-CD8抗体重链可变结构域
<400> 30
Gln Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Phe Arg Tyr Thr Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> TRX2抗-CD8抗体轻链可变结构域
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> TRX2抗-CD8抗体重链可变结构域
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 110
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> A32抗-HIV gp120抗体轻链可变结构域
<400> 33
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile
85 90 95
His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 34
<211> 123
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(123)
<223> A32抗-HIV gp120抗体重链可变结构域
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ser Ser Ser Gly
20 25 30
Ala His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Gln His Thr Ser Glu Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Val Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Arg Thr Leu Arg Asn Ala Phe Asp Ile
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 113
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(113)
<223> 7B2抗-HIV gp41抗体轻链可变结构域
<400> 35
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg His Ser Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Met Arg Leu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Ser Ser His Pro Pro Thr Phe Gly His Gly Thr Arg Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 36
<211> 126
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(126)
<223> 7B2抗-HIV gp41抗体重链可变结构域
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Phe Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Lys Asn Gly Glu Tyr Ser Lys Tyr Ser Pro Ser Ser
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Val Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Leu Leu Gln Tyr Ile
100 105 110
Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(106)
<223> 帕利珠单抗抗-RSV 糖蛋白F抗体轻链可变结构域
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(120)
<223> 帕利珠单抗抗-RSV 糖蛋白F抗体重链可变结构域
<400> 38
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "BRCA84D-5VL" 人源化的抗-B7-H3抗体轻链可变结构域
<400> 39
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "BRCA84D-2VH"人源化的抗-B7-H3抗体重链可变结构域
<400> 40
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Ala Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Gly Ser Arg Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "BRCA69D"人源化的抗-B7-H3 抗体轻链可变结构域
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "BRCA69D" 人源化的抗-B7-H3抗体重链可变结构域
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "PRCA157" 人源化的抗-B7-H3抗体轻链可变结构域
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Pro Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Arg Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "PRCA157" 人源化的抗-B7-H3抗体重链可变结构域
<400> 44
Glu Val Gln Gln Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-A33抗体轻链可变结构域
<400> 45
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-A33抗体重链可变结构域
<400> 46
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-5T4 抗体 "mAb 1"轻链可变结构域
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-5T4 抗体 "mAb 1"重链可变结构域
<400> 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Ala
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 49
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-5T4 抗体 "mAb 2"轻链可变结构域
<400> 49
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 50
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-5T4 抗体 "mAb 2"重链可变结构域
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Ala Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Asn Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Phe Thr Thr Val Val Asp Pro Asn Ser Tyr
100 105 110
Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-ROR1 mAb 1抗体轻链可变结构域
<400> 51
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Lys Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Asp
85 90 95
Tyr Pro Gly Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 52
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化的抗-ROR1 mAb 1抗体重链可变结构域
<400> 52
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Ala Ala Leu Phe Asp Ile Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(107)
<223> 2A2抗-ROR1抗体轻链可变结构域
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Ile Met Ser Thr Thr Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Met Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(118)
<223> 2A2抗-ROR1抗体重链可变结构域
<400> 54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Ile Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Gly Tyr Tyr Asp Tyr Asp Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 55
<211> 110
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> R11抗-ROR1抗体轻链可变结构域
<400> 55
Glu Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Thr Ser Gly Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Arg
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Val Gly Asn Val Ser
85 90 95
Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(116)
<223> R11抗-ROR1抗体重链可变结构域
<400> 56
Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Asp Leu Val Thr Pro Ala Gly Asn
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr Pro
20 25 30
Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35 40 45
Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr
65 70 75 80
Ser Leu Thr Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr
85 90 95
Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Ile Ser Ser
115
<210> 57
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(112)
<223> R12抗-ROR1抗体轻链可变结构域
<400> 57
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro
65 70 75 80
Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr
85 90 95
Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly
100 105 110
<210> 58
<211> 121
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(121)
<223> R12抗-ROR1抗体重链可变结构域
<400> 58
Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly
100 105 110
Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(B7-H3 mAb 1)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 60
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(B7-H3
mAb 1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 60
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
165 170 175
Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr
210 215 220
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 61
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 61
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 62
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 62
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 63
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(VL(B7-H3 mAb 1)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 63
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 64
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 2三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(B7-H3
mAb 1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 64
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr
165 170 175
Arg Tyr Thr Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr
210 215 220
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 65
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(重链CD8 mAb 2)的第三多肽链
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 66
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 2三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 2)的第四多肽链
<400> 66
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 67
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 /
B7-H3 mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(CD8
mAb 1)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 67
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 68
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 /
B7-H3 mAb 1三特异性结合分子(VL(CD8 mAb 1)-VH(CD3
mAb 2)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 68
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr
165 170 175
Leu Tyr Ala Ser Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180 185 190
Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp
210 215 220
His Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 69
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 /
B7-H3 mAb 1三特异性结合分子重链B7-H3 mAb
1)的第三多肽链
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 70
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性CD3 mAb 2 / CD8 mAb 1 /
B7-H3 mAb 1三特异性结合分子(轻链B7-H3 mAb
1)的第四多肽链
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 71
<211> 499
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3
mAb 2三特异性结合分子(VL(B7-H3 mAb 1)-VH(CD8 mAb
1)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 71
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
130 135 140
Thr Ser Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Met Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr
165 170 175
Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
180 185 190
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ile Pro Arg Leu Trp Tyr Phe Asp Val
210 215 220
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly
225 230 235 240
Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly
260 265 270
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
275 280 285
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
290 295 300
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
305 310 315 320
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
325 330 335
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
340 345 350
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
355 360 365
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
370 375 380
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
385 390 395 400
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
405 410 415
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
420 425 430
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
435 440 445
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
450 455 460
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
465 470 475 480
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
485 490 495
Pro Gly Lys
<210> 72
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 /
CD3 mAb 2三特异性结合分子(VL(CD8 mAb 1)-VH(B7-H3
mAb1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys
115 120 125
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
130 135 140
Lys Asp Thr Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala
165 170 175
Ser Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
180 185 190
Thr Ala Tyr Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val
195 200 205
Tyr Tyr Cys Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys
225 230 235 240
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 73
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 / CD3
mAb 2三特异性结合分子(重链CD3 mAb 2)的第三多肽链
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195 200 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
355 360 365
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser
435 440 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450 455
<210> 74
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性B7-H3 mAb 1/ CD8 mAb 1 /
CD3 mAb 2三特异性结合分子(轻链CD3 mAb 2)的第四多肽链
<400> 74
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 75
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(5T4 mAb 2)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 75
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
165 170 175
Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
210 215 220
Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys
275 280 285
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
290 295 300
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
305 310 315 320
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
325 330 335
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
340 345 350
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
355 360 365
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
370 375 380
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
385 390 395 400
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
405 410 415
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
435 440 445
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
450 455 460
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
465 470 475 480
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
485 490 495
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505
<210> 76
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(5T4 mAb
2)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 76
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Ala
165 170 175
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr
180 185 190
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
195 200 205
Ser Ala Val Tyr Asn Cys Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Phe Thr Thr Val
210 215 220
Val Asp Pro Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
275
<210> 77
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 77
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 78
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 78
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 79
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(VL(5T4 mAb 2)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 79
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Tyr Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
130 135 140
Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn
165 170 175
Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe
210 215 220
Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys
275 280 285
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
290 295 300
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
305 310 315 320
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
325 330 335
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
340 345 350
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
355 360 365
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
370 375 380
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
385 390 395 400
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
405 410 415
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
435 440 445
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
450 455 460
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
465 470 475 480
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
485 490 495
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505
<210> 80
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(5T4 mAb
2)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 80
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Ala
165 170 175
Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr
180 185 190
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp
195 200 205
Ser Ala Val Tyr Asn Cys Ala Arg Tyr Gly Pro Leu Phe Thr Thr Val
210 215 220
Val Asp Pro Asn Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu
245 250 255
Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
275
<210> 81
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(重链CD8 mAb 2)的第三多肽链
<400> 81
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 82
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 2)的第四多肽链
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 83
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(ROR1 mAb 1)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 83
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Lys Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Asp
85 90 95
Tyr Pro Gly Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
165 170 175
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
210 215 220
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr
275 280 285
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
290 295 300
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
305 310 315 320
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
325 330 335
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
340 345 350
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
355 360 365
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
370 375 380
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
385 390 395 400
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
405 410 415
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
420 425 430
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
435 440 445
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
450 455 460
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
465 470 475 480
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
485 490 495
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505 510
<210> 84
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(ROR1
mAb 1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 84
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
260 265 270
Glu
<210> 85
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 85
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 86
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 86
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 87
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(VL(ROR1 mAb 1)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 87
Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly His Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Arg Tyr Leu Met
35 40 45
Lys Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr Asn Lys Gly Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Gly Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Asp
85 90 95
Tyr Pro Gly Asn Tyr Leu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
165 170 175
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
210 215 220
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr
275 280 285
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
290 295 300
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
305 310 315 320
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
325 330 335
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
340 345 350
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
355 360 365
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
370 375 380
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
385 390 395 400
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
405 410 415
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
420 425 430
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
435 440 445
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
450 455 460
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
465 470 475 480
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
485 490 495
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505 510
<210> 88
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 2三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(ROR1
mAb 1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 88
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr
165 170 175
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Ala Ala
210 215 220
Leu Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
260 265 270
Glu
<210> 89
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 2三特异性结合分子(重链CD8 mAb 2)的第三多肽链
<400> 89
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Leu Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Pro His Tyr Asp Gly Tyr Tyr His Phe Phe Asp Ser Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 90
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性ROR1 mAb 1 / CD3 mAb 2 /
CD8 mAb 2三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 2)的第四多肽链
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Gly Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Ile Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Tyr Gln Tyr Asn Asn Gly Tyr Thr
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Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 91
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(HIV mAb 1)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 91
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile His Cys Lys Ser Ser Gln Thr Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Arg His Ser Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Leu Tyr Trp Ala Ser Met Arg Leu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Asn Asn Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Ser Ser His Pro Pro Thr Phe Gly His Gly Thr Arg Val Glu Ile
100 105 110
Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
130 135 140
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln
145 150 155 160
Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr
165 170 175
Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn
210 215 220
Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys
245 250 255
Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys
275 280 285
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
290 295 300
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
305 310 315 320
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
325 330 335
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
340 345 350
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
355 360 365
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
370 375 380
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
385 390 395 400
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
405 410 415
Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
420 425 430
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
435 440 445
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
450 455 460
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
465 470 475 480
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
485 490 495
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505
<210> 92
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(HIV mAb
1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 92
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Val Phe Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Thr Glu Tyr Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Tyr Ile Ser Lys Asn Gly Glu Tyr Ser
165 170 175
Lys Tyr Ser Pro Ser Ser Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
180 185 190
Ala Lys Asn Ser Val Phe Leu Gln Leu Asp Arg Leu Ser Ala Asp Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ser
210 215 220
Glu Leu Leu Gln Tyr Ile Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Ala Arg Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
260 265 270
Ala Ala Leu Lys Glu
275
<210> 93
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 93
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 94
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 94
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 95
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(HIV mAb 2)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 95
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr
20 25 30
Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Ile Ser Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Asp Ile
85 90 95
His Asn Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
130 135 140
Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr
165 170 175
Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
180 185 190
Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr
195 200 205
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn
210 215 220
Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu
245 250 255
Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
260 265 270
Ala Leu Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
275 280 285
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
290 295 300
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
305 310 315 320
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
325 330 335
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
340 345 350
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
355 360 365
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
370 375 380
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
385 390 395 400
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
405 410 415
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
420 425 430
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
435 440 445
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
450 455 460
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
465 470 475 480
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
485 490 495
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500 505
<210> 96
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(HIV mAb
2)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 96
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
115 120 125
Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly
130 135 140
Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ala His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Tyr
145 150 155 160
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Asn
165 170 175
Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Thr Ile Ser Gln His
180 185 190
Thr Ser Glu Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Val Ala
195 200 205
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Thr Arg Leu Arg Thr Leu
210 215 220
Arg Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
225 230 235 240
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
260 265 270
Lys Glu
<210> 97
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 97
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 98
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性HIV mAb 2 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 98
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 99
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb 2 Low的可变轻链结构域
<400> 99
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 100
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb 2 Low的可变重链结构域
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Thr Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 101
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb 2 Fast的可变轻链结构域
<400> 101
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 102
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-人CD3 mAb 2 Fast的可变重链结构域
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Lys Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Thr Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 103
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3 mAb
2)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala
245 250 255
Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu
260 265 270
Glu Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
275 280 285
Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
290 295 300
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
305 310 315 320
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
325 330 335
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
340 345 350
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
355 360 365
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
370 375 380
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
385 390 395 400
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
405 410 415
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
420 425 430
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
435 440 445
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
450 455 460
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
465 470 475 480
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
485 490 495
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 104
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2)-VH(5T4 mAb
1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 104
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Thr
165 170 175
Glu Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Pro Met Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly
225 230 235 240
Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
245 250 255
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 105
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 105
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 106
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 / CD8
mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 106
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 107
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Low /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3
mAb 2 Low)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 107
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 108
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Low /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2
Low)-VH(5T4 mAb 1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 108
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Thr
165 170 175
Glu Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Pro Met Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 109
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Low /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 109
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 110
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Low /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb 1)的第四多肽链
<400> 110
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 111
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(VL(5T4 mAb 1)-VH(CD3
mAb 2 Fast)-E-螺旋-(CH2-CH3))的第一多肽链
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Asp Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Lys Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Thr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ser Thr Lys Gly Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 112
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast
/ CD8 mAb 1三特异性结合分子(VL(CD3 mAb 2
Fast)-VH(5T4 mAb 1)-K-螺旋)的第二多肽链
<400> 112
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Asp Pro Asn Arg Gly Gly Thr
165 170 175
Glu Tyr Asn Glu Lys Ala Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Asn Pro Tyr Tyr Pro Met Asp
210 215 220
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
225 230 235 240
Gly Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys
245 250 255
Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265
<210> 113
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast /
CD8 mAb 1三特异性结合分子(重链CD8 mAb 1)的第三多肽链
<400> 113
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Phe Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Asn Thr Leu Tyr Ala Ser Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met His Leu Cys Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Gly Tyr Gly Tyr Tyr Val Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
4 20 425 430
Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 114
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性5T4 mAb 1 / CD3 mAb 2 Fast
/ CD8 mAb 1三特异性结合分子(轻链CD8 mAb
1)的第四多肽链
<400> 114
Asp Val Gln Ile Asn Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Arg Ser Ile Ser Gln Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 115
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的E-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 115
Glu Val Ala Ala Cys Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
20 25
<210> 116
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的K-螺旋异源二聚体促进结构域
<400> 116
Lys Val Ala Ala Cys Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
<210> 117
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ROR1 mAb 1轻链可变结构域 CDRL1
<400> 117
Thr Leu Ser Ser Gly His Lys Thr Asp Thr Ile Asp
1 5 10
<210> 118
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ROR1 mAb 1轻链可变结构域 CDRL2
<400> 118
Leu Glu Gly Ser Gly Ser Tyr
1 5
<210> 119
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ROR1 mAb 1轻链可变结构域 CDRL3
<400> 119
Gly Thr Asp Tyr Pro Gly Asn Tyr Leu
1 5
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ROR1 mAb 1重链可变结构域 CDRH1
<400> 120
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ROR1 mAb 1重链可变结构域 CDRH2
<400> 121
Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 122
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗-ROR1 mAb 1重链可变结构域 CDRH3
<400> 122
Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Ala Ala Leu Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 123
<211> 46
<212> PRT
<213> 停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(46)
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白质G的白蛋白结合结构域 3 (ABD3)
<400> 123
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 124
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白质G的变异的去免疫化的白蛋白结合结构域 3(ABD3)
<400> 124
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Ala Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 125
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 链球菌属菌株G148的蛋白质G的变异的去免疫化的白蛋白结合结构域 3(ABD3)
<400> 125
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Ser Asn Ala Lys Ser Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Ala Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 126
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 126
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 127
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的结构域
<400> 127
Ala Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
<210> 128
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的人CL结构域的部分的变体
<400> 128
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> 129
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的含有半胱氨酸的接头肽("接头3")
<400> 129
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 130
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可选的含有半胱氨酸的接头肽("接头3")
<400> 130
Leu Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 131
Ala Ser Thr Lys Gly
1 5
<210> 132
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 132
Leu Glu Pro Lys Ser Ser
1 5
<210> 133
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有半胱氨酸的人IgG铰链结构域的部分的变体
<400> 133
Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5

Claims (23)

1.能够免疫特异性结合三个不同的表位的三特异性结合分子，其中所述结合分子包括共价复合在一起的四条不同的多肽链并且包括：
(I)抗原结合结构域I，其能够免疫特异性结合第一抗原上存在的表位I，和抗原结合结构域II，其能够免疫特异性结合第二抗原上存在的表位II，其中所述抗原结合结构域I和所述抗原结合结构域II都是双抗体型结合结构域；
(II)非双抗体型抗原结合结构域III，其能够免疫特异性结合第三抗原上存在的表位III；和
(III)Fc结构域，其通过两个CH2-CH3结构域彼此缔合而形成。
其中所述第一抗原、第二抗原和第三抗原是相同的抗原，或独立地与所述抗原中的另一抗原相同或不同。
2.权利要求1所述的三特异性结合分子，其中所述表位I、表位II或表位III之一是细胞受体的表位。
3.权利要求1-2任一项所述的三特异性结合分子，其中所述表位I、表位II或表位III之一是疾病相关的抗原的表位。
4.权利要求3所述的三特异性结合分子，其中所述疾病相关的抗原是癌症抗原，其排列于癌症细胞的表面上。
5.权利要求3所述的三特异性结合分子，其中所述疾病相关的抗原是病原体抗原，其排列于病原体或感染病原体的细胞的表面上。
6.权利要求1-5任一项所述的三特异性结合分子，其中所述Fc结构域能够结合排列在细胞表面上的Fc受体。
7.权利要求3-6任一项所述的三特异性结合分子，其中所述表位I、表位II或表位III之一是CD3的表位，表位I、表位II或表位III的第二个表位是CD8的表位，和表位I、表位II或表位III的第三个表位是所述疾病相关的抗原的表位，并且，其中所述三特异性结合分子的所述抗原结合结构域I、II和III介导细胞毒性T细胞和表达所述疾病相关抗原的细胞的配位结合。
8.权利要求7所述的三特异性结合分子，其中所述CD3、所述CD8排列在T细胞的表面上，并且其中所述疾病相关的抗原排列在癌症细胞、病原体或感染病原体的细胞的表面上，并且其中所述免疫特异性结合足够共定位所述CD3和所述CD8以及所述疾病相关的抗原，从而针对排列所述疾病相关抗原的细胞促进激活排列所述CD8的T细胞。
9.权利要求1-8任一项所述的三特异性结合分子，其中所述非双抗体型结合结构域III包括Fab型结合结构域(VLIII/VHIII)，其能够免疫特异性结合所述表位III，其中所述分子包括：
(A)第一多肽链：
(I)其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)能够结合所述三个表位的第一个表位的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLI)；
(2)能够结合所述三个表位的第二个表位的免疫球蛋白的重链可变结构域(VHII)；
(3)(a)第一包含半胱氨酸的结构域；和异源二聚体-促进结构域；或
(b)包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域；
(5)第二包含半胱氨酸的结构域；和
(6)IgG的CH2和CH3结构域；
或
(II)其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)第一包含半胱氨酸的结构域；
(2)IgG的CH2和CH3结构域；
(3)能够结合所述三个表位的第一个表位的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLI)；
(4)能够结合所述三个表位的第二个表位的免疫球蛋白的重链可变结构域(VHII)；
(5)(a)第二包含半胱氨酸的结构域；和异源二聚体-促进结构域；或
(b)包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域；
(B)第二多肽链，其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)能够结合所述所述三个表位的第二个表位的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLII)；
(2)能够结合所述所述三个表位的第一个表位的免疫球蛋白的重链可变结构域(VHI)；
(3)(a)第一包含半胱氨酸的结构域；和异源二聚体-促进结构域；或
(b)包含半胱氨酸的异源二聚体-促进结构域；
其中所述第二多肽链的所述异源二聚体-促进结构域与所述第一多肽链的所述异源二聚体-促进结构域互补；
(C)第三多肽链，其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)能够结合所述三个表位的第三个表位的免疫球蛋白的重链可变结构域(VHIII)；和
(2)CH1结构域、包含半胱氨酸的铰链结构域和IgG的CH2-CH3结构域；和
(D)第四多肽链，其在N-末端至C-末端方向包括：
(1)能够结合所述所述三个表位的第三个表位的免疫球蛋白的轻链可变结构域(VLIII)；和
(2)包含半胱氨酸的轻链恒定结构域(CL)；
其中：
(i)所述VLI和VHI结构域缔合形成能够结合所述表位I的结构域；
(ii)所述VLII和VHII结构域缔合形成能够结合所述表位II的结构域；
(iii)所述VLIII和VHIII结构域缔合形成能够结合所述表位III的结构域；
(iv)所述第一多肽链的所述CH2-CH3结构域和所述第三多肽链的所述CH2-CH3结构域缔合形成Fc结构域；
(v)所述第一多肽链和第二多肽链彼此共价结合；
(vi)所述第一多肽链和第三多肽链彼此共价结合；
和
(vii)所述第三多肽链和第四多肽链彼此共价结合。
10.权利要求9所述的三特异性结合分子，其中：
(A)所述异源二聚体-促进结构域是E-螺旋和所述互补的异源二聚体-促进结构域是K-螺旋；或
(B)所述异源二聚体-促进结构域是K-螺旋和所述互补的异源二聚体-促进结构域是E-螺旋。
11.权利要求9-10任一项所述的三特异性结合分子，其中：
(A)所述第一多肽链和第三多肽链的所述CH2-CH3结构域各自具有序列SEQ ID NO:6，使得由它们缔合形成的Fc结构域展示正常的FcγR介导的效应子功能；或
(B)所述第一多肽链和第三多肽链的所述CH2-CH3结构域包括至少一个相对于序列SEQID NO:6的氨基酸取代，使得由它们缔合形成的Fc结构域展示改变的FcγR介导的效应子功能。
12.权利要求9-11任一项所述的三特异性结合分子，其中所述第一多肽链和第三多肽链的所述CH2-CH3结构域彼此不同并且具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8。
13.权利要求9-12任一项所述的三特异性结合分子，其中：
(A)所述表位I、表位II和表位III分别是CD3的表位、CD8的表位和所述疾病相关的抗原的表位；
(B)所述表位I、表位II和表位III分别是CD3的表位、所述疾病相关的抗原的表位和CD8的表位；
(C)所述表位I、表位II和表位III分别是CD8的表位、CD3的表位和所述疾病相关的抗原的表位；
(D)所述表位I、表位II和表位III分别是CD8的表位、所述疾病相关的抗原的表位和CD3的表位；
(E)所述表位I、表位II和表位III分别是所述疾病相关的抗原的表位、CD3的表位和CD8的表位；
或
(F)所述表位I、表位II和表位III分别是所述疾病相关的抗原的表位、CD8的表位和CD3的表位。
14.权利要求7-13任一项所述的三特异性结合分子，其中：
(A)所述CD3的表位是通过抗体OKT3、M291、YTH12.5、CD3mAb 1或CD3mAb 2识别的CD3表位；或
(B)所述CD8的表位是通过抗体TRX2或OKT8识别的CD8表位。
15.药学组合物，其包括权利要求7-14任一项所述的三特异性结合分子，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
16.治疗癌症的方法，其包括施用有效量的权利要求15所述的药学组合物至需要其的个体，其中所述疾病相关的抗原是所述癌症抗原。
17.治疗与病原体的存在相关的疾病的方法，其包括施用有效量的权利要求15所述的药学组合物至需要其的个体，其中所述疾病相关的抗原是所述病原体抗原。
18.抗ROR1抗体，或ROR1结合片段，其中所述抗体包括：
(A)轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包括CDRL1，其具有序列SEQ ID NO:117；CDRL2，其具有序列SEQ ID NO:118；和CDRL3，其具有序列SEQ ID NO:119；和
(B)重链可变结构域，所述重链可变结构域包括CDRH1，其具有序列SEQ ID NO:120；CDRH2，其具有序列SEQ ID NO:121；和CDRH3，其具有序列SEQ ID NO:122。
19.权利要求18所述的抗ROR1抗体或其ROR1结合片段，其中所述抗体的轻链可变结构域具有序列SEQ ID NO:51。
20.权利要求18-19任一项所述的抗ROR1抗体或其ROR1结合片段，其中所述抗体的重链可变结构域具有序列SEQ ID NO:52。
21.双抗体，BiTe或单链抗体，其包括权利要求18-20任一项所述的ROR1结合片段。
22.药学组合物，其包括权利要求19-21任一项所述的抗ROR1抗体或其ROR1结合片段，和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
23.治疗癌症的方法，其包括施用有效量的权利要求22所述的药学组合物至需要其的个体。
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