KR102113302B1 - 상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 h5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 조성물, 상기 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출 키트에 관한 것이다.

Description

상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도{Peptide based on complementarity-determining region for binding specific to H5 subtype of avian influenza virus and uses thereof}
본 발명은 상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 항원의 차이에 기초하여 A형, B형 및 C형으로 분류된다. 인플루엔자 A 바이러스는 사람뿐만 아니라 조류 및 돼지도 감염시킨다. C형 인플루엔자는 사람에서 경미한 질병만 일으킨다. 인플루엔자 A 바이러스는 서브타입 또는 타입, 지리적 기원, 균주 번호 및 단리 연도를 포함하는 명명법에 의하여, 예를 들면 A/베이징/353/89로 기술된다. 또한, 인플루엔자 A 바이러스는 표면항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 항원과 뉴라미다아제(neuraminidase, NA) 항원에 의해 아형이 결정된다. HA 항원은 H1-H16까지 알려져 있으며, NA 항원은 N1-N9까지 알려져 있어, 이들의 조합에 의해 총 144종의 아형 발생이 이론적으로 가능하다. 인플루엔자 A 바이러스의 유전자는 8개의 유전자 조각으로 구성되어 있으며, 이러한 이유로 유전자 재조합이 일어날 수 있다. 모든 서브타입은 조류에서 발견되나, H1-H3 및 N1-N2는 인간, 돼지 및 말에서 발견되는 것으로 알려져 있다.
조류 인플루엔자 중 H5 아형의 바이러스는 사람에 감염되는 일반 인플루엔자와 달리 치사율이 56% 이상으로 감염되면 사망률이 매우 높아, 일반 인플루엔자와 H5 아형을 감별하는 방법이 요구되는 실정이다.
인플루엔자 바이러스의 감염 진단법의 가장 민감한 방법으로는 바이러스 분리 및 배양법이 있으나, 상기 방법은 2-3주의 소요시간이 필요하며, 유전자 진단법으로 RNA 분리 후 RT-PCR를 수행하게 되지만, RNA의 불안정성과 고가의 장비 및 숙련공이 필요하여 현장에서 감염 진단을 신속하게 수행할 수 없는 단점이 있다. 신속 진단 시스템은 높은 민감도, 짧은 검출 시간 및 저렴한 비용이 요구된다. 종래 바이러스 진단 시스템의 개발에 인기있는 소재는 주로 바이러스의 특정 단백질에 특이적으로 결합하는 항체가 사용되어 왔지만, 항체는 높은 생산 단가, 낮은 안정성 및 극도의 환경에서 낮은 기능성 등의 문제점을 가지고 있다.
펩티드 압타머는 펩티드-단백질 상호작용(peptide-protein interaction, PPI) 인터페이스를 표적하기 위한 강력한 대안법으로 알려졌다. PPI는 단백질 결합력의 정교한 조절에 관여하고, 세포질 내 위치 및 효소 활성과 같은 중요한 단백질 기능을 조절한다. 그러나, 펩티드 에피토프는 압타머의 경우로 연구되거나 래피드 진단 시스템에서 검출 물질로서 사용된 경우가 많지 않다. 펩티드를 압타머로서 사용하기 위한 방법의 개발은 항체 사용에 대한 대안이 될 수 있을 것이며, 새롭고 고민감성의 진단 시스템 발달을 촉진할 것으로 예측된다.
한국등록특허 제1384178호에는 '인플루엔자 바이러스의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머 및 그를 포함하는 약학 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1884935호에는 '인플루엔자 바이러스에 결합하는 압타머 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 상보성결정부 기반 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인플루엔자 H3 아형의 헤마글루티닌에 결합하는 중화항체(CD8020)를 이용하여 항체결합부(paratope) 결정 도구를 사용하여 상보성결정부 기반의 펩티드 압타머 후보 서열 6개(P1~P6)를 디자인하였다. 상기 6개의 펩티드 압타머 후보 중, 항원에 대한 결합 에너지 및 RMSD가 낮은 P1 펩티드를 선택하고, H5 아형 특이적 결합능이 있는 알려진 펩티드와 바이러스 또는 재조합 단백질의 검출능을 비교 분석한 결과, 본 발명의 P1 펩티드가 H5 아형 헤마글루티닌에 높은 결합능 및 우수한 검출능을 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 키트를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형을 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 펩티드는 항체에 비해 크기가 작고, 안정성이 높으며, 단시간에 적은 비용으로 생산이 가능하고, 장기간 이용할 수 있는 장점이 있으며, 특히 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드는 조류 인플루엔자 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 특징이 있으므로, 신속한 H5 아형 특이적 감염 진단에 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 CR8020 항체로부터 SAbPred 도구(PDB ID: 3SDY)를 이용하여 예측된 CDR 위치 및 서열정보이다.
도 2는 펩티드와 인플루엔자 아형 HA 단백질간 상호결합의 도킹 모델이다.
도 3은 펩티드와 인플루엔자 아형 HA 단백질간 결합 에너지(A) 및 RMSD(B-D) 분석 결과이다. *P<0.05, ***P<0.001.
도 4는 바이러스 검출을 위한 direct FLISA 분석 결과이다. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, HAU: hemagglutination unit.
도 5는 재조합 단백질 검출을 위한 sandwich FLISA 분석 결과이다. **P<0.01, ***P<0.001.
도 6은 H5N3 바이러스 감염된 세포를 펩티드 결합체를 이용하여 검출한 형광 이미지 사진이다.
도 7은 본 발명의 P1 펩티드를 이용하여 제작한 래피드 형광면역진단키트(FICT) 모식도 및 이를 이용하여 바이러스를 검출한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 제공한다.
용어 '펩티드(peptide)'는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드 및 상기 펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 펩티드를 말한다.
본 발명에 따른 상기 H5 아형(subtype)은, 바람직하게는 H5N1, H5N2, H5N3, H5H8 또는 H5N9 등의 바이러스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 키트는 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 검출용 키트에서 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 특이적 항체는 기판에 흡착된 상태로 제공될 수 있다. 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 검출용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명의 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 키트는 본 발명의 펩티드와 형광물질이 결합된 결합체를 포함하여 목적하는 항원을 면역검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 결합체를 포함하는 ELISA( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 키트가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 샌드위치 ELISA 키트가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 스트립 형태의 샌드위치 FICT(fluorescent immunochromatographic test) 키트가 될 수 있다.
상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 인플루엔자 바이러스 항원과 결합하는 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원의 결합부; 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 인플루엔자 바이러스의 특이적 항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 본 발명이 제공하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 바이러스 검출용 키트는 스트립 형태의 니트로셀룰로오스 멤브레인에 유리섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로스 재질의 패드를 결합시켜서 검체시료를 투입할 수 있는 시료주입부가 구비되고, 상기 시료 주입부로부터 일정 간격을 유지하면서 상기 펩티드-형광물질 결합체를 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원의 결합부, 상기 펩티드와 동일한 항원을 검출할 수 있는 다른 항체가 고정된 검사선, 및 상기 조성물에 포함된 항체를 검출할 수 있는 이차 항체가 고정된 대조선이 순차적으로 구비된 면역스트립 또는 FICT(fluorescent immunochromatographic test) 키트이다.
또한, 본 발명은 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 바이러스 검출용 키트에 인플루엔자 바이러스를 함유하는 것으로 의심되는 시료를 투입하여 상기 테스트 스트립의 검사선에 형광빛띠가 나타나면, 인플루엔자 바이러스의 H5 아형 감염을 양성으로 판정하고, 검사선에 형광빛띠가 나타나지 않으면, 인플루엔자 바이러스의 H5 아형 감염을 음성으로 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 인플루엔자 A형 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 검출용 키트를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형을 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스의 H5 아형 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
용어 '시료'는 검출 대상체로 샘플 또는 검체와 동일한 의미로 사용되었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 시약
본 발명에 사용된 유로피움 나노파티클(Europium nanoparticle, Eu-NP)은Bangs Laboratories Inc.(Fisher, 미국)에서 구입하였으며, 아민-라텍스 비드(직경 0.1㎛)는 Life Technology(미국)에서 구매하였다. EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide hydrochloride) 및 Sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt)는 Thermo Scientific(미국)에서 구입하여 사용하였으며, 그 외, 발명에 사용된 모든 시약들은 Sigma-Aldrich(미국)에서 구입하여 사용하였다.
2. 펩티드 디자인 및 도킹(docking) 분석
인플루엔자 A 바이러스 중화 항체 CR8020(Brandenburg, B et al., (2013) PLOS ONE 8(12):e80034)의 상보성 결정부위로부터 항체결합부(paratope) 예측 도구(SAbPred)를 이용하여 H5N3의 HA에 대한 펩티드 압타머 후보를 디자인하였고, 펩트론사(한국)에 의뢰하여 펩티드를 합성하였다. 결합 에너지, RMSDs(root-mean-square deviations) 및 상호작용 자리를 포함하는 다양한 변수들을 김 등(Theranostics (2018) 8(13):3629-3642)의 방법을 이용하여 분석하였다. H5N3의 HA 및 펩티드의 3차원 구조는 I-TASSE 서버를 이용하여 만들어냈으며, 단백질 구조 및 예측에 대한 계층적인 접근은 PyRx 도구를 이용하였다. 항체결합부의 결합능은 the PyRx Virtual Screening Tool AutoDock Vina를 이용하여 분석하였다. 결합 에너지 및 RMSD 결정 외에, 펩티드와 항원간의 잠재적 상호작용(수소결합)을 PyMOL Molecular Graphics 시스템을 이용하여 시각화하였다.
3. 유로피움(Europium)-결합된 펩티드의 제조
펩티드를 PS-COOH 유로피움 나노파티클(이하, Eu NP) 비드(0.1 μm)에 결합시켜 Eu NP-펩티드 복합체를 만들었다. 간단하게, 20㎕의 Eu NP를 754㎕의 0.05M MES 버퍼(pH 6.1, Sigma-Aldrich)에 첨가하고, Eu NP 표면의 -COOH기를 활성화하기 위해 26㎕의 5mM EDC와 200㎕의 50mM sulfo-NHS 존재하에, 25℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 후, 과량의 EDC와 sulfo-NHS는 27,237 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 제거하였다. 활성화된 Eu NP는 0.1M 인산나트륨 버퍼(pH 8.0) 940㎕ 및 60㎕의 10μM 펩티드와 혼합한 후 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 27,237 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수거하고, 세척한 후, 0.1% 소혈청알부민을 포함하고 있는 400㎕의 2mM Borax 버퍼(pH 8.0)에 현탁시켜, 4℃ 암실에서 보관하였다.
4. Direct FLISA(fluorescent-linked immunosorbent assay)
H5N3 [influenza A/spot-billed duck/Korea/KNU SYG06/2006(H5N3)], H7N1 [influenza A/common teal/Korea/KNU YSR12/2012(H7N1)] 및 H3N2(연구소재중앙센터(KNRRC) 등록번호 KBPV-VR-85) 바이러스를 실험에 사용하였다. 상기 모든 바이러스들은 달걀에 접종하여 배양하였으며, 농축하고, 혈구응집 반응(hemagglutination assay)을 통해 적정하였다.
검정색 96-웰 마이크로플레이트(Greiner, Germany)는 다양한 농도의 피분석물(바이러스 또는 재조합 항원)을 웰에 100㎕ 넣어 4℃에서 밤새 반응시켜 코팅시킨 후, PBS-T(phosphate-buffered saline with 0.1% Tween)로 세척하고, 5% 탈지유를 포함하는 버퍼로 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 블록킹하였다. 반응 종료 후, 플레이트를 3회 세척하고, Eu NP-펩티드 복합체의 희석액을 플레이트에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 바이러스(재조합 항원)를 검출하였다. PBS-T를 이용하여 5회 세척하고, 100㎕의 PBS를 각 웰에 넣어준 후, Infinite F200 microplate reader (TECAN, Switzerland)를 이용하여 형광(excitation: 355 nm, emission: 612 nm)을 측정하였다.
5. Sandwich FLISA
펩티드와 항원간의 상호작용을 평가하기 위해서, 항체를 코팅 요소로, 펩티드를 검출요소로 한 샌드위치 검정법을 개발하였다. 샌드위치 FLISA를 위해서 인플루엔자 바이러스 H5 아형에 특이적인 단클론항체 1C5(젠바디사 제공)를 사용하였다. 검정색 96-웰 마이크로플레이트를 10㎍/㎖의 1C5 항체를 이용하여 코팅하고, 재조합 항원 또는 바이러스를 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS-T를 이용하여 세척한 후, Eu NP-펩티드 복합체의 희석액을 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T를 이용하여 세척한 후, Infinite F200 microplate reader를 이용하여 형광을 측정하였다.
6. IFA(Immunofluorescence assay)
펩티드와 스트렙타비딘(US Biological, USA)을 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin (Pierce, USA) 및 FITC(fluorescein isothiocyanate, FluoroTagTM FITC Conjugation Kit, Sigma-Aldrich)를 이용하여 비오틴과 결합시켰다. 간단하게, 200㎍의 펩티드를 10mM 비오틴과 혼합하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 키트에 포함된 탈염 스핀 컬럼을 이용한 정제를 위해 펩티드를 라벨링하였다. 스트렙타비딘을 FITC로 라벨링하기 위해, 5㎎의 스트렙타비딘을 FITC와 몰비 20:1로 혼합한 후 2시간 동안 반응시켰다. 라벨된 펩티드는 Sephadex G-25M column B를 이용하여 정제하였으며, 펩티드 프로브로 IFA를 수행하기 위해, 유리 커버슬립 위에 배양한 Madin-Darby canine kidney 세포(MDCK NBL-2, ATCC® CCL-34TM)를 감염다중도(multiplicity of infection) 0.5의 H5N3 바이러스로 감염시키고 12시간 배양한 후, 4% 파라포름알데히드로 15분동안 고정하였다. PBS-T로 세척하고, 5% 소혈청알부민을 포함하는 PBS-T로 상온에서 2시간 동안 블록킹하였다. 비오틴-결합 펩티드(1:300 희석)을 세포에 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후 세척하고, FITC-결합 스트렙타비딘(1:3,000 희석)을 세포에 처리하여 추가로 1시간 반응시켰다. 그 후, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 세포의 핵을 염색하고, 형광현미경(Olympus, 일본)을 이용하여 관찰하였다(관찰배율 400× objective). 인플루엔자 바이러스의 H5 아형에 특이적인 단클론항체 1C5 및 2H2(아주대학교, 신호준 교수 제공)를 양성 대조군으로 사용하였다.
7. Rapid FICT(fluorescent immunochromatographic test)
펩티드 결합된 immunochromatographic test 스트립을 제작하기 위해서, 니트로셀룰로오스 멤브레인(#HF180, EMD Millipore, Germany)을 항체를 이용하여 코팅하였다. 간단하게, 결합 패드(#G028, EMD Millipore), 샘플 패드(#C083, EMD Millipore) 및 흡수 패드(#G048, EMD Millipore)를 백킹 카드(backing card, #754104, Rockville, USA)에 부착하였다. 측방 유동 반응을 정규화하기 위해서, 니트로셀룰로오스 멤브레인의 대조선을 1㎎/㎖의 goat anti-mouse IgG(Life Technologies)로 코팅하였다. 시험선은 2㎎/㎖의 1C5 항체로 코팅하였다. 멤브레인을 30℃에서 2시간 동안 건조시킨 후, 스트립을 FITC를 이용하여 테스트하였다. 간단한게, 27.2nM의 비오틴-결합 펩티드 3㎕, 660pM의 스트렙타비딘-결합 Eu 2㎕와 9.3nM의 IgG-결합 Eu NP 2㎕를 결합 패드에 처리하고, 75㎕의 분석시료를 75㎕의 용해 버퍼(100mM Tris-HCl, pH 11.0, 100mM EDTA, 0.2% sodium dodecyl sulfate, 및 1% Triton X-100)와 혼합한 후, 혼합물을 샘플 패드에 20분간 연속적으로 떨어뜨린다. 테스트 스트립의 결과는 휴대용 형광 스트립 리더기로 측정하였다.
8. 종래의 금 나노입자-기반 RDT 어세이
본 발명의 펩티드-기반 FITC 어세이를 평가하기 위해서, 콜로이드 금 나노입자를 항체에 연결하였다. 먼저, 0.02% 염화금산(chloroauric acid, Sigma-Aldrich)을 끓이고, 0.2% 구연산나트륨을 첨가한 후 교반하였다. 혼합물이 와인 색으로 변한 후, 용액을 5분간 추가로 끓인 후, 끓이지 않고 10분간 교반하였다. 그 후, 1㎎의 2H2 항체를 100㎖의 콜로이드 금 나노입자와 결합시켰다. 단클론항체-금 결합체는 원심분리(27,237 ×g)를 통해 침전시켜 회수하고, 0.1% 소혈청알부민을 포함하는 PBS를 이용하여 재현탁시켜 450nm에서 흡광도가 10이 되도록 조정하였다. 스트립의 시험선은 2㎎/㎖의 1C5(마우스 단클론항체)를 대조선은 1㎎/㎖의 goat anti-mouse IgG를 투여하여 준비하였다. RDT에도 Rapid FICT와 동일한 용해 버퍼를 사용하였고, 동량의 시료 및 용해 버퍼를 혼합하여 샘플 패드에 20분간 떨어뜨린 후, 육안으로 결과를 판정하였다.
9. 통계
모든 결과는 GraphPad Prism 5.0을 이용하여 통계적으로 분석하였다. 일원- 및 이원-분산분석(One-way and two-way analysis of variance)을 FLISA 및 FITC 결과 분석에 사용하였다. 모든 결과는 3반복의 평균과 표준편차값으로 나타내었다.
실시예 1. 상보성결정부(complementarity-determining region, CDR) 예측
인플루엔자 A 바이러스의 H3 단백질(PDB ID: 3SDY)에 결합하는 CR8020 단클론항체 주형으로부터 바이오인포메틱스 도구를 통해 6개의 잠재적 CDRs을 예측하였다. 중쇄 및 경쇄의 주형은 헤마글루티닌 HA1 사슬, 헤마글루티닌 HA2 사슬, CR8020 항체의 중쇄 및 CR8020의 경쇄의 크리스탈 구조에 근거하였다. 항원-항체 반응에 관여하는 CDR을 예측하기 위해서, SAbPred (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/WelcomeSAbPred.php)을 사용하였다. CDR의 위치는 도 1A에 시각화하였으며, CR8020 항체의 중쇄 및 경쇄의 상호작용 자리를 보여준다. 6개의 CDRs(P1-P6)의 위치는 도 1B에 나타내었으며, 각 CDR의 서열을 정리하면 도 1C와 같다.
Paratome server (www.ofranlab.org/paratome)는 CDR을 예측하는 대안 도구로 사용하였으며, 분석 결과 SAbPred 도구를 통해 예측된 CDR과 유사한 서열을 보여주었다.
실시예 2. 펩티드와 항원 상호작용 자리의 예측
후보 펩티드(P1) 압타머와 항원인 HA 단백질의 상호작용 자리를 결정하기 위해서, I-TASSER를 사용하여 선형 펩티드 모델의 활성 입체배좌(conformation)를 제작하였고, PyMOL Molecular Graphics system을 이용하여 시각화하였다(도 2A). 이전의 연구(한국등록특허 제1892040호)를 통해 확인된, H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드(H5-P2)를 함께 비교하였다.
도 2B에 개시된 것과 같이, 전형적인 AutoDock Vina docking 수행을 통해 후보 펩티드의 H3N2, H5N3 및 H7N1의 HA 상의 결합 입체배좌를 확인할 수 있었다. 도킹 분석 결과를 통해, 본 발명의 후보 펩티드(P1) 압타머와 H5 아형에 특이적으로 결합하는 것으로 보고된 펩티드(H5-P2) 모두 H7N1 바이러스에는 결합하지 않을 것으로 예측되었다.
실시예 3. HA 단백질과 CDR 유래 펩티드의 도킹 분석
에피토프 유래 펩티드와 비교를 통해 펩티드 압타머로 in silico-예측된 CDRs를 평가하기 위해, 6개의 CDR 펩티드(P1: KASGYTFTSF (서열번호 1), P2: WIGWISAYNGD (서열번호 2), P3: EPPLFYSSWSLDN (서열번호 3), P4: RASQSVSMNYLA (서열번호 4), P5: LLIYGASRRAT (서열번호 5), 및 P6: QQYGTSPRTFGQ (서열번호 6))의 3차원 구조를 만들고, H3N2(GenBank accession number: ACU79871.1, 566 aa), H5N3(GenBank accession number: AEB89892.1, 564 a.a) 및 H7N1(GenBank accession number: BAF02932.2, 560 aa)의 HA와 각 펩티드간의 결합 에너지, RMSD와 같은 도킹 결과를 분석하였다. 이전의 연구를 통해 확인된, H5 아형에 특이적으로 결합하는 펩티드(H5-P2)를 함께 비교하였다.
도 3A에 개시된 것과 같이, 6개의 펩티드들 중 P1 펩티드의 H5N3 아형 HA에 대한 결합 에너지(-7.42 ± 0.22 kcal/mol)가 H5-P2의 결합 에너지(-7.14 ± 0.28 kcal/mol)보다 유의성 수준(p<0.05)에서 차이나는 것을 확인할 수 있었다. 낮은 결합 에너지는 높은 결합 친화성을 의미하므로, 본 발명의 P1 펩티드가 H5-P2 펩티드에 비해 H5 아형에 보다 특이적으로 결합할 수 있을 것으로 예측되었다.
비록, H5N3 아형 HA에 대한 P1 펩티드와 H5-P2 펩티드의 RMSD 값에는 유의미한 차이가 확인되지 않았으나, H3N2 또는 H7N1의 HA에 대한 P1 펩티드와 H5-P2 펩티드의 RMSD 값은 유의성 수준(p<0.001)에서 차이가 있는 것으로 나타났다(도 3B-D). 따라서, P1 펩티드는 H3N2 및 H7N1에 비해 H5 아형에 보다 특이적인 것으로 예측되었다. 결합 에너지(VINA 도킹 점수) 및 RMSD 값은 하기 표 1에 정리하였다.
Figure 112018129534142-pat00001
(Mode 1 ~ 8: 3차 구조 모델링을 하면 펩타이드 서열이 구조를 조금씩 틀어서, 여러 가지로 결합할 수 있는 가능성을 8 가지로 제시함. Mode 0은 본래 펩타이드 구조가 결합하는 것을 의미하지만, 1번에서 8번으로 갈수록 본래 펩타이드 구조와 더 달라진 상태에서의 결합력을 의미. 본 발명에서는 모든 가능성을 다 합쳐서 계산하는 방법을 사용. 즉, Mode 0에서 Mode 8을 다 합쳐서 계산함.)
실시예 4. FLISA를 이용한 펩티드-바이러스/재조합 단백질 상호작용
후보 펩티드와 바이러스, Eu NP-결합 펩티드의 상호작용을 분석하기 위해, direct FLISA를 수행하였다(도 4A). 그 결과, 본 발명의 P1 펩티드와 H5-P2 펩티드는 H5N3에서만 낮은 역가(15.6 HAU/㎖)까지 형광이 검출되었으며, H3N2와 H7N1 바이러스에서는 낮은 역가에서는 형광이 검출되지 않음을 알 수 있었다(도 4B).
후보 펩티드와 재조합 단백질, Eu NP-결합 펩티드의 상호작용을 분석하기 위해, sandwich FLISA를 수행하였다(도 5A). Sandwich FLISA는 동일한 단클론항체(1G5)를 코팅하여 포획 항체로 사용하고, 재조합 단백질의 검출은 P1 펩티드, H5-P2 펩티드 또는 단클론항체(2H2)를 사용하여 형광 신호를 측정하여 분석하였다. 그 결과, 항체-항체의 sandwich FLISA에서 가장 높은 형광 신호가 확인되었으며, 항체-펩티드 sandwich FLISA에서는 본 발명의 P1 펩티드를 사용한 경우가 H5-P2 펩티드를 사용한 경우보다 재조합 단백질 검출의 민감도가 우수한 것으로 확인되었다(도 5B).
실시예 5. 바이러스 감염 세포의 면역학적 염색 분석
본 발명의 P1 펩티드를 이용하여 바이러스 감염 세포를 면역학적 염색을 통해 분석하였다. 비오틴-결합 펩티드를 바이러스 감염 세포에 처리한 후, FITC가 결합된 스트렙타비딘을 처리하여 형광 현미경으로 관찰한 결과, 본 발명의 P1 펩티드는 H5 아형에 특이적인 단클론항체(1C5)를 사용한 실험군과 유사하게 세포 내 바이러스를 효과적으로 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 6). 이전에 보고된 H5-P2 펩티드는 FITC 신호가 거의 확인되지 않아, 본 발명의 P1 펩티드 압타머가 H5 아형 인플루엔자 바이러스의 검출능이 매우 우수함을 알 수 있었다.
실시예 6. Rapid FITC 수행
본 발명자는 펩티드 압타머 기반의 신속 진단 키트를 제작하였다. 신속 진단 키트의 구성은 도 7A에 나타내었으며, 제작한 키트를 이용한 이용한 바이러스 검출 결과는 도 7B와 같다. H5N3, H3N2 및 H7N1 바이러스를 다양한 농도로 희석하고 이를 샘플 패드에 적용하여 형광 신호를 측정한 결과, H3N2 및 H7N1 바이러스에 대해서는 높은 역가(5,120 HAU/㎖)의 바이러스 시료에 대해서도 형광 신호가 확인되지 않았으나, H5N3 바이러스에서는 640 HAU/㎖의 LOD(limit of detection)를 보여주었다(P<0.001). H5 아형 특이적인 신속 진단 키트는 상업화된 것이 없기 때문에, 금 나노입자-결합된 2H2 단클론항체를 제작하여 1C5 스트립에 적용하여 전통적인 신속 진단 방법으로, 본 발명의 검출 결과와 비교하였다. 그 결과, 금-나노입자 결합된 단클론항체를 이용한 전통적인 신속 진단 방법에서는 H5N3 바이러스의 1,280 HAU/㎖에서 약하게 신호가 나타나 본 발명의 P1 펩티드 압타머를 이용한 신속 진단 방법이 전통적인 방법에 비해 보다 우수한 검출능을 보임을 알 수 있었다.
<110> Wonkwang University Center for Industry-Academy Cooperation <120> Peptide based on complementarity-determining region for binding specific to H5 subtype of avian influenza virus and uses thereof <130> PN18548 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 peptide <400> 1 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 peptide <400> 2 Trp Ile Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asp 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P3 peptide <400> 3 Glu Pro Pro Leu Phe Tyr Ser Ser Trp Ser Leu Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P4 peptide <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Asn Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P5 peptide <400> 5 Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Arg Arg Ala Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P6 peptide <400> 6 Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gln 1 5 10

Claims (6)

  1. 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3에 특이적으로 결합하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드.
  2. 제1항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 형광물질과 결합된 펩티드인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항의 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 조성물을 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 바이러스 검출용 키트는 시료를 주입하는 시료 주입부; 상기 시료 주입부로부터 일정 간격 이격된 지점에 위치하는 시료 내의 인플루엔자 바이러스 항원과 결합하는 상기 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 조성물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 항원의 결합부; 상기 결합부로부터 일정간격이 이격된 위치에 인플루엔자 바이러스의 특이적 항체가 고정된 검사선(test line); 및 항-마우스 IgG가 고정된 대조선(control line)이 순차적으로 구비되는 것을 특징으로 하는 테스트 스트립 형태의 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 키트.
  6. 인플루엔자 A형 바이러스의 감염이 의심되는 동물로부터 분리된 시료를 제4항의 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 검출용 키트를 이용하여 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3을 검출하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 A형 바이러스의 H5N3 감염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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