ES2856839T3

ES2856839T3 - Moléculas de unión triespecíficas que se unen específicamente a múltiples antígenos del cáncer y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2856839T3
Application number: ES15799187T
Authority: ES
Inventors: Ezio Bonvini; Paul Moore; Jonathan Li; Leslie Johnson; Kalpana Shah
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: JP2017519744A; AU2015266797A1; EP3148580A4; KR102355609B1; KR102364383B1; CN106573050A; PE20170765A1; AU2019204236A1; US20200199223A1; SG11201609917PA; AU2015266880A1; IL249266A0; WO2015184207A1; AU2015266797C1; WO2015184203A1; MX2016015398A; JP2021073224A; KR20170012351A; ES2890079T3; TWI747041B

Abstract

Una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes, que comprende: (I) cuatro cadenas polipeptídicas diferentes que forman un complejo covalente entre sí; (II) un dominio de unión a antígeno I que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo I presente en un primer antígeno, y un dominio de unión a antígeno II que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo II presente en un segundo antígeno; (III) un dominio de unión a antígeno III que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo III presente en un tercer antígeno; y (IV) un dominio Fc, en donde: (A) uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un antígeno de células efectoras, otro del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un primer antígeno de cáncer y el otro del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un segundo antígeno de cáncer; (B) una primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VLI)-(Enlazador 1)-(Dominio VHII)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros-(Enlazador 3)-(Dominio CH2-CH3); o (Dominio CH2-CH3)-(Enlazador 4)-(Dominio VLI)-(Enlazador 1)-(Dominio VHII)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros); o (Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3)-(Enlazador 4)-(Dominio VLI)-(Enlazador 1)-(Dominio VHII)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros); (C) una segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VLII)- (Enlazador 1)-(Dominio VHI)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros); (D) una tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VHIII)- (Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3); (E) una cuarta cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VLIII)- (Dominio que Contiene Cisteína); (F) el Dominio VLI es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo I, el Dominio VHI es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo I, el Dominio VLII es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo II, el Dominio VHII es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo II, el Dominio VLIII es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo III y el Dominio VHIII es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo III: y (G) el Dominio VLI y el Dominio VHI se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno I, el Dominio VLII y el Dominio VHII se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno II, el Dominio VLIII y el Dominio VHIII se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno III y el Dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el Dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica se asocian para formar el Dominio Fc.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión triespecíficas que se unen específicamente a múltiples antígenos del cáncer y métodos de uso de las mismas

Referencia al listado de secuencias:

se incluye una parte separada de listado de secuencias de la descripción conforme a la Regla 5.2 (a) del PCT.

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a moléculas de unión triespecíficas, que son moléculas polipeptídicas de cadenas múltiples que poseen tres dominios de unión y, por tanto, son capaces de mediar la unión coordinada a tres epítopos. La molécula de unión triespecífica se caracteriza preferentemente por poseer dominios de unión que le permiten unirse de manera inmunoespecífica a: (1) un epítopo de un primer antígeno de cáncer, (2) un epítopo de un segundo antígeno de cáncer y (3) un epítopo de una molécula que se expresa en la superficie de una célula efectora del sistema inmunitario y, por lo tanto, es capaz de localizar una célula efectora del sistema inmunitario en una célula que expresa un antígeno de cáncer, facilitando de ese modo la destrucción de dicha célula cancerosa.

Descripción de la técnica relacionada:

I. El sistema inmunitario de los mamíferos

El sistema inmunitario de los mamíferos sirve como defensa contra una diversidad de afecciones, entre las que se incluyen, por ejemplo, lesiones, infecciones y neoplasias. La eficiencia con la que los seres humanos y otros mamíferos desarrollan una respuesta inmunológica a los patógenos, las sustancias extrañas y los antígenos del cáncer se basa en dos características: la exquisita especificidad de la respuesta inmunitaria para el reconocimiento de antígenos y la memoria inmunitaria que permite respuestas más rápidas y vigorosas tras la reactivación con el mismo antígeno (Portoles, P. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination," Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21).

El sistema inmunitario de los mamíferos está mediado por dos sistemas separados pero interrelacionados: el sistema inmunitario celular y el sistema inmunitario humoral. En términos generales, el sistema humoral está mediado por productos solubles (anticuerpos o inmunoglobulinas) que tienen la capacidad de combinarse y neutralizar productos reconocidos por el sistema como extraños para el cuerpo. Por el contrario, el sistema inmunitario celular implica la movilización de ciertas células, denominadas "células T", que ejercen una diversidad de funciones terapéuticas. Las células T son linfocitos que proceden del timo y circulan entre los tejidos, el sistema linfático y el sistema circulatorio. En respuesta a la presencia y reconocimiento de estructuras extrañas (antígenos), las células T se "activan" para iniciar una respuesta inmunitaria. En muchos casos, estos antígenos extraños se expresan en células hospedadoras como resultado de una neoplasia o una infección. Aunque las células T no secretan anticuerpos por sí mismas, por lo general son necesarias para la secreción de anticuerpos por la segunda clase de linfocitos, las células B (que proceden de la médula ósea). Es crucial el hecho de que las células T presenten una extraordinaria especificidad inmunológica para poder distinguir un antígeno de otro). Son de especial relevancia dos tipos de células T, "las células T auxiliares" y las "células T citotóxicas".

Las células T auxiliares se caracterizan por su expresión de la glicoproteína CD4 (es decir, son "CD4+"). Las células T CD4+ son los organizadores esenciales de la mayoría de las respuestas inmunitarias y autoinmunitarias de los mamíferos (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48). Se ha observado que la activación de células T CD4+ está mediada por interacciones coestimuladoras entre un complejo de antígeno:molécula mayor de histocompatibilidad II (MHC II) que se dispone en la superficie de una célula presentadora de antígeno (tal como una célula B, un macrófago o una célula dendrítica) y un complejo de dos moléculas, el receptor de células T ("TCR") y un ligando del receptor CD3 de la superficie celular, que se disponen en la superficie de una célula T CD4+ virgen. Las células T colaboradoras activadas son capaces de proliferar en células Th1 que son capaces de mediar una respuesta inflamatoria a la célula diana.

Las células T citotóxicas se caracterizan por su expresión de CD8 (es decir, son "CD8+" además de CD3+). Se ha descubierto que la activación de células T CD8+ está mediada por interacciones coestimuladoras entre complejo de antígeno: molécula mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) que se dispone en la superficie de una célula diana y un complejo de CD8 y el receptor de células T, que se disponen en la superficie de la célula T CD8+. A diferencia de las moléculas del MHC II, que se expresan solo por ciertas células del sistema inmunitario, las moléculas del MHC I se expresan muy extensamente. Por lo tanto, las células T citotóxicas son capaces de unirse a una amplia diversidad de tipos de células. Las células T citotóxicas activadas intervienen en la muerte de las células mediante la liberación de las citotoxinas perforina, granzimas y granulisina. Mediante la acción de la perforina, las granzimas entran en el citoplasma de la célula diana y su función serina proteasa desencadena la cascada de las caspasas, que es una serie de cisteína proteasas que finalmente conducen a la apoptosis (muerte celular programada) de las células diana.

El receptor de células T ("TCR") es un heterodímero unido covalentemente de cadenas a y p ("TCRap"). Estas cadenas son polipéptidos de membrana de clase I de 259 (a) y 296 (p) aminoácidos de longitud. La molécula de CD3 es un correceptor de las células T que está compuesto por cinco cadenas polipeptídicas distintas (una cadena y de CD3, una cadena 8 de CD3, dos cadenas £ de c D3 y dos cadenas zeta). Las cadenas polipeptídicas individuales se asocian para formar un complejo de tres dímeros (£Y, £8, ZZ) (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; páginas 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice," J. Pathol. 173:303-307; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21; Call, M.E. et al. (2007) "Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors," Nat. Rev. Immunol. 7:841-850; Weiss, A. (1993) "T Cell Antigen Receptor Signal Transduction: A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases," Cell 73:209-212). El complejo CD3 se asocia con el TCR generando una señal de activación en los linfocitos T. En ausencia de CD3, los TCR no se ensamblan correctamente y se degradan (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177). El CD3 se encuentra unido a las membranas de todas las células T maduras y prácticamente no se encuentra en ningún otro tipo de célula (véase, Janeway, C.A. et al. (2005) En: IMMUNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE," 6a ed. Garland Science Publishing, NY, págs. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3£:y Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex," Immunity. febrero de 2006; 24(2):133-139).

El complejo de TCR y CD3, junto con la cadena zeta de la cadena Z de CD3 (también conocida como cadena zeta del receptor T3 de células T o CD247) comprende el complejo TCR (van der Merwe, P.A. etc. (publicación electrónica, 3 de diciembre de 2010) "Mechanisms For T Cell Receptor Triggering," Nat. Rev. Immunol. 11:47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology of the T cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140). El complejo es particularmente significativo ya que contiene un gran número (diez) de motivos de inmunorreceptor activable por tirosina (ITAM).

Se requieren dos interacciones para la activación de las células T (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). En la primera interacción, una célula debe presentar el antígeno diana relevante unido al complejo mayor de histocompatibilidad de la célula para que pueda unirse al receptor de células T ("TCR") de un linfocito T virgen. En la segunda interacción, un ligando de la célula debe unirse a un correceptor del linfocito T (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev. 229:307-321). Las células T que experimentan ambas señales estimulantes entonces son capaces de responder a las citocinas (tales como la interleucina-2 y la interleucina-12). En ausencia de ambas señales coestimuladoras durante la interacción del TCR, las células T entran en un estado funcionalmente carente de respuesta conocido como anergia clonal (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328). En estados patológicos, las células T son los actores clave de diversas enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos, tales como la diabetes de tipo I, la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48).

Se cree que la necesidad de dos señales para activar las células T de manera que consigan una respuesta inmunitaria adaptativa proporciona un mecanismo para evitar respuestas a autoantígenos que pueden estar presentes en una célula presentadora de antígeno en lugares del sistema donde puede ser reconocida por una célula T. Cuando el contacto de una célula T con una célula da como resultado la generación de solo una de las dos señales requeridas, la célula T no se activa y no se produce una respuesta inmunitaria adaptativa.

II. Anticuerpos y otras moléculas de unión a epítopos

A. Anticuerpos

Los "anticuerpos" son moléculas de inmunoglobulina capaces de unirse de manera específica a una diana, tales como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en el dominio variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el término no solo abarca anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, anticuerpos camelizados, anticuerpos monocatenarios y anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) (entre los que se incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id contra los anticuerpos de la invención), sino también mutantes de los mismos, variantes de origen natural, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. A lo largo de la presente solicitud, la numeración de los restos de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos está de acuerdo con el índice EU de Kabat et al. (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Publicación de los Institutos Nacionales de la Salud N.° 91-3242. Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo" es una porción de un anticuerpo que posee al menos un sitio de reconocimiento de antígeno. Tal como se usa en el presente documento, el término abarca fragmentos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')²Fv), Fv biespecíficos con enlaces disulfuro (sdFv), intracuerpos y moléculas monocatenarias (por ejemplo, scFv). En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

Los anticuerpos naturales (tales como los anticuerpos IgG) se componen de dos Cadenas ligeras complejadas con dos Cadenas pesadas. Cada cadena ligera contiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Cada cadena pesada contiene un dominio variable (VH), tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) y un dominio de bisagra situado entre los dominios CH1 y CH2. Por lo tanto, la unidad estructural básica de las inmunoglobulinas naturales (por ejemplo, IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, normalmente expresadas como una glicoproteína de aproximadamente 150.000 Da. La porción amino-terminal ("N") de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal ("C") de cada cadena define una región constante, teniendo las cadenas ligeras un solo dominio constante y teniendo normalmente las cadenas pesadas tres dominios constantes y una región bisagra. Por lo tanto, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula de IgG es n-VL-CL-c y la estructura de las cadenas pesadas de IgG es n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (donde H es la región bisagra, y n y c representan, respectivamente, el extremo N y el extremo C del polipéptido).

La capacidad de un anticuerpo intacto, no modificado, (por ejemplo, un anticuerpo IgG) para unirse a un epítopo de un antígeno depende de la presencia de dominios variables en las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina (es decir, el dominio VL y el dominio VH, respectivamente). La interacción de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular, la interacción de sus dominios VL y VH forma uno de los sitios de unión al epítopo del anticuerpo. Las regiones variables de una molécula de IgG consisten en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que contienen los restos que están en contacto con el epítopo, y segmentos que no son CDR, a los que se conoce como segmentos marco (FR) que, en general, mantienen la estructura y determinan el posicionamiento de los bucles de CDR para permitir dicho contacto (aunque ciertos restos marco también pueden estar en contacto con el antígeno). Por lo tanto, los dominios VL y VH tienen la estructura n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c. Los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, la segunda y la tercera CDR de una cadena ligera de anticuerpo se denominan en el presente documento, respectivamente, Dominio CDR ^l I , Dominio CDR ^l 2 y Dominio CDR ^l 3. De forma similar, los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, la segunda y la tercera CDR de una cadena pesada de anticuerpo se denominan en el presente documento, respectivamente, Dominio CDR ^h1, Dominio CDR ^h 2 y Dominio CDR ^h 3. Por lo tanto, las expresiones Dominio CDRl1, Dominio CDRl2, Dominio CDRl3, Dominio CDRh1, Dominio CDRh2 y Dominio CDRh3 se refieren a polipéptidos que, cuando se incorporan en una proteína, hacen que esa proteína pueda unirse a un epítopo específico independientemente de si dicha proteína es un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas, un diacuerpo o una molécula de unión monocatenaria (por ejemplo, un scFv, un BiTe, etc.), o es otro tipo de proteína. A diferencia de dichos anticuerpos, la construcción scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una sola cadena polipeptídica, en la que los dominios están separados por un enlazador flexible de suficiente longitud para permitir el autoensamblaje de los dos dominios produciendo un sitio de unión al epítopo funcional. Cuando el autoensamblaje de los dominios Vl y VH es imposible debido a un enlazador de insuficiente longitud (inferior a aproximadamente 12 restos de aminoácido), dos de los constructos scFv pueden interactuar entre sí para formar una molécula bivalente en la que la VL de una cadena se asocia con la VH de la otra (revisado en Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).

Además de sus usos conocidos en el diagnóstico, se ha demostrado que los anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos. Las últimas décadas han visto un resurgimiento del interés en el potencial terapéutico de los anticuerpos, y los anticuerpos se han convertido en una de las clases principales de fármacos derivados de la biotecnología (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). Cerca de 200 fármacos basados en anticuerpos han sido aprobados para su uso o están en desarrollo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos en la que el anticuerpo monoclonal comprende aminoácidos (naturales y no naturales) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único epítopo (o sitio antigénico). La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')²Fv), monocatenario (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unión a un antígeno. No se pretende que esta expresión esté limitada con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que este se fabrica (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). La expresión incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos, etc. descritos anteriormente en la definición de "anticuerpo". Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos monoclonales. Un método que puede emplearse es el método de Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497 o una modificación del mismo. Normalmente, los anticuerpos monoclonales se desarrollan en ratones, ratas o conejos. Los anticuerpos se producen inmunizando a un animal con una cantidad inmunogénica de células, extractos celulares o preparaciones de proteínas que contienen el epítopo deseado. El inmunógeno puede ser, pero sin limitación, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o tejido. Las células utilizadas para la inmunización se pueden cultivar durante un período de tiempo (por ejemplo, al menos 24 horas) antes de su uso como inmunógeno. Las células se pueden usar como inmunógenos por sí mismas o en combinación con un adyuvante no desnaturalizante, tal como Ribi (véase, por ejemplo, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3): 119-125).

En general, las células deben mantenerse intactas y preferentemente viables cuando se usan como inmunógenos. Las células intactas pueden permitir que el animal inmunizado detecte mejor los antígenos que las células rotas. La utilización de adyuvantes desnaturalizantes o agresivos, por ejemplo, adyuvante de Freud, puede romper las células y, por lo tanto, se desaconseja. El inmunógeno se puede administrar varias veces a intervalos periódicos tales como, cada quince días o cada semana, o puede administrarse de tal manera que se mantenga la viabilidad en el animal (por ejemplo, en un tejido recombinante). Como alternativa, los anticuerpos monoclonales existentes y cualquier otro anticuerpo equivalente que sea inmunoespecífico para un epítopo patógeno deseado se pueden secuenciar y producir de forma recombinante por cualquier medio conocido en la técnica. En un ejemplo, tal anticuerpo se secuencia y la secuencia polinucleotídica se clona luego en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped posteriormente puede expandirse y congelarse para su uso futuro. La secuencia polinucleotídica de tales anticuerpos puede usarse para manipulación genética para generar un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo caninizado, o para mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. La expresión anticuerpo "humanizado" se refiere a una molécula quimérica, preparada de forma general usando técnicas recombinantes, que tiene un sitio de unión a antígeno derivado de una inmunoglobulina procedente de una especie no humana, mientras que el resto de la estructura de inmunoglobulina de la molécula está basada en la estructura y/o en la secuencia de una inmunoglobulina humana. La secuencia polinucleotídica de los dominios variables de tales anticuerpos puede usarse para manipulación genética para generar tales derivados y mejorar la afinidad u otras características de tales anticuerpos. El principio general para humanizar un anticuerpo implica conservar la secuencia básica de la porción del anticuerpo que se une al antígeno, mientras se intercambia el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpos humanos. Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida (2) diseñar el anticuerpo humanizado o el anticuerpo caninizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización o caninización (3) utilizar las metodologías/técnicas de humanización o caninización reales y (4) realizar la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; y 6.331.415.

El dominio de unión al epítopo de tales anticuerpos puede comprender dominios variables completos fusionados con dominios constantes o solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígenos pueden ser de tipo silvestre o estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. Esto elimina la región constante como inmunógeno en individuos humanos, pero sigue existiendo la posibilidad de una respuesta inmunitaria a la región variable extraña (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 86:4220-4224). Otro enfoque se centra no solamente en proporcionar regiones constantes derivadas de regiones humanas, sino en la modificación de las regiones variables, así como en una remodelación tan estrecha como sea posible de las mismas a la forma humana. Se sabe que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que varían en respuesta a los antígenos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones marco (FR) que están relativamente conservadas en una especie dada y que supuestamente proporcionan un andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un antígeno particular, las regiones variables se pueden "remodelar" o "humanizar" injertando CDR derivadas de anticuerpos no humanos en las FR presentes en el anticuerpo humano que se va a modificar. La aplicación de este enfoque a diversos anticuerpos se ha notificado por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 89:4285-4289; y Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. En algunos casos, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR procedentes de anticuerpos de ratón).

En otros casos, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) que difieren en secuencia con respecto al anticuerpo original.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpos "humanizadas" que comprenden un sitio de unión al antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor o roedor modificado y sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) asociadas fusionadas a dominios constantes humanos (véase, por ejemplo, Winter et al. (1991) "Man-made Antibodies," Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen," J. Immunol. 138:4534-4538, and Brown et al. (1987) "Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583). Otras referencias describen CDR de roedores injertadas en una región marco (FR) de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (véase, por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; y Jones et al. (1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse," Nature 321:522-525). Otra referencia describe CDR de roedor soportadas por regiones marco de roedor revestidas de forma recombinante. Véase, por ejemplo, la publicación de patente europea n.° 0.519.596. Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada hacia las moléculas de anticuerpos anti-humano de roedores, lo que limita la duración y eficacia de las aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Se describen otros métodos de humanización de anticuerpos que también pueden utilizarse por Daugherty et al. (1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins," Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 y en las patentes de Estados Unidos n.° 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; y 5.866.692.

B. Anticuerpos biespecíficos, diacuerpos multiespecíficos y diacuerpos DART™

Los anticuerpos naturales son capaces de unirse a una sola especie de epítopo (es decir, son "monoespecíficos"), aunque pueden unir múltiples copias de esa especie (es decir, pueden presentar bi-valencia o multi-valencia). Se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpos biespecíficos recombinantes (véanse, por ejemplo, las publicaciones del PCT n.° WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), de las que la mayoría utilizan péptidos enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína de unión adicional (por ejemplo, scFv, VL, VH, etc.) al el núcleo del anticuerpo o dentro de este, o para fusionar múltiples porciones de anticuerpos o para fusionar (por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv) a un dominio promotor de heterodimerización tal como el dominio CH2-CH3 o polipéptidos alternativos (documentos WO 2005/070966, WO 2006/107786A, WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Normalmente, tales enfoques implican compromisos y compensaciones. Por ejemplo, las publicaciones del PCT n.° WO 2013/174873, WO 2011/133886 y WO 2010/136172 desvelan que el uso de enlazadores puede causar problemas en entornos terapéuticos, y enseña un anticuerpo triespecífico en el que los dominios CL y CH1 están cambiados con respecto a sus respectivas posiciones naturales y los dominios VL y VH se han diversificado (documentos WO 2008/027236; WO 2010/108127) para permitir la unión a más de un antígeno. Por lo tanto, las moléculas desveladas en estos documentos cambian la especificidad de unión por la capacidad de unirse a especies de antígeno adicionales. Las publicaciones del PCT n.° w O 2013/163427 y WO 2013/119903 desvelan la modificación del dominio CH2 para que contenga un aducto de proteína de fusión que comprende un dominio de unión. El documento señala que el dominio CH2 probablemente solo juega un papel mínimo en la mediación de la función efectora. las publicaciones del PCT n.° WO 2010/028797, WO2010028796 y WO 2010/028795 desvelan anticuerpos recombinantes cuyos dominios Fc se han reemplazado con dominios VL y Vh adicionales, para formar moléculas de unión trivalentes. Las publicaciones del PCT n.° WO 2003/025018 y WO2003012069 desvelan diacuerpos recombinantes cuyas cadenas individuales contienen dominios scFv. Las publicaciones del PCT n.° WO 2013/006544 desvelan moléculas Fab multivalentes que se sintetizan como una única cadena polipeptídica y luego se someten a proteólisis para producir estructuras heterodiméricas. Por lo tanto, las moléculas desveladas en estos documentos cambian toda o parte de la capacidad de mediar la función efectora por la capacidad de unirse a especies de antígenos adicionales. las publicaciones del PCT n.° WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 y WO 1991/003493 desvelan la adición de dominios de unión o grupos funcionales adicionales a un anticuerpo o a una porción de anticuerpo (por ejemplo, la adición de un diacuerpo a la cadena ligera del anticuerpo, o la adición de dominios VL y VH adicionales a las cadenas ligera y pesada del anticuerpo, o la adición de una proteína de fusión heteróloga o el encadenamiento de múltiples dominios Fab entre sí). Por lo tanto, las moléculas desveladas en estos documentos cambian la estructura del anticuerpo nativo por la capacidad de unirse a especies de antígeno adicionales.

La técnica también ha señalado la capacidad de producir diacuerpos que difieren de tales anticuerpos naturales en ser capaces de unirse a dos o más especies de epítopos diferentes (es decir, al presentar biespecificidad o multiespecificidad además de bivalencia o multivalencia) (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90:6444-6448; documento US 2004/0058400 (Hollinger et al.); documento US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem.

280(20): 19665-19672; documento WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single-chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8): 583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944).

El diseño de un diacuerpo se basa en la estructura de fragmentos de dominio variable monocatenarios (scFv). Tales moléculas se preparan uniendo dominios variables de cadena ligera y/o pesada entre sí a través de un péptido enlazador corto. Bird et al. (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426) describe un ejemplo de péptidos enlazadores que forman un puente de aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi de un dominio variable y el extremo amino del otro dominio variable. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). Los enlazadores, a su vez, se pueden modificar para funciones adicionales, tales como la fijación de fármacos o la fijación a soportes sólidos. Las variantes monocatenarias pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el scFv se puede introducir en una célula hospedadora adecuada, ya sea eucariota, tal como una levadura, una célula vegetal, de insecto o de mamífero, o procariota, tal como E. coli. Se pueden preparar polinucleótidos que codifican el scFv de interés mediante manipulaciones de rutina tales como ligamiento de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse usando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.

La patente de Estados Unidos n.° 7.585.952 y la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010-0173978 se refieren a moléculas de scFv que son inmunoespecíficas para ErbB2. Se han descrito captadores biespecíficos de células T ("BiTEs"), un tipo de molécula de scFv (documento WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells," Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody," Science 321: 974-977). Estas moléculas están compuestas por una única molécula de cadena polipeptídica que tiene dos dominios de unión a antígeno, de los que uno se une inmunoespecíficamente a un epítopo de CD3 y el otro se une inmunoespecíficamente a un antígeno presente en la superficie de una célula diana.

La provisión de diacuerpos no monoespecíficos proporciona una ventaja significativa: la capacidad de co-ligar y co localizar células que expresan diferentes epítopos. Por lo tanto, los diacuerpos bivalentes tienen una amplia gama de aplicaciones entre las que se incluyen la terapia y el inmunodiagnóstico. La bivalencia permite tener gran flexibilidad en el diseño y la modificación por ingeniería genética del diacuerpo en diversas aplicaciones, proporcionando mejor avidez hacia los antígenos multiméricos, la reticulación de diferentes antígenos y el direccionamiento dirigido a tipos específicos de células basándose en la presencia de los dos antígenos diana. Debido a su mayor valencia, a sus bajas constantes de disociación y a su rápido aclaramiento de la circulación (para diacuerpos de pequeño tamaño, en o por debajo de ~50 kDa), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han demostrado una utilidad particular en el campo de la generación de imágenes de tumores (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,"Protein Eng. 10:1221). Tiene una importancia particular la coligación de diferentes células, por ejemplo, el entrecruzamiento de linfocitos T citotóxicos con células tumorales (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631 y Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305).

Los dominios de unión al epítopo de diacuerpos pueden dirigirse a un determinante de superficie de cualquier célula efectora inmunitaria, tal como CD3, CD16, CD32, CD64, etc., que se expresan en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otras células mononucleares. En muchos estudios, también se observó que la unión del diacuerpo a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores de Fcy (FcyR), activa a la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; documentos WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; y WO 2012/162068). Normalmente, la activación de células efectoras se desencadena por la unión de un anticuerpo unido a un antígeno a una célula efectora a través de la interacción Fc-FcyR; por lo tanto, en este sentido, las moléculas de diacuerpo pueden presentar una funcionalidad similar a la Ig independientemente de si comprenden un dominio Fc (por ejemplo, como se analiza en cualquier ensayo de la función efectora conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Mediante el entrecruzamiento de células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solo lleva la célula efectora a las proximidades de las células tumorales, sino que conduce a la destrucción eficaz del tumor (véase, por ejemplo, Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.171.586 se refiere a la producción de anticuerpos biespecíficos mediante la escisión proteolítica de dos anticuerpos para obtener sus fragmentos F(ab')2, a la reducción de dichos fragmentos en condiciones para prevenir la formación de enlaces disulfuro intermoleculares y después a la mezcla de los fragmentos para generar el anticuerpo biespecífico). Las patentes de Estados Unidos n.° 6.551.592; 6.994.853 y 8.277.806 y las publicaciones del PCT n.° WO 2012/156430, WO 2002/020039, WO 2000/018806 y WO 1998/003670 se refieren a la producción de anticuerpos triespecíficos capaces de unirse simultáneamente a células T y otros antígenos en una célula tumoral y, a través de la porción Fc del anticuerpo biespecífico, al receptor Fc de células que poseen dicho receptor. las publicaciones del PCT n.° WO 2000/018806, Los documentos w O 1998/003670 y W o 2006/072152 se refieren a la producción de anticuerpos triespecíficos capaces de unirse simultáneamente a células T y a otros antígenos. La publicación de patente de Estados Unidos n.° 2008-0057054 desvela conjugados biespecíficos específicos para un elemento de unión contra oligómeros de beta amiloides y un elemento de unión contra la proteína transmembrana telencefalina. La publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010-0291112 se refiere a moléculas Fv monocatenarias biespecíficas y triespecíficas que se unen específicamente a uno (o dos) antígenos tumorales y a un antígeno de células efectoras (tal como CD3, CD16, CD32, CD64, etc.).

Las publicaciones del PCT n.° WO 1999/042597 y WO 1998/006749 desvelan derivados de anticuerpos que comprenden dominios de unión al complejo mayor de histocompatibilidad humano, con o sin péptidos de unión al MHC unidos. La publicación del PCT n.° WO 02/072141 se refiere a moléculas de unión multiespecíficas cuyas tasas de activación (tasas a las que se unen a las moléculas diana) y tasas de desactivación (tasas a las que liberan las moléculas diana) difieren para unirse preferentemente a una diana en comparación con su unión a la otra molécula diana. Moléculas triespecíficas, por ejemplo, moléculas que tienen una primera porción monovalente que es un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD28, y una segunda porción que comprende un resto que ejerce una función inmunitaria divalente que se une inmunoespecíficamente a uno o más ligandos diana en una célula diana enferma o una célula inmunitaria.

La patente de Estados Unidos n.° 7.695.936 y la publicación de patente 2007/0196363 se refieren a anticuerpos biespecíficos que se forman a partir de las cadenas pesadas de dos anticuerpos, de los que uno posee una protuberancia incorporada por ingeniería genética en su cadena pesada y el otro posee una cavidad complementaria incorporada por ingeniería genética en su cadena pesada. Se enseña que la presencia de tales "botones" y "ojales" complementarios forma preferentemente heteroanticuerpos biespecíficos (que tienen una cadena pesada de cada uno de dichos anticuerpos) en relación con los homoanticuerpos monoespecíficos que contienen dos cadenas pesadas del mismo anticuerpo. Se proponen diversos heteroanticuerpos biespecíficos, incluidos los que son inmunoespecíficos para CD3 y un antígeno de células tumorales. También se proponen diversos heteroanticuerpos triespecíficos, incluidos algunos que son inmunoespecíficos para CD3, CD8 y CD37 (una proteína transmembrana expresada predominantemente en células B que está involucrada en la regulación de la proliferación de células T (Robak, T. et al. (2014) "Anti-CD37 Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia," Expert Opin. Biol. Ther. 14(5):651-661), sin embargo, no se proporciona ningún mecanismo para su producción ni divulgación de su estructura.

La publicación del PCT WO2012-162561 se refiere a moléculas de unión tetravalentes biespecíficas que comprenden dos polipéptidos, de los que cada uno comprende dos estructuras de diacuerpo, separados por un dominio CH2-CH3 intermedio. El documento también se refiere a moléculas de unión tetravalentes compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas en las que dos de las cadenas polipeptídicas contienen dominios ligeros variables y pesados variables para dos antígenos, y en las que las otras dos cadenas polipeptídicas contienen los dominios pesados variables y ligeros variables complementarios para los antígenos y un dominio CH2-CH3 terminal. Las moléculas de unión tetravalentes biespecíficas se forman a través de la asociación de sus respectivos dominios CH2-CH3. En la construcción de la cadena de cuatro polipéptidos, las cadenas "ligeras" no se unen covalentemente a las cadenas pesadas, lo que conduce a la inestabilidad (véase, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672). El documento desvela una tercera construcción en la que las cadenas se han alterado para proporcionar tal enlace covalente, pero a costa de eliminar su biespecificidad (es decir, las moléculas son monoespecíficas). Se desvelan moléculas que tienen especificidad por CD2, CD3, CD4, CD8, CD161, un receptor de quimioquinas, CD95, CCR5, etc. No se desvela una molécula biespecífica capaz de unirse tanto a CD3 como a CD8.

Sin embargo, las ventajas anteriores tienen un coste notable. La formación de tales diacuerpos no monoespecíficos requiere el ensamblaje exitoso de dos o más polipéptidos distintos y diferentes (es decir, tal formación requiere que los diacuerpos se formen mediante la heterodimerización de diferentes especies de cadenas polipeptídicas). Este hecho contrasta con los diacuerpos monoespecíficos, que se forman mediante la homodimerización de cadenas polipeptídicas idénticas. Debido a que deben proporcionarse al menos dos polipéptidos diferentes (es decir, dos especies de polipéptidos) para formar un diacuerpo no monoespecífico, y debido a que la homodimerización de tales polipéptidos conduce a moléculas inactivas (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), la producción de dichos polipéptidos debe lograrse de tal manera que se evite la unión covalente entre polipéptidos de la misma especie (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). Por lo tanto, la técnica ha enseñado la asociación no covalente de tales polipéptidos (véase, por ejemplo, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows SiteSpecific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8): 583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The InsulinLike Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).

Sin embargo, la técnica ha reconocido que los diacuerpos biespecíficos compuestos de polipéptidos asociados no covalentemente son inestables y se disocian fácilmente en monómeros no funcionales (véase, por ejemplo, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).

Frente a este desafío, la técnica ha conseguido desarrollar diacuerpos heterodiméricos no monoespecíficos unidos covalentemente, denominados DART™ (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; la publicación de patente europea n.° EP 2714079; los documentos EP 2601216; EP 2376109; y EP 2158221 y las publicaciones del PCT n.° WO/2012/162068; WO 2012/018687; y WO 2010/080538; y Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449). Dichos diacuerpos comprenden dos o más polipéptidos complejados covalentemente e implican la introducción por ingeniería genética de uno o más restos de cisteína en cada una de las especies polipeptídicas empleadas que permite que se formen enlaces disulfuro y de ese modo la unión covalente de dos cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, se ha demostrado que la adición de un resto de cisteína al extremo C de estos constructos permite que se formen enlaces disulfuro entre las cadenas polipeptídicas, estabilizándose el heterodímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente.

Hay muchos ejemplos de DART™. Cada uno de los dos polipéptidos del ejemplo más sencillo de DART™ comprende tres dominios (Figura 1). El primer polipéptido comprende: (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la primera inmunoglobulina (VL1), (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) y (iii) un tercer dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio que promueve la heterodimerización que sirve para promover la heterodimerización con la segunda cadena polipeptídica. El resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) del tercer dominio sirve para promover la unión covalente de la primera cadena polipeptídica a la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo. El segundo polipéptido contiene: (i) un primer dominio complementario (un dominio que contiene VL2), (ii) un segundo dominio complementario (un dominio que contiene VH1) y (iii) un tercer dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y, opcionalmente, un dominio promotor de la heterodimerización complementario que forma un complejo con el dominio promotor de la heterodimerización de la primera cadena polipeptídica para promover la heterodimerización con la primera cadena polipeptídica. El resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) del tercer dominio de la segunda cadena polipeptídica sirve para promover el enlace covalente de la segunda cadena polipeptídica a la primera cadena polipeptídica del diacuerpo. Estas moléculas son estables, potentes y tienen la capacidad de unirse simultáneamente a dos o más antígenos. Son capaces de promover la muerte redirigida de células que expresan antígenos diana mediada por células T.

En un ejemplo, los terceros dominios del primer y segundo polipéptidos contienen, cada uno, un resto de cisteína, que sirve para unir los polipéptidos entre sí mediante un enlace disulfuro. El tercer dominio de uno o ambos polipéptidos puede poseer adicionalmente la secuencia de un dominio CH2-CH3, de tal manera que la formación de complejos de los polipéptidos de diacuerpo forma un dominio Fc que es capaz de unirse al receptor Fc de células (tales como linfocitos B, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos) (Figuras 2A-2B).

Se han descrito muchas variaciones de estas moléculas (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; la publicación de patente europea n.° EP 2714079; los documentos EP 2601216; EP 2376109; y EP 2158221 y las publicaciones del PCT n.° WO/2012/162068; WO 2012/018687; y WO 2010/080538). Estos DART portadores de Fc pueden comprender tres cadenas polipeptídicas (por ejemplo, Figura 2B). La primera cadena polipeptídica de dicho diacuerpo contiene tres dominios: (i) un dominio que contiene VL1, (ii) un dominio que contiene VH2 y (iii) un dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio que promueve la heterodimerización, y (iv) un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína y un Dominio CH2-CH3. La segunda cadena polipeptídica de dicho DART™ contiene: (i) un dominio que contiene VL2, (ii) un dominio que contiene VH1 y (iii) un dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio promotor de heterodimerización que promueve la heterodimerización con la primera cadena polipeptídica. El resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) del tercer dominio de la segunda cadena polipeptídica sirve para promover el enlace covalente de la segunda cadena polipeptídica a la primera cadena polipeptídica del diacuerpo. El tercer polipéptido de dicho DART™ comprende un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio CH2-CH3. Por lo tanto, la primera y segunda cadenas polipeptídicas de dicho DART™ se asocian entre sí para formar un sitio de unión VL1/VH1 que es capaz de unirse al epítopo, así como un sitio de unión VL2/VH2 que es capaz de unirse al segundo epítopo. El primer y segundo polipéptidos están unidos entre sí a través de un enlace disulfuro en el que están implicados restos de cisteína en sus terceros dominios respectivos. Particularmente, la primera y la tercera cadenas polipeptídicas forman un complejo entre sí para formar un dominio Fc que se estabiliza mediante un enlace disulfuro. Dichos diacuerpos tienen una potencia mejorada. Dichos DART™ portadores de Fc pueden tener dos orientaciones (Tabla 1):

Se han descrito diacuerpos DART™ incluso más complejos, denominados diacuerpos Ig-DART™ (Figuras 3A-3B) y Fc-DART™ (Figura 3C) (documento WO 2012/018687). Los Fc-DART™ tienen cuatro cadenas polipeptídicas. La primera y tercera cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo contienen tres dominios: (i) un dominio que contiene VL1, (ii) un dominio que contiene v H2 y (iii) un dominio que contiene una secuencia CH2-CH3. El segundo y cuarto polipéptidos de Fc-DART™ contienen: (i) un dominio que contiene VL2, (ii) un dominio que contiene VH1 y (iii) un dominio que promueve la heterodimerización y que forma enlaces covalentes con la primera cadena polipeptídica de Fc-DART™. La tercera y la cuarta, y la primera y la segunda cadenas polipeptídicas pueden ser iguales o diferentes para permitir una unión tetravalente que sea monoespecífica, biespecífica o tetraespecífica. Estas moléculas DART™ más complejas también poseen dominios que contienen cisteína que funcionan para formar un complejo unido covalentemente. Los diacuerpos Fc-DART™ contienen dominios CH1 y CL.

Se conocen en la técnica constructos alternativos para aplicaciones en las que es deseable una molécula tetravalente pero no se requiere un Fc, que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos en tándem tetravalentes, también conocidos como "TandAbs" (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2005-0079170, 2007 0031436, 2010-0099853, 2011-020667 y 2013-0189263; las publicaciones de patente europea n.° EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 y EP 1293514; y las publicaciones del PCT n.° WO 1999/057150, WO 2003/025018 y WO 2013/013700) que se forman por la homodimerización de dos cadenas idénticas que poseen, cada una, un dominio VH1, VL2, VH2 y VL2.

Sin embargo, a pesar de todos los avances anteriores, sigue existiendo la necesidad de composiciones que puedan proporcionar un mayor valor terapéutico a pacientes que padecen cáncer u otras enfermedades y afecciones. La presente invención, tal como se define en las reivindicaciones, está dirigida a este y otros objetivos.

Sumario de la invención:

En detalle, y tal como se especifica en las reivindicaciones, la invención proporciona una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes, siendo dichos epítopos el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III, en donde dos de los tres epítopos son epítopos del o de los antígenos del cáncer, y el tercero de dichos epítopos es un epítopo de un antígeno de células efectoras.

En particular, la invención se refiere a la realización de dicha molécula de unión triespecífica en donde la molécula comprende cuatro cadenas polipeptídicas diferentes complejadas covalentemente entre sí y comprende:

(I) un dominio de unión a antígeno I que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo I presente en un primer antígeno, y un dominio de unión a antígeno II que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo II presente en un segundo antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno I y el dominio de unión a antígeno II son dominios de unión de tipo diacuerpo;

(II) un dominio de unión a antígeno III que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo III presente en un tercer antígeno; y

(III) un dominio Fc que se forma mediante la formación de un complejo de dos Dominios CH2-CH3 entre sí;

donde uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un antígeno de células efectoras, otro del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un primer antígeno de cáncer y el otro del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un segundo antígeno de cáncer, y en donde los dominios de unión a antígeno I, II y III de las moléculas de unión median la unión coordinada de una célula efectora del sistema inmunitario que expresa el antígeno de la célula efectora y una célula cancerosa que expresa el primer y segundo antígenos de cáncer.

En particular, la invención se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el dominio Fc es capaz de unirse a un receptor Fc dispuesto en la superficie de una célula.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el antígeno de la célula efectora está dispuesto en la superficie de una célula efectora y en donde los antígenos de cáncer están dispuestos en la superficie de una célula cancerosa, y en donde la unión inmunoespecífica es suficiente para colocalizar el antígeno de la célula efectora y los antígenos de cáncer, facilitando así la activación de la célula efectora contra la célula cancerosa.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el antígeno de la célula efectora se selecciona del grupo que consiste en: CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, el receptor de células B (BCR), el receptor de células T (TCR) y el receptor NKG2D.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el primer y segundo antígenos de cáncer se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: antígeno de cáncer de colon 19.9; una mucina de cáncer gástrico; antígeno 4.2; glicoproteína A33 (gpA33); ADAM-9; antígeno de cáncer gástrico AH6; ALCAM; antígeno de linfocito humano maligno APO-1; antígeno de cáncer B1; B7-H3; beta-catenina; grupo sanguíneo ALe^b/Le^y; antígeno de linfoma de Burkitt-38.13, antígeno de adenocarcinoma de colon C14; antígeno de carcinoma de ovario CA125; Carboxipeptidasa M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD30; CD33; CD36; CD45; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD103; CD317; CDK4; antígeno carcinoembrionario (CEA); CEACAM5; CEACAM6; CO17-1A; CO-43 (grupo sanguíneo Le^b); CO-514 (grupo sanguíneo Le^a); CTA-1; CTLA4; Citoqueratina 8; antígeno D1.1; antígeno D¹56-22; DR5; Serie E¹(grupo sanguíneo B); EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico); Receptor de efrina A2 (EphA2); ErbB1; ErbB3; ErbB4; Ga Ge -1; Ga Ge -2; GD2/GD3/GM2; antígeno de adenocarcinoma de pulmón F3; antígeno FC10.2; G49, GD2 de gangliósido; GD3 de gangliósido; GM2 de gangliósido; GM3 de gangliósido; G^d2; G^d3; GICA 19-9; G^m2; gp100; antígeno de células T de leucemia humana Gp37; antígeno de melanoma gp75; gpA33; antígeno HER2 (p185^HER2); antígeno de glóbulos grasos de leche humana (HMFG); virus del papiloma humano E6/virus del papiloma humano E7; antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA); antígeno I (antígeno de diferenciación) I(Ma); Integrina Alfa-V-Beta-6 Integrina p6 (ITGB6); interleucina-13; Receptor a2 (IL13Ra2); JAM-3; KID3; KID31; Antígeno de pancarcinoma KS 1/4; antígenos de carcinoma de pulmón humano L6 y L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; Myl; N-acetilglucosaminiltransferasa; neoglicoproteína; NS-10; OFA-1; OFA-2; oncostatina M; p15; antígeno asociado con melanoma p97; mucina epitelial polimórfica (PEM); antígeno de mucina epitelial polimórfica (PEMA); PIPA; antígeno específico de la próstata (PSA); antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); fosfato ácido prostático; R²⁴; ROR1; esfingolípidos; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; péptido derivado del receptor de células T; T⁵A⁷; TAG-72; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de TNF-a; receptor de TNF-p; receptor de TNF-y; TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); receptor de transferrina; antígeno de trasplante específico de tumor (TSTA), antígeno-alfa-fetoproteína oncofetal (AFP); VEGF; VEGFR, VEP8; VEP9; VIM-D5; y hapteno Y, Le^y.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el primer y segundo antígenos de cáncer se seleccionan del grupo que consiste en: CD2, CD317, CEACAM5, CEACAM6, DR5, EphA2, gpA33, Her2, B7-H3; EGF, EGFR, VEGF y VEGFR.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el dominio de unión III no de tipo diacuerpo comprende el dominio de unión de tipo Fab (VLiii/ VHiii) que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo III, en donde la molécula comprende:

(A) una primera cadena polipeptídica que comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal:

(1) un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al primero de los tres epítopos (VLi);

(2) un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse a un segundo de los tres epítopos (VHii);

(3) un dominio promotor de heterodímeros; y

(4) dominios ^cH2 y CH3 de una IgG;

(B) una segunda cadena polipeptídica que comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal:

(1) un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al segundo de los tres epítopos (VLii);

(2) un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al primero de los tres epítopos (VHi); y

(3) un dominio promotor de heterodímeros complementario;

(C) una tercera cadena polipeptídica que comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal:

(1) un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse a un tercero de los tres epítopos (VHiii); y

(2) un dominio CH1, un dominio bisagra y un dominio CH2-CH3 de una IgG;

y

(D) una cuarta cadena polipeptídica que comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal:

(1) un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al tercero de los tres epítopos (VLiii); y

(2) un dominio constante de cadena ligera (CL);

en donde:

(i) los dominios VLi y VHi se asocian para formar un dominio capaz de unirse al primer epítopo;

(ii) los dominios VLii y VHii se asocian para formar un dominio capaz de unirse al segundo epítopo;

(iii) los dominios VLiii y VHiii se asocian para formar un dominio capaz de unirse al tercer epítopo;

(iv) los dominios CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica se asocian para formar un dominio Fc;

(v) la primera y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente entre sí;

(vi) la primera y la tercera cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente entre sí; y

(vii) la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas están unidas covalentemente entre sí.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde:

(A) el dominio promotor de heterodímeros es una espiral E y el dominio promotor de heterodímeros complementario es una espiral K; o

(B) el dominio promotor de heterodímeros es una espiral K y el dominio promotor de heterodímeros complementario es una espiral E.

(A) los dominios CH2-CH3 de la primera y tercera cadenas polipeptídicas tienen cada uno la secuencia de SEQ ID NO: 1, de manera que el dominio Fc formado a partir de su asociación presenta una función efectora normal mediada por FcyR; o

(B) el dominio CH2-CH3 de la primera y tercera cadenas polipeptídicas comprende al menos una sustitución de aminoácidos, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO: 1, de manera que el dominio Fc formado a partir de su asociación presenta una función efectora alterada mediada por FcyR.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde dicha al menos una sustitución de aminoácidos comprende al menos una sustitución de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L, en donde la numeración es la del índice EU de Kabat.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde dicha al menos una sustitución de aminoácidos comprende:

(A) al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; (B) al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L y P396L;

(2 ) F243Ly R292P; y

(3) R292P y V305I;

(C) al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P y Y300L;

(2) F243L, R292P y V305I;

(3) F243L, R292P y P396L; y

(4) R292P, V305I y P396L;

(D) al menos cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L y P396L; y

(2) F243L, R292P, V305I y P396L;

o

(E) al menos las cinco sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; y

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L.

La invención también se refiere a la realización de dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el dominio CH2-CH3 de la primera y tercera cadenas polipeptídicas difieren entre sí y tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 53.

(A) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del primer antígeno de cáncer, un epítopo del segundo antígeno de cáncer y un epítopo del antígeno de células efectoras;

(B) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del primer antígeno de cáncer, un epítopo del antígeno de células efectoras y un epítopo del segundo antígeno de cáncer;

(C) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del segundo antígeno de cáncer, un epítopo del primer antígeno de cáncer y un epítopo del antígeno de células efectoras;

(D) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del segundo antígeno de cáncer, un epítopo del antígeno de células efectoras y un epítopo del primer antígeno de cáncer;

(E) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del antígeno de células efectoras, un epítopo del primer antígeno de cáncer y un epítopo del segundo antígeno de cáncer;

y

(F) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del antígeno de células efectoras, un epítopo del segundo antígeno de cáncer y un epítopo del primer antígeno de cáncer.

(A) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD2 reconocido por el anticuerpo Lo-CD2a; (B) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD3 reconocido por el anticuerpo OKT3, M291, YTH12.5, mAb 1 anti-CD3 o mAb 2 anti-CD3;

(C) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD16 reconocido por el anticuerpo 3G8 o A9; (D) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD19 reconocido por el anticuerpo MD1342, m Ed I-551, blinatumomab o HD37;

(E) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD20 reconocido por el anticuerpo rituximab, ibritumomab, ofatumumab y tositumomab;

(F) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD22 reconocido por el anticuerpo epratuzumab;

(G) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD32B reconocido por el anticuerpo mAb 1 de CD32B;

(H) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD64 reconocido por el anticuerpo mAb 1 de CD64;

(I) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo BCR/CD79 reconocido por el anticuerpo mAb 1 de CD79;

(J) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de TCR reconocido por el anticuerpo BMA 031; o (K) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo del receptor NKG2D reconocido por el anticuerpo KYK-2.0.

La invención también se refiere a una composición de ácido nucleico que comprende polinucleótidos que codifican cadenas polipeptídicas, como se especifica en las reivindicaciones.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las moléculas de unión triespecíficas descritas anteriormente y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

La invención también se refiere a la realización de dicha composición farmacéutica o de cualquiera de dichas moléculas de unión triespecíficas para su uso en el tratamiento del cáncer.

La invención también se refiere a la realización de dichas composiciones farmacéuticas o dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el cáncer se caracteriza por la presencia de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en una célula de: un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomisarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico y un cáncer de útero.

La invención también se refiere a la realización de dichas composiciones farmacéuticas o dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el cáncer es un cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioma, cáncer de riñón, cáncer de mama, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, neuroblastoma; sarcoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de páncreas o cáncer de recto.

La invención también se refiere a la realización de dichas composiciones farmacéuticas o dichas moléculas de unión triespecíficas en donde el cáncer es leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), tricoleucemia (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas (BPDCN), linfoma no Hodgkin (NHL), incluyendo leucemia de células del manto (MCL) y linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica o linfoma de Burkitt.

Breve descripción de los dibujos:

Las Figuras 1A-1B muestran una representación esquemática de los dominios de los diacuerpos DART™. La Figura 1A muestra una representación esquemática de los dominios de un diacuerpo DART™ básico. La Figura 1B proporciona un esquema de un diacuerpo unido covalentemente compuesto por dos cadenas polipeptídicas, teniendo cada una un dominio promotor de heterodímeros. Los dominios VL y VH que reconocen el mismo epítopo se muestran utilizando el mismo sombreado.

Las Figuras 2A-2B proporcionan un esquema de diacuerpos unidos covalentemente compuestos por dos cadenas polipeptídicas, teniendo cada una un dominio CH2 y CH3 (Figura 2A) o teniendo solo una de ellas un dominio CH2 y CH3 (Figura 2B), de modo que las cadenas asociadas forman un dominio Fc que comprende todo o parte de un dominio Fc natural. Los dominios VL y VH que reconocen el mismo epítopo se muestran utilizando el mismo sombreado.

Las Figuras 3A-3C proporcionan esquemas que muestran diacuerpos tetravalentes compuestos por dos pares de cadenas polipeptídicas. Los pares son diferentes, dando como resultado una molécula biespecífica que es bivalente con respecto a cada uno de dos epítopos, siendo uno de ellos un epítopo de DR5 y siendo el otro un epítopo de una molécula presente en la superficie de una célula efectora. Un polipéptido de cada par posee un dominio CH2 y CH3, de manera que las cadenas asociadas forman un dominio Fc que comprende todo o parte de un dominio Fc natural. Los dominios VL y VH que reconocen el mismo epítopo se muestran utilizando el mismo sombreado. Solo un par de epítopos (mostrados con el mismo sombreado) es capaz de unirse a DR5. La Figura 3A muestra un diacuerpo de Ig. La Figura 3B muestra un diacuerpo de Ig, que contiene dominios promotores de heterodímeros de espiral E y de espiral K. La Figura 3C muestra un diacuerpo Fc-DART™ que contiene dominios CH1 y CL de anticuerpo. La notación "VL1" y "VH1" denotan, respectivamente, el dominio de cadena ligera variable y el dominio de cadena pesada variable que se unen al "primer" epítopo. De forma similar, la notación "VL2" y "VH2" denotan, respectivamente, el dominio de cadena ligera variable y el dominio de cadena pesada variable que se unen al "segundo" epítopo.

Las Figuras 4A-4G proporcionan una representación esquemática de los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención. Las figuras ilustran esquemáticamente el orden y la orientación de los dominios de las realizaciones de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención. Las Figuras 4A, 4B y 4G ilustran realizaciones en las que la molécula de unión triespecífica se compone de cuatro cadenas polipeptídicas. Las Figuras 4C, 4D, 4E y 4F ilustran realizaciones en las que la molécula de unión está compuesta por tres cadenas polipeptídicas. La molécula puede poseer dominios bisagra y/o CL (Figuras 4A, 4B, 4C, 4E) o puede contener un péptido enlazador alternativo (Figura 4D, 4F, 4G).

Las Figuras 5A-5E proporcionan una representación esquemática de los dominios de una realización alternativa de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, en la que el dominio de unión a células efectoras está compuesto por un dominio de unión de tipo receptor de células efectoras en lugar de un dominio de unión de tipo diacuerpo o un dominio de unión de tipo Fab. Las Figuras 5A y 5B ilustran realizaciones en las que la molécula de unión triespecífica está compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. La Figura 5C y la Figura 5e ilustran una realización en la que la molécula de unión está compuesta por tres cadenas polipeptídicas. La Figura 5D ilustra una realización en la que la molécula de unión está compuesta por cinco cadenas polipeptídicas. La molécula puede poseer dominios bisagra y/o CL o puede contener péptidos enlazadores alternativos.

La Figura 6 muestra la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-DR5 humano mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR5 para unirse al DR5 humano y al DR5 de mono cinomolgo.

La Figura 7, paneles A-H, muestra la cinética de la unión del mAb 1 de DR5 (paneles A y E), el mAb 2 de DR5 (paneles B y F), el mAb 3 de DR5 (paneles C y G) y el mAb 4 de DR5 (paneles D y H) para el DR5 humano (paneles A-D) y para el DR5 de mono cinomolgo (paneles E-H).

La Figura 8 muestra la superioridad inesperada del mAb 1 de DR5 y el mAb 2 de DR5. La superioridad se evaluó comparando la capacidad de los diacuerpos DR5 x CD3 que tienen los dominios VL y VH del mAb 1 de DR5, del mAb 2 de DR5, del mAb 3 de DR5 o del mAb 4 de DR5, para mediar la citotoxicidad de células tumorales de adenocarcinoma del epitelio basal alveolar humano, conocidas como células A549.

Las Figuras 9A-9C demuestran la mejora sinérgica en la unión de las células diana que se consigue cuando los dos dominios de unión al antígeno de cáncer de una molécula de unión triespecífica de la presente invención son capaces de unirse a una célula diana. La Figura 9A muestra la unión obtenida cuando moléculas triespecíficas: mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5; mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33; y mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 se incuban en presencia de células CHO que expresan EphA2. La Figura 9B muestra la unión obtenida cuando tales moléculas triespecíficas se incuban en presencia de células CHO que expresan DR5. La Figura 9C muestra la unión obtenida cuando se incuban tales moléculas triespecíficas en presencia de células de próstata humanas DU145 que expresan EphA2 y DR5, pero no gpA33.

Las Figuras 10A-10C demuestran el aumento sinérgico en la citotoxicidad de la célula diana que se consigue cuando los dos dominios de unión al antígeno de cáncer de una molécula de unión triespecífica de la presente invención son capaces de unirse a una célula diana. La Figura 10A muestra el porcentaje de citotoxicidad obtenido al incubar moléculas triespecíficas: mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5; mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33; y mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 en presencia de células CHO que expresan EphA2 y linfocitos citotóxicos. La Figura 10B muestra el porcentaje de citotoxicidad obtenido cuando dichas moléculas triespecíficas se incuban en presencia de células CHO que expresan DR5 y linfocitos citotóxicos. La Figura 10C muestra la citotoxicidad obtenida cuando dichas moléculas triespecíficas se incuban en presencia de células de próstata humana DU145 y linfocitos citotóxicos. Las células DU145 expresan EphA2 y DR5, pero no gpA33. La citotoxicidad se midió mediante el aumento de luminiscencia provocado por la liberación de luciferasa tras la lisis celular.

Descripción detallada de la invención:

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden incluir dominios de unión a epítopo de derivados humanizados quiméricos o caninizados de los anticuerpos mencionados anteriormente, por ejemplo, mAb 1 de DR5 o mAb 2 de DR5.

I. Técnicas generales y definiciones generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en las referencias, tales como, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Tercera edición (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. y Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) New York, NY; WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al., Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al., eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al. 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. et al. Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, Uk ); and DEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, OCTAVA EDICIÓN, DeVita, V. et al. Eds.

2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

II. Moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención

A. Capacidades de unión

Las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención pueden unirse de forma coordinada y simultánea a tres epítopos diferentes. Las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención comprenden:

(I) un "Dominio de Unión I" que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un "Epítopo I" presente en un primer antígeno y un "Dominio de Unión II" que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un "Epítopo II" presente en un segundo antígeno, en donde dicho Dominio de unión I y dicho Dominio de unión II son ambos "Dominios de Unión de Tipo-Diacuerpo;"

(II) un "Dominio de Unión III" que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un "Epítopo III" presente en un tercer antígeno; y

(III) un Dominio Fc que se forma mediante la formación de un complejo de dos Dominios CH2-CH3 entre sí;

en donde:

(A) uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un primer "Antígeno de cáncer";

(B) un segundo del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un segundo Antígeno de cáncer; y (C) el tercero del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de una molécula expresada en la superficie de una célula efectora del sistema inmunitario ("Antígeno de célula efectora");

y en donde los dominios de unión I, II y III de las moléculas de unión median la unión coordinada de la célula efectora del sistema inmunitario y una célula que expresa tanto el primer como el segundo antígenos de cáncer para colocalizar de ese modo tales células.

Los dominios de unión al epítopo de diacuerpos también pueden dirigirse a un determinante de superficie de una célula B, tal como CD19, CD20, CD22, CD30, CD37, CD40 y CD74 (Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Cheson, B.D. et al. (2008) "Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin's Lymphoma," N. Engl. J. Med.

359(6):613-626; Castillo, J. et al. (2008) "Newer monoclonal antibodies for hematological malignancies," Exp. Hematol.

36(7):755-768. En muchos estudios, también se observó que la unión del diacuerpo a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores de Fcy (FcyR), activa a la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bi-specific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-Cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bi-specific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, la activación de células efectoras se desencadena por la unión de un anticuerpo unido al antígeno a una célula efectora a través de la interacción de Fc y FcyR; por lo tanto, en este sentido, las moléculas de diacuerpo pueden presentar una funcionalidad similar a la de Ig independientemente de si comprenden un dominio Fc (por ejemplo, como se analiza en cualquier ensayo de la función efectora conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Mediante el entrecruzamiento de células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solo lleva la célula efectora a las proximidades de las células tumorales, sino que conduce a la destrucción eficaz del tumor (véase, por ejemplo, Cao et al. (2003) "Bi-specific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).

Aunque se prefieren en particular tales moléculas de unión triespecíficas, la invención también contempla específicamente moléculas de unión triespecíficas que comprenden cualquier combinación de dominios de unión suficiente para producir una molécula que tiene tres especificidades de unión, de las cuales dos son especificidades de unión dirigidas contra antígenos de cáncer y una es una especificidad de unión dirigida contra un antígeno de células efectoras. Por lo tanto, por ejemplo, la invención contempla: una molécula de unión triespecífica que comprende tres dominios de unión tipo Fab, una molécula de unión triespecífica que comprende un dominio de anticuerpo biespecífico bivalente (formado, por ejemplo, complejando dos cadenas ligeras diferentes y dos cadenas pesadas diferentes) y un dominio de unión de tipo Fab, una molécula de unión triespecífica que comprende dos dominios de anticuerpo biespecífico bivalente (formados, por ejemplo, complejando cuatro cadenas ligeras diferentes y dos cadenas pesadas diferentes), pero en el que uno de los dominios de anticuerpo se ha vuelto inactivo, etc.

Los términos "polipéptido", "cadena polipeptídica", y "péptido" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud, pero especialmente longitudes superiores a 3, 5, 10, 15, 20 o 25 restos de aminoácidos, en los que dos y, más preferentemente, todos de los restos de aminoácidos están unidos mediante un enlace amida (peptídico) (-NH-C(O)-). Sin embargo, el polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos de esta divulgación pueden presentarse como cadenas sencillas o como cadenas complejadas (como se especifica en las reivindicaciones).

Un "Dominio de unión de tipo diacuerpo" es el dominio de unión al epítopo de un diacuerpo y, especialmente, un diacuerpo DART®. Las expresiones "diacuerpo" y "diacuerpo DART®" se han analizado anteriormente y se refieren a una molécula que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que preferentemente forman complejos entre sí a través de una interacción covalente para formar al menos dos sitios de unión al epítopo, que pueden reconocer epítopos iguales o diferentes. Dos de las cadenas polipeptídicas de un diacuerpo o diacuerpo DART® comprenden, cada una, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, pero estas regiones no interaccionan para formar un sitio de unión al epítopo (es decir, no son mutuamente "complementarias"). Más bien, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de una de las cadenas (por ejemplo, la primera) del diacuerpo, o diacuerpo DART®, interacciona con la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica de un diacuerpo o diacuerpo DART® diferente (por ejemplo, la segunda), para formar un sitio de unión al epítopo. De forma similar, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de una de las cadenas polipeptídicas (por ejemplo, la primera) del diacuerpo, o diacuerpo DART®, interacciona con la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica de un diacuerpo o diacuerpo DART® diferente (por ejemplo, la segunda), para formar un sitio de unión al epítopo. Se desvelan moléculas de diacuerpo DART® en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; la publicación de patente europea n.° EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y las publicaciones del PCT n.° WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665, WO 2008/157379 y Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bi-specific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; y Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449.

Un dominio de unión III es preferentemente un dominio de unión que "no es de tipo diacuerpo", que pretende indicar que el dominio de unión III no tiene la estructura de un dominio de unión de tipo diacuerpo. Preferentemente, el dominio de unión III es un dominio de unión que no es de tipo diacuerpo que es un dominio de unión de tipo Fab o un dominio de unión de tipo receptor de célula efectora. Por lo tanto, en una realización, como se ilustra en las Figuras 4A-4G, el dominio de unión III es un dominio de unión de tipo Fab. Las Figuras 5A-5E ejemplifican la realización en la que el dominio de unión III es un dominio de unión de tipo receptor de célula efectora. Tal como se usa en el presente documento, la expresión un "dominio de unión de tipo Fab" se refiere a un dominio de unión a epítopo que se forma mediante la interacción del dominio VL de una cadena ligera de inmunoglobulina y un dominio VH complementario de una cadena pesada de inmunoglobulina. Los dominios de unión de tipo Fab difieren del dominio de unión de tipo diacuerpo en que las dos cadenas polipeptídicas que forman un dominio de unión de tipo Fab comprenden solo un dominio de unión de un solo epítopo, mientras que las dos cadenas polipeptídicas que forman un dominio de unión de tipo diacuerpo comprenden al menos dos dominios de unión a epítopo. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, los dominios de unión de tipo Fab son distintos del dominio de unión de tipo diacuerpo. Cuando un dominio de unión es un dominio de unión de tipo Fab o un dominio de unión de tipo diacuerpo, estará compuesto por un dominio VL y un dominio VH, que puede estar situado en la misma o en diferentes cadenas polipeptídicas. La selección de dichos dominios VL y VH está coordinada, de manera que los dominios forman un dominio de unión a epítopo. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "Dominio de unión de tipo receptor de célula efectora" se refiere a un dominio de unión a epítopo que se forma mediante la interacción de un dominio variable de una cadena alfa del receptor de células T y un dominio variable de una cadena beta del receptor de células T. Dichos receptores reconocen péptidos presentados en el contexto del MHC y, por tanto, son capaces de reconocer epítopos intracelulares.

Por tanto, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se distinguen de las moléculas de unión tetravalentes, tales como las producidas a partir de la dimerización de un anticuerpo bivalente, y preferentemente poseen tres y no cuatro dominios de unión. Como se analiza posteriormente, las moléculas triespecíficas de la presente invención pueden poseer dominios de unión adicionales (tales como un dominio de unión a albúmina, un dominio de unión a FcyR, etc.). No se pretende que tales dominios de unión adicionales sean considerados o contados como uno de los tres dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "asociación" o "asociar", con respecto a los polipéptidos (por ejemplo, un polipéptido de diacuerpo a otro, una cadena ligera de inmunoglobulina a una cadena pesada de inmunoglobulina, un dominio CH2-CH3 a otro dominio CH2-CH3, etc.) pretenden indicar una combinación no covalente de los polipéptidos. Con los términos "complejos" o "complejante" se pretende indicar una combinación covalente de los polipéptidos.

Tal como se usa en el presente documento, se dice que los dominios de unión de una molécula de unión de la invención median un "enlace coordinado" si al menos dos de sus dominios de unión, y preferentemente todos sus dominios de unión, son capaces de unirse al mismo tiempo a sus respectivos epítopos o ligando de unión reconocidos. Esta unión puede ser simultánea. Sin embargo, un aspecto de la presente invención se refiere a la modificación de las tasas de "asociación" y/o "disociación" con las que dichos dominios de unión se unen a sus epítopos reconocidos. Tal como se utiliza en el presente documento, la "tasa de asociación" de la unión es una medida de la afinidad con la que dichos dominios de unión reconocen e inician la unión a sus epítopos reconocidos. Por el contrario, la "tasa de disociación" de la unión es una medida del grado de estabilidad del complejo formado por el dominio de unión y el epítopo. Las tasas de "asociación" y/o "disociación" de la unión pueden modificarse alterando la secuencia de aminoácidos de las CDR de un dominio de unión. Como se analiza posteriormente, independientemente de cualquier modificación de CDR, el grado de unión coordinada de las moléculas de la presente invención se puede modular cambiando la configuración de sus dominios de unión de modo que un dominio de unión particular (es decir, un dominio VLx/VHx) esté presente como dominio de unión III o como un dominio de unión de tipo diacuerpo interno o externo en relación con el dominio de unión III (analizado en detalle más adelante).

Las tasas de asociación y disociación de los dominios de unión de las moléculas de unión de la presente invención se pueden medir fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante análisis Biacore® (Jason-Moller, L. et al. (2006) "Overview Of Biacore Systems And Their Applications," Curr. Protoc. Protein Sci. Capítulo 19: Unidad 19.13; Swanson, S.J. (2005) "Characterization Of An Immune Response," Dev. Biol. (Basilea).

122:95-101; Buijs, J. et al. (2005) "SPR-MS In Functional Proteomics," Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(1):39-47; Karlsson, R. et al. (2004) "SPR For Molecular Interaction Analysis: A Review Of Emerging Application Areas," J. Mol. Recognit. 17(3):151-161; Van Regenmortel, M.H. (2003) "Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements," Dev. Biol. (Basilea) 112:141-151; Malmqvist, M. (1999) "BIACORE: An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions," Biochem. Soc. Trans. 27(2):335-340; Malmqvist, M. et al. (1997) "Biomolecular Interaction Analysis: Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins," Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):378-383; Fivash, M. et al. (1998) "Biacore For Macromolecular Interaction," Curr. Opin. Biotechnol.

9(1):97-101; Malmborg, A.C. et al. (1995) "Biacore As A Tool In Antibody Engineering," J. Immunol. Methods. 183(1):7-13). Las tasas de asociación y disociación de los dominios de unión de las moléculas de unión de la presente invención se pueden alterar fácilmente mediante mutagénesis aleatoria o dirigida de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos dominios de unión, seguido por el cribado de rutina de las moléculas de ácido nucleico recuperadas por su capacidad para codificar proteínas mutadas que presentan tal cinética de unión alterada.

Los dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se unen a epítopos de una manera "inmunoespecífica". Tal como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo, diacuerpo u otra molécula de unión a epítopo se une "inmunoespecíficamente" a una región de otra molécula (es decir, un epítopo) si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con ese epítopo en relación con epítopos alternativos. Por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítopo viral es un anticuerpo que se une a este epítopo viral con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que cuando se une inmunoespecíficamente a otros epítopos virales o no virales. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une inmunoespecíficamente a una primera diana puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Por lo tanto, una "unión específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa unión "específica". Se dice que dos moléculas son capaces de unirse entre sí de una manera "fisioespecífica", si dicha unión presenta la especificidad con la que los receptores se unen a sus respectivos ligandos.

La funcionalidad de los anticuerpos se puede mejorar generando moléculas multiespecíficas basadas en anticuerpos que puedan unirse simultáneamente a dos antígenos independientes y distintos (o diferentes epítopos del mismo antígeno) y/o generando una molécula basada en anticuerpos que tenga una mayor valencia (es decir, más de dos sitios de unión) para el mismo epítopo y/o antígeno.

Por lo tanto, en su realización más simple, las moléculas de unión preferidas de la presente invención son al menos triespecíficas. De manera significativa, estas moléculas tienen al menos tres sitios que son capaces de unirse al antígeno: un dominio de unión de tipo diacuerpo "externo" que se encuentra más alejado del dominio de unión III, un dominio de unión de tipo diacuerpo "interno" que se encuentra más cerca del dominio de unión III, y el propio dominio de unión III. Las posiciones de dichos dominios se designan respectivamente como "Sitio A", Sitio B" y "Sitio C" (Figuras 4A-4G; Figuras 5A-5E).

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención son capaces de unirse coordinadamente a tres epítopos diferentes al comprender tres dominios de unión. Dos de los dominios de unión de estas moléculas son capaces de unirse a epítopos de "Antígenos de cáncer", de manera que la molécula es capaz de unirse a dos antígenos de cáncer diferentes. El tercer dominio de unión de tales moléculas es capaz de unirse a un epítopo de una molécula expresada en la superficie de una célula efectora del sistema inmunitario (es decir, un "Antígeno de célula efectora"). Por lo tanto, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención son capaces de mediar la unión coordinada y simultánea a una célula de cáncer que expresa dos antígenos de cáncer y a una célula efectora del sistema inmunitario que expresa el antígeno de célula efectora. Los epítopos reconocidos por las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden ser continuos o discontinuos (por ejemplo, conformacionales).

El primer y segundo antígenos de cáncer que se unen a los dominios de unión a antígeno de cáncer de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden seleccionarse de cualquier molécula que esté presente de forma característica en la superficie de una célula cancerosa. Un aspecto de la presente invención se refiere a la capacidad de establecer como diana "antígenos de cáncer de baja expresión" (es decir, un antígeno de cáncer que puede expresarse en una célula cancerosa a un nivel demasiado bajo como para permitir que una molécula de unión monoespecífica proporcione una terapia eficaz para el cáncer). A diferencia de lo que ocurre con estas moléculas de unión monoespecíficas, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, al dirigirse a dos antígenos de cáncer en lugar de a uno, presentan una avidez de unión mejorada sinérgica y cooperativa que puede compensar la baja afinidad de unión y, por tanto, puede usarse ventajosamente para dirigirse a cánceres caracterizados incluso por un antígeno de cáncer de baja expresión. Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a la capacidad de establecer como diana "antígenos de cáncer de baja especificidad" (es decir, un antígeno de cáncer que puede expresarse en una célula normal además de expresarse en una célula cancerosa). Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, al proporcionar una avidez de unión mejorada sinérgica y cooperativa a dos antígenos de cáncer, presenta una mayor avidez de unión incluso para antígenos de cáncer de baja especificidad y, por lo tanto, proporciona un medio para tratar cánceres que se caracterizan por estos antígenos de cáncer. Por lo tanto, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden usar para impartir una terapia anticancerosa incluso en circunstancias en las que uno o los dos de los antígenos de cáncer diana son ineficaces por sí mismos para proporcionar dicha terapia.

Por ejemplo, CD32B (el receptor FcyRIIB) se expresa ampliamente en las células hematopoyéticas, incluyendo monocitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. Al unirse al dominio Fc de IgG, CD32B inhibe el sistema inmunitario del hospedador deprimiendo de esta manera una respuesta inmunitaria en curso. Aunque tal inhibición es deseable para ayudar al hospedador a recuperarse de reacciones inflamatorias, actúa exacerbando las deficiencias inmunitarias de sujetos que padecen cáncer o enfermedades infecciosas. Los anticuerpos que se unen a CD32B, que bloquean la unión de moléculas de Fc de IgG, sirven para prevenir dicha inhibición y, por lo tanto, tienen utilidad como moléculas auxiliares en el tratamiento de cánceres y de enfermedades infecciosas (Veri, M.C. et al. (2007) "Monoclonal Antibodies Capable Of Discriminating The Human Inhibitory Fcgamma-Receptor IIB (CD32B) From The Activating Fcgamma-Receptor IIA (CD32A): Biochemical, Biological And Functional Characterization," Immunology 121(3):392-404). Desafortunadamente, CD32B también se expresa en células endoteliales sinusoidales hepáticas ("células LSE") (Shahani, T. et al. (2014) "Human Liver Sinusoidal Endothelial Cells But Not Hepatocytes Contain Factor VIII," J. Thromb. Haemost. 12(1):36-42; Geraud, C. et al. (2013) "Endothelial Transdifferentiation In Hepatocellular Carcinoma: Loss Of Stabilin-2 Expression In Peri-Tumourous Liver Correlates With Increased Survival," Liver Int. 33(9): 1428-1440; Takabe, Y. et al. (2012) "Immunomagnetic Exclusion Of E-Cadherin-Positive Hepatoblasts In Fetal Mouse Liver Cell Cultures Impairs Morphogenesis And Gene Expression Of Sinusoidal Endothelial Cells," J. Anat. 221(3):229-239). Por lo tanto, los anticuerpos que se unen a CD32B atacan a las células LSE. Sin embargo, mediante la formación de una molécula de unión triespecífica de la presente invención que se une a CD32B y a antígenos (es decir, el primer y segundo antígenos de cáncer) que no se expresan en las células LSE, o que se expresan en niveles bajos en dichas células (es decir, antígeno(s) de cáncer de baja expresión), o se expresan con baja especificidad en células cancerosas y tales células LSE (es decir,, antígeno(s) de cáncer de baja especificidad), la presente invención proporciona composiciones y métodos que se usarían para deprimir la inhibición del sistema inmunitario mediada por CD32B.

B. Dominios de unión a antígenos de cáncer ilustrativos

Los ejemplos de antígenos de cáncer adecuados incluyen: 19.9 encontrado en cáncer de colon, mucinas de cáncer gástrico; 4.2; A33 (un antígeno de carcinoma colorrectal; Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998);

ADAM-9 (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0172350; publicación del PCT n.° WO 06/084075; AH6 encontrado en cáncer gástrico; ALCAM (publicación del PCT n.° WO 03/093443); APO-1 (antígeno de linfocito humano maligno) (Trauth et al. (1989) "Monoclonal Antibody-Mediated Tumor Regression By Induction Of Apoptosis," Science 245:301-304); B1 (Egloff, A.M. et al. 2006, Cancer Res. 66(1):6-9); BAGE (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); B7-H3; beta-catenina (Prange W. et al. 2003 J Pathol. 201(2):250-9); grupo sanguíneo ALeb/Ley encontrado en adenocarcinoma de colon; antígeno de linfoma de Burkitt-38.13, C14 encontrado en adenocarcinoma de colon; CA125 (antígeno de carcinoma de ovario) (Bast, R.C. Jr. et al. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81 ; Yu et al. (1991) "Coexpression Of Different Antigenic Markers On Moieties That Bear CA 125 Determinants," Cancer Res. 51(2):468-475); Carboxipeptidasa M (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0166291);

CD5 (Calin, G.A. et al. 2006 Semin Oncol. 33(2):167-73; CD19 (Ghetie et al. (1994) "Anti-CD19 Inhibits The Growth Of Human B-Cell Tumor Lines In Vitro And Of Daudi Cells In SClD Mice By Inducing Cell Cycle Arrest," Blood 83:1329-1336; Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD20 (Thomas, D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36); CD22 (Kreitman, R.J. 2006 AAPS J. 18;8(3):E532-51); CD23 (Rosati, S. et al. 2005 Curr Top Microbiol Immunol. 5;294:91-107); CD25 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48); CD27 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91 (9): 1234-40); CD28 (Bataille, R. 2006 Haematologica 91(9):1234-40); CD33 (Sgouros et al. (1993) "Modeling And Dosimetry Of Monoclonal Antibody M195 (Anti-CD33) In Acute Myelogenous Leukemia," J. Nucl. Med. 34:422-430); CD36 (Ge, Y. 2005 Lab Hematol. 11(1):31-7); CD40/CD154 (Messmer, D. et al. 2005 Ann N Y Acad Sci. 1062:51-60); CD45 (Jurcic, J.G. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):339-46); CD56 (Bataille, R.

2006 Haematologica 91(9):1234-40); c D46 (patente de Estados Unidos n.° 7.148.038; publicación del PCT n.° WO 03/032814); CD79a/CD79b (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4):139-48; Chu, P.G. et al. 2001 Appl Immunohistochem Mol Morphol. 9(2):97-106); CD103 (Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48);

CDK4 (Lee, Y.M. et al. 2006 Cell Cycle 5(18):2110-4); CEA (antígeno carcinoembrionario) (Foon et al. (1995) "Immune Response To The Carcinoembryonic Antigen In Patients Treated With An Anti-Idiotype Antibody Vaccine," J. Clin. Invest. 96(1):334-42); CEA (antígeno carcinoembrionario; Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46; Tellez-Avila, F.I. et al. 2005 Rev Invest Clin. 57(6):814-9); CO17-1A (Ragnhammar et al. (1993) "Effect Of Monoclonal Antibody 17-1A And GM-CSF In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma - Long-Lasting, Complete Remissions Can Be Induced," Int. J. Cancer 53:751-758); CO-43 (grupo sanguíneo Leb); CO-514 (grupo sanguíneo Lea) encontrado en adenocarcinoma; CTA-1; CTLA4 (Peggs, K.S. et al. 2006 Curr Opin Immunol. 18(2):206-13);

Citoqueratina 8 (publicación del PCT n.° WO 03/024191); D1.1; D156-22; DR5 (Abdulghani, J. et al. (2010) "TRAIL Receptor Signaling And Therapeutics," Expert Opin. Ther. Targets 14(10):1091-1108; Andera, L. (2009) "Signaling Activated By The Death Receptors Of The TNFR Family," Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech. Repub. 153(3):173-180; Carlo-Stella, C. et al. (2007) "Targeting TRAIL Agonistic Receptors for Cancer Therapy," Clin, Cancer 13(8):2313-2317; Chaudhari, B.R. et al. (2006) "Following the TRAIL to Apoptosis," Immunologic Res.

35(3):249-262); serie E ¹(grupo sanguíneo B) encontrado en cáncer de páncreas; e Gf R (receptor del factor de crecimiento epidérmico) (Adenis, A. et al. 2003 Bull Cancer. 90 Spec No:S228-32); Receptores de efrina (y, en particular, EphA2 (patente de Estados Unidos n.° 7.569.672; publicación del PCT n.° WO 06/084226); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4; Zhou, H. et al. 2002 Oncogene 21(57):8732-8740; Rimon, E. et al. 2004 Int J Oncol. 24(5):1325-1338);

GAGE (GAGE-1; GAGE-2; Akcakanat, A. et al. 2006 Int J Cancer. 118(1):123-128); GD2/GD3/GM2 (Livingston, P.O. et al. 2005 Cancer Immunol Immunother. 54(10):1018-1025); F3 encontrado en adenocarcinoma de pulmón; FC10.2 encontrado en células de carcinoma embrionario y adenocarcinoma gástrico; G49, gangliósido GD2 (Saleh et al. (1993) "Generation Of A Human Anti-Idiotypic Antibody That Mimics The GD2 Antigen," J.Immunol., 151, 3390-3398); gangliósido GD3 (Shitara et al. (1993) "A Mouse/Human Chimeric Anti-(Ganglioside GD3) Antibody With Enhanced Antitumor Activities," Cancer Immunol. Immunother. 36:373-380); gangliósido GM2 (Livingston et al. (1994) "Improved Survival In Stage III Melanoma Patients With GM2 Antibodies: A Randomized Trial Of Adjuvant Vaccination With GM2 Ganglioside," J. Clin. Oncol. 12:1036-1044); gangliósido GM3 (Hoon et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Human Monoclonal Antibody Reactive To Ganglioside GM3 Antigen On Human Cancers," Cancer Res. 53:5244-5250); G ^d2 ; G ^d3 ; GICA 19-9 (Herlyn et al. (1982) "Monoclonal Antibody Detection Of A Circulating Tumor-Associated Antigen. I. Presence Of Antigen In Sera Of Patients With Colorectal, Gastric, And Pancreatic Carcinoma," J. Clin. Immunol. 2:135-140); G ^m2 ; gp100 (Lotem, M. et al. 2006 J Immunother. 29(6):616-27); Gp37 (antígeno de célula T de leucemia humana) (Bhattacharya-Chatterjee et al. (1988) "Idiotype Vaccines Against Human T Cell Leukemia. II. Generation And Characterization Of A Monoclonal Idiotype Cascade (Ab1, Ab2 and Ab3)," J. Immunol. 141:1398-1403); gp75 (antígeno de melanoma) (Vijayasardahl et al. (1990) "The Melanoma Antigen Gp75 Is The Human Homologue Of The Mouse B (Brown) Locus Gene Product," J. Exp. Med. 171(4):1375-1380); gpA33; antígeno HER2 (p185HER2) (Kumar, Pal S et al. 2006 Semin Oncol. 33(4):386-91); antígeno CD20 de linfoma B humano (Reff et al. (1994) "Depletion Of B Cells In Vivo By A Chimeric Mouse Human Monoclonal Antibody To CD20," Blood 83:435-445); antígeno de glóbulos grasos de leche humana; virus del papiloma humano E6/virus del papiloma humano E7 (DiMaio, D. et al. 2006 Adv Virus Res. 66:125-59; HMW-mAa (antígeno de melanoma de alto peso molecular) (Natali et al. (1987) "Immunohistochemical Detection Of Antigen In Human Primary And Metastatic Melanomas By The Monoclonal Antibody 140.240 And Its Possible Prognostic Significance," Cancer 59:55-63; Mittelman et al. (1990) "Active Specific Immunotherapy In Patients With Melanoma. A Clinical Trial With Mouse Anti idiotypic Monoclonal Antibodies Elicited With Syngeneic Anti-High-Molecular-Weight-Melanoma-Associated Antigen Monoclonal Antibodies," J. Clin. Invest. 86:2136-2144); antígeno I (antígeno de diferenciación) (Feizi (1985) "Demonstration By Monoclonal Antibodies That Carbohydrate Structures Of Glycoproteins And Glycolipids Are Onco-Developmental Antigens," Nature 314: 53-57) tal como I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos; Integrina Alfa-V-Beta-6 (publicación del PCT n.° WO 03/087340); JAM-3 (publicación del PCT n.° WO 06/084078); KID3 (publicación del PCT n.° WO 05/028498); KID31 (publicación del PCT n.° WO 06/076584); antígeno de pancarcinoma KS 1/4 (Perez et al. (1989) "Isolation And Characterization Of A cDNA Encoding The Ks1/4 Epithelial Carcinoma Marker," J. Immunol.

142:3662-3667; Moller et al. (1991) "Bi-specific-Monoclonal-Antibody-Directed Lysis Of Ovarian Carcinoma Cells By Activated Human T Lymphocytes," Cáncer Immunol. Immunother. 33(4):210-216; Ragupathi, G. 2005 Cáncer Treat Res. 123:157-80); L6 y L20 (antígenos de carcinoma de pulmón humano) (Hellstrom et al. (1986) ' 'Monoclonal Mouse Antibodies Raised Against Human Lung Carcinoma," Cancer Res. 46:3917-3923); LEA; LUCA-2 (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0172349; publicación del PCT n.° WO 06/083852); M1:22:25:8; M18; M39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3; (Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84); MART (Kounalakis, N. et al. 2005 Curr Oncol Rep. 7(5):377-82; MUC-1 (Mathelin, C. 2006 Gynecol Obstet Fertil. 34(7-8):638-46); MUM-1 (Castelli, C. et al. 2000 J Cell Physiol. 182(3):323-31); Myl; N-acetilglucosaminiltransferasa (Dennis, J.W. 1999 Biochim Biophys Acta. 6;1473(1):21-34); neoglicoproteína; NS-10 encontrado en adenocarcinomas; OFA-1; OFA-2; Oncostatina M (Oncostatin Receptor Beta) (patente de Estados Unidos n.° 7.572.896; publicación del PCT n.° WO 06/084092); p15 (Gil, J. et al. 2006 Nat Rev Mol Cell Biol. 7(9):667-77); p97 (antígeno asociado a melanoma) (Estin et al. (1989) "Transfected Mouse Melanoma Lines That Express Various Levels Of Human Melanoma-Associated Antigen p97," J. Natl. Cancer Instit. 81(6):445-454); PEM (mucina epitelial polimórfica) (Hilkens et al. (1992) "Cell Membrane-Associated Mucins And Their Adhesion-Modulating Property," Trends in Biochem. Sci. 17:359-363); PEMA (antígeno de mucina epitelial polimórfica); PIPA (patente de Estados Unidos n.° 7.405.061; publicación del PCT n.° WO 04/043239); Ps A (antígeno específico de próstata) (Henttu et al. (1989) "cDNA Coding For The Entire Human Prostate Specific Antigen Shows High Homologies To The Human Tissue Kallikrein Genes," Biochem. Biophys. Res. Comm. 10(2):903-910; Israeli et al. (1993) "Molecular Cloning Of A Complementary DNA Encoding A Prostate-Specific Membrane Antigen," Cancer Res. 53:227-230; Cracco, C.M. et al. 2005 Minerva Urol Nefrol. 57(4):301-11); PSMA (antígeno de membrana específico de próstata) (Ragupathi, G. 2005 Cancer Treat Res. 123:157-180); fosfato ácido prostático (Tailor et al. (1990) "Nucleotide Sequence Of Human Prostatic Acid Phosphatase Determined From A Full-Length cDNA Clone," Nucl. Acids Res. 18(16):4928); R²⁴ encontrado en melanoma; Ro R1 (patente de Estados Unidos n.° 5.843.749); esfingolípidos; SSEA-1; s SeA-3; SSEA-4; sTn (Holmberg, L.A. 2001 Expert Opin Biol Ther.

1(5):881-91); péptido derivado del receptor de células T de un linfoma cutáneo de células T (véase Edelson (1998) "Cutaneous T-Cell Lymphoma: A Model For Selective Immunotherapy," Cancer J Sci Am. 4:62-71); T⁵A⁷ encontrado en células mieloides; t AG-72 (Yokota et al. (1992) "Rapid Tumor Penetration Of A Single-Chain Fv And Comparison With Other Immunoglobulin Forms," Cancer Res. 52:3402-3408); TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de TNF (receptor de TNF-a, receptor de TNF-p; receptor de TNF-y (van Horssen, R. et al. 2006 Oncologist. 11(4):397-408; Gardnerova, M. et al. 2000 Curr Drug Targets. 1(4):327-64); TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); receptor de transferrina (patente de Estados Unidos n.° 7.572.895; publicación del PCT n.° WO 05/121179); TSTA (antígeno de trasplante específico de tumor) tal como antígenos tumorales inducidos por virus incluyendo el antígeno T de virus de tumores de ADN y antígenos de envuelta de virus de tumores de ARN, alfa-fetoproteína de antígeno oncofetal tal como CEA de colon, antígeno oncofetal de tumor de vejiga (Hellstrom et al. (1985) "Monoclonal Antibodies To Cell Surface Antigens Shared By Chemically Induced Mouse Bladder Carcinomas," Cancer. Res. 45:2210-2188); receptor de VEGF (O'Dwyer. P.J.

2006 Oncologist. 11(9):992-998); VEP8; VEP9; VIM-D5; y hapteno Y, Le^y encontrado en células de carcinoma embrionario.

1. Dominio de unión a Campath-1 (CD52) (Alemtuzumab)

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-CD52 humanizado "Alemtuzumab" (SEQ ID NO: 205) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C KASQNID KYLNWYQQKP GKAPKLLIYN

TNNLQTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQ P EDIATYYCLQ H ISRPRTFGQ

GTKVEIKR

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-CD52 humanizado "Alemtuzumab" (SEQ ID NO: 206) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVSGFTFT DFYMNWVRQP PGRGLEWIGF

IRDKAKGYTT EYNPSVKGRV TMLVDTSKNQ FSLRLSSVTA ADTAVYYCAR

EGHTAAPFDY WGQGSLVTVS S

2. Dominios de unión a CD317 (BMST2)

CD317 (también conocido como antígeno 2 de células estromales de médula ósea; BMST) se sobreexpresa en varias células cancerosas aisladas de mama, pulmón, riñón, endometrio y piel (Kawai, S. et al. (2008) "Interferon-a enhances CD317 expression and the antitumor activity of anti-CD317 monoclonal antibody in renal cell carcinoma xenograft models," Cancer Science 99(12):2461-2466; Cai, D. et al. (2009) "Up-Regulation Of Bone Marrow Stromal Protein 2 (BST2) In Breast Cancer With Bone Metastasis," BMC Cancer 9:102, págs. 1-10; Wang, W. et al. (2009) HM1.24 (CD317) Is A Novel Target Against Lung Cancer For Immunotherapy Using Anti-HM1.24 Antibody," Cancer Immunology, Immunotherapy 58(6):967-976; Wang, W. et al. (2009) "Chimeric And Humanized Anti-HM1.24 Antibodies Mediate Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Lung Cancer Cells. Lung Cancer," 63( 1 ):23-31; Sayeed, A. et al. (2013) "Aberrant Regulation Of The BST2 (Tetherin) Promoter Enhances Cell Proliferation And Apoptosis Evasión In High Grade Breast Cáncer Cells," PLoS ONE 8(6)e67191, págs. 1-10; Yi, E.H. et al. (2013) "BST-2 Is A Potential Activator Of Invasion And Migration In Tamoxifen-Resistant Breast Cancer Cells," Biochem. Biophys. Res. Commun. 435(4):685-690; Staudinger, M. (2014) "The Novel Immunotoxin HM1.24-ETA' Induces Apoptosis In Multiple Myeloma Cells," Blood Cancer J. 13;4:e219, págs. 1-11). En el mercado están disponibles anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a CD317 (Novus Biologicals LLC; BioLegend, Inc.; véase también la patente de Estados Unidos n.° 8.834.876, que hace referencia al depósito de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo HM1.24 como FERM BP-5644 y FERM BP-5646; véase también la patente de Estados Unidos n.° 8.394.374). A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-CD317 "HM1.24" (SEQ ID NO: 302) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKKASQDV NTAVAWYQQK PGQSPKLLIY

SASNRYTGVP DRITGSGSGT DFTFTISSVQ AEDLALTTCQ QHYSTPFTFG

SGTKLEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-CD317 "HM1.24" (SEQ ID NO: 303) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT PYWMQWVKQR PGQGLEWIGS

IFPGDGDTRY SQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSILAFED SAVYYCARGL

RRGGYYFDYW GQGTTLTVSS

3. Dominios de unión a CEACAM5 y CEACAM6

Se ha descubierto que las moléculas de adhesión celular 5 y 6 relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM5) y (CEACAM6) están asociadas con diversos tipos de cánceres, entre los que se incluyen el cáncer de tiroides medular, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer hematopoyético, leucemia y cáncer de ovario (publicación del PCT n.° WO 2011/034660) y, particularmente, el cáncer colorrectal, gastrointestinal, pancreático, cáncer de pulmón no microcítico (NSCL), mama, tiroides, estómago, carcinomas de ovario y útero (Zheng, C. et al. (2011) "A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody, CC4, Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity," PLoS One 6(6):e21146, págs. 1-11).

Se ha descubierto que CEACAM5 se sobreexpresa en el 90 % de los cánceres gastrointestinales, colorrectales y de páncreas, en el 70 % de las células del cáncer no microcítico de pulmón y en el 50 % de los cánceres de mama (Thompson, J.A. et al. (1991) "Carcinoembryonic Antigen Gene Family: Molecular Biology And Clinical Perspectives," J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366).

La molécula de adhesión celular 6 relacionada con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM6) sobreexpresado juega un papel importante en la invasión y metástasis de una diversidad de cánceres humanos, entre los que se incluyen el cáncer de tiroides medular, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, carcinoma hepatocelular, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, cánceres de cabeza y cuello, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de endometrio, cáncer de mama, cáncer hematopoyético, leucemia y cáncer de ovario (publicación del PCT n.° WO 2011/034660; Deng, X. et al. (2014) "Expression Profiling Of CeAc AM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma," Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697; Cameron, S. et al. (2012) "Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis," Mol. Cancer 11:74, págs. 1-11; Chapin, C. et al. (2012) "Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25; Riley, C.J. et al. (2009) "Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer," Cancer Res. 69(5):1933-1940; Lewis-Wambi, J.S. et al. (2008) "Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells," Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779; Blumenthal, R.D. et al. (2007) "Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers," BMC Cancer. 7:2, págs. 1-15). En el mercado están disponibles anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a CEACAM5 y CEACAM6 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Novus Biologicals LLC; Abnova Corporation). A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo 16C3 anti-CEACAM5/ANTI-CEACAM6 humanizado (documento EP 2585476) (SEQ ID NO: 304) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C GASENIY GALNWYQRKP GKSPKLLIWG

ASNLADGMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYYCQN VLSSPYTFGG

GTKLEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo 16C3 anti-CEACAM5/ANTI-CEACAM6 humanizado (documento EP 2585476) (SEQ ID NO: 305) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMHWVKQS HAKSLEWIGL

ISTYSGDTKY NQNFKGKATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARGD

YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo hMN15 anti-CEACAM5/CEACAM6 humanizado (documento WO 2011/034660) (SEQ ID NO: 306) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTCSASSRVS Y1HWYQQKPG KAPKRWIYGT

STLASGVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYCQQW SYNPPTFGQG

TKVEIKR

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo hMN15 anti-CEACAM5/CEACAM6 humanizado (documento WO 2011/034660) (SEQ ID NO: 307) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMSWVRQA PGKGLEWLGF

IANKANGHTT DYSPSVKGRF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR

DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S

4. Dominios de unión a DR5

DR5 es un antígeno de cáncer preferido de la presente invención. Las moléculas de unión anti-DR5 humano preferidas de la presente invención poseen los dominios VL y/o VH de los anticuerpos monoclonales murinos anti-DR5 humanos "mAb 1 de DR5" y/o "mAb 2 de DR5", y, más preferentemente, poseen 1, 2 o las 3 CDR de las CDR del dominio VL y/o 1, 2 o las 3 CDR del dominio VH de tales anticuerpos monoclonales anti-DR5 humano. Como alternativa, se puede emplear cualquier anticuerpo monoclonal anti-DR5 humano, particularmente: drozitumab (denominado en el presente documento "mAb 3 de DR5"), conatumumab (denominado en el presente documento "mAb 4 de DR5"), tigatuzumab (denominado en el presente documento "mAb 5 de DR5"), LBY135-1 (denominado en el presente documento "mAb 6 de DR5"), LBY135-2 (denominado en el presente documento "mAb 7 de DR5") y KMTR2 (denominado en el presente documento "mAb 8 de DR5").

a. El anticuerpo anti-DR5 humano, mAb 1 de DR5

DR5 tiene utilidad potencial en el tratamiento de una amplia gama de cánceres (por ejemplo, cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioma, cáncer de riñón, cáncer de mama, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, neuroblastoma; sarcoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer rectal. La secuencia de aminoácidos del precursor de DR5 humano (secuencia del NCBI NP_003833.4) (SEQ ID NO: 2) es:

MEQRGQNAPA ASGARKRHGP GPREARGARP GLRVPKTLVL VVAAVLLLVS

AESALITQQD LAPQQRVAPQ QKRSSPSEGL CPPGHHISED GRDCISCKYG

QDYSTHWNDL LFCLRCTRCD SGEVELSPCT TTRNTVCQCE EGTFREEDSP

EMCRKCRTGC PRGMVKVGDC TPWSDIECVH KESGTKHSGE APAVEETVTS

SPGTPASPCS LSG IIIG V TV AAVVLIVAVF VCKSLLWKKV LPYLKGICSG

GGGDPERVDR SSQRPGAEDN VLNEIVSILQ PTQVPEQEME VQEPAEPTGV

NMLSPGESEH LLEPAEAERS QRRRLLVPAN EGDPTETLRQ CFDDFADLVP

FDSWEPLMRK LGLMDNEIKV AKAEAAGHRD TLYTMLIKWV NKTGRDASVH

TLLDALETLG ERLAKQKIED HLLSSGKFMY LEGNADSAMS

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 3) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV

LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEDGDAATY YCQHSRDLPP

TFGGGTKLEI K

CDRl1 de mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 4) RASKSVSSSGYSYMH

CDRl2 de mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 5) LSSNLDS

CDRl3 de mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 6) QHSRDLPPT

El dominio VL de mAb 1 de DR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 7) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 8) (los restos de las CDR se muestran subrayados). El aminoácido C-terminal puede sustituirse con alanina para facilitar la subclonación de este dominio VH.

EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE

INPDSNTINY TPSLKDK F II SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA

YYGNPAWFAY WGQGTLVTVSS

CDRh1 de mAb (SEQ ID NO: 9): GFDFSRYWMS

CDRh2 de mAb

(SEQ ID NO: 10): EINPDSNTINYTPSLKD CDRh3 de mAb

DR5 (SEQ ID NO: 11): RAYYGNPAWFAY

El dominio VH de mAb 1 de DR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 12) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa

attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tcc

b. El anticuerpo anti-DR5 humano mAb 2 de DR5

(1) Anticuerpo mAb 2 de DR5 murino anti-humano

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 13) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW

ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG

GTKLEIK

CDRlI de mAb2 de DR5 (SEQ ID NO: 14): KASQDVNTAVA

CDRl2 de mAb2 de DR5 (SEQ ID NO: 15): WASTRHT

CDRl3 de mAb2 de DR5 (SEQ ID NO: 16): QQHYITPWT

El dominio VL de mAb 2 de DR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 17) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca acaaaaacca gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaaa

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 18) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW

FYPGNNNIKY NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE

QGPGYFDYWG QGTTLTVSS

CDRh1 de mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 19): GYTFTEYILH

CDRh2 de mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 20): WFYPGNNNIKYNEKFKD

CDRh3 de mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 21): HEQGPGYFDY

El dominio VH de mAb 2 de DR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 22) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt tacactgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggacaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcc

(2) mAb 2 de DR5 humanizado ("mAb 2 de hDR5")

El mAb 2 de DR5 anti-DR5 humano murino descrito anteriormente se humanizó con el fin de demostrar la capacidad de humanizar un anticuerpo anti-DR5 humano para disminuir su antigenicidad tras la administración a un receptor humano. La humanización produjo cuatro dominios VL humanizados denominados en el presente documento "VL-2 de mAb 2 de hDR5", "VL-3 de mAb 2 de hDR5", "VL-4 de mAb 2 de hDR5", y "VL-5 de mAb 2 de hDR5", y un dominio VH humanizado, denominado en el presente documento "VH-2 de mAb 2 de hDR5" Cualquiera de los dominios VL humanizados puede emparejarse con el dominio VH humanizado. En consecuencia, cualquier anticuerpo que comprenda uno de los dominios VL humanizados emparejado con el dominio VH humanizado se denomina genéricamente "mAb 2 de hDR5", y las combinaciones particulares de dominios VL/VH humanizados se denominan haciendo referencia al dominio VL.

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de VL-2 de mAb 2 de hDR5 (SEQ ID NO: 23) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW

ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQ P EDVATYYCQQ HYITPWTFGG

GTKLEIK

VL-2 de mAb 2 de hDR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 24) que tiene la secuencia que se muestra a continuación:

gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgta aagcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg

ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de VL-3 de mAb 2 de hDR5 (SEQ ID NO: 25) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW

ASTRHTGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQ P EDVATYYCQQ HYITPWTFGG

GTKLEIK

VL-3 de mAb 2 de hDR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 26) que tiene la secuencia que se muestra a continuación:

gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatgtgg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de VL-4 de mAb 2 de hDR5 (SEQ ID NO: 27) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW

ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ HYITPWTFGG

GTKLEIK

VL-4 de mAb 2 de hDR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 28) que tiene la secuencia que se muestra a continuación:

gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccatct aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagcca gaggatatcg ctacatacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de VL-5 de mAb 2 de hDR5 (SEQ ID NO: 29) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

D IQ M T Q S P S F LS A S V G D R V T IT C RASQ D VN T A V A WYQQKP G K A P K L L IY W

A S T R H T GVPD RFSG SG SG TD F T L T IS S L Q P E D IA T Y Y C QQ H Y IT P W T FGG

G T K L E IK

VL-5 de mAb 2 de hDR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 30) que tiene la secuencia que se muestra a continuación:

gatattcaga tgacccagag tccctcattt ctgtccgcct ccgtcggtga ccgcgtgact attacttgtc gggcttctca ggatgtcaac accgccgtgg cttggtacca gcagaagccc ggtaaagcac ctaagctgct gatctattgg gccagcactc ggcacaccgg agtcccagat aggttctctg gcagtggatc agggacagac tttaccctga caattagctc cctgcagccc gaggatatcg ctacttacta ttgtcagcag cactacatca ctccttggac cttcggcggg ggcacaaaac tggaaatcaa a

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de VH-2 de mAb 2 de hDR5 (SEQ ID NO: 31) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

Q VQ LVQ SG AE V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T E Y IL H WVRQA PGQGLEWMGW

F Y P G N N N IK Y N E K F K D R V T I T A D K S T S T V Y M E L S S L R S E D TA V Y Y C A R H E

QGPGYFDYWG Q G T LV T V S S

VH-2 de mAb 2 de hDR5 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 32) que tiene la secuencia que se muestra a continuación:

caggtccagc tggtgcagag tggggcagag gtgaaaaagc caggggcatc agtgaaagtg tcttgtaaag catcaggtta tacatttact gagtacatcc tgcactgggt gcgacaggca ccaggacagg gactggaatg gatggggtgg ttctaccctg gcaacaacaa cattaagtac aacgagaagt ttaaagaccg ggtgaccatc acagcggata agtctaccag tacagtctat atggagctga gctccctgag aagcgaagac accgccgtct actattgcgc tcgccacgaa cagggtccag gttactttga ttattggggg cagggaactc tggtcacagt cagctcc

La CDR1 del dominio VL de VL-3 de mAb 2 de hDR5, VL-4 de mAb 2 de hDR5 y VL-5 de mAb de hDR5 tiene la secuencia de aminoácidos: RASQDVNTAVA (SEQ ID NO: 320).

C. Drozitumab ("mAb 3 de DR5")

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de drozitumab ("mAb 3 de DR5") (SEQ ID NO: 54) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

SELTQDPAVS VALGQTVRIT CSGDSLRSYY ASWYQQKPG QAPVLVIYGA

NNRPSGIPDR FSGSSSGNTA SLTITGAQAE DEADYYCNSA DSSGNHWFG

GGTKLTVLG CDRlI de mAb 3 de DR5 (SEQ ID NO: 55): SGDSLRSYYAS

CDRl2 de mAb 3 de DR5 (SEQ ID NO: 56): GANNRPS

CDRl3 de mAb 3 de DR5 (SEQ ID NO: 57): NSADSSGNHVV

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de drozitumab ("mAb 3 de DR5") (SEQ ID NO: 58) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLVQSGGG VERPGGSLRL SCAASGFTFD DYAMSWVRQA PGKGLEWVSG

INWQGGSTGY ADSVKGRVTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAKIL

GAGRGWYFDY WGKGTTVTVS S CDRh1 de mAb3 de DR5 (SEQ ID NO: 59): GFTFDDYAMS

CDRh2 de mAb 3 de DR5 (SEQ ID NO: 60): INWQGGSTGYADSVKG

CDRh3 de mAb3 de DR5 (SEQ ID NO: 61): ILGAGRGWYFDY

d. Conatumumab ("mAb 4 de DR5")

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de conatumumab ("mAb 4 de DR5") (SEQ ID NO: 62) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGIS RSYLAWYQQK PGQAPSLLIY

GASSRATG IP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QFGSSPWTFG

QGTKVEIK CDRl1 de mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 63): RASQGISRSYLA

CDRl2 de mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 64): GASSRAT

CDRl3 de mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 65): QQFGSSPWT

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de conatumumab ("mAb 4 de DR5") (SEQ ID NO: 66) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQESGPG LVKPSQTLSL TCTVSGGSIS SGDYFWSWIR QLPGKGLEWI

GH1HNSGTTY YNPSLKSRVT ISVDTSKKQF SLRLSSVTAA DTAVYYCARD

RGGDYYYGMD VWGQGTTVTV SS

CDRh1 de mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 67) GGSISSGDYFWS

CDRh2 de mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 68) HIHNSGTTYYNPSLKS

CDRh3 de mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 69) DRGGDYYYGMDV

e. Tigatuzumab ("mAb 5 de DR5")

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de tigatuzumab ("mAb 5 de DR5") (SEQ ID NO: 70) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C KASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW

ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQ P EDFATYYCQQ YSSYRTFGQG

TKVEIK CDRl1 de mAb 5 de DR5 (SEQ ID NO: 71): KASQDVGTAVA

CDRl2 de mAb 5 de DR5 (SEQ ID NO: 72): WASTRHT

CDRl3 de mAb 5 de DR5 (SEQ ID NO: 73): QQYSSYRT

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de tigatuzumab ("mAb 5 de DR5") (SEQ ID NO: 74) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQ LVESG G G LV Q P G G S LR L S C A A S G F T F S SYVM SWVRQA PG KGLEW VAT

IS S G G S Y T Y Y P D S VKG R F T I S R D N A K N T LY LQ M N S LR AE D TAVYYC A R R G

D S M IT T D Y W G Q G T LV T V S S

CDRhI de mAb5 de DR5 (SEQ ID NO: 75): GFTFSSYVMS

CDRh2 de mAb 5 de DR5 (SEQ ID NO: 76): TISSGGSYTYYPDSVKG

CDRh3 de mAb 5 de DR5 (SEQ ID NO: 77): RGDSMITTDY

f. LBY135-1 ("mAb 6 de DR5")

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de LBY135-1 ("mAb 6 de DR5") (SEQ ID NO: 78) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

D IA M T Q S H K F M STLVG D R VS IT C K A S QDVN T A I A WYQQKP G Q S P K L L IY W

A S T R H T GVPD R FYG SG SG TD Y T L T IS S M E A ED A ATYY C Q Q W S S N P LT F G A

G T K L E L K R A

CDRl1 de mAb 6 de DR5 (SEQ ID NO: 79): QDVNTAIA

CDRl2 de mAb 6 de DR5 (SEQ ID NO: 80): WASTRHT

CDRl3 de mAb 6 de DR5 (SEQ ID NO: 81): QQWSSNPLT

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de LBY135-1 ("mAb 6 de DR5") (SEQ ID NO: 82) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

KVQ LQ Q SG AE L V K P G A S V K L S C K A S G Y T F T D Y T IH WVKQR SG QGLEW IGW

F Y P G G G Y IK Y N E K F K D R A T L T A D K S S N T V Y M E LS R LT S E G SA V Y FC A R H E

E G IY F D Y WGQ G T T L T V S S

CDRh1 de mAb 6 de DR5 (SEQ ID NO: 83): GYTFTDYTIH

CDRh2 de mAb 6 de DR5 (SEQ ID NO: 84): WFYPGGGYIKYNEKFKD

CDRh3 de mAb 6 de DR5 (SEQ ID NO: 85): HEEGIYFDY

g. LBY135-2 ("mAb 7 de DR5")

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de LBY135-2 ("mAb 7 de DR5") (SEQ ID NO: 86) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

D IV M T Q S H K F M STSVG DRVS IT C KA SQ D VN T A I A WYQQKP G Q S P K L L IY W

A S T R H T GVPD R FTG SG SG TD Y T L T IS S V Q A E D L A L Y Y C QQ H Y T T P F T FGS

G TK L CDRl1 de mAb 7 de DR5 (SEQ ID NO: 87): KASQDVNTAIA

CDRl2 de mAb 7 de DR5 (SEQ ID NO: 88): WASTRHT

CDRl3 de mAb 7 de DR5 (SEQ ID NO: 89): QQHYTTPFT

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de LBY135-2 ("mAb 7 de DR5") (SEQ ID NO: 90) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

KVQ LQ Q SG AE L V K P G A S V K L SC K A S G Y T F T D Y T IH WVKQR SG QGLEW IGW

F Y P G G G Y IK Y N E K F K D R A T L T A D K S S N T V Y M E L S R LT S E D SA VY FC A R H E

EG IY FD Y W G Q G T T L T V S S

CDRh1 de mAb 7 de DR5 (SEQ ID NO: 91) GYTFTDYTIH

CDRh2 de mAb 7 de DR5 (SEQ ID NO: 92) WFYPGGGYIKYNEKFKD

CDRh3 de mAb 7 de DR5 (SEQ ID NO: 93) HEEGIYFDY

h. KMTR2 ("mAb 8 de DR5")

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de KMTR2 ("mAb 8 de DR5") (SEQ ID NO: 94) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPLTFGG

GTKVEIKR

CDRl1 de mAb 8 de DR5 (SEQ ID NO: 95): RASQSVSSYLA

CDRl2 de mAb 8 de DR5 (SEQ ID NO: 96): DASNRAT

CDRl3 de mAb 8 de DR5 (SEQ ID NO: 97): QQRSNWPLT

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de KMTR2 ("mAb 8 de DR5") (SEQ ID NO: 98) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVQSGAE MKKPGASVKV SCKTSGYTFT NYKINWVRQA PGQGLEWMGW

MNPDTDSTGY PQKFQGRVTM TRNTSISTAY MELSSLRSED TAVYYCARSY

GSGSYYRDYY YGMDVWGQGT TVTVSS

CDRh1 de mAb 8 de DR5 (SEQ ID NO: 99): GYTFTNYKIN

CDRh2 de mAb 8 de DR5 (SEQ ID NO: 100): WMNPDTDSTGYPQKFQG

CDRh3 de mAb 8 de DR5 (SEQ ID NO: 101): SYGSGSYYRDYYYGMDV

5. Dominios de unión a EphA2

El receptor de la tirosina quinasa, receptor 2 de efrina tipo A (EphA2) es un antígeno de cáncer preferido de la presente invención. EphA2 normalmente se expresa en sitios de contacto de célula a célula en tejidos epiteliales adultos, sin embargo, ciertos estudios recientes han demostrado que también se sobreexpresa en varios tipos de carcinomas epiteliales, observándose el mayor nivel de expresión de EphA2 en lesiones metastásicas. Se han encontrado altos niveles de expresión de EphA2 en una amplia gama de cánceres y en numerosas líneas de células tumorales, entre las que se incluyen el cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico y melanoma (Xu, J. et al. (2014) "High Epha2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome," Oncol. Lett. agosto de 2014; 8(2): 687-692; Miao, B. et al. (2014) "EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma," Cancer Discov. pii: CD-14-0295. EphA2 no parece ser simplemente un marcador de cáncer, sino que parece sobreexpresarse de forma persistente y cambiar funcionalmente en numerosos cánceres humanos (Chen, P. et al. (2014) "Epha2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of Lncap Prostate Cancer Cells," Oncol. Lett. 8(1):41-46).

La invención contempla particularmente la selección de EphA2 como un antígeno de cáncer y el uso de anticuerpos anti-EphA2 para proporcionar el dominio de unión a antígeno de cáncer de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. Los anticuerpos anti-EphA2 ilustrativos incluyen "mAb 1 de EphA2", "mAb 2 de EphA2" y "mAb 3 de EphA2".

a. mAb 1 de EphA2

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-EphA2 humano preferido ("mAb 1 de EphA2") (SEQ ID NO: 153) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQTTSS LSASLGDRIT IS C RASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG

TKLEIK

CDRl1 de mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 154) RASQDISNYLN

CDRl2 de mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 155) YTSRLHS

CDRl3 de mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 156) QQGYTLYT

El dominio VL de mAb 1 de EphA2 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 157) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados): gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaa

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 158) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM

IWGGGSTDYN SALKSR L SIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG

NYYTMDYWGQ GTSVTVSS

CDRh1 de mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 159): GFSLSRYSVH

CDRh2 de mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 160): MIWGGGSTDYNSALKS

CDRh3 de mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 161): KHGNYYTMDY

El dominio VH de mAb 1 de EphA2 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 162) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg

atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctcc

b. mAb 2 de EphA2

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un segundo anticuerpo anti-EphA2 humano preferido ("mAb 2 de EphA2") (SEQ ID NO: 163) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS IS C RSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK

LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

TFGSGTKLEI K

CDRl1 de mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 164): RSSQSLVHSSGNTYLH

CDRl2 de mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 165): KVSNRFS

CDRl3 de mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 166): SQSTHVPT

El dominio VL de mAb 2 de EphA2 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 318) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados): gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaa

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 167) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW

INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL

GPYYFDYWGQ GTTLTVSS

CDRh1 de mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 168): GFTFTNYGMN

CDRh2 de mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 169): WINTYIGEPTYADDFKG

CDRh3 de mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 170): ELGPYYFDY

El dominio VH de mAb 2 de EphA2 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 171) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atattggaga gccgacatat gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcc

c. mAb 3 de EphA2

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de otro anticuerpo anti-EphA2 humano preferido ("mAb 3 de EphA2") (SEQ ID NO: 172) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN IT C KASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW

ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG

GTKLEIK

CDRl1 de mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 173): KASQDVTTAVA

CDRl2 de mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 174): WASTRHA

CDRl3 de mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 175): QQHYSTPYT

El dominio VL de mAb 3 de EphA2 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 176) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados): gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca 0.C0.0.0.0.0.CC0. gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa a

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 177) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT

ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE

SDRPFPYWGQ GTLVTVSS

CDRh1 de mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 178): GFTFTDHYMY

CDRh2 de mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 179): TISDGGSFTSYPDSVKG

CDRh3 de mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 180): DESDRPFPY

El dominio VH de mAb 3 de EphA2 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 319) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca tgtattgggt tcgccagact ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctcc

6. Dominios de unión a gpA33

gpA33 también es un antígeno de cáncer preferido de la presente invención. El cáncer colorrectal se encuentra entre las neoplasias malignas más comunes del mundo occidental y es una de las principales causas de muerte por cáncer (Silverberg, E. et al. (1989) "Cancer Statistics, 1989," CA Cancer J Clin. 39(1):3-20). Una diana potencialmente útil para el cáncer de colon es la glucoproteína transmembrana de 43 kD A33 (gpA33), que se expresa en >95 % de todos los carcinomas colorrectales (Heath, J.K. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium," Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686; Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia," J. Clin. Pathol. 59(3):260-263). El antígeno gpA33 se descubrió por primera vez mediante la obtención de anticuerpos monoclonales murinos contra la línea celular ASPC1 derivada del carcinoma pancreático humano.

La invención contempla particularmente la selección de gpA33 como un antígeno de cáncer y el uso de anticuerpos anti-gpA33 para proporcionar el dominio de unión a antígeno de cáncer de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. Un anticuerpo anti-gpA33 ilustrativo es "mAb 1 de gpA33".

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-gpA33 humano preferido ("mAb 1 de gpA33") (SEQ ID NO: 181) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIK

CDRlI de mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 182) SARSSISFMY

CDRl2 de mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 183) DTSNLAS

CDRl3 de mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 184) QQWSSYPLT

El dominio VL de mAb 1 de gpA33 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 185) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaag

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR

IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY

GNNVYFDVWG QGTTVTVSS

CDRh1 de mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 187): GYTFTGSWMN

CDRh2 de mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 188): RIYPGDGETNYNGKFKD

CDRh3 de mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 189): IYGNNVYFDV

El dominio VH de mAb 1 de gpA33 se codifica preferentemente por un polinucleótido (SEQ ID NO: 190) que tiene la secuencia que se muestra a continuación (los polinucleótidos que codifican las CDR se muestran subrayados):

caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg

agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctcc

7. Dominios de unión a Her2

La invención también contempla particularmente la selección de Her2 como un antígeno de cáncer y el uso de anticuerpos anti-Her2 para proporcionar el dominio de unión a antígeno de cáncer de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. Los anticuerpos anti-Her2 ejemplares incluyen "mAb 1 de Her2" y Trastuzumab.

a. mAb 1 de Her2

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-Her2 ("mAb 1 de Her2") (SEQ ID NO: 191) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASFLESGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ

GTKVEIKRT

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de un anticuerpo anti-Her2 ("mAb 1 de Her2") (SEQ ID NO: 192) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTY1HWVKQR PEQGLEWIGR

IYPTNGYTRY DPKFQDKATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSRWG

GDGFYAMDYW GQGASVTVSS

b. Trastusumab

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-Her2 humanizado "Trastuzumab" (SEQ ID NO: 193) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ

GTKVEIKR

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-Her2 humanizado "Trastuzumab" (SEQ ID NO: 194) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTY1HWVRQA PGKGLEWVAR

IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG

GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS

8. Dominios de unión a B7-H3

Además de su expresión en células de neuroblastoma, también se sabe que el antígeno B7-H3 humano se expresa en una diversidad de células cancerosas distintas (por ejemplo, cánceres gástrico, de ovario y de pulmón no microcítico). Se ha detectado inmunohistológicamente la expresión de la proteína B7-H3 en líneas de células tumorales (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production," Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 101(34): 12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297). Se ha encontrado expresión de ARNm en corazón, riñón, testículos, pulmón, hígado, páncreas, próstata, colon y células osteoblásticas (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223,1-223,7). A nivel de proteína, B7-H3 se encuentra en el hígado humano, pulmón, vejiga, testículos, próstata, mama, placenta y órganos linfoides (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 105(30):10277-10278).

La invención también contempla particularmente la selección de B7-H3 como un antígeno de cáncer y el uso de anticuerpos anti-B7-H3 para proporcionar el dominio de unión a antígeno de cáncer de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. Los anticuerpos anti-B7-H3 ilustrativos incluyen "mAb 1 de B7-H3", "mAb 2 de B7-H3", y "mAb 3 de B7-H3".

a. mAb 1 de B7-H3

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-B7-H3 ("mAb 1 de B7-H3") (SEQ ID NO: 195) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIAMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVD TNVAWYQQKP GQSPKALIYS

ASYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTINNVQS EDLAEYFCQQ YNNYPFTFGS

GTKLEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de un anticuerpo anti-B7-H3 ("mAb 1 de B7-H3") (SEQ ID NO: 196) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DVQLVESGGG LVQPGGSRKL S CAASGFTFS SFGMHWVRQA PEKGLEWVAY

ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNPKNTLF LQMTSLRSED TAMYYCGRGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTLTV SS

b. mAb 2 de B7-H3

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-B7-H3 ("mAb 2 de B7-H3") (SEQ ID NO: 197) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQTTSS LSASLGDRVT IS C RASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de un anticuerpo anti-B7-H3 ("mAb 2 de B7-H3") (SEQ ID NO: 198) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQWVKQR PGQGLEWIGT

IYPGDGDTRY TQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCARRG

IPRLWYFDVW GAGTTVTVSS

c. mAb 3 de B7-H3

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-B7-H3 ("mAb 3 de B7-H3") (SEQ ID NO: 199) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN

TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG

GGTNLEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de un anticuerpo anti-B7-H3 ("mAb 3 de B7-H3") (SEQ ID NO: 200) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT

INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD

GGAMDYWGQG TSVTVSS

9. Dominios de unión al receptor de EGF (Cetuximab)

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-EGFR quimérico "Cetuximab" (SEQ ID NO: 201) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DILLTQSPVI LSVSPGERVS FSCRASQSIG TN1HWYQQRT NGSPRLLIKY

A S E S IS G IPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES EDIADYYCQQ NNNWPTTFGA

GTKLELKR

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-EGFR quimérico "Cetuximab" (SEQ ID NO: 202) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLKQSGPG LVQPSQSLSI TCTVSGFSLT NYGVHWVRQS PGKGLEWLGV

IWSGGNTDYN TPFTSRLSIN KDNSKSQVFF KMNSLQSNDT AIYYCARALT

YYDYEFAYWG QGTLVTVSA

Panitumumab (por ejemplo, Vectibix®, Amgen) es un anticuerpo de unión al receptor de EGF alternativo que se puede usar de acuerdo con la presente invención.

10. Dominios de unión a VEGF (Bevacizumab)

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-VEGF humanizado "Bevacizumab" (SEQ ID NO: 203) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

D IQ M T Q S P S S LS A S V G D R V T I T C S A S Q D IS N Y L N WYQQKP G K A P K V L IY F

T S S L H S GVPS RFSG SG SG TD F T L T IS S L Q P E D F A T Y Y C QQ Y S T V P W T FGQ

G T K V E IK R

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-VEGF humanizado "Bevacizumab" (SEQ ID NO: 204) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

A S G Y T F T NYGMNWVRQA PGKGLEWVGW

T S K S T A Y LQ M N S LR AE D T A V Y Y C A K Y P

11. Dominios de unión a 5T4

La proteína oncofetal, 5T4, es una proteína asociada a tumores que se presenta en la membrana celular de muchos carcinomas, incluyendo los carcinomas de riñón, colon, próstata, pulmón y en la leucemia linfoblástica aguda (véase, Boghaert, E.R. et al. (2008) "The Oncofetal Protein, 5t 4, Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin," Int. J. Oncol. 32(1):221-234; Eisen, T. et al. (2014) "Naptumomab Estafenatox: Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin," Curr. Oncol. Rep. 16:370, págs. 1-6). A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-5T4 ilustrativo ("mAb 1 de 5T4") (los restos de las CDR se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 308):

D IQ M T Q S P S S LS A S V G D R V T IT C R A S Q G IS N Y L A WFQQKP G K A P K S L IY R

A N R L Q S GVPS RFSG SG SG TD F T L T IS S L Q P E D V A T Y Y C LQ Y D D FPW TFGQ

G T K L E IK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-5T4 ilustrativo (los restos de las CDR se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 309):

Q VQ LVQ SG AE V K K P G A S V K V S C K A S G Y T F T SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR

ID P N R G G T E Y N E K A K S RVTM T A D K S T S T A Y M E L S S L R S E D TAVYYC AG G N

PYYPMDYWGQ G T T V T V S S

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-5T4 ilustrativo ("mAb 2 de 5T4") (los restos de las CDR se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 310):

D V LM T Q T P LS LP V S LG D Q A S IS C R S S Q S IV Y S N G N T Y LE W YLQ K PG Q S PK

L L I Y K V S N R F SG VPDRFSG S G S G T D F T L K I S R V E A E D LG V Y Y C FQ G SHVP

F T F G S G T K L E I K

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho segundo anticuerpo anti-5T4 ilustrativo (los restos de las CDR se muestran subrayados) (SEQ ID NO: 311):

QVQLQQPGAE LV K P G A S V K M S C K A S G Y T F T S Y W IT WVKQR PG Q G LEW IG D

IY P G S G R A N Y N E K F K S K A T L T V D T S S S T A Y M Q LS S LT S E D SAVYNC AR YG

P L F T T W D P N SYAMDYWGQG T S V T V S S

12. Dominios de unión aIL13Ra2

El receptor a2 de la interleucina-13 (IL13Ra2) se sobreexpresa en una diversidad de cánceres, entre los que se incluyen el glioblastoma, cáncer colorrectal, cáncer de cuello uterino, cáncer pancreático, melanoma múltiple, osteosarcoma, leucemia, linfoma, cáncer de próstata y cáncer de pulmón (publicación del PCT n.° WO 2008/146911;

Brown, C.E. et al. (2013) "Glioma IL13Ra2 Is Associated With Mesenchymal Signature Gene Expression And Poor Patient Prognosis," PLoS One. 18;8(10):e77769; Barderas, R. et al. (2012) "High Expression Of IL-13 Receptor A2 In Colorectal Cancer Is Associated With Invasion, Liver Metastasis, And Poor Prognosis," Cancer Res. 72(11 ):2780-2790; Kasaian, M.T. et al. (2011) "IL-13 Antibodies Influence IL-13 Clearance In Humans By Modulating Scavenger Activity Of IL-13Ra2," J. Immunol. 187(1):561-569; Bozinov, O. et al. (2010) "Decreasing Expression Of The Interleukin-13 Receptor IL-13Ralpha2 In Treated Recurrent Malignant Gliomas," Neurol. Med. Chir. (Tokio) 50(8):617-621; Fujisawa, T. et al. (2009) "A novel role of interleukin-13 receptor alpha2 in pancreatic cancer invasion and metastasis," Cancer Res. 69(22):8678-8685). En el mercado están disponibles anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a IL13Ra2 (Abnova Corporation, Biorbyt, LifeSpan BioSciences, United States Biologicals; véase también la publicación del PCT n.° WO 2008/146911). A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-IL13Ra2 ilustrativo ("hu08", publicación del PCT n.° WO 2014/072888) (los restos de las CDR se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 321):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS

ASYRSTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQH HYSAPWTFGG

GTKVEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-IL13Ra2 ilustrativo ("hu08", publicación del PCT n.° WO 2014/072888) (los restos de las CDR se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 322):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KNGMSWVRQA PGKGLEWVAT

VSSGGSYIYY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG

TTALATRFFD VWGQGTLVTV SS

13. Dominios de unión a la integrina Beta6

La integrinap6 (ITGB6) es un subtipo de integrina que se expresa exclusivamente en las superficies de las células epiteliales y es un receptor de proteínas de la matriz extracelular (ECM). La expresión de ITGB6 se expresa específicamente en tejidos tumorales (tales como los de cáncer de colon, próstata y riñón), pero generalmente es indetectable en tejido epitelial sano (Liang, B. et al. (2014) "Integrinp6-targeted Immunoliposomes Mediate Tumor Specific Drug Delivery and Enhance Therapeutic Efficacy in Colon Carcinoma," Clin. Cancer Res. 30 de diciembre. pii: clincanres.1194.2014). En el mercado están disponibles anticuerpos monoclonales que se unen inmunoespecíficamente a ITGB6 (por ejemplo, MAB2075Z clon R6G9, EMD Millipore; véase también, Weinacker, A. et al. (1994) "Role Of The Integrin Alpha V Beta 6 In Cell Attachment To Fibronectin. Heterologous Expression Of Intact And Secreted Forms Of The Receptor," J. Biol. Chem. 269:6940-6948). En las publicaciones del PCT n.° WO 03/100033 y WO 2007/008712 se desvelan anticuerpos monoclonales anti-ITGB6 3G9 y 8G6 y variantes de los mismos.

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-ITGB6 humanizado ilustrativo (derivado del anticuerpo 3G9, publicación del PCT n.° WO 2007/008712) (los restos de las CDR se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 312):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSASSSVS SSYLYWYQQK PGQAPRLLIY

STSNLASG IP ARFSGSGSGT GFTLTISSLE PEDFAVYYCH QWSTYPPTFG

GGTKVEIK

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-ITGB6 ilustrativo (derivado del anticuerpo 3G9, publicación del PCT n.° WO 2007/008712) (los restos de las c Dr se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 313):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYWMSWVRQA PGKGLEWVAS

ISSGGRMYYP FTVKGR FTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDT AVYYCARGSI

YDGYYVFPYW GQGTLVTVSS

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-ITGB6 ilustrativo (derivado del anticuerpo 8G6, publicación del PCT n.° WO 2007/008712) (los restos de las Cd R se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 314):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS TSSYSYMYWY QQKPGQAPRL

LIY YASNLES GIPARFSGSG SGTDFTLTIS SLEPEDFAVY YCQHNWEIPF

TFGGGTKVEI K

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-ITGB6 ilustrativo (derivado del anticuerpo 8G6, publicación del PCT n.° WO 2007/008712) (los restos de las c Dr se muestran subrayados): (SEQ ID NO: 315):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMHWVRQAPGQGLEWMGVISTYY

GNTNYNQKFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGGLRRGDRPSLQ

YAMDYWGQGTLVTVSS

14. Dominios de unión a antígenos anti-cáncer adicionales

Otros anticuerpos contra antígenos de cáncer que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos disponibles comercialmente: Brentuximab (por ejemplo, Adcetris®), que se une a CD30;

Gemtuzumab (por ejemplo, Mylotarg®, Wyeth), que se une a CD33; e Ipilimumab (por ejemplo, Yervoy®), que se une a CTLA-4.

C. Dominios de unión a células efectoras ilustrativos

Para proporcionar los dominios de unión a células efectoras de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden utilizar anticuerpos que son capaces de unirse a células efectoras del sistema inmunitario. Son particularmente adecuados los anticuerpos que se unen a CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, el receptor de células B (BCR), el receptor de células T (TCR) y el receptor NKG2D.

1. Dominios de unión a CD2

CD2 es una molécula de adhesión celular que se encuentra en la superficie de las células T y los linfocitos citolíticos naturales (NK). CD2 mejora la citotoxicidad de las células NK, posiblemente como un promotor de la formación de nanotubos en las células NK (Mace, E.M. et al. (2014) "Cell Biological Steps And Checkpoints In Accessing NK Cell Cytotoxicity," Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci, C.J. et al. (2012) "CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation," PLoS One 7(10):e47664:1-12). La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-CD2 (Lo-CD2a; n.° de referencia de ATCC: 11423) es (SEQ ID NO: 102) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DVVLTQTPPT LLATIGQSVS IS C RSSQSLL HSSGNTYLNW LLQRTGQSPQ

PLIY LVSKLE SGVPNRFSGS GSGTDFTLKI SGVEAEDLGV YYCMQFTHYP

YTFGAGTKLE LK

La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-CD2 (Lo-CD2a; n.° de referencia de ATCC: 11423) es (SEQ ID NO: 103) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLQQSGPE LQRPGASVKL SCKASGYIFT EYYMYWVKQR PKQGLELVGR

IDPEDGSIDY VEKFKKKATL TADTSSNTAY MQLSSLTSED TATYFCARGK

FNYRFAYWGQ GTLVTVSS

2. Dominios de unión a CD3

En una realización preferida, el segundo epítopo que se une a las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención será un epítopo de CD3. CD3 es un correceptor de células T compuesto por cuatro cadenas distintas (Wucherpfennig, K.W. etal. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; páginas 1-14). En los mamíferos, el complejo contiene una cadena CD3y, una cadena CD38 y dos cadenas CD3e. Estas cadenas se asocian con una molécula conocida como receptor de células T (TCR) para generar una señal de activación en los linfocitos T. En ausencia de CD3, los TCR no se ensamblan correctamente y se degradan (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177). El CD3 se encuentra unido a las membranas de todas las células T maduras y prácticamente no se encuentra en ningún otro tipo de célula (véase, Janeway, C.A. et al. (2005) En: IMMUNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE," 6a ed. Garland Science Publishing, NY, págs. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3e:y Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex," Immunity. febrero de 2006; 24(2):133-139).

Como se analiza posteriormente, para ilustrar la presente invención, se produjeron moléculas de unión anti-CD3 humano x anti-DR5 humano biespecíficas. Un anticuerpo anti-CD3 humano usado para estos constructos se denomina en el presente documento "mAb 2 de CD3". A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG

CDRl1 de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 105): RSSTGAVTTSNYAN

CDRl2 de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 106): GTNKRAP

CDRl3 de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 107): ALWYSNLWV

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 108) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS

CDRh1 de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 109): TYAMN

CDRh2 de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 110): RIRSKYNNYATYYADSVKD

CDRh3 de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 111): HGNFGNSYVSWFAY

En algunos de los constructos de CD3, se empleó una variante de dominio VH para el mAb 2 de CD3. La variante de dominio VH posee una sustitución D65G, teniendo así la secuencia de aminoácidos que se muestra a continuación (SEQ ID NO: 112) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS

La sustitución hace que la CDRh2 tenga la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 113) RIRSKYNNYATYYADSVKG. La posición sustituida (D65G) se muestra con un doble subrayado.

Un segundo anticuerpo anti-CD3 utilizado en el presente documento es el anticuerpo Muromonab-CD3 "OKT3" (Xu et al. (2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol.

200:16-26); Norman, D.J. (1995) "Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3," Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax, D.M. et al. (1987) "Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection," Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen, L.J. et al. (1993) "OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With T ransplantation," Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678). A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VL de Ok T3 (SEQ ID No : 114) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT

SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG

TKLEINR

A continuación se muestra la secuencia de aminoácidos del dominio VH de OKT3 (SEQ ID NO: 115) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY

INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY

DDHYCLDYWG QGTTLTVSS

3. Dominios de unión a CD16

CD16 es el receptor FcyRIIIA. CD16 se expresa por neutrófilos, eosinófilos, linfocitos citolíticos naturales (NK) y macrófagos tisulares que se unen a IgG humana agregada pero no monomérica (Peltz, G.A. et al. (1989) "Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 86(3):1013-1017; Bachanova, V. et al. (2014) "NK Cells In Therapy Of Cancer," Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller, J.S. (2013) "Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic," Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou, P. et al. (2002) "Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases," Autoimmun Rev. 1 (1-2): 13-19; Peipp, M. et al. (2002) "Bi-specific Antibodies Targeting Cancer Cells," Biochem. Soc. Trans.

30(4):507-511).

La secuencia de aminoácidos de un dominio de cadena ligera variable del anticuerpo anti-CD 163G8 es (SEQ ID NO: 116) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DTVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCKASQSVD FDGDSFMNWY QQKPGQPPKL

LIYTTSNLES GIPARFSASG SGTDFTLN1H PVEEEDTATY YCQQSNEDPY

TFGGGTKLEI K

La secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable del anticuerpo anti-CD16 3G8 es (SEQ ID NO: 117) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCSFSGFSLR TSGMGVGWIR QPSGKGLEWL

AHIWWDDDKR YNPALKSRLT ISKDTSSNQV FLKIASVDTA DTATYYCAQI

NPAWFAYWGQ GTLVTVSA

La secuencia de aminoácidos de un dominio de cadena ligera variable del anticuerpo anti-CD 16 A9 es (SEQ ID NO: 118) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQAVVTQES ALTTSPGETV TLTCRSNTGT VTTSNYANWV QEKPDHLFTG

L IGHTNNRAP GVPARFSGSL IGDKAALTIT GAQTEDEAIY FCALWYNNHW

VFGGGTKLTVL

La secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable del anticuerpo anti-CD16 A9 es (SEQ ID NO: 119) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGAE LVRPGTSVKI SCKASGYTFT NYWLGWVKQR PGHGLEWIGD

IYPGGGYTNY NEKFKGKATV TADTSSRTAY VQVRSLTSED SAVYFCARSA

SWYFDVWGAR TTVTVSS

4. Dominios de unión a CD19

El antígeno CD19 es una glicoproteína transmembrana de tipo I que pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas Ig. CD19 se expresa en células dendríticas foliculares y en células B. Se considera un marcador de células pan B expresado durante todo el desarrollo de las células B, pero con una expresión tres veces mayor en células maduras en comparación con las células B inmaduras (Raufi A. et al. (2013) "Targeting CD19 In B-Cell Lymphoma: Emerging Role Of SAR3419," Cancer Manag. Res. 5:225-233). Se han descrito muchos anticuerpos de CD19 (por ejemplo, MD1342, MEDI-551, etc.) (Mei, H.E. et al. (2012) "Rationale Of Anti-CD19 Immunotherapy: An Option To Target Autoreactive Plasma Cells In Autoimmunity," Arthritis Res. Ther. 14(Suppl 5):S1:1-16). En el documento EP 2186527 se desvela la molécula de unión anti-CD19 "blinatumomab".

La secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-CD19 preferido (HD37) es (SEQ ID NO: 120) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DILITQSPKS MSMSVGERVT LTCKASENW TYVSWYQQKP EQSPKLLIYG

ASNRYTGVPD RFTGSGSATD FTLTISSVQA EDLADYHCGQ GYSYPYTFGG

GTKLEIKR

La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-CD 19 HD37 es (SEQ ID NO: 121) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQSGAE LVRPGSSVKI SCKASGYAFS SYWMNWVKQR PGQGLEWIGQ

IWPGDGDTNY NGKFKGKATL TADESSSTAY MQLSSLASED SAVYFCARRE

TTTVGRYYYA MDYWGQGTSV TVSS

5. Dominios de unión a CD20

CD20 es un antígeno de diferenciación específico de células B que se expresa en células B maduras y en la mayoría de los linfomas no Hodgkin de células B, pero no en progenitores de células B en sus primeras fases ni en células plasmáticas maduras en sus últimas fases (Maloney, D.G. (2012) "Anti-CD20 Antibody Therapy for B-Cell Lymphomas," N. Engl. J. Med. 366:2008-2016). El rituximab es un anticuerpo anti-CD20 humano ilustrativo. La secuencia de aminoácidos del dominio VL de un anticuerpo anti-CD20 quimérico (rituximab) es (SEQ ID NO: 122) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QIVLSQSPAI LSASPGEKVT MTCRASSSVS Y1HWFQQKPG SSPKPWIYAT

SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW TSNPPTFGGG

TKLEIKR

La secuencia de aminoácidos del dominio VH de un anticuerpo anti-CD20 (rituximab) es (SEQ ID NO: 123) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYNMHWVKQT PGRGLEWIGA

IYPGNGDTSY NQKFKGKATL TADKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARST

YYGGDWYFNV WGAGTTVTVS A

Otros anticuerpos anti-CD20 alternativos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes anticuerpos disponibles comercialmente: Ibritumomab (por ejemplo, Zevalin®, Spectrum Pharmaceuticals, Inc.), Ofatumumab (por ejemplo, Arzerra®, SmithKlineGlaxo) y Tositumomab (por ejemplo, Bexxar®, GlaxoSmithKline).

6. Dominios de unión a CD22

CD22 es una proteína transmembrana de unión a azúcar que se encuentra en la superficie de las células B maduras y, en menor grado, en algunas células B inmaduras (documento WO 2011/032633; Poe, J.C. et al. (2012) "CD22 And Siglec-G In B Cell Function And Tolerance," Trends Immunol. 33(8):413-420; Chen, W.C. et al. (2012) "Targeting B Lymphoma With Nanoparticles Bearing Glycan Ligands Of CD22," Leuk. Lymphoma 53(2):208-210; Walker, J.A. (2008) "CD22: An Inhibitory Enigma," Immunology 123(3):314-325; Coleman, M. et al. (2003) "Epratuzumab: Targeting B-Cell Malignancies Through CD22," Clin. Cancer Res. 9(10 Pt 2):3991S-3994S).

La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-CD22 (epratuzumab) es (SEQ ID NO: 124) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MSCKSSQSVL YSANHKNYLA WYQQKPGKAP

KLLIYWASTR E SGVPSRFSG SGSGTDFTFT ISSLQPEDIA TYYCHQYLSS

WTFGGGTKVQ IKR

La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-CD22 (epratuzumab) es (SEQ ID NO: 125) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFT SYWLHWVRQA PGQGLEWIGY

INPRNDYTEY NQNFKDKATI TADESTNTAY MELSSLRSED TAFYFCARRD

ITTFYWGQGT TVTVSS

7. Dominios de unión a CD32B

Una secuencia preferida para el dominio VL de un anticuerpo que se une a CD32B humano es el mAb 1 de CD32B (SEQ ID NO: 126) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQMTQSPSS LLAALGERVS LTCRASQEIS GYLSWLQQKP DGTIKRLIYA

ASTLDSGVPK RFSGSESGSD YSLTISSLES EDFADYYCLQ YFSYPLTFGA

GTKLELK

Una secuencia preferida para el dominio VH del anticuerpo mAb 1 de CD32B que se une a CD32B humano es (SEQ ID NO: 127) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVKLEESGGG LVQPGGSMKL SCEASGFTFS DAWMDWVRQS PEKGLEWVAE

IRNKAKNHAT YYAESVIGRF TISRDDSKSS VYLQMNSLRA EDTGIYYCGA

LGLDYWGQGT TLTVSS

8. Dominios de unión a CD64

CD64 es el receptor FcyRI y se expresa en monocitos/macrófagos, células dendríticas y granulocitos activados. La expresión puede regularse positivamente mediante estimulación con IFN-y. CD64 se une al complejo inmunitario IgG. c D64 juega un papel en la captura de antígenos, fagocitosis de complejos IgG/antígeno y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (documento WO 2006/002438).

Una secuencia preferida para el dominio VL de un anticuerpo que se une a CD64 humano es el mAb 1 de CD64 (SEQ ID NO: 128) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD

ASSRATGIPA RFGGSGSGGT DFTLTISSLE PEDFAVYYCQ LRSNWPPYTF

GQGTKLEIK

Una secuencia preferida para el dominio VH de un anticuerpo que se une a CD64 humano es (SEQ ID NO: 129) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS GYGMHWVRQA PGKGLEWVTV

IWYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDT

GDRFFDYWGQ GTLVTVSS

9. Dominios de unión a BCR/CD79

El BCR está compuesto por una inmunoglobulina de membrana que, junto con las subunidades a y p asociadas de manera no covalente de CD79 ("CD79a" y "CD79b", respectivamente), forma el complejo BCR. CD79a y CD79b son subunidades de transducción de señales que contienen un motivo de activación basado en tirosina de inmunorreceptor conservado ("ITAM") necesario para la transducción de señales (Dylke, J. et al. (2007) "Role Of The Extracellular And Transmembrane Domain Of Ig-Alpha/Beta In Assembly Of The B Cell Antigen Receptor (BCR)," Immunol. Lett.

112(1):47-57; Cambier, J.C. (1995) "New Nomenclatura For The Reth Motif (or ARH1/TAM/ARAM/YXXL)," Immunol. Today 16:110). La agregación del complejo BCR por el antígeno multivalente inicia la transfosforilación de los ITAM CD79a y CD79b y la activación de quinasas asociadas a receptores (DeFranco, A.L. (1997) "The Complexity Of Signaling Pathways Activated By The BCR," Curr. Opin. Immunol. 9:296-308; Kurosaki, T. (1997) "Molecular Mechanisms In B Cell Antigen Receptor Signaling," Curr. Opin. Immunol. 9:309-318; Kim, K.M. et al. (1993) "Signalling Function Of The B-Cell Antigen Receptors," Immun. Rev. 132:125-146). Los ITAM fosforilados reclutan efectores adicionales tales como PI3K, PLC-^yy miembros de la ruta Ras/MAPK. Estos acontecimientos de señalización son responsables tanto de la proliferación de las células B como del aumento de la expresión de marcadores de activación (tales como MHCII y CD86) que se requieren para cebar las células B para sus interacciones posteriores con células T auxiliares ("Th").

Una secuencia preferida para el dominio VL de un anticuerpo que se une al receptor de células B humano (CD79) es el mAb 1 de CD79 (SEQ ID NO: 130) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DVVMTQTPLT LSVNIGQPAS IS C KSSQSLL DTDGKTYLNW LLQRPQGSPN

RLIYLVSKLD S GVPDRFTGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGI YYCWQGTHFP

LTFGAGTKLE LK

Una secuencia preferida para el dominio VH del anticuerpo mAb 1 de CD79 que se une al receptor de células B humano (CD79) es (SEQ Id NO: 131) (los restos de las c Dr se muestran subrayados):

QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWMNWVKQR PGQGLEWIGM

VDPSDSETHY NQMFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARAM

GYWGQGTSVT VSS

10. Dominios de unión al receptor de células T

En una realización alternativa, el segundo epítopo que se une a las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención será un epítopo del receptor de células T (TCR). El receptor de células T se expresa de forma nativa por linfocitos T CD4+ o CD8+, y permite que dichas células reconozcan péptidos antigénicos que se unen y se presentan por proteínas del MHC de clase I o clase II de células presentadoras de antígeno. El reconocimiento de un complejo pMHC (péptido-MHC) por un TCR inicia la propagación de una respuesta inmunitaria celular que conduce a la producción de citocinas y a la lisis de la célula presentadora de antígeno (véase, por ejemplo, Armstrong, K.M. et al. (2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Complexes," Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen, R. (2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy," Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier, K.C. et al. (2007) "Master Switches Of T-Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone, R. et al. (2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther. 12(6):534-550). CD3 es el receptor que se une al TCR (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex," Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair, E.W. (publicación electrónica, 12 de octubre de 2009) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity," Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle, P.A. et al. (publicación electrónica, 9 de junio de 2009) "Bi-specific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin, J.E. et al. (2009) "T Cell Activation," Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders, L. et al. (2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression," Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).

Los anticuerpos que se unen específicamente al receptor de células T incluyen el anticuerpo anti-TCR BMA 031 (documento EP 0403156; Kurrle, R. et al. (1989) "b Ma 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application," Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan, B. et al. (1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human a/p T Cell," J. Immunol. 146(3):928-935; Shearman, C.W. et al. (1991) "Construction, Expression And Characterization of Humanized Antibodies Directed Against The Human a/p T Cell Receptor," J. Immunol. 147(12):4366-4373).

La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-TCR BMA 031 es (SEQ ID NO: 132) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCSATSSVS YMHWYQQKPG KAPKRWIYDT

SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGQG

TKLEIK

La secuencia de aminoácidos de un dominio VH del anticuerpo anti-TCR BMA 031 es (SEQ ID NO: 133) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYKFT SYVMHWVRQA PGQGLEWIGY

INPYNDVTKY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY LQMNSLRSED TAVHYCARGS

YYDYDGFVYW GQGTLVTVSS

11. Dominios de unión al receptor NKG2D

En una realización alternativa, el segundo epítopo que se une a las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención será un epítopo del receptor NKG2D. El receptor NKG2D se expresa en todos los linfocitos citolíticos naturales humanos (y de otros mamíferos) (Bauer, S. et al. (1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29) así como en todas las células T CD8+ (Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8ap T Cells By NKg 2d Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells," Nat. Immunol. 2(3):255-260; Jamieson, A.M. et al. (2002) "The Role o f The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29). Estos ligandos de unión, y particularmente los que no se expresan en células normales, incluyen la molécula de histocompatibilidad 60 (H60), el producto del gen-1 inducible temprano del ácido retinoico (RAE-1) y el transcrito de tipo proteína de unión a UL16 murino 1 (MULT1) (Raulet D.H. (2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands," Nature Rev. Immunol.

3:781-790; Coudert, J.D. et al. (2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells," Blood 106:1711-1717). Los anticuerpos que se unen específicamente al receptor NKG2D incluyen KYK-2.0 (Kwong, KY et al. (2008) "Generation, Affinity Maturation, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol.

384:1143-1156; y la publicación del PCT n.° WO 2010/027797).

La secuencia de aminoácidos del dominio VL del anticuerpo anti-NKG2D KYK-1.0 es (SEQ ID NO: 134) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QPVLTQPSSV SVAPGETARI PCGGDDIETK SVHWYQQKPG QAPVLVIYDD

DDRPSGIPER FFGSNSGNTA TLSISRVEAG DEADYYCQVW DDNNDEWVFG

GGTQLTVL

La secuencia de aminoácidos del dominio VH del anticuerpo anti-NKG2D KYK-1.0 es (SEQ ID NO: 135) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EVQLVESGGG VVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF

IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTKY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR

FGYYLDYWGQ GTLVTVSS

La secuencia de aminoácidos de un dominio VL del anticuerpo anti-NKG2D KYK-2.0 es (SEQ ID NO: 136) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QSALTQPASV SGSPGQSITI SCSGSSSNIG NNAVNWYQQL PGKAPKLLIY

YDDLLPSGVS DRFSGSKSGT SAFLAISGLQ SEDEADYYCA AWDDSLNGPV

FGGGTKLTVL

La secuencia de aminoácidos de un dominio VH del anticuerpo anti-NKG2D KYK-2.0 es (SEQ ID NO: 137) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMHWVRQA PGKGLEWVAF

IRYDGSNKYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDR

GLGDGTYFDY WGQGTTVTVS S

D. Moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención

1. Dominios Fc preferidos

Los dominios CH2 y CH3 de las dos cadenas pesadas interaccionan para formar el Dominio Fc, que es un dominio que se reconoce por Receptores Fc celulares (FcyRs). Tal como se usa en el presente documento, la expresión "dominio Fc" se utiliza para definir una región C-terminal de una cadena pesada de IgG. La secuencia de aminoácidos del dominio CH2-CH3 de una IgG1 humana ilustrativa es (SEQ ID NO: 1):

APELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVWDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT

231 240 250 260 270 280

<-CH2 | CH3^

KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA K GQPREPQVY

290 300 310 320 330 340

TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK

350 360 370 380 390 400

< -c m |

LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK

410 420 430 440

A lo largo de la presente memoria descriptiva, la numeración de los restos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU de Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5.a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991). El "índice EU de Kabat" se refiere a la numeración del anticuerpo humano IgG1 EU. Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras maduras de las inmunoglobulinas se designan por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describió numerosas secuencias de aminoácidos para los anticuerpos, identificó una secuencia consenso de aminoácidos para cada subgrupo y asignó un número de restos a cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat puede extenderse a los anticuerpos no incluidos en su compendio alineando el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias consenso en Kabat haciendo referencia a aminoácidos conservados. Este método para asignar números de restos se ha vuelto una norma en el campo e identifica fácilmente los aminoácidos en posiciones equivalentes de diferentes anticuerpos, Incluyendo las variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, un aminoácido que está en la posición 5o de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo murino.

Aunque los límites pueden variar ligeramente, el dominio CH2 de un dominio Fc de IgG humana se extiende normalmente desde el aminoácido 231 al aminoácido 341 de una IgG humana según el sistema de numeración de Kabat. El dominio CH3 de una IgG humana normalmente se extiende desde el aminoácido 342 hasta el 447 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. La "región bisagra" o "dominio bisagra", en general, se define como el tramo desde la Glu216 hasta la Pro230 de la IgG1 humana.

Se han observado polimorfismos en varias posiciones diferentes dentro de las regiones constantes de anticuerpos (por ejemplo, posiciones de Fc, entre las que se incluyen, pero sin limitación, las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358 numeradas por el índice EU como se establece en Kabat) y, por lo tanto, pueden existir ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias de la técnica anterior. Las formas polimórficas de inmunoglobulinas humanas están bien caracterizadas. En la actualidad, se conocen alotipos de 18 Gm: G1m (1, 2, 3, 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b3, bO, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Se contempla específicamente que los anticuerpos de la presente invención pueden incorporar cualquier alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina, y no se limitan al alotipo, isoalotipo o haplotipo de las secuencias proporcionadas en el presente documento.

Las señales activadoras e inhibidoras se transducen a través de los receptores Fc (FcyR) después de su ligamiento a un dominio Fc. Estas funciones diametralmente opuestas se deben a las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas de los receptores. Dos dominios distintos dentro de los dominios de señalización citoplasmáticos del receptor denominados motivos de activación basados en tirosina de inmunorreceptores (ITAM) o motivos de inhibición basados en tirosina de inmunorreceptores (ITIM) son los responsables de las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplasmáticas en estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcyR. Los complejos FcyR que contienen ITAM incluyen FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIIA, mientras que los complejos que contienen ITIM solo incluyen FcyRIIB. Los neutrófilos humanos expresan el gen de FcyRIIA. El agrupamiento de FcyRIIA a través de complejos inmunitarios o reticulación de anticuerpos específicos sirve para agregar los ITAM junto con las quinasas asociadas a receptores que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de los ITAM sirve como sitio de acoplamiento para la quinasa Syk, cuya activación da como resultado la activación de sustratos aguas abajo (por ejemplo, PI3K). La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios. El gen de FcyRIIB se expresa en los linfocitos B; su dominio extracelular es idéntico al 96 % a FcyRIIA, y se une a los complejos de IgG de manera casi idéntica. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático de FcyRIIB define esta subclase inhibidora de FcyR. Recientemente, se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se liga junto con un FcyR activador, el ITIM de FcyRIIB se fosforila y atrae el dominio SH2 de la inositol polifosfato 5'- fosfatasa (SHIP), que hidroliza los mensajeros del fosfoinositol liberados como consecuencia de la activación de tirosina quinasa mediada por FcyR que contiene ITAM, impidiendo, por consiguiente, el flujo de entrada de Ca++ intracelular. De este modo, el entrecruzamiento de FcyRIIB atenúa la respuesta activadora al ligamiento de FcyR e inhibe la respuesta celular. De esta forma se anula la activación de células B, la proliferación de células B y la secreción de anticuerpos.

El dominio Fc de las moléculas de unión de la presente invención puede ser un dominio Fc completo (por ejemplo, un dominio Fc de IgG completo) o solo un fragmento de un dominio Fc completo. Aunque el dominio Fc de los diacuerpos Fc monovalentes biespecíficos de la presente invención puede poseer la capacidad de unirse a uno o más receptores Fc (por ejemplo, FcyR), más preferentemente, dicho dominio Fc provocará una unión alterada a FcyRIA (CD64), FcyR iIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcyRIIIB (CD16b) (con respecto a la unión que presenta un dominio Fc de tipo silvestre) o eliminará sustancialmente la capacidad de dicho dominio Fc para unirse a uno o más receptores inhibidores. Por lo tanto, el dominio Fc de los diacuerpos que contienen el dominio Fc de la presente invención puede incluir parte o la totalidad del dominio CH2 y/o parte o la totalidad del dominio CH3 de un dominio Fc completo, o puede comprender una variante de CH2 y/o una secuencia de CH3 variante (que puede incluir, por ejemplo, una o más inserciones y/o una o más deleciones con respecto a los dominios CH2 o CH3 de un dominio Fc completo). Dichos dominios Fc pueden comprender porciones de polipéptido que no son Fc, o pueden comprender porciones de dominios Fc completos no naturales, o pueden comprender orientaciones no naturales de dominios CH2 y/o CH3 (tales como, por ejemplo, dos dominios CH2 o dos dominios CH3, o en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio CH3 unido a un dominio CH2, etc.).

Las modificaciones del dominio Fc identificadas como modificaciones que alteran la función efectora son conocidas en la técnica, incluyendo modificaciones que aumentan la unión a receptores activadores (por ejemplo, FcyRIIA (CD16A) y reducen la unión a receptores inhibidores (por ejemplo, FcyRIIB (CD32B) (véase, por ejemplo, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res.

57(18):8882-8890).

En particular, se prefiere que los dominios CH2-CH3 de las cadenas polipeptídicas de los diacuerpos que contienen el dominio Fc de la presente invención presenten una unión disminuida (o sustancialmente nula) a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcyRIIIB (CD16b) (en relación con la unión presentada por el dominio Fc de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1). Se han descrito anteriormente las variantes de Fc y las formas mutantes capaces de mediar tal unión alterada. En una realización preferida, el dominio CH2-CH3 de la primera y/o tercera cadenas polipeptídicas de dichos diacuerpos incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las sustituciones: L234A, L235a , F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L. Las variantes ejemplares de dominios Fc de IgG1 humana con unión reducida a CD32B y/o unión aumentada a CD16A contienen sustituciones F243L, R292P, Y300L, V305I o P396L. Estas sustituciones de aminoácidos pueden estar presentes en un dominio Fc de IgG1 humana en cualquier combinación. En una realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R292P y Y300L. En otra realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L. En una realización, el dominio CH2-CH3 de la primera y/o tercera cadenas polipeptídicas de dichos diacuerpos incluye 1,2 o 3 de las sustituciones: L234A, L235A, N297G, N297Q. En otra realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución N297Q, sustituciones L234A y L235A o una sustitución D265A, ya que estas mutaciones anulan la unión de FcR. Como alternativa, se utiliza un dominio CH2-CH3 que presenta inherentemente una unión disminuida (o sustancialmente nula) a FcyRIIIA (CD16a) y/o una función efectora reducida (en relación con la unión presentada por el dominio Fc de IgG1 de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1)). En una realización específica, los diacuerpos que contienen el dominio Fc de la presente invención comprenden un dominio Fc de IgG2 o un dominio Fc de IgG4. Cuando se utiliza un dominio Fc de IgG4, la presente invención también abarca la introducción de una mutación estabilizadora como S228P, numerado por el índice de EU como se establece en Kabat (Lu et al., (2008) "The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J Pharmaceutical Sciences 97:960-969) to reduce the incidence of strand exchange. Pueden introducirse otras mutaciones estabilizadoras conocidas en la técnica en un dominio Fc de IgG4 (Peters, P et al., (2012) "Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability," J. Biol. Chem., 287:24525-24533; publicación de patente del PCT n.°: WO 2008/145142). Como las sustituciones N297A, L234A, L235A y D265A anulan la función efectora, en circunstancias en las que se desea la función efectora, preferentemente no se emplearían estas sustituciones.

Los dominios CH2 y/o CH3 de tales cadenas polipeptídicas no necesitan ser idénticos en secuencia, y ventajosamente se modifican para fomentar la formación de complejos entre las dos cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, se puede introducir una sustitución de aminoácidos (preferentemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un "botón", por ejemplo, triptófano) en el dominio CH2 o CH3 de modo que la interferencia estérica impida la interacción con un dominio mutado de manera similar y obligue al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el que se ha introducido por ingeniería genética una mutación complementaria o de acomodación, es decir, "el ojal" (por ejemplo, una sustitución con glicina). Dichos conjuntos de mutaciones pueden introducirse por ingeniería genética en dos cualesquiera de los polipéptidos de la molécula de unión triespecífica. Los métodos de modificación por ingeniería genética de proteínas para favorecer la heterodimerización con respecto a la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular con respecto a la ingeniería de moléculas de tipo inmunoglobulina, y se incluyen en el presente documento (véase, por ejemplo, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, and Xie et al. (2005) "A New Format Of Bi-specific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101). Preferentemente, el "botón" se modifica por ingeniería genética en los dominios CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el "ojal" se modifica por ingeniería genética en los dominios CH2-CH3 de la otra cadena polipeptídica que contiene CH2-CH3. Por lo tanto, el "botón" ayudará a impedir que la primera cadena polipeptídica se homodimerice a través de sus dominios CH2 y/o CH3. La cadena polipeptídica CH2-CH3 "portadora del ojal" se heterodimerizará con la cadena polipeptídica CH2-CH3 "portadora del botón" y también se homodimerizará consigo misma. Se crea un botón preferido modificando un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366W. Se crea un ojal preferido modificando un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366S, L368A y Y407V. Para ayudar a purificar el homodímero de la cadena polipeptídica "portadora del ojal" de la molécula de unión triespecífica final, el sitio de unión de la proteína A de los dominios CH2 y CH3 del dominio Fc "portador del ojal" preferentemente se muta por sustitución de aminoácidos en la posición 435 (H435R). Por lo tanto, el homodímero del dominio Fc "portador del ojal" no se unirá a la proteína A, mientras que la molécula de unión triespecífica deseada conservará su capacidad para unirse a la proteína A través del sitio de unión de la proteína A en la primera cadena polipeptídica.

Una secuencia preferida para los dominios CH2 y CH3 de la primera cadena polipeptídica de un diacuerpo que contiene un dominio Fc de la presente invención tendrá la secuencia "portadora del botón" (SEQ ID NO: 52):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHNHYTQKS LSLSPGK

Una secuencia preferida para los dominios CH2 y CH3 de la segunda cadena polipeptídica de un diacuerpo que contiene un dominio Fc de la presente invención que tiene dos cadenas polipeptídicas (o la tercera cadena polipeptídica de un diacuerpo que contiene un dominio Fc que tiene tres cadenas polipeptídicas) tendrá la secuencia "portadora del ojal" (SEQ ID NO: 53):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHNRYTQKS LSLSPGK

Como se observará, los dominios CH2-CH3 de SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53 incluyen una sustitución en la posición 234 con alanina y en la posición 235 con alanina y, por lo tanto, forman un dominio Fc que presenta una unión disminuida (o sustancialmente nula) a FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD16a) o FcyRIIIB (CD16b) (en relación con la unión presentada por el dominio Fc de tipo silvestre (SEQ ID NO: 1).

Se prefiere que la primera cadena polipeptídica tenga una secuencia CH2-CH3 "portadora del botón", tal como la de SEQ ID NO: 52. Sin embargo, como se reconocerá, podría emplearse un dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (por ejemplo, SEQ ID NO: 53) en la primera cadena polipeptídica, en cuyo caso, se emplearía un dominio CH2-CH3 "portador del botón" (por ejemplo, SEQ ID NO: 52) en la segunda cadena polipeptídica de un diacuerpo que contiene un dominio Fc de la presente invención que tiene dos cadenas polipeptídicas (o la tercera cadena polipeptídica de un diacuerpo que contiene un dominio Fc que tiene tres cadenas polipeptídicas).

2. Primera cadena polipeptídica preferida

Una primera cadena polipeptídica de una molécula de unión preferida de la presente invención comprenderá un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo I (VL ⁱ), un dominio de cadena pesada variable capaz de unirse al epítopo II (VH ^{i i}), un dominio promotor de heterodímeros y un dominio CH2-CH3.

Dado que los dominios de cadena ligera variable y cadena pesada variable del primer polipéptido se dirigen hacia diferentes epítopos, no pueden asociarse para formar un dominio de unión que sea capaz de unirse al epítopo I o al epítopo II. Los dominios de cadena ligera variable y de cadena pesada variable del primer polipéptido están separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que es suficientemente corto como para impedir sustancialmente la asociación de estos dominios. Un enlazador ilustrativo, denominado "Enlazador 1", tiene la secuencia (SEQ ID NO: 33): GGGSGGGG.

El dominio de cadena pesada variable del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros de ese polipéptido están preferentemente separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que contiene 1,2, 3 o más restos de cisteína. Un péptido espaciador que contiene cisteína preferido ("Enlazador 2") tiene la secuencia SEQ ID NO: 34: GGCGGG.

Los enlazadores que se pueden emplear para enlazar un dominio CH2-CH3 a una cadena polipeptídica de las moléculas de la presente invención incluyen: ASTKG (SEQ ID NO: 47), DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 48), LEPKSS (SEQ ID NO: 49) y APSSSPME (SEQ ID NO: 50), APSSS (SEQ ID NO: 152) y GGG o GCG. Puede usarse la SEQ ID NO: 49 en lugar de GGG o GCG para facilitar la clonación. De manera adicional, la SEQ ID NO: 49 puede ir seguida inmediatamente por la SEQ ID NO: 47 para formar un enlazador alternativo (LEPKSSDKTHTCPp Cp ; SEQ ID NO: 51).

El dominio promotor de heterodímeros del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros del segundo polipéptido se seleccionan de forma coordinada. Los dominios se diferencian entre sí y están diseñados para asociarse entre sí para promover la asociación de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, uno de los dominios promotores de heterodímeros se diseñará por ingeniería genética para tener una carga negativa a pH 7, mientras que la otra de las dos cadenas polipeptídicas se diseñará por ingeniería genética para tener una carga positiva a pH 7. La presencia de dichos dominios cargados promueve la asociación entre el primer y el segundo polipéptidos y, por lo tanto, fomenta la heterodimerización. Es indiferente qué dominios promotores de heterodímeros se proporcionan a qué cadena, siempre que los dominios empleados en la primera y segunda cadenas polipeptídicas difieran para fomentar la heterodimerización entre dichas cadenas.

Los dominios promotores de heterodímeros pueden ser los dominios CL y CH1 de IgG o pueden ser un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos GVEPKSC (SEQ ID NO: 35) o VEPKSC (SEQ ID NO: 36) derivado del dominio bisagra de una IgG humana, y en lugar del dominio CL, se pueden emplear los 6 aminoácidos C-terminales de la cadena ligera kappa humana, GFNRGEC (SEQ ID NO: 37) o FNRGEC (SEQ ID NO: 38).

Más preferentemente, sin embargo, los dominios promotores de heterodímeros de dichos diacuerpos se forman a partir de uno, dos, tres o cuatro dominios de espiral repetidos en tándem de carga opuesta que comprenden una secuencia de al menos seis, al menos siete o al menos ocho restos de aminoácidos cargados (Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Arndt, K.M. et al. (2002) "Comparison of In Vivo Selection and Rational Design of Heterodimeric Coiled Coils," Structure 10:1235-1248; Boucher, C. et al. (2010) "Protein Detection By Western Blot Via Coiled-Coil Interactions," Analytical Biochemistry 399:138-140; Cachia, P.J. et al. (2004) "Synthetic Peptide Vaccine Development: Measurement Of Polyclonal Antibody Affinity And Cross-Reactivity Using A New Peptide Capture And Release System For Surface Plasmon Resonance Spectroscopy," J. Mol. Recognit.

17:540-557; De Crescenzo, G.D. et al. (2003) "Real-Time Monitoring of the Interactions of Two-Stranded de novo Designed Coiled-Coils: Effect of Chain Length on the Kinetic and Thermodynamic Constants of Binding," Biochemistry 42:1754-1763; Fernandez-Rodriquez, J. et al. (2012) "Induced Heterodimerization And Purification Of Two Target Proteins By A Synthetic Coiled-Coil Tag," Protein Science 21:511-519; Ghosh, T.S. et al. (2009) "End-To-End And End-To-Middle Interhelical Interactions: New Classes Of Interacting Helix Pairs In Protein Structures," Acta Crystallographica D65:1032-1041; Grigoryan, G. et al. (2008) "Structural Specificity In Coiled-Coil Interactions," Curr. Opin. Struc. Biol. 18:477-483; Litowski, J.R. et al. (2002) "Designing Heterodimeric Two-Stranded a-Helical Coiled-Coils: The Effects Of Hydrophobicity And a-Helical Propensity On Protein Folding, Stability, And Specificity," J. Biol. Chem. 277:37272-37279; Steinkruger, J.D. et al. (2012) "The d'—d--d' Vertical Triad is Less Discriminating Than the a'--a--a' Vertical Triad in the Antiparallel Coiled-coil Dimer Motif," J. Amer. Chem. Soc. 134(5):2626-2633; Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled- coil Interface," J. Molec. Biol.

366:1232-1242; Tripet, B. et al. (2002) "Kinetic Analysis of the Interactions between Troponin C and the C-terminal Troponin I Regulatory Region and Validation of a New Peptide Delivery/Capture System used for Surface Plasmon Resonance," J. Molec. Biol. 323:345-362; Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies," Adv. Prot. Chem. 70:79-112; Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367).

Dichos dominios de espiral repetidos pueden ser repeticiones exactas o pueden tener sustituciones. Por ejemplo, el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica puede comprender una secuencia de ocho restos de aminoácidos cargados negativamente y el dominio promotor de heterodímeros de la segunda cadena polipeptídica puede comprender una secuencia de ocho restos de aminoácidos cargados negativamente. Es indiferente qué espiral se proporciona a la primera o segunda cadenas polipeptídicas, siempre que se utilice una espiral de carga opuesta para la otra cadena polipeptídica. El aminoácido cargado positivamente puede ser lisina, arginina, histidina, etc. y/o el aminoácido cargado negativamente puede ser ácido glutámico, ácido aspártico, etc. El aminoácido cargado positivamente es preferentemente lisina y/o el aminoácido cargado negativamente es preferentemente ácido glutámico. Es posible que se emplee un único dominio promotor de heterodímeros (ya que dicho dominio inhibirá la homodimerización y, por lo tanto, promoverá la heterodimerización), sin embargo, se prefiere que tanto la primera como la segunda cadena polipeptídica de los diacuerpos de la presente invención contengan dominios promotores de heterodímeros.

En una realización preferida, uno de los dominios promotores de heterodímeros comprenderá cuatro dominios helicoidales de "espiral E" en tándem (SEQ ID NO: 39: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK), cuyos restos de glutamato formarán una carga negativa a pH 7, mientras que el otro de los dominios promotores de heterodímeros comprenderá cuatro dominios de "espiral K" en tándem (SEQ ID NO: 40: Kv Aa LKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE), cuyos restos de lisina formarán una carga positiva a pH 7. La presencia de dichos dominios cargados promueve la asociación entre el primer y el segundo polipéptidos y, por lo tanto, fomenta la heterodimerización. Se prefiere especialmente un dominio promotor de heterodímeros en el que uno de los cuatro dominios helicoidales de "espiral E" en tándem de SEQ ID NO: 39 se haya modificado para contener un resto de cisteína: EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 41). Análogamente, se prefiere especialmente un dominio promotor de heterodímeros en el que uno de los cuatro dominios helicoidales de "espiral K" en tándem de SEQ ID NO: 40 se haya modificado para contener un resto de cisteína: KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO: 42).

Como se desvela en el documento WO 2012/018687, para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los diacuerpos in vivo, un diacuerpo puede modificarse para que contenga una porción polipeptídica de una proteína de unión al suero en uno o más de los extremos del diacuerpo. Aún más preferentemente, tal porción de polipéptido de una proteína de unión al suero se instalará en el extremo C del diacuerpo. La albúmina es la proteína más abundante en el plasma y tiene una semivida de 19 días en los seres humanos. La albúmina posee varios sitios de unión a moléculas pequeñas que le permiten unirse de manera no covalente a otras proteínas y, por lo tanto, prolongar su semivida en suero. El dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa de Streptococcus G148 consta de 46 restos de aminoácidos que forman un paquete estable de tres hélices y tiene una amplia especificidad de unión a albúmina (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120. Por lo tanto, una porción polipeptídica particularmente preferida de una proteína de unión al suero para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un diacuerpo in vivo es el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína estreptocócica G y, más preferentemente, el dominio de unión a la albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa de Streptococcus G148 (SEQ ID NO: 43): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS a e g v k a l id e il a a l p .

Como se desvela en el documento WO 2012/162068, las variantes "desinmunizadas" de SEQ ID NO: 43 tienen la capacidad de atenuar o eliminar la unión al MHC de clase II. Según los resultados de mutaciones combinatorias, se considera que las siguientes combinaciones de sustituciones son sustituciones preferidas para formar dicho dominio de unión a albúmina desinmunizado: 66S/70S 71A; 66S/70S 79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. Las variantes de ABD que tienen las modificaciones L64A, I65A y D79A o las modificaciones N66S, T70S y D79A. La variante de ABD desinmunizado que tiene la secuencia de aminoácidos:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ ID NO: 44),

o la secuencia de aminoácidos:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ ID NO: 45),

es particularmente preferida ya que tales dominios de unión a albúmina desinmunizados presentan una unión sustancialmente de tipo silvestre al mismo tiempo que proporcionan unión atenuada al MHC de clase II. Por lo tanto, la primera cadena polipeptídica de dicho diacuerpo que tiene un dominio de unión a albúmina contiene un tercer enlazador (Enlazador 3) preferentemente situado en el extremo C del dominio de espiral E (o espiral K) de dicha cadena polipeptídica para intervenir entre el dominio de espiral E (o espiral K) y el dominio de unión a albúmina (que es preferentemente un dominio de unión a albúmina desinmunizado). Una secuencia preferida para tal Enlazador 3 es la SEQ ID NO: 46: GGGS.

Por lo tanto, en resumen, una primera cadena polipeptídica preferida de una molécula de unión triespecífica preferida de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio Vü)-(Enlazador 1)-(Dominio VHii)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros de espiral E)-(Enlazador 3)-(Dominio CH2-CH3 Portador del Botón).

3. Primera cadena polipeptídica alternativa

En una realización, las orientaciones de los dominios descritos anteriormente estarán en la dirección N-terminal a C-terminal. La presente invención, sin embargo, también contempla una variación de la misma, donde las orientaciones de los dominios de la primera cadena polipeptídica son: NH2-(Dominio CH3-CH2 Portador de Botón)-(Dominio VLⁱ)-(Enlazador 1 )-(Dominio VHn)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros de espiral E). Preferentemente, está presente un péptido que contiene cisteína en posición N-terminal con respecto a dicho dominio CH2-CH3. La secuencia de un péptido ilustrativo es la secuencia (SEQ ID NO: 48): DKTHTCPPCP. Preferentemente, en esta realización, el dominio CH3 está separado del dominio VLi por un enlazador peptídico intermedio (Enlazador 4), tal como uno que tiene la secuencia de aminoácidos de (SEQ ID NO: 152): APSSS y, más preferentemente, la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 50): APSSSPME.

4. Segunda cadena polipeptídica preferida

Una segunda cadena polipeptídica de dichas moléculas de unión triespecíficas preferidas comprenderá, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo II (VL ^{i i} ), un dominio de cadena pesada variable capaz de unirse al epítopo I (VH ⁱ ), y un dominio promotor de heterodímeros.

Dado que los dominios de cadena ligera variable y cadena pesada variable del segundo polipéptido se dirigen hacia diferentes epítopos, no pueden asociarse para formar un dominio de unión que sea capaz de unirse al epítopo I o al epítopo II. Los dominios de cadena ligera variable y de cadena pesada variable del segundo polipéptido están separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que es suficientemente corto como para impedir sustancialmente la asociación de estos dominios. El "Enlazador 1", que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 33):

GGGSGGGG es un enlazador ilustrativo para este propósito.

Como ocurre en el caso de la primera cadena polipeptídica, el dominio de cadena pesada variable del segundo polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros de ese polipéptido están preferentemente separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que contiene 1,2, 3 o más restos de cisteína. El "Enlazador 2", que tiene la secuencia (s Eq ID NO: 34) GGCGGG es un enlazador ilustrativo para este propósito. Dichos restos de cisteína pueden formar enlaces disulfuro con restos de cisteína en el péptido espaciador que contiene cisteína que separa el dominio de cadena pesada variable del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros de ese polipéptido. Por lo tanto, el primer y segundo polipéptidos de las moléculas de unión de la presente invención se unen covalentemente entre sí.

Como se ha analizado anteriormente, el dominio promotor de heterodímeros de la segunda cadena polipeptídica se selecciona coordinado con el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica. Por lo tanto, en una realización preferida, el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica es un dominio de "espiral K" (SEQ ID NO: 40) o un dominio de "espiral E" (SEQ ID n O: 39). Si en la primera cadena polipeptídica se emplea la espiral E que contiene cisteína (SEQ ID NO: 41), en la segunda cadena polipeptídica se emplea preferentemente la espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42). A la inversa, si en la primera cadena polipeptídica se emplea la espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42), en la segunda cadena polipeptídica se emplea preferentemente la espiral E que contiene cisteína (SEQ ID NO: 41). Dado que la primera cadena polipeptídica preferentemente poseerá un dominio de "espiral E", la segunda cadena polipeptídica contendrá preferentemente un dominio de "espiral K".

Como la primera y segunda cadenas polipeptídicas son cadenas polipeptídicas de un diacuerpo, pueden asociarse para formar un dominio de unión al dominio I (VLa/ VHa) que reconoce y se une inmunoespecíficamente al epítopo I, y un dominio de unión al dominio II (VLb/ VHb) que reconoce y se une inmunoespecíficamente al epítopo II.

Por lo tanto, en resumen, una segunda cadena polipeptídica preferida de una molécula de unión preferida de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio VLii)-(Enlazador 1)-(Dominio VH ⁱ )-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros de espiral K).

5. Tercera cadena polipeptídica preferida

Una tercera cadena polipeptídica de una molécula de unión preferida de la presente invención es un polipéptido que comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de unión, un dominio CH1-bisagra opcional y un dominio CH2-CH3. El dominio de unión de la tercera cadena polipeptídica de una molécula de unión preferida de la presente invención puede ser un dominio de cadena pesada variable capaz de unirse al epítopo III. (VH ^{i i i} ), en cuyo caso, la cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión preferidas de la presente invención (analizadas más adelante) es un polipéptido que comprende un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo III (VL ^{i i i} ), de manera que el dominio de unión es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un antígeno que posee el epítopo III. Como alternativa, el dominio de unión de la tercera cadena polipeptídica de las moléculas de unión preferidas de la presente invención puede comprender un dominio de unión de tipo receptor de célula efectora, en cuyo caso, la cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión preferidas de la presente invención (analizadas más adelante) es un polipéptido que comprende un dominio de unión de tipo receptor de célula efectora complementario, de manera que la interacción de dos cadenas polipeptídicas forma un dominio de unión que es capaz de unirse fisioespecíficamente a la molécula presente en la superficie de la célula efectora. La tercera cadena polipeptídica puede aislarse a partir de anticuerpos naturales. Como alternativa, puede construirse de forma recombinante. Un dominio CH1 ilustrativo es un dominio CH1 de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 207):

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV

Una variante del dominio CH1 de IgG1 humana de SEQ ID NO: 207 es (SEQ ID NO: 208):

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV

Un dominio bisagra ejemplar es un dominio bisagra de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 209): EPKSCDKTHTCPPCP. Como se reconocerá, el dominio bisagra ilustrativo comprende múltiples restos de cisteína (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains," J. Biol. Chem.

280:14402-14412) que pueden participar en la unión covalente entre cadenas.

Aunque se puede emplear un dominio CH2-CH3 de tipo silvestre, se prefiere, tal como se ha descrito anteriormente, emplear un dominio CH2-CH3 modificado que promueva la heterodimerización con el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica.

Preferentemente, por lo tanto, el dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica será un dominio CH2-CH3 "portador del ojal" cuya secuencia de aminoácidos es complementaria al dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52) empleado en el primer polipéptido. Como se ha analizado anteriormente, el dominio CH2-CH3 "portador del ojal" preferentemente debe comprender una sustitución en la posición 435 (H435R) para eliminar el sitio de unión de la proteína A. Un ejemplo de dominio CH2-CH3 "portador del ojal" con la sustitución H435R para el tercer polipéptido es SEQ ID NO: 53.

Como se reconocerá, podría emplearse un dominio CH2-CH3 "portador del botón" (por ejemplo, SEQ ID NO: 52) en la tercera cadena polipeptídica, en cuyo caso, se emplearía un dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (por ejemplo, SEQ ID NO: 53) en la primera cadena polipeptídica.

En la realización en la que la tercera (y cuarta) cadenas polipeptídicas de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención comprenden, cada una, una cadena polipeptídica de un dominio de unión de tipo receptor de célula efectora, son bien conocidos los métodos para producir tales dominios de unión de tipo receptor de célula efectora (por ejemplo, documento US2012/0294874A1).

Por lo tanto, en resumen, una tercera cadena polipeptídica de las moléculas de unión preferidas de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio VHiii)-(Dominio CH1 Opcional)-(Dominio Bisagra Opcional)-(Dominio CH2-CH3 "Portador del Ojal") o (Dominio de Unión de Tipo Receptor de Células T; primer o segundo polipéptido del mismo)-(Dominio CH1 Opcional)-(Dominio Bisagra Opcional)-(Dominio CH2-CH3 "Portador del Ojal").

6. Cuarta cadena polipeptídica preferida

Una cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención es un polipéptido de un dominio de unión de tipo receptor de célula efectora (en donde el tercer y cuarto polipéptidos forman un ligando para un receptor que se encuentra en la superficie de una célula efectora o, más preferentemente, una cadena ligera del anticuerpo indicado anteriormente que se une inmunoespecíficamente al epítopo III o que es complementaria al dominio de unión de la tercera cadena polipeptídica.

Por lo tanto, en donde el tercer y cuarto polipéptidos forman un dominio de unión de tipo Fab de tal forma que la cuarta cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo III (VL ^{i i i} ) y un dominio para promover la unión covalente a la tercera cadena polipeptídica o un dominio de unión y dicho dominio para promover la unión covalente a la tercera cadena polipeptídica. Dicho dominio puede ser un dominio CL o una parte del mismo que contiene cisteína, tal como (SEQ ID NO: 38) FNRGEC o un enlazador tal como el enlazador 2 (que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 34) GGCGGG. Un péptido que contiene cisteína ilustrativo que forma enlaces disulfuro con dicho enlazador 2 comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO: 36) o un dominio bisagra.

La cuarta cadena polipeptídica puede aislarse a partir de anticuerpos naturales. Como alternativa, puede construirse de forma recombinante. Un dominio CL preferido es un dominio Kappa CL de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 210):

RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG

NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK

SFNRGEC

Como alternativa, un dominio CL ilustrativo es un dominio Lambda2 CL de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 211):

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA

GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP

TECS

Como se observará, el dominio CL, u otro dominio que contenga cisteína, de la cuarta cadena polipeptídica comprende restos de cisteína. Dichos restos de cisteína pueden unirse covalentemente a restos de cisteína del dominio CH1 de la tercera cadena polipeptídica para formar de esta manera un complejo covalente de la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de las moléculas de unión de la presente invención entre sí. Por lo tanto, la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí.

De manera adicional, los restos de cisteína del dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica pueden formar enlaces disulfuro con restos de cisteína del dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica. Por lo tanto, la primera y la tercera cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí.

E. Dominios Fc variantes

En la función inmunitaria tradicional, la interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con células del sistema inmunitario da lugar a una amplia selección de respuestas, que varían de las funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, la desgranulación de mastocitos y la fagocitosis hasta señales inmunomoduladoras, tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y la secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o complejos inmunitarios a receptores de superficie de células especializadas en células hematopoyéticas. La diversidad de las respuestas celulares desencadenadas por los anticuerpos y los complejos inmunitarios se debe a la heterogeneidad estructural de los tres receptores de Fc: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) y FcyRIII (CD16) son receptores activadores (es decir, potencian el sistema inmunitario); FcyRIIB (CD32B) es un receptor inhibidor (es decir, atenúa el sistema inmunitario). La secuencia de aminoácidos de un dominio Fc de IgG1 ilustrativo (SEQ ID NO: 1) se ha presentado anteriormente.

La modificación del dominio Fc normalmente conduce a un fenotipo alterado, por ejemplo, una semivida en suero alterada, una estabilidad modificada, una susceptibilidad alterada a las enzimas celulares o una función efectora alterada. Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. La reducción o eliminación de la función efectora es deseable en ciertos casos, por ejemplo en el caso de anticuerpos cuyo mecanismo de acción implica bloqueo o antagonismo, pero sin destruir a las células que portan un antígeno diana. Una función efectora aumentada es deseable en general cuando se dirige a células indeseables, tales como células tumorales y extrañas, donde los FcyR se expresan en niveles bajos, por ejemplo, células B específicas de tumor con niveles bajos de FcyRIIB (por ejemplo, linfoma no Hodgkin, CLL y linfoma de Burkitt). En dichas realizaciones, las moléculas de la invención con actividad de función efectora conferida o modificada son útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, un trastorno o una infección cuando se desea una eficacia mejorada de la actividad de la función efectora.

En ciertas realizaciones, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc que posee una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, deleciones o inserciones) en la secuencia de aminoácidos de un dominio Fc de tipo silvestre (s Eq ID NO: 1), que reducen la afinidad y la avidez del dominio Fc y, por lo tanto, la molécula de la invención, por uno o más receptores FcyR. En otras realizaciones, las moléculas de la invención comprenden un dominio Fc que posee una o más modificaciones de los aminoácidos del dominio Fc de tipo silvestre, que aumentan la afinidad y la avidez del dominio Fc y, por lo tanto, la molécula de la invención, por uno o más receptores FcyR. En otras realizaciones, las moléculas comprenden un dominio Fc variante en donde dicha variante confiere o media una actividad ADCC aumentada y/o una unión aumentada a FcyRIIA, con respecto a una molécula que no comprende ningún dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. En realizaciones alternativas, las moléculas comprenden un dominio Fc variante en donde dicha variante confiere o media una actividad ADCC (u otra función efectora) disminuida y/o una unión aumentada a FcyRIIB, con respecto a una molécula que no comprende ningún dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. En algunas realizaciones, la invención abarca moléculas de unión triespecíficas que comprenden un dominio Fc variante, sin que dicho dominio Fc variante muestre una unión detectable a ningún FcyR, en relación con una molécula comparable que comprende el dominio Fc de tipo silvestre. En otras realizaciones, la invención abarca moléculas de unión triespecíficas que comprenden un dominio Fc variante, en donde dicho dominio Fc variante solo se une a un único FcyR, preferentemente uno de FcyRIIA, FcyRIIB o FcyRIIIA. Cualquiera de dichos aumentos de afinidad y/o avidez se evalúa preferentemente midiendo in vitro el grado de unión detectable a FcyR o la actividad relacionada con FcyR en células que expresan niveles bajos de FcyR cuando la actividad de unión de la molécula parental (sin el dominio Fc modificado) no puede detectarse en las células, o en células que expresan antígenos diana no relacionados con el receptor FcyR a una densidad de 30.000 a 20.000 moléculas/célula, a una densidad de 20.000 a 10.000 moléculas/célula, a una densidad de 10.000 a 5.000 moléculas/célula, a una densidad de 5.000 a 1.000 moléculas/célula, a una densidad de 1.000 a 200 moléculas/célula o a una densidad de 200 moléculas/célula o menos (pero al menos 10, 50, 100 o 150 moléculas/célula).

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden comprender afinidades alteradas por un receptor de Fcy activador y/o inhibidor. En una realización, la molécula de unión triespecífica comprende un dominio Fc variante que tiene mayor afinidad por FcyRIIB y menor afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre. En otra realización, la molécula de unión triespecífica de la presente invención comprende un dominio Fc variante, que tiene una menor afinidad por FcyRIIB y mayor afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre. En otra realización más, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc variante que tiene menor afinidad por FcyRIIB y menor afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre. En otra realización adicional, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc variante, que tiene una afinidad sin cambios por FcyRIIB y una menor (o mayor) afinidad por FcyRIIIA y/o FcyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre.

En ciertas realizaciones, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc variante que tiene una afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIA de manera que la inmunoglobulina tiene una función efectora mejorada, por ejemplo, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos. Los ejemplos no limitantes de funciones de células efectoras incluyen la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis dependiente de anticuerpos, fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión a células, formación de rosetas, unión a C1q y citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento.

En una realización preferida, la alteración en la afinidad o función efectora es de al menos 2 veces, preferentemente al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. En otras realizaciones de la invención, el dominio Fc variante se une inmunoespecíficamente a uno o más FcR con al menos un 65 %, preferentemente al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 225 % o 250 % más de afinidad con respecto a una molécula que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. Tales mediciones pueden ser ensayos in vivo o in vitro y, en una realización preferida, son ensayos in vitro tales como ELISA o ensayos de resonancia de plasmón de superficie.

En diferentes realizaciones, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc variante en donde dicha variante agoniza al menos una actividad de un receptor FcyR, o antagoniza al menos una actividad de un receptor FcyR. En una realización preferida, las moléculas comprenden una variante que antagoniza una o más actividades de FcyRIIB, por ejemplo, la señalización mediada por receptores de células B, la activación de células B, la proliferación de células B, la producción de anticuerpos, el flujo de entrada de calcio intracelular de células B, la progresión del ciclo celular, la inhibición de la señalización de FceRI mediada por FcyRIIB, la fosforilación de FcyRIIB, el reclutamiento de SHIP, la fosforilación de SHIP y la asociación con Shc, o la actividad de una o más moléculas aguas abajo (por ejemplo, MAP quinasa, JNK, p38 o Akt) en la ruta de transducción de señales de FcyRIIB. En otra realización, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden una variante que agoniza una o más actividades de FceRI, por ejemplo, la activación de mastocitos, la movilización del calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina.

En ciertas realizaciones, las moléculas comprenden un dominio Fc que comprende regiones de dos o más isotipos de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Los diversos isotipos de IgG presentan diferentes propiedades físicas y funcionales, incluida la semivida en suero, la fijación al complemento, afinidades de unión a FcyR y actividades de función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC, etc.) debido a diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus dominios bisagra y/o Fc, por ejemplo, tal como se describe en Flesch y Neppert (1999) J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel et al. (1993) J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; o Bruggemann et al. (1987) J. Exp. Med 166:1351-1361. Este tipo de dominio Fc variante puede usarse solo o en combinación con una modificación de aminoácidos, para afectar a la función efectora mediada por Fc y/o la actividad de unión. En combinación, la modificación de aminoácidos y la bisagra de IgG/Dominio Fc pueden mostrar una funcionalidad similar (por ejemplo, mayor afinidad por FcyRIIA) y pueden actuar de forma aditiva o, más preferentemente, de forma sinérgica para modificar la funcionalidad efectora en la molécula de la invención, con respecto a una molécula de la invención que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. En otras realizaciones, la modificación de aminoácidos y el dominio Fc de IgG pueden mostrar una funcionalidad opuesta (por ejemplo, mayor y menor afinidad por FcyRIIA, respectivamente) y pueden actuar para atenuar o reducir selectivamente una funcionalidad específica en la molécula de la invención, con respecto a una molécula de la invención que no comprende un dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre del mismo isotipo.

En una realización específica preferida, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc variante, en donde dicho dominio Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos con respecto a la región Fc de tipo silvestre, de tal forma que dicha molécula tiene una afinidad alterada por un FcR, siempre que dicho dominio Fc variante no tenga una sustitución en posiciones que hagan contacto directo con FcyR basándose en el análisis cristalográfico y estructural de las interacciones Fc-FcR tales como las descritas por Sondermann et al. (2000) Nature 406:267-73. Son ejemplos de posiciones dentro del dominio Fc que hacen contacto directo con FcyR los restos de aminoácidos 234-239 (región bisagra), los restos de aminoácidos 265-269 (bucle B/C), los restos de aminoácidos 297-299 (bucle C'/E) y los restos de aminoácidos 327-332 (bucle F/G). En algunas realizaciones, las moléculas de la invención comprenden dominios Fc variantes. Los dominios comprenden la modificación de al menos un resto que no entra en contacto directo con un FcyR basándose en el análisis estructural y cristalográfico, por ejemplo, no está dentro del sitio de unión de Fc-FcyR.

Los dominios Fc variantes son bien conocidos en la técnica, y cualquier variante de Fc conocida puede usarse en la presente invención para conferir o modificar la función efectora presentada por una molécula de la invención que comprende un dominio Fc (o una porción del mismo) según se ensaya funcionalmente, por ejemplo, en un ensayo dependiente de los linfocitos NK o dependiente de macrófagos. Por ejemplo, se desvelan variantes del dominio Fc identificadas como variantes que alteran la función efectora en la técnica de la tecnología de obtención de anticuerpos por ingeniería genética (Antibody Engineering Technology Art) y cualquier variante adecuada allí desvelada puede usarse en las presentes moléculas.

En ciertas realizaciones, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenden un dominio Fc variante, que tiene una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más sitios, alterando dicha o dichas modificaciones (con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre) la relación de afinidades del dominio Fc variante por un FcyR activador (tal como FcyRIIA o FcyRIIIA) con respecto a un FcyR inhibidor (tal como FcyRIIB):

^{^ j <• - j j _ C a m b í o d e l t i p o s i l v e s t r e a l a v a r i a n t e e n a f i n i d a d p o r F c y R ^ cn v a ^ or}

Relación de afinidades _ C a m b i o d e l t i p o s i l v e s t r e a l a v a r i a n t e e n a f i n i d a d p o r F c y R ¡ n h íb id 0r

Son particularmente preferidas las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención que poseen un dominio Fc variante (con respecto al dominio Fc de tipo silvestre) en donde la variante de Fc tiene una relación de afinidades mayor que 1. Dichas moléculas tienen una utilidad particular para proporcionar un tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, trastorno, o infección, o la mejora de un síntoma de la misma, donde se desea una mayor eficacia de la función de la célula efectora (por ejemplo, ADCC) mediada por FcyR, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa. Por el contrario, una variante de Fc que tiene una relación de afinidades menor que 1 media la disminución de la eficacia de la función de las células efectoras. La tabla 1 presenta una lista de mutaciones individuales, dobles, triples, cuádruples y quíntuples en función de si su relación de afinidades es mayor o menor que 1.

continuación

En una realización específica, en los dominios Fc variantes, cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 o 330 y, preferentemente, en uno o más de los siguientes restos: A240, 1240, L241, L243, H244, N298, 1328 o V330. En una realización específica diferente, en los dominios Fc variantes, cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 y, preferentemente, en uno o más de los siguientes restos: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, I300 o L300.

En una realización preferida, en dominios Fc variantes que se unen a un FcyR con una afinidad alterada, cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Preferentemente, la variante del dominio Fc tiene cualquiera de los siguientes restos: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 o A430.

En una realización distinta, en dominios Fc variantes que se unen a un FcyR (a través de su dominio Fc) con una afinidad reducida, cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439.

En una realización distinta, en los dominios Fc variantes que se unen a un FcyR (a través de su dominio Fc) con una afinidad mejorada, cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 o 430. En una realización distinta, en dominios Fc variantes que se unen a FcyRIIA con una afinidad mejorada, cualquiera de los siguientes restos: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 o A430.

Las variantes preferidas incluyen una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones: 228, 230, 231,232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 o 332.

Las variantes particularmente preferidas incluyen una o más modificaciones seleccionadas de los grupos A-AI:

continuación

Las variantes aún más particularmente preferidas incluyen una o más modificaciones seleccionadas de los Grupos 1 105:

continuación

En una realización, una molécula de unión a DR5 multivalente de la invención comprenderá un dominio Fc variante que tiene al menos una modificación en el dominio Fc. En ciertas realizaciones, el dominio Fc variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L, en donde dicha numeración es la del índice EU de Kabat.

En una realización específica, el dominio Fc variante comprende:

(A) al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L;

(B) al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L y P396L;

(2) F243L y R292P; y

(3) R292P y V305I;

(C) al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P y Y300L;

(2) F243L, R292P y V305I;

(3) F243L, R292P y P396L; y

(4) R292P, V305I y P396L;

(D) al menos cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L y P396L; y

(2) F243L, R292P, V305I y P396L; o

(E) al menos las cinco sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; y

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L.

En otra realización específica, el dominio Fc variante comprende sustituciones de:

(A) F243L, R292P y Y300L;

(B) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L; o

(C) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L.

En otras realizaciones, la invención abarca el uso de cualquier variante de Fc conocida en la técnica, tal como las divulgadas en Jefferis, B.J. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKt 3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; las patentes de Estados Unidos n.° 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; 7.276.586; y 7.317.091; y las publicaciones del PCT WO 00/42072 y PCT WO 99/58572.

En algunas realizaciones, las moléculas de la invención comprenden además uno o más sitios de glicosilación, de modo que uno o más restos de carbohidratos se unen covalentemente a la molécula. Preferentemente, las moléculas de la invención con uno o más sitios de glicosilación y/o una o más modificaciones en el dominio Fc confieren o tienen una función efectora mediada por anticuerpos mejorada, por ejemplo, una actividad de ADCC mejorada, en comparación con un anticuerpo parental. En algunas realizaciones, la invención comprende además moléculas que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos que se sabe directa o indirectamente que interaccionan con un resto de carbohidrato del anticuerpo, incluidos, pero sin limitación, los aminoácidos en las posiciones 241,243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 y 301. En la técnica se conocen aminoácidos que interaccionan directa o indirectamente con un resto de carbohidrato de un anticuerpo, véase, por ejemplo, Jefferis et al., 1995 Immunology Letters, 44: 111-7.

En otra realización, la invención abarca moléculas que se han modificado mediante la introducción de uno o más sitios de glicosilación en uno o más sitios de las moléculas, preferentemente sin alterar la funcionalidad de las moléculas, por ejemplo, la actividad de unión al antígeno diana o FcyR. Se pueden introducir sitios de glicosilación en la región variable y/o constante de las moléculas de la invención. Tal como se usa en el presente documento, "sitios de glicosilación" incluye cualquier secuencia de aminoácidos específica en un anticuerpo a la que se unirá un oligosacárido (es decir, carbohidratos que contienen dos o más azúcares sencillos unidos entre sí) de forma específica y covalente. Las cadenas laterales de oligosacárido típicamente están unidas a la cadena principal de un anticuerpo a través de enlaces N u O. La N-glicosilación se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a la cadena lateral de un resto de asparagina. La O-glicosilación se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a un hidroxiaminoácido, por ejemplo, serina, treonina. Las moléculas de la invención pueden comprender uno o más sitios de glicosilación, incluyendo sitios de N-glicosilación y O-glicosilación. De acuerdo con la presente invención puede utilizarse cualquier sitio de glicosilación para la N-glicosilación o la O-glicosilación conocido en la técnica. Un sitio de N-glicosilación ilustrativo que es útil de acuerdo con los métodos de la presente divulgación es la secuencia de aminoácidos: Asn-X-Thr/Ser, en donde X puede ser cualquier aminoácido y Thr/Ser indica una treonina o una serina. Dicho sitio o sitios pueden introducirse en una molécula de la invención usando métodos bien conocidos en la técnica a la que pertenece la presente invención (véase, por ejemplo, IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, capítulo 8, págs. 106-116. Un método ilustrativo para introducir un sitio de glicosilación en una molécula de la invención puede comprender: modificar o mutar una secuencia de aminoácidos de la molécula de modo que se obtenga la secuencia Asn-X-Thr/Ser deseada.

En algunos casos, la divulgación abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de una molécula de la invención mediante la adición o deleción de un sitio de glicosilación. Los métodos para modificar el contenido de carbohidratos de los anticuerpos (y moléculas que comprenden dominios de anticuerpos) son bien conocidos en la técnica y se incluyen en la divulgación, véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.218.149; el documento EP 0359096 B1; la publicación de Estados Unidos n.° US 2002/0028486; WO 03/035835; la publicación de Estados Unidos n.° 2003/0115614; la patente de Estados Unidos n.° 6.218.149; la patente de los Estados Unidos n.° 6.472.511. En otros casos, la divulgación abarca métodos para modificar el contenido de carbohidratos de una molécula de la invención mediante la deleción de uno o más restos de carbohidratos endógenos de la molécula. En un ejemplo específico, la divulgación abarca el desplazamiento del sitio de glicosilación del dominio Fc de un anticuerpo, mediante la modificación de las posiciones adyacentes a 297. En un ejemplo específico, la divulgación abarca la modificación de la posición 296 de modo que esté glicosilada la posición 296 y no la posición 297.

La función efectora también se puede modificar mediante técnicas tales como la introducción de uno o más restos de cisteína en el dominio Fc, lo cual permite la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región, obteniéndose como resultado la generación de un anticuerpo homodimérico que puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor destrucción de células mediada por el complemento y ADCC (Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies," J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922. Pueden prepararse también anticuerpos homodiméricos con la actividad antitumoral potenciada utilizando agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales tales como los que se describen en Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565. Como alternativa, puede diseñarse mediante ingeniería genética un anticuerpo que tiene dominios Fc duales y puede de este modo potenciarse la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge," Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

III. Moléculas de unión triespecíficas ilustrativas

F. mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5

Se construyó una molécula de unión triespecífica ilustrativa compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. La molécula de unión triespecífica comprende los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33, los dominios Vl y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de DR5 y, en consecuencia, se denominó "mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 212):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS R T P E V T C V V V DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAK T K P RE E

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 212, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 212 es el de la SEQ ID NO: 213:

gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga y a a C C a C a y y tgtacaccct ycccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga

tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es la (SEQ ID NO: 214):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS

WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE

KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

En la SEQ ID NO: 214, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 238-243 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 244-271 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 214 es el de la (SEQ ID NO: 215):

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 216):

EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE

INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA

YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

En la SEQ ID NO: 216, los restos de aminoácidos 1-121 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 8), los restos 122-219 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 220-234 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 235-451 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 216 es el de la (SEQ ID NO: 217):

gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt a _— r _— .r. -C _{_} T _j t. _— C _{_} T _j t _— .CTCT - t cagcgtcctc accgtcctgc a_—n -n -a _—a _{_j} aa _—n -t _—a _{_j} gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt cLcLcL

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAbl de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 218):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV

LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEDGDAATY YCQHSRDLPP

TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

THQGLSSPVT KSFNRGEC

En la SEQ ID NO: 218, los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 3) y los restos 112-218 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 218 es el de la (SEQ ID NO: 219):

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

G. mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de DR5

Se construyó una segunda molécula de unión triespecífica ilustrativa compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. La molécula de unión triespecífica comprende los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 2 de DR5 y, en consecuencia, se denominó "mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de DR5". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 220):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 220, Los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 220 es el de la (SEQ ID NO: 221):

gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc r '-Z i-Z iry \--Z ir '-Z i-Z ir ' UU r ^ ' ^ r '-h l ^q _A ^p-h z rr rr r r+U- U a1 r-] r u a f o tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag ü d y L d U d d C d g u d u g L d c c g i_g L g g L u d g u gLUULUcLUUy n j ( jL g ( ja ( j ( ja ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg

ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de DR5 es (SEQ ID NO: 222):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS

WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE

KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

En la SEQ ID NO: 222, Los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID n O: 186), los restos 238-243 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 244-271 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 222 es el de la (SEQ ID NO: 223):

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de DR5 es (SEQ ID NO: 224):

KVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCKASGYTFT EYILHWVKQK SGQGLEWIGW

FYPGNNNIKY NEKFKDKATL TADKSSSTVY MELSRLTSED SAVYFCARHE

QGPGYFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD

YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY

ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK

DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS

TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV

YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 224, los restos de aminoácidos 1-119 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 18), los restos 120-217 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 08), los restos 218-232 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 233-449 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 224 es el de la (SEQ ID NO: 225):

aaggtccagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggtgaaac ccggggcatc agtgaagctg tcctgcaagg cttctgggta caccttcact gagtatattt tacactgggt aaagcagaag tctggacagg gtcttgagtg gattgggtgg ttttatcctg gaaataataa tataaagtac aatgagaaat tcaaggacaa ggccacactg actgcggaca aatcctccag cacagtctat atggaactta gtagattgac atctgaagac tctgcggtct atttctgtgc aagacacgaa caaggaccag gttactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag

caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de DR5 es (SEQ ID NO: 226):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW

ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG

GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

En la SEQ ID NO: 226, Los restos de aminoácidos 1-107 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL de mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 13) y los restos 108-214 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 226 es el de la (SEQ ID NO: 227):

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca 0 C 00000 C C 0 gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga C J000 C 0 C 000 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt

H. mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5

Se construyó una molécula de unión triespecífica ilustrativa adicional compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. La molécula de unión triespecífica comprende los dominios VL y VH del mAb 1 de EphA2, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de DR5 y, en consecuencia, se denominó "mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es (SEQ ID NO: 228):

DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 228, Los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 153), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 228 es el de la (SEQ ID NO: 229):

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa

ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es la (SEQ ID NO: 230):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY

SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA LKSRLSISKD NSKSQVFLKM

NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 230, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 158), los restos 237-242 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 243-270 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 230 es el de la (SEQ ID NO: 231):

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac agagcctgtc catcacatgc actgtctctg ggttctcatt atccagatat agtgtacact gggttcgcca gcctccagga aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 232):

EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE

INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA

YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

En la SEQ ID NO: 232, los restos de aminoácidos 1-121 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 8), los restos 122-219 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 220-234 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 235-451 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 232 es el de la (SEQ ID NO: 233):

gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga

caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt cLcLcL

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 234):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV

LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEDGDAATY YCQHSRDLPP

TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

THQGLSSPVT KSFNRGEC

En la SEQ ID NO: 234, los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 3) y los restos 112-218 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 234 es el de la (SEQ ID NO: 235):

I. mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5

Se construyó una molécula de unión triespecífica ilustrativa adicional compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. La molécula de unión triespecífica comprende los dominios VL y VH del mAb 2 de EphA2, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de DR5 y, en consecuencia, se denominó "mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 236):

DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK

LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST

YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL

YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG

EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS

VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT

KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA

KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN

NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK

SLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 236, Los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 163), los restos 112-119 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 120-244 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 245-250 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 251-278 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 279-281 son el enlazador GGG, los restos 282-291 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 292-508 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 236 es el de la (SEQ ID NO: 237):

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc ggggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg

tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es la (SEQ ID NO: 238):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY

GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ

INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 238, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 167), los restos 237-242 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 243-270 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 238 es el de la (SEQ ID NO: 239):

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg ggtttacctt cacaaactat ggaatgaact gggtgaagca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac acctatattg gagagccgac atatgctgat gacttcaagg gacggtttgt cttctctttg gaaacctctg ccagcactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaaaaatga ggacatggcc acatatttct gtgcaagaga actgggacca tactactttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 240):

EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE

INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA

YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

En la SEQ ID NO: 240, los restos de aminoácidos 1-121 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 8), los restos 122-219 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 220-234 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 235-451 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 240 es el de la (SEQ ID NO: 241):

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 242):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV

LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEDGDAATY YCQHSRDLPP

TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

THQGLSSPVT KSFNRGEC

En la SEQ ID NO: 242, los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 3) y los restos 112-218 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 242 es el de la (SEQ ID NO: 243):

J. mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5

Se construyó una molécula de unión triespecífica ilustrativa adicional compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas. La molécula de unión triespecífica comprende los dominios VL y VH del mAb 3 de EphA2, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de DR5 y, en consecuencia, se denominó "mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 244):

DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW

ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SPGK

En la SEQ ID NO: 244, los restos de aminoácidos 1-107 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 172), los restos 108-115 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 116-240 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 241-246 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 247-274 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 275-277 son el enlazador GGG, los restos 278-287 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 288-504 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 244 es el de la (SEQ ID NO: 245):

gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca 0.C0.0.0.0.0.CC0. gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag r_•wr_j U r1-]r ^ OL r _'wr _j+ u- ^q u ^p o ^q u ^^rT-hrr-hrrrT-l-r''' ^{l_- ___ ___ l— ___ tw-}1-ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag

ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es la (SEQ ID NO: 246):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH

YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ

MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 246, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 177), los restos 237-242 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 243-270 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 246 es el de la (SEQ ID NO: 247):

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggagaagtg cagctggtgg agtctggggg aggctcagtg aagcctggag ggtccctgaa actctcctgt gcagcctctg gattcacttt cactgaccat tacatgtatt gggttcgcca gactccggaa aagaggctgg agtgggtcgc aaccattagt gatggcggta gtttcacctc ctatccagac agtgtgaagg ggcgattcac catctccaga gacattgcca agaacaacct gtacctccaa atgagcagtc tgaagtctga ggacacagcc atgtattact gtacaagaga tgagagcgat aggccgtttc cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 248):

EVKFLESGGG LVQPGGSLKL SCVASGFDFS RYWMSWVRQA PGKGLEWIGE

INPDSNTINY TPSLKDKFII SRDNAKNTLY LQMTKVRSED TALYYCTRRA

YYGNPAWFAY WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

En la SEQ ID NO: 248, los restos de aminoácidos 1-121 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 8), los restos 122-219 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 220-234 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 235-451 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 248 es el de la (SEQ ID NO: 249):

gaggtgaagt ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc tcctgtgtag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcaatac gataaactat acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtat ctgcaaatga ccaaagtgag atctgaggac acagcccttt attattgtac aagaagggcc tactatggta acccggcctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct tccgcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc

^{-i r r -n -n t r f r r r n -D r ^ r í r r l - r r - / " ’ í-T T -r N -í-T d •zz r >-r}r ’ Q n rm n T T T 'l

gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gagagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgcgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gcccLcecag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgagt tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtcagcaagc tcaccgtgga

caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccgctac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de DR5 es (SEQ ID NO: 250):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV

LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEDGDAATY YCQHSRDLPP

TFGGGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

THQGLSSPVT KSFNRGEC

En la SEQ ID NO: 250, los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 3) y los restos 112-218 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 250 es el de la (SEQ ID NO: 251):

Aunque las moléculas de unión triespecíficas ilustrativas descritas anteriormente comprenden tres CDR de cadena ligera (VL) y tres CDR de cadena pesada (VH) para cada dominio de unión, se reconocerá que la invención también incluye moléculas de unión triespecíficas que poseen:

(1) al menos una de las CDR del dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión;

(2) al menos dos de las CDR del dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión;

(3) las tres CDR del dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión;

(4) al menos una de las CDR del dominio VH de cualquiera de dichos dominios de unión;

(5) al menos dos de las CDR del dominio VH de cualquiera de dichos dominios de unión;

(6) las tres CDR del dominio VH de cualquiera de dichos dominios de unión;

(7) al menos una de las CDR del dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión y al menos una de las CDR del dominio VH de ese dominio de unión;

(8) al menos dos de las CDR del dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión y al menos dos de las CDR del dominio VH de ese dominio de unión;

(9) las tres CDR del dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión y las tres CDR del dominio VH de ese dominio de unión;

(10) el dominio VL de cualquiera de dichos dominios de unión;

(11) el dominio VH de cualquiera de dichos dominios de unión; o

(12) los Dominios VL y VH de cualquiera de dichos dominios de unión.

K. mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de EphA2

Se construyó una molécula de unión triespecífica compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas que comprende los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de EphA2. La molécula de unión triespecífica se denominó, en consecuencia, "mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de EphA2". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 252):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 252, Los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de CD3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 252 es el de la (SEQ ID NO: 253):

gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt

^;'-⁼*■^{i r}'- ^''• ^r3 ^{r h r r r r ^ i r ' r r r r}r 'r r i_ '^Úr rr 'Ú r ^^'Ú r rr 'Ú r i_rr r r r ^ r r r r r r ^ i r r r r ^ i r r cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de EphA2 es la (SEQ ID NO: 254):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS

WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE

KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

En la SEQ ID NO: 254, Los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID n O: 186), los restos 238-243 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 244-271 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 254 es el de la (SEQ ID NO: 255):

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de EphA2 es (SEQ ID NO: 256):

QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVHWVRQP PGKGLEWLGM

IWGGGSTDYN SALKSRLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCARKHG

NYYTMDYWGQ GTSVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 256, los restos de aminoácidos 1-118 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 158), los restos 119-216 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 217-231 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 232-448 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 256 es el de la (SEQ ID NO: 257):

caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcac cctcacagag cctgtccatc acatgcactg tctctgggtt ctcattatcc agatatagtg tacactgggt tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaagcac agactataat tcagctctca aatccagact gagtatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatgtact actgtgccag aaaacatggt aactactata ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de EphA2 es (SEQ ID NO: 258):

DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG

TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD

NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKSFNR GEC

En la SEQ ID NO: 258, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 153) y los restos 107-213 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 258 es el de la (SEQ ID NO: 259):

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg 0.0.0.L0.0.0.0.Cy tacggtggct gcaccatcg ^{J_ _ J _ J _}g L U L L U d L U L L cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt

L. mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de EphA2

Se construyó una molécula de unión triespecífica compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas que comprende los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 2 de EphA2. La molécula de unión triespecífica se denominó, en consecuencia, "mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de EphA2". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 260):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 260, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 260 es el de la (SEQ ID NO: 261):

gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaaggg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de EphA2 es la (SEQ ID NO: 262):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS

WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE

KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

En la SEQ ID NO: 262, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 238-243 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 244-271 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 262 es el de la (SEQ ID NO: 263):

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de EphA2 es (SEQ ID NO: 264):

QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGW

INTYIGEPTY ADDFKGRFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAREL

GPYYFDYWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 264, los restos de aminoácidos 1-118 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 167), los restos 119-216 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 217-231 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 232-448 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 264 es el de la (SEQ ID NO: 265):

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctgggtt taccttcaca aactatggaa tgaactgggt gaagcaggct ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct atattggaga gccgacatat gctgatgact tcaagggacg gtttgtcttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggccacat atttctgtgc aagagaactg ggaccatact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca

■ r r r r r r r r r r p ^ r r r ,rrnT ,r ,r ,1- nTr nT’ -hrrrT'-hnTrlttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 2 de EphA2 es (SEQ ID NO: 266):

DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK

LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

TFGSGTKLEI KRTVAAPSVF IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV

QWKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS STLTLSKADY EKHKVYACEV

THQGLSSPVT KSFNRGEC

En la SEQ ID NO: 266, los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 163) y los restos 112-218 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 266 es el de la (SEQ ID NO: 267):

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaacgtacgg tggctgcacc atcggtcttc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgt

M. mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 3 de EphA2

Se construyó una molécula de unión triespecífica compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas que comprende los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 3 de EphA2. La molécula de unión triespecífica se denominó, en consecuencia, "mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 3 de EphA2". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 268):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 268, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 268 es el de la (SEQ ID NO: 269):

^{r r r r r ' n t n t ^ r r - h r r r r i z i r T r T - l - r T} ^Oi. UUU l ^Oi. Oi. M Oi.^ t_A Oi. Oi. V

cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 3 de EphA2 es la (SEQ ID NO: 270):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS

WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSGGC GGGKVAALKE

KVAALKEKVA ALKEKVAALK E

En la SEQ ID NO: 270, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 238-243 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 244-271 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 270 es el de la (SEQ ID NO: 271):

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag

C a a y C y t y a a ggtctcctgc a a a g C a t C a g ^ j ' ^ L A— . C L > L -I— . C L ' ^ C L > - LI— . L -I— . ta.Ca.ggca.gc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt ggcggtggaa aagtggccgc actgaaggag aaagttgctg ctttgaaaga gaaggtcgcc gcacttaagg aaaaggtcgc agccctgaaa gag

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 3 de EphA2 es (SEQ ID NO: 272):

EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMYWVRQT PEKRLEWVAT

ISDGGSFTSY PDSVKGRFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTRDE

SDRPFPYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 272, los restos de aminoácidos 1-118 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 177), los restos 119-216 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 217-231 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 232-448 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 272 es el de la (SEQ ID NO: 273):

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc tcctgtgcag cctctggatt cactttcact gaccattaca tgtattgggt tcgccagact ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gcggtagttt cacctcctat ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca ttgccaagaa caacctgtac ctccaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtac aagagatgag agcgataggc cgtttcctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctccgcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgag ttgcgcagtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct cgtcagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccgcta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 1 de gpA33 x mAb 2 de CD3 x mAb 3 de EphA2 es (SEQ ID NO: 274):

DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW

ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG

GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

En la SEQ ID NO: 274, los restos de aminoácidos 1-107 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 172) y los restos 108-214 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 274 es el de la (SEQ ID NO: 275):

gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca 0 C 00000 C C 0 gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa acgtacggtg gctgcaccat cggtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga C J000C 0 C 000 gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt

N. mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33

Se construyó una molécula de unión triespecífica alternativa de EphA2/CD3/gpA33. La molécula estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas y comprendía los dominios VL y VH del mAb 1 de EphA2, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de c D3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33. La molécula se denominó "mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 276):

DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GYTLYTFGGG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASG FTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSG GCGGGEVAAL

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

En la SEQ ID NO: 276, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 153), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 240-245 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 274-276 son el enlazador GGG, los restos 277-286 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 287-503 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 276 es el de la (SEQ ID NO: 277):

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagaatcacc atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca gatggaactg ttaaactcct gatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggttatacgc tgtacacgtt cggagggggg accaagctgg aaataaaagg tggaggatcc ggcggcggag gcgaggtgca gctggtggag tctgggggag gcttggtcca gcctggaggg tccctgagac tctcctgtgc agcctctgga ttcaccttca gcacatacgc tatgaattgg gtccgccagg ctccagggaa ggggctggag tgggttggaa ggatcaggtc caagtacaac aattatgcaa cctactatgc cgactctgtg aagggtagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 278):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLKESGPGLV APSQSLSITC TVSGFSLSRY

SVHWVRQPPG KGLEWLGMIW GGGSTDYNSA LKSRLSISKD NSKSQVFLKM

NSLQTDDTAM YYCARKHGNY YTMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 278, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de EphA2 (SEQ ID NO: 158), los restos 237-242 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 243-270 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 278 es el de la (SEQ ID NO: 279):

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtg cagctgaagg agtcaggacc tggcctggtg gcaccctcac a.g’a.g’c c t g ’t c C a t C a C a t y C CLO ^"I L^—. ^/"V^ ^{"I— "I— "I—} ^{/“ V}/—V/—v-I L—-I L— L /— -1I L—- U/—*< C I»-I L—-I L— a t C C a g a t a t agtgtacact gggttcgcca gcctccagga aagggtctgg agtggctggg aatgatatgg ggtggtggaa gcacagacta taattcagct ctcaaatcca gactgagtat cagcaaggac aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatg tactactgtg ccagaaaaca tggtaactac tatactatgg actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctccgg aggatgtggc ggtggaaaag tggccgcact gaaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es (SEQ ID NO: 280):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR

IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY

GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD

YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY

ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK

DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS

TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV

YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 280, los restos de aminoácidos 1-119 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 120-217 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 218-232 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 233-449 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 280 es el de la (SEQ ID NO: 281):

caggtccagc tggtccagag cggggccgaa gtcaaaaaac ccggagcaag cgtgaaggtc tcctgcaaag catcaggcta tacatttaca ggcagctgga tgaactgggt gaggcaggct ccaggacagg gactggagtg gatcgggcgc atctaccctg gagacggcga aactaactat aatggaaagt tcaaagaccg agtgaccatc acagccgata agtctactag taccgcctac atggagctga gctccctgcg gtctgaagat accgccgtct actattgcgc tagaatttac ggaaacaatg tctattttga cgtgtggggg cagggaacaa ctgtgactgt ctcctccgcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gagttgcgca gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaaccg ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica del mAb 1 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es (SEQ ID NO: 282):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD

NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKSFNR GEC

En la SEQ ID NO: 282, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181) y los restos 107-213 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 282 es el de la (SEQ ID NO: 283):

gacattcagc tgactcagtc cccctctttt ctgtccgcat ccgtcggaga tcgagtgact attacttgct ctgctaggtc ctcaatcagc ttcatgtact ggtatcagca gaagcccggc aaagcaccta agctgctgat ctacgacaca agcaacctgg cctccggggt gccatctcgg ttctctggca gtgggtcagg aactgagttt accctgacaa ttagctccct ggaggctgaa gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agcagctatc ctctgacctt cggacagggg actaaactgg aaatcaagcg tacggtggct gcaccatcgg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt

O. mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33

Se construyó una segunda molécula de unión triespecífica alternativa de EphA2/CD3/gpA33. La molécula estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas y comprendía los dominios VL y VH del mAb 2 de EphA2, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33. La molécula se denominó "mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33." La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 284):

DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSSGNTYLHW YLQKPGQSPK

LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

TFGSGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST

YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL

YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSGGCGGG

EVAALEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKGG GDKTHTCPPC PAPEAAGGPS

VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT

KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA

KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLWCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN

NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK

SLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 284, Los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 163), los restos 112-119 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 120-244 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 245-250 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 251-278 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 279-281 son el enlazador GGG, los restos 282-291 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 292-508 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 284 es el de la (SEQ ID NO: 285):

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtagtg gaaacaccta tttacattgg tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac acatgttccc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata aaaggtggag gatccggcgg cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccggaggatg tggcggtgga gaagtggccg cactggagaa agaggttgct gctttggaga aggaggtcgc tgcacttgaa aaggaggtcg cagccctgga gaaaggcggc ggggacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgcggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 286):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQI QLVQSGPELK KPGETVKISC KASGFTFTNY

GMNWVKQAPG KGLKWMGWIN TYIGEPTYAD DFKGRFVFSL ETSASTAYLQ

INNLKNEDMA TYFCARELGP YYFDYWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 286, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de EphA2 (SEQ ID NO: 167), los restos 237-242 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 243-270 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 286 es el de la (SEQ ID NO: 287):

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica del mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 288):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR

IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY

GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD

YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY

ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK

DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS

TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV

YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 288, los restos de aminoácidos 1-119 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 120-217 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 218-232 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 233-449 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 288 es el de la (SEQ ID NO: 289):

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de mAb 2 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 290):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD

NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKSFNR GEC

En la SEQ ID NO: 290, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181) y los restos 107-213 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 290 es el de la (SEQ ID NO: 291):

P. mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33

Se construyó una tercera molécula de unión triespecífica alternativa de EphA2/CD3/gpA33. La molécula estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas y comprendía los dominios VL y VH del mAb 3 de EphA2, los dominios VL y VH del anticuerpo mAb 2 de CD3 y los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33. La molécula se denominó "mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de esta molécula de unión triespecífica es la (SEQ ID NO: 292):

DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITCKASQDVT TAVAWYQQKP GQSPKLLIFW

ASTRHAGVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYCQQ HYSTPYTFGG

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SPGK

En la SEQ ID NO: 292, Los restos de aminoácidos 1-107 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 172), los restos 108-115 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 116-240 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 241-246 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34), los restos 247-274 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39), los restos 275-277 son el enlazador GGG, los restos 278-287 son el enlazador DKTHTCPPCP (Se Q ID NO: 48) y los restos 288-504 son el dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQ ID NO: 52).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 292 es el de la (SEQ ID NO: 293):

gacattgtgc tgacccagtc tcacagatcc atgtccacat cagtaggaga cagggtcaac atcacctgca aggccagtca ggatgtgact actgctgtag cctggtatca 0.C 0.0.0.0.0.C C 0. gggcaatctc ctaaattact gattttctgg gcatccaccc ggcacgctgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tgtgcaggct ggagacctgg cactttatta ctgtcaacaa cattatagca caccgtacac attcggaggg gggaccaagc tggaaataaa aggtggagga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc ggaggatgtg gcggtggaga agtggccgca ctggagaaag aggttgctgc tttggagaag gaggtcgctg cacttgaaaa ggaggtcgca gccctggaga aaggcggcgg ggacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa gccgcggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 294):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLVESGGGSV KPGGSLKLSC AASGFTFTDH

YMYWVRQTPE KRLEWVATIS DGGSFTSYPD SVKGRFTISR DIAKNNLYLQ

MSSLKSEDTA MYYCTRDESD RPFPYWGQGT LVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 294, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 3 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 3 de EphA2 (SEQ ID NO: 177), los restos 237-242 corresponden al enlazador GGCGGG (SEQ ID NO: 34) y los restos 243-270 son un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 294 es el de la (SEQ ID NO: 295):

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica del mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 296):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMNWVRQA PGQGLEWIGR

IYPGDGETNY NGKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARIY

GNNVYFDVWG QGTTVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD

YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY

ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK

DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS

TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV

YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK

En la SEQ ID NO: 296, los restos de aminoácidos 1-119 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 120-217 corresponden a un dominio CH1 modificado (SEQ ID NO: 208), los restos 218-232 corresponden a un enlazador (SEQ ID NO: 209) y los restos 233-449 corresponden al dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (SEQ ID NO: 53).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 296 es el de la (SEQ ID NO: 297):

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de mAb 3 de EphA2 x mAb 2 de CD3 x mAb 1 de gpA33 es la (SEQ ID NO: 298):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGQG

TKLEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD

NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKSFNR GEC

En la SEQ ID NO: 298, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181) y los restos 107-213 corresponden al dominio CL Kappa (SEQ ID NO: 210).

Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 298 es el de la (SEQ ID NO: 299):

IV. Anticuerpos y diacuerpos de referencia

Para ayudar en la caracterización de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, se construyeron los siguientes diacuerpos de referencia.

Q. Diacuerpo de mAb 1 de DR5 x mAb 2 de CD3

Se construyó un diacuerpo biespecífico ilustrativo compuesto por dos cadenas polipeptídicas que tenía los dominios VL y VH del anticuerpo anti-DR5 humano denominado mAb 1 de DR5 y los dominios VL y VH del mAb 2 de CD3. El diacuerpo se denominó "diacuerpo de mAb 1 de DR5 x mAb 2 de CD3". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de este diacuerpo es la (SEQ ID NO: 140):

DIVLTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASKSVS SSGYSYMHWY QQKPGQPPKV

LIFLSSNLDS GVPARFSGSG SGTDFTLN1H PVEDGDAATY YCQHSRDLPP

TFGGGTKLEI KGGGSGGGGE VQLVESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFST

YAMNWVRQAP GKGLEWVGRI RSKYNNYATY YADSVKGRFT ISRDDSKNSL

YLQMNSLKTE DTAVYYCVRH GNFGNSYVSW FAYWGQGTLV TVSSASTKGE

VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK

En la SEQ ID NO: 140, Los restos de aminoácidos 1-111 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 3), los restos 112-119 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 120-244 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de c D3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID n O: 112), los restos 245-249 corresponden al enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 250-277 corresponden a un dominio de espiral E que contiene cisteína (SEQ ID NO: 41). Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 140 es el de la SEQ ID NO: 141:

gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctcgggca gagggccacc atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcctctggct atagttatat gcactggtac caacagaaac caggacagcc acccaaagtc ctcatctttc tttcatccaa cctagattct ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat cctgtggagg atggggatgc tgcaacctat tactgtcagc acagtaggga tcttcctccg acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaaggaggcg gatccggcgg cggaggcgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtccagcctg gagggtccct gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcagcaca tacgctatga attgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt tggaaggatc aggtccaagt acaacaatta tgcaacctac tatgccgact ctgtgaaggg tagattcacc atctcaagag atgattcaaa gaactcactg tatctgcaaa tgaacagcct gaaaaccgag gacacggccg tgtattactg tgtgagacac ggtaacttcg gcaattctta cgtgtcttgg tttgcttatt ggggacaggg gacactggtg actgtgtctt ccgcctccac caagggcgaa gtggccgcat gtgagaaaga ggttgctgct ttggagaagg aggtcgctgc acttgaaaag gaggtcgcag ccctggagaa a

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo de mAb 1 de DR5 x mAb 2 de CD3 es la (SEQ ID NO: 142):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KFLESGGGLV QPGGSLKLSC VASGFDFSRY

WMSWVRQAPG KGLEWIGEIN PDSNTINYTP SLKDKFIISR DNAKNTLYLQ

MTKVRSEDTA LYYCTRRAYY GNPAWFAYWG QGTLVTVSAA STKGKVAACK

EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE

En la SEQ ID NO: 142, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de DR5 (SEQ ID NO: 8), con la excepción de que el resto de serina C-terminal de la SEQ ID NO: 8 se ha reemplazado por un resto de alanina), los restos 240-244 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 245-272 corresponden a un dominio de espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42). Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 142 es el de la SEQ ID NO: 143:

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc gggggtggca caaaactgac tgtgctggga ggtggtggat ccggcggcgg aggcgaggtg aagtttctcg agtctggagg tggcctggtg cagcctggag gatccctgaa actctcctgt gtagcctcag gattcgattt tagtagatac tggatgagtt gggtccggca ggctccaggg aaagggctag aatggattgg agaaattaat ccagatagca atacgataaa ctatacgcca tctctaaagg ataaattcat catctccaga gacaacgcca aaaatacgct gtatctgcaa atgaccaaag tgagatctga ggacacagcc ctttattatt gtacaagaag ggcctactat ggtaacccgg cctggtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgcagcc tccaccaagg gcaaagtggc cgcatgtaag gagaaagttg ctgctttgaa agagaaggtc gccgcactta aggaaaaggt cgcagccctg aaagag

R. Diacuerpo de mAb 2 de DR5 x mAb 2 de CD3

Se construyó un diacuerpo biespecífico ilustrativo compuesto por dos cadenas polipeptídicas que tenía los dominios VL y VH del anticuerpo anti-DR5 humano denominado mAb 2 de DR5 y los dominios VL y VH del mAb 2 de CD3. El diacuerpo se denominó "diacuerpo de mAb 2 de DR5 x mAb 2 de CD3". La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de este diacuerpo es la (SEQ ID NO: 144):

DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW

ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD YTLTIKSVQA EDLTLYYCQQ HYITPWTFGG

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEK

En la SEQ ID NO: 144, los restos de aminoácidos 1-107 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de DR5 (SEQ ID NO: 13), los restos 108-115 corresponden al péptido espaciador intermedio (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 116-240 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de CD3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID NO: 112), los restos 241-245 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral E que contiene cisteína (SEQ ID NO: 41). Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 144 es el de la SEQ ID NO: 145:

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccactt cagtaggaga cagggtcagc atcacctgca aggccagtca ggatgtgaat actgctgtag cctggtatca 0.C0.0.0.0.0.CC0. gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc ggcacactgg agtccctgat cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatacactca ccatcaaaag tgtgcaggct gaagacctga cactttatta ctgtcagcaa cactatatca ctccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaaatcaa aggaggcgga tccggcggcg gaggcgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt ccagcctgga gggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagcacata cgctatgaat tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctg gagtgggttg gaaggatcag gtccaagtac aacaattatg caacctacta tgccgactct gtgaagggta gattcaccat ctcaagagat gattcaaaga actcactgta tctgcaaatg aacagcctga aaaccgagga cacggccgtg tattactgtg tgagacacgg taacttcggc aattcttacg tgtcttggtt tgcttattgg ggacagggga cactggtgac tgtgtcttcc gcctccacca agggcgaagt ggccgcatgt gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaa

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo de mAb 2 de DR5 x mAb 2 de CD3 es la (SEQ ID NO: 146):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGKV QLQQSGAELV KPGASVKLSC KASGYTFTEY

ILHWVKQKSG QGLEWIGWFY PGNNNIKYNE KFKDKATLTA DKSSSTVYME

LSRLTSEDSA VYFCARHEQG PGYFDYWGQG TTLTVSSAST KGKVAACKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 146, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (SEQ ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de d R5 (SEQ ID NO: 18), los restos 238-242 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 243-270 corresponden a un dominio de espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42). Un polinucleótido que codifica la SEQ ID NO: 146 es el de la SEQ ID NO: 147:

caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc

gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggcgg aggcaaggtc cagctgcagc agtctggagc tgaactggtg aaacccgggg catcagtgaa gctgtcctgc aaggcttctg ggtacacctt cactgagtat attttacact gggtaaagca gaagtctgga cagggtcttg agtggattgg gtggttttat cctggaaata ataatataaa gtacaatgag aaattcaagg acaaggccac actgactgcg gacaaatcct ccagcacagt ctatatggaa cttagtagat tgacatctga agactctgcg gtctatttct gtgcaagaca cgaacaagga ccaggttact ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc cgcctccacc aagggcaaag tggccgcatg taaggagaaa gttgctgctt tgaaagagaa ggtcgccgca cttaaggaaa aggtcgcagc cctgaaagag

S. Diacuerpo de mAb 3 de DR5 x mAb 2 de CD3

Se construyó un diacuerpo biespecífico ilustrativo compuesto por dos cadenas polipeptídicas que tenía los dominios VL y VH del anticuerpo anti-DR5 humano denominado mAb 3 de DR5 y los dominios VL y VH del mAb 2 de CD3. La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia (SEQ ID NO: 148) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

S E LT Q D P A V S V A L G Q T V R IT CS G D S LR S Y Y A S WYQQKPGQ A P V L V IY GAN

N R P S G IP D R F SG SSSG NTAS L T IT G A Q A E D EA D YYC N SA D S S G N H W FGG

G T K LT V LG G G GSGGGGEVQL VESG G G LVQ P G G S LR LS C A A S G F T F S TYA M

NWVRQAPGKG LEWVGR IR S K Y N N Y A T Y Y A D SV KG R F T IS R D D S K N S LY LQ

M N S LK T E D T A V Y Y C V R HG NF G NSYVSW FAY W G QGTLVTVS S A S T K G E V A A

C E K E V A A L E K E V A A L E K E V A A L E K

En la SEQ ID NO: 148, los restos de aminoácidos 1-108 corresponden al dominio VL del mAb 3 de DR5 (SEQ ID NO: 54), los restos 109-116 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 117-241 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de CD3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID NO: 112), los restos 242-246 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47)y los restos 247-275 corresponden a un dominio de espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42).

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia (SEQ ID NO: 149) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

Q A V V T Q E P S L T V S P G G T V T L TC R S S T G A V T T S N Y A N WVQQ K P G Q A P R G L I

GG TN KR APWT P A R F S G S LLG G K A A L T IT G A Q AED EADYYC ALW Y SN LW VF

G G G T K LT V LG GGGSGGGGEV QLVQSGGGVE R P G G SLR LSC A A S G F T F D D Y

AM SWVRQAPG KG LEW VSG I N WQGGSTGYAD SV KG R V T IS R D N A K N S LY LQ

M N S LR A E D TA V Y Y C A K IL G A GRGWYFDYWG K G T T V T V S S A S TK G K V A A C K

E K V A A L K E K V A A L K E K V A A L KE

En la SEQ ID NO: 149, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden al dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 119-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 3 de DR5 (SEQ ID NO: 58), los restos 240-244 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 245-272 corresponden a un dominio de espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42).

T. Diacuerpo de mAb 4 de DR5 x mAb 2 de CD3

Se construyó un diacuerpo biespecífico ilustrativo compuesto por dos cadenas polipeptídicas que tenía los dominios VL y VH del anticuerpo anti-DR5 humano denominado mAb 4 de DR5 y los dominios VL y VH del mAb 2 de CD3. La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia (SEQ ID NO: 150) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQGIS RSYLAWYQQK PGQAPSLLIY

GASSRATGIP DRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QFGSSPWTFG

QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSTYAM

NWVRQAPGKG LEWVGRIRSK YNNYATYYAD SVKGRFTISR DDSKNSLYLQ

MNSLKTEDTA VYYCVRHGNF GNSYVSWFAY WGQGTLVTVS SASTKGEVAA

CEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEK

En la SEQ ID NO: 150, los restos de aminoácidos 1-108 corresponden al dominio VL del mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 62), los restos 109-116 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 117-241 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de CD3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID NO: 112), los restos 242-246 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47)y los restos 247-275 corresponden a un dominio de espiral E que contiene cisteína (SEQ ID NO: 41).

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia (SEQ ID NO: 151) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQESGPGLV KPSQTLSLTC TVSGGSISSG

DYFWSWIRQL PGKGLEWIGH 1HNSGTTYYN PSLKSRVTIS VDTSKKQFSL

RLSSVTAADT AVYYCARDRG

GDYYYGMDVW GQGTTVTVSS ASTKGKVAAC

KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE

En la SEQ ID NO: 151, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden al dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 119-240 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 4 de DR5 (SEQ ID NO: 66), los restos 241-245 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 246-273 corresponden a un dominio de espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42).

U. Diacuerpo de referencia gpA33 x mAb 2 de CD3

Para ilustrar adicionalmente las moléculas de unión triespecíficas biespecíficas de la presente divulgación, se construyó un diacuerpo compuesto por dos cadenas polipeptídicas usando los dominios VL y VH del mAb 1 de gpA33 y el mAb 2 de CD3. La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia (SEQ ID NO: 316) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCSARSSIS FMYWYQQKPG KAPKLLIYDT

SNLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYCQQWSSYPLTFGQG

TKLEIKGGGS GGGGEVQLVE SGGGLVQPGG SLRLSCAASGFTFSTYAMNW

VRQAPGKGLE WVGRIRSKYN NYATYYADSV KGRFTISRDD SKNSLYLQMN

SLKTEDTAVY YCVRHGNFGN SYVSWFAYWG QGTLVTVSSA STKGEVAACE

KEVAALEKEV AALEKEVAAL EK

En la SEQ ID NO: 316, los restos de aminoácidos 1-106 corresponden al dominio VL del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 181), los restos 107-114 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 115-239 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 2 de CD3 que tiene la sustitución D65G (SEQ ID NO: 112), los restos 240-244 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47)y los restos 245-272 corresponden a un dominio de espiral E que contiene cisteína (SEQ ID NO: 41).

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia (SEQ ID NO: 317) (los restos de las CDR se muestran subrayados):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTGS

WMNWVRQAPG QGLEWIGRIY PGDGETNYNG KFKDRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARIYGN NVYFDVWGQG TTVTVSSAST KGKVAACKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 317, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden al dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 119-237 corresponden a la secuencia de aminoácidos del dominio VH del mAb 1 de gpA33 (SEQ ID NO: 186), los restos 238-242 corresponden a un enlazador ASTKG (SEQ ID NO: 47) y los restos 243-270 corresponden a un dominio de espiral K que contiene cisteína (SEQ ID NO: 42).

V. Anticuerpo de referencia anti-fluoresceína

El anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 (Gruber, M. et al. (1994) "Efficient Tumor Cell Lysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli," J. Immunol. 152(11):5368-5374; Bedzyk, W.D. et al. (1989) "Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family," J. Biol. Chem. 264(3): 1565-1569) se utilizó en diacuerpos de control. Las secuencias de aminoácidos de los dominios ligero variable y pesado variable del anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 son las siguientes:

Secuencia de aminoácidos del dominio de cadena ligera variable del anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 (SEQ ID NO: 138) (los restos de las CDR están subrayados):

DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK

VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

WTFGGGTKLE IK

Secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable del anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 (SEQ ID NO: 139) (los restos de las CDR están subrayados):

EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWMNWVRQS PEKGLEWVAQ

IRNKPYNYET YYSDSVKGRF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG

SYYGMDYWGQ GTSVTVSS

V. Métodos de producción

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden crear a partir de polinucleótidos y/o secuencias de anticuerpos que son inmunoespecíficos para DR5, un antígeno de cáncer deseado, y una célula efectora deseada mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por síntesis o de forma recombinante. Un método para producir estos péptidos agonistas, antagonistas y moduladores implica la síntesis química del polipéptido, seguida de un tratamiento en condiciones oxidantes adecuadas para obtener la conformación nativa, es decir, los enlaces correctos de puentes disulfuro. Esto se puede lograr utilizando metodologías bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Kelley, R. F. et al. (1990) En: GENETIC ENGINEERING PRINCIPLES AND METHODS, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pág. 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; véanse también las patentes de Estados Unidos n.° 4.105.603; 3.972.859; 3.842.067; y 3.862.925).

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar convenientemente usando síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

En otra alternativa más, pueden obtenerse anticuerpos adecuados que tienen una o más de las CDR de un anticuerpo anti-DR5 deseado, un anticuerpo anti-antígeno de cáncer o un anticuerpo anti-célula efectora mediante el uso de ratones disponibles comercialmente que han sido diseñados por ingeniería genética para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. También pueden utilizarse animales transgénicos que están diseñados para producir una respuesta inmunitaria más deseable (por ejemplo, anticuerpos completamente humanos) o más robusta para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Son ejemplos de dicha tecnología XENOMOUSE™ (Abgenix, Inc., Fremont, CA) y HUMAB-MOUSE® y TC MOUSE ™ (ambos de Medarex, Inc., Princeton, NJ).

En una alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de forma recombinante y expresarse usando cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante aislando primero los anticuerpos producidos en animales hospedadores, obteniendo la secuencia génica y usando la secuencia génica para expresar el anticuerpo de manera recombinante en células hospedadoras (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpos en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han desvelado métodos adecuados para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche (véase, por ejemplo, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; y Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157). En la técnica se conocen métodos adecuados para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, monocatenarios, etc. En otra alternativa, los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; 6.265.150; y Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12,433-455).

Los anticuerpos o la proteína de interés pueden someterse a secuenciación mediante degradación de Edman, que es bien conocida para los expertos en la materia. La información de péptidos generada por espectrometría de masas o degradación de Edman se puede usar para diseñar sondas o cebadores que se usan para clonar la proteína de interés.

Un método alternativo de clonación de la proteína de interés es mediante "panning" (un método específico de selección de anticuerpos mediante la inmovilización del antígeno en una superficie) usando DR5 purificado y/o un antígeno de cáncer deseado, y/o una molécula expresada en la superficie de una célula efectora deseada (o porciones de cualquiera de dichas moléculas), para que las células que expresan un anticuerpo o proteína de interés que posee una o más CDR sean capaces de unirse a DR5, o a dicho antígeno de cáncer o célula efectora deseada. El procedimiento de "panning' se puede realizar obteniendo una biblioteca de ADNc a partir de tejidos o células que expresan DR5, sobreexpresando los ADNc en un segundo tipo de célula y seleccionando las células transfectadas del segundo tipo de célula para una unión específica a DR5 en presencia o ausencia de un anticuerpo conocido que sea capaz de unirse a dicha molécula (por ejemplo, mAb 1 de DR5 o mAb 2 de DR5 en el caso de "panning ' de nuevos anticuerpos anti-DR5, etc.). En la técnica se pueden encontrar descripciones detalladas de los métodos utilizados en la clonación de genes de mamíferos que codifican proteínas de la superficie celular mediante "panning ' (véase, por ejemplo, Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cdNa By A High-Efficiency Co S Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 84:8573-8577 y Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854).

Pueden introducirse vectores que contienen polinucleótidos de interés en la célula hospedadora por cualquiera de varios medios apropiados, incluida la electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula hospedadora.

Cualquier célula hospedadora capaz de sobreexpresar ADN heterólogos se puede utilizar con el fin de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células COS, HeLa y CHO. Preferentemente, las células hospedadoras expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferentemente 10 veces mayor, incluso más preferentemente 20 veces mayor que el del correspondiente anticuerpo o proteína endógena de interés, si está presente, en las células hospedadoras. La selección de las células hospedadoras en busca de una unión específica a DR5 se realiza mediante un inmunoensayo o FACS. Puede identificarse una célula que sobreexpresa el anticuerpo o la proteína de interés.

La divulgación incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de esta invención. Los polipéptidos de esta invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse mediante degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos únicos o de fusión) como se describe anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se fabrican convenientemente mediante síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, podría producirse un polipéptido anti-DR5 mediante un sintetizador de polipéptidos automatizado empleando el método de fase sólida.

La divulgación incluye modificaciones de dichos anticuerpos (o de cualquiera de sus fragmentos polipeptídicos que se unen a DR5, el antígeno de cáncer o la célula efectora, según sea el caso) y los agonistas, antagonistas y moduladores de tales moléculas, incluyendo anticuerpos funcionalmente equivalentes y polipéptidos de fusión que no afectan significativamente a las propiedades de tales moléculas así como variantes que tienen actividad mejorada o disminuida. La modificación de polipéptidos es una práctica rutinaria en la técnica y no es necesario describirla en detalle en el presente documento. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional o el uso de análogos químicos. Los restos de aminoácidos que se pueden sustituir de forma conservativa entre sí incluyen, pero sin limitación: glicina/alanina; serina/treonina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos serían conservativas, es decir, el aminoácido sustituido poseería propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Tales sustituciones conservativas son conocidas en la técnica y se han proporcionado ejemplos anteriormente. Las modificaciones de aminoácidos pueden variar desde el cambio o la modificación de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como la región variable. Los cambios en la región variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión. Otros métodos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, entre las que se incluyen, pero sin limitación, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Se pueden utilizar modificaciones, por ejemplo, para la fijación de marcadores para inmunoensayo, tales como la unión de restos radiactivos para radioinmunoensayo. Los polipéptidos modificados se preparan usando procedimientos establecidos en la técnica y se pueden seleccionar usando ensayos estándar conocidos en la técnica.

La invención abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más de los polipéptidos de esta invención. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende una cadena ligera, una cadena pesada o tanto una cadena ligera como una pesada. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado públicamente. Para los fines de la presente invención, una proteína de fusión de anticuerpos contiene uno o más dominios polipeptídicos que se unen específicamente a DR5, a un antígeno de cáncer o a una célula efectora (según sea el caso) y otra secuencia de aminoácidos a la que no se une en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región.

VI. Usos de las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación proporcionan una terapia general para el cáncer. Los cánceres que se pueden tratar por tales moléculas incluyen cánceres caracterizados por la presencia de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en una célula de: un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomisarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico y un cáncer de útero. Las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación se pueden usar en el tratamiento del cáncer colorrectal, carcinoma hepatocelular, glioma, cáncer de riñón, cáncer de mama, mieloma múltiple, cáncer de vejiga, neuroblastoma; sarcoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y cáncer rectal.

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación mejoran la terapia contra el cáncer proporcionada por un anticuerpo dirigido a un antígeno de cáncer que es característico de las células de un tumor diana al ser además capaces de unirse a moléculas de DR5 dispuestas en la superficie de tales células tumorales. La utilidad de la divulgación se ve particularmente en circunstancias en las que la densidad del antígeno de cáncer es baja, o cuando la cinética de unión del anticuerpo anti-antígeno de cáncer es subóptima (o insuficiente) para promover una respuesta terapéutica clínicamente suficiente. En tales casos, la capacidad de las moléculas de la presente divulgación para unirse tanto al antígeno de cáncer como al DR5 de las células tumorales proporciona una unión mejorada (a través de la avidez) que es suficiente para promover una respuesta terapéutica clínicamente suficiente. De manera adicional, al poseer también un dominio de unión capaz de unirse a una molécula en la superficie de una célula efectora del sistema inmunitario, las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación permiten la colocalización de dichas células del sistema inmunitario en las células tumorales, promoviendo de ese modo una respuesta citotóxica contra las células tumorales mediante la destrucción redirigida.

Como se muestra en la Tabla 2, las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación que poseen combinaciones particulares de dominios de unión al antígeno de cáncer tienen una utilidad preferida en el tratamiento de cánceres específicos.

Además de su utilidad en terapia, las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación pueden marcarse de forma detectable y utilizarse en el diagnóstico de cánceres o en la formación de imágenes de tumores y células tumorales.

VII. Composiciones farmacéuticas

Las composiciones de la invención incluyen composiciones de fármaco a granel útiles para la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que sean apropiadas para la administración a un sujeto o paciente) que puedan usarse en la preparación de formas farmacéuticas unitarias. Dichas composiciones comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, o una combinación de tales agentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención abarca particularmente aquellas composiciones farmacéuticas en las que la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión a DR5 de:

(1) un anticuerpo mAb 1 de DR5;

(2) un anticuerpo mAb 2 de DR5;

(3) un anticuerpo mAb 3 de DR5;

(4) un anticuerpo mAb 4 de DR5;

(5) un anticuerpo mAb 5 de DR5;

(6) un anticuerpo mAb 6 de DR5;

(7) un anticuerpo mAb 7 de DR5; o

(8) un anticuerpo mAb 8 de DR5

(o un derivado humanizado de cualquiera de dichos anticuerpos).

La invención abarca además, en particular, aquellas composiciones farmacéuticas en las que la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión al antígeno de cáncer que:

(A) se une a un epítopo de EphA2, especialmente en donde la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión al antígeno de cáncer de mAb 1 de EphA2, mAb 2 de EphA2 o mAb 3 de EphA2, o una variante humanizada o quimérica de los mismos; o

(B) se une a un epítopo de gpA33, especialmente en donde la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión al antígeno de cáncer de mAb 1 de gpA33, o una variante humanizada o quimérica del mismo; o

(C) se une a un epítopo de Her2, especialmente en donde la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión al antígeno de cáncer de mAb 1 de Her2 o trastuzumab, o una variante humanizada o quimérica del mismo; o

(D) se une a un epítopo de B7-H3, especialmente en donde la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión al antígeno de cáncer de mAb 1 de B7-H3, MAb 2 de B7-H3 o mAb 3 de B7-H3, o una variante humanizada o quimérica de los mismos.

La invención abarca además, en particular, aquellas composiciones farmacéuticas en las que la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión a células efectoras que se une a CD2, CD3, CD17, CD20, CD22, CD32B, CD64, BCR/CD79, al receptor de células T o al receptor NKG2d . La invención abarca además, en particular, aquellas composiciones farmacéuticas en las que la molécula de unión triespecífica tiene un dominio de unión a células efectoras del anticuerpo: Lo-CD2a, mAb 2 de CD3, OKT3, 3G8, A9, HD37, rituximab, epratuzumab, mAb 1 de CD32B, mAb 1 de CD64, mAb 1 de CD79, BMA 031, KYK-1.0 o KYK-2.0.

La invención contempla específicamente moléculas de unión triespecíficas, composiciones farmacéuticas que comprenden dicha molécula de unión y usos de dichas moléculas de unión triespecíficas, en donde:

(1) el dominio de unión a DR5 es un dominio de unión a DR5 de cualquier anticuerpo anti-DR5;

(2) el dominio de unión al cáncer es cualquiera de los antígenos de cáncer desvelados en el presente documento; y

(3) los dominios de unión a células efectoras se unen a cualquiera de CD2, CD3, CD17, CD20, CD22, CD32B, c D64, BCR/CD79, al receptor de células T o al receptor NKG2D.

La invención contempla además específicamente moléculas de unión triespecíficas, composiciones farmacéuticas que comprenden dicha molécula de unión y usos de dichas moléculas de unión triespecíficas, en donde:

(2) el dominio de unión al cáncer es cualquiera de los siguientes: EphAl, gpA33, Her2 o B7-H3; y

La invención contempla particularmente cada una de las moléculas de unión triespecíficas, así como composiciones farmacéuticas que comprenden dicha molécula de unión y usos de dichas moléculas de unión triespecíficas, en donde:

(1) el dominio de unión a DR5 es un dominio de unión a DR5 de cualquiera de: un anticuerpo mAb 1 de DR5, un anticuerpo mAb 2 de DR5, un anticuerpo mAb 3 de DR5, un anticuerpo mAb 4 de DR5, un anticuerpo mAb 5 de DR5, un anticuerpo mAb 6 de DR5, un anticuerpo mAb 7 de DR5 o un anticuerpo mAb 8 de DR5;

(2) el dominio de unión al antígeno de cáncer es un dominio de unión de cualquiera de: mAb 1 de EphA2, mAb 2 de EphA2, mAb 3 de EphA2, mAb 1 de gpA33, mAb 1 de Her2, trastuzumab, mAb 1 de B7-H3, MAb 2 de B7-H3 o mAb 3 de B7-H3;

y

(3) el dominio de unión a células efectoras es un dominio de unión de cualquiera de: Lo-CD2a, mAb 2 de CD3, o Kt 3, 3G8, A9, HD37, rituximab, epratuzumab, mAb 1 de CD32B, mAb 1 de CD64, mAb 1 de CD79, BMA 031, KYK-1.0 o KYK-2.0.

Como 8 anticuerpos de dominio de unión anti-DR5, se enumeran 9 anticuerpos contra el dominio de unión a un antígeno de cáncer y 14 anticuerpos contra el dominio de unión a células efectoras, abarcando tal contemplación específica todas (8 x 9 x 14 =) 1.008 combinaciones de dichos dominios de unión.

La invención también abarca las composiciones farmacéuticas que incluyen adicionalmente un segundo anticuerpo terapéutico (por ejemplo, anticuerpo monoclonal específico de tumor) que es específico para un antígeno de cáncer particular y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que se ha aprobado por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante (por ejemplo, adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o portador con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los procedentes del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

Las composiciones de la invención pueden formularse en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, las formadas con aniones tales como los derivados del ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

La presente divulgación también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos de una molécula de unión triespecífica de la presente divulgación (y, más preferentemente, cualquiera de las moléculas de unión específicas analizadas o ejemplificadas anteriormente). De manera adicional, también se puede incluir uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad en el paquete o kit farmacéutico. La presente divulgación también proporciona un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la divulgación. Opcionalmente asociado a dicho envase o envases puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, reflejando dicho aviso la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.

La presente divulgación proporciona kits que se pueden usar en los métodos anteriores. Un kit puede comprender cualquiera de las moléculas de unión triespecíficas de la presente divulgación. El kit puede comprender además uno o más agentes profilácticos o terapéuticos diferentes útiles para el tratamiento del cáncer, en uno o más recipientes; y/o el kit puede comprender además uno o más anticuerpos citotóxicos que se unen a uno o más antígenos de cáncer asociados con el cáncer. En ciertos casos de la presente divulgación, el otro agente profiláctico o terapéutico puede ser un agente qumioterapéutico. En otros casos de la presente divulgación, el agente profiláctico o terapéutico es un agente terapéutico biológico u hormonal.

VIII. Métodos de administración

Las composiciones de la presente invención pueden proporcionarse para su uso en el tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección mediante la administración a un sujeto de una cantidad eficaz de una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención, o una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión o una molécula conjugada de la invención. En un aspecto preferido, dichas composiciones están esencialmente purificadas (es decir, esencialmente libres de sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios no deseados). En una realización específica, el sujeto es un animal, preferentemente un mamífero tal como un animal no primate (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor, etc.) o un primate (por ejemplo, mono, tal como un mono cinomolgo, ser humano, etc.). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano.

Se conocen diversos sistemas de liberación y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System, " J. Biol. Chem. 262:44294432), la construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico u otro, etc.

Los métodos para administrar una molécula de la invención incluyen, pero sin limitación, administración parental (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, las vías intranasal y oral). En un ejemplo específico, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, se puede emplear también la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.019.968; 5.985.320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y las publicaciones del PCT n.° WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903.

La divulgación también dispone que las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se envasan en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de la molécula. En un ejemplo, estas moléculas se suministran en forma de polvo liofilizado esterilizado en seco o concentrado libre de agua en un recipiente cerrado herméticamente, y pueden reconstituirse, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferentemente, las moléculas de unión triespecífica de la presente invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado a una dosis unitaria de al menos 5 |jg, más preferentemente al menos 10 |jg, al menos 15 |jg, al menos 25 |jg, al menos 50 jig, al menos 100 jig o al menos 200 jig.

Las moléculas de unión triespecíficas liofilizadas de la presente divulgación deben almacenarse entre 2 y 8 ° C en su recipiente original y las moléculas deben administrarse en el transcurso de 12 horas, preferentemente en el transcurso de 6 horas, en el transcurso de 5 horas, en el transcurso de 3 horas o en el transcurso de 1 hora tras su reconstitución. En un caso alternativo, dichas moléculas se suministran en forma líquida en un envase cerrado herméticamente que indique la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. Preferentemente, dichas moléculas de unión triespecíficas, cuando se proporcionan en forma líquida, se suministran en un recipiente herméticamente cerrado en el que las moléculas están presentes en una concentración de al menos 1 jig/ml, más preferentemente al menos 2,5 jig/ml, al menos 5 jig/ml, al menos 10 jig/ml, al menos 50 jig/ml o al menos 100 jig/ml.

La cantidad de la composición de la invención que será eficaz para su uso en el tratamiento, la prevención o la mejoría de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. La dosis exacta que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelos in vitro o animales.

Para los diacuerpos monovalentes de las moléculas de unión triespecíficas abarcadas por la invención, la dosis administrada a un paciente se determina preferentemente basándose en el peso corporal (kg) del sujeto receptor. La dosis administrada es típicamente de al menos aproximadamente 0,3 ng/kg por día a aproximadamente 0,9 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 1 ng/kg por día a aproximadamente 3 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 3 ng/kg por día a aproximadamente 9 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 10 ng/kg por día a aproximadamente 30 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 30 ng/kg por día a aproximadamente 90 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 100 ng/kg por día a aproximadamente 300 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 200 ng/kg por día a aproximadamente 600 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 300 ng/kg por día a aproximadamente 900 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 400 ng/kg por día a aproximadamente 800 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 500 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 600 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 700 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 800 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, de al menos aproximadamente 900 ng/kg por día a aproximadamente 1000 ng/kg por día, o al menos aproximadamente 1000 ng/kg por día.

En otro caso, al paciente se le administra un régimen de tratamiento que comprende una o más dosis de tal cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una molécula de unión triespecífica de la presente invención, en donde el régimen de tratamiento se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días. En ciertos casos, el régimen de tratamiento comprende la administración intermitente de dosis de la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención (por ejemplo, se administra una dosis el día 1, el día 2, el día 3 y el día 4 de una semana dada y no se administran dosis de la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de la molécula de unión triespecífica

Se prevé especialmente la administración de moléculas de unión triespecíficas que comprenden cualquiera de las combinaciones específicas de dominios de unión a DR5, dominios de unión a antígenos de cáncer y dominios de unión a células efectoras analizados anteriormente, el día 5, el día 6 y día 7 de la misma semana). Normalmente, hay 1, 2, 3, 4, 5 o más ciclos de tratamiento. Cada ciclo puede ser el mismo régimen o un régimen diferente.

En otro caso, la dosis administrada se aumenta durante el primer trimestre, la primera mitad o los primeros dos tercios o tres cuartos del régimen o de los regímenes (por ejemplo, durante el primer, segundo o tercer regímenes de un tratamiento de 4 ciclos) hasta que se logre la cantidad diaria profiláctica o terapéuticamente eficaz de la molécula de unión triespecífica. La Tabla 3 proporciona 5 ejemplos de diferentes regímenes de dosificación descritos anteriormente para un ciclo de tratamiento típico.

La dosis y frecuencia de administración de una molécula de unión triespecífica de la invención se pueden disminuir o modificar potenciando la captación y penetración de la molécula en el tejido mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.

La dosis de una molécula de unión triespecífica de la invención administrada a un paciente puede calcularse para su uso como terapia con un solo agente. Como alternativa, la molécula puede utilizarse en combinación con otras composiciones terapéuticas y las dosis administradas a un paciente son menores que cuando se usan dichas moléculas como terapia con un solo agente.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar localmente en el área que necesita tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local, mediante inyección o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Preferentemente, cuando se administra una molécula de la invención, debe prestarse atención en usar materiales a los que no se absorba la molécula.

Las composiciones de la invención se pueden liberar en una vesícula, en particular, un liposoma (véase, Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., en LIPOSOMES IN THE THERAPY OF INFECTIOUS DISEASE AND CANCER, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327).

Las composiciones de la invención se pueden administrar en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan una o más moléculas de unión triespecíficas de la invención. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.526.938; la publicación del PCT WO 91/05548; la publicación del p Ct WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. En una realización, se puede usar una bomba en un sistema de liberación controlada (véase Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; y Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos para obtener la liberación controlada de las moléculas (véase, por ejemplo, MEDICAL APPLICATIONS o F CONTROLLED RELEASE, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol.

25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J.

Neurosurg. 7(1):105-112); la patente de Estados Unidos n.° 5.679.377; la patente de Estados Unidos n.° 5.916.597; la patente de Estados Unidos n.° 5.912.015; la patente de Estados Unidos n.° 5.989.463; la patente de Estados Unidos n.° 5.128.326; publicación del PCT n.° WO 99/15154; y la publicación del PCT n.° WO 99/20253). Los ejemplos de polímeros que se utilizan en las formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero sin limitación, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGa ) y poliortoésteres. Se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana terapéutica (por ejemplo, los pulmones), siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en MEDICAL APPLICATIONS o F CONTROLLED RELEASE, supra, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). Las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada pueden usarse de acuerdo con Dunn et al. (véase el documento U.S. 5.945.155). Este método en concreto se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo a partir del sistema polimérico. La implantación puede producirse, en general, en cualquier parte del organismo del paciente que necesite el tratamiento terapéutico. Se puede utilizar un sistema de liberación sostenida no polimérico, con lo que, como sistema de liberación del fármaco, se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto. Tras la implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, dispersará o lixiviará de la composición hacia el fluido del tejido circundante y el material no polimérico coagulará o precipitará poco a poco, formando una matriz sólida, microporosa (véase el documento US 5.888.533).

Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.526.938; las publicaciones internacionales del PCT n.° WO 91/05548 y W o 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.

Cuando la composición de la invención es un ácido nucleico que codifica una molécula de unión triespecífica de la presente invención, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su molécula de unión triespecífica codificada construyéndola como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándola para que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la patente de Estados Unidos n.° 4.980.286) o mediante inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont) o mediante el recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección o mediante la administración en asociación con un péptido de tipo homeocaja que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:1864-1868), etc. Como alternativa, se puede introducir un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para su expresión por recombinación homóloga.

El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una molécula de unión triespecífica de la invención puede incluir un solo tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con dicho diacuerpo una vez por semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, preferentemente entre 2 y 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. Como alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosis eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el ciclo del tratamiento específico.

Ejemplos:

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no tienen por objeto ser limitantes de la presente invención a menos que se especifique.

W. Ejemplo 1: Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-DR5 humano mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR5

Se aislaron dos anticuerpos monoclonales como anticuerpos capaces de unirse inmunoespecíficamente a DR5 humano, y recibieron las denominaciones "mAb 1 de DR5" y "mAb 2 de DR5". Como se ha analizado anteriormente, se observó que las CDR de estos anticuerpos eran diferentes. Para determinar si los anticuerpos se unían a diferentes epítopos de DR5, se preparó una proteína de fusión DR5-Fc humana y se utilizó para recubrir una superficie inmovilizada. El mAb 1 de DR5 (1 jg/m l) se biotiniló y se incubó con una IgG de control o con mAb 2 de DR5 (10 |jg/ml), y se evaluó la capacidad del anticuerpo IgG o mAb 2 de DR5 para competir por la unión (a la proteína de fusión DR5-Fc humana) con mAb 1 de DR5 midiendo la cantidad de anticuerpo biotinilado inmovilizado. De manera adicional, se evaluó la capacidad del anticuerpo IgG o mAb 1 de DR5 para competir por la unión con mAb 2 de DR5 biotinilado. Los resultados de ese experimento se muestran en la Tabla 4.

Los resultados de este experimento indican que el anticuerpo biotinilado era capaz de unirse a la proteína DR5 incluso en presencia de cantidades en exceso del anticuerpo no biotinilado. Por lo tanto, los resultados muestran que el mAb 1 de DR5 y el mAb 2 de DR5 se unen a diferentes epítopos de DR5.

Para caracterizar aún más los anticuerpos mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR, se evaluó su capacidad para bloquear la unión entre DR5 y el ligando TRAIL. Por lo tanto, el mAb 1 de DR5 biotinilado, el mAb 2 de DR5 biotinilado o la fusión DR5-Fc biotinilada (cada uno a 2 pg/ml) se incubaron por separado con la fusión DR5-Fc inmovilizada (1 pg/ml) en presencia de tampón o TRAIL marcado con histidina (20 pg/ml). Se evaluó la cantidad de anticuerpo biotinilado inmovilizado. Los resultados de ese experimento se muestran en la Tabla 5.

Los resultados muestran que la cantidad de mAb 1 de DR5 o mAb 2 de DR5 unido a DR5-Fc inmovilizado no se vio afectada por la presencia de TRAIL marcado con histidina, lo que indica que ni el mAb 1 de DR5 ni el mAb 2 de DR5 bloquean el sitio de unión del ligando TRAIL de DR5. De manera adicional, ninguno de los anticuerpos fue capaz de unirse al ligando TRAIL marcado con histidina.

X. Ejemplo 2: Especificidad de especie de anticuerpos monoclonales anti-DR5 humanos mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR5

Para evaluar la especificidad de especie de los anticuerpos monoclonales anti-DR5 humano mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR5, se comparó la capacidad de los anticuerpos para unirse al DR5 humano con su capacidad para unirse a DR5 de mono cinomolgo (Macaca fascicularis). Los resultados de ese experimento se muestran en la Figura 6. Los resultados muestran que ambos anticuerpos son capaces de unirse a DR5 de mono cinomolgo, pero cada uno de ellos presenta una mayor afinidad de unión por DR5 humano.

La cinética de unión se investigó mediante el análisis Biacore, como se muestra en la Figura 7. Se incubaron diacuerpos DR5 x CD3 biespecíficos con DR5 marcado con His y se determinó la cinética de unión mediante un análisis Biacore. Los diacuerpos empleados fueron mAb 1 de DR5 x mAb 2 de CD3 (Figura 7, Paneles A y E), MAb 2 de DR5 x mAb 2 de CD3 (Figura 7, Paneles B y F), MAb 3 de DR5 x mAb 2 de CD3 (Figura 7, Paneles C y G) y mAb 4 de DR5 x mAb 2 de CD3 (Figura 7, Paneles D y H). La Figura 7, Paneles A-D muestra los resultados para DR5 humano. La Figura 7, Paneles E-H muestra los resultados para DR5 de mono cinomolgo. Los valores calculados de ka, kd y KD se presentan en la Tabla 6.

continuación

Los resultados demuestran que el mAb 1 de DR5 y el mAb 2 de DR5 presentan cinéticas de unión alteradas con respecto a los anticuerpos de referencia mAb 3 de DR5 y mAb 4 de DR5.

Y. Ejemplo 3: Superioridad inesperada de mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR5

La capacidad de las moléculas de unión a DR5 mAb 1 de DR5 y mAb 2 de DR5 de la presente invención para mediar la citotoxicidad se comparó con la de los anticuerpos anti-DR5 de referencia: mAb 3 de DR5 y mAb 4 de DR5. Para hacer tal comparación, se preparó un diacuerpo DR5 x CD3 biespecífico que contenía los dominios VL y VH de estos anticuerpos y los dominios VL y VH del mAb 2 de CD3. Los diacuerpos preparados fueron: mAb 1 de d R5 x mAb 2 de CD3; mAb 2 de DR5 x mAb 2 de CD3; mAb 3 de DR5 x mAb 2 de Cd 3; y mAb 4 de DR5 x mAb 2 de CD3.

El diacuerpo de control empleado contenía los dominios VL y VH del anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 (respectivamente, SEQ ID NO: 138 y 139) y los dominios VL y VH del mAb 2 de CD3 (respectivamente, SEQ ID NO: 102 y 108) y se le denominó diacuerpo de control anti-fluoresceína x anti-CD3 "4-4-20 x mAb 2 de CD3". El diacuerpo estaba compuesto por dos cadenas polipeptídicas. La primera cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia de aminoácidos (s Eq ID NO: 300) (las CDR se muestran subrayadas):

DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISCRSSQSLV HSNGNTYLRW YLQKPGQSPK

VLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFCSQSTHVP

WTFGGGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFN

TYAMNWVRQA PGKGLEWVAR IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS

LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG

GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK

En la SEQ ID NO: 300, los restos de aminoácidos 1-112 corresponden al dominio VL del anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 (SEQ ID NO: 138), los restos 113-120 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 121-245 corresponden al dominio VH del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 108), los restos 246-251 son un péptido espaciador que contiene cisteína (GGCGGG) (SEQ ID NO: 34) y los restos 252-280 corresponden a un dominio de espiral E (SEQ ID NO: 39).

La segunda cadena polipeptídica del diacuerpo tenía la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 301) (las CDR se muestran subrayadas):

QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV KLDETGGGLV QPGRPMKLSC VASGFTFSDY

WMNWVRQSPE KGLEWVAQIR NKPYNYETYY SDSVKGRFTI SRDDSKSSVY

LQMNNLRVED MGIYYCTGSY YGMDYWGQGT SVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

En la SEQ ID NO: 301, los restos de aminoácidos 1-110 corresponden al dominio VL del mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 104), los restos 111-118 corresponden al péptido espaciador intermedio GGGSGGGG (enlazador 1) (Se Q ID NO: 33), los restos 119-236 corresponden al dominio VH del anticuerpo anti-fluoresceína 4-4-20 (SEQ ID NO: 139), los restos 237-242 son un péptido espaciador que contiene cisteína (GGCGGG) (SEQ ID n O: 34) y los restos 243-270 corresponden a un dominio de espiral K (SEQ ID NO: 40).

Las células tumorales diana se incubaron con uno de estos diacuerpos o con el diacuerpo de control (4-4-20 x mAb 2 de CD3) en presencia de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células epiteliales basales alveolares

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes, que comprende:

(I) cuatro cadenas polipeptídicas diferentes que forman un complejo covalente entre sí;

(II) un dominio de unión a antígeno I que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo I presente en un primer antígeno, y un dominio de unión a antígeno II que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo II presente en un segundo antígeno;

(III) un dominio de unión a antígeno III que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo III presente en un tercer antígeno; y

(IV) un dominio Fc, en donde:

(A) uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un antígeno de células efectoras, otro del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un primer antígeno de cáncer y el otro del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un segundo antígeno de cáncer;

(B) una primera cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal:

(Dominio Vü)-(Enlazador 1 )-(Dominio VHii)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros-(Enlazador 3)-(Dominio CH2-CH3); o

(Dominio CH2-CH3)-(Enlazador 4)-(Dominio Vü)-(Enlazador 1)-(Dominio VHii)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros); o

(Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3)-(Enlazador 4)-(Dominio VL)-(Enlazador 1)-(Dominio VHii)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros);

(C) una segunda cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VLii)-(Enlazador 1)-(Dominio VHi)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros);

(D) una tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VHiii)-(Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3);

(E) una cuarta cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal: (Dominio VLiii)-(Dominio que Contiene Cisteína);

(F) el Dominio VLi es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo I, el Dominio VHi es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo I, el Dominio VLii es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo II, el Dominio VHii es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo II, el Dominio VLiii es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo III y el Dominio VHiii es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo III: y

(G) el Dominio VLi y el Dominio VHi se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno I, el Dominio VLii y el Dominio VHii se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno II, el Dominio VLiii y el Dominio VHiii se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno III y el Dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el Dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica se asocian para formar el Dominio Fc.

2. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 1, en donde el dominio que contiene cisteína de la tercera cadena polipeptídica se elige entre un dominio CH1 y/o un dominio bisagra y el dominio que contiene cisteína de la cuarta cadena polipeptídica es un dominio CL.

3. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde (i) la primera cadena polipeptídica y la segunda cadena polipeptídica están unidas covalentemente entre sí; (ii) la primera cadena polipeptídica y la tercera cadena polipeptídica están unidas covalentemente entre sí; y (iii) la tercera cadena polipeptídica y la cuarta cadena polipeptídica están unidas covalentemente entre sí.

4. Una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes, que comprende:

(I) tres cadenas polipeptídicas diferentes que forman un complejo covalente entre sí;

(IV) un dominio Fc; en donde:

(Dominio CH2-CH3)-(Enlazador 4)-(Dominio VLI)-(Enlazador 1)-(Dominio VHii)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros); o

(Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3)-(Enlazador 4)-(Dominio VU)-(Enlazador 1)-(Dominio VHII)-(Enlazador 2)-(Dominio Promotor de Heterodímeros);

(D) una tercera cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal:

(Dominio VLm)-(Enlazador Flexible)-(Dominio VHm)-(Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3); o (Dominio 1 que Contiene Cisteína)-(Dominio VLm)-(Enlazador flexible)-(Dominio VHm)-(Dominio 2 que Contiene Cisteína)-(Dominio que Contiene Cisteína)-(Dominio CH2-CH3);

(E) el Dominio VLi es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo I, el Dominio VHi es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo I, el Dominio VLii es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo II, el Dominio VHii es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo II, el Dominio VLiii es un dominio variable de cadena ligera de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo III y el Dominio VHiii es un dominio variable de cadena pesada de una inmunoglobulina capaz de unirse al epítopo III; y

(F) el Dominio VLi y el Dominio VHi se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno I, el Dominio VLii y el Dominio VHii se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno II, el Dominio VLiii y el Dominio VHiii se asocian para formar el Dominio de Unión a Antígeno III y el Dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el Dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica se asocian para formar el Dominio Fc.

5. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 4, en donde el dominio 1 que contiene cisteína de la tercera cadena polipeptídica es un dominio CL y el dominio 2 que contiene cisteína de la tercera cadena polipeptídica se elige entre un dominio CH1 y/o un dominio bisagra.

6. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde:

(A) el enlazador 2 comprende un resto de cisteína, o

el dominio promotor de heterodímeros comprende un resto de cisteína, o

el enlazador 2 comprende un resto de cisteína y el dominio promotor de heterodímeros comprende un resto de cisteína; y/o

(B) el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y la tercera cadena polipeptídica comprende, independientemente:

(1) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:

F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; o

(2) dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L y P396L;

(2 ) F243Ly R292P; y

(3) R292P y V305I; o

(3) tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P y Y300L;

(2) F243L, R292P y V305I;

(3) F243L, R292P y P396L; y

(4) R292P, V305I y P396L; o

(4) cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L y P396L; y

(2) F243L, R292P, V305I y P396L; o

(5) cinco sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(i) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; y

(ii) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L; y/o

(C) el dominio promotor de heterodímeros en la primera cadena polipeptídica es un dominio de espiral E y el dominio promotor de heterodímeros en la segunda cadena polipeptídica es un dominio de espiral K; o el dominio promotor de heterodímeros en la primera cadena polipeptídica es un dominio de espiral K y el dominio promotor de heterodímeros en la segunda cadena polipeptídica es un dominio de espiral E; y/o

(D) el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica es un dominio CH2-CH3 portador de botón y el dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica es un dominio CH2-CH3 portador de ojal; o

el dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica es un dominio CH2-CH3 portador de botón y el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica es un dominio CH2-CH3 portador de ojal.

7. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:

el enlazador 1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 33;

el enlazador 2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 34 o 47;

el dominio promotor de heterodímeros comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 o 42; el enlazador 3 comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 152 o GCG o GGG;

el enlazador 4 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 50 o 152;

el dominio CH2-CH3 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 52 o 53;

el dominio CH1-bisagra comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 207, 208 o 209;

el dominio que contiene cisteína comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 34, 36, 38, 48, 210 o 211; o una combinación de los anteriores.

8. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde:

(A) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del primer antígeno de cáncer, un epítopo del segundo antígeno de cáncer y

un epítopo del antígeno de células efectoras;

(B) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del primer antígeno de cáncer, un epítopo del antígeno de células efectoras y

un epítopo del segundo antígeno de cáncer;

(D) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del segundo antígeno de cáncer, un epítopo del antígeno de células efectoras y

un epítopo del primer antígeno de cáncer;

(E) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del antígeno de células efectoras, un epítopo del primer antígeno de cáncer y

un epítopo del segundo antígeno de cáncer; o

(F) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del antígeno de células efectoras, un epítopo del segundo antígeno de cáncer y un

epítopo del primer antígeno de cáncer.

9. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde:

(A) el antígeno de la célula efectora es CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, Receptor de células B (BCR), Receptor de células T (TCR) o Receptor NKG2D;

(B) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD2 reconocido por el anticuerpo Lo-CD2a; (C) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD3 reconocido por el anticuerpo OKT3, M291, YTH12.5, mAb 1 anti-CD3 o mAb 2 anti-CD3;

(D) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD16 reconocido por el anticuerpo 3G8 o A9; (E) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD19 reconocido por el anticuerpo MD1342, m Ed I-551, blinatumomab o HD37;

(F) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD20 reconocido por el anticuerpo rituximab, ibritumomab, ofatumumab y tositumomab;

(G) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD22 reconocido por el anticuerpo epratuzumab;

(H) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD32B reconocido por el anticuerpo mAb 1 de CD32B;

(I) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de CD64 reconocido por el anticuerpo mAb 1 de CD64;

(J) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo BCR/CD79 reconocido por el anticuerpo mAb 1 de CD79;

(K) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo de TCR reconocido por el anticuerpo BMA 031; (L) el epítopo de un antígeno de células efectoras es un epítopo del receptor NKG2D reconocido por el anticuerpo KYK-2.0;

(M) uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un antígeno de células efectoras y el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo comprende las seis CDR de las SEQ ID NO: 102 y 103; 104 y 108; 104 y 112; 114 y 115; 116 y 117; 118 y 119; 120 y 121; 122 y 123; 124 y 125; 126 y 127; 128 y 129; 130 y 131; 132 y 133; 134 y 135; o 136 y 137; o comprende una o más de las SEQ ID NO: 102-104, 108, 112, 114 y 115-137; y/o

(N) uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de un antígeno de cáncer y el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo comprende las seis CDR de las SEQ ID NO: 3 y 8; 13 y 18; 23 y 31; 25 y 31; 27 y 31; 29 y 31; 54 y 58; 62 y 66; 70 y 74; 78 y 82; 86 y 90; 94 y 98; 153 y 158; 163 y 167; 172 y 177; 181 y 186; 191 y 192; 193 y 194; 195 y 196; 197 y 198; 199 y 200; 201 y 202; 203 y 204; 205 y 206; 302 y 303; 304 y 305; 306 y 307; 308 y 309; 310 y 311; 312 y 313; 314 y 315; o 321 y 322; o comprende una o más de las SEQ ID NO: 3, 8, 13, 18, 23, 25, 27, 29, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 153, 158, 163, 167, 172, 177, 181, 186, 191-206, 302-315, 321 y 322.

10. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el primer antígeno de cáncer y el segundo antígeno de cáncer se eligen independientemente entre: antígeno de cáncer de colon 19.9; una mucina de cáncer gástrico; antígeno 4.2; glicoproteína A33 (gpA33); ADAM-9; antígeno de cáncer gástrico AH6; ALCAM; antígeno de linfocito humano maligno APO-1; antígeno de cáncer B1; B7-H3; beta-catenina; grupo sanguíneo ALeb/Ley; antígeno de linfoma de Burkitt-38.13, antígeno de adenocarcinoma de colon C14; antígeno de carcinoma de ovario CA125; Carboxipeptidasa M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD30; CD33; CD36; CD45; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD103; CD317; CDK4; antígeno carcinoembrionario (CEA); CEACAM5; CEACAM6; CO17-1A; CO-43 (grupo sanguíneo Leb); CO-514 (grupo sanguíneo Lea); CTA-1; CTLA4; Citoqueratina 8; antígeno D1.1; antígeno D156-22; DR5; Serie E1 (grupo sanguíneo B); EGFR (receptor de factor de crecimiento epidérmico); Receptor de efrina A2 (EphA2); ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2/GD3/GM2; antígeno de adenocarcinoma de pulmón F3; antígeno FC10.2; G49, GD2 de gangliósido; GD3 de gangliósido; GM2 de gangliósido; GM3 de gangliósido; G^d2; G^d3; GICA 19-9; G^m2; gp100; antígeno de células T de leucemia humana Gp37; antígeno de melanoma gp75; gpA33; antígeno HER2 (p185HER2); antígeno de glóbulos grasos de leche humana (HMFG); virus del papiloma humano E6/virus del papiloma humano E7; antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA); antígeno I (antígeno de diferenciación) I(Ma); Integrina Alfa-V-Beta-6 Integrina p6 (ITGB6); interleucina-13; Receptor a2 (IL13Ra2); JAM-3; KID3; KID31; antígeno de pancarcinoma KS 1/4; antígenos de carcinoma de pulmón humano L6 y L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8; M18; M39; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; Myl; N-acetilglucosaminiltransferasa; neoglicoproteína; NS-10; OFA-1; OFA-2; oncostatina M; p15; antígeno asociado con melanoma p97; mucina epitelial polimórfica (PEM); antígeno de mucina epitelial polimórfica (PEMA); PIPA; antígeno específico de la próstata (PSA); antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); fosfato ácido prostático; R24; ROR1; esfingolípidos; SSEA-1; SSEA-3; SSEA-4; sTn; péptido derivado del receptor de células T; T5A7; TAG-72; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de TNF-a; receptor de TNF-p; receptor de TNF-y; TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); receptor de transferrina; antígeno de trasplante específico de tumor (TSTA), antígeno-alfa-fetoproteína oncofetal (AFP); VEGF, VEGFR; VEP8; VEP9; VIM-D5; y hapteno Y, Ley; y 5T4.

11. Una composición de ácido nucleico que comprende polinucleótidos que codifican cadenas polipeptídicas de la molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

13. Una molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso como un medicamento.

14. Una molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 o una composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento de un cáncer.

15. Una molécula de unión triespecífica según la reivindicación 14 o una composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso según la reivindicación 14, en donde:

(A) el cáncer se caracteriza por la presencia de una célula cancerosa de: un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomisarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico o un cáncer de útero; y/o

(B) el cáncer es un cáncer colorrectal, un carcinoma hepatocelular, un glioma, un cáncer de riñón, un cáncer de mama, un mieloma múltiple, cáncer de vejiga, un neuroblastoma, un sarcoma, un linfoma no Hodgkin, un cáncer de pulmón no microcítico, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un cáncer rectal, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), leucemia linfoblástica aguda de precursores de células B (B-ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), tricoleucemia (HCL), neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas (BPDCN), linfoma no Hodgkin (NHL), leucemia de células de manto (MCL), linfoma linfocítico pequeño (SLL), linfoma de Hodgkin, mastocitosis sistémica o linfoma de Burkitt.