ES2890079T3 - Moléculas de unión triespecíficas y métodos de uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes, que comprende: (a) un dominio de unión a antígeno I que comprende un dominio VHI y un dominio VLI, capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo I presente en un primer antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno I es un dominio de unión de tipo diacuerpo; (b) un dominio de unión a antígeno II que comprende un dominio VHII y un dominio VLII, capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo II presente en un segundo antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno II es un dominio de unión de tipo diacuerpo; (c) un dominio de unión a antígeno III que comprende un dominio VHIII y un dominio VLIII, capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo III presente en un tercer antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno III es un dominio de unión de tipo no diacuerpo; (d) un dominio promotor de heterodímeros de espiral E y un dominio promotor de heterodímeros de espiral K; (e) un dominio Fc que se forma mediante la asociación de dos dominios CH2-CH3 entre sí; (f) dominios que contienen cisteína a través de los cuales diferentes cadenas polipeptídicas forman complejos de manera covalente entre sí; (g) un enlazador 1 entre el dominio VHI y el dominio VLII y entre el dominio VHII y el dominio VLI; y (h) un enlazador 2 entre el dominio VHII y un dominio promotor de heterodímeros o entre el dominio VHI y un dominio promotor de heterodímeros; en donde: el primer antígeno, el segundo antígeno y el tercer antígeno son el mismo antígeno, o son independientemente iguales o diferentes de otro de los antígenos; y la molécula de unión triespecífica tiene la estructura de dominio representada en una cualquiera de las Figuras 4A, 4C, 4E, 4F, 4H, 4I y 4K; opcionalmente en donde la molécula de unión triespecífica comprende además: (i) un enlazador 3 entre un dominio promotor de heterodímeros y uno de los dominios CH2-CH3; (j) un enlazador 4 entre el dominio VLI y uno de los dominios CH2-CH3; (k) un dominio CL; y/o (l) un dominio CH1-bisagra.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas de unión triespecíficas y métodos de uso de las mismas

Antecedentes de la invención:

Campo de la invención:

La presente invención se refiere a moléculas de unión triespecíficas, que son moléculas polipeptídicas de cadenas múltiples que poseen tres dominios de unión y, por tanto, son capaces de mediar la unión coordinada a tres epítopos. Los dominios de unión se pueden seleccionar de manera que las moléculas de unión triespecíficas sean capaces de unirse a tres epítopos diferentes cualesquiera. Dichos epítopos pueden ser epítopos del mismo antígeno o epítopos de dos o tres antígenos diferentes. En una realización preferida, uno de dichos epítopos será capaz de unirse a CD3, el segundo de dichos epítopos será capaz de unirse a CD8, y el tercero de dichos epítopos será capaz de unirse a un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad. También se describe un nuevo anticuerpo de unión a ROR1, así como derivados del mismo y usos para dichas composiciones.

Descripción de la técnica relacionada:

I. El sistema inmunitario de los mamíferos

El sistema inmunitario de los mamíferos sirve como defensa contra una diversidad de afecciones, entre las que se incluyen, por ejemplo, lesiones, infecciones y neoplasias. La eficiencia con la que los seres humanos y otros mamíferos desarrollan una respuesta inmunitaria a los patógenos, las sustancias extrañas y los antígenos del cáncer se basa en dos características: la exquisita especificidad de la respuesta inmunitaria para el reconocimiento de antígenos y la memoria inmunitaria que permite respuestas más rápidas y vigorosas tras la reactivación con el mismo antígeno (Portoles, P. et al. (2009) "The TCR/CD3 Complex: Opening the Gate to Successful Vaccination," Current Pharmaceutical Design 15:3290-3300; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21).

El sistema inmunitario de los mamíferos está mediado por dos sistemas separados pero interrelacionados: el sistema inmunitario celular y el sistema inmunitario humoral. En términos generales, el sistema humoral está mediado por productos solubles (anticuerpos o inmunoglobulinas) que tienen la capacidad de combinarse y neutralizar productos reconocidos por el sistema como extraños para el cuerpo. Por el contrario, el sistema inmunitario celular implica la movilización de ciertas células, denominadas "células T", que ejercen una diversidad de funciones terapéuticas. Las células T son linfocitos que proceden del timo y circulan entre los tejidos, el sistema linfático y el sistema circulatorio. En respuesta a la presencia y reconocimiento de estructuras extrañas (antígenos), las células T se "activan" para iniciar una respuesta inmunitaria. En muchos casos, estos antígenos extraños se expresan en células hospedadoras como resultado de una neoplasia o una infección. Aunque las células T no secretan anticuerpos por sí mismas, por lo general son necesarias para la secreción de anticuerpos por la segunda clase de linfocitos, las células B (que proceden de la médula ósea). Es crucial el hecho de que las células T presenten una extraordinaria especificidad inmunitaria para poder distinguir un antígeno de otro). Son de especial relevancia dos tipos de células T, "las células T auxiliares" y las "células T citotóxicas".

Las células T auxiliares se caracterizan por su expresión de la glicoproteína, CD4 (es decir, son "CD4+"). Las células T CD4+ son los organizadores esenciales de la mayoría de las respuestas inmunitarias y autoinmunitarias de los mamíferos (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res.

28(1):39-48). Se ha observado que la activación de células T CD4+ está mediada por interacciones coestimuladoras entre un complejo de antígeno:molécula mayor de histocompatibilidad II (MHC II) que se dispone en la superficie de una célula presentadora de antígeno (tal como una célula B, un macrófago o una célula dendrítica) y un complejo de dos moléculas, el receptor de células T ("TCR") y un ligando del receptor CD3 de la superficie celular, que se disponen en la superficie de una célula T CD4+ virgen. Las células T auxiliares activadas son capaces de proliferar en células Th1 que son capaces de mediar una respuesta inflamatoria a la célula diana.

Las células T citotóxicas se caracterizan por su expresión de CD8 (es decir, son "CD8+" además de CD3+). Se ha observado que la activación de células T CD8+ está mediada por interacciones coestimuladoras entre un complejo de antígeno: molécula mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC I) que se dispone en la superficie de una célula diana y un complejo de CD8 y el receptor de células T, que se disponen en la superficie de la célula T CD8+. A diferencia de las moléculas del MHC II, que se expresan solo por ciertas células del sistema inmunitario, las moléculas del MHC I se expresan muy extensamente. Por lo tanto, las células T citotóxicas son capaces de unirse a una amplia diversidad de tipos de células. Las células T citotóxicas activadas intervienen en la muerte de las células mediante la liberación de las citotoxinas perforina, granzimas y granulisina. Mediante la acción de la perforina, las granzimas entran en el citoplasma de la célula diana y su función serina proteasa desencadena la cascada de las caspasas, que es una serie de cisteína proteasas que finalmente conducen a la apoptosis (muerte celular programada) de las células diana.

El receptor de células T ("TCR") es un heterodímero unido covalentemente de cadenas a y p ("TCRap"). Estas cadenas son polipéptidos de membrana de clase I de 259 (a) y 296 (p) aminoácidos de longitud. La molécula de CD3 es un correceptor de las células T que está compuesto por cinco cadenas polipeptídicas distintas (una cadena y de CD3, una cadena 8 de CD3, dos cadenas £ de c D3 y dos cadenas zeta). Las cadenas polipeptídicas individuales se asocian para formar un complejo de tres dímeros (£Y, £8, ZZ) (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T Cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; páginas 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice," J. Pathol. 173:303-307; Guy, C.S. et al. (2009) "Organization of Proximal Signal Initiation at the TCR:CD3 Complex," Immunol Rev. 232(1):7-21; Call, M.E. et al. (2007) "Common Themes In The Assembly And Architecture Of Activating Immune Receptors," Nat. Rev. Immunol. 7:841-850; Weiss, A. (1993) "T Cell Antigen Receptor Signal Transduction: A Tale Of Tails And Cytoplasmic Protein-Tyrosine Kinases," Cell 73:209-212). El complejo CD3 se asocia con el TCR generando una señal de activación en los linfocitos T. En ausencia de CD3, los t Cr no se ensamblan correctamente y se degradan (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2): 170-177). El CD3 se encuentra unido a las membranas de todas las células T maduras y prácticamente no se encuentra en ningún otro tipo de célula (véase, Janeway, C.A. et al. (2005) En: IMMUNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE," 6a ed. Garland Science Publishing, NY, págs. 214-216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3£:y Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex," Immunity. Febrero de 2006; 24(2): 133-139).

El complejo de TCR y CD3, junto con la cadena zeta de la cadena Z de CD3 (también conocida como cadena zeta del receptor T3 de células T o CD247) comprende el complejo TCR (van der Merwe, P.A. etc. (publicación electrónica, 3 de diciembre de 2010) "Mechanisms For T Cell Receptor Triggering," Nat. Rev. Immunol. 11:47-55; Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology of the T cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140). El complejo es particularmente significativo ya que contiene un gran número (diez) de motivos de inmunorreceptor activable por tirosina (ITAM).

Se requieren dos interacciones para la activación de las células T (Viglietta, V. et al. (2007) "Modulating Co-Stimulation," Neurotherapeutics 4:666-675; Korman, A.J. et al. (2007) "Checkpoint Blockade in Cancer Immunotherapy," Adv. Immunol. 90:297-339). En la primera interacción, una célula debe presentar el antígeno diana relevante unido al complejo mayor de histocompatibilidad de la célula para que pueda unirse al receptor de células T ("TCR") de un linfocito T virgen. En la segunda interacción, un ligando de la célula debe unirse a un correceptor del linfocito T (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48; Lindley, P.S. et al. (2009) "The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Costimulation," Immunol. Rev.

229:307-321). Las células T que experimentan ambas señales estimulantes entonces son capaces de responder a las citocinas (tales como la interleucina-2 y la interleucina-12). En ausencia de ambas señales coestimuladoras durante la interacción del TCR, las células T entran en un estado funcionalmente carente de respuesta conocido como anergia clonal (Khawli, L.A. et al. (2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328). En estados patológicos, las células T son los actores clave de diversas enfermedades autoinmunitarias específicas de órganos, tales como la diabetes de tipo I, la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple (Dong, C. et al. (2003) "Immune Regulation by Novel Costimulatory Molecules," Immunolog. Res. 28(1):39-48). E

Se cree que la necesidad de dos señales para activar las células T de manera que consigan una respuesta inmunitaria adaptativa proporciona un mecanismo para evitar respuestas a autoantígenos que pueden estar presentes en una célula presentadora de antígeno en lugares del sistema donde puede ser reconocida por una célula T. Cuando el contacto de una célula T con una célula da como resultado la generación de solo una de las dos señales requeridas, la célula T no se activa y no se produce una respuesta inmunitaria adaptativa.

II. Anticuerpos y otras moléculas de unión a epítopos

A. Anticuerpos

Los "anticuerpos" son moléculas de inmunoglobulina capaces de unirse de manera específica a una diana, tales como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en el dominio variable de la molécula de inmunoglobulina. Tal como se usa en el presente documento, el término no solo abarca anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también mutantes de los mismos, variantes de origen natural, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo con un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. A lo largo de la presente patente, la numeración de los restos de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos está de acuerdo con el índice EU de Kabat et al. (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Publicación de los Institutos Nacionales de la Salud N.° 91-3242. Tal como se usa en el presente documento, un "fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo" es una porción de un anticuerpo que posee al menos un sitio de reconocimiento de antígeno. Tal como se usa en el presente documento, el término abarca fragmentos (por ejemplo, Fab, Fab', F (ab ')2 Fv) y moléculas monocatenarias (p. ej., ScFv).

Los anticuerpos naturales (tales como los anticuerpos IgG) se componen de dos Cadenas ligeras complejadas con dos Cadenas pesadas. Cada cadena ligera contiene un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). Cada cadena pesada contiene un dominio variable (VH), tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) y un dominio de bisagra situado entre los dominios CH1 y CH2. Por lo tanto, la unidad estructural básica de las inmunoglobulinas naturales (por ejemplo, IgG) es un tetrámero que tiene dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, normalmente expresadas como una glicoproteína de aproximadamente 150.000 Da. La porción amino-terminal ("N") de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal ("C") de cada cadena define una región constante, teniendo las cadenas ligeras un solo dominio constante y teniendo normalmente las cadenas pesadas tres dominios constantes y una región bisagra. Por lo tanto, la estructura de las cadenas ligeras de una molécula de IgG es n-VL-CL-c y la estructura de las cadenas pesadas de IgG es n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (donde H es la región bisagra, y n y c representan, respectivamente, el extremo N y el extremo C del polipéptido).

La capacidad de un anticuerpo intacto, no modificado, (por ejemplo, un anticuerpo IgG) para unirse a un epítopo de un antígeno depende de la presencia de dominios variables en las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina (es decir, el dominio VL y el dominio VH, respectivamente). La interacción de una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo y, en particular, la interacción de sus dominios VL y VH forma uno de los sitios de unión al epítopo del anticuerpo. Las regiones variables de una molécula de IgG consisten en las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que contienen los restos que están en contacto con el epítopo, y segmentos que no son CDR, a los que se conoce como segmentos marco (FR) que, en general, mantienen la estructura y determinan el posicionamiento de los bucles de CDR para permitir dicho contacto (aunque ciertos restos marco también pueden estar en contacto con el antígeno). Por lo tanto, los dominios VL y VH tienen la estructura n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c. Los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, la segunda y la tercera CDR de una cadena ligera de anticuerpo se denominan en el presente documento, respectivamente, Dominio CDR^lI , Dominio CDR^l2 y Dominio CDR^l3. De forma similar, los polipéptidos que son (o pueden servir como) la primera, la segunda y la tercera CDR de una cadena pesada de anticuerpo se denominan en el presente documento, respectivamente, Dominio CDRh1, Dominio CDRh2 y Dominio CDRh3. Por lo tanto, las expresiones Dominio CDRl1, Dominio CDRl2, Dominio CDRl3, Dominio CDRh1, Dominio CDRh2 y Dominio CDRh3 se refieren a polipéptidos que, cuando se incorporan en una proteína, hacen que esa proteína pueda unirse a un epítopo específico independientemente de si dicha proteína es un anticuerpo que tiene cadenas ligeras y pesadas, un diacuerpo o una molécula de unión monocatenaria (por ejemplo, un scFv, un BiTe, etc.), o es otro tipo de proteína. A diferencia de dichos anticuerpos, la construcción scFv comprende un dominio VL y VH de un anticuerpo contenido en una sola cadena polipeptídica, en donde los dominios están separados por un enlazador flexible de suficiente longitud para permitir el autoensamblaje de los dos dominios produciendo un sitio de unión al epítopo funcional. Cuando el autoensamblaje de los dominios VL y VH es imposible debido a un enlazador de insuficiente longitud (inferior a aproximadamente 12 restos de aminoácido), dos de las construcciones scFv pueden interactuar entre sí para formar una molécula bivalente en la que la VL de una cadena se asocia con la V^h de la otra (revisado en Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).

Además de sus usos conocidos en el diagnóstico, se ha demostrado que los anticuerpos son útiles como agentes terapéuticos. Las últimas décadas han visto un resurgimiento del interés en el potencial terapéutico de los anticuerpos, y los anticuerpos se han convertido en una de las clases principales de fármacos derivados de la biotecnología (Chan, C.E. et al. (2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). Cerca de 200 fármacos basados en anticuerpos han sido aprobados para su uso o están en desarrollo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos en donde el anticuerpo monoclonal comprende aminoácidos (naturales y no naturales) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un único epítopo (o sitio antigénico). La expresión "anticuerpo monoclonal" abarca no solo anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2 Fv), monocatenario (scFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unión a un antígeno. No se pretende que esta expresión esté limitada con respecto a la fuente del anticuerpo o la forma en que este se fabrica (por ejemplo, mediante hibridoma, selección de fagos, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.). La expresión incluye inmunoglobulinas completas, así como los fragmentos, etc. descritos anteriormente en la definición de "anticuerpo". Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos monoclonales. Un método que puede emplearse es el método de Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497 o una modificación del mismo. Normalmente, los anticuerpos monoclonales se desarrollan en ratones, ratas o conejos. Los anticuerpos se producen inmunizando a un animal con una cantidad inmunogénica de células, extractos celulares o preparaciones de proteínas que contienen el epítopo deseado. El inmunógeno puede ser, pero sin limitación, células primarias, líneas celulares cultivadas, células cancerosas, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos o tejido. Las células utilizadas para la inmunización se pueden cultivar durante un período de tiempo (por ejemplo, al menos 24 horas) antes de su uso como inmunógeno. Las células se pueden usar como inmunógenos por sí mismas o en combinación con un adyuvante no desnaturalizante, tal como Ribi (véase, por ejemplo, Jennings, V.M. (1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125).

En general, las células deben mantenerse intactas y preferentemente viables cuando se usan como inmunógenos. Las células intactas pueden permitir que el animal inmunizado detecte mejor los antígenos que las células rotas. La utilización de adyuvantes desnaturalizantes o agresivos, por ejemplo, adyuvante de Freud, puede romper las células y, por lo tanto, se desaconseja. El inmunógeno se puede administrar varias veces a intervalos periódicos tales como, cada quince días o cada semana, o puede administrarse de tal manera que se mantenga la viabilidad en el animal (por ejemplo, en un tejido recombinante). Como alternativa, los anticuerpos monoclonales existentes y cualquier otro anticuerpo equivalente que sea inmunoespecífico para un epítopo patógeno deseado se pueden secuenciar y producir de forma recombinante por cualquier medio conocido en la técnica. En una realización, tal anticuerpo se secuencia y la secuencia polinucleotídica se clona luego en un vector para su expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en un vector en una célula huésped y la célula huésped posteriormente puede expandirse y congelarse para su uso futuro. La secuencia polinucleotídica de tales anticuerpos puede usarse para manipulación genética para generar un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo caninizado, o para mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. El principio general para humanizar un anticuerpo implica conservar la secuencia básica de la porción del anticuerpo que se une al antígeno, mientras se intercambia el resto no humano del anticuerpo con secuencias de anticuerpos humanos. Hay cuatro etapas generales para humanizar un anticuerpo monoclonal. Estas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida (2) diseñar el anticuerpo humanizado o el anticuerpo caninizado, es decir, decidir qué región marco del anticuerpo usar durante el proceso de humanización o caninización (3) utilizar las metodologías/técnicas de humanización o caninización reales y (4) realizar la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; y 6.331.415.

El dominio de unión al epítopo de tales anticuerpos puede comprender dominios variables completos fusionados con dominios constantes o solo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas en regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión a antígenos pueden ser de tipo silvestre o estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. Esto elimina la región constante como inmunógeno en individuos humanos, pero sigue existiendo la posibilidad de una respuesta inmunitaria a la región variable extraña (LoBuglio, A.F. et al. (1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 86:4220-4224). Otro enfoque se centra no solamente en proporcionar regiones constantes derivadas de regiones humanas, sino en la modificación de las regiones variables, así como en una remodelación tan estrecha como sea posible de las mismas a la forma humana. Se sabe que las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) que varían en respuesta a los antígenos en cuestión y determinan la capacidad de unión, flanqueadas por cuatro regiones marco (FR) que están relativamente conservadas en una especie dada y que supuestamente proporcionan un andamiaje para las CDR. Cuando se preparan anticuerpos no humanos con respecto a un antígeno particular, las regiones variables se pueden "remodelar" o "humanizar" injertando CDR derivadas de anticuerpos no humanos en las FR presentes en el anticuerpo humano que se va a modificar. La aplicación de este enfoque a diversos anticuerpos se ha notificado por Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; Kettleborough, C. A. et al. (1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) "Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity," Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 89:4285-4289; y Co, M.S. et al. (1992) "Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR procedentes de anticuerpos de ratón). En otras realizaciones, los anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco o seis) que difieren en secuencia con respecto al anticuerpo original.

B. Anticuerpos biespecíficos, diacuerpos multiespecíficos y diacuerpos DART™

Los anticuerpos naturales son capaces de unirse a una sola especie de epítopo (es decir, son "monoespecíficos"), aunque pueden unir múltiples copias de esa especie (es decir, pueden presentar bivalencia o multivalencia). Se ha desarrollado una amplia diversidad de formatos de anticuerpos biespecíficos recombinantes (véanse, por ejemplo, las publicaciones del PCT n.° WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), de las que la mayoría utilizan péptidos enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) a una proteína de unión adicional (por ejemplo, scFv, VL, VH, etc.) al l núcleo del anticuerpo o dentro de este, o para fusionar múltiples porciones de anticuerpos o para fusionar (por ejemplo, dos fragmentos Fab o scFv) a un dominio promotor de heterodimerización tal como el dominio CH2-CH3 o polipéptidos alternativos (documentos WO 2005/070966, WO 2006/107786A, WO 2006/107617A, WO 2007/046893). Wong et al. ("Rheumatoid arthritis T cells produce Th1 cytokines in response to stimulation with a novel trispecific antibody directed against CD2, CD3, and CD28"; Scand J Rheumatol. 2000; 29(5):282-7) describe grupos sulfidrilo de la región bisagra de fragmentos Fab de tres anticuerpos monoclonales diferentes conjugados entre sí. Se desvelan construcciones triespecíficas similares (entre las que se incluyen una dirigido contra CD8, CD3 y Cd37) en Tutt et al., "Trispecific F(ab')3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells," (1991), J. Immunol. 147(1):60-69. Normalmente, tales enfoques implican compromisos y compensaciones. Por ejemplo, las publicaciones del PCT n.° WO 2013/174873, WO 2011/133886 y W^o 2010/136172 desvelan que el uso de enlazadores puede causar problemas en entornos terapéuticos, y enseña un anticuerpo triespecífico en el que los dominios CL y CH1 están cambiados con respecto a sus respectivas posiciones naturales y los dominios VL y VH se han diversificado (documentos WO 2008/027236; WO 2010/108127) para permitir la unión a más de un antígeno. Por lo tanto, las moléculas desveladas en estos documentos cambian la especificidad de unión por la capacidad de unirse a especies de antígeno adicionales. Las publicaciones del PCT n.° WO 2013/163427 y w O 2013/119903 desvelan la modificación del dominio CH2 para que contenga un aducto de proteína de fusión que comprende un dominio de unión. El documento señala que el dominio CH2 probablemente solo juega un papel mínimo en la mediación de la función efectora. Las publicaciones del PCT n.° WO 2010/028797, WO2010028796 y WO 2010/028795 desvelan anticuerpos recombinantes cuyos dominios Fc se han reemplazado con dominios VL y VH adicionales, para formar moléculas de unión trivalentes. Las publicaciones del ^pC^t n.° WO 2003/025018 y WO2003012069 desvelan diacuerpos recombinantes cuyas cadenas individuales contienen dominios scFv. Las publicaciones del PCT n.° WO 2013/006544 desvelan moléculas Fab multivalentes que se sintetizan como una única cadena polipeptídica y luego se someten a proteólisis para producir estructuras heterodiméricas. Por lo tanto, las moléculas desveladas en estos documentos cambian toda o parte de la capacidad de mediar la función efectora por la capacidad de unirse a especies de antígenos adicionales. Las publicaciones del PCT n.° WO 2014/022540, ^w O 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, Los documentos WO 1992/022583 y WO 1991/003493 divulgan la adición de dominios de unión o grupos funcionales adicionales a un anticuerpo o una porción de anticuerpo (por ejemplo, añadiendo un diacuerpo a la cadena ligera del anticuerpo o añadiendo dominios VL y VH adicionales a las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo, o añadiendo una proteína de fusión heteróloga o encadenando múltiples dominios Fab entre sí). Por lo tanto, las moléculas desveladas en estos documentos cambian la estructura del anticuerpo nativo por la capacidad de unirse a especies de antígeno adicionales.

La técnica también ha señalado la capacidad de producir diacuerpos que difieren de tales anticuerpos naturales en ser capaces de unirse a dos o más especies de epítopos diferentes (es decir, al presentar biespecificidad o multiespecificidad además de bivalencia o multivalencia) (véase, por ejemplo, Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 90:6444-6448; documento US 2004/0058400 (Hollinger et al.); documento US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672; documento WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single-chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8): 583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944).

El diseño de un diacuerpo se basa en la estructura de fragmentos de dominio variable monocatenarios (scFv). Tales moléculas se preparan uniendo dominios variables de cadena ligera y/o pesada entre sí a través de un péptido enlazador corto. Bird et al. (1988) ("Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426) describe un ejemplo de péptidos enlazadores que forman un puente de aproximadamente 3,5 nm entre el extremo carboxi de un dominio variable y el extremo amino del otro dominio variable. Se han diseñado y utilizado enlazadores de otras secuencias (Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). Los enlazadores, a su vez, se pueden modificar para funciones adicionales, tales como la fijación de fármacos o la fijación a soportes sólidos. Las variantes monocatenarias pueden producirse de forma recombinante o sintética. Para la producción sintética de scFv, se puede utilizar un sintetizador automático. Para la producción recombinante de scFv, un plásmido adecuado que contiene un polinucleótido que codifica el scFv se puede introducir en una célula hospedadora adecuada, ya sea eucariota, tal como una levadura, una célula vegetal, de insecto o de mamífero, o procariota, tal como E. coli. Se pueden preparar polinucleótidos que codifican el scFv de interés mediante manipulaciones de rutina tales como ligamiento de polinucleótidos. El scFv resultante puede aislarse usando técnicas estándar de purificación de proteínas conocidas en la técnica.

La patente de Estados Unidos n.° 7.585.952 y la publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010-0173978 se refieren a moléculas de scFv que son inmunoespecíficas para ErbB2. Se han descrito captadores biespecíficos de células T ("BiTEs"), un tipo de molécula de scFv (documento WO 05/061547; Baeuerle, P et al. (2008) "BiTE: A New Class Of Antibodies That Recruit T Cells," Drugs of the Future 33: 137-147; Bargou, et al. 2008) "Tumor Regression in Cancer Patients by Very Low Doses of a T Cell-Engaging Antibody," Science 321:974-977). Estas moléculas están compuestas por una única molécula de cadena polipeptídica que tiene dos dominios de unión a antígeno, de los que uno se une inmunoespecíficamente a un epítopo de CD3 y el otro se une inmunoespecíficamente a un antígeno presente en la superficie de una célula diana.

La provisión de diacuerpos no monoespecíficos proporciona una ventaja significativa: la capacidad de coligar y colocalizar células que expresan diferentes epítopos. Por lo tanto, los diacuerpos bivalentes tienen una amplia gama de aplicaciones entre las que se incluyen la terapia y el inmunodiagnóstico. La bivalencia permite tener gran flexibilidad en el diseño y la modificación por ingeniería genética del diacuerpo en diversas aplicaciones, proporcionando mejor avidez hacia los antígenos multiméricos, la reticulación de diferentes antígenos y el direccionamiento dirigido a tipos específicos de células basándose en la presencia de los dos antígenos diana. Debido a su mayor valencia, bajas tasas de disociación y aclaramiento rápido de la circulación (para diacuerpos de pequeño tamaño, en o por debajo de ~50 kDa), las moléculas de diacuerpo conocidas en la técnica también han demostrado un uso particular en el campo de la generación de imágenes de tumores (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris", Protein Eng.

10:1221). Tiene una importancia particular la coligación de diferentes células, por ejemplo, el entrecruzamiento de linfocitos T citotóxicos con células tumorales (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631 y Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305).

Los dominios de unión al epítopo de diacuerpos pueden dirigirse a un determinante de superficie de cualquier célula efectora inmunitaria, tal como CD3, CD16, CD32, CD64, etc., que se expresan en linfocitos T, linfocitos citolíticos naturales (NK) u otras células mononucleares. En muchos estudios, la unión del diacuerpo a determinantes de células efectoras, por ejemplo, receptores Fcy (FcyR), también se observó que activa la célula efectora (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng.

9:299-305; Holliger et al. (1999) "Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res.

59:2909-2916; WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Normalmente, la activación de células efectoras se desencadena por la unión de un anticuerpo unido a un antígeno a una célula efectora a través de la interacción F^c-F^cyR; por lo tanto, en este sentido, las moléculas de diacuerpo pueden presentar una funcionalidad similar a la de Ig independientemente de si comprenden un dominio Fc (por ejemplo, como se analiza en cualquier ensayo de la función efectora conocido en la técnica o ilustrado en el presente documento (por ejemplo, ensayo de ADCC)). Mediante el entrecruzamiento de células tumorales y efectoras, el diacuerpo no solo lleva la célula efectora a las proximidades de las células tumorales, sino que conduce a la destrucción eficaz del tumor (véase, por ejemplo, Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics," Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).

Por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.171.586 se refiere a la producción de anticuerpos biespecíficos mediante la escisión proteolítica de dos anticuerpos para obtener sus fragmentos F(ab')2, a la reducción de dichos fragmentos en condiciones para prevenir la formación de enlaces disulfuro intermoleculares y después a la mezcla de los fragmentos para generar el anticuerpo biespecífico). Las patentes de Estados Unidos n.° 6.551.592; 6.994.853 y 8.277.806 y las publicaciones del PCT n.° WO 2012/156430, WO 2002/020039, WO 2000/018806 y WO 1998/003670 se refieren a la producción de anticuerpos triespecíficos capaces de unirse simultáneamente a células T y otros antígenos en una célula tumoral y, a través de la porción Fc del anticuerpo biespecífico, al receptor Fc de células que poseen dicho receptor. Las publicaciones del PCT n.° WO 2000/018806, Los documentos WO 1998/003670 y WO 2006/072152 se refieren a la producción de anticuerpos triespecíficos capaces de unirse simultáneamente a células T y a otros antígenos. La publicación de patente de Estados Unidos n.° 2008-0057054 desvela conjugados biespecíficos específicos para un elemento de unión contra oligómeros de beta amiloides y un elemento de unión contra la proteína transmembrana telencefalina. La publicación de patente de Estados Unidos n.° 2010-0291112 se refiere a moléculas Fv monocatenarias biespecíficas y triespecíficas que se unen específicamente a uno (o dos) antígenos tumorales y a un antígeno de células efectoras (tal como CD3, CD16, CD32, CD64, etc.).

Las publicaciones del PCT n.° WO 1999/042597 y WO 1998/006749 desvelan derivados de anticuerpos que comprenden dominios de unión al complejo mayor de histocompatibilidad humano, con o sin péptidos de unión al MHC unidos. La publicación del PCT n.° WO 02/072141 se refiere a moléculas de unión multiespecíficas cuyas tasas de asociación (tasas a las que se unen a las moléculas diana) y tasas de disociación (tasas a las que liberan las moléculas diana) difieren para unirse preferentemente a una diana en comparación con su unión a la otra molécula diana. Moléculas triespecíficas, por ejemplo, moléculas que tienen una primera porción monovalente que es un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD28, y una segunda porción que comprende un resto que ejerce una función inmunitaria divalente que se une inmunoespecíficamente a uno o más ligandos diana en una célula diana enferma o una célula inmunitaria.

La patente de Estados Unidos n.° 7.695.936 y la publicación de patente 2007 / 0196363 se refieren a anticuerpos biespecíficos que se forman a partir de las cadenas pesadas de dos anticuerpos, de los que uno posee una protuberancia incorporada por ingeniería genética en su cadena pesada y el otro posee una cavidad complementaria incorporada por ingeniería genética en su cadena pesada. Se enseña que la presencia de tales "botones" y "ojales" complementarios forma preferentemente heteroanticuerpos biespecíficos (que tienen una cadena pesada de cada uno de dichos anticuerpos) en relación con los homoanticuerpos monoespecíficos que contienen dos cadenas pesadas del mismo anticuerpo. Se proponen diversos heteroanticuerpos biespecíficos, incluidos los que son inmunoespecíficos para CD3 y un antígeno de células tumorales. También se proponen diversos heteroanticuerpos triespecíficos, incluidos algunos que son inmunoespecíficos para CD3, CD8 y CD37 (una proteína transmembrana expresada predominantemente en células B que está involucrada en la regulación de la proliferación de células T (Robak, T. et al. (2014) "Anti-CD37 Antibodies For Chronic Lymphocytic Leukemia," Expert Opin. Biol. Ther.

14(5):651-661), sin embargo, no se proporciona ningún mecanismo para su producción ni divulgación de su estructura.

La publicación del PCT WO2012-162561 se refiere a moléculas de unión tetravalentes biespecíficas que comprenden dos polipéptidos, de los que cada uno comprende dos estructuras de diacuerpo, separados por un dominio CH2-CH3 intermedio. El documento también se refiere a moléculas de unión tetravalentes compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas en las que dos de las cadenas polipeptídicas contienen dominios ligeros variables y pesados variables para dos antígenos, y en las que las otras dos cadenas polipeptídicas contienen los dominios pesados variables y ligeros variables complementarios para los antígenos y un dominio CH2-CH3 terminal. Las moléculas de unión tetravalentes biespecíficas se forman a través de la asociación de sus respectivos dominios CH2-CH3. En la construcción de la cadena de cuatro polipéptidos, las cadenas "ligeras" no se unen covalentemente a las cadenas pesadas, lo que conduce a la inestabilidad (véase, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Iike Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672). El documento desvela una tercera construcción en la que las cadenas se han alterado para proporcionar tal enlace covalente, pero a costa de eliminar su biespecificidad (es decir, las moléculas son monoespecíficas). Se desvelan moléculas que tienen especificidad por CD2, CD3, CD4, CD8, CD161, un receptor de quimiocina, CD95, CCR5, etc. No se desvela una molécula biespecífica capaz de unirse tanto a CD3 como a CD8.

Sin embargo, las ventajas anteriores tienen un coste notable. La formación de tales diacuerpos no monoespecíficos requiere el ensamblaje exitoso de dos o más polipéptidos distintos y diferentes (es decir, tal formación requiere que los diacuerpos se formen mediante la heterodimerización de diferentes especies de cadenas polipeptídicas). Este hecho contrasta con los diacuerpos monoespecíficos, que se forman mediante la homodimerización de cadenas polipeptídicas idénticas. Debido a que se deben proporcionar al menos dos polipéptidos diferentes (es decir, dos especies de polipéptidos) para formar un diacuerpo no monoespecífico, y debido a que la homodimerización de dichos polipéptidos conduce a moléculas inactivas (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), la producción de dichos polipéptidos debe lograrse de tal manera que se evite la unión covalente entre polipéptidos de la misma especie (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). Por lo tanto, la técnica ha enseñado la asociación no covalente de tales polipéptidos (véase, por ejemplo, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8): 583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The InsulinLike Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).

Sin embargo, la técnica ha reconocido que los diacuerpos biespecíficos compuestos de polipéptidos asociados no covalentemente son inestables y se disocian fácilmente en monómeros no funcionales (véase, por ejemplo, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672).

Frente a este desafío, la técnica ha conseguido desarrollar diacuerpos heterodiméricos estables no monoespecíficos unidos covalentemente, denominados DART™ (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; la publicación de patente europea n.° EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y las publicaciones del PCT n.° WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; y Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449). Dichos diacuerpos comprenden dos o más polipéptidos complejados covalentemente e implican la introducción por ingeniería genética de uno o más restos de cisteína en cada una de las especies polipeptídicas empleadas que permite que se formen enlaces disulfuro y de ese modo la unión covalente de dos cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, se ha demostrado que la adición de un resto de cisteína al extremo C de estas construcciones permite que se formen enlaces disulfuro entre las cadenas polipeptídicas, estabilizándose el heterodímero resultante sin interferir con las características de unión de la molécula bivalente.

Hay muchas formas de realizaciones de DART™. Cada uno de los dos polipéptidos de la realización más sencilla de DART™ comprende tres dominios (figura 1A). El primer polipéptido comprende: (i) un primer dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena ligera de la primera inmunoglobulina (VL1), (ii) un segundo dominio que comprende una región de unión de un dominio variable de cadena pesada de una segunda inmunoglobulina (VH2) y (iii) un tercer dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio promotor de la heterodimerización que sirve para promover la heterodimerización con la segunda cadena polipeptídica (figura 1B). El resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) del tercer dominio sirve para promover la unión covalente de la primera cadena polipeptídica a la segunda cadena polipeptídica del diacuerpo. El segundo polipéptido contiene: (i) un primer dominio complementario (un dominio que contiene VL2), (ii) un segundo dominio complementario (un dominio que contiene VH1) y (iii) un tercer dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y, opcionalmente, un dominio promotor de la heterodimerización complementario que forma un complejo con el dominio promotor de la heterodimerización de la primera cadena polipeptídica para promover la heterodimerización con la primera cadena polipeptídica. El resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) del tercer dominio de la segunda cadena polipeptídica sirve para promover el enlace covalente de la segunda cadena polipeptídica a la primera cadena polipeptídica del diacuerpo. Estas moléculas son estables, potentes y tienen la capacidad de unirse simultáneamente a dos o más antígenos. Son capaces de promover la muerte redirigida de células que expresan antígenos diana mediada por células T.

En una realización, los terceros dominios del primer y segundo polipéptidos contienen, cada uno, un resto de cisteína, que sirve para unir los polipéptidos entre sí mediante un enlace disulfuro. El tercer dominio de uno o ambos polipéptidos puede poseer adicionalmente la secuencia de un dominio CH2-CH3, de tal manera que la formación de complejos de los polipéptidos de diacuerpo forma un dominio Fc que es capaz de unirse al receptor Fc de células (tales como linfocitos B, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos y mastocitos) (Figuras 2A-2B).

Se han descrito muchas variaciones de estas moléculas (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; la publicación de patente europea n.° EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y las publicaciones del PCT n.° WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538). Estos DART que portan Fc pueden comprender tres cadenas polipeptídicas (p. ej., figura 2B). La primera cadena polipeptídica de dicho diacuerpo contiene tres dominios: (i) un dominio que contiene VLI, (ii) un dominio que contiene v H2 y (iii) un dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio promotor de la heterodimerización, y (iv) un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína y un Dominio CH2-CH3. La segunda cadena polipeptídica de dicho DART™ contiene: (i) un dominio que contiene VL2, (ii) un dominio que contiene VH1 y (iii) un dominio que contiene un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio promotor de heterodimerización que promueve la heterodimerización con la primera cadena polipeptídica. El resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) del tercer dominio de la segunda cadena polipeptídica sirve para promover el enlace covalente de la segunda cadena polipeptídica a la primera cadena polipeptídica del diacuerpo. El tercer polipéptido de dicho DART™ comprende un resto de cisteína (o un dominio que contiene cisteína) y un dominio CH2-CH3. Por lo tanto, la primera y segunda cadenas polipeptídicas de dicho DART™ se asocian entre sí para formar un sitio de unión VL1/VH1 que es capaz de unirse al epítopo, así como un sitio de unión VL2/VH2 que es capaz de unirse al segundo epítopo. El primer y segundo polipéptidos están unidos entre sí a través de un enlace disulfuro en el que están implicados restos de cisteína en sus terceros dominios respectivos. Particularmente, la primera y la tercera cadenas polipeptídicas forman un complejo entre sí para formar un dominio Fc que se estabiliza mediante un enlace disulfuro. Dichos diacuerpos tienen una potencia mejorada. Dichos DART™ que portan Fc pueden tener dos orientaciones (tabla 1):

Se han descrito diacuerpos DART™ aún más complejos, denominados Ig-DART™ (figuras 3A-3B) y diacuerpos Fc-DART™ (figura 3C) (documento WO 2012/018687). Los Fc-DART™ tienen cuatro cadenas polipeptídicas. La primera y tercera cadenas polipeptídicas de dicho diacuerpo contienen tres dominios: (i) un dominio que contiene VL1, (ii) un dominio que contiene VH2 y (iii) un dominio que contiene una secuencia CH2-CH3. El segundo y cuarto polipéptidos de Fc-DART™ contienen: (i) un dominio que contiene VL2, (ii) un dominio que contiene VH1 y (iii) un dominio que promueve la heterodimerización y que forma enlaces covalentes con la primera cadena polipeptídica de Fc-DART™. La tercera y la cuarta, y la primera y la segunda cadenas polipeptídicas pueden ser iguales o diferentes para permitir una unión tetravalente que sea monoespecífica, biespecífica o tetraespecífica. Estas moléculas DART™ más complejas también poseen dominios que contienen cisteína que funcionan para formar un complejo unido covalentemente. Los diacuerpos Fc-DART™ contienen dominios CH1 y CL.

Se conocen en la técnica construcciones alternativas para aplicaciones en las que es deseable una molécula tetravalente pero no se requiere un Fc, que incluyen, pero sin limitación, anticuerpos en tándem tetravalentes, también conocidos como "TandAb" (véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2005­ 0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667 y 2013-0189263; las publicaciones de patente europea n.° EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 y EP 1293514; las publicaciones del PCT n.° WO 1999/057150, WO 2003/025018 y WO 2013/013700) que están formados por la homodimerización de dos cadenas idénticas que poseen cada una un dominio VH1, ^v L2, VH2 y VL2.

III. Muerte redirigida

Como se ha analizado anteriormente, las interacciones entre CD8, el MHC I y el receptor de células T conducen a la activación de las células T citotóxicas y su capacidad para destruir las células cercanas. Se pueden usar diacuerpos biespecíficos que se unen a CD3 y a un antígeno tumoral para colocalizar células T CD8+ citotóxicas en las células tumorales, logrando una "muerte redirigida" de dichas células (documentos WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO/2012/162068, US 2010/0174053; US 2013/0295121).

Sin embargo, los esfuerzos para tratar el cáncer o las enfermedades infecciosas mediante la colocalización de células T CD3+ en el locus de las células tumorales o patógenas no han tenido un éxito completo. Los anticuerpos que se dirigen a CD3 se unen tanto a células T citotóxicas CD3+ CD8+ como a células T auxiliares CD3+ CD4+, conduciendo a la activación de ambas células. Las citocinas producidas por las células T auxiliares T CD3+ CD4+ activadas, sin embargo, contribuyen a efectos secundarios graves, por ejemplo, tormentas de citocinas potencialmente letales (Ferran, C. et al. (1990) "Cytokine-Related Syndrome Following Injection Of Anti-CD3 Monoclonal Antibody: Further Evidence For Transient In Vivo T Cell Activation," Eur. J. Immunol. 20:509-515). De manera adicional, dichos anticuerpos anti-CD3 se unen a otros tipos de células, incluyendo células T doble negativas CD3+ CD4' CD8- etc. que expresan citocinas tras la activación (Johansson, Martina et al. (2003) "A Unique Population of Extrathymically Derived apTCR+ CD4- CD8- T Cells with Regulatory Functions Dominates the Mouse Female Genital Tract," J. Immunol. 170:1659-1666; Blank, C. et al. (2003) "Absence of Programmed Death Receptor 1 Alters Thymic Development and Enhances Generation of CD4/CD8 Double-Negative TCR-Transgenic T Cells," J. Immunol. 171:4574-4581; Mclntyre, M.S.F. et al. (2011) "Consequences Of Double Negative Regulatory T Cell And Antigen Presenting Cell Interaction On Immune Response Suppression," Intl. Immunopharmacol. 11:597-603), y que suprimen la citotoxicidad mediada por células T c D3+ CD8+ (Hillhouse, EE. (2013) "A Comprehensive Review Of The Phenotype And Function Of Antigen-Specific Immunoregulatory Double Negative T Cells," J. Autoimmun. 40:58-65).

Se ha propuesto que la producción de citocinas asociada con la administración de anticuerpos que se dirigen a CD3 podría evitarse utilizando anticuerpos biespecíficos que se dirijan a CD8 y al antígeno tumoral (Michalk, I. et al. (2014) "Characterization of a Novel Single-Chain Bispecific Antibody for Retargeting of T Cells to Tumor Cells via the TCR Co-Receptor CD8," PLOS One 9(4):e95517, páginas 1-8). Por lo tanto, se han estudiado los anticuerpos anti-CD8 para determinar si serían capaces de inducir la función efectora cuando se utilizan solos. Clement, M. et al. informó que seis de los siete anticuerpos anti-CD8 humanos probados no lograron activar las células T CD8+, pero que tal activación podría lograrse usando concentraciones muy altas (10-100 pg/ml) del anticuerpo anti-CD8 humano "OKT8" (Clement, M. et al. (2011) "Anti-CD8 Antibodies Can Trigger CD8+ T Cell Effector Function In The Absence Of TCR Engagement And Improve Peptide-MHCI Tetramer Staining," J. Immunol. 187(2):654-663). Para que se produzca este efecto se requiere la unión cooperativa a dos moléculas CD8, ya que se observó que los fragmentos F(ab)'2 de OKT8 eran capaces de mediar el efecto, mientras que se observó que OKT8 Fab eran incapaces de hacerlo.

Por lo tanto, a pesar de dichos estudios, la toxicidad mediada por citocinas relacionada con el uso de anticuerpos anti-CD4 o anti-CD8 no se ha entendido completamente. Los estudios han revelado que la toxicidad por citocinas observada tras la administración de anticuerpos anti-CD3 no se elimina agotando las células T CD3+ CD4+ o eliminando las células T CD3+ CD8+. Por lo tanto, tanto las células T CD3+ CD4+ como las células T CD3+ CD8+ contribuyen a los efectos tóxicos de los anticuerpos anti-CD3, y se requieren relativamente pocas células para mediar el efecto completo (Finck, BK et al. (1992) "The Role Of T-Cell Subsets In The Response To Anti-CD3 Monoclonal Antibodies," Clin Immunol Immunopathol. diciembre de 1992;65(3):234-41).

Por otra parte, un anticuerpo biespecífico que se dirige a CD8 y un antígeno tumoral no es específico para células T y células tumorales CD3+ CD8+, sino que es específico solo para células y células tumorales CD8+. En particular, el subconjunto de linfocitos citolíticos naturales (NK) CD3' CD8+ sería la diana de dicho anticuerpo. Dichas células, que representan la mayoría de las células NK son potentes productores de citocinas y su activación probablemente contribuiría a una tormenta de citocinas. Las células NK CD3- CD8+ son la fuente principal de IFN-y en chimpancés infectados con VIH-1 (Rodriquez, A.R. et al. (2007) "Influence Of Interleukin-15 On C^d8+ Natural Killer Cells In Human Immunodeficiency Virus Type 1-Infected Chimpanzees," J. Gen. Virol. 88:641-651).

Por consiguiente, a pesar de todos los avances anteriores, persiste la necesidad de composiciones mejoradas capaces de dirigir más vigorosamente el sistema inmunitario del organismo para que ataque las células cancerosas o las células infectadas por patógenos, especialmente a concentraciones terapéuticas más bajas. Como se describe con detalle más adelante, la presente invención aborda esta necesidad proporcionando moléculas de unión triespecíficas que se unen a: (1) un epítopo de CD3, (2) un epítopo de CD8 y (3) un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad que se expresa en una célula diana (especialmente una célula cancerosa o una célula infectada por patógenos) y media la unión coordinada de las células T citotóxicas a las células que presentan el antígeno asociado a enfermedad.

Sumario de la invención:

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes como se define en la reivindicación 1. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición como se define en la reivindicación 17. En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión triespecífica o una composición farmacéutica para su uso como medicamento, como se define en la reivindicación 18. En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una molécula de unión triespecífica o una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un cáncer o una infección por patógenos, como se define en la reivindicación 19. Otras características de la invención se definen en las reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de las figuras:

Las Figuras 1A-1B muestran una representación esquemática de los dominios de los diacuerpos DART™. La Figura 1A muestra una representación esquemática de los dominios de un diacuerpo DART™ básico. La Figura 1B proporciona un esquema de un diacuerpo unido covalentemente compuesto por dos cadenas polipeptídicas, teniendo cada una un dominio promotor de heterodímeros. Los dominios VL y VH que reconocen el mismo epítopo se muestran utilizando el mismo sombreado.

Las Figuras 2A-2B proporcionan un esquema de diacuerpos unidos covalentemente compuestos por dos cadenas polipeptídicas, teniendo cada una un dominio CH2 y CH3 (Figura 2A) o teniendo solo una de ellas un dominio CH2 y CH3 (Figura 2B), de modo que las cadenas asociadas forman un dominio Fc que comprende todo o parte de un dominio Fc natural. Los dominios VL y VH que reconocen el mismo epítopo se muestran utilizando el mismo sombreado.

Las Figuras 3A-3C proporcionan esquemas que muestran diacuerpos tetravalentes compuestos por dos pares de cadenas polipeptídicas. Los pares son diferentes, dando como resultado una molécula biespecífica que es bivalente con respecto a cada uno de dos epítopos, siendo uno de ellos un epítopo de DR5 y siendo el otro un epítopo de una molécula presente en la superficie de una célula efectora. Un polipéptido de cada par posee un dominio CH2 y CH3, de manera que las cadenas asociadas forman un dominio Fc que comprende todo o parte de un dominio Fc natural. Los dominios VL y VH que reconocen el mismo epítopo se muestran utilizando el mismo sombreado. Solo un par de epítopos (mostrados con el mismo sombreado) es capaz de unirse a DR5. La Figura 3A muestra un diacuerpo de Ig. La Figura 3B muestra un diacuerpo de Ig, que contiene dominios promotores de heterodímeros de espiral E y de espiral K. La Figura 3C, muestra un diacuerpo Fc-DART™ que contiene dominios CH1 y CL de anticuerpo. La notación "VL1" y "VH1" denotan, respectivamente, el dominio de cadena ligera variable y el dominio de cadena pesada variable que se unen al "primer" epítopo. De forma similar, la notación "VL2" y "VH2"denotan respectivamente, el dominio de cadena ligera variable y el dominio de cadena pesada variable que se unen al "segundo" epítopo.

Las Figuras 4A-4L proporcionan una representación esquemática de los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas. Las Figuras 4A y 4B, respectivamente, ilustran esquemáticamente los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas en las que el dominio de unión de tipo no diacuerpo de la molécula de unión triespecífica es un dominio de unión de tipo Fab o un dominio de unión a receptores de células T. Las Figuras 4C y 4D, respectivamente, ilustran esquemáticamente los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas que tienen diferentes orientaciones de dominio en las que el dominio de unión de tipo no diacuerpo es un dominio de unión de tipo Fab o un dominio de unión de tipo receptor de células T. Las Figuras 4E-4J representan moléculas similares que tienen tres cadenas polipeptídicas. La molécula puede poseer dominios bisagra y CL (Figuras 4E, 4H) o puede contener un péptido enlazador alternativo (Figuras 4F, 4I). Las Figuras 4K-4L representan moléculas similares que tienen cinco cadenas polipeptídicas.

Las Figuras 5A-5D muestran la capacidad de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 para unirse a las células A498 diana (Figura 5A) y células JIMT-1 diana(Figura 5B), PBMC CD5+/CD4- seleccionadas (Figura 5C) y PBMC CD5+/CD4+ seleccionadas(Figura 5D).

Las Figuras 6A-6C demuestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención para mediar la muerte redirigida de células diana. La Figura 6A muestra los resultados de un ensayo de luciferasa de lisis celular de células JIMT-1. La Figura 6B muestra los resultados de un ensayo de LDH de citotoxicidad de células JIMT-1. La Figura 6C muestra los resultados de un ensayo de LDH de citotoxicidad de células A498.

Las Figuras 7A-7D demuestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención para mediar la activación de las células T tras la incubación con células JIMT-1 (Figura 7A: células T CD4/CD69;

Figura 7B: células T CD4/CD25; Figura 7C: células T CD8/CD69; Figura 7D: células T CD8/CD25).

Las Figuras 8A-8D demuestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención para mediar la activación de las células T tras la incubación con células A498 (Figura 8A: células T CD4/CD69;

Figura 8B: células T CD4/CD25; Figura 8C: células T CD8/CD69; Figura 8D: células T CD8/CD25).

Las Figuras 9A-9B muestran poblaciones de células CD5+ CD4+ seleccionadas (Figura 9A) o CD5+ CD4' seleccionadas (Figura 9B) de PMBC humanas en función del aumento de la concentración de moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 o moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8. Se utilizaron como controles B7-H3 X CD3 DART™ (con y sin dominio Fc).

Las Figuras 10A-10C muestran el efecto de diferentes dominios de unión a CD8 sobre la citotoxicidad de una molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / CD8.

Las Figuras 11A-11C demuestran la capacidad de modular la unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención seleccionando el sitio A, Sitio B o Sitio C para el dominio de unión a CD3. Las moléculas de unión triespecíficas empleadas eran capaces de unirse inmunoespecíficamente al antígeno asociado a enfermedad, B7-H3. La citotoxicidad se mide usando un ensayo de luciferasa.

Las Figuras 12A-12C demuestran el efecto de la selección de posición (Sitio A, Sitio B o Sitio C) sobre la citotoxicidad mediada por las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención usando un ensayo de LDH.

Las Figuras 13A-13E muestran el efecto de la variación de posición sobre la citotoxicidad utilizando una molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8, una molécula de unión triespecífica mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 y una molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3. Se utilizó como control un B7-H3 X CD3 DART™ con dominio Fc. Figuras 14A-14B, la ubicación del dominio de unión a CD3 en el sitio C, disminuyó en gran medida la unión tanto a las células CD5+ CD4+ (Figura 14A) como a las células CD5+ CD4' (Figura 14B).

Las Figuras 15A-15B muestran poblaciones de células CD5+ CD4+ seleccionadas (Figura 15A) o CD5+ CD4' seleccionadas (Figura 15B) de PMBC humanas en función del aumento de la concentración de moléculas de unión triespecíficas mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 o moléculas de unión triespecíficas mAb2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8. Se utilizaron como controles 5T4 X CD3 DART™ (con y sin dominio Fc).

Las Figuras 16A-16C muestran que el efecto observado de la variación de posición sobre la citotoxicidad no dependía del dominio de unión a CD8 empleado.

Las Figuras 17A-17C demuestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención para mediar en la muerte redirigida de células diana que expresan ROR1.

Las Figuras 18A-18C muestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 para unirse a proteína gp140 inmovilizada, soluble(Figura 18A), CD3 humano (Figura 18B) y tanto a la proteína gp140 como a CD3 humano (Figura 18C).

Las Figuras 19A-19C muestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 para unirse a células HEK293/D375 que expresan env de VIH a diferencia de una molécula de unión triespecífica de control (Figura 19C).

Las Figuras 20A-20B muestran la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 de unirse para mostrar unión específica con la población de células CD5+/CD5- de PBMC humanas.

Las Figuras 21A-21F muestran la actividad citotóxica mediada por la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 o mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 en células Jurkat en presencia o ausencia de tetraciclina (Figuras 21A-21B; Figuras 21C-21D). Las Figuras 21E-21F muestran la actividad citotóxica de una molécula triespecífica de anticuerpo anti-RSV (por sus siglas en inglés) de control (Palivizumab; mAb 1 de RSV).

Las Figuras 22A-22B muestran el porcentaje de células Jurkat 522 FY que expresan env de VIH vivas al día y 2 días después de la incubación con células pan T purificadas y con moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 o mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8.

Las Figuras 23A-23C muestran los resultados de una evaluación de la actividad de CTL de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 en células Jurkat 522 FY que expresan env de VIH utilizando células T CD4+, CD8+ o pan T.

Las Figuras 24A-24C muestran los resultados de una evaluación de la actividad de CTL de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 en células Jurkat 522 FY que expresan env de VIH utilizando células T CD4+, CD8+ o pan T.

Las Figuras 25A-25C muestran la cinética de unión para moléculas DART™ que tienen el dominio de unión mAb 2 de CD3 (Figura 25A) y sus variantes de afinidad mAb 2 de CD3 low (Figura 25B) y mAb 2 de CD3 Fast (Figura 25C).

Las Figuras 26A-26B muestran poblaciones de células CD5+ CD4+ seleccionadas (Figura 26A) o CD5+ CD4-seleccionadas (Figura 26B) de PMBC humanas en función del aumento de la concentración de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8, de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 y de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast/ mAb 1 de CD8. Se utilizaron como controles 5T4 X CD3 DART™ (con especificidades de CD3 de tipo silvestre, Low y Fast).

Las Figuras 27A-27C muestran el efecto de las variantes de mAb de CD3 (mAb 2 de CD3 Low y mAb 2 de CD3 Fast) sobre la citotoxicidad de una molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 utilizando un ensayo de LDH.

Las Figuras 28A-28F demuestran el nivel de IFN-^y (Figura 28A), TNF-a (Figura 28B), IL-10 (Figura 28C), IL-6 (Figura 28D), IL-4 (Figura 28E) e IL-2 (Figura 28F) liberado a partir de PBMC del donante 1 en presencia de concentraciones crecientes de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8, de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 y de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8.

Las Figuras 29A-29F demuestran el nivel de IFN-y (Figura 29A), TNF-a (Figura 29B), IL-10 (Figura 29C), IL-6 (Figura 29D), IL-4 (Figura 29E) e IL-2 (Figura 29F) liberado a partir de PBMC del donante 2 en presencia de concentraciones crecientes de molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8, de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 y de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8.

Descripción detallada de la invención:

La información técnica que se expone más adelante puede, en algunos aspectos, ir más allá de la divulgación de la invención, que se define de manera exclusiva por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para situar la invención real en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Dicha información técnica adicional que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la presente invención.

La presente invención se refiere a moléculas de unión triespecíficas, que son moléculas polipeptídicas de cadenas múltiples que poseen tres dominios de unión y, por tanto, son capaces de mediar la unión coordinada a tres epítopos. Los dominios de unión se pueden seleccionar de manera que las moléculas de unión triespecíficas sean capaces de unirse a tres epítopos diferentes cualesquiera. Dichos epítopos pueden ser epítopos del mismo antígeno o epítopos de dos o tres antígenos diferentes. También se describe un nuevo anticuerpo de unión a ROR1, así como derivados del mismo y usos para dichas composiciones.

I. Técnicas generales y definiciones generales

La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que se encuentran entre las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican con detalle en las referencias, tales como, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Tercera edición (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press, Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press, New York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I., Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. y Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York, NY; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al., Eds., 1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.) New York, NY; WEIR'S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. et al. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al., Eds., 1987) Greene Pub. Associates, New York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al., Eds., 1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al., eds., 1991) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley and Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al. 2007) Garland Science, London, u K; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty., ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al. Eds., 2000) Oxford University Press, USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al. Eds., 1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THE ANTIBODIES (Zanetti, M. et al. Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London, UK); and DEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, OCTAVA EDICIÓN, DeVita, V. et al. Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

II. Moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención A. Capacidades de unión

Las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas, son capaces de unirse de forma coordinada y simultánea a tres epítopos diferentes. Dichas moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención comprenden:

(I) un "Dominio de Unión I" que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un "Epítopo I" presente en un primer antígeno y un "Dominio de Unión II" que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un "Epítopo II" presente en un segundo antígeno, en donde dicho Dominio de unión I y dicho Dominio de unión II son ambos "Dominios de Unión de Tipo-Diacuerpo;"

(II) un "Dominio de Unión III" "de Tipo No Diacuerpo" que es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un "Epítopo III" presente en un tercer antígeno; y

(III) un Dominio Fc que se forma mediante la formación de un complejo de dos Dominios CH2-CH3 entre sí.

Normalmente, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención comprenderán cuatro cadenas polipeptídicas diferentes, teniendo cada una un extremo amino y un extremo carboxilo (véase la Figura 4A y 4C), sin embargo, las moléculas pueden comprender un número menor o mayor de cadenas polipeptídicas fusionando dichas cadenas polipeptídicas entre sí (por ejemplo, mediante un enlace peptídico) o dividiendo dichas cadenas polipeptídicas para formar cadenas polipeptídicas adicionales. Las Figuras 4e , 4F, 4H y 4I ilustran este aspecto de la presente invención representando esquemáticamente dichas moléculas que tienen tres cadenas polipeptídicas. La Figura 4K ilustra este aspecto de la presente invención representando esquemáticamente moléculas que tienen cinco cadenas polipeptídicas.

Los términos y expresiones "polipéptido", "cadena polipeptídica", y "péptido" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud, pero especialmente longitudes superiores a 3, 5, 10, 15, 20 o 25 restos de aminoácidos, en los que dos y, más preferentemente, todos de los restos de aminoácidos están unidos mediante un enlace amida (peptídico) (-NH-C(O)-). Sin embargo, el polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. En la definición también se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos de la presente invención pueden presentarse como cadenas sencillas o como cadenas en forma de complejos.

Un "Dominio de unión de tipo diacuerpo" es el dominio de unión al epítopo de un diacuerpo y, especialmente, un diacuerpo DART®. Las expresiones "diacuerpo" y "diacuerpo DART®" se han analizado anteriormente y se refieren a una molécula que comprende al menos dos cadenas polipeptídicas que preferentemente forman complejos entre sí a través de una interacción covalente para formar al menos dos sitios de unión al epítopo, que pueden reconocer epítopos iguales o diferentes. Dos de las cadenas polipeptídicas de un diacuerpo o diacuerpo DART® comprenden, cada una, una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina y una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, pero estas regiones no interaccionan para formar un sitio de unión al epítopo (es decir, no son mutuamente "complementarias"). Más bien, la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de una (p. ej., la primera) de las cadenas del diacuerpo, o diacuerpo DART® interacciona con la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica diferente (p. ej., la segunda)del diacuerpo o diacuerpo DART® para formar un sitio de unión al epítopo. De forma similar, la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina de una de las cadenas polipeptídicas (por ejemplo, la primera) del diacuerpo, o diacuerpo DART®, interacciona con la región variable de cadena pesada de inmunoglobulina de una cadena polipeptídica de un diacuerpo o diacuerpo DART® diferente (por ejemplo, la segunda), para formar un sitio de unión al epítopo. Se desvelan moléculas de diacuerpo DART® en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2013-0295121; 2010-0174053 y 2009-0060910; la publicación de patente europea n.° EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 y las publicaciones del PCT n.° WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665, WO 2008/157379 y Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control OfB Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor 11 b (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bi-specific Antibody Scaffold," Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; y Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449.

Un Dominio de Unión III es preferentemente un "Dominio de Unión de Tipo No Diacuerpo", que pretende indicar que el dominio de unión III no tiene la estructura de un dominio de unión de tipo diacuerpo. Preferentemente, el dominio de unión III es un dominio de unión de tipo no diacuerpo que es un Dominio de Unión de Tipo Fab o un Dominio de Unión de Tipo Receptor. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "Dominio de Unión de Tipo Fab" se refiere a un dominio de unión a epítopo que se forma mediante la interacción del dominio VL de una cadena ligera de inmunoglobulina y un dominio V^h complementario de una cadena pesada de inmunoglobulina. Los dominios de unión de tipo Fab difieren del dominio de unión de tipo diacuerpo en que las dos cadenas polipeptídicas que forman un dominio de unión de tipo Fab comprenden solamente un dominio de unión a un solo epítopo, mientras que las dos cadenas polipeptídicas que forman un dominio de unión de tipo diacuerpo comprenden al menos dos dominios de unión a epítopo. Por lo tanto, como se usa en el presente documento, los dominios de unión de tipo Fab son distintos del dominio de unión de tipo diacuerpo. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "Dominio de Unión de Tipo Receptor" se refiere a un dominio de unión a epítopo de un receptor celular que se forma mediante la interacción de dos polipéptidos. Los dominios de unión de tipo receptor se ejemplifican en el presente documento mediante referencia a un Dominio de Unión de Tipo Receptor de Células T, que se forma a partir de la interacción de un dominio variable de una cadena alfa de un receptor de células T y un dominio variable de una cadena beta de un receptor de células T. Dichos dominios de unión de receptores de células T reconocen péptidos presentados en el contexto del MHC y, por tanto, son capaces de reconocer epítopos intracelulares. Aunque la invención se ilustra con respecto a dichos dominios de unión de tipo receptor, se apreciará que pueden emplearse dominios de unión de tipo receptor distintos de los dominios de unión de tipo receptor de células T y están abarcados por la presente invención. Otros ejemplos de receptores que tienen dominios de unión de tipo receptor incluyen el receptor de IL-2, el receptor de IL-4, el receptor de IL-7, el receptor de IL-9, el receptor de IL-15, el receptor de IL-21, el receptor de insulina y la linfopoyetina del estroma tímico.

Por tanto, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se distinguen de las moléculas de unión tetravalentes, tales como las producidas a partir de la dimerización de un anticuerpo bivalente, y preferentemente poseen tres y no cuatro dominios de unión. Como se analiza posteriormente, las moléculas triespecíficas de la presente invención pueden poseer dominios de unión adicionales (tales como un dominio de unión a albúmina, un dominio de unión a F^cyR, etc.). No se pretende que tales dominios de unión adicionales sean considerados o contados como uno de los tres dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "asociación" o "asociar", con respecto a los polipéptidos (por ejemplo, un polipéptido de diacuerpo a otro, una cadena ligera de inmunoglobulina a una cadena pesada de inmunoglobulina, un dominio CH2-CH3 a otro dominio CH2-CH3, etc.) pretenden indicar una combinación no covalente de los polipéptidos. Con los términos "complejos" o "complejante" se pretende indicar una combinación covalente de los polipéptidos.

Tal como se usa en el presente documento, se dice que los dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la invención median un "enlace coordinado" si al menos dos de sus dominios de unión, y preferentemente todos sus dominios de unión, son capaces de unirse al mismo tiempo a sus respectivos epítopos o ligando de unión reconocidos. Esta unión puede ser simultánea. Sin embargo, un aspecto de la presente invención se refiere a la modificación de las tasas de "asociación" y/o "disociación" con las que dichos dominios de unión se unen a sus epítopos reconocidos. Tal como se utiliza en el presente documento, la "tasa de asociación" de la unión es una medida de la afinidad con la que dichos dominios de unión reconocen e inician la unión a sus epítopos reconocidos. Por el contrario, la "tasa de disociación" de la unión es una medida del grado de estabilidad del complejo formado por el dominio de unión y el epítopo. Las tasas de "asociación" y/o "disociación" de la unión pueden modificarse alterando la secuencia de aminoácidos de las CDR de un dominio de unión. Como se analiza posteriormente, independientemente de cualquier modificación de CDR, el grado de unión coordinada de las moléculas de la presente invención se puede modular cambiando la configuración de sus dominios de unión de modo que un dominio de unión particular (es decir, un dominio VLx/VHx) esté presente como dominio de unión III o como un dominio de unión de tipo diacuerpo interno o externo en relación con el dominio de unión III (analizado en detalle más adelante).

Las tasas de asociación y disociación de los dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden medir fácilmente mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante análisis Biacore® (Jason-Moller, L. et al. (2006) "Overview Of Biacore Systems And Their Applications," Curr. Protoc. Protein Sci. Capítulo 19: Unidad 19.13; Swanson, S.J. (2005) "Characterization Of An Immune Response," Dev. Biol. (Basilea). 122:95-101; Buijs, J. et al. (2005) "SPR-Ms In Functional Proteomics," Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(1):39-47; Karlsson, R. et al. (2004) "SPR For Molecular Interaction Analysis: A Review Of Emerging Application Areas," J. Mol. Recognit. 17(3): 151-161; Van Regenmortel, M.H. (2003) "Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements," Dev. Biol. (Basilea) 112:141-151; Malmqvist, M. (1999) "BIACORE: An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions," Biochem. Soc. Trans.

27(2):335-340; Malmqvist, M. et al. (1997) "Biomolecular Interaction Analysis: Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins," Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):378-383; Fivash, M. et al. (1998) "Biacore For Macromolecular Interaction," Curr. Opin. Biotechnol. 9(1):97-101; Malmborg, A.C. et al. (1995) "Biacore As A Tool In Antibody Engineering," J. Immunol. Methods. 183(1):7-13). Las tasas de asociación y disociación de los dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden alterar fácilmente mediante mutagénesis aleatoria o dirigida de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos dominios de unión, seguido por el cribado de rutina de las moléculas de ácido nucleico recuperadas por su capacidad para codificar proteínas mutadas que presentan tal cinética de unión alterada.

Los dominios de unión de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se unen a epítopos de una manera "inmunoespecífica". Tal como se usa en el presente documento, se dice que un anticuerpo, diacuerpo u otra molécula de unión a epítopo se une "inmunoespecíficamente" a una región de otra molécula (es decir, un epítopo) si reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con ese epítopo en relación con epítopos alternativos. Por ejemplo, un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un epítopo viral es un anticuerpo que se une a este epítopo viral con mayor afinidad, avidez, más fácilmente y/o con mayor duración que cuando se une inmunoespecíficamente a otros epítopos virales o no virales. También se entiende al leer esta definición que, por ejemplo, un anticuerpo (o resto o epítopo) que se une inmunoespecíficamente a una primera diana puede o no unirse específica o preferentemente a una segunda diana. Por lo tanto, una "unión específica" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) una unión exclusiva. Generalmente, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa unión "específica". Se dice que dos moléculas son capaces de unirse entre sí de una manera "fisioespecífica", si dicha unión presenta la especificidad con la que los receptores se unen a sus respectivos ligandos.

Por lo tanto, en su realización más simple, las moléculas de unión de la presente invención tienen al menos tres "sitios" que son capaces de unirse al antígeno: un dominio de unión de tipo diacuerpo "externo" que se encuentra más alejado del dominio de unión III, un dominio de unión de tipo diacuerpo "interno" que se encuentra más cerca del dominio de unión III y el propio dominio de unión III. Las posiciones de dichos dominios se designan respectivamente como Sitio A, Sitio B y Sitio C (Figuras 4A-4D).

Los dominios de unión que se unen a los epítopos I, II y III se seleccionan para que sean diferentes entre sí. Sin embargo, los epítopos I, II y III pueden ser epítopos del mismo antígeno, de dos antígenos diferentes o de tres antígenos diferentes. Por tanto, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden ser capaces de unirse de forma coordinada a 1, 2 o 3 moléculas de antígeno diferentes. Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden emplearse con respecto a cualquier posible epítopo y cualquier posible antígeno. Por ejemplo, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden tener 1,2 o 3 dominios de unión que se unen a un epítopo de una célula efectora (p. ej., CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, el receptor de células B (BCR), el receptor de células T (TCR) y el receptor NKG2D), o a un epítopo de una célula T citotóxica (por ejemplo, CD8 presente en las células T citotóxicas), o a un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad, o cualquier combinación de dichos posibles dominios de unión.

Tal como se usa en el presente documento, un "Antígeno asociado a enfermedad" es un antígeno que se expresa de forma característica en una célula "infectada por patógenos" o en una "célula cancerosa", pero no se expresa de forma característica en una célula normal.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión célula "infectada por patógenos" se refiere a una célula que ha sido infectada por una bacteria (p.ej, E. coli, C. difficile, Salmonella thyphimurium, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis y Streptococcus pneumonia, etc.), un hongo (p.ej, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Coccidioides, Histoplasma, Pneumocystis, Stachybotrys, etc.), a protozoo (Amoebozoa, Excavata, Chromalveolata, Entamoeba, Plasmodium, Giardia, Trypanosoma, Coccidia, Besnoitia, Dicrocoelium, Leishmania, etc.) o un virus (y especialmente un adenovirus, un virus adenoasociado, un virus B (macacine herpesvirus I), un virus BK, un buniavirus, un virus chikungunya, un virus cocksackie, un coronavirus, un citomegalovirus, un virus de la encefalitis equina del este, un virus del Ébola, un enterovirus, un virus de Epstein-Barr, un hantavirus, un virus de la hepatitis A, un virus de la hepatitis B, un virus de la hepatitis C, un virus de la hepatitis D, un virus de la hepatitis E, un virus del herpes simple 1, un virus del herpes simple 2, un virus espumoso humano, un virus del herpes humano 3, un virus del herpes humano 5, un virus del herpes humano 6, un virus del herpes humano 7, un virus de la inmunodeficiencia humana, un virus del papiloma humano, un virus p-linfotrópico humano, un virus de la leucemia de células T humano I, un virus de la leucemia de células T humano II, un virus de la gripe, un virus JC, un JEV, un herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi, un virus Lassa, un virus de la coriomeningitis linfocítica, un virus de Marburg, un virus del sarampión, un virus de las paperas, un virus Nipah, un norovirus, un virus de Norwalk, un ortoreovirus, un virus paragripal, un parvovirus, un poliovirus, un virus de la rabia, un reovirus, un virus sincitial respiratorio, rinovirus, un virus de la fiebre del Valle del Rift, un rotavirus, virus de la rubeola, un virus de la viruela, un virus de la encefalitis de San Luis, un virus variola mayor, un virus variola menor, un virus de la varicela-zoster, un virus del Nilo Occidental, un virus de la encefalitis equina occidental o un virus de la fiebre amarilla).

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "célula cancerosa" se refiere a una célula maligna de: un tumor de la glándula suprarrenal, un cáncer asociado al SIDA, un sarcoma alveolar de las partes blandas, un tumor astrocítico, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, un cáncer de cerebro y médula espinal, un tumor cerebral metastásico, un cáncer de mama, un tumor del cuerpo carotídeo, un cáncer de cuello uterino, un condrosarcoma, un cordoma, un carcinoma de células renales cromófobo, un carcinoma de células claras, un cáncer de colon, un cáncer colorrectal, un histiocitoma cutáneo fibroso benigno, un tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, un ependimoma, un tumor de Ewing, un condrosarcoma mixoide extraesquelético, una fibrogénesis ósea imperfecta, una displasia fibrosa del hueso, un cáncer de vesícula biliar o de conductos biliares, cáncer gástrico, una enfermedad trofoblástica gestacional, un tumor de células germinales, un cáncer de cabeza y cuello, carcinoma hepatocelular, un tumor de células de los islotes, un sarcoma de Kaposi, un cáncer de riñón, una leucemia, un lipoma/tumor lipomatoso benigno, un liposarcoma/tumor lipomatoso maligno, un cáncer de hígado, un linfoma, un cáncer de pulmón, un meduloblastoma, un melanoma, un meningioma, una neoplasia endocrina múltiple, un mieloma múltiple, un síndrome mielodisplásico, un neuroblastoma, un tumor neuroendocrino, un cáncer de ovario, un cáncer pancreático, un carcinoma papilar de tiroides, un tumor paratiroideo, un cáncer pediátrico, un tumor maligno de la vaina de nervio periférico, un feocromocitoma, un tumor de la pituitaria, un cáncer de próstata, un melanoma uveal posterior, un trastorno hematológico raro, un cáncer metastásico renal, un tumor rabdoide, un rabdomisarcoma, un sarcoma, un cáncer de piel, un sarcoma de tejidos blandos, un cáncer de células escamosas, un cáncer de estómago, un sarcoma sinovial, un cáncer testicular, un carcinoma tímico, un timoma, un cáncer de tiroides metastásico o un cáncer de útero.

Ejemplos de antígenos que se expresan de forma característica por las células cancerosas incluyen un "antígeno de cáncer" tal como un antígeno de cáncer de mama, un antígeno de cáncer de ovario, un antígeno de cáncer de próstata, un antígeno de cáncer de cuello uterino, un antígeno de carcinoma de páncreas, un antígeno de cáncer de pulmón, un antígeno de cáncer de vejiga, un antígeno de cáncer de colon, un antígeno de cáncer de testículo, un antígeno de cáncer de glioblastoma, un antígeno asociado con una neoplasia maligna de células B, un antígeno asociado con mieloma múltiple, un antígeno asociado con el linfoma no Hodgkin o un antígeno asociado con la leucemia linfocítica crónica. Antígenos ilustrativos que se expresan de forma característica por las células cancerosas incluyen los antígenos: antígeno de cáncer de colon 19.9; antígeno de mucina de cáncer gástrico 4.2; antígeno de carcinoma colorrectal A33 (Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol. Nov; 33(8):991-998); ADAM-9 (publicación de patente de Estados Unidos n.° 2006/0172350; publicación del PCT n.° WO 06/084075; AFP antígeno-alfafetoproteína oncofetal (Malaguarnera, G. et al. (2010) "Serum markers of hepatocellular carcinoma," Dig. Dis. Sci.

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Anticuerpos ilustrativos que se unen inmunoespecíficamente a un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad que pueden usarse para proporcionar los dominios variables de cadena ligera, dominios variables de cadena pesada, cadenas ligeras de anticuerpos o cadenas pesadas de anticuerpos de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se presentan en la Tabla 2.

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Un antígeno asociado a una enfermedad puede expresarse de forma característica en una célula infectada por patógenos o en una célula cancerosa y procesarse y presentarse en la superficie celular en el contexto de un complejo MHC, pero no expresarse de forma característica en una célula normal. Los anticuerpos que reconocen dichos fragmentos de péptidos son conocidos en la técnica o se pueden generar utilizando métodos bien conocidos, incluyendo aquellos descritos en el documento WO 2002/014870.

Los polipéptidos de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden adaptarse para contener los dominios ligeros variables o pesados variables (el caso de la primera y segunda cadenas polipeptídicas de dichas moléculas) o las cadenas ligeras o pesadas (en el caso de la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de dichas moléculas) de dichos anticuerpos. Por lo tanto, los anticuerpos descritos anteriormente pueden utilizarse para producir moléculas de unión triespecíficas de la presente invención cuyo sitio A, sitio B o el sitio C son capaces de unirse a un epítopo de dichos antígenos asociados a enfermedad.

B. Atributos estructurales preferidos

Normalmente, las moléculas de unión triespecíficas de las presentes moléculas comprenderán cuatro cadenas polipeptídicas diferentes, teniendo cada una un extremo amino y un extremo carboxilo (véase las Figuras 4A-4D), sin embargo, las moléculas pueden comprender un número menor o mayor de cadenas polipeptídicas fusionando dichas cadenas polipeptídicas entre sí (p. ej., mediante un enlace peptídico) o dividiendo dichas cadenas polipeptídicas para formar cadenas polipeptídicas adicionales, o asociando cadenas polipeptídicas menores o adicionales mediante enlaces disulfuro. Las Figuras 4E, 4F, 4H y 4I ilustran este aspecto de la presente invención representando esquemáticamente dichas moléculas que tienen tres cadenas polipeptídicas. La Figura 4K ilustra este aspecto de la presente invención representando esquemáticamente moléculas que tienen cinco cadenas polipeptídicas.

Los diversos dominios de inmunoglobulina de dichas moléculas pueden derivar de inmunoglobulinas de cualquier isotipo o alotipo, incluyendo, pero sin limitación, IgA, IgD, IgG, IgE e IgM. En realizaciones preferidas, como se analiza más adelante, dichas inmunoglobulinas derivan de inmunoglobulinas IgG. En realizaciones específicas, el isotipo de IgG utilizado es IgG1, sin embargo, pueden emplearse IgG de otros isotipos (p. ej., IgG2, IgG3 o IgG4 o un alotipo de las mismas). Cuando se utiliza un dominio Fc de IgG4, la presente invención abarca la introducción de una mutación estabilizadora tal como S228P, numerada por el índice EU como se establece en Kabat (Lu et al., (2008) "The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation," J Pharmaceutical Sciences 97:960-969) para reducir la incidencia del intercambio de cadenas. Pueden introducirse otras mutaciones estabilizadoras conocidas en la técnica en un dominio Fc de IgG4 (Peters, P et al., (2012) "Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability," J. Biol. Chem., 287:24525-24533; publicación de patente del PCT n.°: WO 2008/145142). Como las sustituciones N297A, L234A, L235A y D265A anulan la función efectora, en circunstancias en las que se desea la función efectora, preferentemente no se emplearían estas sustituciones.

Las Figuras 4A-4D proporcionan una representación esquemática de los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas. Las Figuras 4A y 4B, respectivamente, ilustran esquemáticamente los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas en las que el dominio de unión de tipo no diacuerpo es un dominio de unión de tipo Fab o un dominio de unión de tipo receptor. Las Figuras 4C y 4D, respectivamente, ilustran esquemáticamente los dominios de moléculas de unión triespecíficas preferidas que tienen diferentes orientaciones de dominio en las que el dominio de unión de tipo no diacuerpo es un dominio de unión de tipo Fab o un dominio de unión de tipo receptor.

Como se indica anteriormente, uno de los epítopo I, epítopo II o epítopo III que está unido por los dominios de unión de dichas moléculas de unión triespecíficas preferidas ilustrativas puede ser un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad. Lo más preferentemente, el dominio de unión de dicha molécula de unión triespecífica preferida ilustrativa que se une a dicho epítopo de un antígeno asociado a enfermedad es un dominio de unión de tipo Fab. Los polipéptidos de dichas moléculas de unión triespecíficas de la presente invención pueden adaptarse para contener los dominios ligeros variables o pesados variables (el caso de la primera y segunda cadenas polipeptídicas de dichas moléculas) o las cadenas ligeras o pesadas (en el caso de la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de dichas moléculas). Por lo tanto, dichos anticuerpos pueden usarse para producir moléculas de unión triespecíficas de la presente invención cuyo sitio A, sitio B o sitio C son capaces de unirse a un epítopo de dichos antígenos asociados a enfermedades.

I. Primera cadena polipeptídica preferida

Una primera cadena polipeptídica de una molécula de unión triespecífica preferida de la presente invención comprenderá un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo I (VLi), un dominio de cadena pesada variable capaz de unirse al epítopo II (VHⁱⁱ ), un resto de cisteína o dominio que contiene cisteína y un dominio promotor de heterodímeros y un dominio CH2-CH3.

Dado que los dominios de cadena ligera variable y cadena pesada variable del primer polipéptido se dirigen hacia diferentes epítopos, no pueden asociarse para formar un dominio de unión que sea capaz de unirse al epítopo I o al epítopo II. Los dominios de cadena ligera variable y de cadena pesada variable del primer polipéptido están separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que es suficientemente corto como para impedir sustancialmente la asociación de estos dominios. Un enlazador ilustrativo, denominado "Enlazador 1", tiene la secuencia SEQ ID NO: 1): GGGSGGGG.

El dominio de cadena pesada variable del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros de ese polipéptido están preferentemente separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que contiene 1, 2, 3 o más restos de cisteína. Un dominio contiene cisteína ("Enlazador 2") preferido tiene la secuencia SEQ ID NO: 2:

GGCGGG. De forma alternativa o adicional, se puede utilizar un dominio promotor de heterodímeros que contiene cisteína, como se describe más adelante.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, uno o más restos de cisteína (o dominio que contiene cisteína, tal como un péptido enlazador que contiene cisteína) se incorporará en la primera cadena polipeptídica (y/o en la segunda, tercera, cuarta o más cadenas polipeptídicas de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención) para unir covalentemente dos de dichas cadenas polipeptídicas entre sí, mientras que en realizaciones equivalentes, dicho resto o restos de cisteína se pueden incorporar en un dominio promotor de heterodímeros, o en otro dominio para lograr el mismo resultado.

El dominio promotor de heterodímeros del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros del segundo polipéptido se seleccionan de forma coordinada. Los dominios se diferencian entre sí y están diseñados para asociarse entre sí para promover la asociación de la primera y la segunda cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, uno de los dominios promotores de heterodímeros se diseñará por ingeniería genética para tener una carga negativa a pH 7, mientras que la otra de las dos cadenas polipeptídicas se diseñará por ingeniería genética para tener una carga positiva a pH 7. La presencia de dichos dominios cargados promueve la asociación entre el primer y el segundo polipéptidos y, por lo tanto, fomenta la heterodimerización. Es indiferente qué dominios promotores de heterodímeros se proporcionan a qué cadena, siempre que los dominios empleados en la primera y segunda cadenas polipeptídicas difieran para fomentar la heterodimerización entre dichas cadenas.

En una realización preferida, el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica es un dominio de "espiral E" (SEQ ID NO: 3): EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK, o un domino de "espiral K" (SEQ ID NO:4): KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKE. Más preferentemente, la primera cadena polipeptídica poseerá un dominio de "espiral E". La primera cadena polipeptídica puede contener solamente un único separador de espiral de este tipo, o puede contener más de uno de dichos separadores de espiral (por ejemplo, dos separadores) y puede tener la misma carga, preferentemente de carga opuesta.

En una realización preferida, el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica comprenderá cuatro dominios helicoidales de "espiral E" en tándem (SEQ ID NO: 3: EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK), cuyos restos de glutamato formarán una carga negativa a pH 7, o cuatro dominios de "espiral K" en tándem (SEQ ID ⁿO: 4: KVAALKE -KVAALKE -KVAALKE-KVAALKE), cuyos restos de lisina formarán una carga positiva a pH 7. La presencia de dichos dominios cargados promueve la asociación entre la primera y la segunda cadenas polipeptídicas y, por lo tanto, fomenta la heterodimerización. Se prefiere especialmente un dominio promotor de heterodímeros en el que uno de los cuatro dominios helicoidales de "espiral E" en tándem de SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4 se haya modificado para contener un resto de cisteína: EVAAc Ek -EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO:115) o en el que uno de los cuatro dominios helicoidales de "espiral K" en tándem de SEQ ID NO: 4 se haya modificado para contener un resto de cisteína: KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE (SEQ ID NO:116). Otros dominios de espiral E y espiral K que pueden emplearse de acuerdo con la presente invención se desvelan en: Woolfson, D.N. (2005) "The Design Of Coiled-Coil Structures And Assemblies," Adv. Prot. Chem. 70:79-112, Straussman, R. et al. (2007) "Kinking the Coiled Coil - Negatively Charged Residues at the Coiled-coil Interface," J. Molec. Biol. 366:1232-1242; Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of the E3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt, K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domains of a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol.

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323:345-362; y Zeng, Y. et al. (2008) "A Ligand-Pseudoreceptor System Based On de novo Designed Peptides For The Generation Of Adenoviral Vectors With Altered Tropism," J. Gene Med. 10:355-367.

Preferentemente, el dominio promotor de heterodímeros empleado y el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica están separados entre sí por un péptido enlazador que contiene cisteína intermedio que proporciona una estabilización mejorada al promotor de heterodímeros. Un péptido enlazador que contiene cisteína preferido ("Enlazador 3") tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5): DKTHTCPPCP.

La secuencia de aminoácidos de un dominio CH2-CH3 de tipo silvestre es la siguiente (el posicionamiento es como en el índice EU como en Kabat et al. (1992) SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Publicación de los National Institutes of Health N.° 91-3242) (SEQ ID NO:6):

En algunos sistemas de expresión, el resto de aminoácido C-terminal del dominio CH3 puede eliminarse postraduccionalmente. En consecuencia, el resto C-terminal del dominio CH3 es un resto de aminoácido opcional.

El dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica se modificará preferentemente para promover la heterodimerización entre el dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica (véase más adelante). Por ejemplo, una sustitución de aminoácidos (preferentemente una sustitución con un aminoácido que comprende un grupo lateral voluminoso que forma un "botón", p. ej., triptófano) se puede introducir en el dominio CH2 o CH3 de la primera cadena polipeptídica de manera que la interferencia estérica evitará la interacción con un dominio mutado de manera similar y obligará al dominio mutado a emparejarse con un dominio en el que se haya modificado por ingeniería genética una mutación complementaria o adaptativa, es decir, "el ojal" (por ejemplo, una sustitución con glicina). Dichas series de mutaciones pueden modificarse por ingeniería genética en cualquier par de polipéptidos que comprenda la molécula de diacuerpo y, además, modificarse por ingeniería genética en cualquier porción de las cadenas polipeptídicas de dicho par. Los métodos de modificación por ingeniería genética de proteínas para favorecer la heterodimerización con respecto a la homodimerización son bien conocidos en la técnica, en particular con respecto a la modificación por ingeniería genética de moléculas similares a inmunoglobulinas, y están incluidas en el presente documento (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.695.936 y la publicación de patente 2007/0196363, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270: 26-35, y Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101. Se crea un botón preferido modificando un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366W. Se crea un ojal preferido modificando un dominio Fc de IgG nativo para que contenga la modificación T366S, L368A y Y407V. Para ayudar a purificar las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, la cadena polipeptídica que contiene las mutaciones de ojal comprende además una sustitución en la posición 435 (H435R) para eliminar el sitio de unión a la proteína A. Por lo tanto, los homodímeros de polipéptidos que contienen las mutaciones de ojal no se unirán a la proteína A, mientras que las moléculas de unión triespecíficas que se forman como resultado de los heterodímeros que contienen botón y ojal conservarán su capacidad para unirse a la proteína A a través del sitio de unión de la proteína A en la cadena polipeptídica que contiene la mutación de botón.

El dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica se modificará preferentemente para reducir o suprimir la unión del Fc a los receptores Fc. Tales mutaciones son bien conocidas en la técnica e incluyen sustituciones en las posiciones 234, 235, 265 y 297 (véase la patente de Estados Unidos n° 5.624.821). Las sustituciones preferidas incluyen una o más de L234a y l235A, D265a y N297Q.

Preferentemente, por lo tanto, el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica tendrá la secuencia "portadora del botón" (SEQ ID NO: 7):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RW SVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEK TISK A K GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHNHYTQKS LSLSPGK

o la secuencia "portadora del ojal" con una sustitución H435R para suprimir la unión a la proteína A (SEQ ID NO: 8):

APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVKFNWYVD

GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RW SVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA

PIEK T ISK A K GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE

WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE

ALHNRYTQKS LSLSPGK

Se prefiere que la primera cadena polipeptídica tenga una secuencia CH2-CH3 "portadora del botón", tal como la de la SEQ ID NO: 7.

Como se reconocerá, se podría emplear un dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (por ejemplo, SEQ ID NO: 8) en la primera cadena polipeptídica, en cuyo caso, se emplearía un dominio CH2-CH3 "portador del botón" (por ejemplo, SEQ ID NO: 7) en la tercera cadena polipeptídica.

Por lo tanto, en resumen, una primera cadena polipeptídica preferida de una molécula de unión triespecífica preferida de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio VLI)-(Enlazador 1)-(Dominio VHn)-(Domimo que contiene cisteína (Enlazador 2))-(Dominio promotor de heterodímero de espiral E)-(Enlazador 3)-(Dominio CH2-CH3 portador del botón) o (Dominio VLi)-(Enlazador 1)-(Dominio VHii Dominio)-(Enlazador 2)-(Dominio promotor de heterodímero de espiral electrónica que contiene cisteína)-(Enlazador 3)-(Dominio CH2-CH3 portador del botón o (Dominio VLi)-(Enlazador 1)-(Dominio VHii)-(Enlazador 2)-(Dominio promotor de heterodímeros de espiral E que contiene cisteína)-(Enlazador 3)-(Dominio CH2-CH3 portador del botón).

2. Segunda cadena polipeptídica preferida

Una segunda cadena polipeptídica de dichas moléculas de unión triespecíficas preferidas comprenderá, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo II (VLii), un dominio de cadena pesada variable capaz de unirse al epítopo I (VHi), un resto de cisteína o dominio que contiene cisteína y un dominio promotor de heterodímeros.

Dado que los dominios de cadena ligera variable y cadena pesada variable del segundo polipéptido se dirigen hacia diferentes epítopos, no pueden asociarse para formar un dominio de unión que sea capaz de unirse al epítopo I o al epítopo II. Los dominios de cadena ligera variable y de cadena pesada variable del segundo polipéptido están separados entre sí por un péptido enlazador intermedio que es suficientemente corto como para impedir sustancialmente la asociación de estos dominios. El "Enlazador 1", que tiene la secuencia (SEQ ID NO:1):

GGGSGGGG es un enlazador ilustrativo para este propósito.

Como ocurre en el caso de la primera cadena polipeptídica, el dominio de cadena pesada variable del segundo polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros de ese polipéptido están preferentemente separados entre sí por un dominio que contiene cisteína que contiene 1, 2, 3 o más restos de cisteína. El "Enlazador 2", que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 2) GGCGG^g es un enlazador ilustrativo para este propósito. Dichos restos de cisteína pueden formar enlaces disulfuro con restos de cisteína en el péptido espaciador que contiene cisteína que separa el dominio de cadena pesada variable del primer polipéptido y el dominio promotor de heterodímeros de ese polipéptido. Por lo tanto, el primer y segundo polipéptidos de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se unen covalentemente entre sí. Como alternativa, se puede utilizar un dominio promotor de heterodímeros que contiene cisteína, como se describe anteriormente.

Como se ha analizado anteriormente, el dominio promotor de heterodímeros de la segunda cadena polipeptídica se selecciona coordinado con el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica. Por lo tanto, en una realización preferida, el dominio promotor de heterodímeros de la primera cadena polipeptídica es un dominio "espiral K" (p. ej., SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 116) o un dominio de "espiral E" (p. ej., SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 115). Dado que la primera cadena polipeptídica preferentemente poseerá un dominio de "espiral E", la segunda cadena polipeptídica contendrá preferentemente un dominio de "espiral K".

Como la primera y segunda cadenas polipeptídicas son cadenas polipeptídicas de un diacuerpo, pueden asociarse para formar un dominio de unión al dominio I (VLa/ VHa) que reconoce y se une inmunoespecíficamente al epítopo I, y un dominio de unión al dominio II (VLb/ VHb) que reconoce y se une inmunoespecíficamente al epítopo II.

Por lo tanto, en resumen, una segunda cadena polipeptídica preferida de una molécula de unión triespecífica preferida de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio VLii )-(Enlazador 1)-(Dominio VHi )-(Dominio que contiene cisteína (Enlazador 2))-(Dominio promotor de heterodímero de espiral K) o (Dominio VL ⁱⁱ )-(Enlazador 1)-(Dominio VHI)-(Enlazador 2)-(Dominio promotor de heterodímero de espiral K que contiene cisteína).

3. Tercera cadena polipeptídica preferida

Una tercera cadena polipeptídica de una molécula de unión triespecífica preferida de la presente invención es un polipéptido que comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de unión, un dominio que contiene cisteína que puede comprender opcionalmente un dominio CH1-bisagra y un dominio CH2-CH3. El dominio de unión de la tercera cadena polipeptídica de una molécula de unión triespecífica preferida de la presente invención puede ser un dominio de cadena pesada variable capaz de unirse al epítopo III. (VHiii), en cuyo caso, la cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención (analizadas más adelante) es un polipéptido que comprende un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo III (VLiii), de manera que el dominio de unión es capaz de unirse inmunoespecíficamente a un antígeno que posee el epítopo III. Como alternativa, el dominio de unión de la tercera cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención puede comprender un dominio de unión de tipo receptor de célula T, en cuyo caso, la cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención (analizadas más adelante) es un polipéptido que comprende un dominio de unión de tipo receptor de célula T complementario, de manera que la interacción de dos cadenas polipeptídicas forma un dominio de unión que es capaz de unirse fisioespecíficamente a una molécula de antígeno presentada en el complejo MHC dispuesto en la superficie de una célula. La tercera cadena polipeptídica puede aislarse a partir de anticuerpos naturales. Como alternativa, puede construirse de forma recombinante. Un dominio CH1 ilustrativo es un dominio CH1 de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:9):

ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV

HTFPAVLQSS G L Y SLSSW T VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV

Un dominio de bisagra ilustrativo es un dominio de bisagra de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:10): EPKSCDKTHTCPPCP. Como se reconocerá, el dominio de bisagra ilustrativo comprende múltiples restos de cisteína (Elkabetz et al. (2005) "Cysteines In CH1 Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains," J. Biol. Chem. 280:14402-14412) que pueden participar en la unión covalente entre cadenas. Como alternativa, se puede emplear un dominio que contiene cisteína diferente (por ejemplo, un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos: VEPKSC (SEQ ID NO:12), AEPKSC (SEQ ID NO:127), GVEPKSC (SEQ ID NO:133) o GGCGGG (SEQ ID NO:2)).

Aunque se puede emplear un dominio CH2-CH3 de tipo silvestre, se prefiere, tal como se ha descrito anteriormente, emplear un dominio CH2-CH3 modificado que promueva la heterodimerización con el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica.

Preferentemente, por lo tanto, el dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica será un dominio CH2-CH3 "portador del ojal" cuya secuencia de aminoácidos es complementaria al dominio CH2-CH3 "portador del botón" (SEQIDNO:7) empleado en el primer polipéptido. Como se ha analizado anteriormente, el dominio CH2-CH3 portador del ojal preferentemente debe comprender una sustitución en la posición 435 (H435R) para eliminar el sitio de unión de la proteína A. Un ejemplo de dominio CH2-CH3 "portador del ojal" con la sustitución H435R para el tercer polipéptido es la SEQ ID NO: 8.

Como se reconocerá, podría emplearse un dominio CH2-CH3 "portador del botón" (por ejemplo, SEQ ID NO: 7) en la tercera cadena polipeptídica, en cuyo caso, se emplearía un dominio CH2-CH3 "portador del ojal" (por ejemplo, SEQ ID NO: 8) en la primera cadena polipeptídica.

En la realización en la que la tercera (y cuarta) cadenas polipeptídicas de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención comprenden, cada una, una cadena polipeptídica de un dominio de unión de tipo receptor de célula T, se reconoció el antígeno mostrado en una superficie celular en el contexto del MHC de clase I. Los métodos son bien conocidos en la técnica para producir tales dominios de unión de tipo receptor de células T (por ejemplo, el documento US2012/0294874A1).

Por lo tanto, en resumen, una tercera cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio VHm)-(Dominio que contiene cisteína (opcionalmente un dominio CH1 y/o un dominio de bisagra)-(Dominio CH2-CH3 portador del ojal), o (Dominio de enlace de tipo receptor; primer o segundo polipéptido del mismo)-(Dominio que contiene cisteína (opcionalmente un dominio CH1 y/o un dominio de bisagra)-(Dominio CH2-CH3 portador del ojal).

4. Cuarta cadena polipeptídica preferida

Una cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención es bien un polipéptido de un dominio de unión de tipo receptor (en donde la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas forman un dominio de unión de tipo receptor), o más preferentemente, una porción polipeptídica de una cadena ligera del anticuerpo indicado anteriormente que se une inmunoespecíficamente al epítopo III y/o que es complementaria al dominio de unión de la tercera cadena polipeptídica.

Por lo tanto, en donde el tercer y cuarto polipéptidos forman un dominio de unión de tipo Fab de tal forma que la cuarta cadena polipeptídica comprende, en la dirección N-terminal a C-terminal, un dominio de cadena ligera variable capaz de unirse al epítopo III (VLm) y un dominio que contiene cisteína para promover la unión covalente a la tercera cadena polipeptídica o un dominio de unión y dicho dominio que contiene cisteína para promover la unión covalente a la tercera cadena polipeptídica. Dicho dominio que contiene cisteína puede ser un dominio CL o una porción del mismo que contiene cisteína, tal como (SEQ ID NO: 11) FNRGEC o (s Eq ID NO: 128) GFNRGEC o un enlazador tal como el enlazador 2 (que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 2) GGCGGG. Un péptido que contiene cisteína ilustrativo que forma enlaces disulfuro con dicho enlazador 2 comprende la secuencia de aminoácidos VEPKSC (SEQ ID NO:12) o un dominio de bisagra.

La cuarta cadena polipeptídica puede aislarse a partir de anticuerpos naturales. Como alternativa, puede construirse de forma recombinante. Un dominio CL preferido es un dominio Kappa CL de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:13):

RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASW CLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG

NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK

SFNRGEC

Como alternativa, un dominio CL ilustrativo es un dominio Lambda2 CL de IgG1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14):

QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA

GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP

TECS

Como se observará, el dominio CL, u otro dominio que contenga cisteína, de la cuarta cadena polipeptídica comprende un resto de cisteína que puede unirse covalentemente a un resto de cisteína del dominio que contiene cisteína de la tercera cadena polipeptídica (p. ej., un dominio CH1) para formar, de este modo, un complejo covalente de la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención entre sí. Por lo tanto, la tercera y cuarta cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí.

De manera adicional, los restos de cisteína del dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica pueden formar enlaces disulfuro con restos de cisteína del dominio CH2-CH3 de la tercera cadena polipeptídica. Por lo tanto, la primera y la tercera cadenas polipeptídicas se unen covalentemente entre sí.

Por lo tanto, en resumen, una cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención comprenderá los dominios y enlazadores: (Dominio VLm)-(dominio que contiene cisteína (opcionalmente un dominio CL), o (Dominio de unión de tipo receptor; primer o segundo polipéptido del mismo)-(dominio que contiene cisteína (opcionalmente un dominio CL).

C. Primera cadena polipeptídica alternativa

En una realización, las orientaciones de los dominios descritos anteriormente estarán en la dirección N-terminal a C-terminal. La presente invención, sin embargo, también contempla una variación de la misma, donde las orientaciones de los dominios de la primera cadena polipeptídica son: NH2-(Dominio CH3-CH2 portador del botón)-(Dominio VLi)-(Enlazador 1)-(Dominio VHn)-(Enlazador 2)-(dominio promotor de heterodímeros de espiral E).

Preferentemente, un dominio que contiene cisteína está presente, N-terminal a dicho dominio CH2-CH3. La secuencia de un péptido ilustrativo es (SEQ ID NO: 5): DKTHTCPPCP, sin embargo, se pueden emplear enlazadores alternativos, por ejemplo, EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:129) o LEPKSSDKTHTCPPCP; SEQ ID NO:130). Preferentemente, en esta realización, el dominio CH3 está separado del Dominio VLⁱ por un enlazador peptídico intermedio, como uno que tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15): APSSS y, más preferentemente, la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 16) APSSSPME, sin embargo, se pueden emplear enlazadores alternativos, por ejemplo, ASTKG (SEQ ID NO:131), LEPKSS (SEQ ID NO:132), GGC o GGG.

D. Dominio de unión a albúmina

Como se desvela en el documento WO 2012/018687, para mejorar las propiedades farmacocinéticas de los diacuerpos in vivo, un diacuerpo puede modificarse para que contenga una porción polipeptídica de una proteína de unión al suero en uno o más de los extremos del diacuerpo. Tales consideraciones también son aplicables a las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. Lo más preferentemente, cuando se desea incorporar una porción polipeptídica de una proteína de unión a suero en las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, dicha porción polipeptídica se instalará en el extremo C de una de las cadenas polipeptídicas de la molécula de unión triespecífica.

La albúmina es la proteína más abundante en el plasma y tiene una semivida de 19 días en los seres humanos. La albúmina posee varios sitios de unión a moléculas pequeñas que le permiten unirse de manera no covalente a otras proteínas y, por lo tanto, prolongar su semivida en suero. El dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa de Streptococcus G148 consta de 46 restos de aminoácidos que forman un paquete estable de tres hélices y tiene una amplia especificidad de unión a albúmina (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120. Por lo tanto, una porción polipeptídica particularmente preferida de una proteína de unión al suero para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un diacuerpo in vivo es el dominio de unión a albúmina (ABD) de la proteína estreptocócica G y, más preferentemente, el dominio de unión a albúmina 3 (ABD3) de la proteína G de la cepa de Streptococcus G148 (SEQ ID NO: 123): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP.

Como se desvela en el documento WO 2012/162068, las variantes "desinmunizadas" de SEQ ID NO: 123 tienen la capacidad de atenuar o eliminar la unión al MHC de clase II. Según los resultados de mutaciones combinatorias, se considera que las siguientes combinaciones de sustituciones son sustituciones preferidas para formar dicho un dominio de unión a albúmina desinmunizado: 66S/70S 71A; 66S/70S 79A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A+66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. Las variantes de ABD que tienen las modificaciones L64A, I65A y D79A o las modificaciones N66S, T70S y D79A. La variante de ABD desinmunizado que tiene la secuencia de aminoácidos:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA64A65NNAKT VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ ID NO:124),

o la secuencia de aminoácidos:

LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS66NAKS70 VEGVKALIA79E ILAALP (SEQ ID NO:125), son particularmente preferidas ya que dichos dominios de unión a albúmina desinmunizados muestran una unión sustancialmente de tipo silvestre al tiempo que proporcionan una unión atenuada al MHC de clase II. Aunque tales dominios de unión a albúmina pueden incorporarse en cualquiera de las cadenas polipeptídicas de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, se prefiere colocar dicho dominio en C-terminal al dominio de la espiral E (o espiral K) de la primera o tercera cadenas polipeptídicas (a través de un enlazador que se interpone entre el dominio de la espiral E (o espiral K) y el dominio de unión a albúmina (que es preferentemente un dominio de unión a albúmina desinmunizado). Una secuencia preferida para dicho enlazador es la SEQ ID NO: 126: GGGS.

E. Funcionalidad del dominio Fc

En una realización, el dominio CH2-CH3 de la primera cadena polipeptídica y el dominio CH2-CH3 del tercer polipéptido formarán un complejo para formar un dominio Fc que es sustancialmente incapaz de unirse a un receptor Fc (es decir, unirse a menos del 10 % de la extensión de un Dominio Fc de tipo silvestre. Como alternativa, el dominio Fc de dichas moléculas será capaz de unirse al receptor Fc en condiciones fisiológicas, de manera que dichas moléculas de unión triespecíficas serán tetraespecíficas, capaces de mediar la unión coordinada a cuatro moléculas (epítopo I, epítopo II y epítopo III, y un receptor Fc). Lo más preferentemente, dichas moléculas capaces de unirse al receptor Fc mediarán adicionalmente la función efectora dependiente de receptor Fc.

La invención también abarca moléculas que comprenden dominios Fc variantes que comprenden una o más sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre comparable. Las moléculas que comprenden dominios Fc variantes normalmente tienen fenotipos alterados con respecto a las moléculas que comprenden dominios Fc de tipo silvestre El fenotipo variante puede expresarse como semivida sérica modificada, una estabilidad modificada, susceptibilidad a enzimas celulares modificada o función efectora modificada según lo determinado en un ensayo dependiente de células NK o dependiente de macrófagos. Las modificaciones del dominio Fc identificadas como modificaciones que alteran la función efectora son conocidas en la técnica, incluyendo modificaciones que aumentan la unión a receptores activadores (p. ej., F^cyRIIA (CD16A) y reducen la unión a receptores inhibidores (p. ej., F^cyRIIB (CD32B) (véase, por ejemplo, Stavenhagen, J.B. et al. (2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890). Las variantes ilustrativas de dominios Fc de IgG1 humana con unión reducida a CD32B y/o unión aumentada a CD16A contienen sustituciones F243L, R292P, Y300L, V305I o P296L. Estas sustituciones de aminoácidos pueden estar presentes en un dominio Fc de IgG1 humana en cualquier combinación. En una realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R292P y Y300L. En otra realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución F243L, R292P, Y300L, V305I y P296L. En otra realización, la variante del dominio Fc de IgG1 humana contiene una sustitución N297Q, sustituciones L234A y L235A o una sustitución D265A, ya que estas mutaciones anulan la unión de FcR.

III. Ejemplificación de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención: Moléculas de unión triespecíficas que tienen dominios de unión que se unen a epítopos de CD3 y CD8 y a un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad

Como se ha explicado anteriormente, la presente invención se refiere particularmente a la realización de moléculas de unión triespecíficas en las que los tres epítopos se seleccionan de tal manera que uno o dos de dichos epítopos son epítopos de una célula del sistema inmunitario, y especialmente, una célula del sistema inmunitario de linfocitos citotóxicos (CTL), y en la que el epítopo o los epítopos restantes son epítopos de un antígeno asociado a enfermedad. En una realización particularmente preferida de dicha molécula de unión triespecífica, los dominios de unión de dicha molécula se seleccionan de manera que el epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de CD3, un segundo del epítopo I, epítopo II o el epítopo III es un epítopo de CD8 y el tercero del epítopo I, epítopo II o epítopo III es un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad, en donde los dominios de unión I, II y III de dichas moléculas de unión triespecíficas median la unión coordinada de una célula T citotóxica y una célula que expresa el antígeno asociado a enfermedad. Dichas moléculas de unión triespecíficas son capaces de localizar un linfocito citotóxico en una célula que expresa un antígeno asociado a enfermedad, y de ese modo facilitar la muerte de las células que expresan el antígeno asociado a enfermedad. El antígeno asociado a enfermedad puede ser un antígeno de cáncer o puede ser un antígeno característico de una infección por patógenos patógeno (p. ej., bacteriana, fúngica, vírica o protozoaria). Más particularmente, la invención se refiere a dichas moléculas de unión triespecíficas que son capaces de mediar la unión coordinada a: (1) un epítopo de CD3, (2) un epítopo de CD8 y (3) un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad. Al unirse a CD3 y CD8, y al antígeno asociado a enfermedad, dichas moléculas colocalizan las células T citotóxicas en células que presentan el antígeno asociado a enfermedad, conduciendo a la activación de dichas células T y al inicio de una respuesta citotóxica contra las células que expresan el antígeno asociado a enfermedad.

Las cadenas pesadas de un anticuerpo anti-CD3 o anti-CD8 pueden emplearse como la tercera cadena polipeptídica de dichas moléculas de unión triespecíficas ilustrativas de la presente invención. De forma análoga, las cadenas ligeras de dichos anticuerpos pueden emplearse como la cuarta cadena polipeptídica de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. Como alternativa, los dominios variables de cadena ligera y/o los dominios variables de cadena pesada de dichos anticuerpos pueden combinarse con otras regiones constantes de inmunoglobulina para lograr dichas cadenas polipeptídicas tercera y cuarta. Por lo tanto, dichos anticuerpos pueden usarse para producir moléculas de unión triespecíficas de la presente invención cuyo sitio C es capaz de unirse a CD3 o CD8.

De forma similar, dichos dominios variables se pueden incorporar en las porciones del dominio variable del primer y tercer polipéptido de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención para producir moléculas de unión específicas de la presente invención cuyo sitio A es capaz de unirse a CD3. o CD8, o cuyo Sitio B es capaz de unirse a CD3 o CD8.

1. Anticuerpos anti-CD3 ilustrativos

Cualquiera de los anticuerpos anti-CD3 o anti-CD8 ilustrativos proporcionados más adelante puede emplearse para preparar los dominios de unión a CD3 o CD8 de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención. OKT3

Dominio variable de cadena ligera de OKT3 (SEQ ID NO: 17) (las CDR se muestran subrayadas):

QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCS A SSSV S YMNWYQQKSG TSPKRWIYDT

SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSN P F T F GSG

TKLEINR

Dominio variable de cadena pesada de OKT3 (SEQ ID NO: 18) (Loa CDR se muestran subrayadas):

QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY

INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY

DDHYCLDYWG QGTTLTVSSA KTTAPSVYPL APVCGDTTGS SVTLGCLVKG

YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVT SS

M291

Dominio variable de cadena ligera de M291 (SEQ ID NO: 19) (las CDR se muestran subrayadas):

DIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWTYDT

SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DADTYYCQQW S S N P P T FGSG

TKLEIK

Dominio variable de cadena pesada de M291 (SEQ ID NO: 20) (Las CDR se muestran subrayadas):

QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFI SYTMHWVKQR PGQGLEWIGY

INPRSGYTHY NQKLKDKATL TADKSSSSAY MQLSSLTSED SAVYYCARSA

YYDYDGFAYW GQGTLVTVSA YTH12.5

Dominio variable de cadena ligera de YTH12.5 (SEQ ID NO: 21) (las CDR se muestran subrayadas):

MGWSCIILFL VATATGVHSD IQLTQPNSVS TSLGSTVKLS CTLSSGNIEN

NYVHWYQLYE GRSPTTMIYD DDKRPDGVPD RFSG SID RSS NSAFLT1HNV

A IED EA IY FC HSYVSSFNVF GGGTKLTVLR

Dominio variable de cadena pesada de YTH12.5 (SEQ ID NO: 22) (Loa CDR se muestran subrayadas):

MGWSCIILFL VATATGVHSE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS

FPMAWVRQAP GKGLEWVSTI STSGGRTYYR DSVKGR F T IS RDNSKNTLYL

QMNSLRAEDT AVYYCAKFRQ YSGGFDYWGQ GTLVTVSS

Anticuerpo 1 anti-CD3 humanizado ("mAb 1 de CD3 ") (US2014/0099318A1)

Variante 1 del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 de CD3 (SEQ ID NO: 23) (las CDR se muestran subrayadas):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT I T C SASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRLIYDS

SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLT ISS L Q PE DFATYYCQQW SR N PPTFGGG

TKVEIK

Variante 2 del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 de CD3 (SEQ ID NO: 24) (las CDR se muestran subrayadas):

DW MTQSPAI MSAFPGEKVT I T C SASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDS

SKLASGVPSR FSGSGSGTEF T L T ISSLQ PE DFATYYCQQW SR N PPTFGGG

TKVEIK

Variante 1 del dominio variable de cadena pesada de mAb 1 de CD3 (SEQ ID NO: 25) (las CDR se muestran subrayadas):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT RSTMHWVRQA PGQGLEWIGY

INPSSAYTNY NQKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCASPQ

VHYDYNGFPY WGQGTLVTVS S

Anticuerpo 2 anti-CD3 humanizado ("mAb 2 de CD3 ") (US2014/0099318A1)

Dominio variable de cadena ligera de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 26) (las CDR se muestran subrayadas):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG

Dominio variable de cadena pesada de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 27) (las CDR se muestran subrayadas):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS

Variante D65G de dominio variable de cadena pesada de mAb 2 de CD3 (SEQ ID NO: 28) (las CDR se muestran subrayadas):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS

2. Anticuerpos anti-CD8 ilustrativos

OKT8 ("mAb 1 de CD8")

Dominio variable de cadena ligera de OKT8 (SEQ ID NO: 29) (las CDR se muestran subrayadas):

DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT IS C RASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV

L I YLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY

TFGGGTKLEI KR

Dominio variable de cadena pesada de OKT8 (SEQ ID NO: 30) (Loa CDR se muestran subrayadas):

QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY

IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF

RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS TRX2 ("mAb 2 de CD8")

Dominio variable de cadena ligera de TRX2 (SEQ ID NO: 31) (las CDR se muestran subrayadas):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C KGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN

TD ILH TGVPS RFSGSGSGTD F T F T IS S L Q P EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG

TKVEIK

Dominio variable de cadena pesada de TRX2 (SEQ ID NO: 32) (Loa CDR se muestran subrayadas):

QVQLVESGGG W QPG RSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL

IYYDGSNKFY ADSVKGR FTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH

YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S

3. Dominios de unión ilustrativos que se unen a epítopos de antígenos asociados a enfermedad

(a) gp41 de VIH

Un antígeno asociado a enfermedad ilustrativo es gp41 del VIH. Un anticuerpo de gp41 ilustrativo es 7B2 ("mAb 1 de VIH").

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de 7B2 (SEQ ID NO: 35):

DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP

KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH

P P T FGHGTRV E IK

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de 7B2 (SEQ ID NO: 36):

QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY

ISKNGEYSKY SPSSNG RFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD

GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS

(b) gp120 de VIH

Un segundo antígeno asociado a enfermedad ilustrativo es gp120 del VIH. Un anticuerpo de gp120 ilustrativo es A32 ("mAb 2 de VIH").

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera VL de A32 (SEQ ID NO: 33):

QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII

SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTD1HNFV

FGGGTKLTVL

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada VH de A32 (SEQ ID NO: 34):

QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI

GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG

TRLRTLRNAF DIWGQGTMVT VSS

(c) Glicoproteína F del RSV

Otro antígeno asociado a enfermedad ilustrativo es la glucoproteína F del RSV. Un anticuerpo contra la glucoproteína F del RSV ilustrativo es palivizumab ("mAb 1 de RSV").

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de palivizumab (SEQ ID NO: 37):

DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT

SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQ PD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG

TKLEIK

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de palivizumab (SEQ ID NO: 38):

QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL

ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS

MITNWYFDVW GAGTTVTVSS

(d) B7-H3

Un antígeno asociado a enfermedad ilustrativo particularmente preferido es B7-H3, que se expresa en una variedad de células cancerosas (p. ej., neuroblastomas, cánceres gástrico, de ovario y de pulmón no microcítico, etc.). Se ha detectado inmunohistológicamente la expresión de la proteína B7-H3 en líneas de células tumorales (Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-y Production," Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 101(34): 12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168:6294-6297). Se ha encontrado expresión de ARNm en corazón, riñón, testículos, pulmón, hígado, páncreas, próstata, colon y células osteoblásticas (Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223,1-223,7). A nivel de proteína, B7-H3 se encuentra en el hígado humano, pulmón, vejiga, testículos, próstata, mama, placenta y órganos linfoides (Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 105(30): 10277-10278). Los anticuerpos ilustrativos que se unen a B7-H3 incluyen "BRCA84D", "BRCA69D" y "PRCA157" humanizados (documento WO 2011/109400). Las cadenas variables ligeras y pesadas ilustrativas tienen las siguientes secuencias (las CDR se muestran subrayadas):

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de BRCA84D-5VL humanizado ilustrativo (SEQ ID NO: 39):

D IQ LTQ SPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKALIYS

ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ

GTKLEIK

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de BRCA84D-2VH humanizado ilustrativo (SEQ ID NO: 40):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY

ISSD S SA IY Y ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR

ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

Secuencia de aminoácidos del domino variable de cadena ligera de BRCA69D ilustrativo ("mAb 1 de B7-H3") (SEQ ID NO: 41):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C RASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS S L Q P EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIK

Secuencia de aminoácidos del domino variable de cadena pesada de BRCA69D ilustrativo ("mAb 1 de B7-H3") (SEQ ID NO: 42):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT

IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG

IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de PRCA157 ilustrativo (SEQ ID NO: 43):

DIQMTQSPAS LSVSVGETVT IT C RA SESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN

TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG

GGTNLEIK

Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de PRCA157 ilustrativo (SEQ ID NO: 44):

EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT

INSGGSNTYY PDSLKGR F T I SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD

GGAMDYWGQG TSVTVSS

(e) Antígeno tumoral A33

El antígeno tumoral A33 es otro antígeno asociado a enfermedad ilustrativo. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-A33 humanizado ilustrativo ("mAb 1 de gpA33") es (SEQ ID NO: 45):

QIVLTQSPAI MSASPGERVT MTCS A R S S IS FMYWYQQKPG SSPRLLIYDT

SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQW SSY PL T FGSG

TKLELKR

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo anti-A33 humanizado ilustrativo (mAb 1 de gpA33) es (SEQ ID NO: 46):

QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFS GSWMNWVKQR PGQGLEWIGR

IYPGDGETNY NGKFKDKATL TADKSSTTAY MELSSLTSVD SAVYFCARIY

GNNVYFDVWG AGTTVTVSS

(f) Antígeno tumoral 5T4

El antígeno tumoral 5T4 es otro antígeno asociado a enfermedad ilustrativo. La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo mAb 1 anti-5T4 humanizado ilustrativo ("mAb 1 de 5T4") es (SEQ ID NO: 47):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT IT C RASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR

ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ

GTKLEIK

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho mAb 1 de 5T4 humanizado ilustrativo es (SEQ ID NO: 48):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR

IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN

PYYPMDYWGQ GTTVTVSS

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de un segundo anticuerpo mAb 2 de 5T4 humanizado ilustrativo ("mAb 2 de 5T4") es (SEQ ID NO: 49):

DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS I S C R S S Q S IV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK

L L IY KVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP

FTFGSGTKLE IK

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho segundo mAb 2 de 5T4 humanizado ilustrativo es (SEQ ID NO: 50):

QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD

IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG

P L F T T W D PN SYAMDYWGQG TSVTVSS

(g) Antígeno ROR1

El antígeno tumoral ROR1 es otro antígeno asociado a enfermedad ilustrativo. Los anticuerpos anti-ROR1 ilustrativos incluyen el anticuerpo 2A2 (documento WO 2010/124188), R11 (documento WO 2012/075158) y R12 (documento WO 2012/075158).

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo 2A2 es (SEQ ID NO: 53):

DIVMTQSQKI MSTTVGDRVS ITCKASQNVD AAVAWYQQKP GQSPKLLIYS

ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNMQS EDLADYFCQQ YDIYPYTFGG

GTKLEIK

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo 2A2 es (SEQ ID NO: 54):

QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFS DYEMHWVIQT PVHGLEWIGA

IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TADKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCTGYY

DYDSFTYWGQ GTLVTVSA

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo R11 es (SEQ ID NO: 55):

ELVMTQTPSS TSGAVGGTVT IN C Q ASQ SID SN LAWFQQKP G Q P P T L L IY R

A S N LA S GVPS RFSGSRSGTE Y T LT IS G V Q R EDAATYYCLG GVGNVSYRTS

FG G G TEVW K

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo R11 es (SEQ ID NO: 56):

QSVKESEGDL V TP A G N LTLT C TASG SDIND Y P IS WVRQAP G K G LE W IG F I

NSGGSTWYAS WVKGR F T IS R TSTTVDLKM T S LTTD D TA TY FCARGYSTYY

G D F N IWGPGT L V T IS S

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo R12 es (SEQ ID NO: 57):

E LV LTQ S P S V S A A LG S P A K I TC TLSSAH KT D T ID WYQQLQ GEAPRYLMQV

QSDGSYTKRP GVPDRFSGSS S G A D R Y L IIP SVQADDEADY YCGADYIGGY

VFGGGTQLTV TG

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada del anticuerpo R12 es (SEQ ID NO: 58):

QEQLVESGGR LV TP G G S LTL SCKASGFDFS AYYMSWVRQA PG KG LEW IAT

IY P S S G K T Y Y ATW VNG RFTI SSDNAQNTVD LQMNSLTAAD RATYFCARDS

Y A D D G A LF N I W G PG TLVTIS S

Otro anticuerpo anti-ROR1 humanizado ilustrativo ("mAb 1 de ROR1") tiene un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 51):

Q LVLTQ SPSA SASLG SSVKL TC TLSSGHKT D T ID WYQQQP GKAPRYLMKL

EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS S S G A D R Y LTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN

YLFGGGTQLT V L

----

La secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de dicho mAb 1 de ROR1 humanizado más preferido es (SEQ ID NO: 52):

QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWVRQA PGKGLEWVAT

IY P S S G K T Y Y ADSVKGR F T I SSDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDS

Y A D D A A L F D I WGQGTTVTVS S

IV. Selección del sitio de unión: Sitio A, Sitio B y Sitio C

Como se indica anteriormente, las moléculas de unión triespecíficas preferidas de la presente invención son al menos triespecíficas, que tienen un dominio de unión de tipo diacuerpo "externo" (sitio A) que se encuentra más alejado de un dominio de unión III, un dominio de unión de tipo diacuerpo "interno" (sitio B) que se encuentra más cercano a un dominio de unión III, y el propio dominio de unión III (Sitio C). Tal como se usa en el presente documento, una descripción de una molécula de unión triespecífica tal como "X/Y/Z" indica que el dominio de unión X está en el sitio A, el dominio de unión Y está en el sitio B y el dominio de unión Z está en el sitio C. Por ejemplo, la designación de molécula de unión triespecífica "mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8"indica que los dominios variables del mAb 1 de B7-H3 ocupan el sitio A de la molécula de unión triespecífica, los dominios variables de mAb 2 de CD3 ocupan el sitio B y los dominios variables de mAb 1 de CD8 ocupan el sitio C de la molécula de unión triespecífica.

Por tanto, la presente invención permite la elección de cuál de dichos sitios se utilizará para unir un epítopo deseado en particular. Un factor para guiar dicha selección, particularmente con moléculas de unión triespecíficas que se unen a CD3, CD8 y a un antígeno asociado a enfermedad, implica una consideración del efecto y la conveniencia de la trogocitosis. La "trogocitosis" es un proceso mediante el cual una célula puede adquirir una porción de la membrana celular de una célula en contacto (Masuda, S. et al. (2013) "Possible Implication Of Fc y Receptor-Mediated Trogocytosis In Susceptibility To Systemic Autoimmune Disease," Clin. Dev. Immunol. 2013: ID del artículo 345745, 6 páginas); Dhainaut, M. et al. (2014) "Regulation of Immune Reactivity by Intercelular Transfer," Front Immunol. 5:112; Ahmed, K.A. et al. (2011) "Mechanisms Of Cellular Communication Through Intercellular Protein Transfer," J. Cell. Mol. Med. 15(7):1458-1473; Ahmed, K.A. et al. (2008) "Intercellular Trogocytosis Plays An Important Role In Modulation Of Immune Responses," Cell. Mol. Immunol. 5(4):261-269; LeMaoult, J. et al. (2007) "Exchanges Of Membrane Patches (Trogocytosis) Split Theoretical And Actual Functions Of Immune Cells," Hum. Immunol. 68(4):240-243; Caumartin. J. et al. (2006) "Intercellular Exchanges Of Membrane Patches (Trogocytosis) Highlight The Next Level Of Immune Plasticity," Transpl. Immunol. 17(1):20-22).

La adquisición de ligandos afines del MHC de clase I por trogocitosis induce a los linfocitos T citotóxicos a convertirse en células "Treg adquiridas" que median en la muerte ("fratricidio") de otras células T citotóxicas, contribuyendo, de este modo, al aclaramiento de las células CD8+ (D'Acquisto, F. et al. (2011) "CD3+ CD4- CD8-(Double Negative) T Cells: Saviours Or Villains Of The Immune Response?" Biochem. Pharmacol. 82:333-340; Joly, E. et al. (2003) "What Is Trogocytosis And What Is Its Purpose?" Nat. Immunol. 4:815-; Hudrisier, D. et al. (2007) "Capture Of Target Cell Membrane Components Via Trogocytosis Is Triggered By A Selected Set Of Surface Molecules On T Or B Cells," J. Immunol. 178:3637-3647).

Una molécula de unión triespecífica de la presente invención que posee un dominio de unión a CD3 como su posición de sitio C tiene los atributos de un anticuerpo anti-CD3, y también una molécula de unión triespecífica que posee un dominio de unión a CD8 como su posición de sitio C tiene los atributos de un anticuerpo anti-CD8. Se ha demostrado que un neutrófilo, monocito o macrófago que tiene un receptor Fc que está unido al dominio Fc de un anticuerpo anti-CD8 (que se ha unido a una molécula CD8 de una célula T) es capaz de transferir el anticuerpo y la molécula CD8 unida desde la célula T a sí misma por trogocitosis e internalizar después rápidamente el anticuerpo; las moléculas vecinas, tal como TCR y CD3 también se pueden transferir en este proceso (Masuda, S. et al., (2013) "Possible Implication of Fcg Receptor-Mediated Trogocytosis in Susceptibility to Systemic Autoimmune Disease," Clin. Develop. Immunol. 2013:ID del artículo 345745, 6 páginas).

Las estructuras de CD3 y CD8 difieren en que CD3 se encuentra cerca de la membrana celular, mientras que CD8 se extiende más lejos de la membrana celular. Por tanto, se espera que la trogocitosis del receptor Fc de CD3 por un anticuerpo anti-CD3 sea más eficaz que la trogocitosis del receptor Fc de CD8 por un anticuerpo anti-CD8.

Este fenómeno indica que una molécula de unión triespecífica de la presente invención que se une a CD3, CD8 y a un antígeno asociado a enfermedad cuyo dominio de unión a CD3 se encuentra en la posición del sitio C mostrarán menos citotoxicidad que una molécula de unión triespecífica análoga en la que el dominio de unión a CD3 se encuentra en el sitio A o en el sitio B. Por lo tanto, al elegir colocar el dominio de unión a CD3 en la posición del sitio C (a diferencia de los sitios A o B), se puede modular el grado de citotoxicidad. De manera adicional, se pueden componer composiciones farmacéuticas que contienen una mezcla de un CD3 en el "Sitio C" y uno en el "Sitio A (o B)" para obtener un grado preferido de citotoxicidad.

V. Anticuerpo mAb 1 anti-ROR1

También se describe un anticuerpo anti-ROR1 humanizado ("mAb 1 de ROR1"), cuyo dominio variable de cadena ligera tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 51):

QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT D T ID WYQQQP GKAPRYLMKL

EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN

YLFGGGTQLT VL

y cuyo dominio variable de cadena pesada tiene la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 52):

QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWVRQA PGKGLEWVAT

IYPSSGKTYY ADSVKGR F T I SSDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDS

YADDAALFDI WGQGTTVTVS S

Las secuencias de CDR^l1, CDR^l2 y CDR^l3 del dominio variable de cadena ligera de dicho anticuerpo mAb 1 de ROR1 son:

CDRl1 del dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 117): TLSSGHKTDTID

CDR^l2 del dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 118): LEGSGSY

CDRl3 del dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 119): GTDYPGNYL

Las secuencias de CDR^h1, CDR^h2 y CDR^h3 del dominio variable de cadena pesada de dicho anticuerpo mAb 1 de ROR1 son:

CDR^hI del dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 120): GFTFSDYYMS

CDR^h2 del dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 121): TIYPSSGKTYYADSVKG

CDRh3 del dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 122): DSYADDAALFDI

El anticuerpo mAb 1 de ROR1 media el aumento de la citotoxicidad y es menos inmunogénico en relación con los anticuerpos anti-ROR1 de la técnica anterior (por ejemplo, el anticuerpo anti-ROR1 R12).

No solo se describen dichas secuencias, sino también se describen derivados de anticuerpo mAb 1 de ROR1 intactos (incluidos los derivados quiméricos o humanizados de los mismos) que poseen 1, 2 o 3 de las CDR de dicho dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 51, CDR mostradas subrayadas) o 1, 2 o 3 de las CDR de dicho dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 52; CDR mostradas subrayadas), y que se unen inmunoespecíficamente a ROR1. Más preferentemente, dichos anticuerpos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados abarcados poseerán 1, 2 o 3 de las CDR de dicho dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 51, CDR mostradas subrayadas) y también 1, 2 o 3 de las CDR de dicho dominio variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 52; CDR mostradas subrayadas) y se unirán inmunoespecíficamente a ROR1. Lo más preferentemente, dichos anticuerpos abarcados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados poseerán las 3 CDR de dicho dominio variable de cadena ligera y las 3 CDR de dicho dominio variable de cadena pesada y serán capaces de unirse inmunoespecíficamente a ROR1.

También se describen fragmentos y derivados de dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 abarcados, incluyendo Fab, Fab', F(ab')2 Fv), monocatenario (scFv), "BiTE®", moléculas de diacuerpo "DART™", mutantes de los mismos, variantes de origen natural y proteínas de fusión, todos los cuales comprenden 1, 2 o 3 de las CDR de dominio variable de cadena ligera, o 1, 2 o 3 de las CDR de dominio variable de cadena pesada, o 1, 2 o 3 de las CDR de dominio variable de cadena ligera, y también 1, 2 o 3 de las CDR de dominio variable de cadena pesada, y que son capaces de unirse inmunoespecíficamente a ROR1.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden tener dominios Fc variantes. La modificación del dominio Fc normalmente conduce a un fenotipo alterado, por ejemplo, una semivida en suero alterada, una estabilidad modificada, una susceptibilidad alterada a las enzimas celulares o una función efectora alterada. Puede ser deseable modificar el anticuerpo con respecto a la función efectora, para mejorar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. La reducción o eliminación de la función efectora es deseable en ciertos casos, por ejemplo en el caso de anticuerpos cuyo mecanismo de acción implica bloqueo o antagonismo, pero sin destruir a las células que portan un antígeno diana. Una función efectora aumentada es deseable en general cuando se dirige a células indeseables, tales como células tumorales y extrañas, donde los FcyR se expresan en niveles bajos, por ejemplo, células B específicas de tumor con niveles bajos de F^cyRIIB (p. ej., linfoma no Hodgkin, CLL y linfoma de Burkitt). Las moléculas con actividad de función efectora conferida o potenciada son útiles para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad, un trastorno o una infección cuando se desea una eficacia mejorada de la actividad de la función efectora.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender una o más modificaciones de los aminoácidos del dominio Fc, que reducen la afinidad y la avidez del dominio Fc de dicha molécula por uno o más receptores FcyR. Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender una o más modificaciones de los aminoácidos del dominio Fc que aumentan la afinidad y la avidez del dominio Fc de dicha molécula por uno o más receptores FcyR. Las moléculas pueden comprender un dominio Fc variante en donde dicha variante confiere o media una actividad ADCC aumentada y/o una unión aumentada a F^cyRIIA, con respecto a una molécula que no comprende ningún dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. Las moléculas pueden comprender un dominio Fc variante en donde dicha variante confiere o media una actividad ADCC (u otra función efectora) disminuida y/o una unión aumentada a FcyRIIB, con respecto a una molécula que no comprende ningún dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre.

También se describen dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados, que comprenden un dominio Fc variante, sin que dicho dominio Fc variante muestre una unión detectable a ningún FcyR, en relación con una molécula comparable que comprende el dominio Fc de tipo silvestre. También se describen dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados, que comprenden un dominio Fc variante, en donde dicho dominio Fc variante solo se une a un único F^cyR, preferentemente uno de F^cyRIIA, F^cyRIIB o F^cyRIIIA.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender afinidades alteradas por un receptor Fcy activador y/o inhibidor. El anticuerpo o molécula comprende un dominio Fc variante que tiene mayor afinidad por F^cyRIIB y menor afinidad por F^cyRIIIA y/o F^cyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre. Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender un dominio Fc variante que tiene una afinidad disminuida por FcyRIIB y una afinidad aumentada por FcyRIIIA y/o F^cyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre. Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender un dominio Fc variante que tiene una afinidad disminuida por F^cyRIIB y una afinidad disminuida por F^cyRIIIA y/o F^cyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre. Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender un dominio Fc variante que tiene una afinidad sin cambios por FcyRIIB y una afinidad disminuida (o aumentada) por F^cyRIIIA y/o F^cyRIIA, con respecto a una molécula comparable con un dominio Fc de tipo silvestre.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados que comprenden un dominio Fc variante con una afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIA de manera que la inmunoglobulina tiene una función efectora potenciada, por ejemplo, ADC^c . Ejemplos no limitantes de funciones de células efectoras incluyen ADCC, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés), fagocitosis, opsonización, opsonofagocitosis, unión a células, restablecimiento, unión a C1q y CDC.

La alteración en la afinidad o función efectora es de al menos 2 veces, preferentemente al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces, al menos 10 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces, en relación con una molécula comparable que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. El dominio Fc variante se puede unir específicamente a uno o más FcR con al menos un 65 %, preferentemente al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 100 %, 125 %, 150 %, 175 %, 200 %, 225 % o 250 % más de afinidad con respecto a una molécula que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. Tales mediciones pueden ser ensayos in vivo o in vitro y, preferentemente, son ensayos in vitro tales como ELISA o ensayos de resonancia de plasmón de superficie.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos o derivados pueden comprender un dominio Fc variante en donde dicha variante agoniza al menos una actividad de un receptor F^cyR o antagoniza al menos una actividad de un receptor F^cyR. Las moléculas pueden comprender una variante que agoniza (o antagoniza) una o más actividades de FcyRIIB, por ejemplo, la señalización mediada por receptores de células B, la activación de células B, la proliferación de células B, la producción de anticuerpos, el flujo de entrada de calcio intracelular de células B, la progresión del ciclo celular, la inhibición de la señalización de FceRI mediada por FcyRIIB, la fosforilación de F^cyRIIB, el reclutamiento de SHIP, la fosforilación de SHIP y la asociación con Shc, o la actividad de una o más moléculas aguas abajo (por ejemplo, MAP quinasa, JNK, p38 o Akt) en la ruta de transducción de señales de FcyRIIB. Las moléculas pueden comprender una variante que agoniza (o antagoniza) una o más actividades de FceRI, por ejemplo, la activación de mastocitos, la movilización del calcio, la desgranulación, la producción de citocinas o la liberación de serotonina.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden comprender un dominio que comprende un dominio Fc de dos o más isotipos de IgG (p. ej., lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4). Los diversos isotipos de IgG presentan diferentes propiedades físicas y funcionales, incluida la semivida en suero, fijación del complemento, afinidades de unión a FcyR y actividades de función efectora (por ejemplo, ADCC, CDC, etc.) debido a diferencias en las secuencias de aminoácidos de sus dominios bisagra y/o Fc, por ejemplo, como se describe en Flesch, BK y Neppert, J. (1999) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G," J. Clin. Lab. Anal. 14:141-156; Chappel, M.S. et al. (1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma Rl Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody," J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel, M.S. et al. (1991) "Identification Of The Fc Gamma Receptor Class l Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant lgG1/lgG2 Hybrid And Point-Mutated Antibodies," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:9036-9040; Bruggemann, M. et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of Chimeric Antibodies," J. Exp. Med 166:1351-1361. Este tipo de dominio Fc variante puede usarse solo o en combinación con una modificación de aminoácidos, para afectar a la función efectora mediada por Fc y/o la actividad de unión. En combinación, la modificación de aminoácidos y la bisagra de IgG/Dominio Fc pueden mostrar una funcionalidad similar (por ejemplo, mayor afinidad por FcyRIIA) y pueden actuar de forma aditiva o, más preferentemente, de forma sinérgica para modificar la funcionalidad efectora en la molécula, en relación con una molécula que comprende un dominio Fc de tipo silvestre. La modificación de aminoácidos y el dominio Fc de IgG pueden mostrar una funcionalidad opuesta (por ejemplo, mayor y menor afinidad por FcyRIIA, respectivamente) y pueden actuar para atenuar o reducir selectivamente una funcionalidad específica en la molécula, en relación con una molécula que no comprende un dominio Fc o que comprende un dominio Fc de tipo silvestre del mismo isotipo.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden comprender un dominio Fc variante, en donde dicho dominio Fc variante comprende al menos una modificación de aminoácidos con respecto a la región Fc de tipo silvestre, de tal forma que la molécula tiene una afinidad por un FcR alterada, siempre que dicho dominio Fc variante no tenga una sustitución en posiciones que hagan contacto directo con FcyR basándose en el análisis cristalográfico y estructural de las interacciones Fc-FcR tales como las desveladas por Sondermann, P. et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human lgG1 Fc Fragment-Fc GammaRlll Complex, "Nature 406:267-273. Son ejemplos de posiciones dentro del dominio Fc que hacen contacto directo con FcyR los restos de aminoácidos 234-239 (región bisagra), los restos de aminoácidos 265-269 (bucle B/C), los restos de aminoácidos 297-299 (bucle C'/E) y los restos de aminoácidos 327-332 (bucle F/G). Las moléculas pueden comprender dominios Fc variantes. Los dominios comprenden la modificación de al menos un resto que no entra en contacto directo con un FcyR basándose en el análisis estructural y cristalográfico, por ejemplo, no está dentro del sitio de unión de F^c-F^cyR.

Los dominios Fc variantes son bien conocidos en la técnica, y se puede usar cualquier variante de Fc conocida para conferir o modificar la función efectora mostrada por dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos que comprenden un dominio Fc (o porción del mismo) como se ensaye funcionalmente, por ejemplo, en un ensayo dependiente de los linfocitos Nk o dependiente de macrófagos. Por ejemplo, Las variantes del dominio Fc identificadas como que alteran la función efectora se desvelan en las publicaciones del PCT n.° WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; WO 2008/140603 y se puede utilizar cualquier variante adecuada desvelada en las mismas en las presentes moléculas.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden comprender un dominio Fc variante, que tiene una o más modificaciones de aminoácidos en uno o más sitios, alterando dicha o dichas modificaciones (con respecto a un dominio Fc de tipo silvestre) la relación de afinidades del dominio Fc variante por un FcyR activador (tal como F^cyRIIA o F^cyRIIIA) con respecto a un F^cyR inhibidor (tal como F^cyRIIB):

Cambio del tipo silvestre a la variante en afinidad por FcYRactivador

Relación de afinidades = -----------------------------------------------------------------------------------------Cambio del tipo silvestre a la variante en afinidad por FcYRinhibidor

Cuando una variante de Fc tiene una relación de afinidades mayor que 1, los métodos tienen un uso particular para proporcionar un tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad, trastorno, o infección, o la mejora de un síntoma de la misma, donde se desea una mayor eficacia de la función de la célula efectora (por ejemplo, ADCC) mediada por F^cyR, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad infecciosa. Cuando una variante de Fc tiene una relación de afinidades inferior a 1, los métodos tienen un uso particular para proporcionar un tratamiento terapéutico o profiláctico de una enfermedad o trastorno, o la mejora de un síntoma del mismo, donde se desea una eficacia disminuida de la función de la célula efectora mediada por F^cyR, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios o inflamatorios. La tabla 3 enumera mutaciones sencillas, dobles, triples, cuádruples y quíntuples ilustrativas en función de si su relación de afinidades es mayor o menor que 1, y se puede encontrar más información sobre estas mutaciones en las publicaciones del PCT n.° WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; WO 2008/140603.

continuación

En los dominios Fc variantes, se puede realizar cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 235, 240, 241, 243, 244, 247, 262, 263, 269, 298, 328 o 330 y, preferentemente, en uno o más de los siguientes restos: A240, 1240, L241, L243, H244, N298, 1328 o V330. En los dominios Fc variantes, se puede realizar cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 268, 269, 270, 272, 276, 278, 283, 285, 286, 289, 292, 293, 301, 303, 305, 307, 309, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439 y, preferentemente, en uno o más de los siguientes restos: H280, Q280, Y280, G290, S290, T290, Y290, N294, K295, P296, D298, N298, P298, V298, 1300 o L300.

En dominios Fc variantes que se unen a un F^cyR con una afinidad alterada, se puede realizar cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 373, 376, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Preferentemente, la variante del dominio Fc tiene cualquiera de los siguientes restos: A256, N268, Q272, D286, Q286, S286, A290, S290, A298, M301, A312, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, N326, S326, K330, T339, A333, A334, E334, H334, L334, M334, Q334, V334, K335, Q335, A359, A360 o A430.

En dominios Fc variantes que se unen a un FcyR (a través de su dominio Fc) con una afinidad reducida, se puede realizar cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 252, 254, 265, 268, 269, 270, 278, 289, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303, 322, 324, 327, 329, 333, 335, 338, 340, 373, 376, 382, 388, 389, 414, 416, 419, 434, 435, 437, 438 o 439.

En los dominios Fc variantes que se unen a un FcyR (a través de su dominio Fc) con una afinidad potenciada, se puede realizar cualquier modificación de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones) en cualquiera de las posiciones 280, 283, 285, 286, 290, 294, 295, 298, 300, 301, 305, 307, 309, 312, 315, 331, 333, 334, 337, 340, 360, 378, 398 o 430. Los dominios Fc variantes que se unen a F^cyRIIA con una afinidad potenciada pueden incluir cualquiera de los siguientes restos: A255, A256, A258, A267, A268, N268, A272, Q272, A276, A280, A283, A285, A286, D286, Q286, S286, A290, S290, M301, E320, M320, Q320, R320, E322, A326, D326, E326, S326, K330, A331, Q335, A337 o A430.

Las variantes preferidas incluyen una o más modificaciones en cualquiera de las posiciones: 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 262, 263, 264, 265, 266, 271, 273, 275, 281, 284, 291, 296, 297, 298, 299, 302, 304, 305, 313, 323, 325, 326, 328, 330 o 332.

Las variantes particularmente preferidas incluyen una o más modificaciones seleccionadas de los grupos A-AI:

continuación

Las variantes aún más particularmente preferidas incluyen una o más modificaciones seleccionadas de los grupos 1­ 105:

continuación

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden comprender un dominio Fc variante que tiene al menos una modificación en el dominio Fc. El dominio Fc variante comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L, en donde dicha numeración es la del índice EU de Kabat. El dominio Fc variante puede comprender:

(A) al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; (B) al menos dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L y P396L;

(2) F243L y R292P; y

(3) R292P y V305I;

(C) al menos tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P y Y300L;

(2) F243L, R292P y V305I;

(3) F243L, R292P y P396L; y

(4) R292P, V305I y P396L;

(D) al menos cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L y P396L; y

(2) F243L, R292P, V305I y P396L; o

(E) al menos las cinco sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; y

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L.

El dominio Fc variante puede comprender sustituciones de:

(A) F243L, R292P y Y300L;

(B) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L; o

(C) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden poseer cualquier variante de Fc conocida en la técnica, tal como las desveladas en Jefferis, R. et al. (2002) "Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic Antibodies For Improved Function," Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001) "Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001) "High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgG1 For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgG1 Variants With Improved Binding To The Fc gamma R," J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E. et al. (2000) "Mapping Of The C1q Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol.

164:4178-84; Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4," J. Immunol. 164:1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterization of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Armour, K.L. et al. (1999) "Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities," Eur. J. Immunol. 29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996) "Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions," Immunol. Lett. 54:101-04; Lund, J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma Receptor I And Influence The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains," J. Immunol. 157:4963-4969; Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, And Reduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-1H," Proc. Nat1. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:11980-84; Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17; Lund, J. et al. (1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors," FASEB J. 9:115-19; Alegre, M.L. et al. (1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57:1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma R11," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al. (1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol.

147:2657-2662; Duncan, A.R. et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564; las patentes de Estados Unidos n.° 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; 7.276.586; y 7.317.091; y las publicaciones del PCT WO 00/42072 y PCT WO 99/58572.

Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden comprender además uno o más sitios de glicosilación, de modo que uno o más restos de carbohidratos se unen covalentemente a la molécula. Preferentemente, dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos con uno o más sitios de glicosilación y/o una o más modificaciones en el dominio Fc confieren o tienen una función efectora mediada por anticuerpos potenciada, por ejemplo, una actividad de ADCC mejorada, en comparación con los anticuerpos o el fragmento de mAb 1 de ROR1 no modificados. También se describen dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos que se sabe directa o indirectamente que interaccionan con un resto de carbohidrato del dominio Fc, incluidos, pero sin limitación, los aminoácidos en las posiciones 241, 243, 244, 245, 245, 249, 256, 258, 260, 262, 264, 265, 296, 299 y 301. En la técnica se conocen aminoácidos que interaccionan directa o indirectamente con un resto de carbohidrato de un domino Fc, véase, por ejemplo, Jefferis, R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44:111-17.

También se describen dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos que se han modificado mediante la introducción de uno o más sitios de glicosilación en uno o más sitios de las moléculas, preferentemente sin alterar la funcionalidad de las moléculas, por ejemplo, la actividad de unión al antígeno diana o F^cyR. Se pueden introducir sitios de glicosilación en la región variable y/o constante de las moléculas. Tal como se usa en el presente documento, "sitios de glicosilación" incluye cualquier secuencia de aminoácidos específica de un anticuerpo a la que se unirá un oligosacárido (es decir, carbohidratos que contienen dos o más azúcares sencillos unidos entre sí) de forma específica y covalente. Las cadenas laterales de oligosacárido típicamente están unidas a la cadena principal de un anticuerpo a través de enlaces N u O. La N-glicosilación se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a la cadena lateral de un resto de asparagina. La O-glicosilación se refiere a la unión de un resto de oligosacárido a un hidroxiaminoácido, por ejemplo, serina, treonina. Dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos pueden comprender uno o más sitios de glicosilación, incluyendo sitios de N-glicosilación y O-glicosilación. Puede utilizarse cualquier sitio de glicosilación para la glicosilación ligada a N o ligada a O conocido en la técnica. Un sitio de glicosilación ligado a N ilustrativo es la secuencia de aminoácidos: Asn-X-Thr/Ser, en donde X puede ser cualquier aminoácido y Thr/Ser indica una treonina o una serina. Dicho sitio o sitios pueden introducirse en una molécula usando métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, IN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson, et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, capítulo 8, págs. 106­ 116. Un método ilustrativo para introducir un sitio de glicosilación en dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos puede comprender: modificar o mutar una secuencia de aminoácidos de la molécula de modo que se obtenga la secuencia Asn-X-Thr/Ser deseada, o expresar un anticuerpo mAb 1 de ROR1 que codifica una molécula de ácido nucleico que tiene dicha secuencia.

También se describen métodos para modificar el contenido de carbohidratos de dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 0 sus fragmentos añadiendo o eliminando un sitio de glicosilación. Métodos para modificar el contenido de carbohidratos de los anticuerpos (y moléculas que comprenden dominios de anticuerpo, por ejemplo, domino Fc) son bien conocidos en la técnica, véanse, por, ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 6.218.149; el documento EP 0 359 096 B1; la publicación de Estados Unidos n.° US 2002/0028486; WO 03/035835; la publicación de Estados Unidos n.° 2003/0115614; la patente de Estados Unidos n.° 6.218.149; la patente de los Estados Unidos n.° 6.472.511. También se describen métodos para modificar el contenido de carbohidratos de dichos anticuerpos mAb 1 de ROR1 o sus fragmentos eliminando uno o más restos de carbohidratos endógenos de la molécula. También se describe el desplazamiento del sitio de glicosilación del dominio Fc de un anticuerpo, mediante la modificación de las posiciones adyacentes a 297. También se describe la modificación de la posición 296, de modo que la posición 296 y no la posición 297 esté glicosilada.

La función efectora se puede modificar mediante técnicas tales como las descritas en las publicaciones del PCT n.° WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; WO 2008/140603 o por otros medios. Por ejemplo, pueden introducirse uno o más restos de cisteína en el dominio Fc, permitiendo de este modo la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región, obteniéndose como resultado la generación de un anticuerpo homodimérico que puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor muerte de células mediada por el complemento y ADCC. Véase Caron, P.C. et al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies," J. Exp. Med. 176:1191-1195; Shopes, B. (1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced Cytolytic Activity," J. Immunol. 148(9):2918-2922. Pueden prepararse también anticuerpos homodiméricos con la actividad antitumoral potenciada utilizando agentes de entrecruzamiento heterobifuncionales tales como los que se describen en Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565. Como alternativa, puede diseñarse mediante ingeniería genética un anticuerpo que tiene dominios Fc duales y puede de este modo potenciarse la lisis por el complemento y las capacidades de ADCC (Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual Fc Domains (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge," Anti-Cancer Drug Design 3:219-230.

El hecho de que una alteración de un solo aminoácido de un resto de CDR puede dar como resultado la pérdida de la unión funcional (Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 (6):1979-1983) proporciona un medio para identificar sistemáticamente secuencias de CDR funcionales alternativas. En un método preferido para obtener dichas CDR variantes, se somete a mutagénesis un polinucleótido que codifica la CDR (por ejemplo, mediante mutagénesis aleatoria o mediante un método dirigido al sitio (por ejemplo, amplificación mediada por la cadena de polimerasa con cebadores que codifican el locus mutado)) para producir una CDR que tiene un resto de aminoácido sustituido. Comparando la identidad del resto relevante en la secuencia de CDR original (funcional) con la identidad de la secuencia de CDR variante sustituida (no funcional), se puede identificar la puntuación de sustitución BLOSUM62.iij para esa sustitución. El sistema BLOSUM proporciona una matriz de sustituciones de aminoácidos creada mediante el análisis de una base de datos de secuencias para alineaciones confiables (Eddy, S.R. (2004) "Where Did The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8): 1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acid substitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:10915-10919; Karlin, S. et al. (1990) "Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino Acid Substitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol. Biol. 219, 555-565. En la actualidad, la base de datos BLOSUM más avanzada es la base de datos BLOSUM62 (BLOSUM62.iij). La tabla 4 presenta las puntuaciones de sustitución BLOSUM62.iij (cuanto más alta es la puntuación, más conservativa es la sustitución y, por tanto, es más probable que la sustitución no afecte la función). Si un fragmento de unión a antígeno que comprende la CDR resultante no se une a ROR1, por ejemplo, entonces la puntuación de sustitución BLOSUM62.iij se considera insuficientemente conservativa, y se selecciona una nueva sustitución candidata y se produce teniendo una puntuación de sustitución más alta. Por lo tanto, por ejemplo, si el resto original era glutamato (E) y el resto sustituto no funcional era histidina (H), entonces la puntuación de sustitución BLOSUM62.iij será 0, y se prefieren cambios más conservativos (tales como aspartato, asparagina, glutamina o lisina).

Por tanto, la invención contempla el uso de mutagénesis aleatoria para identificar CDR mejoradas. La tecnología de presentación en fagos se puede utilizar alternativamente para aumentar (o disminuir) la afinidad de las CDR. Esta tecnología, conocida como maduración por afinidad, emplea mutagénesis o "avance de CDR" y la reselección usa el antígeno diana o un fragmento antigénico del mismo para identificar anticuerpos que tienen CDR que se unen con mayor (o menor) afinidad al antígeno en comparación con el anticuerpo inicial o precursor (véase, por ejemplo, Glaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903). La mutagenización de codones completos en lugar de nucleótidos simples da como resultado un repertorio semialeatorizado de mutaciones de aminoácidos. Es posible construir bibliotecas que consisten en una combinación de clones variantes, cada uno de los cuales difiere en modificaciones de un solo aminoácido en una sola CDR y que contienen variantes que representan cada posible sustitución de aminoácidos para cada resto de CDR. Los mutantes con afinidad de unión aumentada (o disminuida) por el antígeno pueden explorarse poniendo en contacto los mutantes inmovilizados con antígeno marcado. Puede usarse cualquier método de exploración conocido en la técnica para identificar anticuerpos mutantes con afinidad por el antígeno aumentada o disminuida (p. ej., ELISA) (véase Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 95:6037; Yelton et al., 1995, J. Immunology 155:1994). Se puede usar el avance de CDR que aleatoriza la cadena ligera (véase, Schier et al., 1996, J. Mol. Bio. 263:551).

Métodos para lograr dicha maduración por afinidad se describen, por ejemplo, en: Krause, J.C. et al. (2011) "An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody," MBio.

2(1) pii: e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) "Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas," Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) "Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes," J. Mol. Biol.

401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) "Affinity Maturation And Characterization Of A Human Monoclonal Antibody Against HIV-1 gp41," MAbs 1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) "Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth," Virology 393(1): 112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) "Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For AntiRAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions," J. Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) "Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development," Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl, S. et al. (2008) "In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification," Mol. Immunol. 46(1): 135-144; y Barderas, R. et al. (2008) "Affinity maturation of antibodies assisted by in silico modeling," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 105(26):9029-9034. Como ejemplo, las placas de pocillos múltiples se pueden recubrir con un anticuerpo mAb 1 de ROR1 seleccionado (por ejemplo, 100 ng/pocillo en tampón de carbonato a temperatura ambiente durante 2 horas) y posteriormente se pueden incubar con ROR1 soluble añadido a una dilución de 1/10 y se incuban a temperatura ambiente. durante 16 horas o diluir a una concentración de 50 ng/ml en PBS-T-BSA (se añaden 0,05 ml a cada pocillo e incuban durante al menos 2 h a temperatura ambiente). A continuación, se lava la placa y se añaden diluciones de anticuerpos recombinantes a partir de 0,5 pg/ml en PBS-T-BSA y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se mide la unión de anticuerpos recombinantes al antígeno capturado usando, por ejemplo, un conjugado anti-IgG humana-HRP y sustrato TMB. Después de detener el desarrollo del color con ácido sulfúrico diluido, la placa se lee a 450 nM y se identifican anticuerpos de mayor afinidad (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 7.351.803).

VI. Composiciones farmacéuticas

La presente invención comprende composiciones farmacéuticas. Pueden ser útiles para el tratamiento de un cáncer o una enfermedad que se caracteriza por la presencia de un antígeno asociado a enfermedad. Dichas composiciones incluyen composiciones de fármaco a granel útiles para la fabricación de composiciones farmacéuticas (por ejemplo, composiciones impuras o no estériles) y composiciones farmacéuticas (es decir, composiciones que sean apropiadas para la administración a un sujeto o paciente) que puedan usarse en la preparación de formas farmacéuticas unitarias. También se describen tales composiciones que comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de un diacuerpo modificado, o una combinación de dichos agentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, las composiciones de la invención comprenden una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de una o más moléculas de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden tales diacuerpos modificados y un segundo anticuerpo terapéutico que es específico para un antígeno de enfermedad particular, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tal como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" denotan un enfoque para obtener un resultado beneficioso o deseado que incluye preferentemente un resultado clínico beneficioso o deseado. Dichos resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: reducir la proliferación de (o destruir) células infectadas u otras células enfermas, disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, aumentar la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los receptores de animales de compañía.

En una realización específica, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que se ha aprobado por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos(véase, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (2012) Allen, Loyd V., Jr. (Ed.) 22a edición, Pharmaceutical Press, Londres, Reino Unido). El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante (p. ej., adyuvante de Freund (completo e incompleto), excipiente o portador con el que se administra el agente terapéutico. Dichos vehículos farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los procedentes del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como el aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un vehículo preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Se pueden emplear también soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones de la invención se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición se va a administrar por infusión, puede dispensarse con un frasco de infusión que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica estéril. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

Las composiciones de la invención pueden formularse en sus formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin limitación, las formadas con aniones tales como los derivados del ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc.

También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes que contienen un diacuerpo modificado, solo o con dicho vehículo farmacéuticamente aceptable. De manera adicional, también se puede incluir uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento de una enfermedad en el paquete o kit farmacéutico. También se describe un paquete o kit farmacéutico que comprende uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Opcionalmente asociado a dicho envase o envases puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o productos biológicos, reflejando dicho aviso la aprobación por la agencia de fabricación, uso o venta para administración humana.

También se describen los kits que se pueden utilizar en los métodos anteriores. Un kit puede comprender una o más moléculas de la invención. Un kit puede comprender además uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos útiles para el tratamiento del cáncer o una enfermedad caracterizada por la presencia de un antígeno asociado a enfermedad, en uno o más recipientes. Un kit puede comprender además uno o más anticuerpos o diacuerpos que se unen a uno o más antígenos asociados a enfermedad. El otro agente profiláctico o terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico. El agente profiláctico o terapéutico puede ser un agente terapéutico biológico u hormonal.

VII. Métodos para producir las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se producen más preferentemente a través de la expresión recombinante de moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos, como se sabe bien en la técnica.

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar convenientemente usando síntesis de péptidos en fase sólida (Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis," Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

En una alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de forma recombinante y expresarse usando cualquier método conocido en la técnica. Los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante aislando primero los anticuerpos producidos en animales hospedadores, obteniendo la secuencia génica y usando la secuencia génica para expresar el anticuerpo de manera recombinante en células hospedadoras (por ejemplo, células CHO). Otro método que puede emplearse es expresar la secuencia de anticuerpos en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han desvelado métodos adecuados para expresar anticuerpos de forma recombinante en plantas o leche (véase, por ejemplo, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; y Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157). Son bien conocidos en la técnica métodos adecuados para preparar derivados de anticuerpos, p. ej., quiméricos, humanizados, monocatenarios, etc. En otra alternativa, los anticuerpos se pueden producir de forma recombinante mediante tecnología de presentación en fagos (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; 6.265.150; y Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12,433-455).

Los anticuerpos o la proteína de interés pueden someterse a secuenciación mediante degradación de Edman, que es bien conocida para los expertos en la materia. La información de péptidos generada por espectrometría de masas o degradación de Edman se puede usar para diseñar sondas o cebadores que se usan para clonar la proteína de interés.

Un método alternativo de clonación de la proteína de interés es mediante "panning" usando proteínas purificadas o porciones de las mismas para las células que expresan el anticuerpo o proteína de interés. El procedimiento de "panning" puede realizarse obteniendo una biblioteca de ADNc de tejidos o células que expresan o sobreexpresan los ADNc deseados en un segundo tipo de célula, y explorando las células transfectadas del segundo tipo de célula para una unión específica a la proteína deseada. En la técnica se pueden encontrar descripciones detalladas de los métodos utilizados en la clonación de genes de mamíferos que codifican proteínas de superficie celular mediante "panning'' (véase, por ejemplo, Aruffo, A. et al. (1987) "Molecular Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency C^o S Cell Expression System," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 84:8573-8577 y Stephan, J. et al. (1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation," Endocrinol. 140:5841-5854).

Se puede obtener ADNc que codifica anticuerpos y otros agonistas de péptidos, antagonistas y moduladores de péptidos mediante la transcripción inversa de los ARNm de un tipo de célula particular de acuerdo con métodos convencionales en la técnica. Específicamente, el ARNm puede aislarse utilizando varias enzimas líticas o soluciones químicas de acuerdo con los procedimientos establecidos en Sambrook et al., supra o se extraen mediante resinas de unión a ácidos nucleicos disponibles siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes (p. ej., Qiagen, Invitrogen, Promega). Los ADNc sintetizados se introducen después en un vector de expresión para producir el anticuerpo o proteína de interés en células de un segundo tipo. Esto implica que un vector de expresión debe ser replicable en las células hospedadoras como episomas o como parte integral del ADN cromosómico. Vectores de expresión adecuados incluyen, pero sin limitación, plásmidos, vectores víricos, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus y cósmidos.

Los vectores que contienen polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula hospedadora por cualquiera de varios medios apropiados, incluida la electroporación, transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato cálcico, DEAE-dextrano u otras sustancias; bombardeo de microproyectiles; lipofección; e infección (por ejemplo, cuando el vector es un agente infeccioso tal como el virus vaccinia). La elección de introducir vectores o polinucleótidos dependerá a menudo de las características de la célula hospedadora.

Cualquier célula hospedadora capaz de sobreexpresar ADN heterólogos puede usarse con el fin de aislar los genes que codifican el anticuerpo, polipéptido o proteína de interés. Los ejemplos no limitantes de células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células COS, HeLa y CHO. Preferentemente, las células hospedadoras expresan los ADNc a un nivel aproximadamente 5 veces mayor, más preferentemente 10 veces mayor, más preferentemente 20 veces mayor, más preferentemente 50 veces mayor, más preferentemente 100 veces mayor que el del correspondiente anticuerpo o proteína endógenos de interés, si está presente, en las células hospedadoras. La exploración de las células hospedadoras en busca de una unión específica a una proteína deseada se realiza preferentemente mediante un inmunoensayo o FACS. De esta forma se puede identificar una célula que sobreexpresa el anticuerpo o proteína de interés.

También están disponibles varias técnicas que ahora pueden emplearse para producir agonistas, antagonistas y moduladores de péptidos mutantes que codifican adiciones, eliminaciones o cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína resultante en relación con la molécula agonista, antagonista o moduladora del péptido precursor.

La invención incluye modificaciones de las moléculas de unión triespecíficas de la invención que no afectan significativamente sus propiedades y variantes que tienen actividad mejorada o disminuida. La modificación de polipéptidos es una práctica habitual en la técnica. Los ejemplos de polipéptidos modificados incluyen polipéptidos con sustituciones conservativas de restos de aminoácidos, una o más deleciones o adiciones de aminoácidos que no cambian significativamente de manera perjudicial la actividad funcional o el uso de análogos químicos. Los restos de aminoácidos que se pueden sustituir de forma conservativa entre sí incluyen, pero sin limitación: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Estos polipéptidos también incluyen polipéptidos glicosilados y no glicosilados, así como polipéptidos con otras modificaciones postraduccionales, tales como, por ejemplo, glicosilación con diferentes azúcares, acetilación y fosforilación. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos serían conservativas, es decir, el aminoácido sustituido poseería propiedades químicas similares a las del aminoácido original. Tales sustituciones conservativas son conocidas en la técnica y se han proporcionado ejemplos anteriormente. Las modificaciones de aminoácidos pueden variar desde el cambio o la modificación de uno o más aminoácidos hasta el rediseño completo de una región, tal como el dominio variable. Los cambios en el dominio variable pueden alterar la afinidad y/o especificidad de unión. Otros métodos de modificación incluyen el uso de técnicas de acoplamiento conocidas en la técnica, entre las que se incluyen, pero sin limitación, medios enzimáticos, sustitución oxidativa y quelación. Se pueden utilizar modificaciones, por ejemplo, para la fijación de marcadores para inmunoensayo, tales como la unión de restos radiactivos para radioinmunoensayo. Los polipéptidos modificados se preparan usando procedimientos establecidos en la técnica y se pueden seleccionar usando ensayos estándar conocidos en la técnica.

La invención también abarca proteínas de fusión que comprenden uno o más fragmentos o regiones de los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención. En una realización, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de región de cadena ligera variable y al menos 10 aminoácidos de región de cadena pesada variable. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene una región constante de inmunoglobulina heteróloga. En otra realización, el polipéptido de fusión contiene un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo producido a partir de un hibridoma depositado públicamente. A efectos de la presente invención, una proteína de fusión de anticuerpos contiene uno o más dominios polipeptídicos que se unen específicamente a un epítopo vírico deseado o a un receptor activador deseado de una célula efectora inmunitaria o a una proteína presente en la superficie de una célula efectora inmunitaria que expresa dicho receptor activador y a otra secuencia de aminoácidos a la que no está unido en la molécula nativa, por ejemplo, una secuencia heteróloga o una secuencia homóloga de otra región.

La invención incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de la presente invención. Los polipéptidos de esta invención se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse mediante degradación proteolítica o de otro tipo de los anticuerpos, por métodos recombinantes (es decir, polipéptidos únicos o de fusión) como se describe anteriormente o por síntesis química. Los polipéptidos de los anticuerpos, especialmente los polipéptidos más cortos de hasta aproximadamente 50 aminoácidos, se fabrican convenientemente mediante síntesis química. Los métodos de síntesis química son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, podría producirse dicho polipéptido mediante un sintetizador de polipéptidos automatizado empleando el método de fase sólida.

VIII. Usos de las composiciones de la invención

La presente invención abarca composiciones, incluyendo composiciones farmacéuticas, que comprenden las moléculas de unión triespecíficas de la invención, polipéptidos derivados de dichas moléculas, polinucleótidos que comprenden secuencias que codifican dichas moléculas o polipéptidos, y otros agentes como se describe en el presente documento.

Las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención tienen la capacidad de unirse de forma coordinada a tres epítopos y, por lo tanto, tienen un uso sustancial en el diagnóstico, separación química y terapias que implican dichos epítopos. Por ejemplo, dichas moléculas pueden usarse como reactivo en un inmunoensayo en sándwich. En la realización en la que dichas moléculas de unión triespecíficas se unen a un epítopo de un antígeno asociado a enfermedad, dichas moléculas pueden usarse para tratar la enfermedad o afección asociada con o caracterizada por la expresión de dicho antígeno asociado a enfermedad. Por lo tanto, sin limitación, las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas pueden emplearse en el diagnóstico o tratamiento del cáncer y enfermedades causadas por una infección por patógenos (p. ej., bacterianas, fúngicas, vírica o protozoaria).

IX. Métodos de administración

Las composiciones de la presente invención pueden proporcionarse para el tratamiento, profilaxis y mejora de uno o más síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o infección administrando a un sujeto una cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la invención. En un aspecto preferido, dichas composiciones están sustancialmente purificadas (es decir, esencialmente libres de sustancias que limiten su efecto o produzcan efectos secundarios no deseados). En una realización específica, el sujeto es un animal, preferentemente un mamífero tal como un animal no primate (por ejemplo, bovino, equino, felino, canino, roedor, etc.) o un primate (por ejemplo, mono, tal como, un mono cinomolgo, ser humano, etc.). En una realización preferida, el sujeto es un ser humano. Se conocen diversos sistemas de liberación y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o la proteína de fusión, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem.

262:4429-4432), la construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico u otro, etc.

Los métodos para administrar las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), epidural y mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). En una realización específica, las moléculas de la invención se administran por vía intramuscular, intravenosa o subcutánea. Las composiciones pueden administrarse mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en embolada, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local. Además, se puede emplear también la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.019.968; 5.985.320; 5.985.309; 5.934.272; 5.874.064; 5.855.913; 5.290.540; y 4.880.078; y las publicaciones del PCT n.° WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; y WO 99/66903.

La invención también dispone que las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden envasan en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecito que indica la cantidad de dichas moléculas. En una realización, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se suministran en forma de polvo liofilizado esterilizado en seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado y pueden reconstituirse, por ejemplo, con agua o solución salina a la concentración apropiada para la administración a un sujeto. Preferentemente, las moléculas de unión triespecífica de la presente invención se suministran como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado a una dosis unitaria de al menos 5 |jg, más preferentemente al menos 10 jg, al menos 15 jg, al menos 25 jg, al menos 50 jg, al menos 100 jg o al menos 200 jg.

Las moléculas de unión triespecíficas liofilizadas de la presente invención deben almacenarse entre 2 y 8° C en su recipiente original y las moléculas deben administrarse en el transcurso de 12 horas, preferentemente en el transcurso de 6 horas, en el transcurso de 5 horas, en el transcurso de 3 horas o en el transcurso de 1 hora tras su reconstitución. En una realización alternativa, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración de la molécula, proteína de fusión o molécula conjugada. Preferentemente, la forma líquida de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se suministra en un recipiente herméticamente cerrado en el que las moléculas están presentes en una concentración de al menos 1 pg/ml, más preferentemente al menos 2,5 pg/ml, al menos 5 pg/ml, al menos 10 pg/ml, al menos 50 pg/ml o al menos 100 pg/ml.

Tal como se usa en el presente documento, una "cantidad eficaz" de una composición farmacéutica, en una realización, es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados que incluyen, sin limitación, resultados clínicos tales como disminuir los síntomas resultantes de la enfermedad, atenuando un síntoma de infección (p. ej., carga vírica, fiebre, dolor, sepsis, etc.) o un síntoma de cáncer (p. ej., la proliferación, de células cancerosas, presencia tumoral, metástasis tumorales, etc.), aumentando, de este modo, la calidad de vida de aquellos que padecen la enfermedad, disminuir la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, potenciar el efecto de otro medicamento tal como a través del direccionamiento y/o la internalización, retrasar la progresión de la enfermedad y/o prolongar la supervivencia de los individuos.

Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. A efectos de la presente invención, una cantidad eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para reducir la proliferación de (o el efecto de) la presencia vírica y para reducir y/o retrasar el desarrollo de la enfermedad vírica, ya sea directa o indirectamente. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede conseguirse o no junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, se puede considerar una "cantidad eficaz" en el contexto de la administración de uno o más agentes quimioterapéuticos, y se puede considerar que un único agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes diferentes, puede darse o se consigue un resultado deseable. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de los intervalos óptimos de cantidades eficaces de cada componente está dentro del conocimiento de la técnica. Las dosis típicas para la administración de anticuerpos comprenden una o más dosis unitarias entre 0,1 y 100 mg/kg/peso corporal.

La cantidad de la molécula de unión triespecífica de la presente invención que será eficaz en el tratamiento, la prevención o la mejoría de uno o más síntomas asociados con un trastorno puede determinarse mediante técnicas clínicas convencionales. La dosis exacta que se va a emplear en la formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la afección, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del facultativo y las circunstancias de cada paciente. Las dosis eficaces se pueden extrapolar a partir de curvas de dosis-respuesta derivadas de sistemas de prueba de modelos in vitro o animales. Para las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, la dosis administrada a un paciente es normalmente de al menos aproximadamente 0,01 pg/kg/día, al menos aproximadamente 0,05 pg/kg/día, al menos aproximadamente 0,1 pg/kg/día, al menos aproximadamente 0,2 pg/kg/día, al menos aproximadamente 0,5 pg/kg/día, al menos aproximadamente 1 pg/kg/día, al menos aproximadamente 2 pg/kg/día, al menos aproximadamente 5 pg/kg/día, al menos aproximadamente 10 pg/kg/día, al menos aproximadamente 20 pg/kg/día, al menos aproximadamente 50 pg/kg/día, al menos aproximadamente 0,1 mg/kg/día o más del peso corporal del sujeto.

Preferentemente, la dosis administrada a un paciente está entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 0,1 mg/kg/día, más preferentemente, entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 50 pg/kg/día, más preferentemente, entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 50 pg/kg/día, más preferentemente, entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 10 pg/kg/día, más preferentemente, entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 1 pg/kg/día, más preferentemente, entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 0,5 pg/kg/día, y más preferentemente, entre aproximadamente 0,01 pg/kg/día y aproximadamente 0,1 pg/kg/día del peso corporal del sujeto. La dosis y frecuencia de administración de la molécula de unión triespecífica de la invención se pueden disminuir o modificar potenciando la captación y penetración en el tejido de la molécula de unión triespecífica mediante modificaciones tales como, por ejemplo, lipidación.

En otra realización, al paciente se le administra un régimen de tratamiento que comprende una o más dosis de dicha cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención, en donde el régimen de tratamiento se administra durante 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días. En determinadas realizaciones, el régimen de tratamiento comprende la administración intermitente de dosis de la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas abarcadas por la presente invención (por ejemplo, se administra una dosis el día 1, el día 2, el día 3 y el día 4 de una semana dada y no se administran dosis de la cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecífica abarcadas por la presente invención el día 5, el día 6 y día 7 de la misma semana). Normalmente, hay 1, 2, 3, 4, 5 o más ciclos de tratamiento. Cada ciclo puede ser el mismo régimen o un régimen diferente.

En otra realización, la dosis administrada se aumenta durante el primer trimestre, la primera mitad o los primeros dos tercios o tres cuartos del régimen o regímenes (por ejemplo, durante el primer, segundo o tercer regímenes de un tratamiento de 4 ciclos) hasta que se logre la cantidad diaria profiláctica o terapéuticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas abarcadas por la invención.

En una realización, la dosis de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención administradas a un paciente puede calcularse para su uso como terapia con un solo agente. En otra realización, las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se usan en combinación con otras composiciones terapéuticas y las dosis administradas a un paciente son menores que cuando se usan dichas moléculas de unión triespecíficas como terapia de un solo agente.

En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en la zona que necesite tratamiento; esto se puede lograr mediante, por ejemplo, y no a modo de limitación, infusión local, mediante inyección o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras. Preferentemente, cuando se administra una molécula de la invención, debe prestarse atención en usar materiales a los que no se absorba la molécula.

En otra realización, las composiciones pueden suministrarse en una vesícula, en particular, un liposoma (véase, Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, págs. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase, en general, en el mismo lugar).

En otra realización más, las composiciones pueden suministrarse en un sistema de liberación controlada o un sistema de liberación sostenida. Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan una o más moléculas de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.526.938; la publicación del PCT WO 91/05548; la publicación del PCT Wo 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760. En una realización, se puede usar una bomba en un sistema de liberación controlada (véase Langer, supra; Sefton, (1987) "Implantable Pumps," CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis," Surgery 88:507-516; y Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery," N. Engl. J. Med. 321:574-579). En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos para lograr la liberación controlada de anticuerpos (véase, por ejemplo, MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Ratón, Florida (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen y Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-InducedMemory Deficits," J. Neurosurg. 7(1):105-112); la patente de Estados Unidos n.° 5.679.377; la patente de Estados Unidos n.° 5.916.597; la patente de Estados Unidos n.° 5.912.015; la patente de Estados Unidos n.° 5.989.463; la patente de Estados Unidos n.° 5.128.326; publicación del PCT n.° WO 99/15154; y la publicación del PCT n.° WO 99/20253). Ejemplos de polímeros utilizados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero sin limitación, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo), poli(metacrilato de metilo), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-acetato de vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(alcohol vinílico), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA) y poliortoésteres. En otra realización más, se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana terapéutica (por ejemplo, los pulmones), siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, supra, vol. 2, págs. 115-138 (1984)). En otra realización, las composiciones poliméricas útiles como implantes de liberación controlada se usan de acuerdo con Dunn et al. (véase el documento U.S. 5.945.155). Este método en concreto se basa en el efecto terapéutico de la liberación controlada in situ del material bioactivo a partir del sistema polimérico. La implantación puede producirse, en general, en cualquier parte del organismo del paciente que necesite el tratamiento terapéutico. En otra realización, se utiliza un sistema de suministración sostenido no polimérico, con lo que, como sistema de liberación del fármaco, se usa un implante no polimérico en el cuerpo del sujeto. Tras la implantación en el cuerpo, el disolvente orgánico del implante se disipará, dispersará o lixiviará de la composición hacia el fluido del tejido circundante y el material no polimérico coagulará o precipitará poco a poco, formando una matriz sólida, microporosa (véase el documento US 5.888.533).

Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto para producir formulaciones de liberación sostenida que comprenden uno o más agentes terapéuticos de la invención. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 4.526.938; las publicaciones internacionales del PCT n.° WO 91/05548 y WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; y Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.

Cuando se proporciona un ácido nucleico que codifica una molécula de unión triespecífica de la presente invención, el ácido nucleico se puede administrar in vivo para promover la expresión de su molécula de unión triespecífica codificada, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrándolo de modo que se vuelva intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la patente de EE.UU. n.° 4.980.286) o por inyección directa o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola génica; Biolistic, Dupont), o recubriendo con lípidos o receptores de superficie celular o agentes de transfección o administrándolo en unión a un péptido de tipo homeocaja que se sabe que entra en el núcleo (véase por ejemplo, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 88:1864-1868), etc. Como alternativa, se puede introducir un ácido nucleico intracelularmente e incorporarse dentro del ADN de la célula hospedadora para su expresión por recombinación homóloga.

El tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención puede incluir un solo tratamiento o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos. En un ejemplo preferido, un sujeto se trata con moléculas de la invención una vez por semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, preferentemente entre 2 y 8 semanas, más preferentemente entre aproximadamente 3 y 7 semanas, e incluso más preferentemente durante aproximadamente 4, 5 o 6 semanas. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse una vez al día, dos veces al día o tres veces al día. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana, dos veces a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, dos veces al año o una vez al año. También se apreciará que la dosis eficaz de las moléculas usadas para el tratamiento puede aumentar o disminuir durante el ciclo del tratamiento específico.

Habiendo ahora descrito de forma general la invención, la misma se entenderá más fácilmente mediante referencia a los siguientes Ejemplos. Dichos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no tienen por objeto ser limitantes de la presente invención a menos que se especifique.

Ejemplo 1

Producción y propiedades de moléculas de unión triespecíficas anti-CD3, anti-CD8, anti-B7-H3 ilustrativas Con el fin de desarrollar una molécula terapéutica que exhiba una mayor especificidad por las células T CD8+ y una muerte redirigida más potente, se construyeron moléculas de unión triespecíficas que tienen la capacidad de unirse de forma coordinada a CD3, a CD8 y a un antígeno asociado a enfermedad. La molécula de unión triespecífica producida además poseía un dominio Fc para mejorar la semivida de la molécula de unión triespecífica. in vivo. Las estructuras generales de las moléculas de unión triespecíficas se muestran en las Figuras 4A - 4D. Se construyó una molécula de unión triespecífica ilustrativa específica para el antígeno asociado a enfermedad B7-H3. La molécula de unión triespecífica se denomina mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 para indicar las posiciones relativas de los dominios de unión dentro de la molécula de unión triespecífica. El dominio de unión a B7-H3 ocupa la posición del sitio A, el dominio de unión a CD3 ocupa la posición del sitio B y el dominio de unión a CD8 ocupa la posición del sitio C (Figura 4A). La molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (tabla 5).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 59):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS SL Q P EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SR TPEV TCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SPGK

En la primera cadena polipeptídica, VL(mAb 1 de B7-H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41, VH(mAb 2 de CD3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, la espiral E tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y (CH2-CH3) tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos "portadora del botón" de la SEQ ID NO:7.

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 60):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY

WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK

EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE

En la segunda cadena polipeptídica, VL(mAb 2 de CD3 ) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26, VH(mAb 1 de B7-H3) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 42, y la espiral K tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 61):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRW SVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T IS K A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

En la tercera cadena polipeptídica, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de mAb 1 de CD8 empleado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30, un dominio bisagra, un dominio CHl y el dominio CH2-CH3"portador del ojal" con una sustitución H435R para eliminar el sitio de unión de la proteína A (SEQ ID NO: 8).

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 62):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTL TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A PSV FIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

En la cuarta cadena polipeptídica, la secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de mAb 1 de CD8 empleado tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 y un dominio constante de cadena ligera kappa.

La molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 expresada se cargó en una resina MSA, se lavó con NaPO4 10 mM (pH6); NaPO4 10 mM, NaCl 1 M (pH 6) y NaPO4 10 mM (pH6). Los polipéptidos se eluyeron de la resina con glicina 50 mM (pH 3) y se neutralizaron con Tris 1 M (pH 8). Se encontró que la expresión era de 1,7 mg/l; la preparación de molécula de unión triespecífica fue de 0,6 mg/ml, teniendo un rendimiento final de 0,42 mg.

Las propiedades de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 se comparó con las de un B7-H3 X CD3 DART y un B7-H3 X CD3 DART con un Dominio Fc. Como se muestra en las Figuras 5A-5B, la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 mostró una unión de células diana similar (células A498 (Figura 5A); JIMT-1 (Figura 5B)) en comparación con el B7-H3 X CD3 DART y un B7-H3 X CD3 DART con un dominio Fc. Sin embargo, como se muestra en las Figuras 5C-5D, la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 demostró una unión muy aumentada a las células T CD8+ en comparación con las células T CD4+.

Para demostrar la capacidad las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 de la presente invención para mediar en la muerte redirigida de células diana, dichas moléculas se incubaron en presencia de células T y bien células diana JIMT-1 o A498. Las células JIMT-1 son una línea de carcinoma resistente a trastuzumab (Tanner, M. et al. (2004) "Characterization Of A Novel Cell Line Established From A Patient With Herceptin-Resistant Breast Cancer," Mol. Cancer Ther. 3(12): 1585-1592). La línea celular A498 es una línea celular de carcinoma de células renales (Gogh, J. (1978) "Cultivation, Characterization, And Identification Of Human Tumor Cells With Emphasis On Kidney, Testis, And Bladder Tumors," Natl. Cancer Inst. Monogr. 49:5-9). Como se muestra en las Figuras 6A-6C, se observó la muerte redirigida de las células diana. De manera inesperada, dicha muerte fue sustancialmente más potente que la observada para el B7-H3 X CD3 DART correspondiente y un B7-H3 X CD3 DART con un dominio Fc. La muerte redirigida observada se resume en la tabla 6.

Las Figuras 7A-7D muestran la habilidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 para mediar la activación de células T después de la incubación con células JIMT-1. Las Figuras 8A-8D muestran la habilidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 para mediar la activación de células T después de la incubación con células A498. En ambos casos, dicha activación fue inesperadamente superior a la activación observada con B7-H3 X CD3 DART™ comparativo y un B7-H3 X CD3 DART™ con un dominio Fc. La Tabla 7 resume los resultados de CE50.

La molécula de unión triespecífica expresada mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 mostró una actividad citolítica mucho mayor (13 veces) usando células efectoras CD8+ en comparación con las células efectoras CD4+. La molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8también mostró una potencia general muy aumentada (85 veces) usando células "pan" T como efectores en comparación con el DART™.

Ejemplo 2

Efecto del dominio de unión a CD8 sobre la citotoxicidad redirigida

Para evaluar el efecto de la especificidad para CD8, se construyó una segunda molécula de unión triespecífica específica para el antígeno asociado a enfermedad B7-H3 utilizando una secuencia de dominio variable de anticuerpo de CD8 diferente. Las especificidades del dominio variable para B7-H3 y las especificidades del dominio variable por CD3 fueron idénticas a las utilizadas para construir la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8. La molécula de unión triespecífica se denomina mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 y estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (tabla 8).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 63):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS SL Q P EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SR TPEV TCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 64):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTYLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY

WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK

EKYAALKEKV AALKEKVAAL KE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 65):

QVQLVESGGG WQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL

IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH

YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRWSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 66):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP

GKAPKLLIYN TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQ P

EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIKRTVA A P SV F IFP PS

DEQLKSGTAS WCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE

SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKSFNR GEC

Para comparar la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 (construcción y secuencia descritas anteriormente) o mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 para unirse a células T, se purificaron PBMC humanas de donantes sanos con Ficoll, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en tampón FACS que contiene suero AB humano al 10 % y se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos, las células se centrifugaron y las células se resuspendieron a 4 x 106 células/ml en tampón FACS. Se añadieron 50 ^l de moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de Cd8 o mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 tituladas en serie o DART™ (B7-H3 X CD3 o B7-H3 X CD3 con dominio Fc) a los pocillos de una placa profunda de 96 pocillos. Se añadieron después, 50 ^l (4 x 106 células/ml) de células bien mezcladas en tampón FACS que contenía azida sódica al 0,01 % a los pocillos correspondientes y se mezclaron minuciosamente utilizando una pipeta. La placa se incubó en la oscuridad durante aproximadamente 45 minutos a 2-8 °C. Al final de la incubación, las células se lavaron dos veces añadiendo 300 ^l de tampón FACS a cada pocillo, centrifugando la placa a 1200 rpm durante 5 minutos y descartando el sobrenadante. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 ^l de mezcla de anti-FcY humano de cabra conjugado con PE diluido a 1:500, CD5-APC y CD4-PerCP5.5 en tampón FACS que contenía azida sódica al 0,01 % y se incubaron en la oscuridad durante aproximadamente 45 minutos a 2-8 °C. Al final de la incubación, las células se lavaron, se resuspendieron con tampón FACS y se analizaron con un citómetro de flujo BD Caliber. Las células se seleccionaron como CD5+ CD4+ (Figura 9A) o CD5+ CD4-(Figura 9B). Se observó tinción diferencial en la población CD5+ CD4- en comparación con moléculas de unión que poseían o carecían de especificidad para CD8.

La citotoxicidad de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 se comparó con la de la molécula de unión triespecífica mAb1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8. Se emplearon tanto un ensayo de luciferasa como un ensayo de LDH. Los resultados de los dos ensayos coincidieron. Las dos moléculas de unión triespecíficas causaron citotoxicidad redirigida equivalente en presencia de poblaciones de células T CD8+ activadoras o de células pan T. La molécula de unión triespecífica que tiene un dominio de unión del mAb 1 de CD8 mostró una mayor citotoxicidad redirigida en presencia de poblaciones de células CD8+ o células pan T en comparación con el B7h3 X CD3 DART (Figura 10A-10C).

También se observó un aumento (60 veces) en la CE50 para las células efectoras CD8+ frente a CD4+ para la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 en comparación con la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8. Para la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8, se observó un aumento de la potencia que dio como resultado una disminución en la CE50 de más de 100 veces cuando se utilizaron células pan T como células efectoras.

Ejemplo 3

Efecto de las posiciones de los dominios sobre la citotoxicidad redirigida

Para evaluar el efecto de la posición para un dominio de unión dado (CD3, CD8 y antígeno asociado a enfermedad) dentro de la molécula de unión triespecífica (sitio A, sitio B y sitio C), se construyeron varias moléculas de unión triespecíficas adicionales. La Tabla 9 muestra las moléculas de unión triespecíficas y la ubicación (sitio A, sitio B y sitio C) de los diversos dominios de unión (CD3, CD8 y antígeno asociado a enfermedad).

La construcción y secuencia de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 se describió anteriormente. Para las dos moléculas de unión triespecíficas adicionales (mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 y mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3), las especificidades del dominio variable para B7-H3, las especificidades del dominio variable para CD3 y las especificidades del dominio variable para CD8 eran idénticas a las utilizadas para construir la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8. La molécula de unión triespecífica mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 10).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 es (SEQ ID NO: 67):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTL TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SR TPEV TCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 es (SEQ ID NO: 68):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLQQSGAELV KPGASVKLSC TASGFNIKDT

YIHFVRQRPE QGLEWIGRID PANDNTLYAS KFQGKATITA DTSSNTAYMH

LCSLTSGDTA VYYCGRGYGY YVFDHWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 es (SEQ ID NO: 69):

QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT

IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG

IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK

DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS G L Y SLSSW T VPSSSLGTQT

YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP

KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN

STYRW SVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA L P A P IE K T IS KAKGQPREPQ

VYTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV

LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRYT QKSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 / mAb 1 de B7-H3 es (SEQ ID NO: 70):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIKRTV A A P S V F IF P P SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

La molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (tabla 11).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3 es (SEQ ID NO: 71):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FT L TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMQ

WVRQAPGQGL EWMGTIYPGD GDTRYTQKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS

LRSEDTAVYY CARRGIPRLW YFDVWGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV

AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK

DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS

TYRW SVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL P A P IE K T IS K AKGQPREPQV

YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL

DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3 es (SEQ ID NO: 72):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY

TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLQ QSGAELVKPG ASVKLSCTAS GFNIKDTY1H

FVRQRPEQGL EWIGRIDPAN DNTLYASKFQ GKATITADTS SNTAYMHLCS

LTSGDTAVYY CGRGYGYYVF DHWGQGTTLT VSSGGCGGGK VAALKEKVAA

LKEKVAALKE KVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3 es (SEQ ID NO: 73):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL

GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL S S W T V P S S S

LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KRVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL

FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV W DVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR

EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ

PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK

TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNRYTQKSLS

LSPGK

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de B7-H3 / mAb 1 de CD8 / mAb 2 de CD3 es (SEQ ID NO: 74):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ

WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT

HQGLSSPVTK SFNRGEC

Los resultados de esta investigación se muestran en las Figuras 11A-11C, Figuras 12A-12C, Figuras 13A-13E, y en la tabla 26. Las Figuras 11A-11C y Figuras 12A-12C demuestran independientemente que la colocación de un dominio de unión a CD3 en el sitio C de las moléculas de unión triespecíficas reduce la citotoxicidad de la molécula. Las Figuras 13A-13E muestran que esta citotoxicidad disminuida se observa independientemente de si se empleaban células CD4+, CD8+ o pan T.

Como se muestra en las Figuras 14A-14B, la ubicación del dominio de unión a CD3 en el sitio C, disminuyó en gran medida la unión tanto a las células CD5+ CD4+ (Figura 14A) como a las células CD5+ CD4- (Figura 14B).

Particularmente, sin embargo, independientemente de la ubicación del dominio de unión a CD3, todas las moléculas de unión triespecíficas eran capaces de mediar la citotoxicidad redirigida.

Ejemplo 4

Producción y propiedades de moléculas de unión triespecíficas anti-CD3, anti-CD8, anti-5T4 ilustrativas

Se construyeron moléculas de unión triespecíficas ilustrativas adicionales específicas para el antígeno 5T4 asociado a enfermedad. La molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 12).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 75):

DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS IS C R S S Q S IV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK

LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP

FTFGSGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS

TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS

LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG

GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK

TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL P A P IE K T IS K

AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE

NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 76):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQPGAELV KPGASVKMSC KASGYTFTSY

WITWVKQRPG QGLEWIGDIY PGSGRANYNE KFKSKATLTV DTSSSTAYMQ

LSSLTSEDSA VYNCARYGPL FTTW DPNSY AMDYWGQGTS VTVSSGGCGG

GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 77):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T ISK A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 78):

DVQINQSPS F LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTL TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A PSV FIFPP SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

La molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (tabla 13).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 79):

DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS IS C R S S Q S IV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK

LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP

FTFGSGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS

TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS

LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG

GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK

TKPREEQYNS TYRW SVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL P A P IE K T IS K

AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE

NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 80):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQPGAELV KPGASVKMSC KASGYTFTSY

WITWVKQRPG QGLEWIGDIY PGSGRANYNE KFKSKATLTV DTSSSTAYMQ

LSSLTSEDSA VYNCARYGPL FTTW DPNSY AMDYWGQGTS VTVSSGGCGG

GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 81):

QVQLVESGGG W QPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL

IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH

YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS S G L Y S L S S W TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCVWDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRW SVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK A L PA PIE K T I SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGS FFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 82):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN

TDILHTGVPS RFSGSGSGTD F T F T IS S L Q P EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG

TKVEIKRTVA A P S V F IF P P S DEQLKSGTAS W CLLNNFYP REAKVQWKVD

NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKSFNR GEC

Las moléculas de unión triespecíficas mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 se expresaron y purificaron como se describe anteriormente. Se comparó la capacidad de estas dos moléculas de unión triespecíficas para unirse a PBMC humanas CD5+/CD4+ seleccionadas y CD5+/CD4-seleccionadas con las de un 5T4 X CD3 DART con un dominio Fc. Como se muestra en las Figuras 15A-15B, las moléculas de unión triespecíficas 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 demostraron una unión muy aumentada a las células T CD8+ (Figura 15B) en comparación con las células T CD4+ (Figura 15A).

Para demostrar la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 para mediar en la muerte redirigida de las células diana, se incubaron dichas moléculas en presencia de células T y células diana JIMT-1. Como se muestra en las Figuras 16A-16C, se observó la muerte redirigida de las células diana. Como se observó para las moléculas de unión triespecíficas para B7-H3 descritas anteriormente, la muerte fue sustancialmente más potente que la observada para el 5T4 X CD3 DART correspondiente que contiene un dominio Fc. De forma análoga, como se observa para las moléculas de unión triespecíficas para B7-H3, el uso de diferentes dominios variables de CD8 no tuvo ningún efecto sobre la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas para 5T4 para redirigir las células T CD8+ a las células diana. También se observó que la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 era altamente activa y demostró una actividad de CTL mucho mayor usando células efectoras CD8+ frente a CD4+ (CE5023 veces menor). La molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 fue 22 veces más potente usando células efectoras pan T en comparación con un 5T4 X CD3 DART™ y la molécula de unión triespecífica mAb 2 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 fue 25 veces más potente.

Ejemplo 5

Propiedades de moléculas de unión triespecíficas anti-CD3, anti-CD8, anti-ROR1 ilustrativas

Se construyeron moléculas de unión triespecíficas ilustrativas adicionales específicas para el antígeno ROR1 asociado a enfermedad. La molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 14).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 83):

QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL

EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN

YLFGGGTQLT VLGGGGSGGG GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF

STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA TYYADSVKGR FTISRDDSKN

SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT LVTVSSGGCG

GGEVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG

PSV FLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA

KTKPREEQYN STYRW SVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA L P A P IE K T IS

KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP

ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT

QKSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 84):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQE QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSDY

YMSWVRQAPG KGLEWVATIY PSSGKTYYAD SVKGRFTISS DNAKNSLYLQ

MNSLRAEDTA VYYCARDSYA DDAALFDIWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL

KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 85):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTY1HFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T IS K A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 86):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FT L TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A PSV FIFPP SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

La molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 15).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 87):

QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL

EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN

YLFGGGTQLT VLGGGGSGGG GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF

STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA TYYADSVKGR FTISRDDSKN

SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT LVTVSSGGCG

GGEVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG

PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCWVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA

KTKPREEQYN STYRW SVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA L P A P IE K T IS

KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP

ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT

QKSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 88):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQE QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSDY

YMSWVRQAPG KGLEWVATIY PSSGKTYYAD SVKGRFTISS DNAKNSLYLQ

MNSLRAEDTA VYYCARDSYA DDAALFDIWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL

KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 89):

QVQLVESGGG W QPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL

IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH

YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV

KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SG L Y SL SSW TVPSSSLGTQ

TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK

PKDTLMISRT PEVTCWVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY

NSTYRW SVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK A L PA PIE K T I SKAKGQPREP

QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP

VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG

K

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 es (SEQ ID NO: 90):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN

TDILHTGVPS RFSGSGSGTD F T F T IS S L Q P EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG

TKVEIKRTVA A P S V F IF P P S DEQLKSGTAS W CLLNNFYP REAKVQWKVD

NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL

SSPVTKS FNR GEC

Las propiedades de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 se compararon con las de un ROR1 X CD3 DART™ que contenía un dominio Fc. El DART™ y las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 se construyeron utilizando las secuencias Fv de un anticuerpo monoclonal anti-ROR1, mAb 1 de ROR1, que se une al antígeno ROR-1.

Las dos moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 y DART fueron activas todas ellas en ensayos de CTL contra células diana JIMT1-luc y A549. Sin embargo, las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 mostraron una actividad drásticamente aumentada con los efectores células T CD8+ y células pan T.

Se midió la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 1 de ROR1 / mAb 2 de CD3 / mAb 2 de CD8 para mediar en la muerte redirigida de células diana usando tanto un ensayo de luciferasa como un ensayo de LDH. En ambos casos, se observó muerte redirigida. Las Figuras 17A-17C demuestran la muerte redirigida de las células diana según se mide utilizando el ensayo de luciferasa. Los resultados se resumen en la tabla 16.

continuación

Ejemplo 6

Propiedades de moléculas de unión triespecíficas anti-CD3, anti-CD8, anti- env ilustrativas

Se construyeron moléculas de unión triespecíficas ilustrativas adicionales específicas para el antígeno de VIH asociado a enfermedad (gp140). La molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 17).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 91):

DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP

KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH

PPTFGHGTRV EIKGGGSGGG GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF

STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA TYYADSVKGR FTISRDDSKN

SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT LVTVSSASTK

GEVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP

SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK

TKPREEQYNS TYRW SVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL P A P IE K T IS K

AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE

NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ

KSLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 92):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGGGVF KPGGSLRLSC EASGFTFTEY

YMTWVRQAPG KGLEWLAYIS KNGEYSKYSP SSN GRFTISR DNAKNSVFLQ

LDRLSADDTA VYYCARADGL TYFSELLQYI FDLWGQGARV TVSSASTKGK

VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 93):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T IS K A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 94):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FT L TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A PSV FIFPP SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

La molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 18).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 95):

QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII

SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTD1HNFV

FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSTY

AMNWVRQAPG KGLEWVGRIR SKYNNYATYY ADSVKGRFTI SRDDSKNSLY

LQMNSLKTED TAVYYCVRHG NFGNSYVSWF AYWGQGTLVT VSSASTKGEV

AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF

LFPPKPKDTL MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP

REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG

QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY

KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL

SLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 96):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQESGPGLV KPSQTLSLSC TVSGGSSSSG

AHYWSWIRQY PGKGLEWIGY IHYSGNTYYN P S L K S R IT IS QHTSENQFSL

KLNSVTVADT AVYYCARGTR LRTLRNAFDI WGQGTLVTVS SASTKGKVAA

CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 97):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTY1HFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T IS K A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 98):

DVQINQSPS F LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTL TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A PSV FIFPP SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

Se prepararon moléculas de unión triespecíficas que tenían un dominio de unión capaz de unirse al antígeno gp140 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) (es decir, una molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y una molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 ).

Como etapa preliminar, se evaluó la capacidad de las moléculas de unión triespecíficas mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8. Se recubrió un soporte sólido con dos pg/ml de proteína gp140 de la cepa JR-FL en tampón de carbonato-bicarbonato 0,2 M (pH 9,4) y después se incubó con las moléculas de unión triespecíficas (a una concentración inicial de 5 pg/ml, seguido de diluciones en serie 1:2). Al final del ensayo, la unión se bloqueó con solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) que contenía albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en inglés) al 3 %. La unión se detectó mediante ELISA (pico (ThermoScientific-Pierce) usando anti-IgG humana que se había conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP). El ensayo también se usó con CD3 humano inmovilizado (2 |jg/ml) para evaluar la capacidad de las moléculas para unirse a CD3. Se observó que ambas moléculas de unión triespecíficas pueden unirse a la proteína gp140 inmovilizada soluble (Figura 18A) y a CD3 humano (Figura 18B). Se llevó a cabo un ELISA en sándwich para demostrar que las moléculas de unión triespecíficas eran capaces de unirse de manera coordinada tanto a gp140 como a ^c D3. Para este fin, se recubrió un soporte sólido con 2 jg/ml de proteínas gp140 de la cepa JR-FL en tampón de carbonato-bicarbonato 0,2 M (pH 9,4) y después se incubó con las moléculas de unión triespecíficas (a una concentración inicial de 5 jg/ml, seguido de diluciones en serie 1:2). Después se añadió CD3 humano, marcado con biotina (0,5 jg/ml). La unión se detectó mediante ELISA (pico (ThermoScientific-Pierce) usando un conjugado estreptavidina-HRP. La Figura 18C muestra que las moléculas de unión triespecíficas eran capaces de unirse coordinadamente tanto a gp140 como a CD3.

Se observó que las moléculas de unión triespecíficas eran capaces de unirse a la superficie de las células que expresan la proteína env del VIH. Para demostrar este aspecto de la invención, se incubaron células HEK293/D375 que expresan env de VIH con inducción con doxiciclina con las moléculas de unión triespecíficas. La detección de la unión se realizó usando anticuerpo anti-Fc humano biotinilado y estreptavidina-APC. Como se muestra en las Figuras 19A-19C, se observó que ambas moléculas de unión triespecíficas podían unirse a las células HEK293/D375 a diferencia de una molécula de unión triespecífica de control (Figura 19C).

Para demostrar la capacidad de dichas moléculas de unión triespecíficas para mediar en la muerte redirigida de células infectadas por el VIH, se evaluó la capacidad de dichas moléculas para unirse a PBMC. Se lisó sangre humana con tampón de lisis ACK, se lavó 2X con PBS y se resuspendió en tampón FACS que contenía suero AB humano al 10 % y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, las células se sedimentaron por centrifugación y se resuspendieron (4 x 106 células/ml) en tampón FACS. Se añadieron 50 j l de moléculas de unión triespecíficas tituladas en serie a los pocillos de una placa profunda de 96 pocillos. Se añadieron después, 50 j l de las células (4 x 106 células/ml) bien mezcladas en tampón FACS que contenía azida sódica al 0,01 % a los pocillos correspondientes y se mezclaron minuciosamente utilizando una pipeta. La placa se incubó en la oscuridad durante aproximadamente 45 minutos a 2-8 °C. Al final de la incubación, las células se lavaron dos veces añadiendo 300 j l de tampón FACS a cada pocillo, la placa se centrifugó a 1200 rpm durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 100 j l de mezcla de Fcy-PE de cabra anti-IgG humana, CD5-APC y CD4-PerCP5.5 preparada en tampón FACS que contenía azida sódica al 0,01 %, y las células se incubaron en la oscuridad durante aproximadamente 45 minutos a 2-8 °C. Al final de la incubación, las células se lavaron, se resuspendieron con tampón FACS y se analizaron con un citómetro de flujo BD Caliber. Como se muestra en las Figuras 20A-20B, se observó que las moléculas de unión triespecíficas mostraban unión específica a la población de células CD5+/ CD4-.

Las moléculas de unión triespecíficas se incubaron a 37 °C durante 24 horas en presencia de células Jurkat 522 FY que expresan env de VIH y de células pan T en presencia o ausencia de tetraciclina, y se midió la citotoxicidad utilizando un ensayo de ^lD^h . Como se muestra en las Figuras 21A-21F, las moléculas de unión triespecíficas mediaban una citotoxicidad sustancial.

Se realizó un análisis de citotoxicidad utilizando células pan T purificadas y células Jurkat 522 FY que expresan env de VIH y se midió el porcentaje de células vivas. Los resultados de este análisis se muestran en las Figuras 22A-22B.

Se realizó una evaluación de la actividad de CTL de moléculas de unión triespecíficas en células Jurkat 522 FY que expresan env de VIH utilizando células CD4+, CD8+ o pan T. Los resultados de esta evaluación con respecto a la molécula de unión triespecífica mAb 1 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 se muestra en las Figuras 23A-23C. Los resultados de esta evaluación con respecto a la molécula de unión triespecífica mAb 2 de VIH / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 se muestra en las Figuras 24A-24C. La Tabla 19 resume los resultados.

continuación

Se evaluó el impacto de variar la relación de células diana:efectoras. La Tabla 20 resume los resultados obtenidos.

También se realizó una evaluación de la actividad de CTL de moléculas de unión triespecíficas en células HEK293 que expresan env de VIH utilizando células CD4+, CD8+ o pan T. Los resultados de esta evaluación se resumen en la Tabla 21.

Ejemplo 7

Comparación de variantes de afinidad de dominio de unión a CD3

Como se ha indicado anteriormente, los dominios de unión a antígenos asociados a enfermedad, CD3 o CD8 de las moléculas de unión triespecíficas de la presente invención se pueden mutar para aislar los dominios de unión que tienen más características de unión deseadas. El dominio de unión de mAb 2 de CD3 se sometió a dicha mutagénesis y se aislaron dos variantes de afinidad (mAb 2 de CD3 Low y mAb 2 de CD3 Fast).

La secuencia de aminoácidos del dominio de cadena ligera variable del mAb 2 anti-CD3 Low humano es (SEQ ID NO: 99):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG

La secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable del mAb 2 anti-CD3 Low humano es (SEQ ID NO: 100):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HGNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS

La secuencia de aminoácidos del dominio de cadena ligera variable del mAb 2 anti-CD3 Fast es (SEQ ID NO: 101):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG

La secuencia de aminoácidos del dominio de cadena pesada variable del mAb 2 anti-CD3 Fast es (SEQ ID NO: 102):

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR

IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR

HKNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS

Las Figuras 25A-25C muestran la cinética de unión para estas variantes. El mAb 2 de CD3 Low (Figura 25A) es una variante de baja afinidad, mientras que el mAb 2 de CD3 Fast (Figura 25B) tiene una tasa de disociación más rápida en relación con el mAb 2 de CD3 de tipo silvestre (Figura 25C).

Para evaluar el efecto de las características de unión a CD3, se utilizaron dos mutantes de dominio de unión a CD3. Se construyeron tres moléculas de unión triespecíficas específicas para el antígeno asociado a enfermedad 5T4 utilizando una secuencia de dominio variable de mAb 2 de CD3 de tipo silvestre, una secuencia de dominio variable de mAb 2 de CD3 con baja afinidad por CD3 y una secuencia de dominio variable de mAb 2 de CD3 con afinidad de tipo silvestre pero una velocidad de disociación más rápida. Las especificidades del dominio variable de 5T4 y las especificidades del dominio variable de CD8 fueron las mismas entre las tres moléculas de unión triespecíficas. La primera molécula de unión triespecífica se denomina mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 y estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 22).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 103):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR

ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA

LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF

PPKPKDTLMI SRTPEVTCW VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE

EQYNSTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP

REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT

TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL

SPGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 104):

QAWTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF

WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSGGCG GGKVAALKEK

VAALKEKVAA LKEKVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 105):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSW TVP SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRWSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEK TISKA KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 106):

DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

La segunda molécula de unión triespecífica se denomina mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low/ mAb 1 de CD8 y estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 23).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low/ mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 107):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR

ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD F T L T IS SL Q P EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCVW DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low/ mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 108):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF

WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSASTK GKVAACKEKV

AALKEKVAAL KEKVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low/ mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 109):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRW SVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T IS K A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 110):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTL TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A PS V F IF P P SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

La tercera molécula de unión triespecífica se denomina mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8 y estaba compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas diferentes (Tabla 24).

La secuencia de aminoácidos de la primera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast/ mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 111):

DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR

ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FT L T IS SL Q P EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ

GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN

WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM

NSLKTEDTAV YYCVRHKNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC

EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP

PKPKDTLMIS RTPEVTCW V DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE

QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR

EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT

PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS

PGK

La secuencia de aminoácidos de la segunda cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 112):

QAW TQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI

GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF

GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF

WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME

LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSASTK GKVAACKEKV

AALKEKVAAL KEKVAALKE

La secuencia de aminoácidos de la tercera cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 113):

EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTY1HFVRQR PEQGLEWIGR

IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY

GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY

FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL Y S L SSW T V P SSSLGTQTYI

CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD

TLMISRTPEV TCWVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST

YRW SVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP A P IE K T IS K A KGQPREPQVY

TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD

SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

La secuencia de aminoácidos de la cuarta cadena polipeptídica de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast/ mAb 1 de CD8 es (SEQ ID NO: 114):

DVQINQSPSF LAASPGETIT IN C R T SR SIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS

GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FT L TISG LEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA

GTKLELRRTV A A P S V F IF P P SDEQLKSGTA SW CLLNNFY PREAKVQWKV

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG

LSSPVTKSFN RGEC

Las PBMC humanas de donantes sanos se trataron como se describe anteriormente y se incubaron con la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8, la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 y la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast/ mAb 1 de CD8. Se utilizaron como controles 5T4 X CD3 DART™ (con especificidades de CD3 de tipo silvestre, Low y Fast). Las molécula de unión triespecíficas mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 y mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8 contienen dominios de unión a CD3 mutados que muestran una afinidad por y una cinética de unión a CD3 alteradas.

Se observó que las moléculas de unión triespecíficas muestran una unión más débil a las células CD5+ CD4+ (Figura 26A), pero una unión mucho más fuerte a las células CD5+ CD4-(Figura 26B) que los controles DART™. Las Figuras 27A-27C muestran el efecto de las variantes de mAb de CD3 sobre la citotoxicidad de una molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 utilizando un ensayo de LDH. Se obtuvieron resultados similares utilizando un ensayo de luciferasa y con moléculas de unión triespecíficas que tienen un dominio de unión a B7-H3 en lugar del dominio de unión de mAb 1 de 5T4. Los resultados muestran que la molécula de unión triespecífica con mAb 2 de CD3 Low mostró una citotoxicidad mínima, pero que la molécula de unión triespecífica con mAb 2 de CD3 Fast mostró citotoxicidad con células T CD8+ y células pan T en un grado mucho mayor que con células T CD4+.

Para evaluar los efectos de las moléculas de unión triespecíficas sobre los perfiles de citocinas, las PBMC de dos donantes se incubaron en presencia de concentraciones crecientes de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8, de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 y de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast/ mAb 1 de CD8 durante 24 horas. Se midieron los niveles de seis citocinas (IFN-y, TNF-a, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2). Los resultados se muestran en las Figuras 28A-28F (Donante 1) y en las Figuras 29A-29F (Donante 2). Los resultados muestran sorprendentemente una disminución drástica de las citocinas liberadas por las PBMC en comparación con un DART™ que se dirige solamente a CD3 y no es selectivo para células T CD8+.

La molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 mostró una potencia similar a un DART™, CE50 1 pM en comparación con 1,3 pM para el DART™, utilizando células pan T como efectores. Es posible que la actividad del DART™ ya sea máxima para las células T tanto CD4+ como CD8+. La molécula de unión triespecífica desplaza la actividad hacia la población CD8+ y la aleja de la población CD4+, lo que es beneficioso en términos de liberación de citocinas, particularmente de IL-2 y TNFa.

Aunque la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Low / mAb 1 de CD8 fue capaz de unirse a las células T CD4+ y CD8+, su capacidad para redirigir la citólisis de o por esas células se redujo en gran medida en comparación con el dominio de unión del mAb 2 de CD3 no mutado. La molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8, por otro lado, conservó la actividad de CTL, particularmente con las células T CD8+ en comparación/en relación con las células T CD4+ (diferencia de 75 veces en las CE50) en comparación con la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 (diferencia de 7 veces en CE50). La CE50 para la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 Fast / mAb 1 de CD8 era similar a la de la molécula de unión triespecífica mAb 1 de 5T4 / mAb 2 de CD3 / mAb 1 de CD8 (2,8 frente a 1,3 pM), pero la diferencia drástica en el direccionamiento a células T CD8+ frente a CD4+ prácticamente eliminó la liberación de citocinas que se observaba con 5T4 X CD3 DART™ en cultivos de PBMC humanas.

Ejemplo 8

Sumario de datos de CE50 de moléculas de unión triespecíficas ilustrativas

En síntesis, se construyó una serie de 14 moléculas de unión triespecíficas (Tabla 25), teniendo cada una dos dominios de unión de tipo diacuerpo (sitio A y sitio B) y un dominio de enlace de tipo Fab (sitios C):

continuación

Los datos de CE50 de dichas moléculas de unión triespecíficas se resumen en la Tabla 26 (Células diana: JIMT1-luc; Relación de células efectoras:diana 5:1). En algunos casos (mostrado como NR en la Tabla 26), la CE50 no pudo calcularse a partir de los datos porque no se logró la máxima muerte.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de unión triespecífica capaz de unirse inmunoespecíficamente a tres epítopos diferentes, que comprende:

(a) un dominio de unión a antígeno I que comprende un dominio VHⁱ y un dominio VLⁱ, capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo I presente en un primer antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno I es un dominio de unión de tipo diacuerpo;

(b) un dominio de unión a antígeno II que comprende un dominio VHⁱⁱ y un dominio VLⁱⁱ, capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo II presente en un segundo antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno II es un dominio de unión de tipo diacuerpo;

(c) un dominio de unión a antígeno III que comprende un dominio VHiii y un dominio VLiii, capaz de unirse inmunoespecíficamente a un epítopo III presente en un tercer antígeno, en donde el dominio de unión a antígeno III es un dominio de unión de tipo no diacuerpo;

(d) un dominio promotor de heterodímeros de espiral E y un dominio promotor de heterodímeros de espiral K; (e) un dominio Fc que se forma mediante la asociación de dos dominios CH2-CH3 entre sí;

(f) dominios que contienen cisteína a través de los cuales diferentes cadenas polipeptídicas forman complejos de manera covalente entre sí;

(g) un enlazador 1 entre el dominio VHi y el dominio VLii y entre el dominio VHii y el dominio VLi; y

(h) un enlazador 2 entre el dominio VHⁱⁱ y un dominio promotor de heterodímeros o entre el dominio VHⁱ y un dominio promotor de heterodímeros;

en donde:

el primer antígeno, el segundo antígeno y el tercer antígeno son el mismo antígeno, o son independientemente iguales o diferentes de otro de los antígenos; y

la molécula de unión triespecífica tiene la estructura de dominio representada en una cualquiera de las Figuras 4A, 4C, 4E, 4F, 4H, 4I y 4K;

opcionalmente en donde la molécula de unión triespecífica comprende además:

(i) un enlazador 3 entre un dominio promotor de heterodímeros y uno de los dominios CH2-CH3;

(j) un enlazador 4 entre el dominio VLⁱ y uno de los dominios CH2-CH3;

(k) un dominio CL; y/o

(l) un dominio CH1-bisagra.

2. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 1, en donde uno de los dos dominios CH2-CH3 es un dominio CH2-CH3 portador del botón y el otro de los dos dominios CH2-CH3 es un dominio CH2-CH3 portador del ojal.

3. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio CH2-CH3 comprende:

(A) una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:

N297Q, D265A, F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L;

(B) dos sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L y P396L;

(2) F243L y R292P;

(3) R292P y V305I; y

(4) L234A y L235A;

(C) tres sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P y Y300L;

(2) F243L, R292P y V305I;

(3) F243L, R292P y P396L; y

(4) R292P, V305I y P396L;

(D) cuatro sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L y P396L; y

(2) F243L, R292P, V305I y P396L; o

(E) cinco sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en:

(1) F243L, R292P, Y300L, V305I y P396L; y

(2) L235V, F243L, R292P, Y300L y P396L.

4. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:

el enlazador 1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1;

el enlazador 2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o 131;

cada dominio promotor de heterodímeros comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 3, 4, 115 o 116;

el enlazador 3 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 5;

el enlazador 4 comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 15, 16, 131 o 132 o GGC o GGG;

uno de los dominios CH2-CH3 comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 7 u 8; el dominio CH1-bisagra comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 9 o 10; y

el dominio que contiene cisteína comprende la secuencia de las SEQ ID NO: 2, 5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 127, 128, 129, 130 o 133.

5. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde uno del epítopo I, epítopo II o epítopo III es un epítopo de un receptor celular.

6. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de:

una célula efectora elegida de CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD22, CD32B, CD64, Receptor de células B (BCR), Receptor de células T (TCR) o Receptor NKG2D; o

CD8; o

un antígeno asociado a enfermedad.

7. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 6, en donde:

(A) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo de CD3, un epítopo de CD8 y un epítopo del antígeno asociado a enfermedad;

(B) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo de CD3, un epítopo del antígeno asociado a enfermedad y un epítopo de CD8;

(C) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo de CD8, un epítopo de CD3 y un epítopo del antígeno asociado a enfermedad;

(D) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo de CD8, un epítopo del antígeno asociado a enfermedad y un epítopo de CD3;

(E) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del antígeno asociado a enfermedad, un epítopo de CD3 y un epítopo de CD8;

o

(F) el epítopo I, el epítopo II y el epítopo III son, respectivamente, un epítopo del antígeno asociado a enfermedad, un epítopo de CD8 y un epítopo de CD3.

8. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de CD3 y el dominio de unión al antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de CD3:

(a) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 17 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 18, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en SASSSVSYMN, una CDR^l2 que consiste en DTSKLAS y una CDR^l3 que consiste en QQWS^s N^pFTF y un dominio variable de cadena pesada que comprende una Cd Rh1 que consiste en RYTMH, una CDRh2 que consiste en YINPSRGYTNYNQKFKD y una CDRH3 que consiste en YYDDHYCL;

(b) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 19 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 20, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en SASSSVSYMN, una CDRl2 que consiste en DTSKLAS y una CDRl3 que consiste en QQWSSNPPT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR^h1 que consiste en SYTMH, una CDRH2 que consiste en YINPRSGYTHYNQKLKD y una CDR^h3 que consiste en SAYYDYDGFAY;

(c) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 22, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en TLSSGNIENNYVH, una CDR^l2 que consiste en DDDKRPD y una ^c D^rl3 que consiste en HSY^v S^s FNV y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR^h1 que consiste en SSFPMA, una CDRH2 que consiste en TISTSGGRTYYRDSVKG y una CDRh3 que consiste en FrQYSGGFDY;

(d) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 23 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 25, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR^l1 que consiste en SASSSVSYMN, una CDRl2 que consiste en DSSKLAS y una CDRl3 que consiste en QQWSSNPPT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en RSTMH, una CDRH2 que consiste en YINPSSAYTNYNQKFKD y una CDR^h3 que consiste en PQVHYDYNGFPY;

(e) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 24 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 25, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR^l1 que consiste en SASSSVSYMN, una CDRl2 que consiste en DSSKLAS y una CDRl3 que consiste en QQWSSNPPT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en RSTMH, una CDRH2 que consiste en YINPSSAYTNYNQKFKD y una CDRh3 que consiste en PQVHYDYNGFPY;

(f) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 27, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en SSTGAVTTSNYAN, una CDRl2 que consiste en GTNKRAP y una CDRl3 que consiste en ALWYSNLWV y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR^h1 que consiste en TYAMN, una CDRH2 que consiste en IRSKYNNYATYYADSVKD y una CDR^h3 que consiste en HGNFGNSYVSWFAY;

(g) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 28, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en SSTGAVTTSNYAN, una CDR^l2 que consiste en GTNKRAP y una CDR^l3 que consiste en ALWYSNLWV y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en TYAMN, una CDRH2 que consiste en IRSKYNNYATYYADSVKG y una CDRh3 que consiste en HGNFGNSYVSWFAY; o

(h) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 101 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 102, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en RSSTGAVTTSNYAN, una CDRL2 que consiste en GTNKRAP y una CDRL3 que consiste en ALWYSNLWV y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en GFTFSTYAMN, una CDR^h2 que consiste en RI^rS^kYNNYATYYADSVKG y una CDR^h3 que consiste en HKNFGNSYVTWFAY.

9. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en donde uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de CD8 y el dominio de unión al antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de CD8:

(a) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 29 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 30; o

(b) comprende el dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 31 y el dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 32, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR^l1 que consiste en KGSQDINNYLA, una CDR^l2 que consiste en NTDILHT y una CDR^l3 que consiste en YQYNNGYT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una ^c DR^h1 que consiste en DFGMN, una CDRH2 que consiste en LIYYDGSNKFYADSVKG y un CDRH3 que consiste en PHYDGYYHFFDS.

10. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde el antígeno asociado a enfermedad es un antígeno de cáncer que está dispuesto en la superficie de una célula cancerosa.

11. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 10, en donde el antígeno de cáncer es el antígeno de cáncer de colon 19.9; antígeno de mucina de cáncer gástrico 4.2; antígeno de carcinoma colorrectal A33; ADAM-9; antígeno-alfa-fetoproteína oncofetal AFP; ALCAM; B7-H3; BAGE; beta-catenina; CA125; Carboxipeptidasa M; B1; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD30; CD33; CD36; CD40/CD154; CD45; CD56; CD46; CD52; CD79a/CD79b; CD103; CD317; CDK4; antígeno carcinoembrionario CEA; CEACAM5 y CEACAM6; CO-43 (grupo sanguíneo Leb) y CO-514 (grupo sanguíneo Lea); CTLA-1 y CTLA-4; Citoqueratina 8; DR5; Serie E1 (grupo sanguíneo B); receptor de factor de crecimiento epidérmico EGF-R; Receptores de efrina (y en particular EphA2); Erb (ErbB1; ErbB3; ErbB4); antígeno de adenocarcinoma de pulmón F3; antígeno FC10.2; Ga GE (GAGE-1; Ga GE-2); GD2/GD3/GD49/GM2/GM3; GICA 19-9; gp37 (antígeno de células T de leucemia humana); gp75 (antígeno de melanoma); gp100; HER-2/neu; antígeno CD20 de linfoma B humano; antígeno de glóbulos grasos de leche humana; virus del papiloma humano E6/virus del papiloma humano E7; HMW-MAA (antígeno de melanoma de alto peso molecular); antígeno I (antígeno de diferenciación); I(Ma) encontrado en adenocarcinomas gástricos; Integrina Alfa-V-Beta-6 Integrina p6 (ITGB6); Receptor a2 de interleucina-13 (IL13Ra2); JAM-3; KID3; KID31; antígeno de pancarcinoma KS 1/4; KSA (17-1A); antígenos de carcinoma de pulmón humano L6 y L20; LEA; LUCA-2; M1:22:25:8, M18, M39; MAGE (MAGE-1; MAGE-3); MART; Myl, MUC-1; MUM-1; N-acetilglucosaminiltransferasa; neoglicoproteína; NS-10; OFA-1 y OFA-2; Oncostatina M (receptor beta de oncostatina); p15; PSA (antígeno específico de próstata); PSMA; PEMA (antígeno de mucina epitelial polimórfica); PIPA; fosfato ácido prostático; R24; ^rO^r 1; SSEA-1, SS^eA-3 y SSEA-4; sTn; péptido derivado del receptor de células T; T5A7; Antígenos tisulares 37; TAG-72; TL5 (grupo sanguíneo A); receptor de TNF (receptor de TNF-a, receptor de TNF-p; o receptor de TNF-^y); TRA-1-85 (grupo sanguíneo H); receptor de transferrina; antígeno de trasplante específico de tumor TSTA; VEGF-R; hapteno Y, Ley; o 5T4.

12. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 11, en donde uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo de B7-H3, A33, 5T4 o ROR1 y:

(a) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de B7-H3 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 39 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 40, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en KASQNVDTNVA, una CDRl2 que consiste en SASYRYS y una CDRl3 que consiste en QQYNNYPFT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR^hI que consiste en GFTFSSFGMH, una CDR^h2 que consiste en YISSDSSAIYYADTVK y una CDR^h3 que consiste en GRENIYYGSRLDY;

(b) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de B7-H3 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 41 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 42, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en RASQDISNYLN, una C^d R^l2 que consiste en YTSRLHS y una ^c D^rl3 que consiste en Q^q GⁿTLPPT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en GYTFTSYWMQ, una c DRh2 que consiste en TIYPGDGDTRYTQKFK y una CDRh3 que consiste en RGIPRLWYFDV;

(c) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de B7-H3 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 43 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 44, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR^l1 que consiste en RASESIYSYLA, una CDRl2 que consiste en NTKTLPE y una CDRl3 que consiste en QHhYgTPPW y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR^h1 que consiste en SYGMS, una CDR^h2 que consiste en VATINSGGSNT^y Y^p DSL^kG y una C^d R^h3 que consiste en HDGGAMDY;

(d) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de A33 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 45 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 46, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR^l1 que consiste en SARSSIS^fM^y , una CDR^l2 que consiste en DTSNLAS y una CDR^l3 que consiste en QQWSS^y P^lT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR^h1 que consiste en GYTFSGSWMN, una CDR^h2 que consiste en RIYPGDGETNYNGKFKD y una CDR^h3 que consiste en IYGNNVYFDV;

(e) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de 5T4 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 47 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 48, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en RASQGISNYLA, una CDRl2 que consiste en RANRLQS y una CDRl3 que consiste en LQYDDFPWT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en GYTFTSFWMH, una c DRh2 que consiste en RIDPNRGGTEYNEKAKS y una CDR^h3 que consiste en GNPYYPMDY;

(f) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de 5T4 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 49 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 50, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en RSSQSIVYSNGNTYLE, una CDRl2 que consiste en KVSNRFS y una c Drl3 que consiste en fQg SHVPFT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en GYTFTSYWIT, una CDRh2 que consiste en DIYPGSGRANYNEKFKS y una CDRh3 que consiste en YGPLFTTVVDPNSYAMDY;

(g) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de ROR1 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 51 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 52, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en TLSSGHKTDTID, una CDR^l2 que consiste en LEGSGSY y una CDR^l3 que consiste en GTDYPGNYL y un dominio variable de cadena pesada que comprende una c DRh1 que consiste en GFTFSDYYMS, una CDRh2 que consiste en TIYPSSGK^tY^yADSVKG y una CDR^h3 que consiste en DSYADDAALFDI;

(h) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de ROR1 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 53 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 54, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR^l1 que consiste en KASQNVDAAVA, una CDRl2 que consiste en SASNRYT y una CDRl3 que consiste en QqYd IYPYT y un dominio variable de cadena pesada que comprende una Cd Rh1 que consiste en DYEMH, una CDRh2 que consiste en AIDPETGGTAYNQKFKG y una CDRh3 que consiste en YYDYDSFTY;

(i) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de ROR1 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 55 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 56, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en QASQSIDSNLA, una CDR^l2 que consiste en RASNLAS y una CDR^l3 que consiste en LGGV^g N^v SYRTS y un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDRh1 que consiste en DYPIS, una CDRh2 que consiste en FINSGGSTWYASWVKG y una CDR^h3 que consiste en ^gY^sTYYGDFNI; o

(j) el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de ROR1 comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 57 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 58, o comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDRl1 que consiste en TLSSAHKTDTID, una CDRl2 que consiste en GSYTKRP y una CDRl3 que consiste en Ga Dy IGGYV y un dominio variable de cadena pesada que comprende una C^d R^h1 que consiste en AYYMS, una CDR^h2 que consiste en TIYPSSGKTYYATWVNG y una CDR^h3 que consiste en DSYADDGALFNI.

13. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en donde el antígeno asociado a enfermedad es un antígeno de patógeno que está dispuesto en la superficie de un patógeno o de una célula infectada por patógeno.

14. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 13, en donde:

el patógeno es un virus, y/o

el patógeno es el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o el virus sincitial respiratorio (RSV), y/o el antígeno de patógeno es gp41 de VIH, gp120 de VIH o glicoproteína F de RSV.

15. La molécula de unión triespecífica de la reivindicación 14, en donde uno del epítopo I, el epítopo II o el epítopo III es un epítopo gp41 de VIH, gp120 de VIH o glicoproteína F de RSV y el dominio de unión a antígeno que es capaz de unirse inmunoespecíficamente al epítopo de gp41 de VIH, gp120 de VIH o glicoproteína F de RSV:

(a) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 33 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 34;

(b) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 35 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 36; o

(c) comprende un dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 37 y un dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 38.

16. La molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que tiene la estructura de dominio representada en la Figura 4A o en la Figura 4F.

17. Una composición farmacéutica que comprende la molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y un vehículo, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

18. Una molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o una composición farmacéutica de la reivindicación 17, para su uso como un medicamento.

19. Una molécula de unión triespecífica de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o una composición farmacéutica de la reivindicación 17, para su uso en el tratamiento de un cáncer o una infección por patógenos.