JP2020072664A

JP2020072664A - 三重特異性結合分子及びその使用方法

Info

Publication number: JP2020072664A
Application number: JP2019192047A
Authority: JP
Inventors: レスリーエス．ジョンソン; Leslie S Johnson; リンホアン; Huang Ling; グルナドレディチチリ; Reddy Chichili Gurunadh; カルパナシャー; Shah Kalpana; チャーインカオラム; Kao Lam Chia-Ying; ステファンジェームズバーク; James BURKE Stephen; リキンリュウ; Liqin Liu; ポールエー．ムーア; A Moore Paul; エツィオボンビニ; Bonvini Ezio; バスワティバラー; Barat Bhaswati
Original assignee: Macrogenics Inc
Current assignee: Macrogenics Inc
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2020-05-14
Also published as: WO2015184203A1; JP2017519743A; TN2016000525A1; RU2020111366A; ZA201607995B; NZ726514A; CN106414497A; PH12016502369A1; SG11201609917PA; EP3152235A4; PL3152235T3; PE20170766A1; KR20170012351A; TW201946934A; SG10201913680PA; EP3148580B1; SG10201913324PA; MX2020014221A; SG11201609912TA; US10647768B2

Abstract

【課題】３つの結合ドメインを有し、３つのエピトープへの配位結合を仲介できる多重鎖ポリペプチド分子である、三重特異性結合分子を提供する。【解決手段】三重特異性結合分子が、いずれの３つの異なるエピトープに結合できるように選択された結合ドメイン。このようなエピトープは、同一の抗原のエピトープ又は２つ若しくは３つの異なる抗原のエピトープであってよい。好ましい実施形態では、このようなエピトープのうちの１つはＣＤ３に結合でき、このようなエピトープのうちの第２のものはＣＤ８に結合でき、このようなエピトープのうちの第３のものは疾患関連抗原のエピトープに結合できる。新規のＲＯＲ１結合性抗体及びその誘導体、並びにこのような組成物のための使用法。【選択図】図４Ａ

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、米国特許出願第６２／００８，２２９号（２０１４年６月５日出願；係属）、米国特許出願第６２／００４，５７１号（２０１４年５月２９日出願；係属）、及び米国特許出願第６２／１０７，８２４号（２０１５年１月２６日出願；係属）に対する優先権を主張するものであり、上述の特許出願はそれぞれ、参照によりその全体が本出願に援用される。

［配列表の参照］
本出願は、連邦規則法典第３７巻第１．８２１節以下による１つ又は複数の配列表を含み、これらの配列表は、コンピュータ可読媒体（ファイル名：１３０１＿０１１４ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、２０１５年５月１８日作成、サイズ：２４４，０２１バイト）において開示されており、上記ファイルは、参照によりその全体が本出願に援用される。

本発明は、３つの結合ドメインを有し、従って３つのエピトープへの協調的結合を仲介できる多重鎖ポリペプチド分子である、三重特異性結合分子に関する。結合ドメインは、三重特異性結合分子が、いずれの３つの異なるエピトープに結合できるように選択してよい。このようなエピトープは、同一の抗原のエピトープ又は２つ若しくは３つの異なる抗原のエピトープであってよい。好ましい実施形態では、このようなエピトープのうちの１つはＣＤ３に結合でき、このようなエピトープのうちの第２のものはＣＤ８に結合でき、このようなエピトープのうちの第３のものは疾患関連抗原のエピトープに結合できる。本発明はまた、新規のＲＯＲ１結合性抗体及びその誘導体、並びにこのような組成物のための使用法も提供する。

Ｉ．哺乳類免疫系
哺乳類免疫系は、例えば創傷、感染及び新生物を含む多様な状態に対する防御として機能する。ヒト及び他の哺乳類が病原体、外来物質及び癌抗原に対する免疫応答を発現する効率は、２つの特徴：抗原認識に対する免疫応答の優れた特異性、及び同一の抗原による再活性化に対するより迅速かつより活発な応答を可能とする免疫記憶に基づくものである（非特許文献１、２）。

哺乳類免疫系は、２つの別個の、ただし相互に関連した系：細胞免疫系及び体液免疫系によって仲介される。一般に、体液系は、上記系が身体にとって外来物であると認識する産物と化合してこれを中和する能力を有する、可溶性産物（抗体又は免疫グロブリン）によって仲介される。対照的に、細胞免疫系は、多様な治療的役割を果たす「Ｔ細胞」と呼ばれる特定の細胞の可動化を伴う。Ｔ細胞は、胸腺に由来し、組織、リンパ系及び循環器系の間を循環するリンパ球である。外来構造（抗原）の存在及び認識に応答して、Ｔ細胞は「活性化され（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）」た状態となり、免疫応答を開始する。多くの例では、これらの外来抗原は、新生物又は感染の結果として宿主細胞上に発現する。Ｔ細胞自体は抗体を分泌しないが、Ｔ細胞は通常、第２の分類のリンパ球であるＢ細胞（これは骨髄に由来する）による抗体分泌のために必要である。重要なことに、Ｔ細胞は、卓越した免疫学的特異性を示すことによって、抗原を互いに識別できる。２つのタイプのＴ細胞、「Ｔヘルパー細胞」及び「細胞毒性Ｔ細胞」が特に関係する。

Ｔヘルパー細胞は、糖タンパク質ＣＤ４の発現を特徴とする（即ちＴヘルパー細胞は「
ＣＤ４⁺」である）。ＣＤ４⁺Ｔ細胞は、殆どの哺乳類免疫及び自己免疫応答の必須のオーガナイザである（非特許文献３）。ＣＤ４⁺Ｔ細胞の活性化は、抗原：抗原提示細胞（例
えばＢ細胞、マクロファージ又は樹状細胞）の表面上に配列された主要な組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）分子複合体と、ナイーブＣＤ４⁺Ｔ細胞の表面上に配列された２
つの分子の複合体、即ちＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）及びＣＤ３細胞表面受容体リガンドとの間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている。活性化されたＴヘルパー細胞は、標的細胞への炎症応答を仲介できるＴｈ１細胞を増殖させることができる。

細胞毒性Ｔ細胞は、ＣＤ８の発現を特徴とする（即ち細胞毒性Ｔ細胞は、ＣＤ３⁺と同
様に「ＣＤ８＋」である）。ＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性化は、抗原：標的細胞の表面上に配列
された主要な組織適合性クラスＩ（ＭＨＣＩ）分子複合体と、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の表面上
に配列されたＣＤ８及びＴ細胞受容体の複合体との間の共刺激性相互作用によって仲介されることが分かっている。特定の免疫系のみによって発現するＭＨＣＩＩ分子とは異なり、ＭＨＣＩ分子は極めて広範に発現する。従って細胞毒性Ｔ細胞は、広範な細胞タイプに結合できる。活性化された細胞毒性Ｔ細胞は、細胞毒であるパーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシンの放出によって、細胞殺滅を仲介する。パーフォリンの作用により、グランザイムは標的細胞の細胞質に入り、グランザイムのセリンプロテアーゼ機能によって、最終的に標的細胞のアポトーシス（プログラムされた細胞死）につながる一連のシステインであるカスパーゼカスケードをトリガする。

Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）は、共有結合したα及びβ鎖のヘテロ二量体（「ＴＣＲαβ」）である。これらの鎖は、長さがアミノ酸２５９個（α）及び２９６個（β）のクラスＩ膜ポリペプチドである。ＣＤ３分子は、５つの別個のポリペプチド鎖（ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖及び２つのゼータ鎖）からなるＴ細胞共受容体である。個々のポリペプチド鎖は連結して、３つの二量体の複合体（εγ、εδ、ζζ）を形成する（非特許文献４、５、６、７、８）。ＣＤ３複合体はＴＣＲと連結して、Ｔリンパ球中で活性化信号を生成する。ＣＤ３の不在下では、ＴＣＲは適切に集合せず、分解してしまう（非特許文献９）。ＣＤ３は、全ての成熟したＴ細胞に結合した状態で見られ、他の細胞タイプには実質的に見られない（非特許文献１０、１１、１２参照）。

（Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖又はＣＤ２４７としても知られる）ＣＤ３ζ鎖を伴うＴＣＲとＣＤ３との複合体は、ＴＣＲ複合体を含む（非特許文献１３、４）。上記複合体は、多数（１０個）の免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するため、特に重要である。

Ｔ細胞活性化には２つの相互作用が必要である（非特許文献１４、１５）。第１の相互作用では、細胞は、これがナイーブＴリンパ球のＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）に結合できるように、上記細胞の主要な組織適合性複合体に結合した関連する標的抗原を示さなければならない。第２の相互作用では、上記細胞のリガンドは、Ｔリンパ球の共受容体に結合しなければならない（非特許文献３、１６）。これら両方の刺激性信号を受けたＴ細胞は次にサイトカイン（インターロイキン‐２、インターロイキン‐１２等）に応答する。ＴＣＲの会合中にこれら両方の共刺激性信号が存在しない場合、Ｔ細胞は機能的非応答状態となり、これはクローン麻痺と呼ばれる（非特許文献１７）。病理的状態では、Ｔ細胞は、Ｉ型糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症といった様々な器官特異性自己免疫疾患において主要な役割を果たす（非特許文献３）。

Ｔ細胞が適応免疫応答を達成するようにＴ細胞を活性化するために、２つの信号が必要であることにより、系内のＴ細胞が認識可能な場所にある抗原提示細胞上に存在し得る自己抗原に対する応答を回避するための機構が提供されると考えられる。Ｔ細胞とある細胞の接触が、２つの必要な信号のうちの一方の生成しかもたらさない場合、Ｔ細胞は活性化
されず、適応免疫応答は発生しない。

ＩＩ．抗体及び他のエピトープ結合分子
Ａ．抗体
「抗体」は、当該免疫グロブリン分子の可変ドメインに位置する少なくとも１つの抗原認識部位によって、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等の標的に特異的に結合できる、免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、この用語は、完全なポリクローナル又はモノクローナル抗体だけでなく、その突然変異体、自然に発生する変異体、必要な特異性の抗原認識部位を有する抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化抗体及びキメラ抗体、並びに必要な特異性の抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。本出願全体を通して、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸残基の番号付与は、非特許文献１８中のもののようなＥＵインデックスに従ったものである。本明細書において使用される場合、「抗体の抗原結合性断片」は、少なくとも１つの抗原認識部位を有する抗体の一部分である。本明細書において使用される場合、この用語は、断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂Ｆｖ）及び単鎖分子（例え
ばｓｃＦｖ）を包含する。

天然抗体（ＩｇＧ抗体等）は、２つの重鎖と複合体化した２つの軽鎖からなる。各軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含有する。各重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）、並びにＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に位置するヒンジドメインを含有する。従って、自然に発生する免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造単位は、通常は約１５０，０００Ｄａの糖タンパク質として発現される、軽鎖及び２つの重鎖を有する三量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は、抗原認識に主要な役割を果たす約１００〜１１０個の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を画定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメイン及び１つのヒンジ領域を有する。従って、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ‐ＶＬ‐ＣＬ‐ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ‐ＶＨ‐ＣＨ１‐Ｈ‐ＣＨ２‐ＣＨ３‐ｃである（ここでＨはヒンジ領域であり、ｎ及びｃはそれぞれ、ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端を表す）。

完全な未修飾抗体（例えばＩｇＧ抗体）の、抗原のエピトープに結合する能力は、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖上の可変ドメイン（即ちそれぞれＶＬドメイン及びＶＨドメイン）の存在に左右される。抗体軽鎖と抗体重鎖との相互作用、特にそのＶＬドメインとＶＨドメインとの相互作用は、抗体のエピトープ結合部位のうちの１つを形成する。ＩｇＧ分子の可変領域は、エピトープと接触した残基を含有する複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びフレームワークセグメント（ＦＲ）と呼ばれる非ＣＤＲセグメントからなり、上記フレームワークセグメントは、一般にＣＤＲループの構造を維持してＣＤＲの位置を決定することにより、このような接触を可能とする（ただし特定のフレームワーク残基も抗原に接触し得る）。従って、ＶＬ及びＶＨドメインは、構造ｎ‐ＦＲ１‐ＣＤＲ１‐ＦＲ２‐ＣＤＲ２‐ＦＲ３‐ＣＤＲ３‐ＦＲ４‐ｃを有する。抗体軽鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲ_L１ドメイン、ＣＤＲ_L２ドメイン、及びＣＤＲ_L３ドメインと
呼ばれる。同様に、抗体重鎖の第１、第２及び第３のＣＤＲである（又は第１、第２及び第３のＣＤＲとして機能し得る）ポリペプチドは、本明細書ではそれぞれＣＤＲ_H１ドメ
イン、ＣＤＲ_H２ドメイン、及びＣＤＲ_H３ドメインと呼ばれる。よって、ＣＤＲ_L１ドメ
イン、ＣＤＲ_L２ドメイン、ＣＤＲ_L３ドメイン、ＣＤＲ_H１ドメイン、ＣＤＲ_H２ドメイン、及びＣＤＲ_H３ドメインという用語は、あるタンパク質に組み込まれた場合に、当該タ
ンパク質が、軽鎖及び重鎖若しくはダイアボディ若しくは単鎖結合分子（例えばｓｃＦｖ、ＢｉＴｅ等）を有する抗体であるか、又は別のタイプのタンパク質であるかにかかわらず、当該タンパク質を、特定のエピトープに結合できるようにする、ポリペプチドを対象
としている。このような抗体とは対照的に、ｓｃＦｖ構造は、単一ポリペプチド鎖が含有する抗体のＶＬ及びＶＨドメインを備え、これらのドメインは、２つのドメインの機能性エピトープ結合部位への自己集合を可能とするのに十分な長さのフレキシブルリンカーによって隔てられる。ＶＬ及びＶＨドメインの自己集合が、不十分な長さ（約１２個未満のアミノ酸残基）のリンカーによって不可能となる場合、ｓｃＦｖ構造のうちの２つが互いに相互作用して、２価分子を形成でき、この２価分子において一方の鎖のＶＬが他方の鎖のＶＨと連結する（非特許文献１９において概説されている）。

抗体は、診断学におけるその公知の使用法に加えて、治療剤として有用であることが示されている。この数十年、抗体の治療的潜在能力に対する関心が再び高まっており、抗体は、生命工学由来の薬剤の筆頭となるクラスの１つとなっている（非特許文献２０）。２００近くの抗体系薬剤が使用認可済み、又は開発中である。

用語「モノクローナル抗体」は均質な抗体の集団を指し、上記モノクローナル抗体は、抗原の選択的結合に関わる（自然に発生する又は自然に発生しない）アミノ酸から構成される。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープ（又は抗原部位）に対して指向性を有する。用語「モノクローナル抗体」は、完全なモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけでなく、これらの断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）₂、Ｆｖ
等）、単鎖（ｓｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を備える融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、及び必要な特異性及び抗原への結合能力を有する抗原認識部位を備える免疫グロブリン分子の他のいずれの修飾構成を包含する。抗原の源又は抗原を作製する方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、遺伝子導入動物等による）に関して、限定は意図されていない。この用語は、免疫グロブリン全体、及び「抗体」の定義において上述した断片等を含む。モノクローナル抗体の作製方法は当該技術分野において公知である。採用してよい１つの方法は、非特許文献２１の方法又はその修正例である。典型的には、モノクローナル抗体はマウス、ラット又はウサギにおいて発現する。上記抗体は、動物を、所望のエピトープを含有する免疫原性量の細胞、細胞抽出物又はタンパク製剤で免疫化することによって産生される。免疫原は、一次細胞、培養された細胞株、癌細胞、タンパク質、ペプチド、核酸又は組織とすることができるが、これらに限定されない。免疫化に使用してよい細胞は、これらを免疫原として使用するよりもある期間（例えば少なくとも２４時間）だけ前に、培養してよい。細胞は単独で、又はＲｉｂｉ等の非変性アジュバントと組み合わせて、免疫原として使用してよい（非特許文献２２参照）。

一般に細胞は、免疫原として使用される際、完全な状態、及び好ましくは生存できる状態に維持しなければならない。完全な細胞は、破裂した細胞よりも、免疫性を与えられた動物が抗原をより良好に検出できるようにすることができる。変性又は強いアジュバント、例えばフロイントアジュバントの使用は、細胞を破裂させる場合があり、従って推奨されない。免疫原は、２週間に１回若しくは１週間に１回等、周期的な間隔で複数回投与してよく、又は動物中（例えば組織組み換え中）に生存能力を維持できるように投与してよい。あるいは、所望の病原性エピトープに対する免疫特異性を有する既存のモノクローナル抗体及び他の同等の抗体は、当該技術分野で公知のいずれの手段によって、組み換え配列及び産生できる。一実施形態では、このような抗体を配列し、続いてポリヌクレオチド配列を発現又は繁殖のためのベクターにクローン化する。関心対象の抗体をエンコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に保持され、続いて上記宿主細胞を、将来使用するために膨張させて冷凍できる。このような抗体のポリヌクレオチド配列は、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはイヌ化抗体を生成するため、又は抗体の親和性若しくは他の特徴を改善するための、遺伝子操作のために使用してよい。抗体をヒト化する際の一般原理は、抗体の抗原結合部分の塩基配列を保持しながら、抗体の非ヒト残部をヒト抗体配列と交換するステップを伴う。モノクローナル抗体をヒト化するためには、４つの一般的なステップが
存在する。上記ステップは以下の通りである：（１）開始抗体の軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド及び予測されるアミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体又はイヌ化抗体を設計するステップ、即ちヒト化又はイヌ化プロセス中に使用する抗体フレームワーク領域を決定するステップ；（３）実際のヒト化又はイヌ化法／技術；並びに（４）ヒト化抗体のトランスフェクション及び発現。例えば特許文献１、２、３、４を参照。

このような抗体のエピトープ結合ドメインは、定常ドメインに融合した完全な可変ドメイン、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域上に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを備えてよい。抗原結合部位は野生型であってよく、又は１つ若しくは複数のアミノ酸置換によって修飾されてよい。これにより、ヒト個体の免疫原としての不変領域が削減されるが、外来の可変領域に対する免疫応答の可能性は残る（非特許文献２３）。別のアプローチは、ヒト由来不変領域を提供することだけでなく、可変領域を修飾して、ヒト型に可能な限り近くなるように再成形することに焦点を当てている。重鎖及び軽鎖両方の可変領域は、問題となる抗原に応答して変化して結合能力を決定する、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が隣接する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を内包することが知られており、上記フレームワーク領域は、ある所与の種において相対的に保存され、またＣＤＲのための足場を提供するものと推定される。ある特定の抗原に対して非ヒト抗体を調製する際、非ヒト抗体由来のＣＤＲを、修飾されるヒト抗体内に存在するＦＲに移植することによって、可変領域を「再成形」又は「ヒト化」できる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、非特許文献２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３によって報告されている。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つのＣＤＲ全てを含有するヒト化マウス抗体）。他の実施形態では、ヒト化抗体は、オリジナルの抗体に対して配列が異なる改変された１つ又は複数のＣＤＲ（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ）を有する。

Ｂ．二重特異性抗体、多重特異性ダイアボディ及びＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ
天然の抗体は、１つのエピトープ種のみと結合できる（即ち「単一特異性」である）が、これらは当該種の複数の複製にも結合できる（即ち２価性又は多価性を呈することができる）。幅広い組み換え二重特異性抗体フォーマットが開発されており（例えば特許文献５、６、７、８、９、１０、１１参照）、その殆どは、抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ若しくはＩｇＭ）を当該抗体コアに対する若しくは当該抗体コア内の更なる結合タンパク質（例えばｓｃＦｖ、ＶＬＶＨ等）に融合させるため、又は複数の抗体部分を、若しくは（例えば２つのＦａｂ断片若しくはｓｃＦｖ）を、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン若しくは代替となるポリペプチド等のヘテロ二量体化促進ドメインに融合させるために、リンカーペプチドを使用する（特許文献１２、１３、１４、１５）。典型的には、このようなアプローチは妥協及びトレードオフを伴う。例えば特許文献１６、１７、１８は、リンカーの使用によって、治療的設定に問題が生じる場合があることを開示しており、２つ以上の抗原に結合できるように、ＣＬ及びＣＨ１ドメインがそれぞれの自然位置から切り替わり、かつＶＬ及びＶＨドメインが多様化されている、三重特異性抗体を教示している（特許文献１９、２０）。従って、これらの文書に開示されている分子は、結合特異性を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献２１、２２は、ＣＨ２ドメインを修飾して、結合ドメインを備える融合タンパク付加物を含有させるステップを開示している。この文書は、ＣＨ２が、エフェクタ機能の仲介において最低限の役割しか果たさないらしいことを記載している。特許文献２３、２４、２５は、Ｆｃドメインが追加のＶＬ及びＶＨドメインで置換されて、３価結合分子を形成している、組み換え抗体を開示している。特許文献２６、２７は、個々の鎖がｓｃＦｖドメインを含有する組み換えダイアボディを開示している。特許文献２８は、単一のポリペプチド鎖として合成された後、タンパク質分解に供されることによってヘテロ二量体構造が得られる、多価ｆａｂ分子を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、エフェクタ機能を仲介する能
力の全て又はある程度を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。特許文献２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７は、追加の結合ドメイン又は官能基を抗体又は抗体部分に付加するステップ（例えば抗体の軽鎖にダイアボディを付加するステップ、又は抗体の軽鎖及び重鎖に追加のＶＬ及びＶＨドメインを付加するステップ、又は異種融合タンパク質を互いに対して付加するステップ若しくは複数のＦａｂドメインを互いに対して連鎖させるステップ）を開示している。従って、これらの文書に開示されている分子は、ナイーブ抗体構造を、追加の抗原種に結合できる能力と交換している。

本技術分野は更に、２つ以上の異なるエピトープ種と結合できる（即ち２価性又は多価性に加えて二重特異性又は多重特異性を呈することができる）という点でこのような天然抗体とは異なるダイアボディを産生できる可能性に注目している（例えば非特許文献３４、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．による特許文献３８、Ｍｅｒｔｅｎｓｅｔａｌ．による特許文献３９、非特許文献３５、３６、Ｍｅｒｔｅｎｓｅｔａｌ．による特許文献４０、非特許文献３７、３８、３９、４０、４１参照）。

ダイアボディの設計は、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）の構造に基づく。このような分子は、軽鎖及び／又は重鎖可変ドメインを、短い連鎖ペプチドを介して互いに連結することによって作製される。非特許文献４２は、一方の可変ドメインのカルボキシ末端と他方の可変ドメインのアミノ末端との間の約３．５ｎｍを埋める連結ペプチドの例を記載している。他の配列のリンカーも設計及び使用されている（非特許文献４２）。リンカーは、薬剤の付着又は剛性支持体の付着といった追加の機能のために修飾できる。単鎖変異体は、組み換えによって又は合成によって産生できる。ｓｃＦｖの合成産生に関しては、自動化されたシンセサイザを使用できる。ｓｃＦｖの組み換え産生に関しては、ｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫若しくは哺乳類細胞等の真核細胞又は大腸菌等の原核細胞である好適な宿主細胞に導入できる。関心対象のｓｃＦｖをエンコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の従来の操作によって作製できる。得られたｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を用いて単離できる。

特許文献４１、４２は、ＥｒｂＢ２に対して免疫特異的なｓｃＦｖ分子に関する。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（「ＢｉＴＥ」）、あるタイプのｓｃＦｖ分子が記載されている（特許文献４３、；非特許文献４３、４４）。このような分子は、２つの抗原結合ドメインを有する単一のポリペプチド鎖分子からなり、上記２つの抗原結合ドメインは、一方がＣＤ３エピトープに免疫特異的に結合し、もう一方が標的細胞の表面上に存在する抗原に免疫特異的に結合する。

非単一特異性ダイアボディの提供は、異なるエピトープを発現する複数の細胞を共連結（ｃｏ‐ｌｉｇａｔｅ）して共存させることができる能力という有意な利点を提供する。従って２価ダイアボディは、療法及び免疫診断を含む広範な用途を有する。２価性は、様々な用途におけるダイアボディの設計及び加工の大幅な柔軟性を可能とし、これにより、多量体抗原の結合活性の上昇、異なる複数の抗原の架橋、及び両標的抗原の存在に基づく特定の細胞タイプに対する指向性標的化を提供する。当該技術分野において公知のダイアボディ分子は、（〜５０ｋＤａ以下の小さいサイズのダイアボディに関して）その高い結合価、低い解離率及び循環からの迅速な排除により、腫瘍撮像の分野での特定の使用も示している（非特許文献４５）。特に重要なのは、異なる細胞の共連結、例えば細胞毒性Ｔ細胞と腫瘍細胞との架橋である（非特許文献４６、非特許文献４７）。

ダイアボディエピトープ結合ドメインは、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等のいずれの免疫エフェクタ細胞の表面決定基を指向してよく、これらはＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は他の単核細胞上に発現する。多くの研究において、エフェク
タ細胞決定基（例えばＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））に対するダイアボディ結合は、エフェクタ細胞を活性化させることも発見された（非特許文献４７、非特許文献４８、特許文献４４、４５、４６、４７、４８）。通常、エフェクタ細胞の活性化は、抗原に結合した抗体がＦｃ‐ＦｃγＲ相互作用によってエフェクタ細胞に結合することによってトリガされる。従ってこれに関して、ダイアボディ分子は、（例えば当該技術分野において公知の、又は本出願において例示されるいずれのエフェクタ機能アッセイ（例えばＡＤＣＣアッセイ）において分析されるように）Ｆｃドメインを備えるかどうかとは独立して、Ｉｇのような機能性を呈し得る。腫瘍とエフェクタ細胞とを架橋することによって、ダイアボディはエフェクタ細胞を腫瘍細胞近傍にもたらすだけでなく、効果的な腫瘍の殺滅をもたらす（例えば非特許文献４９参照）。

例えば特許文献４９は、２つの抗体をタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ’）₂
断片を得、このような断片を、分子間ジスルフィド結合の形成を防止するための条件下で還元した後、上記断片を混合して二重特異性抗体を産生することによる、二重特異性抗体の産生に関する。特許文献５０、５１、５２、３２、５３、５４、５５は、三重特異性抗体であって、Ｔ細胞と腫瘍細胞上の他の抗原とに同時に結合でき、また二重特異性抗体のＦｃ部分を介してこのような受容体を有する細胞のＦｃ受容体に結合できる、三重特異性抗体の産生に関する。特許文献５４、５５、５６は、Ｔ細胞及び他の抗原に同時に結合できる三重特異性抗体の産生に関する。特許文献５７は、アミロイドβオリゴマーに対する結合要素及び膜貫通タンパク質テレンスファリンに対する結合要素に対して特異的な二重特異性コンジュゲートを開示している。特許文献５８は、１つ（又は２つ）の腫瘍抗原及びエフェクタ細胞抗原（ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４等）に特異的に結合する、二重特異性及び三重特異性単鎖Ｆｖ分子に関する。

特許文献５９、６０は、ＭＨＣ結合ペプチドが結合されている又はされていないヒトの主要な組織適合性複合体結合ドメインを備える、抗体誘導体を開示している。特許文献６１は、オンレート（標的分子に結合する速度）及びオフレート（標的分子を放出する速度）が、他のこのような標的分子への結合に比べてある標的に対して優先的に結合できるよう、異なっている、多重特異性結合分子に関する。三重特異性分子は、例えば抗ＣＤ３又は抗ＣＤ２８抗体である１価の第１の部分、及び標的疾患細胞又は免疫細胞上の１つ又は複数の標的リガンドに結合する２価免疫機能実行部分を備える第２の部分を有する分子である。

特許文献６２、６３は、２つの抗体の重鎖から形成される二重特異性抗体に関し、上記２つの抗体のうちの一方は、その重鎖内へと加工された結節を有し、上記２つの抗体のうちのもう一方は、その重鎖内へと加工された相補的キャビティを有する。このような相補的な「ノブ（ｋｎｏｂ）」及び「ホール（ｈｏｌｅ）」の存在は、同一の抗体の２つの重鎖を含有する単一特異性ホモ抗体に対して、（このような抗体それぞれの１つの重鎖を有する）二重特異性ヘテロ抗体を優先的に形成するために教示される。ＣＤ３及び腫瘍細胞抗原に対して免疫特異的なものを含む様々な二重特異性ヘテロ抗体が提案されている。また、ＣＤ３、ＣＤ８及びＣＤ３７に対して免疫特異的なもの（Ｔ細胞増殖の調節に関わるＢ細胞上に主に発現する膜貫通タンパク質）を含む様々な三重特異性ヘテロ抗体も提案されている（非特許文献５０）が、その産生のための機構及びその構造に関する開示は提供されていない。

特許文献６４は、介在するＣＨ２‐ＣＨ３ドメインによって分離された２つのダイアボディ構造をそれぞれ備える２つのポリペプチドを備える、二重特異性４価結合分子に関する。上記文書はまた、４つのポリペプチド鎖からなる４価結合分子にも関し、上記４つのポリペプチドのうちの２つは、２つの抗原に関する可変軽鎖及び可変重鎖ドメインを含有し、残りの２つは抗原及び末端ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに関する相補的な可変重鎖及び可
変軽鎖ドメインを含有する。二重特異性４価結合分子は、その各ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの連結によって形成される。この４つのポリペプチド鎖がある構造では、「軽（ｌｉｇｈｔ）」鎖は、重鎖と共有結合せず、従って不安定性につながる（非特許文献３６参照）。この文書は、二重特異性を排除する（即ち分子が単一特異性となる）という犠牲を払って上述のような共有結合を提供するように鎖が変化した、第３の構造を開示する。ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６１、ケモカイン受容体、ＣＤ９５、ＣＣＲ５等に対する特異性を有する分子が開示されている。ＣＤ３及びＣＤ８の両方に結合できる二重特異性分子は開示されていない。

しかしながら、上述の利点は顕著なコストにつながる。このような非単一特異性ダイアボディの形成は、２つ以上の別個の異なるポリペプチドの良好な集合を必要とする（即ち上記形成は、ダイアボディが、異なるポリペプチド鎖種のヘテロ二量体形成によって形成されることを必要とする）。この事実は、同一のポリペプチド鎖のホモ二量体形成によって形成される単一特異性ダイアボディとは対照的である。非単一特異性ダイアボディを形成するために少なくとも２つの異なるポリペプチド（即ち２つのポリペプチド種）を提供しなければならないため、及びこのようなポリペプチドのホモ二量体形成は不活性分子をもたらす（非特許文献４０）ため、このようなポリペプチドの産生は、同一種のポリペプチド間での共有結合を防止するような方法で達成しなければならない（非特許文献４０）。従って本技術分野は、このようなポリペプチドの非共有結合的連結を教示している（例えば非特許文献３７、３９、４０、３６参照）。

しかしながら、本技術分野は、非共有結合的に連結したポリペプチドで構成される二重特異性ダイアボディが不安定であり、非機能性モノマーへと容易に分解することを認識している（例えば非特許文献３６参照）。

この課題をものともせず、本技術分野は、ＤＡＲＴ（商標）と呼ばれる、安定した共有結合ヘテロ二量体性非単一特異性ダイアボディの開発に成功した（例えば特許文献６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、４８、４７、４６、非特許文献５１、５２、５３参照）。このようなダイアボディは、２つ以上の共有結合的に複合体化したポリペプチドを備え、１つ又は複数のシステイン残基を、ジスルフィド結合を形成でき、これによって２つのポリペプチド鎖を共有結合させる、採用したポリペプチド種それぞれの中へと加工するステップを伴う。例えば、このような構造のＣ末端へのシステイン残基の追加は、ポリペプチド鎖間のジスルフィド結合を可能とすることが分かっており、これは、２価分子の結合特性に干渉することなく、得られるヘテロ二量体を安定化させる。

多数のＤＡＲＴ（商標）の実施形態が存在する。最も単純なＤＡＲＴ（商標）実施形態の２つのポリペプチドはそれぞれ３つのドメインを備える（図１Ａ）。第１のポリペプチドは：（ｉ）第１の免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）の結合領域を備える、第１のドメイン；（ｉｉ）第２の免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）の結合領域を備える、第２のドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、上記第２のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する役割を果たすヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する第３のドメイン（図１Ｂ）を備える。第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第２のポリペプチド鎖に対する第１のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。第２のポリペプチドは：（ｉ）相補的な第１のドメイン（ＶＬ２含有ドメイン）；（ｉｉ）相補的な第２のドメイン（ＶＨ１含有ドメイン）；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、任意に、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化促進ドメインと複合体化して、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進する、相補的なヘテロ二量体化促進ドメインとを含有する第３のドメインを含有する。第２のポリペプチド鎖の第３のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第１のポリ
ペプチド鎖に対する第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このような分子は、安定かつ強力であり、２つ以上の抗原を同時に結合する能力を有する。これらは、標的抗原を発現する細胞の、標的転換Ｔ細胞仲介殺滅を促進できる。

一実施形態では、第１及び第２のポリペプチドの第３のドメインはそれぞれ、システイン残基を含有し、このシステイン残基は、ジスルフィド結合を介してポリペプチドを一体に結合させる役割を果たす。上記ポリペプチドのうちの一方又は両方の第３のドメインは更に、ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインの配列を有してよく、これにより、ダイアボディポリペプチドの複合体化によって、細胞（Ｂリンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球及び肥満細胞等）のＦｃ受容体に結合できるＦｃドメインが形成される（図２Ａ〜２Ｂ）。

このような分子の多数の変形例が記載されている（例えば特許文献６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、４８、４７、４６参照）。これらのＦｃ担持ＤＡＲＴは、３つのポリペプチド鎖を備えてよい（例えば図２Ｂ）。このようなダイアボディの第１のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）及びヘテロ二量体化促進ドメインを含有するドメインと、（ｉｖ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとを含有する。このようなＤＡＲＴ（商標）の第２のポリペプチド鎖は：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）と、第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を促進するヘテロ二量体化促進ドメインとを含有するドメインを含有する。第２のポリペプチド鎖の第２のドメインのシステイン残基（又はシステイン含有ドメイン）は、ダイアボディの第１のポリペプチド鎖に対する第２のポリペプチド鎖の共有結合を促進する役割を果たす。このようなＤＡＲＴ（商標）の第３のポリペプチドは、システイン残基（又はシステイン含有ドメイン）及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える。従って、このようなＤＡＲＴ（商標）の第１及び第２のポリペプチド鎖は、１つに連結して、エピトープに結合可能なＶＬ１／ＶＨ１結合部位、及び第２のエピトープに結合可能なＶＬ２／ＶＨ２結合部位を形成する。第１及び第２のポリペプチドは、それぞれの第３のドメイン内のシステイン残基が関与するジスルフィド結合を介して、互いに結合される。特に、第１及び第３のポリペプチド鎖は互いと複合体化して、ジスルフィド結合によって安定化されたＦｃドメインを形成する。このようなダイアボディは、増強された強度を有する。このようなＦｃ担持ＤＡＲＴ（商標）は、２つの配向（表１）のうちのいずれを有してよい：

Ｉｇ‐ＤＡＲＴ（商標）（図３Ａ〜３Ｂ）及びＦｃ‐ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディ（図３Ｃ）と呼ばれる、はるかに複雑なＤＡＲＴ（商標）が記載されている（特許文献４７
）。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）は４つのポリペプチド鎖を有する。このようなダイアボディの第１及び第３のポリペプチド鎖は、３つのドメイン：（ｉ）ＶＬ１含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ２含有ドメイン；及び（ｉｉｉ）ＣＨ２‐ＣＨ３配列を含有するドメインを含有する。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）の第２及び第４のポリペプチドは：（ｉ）ＶＬ２含有ドメイン；（ｉｉ）ＶＨ１含有ドメイン；並びに（ｉｉｉ）Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）の第１のポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化及び共有結合を促進するドメインを含有する。第３及び第４、並びに第１及び第２のポリペプチド鎖は、同一であってよく、又は単一特異性、二重特異性若しくは四重特異性のいずれかである４価結合を可能とすることができるよう、異なっていてよい。このようなより複雑なＤＡＲＴ（商標）分子はまた、共有結合複合体を形成する機能を果たすシステイン含有ドメインも有する。Ｆｃ‐ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディは、ＣＨ１及びＣＬドメインを含有する。

４価分子が望ましいもののＦｃは必要ない場合の用途のために、代替的な構成が当該技術分野において公知であり、これは、ＶＨ１、ＶＬ２、ＶＨ２、及びＶＬ２ドメインをそれぞれ有する２つの同一の鎖のホモ二量体化によって形成される「ＴａｎｄＡｂ」とも呼ばれる４価タンデム抗体を含むが、これに限定されない（例えば特許文献７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、２６、８２参照）。

ＩＩＩ．標的転換殺滅
上述のように、ＣＤ８、ＭＨＣＩ及びＴ細胞受容体の間の相互作用は、細胞毒性Ｔ細胞、及び近隣の細胞を殺滅する上記細胞毒性Ｔ細胞の能力の活性化につながる。ＣＤ３及び腫瘍抗原に結合する二重特異性ダイアボディを用いて、腫瘍細胞に対して細胞毒性ＣＤ８⁺Ｔ細胞を共局在化し、このような細胞の「標的転換殺滅」を達成できる（特許文献４６
、４７、４８、６６、６５）。

しかしながら、腫瘍又は病原細胞の座に対してＣＤ３⁺Ｔ細胞を共局在化することによ
って、癌又は感染性疾患を治療する努力は、完全には成功していない。ＣＤ３を標的とする抗体は、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺細胞毒性Ｔ細胞及びＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔヘルパー細胞の両方に結合し、これらの細胞両方の活性化をもたらす。しかしながら、活性化されたＣＤ３⁺ＣＤ
４⁺Ｔヘルパー細胞によって産生されるサイトカインは、例えば寿命を脅かすサイトカイ
ン急増といった重篤な副作用に寄与する（非特許文献５４）。更にこのような抗ＣＤ３抗体は、活性化時にサイトカインを発現するＣＤ３⁺ＣＤ４^-ＣＤ８^-二重陰性Ｔ細胞等を含
み（非特許文献５５、５６、５７）、かつＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞が仲介する細胞毒性を抑制する（非特許文献５８）、他の細胞タイプに結合する。

ＣＤ３を標的とする抗体の投与に関連するサイトカイン産生は、ＣＤ８及び腫瘍抗原を標的とする二重特異性抗体を使用して回避できることが提示されている（非特許文献５９）。従って抗ＣＤ８抗体は、単独使用時にエフェクタ機能を誘発できるかどうかを決定するために研究されている。Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｍらは、試験した７個の抗ヒトＣＤ８抗体のうちの６個が、ＣＤ８⁺Ｔ細胞の活性化に失敗したこと、その一方でこのような活性化を
、極めて高い濃度（１０〜１００μｇ／ｍＬ）の抗ヒトＣＤ８抗体「ＯＫＴ８」を用いて達成できたことを報告した（非特許文献６０）。ＯＫＴ８Ｆ（ａｂ）’₂断片は上記効
果を仲介できることが分かっているが、ＯＫＴ８Ｆａｂはこれを行うことができないことが分かっているため、このような効果のためには２つのＣＤ８分子に対する協調的結合が必要であった。

よって、このような研究にもかかわらず、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８抗体の使用に付随するサイトカイン仲介型毒性は、完全には理解されていない。抗ＣＤ３抗体の投与後に見られるサイトカイン毒性は、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞を枯渇させることによって、又はＣＤ３⁺
ＣＤ８⁺Ｔ細胞を欠失することによって排除されないことが、研究によって明らかとなっ
た。従って、ＣＤ３⁺ＣＤ４⁺Ｔ細胞及びＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方が、抗ＣＤ３抗体の毒作用に寄与し、完全な効果を仲介するために必要な細胞はそれぞれわずかである（非特許文献６１）。

更に、ＣＤ８及び腫瘍抗原を標的とする二重特異性抗体は、ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞及び腫瘍細胞に対して特異的ではなく、ＣＤ８⁺細胞及び腫瘍細胞に対して特異的である。特
に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＣＤ３^-ＣＤ８⁺サブセットが、このような抗体によって標的とされることになる。ＮＫ細胞の大半を表すこのような細胞は、サイトカインの有力な産生源であり、上記細胞の活性化はサイトカイン急増に寄与する可能性が高い。ＣＤ３^-ＣＤ８⁺ＮＫ細胞は、ＨＩＶ‐１感染チンパンジーにおけるＩＦＮ‐γの主要な源である（非特許文献６２）。

結果的に、過去のあらゆる進歩にもかかわらず、特に比較的低い治療的濃度において、癌細胞又は病原体感染細胞を攻撃するよう、身体の免疫系をより強く指向させることができる、改良された組成物に対する需要が存在し続けている。以下に詳細に記載するように、本発明は：（１）ＣＤ３のエピトープ；（２）ＣＤ８のエピトープ；及び（３）標的細胞（特に癌細胞又は病原体感染細胞）上に発現するエピトープに結合して、疾患関連抗原を提示する細胞に対する細胞毒性Ｔ細胞の協調的結合を仲介する、三重特異性結合分子を提供することによって、この需要に対処する。

米国特許第４，８１６，５６７号米国特許第５，８０７，７１５号米国特許第５，８６６，６９２号米国特許第６，３３１，４１５号国際公開第２００８／００３１１６号国際公開第２００９／１３２８７６号国際公開第２００８／００３１０３号国際公開第２００７／１４６９６８号国際公開第２００９／０１８３８６号国際公開第２０１２／００９５４４号国際公開第２０１３／０７０５６５号国際公開第２００５／０７０９６６号国際公開第２００６／１０７７８６Ａ号国際公開第２００６／１０７６１７Ａ号国際公開第２００７／０４６８９３号国際公開第２０１３／１７４８７３号国際公開第２０１１／１３３８８６号国際公開第２０１０／１３６１７２号国際公開第２００８／０２７２３６号国際公開第２０１０／１０８１２７号国際公開第２０１３／１６３４２７号国際公開第２０１３／１１９９０３号国際公開第２０１０／０２８７９７号国際公開第２０１００２８７９６号国際公開第２０１０／０２８７９５号国際公開第２００３／０２５０１８号国際公開第２００３０１２０６９号国際公開第２０１３／００６５４４号国際公開第２０１４／０２２５４０号国際公開第２０１３／００３６５２号国際公開第２０１２／１６２５８３号国際公開第２０１２／１５６４３０号国際公開第２０１１／０８６０９１号国際公開第２００７／０７５２７０号国際公開第１９９８／００２４６３号国際公開第１９９２／０２２５８３号国際公開第１９９１／００３４９３号米国公開特許第２００４／００５８４００号（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．）；米国公開特許第２００４／０２２０３８８号（Ｍｅｒｔｅｎｓｅｔａｌ．）；国際公開第０２／０２７８１号（Ｍｅｒｔｅｎｓｅｔａｌ）；米国特許第７，５８５，９５２号米国公開特許第２０１０‐０１７３９７８号国際公開第０５／０６１５４７号国際公開第２００６／１１３６６５号国際公開第２００８／１５７３７９号国際公開第２０１０／０８０５３８号国際公開第２０１２／０１８６８７号国際公開第２０１２／１６２０６８号米国特許第６，１７１，５８６号米国特許第６，５５１，５９２号米国特許第６，９９４，８５３号米国特許第８，２７７，８０６号国際公開第２００２／０２００３９号国際公開第２０００／０１８８０６号国際公開第１９９８／００３６７０号国際公開第２００６／０７２１５２号米国公開特許第２００８‐００５７０５４号米国公開特許第２０１０‐０２９１１１２号国際公開第１９９９／０４２５９７号国際公開第１９９８／００６７４９号国際公開第０２／０７２１４１号米国特許第７，６９５，９３６号米国公開特許第２００７／０１９６３６３号国際公開第２０１２‐１６２５６１号米国公開特許第２０１３‐０２９５１２１号米国公開特許第２０１０‐０１７４０５３号米国公開特許第２００９‐００６０９１０号欧州特許第２７１４０７９号欧州特許第２６０１２１６号欧州特許第２３７６１０９号欧州特許第２１５８２２１号米国公開特許第２００５‐００７９１７０号米国公開特許第２００７‐００３１４３６号米国公開特許第２０１０‐００９９８５３号米国公開特許第２０１１‐０２０６６７号米国公開特許第２０１３‐０１８９２６３号欧州特許第１０７８００４号欧州特許第２３７１８６６号欧州特許第２３６１９３６号欧州特許第１２９３５１４号国際公開第１９９９／０５７１５０号国際公開第２０１３／０１３７００号

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本発明は三重特異性結合分子に関し、これは、３つの結合ドメインを有することにより、３つのエピトープに対する協調的結合を仲介できる、多重鎖ポリペプチド分子である。上記結合ドメインは、上記三重特異性結合分子がいずれの３つの異なるエピトープに対して結合できるように、選択してよい。このようなエピトープは、同一の抗原のエピトープ、又は２つ若しくは３つの異なる抗原のエピトープであってよい。本発明はまた、新規のＲＯＲ１結合性抗体及びその誘導体、並びにこのような組成物のための使用法も提供する。

本発明は特に、上記３つのエピトープが、このようなエピトープのうちの１つ又は２つが免疫系細胞、特に細胞毒性リンパ球免疫系細胞（ＣＴＬ）の１つ又は複数のエピトープとなり、残りの１つ又は複数のエピトープが疾患関連抗原の１つ又は複数のエピトープとなるように選択された、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。このような特に好ましい三重特異性結合分子は、疾患関連抗原を発現する細胞に対して細胞毒性リンパ球細胞を局在化でき、またこれによって、上記疾患関連抗原を発現する細胞の殺滅を促進できる。上記疾患関連抗原は、癌抗原であってよく、又は病原体（例えば細菌、真菌、ウイルス若しくは原生動物）感染の特徴である抗原であってよい。より詳細には、本発明は：（１）ＣＤ３のエピトープ；（２）ＣＤ８のエピトープ；及び（３）疾患関連抗原のエピトープに対する協調的結合を仲介できる、上述のような三重特異性結合分子に関する。ＣＤ３及びＣＤ８に対して、並びに疾患関連抗原に対して結合することにより、このような分子は、上記疾患関連抗原を提示する細胞に対して細胞毒性Ｔ細胞を共局在化でき、これは、このようなＴ細胞の活性化、及び上記疾患関連抗原を発現する細胞に対する細胞毒性応答の開始につながる。

詳細には、本発明は、３つの異なるエピトープに免疫特異的に結合できる三重特異性結合分子を提供し、ここで上記結合分子は、一体として共有結合的に複合体化した４つの異なるポリペプチド鎖を備え、また：
（Ｉ）第１の抗原上に存在するエピトープＩに免疫特異的に結合できる抗原‐結合ドメインＩ、及び第２の抗原上に存在するエピトープＩＩに免疫特異的に結合できる抗原‐結合ドメインＩＩ（ここで抗原‐結合ドメインＩ及び抗原‐結合ドメインＩＩはいずれもダイアボディタイプ結合ドメインである）；
（ＩＩ）第３の抗原上に存在するエピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できる、非ダイアボディタイプ抗原‐結合ドメインＩＩＩ；並びに
（ＩＩＩ）２つのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが互いに連結することによって形成される、Ｆｃドメイン
を備え、ここで第１、第２及び第３の抗原は同一の抗原であるか、又は独立して、これらの抗原のうちの別のものと同一の若しくは異なるものである。

本発明は特に、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの１つが細胞受容体のエピトープである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの１つが疾患関連抗原のエピトープである（及び特に、上記疾患関連抗原が、癌細胞の表面上に配列された癌抗原であるか、又は病原若しくは病原体感染細胞の表面上に配列された病原抗原である）、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に、Ｆｃドメインが、細胞の表面上に配列されたＦｃ受容体に結合できる、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は特に、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの１つがＣＤ３のエピトープであり、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第２のものがＣＤ８のエピトープであり、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第３のものが疾患関連抗原のエピトープであり、上記三重特異性結合分子の抗原‐結合ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩが、細胞毒性Ｔ細胞と、疾患関連抗原を発現する細胞との協調的結合を仲介する、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。本発明は特に、ＣＤ３、ＣＤ８がＴ細胞の表面上に配列され、疾患関連抗原が癌細胞、病原又は病原体感染細胞の表面上に配列され、免疫特異性結合が、ＣＤ３及びＣＤ８並びに疾患関連抗原を共局在化することによって、疾患関連抗原配列細胞に対するＣＤ８配列Ｔ細胞の活性化を促進するために十分なものである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に、非ダイアボディタイプ結合ドメインＩＩＩが、エピトープＩＩＩに免疫特異的に結合できるＦａｂタイプ結合ドメイン（ＶＬ_III／ＶＨ_III）を備え、上記三重特異性結合分子が：
（Ａ）第１のポリペプチド鎖であって：
（Ｉ）Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第１のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ_I）；
（２）３つのエピトープのうちの第２のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ_II）；
（３）（ａ）第１のシステイン含有ドメイン；及びヘテロ二量体促進ドメイン；若しくは
（ｂ）システイン含有ヘテロ二量体促進ドメイン；
（４）第２のシステイン含有ドメイン；並びに
（５）ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン
を備えるか、又は
（ＩＩ）Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）第１のシステイン含有ドメイン；
（２）ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメイン；
（３）３つのエピトープのうちの第１のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ_I）；
（４）３つのエピトープのうちの第２のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ_II）；並びに
（５）（ａ）第２のシステイン含有ドメイン；及びヘテロ二量体促進ドメイン；若しくは
（ｂ）システイン含有ヘテロ二量体促進ドメイン
を備える、第１のポリペプチド鎖；
（Ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第２のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ_II）；
（２）３つのエピトープのうちの第１のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン重鎖可変ドメイン（ＶＨ_I）；並びに
（３）（ａ）第１のシステイン含有ドメイン；及びヘテロ二量体促進ドメイン；若しくは
（ｂ）システイン含有ヘテロ二量体促進ドメイン；
を備え、上記第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、上記第１のポリペプチド鎖ヘテロ二量体促進ドメインに対して相補的である、第２のポリペプチド鎖；
（Ｃ）第３のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第３のものに結合できる免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン（ＶＨ_III）；並びに
（２）ＩｇＧのＣＨ１ドメイン、システイン含有ヒンジドメイン、及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
を備える、第３のポリペプチド鎖；並びに
（Ｄ）第４のポリペプチド鎖であって、Ｎ末端からＣ末端への方向に：
（１）３つのエピトープのうちの第３のものに結合できる免疫グロブリンの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ_III）；及び
（２）システイン含有軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）；
を備える、第４のポリペプチド鎖
を備え、
（ｉ）ＶＬ_I及びＶＨ_Iドメインは連結して、エピトープＩに結合できるドメインを形成し；
（ｉｉ）ＶＬ_II及びＶＨ_IIドメインは連結して、エピトープＩＩに結合できるドメインを形成し；
（ｉｉｉ）ＶＬ_III及びＶＨ_IIIドメインは連結して、エピトープＩＩＩに結合できるドメインを形成し；
（ｉｖ）第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは連結して、Ｆｃドメインを形成し；
（ｖ）第１及び第２のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合し；
（ｖｉ）第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合し；
（ｖｉｉ）第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合する、上述の三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に：
（Ａ）上記ヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルであり、上記相補的なヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルである；又は
（Ｂ）上記ヘテロ二量体促進ドメインがＫコイルであり、上記相補的なヘテロ二量体促進ドメインがＥコイルである、上述の三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に：
（Ａ）第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインがそれぞれ、これらの連結によって形成されるＦｃドメインが正常なＦｃγＲ仲介性エフェクタ機能を呈するように、配列番号６の配列を有し；又は
（Ｂ）第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインがそれぞれ、これらの連結によって形成されるＦｃドメインが変化したＦｃγＲ仲介性エフェクタ機能を呈するように、配列番号６の配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、上述の三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に、第１及び第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインが互いに異な
っており、かつ配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に：
（Ａ）エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、ＣＤ３のエピトープ、ＣＤ８のエピトープ及び疾患関連抗原のエピトープであり；
（Ｂ）エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、ＣＤ３のエピトープ、疾患関連抗原のエピトープ及びＣＤ８のエピトープであり；
（Ｃ）エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、ＣＤ８のエピトープ、ＣＤ３のエピトープ及び疾患関連抗原のエピトープであり；
（Ｄ）エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、ＣＤ８のエピトープ、疾患関連抗原のエピトープ及びＣＤ３のエピトープであり；
（Ｅ）エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、疾患関連抗原のエピトープ、ＣＤ３のエピトープ及びＣＤ８のエピトープであり；又は
（Ｆ）エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩはそれぞれ、疾患関連抗原のエピトープ、ＣＤ８のエピトープ及びＣＤ３のエピトープである、上述のような三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に：
（Ａ）ＣＤ３のエピトープは、抗体ＯＫＴ３、Ｍ２９１、ＹＴＨ１２．５、ＣＤ３ｍＡｂ１若しくはＣＤ３ｍＡｂ２によって認識されるＣＤ３エピトープであり；又は
（Ｂ）ＣＤ８のエピトープは、抗体ＴＲＸ２若しくはＯＫＴ８によって認識されるＣＤ８エピトープである、上述の三重特異性結合分子の実施形態に関する。

本発明は更に、上述の三重特異性結合分子と、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。

本発明は更に、有効量の上述の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、癌を治療する方法に関し、ここで疾患関連抗原は癌抗原である。

本発明は更に、有効量の上述の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、病原体の存在に関連する疾患を治療する方法に関し、ここで疾患関連抗原は病原体抗原である。

本発明は更に、抗ＲＯＲ１抗体又はＲＯＲ１結合性断片に関し、ここで上記抗体は：
（Ａ）配列番号１１７の配列を有するＣＤＲ_L１、配列番号１１８の配列を有するＣＤ
Ｒ_L２、及び配列番号１１９の配列を有するＣＤＲ_L３を備える、軽鎖可変ドメイン；並びに
（Ｂ）配列番号１２０の配列を有するＣＤＲ_H１、配列番号１２１の配列を有するＣＤ
Ｒ_H２、及び配列番号１２２の配列を有するＣＤＲ_H３を備える、重鎖可変ドメイン
を備える。

本発明は更に、上記抗体が、配列番号５１の配列を有する軽鎖可変ドメインを有する、上述のような抗ＲＯＲ１抗体又はＲＯＲ１結合性断片の実施形態に関する。本発明は更に、上記抗体が、配列番号５２の配列を有する重鎖可変ドメイン、又は配列番号５１の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号５２の配列を有する重鎖可変ドメインの両方を有する、上述のような抗ＲＯＲ１抗体又はＲＯＲ１結合性断片の実施形態に関する。

本発明は更に、抗ＲＯＲ１抗体のＲＯＲ１結合性断片を含む、ダイアボディ、ＢｉＴｅ又は単鎖抗体に関する。

本発明は更に、上述の抗ＲＯＲ１抗体又はそのＲＯＲ１結合性断片と、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。本発明は更に、有効量のこのような医薬組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、癌を治療する方法に関する。

図１Ａ〜１Ｂは、ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのドメインの模式図である。図１Ａは、基本的なＤＡＲＴ（商標）ダイアボディのドメインの模式図である。図１Ｂは、ヘテロ二量体促進ドメインをそれぞれ有する２つのポリペプチド鎖からなる共有結合ダイアボディの概略図を提供する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。図２Ａ〜２Ｂは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをそれぞれ有する（図２Ａ）、又は一方のみがＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有することによって、連結した鎖が、自然に発生するＦｃドメインの全体若しくは一部を含むＦｃドメインを形成する（図２Ｂ）、２つのポリペプチド鎖からなる共有結合ダイアボディの概略図を提供する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。図３Ａ〜３Ｃは、２ペアのポリペプチド鎖からなる４価ダイアボディの概略図を提供する。これらのペアは異なっているため、一方がＤＲ５のエピトープであり、他方がエフェクタ細胞の表面上に存在する分子のエピトープである２つのエピトープそれぞれに関して２価性である、二重特異性分子が得られる。各ペアの１つのポリペプチドはＣＨ２及びＣＨ３ドメインを有することにより、連結した鎖が、自然に発生するＦｃドメインの全体若しくは一部を含むＦｃドメインを形成する。同一のエピトープを認識するＶＬ及びＶＨドメインは、同じように影を付けて示されている。（同じように影を付けて示されている）エピトープの１つのペアのみが、ＤＲ５に結合できる。図３ＡはＩｇダイアボディを示す。図３Ｂは、Ｅコイル及びＫコイルヘテロ二量体促進ドメインを含有するＩｇダイアボディを示す。図３Ｃは、抗体ＣＨ１及びＣＬドメインを含有するＦｃ‐ＤＡＲＴ（商標）ダイアボディを示す。「ＶＬ１」及び「ＶＨ１」という表記法はそれぞれ、「第１の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを表す。同様に「ＶＬ２」及び「ＶＨ２」という表記法はそれぞれ、「第２の」エピトープに結合する可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを表す。図４Ａ〜４Ｌは、好ましい三重特異性結合分子のドメインの模式図を提供する。図４Ａ及び４Ｂはそれぞれ、好ましい三重特異性結合分子の、上記三重特異性結合分子の非ダイアボディタイプ結合ドメインがＦａｂタイプ結合ドメイン又はＴ細胞受容体結合ドメインである、ドメインの概略図である。図４Ｃ及び４Ｄはそれぞれ、異なるドメイン配向を有する好ましい三重特異性結合分子の、非ダイアボディタイプ結合ドメインがＦａｂタイプ結合ドメイン又はＴ細胞受容体タイプ結合ドメインである、ドメインの概略図である。図４Ｅ〜４Ｊは、３つのポリペプチド鎖を有する同様の分子を示す。上記分子は、ヒンジ及びＣＬドメインを有してよく（図４Ｅ、４Ｈ）又は代替的なリンカーペプチドを含有してよい（図４Ｆ、４Ｉ）。図４Ｋ〜４Ｌは、５つのポリペプチド鎖を有する同様の分子を示す。図５Ａ〜５Ｄは、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の、Ａ４９８標的細胞（図５Ａ）、ＪＩＭＴ‐１標的細胞（図５Ｂ）、ＣＤ５＋／ＣＤ４‐ゲートＰＢＭＣ（図５Ｃ）及びＣＤ５＋／ＣＤ４＋ゲートＰＢＭＣ（図５Ｄ）に結合する能力を示す。図６Ａ〜６Ｃは、本発明の三重特異性結合分子の、標的細胞の標的転換殺滅を仲介する能力を実証する。図６Ａは、ＪＩＭＴ‐１細胞の細胞溶解のルシフェラーゼアッセイの結果を示す。図６Ｂは、ＪＩＭＴ‐１細胞の細胞毒性のＬＤＨアッセイの結果を示す。図６Ｃは、Ａ４９８細胞の細胞毒性のＬＤＨアッセイの結果を示す。図７Ａ〜７Ｄは、ＪＩＭＴ‐１細胞（図７Ａ：ＣＤ４／ＣＤ６９Ｔ細胞；図７Ｂ：ＣＤ４／ＣＤ２５Ｔ細胞；図７Ｃ：ＣＤ８／ＣＤ６９Ｔ細胞；図７Ｄ：ＣＤ８／ＣＤ２５Ｔ細胞）を用いたインキュベーション時の、本発明の三重特異性結合分子の、Ｔ細胞活性化を仲介する能力を実証する。図８Ａ〜８Ｄは、Ａ４９８細胞（図８Ａ：ＣＤ４／ＣＤ６９Ｔ細胞；図８Ｂ：ＣＤ４／ＣＤ２５Ｔ細胞；図８Ｃ：ＣＤ８／ＣＤ６９Ｔ細胞；図８Ｄ：ＣＤ８／ＣＤ２５Ｔ細胞）を用いたインキュベーション時の、本発明の三重特異性結合分子の、Ｔ細胞活性化を仲介する能力を実証する。図９Ａ〜９Ｂは、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子又はＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の濃度の上昇に応じた、ヒトＰＭＢＣのＣＤ５⁺ＣＤ４⁺ゲート（図９Ａ）又はＣＤ５⁺ＣＤ４^-ゲート（図９Ｂ）細胞集団を示す。（Ｆｃドメインを有する又は有しない）Ｂ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）を対照として使用した。図１０Ａ〜１０Ｃは、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８三重特異性結合分子の細胞毒性に対する、異なるＣＤ８結合ドメインの影響を示す。図１１Ａ〜１１Ｃは、ＣＤ３結合ドメインに関して部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃを選択することによって、本発明の三重特異性結合分子の結合を変調する能力を実証する。採用した三重特異性結合分子は、疾患関連抗原、Ｂ７‐Ｈ３に免疫特異的に結合できた。細胞毒性は、ルシフェラーゼアッセイを用いて測定される。図１２Ａ〜１２Ｃは、ＬＤＨアッセイを用いて、本発明の三重特異性結合分子によって仲介される細胞毒性に対する位置選択（部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃ）の影響を実証する。図１３Ａ〜１３Ｅは、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子、及びＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子を用いた、細胞毒性に対する位置変化の影響を示す。Ｆｃドメインを有するＡＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）を対照として使用した。図１４Ａ〜１４Ｂは、部位ＣにおけるＣＤ３結合ドメインの配置が、ＣＤ５⁺ＣＤ４⁺細胞（図１４Ａ）及びＣＤ５⁺ＣＤ４^-細胞（図１４Ｂ）の両方に対する結合を大幅に低下させたことを示す。図１５Ａ〜１５Ｂは、５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子又は５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の濃度の上昇に応じた、ヒトＰＭＢＣのＣＤ５⁺ＣＤ４⁺ゲート（図１５Ａ）又はＣＤ５⁺ＣＤ４^-ゲート（図１５Ｂ）細胞集団を示す。（Ｆｃドメインを有する又は有しない）５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）を対照として使用した。図１６Ａ〜１６Ｃは、細胞毒性に対する位置変化の観察された影響は、採用されたＣＤ８結合ドメインに左右されなかったことを示す。図１７Ａ〜１７Ｃは、本発明の三重特異性結合分子の、ＲＯＲ１を発現する標的細胞の標的転換殺滅を仲介する能力を実証する。図１８Ａ〜１８Ｃは、ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の、可溶性固定化ｇｐ１４０タンパク質（図１８Ａ）、ヒトＣＤ３（図１８Ｂ）、並びにｇｐ１４０タンパク質及びヒトＣＤ３の両方（図１８Ｃ）に結合する能力を示す。図１９Ａ〜１９Ｃは、ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の、ＨＩＶｅｎｖ発現ＨＥＫ２９３／Ｄ３７５細胞に結合する能力を、対照の三重特異性結合分子（図１９Ｃ）と対比して示す。図２０Ａ〜２０Ｂは、ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の、ヒトＰＢＭＣのＣＤ５＋／ＣＤ５-細胞集団に対する特異的結合を示す能力を示す。図２１Ａ〜２１Ｆは、テトラサイクリンの存在又は不在下（図２１Ａ〜２１Ｂ；図２１Ｃ〜２１Ｄ）における、ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１又はＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子によって仲介される、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞毒性活性を示す。図２１Ｅ〜２１Ｆは、対照の抗ＲＳＶ抗体（パリビズマブ；ＲＳＶｍＡｂ１）三重特異性結合分子の細胞毒性活性を示す。図２２Ａ〜２２Ｂは、精製したｐａｎＴ細胞及びＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１又はＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子を用いたインキュベーションの１日後及び２日後の、生存しているＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞のパーセンテージを示す。図２３Ａ〜２３Ｃは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はｐａｎＴ細胞を用いた、ＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞に対するＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子のＣＴＬ活性の評価の結果を示す。図２４Ａ〜２４Ｃは、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はｐａｎＴ細胞を用いた、ＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞に対するＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子のＣＴＬ活性の評価の結果を示す。図２５Ａ〜２５Ｃは、ＣＤ３ｍＡｂ２結合ドメイン（図２５Ａ）、並びにそのＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ（図２５Ｂ）及びＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ（図２５Ｃ）親和性変異体を有するＤＡＲＴ（商標）分子に関する、結合キネティクスを示す。図２６Ａ〜２６Ｂは、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子及び５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の濃度の上昇に応じた、ヒトＰＭＢＣのＣＤ５⁺ＣＤ４⁺ゲート（図２６Ａ）又はＣＤ５⁺ＣＤ４^-ゲート（図２６Ｂ）細胞集団を示す。野生型、Ｌｏｗ及びＦａｓｔＣＤ３特異性を有する５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）を、対照として使用した。図２７Ａ〜２７Ｃは、ＬＤＨアッセイを用いて、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の細胞毒性に対する、ＣＤ３ｍＡｂ変異体（ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ及びＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ）の影響を示す。図２８Ａ〜２８Ｆは、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子及び５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の濃度が上昇している状態における、ドナー１からのＰＢＭＣから放出されたＩＦＮ‐γ（図２８Ａ）、ＴＮＦ‐α（図２８Ｂ）、ＩＬ‐１０（図２８Ｃ）、ＩＬ‐６（図２８Ｄ）、ＩＬ‐４（図２８Ｅ）、及びＩＬ‐２（図２８Ｆ）のレベルを実証する。図２９Ａ〜２９Ｆは、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子及び５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の濃度が上昇している状態における、ドナー２からのＰＢＭＣから放出されたＩＦＮ‐γ（図２９Ａ）、ＴＮＦ‐α（図２９Ｂ）、ＩＬ‐１０（図２９Ｃ）、ＩＬ‐６（図２９Ｄ）、ＩＬ‐４（図２９Ｅ）、及びＩＬ‐２（図２９Ｆ）のレベルを実証する。

本発明は、３つの結合ドメインを有し、従って３つのエピトープへの協調的結合を仲介できる多重鎖ポリペプチド分子である、三重特異性結合分子に関する。結合ドメインは、三重特異性結合分子が、いずれの３つの異なるエピトープに結合できるように選択してよい。このようなエピトープは、同一の抗原のエピトープ又は２つ若しくは３つの異なる抗原のエピトープであってよい。本発明はまた、新規のＲＯＲ１結合性抗体及びその誘導体、並びにこのような組成物のための使用法も提供する。

Ｉ．一般的な技術及び一般的な定義
本発明の実践は、そうでないことが示されていない限り、当該技術の範囲内の分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術を採用する。
このような技術は：MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Third Edition (Sambrook et al. Eds., 2001) Cold Spring Harbor Press, Cold SpringHarbor, NY; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS: METHODS AND APPLICATIONS (Methods in Molecular Biology), Herdewijn, P., Ed., Humana Press,Totowa, NJ; OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (Gait, M.J., Ed., 1984); METHODS INMOLECULAR BIOLOGY, Humana Press, Totowa, NJ; CELL BIOLOGY: A LABORATORY NOTEBOOK (Cellis, J.E., Ed., 1998) Academic Press,New York, NY; ANIMAL CELL CULTURE (Freshney, R.I.,Ed., 1987); INTRODUCTION TO CELL AND TISSUE CULTURE (Mather, J.P. and Roberts, P.E., Eds., 1998) Plenum Press, New York,NY; CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROCEDURES (Doyle, A. et al, Eds.,1993-8) John Wiley and Sons, Hoboken, NJ; METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)New York, NY; WEIR' S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY (Herzenberg, L.A. etal. Eds. 1997) Wiley-Blackwell Publishers, New York, NY; GENE TRANSFER VECTORSFOR MAMMALIAN CELLS (Miller, J.M. et al. Eds., 1987) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, F.M. et al, Eds., 1987) Greene Pub. Associates,New York, NY; PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis, K. et al, Eds.,1994) Birkhauser, Boston MA; CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY (Coligan, J.E. et al, eds., 1991) JohnWiley and Sons, Hoboken, NJ; SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wileyand Sons, 1999) Hoboken, NJ; IMMUNOBIOLOGY 7 (Janeway, C.A. et al 2007) Garland Science, London, UK; Antibodies (P. Finch, 1997) Stride Publications, Devoran, UK; ANTIBODIES: A PRACTICAL APPROACH (D. Catty.,ed., 1989) Oxford University Press, USA, New York NY); MONOCLONAL ANTIBODIES: APRACTICAL APPROACH (Shepherd, P. et al Eds., 2000) Oxford University Press,USA, New York NY; USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Harlow, E. et al Eds.,1998) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; THEANTIBODIES (Zanetti, M. et al Eds. 1995) Harwood Academic Publishers, London,UK); 及びDEVITA, HELLMAN, AND ROSENBERG'S CANCER:PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, EIGHTH EDITION, DeVita,V. et al Eds. 2008, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA等の文献に十分に説明されている。

ＩＩ．本発明の好ましい三重特異性結合分子
Ａ．結合能力
本発明の好ましい三重特異性結合分子は、３つの異なるエピトープに協調的かつ同時に結合できる。このような本発明の好ましい三重特異性結合分子は：
（Ｉ）第１の抗原上に存在する「エピトープＩ」に免疫特異的に結合できる「結合ドメインＩ」及び第２の抗原上に存在する「エピトープＩＩ」に免疫特異的に結合できる「結合ドメインＩＩ」。ここで上記結合ドメインＩ及び上記結合ドメインＩＩは共に「ダイアボディタイプ結合ドメイン」である；
（ＩＩ）第３の抗原上に存在する「エピトープＩＩＩ」に免疫特異的に結合できる「非ダイアボディタイプ」「結合ドメインＩＩＩ」；並びに
（ＩＩＩ）２つのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを互いに複合体化することによって形成される、Ｆｃドメイン
を備える。

典型的には、本発明の三重特異性結合分子は４つの異なるポリペプチド鎖を備えることになり、これらはそれぞれ、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する（図４Ａ〜４Ｄ、図５Ａ及び図５Ｂ参照）が、上記分子は、このようなポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合を介して）互いに融合することによって、又はこのようなポリペプチド鎖を分割して更なるポリペプチド鎖を形成することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を備えてよい。図４Ｅ〜４Ｊは、３つのポリペプチド鎖を有するこのような分子を概略的に示すことにより、本発明のこの態様を例示している。図４Ｋ〜４Ｌは、５つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことにより、本発明のこの態様を例示している。

このような三重特異性結合分子が特に好ましいものの、本発明は更に、３つの結合特異性を有する分子の産生に十分な結合ドメインのいずれの組み合わせを備える三重特異性結合分子を、具体的に考察し、上記３つの結合特異性のうちの２つは癌抗原を指向する結合特異性であり、１つはエフェクタ細胞抗原を指向する結合特異性である。従って例えば本発明は：３つのＦａｂタイプ結合ドメインを備える三重特異性結合分子；（例えば２つの異なる軽鎖と２つの異なる重鎖とを複合体化することによって形成される）１つの２価の二重特異性抗体ドメイン及び１つのＦａｂタイプ結合ドメインを備える三重特異性結合分子；（例えば４つの異なる軽鎖と２つの異なる重鎖とを複合体化することによって形成される）２つの２価の二重特異性抗体ドメインを備えるものの、抗体ドメインのうちの一方は不活性となっている三重特異性結合分子等を考察する。

用語「ポリペプチド」、「ポリペプチド鎖」、及び「ペプチド」は本明細書において相互交換可能に使用され、いずれの長さ特にアミノ酸残基３個、５個、１０個、２０個又は２５個超の長さのアミノ酸のポリマーを指すが、そのうち２つの、より好ましくは全てのアミノ酸残基は、アミド（ペプチド）結合（‐ＮＨ‐Ｃ（Ｏ）‐）を介して連結している。しかしながら、ポリマーは直鎖又は分岐であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって中断されていてよい。これらの用語はまた、自然に、又は例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、若しくは標識化成分との複合体形成といった他のいずれの操作若しくは修飾の介入によって修飾された、アミノ酸ポリマーも包含する。またこの定義には、例えばアミノ酸の１つ又は複数の類似体（例えば非天然アミノ酸等を含む）及び当該技術分野で公知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。本発明のポリペプチドは単鎖として、又は複合体化した複数の鎖として発生し得る。

「ダイアボディタイプ結合ドメイン」は、ダイアボディ及び特にＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのエピトープ結合ドメインである。用語「ダイアボディ」及び「ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ」については上述されており、これらは、好ましくは共有結合的相互作用によって互いに複合体化して、同一の又は異なるエピトープを認識してよい少なくとも２つのエピトープ結合部位を形成する、少なくともとも２つのポリペプチド鎖を備える分子を指す。ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの２つはそれぞれ、免疫グロブリン軽鎖可変領域及び免疫グロブリン重鎖可変領域を備えるが、これらの領域は、相互作用してエピトープ結合部位を形成することはない（即ちこれらの領域は相互に「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」ではない）。寧ろ、ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディの鎖のうちの一方（例えば第１のもの）の免疫グロブリン重鎖可変領域は、異なる（例えば第２の）ダイアボディ又はＤＡ
ＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖の免疫グロブリン軽鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。同様に、ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖のうちの一方（例えば第１のもの）の免疫グロブリン軽鎖可変領域は、異なる（例えば第２の）ダイアボディ又はＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディのポリペプチド鎖の免疫グロブリン重鎖可変領域と相互作用して、エピトープ結合部位を形成する。ＤＡＲＴ（登録商標）ダイアボディ分子は、特許文献６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、４８、４７、４６、４４、４５、及び非特許文献５１、５２
、５３に開示されている。

結合ドメインＩＩＩは好ましくは「非ダイアボディタイプ」結合ドメインであり、これは、結合ドメインＩＩＩがダイアボディタイプ結合ドメインの構造を有しないことを示すことを意図したものである。好ましくは、結合ドメインＩＩＩは、Ｆａｂタイプ結合ドメイン又は受容体タイプ結合ドメインである、非ダイアボディタイプ結合ドメインである。本明細書において使用される場合、用語「Ｆａｂタイプ結合ドメイン」は、免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインと免疫グロブリン重鎖の相補的なＶＨドメインとの相互作用によって形成された、エピトープ結合ドメインを指す。Ｆａｂタイプ結合ドメインは、Ｆａｂタイプ結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が単一のエピトープ結合ドメインしか備えない一方で、ダイアボディタイプ結合ドメインを形成する２つのポリペプチド鎖が少なくとも２つのエピトープ結合ドメインを備えるという点で、ダイアボディタイプ結合ドメインとは異なる。従って本明細書において使用される場合、Ｆａｂタイプ結合ドメインは、ダイアボディタイプ結合ドメインとは区別される。本明細書において使用される場合、用語「受容体タイプ結合ドメイン」は、２つのポリペプチドの相互作用によって形成される細胞受容体のエピトープ結合ドメインを指す。本明細書では、受容体タイプ結合ドメインは、Ｔ細胞受容体アルファ鎖の可変ドメインと、Ｔ細胞受容体ベータ鎖の可変ドメインとの相互作用から形成される、Ｔ細胞受容体タイプ結合ドメインを参照して例示される。このようなＴ細胞受容体結合ドメインは、ＭＨＣのコンテクストにおいて発現されるペプチドを認識し、従って細胞内エピトープを認識できる。本発明はこのような受容体タイプ結合ドメインに関して例示されるが、Ｔ細胞受容体タイプ結合ドメイン以外の受容体タイプ結合ドメインを採用してよく、これらが本発明に包含されることは、理解されるだろう。受容体タイプ結合ドメインを有する受容体の他の例としては、ＩＬ‐２受容体、ＩＬ‐４受容体、ＩＬ‐７受容体、ＩＬ‐９受容体、ＩＬ‐１５受容体、ＩＬ‐２１受容体、インスリン受容体、及び胸腺間質リンホポエチンが挙げられる。

よって、本発明の三重特異性結合分子は、２価抗体の二量体化から産生されるもの等の４価結合分子とは区別され、好ましくは４つではなく３つの結合ドメインを有する。以下において議論するように、本発明の三重特異性分子は、更なる結合ドメイン（アルブミン結合ドメイン、ＦｃγＲ結合ドメイン等）を有してよい。このような追加の結合ドメインは、本発明の三重特異性結合分子の３つの結合ドメインのうちの１つとして考慮又は計数されることを意図したものではない。

本明細書において使用される場合、ポリペプチド（例えばあるダイアボディポリペプチドを別のものに対して、免疫グロブリン軽鎖を免疫グロブリン重鎖に対して、あるＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを別のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインに対して等）に関する用語「連結（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」又は「連結する（ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ）」は、ポリペプチドの非共有結合を表すことを意図したものである。用語「複合体（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」又は「複合体化する（ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ）」は、ポリペプチドの共有結合を表すことを意図したものである。

本明細書において使用される場合、本発明の三重特異性結合分子の結合ドメインは、その結合ドメインのうちの少なくとも２つ、好ましくはその結合ドメインのうちの全てが、
それぞれの認識されたエピトープ又は結合リガンドに同時に結合できる場合、「協調的結合（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄｂｉｎｄｉｎｇ）」を仲介する、と言い表される。このような結合は同時であってよい。しかしながら、本発明の一態様は、このような結合ドメインがその認識されたエピトープに結合する「オン」及び／又は「オフ」速度を修正するステップに関する。本明細書において使用される場合、結合の「オン速度（ｏｎｒａｔｅ）」は、このような結合ドメインがエピトープを認識して、認識されたエピトープへの結合を開始する際の親和性の尺度である。対照的に、結合の「オフ速度（ｏｆｆｒａｔｅ）」は結合ドメイン：エピトープ複合体の安定性の度合いの尺度である。結合の「オン」及び／又は「オフ」速度は、結合ドメインのＣＤＲのアミノ酸配列を変化させることによって修正できる。以下において議論するように、いずれのＣＤＲ修飾とは独立して、本発明の分子の協調的結合の程度は、その結合ドメインの構成を、ある特定の結合ドメイン（即ちＶＬｘ／ＶＨｘドメイン）が結合ドメインＩＩＩとして又は結合ドメインＩＩＩに対する内部若しくは外部ダイアボディタイプ結合ドメイン（以下において詳細に議論する）として存在するように変化させることによって、変調できる。

本発明の三重特異性結合分子の結合ドメインのオン及びオフ速度は、当該技術分野において公知の方法によって、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析によって、容易に測定できる（Jason-Moller, L. et al. (2006) "Overview Of Biacore Systems And Their Applications " Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 19:Unit 19.13; Swanson, S.J.(2005) "Characterization Of An Immune Response " Dev. Biol. (Basel).122:95-101; Buijs, J. et al. (2005) "SPR-MS In Functional Proteomics," Brief Funct. Genomic Proteomic. 4(l):39-47; Karlsson, R. et al. (2004) "SPR For Molecular Interaction Analysis: A Review Of Emerging Application Areas," J. Mol. Recognit. 17(3): 151 -161 ; Van Regenmortel,M.H. (2003) "Improving The Quality Of BIACORE-Based Affinity Measurements," Dev. Biol. (Basel) 112: 141-151; Malmqvist,M. (1999) "BIACORE: An Affinity Biosensor System For Characterization Of Biomolecular Interactions " Biochem. Soc. Trans.27(2):335-340; Malmqvist, M. et al. (1997)"Biomolecular Interaction Analysis: Affinity Biosensor Technologies For Functional Analysis Of Proteins," Curr. Opin.Chem. Biol. l(3):378-383; Fivash, M. et al. (1998)"Biacore For Macromolecular Interaction," Curr. Opin. Biotechnol.9(1):97-101; Malmborg, A.C. et al. (1995) "Biacore As A Tool In Antibody Engineering," J.Immunol. Methods. 183(1):7-13）。本発明の三重特異性結合分子の結合ドメインのオン及びオフ速度は、このような結合ドメインをエンコードする核酸分子のランダム又は指向性突然変異誘発と、それに続く、回収した核酸分子の、このような変化した結合キネティクスを示す突然変異タンパク質をエンコードする能力に関する通常のスクリーニングとによって、容易に変化させることができる。

本発明の三重特異性結合分子の結合ドメインは、エピトープに、「免疫特異的な」様式で結合する。本明細書において使用される場合、抗体、ダイアボディ又は他のエピトープ結合分子は、代替的なエピトープに比べて、より頻繁に、より迅速に、より長期間、及び／又はより高い親和性で当該エピトープと反応又は連結する場合、別の分子のある領域（即ちエピトープ）に「免疫特異的に」結合する、と言い表される。例えば、あるウイルスエピトープに免疫特異的に結合する抗体は、他のウイルスエピトープ又は非ウイルスエピトープに免疫特異的に結合するよりも、より高い親和性、結合活性で、より容易に、及び／又はより長い期間、当該ウイルスエピトープに結合する抗体である。この定義を読めば、例えば第１の標的に免疫特異的に結合する抗体（又は部分若しくはエピトープ）は、第２の標的に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことも理解される。従って「特異的結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃｂｉｎｄｉｎｇ）」は、排他的結合を必ずしも必要としない（ただし含むことはできる）。一般に、ただし必ずしもそうではないが、結合に関する言及は「特異的」結合を意味する。２つの分子は、これらの結合が、これら２つの分子そ
れぞれのリガンドに受容体が結合する特異性を呈する場合に、「生理学的に特異的な（ｐｈｙｓｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）」様式で互いに結合できると言い表される。

従って、本発明の好ましい結合分子は、その最も単純な実施形態において、少なくとも三重特異性であり、即ち３つの異なるエピトープに対する協調的結合を仲介できる。重要なことに、このような分子は、抗原に結合できる少なくとも３つの「部位」：結合ドメインＩＩＩから最も離れて位置している「外部」ダイアボディタイプ結合ドメイン、結合ドメインＩＩＩに最も近接して位置している「内部」ダイアボディタイプ結合ドメイン、及び結合ドメインＩＩＩ自体を有する。このようなドメインの位置はそれぞれ、部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃとして表される（図４Ａ‐４Ｄ）。

エピトープＩ、ＩＩ及びＩＩＩに結合する結合ドメインは、互いに異なるように選択される。しかしながら、エピトープＩ、ＩＩ及びＩＩＩは、同一の抗原の、２つの異なる抗原の、又は３つの異なる抗原のエピトープであってよい。よって本発明の三重特異性結合分子は、１、２又は３つの異なる抗原分子に協調的に結合できる。本発明の三重特異性結合分子は、いずれの可能性のあるエピトープ及びいずれの可能性のある抗原に対して採用してよい。例えば本発明の三重特異性結合分子は、エフェクタ細胞のエピトープ（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ６４、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びＮＫＧ２Ｄ受容体）、又は細胞毒性Ｔ細胞のエピトープ（例えば細胞毒性Ｔ細胞上に存在するＣＤ８）に、又は疾患関連抗原のエピトープに結合する、１、２又は３つの結合ドメイン、あるいはこのような可能性のある結合ドメインのいずれの組み合わせを有してよい。

本明細書において使用される場合、「疾患関連抗原」は、「病原体感染（ｐａｔｈｏｇｅｎ‐ｉｎｆｅｃｔｅｄ）」細胞又は「癌細胞（ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌ）」上に特徴的に発現するものの、正常な細胞上には特徴的に発現しない、抗原である。

本明細書において使用される場合、用語「病原体感染」細胞は、細菌（例えば大腸菌、クロストリジウム・ディフィシレ、サルモネラ・ティフィムリウム、緑膿菌、コレラ菌、淋菌、ヘリコバクター・ピロリ、ヘモフィルス・インフルエンザ、赤痢菌、黄色ブドウ球菌、結核菌及び肺炎連鎖球菌等）、真菌（例えばカンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス、コクシジオイデス、ヒストプラズマ、ニューモシスチス、スタキボトリス等）、原生動物（アメーボゾア、エスカバータ、クロムアルベオラータ、エントアメーバ、マラリア原虫、ジアルジア、トリパノソーマ、球虫類、胞子虫網、槍状吸虫、リーシュマニア等）又はウイルス（特にアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、Ｂウイルス（マカシンヘルペスウイルスＩ）、ＢＫウイルス、ブンヤウイルス、チクングニヤウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、サイトメガロウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エンテロウイルス、エプスタイン‐バーウイルス、ハンタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１、単純ヘルペスウイルス２、ヒト泡沫状ウイルス、ヒトヘルペスウイルス３、ヒトヘルペスウイルス５、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトβリンパ球向性ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、インフルエンザウイルス、ＪＣウイルス、ＪＥＶ、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡膜炎ウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ノロウイルス、ノーウォークウイルス、オルトレオウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、レオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ライノウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、天然痘ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、大痘瘡ウイルス、小痘瘡ウイルス、水痘帯状疱疹ヘルペスウイルス、西ナイルウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、若しくは黄熱
病ウイルス）に感染した細胞を指す。

本明細書において使用される場合、用語「癌細胞」は：副腎腫瘍；ＡＩＤＳ関連癌；胞巣状軟部肉腫；星状細胞腫瘍；膀胱癌；骨癌；脳及び脊髄の癌；転移性脳腫瘍；乳癌；頸動脈球腫瘍；子宮頸癌；軟骨肉腫；脊索腫；嫌色素性腎細胞癌；明細胞癌；大腸癌；結腸直腸癌；皮膚の良性線維性組織球腫；線維形成性小円形細胞腫瘍；上衣腫；ユーイング腫瘍；骨外性粘液型軟骨肉腫；骨性線維形成不全症；線維性骨異形成；胆嚢又は胆管癌；消化器癌；妊娠性絨毛性疾患；胚細胞腫瘍；頭頸部癌；肝細胞癌；膵島細胞腫瘍；カポジ肉腫；腎癌；白血病；脂肪腫／良性脂肪腫；脂肪肉腫／悪性脂肪腫；肝癌；リンパ腫；肺癌；髄芽腫；黒色腫；髄膜腫；多発性内分泌腫瘍；多発性骨髄腫；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；神経内分泌腫瘍；卵巣癌；膵臓癌；甲状腺乳頭癌；副甲状腺腫瘍；小児癌；末梢神経鞘腫瘍；褐色細胞腫；下垂体腫瘍；前立腺癌；後部ブドウ膜黒色腫；希少な血液学的障害；腎転移性癌；ラブドイド腫瘍；横紋筋肉腫；肉腫；皮膚癌；軟組織肉腫；扁平上皮癌；胃癌；滑膜肉腫；精巣癌；胸腺癌；胸腺腫；甲状腺転移癌；又は子宮癌の悪性細胞を指す。

癌細胞が特徴的に発現する抗原の例としては、乳癌抗原、卵巣癌抗原、前立腺癌抗原、子宮頸癌抗原、膵臓癌抗原、肺癌抗原、膀胱癌抗原、結腸癌抗原、睾丸癌抗原、膠芽細胞腫癌抗原、Ｂ細胞性悪性疾患に関連する抗原、多発性骨髄腫に関連する抗原、非ホジキンリンパ腫に関連する抗原、又は慢性リンパ性白血病に関連する抗原といった「癌抗原」が挙げられる。癌細胞が特徴的に発現する抗原の例としては、以下の抗原：結腸癌抗原１９．９；胃癌ムチン抗原４．２；結腸直腸癌抗原Ａ３３（Almqvist, Y. 2006, Nucl Med Biol.Nov;33(8):991-998）；ＡＤＡＭ‐９（米国公開特許第２００６／０１７２３５０号；国際公開第０６／０８４０７５号）；ＡＦＰ胎児性抗原‐アルファ‐フェトプロテイン（Malaguarnera, G.et al. (2010) "Serum markers of hepatocellular carcinoma," Dig. Dis.Sci. 55(10):2744-2755）；ＡＬＣＡＭ（国際公開第０３／０９３４４３号）；ＢＡＧＥ（Bodey, B. 2002 Expert Opin Biol Ther. 2(6):577-84）；ベータ‐カテニン（Prange W. et al.2003 J Pathol. 201(2):250-9）；ＣＡ１２５（Bast, R.C. Jr. etal. 2005 Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81）；カルボキシペプチダーゼＭ（米国公開特許第２００６／０１６６２９１号）；Ｂ１（Egloff, A.M. etal. 2006, Cancer Res. 66(l):6-9）；ＣＤ５（Calin, G.A. et al.2006 Semin Oncol. 33(2): 167-73）；ＣＤ１９（Troussard, X. et al. 1998 Hematol Cell Ther. 40(4): 139-48）；ＣＤ２０（Thomas,D.A. et al. 2006 Hematol Oncol Clin North Am.20(5):1125-36）；ＣＤ２０（Cang, S. et al. 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本発明の三重特異性結合分子の可変軽鎖ドメイン、可変重鎖ドメイン、抗体軽鎖又は抗体重鎖を提供するために使用できる疾患関連抗原のエピトープに特異的に結合する例示的な抗体を、表２に提示する。

疾患関連抗原は、病原体感染細中又は癌細胞中に特徴的に発現して、細胞表面上でＭＨＣのコンテクストにおいて処理及び発現され得るが、正常な細胞中では特徴的に発現しない。このようなペプチド断片を認識する抗体は当該技術分野で公知であり、又は国際公開第２００２／０１４８７０に記載されているものを含む公知の方法を用いて生成できる。

本発明の三重特異性結合分子のポリペプチドは、上述のような抗体の（このような分子の第１及び第２のポリペプチド鎖の場合には）可変軽鎖若しくは可変重鎖ドメイン又は（このような分子の第３及び第４のポリペプチド鎖の場合には）重鎖若しくは軽鎖を含有するよう適合させることができる。従って上述の抗体を用いて、部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃが上述のような疾患関連抗原のエピトープに結合できる本発明の三重特異性結合分子を産生できる。

Ｂ．好ましい構造的属性
典型的には、本発明の三重特異性結合分子は４つの異なるポリペプチド鎖を備えることになり、これらはそれぞれ、アミノ末端及びカルボキシ末端を有する（図４Ａ〜４Ｄ参照）が、上記分子は、このようなポリペプチド鎖を（例えばペプチド結合を介して）互いに融合することによって、又はこのようなポリペプチド鎖を分割して更なるポリペプチド鎖を形成することによって、より少数又はより多数のポリペプチド鎖を備えてよい。図４Ｅ〜４Ｊは、３つのポリペプチド鎖を有するこのような分子を概略的に示すことにより、本発明のこの態様を例示している。図４Ｋ〜４Ｌは、５つのポリペプチド鎖を有する分子を概略的に示すことにより、本発明のこの態様を例示している。

このような分子の様々な免疫グロブリンドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭを含むがこれらに限定されないいずれのアイソタイプ又はアロタイプの免疫グロブリンに由来し得る。好ましい実施形態では、以下において議論するように、このような免疫グロブリンＩｇＧ免疫グロブリンに由来する。具体的実施形態では、使用されるＩｇＧアイソタイプはＩｇＧ１であるが、他のアイソタイプのＩｇＧ（例えばＩｇＧ２、ＩｇＧ３若しくはＩｇＧ４又はこれらのアロタイプ）を採用してもよい。ＩｇＧ４Ｆｃドメインを利用する場合、本発明は、鎖交換の発生を低減するための、非特許文献１８に記載されているようなＥＵインデックスによって番号付与されたＳ２２８Ｐ等の、安定化突然
変異の導入を包含する（Lu et al., (2008) “TheEffect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By AnalyticalUltracentrifugation,” J. Pharmaceutical Sciences97:960-969）。当該技術分野で公知の他の安定化突然変異を、IgG４ Fc
ドメインに導入してもよい（Peters, P et al., (2012) “Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide BondHeterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability,” J. Biol. Chem., 287:24525-24533；国際公開第２００８／１４５１４２号）。Ｎ２９７Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＤ２６５Ａ置換はエフェクタ機能を消失させるため、エフェクタ機能が望まれる状況においては、これらの置換を採用しないことが好ましい。

図４Ａ〜４Ｄは、好ましい三重特異性結合分子のドメインの模式図を提供する。図４Ａ及び４Ｂはそれぞれ、非ダイアボディタイプ結合ドメインがＦａｂタイプ結合ドメイン又は受容体タイプ結合ドメインである、好ましい三重特異性結合分子のドメインを概略的に示す。図４Ｃ及び４Ｄはそれぞれ、非ダイアボディタイプ結合ドメインがＦａｂタイプ結合ドメイン又は受容体タイプ結合ドメインである、異なるドメイン配向を有する好ましい三重特異性結合分子のドメインを概略的に示す。

上述のように、上述のような例示的な好ましい三重特異性結合分子の結合ドメインによって結合されるエピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの１つは、疾患関連抗原のエピトープであってよい。疾患関連抗原のこのようなエピトープに結合する、上述のような例示的な好ましい三重特異性結合分子の結合ドメインは、Ｆａｂタイプ結合ドメインであることが最も好ましい。本発明のこのような三重特異性結合分子のポリペプチドは、（このような分子の第１及び第２のポリペプチド鎖の場合には）可変軽鎖若しくは可変重鎖ドメイン又は（このような分子の第３及び第４のポリペプチド鎖の場合には）重鎖若しくは軽鎖を含有するよう適合させることができる。従って上述の抗体を用いて、部位Ａ、部位Ｂ又は部位Ｃが上述のような疾患関連抗原のエピトープに結合できる本発明の三重特異性結合分子を産生できる。

１．好ましい第１のポリペプチド鎖
本発明の好ましい三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖は、エピトープＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬ_I）、エピトープＩＩに結合できる可変重鎖ドメイン（Ｖ
Ｈ_II）、システイン残基又はシステイン含有ドメイン及びヘテロ二量体促進ドメイン並びにＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備える。

第１のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、異なるエピトープに向かって配向されているため、これらは、エピトープＩ又はエピトープＩＩに結合できる結合ドメインを形成するために一体に連結できない。第１のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、これらのドメインの連結を実質的に防止するために、十分に短い介在リンカーペプチドによって互いから分離されている。「リンカー１」と呼ばれる例示的なリンカーは、配列（配列番号１）：GGGSGGGGを有する。

第１のポリペプチドの可変重鎖ドメイン、及び上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは好ましくは、１、２、３、又は４つ以上のシステイン残基を含有する介在リンカーペプチドによって、互いから分離されている。好ましいシステイン含有ドメイン（「リンカー２」）は、配列番号２：GGCGGGの配列を有する。あるいは、又は更に、以下に記載するようなシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインを使用してよい。

従っていくつかの実施形態では、２つの上述のようなポリペプチド鎖を一体に共有結合させるために、１つ又は複数のシステイン残基（若しくはシステイン含有ペプチドリンカー等のシステイン含有ドメイン）を、第１のポリペプチド鎖に（及び／又は本発明の三重
特異性結合分子の第２、第３、第４の、若しくは更なるポリペプチド鎖に）組み込むが、その一方で同等の実施形態では、同一の結果を達成するために、このような１つ又は複数のシステイン残基を、ヘテロ二量体促進ドメインに、又は別のドメインに組み込んでよい。

第１のポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメイン及び第２のポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは、協調的に選択される。これらのドメインは互いに異なっており、第１及び第２のポリペプチド鎖の連結を促進するために互いに連結するよう設計される。例えば上記ヘテロ二量体促進ドメインのうちの一方は、ｐＨ７において負電荷を有するように加工され、その一方で上記２つのポリペプチド鎖のうちのもう一方は、ｐＨ７において正電荷を有するように加工される。このような荷電ドメインの存在は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間の連結を促進し、従ってヘテロ二量体化を促進する。第１及び第２のポリペプチド鎖に対して採用されるドメインが、これらの鎖の間のヘテロ二量体を促進できるように異なっている限り、どの鎖にどのヘテロ二量体促進ドメインが提供されるかは重要ではない。

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは「Ｅコイル（Ｅ‐ｃｏｉｌ）」ドメイン（配列番号３）：EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK、又は「Ｋコイル（Ｋ‐ｃｏｉｌ）」ドメイン（配列番号４）：KVAALKEKVAALKEKVAALKEKVAALKEである。より好ましくは、第１のポリペプチド鎖が「Ｅコイル」ドメインを有することになる。第１のポリペプチド鎖はこのようなコイルセパレータを１つだけ含有してよく、又は２つ以上のこのようなコイルセパレータ（例えば２つのセパレータ）を含有してよく、同一の大きさの反対の電荷を有するものとすることができる。

好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、そのグルタミン酸塩残基がｐＨ７において負電荷を形成する４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメイン（配列番号３：EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK）を備えるか、又はそのリジン
残基がｐＨ７において正電荷を形成する４つのタンデム「Ｋコイル」ドメイン（配列番号４：KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE）を備える。このような荷電ドメインの存在は、
第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖との間の連結を促進し、従ってヘテロ二量体化を促進する。特に好ましいのは、配列番号３又は配列番号４の４つのタンデム「Ｅコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK（配列番号１１５）を含有するように修飾されているか、又は配列番号４の４つのタン
デム「Ｋコイル」螺旋ドメインのうちの１つが、システイン残基：KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE（配列番号１１６）を含有するように修飾されている、ヘテロ二量体促進ド
メインである。本発明に従って採用できる他のＥコイル及びＫコイルドメインは、以下に開示されている：Woolfson, D.N. (2005) "TheDesign Of Coiled-Coil Structures And Assemblies " Adv. Prot. Chem.70:79-112, Straussman, R. et al. (2007) "Kinkingthe Coiled Coil -Negatively Charged Residues at the Coiled-coilInterface," J. Molec. Biol. 366: 1232-1242; Apostolovic, B. et al. (2008) "pH-Sensitivity of theE3/K3 Heterodimeric Coiled Coil," Biomacromolecules 9:3173-3180; Arndt,K.M. et al. (2001) "Helix-stabilized Fv (hsFv) Antibody Fragments: Substituting the Constant Domainsof a Fab Fragment for a Heterodimeric Coiled-coil Domain," J. Molec. Biol. 312:221-228; Steinkruger,J.D. et al. (2012) "The d'-d-d' Vertical Triad
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好ましくは、第１のポリペプチド鎖の採用されるヘテロ二量体促進ドメイン及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、ヘテロ二量体促進ドメインに対して改善された安定化を提供する介在システイン含有リンカーペプチドによって、互いから分離されている。好ましいシステイン含有リンカーペプチド（「リンカー３」）は、アミノ酸配列（配列番号５）：DKTHTCPPCPを有する。

野生型ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである（位置は、非特許文献１８中のもののようなＥＵインデックスによるものである）（配列番号６）：
|CH2 →
APELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT
231 240 250 260 270 280
←CH2│CH3→
KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA K GQPREPQVY
290 300 310 320 330 340

TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK
350 360 370 380 390 400
←CH3│
LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK
410 420 430 440

いくつかの発現系では、ＣＨ３ドメインのＣ末端アミノ酸残基は、翻訳後に除去してよい。従ってＣＨ３ドメインのＣ末端残基は、任意のアミノ酸残基である。

第１のポリペプチド鎖のＣＨ‐ＣＨ３ドメインは好ましくは、第３のポリペプチド鎖（以下を参照）のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン間のヘテロ二量体化を促進するために修飾される。例えば、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２又はＣＨ３ドメインにアミノ酸置換（好ましくは「ノブ（ｋｎｏｂ）」を形成する嵩高な側鎖基、例えばトリプトファンを含むアミノ酸による置換）を導入して、立体障害により、同様に突然変異させたドメインとの相互作用を防止し、上記変化させたドメインを、相補的な又は適応した突然変異（例えばグリシンによる置換）を施されたドメイン、即ち「ホール（ｈｏｌｅ）」とペアにすることができる。このような一連の突然変異は、ダイアボディ分子を構成するポリペプチドのいずれのペアに施すことができ、また更に、上記ペアのポリペプチド鎖のいずれの部分に施すことができる。ホモ二量体化を抑えてヘテロ二量体化を促進するためのタンパク質加工の方法は、特に免疫グロブリン様分子の加工に関して当該技術分野で公知であり、本明細書に包含される（例えば特許文献６２、６３、Ridgway et al. (1996) “‘Knobs-Into-Holes’Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621; Atwell et al. (1997) “Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol.270: 26-35；及びXie et al. (2005) “A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に援用される））。好ましいノブは、天然ＩｇＧＦｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｗを含有させることによって生成される。好ましいホールは、天然ＩｇＧＦｃドメインを修飾して修飾基Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含有させることによって生成される。本発明の三重特異性結合分子を精製するのを補助するために、ホール突然変異を含有するポリペプチド鎖は更に、タンパク質Ａ結合部位を除去するための位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）における置換を含む。このようにして、ホール突然変異を含有する上記ポリペプチドのホモ二量体はタンパク質Ａに結合せず、その一方でノブ及びホール含有ヘテロ二量体の結果として形成される三重特異性結合分子は、ノブ突然変異を含有するポリペプチド鎖のタンパク質Ａ結合部位を介してタンパク質Ａに結合する能力を有したままとなる。

第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは好ましくは、Ｆｃ‐Ｆｃ受容体の結合を低減又は抑制するように修飾される。このような突然変異は当該技術分野において公知であり、位置２３４、２３５、２６５及び２９７に置換を含む（米国特許第５，６２４，８２１号参照）。好ましい置換は、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ並びにＮ２９７Ｑのうちの１つ以上を含む。

従って好ましくは、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは「ノブ担持（Ｎｏｂ‐Ｂｅａｒｉｎｇ）」配列（配列番号７）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNHYTQKS LSLSPGK
又はタンパク質Ａ結合を抑制するためのＨ４３５Ｒ置換を有する「ホール担持（ｈｏｌｅ‐ｂｅａｒｉｎｇ）」配列（配列番号８）：
APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA
PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE
WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE
ALHNRYTQKS LSLSPGK
を有する。

第１のポリペプチド鎖が、配列番号７のもの等の「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３配列を有することが好ましい。

認識されるように、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号８）を第１のポリペプチド鎖において採用してよく、この場合「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号７）は第３のポリペプチド鎖において採用される。

従って要約すると、本発明の好ましい三重特異性結合分子の好ましい第１のポリペプチド鎖は、以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＬ_Iドメイン）‐（リンカー１）‐
（ＶＨ_IIドメイン）‐（システイン含有ドメイン（リンカー２））‐（Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）又は（ＶＬ_Iドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨ_IIドメイン）‐（リンカー２）‐（システイン含
有Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン又は（ＶＬ_Iドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨ_IIドメイン）‐（リンカー２）
‐（システイン含有Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン）‐（リンカー３）‐（ノブ担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）。

２．好ましい第２のポリペプチド鎖
上述のような好ましい三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、エピトープＩＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬ_II）、エピトープＩに結合できる可変重鎖ドメイン（ＶＨ_I）、システイン残基又はシステイン含有ドメイン
、及びヘテロ二量体促進ドメインを備える。

第２のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、異なるエピトープに向かって配向されているため、これらは、エピトープＩ又はエピトープＩＩに結合できる結合ドメインを形成するために一体に連結できない。第２のポリペプチドの可変軽鎖及び可変重鎖ドメインは、これらのドメインの連結を実質的に防止するために、十分に短い介在リンカーペプチドによって互いから分離されている。配列（配列番号１）：GGGSGGGGを有する「リンカー１」が、この目的のための例示的なリンカーである。

第１のポリペプチド鎖の場合と同様に、第２のポリペプチドの可変重鎖ドメイン、及び上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインは好ましくは、１、２、３、又は４つ以上のシステイン残基を含有する介在システイン含有ドメインによって、互いから分離されている。（「リンカー２」）は、配列番号２：GGCGGGを有する「リンカー２」が、この目的のための例示的なリンカーである。このようなシステイン残基は、第１のポリペプチドの重鎖ドメインと、上記ポリペプチドのヘテロ二量体促進ドメインとを分離する、システイン含有スペーサペプチド中のシステイン残基と、ジスルフィド結合を形成できる。従って、本発明の三重特異性結合分子の第１及び第２のポリペプチドは、互いに対して共有結合する。あるいは、上述のようなシステイン含有ヘテロ二量体促進ドメインを使用してよい。

上述のように、第２のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインと協調するように選択される。従って好ましい実施形態では、第１のポリペプチド鎖のヘテロ二量体促進ドメインは「Ｋコイル」ドメイン（例えば配列番号４若しくは配列番号１１６）又は「Ｅコイル」ドメイン（例えば配列番号３若しくは配列番号１１５）である。第１のポリペプチド鎖は好ましくは「Ｅコイル」ドメインを有するため、第２のポリペプチド鎖は好ましくは「Ｋコイル」ドメインを含有する。

第１及び第２のポリペプチド鎖はダイアボディのポリペプチド鎖であるため、これらは一体に連結して、エピトープＩを認識してこれに免疫特異的に結合するドメインＩ結合ドメイン（ＶＬ_A／ＶＨ_A）、及びエピトープＩＩを認識してこれに免疫特異的に結合するドメインＩＩ結合ドメイン（ＶＬ_B／ＶＨ_B）を形成できる。

従って要約すると、本発明の好ましい三重特異性結合分子の好ましい第２のポリペプチド鎖は、以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＬ_IIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨ_Iドメイン）‐（システイン含有ドメイン（リンカー２））‐（Ｋコイルヘテロ二
量体促進ドメイン）又は（ＶＬ_IIドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨ_Iドメイン）‐（
リンカー２）‐（システイン含有Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン）。

３．好ましい第３のポリペプチド鎖
本発明の好ましい三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端へ
の方向に、結合ドメイン、ＣＨ１‐ヒンジドメインを任意に備えるシステイン含有ドメイン、及びＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを備えるポリペプチドである。本発明の好ましい三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖の結合ドメインは、エピトープＩＩＩに結合できる可変重鎖ドメイン（ＶＨ_III）であってよく、この場合、（以下において議論される）本
発明の好ましい三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖は、エピトープＩＩＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬ_III）を備えるポリペプチドであり、これにより上記結合
ドメインが、エピトープＩＩＩを有する抗原に免疫特異的に結合できる。あるいは、本発明の好ましい三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖の結合ドメインは、Ｔ細胞受容体タイプ結合ドメインを備えてよく、この場合、（以下において議論される）本発明の好ましい三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖は、相補的なＴ細胞受容体タイプ結合ドメインを備えるポリペプチドであり、これにより、２つのポリペプチド鎖の相互作用が、細胞の表面上に配列されたＭＨＣ複合体中に発現される抗原分子に生理学的に特異的に結合できる結合ドメインを形成する。第３のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいは第３のポリペプチド鎖は、組み換えによって構成してよい。例示的なＣＨ１ドメインは、アミノ酸配列（配列番号９）：
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV
を有するヒトＩｇＧ１ＣＨ１ドメインである。

例示的なヒンジドメインは、アミノ酸配列（配列番号１０）：EPKSCDKTHTCPPCPを有す
るヒトＩｇＧ１ヒンジドメインである。認識されるように、上記例示的なヒンジドメインは、鎖間共有結合に関与し得る複数のシステイン残基を備える（Elkabetz et al. (2005)
“Cysteines In CHI Underlie Retention Of Unassembled Ig Heavy Chains,”J. Biol.
Chem. 280: 14402-14412）。あるいは、ある異なるシステイン含有ドメインを採用して
よい（例えばアミノ酸配列：VEPKSC（配列番号１２）、AEPKSC（配列番号１２７）、GVEPKSC（配列番号１３３）又はGGCGGG（配列番号２）を有するペプチド）。

野生型ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを採用してよいが、上述のように、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインとのヘテロ二量体化を促進する修飾されたＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを採用することが好ましい。

従って好ましくは、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、第１のポリペプチドにおいて採用される「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（配列番号７）に対してアミノ酸配列が相補的である「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインである。上述のように、ホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは好ましくは、タンパク質Ａ結合部位を除去するための、位置４３５（Ｈ４３５Ｒ）における置換を含むべきである。第３のポリペプチドに関するＨ４３５Ｒ置換を有する「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、配列番号８である。

認識されるように、「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号７）を第３のポリペプチド鎖において採用してよく、この場合、「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン（例えば配列番号８）が、第１のポリペプチド鎖において採用されることになる。

本発明の好ましい三重特異性結合分子の第３（及び第４）のポリペプチド鎖がそれぞれ、T細胞受容体タイプ結合ドメインのポリペプチド鎖を備える実施形態では、Ｉ型ＭＨＣ
のコンテクストにおいて細胞表面上で発現される抗原が識別された。このようなＴ細胞受容体タイプ結合ドメインを産生するための方法は、当該技術分野において公知である（例えば米国公開特許第２０１２／０２９４８７４Ａ１号）。

従って要約すると、本発明の好ましい三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖は、
以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＨ_IIIドメイン）‐（システイン含有ドメイ
ン（任意にＣＨ１ドメイン及び／若しくはヒンジドメイン）‐（ホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）、又は（受容体タイプ結合ドメイン；その第１又は第２のポリペプチド）‐（システイン含有ドメイン（任意にＣＨ１ドメイン及び／若しくはヒンジドメイン）‐（ホール担持ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン）。

４．好ましい第４のポリペプチド鎖
本発明の好ましい三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖は、受容体タイプ結合ドメインのポリペプチド（ここで第３及び第４のポリペプチド鎖は受容体タイプ結合ドメインを形成する）、又はより好ましくは、エピトープＩＩＩに免疫特異的に結合する、及び／若しくは及び／又は第３のポリペプチド鎖の結合ドメインに対して相補的な、上述の抗体の軽鎖のポリペプチド部分である。

従って、第３及び第４のポリペプチドがＦａｂタイプ結合ドメインを形成する場合、このような第４のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端への方向に、エピトープＩＩＩに結合できる可変軽鎖ドメイン（ＶＬ_III）、並びに第３のポリペプチド鎖との共有結合を促
進するためのシステイン含有ドメイン、又は結合ドメイン、及び第３のポリペプチド鎖との共有結合を促進するための上述のようなシステイン含有ドメインを備える。このようなシステイン含有ドメインは、ＣＬドメイン、又は（配列番号１１）FNRGEC若しくは（配列番号１２８）GFNRGECといったそのシステイン含有部分、又はリンカー２（配列（配列番
号２）GGCGGGを有する）リンカー２等のリンカーであってよい。このようなリンカー２とジスルフィド結合を形成する例示的なシステイン含有ドメインは、アミノ酸配列VEPKSC（配列番号１２）又はヒンジドメインを備える。

第４のポリペプチド鎖は、自然に発生する抗体から単離できる。あるいは第３のポリペプチド鎖は、組み換えによって構成してよい。好ましいＣＬドメインは、アミノ酸配列（配列番号１３）：
RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
SFNRGEC
を有するヒトＩｇＧ１ＣＬカッパドメインである。

あるいは、例示的なＣＬドメインは、アミノ酸配列（配列番号１４）：
QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA
GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP
TECS
を有するヒトＩｇＧ１ＣＬラムダ２ドメインである。

理解されるように、第４のポリペプチド鎖のＣＬドメイン又は他のシステイン含有ドメインは、第３のポリペプチド鎖のシステイン含有ドメイン（例えばＣＨ１ドメイン）と共有結合でき、それによって本発明の三重特異性結合分子の第３及び第４のポリペプチド鎖を互いに対して共有結合的に複合体化できる、システイン残基を備える。よって第３及び第４のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合する。

更に、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのシステイン残基は、第３のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメインのシステイン残基とジスルフィド結合を形成できる。よって第１及び第３のポリペプチド鎖は、互いに対して共有結合する。

従って要約すると、本発明の好ましい三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖は、以下のドメイン及びリンカーを備える：（ＶＬ_IIIドメイン）‐（システイン含有ドメイ
ン（任意にＣＬドメイン）、又は（受容体タイプ結合ドメイン；その第１又は第２のポリペプチド）‐（システイン含有ドメイン（任意にＣＬドメイン）。

Ｃ．代替的な第１のポリペプチド鎖
一実施形態では、上述のドメインの配向は、Ｎ末端からＣ末端への方向である。しかしながら本発明はその変形例も考察し、ここでは第１のポリペプチド鎖のドメインの配向は：ＮＨ₂‐（ノブ担持ＣＨ３‐ＣＨ２ドメイン）‐（ＶＬ_Iドメイン）‐（リンカー１）‐（ＶＨ_IIドメイン）‐（システイン含有ドメインリンカー２）‐（Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン）となる。好ましくは、上記ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインへのＮ末端にシステイン含有ドメインが存在する。例示的なペプチドの配列は（配列番号５）：DKTHTCPPCPであるが、代替的なリンカー、例えばEPKSCDKTHTCPPCP（配列番号１２９）又はLEPKSSDKTHTCPPCP；配列番号１３０）を採用してよい。この実施形態において好ましくは、ＣＨ３ドメ
インは、アミノ酸配列（配列番号１５）：APSSS、及びより好ましくはアミノ酸配列（配
列番号１６）APSSSPMEを有するもの等の介在ペプチドリンカーによって、ＶＬ_Iドメイン
から分離されているが、代替的なリンカー、例えばASTKG（配列番号１３１）、LEPKSS（
配列番号１３２）、GGC又はGGGを採用してよい。

Ｄ．アルブミン結合ドメイン
特許文献４７に開示されているように、ダイアボディのインビボ薬学動態学的特性を改善するために、ダイアボディを、上記ダイアボディの末端のうちの１つ又は複数において血清結合性タンパク質のポリペプチド部分を含有するように、修飾してよい。このような考察は、本発明の三重特異性結合分子にも適用可能である。最も好ましくは、血清結合性タンパク質のポリペプチド部分を本発明の三重特異性結合分子に組み込むことが望まれる場合に、このようなポリペプチド部分を、上記三重特異性結合分子のポリペプチド鎖のうちの１つのＣ末端に配置する。

アルブミンは、血漿中に最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて１９日の半減期を有する。アルブミンは、アルブミンを他のタンパク質に非共有結合させることができ、従ってアルブミンの血漿半減期を延長できる、複数の小さな分子結合部位を有する。連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）は、安定な３ヘリックスバンドルを形成し、かつ広範なアルブミン結合特異性を有する４６個のアミノ酸残基からなる（Johansson, M.U. et al. (2002) “Structure,Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules ” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120）。従って、ダイアボディのインビボ薬学動態学的特性を改善するための、特に好
ましい血清結合性タンパク質のポリペプチド部分は、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン‐結合ドメイン（ＡＢＤ）であり、より好ましくは、連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン‐結合ドメイン３（ＡＢＤ３）（配列番号１２３）：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALPである。

特許文献４８（参照により本出願に援用される）に開示されているように、配列番号１２３の「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）」変異体は、ＭＨＣクラスＩＩ結合を減衰させる又は除去する能力を有する。組み合わせ突然変異の結果に基づき、以下の置換の組み合わせが、上述のような脱免疫化アルブミン‐結合ドメインを形成するための好ましい置換であると考えられる：６６Ｓ／７０Ｓ＋７１Ａ；６６Ｓ／７０Ｓ＋７９Ａ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７１Ａ＋６６Ｅ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｓ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｄ；６４Ａ／６５Ａ／７９Ａ＋６６Ｅ。修飾Ｌ６４Ａ、Ｉ６５Ａ及びＤ７９Ａ又は修飾Ｎ６６Ｓ、Ｔ７０Ｓ及びＤ７９Ａを有する変異型ＡＢＤ。アミノ酸配列：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNA ₆₄ A ₆₅NNAKTVEGVKALIA ₇₉E ILAALP（配列番号１２４）、又はアミノ酸配列：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIS ₆₆NAKS ₇₀VEGVKALIA ₇₉E ILAALP（配列番号１２５）を有する変異型脱免疫
化ＡＢＤは、上述のような脱免疫化アルブミン‐結合ドメインが、ＭＨＣクラスＩＩ結合の減衰を提供しながら、実質的に野生型の結合を呈するため、特に好ましい。上述のようなアルブミン‐結合ドメインは、本発明の三重特異性結合分子のポリペプチド鎖のいずれに組み込んでよいが、このようなドメインを、第１又は第３のポリペプチド鎖のＥコイル（又はＫコイル）ドメインに（Ｅコイル（又はＫコイル）ドメインと（好ましくは脱免疫化アルブミン‐結合ドメインである）上記アルブミン‐結合ドメインとの間に介在するリンカーを介して）Ｃ末端において位置決めすることが好ましい。このようなリンカーに関して好ましい配列は、配列番号１２６：GGGSである。

Ｅ．Ｆｃドメインの機能性
一実施形態では、第１のポリペプチド鎖のＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン及び第３のポリペプチドのＣＨ２‐ＣＨ３ドメインは、複合体化して、Ｆｃ受容体に実質的に結合できない（即ち野生型Ｆｃドメインの範囲の１０％未満に結合する）Ｆｃドメインを形成する。あるいは、このような分子のＦｃドメインは、生理学的条件下でＦｃ受容体に結合でき、これにより上記三重特異性結合分子は四重特異性となり、４つの分子（エピトープＩ、エピトープＩＩ及びエピトープＩＩＩ、並びにＦｃ受容体）への協調的結合を仲介できる。最も好ましくは、Ｆｃ受容体に結合できるこのような分子は更に、Ｆｃ受容体依存性エフェクタ機能を仲介する。

本発明はまた、変異型Ｆｃドメインを含む分子も包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、同等の野生型Ｆｃドメインに対する１つ又は複数のアミノ酸置換、挿入又は欠失を含む。変異型Ｆｃドメインを含む分子は通常、野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して変化した表現型を有する。この変異型表現型は、変化した血清半減期、変化した安定性、細胞酵素に対する変化した感受性、又はＮＫ依存性若しくはマクロファージ依存性アッセイで測定されるような変化したエフェクタ機能として表現され得る。変化したエフェクタ機能として表されるＦｃドメイン修飾には当該技術分野において公知であり、活性化型受容体に対する結合を増大させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ））、及び阻害型受容体に対する結合を低下させる修飾（例えばＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ））が含まれる（例えばStavenhagen, J.B. et al. (2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion
In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors,” Cancer Res. 57(18):8882-8890を参照）。ＣＤ３２Ｂに対する結合が低下し、及び／又はＣＤ１６Ａに対する結合が増大した、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインの例示的な変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ又はＰ２９６Ｌ置換を含有する。これらのアミノ酸置換は、いずれの組み合わせでヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインに存在してよい。一実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異体は、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ２９６Ｌ置換を含有する。別の実施形態では、上記ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン変異体は、これらの突然変異がＦｃＲ結合を消滅させるため、Ｎ２９７Ｑ置換、Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ置換、又はＤ２６５Ａ置換を含有する。

ＩＩＩ．本発明の三重特異性結合分子の例証：ＣＤ３及びＣＤ８のエピトープに、並びに疾患関連抗原のエピトープに結合する結合ドメインを有する、三重特異性結合分子
上述のように、本発明は特に、３つのエピトープが、このようなエピトープのうちの１つ又は２つが免疫系細胞、特に細胞毒性リンパ球免疫系細胞（ＣＴＬ）の１つ又は複数のエピトープとなり、残りの１つ又は複数のエピトープが疾患関連抗原の１つ又は複数のエピトープとなるように選択された、三重特異性結合分子の実施形態に関する。このような三重特異性結合分子の特に好ましい実施形態では、このような分子の結合ドメインは、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩがＣＤ３のエピトープとなり、エピト
ープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩのうちの第２のものがＣＤ８のエピトープとなり、エピトープＩ、エピトープＩＩ又はエピトープＩＩＩが疾患関連抗原のエピトープとなり、ここで上記三重特異性結合分子の結合ドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩが、細胞毒性Ｔ細胞及び疾患関連抗原を発現する細胞の協調的結合を仲介するように、選択される。このような三重特異性結合分子は、細胞毒性リンパ球細胞を、疾患関連抗原を発現する細胞に対して局在化でき、またこれによって、疾患関連抗原を発現する細胞の殺滅を促進できる。上記疾患関連抗原は、癌抗原であってよく、又は病原体（例えば細菌、真菌、ウイルス若しくは原生動物）感染の特徴である抗原であってよい。より詳細には、本発明は：（１）ＣＤ３のエピトープ；（２）ＣＤ８のエピトープ；及び（３）疾患関連抗原のエピトープに対する協調的結合を仲介できる、上述のような三重特異性結合分子に関する。ＣＤ３及びＣＤ８に対して、並びに疾患関連抗原に対して結合することにより、このような分子は、上記疾患関連抗原を提示する細胞に対して細胞毒性Ｔ細胞を共局在化でき、これは、このようなＴ細胞の活性化、及び上記疾患関連抗原を発現する細胞に対する細胞毒性応答の開始につながる。

抗ＣＤ３又は抗ＣＤ８抗体の重鎖を、上述のような本発明の例示的な三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖として採用してよい。同様に、これらの抗体の軽鎖を、本発明の三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖として採用してよい。あるいは、これらの抗体の軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインを、他の免疫グロブリン定常領域と組み合わせて、上述のような第３及び第４のポリペプチド鎖を得てよい。よってこれらの抗体を用いて、部位ＣがＣＤ３又はＣＤ８に結合できる本発明の三重特異性結合分子を産生できる。

同様に、上述のような可変ドメインを、本発明の三重特異性結合分子の第１及び第３のポリペプチドの可変ドメイン部分に組み込むことによって、部位ＡがＣＤ３若しくはＣＤ８に結合できる、又は部位ＢがＣＤ３若しくはＣＤ８に結合できる、本発明の三重特異性結合分子を産生できる。

１．例示的な抗ＣＤ３抗体
本発明の三重特異性結合分子のＣＤ３又はＣＤ８結合ドメインを作製するために、以下に提供する抗ＣＤ３又は抗ＣＤ８抗体のいずれを採用してよい。

ＯＫＴ３
ＯＫＴ３軽鎖可変ドメイン（配列番号１７）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVSYMNWYQQKSG TSPKRWIYDT
SKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSG
TKLEINR

ＯＫＴ３重鎖可変ドメイン（配列番号１８）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFT RYTMHWVKQR PGQGLEWIGY
INPSRGYTNY NQKFKDKATL TTDKSSSTAY MQLSSLTSED SAVYYCARYY
DDHYCLDYWG QGTTLTVSSA KTTAPSVYPL APVCGDTTGS SVTLGCLVKG
YFPEPVTLTW NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVT SS

Ｍ２９１
Ｍ２９１軽鎖可変ドメイン（配列番号１９）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
DIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWTYDT
SKLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE DADTYYCQQW SSNPPTFGSG
TKLEIK

Ｍ２９１重鎖可変ドメイン（配列番号２０）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLQQSGAE LARPGASVKM SCKASGYTFI SYTMHWVKQR PGQGLEWIGY
INPRSGYTHY NQKLKDKATL TADKSSSSAY MQLSSLTSED SAVYYCARSA
YYDYDGFAYW GQGTLVTVSA

ＹＴＨ１２．５
ＹＴＨ１２．５軽鎖可変ドメイン（配列番号２１）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
MGWSCIILFL VATATGVHSD IQLTQPNSVS TSLGSTVKLS CTLSSGNIEN
NYVHWYQLYE GRSPTTMIYDDDKRPDGVPD RFSGSIDRSS NSAFLTIHNV
AIEDEAIYFC HSYVSSFNVF GGGTKLTVLR

ＹＴＨ１２．５重鎖可変ドメイン（配列番号２２）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
MGWSCIILFL VATATGVHSE VQLLESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFTFSS
FPMAWVRQAP GKGLEWVSTISTSGGRTYYR DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL
QMNSLRAEDT AVYYCAKFRQ YSGGFDYWGQ GTLVTVSS

ヒト化抗ＣＤ３抗体１（「ＣＤ３ｍＡｂ１」）（米国特許公開第２０１４／００９９３１８Ａ１号）
ＣＤ３ｍＡｂ１軽鎖可変ドメイン（配列番号２３）変異体１（ＣＤＲは下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRLIYDS
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SRNPPTFGGG
TKVEIK

ＣＤ３ｍＡｂ１軽鎖可変ドメイン（配列番号２４）変異体２（ＣＤＲは下線を付して示す）：
DVVMTQSPAI MSAFPGEKVT ITCSASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDS
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SRNPPTFGGG
TKVEIK

ＣＤ３ｍＡｂ１重鎖可変ドメイン（配列番号２５）変異体１（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT RSTMHWVRQA PGQGLEWIGY
INPSSAYTNY NQKFKDRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCASPQ
VHYDYNGFPY WGQGTLVTVS S

ヒト化抗ＣＤ３抗体２（「ＣＤ３ｍＡｂ２」）（米国特許公開第２０１４／００９９３１８Ａ１号）
ＣＤ３ｍＡｂ２軽鎖可変ドメイン（配列番号２６）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG

ＣＤ３ｍＡｂ２重鎖可変ドメイン（配列番号２７）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS

ＣＤ３ｍＡｂ２重鎖可変ドメインＤ６５Ｇ変異体（配列番号２８）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSS

２．例示的な抗ＣＤ８抗体
ＯＫＴ８（「ＣＤ８ｍＡｂ１」）
ＯＫＴ８軽鎖可変ドメイン（配列番号２９）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
DIVMTQSPAS LAVSLGQRAT ISCRASESVD SYDNSLMHWY QQKPGQPPKV
LIYLASNLES GVPARFSGSG SRTDFTLTID PVEADDAATY YCQQNNEDPY
TFGGGTKLEI KR

ＯＫＴ８重鎖可変ドメイン（配列番号３０）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLLESGPE LLKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQS HGKSLEWIGY
IYPYTGGTGY NQKFKNKATL TVDSSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARNF
RYTYWYFDVW GQGTTVTVSS

ＴＲＸ２（「ＣＤ８ｍＡｂ２」）
ＴＲＸ２軽鎖可変ドメイン（配列番号３１）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG
TKVEIK

ＴＲＸ２重鎖可変ドメイン（配列番号３２）（ＣＤＲは下線を付して示す）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS S

３．疾患関連抗原のエピトープに結合する例示的な結合ドメイン
（ａ）ＨＩＶｇｐ４１
例示的な疾患関連抗原は、ＨＩＶｇｐ４１である。例示的なｇｐ４１抗体は、７Ｂ２（「ＨＩＶｍＡｂ１」）である。

７Ｂ２軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３５）：
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH
PPTFGHGTRV EIK

７Ｂ２重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３６）：
QVQLVQSGGG VFKPGGSLRL SCEASGFTFT EYYMTWVRQA PGKGLEWLAY
ISKNGEYSKY SPSSNGRFTI SRDNAKNSVF LQLDRLSADD TAVYYCARAD
GLTYFSELLQ YIFDLWGQGA RVTVSS

（ｂ）ＨＩＶｇｐ１２０
第２の例示的な疾患関連抗原は、ＨＩＶｇｐ１２０である。例示的なｇｐ１２０抗体は、Ａ３２（「ＨＩＶｍＡｂ２」）である。

Ａ３２ＶＬ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３３）：
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII SEVNNRPSGV PDRFSGSKSGNTA
SLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV FGGGTKLTVL

Ａ３２ＶＨ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３４）：
QVQLQESGPG LVKPSQTLSL SCTVSGGSSS SGAHYWSWIR QYPGKGLEWI
GYIHYSGNTY YNPSLKSRIT ISQHTSENQF SLKLNSVTVA DTAVYYCARG
TRLRTLRNAF DIWGQGTMVT
VSS

ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ
更なる例示的な疾患関連抗原は、ＲＳＶ糖タンパク質Ｆである。例示的な抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体は、パリビズマブ（「ＲＳＶｍＡｂ１」）である。

パリビズマブ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３７）：
DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCRASQSVG YMHWYQQKPG KAPKLLIYDT
SKLASGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYCFQG SGYPFTFGGG
TKLEIK

パリビズマブ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３８）：
QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVGWIR QPPGKALEWL
ADIWWDDKKD YNPSLKSRLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCARS
MITNWYFDVW GAGTTVTVSS

（ｄ）Ｂ７‐Ｈ３
特に好ましい例示的な疾患関連抗原はＢ７‐Ｈ３であり、これは、様々な癌細胞（例えば神経芽腫、胃、卵巣及び非小細胞肺癌等）上に発現する。Ｂ７‐Ｈ３タンパク質発現は、腫瘍細胞株において免疫組織学的に検出されている（Chapoval, A. et al.(2001) “B7-H3: A Costimulatory Molecule For T CellActivation and IFN-y Production”Nature Immunol.2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) “Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By NasalEpithelial Cells During Differentiation And Activation,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Castriconi
et al. (2004) “Identification Of 4Ig-B7-H3 As ANeuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NKCell-Mediated Lysis,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)101(34): 12640-12645）；Sun, M. et al. (2002) “Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes,” J. Immunol. 168:6294-6297）。ｍＲＮＡ発現は、心臓、腎臓、精巣、肺、肝臓、膵臓、前立腺、結腸及び骨芽細胞に見られる（Collins, M. et al. (2005) “The B7 Family OfImmune-Regulatory Ligands,” Genome Biol.
6:223.1-223.7）。タンパク質レベルでは、Ｂ７‐Ｈ３はヒト肝臓、肺、膀胱、精巣、前立腺、乳房、胎盤及びリンパ器官に見られる（Hofmeyer, K. etal. (2008) “The Contrasting Role Of B7-H3,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278）。
Ｂ７‐Ｈ３に結合する例示的な抗体としては、ヒト化「ＢＲＣＡ８４Ｄ」、「ＢＲＣＡ６９Ｄ」及び「ＰＲＣＡ１５７」が挙げられる（国際公開第２０１１／１０９４００号）。例示的な可変軽鎖及び重鎖は、以下の配列を有する（ＣＤＲは下線を付して示す）：

例示的なヒト化ＢＲＣＡ８４Ｄ‐５ＶＬ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）：
DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCKASQNVD TNVAWYQQKP GQAPKALIYS
ASYRYSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNNYPFTFGQ
GTKLEIK

例示的なヒト化ＢＲＣＡ８４Ｄ‐２ＶＨ重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４
０）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMHWVRQA PGKGLEWVAY
ISSDSSAIYY ADTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGRGR
ENIYYGSRLD YWGQGTTVTV SS

例示的なＢＲＣＡ６９Ｄ（「Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１」）軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４１）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIK

例示的なＢＲＣＡ６９Ｄ（「Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１」）重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４２）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS

例示的なＰＲＣＡ１５７軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４３）：
DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITCRASESIY SYLAWYQQKQ GKSPQLLVYN
TKTLPEGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYCQH HYGTPPWTFG
GGTNLEIK

例示的なＰＲＣＡ１５７重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４４）：
EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMSWVRQT PDKRLEWVAT
INSGGSNTYY PDSLKGRFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCARHD
GGAMDYWGQG TSVTVSS

（ｅ）Ａ３３腫瘍抗原
Ａ３３腫瘍抗原は、別の例示的な疾患関連抗原である。例示的なヒト化抗Ａ３３抗体（「ｇｐＡ３３ｍＡｂ１」）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号４５）：QIVLTQSPAI MSASPGERVT MTCSARSSIS FMYWYQQKPG SSPRLLIYDT
SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTISRMEAE DAATYYCQQW SSYPLTFGSG
TKLELKR
である。

上記例示的なヒト化抗Ａ３３抗体（ｇｐＡ３３ｍＡｂ１）の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号４６）：
QVQLQQSGPE LVKPGASVKI SCKASGYTFS GSWMNWVKQR PGQGLEWIGR
IYPGDGETNY NGKFKDKATL TADKSSTTAY MELSSLTSVD SAVYFCARIY
GNNVYFDVWG AGTTVTVSS
である。

（ｆ）５Ｔ４腫瘍抗原
５Ｔ４腫瘍抗原は、別の例示的な疾患関連抗原である。例示的なヒト化抗５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ｍＡｂ１」）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号４７）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIK
である。

上記例示的なヒト化５Ｔ４ｍＡｂ１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号４８）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR
IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN
PYYPMDYWGQ GTTVTVSS
である。

第２の例示的なヒト化５Ｔ４抗体（「５Ｔ４ｍＡｂ２」）の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号４９）：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IK
である。

上記第２の例示的なヒト化５Ｔ４ｍＡｂ２の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５０）：
QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWITWVKQR PGQGLEWIGD
IYPGSGRANY NEKFKSKATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCARYG
PLFTTVVDPN SYAMDYWGQG TSVTVSS
である。

（ｇ）ＲＯＲ１抗原
ＲＯＲ１腫瘍抗原は、別の例示的な疾患関連抗原である。例示的な抗ＲＯＲ１抗体としては、抗体２Ａ２（国際公開第２０１０／１２４１８８号）、Ｒ１１（国際公開第２０１２／０７５１５８号）及びＲ１２（国際公開第２０１２／０７５１５８号）が挙げられる。

２Ａ２抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５３）：
DIVMTQSQKI MSTTVGDRVS ITCKASQNVD AAVAWYQQKP GQSPKLLIYS
ASNRYTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNMQS EDLADYFCQQ YDIYPYTFGG
GTKLEIK
である。

２Ａ２抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５４）：
QVQLQQSGAE LVRPGASVTL SCKASGYTFS DYEMHWVIQT PVHGLEWIGA
IDPETGGTAY NQKFKGKAIL TADKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCTGYY
DYDSFTYWGQ GTLVTVSA
である。

Ｒ１１抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５５）：
ELVMTQTPSS TSGAVGGTVT INCQASQSID SNLAWFQQKP GQPPTLLIYR
ASNLASGVPS RFSGSRSGTE YTLTISGVQR EDAATYYCLG GVGNVSYRTS
FGGGTEVVVK
である。

Ｒ１１抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５６）：
QSVKESEGDL VTPAGNLTLT CTASGSDIND YPISWVRQAP GKGLEWIGFI
NSGGSTWYAS WVKGRFTISR TSTTVDLKMT SLTTDDTATY FCARGYSTYY
GDFNIWGPGT LVTISS
である。

Ｒ１２抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５７）：
ELVLTQSPSV SAALGSPAKI TCTLSSAHKT DTIDWYQQLQ GEAPRYLMQV
QSDGSYTKRP GVPDRFSGSS SGADRYLIIP SVQADDEADY YCGADYIGGY
VFGGGTQLTV TG
である。

Ｒ１２抗体の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５８）：
QEQLVESGGR LVTPGGSLTL SCKASGFDFS AYYMSWVRQA PGKGLEWIAT
IYPSSGKTYY ATWVNGRFTI SSDNAQNTVD LQMNSLTAAD RATYFCARDS
YADDGALFNI WGPGTLVTIS S
である。

（後で詳細に議論される）本発明の一態様は、より好ましいヒト化抗ＲＯＲ１抗体（「ＲＯＲ１ｍＡｂ１」）の提供である。このより好ましいＲＯＲ１ｍＡｂ１は、以下の配列（配列番号５１）：

QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL
EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN
YLFGGGTQLT VL
を有する軽鎖可変ドメインを有する。

このようなより好ましいヒト化ＲＯＲ１ｍＡｂ１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は（配列番号５２）：
QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWVRQA PGKGLEWVAT
IYPSSGKTYY ADSVKGRFTI SSDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDS
YADDAALFDI WGQGTTVTVS S
である。

ＩＶ．結合部位：部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃの選択
上述のように、本発明の好ましい三重特異性結合分子は少なくとも三重特異性であり、結合ドメインＩＩＩから最も離れて位置している「外部」ダイアボディタイプ結合ドメイン（部位Ａ）、結合ドメインＩＩＩに最も近接して位置している「内部」ダイアボディタイプ結合ドメイン（部位Ｂ）、及び結合ドメインＩＩＩ自体（部位Ｃ）を有する。本明細書において使用される場合、「Ｘ／Ｙ／Ｚ」のような三重特異性結合分子の記載は、Ｘ結合ドメインが部位Ａにあり、Ｙ結合ドメインが部位Ｂにあり、Ｚ結合ドメインが部位Ｃにあることを示している。例えば三重特異性結合分子の呼称「Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１」は、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１可変ドメインが上記三重特異性結合分子の部位Ａを占有しており、ＣＤ３ｍＡｂ２可変ドメインが上記三重特異性結合分子の部位Ｂを占有しており、ＣＤ８ｍＡｂ１可変ドメインが上記三重特異性結合分子の部位Ｃを占有していることを示している。

従って本発明により、このような部位のうちのいずれを、ある特定の所望のエピトープに結合するために使用できるかに関する選択が可能となる。特にＣＤ３、ＣＤ８及び疾患関連抗原に結合する三重特異性結合分子と共に、このような選択をガイドする因子は、トロゴサイトーシスの影響及び望ましさに関する考察を伴う。「トロゴサイトーシス（ｔｒｏｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）」は、ある細胞が、接触する細胞の細胞膜の一部分を取得できる過程である（Masuda, S. et al. (2013) "Possible Implication Of Fc y Receptor-Mediated Trogocytosis In Susceptibility ToSystemic Autoimmune Disease " Clin. Dev. Immunol. 2013: Article ID 345745,6 pages; Dhainaut, M. et al. (2014) "Regulatio
n of Immune Reactivity by Intercellular Transfer " Front Immunol. 5: 112;Ahmed,
K.A. et al. (2011) "Mechanisms Of Cellular Communication Through Intercellular Protein Transfer " J. Cell. Mol. Med. 15(7): 1458-1473; Ahmed, K.A. et al. (2008) "Intercellular TrogocytosisPlays An Important Role In Modulation Of Immune Responses " Cell. Mol.Immunol. 5(4):261-269; LeMaoult, J. et al. (2007)"Exchanges Of Membrane Patches (Trogocytosis)Split Theoretical And Actual Functions Of Immune Cells " Hum. Immunol.68(4) :240-243; Caumartin. J. et al. (2006)"Intercellular Exchanges Of Membrane Patches (Trogocytosis)Highlight The Next Level Of Immune Plasticity " Transpl.Immunol. 17(l):20-22）。

トロゴサイトーシスによるコグネイトＭＨＣクラスＩリガンドの取得は、細胞毒性Ｔリンパ球が、他の細胞毒性Ｔ細胞の殺滅（「兄弟殺し（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）」）を仲介することによってＣＤ８⁺細胞のクリアランスに寄与する「後天的なＴｒｅｇ（Ａｃｑｕ
ｉｒｅｄＴｒｅｇ）」細胞となるのを誘導する（D'Acquisto, F. et al. (2011) "CD3⁺
CD4 CD8 (Double Negative) T Cells: Saviours Or Villains Of The Immune Response?" Biochem. Pharmacol. 82:333-340; Joly, E. et al. (2003) "What Is Trogocytosis And What Is Its Purpose!" Nat. Immunol.4:815-; Hudrisier, D. et al. (2007) "Capture Of Target Cell Membrane Components Via Trogocytosis Is Triggered By A Selected Set Of Surface Molecules On T Or B Cells," J.Immunol. 178:3637-3647）。

その部位Ｃ位置としてＣＤ３結合ドメインを有する本発明の三重特異性結合分子は、抗ＣＤ３抗体の属性を有し、同様に、その部位Ｃ位置としてＣＤ８結合ドメインを有するこのような三重特異性結合分子は、抗ＣＤ８抗体の属性を有する。（Ｔ細胞のＣＤ８分子に結合した）抗ＣＤ８抗体のＦｃドメインに結合する、Ｆｃ受容体を有する好中球、単球又はマクロファージは、Ｔ細胞からトロゴサイトーシスによってそれ自体へと抗体及び結合したＣＤ８分子を転写でき、また上記抗体を迅速に吸収でき；ＴＣＲ及びＣＤ３等のバイスタンダー分子もこのプロセスにおいて転写できる（Masuda, S. et al., (2013) "Possible Implication of Fcg Receptor-Mediated Trogocytosis in Susceptibility to Systemic Autoimmune Disease," Clin. Develop. Immunol.2013:Article ID 345745, 6 pages）。

ＣＤ３及びＣＤ８の構造は、ＣＤ３が細胞膜付近に位置する一方で、ＣＤ８が上記細胞膜から更に延伸する点で異なる。従って、抗ＣＤ３抗体によるＣＤ３のＦｃ受容体トロゴサイトーシスが、抗ＣＤ８抗体によるＣＤ８のＦｃ受容体トロゴサイトーシスよりも高効率となることが予想される。

この現象は、ＣＤ３結合ドメインが部位Ｃに位置する、ＣＤ３、ＣＤ８及び疾患関連抗原に結合する本発明の三重特異性結合分子が、ＣＤ３結合ドメインが部位Ａ又は部位Ｂに位置する同様の三重特異性結合分子よりも低い細胞毒性を呈することを示す。（部位Ａ又はＢではなく）部位Ｃ位置にＣＤ３結合ドメインを配置することを選択することによって、細胞毒性の程度を変調できる。更に、「部位Ｃ」及び「部位Ａ（又はＢ）」ＣＤ３の混合物を含有する医薬組成物を調合することによって、好ましい程度の細胞毒性を得ることができる。

Ｖ．抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体
上述のように、本出願の一態様は、その軽鎖可変ドメインがアミノ酸配列（配列番号５１）：
QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL
EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN
YLFGGGTQLT VL
を有し、またその重鎖可変ドメインがアミノ酸配列（配列番号５２）：
QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMSWVRQA PGKGLEWVAT
IYPSSGKTYY ADSVKGRFTI SSDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDS
YADDAALFDI WGQGTTVTVS S
を有する、極めて好ましいヒト化抗ＲＯＲ１抗体（「ＲＯＲ１ｍＡｂ１」）の提案である。

このようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲ_L１、ＣＤＲ_L２、及びＣＤＲ_L３の配列は：
軽鎖可変ドメインＣＤＲ_L１（配列番号１１７）：TLSSGHKTDTID
軽鎖可変ドメインＣＤＲ_L２（配列番号１１８）：LEGSGSY
軽鎖可変ドメインＣＤＲ_L３（配列番号１１９）：GTDYPGNYL
である。

このようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲ_H１、ＣＤＲ_H２、及びＣＤＲ_H３の配列は：
重鎖可変ドメインＣＤＲ_H１（配列番号１２０）：GFTFSDYYMS
重鎖可変ドメインＣＤＲ_H２（配列番号１２１）：TIYPSSGKTYYADSVKG
重鎖可変ドメインＣＤＲ_H３（配列番号１２２）：DSYADDAALFDI
である。

上記ＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体は、細胞毒性の上昇を仲介し、従来技術の抗ＲＯＲ１抗体（例えば抗ＲＯＲ１抗体Ｒ１２）と比べて免疫原性が低い。

本発明は、このような配列だけでなく、上述のような軽鎖可変ドメイン（配列番号５１、ＣＤＲは下線を付して示す）のＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つ、又は上述のような重鎖可変ドメイン（配列番号５２；ＣＤＲは下線を付して示す）のＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つを有し、かつＲＯＲ１に免疫特異的に結合する、完全なＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体誘導体（そのキメラ又はヒト化誘導体を含む）をも包含する。より好ましくは、このような包含される抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体は、上述のような軽鎖可変ドメイン（配列番号５１、ＣＤＲは下線を付して示す）のＣＤＲのうちの１つ、２つ又は３つと、上述のような重鎖可変ドメイン（配列番号５２；ＣＤＲは下線を付して示す）のＣＤＲのうちの１つ、２つ又は３つとを有し、かつＲＯＲ１に免疫特異的に結合する。最も好ましくは、このような包含される抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体は、上述のような軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ全てと、上述のような重鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ全てとを有し、かつＲＯＲ１に免疫特異的に結合する。

本発明は更に、上述のような包含されるＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体の、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂Ｆｖ）、単鎖（ＳｃＦｖ）、「ＢｉＴＥｓ（登録商標）」、「ＤＡＲ
Ｔ（商標）」ダイアボディ分子、これらの突然変異体、自然に発生する変異体、及び融合タンパク質を含む断片及び誘導体を包含し、これらは全て、軽鎖可変ドメインＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つ、又は重鎖可変ドメインＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つ、あるいは軽鎖可変ドメインＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つ、及び重鎖可変ドメインＣＤＲのうちの１つ、２つ若しくは３つを備え、かつＲＯＲ１に免疫特異的に結合できる。

好ましい実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、変異型Ｆｃドメインを有してよい。Ｆｃドメインの修飾は通常、表現型の変化、例えば血清半減期の変化、安定性の変化、細胞酵素に対する感受性の変化又はエフェクタ機能の変化につながる。本発明の抗体をエフェクタ機能に関して修飾して、例えば癌の
治療における抗体の有効性を増強することが望ましい場合がある。例えば、作用機序が、標的抗原を担持する細胞の殺滅ではなく遮断又は拮抗作用を伴う抗体の場合といった、特定の場合においては、エフェクタ機能の低減又は削減が望ましい。エフェクタ機能の上昇は、ＦｃγＲが低いレベルで発現する腫瘍及び外来細胞、例えばＦｃγＲＩＩＢのレベルが低い腫瘍特異性Ｂ細胞（例えば非ホジキンリンパ腫、ＣＬＬ及びバーキットリンパ腫）といった、望ましくない細胞を対象とする場合に一般に望ましい。上記実施形態では、エフェクタ機能活性が与えられた又は増強された本発明の分子は、エフェクタ機能活性の効率の増強が望ましい疾患、障害又は感染の治療及び／又は予防のために有用である。

特定の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、Ｆｃドメインのアミノ酸に対する１つ又は複数の修飾を含み、これはこのような分子のＦｃドメインの、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を低下させる。他の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、上述のような分子のＦｃドメインの、１つ又は複数のＦｃγＲ受容体に対する親和性及び結合活性を上昇させる、Ｆｃドメインのアミノ酸に対する１つ又は複数の修飾を含んでよい。他の実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃドメインを含み、ここで上記変異型は、Ｆｃドメインを含まない、又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性の上昇、及び／又はＦｃγＲＩＩＡへの結合の増大を与える、又は仲介する。代替実施形態では、上記分子は変異型Ｆｃドメインを含み、ここで上記変異型は、ドメインを含まない、又は野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して、ＡＤＣＣ活性（若しくは他のエフェクタ機能）の低下、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合の増大を与える、又は仲介する。

いくつかの実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含む、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体を包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインを含む同等の分子と比べて、いずれのＦｃγＲに対する検出可能な結合を示さない。他の実施形態では、本発明は、変異型Ｆｃドメインを含む、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体を包含し、上記変異型Ｆｃドメインは、単一のＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、又はＦｃγＲＩＩＩＡのうちの１つにしか結合しない。

上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、活性化及び／又は阻害性Ｆｃγ受容体に対する親和性が変化し得る。一実施形態では、上記抗体又は分子は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が上昇し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下した、変異型Ｆｃドメインを含む。別の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が上昇した、変異型Ｆｃドメインを含む。更に別の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が低下し、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下した、変異型Ｆｃドメインを含む。また更に別の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、野生型Ｆｃドメインを有する同等の分子と比べて、ＦｃγＲＩＩＢに対する親和性が変化せず、かつＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が低下（又は上昇）した、変異型Ｆｃドメインを含む。

特定の実施形態では、本発明は、免疫グロブリンが増強されたエフェクタ機能、例えばＡＤＣＣを有するように、ＦｃγＲＩＩＩＡ及び／又はＦｃγＲＩＩＡに対する親和性が変化した変異型Ｆｃドメインを含む、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断
片若しくは誘導体を包含する。エフェクタ細胞機能の非限定的な例としては、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、食作用、オプソニン作用、オプソニン食作用、細胞結合、ロゼット形成、Ｃ１ｑ結合、及びＣＤＣが挙げられる。

ある好ましい実施形態では、親和性又はエフェクタ機能の変化は、野生型Ｆｃドメインを含む同等の分子に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍である。本発明の他の実施形態では、変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインを含む分子に対して少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、又は２５０％高い親和性で、１つ又は複数のＦｃＲに特異的に結合する。このような測定は、インビボ又はインビトロアッセイとすることができ、好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡ又は表面プラズモン共鳴アッセイ等のインビトロアッセイである。

様々な実施形態において、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、変異型Ｆｃドメインを含み、上記変異型は、ＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性を刺激するか、又はＦｃγＲ受容体の少なくとも１つの活性に拮抗する。好ましい実施形態では、上記分子は、ＦｃγＲＩＩＢの１つ又は複数の活性、例えば、Ｂ細胞受容体‐仲介型シグナリング、Ｂ細胞の活性化、Ｂ細胞増殖、抗体産生、Ｂ細胞の細胞内カルシウム流入、細胞周期進行、ＦｃεＲＩシグナリングのＦｃγＲＩＩＢ‐仲介型阻害、ＦｃγＲＩＩＢのリン酸化、ＳＨＩＰ動員、ＳＨＩＰリン酸化及びＳｈｃとの連結、又はＦｃγＲＩＩＢシグナル伝達経路中の１つ若しくは複数の下流分子の活性（例えばＭＡＰキナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８若しくはＡｋｔ）を刺激する（又はこれに拮抗する）変異体を含む。別の実施形態では、上記分子は、ＦｃεＲＩの１つ又は複数の活性、例えば肥満細胞活性化、カルシウム可動化、脱顆粒、サイトカイン産生又はセロトニン放出を刺激する（又はこれに拮抗する）変異体を含む。

特定の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は、２つ以上のＩｇＧアイソタイプ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）からのＦｃドメイン含有ドメインを含む。上記様々なＩｇＧアイソタイプは、例えばFlesch, B.K.
and Neppert, J. (1999) "Functions Of The Fc Receptors For Immunoglobulin G " J.
Clin. Lab. Anal. 14: 141-156; Chappel, M.S. et al.(1993) "Identification Of A Secondary Fc Gamma RI Binding Site Within A Genetically Engineered Human IgG Antibody J. Biol. Chem. 33:25124-25131; Chappel, M.S. et al. (1991) "Identification
Of The Fc Gamma Receptor Class I Binding Site In Human IgG Through The Use Of Recombinant IgGl/IgG2 Hybrid And Point-MutatedAntibodies " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:9036-9040; Briiggemann, M. et al. (1987) "Comparison Of The Effector Functions Of Human Immunoglobulins Using A Matched Set Of ChimericAntibodies
" J. Exp. Med 166: 1351-1361に記載されているような、そのヒンジ及び／又はドメイ
ンのアミノ酸配列の違いにより、血清半減期、補体結合、ＦｃγＲ結合親和性及びエフェクタ機能活性（例えばＡＤＣＣ、ＣＤＣ等）を含む様々な物理的及び機能的特性を呈する。このタイプの変異型Ｆｃドメインを、単独で、又はアミノ酸修飾と組み合わせて使用して、Ｆｃ仲介型エフェクタ機能及び／又は結合活性に影響を及ぼすことができる。組み合わせにおいて、アミノ酸修飾及びＩｇＧヒンジ／Ｆｃドメインは、同様の機能性（例えばＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇）を示すことができ、また相加的に、又はより好ましくは相乗的に作用して、野生型Ｆｃドメインを含む本発明の分子と比べて、本発明の分子のエフェクタ機能性を修飾できる。他の実施形態では、アミノ酸修飾及びＩｇＧＦｃドメインは反対の機能性（例えばそれぞれＦｃγＲＩＩＡに対する親和性の上昇及び低下）を示すことができ、また、同一のアイソタイプの、Ｆｃドメインを含まない又は野生型
Ｆｃドメインを含む本発明の分子と比べて、本発明の分子の特異的機能性を選択的に調節又は低下させるよう作用できる。

好ましい具体的実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片若しくは誘導体は、変異型Ｆｃドメインを含み、上記変異型Ｆｃドメインは、野生型Ｆｃドメインに対する少なくとも１つのアミノ酸修飾を含み、これにより、上記変異体Ｆｃドメインが、Sondermann, P. et al. (2000) "The 3.2-A Crystal Structure Of The Human IgGI Fc Fragment-Fc GammaRIII Complex, " dAmz 406:267-273に開示されているもののようなＦｃ‐ＦｃＲ相互作用の結晶学的及び構造的分析に基づいて、ＦｃγＲと直接接触する位置において置換を有しない場合に上記分子のＦｃＲに対する親和性が変化する。ＦｃγＲと直接接触するＦｃドメイン内の位置の例は、アミノ酸残基２３４‐２３９（ヒンジドメイン）、アミノ酸残基２６５‐２６９（Ｂ／Ｃループ）、アミノ酸残基２９７‐２９９（Ｃ’／Ｅループ）及びアミノ酸残基３２７‐３３２（Ｆ／Ｇループ）である。いくつかの実施形態では、本発明の分子は、構造的及び結晶学的分析に基づいてＦｃγＲと直接接触しない、例えばＦｃ‐ＦｃγＲ結合部位内にない、少なくとも１つの残基の修飾を含む、変異型Ｆｃドメインを含む。

変異型Ｆｃドメインは当該技術分野において公知であり、例えばＮＫ依存性又はマクロファージ依存性アッセイにおいて機能的にアッセイされるような、上述のようなＲＯＲ１
ｍＡｂ１抗体、又はＦｃドメイン（若しくはその一部）を含むその断片が呈するエフェクタ機能を付与又は改変するために、いずれの公知のＦｃ変異体を本発明において使用してよい。例えば、変化したエフェクタ機能として識別されるＦｃドメイン変異体は、国際公開第０４／０６３３５１号；国際公開第０６／０８８４９４号；国際公開第０７／０２４２４９号；国際公開第０６／１１３６６５号；国際公開第０７／０２１８４１号；国際公開第０７／１０６７０７号；国際公開第２００８／１４０６０３号に開示されており、これらの文献に開示されているいずれの好適な変異体を、本発明の分子において使用してよい。

特定の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は、１つ又は複数の部位において１つ又は複数のアミノ酸修飾を有する変異型Ｆｃドメインを含み、上記１つ又は複数の修飾は、変異型Ｆｃドメインの、阻害型ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＢ等）に対する親和性に対する活性化ＦｃγＲ（ＦｃγＲＩＩＡ又はＦｃγＲＩＩＩＡ等）に対する親和性の比率を、（野生型Ｆｃドメインに対して）変化させる：

あるＦｃ変異体の親和性の比率が１を超える場合、本発明の方法は、例えば癌又は感染症といった、ＦｃγＲが仲介するエフェクタ細胞機能（例えばＡＤＣＣ）の効率の増強が望まれる疾患、障害、若しくは感染の治療的若しくは予防的処置、又はその症状の寛解を提供するにあたって特定の用途を有する。あるＦｃ変異体の親和性の比率が１未満である場合、本発明の方法は、例えば自己免疫障害又は炎症性障害といった、ＦｃγＲが仲介するエフェクタ細胞機能の効率の低下が望まれる疾患、若しくは障害の治療的若しくは予防的処置、又はその症状の寛解を提供するにあたって特定の用途を有する。表３は、例示的な単一、二重、三重、四重及び五重突然変異を、その親和性の比率が１を超えるか１未満であるかによって列挙しており、これらの突然変異に関する更なる情報は、国際公開第０４／０６３３５１号；国際公開第０６／０８８４９４号；国際公開第０７／０２４２４９
号；国際公開第０６／１１３６６５号；国際公開第０７／０２１８４１号；国際公開第０７／１０６７０７号；国際公開第２００８／１４０６０３号に見ることができる。

ある具体的な実施形態では、変異型Ｆｃドメインにおいて、２３５、２４０、２４１、２４３、２４４、２４７、２６２、２６３、２６９、２９８、３２８、又は３３０位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）、及び好ましくは以下の残基のうちの１つ又は複数：Ａ２４０、Ｉ２４０、Ｌ２４１、Ｌ２４３、Ｈ２４４、Ｎ２９８、Ｉ３２８又はＶ３３０。異なる具体的な実施形態では、変異型Ｆｃドメインにおいて、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８３、２８５、２８６、２８９、２９２、２９３、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）、好ましくは以下の残基のうちの１つ又は複数：Ｈ２８０、Ｑ２８０、Ｙ２８０、Ｇ２９０、Ｓ２９０、Ｔ２９０、Ｙ２９０、Ｎ２９４、Ｋ２９５、Ｐ２９６、Ｄ２９８、Ｎ２９８、Ｐ２９８、Ｖ２９８、Ｉ３００又はＬ３００。

ある好ましい実施形態では、変化した親和性でＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、２５５、２５６、２５８、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３２０、３２２、３２６、３２９、３３０、３３２、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３５９、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）。好ましくは、上記変異型Ｆｃドメインは、以下の残基のうちのいずれか１つを有する：Ａ２５６、Ｎ２６８、Ｑ２７２、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ａ２９８、Ｍ３０１、Ａ３１２、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｎ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ｔ３３９、Ａ３３３、Ａ３３４、Ｅ３３４、Ｈ３３４、Ｌ３３４、Ｍ３３４、Ｑ３３４、Ｖ３３４、Ｋ３３５、Ｑ３３５、Ａ３５９、Ａ３６０又はＡ４３０。

異なる実施形態では、低下した親和性で（そのＦｃドメインを介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）。

異なる実施形態では、増強された親和性で（そのＦｃドメインを介して）ＦｃγＲに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８、又は４３０位のうちのいずれかにおけるいずれかのアミノ酸修飾（例えば置換）。異なる実施形態では、増強された親和性でＦｃγＲＩＩＡに結合する変異型Ｆｃドメインにおいて、以下の残基のうちのいずれか１つ：Ａ２５５、Ａ２５６、Ａ２５８、Ａ２６７、Ａ２６８、Ｎ２６８、Ａ２７２、Ｑ２７２、Ａ２７６、Ａ２８０、Ａ２８３、Ａ２８５、Ａ２８６、Ｄ２８６、Ｑ２８６、Ｓ２８６、Ａ２９０、Ｓ２９０、Ｍ３０１、Ｅ３２０、Ｍ３２０、Ｑ３２０、Ｒ３２０、Ｅ３２２、Ａ３２６、Ｄ３２６、Ｅ３２６、Ｓ３２６、Ｋ３３０、Ａ３３１、Ｑ３３５、Ａ３３７又はＡ４３０。

好ましい変異体は、２２８、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２７１、２７３、２７５、２８１、２８４、２９１、２９６、２９７、２９８、２９９、３０２、３０４、３０５、３１３、３２３、３２５、３２６、３２８、３３０又は３３２位のうちのいずれにおける１つ又は複数の修飾を含む。

特に好ましい変異体は、群Ａ〜ＡＩから選択された１つ又は複数の修飾を含む：

更に特に好ましい変異体は、群１〜１０５から選択された１つ又は複数の修飾を含む:

一実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は、Ｆｃドメインにおいて少なくとも１つの修飾を有する変異型Ｆｃドメインを含む。特定の実施形態では、上記変異型Ｆｃドメインは、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される少なくとも１つの置換を含み、ここで上記番号付与は、非特許文献１８におけるＥＵインデックスの番号付与である。ある具体的実施形態では、変異型Ｆｃドメインは以下を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌからなる群から選択される、少なくとも１つの置換；
（Ｂ）（１）Ｆ２４３Ｌ及びＰ３９６Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ及びＲ２９２Ｐ；並びに
（３）Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
からなる群から選択される、少なくとも２つの置換；
（Ｃ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＹ３００Ｌ；
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＶ３０５Ｉ；
（３）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（４）Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも３つの置換；
（Ｄ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；
からなる群から選択される、少なくとも４つの置換；又は
（Ｅ）（１）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ及びＰ３９６Ｌ；並びに
（２）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ及びＰ３９６Ｌ
からなる群から選択される、少なくとも５つの置換。

別の具体的実施形態では、変異型Ｆｃドメインは、以下の置換を含む：
（Ａ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、及びＹ３００Ｌ；
（Ｂ）Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、及びＰ３９６Ｌ；又は
（Ｃ）Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、及びＰ３９６Ｌ。

他の実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は：Jefferis, R. et al. (2002) Interaction Sites On Human IgG-Fc For FcgammaR: Current Models," Immunol. Lett. 82:57-65; Presta, L.G. et al. (2002) "Engineering Therapeutic
Antibodies For Improved Function " Biochem. Soc. Trans. 30:487-90; Idusogie, E.E. et al. (2001)"Engineered Antibodies With Increased Activity To Recruit Complement," J. Immunol. 166:2571-75; Shields, R.L. et al. (2001)"High Resolution Mapping Of The Binding Site On Human IgGl For Fc Gamma RI, Fc Gamma RII, Fc Gamma RIII, And FcRn And Design Of IgGl Variants With Improved Binding To The Fc gamma
R " J. Biol. Chem. 276:6591-6604; Idusogie, E.E.et al. (2000) "Mapping Of The Clq Binding Site On Rituxan, A Chimeric Antibody With A Human IgG Fc," J. Immunol. 164:4178-84;Reddy, M.P. et al. (2000) "Elimination Of Fc Receptor-Dependent Effector Functions Of A Modified IgG4 Monoclonal Antibody To Human CD4 " J.Immunol. 164: 1925-1933; Xu, D. et al. (2000) "In Vitro Characterizationof Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies " Cell.Immunol. 200: 16-26; Armour, K.L. et al. (1999)"Recombinant human IgG Molecules Lacking Fcgamma Receptor I Binding And Monocyte Triggering Activities " Eur. J. Immunol.29:2613-24; Jefferis, R. et al. (1996)"Modulation Of Fc(Gamma)R And Human Complement Activation By IgG3-Core Oligosaccharide Interactions " Immunol. Lett. 54: 101-04; Lund,
J. et al. (1996) "Multiple Interactions Of IgG With Its Core Oligosaccharide Can Modulate Recognition By Complement And Human Fc Gamma ReceptorI And Influence
The Synthesis Of Its Oligosaccharide Chains " J. Immunol. 157:4963-4969;Hutchins et al. (1995) "Improved Biodistribution, Tumor Targeting, AndReduced Immunogenicity In Mice With A Gamma 4 Variant Of Campath-IH,"Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92: 11980-84; Jefferis,R. et al. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors:The Role Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: 111-17; Lund, J. et al.(1995) "Oligosaccharide-Protein Interactions In IgG Can Modulate Recognition By Fc Gamma Receptors " FASEB J. 9: 115-19; Alegre, M . et al.(1994) "A Non-Activating "Humanized" Anti-CD3 Monoclonal Antibody Retains Immunosuppressive Properties In Vivo," Transplantation 57: 1537-1543; Lund et al. (1992) "Multiple Binding Sites On The CH2 Domain Of IgG For Mouse Fc Gamma RII," Mol. Immunol. 29:53-59; Lund et al.(1991) "Human Fc Gamma RI And Fc Gamma RII Interact With Distinct But Overlapping Sites On Human IgG," J. Immunol. 147:2657-2662; Duncan, A.R.et al. (1988) "Localization Of The Binding Site For The Human High-Affinity Fc Receptor On IgG," Nature 332:563-564；米国特許第５，６２４，８２１号；
米国特許第５，８８５，５７３号；米国特許第６，１９４，５５１号；米国特許第７，２７６，５８６号；及び米国特許第７，３１７，０９１号；並びに国際公開第００／４２０７２号及び国際公開第９９／５８５７２号に開示されているもの等の、公知のいずれのＦｃ変異体を有してよい。

いくつかの実施形態では、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は更に、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよく、これにより、１つ又は複数の炭水化物部分は上記分子に共有結合によって付着する。好ましくは、Ｆｃドメインに１つ若しくは複数のグリコシル化部位及び／又は１つ若しくは複数の修飾を有する上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は、修飾されていないＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又は断片と比べて、増強された抗体仲介性エフェクタ機能、例えば増強されたＡＤＣＣ活性を与える、又は有する。いくつかの実施形態では、本発明は更に、Ｆｃドメインの炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用することが分かっている、２４１、２４３、２４４、２４５、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、及び３０１位のアミノ酸を含むがこれらに限定されないアミノ酸の１つ又は複数の修飾を含む、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片を含む。Ｆｃドメインの炭水化物部分と直接的又は間接的に相互作用するアミノ酸は当該技術分野において公知であり、例えばJefferis, R. etal. (1995) "Recognition Sites On Human IgG For Fc Gamma Receptors: TheRole Of Glycosylation," Immunol. Lett. 44: 111-17を参照されたい。

別の実施形態では、本発明は、好ましくは当該分子の機能性、例えば標的分子又はＦｃγＲへの結合活性を変化させることなく、１つ又は複数のグリコシル化部位を、当該分子の１つ又は複数の部位に導入することによって修飾された、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片を包含する。グリコシル化部位は、本発明の分子の可変及び／又は定常領域に導入してよい。本明細書において使用される場合、「グリコシル化部位（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｓｉｔｅ）」は、オリゴ糖（即ち一体に連結した２つ以上の単糖を含有する炭水化物）が特異的に共有結合によって付着する、抗体中のいずれの具体的なアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は典型的には、Ｎ結合又はＯ結合を介して抗体のバックボーンに連結する。Ｎ結合グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を表す。Ｏ結合グリコシル化は、例えばセリン、トレオニンといったヒドロキシアミノ酸へのオリゴ糖部分の付着を表す。上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片は、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化部位を含む、１つ又は複数のグリコシル化部位を備えてよい。当該技術分野において公知のＮ結合又はＯ結合グリコシル化のためのいずれのグリコシル化部位を、本発明に従って使用してよい。例示的なＮ結合グリコシル化部位は、アミノ酸配列：Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸはいずれのアミノ酸であってよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはトレオニン又はセリンを示す。このような１つ又は複数の部位は、本発明が関与する技術分野において公知の方法を用いて、本発明の分子に導入してよい（例えばIN VITRO MUTAGENESIS, RECOMBINANT DNA: A SHORT COURSE, J. D. Watson,et al. W.H. Freeman and Company, New York, 1983, chapter 8, pp. 106-116（その全体は参照によって本出願に援用される）を参照のこと）。グリコシル化部位を上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片に導入するための例示的な方法は：分子のアミノ酸配列を修飾するか若しくは突然変異させて、所望のＡｓｎ‐Ｘ‐Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を得るステップ、又はこのような配列を有する核酸分子をエンコードするＲＯＲ１
ｍＡｂ１抗体を発現させるステップを含んでよい。

いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を追加又は欠失することによって、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片の炭水化物含量を改変する方法を包含する。抗体（及び抗体ドメイン、例えばＦｃドメインを含む分子）の炭水化物含量を改変する方法は、当該技術分野において公知であり、本発明に包含される。例えば米国
特許第６，２１８，１４９号；欧州特許第０３５９０９６Ｂ１号；米国特許出願第２００２／００２８４８６号；国際公開第０３／０３５８３５号；米国特許出願第２００３／０１１５６１４号；米国特許第６，２１８，１４９号；米国特許第６，４７２，５１１号（これらの全体は参照によって本出願に援用される）を参照されたい。他の実施形態では、本発明は、当該分子の１つ又は複数の内因性炭水化物部分を欠失することによって、上述のようなＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体又はその断片の炭水化物含量を改変する方法を包含する。ある具体的実施形態では、本発明は、２９７位に隣接する位置を修飾することによって、抗体のＦｃドメインのグリコシル化部位をシフトするステップを包含する。ある具体的実施形態では、本発明は２９６位を修飾することによって、２９７位ではなく２９６位をグリコシル化するステップを包含する。

エフェクタ機能は、国際公開第０４／０６３３５１号；国際公開第０６／０８８４９４号；国際公開第０７／０２４２４９号；国際公開第０６／１１３６６５号；国際公開第０７／０２１８４１号；国際公開第０７／１０６７０７号；国際公開第２００８／１４０６０３号に記載されているもの等の技術によって、又は他の手段によって改変できる。例えば、Ｆｃドメインに１つ又は複数のシステイン残基を導入することによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合を可能とし、吸収能力が改善され得る、並びに／又は補体仲介型細胞殺滅及びＡＤＣＣが増大し得るホモ二量体抗体を生成できる。Caron, P.C. et
al. (1992) "Engineered Humanized Dimeric Forms Of IgG Are More Effective Antibodies J. Exp. Med. 176: 1191-1195; Shopes, B.(1992) "A Genetically Engineered Human IgG Mutant With Enhanced CytolyticActivity," J. Immunol. 148(9):2918-2922を参照されたい。抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体抗体はまた、Wolff, E.A. et al. (1993) "Monoclonal Antibody Homodimers: Enhanced Antitumor Activity In Nude Mice," Cancer Research 53:2560-2565に記載されているようなヘテロ二機能性クロスリンカーを用いて調製できる。あるいは、二重Ｆｃドメインを有し、それによって補体溶解及びＡＤＣＣ能力が増強され得る抗体を加工できる（Stevenson, G.T. et al. (1989) "A Chimeric Antibody With Dual FcDomains (bisFabFc) Prepared By Manipulations At The IgG Hinge " Anti-Cancer Drug Design 3:219-230）。

ＣＤＲ残基の単一のアミノ酸改変が、機能的結合の損失につながり得るという事実（Rudikoff, S. etc. (1982) "Single Amino Acid Substitution Altering Antigen-Binding Specificity," Proc. Natl.Acad. Sci. (USA) 79(6): 1979-1983）は、代替的な機能性
ＣＤＲ配列を組織的に識別するための手段を提供する。上述のような変異型ＣＤＲを得るための１つの好ましい方法では、上記ＣＤＲをエンコードするポリヌクレオチドを（例えばランダム突然変異誘発によって、又は部位指向性の方法（例えば突然変異した座をエンコードするプライマによるポリメラーゼ鎖仲介型増幅）によって）突然変異誘発して、置換されたアミノ酸残基を有するＣＤＲを産生する。オリジナルの（機能性）ＣＤＲ配列中の関連する残基の同一性を、置換された（非機能性）変異型ＣＤＲ配列の同一性と比較することによって、当該置換に関するＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを識別できる。ＢＬＯＳＵＭシステムは、信頼できる整列のために配列のデータベースを分析することによって生成されたアミノ酸置換のマトリクスを提供する（Eddy, S.R. (2004) "Where Did
The BLOSUM62 Alignment Score Matrix Come From?," Nature Biotech. 22(8):1035-1036; Henikoff, J.G. (1992) "Amino acidsubstitution matrices from protein blocks," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)89: 10915-10919; Karlin, S. et al. (1990)"Methods For Assessing The Statistical Significance Of Molecular Sequence Features By Using General Scoring Schemes," Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)87:2264-2268; Altschul, S.F. (1991) "Amino AcidSubstitution Matrices From An Information Theoretic Perspective," J. Mol.Biol. 219, 555-565）。現在、最も進化したＢＬＯＳＵＭデータベースは、ＢＬＯＳＵＭ６２データベース（ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ）である。表４は、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアを示す（スコアが高いほど置換が保存的であり、
従って置換が機能に影響を与えにくい）。例えば、結果として得られるＣＤＲを含む抗原結合性断片がＲＯＲ１に結合できない場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは、十分に保存的でないと考えられ、より高い置換スコアを有する新たな置換候補が選択及び産生される。従って例えば、オリジナルの残基がグルタミン酸（Ｅ）であり、非機能性置換残基がヒスチジン（Ｈ）であった場合、ＢＬＯＳＵＭ６２．ｉｉｊ置換スコアは０となり、（アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はリシン等への）より保存的な変化が好ましい。

従って本発明は、改善されたＣＤＲの識別のためのランダム突然変異誘発の使用を考える。あるいはファージディスプレイ技術を用いて、ＣＤＲ親和性を上昇（又は低下）させることができる。この技術は、親和性成熟とも呼ばれ、これは突然変異誘発又は「ＣＤＲウォーキング（ＣＤＲｗａｌｋｉｎｇ）」を用い、また再選択は、標的抗原又はその抗原断片を用いて、初期又は親抗原と比較した場合により高い（又はより低い）親和性で上記抗原に結合するＣＤＲを有する抗体を識別する（例えばGlaser et al. (1992) J. Immunology 149:3903を参照）。単一のヌクレオチドではなくコドン全体に突然変異誘発を行う
ことにより、アミノ酸突然変異の半ランダム化レパートリーが得られる。変異体クローンのプールからなるライブラリを構成でき、上記変異体クローンはそれぞれ、単一のＣＤＲ中の単一のアミノ酸変化によって異なるものとなり、また各ＣＤＲ残基に関して可能なアミノ酸置換それぞれを表す変異体を含有する。抗原に対する結合親和性が上昇（又は低下）した突然変異体は、固定された突然変異体を標識化抗原と接触させることによってスクリーニングできる。当該技術分野において公知のいずれのスクリーニング方法（例えばＥＬＩＳＡ）を使用して、抗原に対する結合親和性が上昇（又は低下）した突然変異型抗体を識別できる（Wu et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 95:6037; Yelton et
al., 1995, J. Immunology 155:1994を参照）。軽鎖をランダム化するＣＤＲウォーキングも使用してよい（Schier et al.,1996, J. Mol. Bio. 263:551を参照）。

このような親和性成熟を達成するための方法は例えば：Krause, J.C. et al. (2011)
“An Insertion Mutation That Distorts Antibody Binding Site Architecture Enhances Function Of A Human Antibody,” MBio. 2(1) pii:e00345-10. doi: 10.1128/mBio.00345-10; Kuan, C.T. et al. (2010) “Affinity-Matured Anti-Glycoprotein NMB Recombinant Immunotoxins Targeting Malignant Gliomas And Melanomas,” Int. J. Cancer 10.1002/ijc.25645; Hackel, B.J. et al. (2010) “Stability And CDR Composition Biases Enrich Binder Functionality Landscapes,” J. Mol. Biol. 401(1):84-96; Montgomery, D.L. et al. (2009) “Affinity Maturation And Characterization Of A Human MonoclonalAntibody Against HIV-1 gp41,” MAbs1(5):462-474; Gustchina, E. et al. (2009) “Affinity Maturation By Targeted Diversification Of The CDR-H2 Loop Of
A Monoclonal Fab Derived From A Synthetic Naive Human Antibody Library And Directed Against The Internal Trimeric Coiled-Coil Of Gp41 Yields A Set Of Fabs With
Improved HIV-1 Neutralization Potency And Breadth,”Virology 393(1):112-119; Finlay, W.J. et al. (2009) “Affinity Maturation Of A Humanized Rat Antibody For Anti-RAGE Therapy: Comprehensive Mutagenesis Reveals A High Level Of Mutational Plasticity Both Inside And Outside The Complementarity-Determining Regions,” J.
Mol. Biol. 388(3):541-558; Bostrom, J. et al. (2009) “Improving Antibody Binding Affinity And Specificity For Therapeutic Development,” Methods Mol. Biol. 525:353-376; Steidl,S. et al. (2008) “In Vitro Affinity Maturation Of Human GM-CSF Antibodies By Targeted CDR-Diversification,” Mol.Immunol. 46(1):135-144; and Barderas, R. et al.(2008) “Affinity maturation of antibodies assisted byin silico modeling,” Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)105(26):9029-9034に記載されてい
る。例えば、マルチウェルプレートを、（例えば２時間にわたって室温において炭酸塩緩衝液中で１００ｎｇ／ウェルの）選択されたＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体でコーティングして、その後、１／１０に希釈して添加され、１６時間にわたって室温でインキュベートされた、又はＰＢＳ‐Ｔ‐ＢＳＡ中で５０ｎｇ／ｍｌの濃度まで希釈された（各ウェルに０．０５ｍｌ添加し、室温で少なくとも２時間にわたってインキュベートされた）、可溶性ＲＯＲ１を用いてインキュベートしてよい。続いてプレートを洗浄し、次にＰＢＳ‐Ｔ‐ＢＳＡ中で０．５μｇ／ｍｌから開始される組み換え抗体の希釈を加え、室温で１時間にわたってインキュベートする。捕捉した抗原への組み換え抗体の結合を、例えば抗ヒトＩｇＧ‐ＨＲＰコンジュゲート及びＴＭＢ基質を用いて測定する。希釈した硫酸を用いて色の発現を停止させた後、４５０ｎＭでプレートを読み取り、より高い親和性の抗体を識別する（例えば米国特許第７，３５１，８０３号を参照）。

ＶＩ．医薬組成物
一実施形態では、本発明は、疾患関連抗原の存在を特徴とする癌又は疾患の治療のための医薬組成物を含む。このような組成物は、医薬組成物の製造に使用できるバルク薬剤組成物（例えば不純又は非滅菌組成物）、及び単位剤形の調製に使用できる医薬組成物（即ち被験体又は患者への投与に好適な組成物）を含む。これらの組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の修飾されたダイアボディ、又はこのような作用剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防的又は治療的有効量の本発明の分子のうちの1つ又は複数と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。本
発明はまた、このような修飾されたダイアボディ、及び特定の疾患抗原に対して特異的な第２の治療用抗体、並びに薬学的に許容可能なキャリアを含む、医薬組成物を包含する。

本明細書において使用される場合、用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益な又は望ましい結果（これは有益な又は望ましい臨床
的結果を含み、また好ましくは有益な又は望ましい臨床的結果である）を得るためのアプローチを指す。このような有益な又は望ましい臨床的結果としては、感染した細胞若しくは他の疾患に罹患した細胞の増殖の低減（若しくは破壊）、疾患に由来する症状の低減、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇、疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減、疾患の進行の遅延、及び／又は個体の生存期間の延長のうちの１つ又は複数が挙げられるが、これらに限定されない。

ある具体的実施形態では、用語「薬学的に許容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用に関して、連邦規制当局若しくは州政府によって承認されている、又は米国薬局方若しくは他の一般に認められた薬局方に記載されていることを意味する（例えばREMINGTON: THE SCIENCE AND
PRACTICE OF PHARMACY (2012) Allen, Loyd V., Jr. (Ed.)22^nd Edition, Pharmaceutical Press, London UKを参照）。用語「キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」は、希釈剤、アジュバント（例えばフロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤、又は治療薬の投与に用いられるビヒクルを指す。これらの薬学的キャリアは、水及び石油、動物油、植物油若しくは合成油を含む油（例えば落花生油、大豆油、鉱物油、胡麻油等）等の、無菌液体とすることができる。医薬組成物を静脈投与する場合、水が好ましいキャリアである。特に注射用溶液のための液体キャリアとして、食塩水、並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も採用できる。好適な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。必要な場合は、上記組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル、粉体、徐放性製剤等の形態を取ることができる。

一般に、本発明の組成物の成分は、例えば活性作用剤の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ中の凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、別個に、又は単位剤形にまとめて混合された状態で供給される。組成物を点滴によって投与する場合、組成物は、滅菌された薬学的グレードの水又は食塩水を内包する点滴ボトルを用いて吐出できる。組成物を注射によって投与する場合、投与前に成分を混合できるように、注射用無菌水又は食塩水のアンプルを提供できる。

本発明の組成物は、中性又は塩形態として処方できる。薬学的に許容可能な塩としては：塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等由来の陰イオンを有して形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２‐メチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等由来の陽イオンを有して形成されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明はまた、単独で又は上述の薬学的に許容可能なキャリアと併せて、本発明の修飾されたダイアボディを含有する１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。更に、疾患の治療に有用な１つ又は複数の他の予防剤又は治療剤も、上記医薬パック又はキットに含めることができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の成分のうちの１つ又は複数で充填された１つ又は複数のコンテナを備える、医薬パック又はキットも提供する。任意に、このような１つ又は複数のコンテナは、医薬製品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知と関連するものとすることができ、上記通知は、ヒトへの投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映したものである。

本発明は、上述の方法において使用できるキットを提供する。一実施形態では、キット
は、本発明の分子のうちの１つ又は複数を含むことができる。別の実施形態では、キットは更に、癌又は疾患関連抗原の存在を特徴とする疾患の治療に有用な１つ若しくは複数の他の予防剤又は治療剤を、１つ又は複数のコンテナ内に含む。別の実施形態では、キットは更に、１つ又は複数の疾患関連抗原に結合する１つ又は複数の抗体又はダイアボディを含む。特定の実施形態では、他の予防剤又は治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、予防剤又は治療剤は生物学的治療剤又はホルモン療法剤である。

ＶＩＩ．本発明の三重特異性結合分子を産生する方法
当該技術分野において公知であるように、最も好ましくは、本発明の三重特異性結合分子は、上述のようなポリペプチドをエンコードする核酸分子の組み換え発現によって産生される。

本発明のポリペプチドは従来、固相ペプチド合成を用いて調製できる（Merrifield, B.
(1986) "Solid Phase Synthesis " Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino
Acids " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131- 135; Ganesan, A.(2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev.Med. Chem. 6(1):3-10)。

ある代替案では、当該技術分野において公知の方法を用いて、抗体を組み換えによって作製し、発現させてよい。抗体は、まず宿主動物から作製された抗体を単離し、遺伝子配列を取得し、上記遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）内で抗体を組み換え発現させることによって作製できる。採用できる別の方法は、植物（例えばタバコ）又はトランスジェニックミルク中で抗体配列を発現させることである。植物又はミルク中で抗体を組み換え発現させるための好適な方法は、開示されている（例えばPeeters et al.
(2001) "Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants,"Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995)"Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93;and Pollock et a/.(1999) "Transgenic Milk As A Method For The ProductionOf Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231 : 147-157を参照）。例えばキメラ、ヒト化、単鎖等の抗体の誘導体を作製するための好適な方法は、当該技術分野において公知である。別の代替案では、抗体はファージディスプレイ技術によって、組み換えによって作製できる（例えば米国特許第５，５６５，３３２号；米国特許第５，５８０，７１７号；米国特許第５，７３３，７４３号；米国特許第６，２６５，１５０号；及びWinter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455を参照）。

関心対象の抗体又はタンパク質は、エドマン分解による配列決定に供してよく、これは当業者には公知である。質量分析又はエドマン分解から生成されるペプチド情報を用いて、関心対象のタンパク質をクローニングするために使用されるプローブ又はプライマを設計できる。

関心対象のタンパク質クローニングの代替的な方法は、関心対象の抗体又はタンパク質を発現する細胞に関して、精製したタンパク質又はその一部分を用いて「パンニング（ｐａｎｎｎｉｎｇ）」することによるものである。「パンニング」手順は、第２の細胞タイプの所望のｃＤＮＡを発現又は過剰発現する組織又は細胞からｃＤＮＡライブラリを取得し、所望のタンパク質への特異的結合のために第２の細胞タイプのトランスフェクト細胞をスクリーニングすることによって、実施してよい。「パンニング」による、細胞表面タンパク質に関する哺乳類遺伝子コーディングのクローニングにおいて使用される方法の詳細な説明は、従来技術中に見ることができる（例えばAruffo, A. et al. (1987) "Molecu
lar Cloning Of A CD28 cDNA By A High-Efficiency COS Cell Expression System" Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84:8573-8577 and Stephan, J. et al.(1999) "Selective Cloning Of Cell Surface Proteins Involved In Organ Development: Epithelial Glycoprotein Is Involved In Normal Epithelial Differentiation " Endocrinol. 140:5841-5854を参照）。

抗体、並びに他のペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータをエンコードするｃＤＮＡは、当該技術分野において標準的な方法に従った特定の細胞タイプからのｍＲＮＡの逆転写によって得ることができる。具体的には、ｍＲＮＡは、既出のSambrook et al.に記載の手順に従って、様々な溶解酵素若しくは化学溶液を用いて単離でき、又は
市販の核酸結合樹脂により、製造者（例えばＱｉａｇｅｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ）が提供する添付の説明書に従って抽出できる。次に合成ｃＤＮＡを発現ベクターに導入して、第２のタイプの細胞において関心対象の抗体又はタンパク質を産生する。発現ベクターは宿主細胞内で、エピソームとして又は染色体ＤＮＡの不可欠な部分として複製可能でなければならないことがうかがえる。好適な発現ベクターとしては、プラスミド；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス及びコスミドを含むウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

関心対象のポリヌクレオチドを含有するベクターは：電気穿孔；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ‐デキストラン又は他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；及び感染（例えばベクターがワクシニアウイルス等の感染性因子である場合）を含む多数の適切な手段のうちのいずれによって、宿主細胞に導入できる。ベクター又はポリヌクレオチドの導入の選択は、宿主細胞の特徴に左右される場合が多い。

関心対象の抗体、ポリペプチド、又はタンパク質をエンコードする遺伝子を単離する目的で、異種ＤＮＡを過剰発現できるいずれの宿主細胞を使用できる。好適な哺乳類宿主細胞の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は、対応する関心対象の内因性抗体又は宿主細胞中に存在する場合はタンパク質の５倍高い、より好ましくは１０倍高い、より好ましくは２０倍高い、より好ましくは５０倍高い、より好ましくは、１００倍高いレベルのｃＤＮＡを発現する。所望のタンパク質への特異的結合に関する宿主細胞のスクリーニングは好ましくは、イムノアッセイ又はＦＡＣＳによって実行される。関心対象の抗体又はタンパク質を過剰発現する細胞は、このようにして識別できる。

親ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータ分子に対する、得られるタンパク質のアミノ酸配列の追加、欠失又は変更をエンコードする、突然変異型ペプチドアゴニスト、アンタゴニスト及びモジュレータを産生するために現在採用できる様々な技術も利用可能である。

本発明は、本発明の三重特異性結合分子への、その特性に有意な影響を及ぼさない修飾、及び活性が増強した又は低下した変異体を含む。ポリペプチドの修飾は、当該技術分野において慣用的に実践されている。修飾されたポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換を有するポリペプチド、機能的活性を大きく劣化するように変化させない１つ若しくは複数の欠失若しくは追加、又は化学的類似体の使用が挙げられる。互いを保存的に置換できるアミノ酸残基としては：グリシン／アラニン；バリン／イソロイシン／ロイシン；アスパラギン／グルタミン；アスパラギン酸／グルタミン酸；セリン／トレオニン；リジン／アルギニン；フェニルアラニン／チロシンが挙げられるが、これらに限定されない。これらのポリペプチドとしては、グリコシル化及び非グリコシル化ポリペプチド、並びに例えば異なる複数の糖によるグリコシル化、アセチル化及びリン酸化といった、
その他の変換後修飾を有するポリペプチドも挙げられる。好ましくは、アミノ酸置換は保存的であり、即ち置換されたアミノ酸は、オリジナルのアミノ酸と同様の化学的特性を有する。このような保存的置換は当該技術分野において公知であり、その例は上述されている。アミノ酸修飾は、１つ又は複数のアミノ酸を変化させるか又は修飾することから、可変ドメイン等の領域の完全な再設計にまで及んでよい。可変ドメインの変化は、結合親和性及び／又は特異性を変化させる。他の修飾方法としては、酵素的手段、酸化的置換及びキレート化を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の連結技術の使用が挙げられる。修飾は例えば、イムノアッセイのための標識の付与、例えばラジオイムノアッセイのための放射性部分の付与等のために使用できる。修飾されたポリペプチドは、当該技術分野において確立された手順を用いて作製され、また当該技術分野において公知の標準的なアッセイを用いてスクリーニングできる。

本発明はまた、本発明のポリペプチド及び抗体からの１つ又は複数の断片又は領域を備える融合タンパク質も包含する。一実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続するアミノ酸、及び可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を備える、融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、異種免疫グロブリン定常領域を含有する。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、公的に寄託されたハイブリドーマから産生された抗体の軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含有する。本発明の目的のために、抗体融合タンパク質は、免疫エフェクタ細胞の所望のウイルスエピトープ若しくは所望の活性化受容体、又は上述のような活性化受容体、及びネイティブ分子内では上記活性化受容体が付着しない別のアミノ酸配列、例えば別の領域からの異種配列若しくは同種配列を発現する免疫エフェクタ細胞の表面上に存在するタンパク質に特異的に結合する、１つ又は複数のポリペプチドドメインを含有する。

本発明は、本発明の抗体のアミノ酸配列を備えるポリペプチドを含む。本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の手順で産生できる。上記ポリペプチドは、抗体のタンパク質分解若しくは他の分解によって、上述のような組み換え法（即ち単一若しくは融合ポリペプチド）によって、又は化学的合成によって産生できる。上記抗体のポリペプチド、特にアミノ酸最高約５０個分の比較的短いポリペプチドは、化学的合成によって便利に作製される。化学的合成方法は当該技術分野において公知であり、市販されている。例えば上述のようなポリペプチドは、固相法を採用した自動ポリペプチド合成器によって産生してよい。

ＶＩＩＩ．本発明の組成物の使用
本発明は、本発明の三重特異性結合分子、このような分子に由来するポリペプチド、このような分子又はポリペプチドをエンコードする配列を備えるポリヌクレオチド、及び本明細書に記載の他の作用剤を備える、医薬組成物を含む組成物を包含する。

本発明の三重特異性結合分子は、３つのエピトープに協調的に結合する能力を有し、従って、診断、化学的分離、及びこのようなエピトープを伴う治療薬において、有意な用途を有する。例えばこのような分子は、サンドイッチイムノアッセイにおける試薬として使用してよい。

このような三重特異性結合分子が疾患関連抗原のエピトープに結合する実施形態では、上記分子は、上記疾患関連抗原の発現に関連する、又は上記疾患関連抗原の発現を特徴とする疾患又は状態の治療のために使用できる。従って、限定するものではないが、上記分子を含む医薬組成物は、癌及び病原体（例えば細菌、真菌、ウイルス又は原生動物）感染によって引き起こされる疾患の診断又は治療において採用できる。

ＩＸ．投与方法
本発明の組成物は、有効量の本発明の医薬組成物を被験体に投与することによる、疾患、障害又は感染症に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善のために提供できる。好ましい態様では、上記組成物は実質的に精製される（即ち上記組成物の効果を制限する、又は望ましくない副作用を生成する物質を実質的に含まない）。ある具体的実施形態では、被験体は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ属、ウマ科、ネコ科、イヌ科、齧歯類等）又は霊長類（例えばカニクイザル等のサル、ヒト等）といった哺乳類である。ある好ましい実施形態では、被験体はヒトである。

例えば抗体又は融合タンパク質を発現できるリポソーム、微粒子マイクロカプセル、組み換え細胞内へのカプセル化；受容体仲介性エンドサイトーシス（例えばWu et al. (1987) “Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System,”J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）；レトロウイルス又は他のベクターの一
部としての核酸の構築等、様々な送達系が公知であり、本発明の組成物の投与に使用できる。

本発明の三重特異性結合分子を投与する方法としては：非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内及び皮下）；硬膜外；並びに粘膜（例えば鼻腔内及び経口経路）が挙げられるがこれらに限定されない。ある具体的実施形態では、本発明の分子は、筋肉内、静脈内又は皮下投与される。組成物は、いずれの便利な経路によって、例えば点滴又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚層（例えば口腔粘膜、直腸及び腸粘膜等）を通した吸収によって投与してよく、他の生物学的活性作用剤と共に投与してよい。投与は全身性又は局所性とすることができる。更に、例えば吸入器又は噴霧器の使用及びエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与を採用することもできる。例えば米国特許第６，０１９，９６８号；米国特許第５，９８５，３２０号；米国特許第５，９８５，３０９号；米国特許第５，９３４，２７２号；米国特許第５，８７４，０６４号；米国特許第５，８５５，９１３号；米国特許第５，２９０，５４０号；米国特許第４，８８０，０７８号；国際公開第９２／１９２４４号；国際公開第９７／３２５７２号；国際公開第９７／４４０１３号；国際公開第９８／３１３４６号；国際公開第９９／６６９０３号を参照（これらはそれぞれ、参照により本明細書に援用される）。

本発明はまた、本発明の三重特異性結合分子を、上記分子の量を示すアンプル又はサシェ等の気密性コンテナ内に包装することも提供する。一実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として供給され、例えば水又は食塩水を用いて、被験体への投与に適切な濃度へと再構成できる。好ましくは、本発明の三重特異性結合分子は、少なくとも５μｇ、より好ましくは少なくとも１０μｇ、少なくとも１５μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも１００μｇ又は少なくとも２００μｇの単位剤形で、気密性コンテナ内の滅菌凍結乾燥粉末として供給される。

凍結乾燥された本発明の三重特異性結合分子は、その元々のコンテナ内において２〜８℃で保管するべきであり、またこの分子は、再構成後１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内又は１時間以内に投与するべきである。ある代替実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、この分子、融合タンパク質又はコンジュゲート分子の量及び濃度を示す気密性コンテナ内に、液体形態で供給される。好ましくは、本発明の三重特異性結合分子の液体形態は、少なくとも１μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ又は少なくとも１００μｇ／ｍｌの濃度でこの分子が存在する気密性コンテナ内に供給される。

本明細書において使用される場合、医薬組成物の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍ
ｏｕｎｔ）」は、一実施形態において：疾患によってもたらされる症状の低減；感染の症状（例えばウイルス負荷、発熱、疼痛、敗血症等）若しくは癌の症状（例えば癌細胞の増殖、腫瘍の存在、腫瘍転移等）を減弱させる疾患に起因する症状の減弱；これによる、疾患に罹患したヒトのＱＯＬの上昇；疾患を治療するために必要な他の投薬量の低減；標的化及び／若しくは内在化等による別の投薬の効果の増強；疾患の進行の遅延；並びに／又は個体の生存期間の延長を含むがこれらに限定されない、有益な又は所望の結果を得るために十分な量である。

有効量は、１回又は複数回の投与で投与できる。本発明の目的のために、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、直接的又は間接的な、ウイルスの存在（又はその影響）の増殖の低減、並びにウイルス性疾患の進展の低減及び／又は遅延に十分な量である。いくつかの実施形態では、薬剤、化合物又は医薬組成物の有効量は、別の薬剤、化合物又は医薬組成物と組み合わせて達成してもしなくてもよい。従って「有効量」は、１つ又は複数の化学療法剤を投与する文脈で考えることができ、また単一の作用剤が、１つ又は複数の他の作用剤と組み合わせて所望の結果を達成できる又は所望の結果を達成する場合に、有効量で与えられているものと考えることができる。個別の必要量は異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。抗体投与の典型的な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／体重の単位用量を１回分又は複数回分含む。

障害に関連する１つ又は複数の症状の治療、予防及び改善に効果的な本発明の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定できる。処方において採用するべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも左右され、施術者の判断及び各患者の状況に従って決定するべきである。効果的な用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から得られた用量‐応答曲線から外挿できる。本発明の三重特異性結合分子に関して、患者に投与される投薬量は典型的には、被験者の体重の、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約２０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ／日又はそれを超える量である。

好ましくは、患者に投与される投薬量は、被験体の体重の約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約５０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約５０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１０μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１μｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約０．５μｇ／ｋｇ／日、及びより好ましくは約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約０．１μｇ／ｋｇ／日である。本発明の三重特異性結合分子の投与の投薬量及び頻度は、例えば脂質化等の修飾によって上記三重特異性結合分子の取り込み及び組織貫通を増強することによって、低減又は変更できる。

別の実施形態では、患者は、上述のような予防的又は治療的有効量の本発明が包含する三重特異性結合分子の１回又は複数回の用量を含む治療レジメンを投与され、この治療レジメンは、２日、３日、４日、５日、６日又は７日に亘って投与される。特定の実施形態では、治療レジメンは、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する三重特異性結合分子の用量を断続的に投与する（例えば所定の週の１日目、２日目、３日目及び４日目に投与し、同一の週の５日目、６日目及び７日目には、予防的又は治療的有効量の本発明が包含する三重特異性結合分子の用量を投与しない）ことを含む。典型的には、１、２、３、４、５つ又はそれを超える治療のコースが存在する。各コースは、同一のレジメン又は異なるレジメンであってよい。

別の実施形態では、投与される用量は、本発明が包含する三重特異性結合分子の１日の予防的又は治療的有効量に到達するまで、１つ又は複数のレジメンの最初の１／４、最初の半分又は最初の２／３若しくは３／４に亘って（例えば４コース治療の第１、第２又は第３のレジメンに亘って）漸増する。

一実施形態では、患者に投与される本発明の三重特異性結合分子の投薬量は、単一作用剤による治療としての使用のために計算してよい。別の実施形態では、本発明の三重特異性結合分子は、他の治療用組成物と併用され、患者に投与される投薬量は、このような三重特異性結合分子を単一作用剤による治療として使用する場合よりも小さくなる。

ある具体的実施形態では、本発明の医薬組成物を、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは、以下に限定されるものではないが、例えば局所的点滴によって、注射によって、又はインプラントを用いて達成してよく、上記インプラントは多孔性、非多孔性又はゼラチン材料性であり、シラスティック膜等の膜又は繊維を含む。好ましくは、本発明の分子を投与する際、この分子が吸収されない材料を使用するよう注意しなければならない。

別の実施形態では、上記組成物は、小嚢、特にリポソーム中で送達できる（Langer (1990) “New Methods Of Drug Delivery,” Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Diseaseand Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365(1989); Lopez-Berestein,同上、pp.317-327 参照）。

更に別の実施形態では、上記組成物は、放出制御系又は徐放系中で送達できる。１つ又は複数の本発明の分子を含む徐放性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号；国際公開第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996) “Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995) “Antibody Mediated Lung Targeting
Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397;Cleek et al.(1997) “Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF
Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact.Mater. 24:853-854;及びLam et al. (1997) “Microencapsulation Of Recombinant
Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery,”Proc. Int’l. Symp. Control
Rel. Bioact. Mater. 24:759-760を参照（これらはそれぞれ参照によりその全体が本明
細書に援用される）。一実施形態では、放出制御系においてポンプを使用してよい（Langer, supra;Sefton,(1987)“Implantable Pumps,” CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240;Buchwald et al.(1980)“Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By AnImplantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent VenousThrombosis,” Surgery 88:507-516;及びSaudek etal.(1989)“A Preliminary Trial
Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery,” N. Engl. J. Med.321:574-579参照）。別の実施形態では、分子の放出制御を達成するためにポリマー材料を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release, Langer
and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York(1984);Levy et al.(1985)“Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controlled-Release Diphosphonate,” Science 228:190-192;During et al.(1989)“Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization,” Ann. Neurol. 25:351-356;Howard et al.(1989)“Intrace
rebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits,” J. Neurosurg.7(1):105-112)；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号
；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；国際公開第９９／１５１５４号；及び国際公開第９９／２０２５３号参照）。徐放性処方において使用されるポリマーの例としては、ポリ（2‐ヒドロキシエ
チルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン‐コ‐酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物類、ポリ（Ｎ‐ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド類（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド‐コ‐グリコリド）類（ＰＬＧＡ）及びポリオルトエステル類が挙げられるが、これらに限定されない。更に別の実施形態では、放出制御系は、治療標的（例えば肺）の近傍に配置でき、従って全身用量の一部しか必要としない（例えばGoodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra,vol.2, pp.115-138(1984)参照）。放出制御インプラントとして有用なポリマー組成物は、Dunnet al.に従って使用できる（米国特許第５，９４５
，１５５号参照）。この特定の方法は、ポリマー系からの生物活性材料のインサイチュ放出制御の治療効果に基づく。埋入は一般に、治療的処置を必要とする患者の身体内のいずれの部位において実施できる。別の実施形態では、非ポリマー徐放系が使用され、この場合、被験体の身体内の非ポリマーインプラントを、薬剤送達系として使用する。身体内への埋入後、インプラントの有機溶媒が組成物から周辺の組織液中へと放散、分散又は浸出し、非ポリマー材料は徐々に凝集又は沈殿して、固体の微小細孔性マトリクスを形成する（米国特許第５，８８８，５３３号参照）。

放出制御系については、Langer(1990,“New Methods Of Drug Delivery,” Science249:1527-1533)による報告中で議論されている。１つ又は複数の本発明の治療剤を含む徐放
性処方を製造するために、当業者に公知のいずれの技術を使用できる。例えば：米国特許第４，５２６，９３８号；国際公開第９１／０５５４８号及び第９６／２０６９８号；Ning et al.(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel,”Radiotherapy & Oncology39:179-189;Song et al.(1995)“Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology50:372-397;Cleek et al.(1997)“Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application,” Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact.Mater. 24:853-854;並びにLam et al.(1997)“Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody ForLocal Delivery,” Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759-760参照（これらはそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

本発明の組成物が、本発明の三重特異性結合分子をエンコードする核酸である、ある具体的実施形態では、この核酸は、この核酸がエンコードする三重特異性結合分子の発現を促進するために、この核酸を適切な核酸発現ベクターの一部として構築して、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、又は直接注射によって、又は微粒子衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくは遺伝子導入剤を用いてコーティングすることによって、又は細胞核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドと連鎖させて上記核酸を投与すること（例えばJoliot et al.(1991)“Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis,” Proc. Natl.Acad. Sci.(U.S.A.)88:1864-1868を参照）等によって、上記核酸を投与することにより、インビボ投与できる
。あるいは核酸を細胞内に導入して、相同遺伝子組み換えによる発現のためのホスト細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。

治療的又は予防的有効量の本発明の三重特異性結合分子を用いた被験体の治療は、単回
治療を含むことができ、又は好ましくは一連の複数回の治療を含むことができる。ある好ましい例では、被験体は、本発明の分子を用いて、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、更に好ましくは約４、５又は６週間に亘って週１回処置される。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、１日１回、１日２回又は１日３回投与できる。他の実施形態では、この医薬組成物は、１週間に１回、１週間に２回、２週間に１回、１ヶ月に１回、６週間に１回、２ヶ月に１回、１年に２回又は１年に１回投与できる。治療に使用される上記分子の有効な用量設定は、特定の治療の期間に亘って増減させてよいことも理解されるだろう。

ここまで本発明を概説してきたが、以下の実施例を参照することにより、本発明は更に容易に理解されるだろう。これらの実施例は例示として提供されており、そうでないことが明記されていない限り本発明を制限することを意図したものではない。

実施例１例示的な抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗Ｂ７‐Ｈ３三重特異性結合分子の産生及び特性
ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するより高い特異性、及びより強力な標的転換殺滅を呈する治療用分子を開発するために、ＣＤ３、ＣＤ８及び疾患関連抗原に対して協調的に結合する能力を有する三重特異性結合分子を構成した。産生された三重特異性結合分子は更に、上記三重特異性結合分子のインビボ半減期を増強するために、Ｆｃドメインを有していた。三重特異性結合分子の一般的構造を、図４Ａ〜４Ｄに示す。疾患関連抗原Ｂ７‐Ｈ３に対して特異的な例示的三重特異性結合分子を構成した。上記三重特異性結合分子内の結合ドメインの相対的位置を示すために、上記三重特異性結合分子をＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１と呼ぶ。Ｂ７‐Ｈ３結合ドメインは部位Ａの位置を占有し、ＣＤ３結合ドメインは部位Ｂの位置を占有し、ＣＤ８結合ドメインは部位Ｃの位置を占有する（図４Ａ）。Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表５）。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号５９）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK

第１のポリペプチド鎖において、ＶＬ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）は配列番号４１のアミノ酸配列を有し、ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）は配列番号２７のアミノ酸配列を有し、Ｅコイルは配列番号３のアミノ酸配列を有し、（ＣＨ２‐ＣＨ３）は、配列番号７の「ノブ担持」アミノ酸配列のアミノ酸配列を有する。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６０）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY
WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE

第２のポリペプチド鎖において、ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）は配列番号２６のアミノ酸配列を有し、ＶＨ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）は配列番号４２のアミノ酸配列を有し、Ｋコイルは配列番号４のアミノ酸配列を有する。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６１）：EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

第３のポリペプチド鎖において、採用されるＣＤ８ｍＡｂ１重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０のアミノ酸配列、ヒンジドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びタンパク質Ａ結合部位（配列番号８）を除去するためのＨ４３５Ｒ置換を伴う「ホール担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメインを有する。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６２）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

第４のポリペプチド鎖において、採用されるＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２９のアミノ酸配列、及びカッパ軽鎖定常ドメインを有する。

発現したＢ７Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子をＭＳＡ樹脂上に装填し、１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ６）；１０ｍＭＮａＰ
Ｏ_4、１ＭＮａＣｌ（ｐＨ６）及び１０ｍＭＮａＰＯ₄（ｐＨ６）で洗浄した。５０ｍＭグリシン（ｐＨ３）を用いてポリペプチドを樹脂から溶出させ、１ＭＴｒｉｓ（ｐＨ８）で中和した。発現は１．７ｍｇ／Ｌであることが分かった；上記三重特異性結合分子の調製は０．６ｍｇ／ｍｌであり、最終収量は０．４２ｍｇであった。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の特性を、Ｂ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴ及びＦｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴの特性と比較した。図５Ａ〜５Ｂに示すように、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、Ｂ７‐Ｈ３Ｘ
ＣＤ３ＤＡＲＴ及びＦｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴと比較して、同様の標的細胞結合（Ａ４９８細胞（図５Ａ）；ＪＩＭＴ‐１（図５Ｂ））を示した。しかしながら、図５Ｃ〜５Ｄに示すように、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して大幅に増大した、ＣＤ８＋Ｔ細胞への結合を示した。

本発明のＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の、標的細胞の標的転換殺滅を仲介する能力を実証するために、上述の分子を、Ｔ細胞及びＪＩＭＴ‐１又はＡ４９８標的細胞の存在下でインキュベートした。ＪＩＭＴ‐１細胞は、トラスツズマブ耐性癌腫株である（Tanner, M. et al. (2004) "Characterization Of A N ^' ovel Cell Line Established From A Patient With Herceptin-Resistant Breast Cancer " Mol. Cancer Ther.3(12): 1585-1592）。Ａ４９８細胞株は、腎
細胞癌腫細胞株である（Gogh, J. (1978) Cultivation,Characterization, And Identification Of Human Tumor Cells With Emphasis On Kidney, Testis, And Bladder Tumors
" Natl. Cancer Inst. Monogr. 49:5-9）。図６Ａ〜６Ｃに示すように、標的細胞の標的転換殺滅が観察された。予想外に、このような殺滅は、対応するＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３
ＤＡＲＴ及びＦｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴに関して観察されるものよりも有意に強力であった。観察された標的転換殺滅を表６にまとめる。

図７Ａ〜７Ｄは、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ三重特異性結合分子の、ＪＩＭＴ‐１細胞のインキュベーション後にＴ細胞活性化を仲介する
能力を示す。図８Ａ〜８Ｄは、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の、Ａ４９８細胞のインキュベーション後にＴ細胞活性化を仲介する能力を示す。どちらの場合においても、このような活性化は、同等のＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）及びＦｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）を用いて観察される活性化よりも予想外に優れていた。表７は、ＥＣ５０の結果をまとめたものである。

発現したＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、ＣＤ４＋エフェクタ細胞に比べて、ＣＤ８＋エフェクタ細胞を使用して、はるかに高い（１３倍の）細胞溶解活性を呈した。Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子はまた、ＤＡＲＴ（商標）に比べて、「ｐａｎ」Ｔ細胞をエフェクタとして用いて、大幅に上昇した（８５倍の）全体としての効力を呈した。

実施例２標的転換細胞毒性に対するＣＤ８結合ドメインの影響
ＣＤ８特異性の影響を評価するために、疾患関連抗原Ｂ７‐Ｈ３に対して特異的な第２の三重特異性結合分子を、異なるＣＤ８抗体可変ドメイン配列を利用して構成した。Ｂ７‐Ｈ３可変ドメイン特異性及びＣＤ３可変ドメイン特異性は、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子を構成するために使用したものと同一であった。この三重特異性結合分子はＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２と呼ばれ、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表８）。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６３）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKDRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６４）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSY
WMQWVRQAPG QGLEWMGTIY PGDGDTRYTQ KFKGRVTITA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCARRGIP RLWYFDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK
EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６５）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６６）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP
GKAPKLLIYN TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP
EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG TKVEIKRTVA APSVFIFPPS
DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD NALQSGNSQE
SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１（上述の構成及び配列）又はＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の、Ｔ細胞に結合する能力を比較するために、健康なドナーのヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌを用いて精製し、ＰＢＳで２回洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清を含有するＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁し、室温で２０分間インキュベートし、細胞を遠心沈殿させ、ＦＡＣＳ緩衝液中で４ｘ１０⁶細胞／ｍＬの細胞を再懸濁した。５０μｌの連続滴定したＢ
７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１若しくはＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子又はＤＡＲＴ（商標）（Ｂ７‐Ｈ３ＸＣＤ３若しくはＦｃドメインを有するＢ７‐Ｈ３ＸＣＤ３）を、９６ウェルの深型プレートのウェルに添加した。続いて、０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中の十分に混合した細胞５０μＬ（４ｘ１０⁶細胞／ｍ
Ｌ）を対応するウェルに添加し、ピペットを用いて徹底的に混合した。プレートを、２〜８℃で約４５分間、暗所でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を、各ウェルに３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって２回洗浄し、プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄した。細胞のペレットを、０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中の、ＰＥコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃγ（１：５００希釈）、ＣＤ５‐ＡＰＣ及びＣＤ４‐ＰｅｒＣＰ５．５の混合物１００μＬ中で再懸濁し、２〜８℃で約４５分間、暗所でインキュベートした。インキュベーションの終了時に細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて再懸濁し、ＢＤＣａｌｉｂｅｒフローサイトメータを用いて分析した。細胞を、ＣＤ５⁺ＣＤ４⁺（図９Ａ）又はＣＤ５⁺ＣＤ
４^-（図９Ｂ）に対してゲーティングした。ＣＤ８特異性を有する又はＣＤ８特異性を有
しない結合分子と比べて、ＣＤ５⁺ＣＤ４^-集団において分染が観察された。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の細胞毒性を、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の細胞毒性と比較した。ルシフェラーゼアッセイ及びＬＤＨアッセイの両方を採用した。２つのアッセイの結果は合致した。これら２つの三重特異性結合分子は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞又はｐａｎＴ細胞集合の存在下において同等の標的転換細胞毒性を引き起こした。ＣＤ８ｍＡｂ１結合ドメインを有する三重特異性結合分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞又はｐａｎＴ細胞集合の存在下において、Ｂ７Ｈ３ＸＣＤ３ＤＡＲＴと比べてより高い標的転換細胞毒性を呈した（図１０Ａ〜１０Ｃ）。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子に関して、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子と比べて、ＣＤ８＋ｖｓ．ＣＤ４＋エフェクタ細胞に関するＥＣ５０の上昇（６０倍）も観察された。Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子に関して、ｐａｎＴ細胞がエフェクタ細胞として使用される場合に、１００倍を超えるＥＣ５０の低下につながる強度の上昇が観察された。

実施例３標的転換細胞毒性に対するドメイン位置の影響
三重特異性結合分子内での所与の結合ドメイン（ＣＤ３、ＣＤ８及び疾患関連抗原）に
関する位置（部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃ）の影響を評価するために、複数の追加の三重特異性結合分子を構成した。表９は、これら三重特異性結合分子と、様々な結合ドメイン（ＣＤ３、ＣＤ８及び疾患関連抗原）の位置（部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃ）とを示す。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の構成及び配列については上述した。追加の２つの三重特異性結合分子（ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１及びＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２）に関して、Ｂ７‐Ｈ３可変ドメイン特異性、ＣＤ３可変ドメイン特異性及びＣＤ８可変ドメイン特異性は、Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子を構成するために使用したものと同一であった。ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１０）。

ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６７）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK

ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６８）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGEV QLQQSGAELV KPGASVKLSC TASGFNIKDT
YIHFVRQRPE QGLEWIGRID PANDNTLYAS KFQGKATITA DTSSNTAYMH
LCSLTSGDTA VYYCGRGYGY YVFDHWGQGT TLTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE

ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６９）：
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQWVRQA PGQGLEWMGT
IYPGDGDTRY TQKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARRG
IPRLWYFDVW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK
DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT
YICNVNHKPS NTKVDKRVEP KSCDKTHTCP PCPAPEAAGG PSVFLFPPKP
KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
VYTLPPSREE MTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNRYT QKSLSLSPGK

ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１１）。

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７１）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWMQ
WVRQAPGQGL EWMGTIYPGD GDTRYTQKFK GRVTITADKS TSTAYMELSS
LRSEDTAVYY CARRGIPRLW YFDVWGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV
AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK
DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７２）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPPTFGG
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLQ QSGAELVKPG ASVKLSCTAS GFNIKDTYIH
FVRQRPEQGL EWIGRIDPAN DNTLYASKFQ GKATITADTS SNTAYMHLCS
LTSGDTAVYY CGRGYGYYVF DHWGQGTTLT VSSGGCGGGK VAALKEKVAA
LKEKVAALKE KVAALKE

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７３）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKDRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL
GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSS
LGTQTYICNV NHKPSNTKVD KRVEPKSCDK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL
FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR
EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLSCAVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK
TTPPVLDSDG SFFLVSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNRYTQKSLS
LSPGK

Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７４）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ
WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT
HQGLSSPVTK SFNRGEC

この調査の結果を、図１１Ａ〜１１Ｃ、図１２Ａ〜１２Ｃ、図１３Ａ〜１３Ｅ及び表２６に示す。図１１Ａ〜１１Ｃ及び図１２Ａ〜１２Ｃは独立して、三重特異性結合分子の部位ＣにＣＤ３結合ドメインを配置することによって、分子の細胞毒性が低下することを実証している。図１３Ａ〜１３Ｅは、この減少した細胞毒性が、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はｐａｎＴ細胞のいずれを採用するかにかかわらず観察されることを示している。

図１４Ａ〜１４Ｂに示すように、ＣＤ３結合ドメインを部位Ｃに配置すると、ＣＤ５⁺
ＣＤ４⁺細胞（図１４Ａ）及びＣＤ５⁺ＣＤ４^-細胞（図１４Ｂ）の両方への結合が大幅に
減少した。しかしながら、ＣＤ３結合ドメインの配置に関係なく、全ての三重特異性結合分子は標的転換細胞毒性を仲介できたことに留意されたい。

実施例４例示的な抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗５Ｔ４三重特異性結合分子の産生及び特性
疾患関連抗原５Ｔ４に対して特異的な、更なる例示的な三重特異性結合分子を構成した。５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１２）。

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７５）：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS
LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG
GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK
TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK
AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE
NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ
KSLSLSPGK

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７６）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQPGAELV KPGASVKMSC KASGYTFTSY
WITWVKQRPG QGLEWIGDIY PGSGRANYNE KFKSKATLTV DTSSSTAYMQ
LSSLTSEDSA VYNCARYGPL FTTVVDPNSY AMDYWGQGTS VTVSSGGCGG
GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７７）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７８）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１３）。

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号７９）：
DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSQSIV YSNGNTYLEW YLQKPGQSPK
LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP
FTFGSGTKLE IKGGGSGGGG EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS
TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS
LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR HGNFGNSYVS WFAYWGQGTL VTVSSGGCGG
GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK
TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK
AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE
NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ
KSLSLSPGK

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８０）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQQPGAELV KPGASVKMSC KASGYTFTSY
WITWVKQRPG QGLEWIGDIY PGSGRANYNE KFKSKATLTV DTSSSTAYMQ
LSSLTSEDSA VYNCARYGPL FTTVVDPNSY AMDYWGQGTS VTVSSGGCGG
GKVAALKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８１）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８２）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG
TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及び５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子を、上述のように発現させて精製した。これら２つの三重特異性結合分子の、ＣＤ５＋／ＣＤ４＋ゲート及びＣＤ５＋／ＣＤ４‐ゲートヒトＰＢＭＣに結合する能力を、Ｆｃドメインを有する５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴの能力と比較した。図１５Ａ〜１５Ｂに示すように、５Ｔ４／ＣＤ
３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及び５Ｔ４／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
２三重特異性結合分子は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１５Ａ）と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１５Ｂ）に対する結合の大幅な増大を示した。

５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及び５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の、標的細胞の標的転換殺滅を仲介する能力を実証するために、上記分子を、Ｔ細胞及びＪＩＭＴ‐１標的細胞の存在下でインキュベートした。図１６Ａ〜１６Ｃに示すように、標的細胞の標的転換殺滅が観察された。上述のＢ７‐Ｈ３三重特異性結合分子に関して観察されるように、上記殺滅は、対応する、Ｆｃドメインを含有する５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴに関して観察されるものよりも有意に強力であった。同様に、Ｂ７‐Ｈ３三重特異性結合分子に関して観察されたように、異なるＣＤ８可変ドメインの使用は、三重特異性結合分子の、ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的細胞に対して標的転換する能力に影響を及ぼさなかった。５Ｔ４ｍＡｂ
２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子は活性が高いことも分かり、またＣＤ８＋ｖｓ．ＣＤ４＋エフェクタ細胞を使用すると、ＣＴＬ活性がはるかに高いことも実証された（２３倍低いＥＣ５０）。５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ
２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）と比べて、ｐａｎＴ細胞エフェクタを使用すると２２倍強力となり、また５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子は２５倍強力であった。

実施例５例示的な抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＲＯＲ１三重特異性結合分子の特性
疾患関連抗原ＲＯＲ１に対して特異的な、更なる例示的な三重特異性結合分子を構成した。ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１４）。

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８３）：
QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL
EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN
YLFGGGTQLT VLGGGGSGGG GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF
STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA TYYADSVKGR FTISRDDSKN
SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT LVTVSSGGCG
GGEVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA
KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS
KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP
ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
QKSLSLSPGK

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８４）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQE QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSDY
YMSWVRQAPG KGLEWVATIY PSSGKTYYAD SVKGRFTISS DNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTA VYYCARDSYA DDAALFDIWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８５）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８６）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１５）。

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８７）：
QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TCTLSSGHKT DTIDWYQQQP GKAPRYLMKL
EGSGSYNKGS GVPDRFGSGS SSGADRYLTI SSLQSEDEAD YYCGTDYPGN
YLFGGGTQLT VLGGGGSGGG GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF
STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA TYYADSVKGR FTISRDDSKN
SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT LVTVSSGGCG
GGEVAALEKE VAALEKEVAA LEKEVAALEK GGGDKTHTCP PCPAPEAAGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA
KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS
KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP
ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
QKSLSLSPGK

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８８）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQE QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSDY
YMSWVRQAPG KGLEWVATIY PSSGKTYYAD SVKGRFTISS DNAKNSLYLQ
MNSLRAEDTA VYYCARDSYA DDAALFDIWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL
KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号８９）：
QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFTFS DFGMNWVRQA PGKGLEWVAL
IYYDGSNKFY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKPH
YDGYYHFFDS WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV
KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ
TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK
PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP
QVYTLPPSRE EMTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP
VLDSDGSFFL VSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNRY TQKSLSLSPG
K

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９０）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKGSQDIN NYLAWYQQKP GKAPKLLIYN
TDILHTGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCYQ YNNGYTFGQG
TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD
NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL
SSPVTKSFNR GEC

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の特性を、Ｆｃドメインを含有するＲＯＲ１ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）の特性と比較した。ＤＡＲＴ（商標）、並びにＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子を、ＲＯＲ‐１抗原に結合する抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体ＲＯＲ１ｍＡｂ１からのＦｖ配列を用いて構成した。

２つのＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＲＯＲ１
ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子、並びにＤＡＲＴは全て、ＣＴＬアッセイにおいて、ＪＩＭＴ１‐ｌｕｃ及びＡ５４９標的細胞に対する活性を有した。しかしながら、ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８
ｍＡｂ１及びＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子は、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びｐａｎＴ細胞エフェクタにより、活性が劇的に上昇した。

ＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の、標的細胞の標的転換殺滅を仲介する能力を、ルシフェラーゼアッセイ及びＬＤＨアッセイの両方を用いて測定した。どちらの場合においても、標的転換殺滅が観察された。図１７Ａ〜１７Ｃは、ルシフェラーゼアッセイを用いて測定された標的細胞の標的転換殺滅を示す。結果を表１６にまとめる。

実施例６例示的な抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗Ｅｎｖ三重特異性結合分子の特性
疾患関連抗原ＨＩＶ（ｇｐ１４０抗原）に対して特異的な、更なる例示的な三重特異性結合分子を構成した。ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１７）。

ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の
第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９１）：
DIVMTQSPDS LAVSPGERAT IHCKSSQTLL YSSNNRHSIA WYQQRPGQPP
KLLLYWASMR LSGVPDRFSG SGSGTDFTLT INNLQAEDVA IYYCHQYSSH
PPTFGHGTRV EIKGGGSGGG GEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFTF
STYAMNWVRQ APGKGLEWVG RIRSKYNNYA TYYADSVKGR FTISRDDSKN
SLYLQMNSLK TEDTAVYYCV RHGNFGNSYV SWFAYWGQGT LVTVSSASTK
GEVAACEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP
SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK
TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK
AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE
NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ
KSLSLSPGK

ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９２）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGGGVF KPGGSLRLSC EASGFTFTEY
YMTWVRQAPG KGLEWLAYIS KNGEYSKYSP SSNGRFTISR DNAKNSVFLQ
LDRLSADDTA VYYCARADGL TYFSELLQYI FDLWGQGARV TVSSASTKGK
VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE

ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９３）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG

ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９４）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

ＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表１８）。

ＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９５）：
QSALTQPPSA SGSPGQSVTI SCTGTSSDVG GYNYVSWYQH HPGKAPKLII
SEVNNRPSGV PDRFSGSKSG NTASLTVSGL QAEDEAEYYC SSYTDIHNFV
FGGGTKLTVL GGGSGGGGEV QLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSTY
AMNWVRQAPG KGLEWVGRIR SKYNNYATYY ADSVKGRFTI SRDDSKNSLY
LQMNSLKTED TAVYYCVRHG NFGNSYVSWF AYWGQGTLVT VSSASTKGEV
AACEKEVAAL EKEVAALEKE VAALEKGGGD KTHTCPPCPA PEAAGGPSVF
LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLWCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL
SLSPGK

ＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９６）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLQESGPGLV KPSQTLSLSC TVSGGSSSSG
AHYWSWIRQY PGKGLEWIGY IHYSGNTYYN PSLKSRITIS QHTSENQFSL
KLNSVTVADT AVYYCARGTR LRTLRNAFDI WGQGTLVTVS SASTKGKVAA
CKEKVAALKE KVAALKEKVA ALKE

ＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９７）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPG

ＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９８）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のｇｐ１４０抗原に結合できる結合ドメインを有する三重特異性結合分子（即ちＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子及びＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子）を調製した。

予備的ステップとして、ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１及びＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の能力を評価した。０．２Ｍ炭酸塩‐重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中の２μｇ／ｍｌのＪＲ‐ＦＬ株ｇｐ１４０タンパク質で固体支持体をコーティングした後、三重特異性結合分子（開始濃度５μｇ／ｍｌ、その後１：２連続希釈）を用いてインキュベートした。アッセイの完了時、結合を、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロックした。結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡ（ｐｉｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ‐Ｐｉｅｒｃｅ））によって検出した。また、上記分子のＣＤ３に結合する能力を評価するために、固定化ヒトＣＤ３（２μｇ／ｍｌ）を用いたアッセイも使用した。いずれの三重特異性結合分子も、可溶性固定化ｇｐ１４０タンパク質（図１８Ａ）及びヒトＣＤ３（図１８Ｂ）に結合できることが分かった。上記三重特異性結合分子が、ｇｐ１４０及びＣＤ３の両方に協調的に結合できることを実証するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。この目的のために、０．２Ｍ炭酸塩‐重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）中の２μｇ／ｍｌのＪＲ‐ＦＬ株ｇｐ１４０タンパク質で固体支持体をコーティングした後、三重特異性結合分子（開始濃度５μｇ／ｍｌ、その後１：２連続希釈）を用いてインキュベートした。続いてビオチンで標識したヒトＣＤ３を添加した（０．５μｇ／ｍｌ）。結合を、ストレプトアビジン‐ＨＲＰを用いたＥＬＩＳＡ（ｐｉｃｏ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ‐Ｐｉｅｒｃｅ））によって検出した。図１８Ｃは、上記三重特異性結合分子がｇｐ１４０及びＣＤ３の両方に協調的に結合できたことを示している。

上記三重特異性結合分子は、ＨＩＶｅｎｖタンパク質を発現する細胞の表面に結合できることが分かった。本発明のこの態様を実証するために、ドキシサイクリン導入下のＨＩＶｅｎｖ発現ＨＥＫ２９３／Ｄ３７５細胞を、上記三重特異性結合分子を用いてインキュベートした。結合の検出は、ビオチン化抗ヒトＦｃ抗体及びストレプトアビジン‐ＡＰＣを用いて実施した。図１９Ａ〜１９Ｃに示すように、いずれの三重特異性結合分子も、対照三重特異性結合分子（図１９Ｃ）とは対照的に、ＨＥＫ２９３／Ｄ３７５細胞に結合できることが分かった。

上述のような三重特異性結合分子の、ＨＩＶ感染細胞の標的転換殺滅を仲介する能力を実証するために、上記分子の、ＰＢＭＣに結合する能力を評価した。ヒト血液をＡＣＫ溶解緩衝液で溶解し、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、１０％ヒトＡＢ血清を含有するＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁して、室温で２０分間インキュベートした。その後上記細胞を、遠心分離によってペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁（４ｘ１０⁶細胞／ｍＬ）した。５
０μＬの連続滴定された三重特異性結合分子を、９６ウェル深型プレートのウェルに添加
した。続いて、０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中の十分に混合した細胞５０μＬ（４ｘ１０⁶細胞／ｍＬ）を対応するウェルに添加し、ピペットを用いて
徹底的に混合した。プレートを、２〜８℃で約４５分間、暗所でインキュベートした。インキュベーションの終了時に、細胞を、各ウェルに３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加することによって２回洗浄し、プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して、上清を廃棄した。細胞のペレットを、０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＦＡＣＳ緩衝液中の、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃγ−ＰＥ、ＣＤ５‐ＡＰＣ及びＣＤ４‐ＰｅｒＣＰ５．５の混合物１００μＬ中で再懸濁し、細胞を２〜８℃で約４５分間、暗所でインキュベートした。インキュベーションの終了時に細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液を用いて再懸濁し、ＢＤ
Ｃａｌｉｂｅｒフローサイトメータを用いて分析した。図２０Ａ〜２０Ｂに示すように、上記三重特異性結合分子は、ＣＤ５＋／ＣＤ４−集団に対する特異的結合を呈することが分かった。

上記三重特異性結合分子を、テトラサイクリンの存在下又は不在下において、ＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞及びｐａｎＴ細胞の存在下で２４時間にわたって３７℃でインキュベートし、ＬＤＨアッセイを用いて細胞毒性を測定した。図２１Ａ〜２１Ｆに示すように、上記三重特異性結合分子は、有意な細胞毒性を仲介した。

細胞毒性分析を、精製したｐａｎＴ細胞及びＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞を用いて実施し、生存する細胞の百分率を測定した。この文積の結果を図２２Ａ〜２２Ｂに示す。

ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はｐａｎＴ細胞を用いて、ＨＩＶｅｎｖ発現Ｊｕｒｋａｔ５２２ＦＹ細胞に対する三重特異性結合分子のＣＴＬ活性の評価を行った。ＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子に関するこの評価の結果を、図２３Ａ〜２３Ｃに示す。ＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子に関するこの評価の結果を、図２４Ａ〜２４Ｃに示す。表１９はこれらの結果をまとめたものである。

標的：エフェクタ細胞の比率を変化させることによる影響を評価した。表２０は、得られた結果をまとめたものである。

ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はｐａｎＴ細胞を用いて、ＨＩＶｅｎｖ発現ＨＥＫ２９３細胞に対する三重特異性結合分子のＣＴＬ活性の評価も行った。この評価の結果を、表２１にまとめる。

実施例７ＣＤ３結合ドメイン親和性変異体の比較
上述のように、本発明の三重特異性結合分子のＣＤ３、ＣＤ８又は疾患関連抗原結合ド
メインは、より望ましい結合特性を有するようにするために突然変異させることができる。ＣＤ３ｍＡｂ２結合ドメインをこのような突然変異誘発に供し、２つの親和性変異体（ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ及びＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ）を単離した。

抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗの可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号９９）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVTTSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG

抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗの可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１００）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HGNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS

抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔの可変軽鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０１）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG

抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔの可変重鎖ドメインのアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０２）：
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMNWVRQA PGKGLEWVGR
IRSKYNNYAT YYADSVKGRF TISRDDSKNS LYLQMNSLKT EDTAVYYCVR
HKNFGNSYVT WFAYWGQGTL VTVSS

図２５Ａ〜２５Ｃは、これらの変異体の結合キネティクスを示す。ＣＤ３ｍＡｂ２
Ｌｏｗ（図２５Ａ）は低親和性変異体であり、ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ（図２５Ｂ）は、野生型ＣＤ３ｍＡｂ２と比べて高速な解離速度を有する（図２５Ｃ）。

ＣＤ３結合特性の影響を評価するために、２つのＣＤ３結合ドメイン突然変異体を使用した。疾患関連抗原５Ｔ４に対して特異的な３つの三重特異性結合分子を、野生型ＣＤ３
ｍＡｂ２可変ドメイン配列、ＣＤ３に対する親和性が低いＣＤ３ｍＡｂ２可変ドメイン配列、及び野生型親和性を有するもののオフレートがより速いＣＤ３ｍＡｂ２可変ドメイン配列を利用して構成した。５Ｔ４可変ドメイン特異性及びＣＤ８可変ドメイン特異性は、３つの三重特異性結合分子の間で同一であった。第１の三重特異性結合分子は５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１と呼ばれ、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表２２）。

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０３）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA
LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF
PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP
REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT
TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL
SPGK

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０４）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF
WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSGGCG GGKVAALKEK
VAALKEKVAA LKEKVAALKE

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０５）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０６）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

第２の三重特異性結合分子は５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１と呼ばれ、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表２３）。

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０７）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０８）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF
WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSASTK GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１０９）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１０）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

第３の三重特異性結合分子は５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１と呼ばれ、４つの異なるポリペプチド鎖で構成された（表２４）。

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１１）：
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR
ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ
GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN
WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM
NSLKTEDTAV YYCVRHKNFG NSYVTWFAYW GQGTLVTVSS ASTKGEVAAC
EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP
PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR
EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT
PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS
PGK

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１２）：
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI
GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF
GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF
WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME
LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSASTK GKVAACKEKV
AALKEKVAAL KEKVAALKE

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１３）：
EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHFVRQR PEQGLEWIGR
IDPANDNTLY ASKFQGKATI TADTSSNTAY MHLCSLTSGD TAVYYCGRGY
GYYVFDHWGQ GTTLTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY
FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI
CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD
TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST
YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY
TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD
SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号１１４）：
DVQINQSPSF LAASPGETIT INCRTSRSIS QYLAWYQEKP GKTNKLLIYS
GSTLQSGIPS RFSGSGSGTD FTLTISGLEP EDFAMYYCQQ HNENPLTFGA
GTKLELRRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC

健康なドナーのヒトＰＢＭＣを上述のように処理し、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、及び５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子を用いてインキュベートした。（野生型のＬｏｗ及びＦａｓｔＣＤ３特異性を有する）５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）を、対照として使用した。５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１及び５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、ＣＤ３に対する親和性及び結合キネティクスが変化した、突然変異型ＣＤ３結合ドメインを含有する。

上記三重特異性結合分子は、ＤＡＲＴ（商標）対照と比べて、ＣＤ５⁺ＣＤ４⁺細胞（図２６Ａ）に対する結合が弱いものの、ＣＤ５⁺ＣＤ４^-細胞（図２６Ｂ）に対する結合がはるかに強いことが分かった。

図２７Ａ〜２７Ｃは、ＬＤＨアッセイを用いて、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ
２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の細胞毒性に対する、ＣＤ３ｍＡｂ変異体の影響を示す。ルシフェラーゼアッセイを用い、５Ｔ４ｍＡｂ１結合ドメインの代わりにＢ７‐Ｈ３結合ドメインを有する三重特異性結合分子を用いても、同様の結果が得
られた。この結果は、ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ三重特異性結合分子が最小の細胞毒性を呈する一方で、ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ三重特異性結合分子がＣＤ８＋Ｔ細胞及びｐａｎＴ細胞に関して、ＣＤ４＋Ｔ細胞よりもはるかに高いレベルの細胞毒性を呈したことを示している。

サイトカインプロファイルに対する三重特異性結合分子の影響を評価するために、２人のドナーからのＰＢＭＣを、濃度を上昇させた５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子、及び５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の存在下で２４時間インキュベートした。６つのサイトカイン（ＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１０、ＩＬ‐６、ＩＬ‐４及びＩＬ‐２）のレベルを測定した。結果を図２８Ａ〜２８Ｆ（ドナー１）及び図２９Ａ〜２９Ｆ（ドナー２）に示す。この結果は驚くべきことに、ＣＤ３のみを標的とし、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して選択的でないＤＡＲＴ（商標）に比べて、ＰＢＭＣから放出されるサイトカインが劇的に減少することを示している。

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、ｐａｎＴ細胞をエフェクタとして使用すると、ＤＡＲＴ（商標）と同等の強度、即ちＤＡＲＴ（商標）に関する１．３ｐＭと比べて１ｐＭのＥＣ５０を呈した。ＤＡＲＴ（商標）の活性は既に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に関して最高であり得る。上記三重特異性結合分子は、活性を、ＣＤ８＋集合に向かいかつＣＤ４＋集合から離れるようにシフトし、これはサイトカイン放出、特にＩＬ‐２及びＴＮＦαに関して有益である。

５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に結合できるものの、これらの細胞の、又はこれらの細胞による細胞溶解を標的転換させる能力は、非突然変異型ＣＤ３ｍＡｂ２結合ドメインと比べて大幅に低下した。その一方で、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２
Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子は、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子と比べて（ＥＣ５０において７倍の差異）、特にＣＤ４＋Ｔ細胞と比べて／ＣＤ４＋Ｔ細胞に対して、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する（ＥＣ５０において７５倍の差異）ＣＴＬ活性を保持した。５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子に関するＥＣ５０は、５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子に関するＥＣ５０と同等であった（２．８ｖｓ１．３ｐＭ）が、ＣＤ８＋ｖｓＣＤ４＋Ｔ細胞の標的化の劇的な差異により、ヒトＰＢＭＣ培養物中において、５Ｔ４ＸＣＤ３ＤＡＲＴ（商標）に関して観察されたサイトカイン放出が実質的に除去された。

実施例８例示的な三重特異性結合分子のＥＣ５０データの要約
要約すると、それぞれ２つのダイアボディタイプ結合ドメイン（部位Ａ及び部位Ｂ）並びにＦａｂタイプ結合ドメイン（部位Ｃ）を有する、一連の１４個の三重特異性結合分子が構成された（表２５）。

これらの三重特異性結合分子のＥＣ５０データを表２６にまとめる（標的細胞：ＪＩＭＴ１‐ｌｕｃ；エフェクタ：標的細胞比率５：１）。いくつかの場合（表２６においてＮＲで示す）においては、最大殺滅が達成されなかったため、ＥＣ５０をこのデータから算出できなかった。

本明細書において言及されている全ての公刊物及び特許は、個々の公刊物又は特許出願それぞれの全体が参照により本明細書に援用されていることが具体的かつ独立に指示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用されている。本発明をその具体的実施形態に関して説明したが、更なる修正形態が可能であり、本出願は、本発明が属する分野の公知の方法又は慣例の範囲内であるような、及びこれまでに挙げた必須の特徴に適用できるような、本開示からの逸脱を含む、本発明の原理に概ね従う本発明のいずれの変形、使用又は改変を包含することを意図していることを理解されたい。

配列表の数字見出し＜２２３＞の記載は以下のとおりである。
配列番号１：リンカー１
配列番号２：システイン含有ドメイン（「リンカー２」）
配列番号３：Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号４：Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号５：システイン含有リンカーペプチド（「リンカー３」）
配列番号６：ヒト野生型ＩｇＧＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号７：「ノブ担持」ＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号８：「ホール担持」ＩｇＧＣＨ２‐ＣＨ３ドメイン
配列番号９：ヒトＩｇＧ１ＣＨ１ドメイン
配列番号１０：ヒトＩｇＧ１ヒンジドメイン
配列番号１１：ヒトＣＬドメインのシステイン含有部分
配列番号１２：ヒトＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分
配列番号１３：ヒトＩｇＧ１ＣＬカッパドメイン
配列番号１４：ヒトＩｇＧ１ＣＬラムダ２ドメイン
配列番号１５：ペプチドリンカー
配列番号１６：ペプチドリンカー
配列番号１７：ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号１８：ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号１９：Ｍ２９１抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号２０：Ｍ２９１抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号２１：ＹＴＨ１２．５抗ＣＤ３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号２２：ＹＴＨ１２．５抗ＣＤ３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号２３：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ１」の軽鎖可変ドメイン変異体１
配列番号２４：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ１」の軽鎖可変ドメイン変異体２
配列番号２５：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ１」の重鎖可変ドメイン
配列番号２６：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ２」の軽鎖可変ドメイン
配列番号２７：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ２」の重鎖可変ドメイン
配列番号２８：ヒト化抗ＣＤ３「ｍＡｂ２」の重鎖可変ドメインＤ６５Ｇ変異体
配列番号２９：ＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号３０：ＯＫＴ８抗ＣＤ８抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号３１：ＴＲＸ２抗ＣＤ８抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号３２：ＴＲＸ２抗ＣＤ８抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号３３：Ａ３２抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号３４：Ａ３２抗ＨＩＶｇｐ１２０抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号３５：７Ｂ２抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号３６：７Ｂ２抗ＨＩＶｇｐ４１抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号３７：パリビズマブ抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号３８：パリビズマブ抗ＲＳＶ糖タンパク質Ｆ抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号３９：「ＢＲＣＡ８４Ｄ‐５ＶＬ」ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号４０：「ＢＲＣＡ８４Ｄ‐２ＶＨ」ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号４１：「ＢＲＣＡ６９Ｄ」ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号４２：「ＢＲＣＡ６９Ｄ」ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号４３：「ＰＲＣＡ１５７」ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号４４：「ＰＲＣＡ１５７」ヒト化抗Ｂ７‐Ｈ３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号４５：ヒト化抗Ａ３３抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号４６：ヒト化抗Ａ３３抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号４７：ヒト化抗５Ｔ４抗体「ｍＡｂ１」の軽鎖可変ドメイン
配列番号４８：ヒト化抗５Ｔ４抗体「ｍＡｂ１」の重鎖可変ドメイン
配列番号４９：ヒト化抗５Ｔ４抗体「ｍＡｂ２」の軽鎖可変ドメイン
配列番号５０：ヒト化抗５Ｔ４抗体「ｍＡｂ２」の重鎖可変ドメイン
配列番号５１：ヒト化抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号５２：ヒト化抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号５３：２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号５４：２Ａ２抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号５５：Ｒ１１抗ＲＯＲ１抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号５６：Ｒ１１抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号５７：Ｒ１２抗ＲＯＲ１抗体の軽鎖可変ドメイン
配列番号５８：Ｒ１２抗ＲＯＲ１抗体の重鎖可変ドメイン
配列番号５９：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号６０：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号６１：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号６２：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号６３：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号６４：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号６５：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ２重鎖）
配列番号６６：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ２軽鎖）
配列番号６７：例示的なＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＣＤ８ｍＡｂ１）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号６８：例示的なＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ８ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号６９：例示的なＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１重鎖）
配列番号７０：例示的なＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１／Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号７１：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ８ｍＡｂ１）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号７２：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ８ｍＡｂ１）‐ＶＨ（Ｂ７‐Ｈ３ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号７３：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ３ｍＡｂ２重鎖）
配列番号７４：例示的なＢ７‐Ｈ３ｍＡｂ１／ＣＤ８ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ３ｍＡｂ２軽鎖）
配列番号７５：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（５Ｔ４ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号７６：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（５Ｔ４ｍＡｂ２）‐Ｋコイル）
配列番号７７：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号７８：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号７９：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（５Ｔ４ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号８０：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（５Ｔ４ｍＡｂ２）‐Ｋコイル）
配列番号８１：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ２重鎖）
配列番号８２：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ２軽鎖）
配列番号８３：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＲＯＲ１ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号８４：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＲＯＲ１ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号８５：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号８６：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号８７：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
２三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＲＯＲ１ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号８８：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
２三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＲＯＲ１ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号８９：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
２三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ２重鎖）
配列番号９０：例示的なＲＯＲ１ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
２三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ２軽鎖）
配列番号９１：例示的なＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＨＩＶｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号９２：例示的なＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＨＩＶｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号９３：例示的なＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号９４：例示的なＨＩＶｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号９５：例示的なＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＨＩＶｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号９６：例示的なＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（ＨＩＶｍＡｂ２）‐Ｋコイル）
配列番号９７：例示的なＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号９８：例示的なＨＩＶｍＡｂ２／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号９９：抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗの可変軽鎖ドメイン
配列番号１００：抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗの可変重鎖ドメイン
配列番号１０１：抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔの可変軽鎖ドメイン
配列番号１０２：抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔの可変重鎖ドメイン
配列番号１０３：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（５Ｔ４ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号１０４：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２）‐ＶＨ（５Ｔ４ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号１０５：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号１０６：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２／ＣＤ８ｍＡｂ
１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号１０７：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８
ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（５Ｔ４ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号１０８：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８
ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ）‐ＶＨ（５Ｔ４ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号１０９：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８
ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号１１０：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｌｏｗ／ＣＤ８
ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号１１１：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第１のポリペプチド鎖（ＶＬ（５Ｔ４ｍＡｂ１）‐ＶＨ（ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ）‐Ｅコイル‐（ＣＨ２‐ＣＨ３））
配列番号１１２：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第２のポリペプチド鎖（ＶＬ（ＣＤ３ｍＡｂ２
Ｆａｓｔ）‐ＶＨ（５Ｔ４ｍＡｂ１）‐Ｋコイル）
配列番号１１３：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第３のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１重鎖）
配列番号１１４：例示的な５Ｔ４ｍＡｂ１／ＣＤ３ｍＡｂ２Ｆａｓｔ／ＣＤ８ｍＡｂ１三重特異性結合分子の第４のポリペプチド鎖（ＣＤ８ｍＡｂ１軽鎖）
配列番号１１５：システイン含有Ｅコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１１６：システイン含有Ｋコイルヘテロ二量体促進ドメイン
配列番号１１７：抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ１
配列番号１１８：抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ２
配列番号１１９：抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１の軽鎖可変ドメインのＣＤＲＬ３
配列番号１２０：抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ１
配列番号１２１：抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ２
配列番号１２２：抗ＲＯＲ１ｍＡｂ１の重鎖可変ドメインのＣＤＲＨ３
配列番号１２３：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）
配列番号１２４：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異体
配列番号１２５：連鎖球菌株Ｇ１４８のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）の脱免疫化変異体
配列番号１２６：ペプチドリンカー
配列番号１２７：システイン含有ドメイン
配列番号１２８：ヒトＣＬドメインのシステイン含有変異体部分
配列番号１２９：代替的なシステイン含有リンカーペプチド（「リンカー３」）
配列番号１３０：代替的なシステイン含有リンカーペプチド（「リンカー３」）
配列番号１３１：ペプチドリンカー
配列番号１３２：ペプチドリンカー
配列番号１３３：ヒトＩｇＧヒンジドメインのシステイン含有部分の変異体

Claims

ＣＤ３のエピトープに結合できる結合分子であって、
（Ａ）配列ＲＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮを有するＣＤＲＬ１と、配列ＧＴＮＫＲＡＰを有するＣＤＲＬ２と、及び配列ＡＬＷＹＳＮＬＷＶを有するＣＤＲＬ３とを含む軽鎖可変ドメインと；並びに
（Ｂ）配列ＧＦＴＦＳＴＹＡＭＮを有するＣＤＲＨ１と、配列ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧを有するＣＤＲＨ２と、及び配列ＨＫＮＦＧＮＳＹＶＴＷＦＡＹを有するＣＤＲＨ３とを含む重鎖可変ドメインと
を含み、
前記結合分子は抗体、抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、ＢｉＴｅ又は三重特異性結合分子である、結合分子。
前記軽鎖可変ドメインは配列番号１０１の配列を含み、かつ前記重鎖可変ドメインは配列番号１０２の配列を含む、請求項１に記載の結合分子。
５Ｔ４のエピトープに結合できる結合分子であって、
（Ａ）配列ＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡを有するＣＤＲＬ１と、配列ＲＡＮＲＬＱＳを有するＣＤＲＬ２と、及び配列ＬＱＹＤＤＦＰＷＴを有するＣＤＲＬ３とを含むか；又は
配列ＲＳＳＱＳＩＶＹＳＮＧＮＴＹＬＥを有するＣＤＲＬ１と、配列ＫＶＳＮＲＦＳを有するＣＤＲＬ２と、及び配列ＦＱＧＳＨＶＰＦＴを有するＣＤＲＬ３とを含む軽鎖可変ドメインと；並びに
（Ｂ）配列ＧＹＴＦＴＳＦＷＭＨを有するＣＤＲＨ１と、配列ＲＩＤＰＮＲＧＧＴＥＹＮＥＫＡＫＳを有するＣＤＲＨ２と、及び配列ＧＮＰＹＹＰＭＤＹを有するＣＤＲＨ３とを含むか；又は
配列ＧＹＴＦＴＳＹＷＩＴを有するＣＤＲＨ１と、配列ＤＩＹＰＧＳＧＲＡＮＹＮＥＫＦＫＳを有するＣＤＲＨ２と、及び配列ＹＧＰＬＦＴＴＷＤＰＮＳＹＡＭＤＹを有するＣＤＲＨ３とを含む重鎖可変ドメインと
を含み、
前記結合分子は抗体、抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、ＢｉＴｅ又は三重特異性結合分子である、結合分子。
前記軽鎖可変ドメインは配列番号４７の配列を含み、かつ前記重鎖可変ドメインは配列番号４８の配列を含むか；又は
前記軽鎖可変ドメインは配列番号４９の配列を含み、かつ前記重鎖可変ドメインは配列番号５０の配列を含む、請求項３に記載の結合分子。
ＲＯＲ１のエピトープに結合できる結合分子であって、
（Ａ）配列番号１１７の配列を有するＣＤＲＬ１と、配列番号１１８の配列を有するＣＤＲＬ２と、及び配列番号１１９の配列を有するＣＤＲＬ３とを含む軽鎖可変ドメインと；並びに
（Ｂ）配列番号１２０の配列有するＣＤＲＨ１と、配列番号１２１の配列を有するＣＤＲＨ２と、及び配列番号１２２の配列を有するＣＤＲＨ３とを含む重鎖可変ドメインと
を含み、
前記結合分子は抗体、抗体断片、単鎖抗体、ダイアボディ、ＢｉＴｅ又は三重特異性結合分子である、結合分子。
前記軽鎖可変ドメインは配列番号５１の配列を含み、かつ前記重鎖可変ドメインは配列番号５２の配列を含む、請求項５に記載の結合分子。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子のポリペプチド鎖をエンコードするポリヌクレオチドを含む、核酸組成物。
請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子と、薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤又は希釈剤とを含む、医薬組成物。
薬剤として使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子又は請求項８に記載の組成物。
癌又は病原体感染の治療に使用するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の結合分子又は請求項８に記載の組成物。