CN112384243A - 三价三特异性抗体构建体 - Google Patents

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Abstract

提出了三特异性三价抗体构建体、包含所述构建体的药物组合物及其使用方法。

Description

三价三特异性抗体构建体
1.对相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月17日提交的美国分案申请号62/659,047的权益和对其的优先权。上文引用的申请的全部内容通过引用并入。
2.序列表
本申请包括已经通过EFS-Web提交并且其全部内容通过引用并入本文中的序列表。创建于2019年XX月的所述ASCII拷贝被命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，大小为X,XXX,XXX字节。
3.背景技术
抗体是医学领域中非常宝贵的工具。特别是，单克隆抗体的重要性，包括它们在科学研究和医学诊断中的作用，已经被广泛认可了几十年。然而，抗体的全部潜力，特别是它们作为治疗剂的成功应用，直到最近才得到证实，如被以下成功疗法所证实：阿达木单抗(修美乐(Humira))、利妥昔单抗(美罗华(Rituxan))、英夫利昔单抗(类克(Remicade))、贝伐珠单抗(阿瓦斯汀(Avastin))、曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin))、派姆单抗(Keytruda)和易普利姆玛(Yervoy)。在这些临床成功之后，对抗体疗法的兴趣将只可能继续增加。因此，在研究药物开发和下游临床环境的领域中均存在对抗体的有效产生和制造的需求。
抗体治疗领域的一个活跃研究领域是多特异性抗体(即被工程化以识别多个靶标的单个抗体)的设计和使用。这些抗体提供了更好的治疗控制的希望。例如，存在改善靶特异性以减少与许多抗体疗法相关的脱靶效应的需求，特别是在基于抗体的免疫疗法的情况下。此外，多特异性抗体提供新的治疗策略，例如多种细胞受体的协同靶向，尤其是在免疫疗法背景下。一种这样的免疫疗法是使用双特异性抗体来募集T细胞，以通过T细胞标志物和肿瘤细胞标志物的双特异性结合来靶向并杀死特异性肿瘤细胞群体。例如，在美国公开号2006/0193852中描述了使用CD3xCD19双特异性抗体靶向B细胞淋巴瘤。
尽管多特异性抗体具有前景，但它们的生产和使用受到许多限制其实际实施的限制因素的困扰。通常，所有多特异性抗体平台必须解决确保关联(cognate)重链和轻链对之间的高保真配对的问题。然而，各种平台存在许多问题。例如，抗体链工程化可以导致组装抗体的稳定性不良、抗体链的表达和折叠不良，和/或免疫原性肽产生。其他方法受不切实际的制造过程的困扰，例如复杂的体外组装反应或纯化方法。此外，若干平台受不能容易且有效地插入不同的抗体结合结构域的困扰。与多特异性抗体制造相关的这些各种问题限制了许多平台的适用性，尤其是它们在许多治疗药物管线所必需的高通量筛选中的用途，例如在筛选改善的抗原结合特异性或亲和性中的用途。
因此，存在对能够高水平表达和有效纯化的抗体平台的需求。特别地，存在对改善在研究和治疗背景下均具有直接适用性的多特异性抗体的制造能力的多特异性抗体平台的需求。还存在对特异性结合不同细胞群体(包括肿瘤细胞群体)的改进的多特异性抗体的需求，所述改进的多特异性抗体具有包括增加的亲和性或亲和力、减少的脱靶结合和/或减少的意外免疫激活的改善。
4.发明内容
本文公开的是一种三价三特异性结合分子，其包含：第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、第四多肽链和第五多肽链，其中：(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D、结构域E、结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有可变区结构域氨基酸序列，结构域B具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域N具有可变区结构域氨基酸序列和结构域O具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列和结构域G具有恒定区结构域氨基酸序列氨基酸序列；(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列和K具有恒定区结构域氨基酸序列；(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；(e)所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且其中结构域P具有可变区结构域氨基酸序列和结构域Q具有恒定区结构域氨基酸序列；(f)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；(g)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；(h)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；(i)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；(j)结构域N、结构域A和结构域H的所述氨基酸序列是不同的，(k)所述第二多肽链与所述第五多肽链是相同的且所述第四多肽链是不同的，或者所述第四多肽链与所述第五多肽链是相同的且所述第二多肽链是不同的，并且(l)所述结构域A与所述结构域F之间的所述相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的所述相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，并且所述结构域N与所述结构域P之间的所述相互作用形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
在某些方面中，所述第二多肽链和所述第五多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第五多肽链，结构域O和结构域B的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域I的所述氨基酸序列不同于结构域O和结构域B。
在某些方面中，所述第四多肽链和所述第五多肽链是相同的，并且所述第二多肽链不同于所述第二多肽链和所述第五多肽链，结构域O和结构域I的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域B的所述氨基酸序列不同于结构域O和结构域I。
还在本文中公开的是一种三价三特异性结合分子，其包含：第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、第四多肽链和第六多肽链，其中：(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有可变区结构域氨基酸序列，结构域B具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列和结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列和结构域G具有恒定区结构域氨基酸序列氨基酸序列；(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J、结构域K、结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域R具有可变区结构域氨基酸序列和结构域S具有恒定区结构域氨基酸序列；(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；(e)所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有可变区结构域氨基酸序列和结构域U具有恒定区结构域氨基酸序列；(f)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；(g)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；(h)所述第一多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；(i)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；(j)结构域R、结构域A和结构域H的所述氨基酸序列是不同的；(k)所述第二多肽链与所述第六多肽链是相同的且所述第四多肽链是不同的，或者所述第四多肽链与所述第六多肽链是相同的且所述第二多肽链是不同的；(l)所述结构域A与所述结构域F之间的所述相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的所述相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，并且所述结构域R与所述结构域T之间的所述相互作用形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
在某些方面中，所述第四多肽链和所述第六多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第六多肽链，结构域S和结构域I的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域B的所述氨基酸序列不同于结构域S和结构域I。
在某些方面中，所述第二多肽链和所述第六多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第六多肽链，结构域S和结构域B的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域I的所述氨基酸序列不同于结构域S和结构域B。
还在本文中公开的是一种纯化的结合分子，所述纯化的结合分子包含本文中所述的任何结合分子。在某些方面中，所述结合分子是通过包括CH1亲和纯化步骤的纯化方法纯化的。在某些方面中，所述纯化方法是单步纯化方法。
还在本文中公开的是一种药物组合物，其包含本文中所述的任何结合分子和药学上可接受的稀释剂。
还在本文中公开的是一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本文中所述的任何药物组合物。
5.附图说明
图1显示CH3-CH3 IgG1二聚体对与CH1-CL的比对。四级结构与
Figure BDA0002839770970000061
的RMSD比对。
图2呈现本文中所描述的各种结合分子(也称为抗体构建体)的示意性架构，其具有各自的命名惯例。
图3呈现本文中所描述的二价1x1抗体构建体的多肽链及其结构域的更高分辨率的示意图，其具有各自的命名惯例。
图4显示示例性二价单特异性构建体的架构。
图5显示来自实施例1中描述的生物膜层干涉法(BLI)实验的数据，其中检测了具有图4中所示架构的二价单特异性结合分子[多肽1：VL-CH3(杵)-CH2-CH3/多肽2：VH-CH3(臼)]。抗原结合位点对TNFα具有特异性。来自结合分子固定化和与固定的构建体结合的TNFα的BLI响应证实与抗原的稳健的、特异性的、二价的结合。该数据与具有高百分比的多肽1和多肽2的预期配对的分子一致。
图6说明示例性二价1x1双特异性结合分子“BC1”的特征。
图7A显示“BC1”的尺寸排阻色谱(SEC)分析，其证明单步CH1亲和纯化步骤(CaptureSelectTM CH1亲和树脂)通过凝胶过滤产生单个单分散峰，其中>98％是未聚集的二价蛋白。图7B显示CrossMab二价抗体构建体的SEC分析的比较文献数据[数据来自Schaefer等(Proc Natl Acad Sci USA.2011年7月5日；108(27):11187-92)]。
图8A是使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线，其显示单个陡峰。图8B是使用标准蛋白A纯化的纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线。
图9显示在纯化的各个阶段的“BC1”的非还原性SDS-PAGE凝胶。
图10A和10B比较了单步CH1亲和纯化后的“BC1”在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE凝胶(图10A)与CrossMab双特异性抗体在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE凝胶(如参考文献中所公开的)(图10B)。
图11A和11B显示“BC1”的质谱分析，其证实在还原性条件下两条不同的重链(图11A)和两条不同的轻链(图11B)。
图12呈现纯化的“BC1”在非还原性条件下的质谱分析，其确认纯化后不存在不完全配对。
图13呈现加速稳定性测试数据，其证实“BC1”在40℃下8周内相对于两种IgG对照抗体的稳定性。
图14说明在实施例3中进一步描述的示例性二价1x1双特异性结合分子“BC6”的特征。
图15A呈现使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的“BC6”的尺寸排阻色谱(SEC)分析，其证实单步CH1亲和纯化产生单个单分散峰且不存在非共价聚集体。图15B显示“BC6”在非还原性条件下的SDS-PAGE凝胶。
图16说明在实施例4中进一步描述的示例性二价双特异性结合分子“BC28”的特征。
图17显示在“BC28”、“BC29”、“BC30”、“BC31”和“BC32”的单步CH1亲和纯化后在非还原性条件下的SDS-PAGE分析。
图18显示各自使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂进行一步纯化后的“BC28”和“BC30”的SEC分析。
图19说明实施例5中进一步描述的示例性二价双特异性结合分子“BC44”的特征。
图20A和20B分别显示在加速稳定性测试条件下两种二价结合分子“BC15”和“BC16”的尺寸排阻色谱数据。“BC15”和“BC16”具有不同的可变区-CH3连接。
图21呈现本文中描述的三价2x1抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图22说明在实施例7中进一步描述的示例性三价2x1双特异性结合分子“BC1-2x1”的特征。
图23显示在纯化的各个阶段，使用ThermoFisher Expi293瞬时转染系统表达的“BC1”和“BC1-2x1”蛋白的非还原性SDS-PAGE。
图24使用Octet(Pall ForteBio)生物膜层干涉法分析比较二价1x1构建体“BC1”的亲合力(avidity)与三价2x1构建体“BC1-2x1”的亲合力。
图25显示三价2x1构建体“TB111”的显著特征。
图26呈现本文中描述的三价1x2抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图27说明在实施例10中进一步描述的示例性三价1x2构建体“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”的特征。
图28是SDS-PAGE凝胶，其中显示在非还原性(“-DTT”)和还原性(“+DTT”)条件下的三价1x2构建体“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”构建体的泳道已经用方框标示。
图29显示抗原结合在两种抗体：二价1x1构建体“CTLA4-4 x OX40-8”和三价1x2构建体“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”之间的比较。“CTLA4-4 x OX40-8”单价地结合至CTLA4，而“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”二价地结合至CTLA4。
图30说明在实施例11中进一步描述的示例性三价1x2三特异性构建体“BC28-1x1x1a”的特征。
图31显示瞬时表达和单步CH1亲和树脂纯化后的“BC28-1x1x1a”的尺寸排阻色谱，其展示单个明确界定的峰。
图32显示如实施例12中进一步描述的二价和三价构建体各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE结果。
图33A-33C显示对3种抗原：PD1、抗原“A”和CTLA4的Octet结合分析。如在实施例13中进一步描述的，图33A显示“BC1”与PD1和抗原“A”的结合；图33B显示二价双特异性构建体“CTLA4-4 x OX40-8”与CTLA4、抗原“A”和PD1的结合；图33C显示三价三特异性“BC28-1x1x1a”与PD1、抗原“A”和CTLA4的结合。
图34呈现本文中描述的某些四价2x2构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图35说明在实施例14中进一步描述的示例性四价2x2构建体“BC22-2x2”的某些显著特征。
图36是非还原性SDS-PAGE凝胶，其对在纯化的不同阶段的2x2四价“BC22-2x2”构建体与1x2三价构建体“BC12-1x2”和2x1三价构建体“BC21-2x1”进行比较。
图37提供示例性四价2x2构建体的架构。
图38呈现本文中描述的某些四价构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图39提供双特异性四价构建体的示例性架构。
图40提供使用共同轻链策略的三特异性四价构建体的示例性架构。
图41显示如图39中示意的四价构建体的双特异性抗原接合，其证实该构建体能够进行同时接合。来自B-Body固定化和与固定的构建体结合的TNFα的生物膜层干涉法(BLI)响应与具有高百分比的预期链配对的分子一致。
图42提供结合至细胞表面抗原的B-Body的流式细胞术分析。交叉阴影线信号表示没有抗原的细胞；点信号表示具有表面抗原的瞬时转染细胞。
图43提供三价构建体的示例性架构。
图44提供三价构建体的示例性架构。
图45显示如实施例17中进一步描述的二价和三价构建体各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE结果。
图46显示为评估连接变体的配对稳定性而测量的“BC24jv”、“BC26jv”和“BC28jv”的热转变的差异。
图47显示用于确定针对非诱变的SP34-89单价B-Body的对CD3的结合亲和性的两倍连续稀释液(200-12.5nM)的Octet(Pall ForteBio)生物膜层干涉法分析。
图48显示双特异性抗体的SDS-PAGE分析，所述双特异性抗体包含引入CH3结构域中的标准杵臼正交突变，发现所述CH3结构域位于它们在双特异性抗体Fc部分内的天然位置，所述双特异性抗体已通过使用单步CH1亲和性化步骤(CaptureSelectTMCH1亲和树脂)被纯化。
图49显示了Octet(Pall ForteBio)生物膜层干涉法分析，其表明FcγRIa结合至曲妥珠单抗(图49A“WT IgG1”)，但不结合至sFc10(图49B)。
图50显示在ADCC测定中检测的曲妥珠单抗(赫赛汀，“WT-IgG1”)的杀伤作用，而不是Fc变体的杀伤作用。
图51显示在C1q ELISA中检测的C1q与曲妥珠单抗(赫赛汀，“WT-IgG1”)结合，而不是与Fc变体结合。
图52呈现本文中描述的一系列三价三特异性2x1抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图53呈现本文中描述的一系列三价三特异性2x1抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图54呈现本文中描述的一系列三价三特异性1x2抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图55呈现本文中描述的一系列三价三特异性1x2抗体构建体的多肽链及其结构域的示意图，其具有各自的命名惯例。
图56显示对与OX40-13 VH结构域配对的VL结构域的Octet结合分析，所述VL结构域具有图56A中所示的非关联VL结构域1-12和21-24，图56B中所示的非关联VL结构域25-40，和图56C中所示的非关联VL结构域14-20和关联VL结构域VL13。
附图仅出于说明的目的而描述本发明的各种实施方式。本领域技术人员将从以下讨论中容易地认识到可以采用本文中说明的结构和方法的替代实施方式而不偏离本文中描述的本发明的原理。
6.具体实施方式
6.1.定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文中所用，以下术语具有下文所赋予的含义。
“抗原结合位点”指特异性识别或结合至给定抗原或表位的三价三特异性结合分子的区域。
如本文中所用并参考图3，“B-Body”是指包含第一多肽链和第二多肽链的特征的结合分子，其中：(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且其中结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列和结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有VH氨基酸序列和结构域G具有CH3氨基酸序列；并且(c)所述第一多肽和所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。在国际专利申请号PCT/US2017/057268中更加详细地描述了B-body，其全部内容通过引用并入本文中。
如本文中所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性治疗(therapeutic treatment)和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施两者，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或紊乱，例如多发性硬化、关节炎或癌症的进展。无论是可检测的还是不可检测的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状的缓和、疾病程度的降低、稳定的(即不恶化的)疾病状态、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻，和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还可以是指与如果不接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些人包括已经具有所述状况或紊乱的那些人以及易于具有所述状况或紊乱的那些人或者其中待预防所述状况或紊乱的那些人。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指对其而言，诊断、预后或治疗(therapy)是期望的任何受试者(特别是哺乳动物受试者)。哺乳动物受试者包括人,家畜,农场动物和动物园、运动或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。
术语“足够量”是指足以产生期望效果的量，例如足以调节细胞内蛋白聚集的量。
术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为预防可以被认为是治疗。
6.2.其他解释性惯例
除非另有说明，本文中提到序列均是提到氨基酸序列。
除非另有说明，抗体恒定区残基编号是根据如在www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html#refs(2017年8月22日访问)处和在Edelman等，Proc.Natl.Acad.USA,63:78-85(1969)中描述的Eu索引(其全部内容通过引用并入本文中)，并且根据其在内源恒定区序列中的位置识别残基，而不管残基在本文中所述的三价三特异性结合分子的链内的物理位置。“内源序列”或“天然序列”是指任何序列，包括核酸和氨基酸序列两者，其源自生物体、组织或细胞，并且未经人工修饰或突变。
多肽链编号(例如“第一”多肽链、“第二”多肽链等，或多肽“链1”、“链2”等)在本文中用作形成结合分子的特定多肽链的唯一标识符，并且并非旨在表示结合分子内不同多肽链的顺序或数量。
在本公开中，“包含/包括(comprises/comprising)”、“含有(containing)”、“具有(having)”、“包含/包括(includes/including)”及其语言变体具有在美国专利法中赋予它们的含义，其允许超出明确记载的那些组分的另外组分的存在。
本文中提供的范围被理解为是在所述范围内的所有值的简写，包括所记载的端点。例如，1至50的范围被理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50组成的组的任意数字、数字组合或子范围。
除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文中所用，术语“或(or)”被理解为是包括性的。除非特别说明或从上下文中显而易见，如本文种所用，术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”被理解为单数或复数。
除非特别说明或从上下文显而易见，本文中使用的术语“约”被理解为处于本领域的正常容忍范围内，例如在平均值的2个标准偏差内。“约”可以被理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从上下文是清楚的，本文种提供的所有数值均由术语“约”修饰。
6.3.三价三特异性结合分子
在第一个方面中，提供了三价三特异性结合分子。三价三特异性结合分子具有三个抗原结合位点，其中所述ABS共同具有三个识别特异性，因此被称为“三价三特异性”。
6.3.1.三价三特异性2x1抗体架构
参考图21，在各种三价实施方式中，三价三特异性结合分子包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、第四多肽链和第五多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D、结构域E、结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有可变区结构域氨基酸序列，结构域B具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域N具有可变区结构域氨基酸序列和结构域O具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列和结构域G具有恒定区结构域氨基酸序列氨基酸序列；
(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列和K具有恒定区结构域氨基酸序列；
(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；
(e)所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且其中结构域P具有可变区结构域氨基酸序列和结构域Q具有恒定区结构域氨基酸序列，
(f)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；
(g)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；
(h)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(i)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(j)结构域N、结构域A和结构域H的所述氨基酸序列是不同的，
(k)所述第二多肽链与所述第五多肽链是相同的且所述第四多肽链是不同的，或者所述第四多肽链与所述第五多肽链是相同的且所述第二多肽链是不同的；并且
(l)所述结构域A与所述结构域F之间的所述相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的所述相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，并且所述结构域N与所述结构域P之间的所述相互作用形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
如图2中所示意，这些三价实施方式被称为“2x1”三价构建体。
参考图52，在某些实施方式中，所述第二多肽链和所述第五多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第五多肽链，结构域O和结构域B的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域I的所述氨基酸序列不同于结构域O和结构域B。
参考图53，在某些实施方式中，所述第四多肽链和所述第五多肽链是相同的，并且所述第二多肽链不同于所述第二多肽链和所述第五多肽链，结构域O和结构域I的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域B的所述氨基酸序列不同于结构域O和结构域I。
在各种实施方式中，所述结构域O通过肽接头连接至结构域A。在各种实施方式中，所述结构域S通过肽接头连接至结构域H。在一个优选的实施方式中，将结构域O连接至结构域A或者将结构域S连接至结构域H的肽接头是如在第6.3.20.6节中更详细描述的6个氨基酸的GSGSGS肽序列。
6.3.2.三价三特异性1x2抗体架构
参考图26，在各种三价实施方式中，三价三特异性结合分子包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、第四多肽链和第六多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有可变区结构域氨基酸序列，结构域B具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列和结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，
其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列和结构域G具有恒定区结构域氨基酸序列氨基酸序列；
(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J、结构域K、结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域R具有可变区结构域氨基酸序列和结构域S具有恒定区结构域氨基酸序列；
(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；
(e)所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有可变区结构域氨基酸序列和结构域U具有恒定区结构域氨基酸序列，
(f)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；
(g)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；
(h)所述第一多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(i)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(j)结构域R、结构域A和结构域H的所述氨基酸序列是不同的，
(k)所述第二多肽链与所述第六多肽链是相同的且所述第四多肽链是不同的，或者所述第四多肽链与所述第六多肽链是相同的且所述第二多肽链是不同的，并且
(l)所述结构域A与所述结构域F之间的所述相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，所述结构域H与所述结构域L之间的所述相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，并且所述结构域R与所述结构域T之间的所述相互作用形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
如图2中所示意，这些三价实施方式被称为“1x2”三价构建体。
参考图54，在某些实施方式中，所述第四多肽链和所述第六多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第六多肽链，结构域S和结构域I的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域B的所述氨基酸序列不同于结构域S和结构域I。
参考图55，在某些实施方式中，所述第二多肽链和所述第六多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第六多肽链，结构域S和结构域B的所述氨基酸序列是相同的，并且结构域I的所述氨基酸序列不同于结构域S和结构域B。
在各种实施方式中，所述结构域O通过肽接头连接至结构域A。在各种实施方式中，所述结构域S通过肽接头连接至结构域H。在一个优选的实施方式中，将结构域O连接至结构域A或者将结构域S连接至结构域H的肽接头是如在第6.3.20.6节中更详细描述的6个氨基酸的GSGSGS肽序列。
6.3.3.结构域A(可变区)
在三价三特异性结合分子中，结构域A具有可变区结构域氨基酸序列。如本文中所述，可变区结构域氨基酸序列是包含VL和VH抗体结构域序列的抗体的可变区结构域氨基酸序列。分别在下述第6.3.3.1节和第6.3.3.4节中更详细地描述了VL和VH序列。在一个优选的实施方式中，结构域A具有VL抗体结构域序列和结构域F具有VH抗体结构域序列。
6.3.3.1.VL区
在本文中所述的三价三特异性结合分子中有用的VL氨基酸序列是抗体轻链可变结构域序列。在本文中所述的天然抗体和抗体构建体两者中的典型排布中，特定的VL氨基酸序列与特定的VH氨基酸序列相关联以形成抗原结合位点。在各种实施方式中，VL氨基酸序列是哺乳动物序列，包括如下文第6.3.3.2节和第6.3.3.3节中进一步详细描述的人序列，合成序列，或者人、非人哺乳动物、哺乳动物和/或合成序列的组合。
在各种实施方式中，VL氨基酸序列是天然存在序列的突变序列。在某些实施方式中，VL氨基酸序列是lambda(λ)轻链可变结构域序列。在某些实施方式中，VL氨基酸序列是kappa(κ)轻链可变结构域序列。在一个优选的实施方式中，VL氨基酸序列是kappa(κ)轻链可变结构域序列。
在本文中所述的三价三特异性结合分子中，结构域A的C端被连接至结构域B的N端。在某些实施方式中，结构域A具有VL氨基酸序列，所述VL氨基酸序列，如下文第6.3.20.1节和实施例6中更详细地描述，在其C端处在结构域A与结构域B之间的连接处突变。
6.3.3.2.互补决定区
VL氨基酸序列包含称为“互补决定区”(CDR)的高度可变序列，通常是三个CDR(CDR1、CD2和CDR3)。在各种实施方式中，CDR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，CDR是人序列。在各种实施方式中，CDR是天然存在的序列。在各种实施方式中，CDR是已经突变以改变抗原结合位点对特定抗原或表位的结合亲和性的天然存在的序列。在某些实施方式中，天然存在的CDR已经通过亲和性成熟和体细胞超突变在体内宿主中突变。在某些实施方式中，CDR已经通过包括但不限于PCR诱变和化学诱变的方法在体外突变。在各种实施方式中，CDR是合成序列，包括但不限于从随机序列CDR文库和合理设计的CDR文库获得的CDR。
6.3.3.3.框架区和CDR移植
VL氨基酸序列包含“框架区”(FR)序列。FR通常是充当分散的CDR的骨架的保守序列区(参见第6.3.3.2.节)，通常为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4排列(从N端到C端)。在各种实施方式中，FR是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，FR是人序列。在各种实施方式中，FR是天然存在的序列。在各种实施方式中，FR是合成序列，包括但不限于合理设计的序列。
在各种实施方式中，FR和CDR均来自同一天然存在的可变结构域序列。在各种实施方式中，FR和CDR来自不同的可变结构域序列，其中CDR被移植到FR骨架上，CDR提供对特定抗原的特异性。在某些实施方式中，移植的CDR均来源于相同的天然存在的可变结构域序列。在某些实施方式中，移植的CDR来源于不同的可变结构域序列。在某些实施方式中，移植的CDR是合成序列，包括但不限于从随机序列CDR文库和合理设计CDR文库获得的CDR。在某些实施方式中，移植的CDR和FR来自相同的物种。在某些实施方式中，移植的CDR和FR来自不同的物种。在优选的移植CDR实施方式中，抗体是“人源化的”，其中移植的CDR是非人哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴和山羊序列，并且FR是人序列。在美国专利号6,407,213中更详细地讨论了人源化抗体，其全部内容通过引入并入本文中。在各种实施方式中，来自一个物种的FR的部分或特定序列被用于替换另一物种的FR的部分或特定序列。
6.3.3.4.VH区
在本文所述的三价三特异性结合分子中，VH氨基酸序列是抗体重链可变结构域序列。在本文所述的天然和三价三特异性结合分子两者的典型抗体排布中，特定的VH氨基酸序列与特定的VL氨基酸序列相关联以形成抗原结合位点。在各种实施方式中，VH氨基酸序列是哺乳动物序列，包括人序列，合成序列，或者非人哺乳动物、哺乳动物和/或合成序列的组合(如上文第6.3.3.2节和第6.3.3.3节中进一步详细描述的)。在各种实施方式中，VH氨基酸序列是天然存在的序列的突变序列。
6.3.4.结构域B(恒定区)
在三价三特异性结合分子中，结构域B具有恒定区结构域序列。如本文所描述，恒定区结构域氨基酸序列是抗体恒定区结构域的序列。
在各种实施方式中，恒定区序列是哺乳动物序列，包括但不限于，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，恒定区序列是人序列。在某些实施方式中，恒定区序列来自抗体轻链。在特定实施方式中，恒定区序列来自λ或κ轻链。在某些实施方式中，恒定区序列来自抗体重链。在特定实施方式中，恒定区序列是IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型的抗体重链序列。在一个特异性实施方式中，恒定区序列来自IgG同种型。在一个优选的实施方式中，恒定区序列来自IgG1同种型。在优选的特异性实施方式中，恒定区序列是CH3序列。在下文第6.3.4.1节中更详细地描述了CH3序列。在其他优选实施方式中，恒定区序列是直系同源CH2序列。在下文第6.3.4.2节中更详细地描述了直系同源CH2序列。
在特定实施方式中，恒定区序列已被突变以包含一个或多个正交突变。在一个优选的实施方式中，结构域B具有恒定区序列，所述恒定区序列为CH3序列，所述CH3序列包含杵-臼(knob-hole)(同义地，“杵在臼中(knob-in-hole)”，“KIH”)正交突变(如下文第6.3.16.2节中更详细地描述)和S354C或Y349C突变，所述S354C或Y349C突变与含有正交突变的CH3结构域形成工程化二硫桥(如下文第6.3.16.1节中更详细地描述)。在一些优选的实施方式中，杵臼正交突变是T366W突变。
6.3.4.1.CH3区
如本文所述，CH3氨基酸序列是抗体重链C端结构域的序列。
在各种实施方式中，CH3序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，CH3序列是人序列。在某些实施方式中，CH3序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4同种型或CH4序列来自IgE或IgM同种型。在一个特异性实施方式中，CH3序列来自IgG同种型。在一个优选的实施方式中，CH3序列来自IgG1同种型。在一些实施方式中，CH3序列来自IgA同种型。
在某些实施方式中，CH3序列是内源序列。在特定实施方式中，CH3序列是UniProt登录号P01857氨基酸224-330。在各种实施方式中，CH3序列是内源CH3序列的区段。在特定实施方式中，CH3序列具有缺乏N端氨基酸G224和Q225的内源CH3序列。在特定实施方式中，CH3序列具有缺乏C端氨基酸P328、G329和K330的内源CH3序列。在特定实施方式中，CH3序列具有缺乏N端氨基酸G224和Q225以及C端氨基酸P328、G329和K330两者的内源CH3序列。在优选的实施方式中，三价三特异性结合分子具有有带CH3序列的多个结构域，其中CH3序列可以指全内源CH3序列以及缺乏N端氨基酸、C端氨基酸或者这两者的CH3序列。
在某些实施方式中，CH3序列是具有一个或多个突变的内源序列。在特定实施方式中，突变是一个或多个正交突变，其被引入内源CH3序列中以指导特定CH3序列的特异性配对(如下文第6.3.16.1-6.3.16.4节中更详细地描述的)。
在某些实施方式中，通过将具有一种同种异型(allotype)的特定氨基酸替换为具有另外的同种异型的氨基酸，CH3序列被工程化以减少抗体的免疫原性，其在本文中被称为同族同种异型(isoallotype)突变(如Stickler等(Genes Immun.2011Apr；12(3):213–221)中更详细地描述(其所教导的全部内容通过引用并入本文中))。在特定实施方式中，替换G1m1同种异型的特定氨基酸。在一个优选的实施方式中，在CH3序列中作出同族同种异型突变D356E和L358M。
在一个优选的实施方式中，结构域B具有人IgG1 CH3氨基酸序列，其含有如下突变变化：P343V；Y349C；和三肽插入(445P、446G、447K)。在其他优选实施方式中，结构域B具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：T366K；和三肽插入(445K、446S、447C)。在其他优选实施方式中，结构域B具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：Y349C；和三肽插入(445P、446G、447K)。
在某些实施方式中，结构域B具有447C突变被引入否则为内源性的CH3序列的人IgG1 CH3序列。
在本文所述的三价三特异性结合分子中，结构域B的N端与结构域A的C端连接。在某些实施方式中，结构域B具有CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列在其N端处在结构域A和结构域B之间的连接处被突变，如下文第6.3.20.1节和实施例6中更详细地描述。
在三价三特异性结合分子中，结构域B的C端与结构域D的N端连接。在某些实施方式中，结构域B具有CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列在C端处在结构域B与结构域D之间的连接处延伸，如下文第6.3.20.3节中更详细地描述。
在一些实施方式中，结构域B包含人IgA CH3序列。在第6.3.16.4节中更详细地描述了CH3同种型取代。示例性人IgA CH3氨基酸序列是：
TFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRL(SEQ ID NO:84)
6.3.4.2.直系同源CH2区
如本文所述，CH2氨基酸序列是按照从N端到C端，CH2氨基酸序列是抗体重链第三结构域的序列。在通常情况下，将在下述第6.3.5节中更详细地讨论CH2氨基酸序列。在一系列实施方式中，三价三特异性结合分子具有一对以上成对的具有CH2序列的CH2结构域组，其中第一组具有来自第一同种型的CH2氨基酸序列和一个或多个来自另一同种型的CH2氨基酸序列的直系同源组。如本文所述，直系同源CH2氨基酸序列能够与来自共享同种型的CH2氨基酸序列相互作用，但不能与存在于三价三分子结合分子中的另一同种型的CH2氨基酸序列显着相互作用。在特定实施方式中，所述CH2氨基酸序列的组均来自同一物种。在优选的实施方式中，所有CH2氨基酸序列的组是人CH2氨基酸序列。在其他实施方式中，CH2氨基酸序列的组来自不同物种。在特定实施方式中，第一组CH2氨基酸序列与在三价三特异性结合分子中的其他非CH2结构域来自同一同种型。在一个特异性实施方式中，第一组具有来自IgG同种型的CH2氨基酸序列和一个或多个直系同源组具有来自IgM或IgE同种型的CH2氨基酸序列。在某些实施方式中，一个或多个CH2氨基酸序列的组是内源CH2序列。在其他实施方式中，一个或多个CH2氨基酸序列的组是具有一个或多个突变的内源CH2序列。在特定实施方式中，一个或多个突变是正交杵臼突变、正交电荷对突变或正交疏水突变。在国际PCT申请WO2017/011342和WO2017/106462中更详细地描述了用于三价三特异性结合分子的直系同源CH2氨基酸序列，其全部内容通过引用并入本文中。
6.3.5.结构域D(恒定区)
在本文所述的三价三特异性结合分子中，结构域D具有恒定区氨基酸序列。在第6.3.4节中更详细地描述了恒定区氨基酸序列。
在优选的一系列实施方式中，结构域D具有CH2氨基酸序列。如本文所述，CH2氨基酸序列是天然抗体重链的第三结构域的CH2氨基酸序列(依据从N端到C端的参照)。在各种实施方式中，CH2序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，CH2序列是人序列。在某些实施方式中，CH2序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在一个优选的实施方式中，CH2序列来自IgG1同种型。
在某些实施方式中，CH2序列是内源序列。在特定实施方式中，序列是UniProt登录号P01857氨基酸111-223。在一个优选的实施方式中，CH2序列具有将N端可变结构域-恒定结构域区段连接至CH2结构域的N端铰链区肽，如在下述第6.3.20.3节中更详细地描述的。
在三价三特异性结合分子中，结构域D的N端连接至结构域B的C端。在某些实施方式中，结构域B具有CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列在C端处的结构域B与结构域D之间的连接处延伸(如下文第6.3.20.3节中更详细地描述的)。
6.3.6.结构域E(恒定区)
在三价三特异性结合分子中，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列。在第6.3.4节中更详细地描述了恒定区氨基酸序列。
在某些实施方式中，恒定区序列是CH3序列。在上述第6.3.4.1节中更详细地描述了CH3序列。在特定实施方式中，恒定区序列已被突变以包含一个或多个正交突变。在一个优选的实施方式中，结构域E具有恒定区序列，所述恒定区序列为CH3序列，所述CH3序列包含杵-臼(knob-hole)(同义地，“杵在臼中(knob-in-hole)”，“KIH”)正交突变(如下文第6.3.16.2节中更详细地描述)和S354C或Y349C突变，所述S354C或Y349C突变与含有正交突变的CH3结构域形成工程化二硫桥(如下文第6.3.16.1节中更详细地描述)。在一些优选实施方式中，杵臼正交突变是T366W突变。
在某些实施方式中，恒定区结构域序列是CH1序列。在特定实施方式中，结构域E的CH1氨基酸序列仅是在三价三特异性结合分子中的CH1氨基酸序列。在某些实施方式中，CH1结构域的N端连接至CH2结构域的C端，如在下文第6.3.20.5节中更详细地描述的。在某些实施方式中，恒定区序列是CL序列。在某些实施方式中，CL结构域的N端连接至CH2结构域的C端，如在下文第6.3.20.5节中更加详细地描述的。在第6.3.10.1节中更详细地描述了CH1和CL序列。
6.3.7.结构域F(可变区)
在三价三特异性结合分子中，结构域F具有可变区结构域氨基酸序列。如在第6.3.1节中更详细地讨论的，可变区结构域氨基酸序列是包含VL和VH抗体结构域序列的抗体的可变区结构域氨基酸序列。在上文第6.3.3.1节和第6.3.3.4节中分别更详细地描述了VL和VH序列。在一个优选的实施方式中，结构域F具有VH抗体结构域序列。
6.3.8.结构域G(恒定区)
在三价三特异性结合分子中，结构域G具有恒定区氨基酸序列。在第6.3.4节中更详细地描述了恒定区氨基酸序列。
在优选的特异性实施方式中，恒定区序列是CH3序列。在下文第6.3.4.1节中更详细地描述了CH3序列。在其他优选实施方式中，恒定区序列是直系同源CH2序列。在下文第6.3.4.2节中更详细地描述了直系同源CH2序列。
在某些优选的实施方式中，结构域G具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：S354C；和三肽插入，445P、446G、447K。在一些优选的实施方式中，结构域G具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：S354C；和445P、446G、447K三肽插入。在一些优选的实施方式中，结构域G具有人IgG1 CH3序列，其含有如下突变变化：L351D，和445G、446E、447C的三肽插入。
6.3.9.结构域H(可变区)
在三价三特异性结合分子中，结构域L具有可变区结构域氨基酸序列。如在第6.3.1节中更详细地讨论的，可变区结构域氨基酸序列是包含VL和VH抗体结构域序列的抗体的可变区氨基酸序列。在上文第6.3.3.1节和第6.3.3.4节中分别更详细地讨论了VL和VH序列。在一个优选的实施方式中，结构域H具有VL抗体结构域序列。
6.3.10.结构域I(恒定区)
在三价三特异性结合分子中，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列。在第6.3.4节中更详细地描述了恒定区结构域氨基酸序列。在三价三特异性结合分子的一系列优选实施方式中，结构域I具有CL氨基酸序列。在另一系列实施方式中，结构域I具有CH1氨基酸序列。在第6.3.10.1节中更详细地描述了CH1和CL氨基酸序列。
6.3.10.1.CH1和CL区
如本文所述，CH1氨基酸序列是按照从N端到C端，抗体重链第二结构域的序列。在某些实施方式中，CH1序列是内源序列。在各种实施方式中，CH1序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，CH1序列是人序列。在某些实施方式中，CH1序列来自IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM同种型。在一个优选的实施方式中，CH1序列来自IgG1同种型。在优选的实施方式中，CH1序列是UniProt登录号P01857氨基酸1-98。
在本文所述的三价三特异性抗体结合分子中使用的CL氨基酸序列是抗体轻链恒定结构域序列。在某些实施方式中，CL序列是内源序列。在各种实施方式中，CL序列是哺乳动物序列，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、骆驼、驴、山羊和人序列。在一个优选的实施方式中，CL序列是人序列。
在某些实施方式中，CL氨基酸序列是lambda(λ)轻链恒定结构域序列。在特定实施方式中，CL氨基酸序列是人λ轻链恒定结构域序列。在优选的实施方式中，lambda(λ)轻链序列是UniProt登录号P0CG04。
在某些实施方式中，CL氨基酸序列是kappa(κ)轻链恒定结构域序列。在一个优选的实施方式中，CL氨基酸序列是人kappa(κ)轻链恒定结构域序列。在一个优选的实施方式中，κ轻链序列是UniProt登录号P01834。
在某些实施方式中，CH1序列和CL序列均是内源序列。在某些实施方式中，CH1序列和CL序列分别在内源CH1和CL序列中分别包含正交修饰(如在下文第6.3.10.2节中更详细地讨论的)。应当理解的是，在CH1序列中的正交突变不能消除CH1结合试剂与CH1结构域之间的特异性结合相互作用。然而，在一些实施方式中，正交突变可以减少但不消除特异性结合相互作用。CH1和CL序列也可以是其内源性或修饰序列的一部分，这样具有CH1序列或其一部分的结构域能够与具有CH1序列或其一部分的结构域关联。此外，具有上述CH1序列一部分的三价三特异性结合分子能够与CH1结合试剂结合。
不希望受到理论的束缚，CH1结构域的独特之处还在于其折叠通常是IgG分泌中的限速步骤(Feige等，Mol Cell.2009年6月12日；34(5):569-79；其全部内容通过引用并入本文中)。因而，基于包含CH1的多肽链的限速组分纯化三价三特异性结合分子可以提供从不完整链中纯化出完整复合物的方法(例如，从仅具有一个或多个不包含CH1的链的复合物中纯化具有限制性CH1结构域的复合物)。
如所讨论的，尽管CH1限制表达可能在某些方面是有益的，但CH1仍有可能限制完整三特异性三价结合分子的总体表达。因而，在某些实施方式中，调节包含CH1序列的多肽链的表达，以提高形成完整复合物的三价三特异性结合分子的效率。在一个说明性实例中，相对于构建用于表达其他多肽链的质粒载体，可以提高构建用于表达包含一个或多个CH1序列的多肽链的质粒载体的比率。在另一个说明性实例中，与包含一个或多个CL序列的多肽相比，包含一个或多个CH1序列的多肽链可以是两条多肽链中较小的。在另一个特异性实施方式中，通过控制哪个多肽链具有一个或多个CH1序列，可以调节包含一个或多个CH1序列的多肽链的表达。例如，工程化三价三特异性结合分子，以使得CH1结构域存在于两结构域多肽链中(例如本文所述的第四多肽链)，而非四结构域多肽链中CH1序列的天然位置(例如本文所述的第三多肽链)。可以将所述工程化用于控制包含一个或多个CH1序列的多肽的表达。然而，在其他方面中，与其他链相比，含CH1的链的相对表达水平过高会导致具有CH1链而不是每个其他链的不完整复合物。因而，在某些实施方式中，调节包含一条或多条CH1序列的多肽链的表达，以减少不含CH1链的不完整复合物的形成，并减少含CH1链但不含在完整复合物中存在的其他链的不完整复合物的形成。
6.3.10.2.CH1和CL正交修饰
在某些实施方式中，CH1序列和CL序列分别在内源CH1和CL序列中分别包含正交修饰。
如本文所描述的“正交修饰”或同义“正交突变”是抗体结构域的氨基酸序列中的一个或多个工程化突变，与缺乏正交修饰的第一结构域和第二结构域的结合相比，其改变具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合的亲和性。在一些实施方式中，与不存在正交修饰的第一结构域和第二结构域的结合相比，正交修饰降低了具有正交修饰的第一结构域与具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和性。在优选的实施方式中，与不存在正交修饰的第一结构域和第二结构域的结合相比，正交修饰增加了具有正交修饰的第一结构域与具有互补正交修饰的第二结构域的结合亲和性。在某些优选的实施方式中，正交修饰降低了具有正交修饰的结构域对缺乏互补正交修饰的结构域的亲和性。
在某些实施方式中，正交突变是在内源抗体结构域序列中的突变。在各种实施方式中，正交修饰是内源抗体结构域序列的N端或C端修饰，包括但不限于添加或缺失氨基酸。在特定实施方式中，正交修饰包括但不限于工程化二硫桥、杵在臼中突变和电荷对突变(如在下文中更详细描述的)。在特定实施方式中，正交修饰包括正交修饰的组合，所述正交修饰选自但不限于工程化硫桥、杵在臼中突变和电荷对突变。在特定实施方式中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸置换组合，例如同族同种异型突变(如在第6.3.4.1节中更详细地描述的)。
在某些实施方式中，CH1/CL对的CH1序列和CL序列分别在内源CH1和CL序列中分别包含正交修饰。在其他实施方式中，CH1/CL对的一个序列包含至少一个修饰，而CH1/CL对的另一序列在各自正交的氨基酸位置中不包含修饰。
CH1/CL正交修饰可能通过CH1结构域中的修饰残基与CL结构域中对应的修饰或未修饰残基之间的相互作用影响CH1/CL结构域配对。
应当理解的是，在CH1序列中的正交突变不能消除CH1结合试剂与CH1结构域之间的特异性结合相互作用。然而，在一些实施方式中，正交突变可以减少但不消除特异性结合相互作用。CH1和CL序列也可以是其内源性或修饰序列的一部分，这样具有CH1序列或其一部分的结构域能够与具有CH1序列或其一部分的结构域关联。此外，具有本文所述的CH1序列的一部分的结合分子可以与CH1结合试剂结合。
示例性CH1/CL正交修饰：工程化的二硫桥
CH1/CL正交修饰的一些实施方式包含在CH1和CL中的工程化半胱氨酸之间的工程化二硫桥。此类工程化二硫桥可以稳定包含修饰的CH1的多肽与包含相应修饰的CL的多肽之间的相互作用。
仅以举例的方式，包含工程化二硫桥的正交CH1/CL修饰可以包含在位置128、129、138、141、168或171(通过EU索引编号)处具有工程化半胱氨酸的CH1结构域。仅以举例的方式，包含工程化二硫桥的此类正交CH1/CL修饰还可以包含在位置116、118、119、164、162或210(通过EU索引编号)处具有工程化半胱氨酸的CL结构域。
例如，CH1/CL正交修饰可以选自CH1序列的位置138和CL序列的位置116处，CH1序列的位置128和CL序列的位置119处或CH1序列的位置129和CL序列的位置210处的工程化半胱氨酸(如在美国专利号8,053,562和美国专利号9,527,927中编号和更详细讨论的，其全部内容分别通过引用并入本文中)。在一些实施方式中，CH1/CL正交修饰包含CH1序列的位置141和CL序列的位置118处的工程化半胱氨酸，其通过EU索引编号。
在一些实施方式中，CH1/CL正交修饰包含CH1序列的位置168和CL序列的位置164处的工程化半胱氨酸，其通过EU索引编号。在一些实施方式中，CH1/CL正交修饰包含CH1序列的位置128和CL序列的位置118处的工程化半胱氨酸，其通过EU索引编号。在一些实施方式中，CH1/CL正交修饰包含CH1序列的位置171和CL序列的位置162处的工程化半胱氨酸，其通过EU索引编号。在一些实施方式中，CL序列是CL-λ序列。在优选的实施方式中，CL序列是CL-κ序列。在一些实施方式中，工程化的半胱氨酸在CH1序列的位置128和CLκ序列的位置118处，通过EU索引编号。
下表8提供了示例性CH1/CL正交修饰，其包含在CH1与CL之间的根据EU索引编号的工程化二硫桥。
Figure BDA0002839770970000311
在一系列优选实施方式中，提供非内源(工程化)半胱氨酸氨基酸的突变是如EU索引编号的CL序列中的F118C和CH1序列中对应的A141C，或CL序列中的F118C突变和CH1序列中对应的T164C，或CL序列中的T164C突变和CH1序列中对应的H168C突变，或CL序列中的S162C突变和CH1序列中对应的P171C突变。
CH1/CL正交修饰：电荷对突变
在各种实施方式中，CL序列和CH1序列中的正交突变是电荷对突变。如本文中所用，电荷对突变是影响结构域表面的氨基酸的取代，所述取代使得所述结构域优选地与具有互补电荷对突变的结构域相关联(相对于与没有互补电荷对突变的结构域相关联)。在某些实施方式中，电荷对突变改善了特定结构域之间的正交关联。在美国专利号8,592,562、美国专利号9,248,182和美国专利号9,358,286中更加详细地描述了电荷对突变，其各自所教导的内容均通过引用并入本文中。在某些实施方式中，电荷对突变改善特定结构域之间的稳定性。在特异性实施方式中，电荷对突变是CL序列中的F118S、F118A或F118V突变和CH1序列中对应的A141L，或CL序列中的T129R突变和CH1序列中对应的K147D，所述突变根据Eu索引编号并在Bonisch等(Protein Engineering,Design&Selection,2017,pp.1–12)中更加详细地描述，其所教导的内容通过引用并入本文中。
在一些情况下，CH1/CL电荷对突变是CL序列中的N138K突变和CH1序列中对应的G166D，或CL序列中的N138D突变和CH1序列中对应地G166K，所述突变通过Eu索引编号。在一些实施方式中，电荷对突变是CH1序列中的P127E突变和对应的Cl序列中的对应的E123K突变。在一些实施方式中，电荷对突变是CH1序列中的P127K突变和对应的CL序列中对应的E123(未突变)。
下表9提供了示例性CH1/CL正交电荷对修饰。
Figure BDA0002839770970000321
6.3.10.3.CH1/CL正交修饰的组合
在某些实施方式中，单个CH1/CL对的CH1和CL结构域分别在内源CH1和CL序列中包含两个或更多个分别正交的修饰。例如，CH1和CL序列可以在内源CH1和CL序列中含有第一正交修饰和第二正交修饰。内源CH1和CL序列中的两个或更多个分别的正交修饰可以选自本文所述的任何CH1/CL正交修饰。
在一些实施方式中，第一正交修饰是正交电荷对突变，和第二正交修饰是正交工程化二硫桥。在一些实施方式中，第一正交修饰是如表9中所述的正交电荷对突变，和其他正交修饰包含选自以下工程化半胱氨酸的工程化二硫桥：CH1序列的位置138和CL序列的位置116处，CH1序列的位置128和CL序列的位置119处，或CH1序列的位置129和在CL序列的位置210处的工程化半胱氨酸(如在美国专利号8,053,562和美国专利号9,527,927中编码和更加详细讨论的，其各自的全部内容通过引用并入本文中)。在一些实施方式中，第一正交修饰是如表9中所述的正交电荷对突变，和其他正交修饰包含如在表8中所述的工程化二硫桥。在一些实施方式中，第一正交修饰包含在CH1序列中的L128C突变和在CL序列中的F118C突变，和第二正交修饰包含同一CH1序列中残基166的修饰和同一CL序列中残基138的修饰。在一些实施方式中，第一正交修饰包含CH1序列中的L128C突变和CL序列中的F118C突变，和第二正交修饰包含CH1序列中的G166D突变和CL序列中的N138K突变。在一些实施方式中，第一正交修饰包含CH1序列中的L128C突变和CL序列中的F118C突变，和第二正交修饰包含CH1序列中的G166K突变和CL序列中的N138D突变。
6.3.11.结构域J(CH2)
在三价三特异性结合分子中，结构域J具有CH2氨基酸序列。在上述第6.3.5节中更详细地描述了CH2氨基酸序列。在一个优选的实施方式中，CH2氨基酸序列具有将结构域J连接至结构域I的N端铰链区(如在第6.3.20.4节中更详细描述的)。
在三价三特异性结合分子中，结构域J的C端连接至结构域K的N端。在特定实施方式中，结构域J连接至具有CH1氨基酸序列或CL氨基酸序列的结构域K的N端(如在下文第6.3.20.5节中更详细描述的)。
6.3.12.结构域K(恒定区)
在三价三特异性结合分子中，结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列。在上文第6.3.4节中更详细地描述了恒定区结构域氨基酸序列。在一个优选的实施方式中，结构域K具有恒定区序列，其是包含杵臼正交突变(如在下文第6.3.16.2节中更详细描述的)；同族同种异型突变(如在上文第6.3.4.1节中更详细描述的)和与含有正交突变的CH3结构域形成工程化二硫桥的S354C或Y349C突变(如在下文第6.3.16.1节中更详细描述的)。在一些优选的实施方式中，与同族同种异型突变组合的杵臼正交突变是下述突变性改变：D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V。
在某些实施方式中，恒定区结构域序列是CH1序列。在特定实施方式中，结构域K的CH1氨基酸序列仅是在三价三特异性结合分子中的CH1氨基酸序列。在某些实施方式中，CH1结构域的N端连接至CH2结构域的C端(如在下文第6.3.20.5节中更详细描述的)。在某些实施方式中，恒定区序列是CL序列。在某些实施方式中，CL结构域的N端连接至CH2结构域的C端(如在下文第6.3.20.5节中更详细描述的)。在第6.3.10.1节中更详细地描述了CH1和CL序列。
6.3.13.结构域L(可变区)
在三价三特异性结合分子中，结构域L具有可变区结构域氨基酸序列。如在第6.3.1节中更详细讨论的，可变区结构域氨基酸序列是包含VL和VH抗体结构域序列的抗体的可变区结构域氨基酸序列。在上文第6.3.3.1节和第6.3.3.4节中分别更详细地描述了VL和VH序列。在一个优选的实施方式中，结构域L具有VH抗体结构域序列。
6.3.14.结构域M(恒定区)
在三价三特异性结合分子中，结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列。在上文第6.3.4节中更详细地描述了恒定区结构域氨基酸序列。在三价三特异性结合分子的一系列优选实施方式中，结构域I具有CH1氨基酸序列。在另一系列优选实施方式中，结构域I具有CL氨基酸序列。在第6.3.10.1节中更详细地描述了CH1和CL氨基酸序列。
6.3.15.结构域A&F的配对
在三价三特异性结合分子中，结构域A的VL或VH氨基酸序列与关联结构域F的VL或VH氨基酸序列相关联并形成抗原结合位点(ABS)。A：F抗原结合位点(ABS)能够特异性结合抗原的表位。在下文第6.3.15.1节中更详细地描述了ABS的抗原结合。
在各种多价实施方式中，由结构域A和结构域F(A:F)形成的ABS在序列上与三价三特异性结合分子内的一个或多个其他ABS是相同的，因此与三价三特异性结合分子内的一个或多个其他序列相同的ABS具有相同识别特异性。
在各种多价实施方式中，A：F ABS在序列上与三价三特异性结合分子内的一个或多个其他ABS是不同的。在某些实施方式中，A：F ABS具有与三价三特异性结合分子内一个或多个其他序列不同的ABS不同的识别特异性。在特定实施方式中，A：F ABS识别与三价三特异性结合分子中的至少一个其他序列不同的ABS识别的抗原不同的抗原。在特定实施方式中，A:F ABS识别与三价三特异性结合分子中至少一个其他序列相同的ABS也识别的抗原不同的抗原表位。在这些实施方式中，由结构域A和结构域F形成的ABS识别抗原表位，其中三价三特异性结合分子内的一个或多个其他ABS识别相同抗原但不同表位。
6.3.15.1.ABS对抗原的结合
ABS和包含这样的ABS的三价三特异性结合分子被称为“识别”ABS特异性结合至其的表位(或更一般地，抗原)，并且表位(或更一般地，抗原)被称为是ABS的“识别特异性”或“结合特异性”。
ABS被称为以特定的亲和性结合其特异性抗原或表位。如本文所描述，“亲和性(affinity)”是指一个分子与另一个分子之间的非共价分子间力的相互作用的强度。亲和性，即相互作用的强度，可以表示为解离平衡常数(KD)，其中较低的KD值是指分子之间较强的相互作用。抗体构建体的KD值通过本领域公知的方法测量，包括但不限于生物膜层干涉法(例如
Figure BDA0002839770970000351
)、表面等离子共振(SPR)技术(例如
Figure BDA0002839770970000352
)和细胞结合测定法。出于本文的目的，亲和性是通过使用
Figure BDA0002839770970000353
的生物膜层干涉法测量的解离平衡常数。
本文所使用的“特异性结合”指的是ABS与其关联抗原或表位之间的亲和性，其中KD值低于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M。
在如本文所描述的结合分子中的ABS的数量定义结合分子的“效价”。如图2中所示意，具有单个ABS的结合分子为“单价”。具有多个ABS的结合分子被称为“多价”。具有两个ABS的多价结合分子是“二价”。具有三个ABS的多价结合分子是“三价”。具有四个ABS的多价结合分子是“四价”。
在各种多价实施方式中，多个ABS均具有相同的识别特异性。如图2中所示，这样的结合分子是“单特异性的”“多价的”结合构建体。在其他多价的实施方式中，多个ABS中的至少两个具有不同的识别特异性。这样的结合分子是多价的且“多特异性的”。在其中ABS总体地具有两种识别特异性的多价实施方式中，结合分子是“双特异性的”。在其中ABS总体地具有三种识别特异性的多价实施方式中，结合分子是“三特异性的”。
在其中ABS对存在于同一抗原上的不同表位总体地具有各种识别特异性的多价实施方式中，结合分子是“多互补位的(multiparatopic)”。其中ABS总体地识别同一抗原上的两个表位的多价实施方式是“双互补位的”。
在各种多价实施方式中，包括本文所述的三价三特异性结合分子的结合分子的多价改善了结合分子对特定靶标的亲合力。如本文所述，“亲合力(avidity)”是指两个或更多个分子(例如，针对特定靶标的多价结合分子)之间的相互作用的总强度，其中亲合力是由多个ABS的亲和性提供的相互作用的累积强度。如上所述，可以通过与用于确定亲和性的方法相同的方法测量亲合力。在某些实施方式中，三价三特异性结合分子对特定靶标的亲合力使得相互作用是特异性结合相互作用，其中两个分子之间的亲合力具有低于10-6M、10- 7M、10-8M、10-9M或10-10M的KD值。在某些实施方式中，结合分子对特定靶标的亲合力具有使得相互作用是特异性结合相互作用的KD值，其中个体ABS的一种或多种亲合性不具有有资格独自特异性结合其各自抗原或表位的KD值。在某些实施方式中，亲合力是由多个ABS对在共同的特定靶标或复合物上的不同抗原(例如，在个体细胞上发现的不同抗原)的亲和性提供的相互作用的累积强度。在某些实施方式中，亲合力是由多个ABS对在共同的个体抗原上的不同表位的亲和性提供的相互作用的累积强度。
6.3.16.结构域B&G的配对
在本文所述的三价三特异性结合分子中，结构域B的恒定区氨基酸序列和结构域G的恒定区氨基酸序列相关联。在上文第6.3.4节中更详细地描述了恒定区结构域氨基酸序列。
在一系列优选的实施方式中，结构域B和结构域G具有CH3氨基酸序列。在上文第6.3.4.1节中更详细地描述了CH3序列。在各种实施方式中，结构域B和结构域G的氨基酸序列是相同的。在这些实施方式的某些中，序列是内源CH3序列。
在各种实施方式中，结构域B和结构域G的氨基酸序列是不同的，并且各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中结构域B与结构域G相互作用，并且其中结构域B和结构域G两者均不与缺乏正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
如本文所描述的“正交修饰”或同义“正交突变”是抗体结构域的氨基酸序列中的一个或多个工程化突变，其增加具有正交修饰的第一结构域对具有互补正交修饰的第二结构域的结合的亲和性。在某些实施方式中，正交修饰降低了具有正交修饰的结构域对缺乏互补正交修饰的结构域的亲和性。在某些实施方式中，正交修饰是内源抗体结构域序列中的突变。在各种实施方式中，正交修饰是内源抗体结构域序列的N端或C端的修饰，包括但不限于氨基酸添加或缺失。在特定的实施方式中，正交修饰包括但不限于工程化二硫桥、杵在臼中突变和电荷对突变，以及同种型取代(如第6.3.16.1-6.3.16.4节中更详细地描述)。在特定实施方式中，正交修饰包括选自但不限于工程化二硫桥、杵在臼中突变和电荷对突变的正交修饰的组合。在特定的实施方式中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸置换组合，例如同族同种异型突变(如上文第6.3.4.1节中更详细地描述)。
6.3.16.1.正交工程化二硫桥
在各种实施方式中，正交修饰包括在第一与第二结构域之间产生工程化二硫桥的突变。如本文所述，“工程化二硫桥”是在两个或更多个结构域中提供非内源性半胱氨酸氨基酸的突变，使得当所述两个或更多个结构域相关联时形成非天然二硫键。在Merchant等(Nature Biotech(1998)16:677-681)中更详细地描述了工程化二硫桥，其所教导的全部内容通过引入并入本文中。在某些实施方式中，工程化二硫桥改善了特定结构域之间的正交关联。在特定的实施方式中，产生工程化二硫桥的突变是在第一或第二CH3结构域之一中的K392C突变和在另一CH3结构域中的D399C。在一个优选的实施方式中，产生工程化二硫桥的突变是在第一或第二CH3结构域之一中的S354C突变和在另一CH3结构域中的Y349C。在另一个优选实施方式中，产生工程化二硫桥的突变是在第一和第二CH3结构域两者中的447C突变，其通过延伸包含KSC三肽序列的CH3结构域的C端而提供。
6.3.16.2.正交杵臼突变
在各种实施方式中，正交修饰包括杵臼(同义，杵在臼中)突变。如本文所描述，杵臼突变是改变第一结构域的表面的空间特征，使得相对于与没有互补空间突变的结构域相关联，所述第一结构域将优先与具有互补空间突变的第二结构域相关联的突变。在美国专利号5,821,333和美国专利号8,216,805中更详细地描述了杵臼突变，其每一个的全部内容并入本文中。在各种实施方式中，杵臼突变与工程化二硫桥组合，如Merchant等(NatureBiotech(1998)16:677-681)更详细地描述，其全部内容通过引用并入本文中。在各种实施方式中组合了杵臼突变、同族同种异型突变和工程化二硫突变。
在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的T366Y突变和在第二结构域中的Y407T突变。在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的F405A和在第二结构域中的T394W。在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的T366Y突变和F405A，以及在第二结构域中的T394W和Y407T。在某些实施方式中，杵臼突变是在第一结构域中的T366W突变和在第二结构域中的Y407A突变。在某些实施方式中，组合的杵臼突变和工程化二硫突变是在第一结构域中的S354C和T366W突变，以及在第二结构域中的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变。在优选实施方式中，组合的杵臼突变、同族同种异型突变和工程化二硫突变是在第一结构域中的S354C和T366W突变，以及在第二结构域中的Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变。
6.3.16.3.正交电荷对突变
在各种实施方式中，正交修饰是电荷对突变。如本文中所用，电荷对突变是影响结构域表面的氨基酸的取代，所述取代使得所述结构域优选地与具有互补电荷对突变的结构域相关联(相对于与没有互补电荷对突变的结构域相关联)。在某些实施方式中，电荷对突变改善了特定结构域之间的正交关联。电荷对突变在美国专利号8,592,562、美国专利号9,248,182和美国专利号9,358,286中更详细地描述，其各自所教导的内容均通过引用并入本文中。在某些实施方式中，电荷对突变改善特定结构域之间的稳定性。在优选实施方式中，电荷对突变是在第一结构域中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
6.3.16.4.IgA-CH3同种型结构域取代
在一些实施方式中，减少第一结构域和第二结构域(其也可以含有CH3序列)与第三结构域和第四结构域(其也可以含有CH3序列)之间不需要的关联是理想的。在这种情况下，在第一结构域和/或第二结构域中使用来自人IgA的CH3序列(IgA-CH3)可以通过减少此类不需要的关联改善抗体的组装和稳定性。在其中第三结构域和第四结构域包含IgG-CH3序列的结合分子的一些实施方式中，第一结构域和/或第二结构域包含IgA-CH3序列。
在一些实施方式中，在第6.3.20.3节中描述了包含CH3接头序列的第一结构域或第二结构域的至少一种。在一些实施方式中，在第6.3.20.3节中描述了包含CH3接头序列的第一结构域和第二结构域两者。在一些实施方式中，第一结构域包含第一CH3接头序列和第二结构域包含第二CH3接头序列。在一些实施方式中，第一CH3接头序列通过在第一和第二CH3接头序列的半胱氨酸残基之间形成的二硫桥与第二CH3接头序列相关联。在一些实施方式中，第一CH3接头与第二CH3接头是相同的。在一些实施方式中，第一CH3接头与第二CH3接头是不同的。在一些实施方式中，第一CH3接头和第二CH3接头的长度相差1-6个氨基酸。在一些实施方式中，第一CH3接头和第二CH3接头的长度相差1-3个氨基酸。
在一些实施方式中，在下表10中提供了第一CH3接头和第二CH3接头。
Figure BDA0002839770970000401
Figure BDA0002839770970000411
在优选的实施方式中，第一CH3接头是AGC和第二CH3接头是AGKGSC。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGKGC和第二CH3接头是AGC。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGKGSC和第二CH3接头是AGC。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGKC和第二CH3接头是AGC。
6.3.17.结构域E&K的配对
在各种实施方式中，结构域E具有CH3氨基酸序列。
在各种实施方式中，结构域K具有CH3氨基酸序列。
在各种实施方式中，结构域E和结构域K的氨基酸序列是相同的，其中序列是内源CH3序列。
在各种实施方式中，结构域E和K的序列是不同的。在各种实施方式中，不同的序列各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中结构域E与结构域K相互作用，并且其中结构域E和结构域K均不与缺乏正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。在某些实施方式中，正交修饰包括但不限于工程化二硫桥、杵臼突变和电荷对突变(如上文第6.3.16.1-6.3.16.4节中更详细地描述的)。在特定实施方式中，正交修饰包括选自但不限于工程化二硫键、杵臼突变和电荷对突变的正交修饰的组合。在特定的实施方式中，正交修饰可以与降低免疫原性的氨基酸置换(例如同族同种异型突变)组合。
6.3.18.结构域I&M和结构域H&L的配对
在各种实施方式中，结构域I具有CL序列和结构域M具有CH1序列。在各种实施方式中，结构域H具有VL序列和结构域L具有VH序列。在一个优选的实施方式中，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列和结构域M具有CH1氨基酸序列。在另一个优选的实施方式中，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列，结构域M具有CH1氨基酸序列和结构域K具有CH3氨基酸序列。
在各种实施方式中，结构域I和结构域M的氨基酸序列各自在内源序列中分别包含正交修饰，其中结构域I与结构域M相互作用，并且其中结构域I和结构域M均不与缺少正交修饰的结构域显著地相互作用。在一系列的实施方式中，结构域I中的正交突变在CL序列中，并且结构域M中的正交突变在CH1序列中。在上文第6.3.10.2节中更加详细地描述了在CH1和CL序列中的正交突变。
在各种实施方式中，结构域H和结构域L的氨基酸序列各自在内源序列中分别包含正交修饰，其中结构域H与结构域L相互作用，并且其中结构域H和结构域L均不与缺少正交修饰的结构域显著地相互作用。在一系列实施方式中，在结构域H中的正交突变在VL序列中和在结构域L中的正交突变在VH序列中。在特定实施方式中，正交突变是在VH/VL界面的电荷对突变。在优选的实施方式中，VH/VL界面处的电荷对突变是VH中的Q39E和VL中对应的Q38K，或VH中的Q39K和VL中对应的Q38E(如Igawa等(Protein Eng.Des.Sel.,2010,vol.23,667–677)更详细地描述的，其所教导的全部内容通过引用并入本文中)。
在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，并且结构域H与结构域L之间的相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，并且结构域H与结构域L之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第二抗原结合位点。
6.3.19.四价2x2结合分子
在各种实施方式中，结合分子具有4个抗原结合位点，因此称为“四价”。
参考图34，在另一系列的实施方式中，结合分子还包含第五多肽链和第六多肽链，其中(a)所述第一多肽链还包含结构域N和结构域O，其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列；(b)所述第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列；(c)所述结合分子还包含第五多肽链和第六多肽链，其中所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，和所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列；以及(d)所述第一多肽链和所述第五多肽链通过结构域N与结构域P之间的相互作用和结构域O与结构域Q之间的相互作用相关联，和所述第三多肽和所述第六多肽通过结构域R与结构域T之间的相互作用和结构域S与结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子。
在各种实施方式中，结构域O通过肽接头连接至结构域A和结构域S通过肽接头连接至结构域H。在一个优选的实施方式中，将结构域O连接至结构域A和将结构域S连接至结构域H的肽接头是6个氨基酸的GSGSGS肽序列(如在第6.3.20.6节中更详细地描述的)。
6.3.19.1.四价2x2双特异性构建体
参考图34，在一系列四价2x2双特异性结合分子中，结构域N和结构域A的氨基酸序列是相同的，结构域H和结构域R的氨基酸序列是相同的，结构域O和结构域B的氨基酸序列是相同的，结构域I和结构域S的氨基酸序列是相同的，结构域P和结构域F的氨基酸序列是相同的，结构域L和结构域T的氨基酸序列是相同的，结构域Q和结构域G的氨基酸序列是相同的，结构域M和结构域U的氨基酸序列是相同的；和其中结构域A与结构域F之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，结构域N与结构域P之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第二抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成特异性针对第二抗原的第三抗原结合位点，和结构域R与结构域T之间的相互作用形成特异性针对第二抗原的第四抗原结合位点。
参考图34，在另一系列四价2x2双特异性结合分子中，结构域H和结构域A的氨基酸序列是相同的，结构域N和结构域R的氨基酸序列是相同的，结构域I和结构域B的氨基酸序列是相同的，结构域O和结构域S的氨基酸序列是相同的，结构域L和结构域F的氨基酸序列是相同的，结构域P和结构域T的氨基酸序列是相同的，结构域M和结构域G的氨基酸序列是相同的，结构域Q和结构域U的氨基酸序列是相同的；和其中结构域A与结构域F之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，结构域N与结构域P之间的相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，结构域H与结构域L之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第三抗原结合位点，和结构域R与结构域T之间的相互作用形成特异性针对第二抗原的第四抗原结合位点。
6.3.20.结构域连接
6.3.20.1.连接VL与CH3结构域的连接
在各种实施方式中，在VL结构域的C端与CH3结构域的N端之间形成连接的氨基酸序列是工程化序列。在某些实施方式中，在VL结构域的C端缺失或添加一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，连接VL结构域的C端与CH3结构域的N端的连接是在下文第6.13.7节的表2中描述的序列之一。在特定的实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111。在某些实施方式中，在CH3结构域的N端缺失或添加一个或多个氨基酸。在特定的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343。在特定的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343和R344。在某些实施方式中，在VL结构域的C端和CH3结构域的N端两者缺失或添加一个或多个氨基酸。在特定的实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111，并且在CH3结构域的N端缺失P343。在优选实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111和V110。在另一个优选实施方式中，在VL结构域的C端缺失A111和V110，并且CH3结构域的N端具有P343V突变。
6.3.20.2.连接VH与CH3结构域的连接
在各种实施方式中，在VH结构域的C端与CH3结构域的N端之间形成连接的氨基酸序列是工程化序列。在某些实施方式中，在VH结构域的C端缺失或添加一个或多个氨基酸。在某些实施方式中，连接VH结构域的C端与CH3结构域的N端的连接是在下文第6.13.7节的表3中描述的序列之一。在特定的实施方式中，在VH结构域的C端缺失K177和G118。在某些实施方式中，在CH3结构域的N端缺失或添加一个或多个氨基酸。在特定的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343。在特定的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343和R344。在特定的实施方式中，在CH3结构域的N端缺失P343、R344和E345。在某些实施方式中，在VH结构域的C端和CH3结构域的N端两者缺失或添加一个或多个氨基酸。在优选实施方式中，在VH结构域的C端缺失T166、K177和G118。
6.3.20.3.连接CH3的C端与CH2的N端的连接(铰链)
在本文所述的三价三特异性结合分子中，CH2结构域的N端具有“铰链”区氨基酸序列。如本文所用，铰链区是连接抗体的N端可变结构域-恒定结构域区段与抗体的CH2结构域的抗体重链的序列。另外，铰链区通常同时提供在N端可变结构域-恒定结构域区段与CH2结构域之间的灵活性，和在重链(例如第一多肽链和第三多肽链)之间形成二硫桥的氨基酸序列基序。如本文所用，铰链区氨基酸序列是SEQ ID NO:56。
在各种实施方式中，CH3氨基酸序列在C端处在CH3结构域的C端与CH2结构域的N端之间的连接处延伸。在某些实施方式中，CH3氨基酸序列在C端处在CH3结构域的C端与铰链区之间的连接处延伸，所述铰链区又连接到CH2结构域的N端。在优选实施方式中，CH3氨基酸序列通过插入PGK三肽序列来延伸，所述PGK三肽序列之后是IgG1铰链区的DKTHT基序。
在特定的实施方式中，在CH3结构域的C端处的延伸引入可以与另一CH3结构域的正交C端延伸形成二硫键的氨基酸序列。在优选实施方式中，在CH3结构域的C端处的延伸引入KSC三肽序列，其后是IgG1铰链区的DKTHT基序，其与引入κ轻链的GEC基序的另一CH3结构域的正交C端延伸形成二硫键。
6.3.20.4.连接CL的C端与CH2的N端的连接(铰链)
在各种实施方式中，CL氨基酸序列是通过其C端与铰链区连接，所述铰链区又与CH2结构域的N端连接。铰链区序列在上文的第6.3.20.3节中更详细地描述。在优选实施方式中，铰链区氨基酸序列是SEQ ID NO:56。
6.3.20.5.连接CH2的C端与恒定区结构域的连接
在各种实施方式中，CH2氨基酸序列通过其C端与恒定区结构域的N端连接。恒定区在上文的第6.3.6节中更详细地描述。在优选实施方式中，CH2序列通过其内源序列连接至CH3序列。在其他实施方式中，CH2序列连接至CH1或CL序列。讨论将CH2序列连接至CH1或CL序列的实例更详细地描述于美国专利号8,242,247中，其全部内容通过引用并入本文中。
6.3.20.6.在三价和四价分子上连接结构域O至结构域A或结构域S至结构域H的连接
在各种实施方式中，在抗体重链的N端延伸抗体重链(例如第一多肽链和第三多肽链)以包含提供其他ABS的其他结构域。参考图21、图26和图34，在某些实施方式中，结构域O和/或结构域S的恒定区结构域氨基酸序列的C端分别连接至结构域A和/或结构域H的可变区结构域氨基酸序列的N端。在一些优选的实施方式中，恒定区结构域是CH3氨基酸序列和可变区结构域是VL氨基酸序列。在一些优选的实施方式中，恒定区结构域是CL氨基酸序列和可变区结构域是VL氨基酸序列。在某些实施方式中，恒定区结构域通过肽接头连接至可变区结构域。在一个优选的实施方式中，肽接头是6个氨基酸GSGSGS的肽序列。
在各种实施方式中，在抗体轻链的N端延伸抗体轻链(例如，第二多肽链和第四多肽链)以包含抗体的其他可变结构域-恒定结构域区段。在某些实施方式中，恒定区结构域是CH1氨基酸序列和可变区结构域是VH氨基酸序列。
6.4.特异性二价B-Body架构
在一个进一步的方面中，基于下文和在第6.4.1-6.4.5节中描述的二价B-body架构提供了三价三特异性结合分子。
参考图3，在一系列实施方式中，二价B-body架构包含第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，和结构域A具有VL氨基酸序列，结构域B具有CH3氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列和结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，和其中结构域F具有VH氨基酸序列和结构域G具有CH3氨基酸序列；(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，和其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列和K具有恒定区结构域氨基酸序列；(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，和其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；(e)所述第一多肽和所述第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用和结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)所述第三多肽和所述第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用和结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；和(g)所述第一多肽和所述第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用和结构域E与结构域K之间的相互作用相关联以形成所述二价B-body架构。
在一个优选的实施方式中，结构域E具有CH3氨基酸序列，结构域H具有VL氨基酸序列，结构域I具有CL氨基酸序列，结构域K具有CH3氨基酸序列，结构域L具有VH氨基酸序列和结构域M具有CH1氨基酸序列。
在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点和结构域H与结构域L之间的相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，以及二价B-body架构是双特异性二价B-body架构。在某些实施方式中，结构域A与结构域F之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点和结构域H与结构域L之间的相互作用形成特异性针对第一抗原的第二抗原结合位点，以及二价B-body架构是单特异性二价B-body架构。
6.4.1.二价双特异性B-Body“BC1”
参考图3和图6，在一系列实施方式中，提供了基于具有第一多肽链、第二多肽、第三多肽链和第四多肽链的二价B-body架构的三价三特异性结合分子，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有含有T366K突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸在IgG1铰链区的DKTHT基序之前引入KSC三肽序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有L351D突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入GEC氨基酸二硫基序；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述结合分子；(h)结构域A和结构域F形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点；和(i)结构域H和结构域L形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
在优选的实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:8，第二多肽链具有序列SEQ ID NO:9，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:10，并且第四多肽链链具有序列SEQ ID NO:11。
6.4.2.二价双特异性B-Body“BC6”
参考图3和图14，在一系列实施方式中，提供了基于具有第一多肽链、第二多肽、第三多肽链和第四多肽链的二价B-body架构的三价三特异性结合分子，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸在IgG1铰链区的DKTHT基序之前引入KSC三肽序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入GEC氨基酸二硫基序；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述二价B-body架构；(h)结构域A和结构域F形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点；和(i)结构域H和结构域L形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
6.4.3.二价双特异性B-Body“BC28”
参考图3和图16，在一系列实施方式中，提供了基于具有第一多肽链、第二多肽、第三多肽链和第四多肽链的二价B-body架构的三价三特异性结合分子，其中(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有含有Y349C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸在IgG1铰链区的DKTHT基序之前引入KSC三肽序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有S354C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1 CH1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述二价B-body架构；(h)结构域A和结构域F形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点；和(i)结构域H和结构域L形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
在优选的实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:24，第二多肽链具有序列SEQ ID NO:25，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:10，并且第四多肽链链具有序列SEQ IDNO:11。
6.4.4.二价双特异性B-Body“BC44”
参考图3和图19，在一系列实施方式中，提供了基于具有第一多肽链、第二多肽、第三多肽链和第四多肽链的二价B-body架构的三价三特异性结合分子，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有第一VL氨基酸序列，结构域B具有含有Y349C突变、P343V突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸在IgG1铰链区的DKTHT基序之前引入KSC三肽序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且结构域E具有含有S354C和T366W突变的人IgG1 CH3氨基酸；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有第一VH氨基酸序列，并且结构域G具有含有S354C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK三肽序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有第二VL氨基酸序列，结构域I具有人CLκ氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列，并且K具有含有Y349C、T366S、L368A和Y407V的人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有第二VH氨基酸序列，并且结构域M具有人IgG1氨基酸序列；(e)第一多肽与第二多肽通过结构域A与结构域F之间的相互作用以及结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)第三多肽与第四多肽通过结构域H与结构域L之间的相互作用以及结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；和(g)第一多肽与第三多肽通过结构域D与结构域J之间的相互作用以及结构域E与结构域K之间的相互作用相关联，以形成所述二价B-body架构；(h)结构域A和结构域F形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点；和(i)结构域H和结构域L形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
在优选的实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:32，所述第二多肽链具有序列SEQ ID NO:25，所述第三多肽链具有序列SEQ ID NO:10，和第四多肽链具有序列SEQID NO:11。
6.4.5.具有IgA-CH3结构域对的二价结合分子
参考图3，在一系列实施方式中，结合分子具有第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第多肽链，其中(a)第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域和结构域E，其中结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且结构域A具有可变区氨基酸序列，结构域B具有人IgA CH3氨基酸序列，结构域D具有人IgG1 CH2氨基酸序列和结构域E具有人IgG1 CH3氨基酸序列；(b)第二多肽链具有结构域F和结构域G，其中结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且其中结构域F具有可变区氨基酸序列和结构域G具有人IgA CH3氨基酸序列；(c)第三多肽链具有结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，其中结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域H具有可变区氨基酸序列，结构域I具有恒定区氨基酸序列，结构域J具有人IgG1 CH2氨基酸序列和结构域K具有人IgG1 CH3氨基酸序列；(d)第四多肽链具有结构域L和结构域M，其中结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且其中结构域L具有可变区氨基酸序列和结构域M具有恒定区氨基酸序列；(e)所述第一多肽链和所述第二多肽链通过结构域A与结构域F之间的相互作用和结构域B与结构域G之间的相互作用相关联；(f)所述第三多肽链和所述第四多肽链通过结构域H与结构域L之间的相互作用和结构域I与结构域M之间的相互作用相关联；(g)所述第一多肽链和所述第三多肽链通过结构域D与结构域J之间的相互作用和结构域E与结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子。在一些实施方式中，结构域A和结构域F形成特异性针对第一抗原的第一结合位点；以及结构域H和结构域L形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点。
在一些实施方式中，结构域A包含VH氨基酸序列，结构域F包含VL氨基酸序列，结构域H包含VH氨基酸序列，结构域I包含CH1氨基酸序列，结构域L包含VL氨基酸序列和结构域M包含CL氨基酸序列。在一些实施方式中，结构域A包含第一VH氨基酸序列和结构域F包含第一VL氨基酸序列，结构域H包含第二VH氨基酸序列和结构域L包含第二VL氨基酸序列。
在优选的实施方式中，结构域A包含VL氨基酸序列，结构域F包含VH氨基酸序列，结构域H包含VL氨基酸序列，结构域L包含VH氨基酸序列，结构域I包含CL氨基酸序列和结构域M包含CH1氨基酸序列。在一些实施方式中，CL氨基酸序列是CL-κ序列。在一些实施方式中，结构域A包含第一VL氨基酸序列和结构域F包含第一VH氨基酸序列，结构域H包含第二VL氨基酸序列和结构域L包含第二VH氨基酸序列。
在一些实施方式中，结构域E还包含在人IgG1 CH3氨基酸序列中的S354C和T366W突变。在一些实施方式中，结构域K还包含在人IgG1 CH3氨基酸序列中的Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A和Y407V突变。
在一些实施方式中，结构域B包含第一CH3接头序列，如在第6.3.20.3节中所述，其在IgG1铰链区DKTHT基序之后；和结构域G包含第二CH3接头序列，如在第6.3.20.3节中所述。在一些实施方式中，第一CH3接头序列通过在第一CH3接头序列和第二CH3接头序列之间形成半胱氨酸残基与第二CH3接头序列相关联。
在一些实施方式中，第一CH3接头和第二CH3接头是相同的。在一些实施方式中，第一CH3接头和第二CH3接头是不同的。在一些实施方式中，第一CH3接头和第二CH3接头的长度相差1-6个氨基酸。在一些实施方式中，第一CH3接头和第二CH3接头的长度相差1-3个氨基酸。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGC和第二CH3接头是AGKGSC。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGKGC和第二CH3接头是AGC。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGKGSC和第二CH3接头是AGC。在一些实施方式中，第一CH3接头是AGKC和第二CH3接头是AGC。
在一些实施方式中，结合分子还包含一个或多个CH1/CL修饰，如在第6.3.10.3节和第6.3.10.3节中所描述的。
在一些实施方式中，结合分子还包含降低效应功能的修饰，如在第6.8.4中所描述的。
6.5.特异性三价结合分子
6.5.1.三价1x2双特异性B-Body“BC28-1x2”
参照第6.4.3节和图26，在一系列实施方式中，基于上文所述的二价B-body架构的三价三特异性结合分子还包含第六多肽链，其中(a)第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域R具有第一VL氨基酸序列，并且结构域S具有含有Y349C突变和C端延伸的人IgG1CH3氨基酸序列，所述C端延伸在连接结构域S与结构域H的GSGSGS接头肽之前引入PGK三肽序列；(b)三价三特异性结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：结构域T和结构域U，其中结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有第一VH氨基酸序列，并且结构域U具有含有S354C突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入PGK氨基酸二硫基序；(c)第三多肽和第六多肽通过结构域R与结构域T之间的相互作用和结构域S与结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述三价三特异性结合分子，并且(d)结构域R和结构域T形成特异性针对第一抗原的第三抗原结合位点。
在优选的实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:24，第二多肽链具有序列SEQ ID NO:25，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:37，第四多肽链具有序列SEQ ID NO:11，以及第六多肽链具有序列SEQ ID NO:25。
6.5.2.三价1x2三特异性B-Body“BC28-1x1x1a”
参照第6.4.3节以及图26和图30，在一系列实施方式中，基于上文所述的二价B-body架构的三价三特异性结合分子还包含第六多肽链，其中(a)第三多肽链还包含结构域R和结构域S，其中结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且其中结构域R具有第三VL氨基酸序列，并且结构域S具有含有T366K突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸在连接结构域S与结构域H的GSGSGS接头肽之前引入KSC三肽序列；(b)三价三特异性结合分子还包含第六多肽链，所述第六多肽链包含：结构域T和结构域U，其中结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且其中结构域T具有第三VH氨基酸序列，并且结构域U具有含有L351D突变和C端延伸的人IgG1 CH3氨基酸序列，所述C端延伸引入GEC氨基酸二硫基序；和(c)第三多肽和第六多肽通过结构域R与结构域T之间的相互作用和结构域S与结构域U之间的相互作用相关联，以形成所述三价三特异性结合分子，并且(d)结构域R和结构域T形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
在优选的实施方式中，第一多肽链具有序列SEQ ID NO:24，第二多肽链具有序列SEQ ID NO:25，第三多肽链具有序列SEQ ID NO:45，第四多肽链具有序列SEQ ID NO:11，以及第六多肽链具有序列SEQ ID NO:53。
6.6.其他结合分子平台
上文所述的各种抗体平台是非限制性的。包括特异性CDR子集的本文所述的三价三特异性结合分子可以基于任何相容性结合分子平台，包括但不限于全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、双抗体、sc双体、DART、tandAb、小抗体、骆驼科动物VHH和其他抗体片段或本领域技术人员已知的形式。在Brinkmann等(MABS,2017,Vol.9,No.2,182–212)中详细描述了示例性抗体和抗体片段，其教导的全部内容通过引用并入本文中。
在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于CrossMabTM平台。在美国专利号8,242,247；9,266,967；和8,227,577，美国专利公开号20120237506，美国专利公开号US20090162359，WO2016016299，WO2015052230中描述了CrossMabTM抗体。在一些实施方式中，基于二价双特异性抗体的三价三特异性结合分子包含：a)与第一抗原特异性结合的抗体的轻链和重链；和b)与第二抗原特异性结合的抗体的轻链和重链，其中来自与第二抗原特异性结合的抗体的恒定结构域CL和CH1彼此替换。在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于参照第6.4节和图3构成的形式，其中A是VH，B是CH1，D是CH2，E是CH3，F是VL，G是CL，H是VL或VH，I是CL，J是CH2，K是CH3，L是VH或VL，和M是CH1。
在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于具有在美国专利号8,871,912和WO2016087650中所述的一般架构的抗体。在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于结构域交换抗体，其包含由VL-CH3组成的轻链(LC)和包含VH-CH3-CH2-CH3的重链(HC)，其中LC的VL-CH3与HC的VH-CH3二聚化，从而形成包含CH3LC/CH3HC结构域对的结构域交换的LC/HC二聚体。在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于参照第6.4节和图3构成的形式，其中A是VH，B是CH3，D是CH2，E是CH3，F是VL，G是CH3，H是VH，I是CH1，J是CH2，K是CH3，L是VL，和M是CL。
在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于在WO2017011342中所述的平台。在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于参照第6.4节和图3构成的形式，其中A是VH或VL，B是I给M或IgE的CH2，D是CH2，E是CH3，F是VL或VH，G是IgM或IgE的CH2，H是VH，I是CH1，J是CH2，K是CH3，L是VL，和M是CL。
在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于如WO2006093794中所述的平台。在一些实施方式中，三价三特异性结合分子基于参照第6.4节和图3构成的形式，其中A是VH，B是CH1，D是CH2，E是CH3，F是VL，G是CL，H是VL，I是CL或CH1，J是CH2，K是CH3，L是VH，和M是CH1或CL。
6.7.抗原特异性
可以选择本文所描述的结合分子的抗原结合位点以特异性结合各种各样的分子靶标。例如，一个或多个抗原结合位点可以特异性结合E-Cad、CLDN7、FGFR2b、N-Cad、Cad-11、FGFR2c、ERBB2、ERBB3、FGFR1、FOLR1、IGF-Ira、GLP1R、PDGFRa、PDGFRb、EPHB6、ABCG2、CXCR4、CXCR7、整联蛋白-avb3、SPARC、VCAM、ICAM、膜联蛋白、TNFα、CD137、血管生成素2、血管生成素3、BAFF、β淀粉样物质、C5、CA-125、CD147、CD125、CD147、CD152、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD25、CD274、CD28、CD3、CD30、CD33、CD37、CD4、CD40、CD44、CD44v4、CD44v6、CD44v7、CD50、CD51、CD52、CEA、CSF1R、CTLA-2、DLL4、EGFR、EPCAM、HER3、GD2神经节苷脂、GDF-8、Her2/neu、CD2221、IL-17A、IL-12、IL-23、IL-13、IL-6、IL-23、整联蛋白、CD11a、MUC1、Notch、TAG-72、TGFβ、TRAIL-R2、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、VEGFc、促红细胞生成素(四螺旋束)(例如EPO(促红细胞生成素)、IL-2(T细胞生长因子)、IL-3(多集落CSF)、IL-4(BCGF-1，BSF-1)、IL-5(BCGF-2)、IL-6、IL-4(IFN-β2、BSF-2、BCDF)、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-13(P600)、G-CSF、IL-15(T细胞生长因子)、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)、OSM(OM，制瘤素M)和LIF(白血病抑制因子))；干扰素(如IFN-γ、IFN-α和IFN-β)；免疫球蛋白超家族(如B7.1(CD80)和B7.2(B70、CD86))；TNF家族(例如TNF-α(恶液质素)、TNF-β(淋巴毒素、LT、LT-α)、LT-β、Fas、CD27、CD30和4-1BBL)；和未分配给特定家族的那些(例如TGF-β、IL1α、IL-1β、IL-1RA、IL-10(细胞因子合成抑制子F)、IL-12(NK细胞刺激因子)、MIF、IL-16、IL-17(mCTLA-8)和/或IL-18(IGIF、干扰素-γ诱导因子))；在涉及双特异性抗体的实施方式中，抗体可以例如结合这些靶标中的两种。此外，抗体的重链的Fc部分可用于靶向Fc受体表达细胞，例如使用IgE抗体的Fc部分靶向肥大细胞和嗜碱性粒细胞。可以选择特异性结合TNF受体家族的一个或多个抗原结合位点，所述TNF受体家族包括但不限于TNFR1(也称为CD120a和TNFRSF1A)、TNFR2(也称为CD120b和TNFRSF1B)、TNFRSF3(也称为LTβR)、TNFRSF4(也称为OX40和CD134)、TNFRSF5(也称为CD40)、TNFRSF6(也称为FAS和CD95)、TNFRSF6B(也称为DCR3)、TNFRSF7(也称为CD27)、TNFRSF8(也称为CD30)、TNFRSF9(也称为4-1BB)、TNFRSF10A(也称为TRAILR1、DR4和CD26)、TNFRSF10B(也称为TRAILR2、DR5和CD262)、TNFRSF10C(也称为TRAILR3、DCR1、CD263)、TNFRSF10D(也称为TRAILR4、DCR2和CD264)、TNFRSF11A(也称为RANK和CD265)、TNFRSF11B(也称为OPG)、TNFRSF12A(也称为FN14、TWEAKR和CD266)、TNFRSF13B(也称为TACI和CD267)、TNFRSF13C(也称为BAFFR、BR3和CD268)、TNFRSF14(也称为HVEM和CD270)、TNFRSF16(也称为NGFR、p75NTR和CD271)、或TNFRSF17(也称为BCMA和CD269)、TNFRSF18(也称为GITR和CD357)、TNFRSF19(也称为TROY、TAJ和TRADE)、TNFRSF21(也称为CD358)、TNFRSF25(也称为Apo-3、TRAMP、LARD或WS-1)、EDA2R(也称为XEDAR)。
可以选择特异性结合免疫肿瘤靶标的一个或多个抗原结合位点或位点，所述免疫肿瘤靶标包括但不限于，检查点抑制剂靶标例如PD1、PDL1、CTLA-4、PDL2、B7-H3、B7-H4、BTLA、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、BY55和CGEN-15049。
在特定实施方式中，三价三特异性结合分子具有特异性结合两个肿瘤相关抗原和T细胞表面表达分子的抗原结合位点。在一个特异性实施方式中，三价三特异性结合分子具有特异性结合两个肿瘤相关抗原和T细胞表面表达的蛋白CD3的抗原结合位点。不希望受到理论的束缚，特异性结合两个肿瘤抗原和T细胞表面表达的分子(即CD3)的三价三特异性结合分子可以通过将T细胞重定向至表达肿瘤相关抗原的细胞(即靶细胞)来指导表达两种肿瘤相关抗原的细胞的T细胞介导的杀伤(细胞毒性)。在美国公开号2006/0193852中详细描述了使用双特异性抗CD3分子介导的T细胞杀伤，其全部内容通过引用并入本文中。在一些实施方式中，T细胞表面表达的分子选自能够将T细胞重新定向至靶细胞的任何分子。在一些实施方式中，单个ABS对两种肿瘤相关抗原的一种或多种亲和性不具有KD值，该KD值不能等同于自身特异性结合各自的抗原或表位，但是针对表达两种肿瘤相关抗原的特异性靶细胞的三价三特异性结合分子的亲和力具有KD值，因此该相互作用是特异性结合相互作用。
在一系列实施方式中，可以选择特异性靶向肿瘤相关细胞的一个或多个抗原结合位点。在各种实施方式中，一个或多个抗原结合位点特异性靶向肿瘤相关免疫细胞。在某些实施方式中，一个或多个抗原结合位点特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞(Treg)。在具体的实施方式中，结合分子具有对选自CD25、OX40、CTLA-4和NRP1中的一种或多种的抗原特异的抗原结合位点，使得结合分子特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞。在具体的实施方式中，结合分子具有特异性结合CD25和OX40、CD25和CTLA4、CD25和NRP1、OX40和CTLA-4、OX40和NRP1、或CTLA-4和NRP1的抗原结合位点，使得结合分子特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞。在优选实施方式中，双特异性二价结合分子具有特异性结合CD25和OX40、CD25和CTLA-4、CD25和NRP1、OX40和CTLA4、OX40和NRP1、或CTLA-4和NRP1的抗原结合位点，使得结合分子特异性靶向肿瘤相关调节性T细胞。在具体的实施方式中，肿瘤相关调节性T细胞的特异性靶向导致调节性T细胞的耗尽(例如杀死)。在优选实施方式中，调节性T细胞的耗尽是由抗体-药物缀合物(ADC)修饰所介导，例如与毒素缀合的抗体，如下文第6.8.1节中更详细地讨论。
6.8.进一步的修饰
在另一系列的实施方式中，三价三特异性结合分子具有另外的修饰。
6.8.1.抗体药物缀合物
在各种实施方式中，三价三特异性结合分子与治疗剂(即药物)缀合以形成三价三特异性结合分子-药物缀合物。治疗剂包括但不限于化学治疗剂、成像剂(例如放射性同位素)、免疫调节剂(例如细胞因子、趋化因子或检查点抑制剂)和毒素(例如细胞毒性剂)。在某些实施方式中、治疗剂通过接头肽附着于三价三特异性结合分子(如下文第6.8.3节中更详细地讨论的)。
制备可以适于将药物与本文公开的三价三特异性结合分子缀合的抗体-药物缀合物(ADC)的方法描述于例如美国专利号8,624,003(罐法)、美国专利号8,163,888(一步)、美国专利号5,208,020(两步法)、美国专利号8,337,856、美国专利号5,773,001、美国专利号7,829,531、美国专利号5,208,020、美国专利号7,745,394、WO 2017/136623、WO 2017/015502、WO 2017/015496、WO 2017/015495、WO 2004/010957、WO 2005/077090、WO 2005/082023、WO 2006/065533、WO 2007/030642、WO 2007/103288、WO 2013/173337、WO 2015/057699、WO 2015/095755、WO 2015/123679、WO 2015/157286、WO 2017/165851、WO 2009/073445、WO 2010/068759、WO 2010/138719、WO 2012/171020、WO 2014/008375、WO 2014/093394、WO 2014/093640、WO 2014/160360、WO 2015/054659、WO 2015/195925、WO 2017/160754、Storz(MAbs.2015Nov-Dec；7(6):989–1009)、Lambert等(Adv Ther,2017 34:1015)、Diamantis等(British Journal of Cancer,2016,114,362–367)、Carrico等(NatChem Biol,2007.3:321-2)、We等(Proc Natl Acad Sci USA,2009.106:3000-5)、Rabuka等(Curr Opin Chem Biol.,2011 14:790-6)、Hudak等(Angew Chem Int Ed Engl.,2012:4161-5)、Rabuka等(Nat Protoc.,20127:1052-67)、Agarwal等(Proc Natl Acad SciUSA.,2013,110:46-51)、Agarwal等(Bioconjugate Chem.,2013,24:846–851)、Barfield等(Drug Dev.and D.,2014,14:34-41)、Drake等(Bioconjugate Chem.,2014,25:1331-41)、Liang等(J Am Chem Soc.,2014,136:10850-3)、Drake等(Curr Opin Chem Biol.,2015,28:174-80)和York等(BMC Biotechnology,2016,16(1):23)中。为其每一个所教导的，将其每一个的全部内容通过引用并入本文中。
6.8.2.另外的结合部分
在各种实施方式中，三价三特异性结合分子具有包含一个或多个另外的结合部分的修饰。在某些实施方式中，结合部分是抗体片段或抗体形式，包括但不限于全长抗体、Fab片段、Fv、scFv、串联scFv、双抗体、单链双抗体(scDiabody)、DART、tandAb、微抗体、骆驼VHH和领域技术人员已知的其他抗体片段或形式。示例性的抗体和抗体片段形式详细描述于Brinkmann等(MABS,2017,Vol.9,No.2,182–212)，其所教导的全部内容通过引用并入本文中。
在特定实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着至第一多肽链或第三多肽链的C端。在特定的实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着至第一多肽链和第三多肽链两者的C端。在特定的实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着至第一多肽链和第三多肽链两者的C端。在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分的各个部分(portion)分别附着至第一多肽链和第三多肽链的C端，使得所述部分(portion)形成功能性结合部分。
在特定实施方式中，一个或多个另外的结合部分附着至任何多肽链(例如第一、第二、第三、第四、第五或第六多肽链)的N端。在某些实施方式中，另外的结合部分的各个部分分别附着至不同多肽链的N端，使得所述部分形成功能性结合部分。
在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分对三价三特异性结合分子内的ABS的不同抗原或表位具有特异性。在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分对三价三特异性结合分子内的ABS的相同抗原或表位具有特异性。在某些实施方式中，其中修饰是两个或更多个另外的结合部分，所述另外的结合部分对相同的抗原或表位具有特异性。在某些实施方式中，其中修饰是两个或更多个另外的结合部分，所述另外的结合部分对不同的抗原或表位具有特异性。
在某些实施方式中，使用体外方法将一个或多个另外的结合部分附着至三价三特异性结合分子，所述体外方法包括但不限于，反应性化学和亲和标签系统，如在下文第6.8.3节中更详细地讨论。在某些实施方式中，一个或多个另外的结合部分通过Fc介导的结合(例如蛋白A/G)附着至三价三特异性结合分子。在某些实施方式中，使用重组DNA技术将一个或多个另外的结合部分附着至三价三特异性结合分子，例如在同一表达载体(例如质粒)上编码三价三特异性结合分子与另外的结合部分之间的融合产物的核苷酸序列。
6.8.3.功能性/反应性基团
在各种实施方式中，三价三特异性结合分子包含可以在下游过程中使用的功能性基团或化学反应性基团的修饰，例如链接到另外的部分(例如如在上文第6.8.1和6.8.2节更详细地讨论的药物缀合物和另外的结合部分)和下游纯化过程。
在某些实施方式中，修饰是化学反应性基团，包括但不限于反应性硫醇(例如基于马来酰亚胺的反应性基团)、反应性胺(例如基于N-羟基琥珀酰亚胺的反应性基团)、“点击化学”(click chemistry)基团(例如反应性炔基)和带有甲酰甘氨酸(FGly)的醛。在某些实施方式中，修饰是功能性基团，包括但不限于亲和肽序列(例如HA、HIS、FLAG、GST、MBP和Strep系统等)。在某些实施方式中，功能性基团或化学反应性基团具有可切割的肽序列。在特定的实施方式中，可切割肽通过包括但不限于光切割、化学切割、蛋白酶切割、还原性条件和pH条件的方法切割。在特定的实施方式中，蛋白酶切割通过细胞内蛋白酶进行。在特定的实施方式中，蛋白酶切割通过细胞外或膜相关蛋白酶进行。在Choi等(Theranostics,2012；2(2):156–178.)中更详细地描述了采用蛋白酶切割的ADC疗法，其所教导的全部内容通过引用并入本文中。
6.8.4.降低的效应功能
在某些实施方式中，三价三特异性结合分子在抗体结构域的氨基酸系列中具有一个或多个工程化的突变，其降低通常与抗体结合相关的效应功能。效应功能包括但不限于由于Fc受体结合至抗体的Fc部分而产生的细胞功能，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体固定(例如C1q结合)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)、调理作用。在美国公开号2017/0137530，Armour等(Eur.J.Immunol.29(8)(1999)2613-2624)，Shields等(J.Biol.Chem.276(9)(2001)6591-6604)和Oganesyan等(Acta Cristallographica D64(2008)700-704)中更加详细地描述了降低效应功能的工程化突变，其各自的全部内容通过引用并入本文中。
在特定实施方式中，三价三特异性结合分子在抗体结构域的氨基酸系列中具有一个或多个工程化的突变，其降低三价三特异性结合分子的Fc部分与FcR受体的结合。在一些实施方式中，FcR受体是FcRγ受体。在特定实施方式中，FcR受体是FcγRIIa和/或FcγRIIIA受体。
在特定实施方式中，降低效应功能的一个或多个工程化的突变是在抗体CH2结构域中的突变。在各种实施方式中，一个或多个工程化的突变在CH2结构域的位置L234和L235处。在特定实施方式中，一个或多个工程化的突变是在CH2结构域的L234A和L235A处。在其他实施方式中，一个或多个工程化的突变在CH2结构域的位置L234、L235和P329处。在特定实施方式中，一个或多个工程化的突变是在CH2结构域的L234A、L235A和P329G处。在优选的实施方式中，一个或多个工程化的突变是在CH2结构域的L234A、L235A和P329K处。
6.9.纯化方法
本文提供了一种纯化包含B-body平台的三价三特异性结合分子的方法。
在一系列实施方式中，所述方法包括以下步骤：i)将包含所述三价三特异性分子的样品与CH1结合试剂接触，其中所述三价三特异性结合分子至少包含在复合物中相关联的第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链和第四多肽链，其中所述复合物包含至少一个CH1结构域或其部分，并且其中在所述复合物中CH1结构域的数量至少比所述复合物的价数少一个，并且其中所述接触在足以使得所述CH1结合试剂与CH1结构域或其部分结合的条件下进行；和ii)从一个或多个不完整的复合物中纯化所述复合物，其中所述不完整的复合物不包含第一多肽链、第二多肽、第三多肽链和第四多肽链。
在典型的天然存在的抗体中，两条重链是相关联的，其每一条均具有作为第二结构域的CH1结构域，从N端到C端编号。因而，典型抗体具有两个CH1结构域。在第6.3.10.1节中更详细地描述了CH1结构域。在本文所述的各种三价三特异性结合分子中，在蛋白中通常存在的CH1结构域已被另一结构域取代，以使得蛋白中CH1结构域的数量被有效降低。在一个非限制性说明性实例中，典型抗体的CH1结构域可以被CH3结构域取代，产生仅具有单一CH1结构域的抗原-结合蛋白。
三价三特异性结合分子还可以指基于抗体架构的分子，所述抗体架构已被工程化，以使得其不再具有典型的抗体架构。例如，抗体可以在其N端或C端延伸以增加抗原结合蛋白的价数(在第6.3.15.1节中更详细地描述)，并且在某些情况下，CH1结构域的数量也增加到超过典型的两个CH1结构域。这样的分子也可以具有一个或多个其CH1结构域被取代，使得蛋白中的CH1结构域的数量比抗原结合蛋白的价数至少少一个。在一些实施方式中，被其他结构域取代的CH1结构域的数量会生成仅具有单一CH1结构域的三价三特异性结合分子。在其他实施方式中，被另一结构域取代的CH1结构域的数量产生具有两个或更多个CH1结构域的三价三特异性结合分子，但至少比抗原结合蛋白的效价少一价。在特定实施方式中，其中三价三特异性结合分子具有两个或更多个CH1结构域，多个CH1结构域可以均在同一多肽链中。在其他特定实施方式中，其中三价三特异性结合分子具有两个或更多个CH1结构域，多个CH1结构域可以是在完整复合物中存在的相同多肽链的多个拷贝中的单一CH1结构域。
6.9.1.CH1结合试剂
在纯化三特异性三价结合分子的示例性非限制性方法中，包含三价三特异性结合分子的样品与CH1结合试剂接触。如本文所述，CH1结合试剂可以是与CH1表位特异性结合的任何分子。在第6.3.10.1节中更加详细地描述了提供CH1表位的各种CH1序列，在第6.3.15.1节中更加详细地描述了特异性结合。
在一些实施方式中，CH1结合试剂来自免疫球蛋白，并且具有与CH1表位特异性结合的抗原结合位点(ABS)。在特定实施方式中，CH1结合试剂是抗体，也称为“抗CH1抗体”。抗CH1抗体可以来自多个物种。在特定实施方式中，抗CH1抗体是哺乳动物抗体，包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、骆驼、驴、山羊和人抗体。在特定实施方式中，抗CH1抗体是单域抗体。如本文所述，单域抗体具有单一可变结构域，其形成ABS并与CH1表位特异性结合。如在国际申请WO 2009/011572中更加详细地描述的(其教导的全部内容通过引用并入本文中)，示例性单域抗体包括但不限于来源于骆驼和鲨鱼的重链抗体。在一个优选的实施方式中，抗CH1抗体是来源于骆驼的抗体(也称为“骆驼抗体”)。示例性骆驼抗体包括但不限于人IgG-CH1 CaptureSelectTM(ThermoFisher，#194320010)和人IgA-CH1(ThermoFisher，#194311010)。在一些实施方式中，抗CH1抗体是单克隆抗体。单克隆抗体通常由培养的抗体生成细胞系产生。在其他实施方式中，抗CH1抗体是多克隆抗体，即均识别CH1表位的不同抗CH1抗体的集合。多克隆抗体通常通过收集含有用目的抗原或其片段(此处为CH1)免疫的动物血清的抗体来产生。
在一些实施方式中，CH1结合试剂是并非来源于免疫球蛋白的分子。此类分子的实例包括但不限于适体、类肽和亲和体，如在Perret和Boschetti(Biochimie,Feb.2018,Vol145:98-112)中更详细地描述的。
6.9.2.固体支持物
在纯化三特异性三价结合分子的示例性非限制性方法中，在本发明的各种实施方式中，CH1结合试剂能够附接至固体支持物。如本文所述，固体支持物指可以将其他实体附着或固化在其上的材料，例如CH1结合试剂。在国际申请号WO 2009/011572中更加详细地描述了也称为“载体”的固体支持物。
在特定实施方式中，固体支持物包含小珠或纳米颗粒。小珠和纳米颗粒的实例包括但不限于琼脂糖小珠、聚苯乙烯小珠、磁性纳米颗粒(例如，DynabeadsTM，ThermoFisher)、聚合物(例如葡聚糖)、合成聚合物(例如SepharoseTM)或任何其他适合连接CH1结合试剂的材料。在特定实施方式中，修饰固体支持物以使得能够附着CH1结合试剂。固体支持物修饰的实例包括但不限于与蛋白形成共价键的化学修饰(例如，活化的醛基)和与CH1结合试剂的同源修饰特异性配对的修饰(例如生物素-链霉亲和素对、二硫键、聚组氨酸-镍或“点击化学”修饰，如叠氮基-炔基对)。
在某些实施方式中，在CH1结合试剂与三价三特异性结合分子结合之前，CH1结合试剂附接至固体支持物，在本文中也称为“抗CH1树脂”。在一些实施方式中，抗CH1树脂分散在溶液中。在其他实施方式中，将抗CH1树脂“包装”在柱子中。然后，抗CH1树脂与三价三特异性结合分子接触，并且CH1结合试剂特异性结合三价三特异性结合分子。
在其他实施方式中，在CH1结合试剂与三价三特异性结合分子接触后，CH1结合试剂附接至固体支持物。作为非限制性说明，可以将具有生物素修饰的CH1结合试剂与三价三特异性结合分子接触，然后可以使CH1结合试剂/三价三特异性结合分子混合物与链霉亲和素修饰的固体支持物接触，以便将CH1结合试剂附接至固体支持物，包括与三价三特异性结合分子特异性结合的CH1结合试剂。
在其中CH1结合试剂附接至固体支持物的方法中，在各种实施方式中，从固体支持物释放或“洗脱”结合的三特异性三价结合分子，以形成具有三价三特异性结合分子的洗脱液。在一些实施方式中，通过逆转配对修饰(例如还原二硫键)，添加试剂与三价三特异性结合分子竞争(例如添加与聚组氨酸竞争与镍结合的咪唑)，裂解掉三价三特异性结合分子(例如在修饰中包含可裂解的部分)或以其他方式干扰CH1结合试剂与三价三特异性结合分子的特异性结合释放结合的三特异性三价结合分子。干扰特异性结合的方法包括但不限于将与CH1结合试剂键合的三特异性三价结合分子与低pH溶液接触。在优选的实施方式中，低pH溶液包含0.1M乙酸(pH 4.0)。在其他实施方式中，可以将结合的三特异性三价结合分子与一定范围的低pH溶液(即，“梯度”)接触。
6.9.3.进一步纯化
在示例性非限制性方法的一些实施方式中，将使用下述步骤的方法的一次迭代用于从一种或多种不完整的复合物中纯化三价三特异性结合分子，所述步骤为将三价三特异性结合分子与CH1结合试剂接触，随后洗脱三价三特异性结合分子。在特定实施方式中，未进行其他纯化步骤。在其他实施方式中，进行一个或多个另外的纯化步骤以进一步从一个或多个不完整的复合物中纯化三价三特异性结合分子。一个或多个另外的纯化步骤包括但不限于基于其他蛋白特征纯化三价三特异性结合分子，如尺寸(例如体积排阻色谱)、电荷(例如离子交换色谱)或疏水性(例如疏水性相互作用色谱)。在一个优选的实施方式中，进行另外的离子交换色谱。此外，如上文所述将三价三特异性结合分子与CH1结合试剂重复接触，以及改进迭代之间的CH1纯化方法(例如在第一次迭代中使用逐步洗脱，在随后的洗脱中使用梯度洗脱)均能够进一步纯化三价三特异性结合分子。
6.9.4.复合物的组装和纯度
在本发明的实施方式中，至少四条不同多肽链关联在一起形成完整的复合物，即三价三特异性结合分子。然而，也可以形成不含所述至少四条不同多肽链的不完整的复合物。例如，可以形成仅具有一条、两条或三条多肽链的不完整的复合物。在其他实例中，不完整的复合物可以含有三种以上多肽链，但是不含至少四种不同多肽链，例如不完整的复合物不适当地与一个拷贝以上的不同多肽链相关联。本发明的方法从不完整的复合物中纯化复合物(即完整的组装的三特异性三价结合分子)。
评估纯化步骤的功效和效率的方法是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于SDS-PAGE分析、离子交换色谱、体积排阻色谱和质谱。还可以根据各种标准评估纯度。标准的实例包括但不限于：1)评估在由完整组装的三特异性三价结合分子提供的洗脱物中总蛋白的百分比，2)评估纯化所需产物的方法的富集倍数或增加百分比，例如将洗脱液中完全组装的三特异性三价结合分子提供的总蛋白与初始样品中的蛋白进行比较，3)评估总蛋白的百分比或不需要的产物(例如上述不完整复合物)的减少百分比，包括确定特定不需要产物的百分比或减少百分比(例如未关联的单一多肽链、多肽链任何组合的二聚体或多肽链任何组合的三聚体)。可以在本文所述方法的任何组合之后评估纯度。例如，可以在使用如本文所述的抗CH1结合试剂进行单次迭代后或另外的纯化步骤后评估纯度(如在第6.9.3节中更详细地描述的)。纯化步骤的功效和效率也可用于比较使用抗CH1结合试剂描述的方法和本领域技术人员公知的其他纯化方法(如蛋白A纯化)。
6.10.制备方法
本文所述的三价三特异性结合分子可以很容易地通过使用目前用于抗体制备的标准无细胞翻译、瞬时转染和稳定转染的方法进行表达而制备。在具体的实施方式中，Expi293细胞(ThermoFisher)可用于使用来自ThermoFisher的方案和试剂(例如ExpiFectamine)或本领域技术人员已知的其他试剂(例如在Fang等(BiologicalProcedures Online,2017,19:11)中详细描述的聚乙烯亚胺、生产三价三特异性结合分子(其所教导的全部内容通过引用并入本文中))。
如在下文的实施例中进一步描述的，表达的蛋白质可以容易地使用CH1亲和树脂纯化(例如CaptureSelect CH1树脂)和由ThermoFisher提供的方案。其他纯化策略包括但不限于使用蛋白A、蛋白G或蛋白A/G试剂纯化。可以使用本领域常规使用的离子交换层析法进行进一步的纯化。
6.11.药物组合物
在另一个方面中，提供了包含如本文所述的三价三特异性结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。在典型实施方式中，药物组合物是无菌的。
在各种实施方式中，药物组合物包含浓度为0.1mg/ml–100mg/ml的三价三特异性结合分子。在特定实施方式中，药物组合物包含浓度为0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、7.5mg/ml或10mg/ml的三价三特异性结合分子。在一些实施方式中，药物组合物包含浓度大于10mg/ml的三价三特异性结合分子。在某些实施方式中，三价三特异性结合分子以20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml或者甚至50mg/ml或更高的浓度存在。在特定实施方式中，三价三特异性结合分子以大于50mg/ml的浓度存在。
在各种实施方式中，在美国专利号8,961,964、美国专利号8,945,865、美国专利号8,420,081、美国专利号6,685,940、美国专利号6,171,586、美国专利号8,821,865、美国专利号9,216,219、US申请号10/813,483、WO 2014/066468、WO 2011/104381和WO 2016/180941中更加详细地描述了药物组合物，其全部内容均通过引用并入本文中。
6.12.治疗方法
在另一个方面中，提高了治疗方法，所述方法包括以有效治疗患者的量向患者施用本文中描述的三价三特异性结合分子。
在一些实施方式中，本公开的抗体可用于治疗癌症。癌症可以是来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳腺、结肠、食道、胃肠、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌症。在一些实施方式中，癌症可以是瘤，恶性的；癌；癌，未分化的；巨大和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛细胞癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性的；胆管癌；肝细胞癌；组合肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；类癌瘤，恶性的；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性粒细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；琥珀酸腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性的；卵巢间质瘤，恶性的；肉瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；成骨细胞瘤，恶性的；支持细胞癌；睾丸间质细胞瘤，恶性的；脂质细胞瘤，恶性的；副神经节瘤，恶性的；乳腺外副神经节瘤，恶性的；嗜铬细胞瘤；肾小球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素瘤；浅表性蔓延性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑素瘤；蓝色痣，恶性的；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性的；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性的；苗勒管(mullerian)混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；肉瘤；间质瘤，恶性的；brenner肿瘤，恶性的；叶状肿瘤，恶性的；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性的；无性细胞瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性的；卵巢肿瘤，恶性的；绒毛膜癌；中肾，恶性的；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性的；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性的；淋巴管；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性的；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因的肉瘤；牙源性肿瘤，恶性的；成釉性牙源肉瘤；成釉细胞瘤，恶性的；成釉细胞纤维肉瘤；松果体，恶性的；脊索瘤；胶质瘤，恶性的；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；原纤维星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质瘤；少突母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节成神经细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性的；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性的；颗粒细胞瘤，恶性的；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金的；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；蕈样真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性白血病；嗜酸粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
本公开的抗体可以自身或以药物组合物的形式施用给受试者以治疗，例如癌症、自身免疫、移植排斥、创伤后免疫响应、移植抗宿主病、缺血，中风和传染病，例如通过靶向病毒抗原(例如HIV的gp120)。
6.13.实施例
通过举例而非限制的方式提供以下实施例。
6.13.1.方法
下文更详细地描述了用于纯化各种抗原结合蛋白的非限制的示例性方法及其在各种测定中的用途。
6.13.1.1.Expi293表达
根据生产商的说明，使用Expi293瞬时转染系统表达测试的各种抗原结合蛋白。简言之，除非另有说明，将编码四条单链的四个质粒以1:1:1:1的质量比混合，并用ExpiFectamine 293转染试剂盒转染至Expi 293细胞。在37℃下使用8％CO2、100％湿度和125rpm的振荡培养细胞。16-18小时的转染后，喂养转染的细胞一次。在第5天通过2000g离心10分钟收获细胞。收集上清液进行亲和层析纯化。
6.13.1.2.蛋白A和抗CH1纯化
使用蛋白A(ProtA)树脂或抗CH1树脂在AKTA Purifier FPLC上分离包含各种抗原结合蛋白的澄清上清液。在进行头对头比较的实例中，将含有各种抗原结合蛋白的上清液分成两个相同的样品。对于ProtA纯化，使用PBS(5mM磷酸钠(pH 7.4)、150mM氯化钠)平衡1mL蛋白A柱(GE Healthcare)。以5ml/min将样品上样到柱上。使用0.1M乙酸(pH 4.0)洗脱样品。通过在280nM处的吸光度监测洗脱情况，并将洗脱峰进行混合以供分析。对于抗CH1纯化，使用PBS平衡1mL CaptureSelectTMXL柱(ThermoFisher)。以5ml/min将样品上样到柱上。使用0.1M乙酸(pH 4.0)洗脱样品。通过在280nM处的吸光度监测洗脱情况，并汇集洗脱峰以供分析。
6.13.1.3.SDS-Page分析
针对完整产物、不完整产物和总体纯度，通过还原和非还原SDS-PAGE分析含有各种分离的抗原结合蛋白的样品。将2μg的每种样品加至15μL的SDS上样缓冲液。在10mM还原剂的存在下将还原样品在75℃下温育10分钟。在没有还原剂的情况下，将非还原样品在95℃下温育5分钟。将还原性和非还原性样品上样至使用运行缓冲液的4-15％梯度TGX凝胶(BioRad)中，并在250伏下运行30分钟。运行完成后，将凝胶用DI水洗涤，并使用GelCode蓝色安全蛋白染色剂(GelCode Blue Safe Protein Stain)(ThermoFisher)染色。在分析前，使用DI水对凝胶脱色。使用标准图像分析软件对脱色凝胶的扫描图像进行光密度分析以计算每个样品中条带的相对丰度。
6.13.1.4.IEX色谱
通过阳离子交换色谱分析包含各种分离的抗原结合蛋白的样品的完整产物与不完整产物和杂质的比率。在AKTA Purifier FPLC上使用5-ml MonoS(GE Lifesciences)来分析澄清的上清液。使用缓冲液A(10mM MES(pH 6.0))来平衡MonoS柱。以2ml/min将样品上样至柱。使用0-30％梯度、超过6CV的缓冲液B(10mM MES(pH 6.0)、1M氯化钠)洗脱样品。通过在280nm处的吸光度监测洗脱，并通过峰积分计算样品的纯度，以鉴定单体峰和污染物峰的丰度。将单体峰和污染物峰分别汇集以供通过如上文所述的SDS-PAGE进行的分析。
6.13.1.5.分析型SEC色谱
通过分析型体积排阻色谱分析包含各种分离的抗原结合蛋白样品的单体与高分子量产物和杂质的比率。用工业标准TSK G3000SWxl色谱柱(Tosoh Bioscience)在Agilent1100HPLC上分析澄清的上清液。使用PBS平衡TSK柱。以1ml/min将25μL的每种样品(1mg/mL)上样至柱上。使用1.5CV的PBS等度流洗脱样品。通过在280nm处的吸光度监测洗脱情况，并通过峰积分分析洗脱峰。
6.13.1.6.质谱
通过质谱分析包含各种分离的抗原结合蛋白的样品，以通过分子量确认正确的种类。所有分析均由第三方研究机构进行。简言之，使用酶混合物处理样品以去除糖基化。样品均以还原形式被测试，以通过分子量特异性鉴定每条链。样品均在非还原条件下被测试，以鉴定样品中所有复合物的分子量。使用质谱分析以根据分子量确定独特产品的数量。
6.13.1.7.通过噬菌体展示实现的抗体发现
使用标准方案进行人Fab文库的噬菌体展示。目的生物素化抗原是购买的或合成的。通过噬菌体ELISA，使用标准方法，针对与目的抗原结合的能力筛选噬菌体克隆。简言之，使用能够在噬菌体(也称为噬菌粒)中复制和表达的表达载体构建Fab形式的噬菌体文库。重链和轻链均在同一表达载体中被编码，其中重链融合至噬菌体衣壳蛋白pIII的截短变体。轻链和重链-pIII融合表达为独立的多肽，并在细菌周质中组装，其中氧化还原电势能够形成二硫键，从而形成含有候选ABS的噬菌体展示抗体。下面列出了文库中使用的噬菌体展示重链(SEQ ID NO:74)和轻链(SEQ ID NO:75)骨架，其中小写字母“x”表示为创建该文库而变化的CDR氨基酸，粗斜体表示恒定的CDR序列。
通过将多样性引入VL和VH CDR序列中来生成特异性文库。通过Kunkel诱变使用引物以将多样性引入VL CDR3和VH CDR1(H1)，CDR2(H2)和CDR3(H3)中以模拟天然抗体库中发现的多样性来创建多样性，如在Kunkel,TA(PNAS 1985年1月1日。82(2)488-492)中更详细地描述的，其全部内容通过引用并入本文中。简言之，使用标准程序从分离的噬菌体制备单链DNA，并进行Kunkel诱变。然后将化学合成的DNA电穿孔至TG1细胞中，随后进行回收。将回收的细胞传代培养并用M13K07辅助噬菌体感染以产生噬菌体文库。
使用标准程序进行噬菌体淘选。简言之，第一轮噬菌体淘选是用固定在链霉亲和素磁珠上的靶标进行的，所述链霉亲和素磁珠在PBST-2％BSA中经受1mL体积的来自制备的文库的～5x1012个噬菌体的处理。在1小时的温育1后，用磁力架将与小珠结合的噬菌体从上清液分离。将小珠洗涤三次以除去非特异性结合的噬菌体，然后将其以OD600～0.6加至ER2738细胞(5mL)。20分钟后，在25mL 2xYT+氨苄西林(Ampicillin)和M13K07辅助噬菌体中传代培养感染的细胞，并允许其在剧烈摇动下在37℃下过夜生长。次日，使用PEG沉淀的标准程序来制备噬菌体。在淘选之前，进行对SAV包被小珠具有特异性的噬菌体的预清除。使用KingFisher磁珠处理器和100nM小珠固化抗原按照标准程序来进行第二轮淘选。总共进行3-4轮噬菌体淘选以富集展示对靶抗原具有特异性的Fab的噬菌体。使用多克隆和单克隆噬菌体ELISA来确认靶标特异性富集。使用DNA测序以确定含有候选ABS的分离的Fab克隆。
为了测量抗原结合剂发现活动中的结合亲和性，使在上述噬菌体筛选中鉴定的VL和VH结构域形成二价单特异性天然人全长IgG1架构并固化在Octet(Pall ForteBio)生物膜层干涉仪的生物传感器上。然后，将目的可溶性抗原加至系统并测量结合。
对于使用B-Body形式进行的实验，使单个克隆的VL可变区形成结构域A和/或结构域H，并使VH区形成如下所示的二价1x1B-Body“BC1”骨架(参考图3)的结构域F和/或结构域L。
“BC1”骨架：
第一多肽链(SEQ ID NO:78)
结构域A＝抗原1B-Body结构域A/H骨架(SEQ ID NO:76)
结构域B＝CH3(T366K；445K、446S、447C三肽插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(T366W、S354C)
第二多肽链(SEQ ID NO:79)：
结构域F＝抗原1B-Body结构域F/L骨架(SEQ ID NO:77)
结构域G＝CH3(L351D；445G、446E、447C三肽插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:80)：
结构域H＝抗原2B-Body结构域A/H骨架(SEQ ID NO:76)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(SEQ ID NO:81)：
结构域L＝抗原2B-Body结构域F/L骨架(SEQ ID NO:77)
结构域M＝CH1。
对于BC1 1x2形式，使可变区结构域形成上述链1、2和4以及具有SEQ ID NO:82序列的链3骨架，其中结构域S与结构域H之间的连接是具有序列TASSGGSSSG(SEQ ID NO:83)的10个氨基酸的接头。在1x2形式中多肽链2和链6是相同的。
6.13.1.8.NFκB GFP Jurkat T细胞刺激测定
NFκB/Jurkat/GFP转录报告细胞系购自System Biosciences(Cat#TR850-1)。用于共刺激的抗CD28抗体购自BD Pharmingen(Cat 555725)。溶液C背景抑制染料购自LifeTechnologies(K1037)。简言之，在96孔黑色壁的透明底板中存在1ug/mL的B-bodyTM抗体和抗CD28抗体的稀释系列的情况下，将Jurkat细胞(效应细胞，E)与肿瘤细胞(T)以2:1至4:1的E：T比率混合。将板在37℃/5％CO2下温育6小时，随后将6X溶液的溶液C背景抑制剂的加至板，并在板读取器上读出GFP荧光。由稀释系列确定EC50值，该值是指给出半数最大响应的抗体浓度。
6.13.1.9.原代T细胞细胞毒性测定
以范围从3:1至10:1的E:T比率混合表达靶肿瘤抗原的细胞(T)和效应细胞(E)。使用的效应细胞包括PBMC或分离的细胞毒性CD8+T细胞。将候选的重定向T细胞抗体以稀释系列添加至细胞。对照包括仅培养基对照，仅肿瘤细胞对照和未处理的E:T细胞对照。将混合细胞和对照条件在37℃/5％CO2下温育40-50小时。从Sigma购买Cytotoxicity DetectionKit Plus(LDH)(Cat 4744934001)，并遵循生产厂商的说明。简言之，加至肿瘤细胞的裂解溶液担当100％细胞毒性对照以及未处理的E:T细胞担当0％细胞毒性对照。通过在490nm处的吸光度确定每个样品中乳酸脱氢酶(LDH)的水平，并将其归一化至100％和0％对照。由稀释系列确定EC50值，该值是指给出半数最大响应的抗体浓度。
6.13.2.实施例1：二价单特异性构建体和二价双特异性构建体
使用标准分子生物学程序遵循以下架构(VL(赛妥珠单抗)-CH3(杵)-CH2-CH3/VH(赛妥珠单抗)-CH3(臼))来构建识别TNFα的二价单特异性B-Body。在这个构建体中，
第一多肽链(SEQ ID NO:1)
结构域A＝VL(赛妥珠单抗)
结构域B＝CH3(IgG1)(杵：S354C+T366W)
结构域D＝CH2(IgG1)
结构域E＝CH3(IgG1)
第二多肽链(SEQ ID NO:2)
结构域F＝VH(赛妥珠单抗)
结构域G＝CH3(IgG1)(臼：Y349C、T366S、L368A、Y407V)
第三多肽链：
与第一多肽链相同
第四多肽链：
与第二多肽链相同。
结构域和多肽链参照符合图3。整个构建体架构在图4中示出。具有以简写“(VL)”识别的结构域A的第一多肽链的序列在SEQ ID NO:1中提供。具有以简写“(VH)”识别的结构域F的第二多肽链的序列在SEQ ID NO:2中提供。
全长构建体在不含大肠杆菌细胞的蛋白质合成表达系统中于26℃下在轻轻摇动下表达～18小时。表达后，将无细胞提取物离心以沉淀不溶物质，并用10x动力学缓冲液(Kinetic Buffer(Forte Bio))将上清液稀释2x，并将其用作生物膜层干涉法的分析物。
将生物素化的TNFα固定在链霉亲和素传感器上以产生～1.5nm的波移位响应。在用10x动力学缓冲液(kinetic buffer)建立基线后，将传感器浸入抗体构建体分析物溶液中。该构建体产生～3nm的响应，与赛妥珠单抗的传统IgG形式相当，这证实了二价单特异性构建体组装成功能性全长抗体的能力。结果显示在图5中。
我们还构建了具有以下结构域架构的二价双特异性抗体：
第一多肽链：VL-CH3-CH2-CH3(杵)
第二多肽链：VH-CH3
第三多肽链：VL-CL-CH2-CH3(臼)
第四多肽链：VH-CH1。
序列(可变区序列除外)分别在SEQ ID NO:3(第一多肽链)、SEQ ID NO:4(第二多肽链)、SEQ ID NO:5(第三多肽链)、SEQ ID NO:6(第四多肽链)中提供。
6.13.3.实施例2：二价双特异性B-Body“BC1”
我们构建了对PD1和第二抗原“抗原A”具有特异性的二价双特异性构建体，其被称为“BC1”。“BC1”架构的显著特征在图6中示出。
更详细地，所述架构(具有符合图3的结构域和多肽链参照以及在括号中表示的天然序列的修饰)是：
第一多肽链(SEQ ID NO:8)
结构域A＝VL(“抗原A”)
结构域B＝CH3(T366K；445K、446S、447C三肽插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(T366W、S354C)
第二多肽链(SEQ ID NO:9)：
结构域F＝VH(“抗原A”)
结构域G＝CH3(L351D；445G、446E、447C三肽插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:10)：
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(SEQ ID NO:11)：
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
结构域A(SEQ ID NO:12)和结构域F(SEQ ID NO:16)形成特异性针对“抗原A”的抗原结合位点(A:F)。结构域H具有来自纳武单抗(nivolumab)的VH序列，并且结构域L具有来自纳武单抗的VL序列；H与L相关联以形成特异性针对人PD1的抗原结合位点(H:L)。
结构域B(SEQ ID NO:13)具有含有多个突变(T366K、445K、446S和447C插入)的人IgG1 CH3的序列。T366K突变是结构域G中L351D残基的电荷对关联体。结构域B上的“447C”残基来自C端的KSC三肽插入。
结构域D(SEQ ID NO:14)具有人IgG1 CH2的序列。
结构域E(SEQ ID NO:15)具有含有突变T366W和S354C的人IgG1 CH3的序列。366W是“杵”突变。354C引入能够与结构域K中的关联349C突变形成二硫键的半胱氨酸。
结构域G(SEQ ID NO:17)具有含有以下突变的人IgG1 CH3的序列：L351D和445G、446E、447C三肽插入。L351D突变引入与结构域B T366K突变关联的电荷对。结构域G上的“447C”残基来自C端的GEC三肽插入。
结构域I(SEQ ID NO:19)具有人Cκ轻链(Cκ)的序列。
结构域J[SEQ ID NO:20]具有人IgG1 CH2结构域的序列，并且与结构域D的序列相同。
结构域K[SEQ ID NO:21]具有含有以下变化的人IgG1 CH3的序列：Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V。349C突变引入能够与结构域E中的关联354C突变形成二硫键的半胱氨酸。356E和L358M引入降低免疫原性的同族同种异型氨基酸。366S、368A和407V是“臼”突变。
结构域M[SEQ ID NO:23]具有人IgG1 CH1区的序列。
使用哺乳动物表达，“BC1”可以容易地以大于100μg/ml的浓度下高水平表达。
我们发现，通过使用来自ThermoFisher的CH1特异性CaptureSelectTM亲和树脂，可以容易地在单个步骤中纯化二价双特异性“BC1”蛋白。
如图7A所示，SEC分析证实单个步骤的CH1亲和纯化步骤通过凝胶过滤产生单个单分散峰，其中>98％是单体。图7B显示了CrossMab二价抗体构建体的SEC分析的比较文献数据。
图8A是使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂进行一步纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线，显示单个陡峰。图8B是使用标准蛋白A纯化进行纯化后的“BC1”的阳离子交换层析洗脱曲线，显示与不完全组装产物的共纯化一致的另外的洗脱峰。
图9显示在非还原性条件下的SDS-PAGE凝胶。如在泳道3中所见，使用CH1亲和树脂的“BC1”的单步纯化提供了几乎均匀的单一条带，泳道4显示进行后续阳离子交换完善步骤的很少的额外纯化。相比之下，泳道7显示使用标准蛋白A纯化的较少量的纯化，泳道8-10证实使用阳离子交换层析的蛋白A纯化的材料的进一步纯化。
图10比较了在非还原性和还原性条件两者下在单步CH1亲和纯化后的“BC1”的SDS-PAGE凝胶(图A)与如在参考文献中公开的在非还原性和还原性条件下的CrossMab双特异性抗体的SDS-PAGE凝胶(图B)。
图11显示“BC1”的质谱分析，证实在还原性条件下两条不同的重链(图11A)和两条不同的轻链(图11B)。图12中的质谱数据确认了纯化后不存在不完全配对。
进行加速稳定性测试以评估“BC1”B-Body设计的长期稳定性。将纯化的B-Body在PBS缓冲液中浓缩至8.6mg/ml，并在40℃温育。使用具有Shodex KW-803柱的分析尺寸排阻色谱(SEC)每周测量结构完整性。通过测量与聚集体的形成相关的完整单体的百分比(单体％)来确定结构完整性。数据显示在图13中。IgG对照1是具有良好稳定性的阳性对照。IgG对照2是已知在温育条件下聚集的阴性对照。如通过分析性SEC测定的，“BC1”B-Body已经温育8周而没有任何结构完整性损失。
我们还确定“BC1”具有高热稳定性，二价构建体的TM为～72℃。
表1在关键可开发性特性方面对“BC1”和CrossMab进行比较：
Figure BDA0002839770970000821
Figure BDA0002839770970000831
*来自Schaefer等(Proc Natl Acad Sci USA.2011Jul 5；108(27):11187-92)的数据。
6.13.4.实施例3：二价双特异性B-Body“BC6”
我们构建了二价双特异性B-Body(被称为“BC6”)。除在结构域B中的残基366处和结构域G中的残基351处保持了野生型残基外，其与“BC1”相同。因此“BC6”缺乏已经被设计为促进“BC1”中结构域B和结构域G的正确配对的电荷对关联体T366K和L351D。“BC6”架构的显著特征在图14中示出。
尽管不存在“BC1”中存在的电荷对残基，我们发现使用CH1亲和树脂的“BC6”的单步纯化得到高度均一的样品。图15A显示使用CaptureSelectTMCH1亲和树脂进行一步纯化后的“BC6”的SEC分析。数据证实单步CH1亲和纯化产生单个单分散峰，这类似于我们在“BC1”中观察到的，其证实多肽链1和2之间以及多肽链3和4之间的二硫键是完整的。色谱图还显示不存在非共价聚集体。
图15B显示在非还原性条件下的SDS-PAGE凝胶，其中泳道1用在单步CH1亲和纯化后的第一批“BC6”加样，泳道2用在单步CH1亲和纯化后的第二批“BC6”加样。泳道3和4证实可以用在CH1亲和纯化之后的离子交换层析实现进一步纯化。
6.13.5.实施例4：二价双特异性B-Body“BC28”、“BC29”、“BC30”、“BC31”
我们构建了二价1x1双特异性B-Body“BC28”、“BC29”、“BC30”和“BC31”，其具有在结构域B和结构域G的CH3界面内的工程化二硫作为在“BC1”和“BC6”中存在的C端的二硫的替代S-S键。文献表明CH3界面的二硫键合不足以在Fc CH3结构域的环境下强迫正交性(orthogonality)。这些B-Body构建体的一般架构在图16中示出，“BC28”的显著特征总结如下：
多肽链1：“BC28”链1(SEQ ID NO:24)
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、T366W)
多肽链2：“BC28”链2(SEQ ID NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
多肽链3：“BC1”链3(SEQ ID NO:10)
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
多肽链4：“BC1”链4(SEQ ID NO:11)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1.
“BC28”A:F抗原结合位点对“抗原A”具有特异性。“BC28”H:L抗原结合位点对PD1(纳武单抗序列)具有特异性。“BC28”结构域B相对于野生型CH3具有以下变化：Y349C；445P、446G、447K插入。“BC28”结构域E相对于野生型CH3具有以下变化：S354C、K366W。“BC28”结构域G相对于野生型具有以下变化：S354C；445P、446G、447K插入。
因此“BC28”具有位于结构域B的349C残基处的工程化半胱氨酸和位于结构域G的354C残基处的工程化半胱氨酸(“349C-354C”)。
“BC29”具有位于结构域B的351C残基和结构域G的351C处半胱氨酸(“351C-351C”)。“BC30”具有位于结构域B的354C残基和结构域G的349C处的工程化半胱氨酸(“354C-349C”)。BC31具有位于394C残基处的工程化半胱氨酸和位于结构域G的394C处的工程化半胱氨酸(“394C-394C”)。BC32具有在结构域B的407C残基和结构域G的407C处的工程化半胱氨酸(“407C-407C”)。
图17显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后在非还原性条件下的SDS-PAGE分析。泳道1和3显示完整“BC28”(泳道1)和“BC30”(泳道3)的高水平表达和实质性均一性。泳道2显示BC29的寡聚化。泳道4和5分别显示BC31和BC32的不良表达，以及BC32中的不充分连接。另一个构建体BC9具有在结构域B的392残基和结构域G的399处引入的半胱氨酸(“392C-399C”)，其是由Genentech报道的二硫配对，证实在SDS PAGE上的寡聚化(数据未显示)。
图18显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的“BC28”和“BC30”的SEC分析。我们还证实了使用蛋白A树脂的单步纯化可以容易地纯化“BC28”(结果未显示)。
6.13.6.实施例5：二价双特异性B-Body“BC44”
图19显示了二价双特异性1x1 B-Body“BC44”的一般架构，我们目前优选的二价双特异性1x1构建体。
第一多肽链(“BC44”链1)(SEQ ID NO:32)
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(P343V；Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域E＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、T366W)
第二多肽链(＝“BC28”多肽链2)(SEQ NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
第三多肽链(＝“BC1”多肽链3)(SEQ ID NO:10)
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(＝“BC1”多肽链4)(SEQ ID NO:11)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
6.13.7.实施例6：可变CH3连接工程化
我们产生了一系列变体，其中我们突变了结构域A与结构域B之间的VL-CH3连接和结构域F与结构域G之间的VH-CH3连接以评估二价1x1 B-Body构建体的表达水平、组装和稳定性。尽管可能存在许多解决方案，但为了减少T细胞表位的引入，我们选择仅使用在VL、VH和CH3结构域内天然发现的残基。结构域架构的结构评估进一步限制了期望的序列组合。下文的表2和表3显示基于“BC1”和其他二价构建体的多种连接变体的连接。
Figure BDA0002839770970000861
Figure BDA0002839770970000871
Figure BDA0002839770970000872
Figure BDA0002839770970000881
图20显示“BC15”和“BC16”样品于40℃下在加速稳定性测试方案的指定周的尺寸排阻色谱。“BC15”保持稳定；“BC16”被证明随着时间的推移是不稳定的。
6.13.8.实施例7：三价2x1双特异性B-Body构建体(“BC1-2x1”)
我们基于“BC1”构建了三价2x1双特异性B-Body“BC1-2x1”。该架构的显著特征在图22中示出。
更详细地，使用图21中总结的结构域和多肽链参照。
第一多肽链
结构域N＝VL(“抗原A”)
结构域O＝CH3(T366K、447C)
结构域A＝VL(“抗原A”)
结构域B＝CH3(T366K、447C)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(杵，354C)
第五多肽链(＝“BC1”链2)
结构域P＝VH(“抗原A”)
结构域Q＝CH3(L351D、447C)
第二多肽链(＝“BC1”链2)
结构域F＝VH(“抗原A”)
结构域G＝CH3(L351D、447C)
第三多肽链(＝“BC1”链3)
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL(κ)
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(臼，349C)
第四多肽链(＝“BC1”链4)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
图23显示使用Thermo Fisher Expi293瞬时转染系统表达的蛋白质的非还原性SDS-PAGE。
泳道1显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的三价2x1“BC1-2X1”蛋白的洗脱液。泳道2显示使用CaptureSelectTM CH1亲和树脂的一步纯化后的较低分子量、较快迁移的二价“BC1”蛋白。泳道3-5显示使用蛋白A的“BC1-2x1”的纯化。泳道6和7显示使用CH1亲和树脂的“BC1-2x1”的纯化。
图24使用Octet(Pall ForteBio)分析比较了二价“BC1”构建体的亲合力与三价2x1“BC1-2x1”构建体的亲合力。将生物素化的抗原“A”固定在表面上，并为了结合分析使抗体构建体在表面上通过。
6.13.9.实施例8：三价2x1三特异性B-Body构建体(“TB111”)
我们设计了具有图25所示意的架构的三价2x1三特异性分子“TB111”。参考图21中阐述的结构域命名惯例，TB111具有以下架构(“Ada”表示来自阿达木单抗的V区)：
多肽链1
结构域N：VH(“Ada”)
结构域O：CH3(T366K、394C)
结构域A：VL(“抗原A”)
结构域B：CH3(T366K、349C)
结构域D：CH2
结构域E：CH3(杵，354C)
多肽链5
结构域P：VL(“Ada”)
结构域Q：CH3(L351D、394C)
多肽链2
结构域F：VH(“抗原A”)
结构域G：CH3(L351D、351C)
多肽链3
结构域H：VL(“Nivo”)
结构域I：CL(κ)
结构域J：CH2
结构域K：CH3(臼，349C)
多肽链4(＝“BC1”链4)
结构域L：VH(“Nivo”)
结构域M：CH1
这个构建体没有表达。
6.13.10.实施例9：三价1x2双特异性构建体(“BC28-1x2”)
我们构建了具有以下结构域结构的三价1x2双特异性B-Body：
第一多肽链(＝“BC28”链1)(SEQ ID NO:24)
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、T366W)
第二多肽链(＝“BC28”链2)(SEQ ID NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:37)
结构域R＝VL(抗原“A”)
结构域S＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
接头＝GSGSGS
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(＝“BC1”链4)(SEQ ID NO:11)：
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
第六多肽链(＝“BC28”链2)(SEQ ID NO:25)
结构域T＝VH(抗原“A”)
结构域U＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
如同H:L结合抗原结合位点一样，A:F抗原结合位点对“抗原A”具有特异性。R:T抗原结合位点对PD具有特异性。因此，该构建体的特异性是抗原“A”x(PD1-抗原“A”)。
6.13.11.实施例10：三价1x2双特异性构建体(“CTLA4-4 xNivo x CTLA4-4”)
我们构建了具有如图27中示意的一般结构的三价1x2双特异性分子(“CTLA4-4 xNivo x CTLA4-4”)。结构域命名在图26中阐述。
图28是SDS-PAGE凝胶，其中显示在非还原性和还原性条件下的“CTLA4-4 x Nivox CTLA4-4”构建体的泳道已经用方框标示。
图29比较了两种抗体的抗原结合：“CTLA4-4 x OX40-8”和“CTLA4-4 x Nivo xCTLA4-4”。“CTLA4-4 x OX40-8”单价地结合至CTLA4；而“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”二价地结合至CTLA4。
6.13.12.实施例11：三价1x2三特异性构建体“BC28-1x1x1a”
我们构建了具有如图30所示意的一般结构的三价1x2三特异性分子。参考图26中所阐述的结构域命名法。
第一多肽链(＝“BC28”链1)[SEQ ID NO:24]
结构域A＝VL(抗原“A”)
结构域B＝CH3(Y349C；445P、446G、447K插入)
结构域D＝CH2
结构域E＝CH3(S354C、T366W)
第二多肽链(＝“BC28”链2)(SEQ ID NO:25)
结构域F＝VH(抗原“A”)
结构域G＝CH3(S354C；445P、446G、447K插入)
第三多肽链(SEQ ID NO:45)
结构域R＝VL(CTLA4-4)
结构域S＝CH3(T366K；445K、446S、447C插入)
接头＝GSGSGS
结构域H＝VL(“Nivo”)
结构域I＝CL
结构域J＝CH2
结构域K＝CH3(Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V)
第四多肽链(＝“BC1”链4)(SEQ ID NO:11)
结构域L＝VH(“Nivo”)
结构域M＝CH1。
第六多肽链(＝hCTLA4-4链2)(SEQ ID NO:53)
结构域T＝VH(CTLA4)
结构域U＝CH3(L351D、445G、446E、447C插入)
该三特异性构建体的抗原结合位点是：
抗原结合位点A:F对“抗原A”具有特异性
抗原结合位点H:L对PD1(纳武单抗序列)具有特异性
抗原结合位点R:T对CTLA4具有特异性。
图31显示瞬时表达和使用CaptureSelectTMCH1亲和树脂的一步纯化后“BC28-1x1x1a”的尺寸排阻色谱，其展示单个明确界定的峰。
6.13.13.实施例12：二价和三价构建体的SDS-PAGE分析
图32显示各种构建体各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTMCH1亲和树脂的一步纯化后在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE凝胶。
泳道1(非还原性条件)和2(还原性条件，+DTT)是二价1x1双特异性构建体“BC1”。泳道3(非还原性)和4(还原性)是三价双特异性2x1构建体“BC1-2x1”(参见实施例7)。泳道5(非还原性)和6(还原性)是三价1x2双特异性构建体“CTLA4-4 x Nivo x CTLA4-4”(参见实施例10)。泳道7(非还原性)和8(还原性)是实施例11中描述的三价1x2三特异性“BC28-1x1x1a”构建体。
SDS-PAGE凝胶证实各种构建体的完整组装，主要条带在非还原性凝胶中在对每种构建体所预期的分子量处显示。
6.13.14.实施例13：结合分析
图33显示对3种抗原：PD1、抗原“A”和CTLA-4的Octet结合分析。在每种情况下，抗原被固定并且B-Body是分析物。作为参照，还比较了1x1双特异性“BC1”和“CTLA4-4 xOX40-8”以证实1x1B-Body仅特异性结合针对其选择抗原结合位点的抗原。
图33A显示“BC1”与PD1和抗原“A”但不与CTLA4结合。图33B显示二价双特异性1x1构建体“CTLA4-4 x OX40-8”与CTLA4但不与抗原“A”或PD1结合。图33C显示三价三特异性1x2构建体“BC28-1x1x1a”与PD1、抗原“A”和CTLA4结合。
6.13.15.实施例14：四价构建体
图35显示2x2四价双特异性构建体“BC22-2x2”的总体架构。通过使每个可变结构域-恒定结构域区段加倍，用“BC1”骨架构建该2x2四价双特异性。结构域命名法在图34中示意。
图36是SDS-PAGE凝胶。泳道7-9分别显示使用CaptureSelectTMCH1亲和树脂的一步纯化后(“CH1洗脱液”)和在另外的离子交换层析纯化后(泳道8，“在IEX后的pk1”；泳道9，“在IEX后的pk2”)的“BC22-2x2”四价构建体。泳道1-3是在CH1亲和纯化(泳道1)和后续的离子交换层析(泳道2和3)后的三价2x1构建体“BC21-2x1”。泳道4-6是1x2三价构建体“BC12-1x2”。
图37显示2x2四价构建体的总体结构。
图39和40示意具有替代结构的四价构建体。结构域命名发在图38中示出。
6.13.16.实施例15：B-Body的双特异性抗原结合。
构建了四价双特异性2x2 B-Body“B-Body-IgG 2x2”。更详细地，使用图38中总结的结构域和多肽链参照。
第一多肽链
结构域A＝VL(赛妥珠单抗)
结构域B＝CH3(IgG1，杵)
结构域D＝CH2(IgG1)
结构域E＝CH3(IgG1)
结构域W＝VH(抗原“A”)
结构域X＝CH1(IgG1)
第三多肽链(与第一多肽链相同)
结构域H＝VL(赛妥珠单抗)
结构域I＝CH3(IgG1，杵)
结构域J＝CH2(IgG1)
结构域K＝CH3(IgG1)
结构域WW＝VH(抗原“A”)
结构域XX＝CH1(IgG1)
第二多肽链
结构域F＝VH(赛妥珠单抗)
结构域G＝CH3(IgG1，臼)
第四多肽链(与第三多肽链相同)
结构域F＝VH(赛妥珠单抗)
结构域G＝CH3(IgG1，臼)
第七多肽链
结构域Y＝VH(“抗原A”)
结构域Z＝CLκ
第八多肽链(与第七多肽链相同)
结构域YY＝VH(“抗原A”)
结构域ZZ＝CLκ。
这如实施例1所述克隆并表达。此处，BLI实验由以下组成：生物素化的抗原“A”固定于链霉亲和素传感器上，接着用10x Kinetic Buffer建立基线。然后将传感器浸入无细胞表达的“B-Body-IgG 2x2”中，随后建立新的基线。最后，将传感器浸入100nM TNFα中，其中观察到第二结合事件，确认了单个“B-Body-IgG 2x2”构建体对抗原两者的双特异性结合。结果显示在图41中。
6.13.17.实施例16：“BB-IgG 2x2”的抗原特异性细胞结合。
使用Expi-293转染试剂盒(Life Technologies)对Expi-293细胞进行模拟转染或用抗原“B”瞬时转染。转染后48小时，收获Expi-293细胞并于室温下在4％多聚甲醛中固定15分钟。将细胞在PBS中洗涤两次。将200,000个抗原B或模拟转染的Expi-293细胞置于V形底96孔板中的100μL PBS中。将细胞与3μg/mL浓度的“B-Body-IgG 2x2”在室温下一起温育1.5小时。将细胞在300×G下离心7分钟，在PBS中洗涤，并与100μL的浓度为8μg/mL的FITC标记的山羊抗人二抗在室温下一起温育1小时。将细胞以300×G离心7分钟，用PBS洗涤，使用Guava easyCyte通过流式细胞术来确认细胞结合。结果显示在图42中。
6.13.18.实施例17：二价和三价构建体的SDS-PAGE分析
图45显示各种构建体各自在瞬时表达和使用CaptureSelectTMCH1亲和树脂的一步纯化后在非还原性和还原性条件下的SDS-PAGE凝胶。
泳道1(非还原性条件)和2(还原性条件，+DTT)是二价1x1双特异性构建体“BC1”。泳道3(非还原性)和4(还原性)是二价1x1双特异性构建体“BC28”(参见实施例4)。泳道5(非还原性)和6(还原性)是二价1x1双特异性构建体“BC44”(参见实施例5)。泳道7(非还原性)和8(还原性)是三价1x2双特异性“BC28-1x2”构建体(参见实施例9)。泳道9(非还原性)和10(还原性)是实施例11中描述的三价1x2三特异性“BC28-1x1x1a”构建体。
SDS-PAGE凝胶证实各种构建体的完整组装，非还原性凝胶中的主要条带在每种构建体预期的分子量处显示。
6.13.19.实施例18：可变CH3连接工程化的稳定性分析
评估了各种连接变体组合之间的配对稳定性。进行差示扫描荧光测定以确定来自链1(结构域A和B)的VL-CH3多肽与来自2(结构域F和G)的VH-CH3多肽之间的各种连接变体配对的熔融温度。连接变体“BC6jv”、“BC28jv”、“BC30jv”、“BC44jv”和“BC45jv”(其每一个具有上文表2和表3中的“BC6”、“BC28”、“BC30”、“BC44”和“BC45”的对应连接序列)证实增加的配对稳定性，Tm在76-77度范围内(参见表4)。图46显示“BC24jv”、“BC26jv”和“BC28jv”的热转变的差异，“BC28jv”表现出三者中的最大稳定性。该图的x轴是温度，y轴是荧光的变化除以温度的变化(-dFluor/dTemp)。如Niesen等(Nature Protocols,(2007)2,2212–2221)中所述进行实验，其全部教导通过引用并入本文中。
Figure BDA0002839770970000971
6.13.20.实施例19：CD3候选结合分子
如下所示，构建和检测多种CD3抗原结合位点。
6.13.20.1.CD3结合臂
使用VH或VL氨基酸序列(SEQ ID No:70-73)中的点突变来工程化基于SP34抗-CD3抗体(SP34-89，SEQ ID NO:68和69)的人源化形式的一系列CD3结合臂变体。如表5中所述将多种VH和VL序列配对在一起。
Figure BDA0002839770970000981
将VL和VH变体克隆到1x1 BC1 B-Body的一个臂中，而另一臂包含无关的抗原结合位点。图47证明了未突变的SP34-89单价B-Body的结合亲和性，如通过Octet(PallForteBio)生物膜层干涉分析所确定的。使用该构建体的两倍连续稀释液(200-12.5nM)确定针对SP34-89的23nM的结合亲和性(kon＝3x105 M-1s-1，koff＝7.1x10-3s-1)，与文献中其他SP34变体的亲和性相匹配。动力学亲和性也与平衡结合亲和性匹配。
6.13.20.2.CD3结合臂的发现
如上所述，使用单克隆噬菌体ELISA形式针对CD3抗原筛选具有引入Fab CDR中的多样性的化学合成Fab噬菌体文库，其中评估了板固化的CD3变体与噬菌体的结合。对表达识别CD3抗原的Fab的噬菌体克隆进行测序。表A列出了CD3抗原结合位点候选物。有趣的是，CD3-8与人和猕猴CD3抗原交叉反应。
Figure BDA0002839770970000982
Figure BDA0002839770970000991
6.13.21.实施例20：双特异性B-Body一步纯化
还测试了双特异性抗体的抗CH1纯化效率，以分析仅在双特异性抗体Fc部分内的天然位置发现的CH3结构域中引入标准杵臼正交突变而没有其他结构域修饰的结合分子。因此，检测了两个抗体KL27-6和KL27-7，每个含有两个CH1结构域，在抗体的每个臂上各有一个。如在第6.13.1节中更详细描述的，表达每种双特异性抗体，在抗CH1柱上将其从不需要的蛋白产物中纯化，并在SDS-PAGE凝胶上运行。如在图48中所示，在75kDa处存在代表不完整双特异性抗体的明显条带，说明复合物仅含有(i)第一多肽链和第二多肽链或者(ii)第三多肽链和第四多肽链，参考图3。因而，使用抗CH1的方法纯化每个臂中都有CH1结构域的完整双特异性分子，由于抗体复合物不完整，导致背景污染。
6.13.22.实施例21：Fc突变降低效应功能
在单克隆IgG1抗体曲妥珠单抗(赫赛汀，“WT-IgG1”)中产生了一系列工程化的Fc变异体，其CH2结构域的位置L234、L235和P329处具有突变。所检测变体的特定突变如下表6所示，并且包括sFc1(PALALA)、sFc7(PGLALA)和sFc10(PKLALA)。所有变体均是通过如本文所述的Expi293表达生产的。
Figure BDA0002839770970001001
使用蛋白热转移染料试剂盒(Thermo Fisher)确定蛋白的解链温度。简言之，将目的蛋白的浓度提高到1mg/ml。将热转移染料混合物(水、热转移缓冲液和热转移染料)加入目的蛋白中。将蛋白/热染料混合物添加到玻璃毛细管中，并在Roche Light Cycler上使用热梯度进行分析。将蛋白在37℃下温育2分钟，然后以0.1℃/秒的升温速率启动从37℃到99℃的热梯度。测量荧光随时间的增加，并用于计算热熔温度。表6中描述了上述蛋白热转移实验的结果。所有变体均显示出具有与野生型IgG可比的稳定性。
将WT-IgG1和Fc变体固化到Octet生物传感器上，并将可溶性FcγRIa加入系统以确定结合。图49显示了Octet(Pall ForteBio)生物膜层干涉测量分析，表明FcγRIa结合曲妥珠单抗(图49A“WT IgG1”)，但不结合sFc10(图49B)。加入FcγRIa后，可见曲妥珠单抗信号增强，但未检测到sFc10信号增强，其表明FcγRIa不再结合工程化突变的抗体。在表6中提供了对所检测变体的结合总结。此外，所有变体保持与HER2较强的结合(未显示)。
作为FcγR结合的另一个指标，在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定中测试了WT-IgG1和Fc变体。简言之，使用ADCC生物报告测定试剂盒(Promega)评估了选定的Fc突变对FCγRIIIa效应功能的影响。将每种变体的系列稀释液与SKBR3细胞一起温育。然后，根据生产厂商的方案，将反应物在37℃的湿润CO2培养箱中与ADCC生物测定效应细胞一起温育，并温育6至24小时。温育后，将Bio-GloTM荧光素酶测定试剂添加到每个样品中，并使用具有发光型发光读取功能的酶标仪测量发光信号。
如图50所示，曲妥珠单抗(赫赛汀，“WT-IgG1”)显示出杀伤作用，而测试的Fc变体均未导致可检测水平的杀伤作用。
还通过ELISA测试了WT-IgG1和Fc变体的补体成分C1q结合。简言之，每个变体最多可固化128μg/ml IgG。用12μg/ml C1q和1/400稀释的C1q-HRP二抗进行ELISA。洗涤并在PBST-BSA(1％)中稀释样品。
如图51所示，曲妥珠单抗(赫赛汀，“WT-IgG1”)显示出C1q结合，而sFc1、sFc7和sFc10均未检测到C1q结合。因而，结果表明，所检测的Fc变体具有降低水平的Fc效应功能。
6.13.23.实施例22：使用共有轻链文库发现具有共有VL序列的新ABS
从头鉴定了具有共享共同轻链可变序列的两个新抗原结合位点(ABS)的三价三特异性结合分子。所使用的共有轻链文库将CDR的多样性限制为重链可变结构域(VH)。创建共有轻链文库，以供体外展示(噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物展示等)或在人源化动物模型中使用。用共有轻链文库进行的选择产生了三价三特异性结合分子，其针对两个ABS的VH结构域中具有多样性，但是在轻链可变结构域(VL)中的单个序列为两个ABS共有。
6.13.23.1.共有轻链噬菌体文库的构建
使用来源于特定重链可变结构域(例如，VH3-23)和特定轻链可变结构域(例如Vk-1)的序列建立共有轻链文库。可以通过本领域公知的各种策略建立噬菌体展示文库。这里，使用能够在噬菌体中复制和表达的表达载体(也称为“噬菌粒”)构建Fab形式的噬菌体文库。重链和轻链均在同一表达载体中编码，其中重链融合至噬菌体衣壳蛋白pIII的截短变体。轻链和重链作为单一多肽表达，并且轻链和重链-pIII融合在细菌周质中装配，其中氧化还原电势可形成二硫键，从而形成含有候选ABS的抗体。
为了构建共有轻链文库，选择单个轻链可变结构域，其中共有轻链CDR1(L1)和CDR2(L2)保留人种系序列，并且CDR3(L3)选自能够支持与各种抗原结合的共有序列。也可以构建文库，其中改变共有轻链中的所有VL CDR，以代表人类轻链可变序列的全部多样性。对于给定共有轻链，通过在人抗体库中发现的CDR长度，使VH结构域的所有CDR位置多样化，以匹配位置氨基酸频率。可以通过本领域公知的各种策略建立多样性。此处，用将多样性引入VH CDR H1、H2和H3中以模拟天然抗体库中发现的多样性的引物进行Kunkel诱变，如在Kunkel,TA(PNAS 1985年1月1日。82(2)488-492)中更详细地描述的，其全部内容通过引用并入本文中。简言之，使用标准程序从分离的噬菌体制备单链DNA，并进行Kunkel诱变。然后，将化学合成的DNA电穿孔至TG1细胞中，随后进行回收。将回收的细胞传代培养并用M13K07辅助噬菌体感染以产生噬菌体文库。
6.13.23.2.共有轻链噬菌体的筛选
使用标准程序进行噬菌体淘选。简言之，第一轮噬菌体淘选是用固定在链霉亲和素磁珠上的靶标进行的，所述链霉亲和素磁珠在PBST-2％BSA中经受1mL体积的来自制备的文库的～5x1012个噬菌体的处理。在1小时的温育1后，用磁力架将与小珠结合的噬菌体从上清液分离。将小珠洗涤三次以除去非特异性结合的噬菌体，然后将其以OD600～0.6加至ER2738细胞(5mL)。20分钟后，在25mL 2xYT+氨苄西林和M13K07辅助噬菌体中传代培养感染的细胞，并允许其在剧烈摇动下在37℃下过夜生长。次日，使用PEG沉淀的标准程序来制备噬菌体。在淘选之前，进行对SAV包被小珠具有特异性的噬菌体的预清除。使用KingFisher磁珠处理器和100nM小珠固化抗原按照标准程序来进行第二轮淘选。总共进行3-4轮噬菌体淘选以富集展示对靶抗原具有特异性的Fab噬菌体。使用多克隆和单克隆噬菌体ELISA来确认靶标特异性富集。
6.13.23.3.使用共有轻链文库的三价三特异性抗体的发现
在发现活动中，鉴定出一种具有共享共有轻链可变区(VL)的两个新ABS的三价三特异性抗体，其中每个识别不同抗原或同一抗原的不同表位。三价三特异性抗体还具有不共享共有VL区的第三ABS，其对第三个独特的抗原具有特异性。
如上所述，使用共有轻链文库的噬菌体展示活动可用于分别鉴定结合抗原1(A1)或抗原2(A2)的候选ABS。鉴定出具有相同VL但具有不同VH的ABS，这些VH赋予抗原1或抗原2特异性，亲和性范围为1μM至1nM以下。将ABS重新形成全长人二价单特异性天然IgG1架构，以进行表征。针对结合亲和性、表位和一般生物物理特性(表达、纯度、可显色性等)评价候选物。鉴定出与抗原1和抗原2两者结合具有范围从10nM-1μM(或优选地，50nM-250nM)的单个结合亲和性的ABS其。
针对来自抗原1和抗原2的亲本IgG候选物的VL和VH结构域，以及特异性针对抗原3(A3)的第三种ABS，重新形成下面的1x2抗体形式。将候选物的组合通过瞬时哺乳动物表达进行表达，纯化并测试将两种抗原同时共同接合在细胞表面的能力。候选物具有下述结合性质：
对抗原1的单价KD：50至100nM
对抗原2的单价KD：50至100nM
对抗原3的单价KD：<100nM
对双重阳性细胞的二价亲和力：<10nM
候选物的链架构(参考图55)：
链1：VHA1-CH3-CH2-CH3臼
链2和链6：VLA1/A2-共有-CH3
链3：VHA2-CH3-VHA3-CH1-CH2-CH3杵
链4：VLA3-CL1
(注意：VLA3-CL1和VHA3-CH1可以互换，并且所有结构域都可以具有此前描述的任何正交突变)
6.13.23.4.使用共有轻链文库的T细胞重新定向的三价三特异性抗体的发现
在发现活动中，鉴定出一种具有共享共有轻链可变区(VL)的两个新ABS的三价三特异性抗体，其中每个识别不同肿瘤抗原或同一肿瘤抗原的不同表位。三价三特异性抗体还具有第三ABS，其不共享共有VL区，其对用于T细胞重新定向疗法的T细胞分子(如CD3ε)具有特异性。也可以将这种三价三特异性抗体设计为利用对两种肿瘤抗原的低单价亲和性，以实现与在细胞表面上存在这两种抗原的肿瘤细胞的强二价结合。
如上所述，使用共有轻链文库的噬菌体展示活动可用于分别鉴定结合肿瘤抗原1(TA1)或肿瘤抗原2(TA2)的候选ABS。鉴定出具有相同VL但具有不同VH的ABS，这些VH赋予抗原1或抗原2特异性，亲和性范围为1μM至1nM以下。将ABS重新形成全长人二价单特异性天然IgG1架构，以进行表征。针对结合亲和性、表位和一般生物物理特性(表达、纯度、可显色性等)评价候选物。鉴定出与抗原1和抗原2两者结合具有范围从10nM-1μM(或优选地，50nM-250nM)的单个结合亲和性的ABS。
来自针对肿瘤抗原1和肿瘤抗原2的亲本IgG候选物的VL和VH结构域，以及特异性针对CD3(例如，SP34、OKT3等，及其人源化变体)的第三种已知ABS重新形成下面的1x2抗体形式。将候选物的组合通过瞬时哺乳动物表达进行表达，纯化并测试将两种抗原同时共同接合在细胞表面的能力。进行其他功能性测定(如T细胞杀伤和增殖测定)以表征抗体功效。候选物具有下述结合性质：
对抗原1的单价KD：50至100nM
对抗原2的单价KD：50至100nM
对CD3ε的单价KD：20至100nM
对双重阳性肿瘤细胞的二价亲合力：<10nM
候选物的链架构(参考图55)：
链1：VHTA1-CH3-CH2-CH3臼
链2和链6：VLTA1/TA2-共有-CH3
链3：VHTA2-CH3-VHCD3-CH1-CH2-CH3杵
链4：VLCD3-CL1
(注意：VLCD3-CL1和VHCD3-CH1可以互换，并且所有结构域都可以具有此前描述的任何正交突变)
6.13.24.实施例23：使用共有重链文库的具有共有VH序列的ABS的发现
从头鉴定了具有共享共同重链可变序列的两个新抗原结合位点(ABS)的三价三特异性结合分子。使用共有轻链文库将CDR的多样性限制在轻链可变结构域(VL)。创建共有重链文库，以供体外展示(噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物展示等)或在人源化动物模型中使用。用共有重链文库进行的选择产生了三价三特异性结合分子，其针对两个ABS的VL结构域中具有多样性，但是在重链可变结构域(VH)中的单一序列为两个ABS共有。
6.13.24.1.共有重链噬菌体文库的构建
使用来源于特定重链可变结构域(例如人VH3-23)和特定轻链可变结构域(例如人Vk-1)的序列建立共有重链文库。可以通过本领域公知的各种策略建立噬菌体展示文库。这里，使用能够在噬菌体中复制和表达的表达载体(也称为“噬菌粒”)构建Fab形式的噬菌体文库。重链和轻链均在同一表达载体中编码，其中重链与噬菌体衣壳蛋白pIII的截短变体融合。轻链和重链作为单一多肽表达，并且轻链和重链-pIII融合在细菌周质中装配，其中氧化还原电势可形成二硫键，从而形成含有候选ABS的抗体。
为了构建共有重链文库，选择单个重链可变结构域，其中共有重链CDR1(H1)和CDR2(H2)保留人种系序列，并且CDR3(H3)选自能够支持与各种抗原结合的共有序列。也可以构建文库，其中改变共有重链中的所有VH CDR，以代表人类重链可变序列的全部多样性。对于给定共有重链，通过在人抗体库中发现的CDR长度，使VL结构域的所有CDR位置多样化，以匹配位置氨基酸频率。可以通过本领域公知的各种策略建立多样性。用将多样性引入VLCDR L1、L2和L3中以模拟天然抗体库中发现的多样性的引物进行Kunkel诱变，如在Kunkel,TA(PNAS 1985年1月1日。82(2)488-492)中更详细地描述的，其全部内容通过引用并入本文中。简言之，使用标准程序从分离的噬菌体制备单链DNA，并进行Kunkel诱变。然后，将化学合成的DNA电穿孔至TG1细胞中，随后进行回收。将回收的细胞传代培养并用M13K07辅助噬菌体感染以产生噬菌体文库。
6.13.24.2.共有重链噬菌体的筛选
使用标准程序进行噬菌体淘选。简言之，第一轮噬菌体淘选是用固定在链霉亲和素磁珠上的靶标进行的，所述链霉亲和素磁珠在PBST-2％BSA中经受1mL体积的来自制备的文库的～5x1012个噬菌体的处理。在1小时的温育1后，用磁力架将与小珠结合的噬菌体从上清液分离。将小珠洗涤三次以除去非特异性结合的噬菌体，然后将其以OD600～0.6加至ER2738细胞(5mL)。20分钟后，在25mL 2xYT+氨苄西林和M13K07辅助噬菌体中传代培养感染的细胞，并允许其在剧烈摇动下在37℃下过夜生长。次日，使用PEG沉淀的标准程序来制备噬菌体。在淘选之前，进行对SAV包被小珠具有特异性的噬菌体的预清除。使用KingFisher磁珠处理器和100nM小珠固化抗原按照标准程序来进行第二轮淘选。总共进行3-4轮噬菌体淘选以富集展示对靶抗原具有特异性的Fab噬菌体。使用多克隆和单克隆噬菌体ELISA来确认靶标特异性富集。
6.13.24.3.使用共有重链文库的三价三特异性抗体的发现
在发现活动中，鉴定出一种具有共享共有重链可变区(VH)的两个新ABS的三价三特异性抗体，其中每个识别不同抗原或同一抗原的不同表位。三价三特异性抗体还具有不共享共有VH区的第三ABS，其对第三个独特抗原具有特异性。
如上所述，使用共有重链文库的噬菌体展示活动可用于分别鉴定结合抗原1(A1)或抗原2(A2)的候选ABS。鉴定出具有相同VH但具有不同VL的ABS，这些VL赋予抗原1或抗原2特异性，亲和性范围为1μM至1nM以下。将ABS重新形成全长人二价单特异性天然IgG1架构，以进行表征。针对结合亲和性、表位和一般生物物理特性(表达、纯度、可显色性等)评价候选物。鉴定出与抗原1和抗原2两者结合具有范围从10nM-1μM(或优选地，50nM-250nM)的单个结合亲和性其的ABS。
针对来自抗原1和抗原2的亲本IgG候选物的VL和VH结构域，以及特异性针对抗原3(A3)的第三ABS，重新形成下面的1x2 B-Body形式。示例性1x2 B-body骨架链如SEQ ID NO:78、79、81和82所示。将候选物的组合通过瞬时哺乳动物表达进行表达，纯化并测试将两种抗原同时共同接合在细胞表面的能力。候选物具有下述结合性质：
对抗原1的单价KD：50至100nM
对抗原2的单价KD：50至100nM
对抗原3的单价KD：<100nM
对双重阳性肿瘤细胞的二价亲合力：<10nM
候选物的链架构(参考图55)：
链1：VLA1-CH3-CH2-CH3臼
链2和链6：VHA1/A2-共有-CH3
链3：VLA2-CH3-VLA3-CL1-CH2-CH3杵
链4：VHA3-CH1
(注意：VLA3-CL1和VHA3-CH1可以互换，并且所有结构域都可以具有此前描述的任何正交突变)
6.13.24.4.使用共有重链文库的T细胞重新定向的三价三特异性抗体的发现
在发现活动中，鉴定出一种具有共享共有重链可变区(VH)的两个新ABS的三价三特异性抗体，其中每个识别不同肿瘤抗原或同一肿瘤抗原的不同表位。三价三特异性抗体还具有不共享共有VH区的第三ABS，其对用于T细胞重新定向疗法的T细胞分子(如CD3ε)具有特异性。也可以将这种三价三特异性抗体设计为利用对两种肿瘤抗原的低单价亲和性，以实现与在细胞表面上存在这两种抗原的肿瘤细胞的强二价结合。
如上所述，使用共有重链文库的噬菌体展示活动可用于分别鉴定结合肿瘤抗原1(TA1)或肿瘤抗原2(TA2)的候选ABS。鉴定出具有相同VH但具有不同VL的ABS，这些VL赋予肿瘤抗原1或肿瘤抗原2特异性，亲和性范围为1μM至1nM以下。将ABS重新形成全长人二价单特异性天然IgG1架构，以进行表征。针对结合亲和性、表位和一般生物物理特性(表达、纯度、可显色性等)评价候选物。鉴定出与抗原1和抗原2两者结合具有范围从10nM-1μM(或优选地，50nM-250nM)的单个结合亲和性的ABS其。
针对来自肿瘤抗原1和肿瘤抗原2的亲本IgG候选物的VL和VH结构域，以及特异性针对CD3(例如，SP34、OKT3等，及其人源化变体)的第三种ABS，重新形成下面的1x2 B-Body形式。示例性1x2 B-body骨架链如SEQ ID NO:78、79、81和82所示。将候选物的组合通过瞬时哺乳动物表达进行表达，纯化并测试将两种抗原同时共同接合在细胞表面的能力。进行其他功能性测定(如T细胞杀伤和增殖测定)以表征抗体功效。候选物具有下述结合性质：
对抗原1的单价KD：50至100nM
对抗原2的单价KD：50至100nM
对CD3ε的单价KD：20至100nM
对双重阳性肿瘤细胞的二价亲合力：<10nM
候选物的链架构(参考图55)：
链1：VLTA1-CH3-CH2-CH3臼
链2和链6：VHTA1/TA2-共有-CH3
链3：VLTA2-CH3-VLCD3-CL1-CH2-CH3杵
链4：VHCD3-CH1
(注意：VLCD3-CL1和VHCD3-CH1可以互换，并且所有结构域都可以具有此前描述的任何正交突变)
6.13.25.实施例24：基于已知ABS序列的具有共有VL或VH序列的新ABS的发现
从具有已知特异性的亲本ABS序列开始，鉴定出具有两个新的抗原结合位点(ABS)的三价三特异性结合分子，这些抗原结合位点共享共有轻链可变序列或共有重链可变序列。共有轻链文库将CDR的多样性限制为重链可变结构域(VH)，而共有重链文库将CDR的多样性限制为重链可变结构域(VL)。形成共有轻链或重链文库，以供在体外展示(噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物展示等)或在人源化动物模型中使用。
尽管其他文库从VH或VL序列(包括种系序列)从头开始，这些序列与结合特异性无关，但此处进行的筛选从具有已知特异性的ABS开始，该ABS可以包括种系序列以外的CDR序列。如上所述，从已知的ABS序列开始，亲本VH或VL序列分别与在其CDR中引入了多样性的VL或VH序列配对。如前所述，筛选非关联的VH/VL对(即不是来自亲本ABS的VH和VL对)与两种抗原抗原1和抗原2的结合。抗原之一可以是与亲本ABS结合的相同抗原。如先前所述，对VH和VL序列进行另外的重排以进一步表征候选ABS。
筛选和鉴定得到具有共享共有VL区或VH区序列的两个新的ABS的三价三特异性结合分子，每个ABS对不同的抗原或表位具有特异性所述不同的抗原或表位。该三价三特异性抗体还具有不共有VL或VH区的第三ABS，其对第三种不同抗原具有特异性。
6.13.25.1.使用来自已知ABS的共有重链的三价三特异性抗体
从对人OX40具有已知特异性的亲本ABS序列开始确定对人OX40抗原具有特异性的新抗原结合位点。
简言之，将从针对人类OX40的噬菌体淘选活动中分离的VH结构域用作常见的重链可变结构域序列，并与从OX40活动中分离的39个其他ABS候选物的VL结构域以及其亲本关联VL结构域配对。在该活动中，VL结构域的多样性仅限于CDR3序列，从而使CDR1和CDR2保持恒定。在表7中提供了候选物的VL CDR3序列。最初选择OX40-13的VH是因为其在L92-L94位置上相对缺乏大量残基(CDRH1：GFTFSSYIIHW；CDRH2：WVAYIFPYSGETYYADS；CDRH3：CARGAYYYTDLVFDYW)。将ABS候选物在Expi293细胞中以2mL的体积小规模表达为单克隆抗体。表达5天后，将澄清的上清液在PBST-BSA中稀释3倍，并通过生物膜层干涉仪(Octet)测试与生物素化人OX40的结合保持情况。这里，使用生物素化的OX40固化抗生素蛋白链菌素传感器，直至达到～0.8nm的结合响应。建立基线后，评估稀释上清液的抗原结合。
图56显示了对与OX40-13 VH结构域配对的VL结构域的Octet结合分析，所述VL结构域具有图56A中所示的非关联VL结构域1-12和21-24、图56B中所示的非关联VL结构域25-40和图56C中所示的非关联VL结构域14-20。几个非关联VL结构域显示出与亲本OX40-13ABS相当的结合，包括OX40-1和OX40-27的VL。其他未显示出与亲本OX40-13相当的可检测的结合。还有一些其他的显示了亲本OX40-13 ABS与可检测结合限度之间的中间结合范围。有趣的是，几个序列(如OX40-1和OX40-27)与亲本OX40-13 VL序列明显不同，表明很多VL序列可能保留了对亲本VH的抗原识别。
本文发现的两个新的OX40 ABS(每个均与来自OX40-13的共有重链可变序列配对)形成了三价三特异性抗体，其中新ABS候选物不会引起表达、产率或结合性质的显著丧失。
Figure BDA0002839770970001111
Figure BDA0002839770970001121
6.13.26.实施例25：具有来自已知ABS的共有VL或VH序列的新ABS的发现
从具有已知特异性的亲本ABS序列开始，鉴定出具有两个新的抗原结合位点(ABS)的三价三特异性结合分子，这些抗原结合位点与亲本ABS共享共有轻链可变序列或共有重链可变序列。共有轻链文库将CDR的多样性限制为重链可变结构域(VH)，而共有重链文库将CDR的多样性限制为重链可变结构域(VL)。形成共有轻链或重链文库，以供在体外展示(噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物展示等)或在人源化动物模型中使用。
其他文库从VH或VL序列(包括种系序列)从头开始，这些序列与结合特异性无关。然而，此处进行的筛选从具有已知特异性的亲本ABS开始，以发现具有不同抗原特异性的新ABS，同时与亲本ABS享有共有VH或VL序列。如上所述，从已知的ABS序列开始，亲本VH或VL序列分别与在其CDR中引入了多样性的VL或VH序列配对。如此前所述，针对与目的抗原的结合筛选配对。如先前所述，对VH和VL序列进行另外的重新格式化以进一步表征候选ABS。
筛选和鉴定得到具有对已知抗原具有特异性的已知亲本ABS和对不同抗原具有特异性的新ABS的三价三特异性结合分子，其中ABS共有VL区或VH区序列。三价三特异性抗体还具有不共享共有VL或VH区的第三ABS，其对第三种不同抗原具有特异性。
6.13.26.1.具有与曲妥珠单抗共享的共有VL的新ABS的发现
使用特异性针对HER2的曲妥珠单抗的轻链VL序列，创建了使用共有轻链文库的噬菌体展示活动。如上所述，使人VH3-23 CDR序列多样化，以通过在人抗体库中发现的CDR长度匹配位置氨基酸频率，并筛选表达成对VL/VH序列的噬菌体与目的抗原(A2)的结合。将ABS重新形成为全长人二价单特异性天然IgG1架构，以进行表征。针对结合亲和性、表位和一般生物物理特性(表达、纯度、可显色性等)评价候选物。鉴定出与抗原1和抗原2两者结合具有范围从10nM-1μM(或优选地，50nM-250nM)的单个结合亲和性，其的ABS。
针对来自目的抗原的亲本IgG候选物的VL和VH结构域，以及特异性针对CD3(例如，SP34、OKT3等，及其人源化变体)的第三种已知ABS，重新形成下面的1x2抗体形式。将候选物的组合通过瞬时哺乳动物表达进行表达，纯化并测试将两种抗原同时共同接合在细胞表面的能力。进行其他功能性测定(如T细胞杀伤和增殖测定)，以表征抗体功效。候选物具有下述结合性质：
对曲妥珠单抗1的单价KD：7nM
对目的抗原(A2)的单价KD：50至100nM
对CD3ε的单价KD：20至100nM
对双重阳性肿瘤细胞的二价亲合力：<10nM
候选物的示例链架构：
链1：VH曲妥珠单抗-CH3-CH2-CH3臼
链2和链6：VL曲妥珠单抗-CH3
链3：VHA2-CH3-VHCD3-CH1-CH2-CH3杵
链4：VLCD3-CL1
(注意：VLCD3-CL1和VHCD3-CH1可以互换，并且所有结构域都可以具有此前描述的任何正交突变)
6.14.序列
>实施例1，二价单特异性构建体链1[SEQ ID NO:1]
(VL)～VEIKRTPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>实施例1，二价单特异性构建体链2[SEQ ID NO:2]
(VH)～VTVSSASPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>实施例1，二价双特异性构建体链1[SEQ ID NO:3]
Figure BDA0002839770970001141
Figure BDA0002839770970001142
>实施例1，二价双特异性构建体链2[SEQ ID NO:4]
(VH)～VTVSSASPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
VH-CH3
>实施例1，二价双特异性构建体链3[SEQ ID NO:5]
Figure BDA0002839770970001151
Figure BDA0002839770970001152
>实施例1，二价双特异性构建体链4[SEQ ID NO:6]
(VH)～VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC
VH-CH1
>人IgG1的Fc片段[SEQ ID NO:7]
GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
>BC1链1[SEQ ID NO:8]
Figure BDA0002839770970001153
结构域排布：
A-B-铰链-D-E
VL-CH3-铰链-CH2-CH3(杵)
在第一CH3中的突变(结构域B)：
T366K；445K、446S、447C插入
在第二CH3中的突变(结构域E)：
S354C、T366W
>BC1链2[SEQ ID NO:9]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTVSSASPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SGEC
结构域排布：
F-G
VH-CH3
在CH3中的突变(结构域G)：
L351D；445G、446E、447C插入
>BC1链3[SEQ ID NO:10]
Figure BDA0002839770970001161
结构域排布：
H-I-铰链-J-K
VL-CL-铰链-CH2-CH3(臼)
在CH3中的突变(结构域K)：
Y349C、D356E、L358M、T366S、L368A、Y407V
>BC1链4[SEQ ID NO:11]
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC
结构域排布：
L-M
VH-CH1
>BC1结构域A[SEQ ID NO:12]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT
>BC1结构域B[SEQ ID NO:13]
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC
>BC1结构域D[SEQ ID NO:14]
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
>BC1结构域E[SEQ ID NO:15]
GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC1结构域F[SEQ ID NO:16]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTVSSAS
>BC1结构域G[SEQ ID NO:17]
PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC
>BC1结构域H[SEQ ID NO:18]
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
>BC1结构域I[SEQ ID NO:19]
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>BC1结构域J[SEQ ID NO:20]
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
>BC1结构域K[SEQ ID NO:21]
GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC1结构域L[SEQ ID NO:22]
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
>BC1结构域M[SEQ ID NO:23]
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPPKSC
>BC28链1[SEQ ID NO:24]
Figure BDA0002839770970001181
Figure BDA0002839770970001191
结构域排布：
A-B-铰链-D-E
Figure BDA0002839770970001192
在结构域B中的突变：
Y349C；445P、446G、447K插入
在结构域E中的突变：
S354C、T366W
>BC28链2[SEQ ID NO:25]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTVSSASPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK
结构域排布：
F-G
VH-CH3
在结构域G中的突变：
S354C；445P、446G、447K插入
>BC28结构域A[SEQ ID NO:26]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT
>BC28结构域B[SEQ ID NO:27]
PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC28结构域D[SEQ ID NO:28]
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
>BC28结构域E[SEQ ID NO:29]
GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC28结构域F[SEQ ID NO:30]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDIHWVRQAPGKGLEWVGDITPYDGTTNYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARLVGEIATGFDYWGQGTLVTVSSAS
>BC28结构域G[SEQ ID NO:31]
PREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC44链1[SEQ ID NO:32]
Figure BDA0002839770970001201
结构域排布：
A-B-铰链-D-E
Figure BDA0002839770970001211
在结构域B中的突变：
P343V；Y349C；445P、446G、447K插入
在结构域E中的突变：
S354C、T366W
>BC44结构域A[SEQ ID NO:33]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT
>BC44结构域B[SEQ ID NO:34]
VREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC44结构域D[SEQ ID NO:35]
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
>BC44结构域E[SEQ ID NO:36]
GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>等同于SEQ ID NO:10的BC28二价链3
>等同于SEQ ID NO:11的BC28二价链4
>BC28 1x2链3[SEQ ID NO:37]
Figure BDA0002839770970001212
Figure BDA0002839770970001221
结构域排布：
R-S-接头-H-I-铰链-J-K-
Figure BDA0002839770970001222
在结构域S中的突变：
Y349C；445P、446G、447K插入
6个氨基酸接头插入：GSGSGS
在结构域K中的突变：
Y349C,D356E,L358M,T366S,L368A,Y407V
>BC28 1x2结构域R[SEQ ID NO:38]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRT
>BC28 1x2结构域S[SEQ ID NO:39]
PREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC28 1x2接头[SEQ ID NO:40]
GSGSGS
>BC28 1x2结构域H[SEQ ID NO:41]
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
>BC28 1x2结构域I[SEQ ID NO:42]
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>BC28 1x2结构域J[SEQ ID NO:43]
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
>BC28 1x2结构域K[SEQ ID NO:44]
GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>BC28-1x1x1a链3[SEQ ID NO:45]
Figure BDA0002839770970001231
结构域排布：
R-S-接头-H-I-铰链-J-K-
Figure BDA0002839770970001241
在结构域S中的突变：
T366K；445K、446S、447C插入
6个氨基酸接头插入：GSGSGS
在结构域K中的突变：
Y349C,D356E,L358M,T366S,L368A,Y407V
>BC28-1x1x1a结构域R[SEQ ID NO:46]
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSSAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASSLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDSYLWTFGQGTKVEIKRT
>BC28-1x1x1a结构域S[SEQ ID NO:47]
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLKCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSKSC
>BC28-1x1x1a接头[SEQ ID NO:48]
GSGSGS
>BC28-1x1x1a结构域H[SEQ ID NO:49]
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
>BC28-1x1x1a结构域I[SEQ ID NO:50]
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>BC28-1x1x1a结构域J[SEQ ID NO:51]
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
>BC28-1x1x1a结构域K[SEQ ID NO:52]
GQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
>hCTLA4-4.链2[SEQ ID NO:53]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYYIHWVRQAPGKGLEWVAVIYPYTGFTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEYTVLDYWGQGTLVTVSSASPREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGE C
结构域排布：
F-G
VH-CH3
在结构域G中的突变：
L351D、445G、446E、447C插入
>hCTLA4-4结构域F[SEQ ID NO:54]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYYIHWVRQAPGKGLEWVAVIYPYTGFTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEYTVLDYWGQGTLVTVSSAS
>hCTLA4-4结构域G[SEQ ID NO:55]
PREPQVYTDPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSGEC
其他序列：
>铰链：DKTHTCPPCP[SEQ ID NO:56]
>BC1-多肽1结构域连接：IKRTPREP[SEQ ID NO:57]
>BC15-多肽1结构域连接：IKRTVREP[SEQ ID NO:58]
>BC16-多肽1结构域连接：IKRTREP[SEQ ID NO:59]
>BC17-多肽1结构域连接：IKRTVPREP[SEQ ID NO:60]
>BC26-多肽1结构域连接：IKRTVAEP[SEQ ID NO:61]
>BC27-多肽1结构域连接：IKRTVAPREP[SEQ ID NO:62]
>BC1-多肽2结构域连接：SSASPREP[SEQ ID NO:63]
>BC13-多肽2结构域连接：SSASTREP[SEQ ID NO:64]
>BC14-多肽2结构域连接：SSASTPREP[SEQ ID NO:65]
>BC24-多肽2结构域连接：SSASTKGEP[SEQ ID NO:66]
>BC25-多肽2结构域连接：SSASTKGREP[SEQ ID NO:67]
>SP34-89 VH[SEQ ID NO:68]
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFSISRDDSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTV
>SP34-89 VL[SEQ ID NO:69]
QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
>SP34-89 VH-N30S VH[SEQ ID NO:70]小写表示突变
Figure BDA0002839770970001261
>SP34-89 VH-G65D VH[SEQ ID NO:71]小写表示突变
Figure BDA0002839770970001262
>SP34-89 VH-S68T VH[SEQ ID NO:72]小写表示突变
Figure BDA0002839770970001263
>SP34-89 VL-W57G VL[SEQ ID NO:73]小写表示突变
Figure BDA0002839770970001271
>噬菌体展示重链[SEQ ID NO:74]:
Figure BDA0002839770970001272
>噬菌体展示轻链[SEQ ID NO:75]:
Figure BDA0002839770970001273
>B-Body结构域A/H骨架[SEQ ID NO:76]:
Figure BDA0002839770970001274
>B-Body结构域F/L骨架[SEQ ID NO:77]:
Figure BDA0002839770970001275
>BC1链1骨架[SEQ ID NO:78]
Figure BDA0002839770970001276
Figure BDA0002839770970001281
“x”代表可变以形成文库的CDR氨基酸，粗斜体代表恒定的CDR序列
结构域排布：
A-B-铰链-D-E
Figure BDA0002839770970001282
在第一CH3中的突变(结构域B)：
T366K；445K、446S、447C插入
在第二CH3中的突变(结构域E)：
S354C,T366W
>BC1链2骨架[SEQ ID NO:79]
Figure BDA0002839770970001283
“x”代表可变以形成文库的CDR氨基酸，粗斜体代表恒定的CDR序列
结构域排布：
F-G
VH-CH3
在CH3中的突变(结构域G)：
L351D；445G、446E、447C插入
>BC1链3骨架[SEQ ID NO:80]
Figure BDA0002839770970001291
“x”代表可变以形成文库的CDR氨基酸，粗斜体代表恒定的CDR序列
结构域排布：
H-I-铰链-J-K
Figure BDA0002839770970001292
在CH3中的突变(结构域K)：
Y349C,D356E,L358M,T366S,L368A,Y407V
>BC1链4骨架[SEQ ID NO:81]
Figure BDA0002839770970001293
“x”代表可变以形成文库的CDR氨基酸，粗斜体代表恒定的CDR序列
结构域排布：
L-M
VH-CH1
>BC1链3 1(A)x2(B-A)SP34-89骨架[SEQ ID NO:82]
Figure BDA0002839770970001301
“x”代表可变以形成文库的CDR氨基酸，粗斜体代表恒定的CDR序列
结构域排布：
R-S-接头-H-I-铰链-J-K
Figure BDA0002839770970001302
在结构域S中的突变：
T366K；445K、446S、447C插入
十个氨基酸接头插入：TASSGGSSSG
在结构域J中的突变：
L234A、L235A和P329K
在结构域K中的突变：
Y349C,D356E,L358M,T366S,L368A,Y407V
>BC1链3 1(A)x2(B-A)SP34-89 S-H连接[SEQ ID NO:83]
TASSGGSSSG
>人IgA CH3[SEQ ID NO:84]
TFRPEVHLLPPPSEELALNELVTLTCLARGFSPKDVLVRWLQGSQELPREKYLTWASRQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVGHEALPLAFTQKTIDRL
7.通过引用并入
出于所有目的，在本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其他文献的全部内容通过引用并入本文中，其程度如同每项个体的出版物、专利、专利申请或其他文献被单独指出出于所有目的通过引用并入。
8.等同
虽然已经说明和描述了各个具体实施方式，但是以上的说明书并非是限制性的。应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种改变。在阅读本说明书后，许多变化对于本领域技术人员而言将变得显而易见。

Claims (55)

1.一种三价三特异性结合分子，其包含：
第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、第四多肽链和第五多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D、结构域E、结构域N和结构域O，
其中所述结构域从N端到C端以N-O-A-B-D-E的方向排列，并且
结构域A具有可变区结构域氨基酸序列，结构域B具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列，结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域N具有可变区结构域氨基酸序列和结构域O具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，
其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且
其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列和结构域G具有恒定区结构域氨基酸序列氨基酸序列；
(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J和结构域K，
其中所述结构域从N端到C端以H-I-J-K的方向排列，并且
其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列和K具有恒定区结构域氨基酸序列；
(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，
其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且
其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；
(e)所述第五多肽链包含结构域P和结构域Q，
其中所述结构域从N端到C端以P-Q的方向排列，并且
其中结构域P具有可变区结构域氨基酸序列和结构域Q具有恒定区结构域氨基酸序列，
(f)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；
(g)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；
(h)所述第一多肽与所述第五多肽通过所述结构域N与所述结构域P之间的相互作用和所述结构域O与所述结构域Q之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(i)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(j)结构域N、结构域A和结构域H的所述氨基酸序列是不同的，
(k)所述第二多肽链与所述第五多肽链是相同的且所述第四多肽链是不同的，或者所述第四多肽链与所述第五多肽链是相同的且所述第二多肽链是不同的，并且
(l)所述结构域A与所述结构域F之间的所述相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，
所述结构域H与所述结构域L之间的所述相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，并且
所述结构域N与所述结构域P之间的所述相互作用形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其中
所述第二多肽链和所述第五多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第五多肽链，
结构域O和结构域B的所述氨基酸序列是相同的，并且
结构域I的所述氨基酸序列不同于结构域O和结构域B。
3.根据权利要求1所述的结合分子，其中
所述第四多肽链和所述第五多肽链是相同的，并且所述第二多肽链不同于所述第二多肽链和所述第五多肽链，
结构域O和结构域I的所述氨基酸序列是相同的，并且
结构域B的所述氨基酸序列不同于结构域O和结构域I。
4.一种三价三特异性结合分子，其包含：
第一多肽链、第二多肽链、第三多肽链、第四多肽链和第六多肽链，其中：
(a)所述第一多肽链包含结构域A、结构域B、结构域D和结构域E，
其中所述结构域从N端到C端以A-B-D-E的方向排列，并且
结构域A具有可变区结构域氨基酸序列，结构域B具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域D具有CH2氨基酸序列和结构域E具有恒定区结构域氨基酸序列；
(b)所述第二多肽链包含结构域F和结构域G，
其中所述结构域从N端到C端以F-G的方向排列，并且
其中结构域F具有可变区结构域氨基酸序列和结构域G具有恒定区结构域氨基酸序列氨基酸序列；
(c)所述第三多肽链包含结构域H、结构域I、结构域J、结构域K、结构域R和结构域S，
其中所述结构域从N端到C端以R-S-H-I-J-K的方向排列，并且
其中结构域H具有可变区结构域氨基酸序列，结构域I具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域J具有CH2氨基酸序列，结构域K具有恒定区结构域氨基酸序列，结构域R具有可变区结构域氨基酸序列和结构域S具有恒定区结构域氨基酸序列；
(d)所述第四多肽链包含结构域L和结构域M，
其中所述结构域从N端到C端以L-M的方向排列，并且
其中结构域L具有可变区结构域氨基酸序列和结构域M具有恒定区结构域氨基酸序列；
(e)所述第六多肽链包含结构域T和结构域U，
其中所述结构域从N端到C端以T-U的方向排列，并且
其中结构域T具有可变区结构域氨基酸序列和结构域U具有恒定区结构域氨基酸序列，
(f)所述第一多肽与所述第二多肽通过所述结构域A与所述结构域F之间的相互作用和所述结构域B与所述结构域G之间的相互作用相关联；
(g)所述第三多肽与所述第四多肽通过所述结构域H与所述结构域L之间的相互作用和所述结构域I与所述结构域M之间的相互作用相关联；
(h)所述第一多肽与所述第六多肽通过所述结构域R与所述结构域T之间的相互作用和所述结构域S与所述结构域U之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(i)所述第一多肽与所述第三多肽通过所述结构域D与所述结构域J之间的相互作用和所述结构域E与所述结构域K之间的相互作用相关联以形成所述结合分子；
(j)结构域R、结构域A和结构域H的所述氨基酸序列是不同的，
(k)所述第二多肽链与所述第六多肽链是相同的且所述第四多肽链是不同的，或者所述第四多肽链与所述第六多肽链是相同的且所述第二多肽链是不同的，
(l)所述结构域A与所述结构域F之间的所述相互作用形成特异性针对第一抗原的第一抗原结合位点，
所述结构域H与所述结构域L之间的所述相互作用形成特异性针对第二抗原的第二抗原结合位点，并且
所述R结构域R与所述结构域T之间的所述相互作用形成特异性针对第三抗原的第三抗原结合位点。
5.根据权利要求4所述的结合分子，其中
所述第四多肽链和所述第六多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第六多肽链，
结构域S和结构域I的所述氨基酸序列是相同的，并且
结构域B的所述氨基酸序列不同于结构域S和结构域I。
6.根据权利要求4所述的结合分子，其中
所述第二多肽链和所述第六多肽链是相同的，并且所述第四多肽链不同于所述第二多肽链和所述第六多肽链，
结构域S和结构域B的所述氨基酸序列是相同的，并且
结构域I的所述氨基酸序列不同于结构域S和结构域B。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的所述氨基酸序列是内源CH3序列。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的氨基酸序列不同，并且各自在内源CH3序列中分别包含正交修饰，其中所述结构域B与所述结构域G相互作用，其中所述结构域B和所述结构域G均不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
9.根据权利要求8所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的所述正交修饰包括在结构域B和结构域G之间产生工程化二硫桥的突变。
10.根据权利要求9所述的结合分子，其中产生工程化二硫桥的所述结构域B和所述结构域G的所述突变是在所述结构域B和所述结构域G之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的所述正交修饰包括杵臼(knob-in-hole)突变。
12.根据权利要求11所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的所述杵臼突变是在所述结构域B和所述结构域G之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的所述正交修饰包括电荷对突变。
14.根据权利要求13所述的结合分子，其中所述结构域B和所述结构域G的所述电荷对突变是在所述结构域B和所述结构域G之一中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的结合分子，其中结构域I具有CL序列和结构域M具有CH1序列。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的结合分子，其中结构域I具有CH1序列和结构域M具有CL序列。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的结合分子，其中所述CH1序列和所述CL序列各自包含一个或多个正交修饰，其中具有所述CH1序列的结构域不与具有缺乏所述正交修饰的CL序列的结构域显著地相互作用。
18.根据权利要求17所述的结合分子，其中所述正交修饰包含在至少一个CH1结构域与CL结构域之间产生工程化二硫桥的突变，所述突变选自以下：在所述CH1序列的位置138和所述CL序列的位置116的工程化半胱氨酸；在所述CH1序列的位置128和所述CL序列的位置119的工程化半胱氨酸；和在所述CH1序列的位置129和所述CL序列的位置210的工程化半胱氨酸。
19.根据权利要求17所述的结合分子，其中所述正交修饰包含在至少一个CH1结构域与CL结构域之间产生工程化二硫桥的突变，其中所述突变包含在所述CH1序列的位置128和CLκ序列的位置118的工程化半胱氨酸。
20.根据权利要求17所述的结合分子，其中所述正交修饰包含在至少一个CH1结构域与CL结构域之间产生工程化二硫桥的突变，所述突变选自以下：所述CL序列中的F118C突变与所述CH1序列中对应的A141C；所述CL序列中的F118C突变与所述CH1序列中对应的L128C；和所述CL序列中的S162C突变与所述CH1序列中对应的P171C突变。
21.根据权利要求17-20中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包含在至少一个CH1结构域与CL结构域之间的电荷对突变，所述电荷对突变选自以下：所述CL序列中的F118S突变与所述CH1序列中对应的A141L；所述CL序列中的F118A突变与所述CH1序列中对应的A141L；所述CL序列中的F118V突变与所述CH1序列中对应的A141L；和所述CL序列中的T129R突变与所述CH1序列中对应的K147D。
22.根据权利要求17-20中任一项所述的结合分子，其中所述正交修饰包含在至少一个CH1结构域与CL结构域之间的电荷对突变，所述电荷对突变选自以下：所述CL序列中的N138K突变与所述CH1序列中对应的G166D，和所述CL序列中的N138D突变与所述CH1序列中对应的G166K。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的结合分子，其中所述结构域E具有CH3氨基酸序列。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的结合分子，其中所述结构域E和所述结构域K的所述氨基酸序列是相同的，其中所述序列是内源CH3序列。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的结合分子，其中所述结构域E和所述结构域K的所述氨基酸序列是不同的。
26.根据权利要求25所述的结合分子，其中不同序列分别在内源CH3序列中各自包含正交修饰，其中所述结构域E与所述结构域K相互作用，且其中所述结构域E或所述结构域K均不与缺乏所述正交修饰的CH3结构域显著地相互作用。
27.根据权利要求26所述的结合分子，其中所述正交修饰包含在所述结构域E与所述结构域K之间产生工程化二硫桥的突变。
28.根据权利要求27所述的结合分子，其中产生工程化二硫桥的所述突变是在所述结构域E和所述结构域K之一中的S354C突变和在另一结构域中的349C。
29.根据权利要求26-28中任一项所述的结合分子，其中在所述结构域E和所述结构域K中的所述正交修饰包括杵臼突变。
30.根据权利要求29所述的结合分子，其中所述杵臼突变是在所述结构域E或所述结构域K之一中的T366W突变和在另一结构域中的T366S、L368A和Y407V突变。
31.根据权利要求26-30中任一项所述的结合分子，其中在所述结构域E和所述结构域K中的所述正交修饰包括电荷对突变。
32.根据权利要求31所述的结合分子，其中所述电荷对突变是在所述结构域E或所述结构域K之一中的T366K突变和在另一结构域中的L351D突变。
33.根据权利要求25所述的结合分子，其中所述结构域E和所述结构域K的所述氨基酸序列是两种不同抗体结构域的内源序列，选择具有特异性相互作用的所述结构域，所述相互作用促进所述第一多肽与所述第三多肽之间的特异性关联。
34.根据权利要求33所述的结合分子，其中所述两种不同氨基酸序列是CH1序列和CL序列。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的结合分子，其中结构域A具有VL氨基酸序列和结构域F具有VH氨基酸序列。
36.根据权利要求1-34中任一项所述的结合分子，其中结构域A具有VH氨基酸序列和结构域F具有VL氨基酸序列。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的结合分子，其中结构域H具有VL氨基酸序列和结构域L具有VH氨基酸序列。
38.根据权利要求1-36中任一项所述的结合分子，其中结构域H具有VH氨基酸序列和结构域L具有VL氨基酸序列。
39.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中形成所述结构域A与所述结构域B之间的连接的序列是IKRTPREP或IKRTVREP。
40.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中形成所述结构域F与所述结构域G之间的连接的序列是SSASPREP。
41.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中至少一个CH3氨基酸序列具有将所述CH3氨基酸序列连接至铰链氨基酸序列的C端三肽插入，其中所述三肽插入选自PGK、KSC和GEC。
42.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述序列是人序列。
43.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中至少一个CH3氨基酸序列是IgG序列。
44.根据权利要求43所述的结合分子，其中所述IgG序列是IgG1序列。
45.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中至少一个CH3氨基酸序列具有一个或多个同族同种异型突变。
46.根据权利要求45所述的结合分子，其中所述同族同种异型突变是D356E和L358M。
47.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述CL氨基酸序列是Cκ序列。
48.根据上述权利要求中任一项所述的结合分子，其中所述CH2序列具有降低Fc效应功能的一个或多个工程化突变。
49.根据权利要求48所述的结合分子，其中所述一个或多个工程化突变在位置L234、L235和P329处。
50.根据权利要求49所述的结合分子，其中所述一个或多个工程化突变是L234A、L235A和P329G。
51.根据权利要求49所述的结合分子，其中所述一个或多个工程化突变是L234A、L235A和P329K。
52.一种纯化的结合分子，所述纯化的结合分子包含通过包括CH1亲和纯化步骤的纯化方法纯化的根据权利要求1-51中任一项所述的结合分子。
53.根据权利要求52所述的纯化的结合分子，其中所述纯化方法是单步纯化方法。
54.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-53中任一项所述的结合分子和药学上可接受的稀释剂。
55.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求54所述的药物组合物。
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