JP2006506323A - インテグリンα−v−β−6に結合する抗体およびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(関連出願)
本出願は、米国仮特許出願第60/372,277号(2002年4月12日出願)および米国仮特許出願第60/373,274号(2002年4月16日出願)の利益を主張し、これらはその全体において参考として援用される。
本発明は、癌生物学および免疫治療の分野における。より具体的には、種々のヒト癌に存在する、インテグリンα−v−β−6に結合するモノクローナル抗体mBLA3のような抗体の発見、そのような癌の診断方法および/または治療方法に関する。
免疫治療あるいは治療目的の抗体の使用は、近年癌を治療するために用いられている。受動免疫治療には、癌治療におけるモノクローナル抗体の使用などが含まれる。例えば、Cancer:Principles and Practice of Oncology、第6版(2001)20章p.495〜508を参照のこと。これらの抗体は、細胞の増殖の直接阻害または生存の直接阻害、および生体の免疫系の天然の細胞殺傷活性を補充するその能力の双方により、固有の治療生物活性を有し得る。これらの薬物は、単独であるいは放射線または化学治療薬剤と併用して投与され得る。Rituxan(登録商標)およびHerceptin(登録商標)は、それぞれリンパ腫の治療および乳癌の治療に認可されており、そのような治療法の二つの例である。あるいは、抗体は、抗体結合体(conjugate)をつくるために使用され得、そこで抗体は毒性剤と結合し、腫瘍と特異的に結合することにより、この薬物を腫瘍に導く。Mylotarg(登録商標)は、白血病処置に使用される認可された抗体結合体の一例である。癌細胞に結合し、診断および治療に利用される可能性のあるモノクローナル抗体は、刊行物において開示されている。例えば、特にいくつかの標的タンパク質の分子量を開示する以下の特許出願を参照のこと。米国特許第6,054,561号(200kD c−erbB−2(Her2)、および40〜200kDの大きさのその他の未知の抗原)および米国特許第5,656,444号(50kDおよび55kD、腫瘍胎児タンパク質)。臨床試験における抗体の例および/または固形腫瘍の治療に認可されている抗体の例としては、以下が挙げられる:Herceptin(抗原:180kD、HER2/neu)、Panorex(抗原:40〜50kD、Ep−CAM)、HMFG1(抗原>200kD、HMW ムチン)、C225(抗原:150kDおよび170kD、EGFレセプター)、Campath(抗原:21〜28kD、CD52)、およびRituxan(抗原:35kD、CD20)。
本明細書中に開示される発明は、β6インテグリンサブユニットに結合する抗体に関し、これは、種々のヒト癌において発現する。従って、1つの局面において、本発明は、β6インテグリンサブユニットに優先的に結合する抗体またはポリペプチドである(抗体であってもなくてもよい)。1つの実施形態において、この抗体またはこのポリペプチドは、標的抗原(β6インテグリンサブユニット)の変性後も免疫学的に活性であり続ける。別の実施形態において、この抗体またはこのポリペプチドは、非還元標的抗原(β6インテグリンサブユニット)に対してのみ免疫学的に活性である。
本発明は、インテグリンのβ6サブユニットに結合する抗体およびポリペプチド、ならびにインテグリンのβ6サブユニットに結合するこれらの抗体およびポリペプチドの製造方法および使用方法を提供する。β6インテグリンサブユニットは、種々のヒト癌において存在することが示されており、その発現は、種々のヒト癌において増加する。本明細書中に記載される抗体は、β6インテグリンサブユニットに結合する。本発明は、β6インテグリンサブユニットの発現に関連する種々のヒト癌の診断方法および処理方法をさらに提供する。
本発明の実施は、特に示さない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を利用し、これらは、当業者の技術の範囲内である。そのような技術は、以下のような文献において十分に説明されている:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrookら、1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、1993−8)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら、編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullisら、編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら、編、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999);Immunobiology(C.A.JanewayおよびP.Travers、1997);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty、編、IRL Press、1988−1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.ShepherdおよびC.Dean、編、Oxford University Press、2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.HarlowおよびD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra、編、Harwood Academic Publishers、1995);および Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVitaら、編、J.B.Lippincott Company、1993)。
「抗体」は、免疫グロブリン分子であり、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位経由で、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどのような特定の標的に結合可能である。本明細書中で使用されるように、この用語は、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のみならず、そのフラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、単鎖(ScFv)、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の改変された立体配置も包含する。
本発明は、抗体(mBLA3、およびmBLA3等価抗体またはmBLA3等価ポリペプチド(mBLA3のβ6インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体を含むか、または、いくつかの実施形態において、この抗体は、mBLA3が優先的に結合する際に、β6インテグリンサブユニット上の同一のエピトープと結合する)を含む)を包含する。本発明はさらに、組成物を包含し、それらとしてはβ6インテグリンサブユニットに結合する、本明細書中に記載される抗体、ポリペプチドおよびタンパク質を含有する薬学的組成物、ならびにβ6インテグリンサブユニットに結合する抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含有する薬学的組成物が挙げられる。本明細書中で使用される場合、組成物は、β6インテグリンサブユニットに結合する1つ以上の抗体、ポリペプチドおよび/もしくはタンパク質、ならびに/またはβ6インテグリンサブユニットに結合する1つ以上の抗体、ポリペプチドおよびタンパク質をコードする配列を含む1つ以上のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、当業者に周知の緩衝液を含む薬学的に受容可能な賦形剤のような適切な賦形剤を含有し得る。
β6インテグリンサブユニットに結合するモノクローナル抗体をスクリーニングするために、いくつかの方法が使用され得る。「結合」とは、免疫学的に関連する結合、すなわち、免疫グロブリン分子がコードされる抗原(またはエピトープ)に特異的な結合のことを言うことが理解される。これは、免疫グロブリンが、非特異的な標的に対して非常に高い濃度で使用される場合に起こり得る、非特異的な結合のことは言わない。スクリーニングに使用され得る1つの方法は、免疫組織化学(IHC)である。標準的な免疫組織化学技術は、当業者に公知である。例えば、Animal Cell Culture Methods(J.P.MatherおよびD.Barnes編,Academic Press,第57巻,第18章および第19章,pp.314−350,1998)参照。生物学的サンプル(例えば組織)は、生検、剖検(autopsies)、または剖検(necropsies)から得られ得る。β6インテグリンサブユニットが癌細胞上のみに存在するか否かを確かめるため、mBLA3が、癌を有する個体由来の組織上におけるβ6インテグリンサブユニットの存在を検出するために使用され得、他方、癌にかかっている個体由来の非癌組織、または、癌を有さない個体由来の組織が、コントロールとして使用される。該組織は、凍結させる間の損傷を防ぐ、固形物質、または半固形の物質(例えばアガロースゲルまたはOCT)に埋め込まれ得、次いで染色のために薄切される。異なる器官由来の癌、および、異なる程度の癌が、モノクローナル抗体をスクリーニングするために使用され得る。スクリーニングの目的で使用され得る組織の例としては、卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられるが、これらに限定されない。スクリーニングの目的で使用され得る異なる癌の型の例としては、癌腫、腺癌、肉腫、腺肉腫、リンパ腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。
mBLA3を特徴づけるために、いくつかの方法が使用される。1つの方法は、それが結合するエピトープを同定することである。エピトープのマッピングは、例えば、Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,オランダ)など、様々な販売元から市販されている。エピトープのマッピングは、mBLA3が結合する配列を決定するために使用され得る。エピトープは、直鎖状のエピトープであり得、すなわち一本鎖のアミノ酸に含有され得るか、または、一本鎖に必ずしも含まれるとは限らないアミノ酸の3次元的な相互作用により形成される高次構造的なエピトープであり得る。多様な長さのペプチド(例えば、少なくとも4〜6個のアミノ酸の長さ)が、単離または合成され得(例えば遺伝子組み換え的に)、mBLA3との結合アッセイに使用される。mBLA3が結合するエピトープは、β6インテグリンサブユニットの細胞外配列に由来する重複ペプチドを使用し、mBLA3による結合を決定することにより、系統的なスクリーニングで決定され得る。
モノクローナル抗体mBLA3、およびβ6インテグリンサブユニットに結合する等価抗体またはmBLA3のポリペプチド誘導体(本明細書に開示された方法によって作製される)が、診断の目的で、種々の組織(卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓が挙げられるが、これらに限定されない)における癌細胞の存在または非存在を同定するために使用され得る。単純にするために、これらの方法は、一般にmBLA3または抗体にしか言及しないが、本明細書に記載される任意のβ6インテグリンサブユニットの結合実施形態に当てはまることを理解する。検出は、一般的β6インテグリンサブユニットに結合する、本明細書に記載の抗体またはポリペプチドと細胞を接触させること、および、β6インテグリンサブユニットと、β6インテグリンサブユニットに特異的に結合する抗体(例えば、mBLA3、mBLA3のヒト化抗体、ヒト抗体、またはその他の任意のβ6インテグリンサブユニット結合部分)との間の複合体の形成を包含する。このような複合体の形成は、インビトロでもインビボでも行なわれ得る。理論に縛られることなく、モノクローナル抗体mBLA3は、β6サブユニットの細胞外ドメインを通じてβ6インテグリンサブユニットに結合し得る。
モノクローナル抗体mBLA3、ならびに、本明細書に開示された方法により作製された等価抗体(およびその他の本発明のポリペプチド実施形態と同様)は、種々の組織に癌(卵巣、乳房、肺、前立腺、結腸、腎臓、皮膚、甲状腺、脳、心臓、肝臓、胃、神経、血管、骨、上部消化管、および膵臓の癌が挙げられるが、これらに限定されない)を有する個体において、治療上の目的で使用され得る。いくつかの実施形態において、(前立腺癌細胞が抗体またはポリペプチドに結合する場合、)癌は前立腺癌である。これらの治療上の方法はまた、前述の結合された実施形態にも適用される。単純にするために、通常はmBLA3または抗体に言及するが、これらの方法は、本明細書に記載された任意のβ6インテグリンサブユニット結合実施形態に適用され、結合実施形態を含む本明細書に記載されるヒト化抗体およびヒト抗体を含むが、これらに限定されないことが理解される。mBLA3を用いた治療は、上述のようにインビトロおよびインビボの両方において複合体の形成に関与し得る。1つの実施形態において、モノクローナル抗体mBLA3は、実施例12および実施例13に示されるように、癌細胞(例えば結腸癌細胞など)に結合し、その増殖を減じ得る。抗体は、生理学的な(例えばインビボ)条件において結合を促進する濃度で投与されることが理解される。別の実施形態において、モノクローナル抗体mBLA3は、単独で、癌細胞に結合し、アポトーシスによる細胞死を誘導し得る。別の実施形態においては、モノクローナル抗体mBLA3は、癌細胞に結合し、転移の進行を遅らせ得る。別の実施形態においては、モノクローナル抗体mBLA3は、癌細胞に結合し、治療薬剤(例えば毒素、または放射性化合物など)、または、プロドラッグを癌細胞上のmBLA3に結合される活性抗癌薬物に変える薬剤(プロドラッグ活性化酵素を含むがこれらに限定されない)を送達し得る。薬剤(例えばプロドラッグ活性化酵素など)に結合された抗体は、プロドラッグと併用して個体に投与される。一般的に、これらの実施形態においては、効果的な量(治療薬剤を標的癌細胞へ送達するのに十分な量、または、プロドラッグを十分な量の活性抗癌薬物に変えるプロドラッグ活性化酵素を送達するのに十分な量)が、個体に投与される。さらに別の実施形態においては、癌を有する個体に対し、本発明の抗体を用いて緩和処置が施される。癌個体の緩和処置は、疾患の有害な症状、または、癌の進行に直接影響を及ぼさずに疾患に与えられる他の処置から生じる医原性の症状を処置すること、あるいは減少させることに関与する。これには、痛みの緩和、栄養補給、性機能障害、心理的苦悩、鬱病、疲労、精神障害、吐き気、嘔吐などのための処置が含まれる。
本発明はまた、診断および/または治療における使用のために、β6インテグリンサブユニットに結合する抗体または本明細書中に記載される任意の組成物を含むキットも提供する。従って、キットは、β6インテグリンサブユニットに優先的に結合し得るか、そして/または、β6インテグリンサブユニットとの複合物を形成し得る抗体を含む(例えば、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、食道、甲状腺、腎臓、または卵巣の癌細胞を検出するのに有用である)。いくつかの実施形態において、キットは、抗体mBLA3、または、mBLA3のβ6インテグリンサブユニットへの優先的な結合を競合的に阻害する抗体を含む。いくつかの実施形態において、キットは、抗体mBLA3、あるいは、治療薬剤、プロドラッグ活性化酵素、または標識剤に結合されたβ6インテグリンサブユニットへのmBLA3の優先的な結合を競合的に阻害する抗体を含む。これらのキットは更に、指示、および/あるいは、この抗体または本明細書中に記載された任意の抗体実施形態またはポリペプチド実施形態を治療薬剤、プロドラッグ活性化酵素、または標識剤に結合するための試薬を含み得る。いくつかの局面において、抗体(例えばモノクローナル、ポリクローナル、ヒト、ヒト化など)のβ6インテグリンサブユニットへの結合は、個体における癌診断のために使用される(例えば、癌細胞の存在もしくは非存在を検出するためのキット、および、乳房、結腸、肺、卵巣、膵臓、前立腺、食道、甲状腺、腎臓、または卵巣の癌細胞の存在もしくは非存在を検出するためのキット)。その他の局面において、キットは、例えば、癌を有する、または癌の家族歴を有する個体を処置するために使用され得る。癌を有する個体を処置するためのキットは、結腸の癌細胞などの癌細胞の増殖(growth)および/または増殖(proliferation)を阻害するためのキット、および/あるいは、治療薬剤またはプロドラッグ活性化酵素を癌細胞へ送達するためのキットを含むが、これらに限定されない。本発明のキットは、適切に包装され、さらなる構成要素を必要に応じて提供し得、このさらなる構成要素は、例えば、本発明の抗体と組み合わせて使用されるプロドラッグ、ならびにβ6インテグリンサブユニットに対する結合を決定するための緩衝液および指示(例えば、捕捉試薬、現像試薬、標識、反応表面、検出手段、コントロールサンプル、および説明の情報)である。指示は、本明細書中に記載されるアッセイを含むがこれらに限定されない、抗原結合の任意の測定のためであり得る。その他の実施形態において、指示は、本明細書中に記載の任意の方法のためであり得、以下を含む:結腸の癌細胞などの癌細胞の増殖(grow)および/または増殖(proliferation)を阻害するための指示;治療薬剤またはプロドラッグ活性化酵素を癌細胞に送達するための指示(プロドラッグを使用するための指示を含む)。いくつかの実施形態において、上述の試薬は、同じ個体における長期の測定または複数の個体における測定を可能にするなど、複数の測定が成され得るように供給される。抗体の結合を検出するための任意の適切な手段(標識された抗ヒト抗体(この標識は酵素であり得る)、フルオロフォア、化学発光物質放射性同位元素、または補酵素)が、使用され得る(そしてキットにおいて提供され得る)。一般的に、使用される標識は酵素である。
妊娠週齢が14〜21週のヒトの胎児の膀胱を、カリフォルニア州Alameda CountyのAdvanced Bioscience Researchから入手した。膀胱を、調達し、濡らした氷上の組織培地に入れ、研究室に輸送した。到着後すぐに、膀胱を、20mlの冷PBSで3回洗浄した。解剖用顕微鏡の下で、膀胱から、膀胱の周りの余分な組織を取り除き、膀胱を冷PBSでさらに2回洗浄した。
培養の11〜16日目のHFB細胞を使用して、モノクローナル抗体を産生した。マウス1匹当たり約106個のHFB細胞を、週1回、Balb/cマウスの足蹠から注射した。非変性アジュバント(例えばRibi)を使用した。週1回注射の6週間後、各免疫化動物の尾から少量の血液を採取し、FACS分析を用いて、HFBに対する抗体価を試験した。抗体価が少なくとも1:2000に達したとき、マウスをCO2チャンバ内で屠殺し、次いで頚椎を脱臼させた。ハイブリドーマの調製のためにリンパ節を収集した。
モノクローナル抗体を、タンパク質−Gアフィニティークロマトグラフィー を使用して、組織培養物の上清から精製した。抗体の精製工程について以下の物質を使用した:ハイブリドーマの組織培養物上清、Immunopure(G)IgG結合緩衝液(Pierce #21011 Rockford,IL)、Immunopure IgG溶出緩衝液(Pierce #21009)、濃HCl(pH調製のため)、Corning 1リットル PES(ポリエーテルスルホン)、0.22μmのフィルター(Corning #431098,Corning,NY)、Amersham Pharmacia GradiFrac System(Amersham Pharmacia,Piscataway,NJ)、タンパク質−Gセファロース4Fast Flow(Amersham Pharmacia #17−0618−02)、ストリッピング緩衝液(3M KSCN/50mM Tris(pH 7.8))、およびPBS(リン酸緩衝生理食塩水)3M Tris(pH 9.0)。
細胞ペレット(ヘマトクリット値約25μlの膵臓腫瘍細胞株CFPAC−1(ATCC番号CRL−1918)またはSU.86.86(ATCC番号CRL−1837))が、最初に細胞を水中で0.5mlまで希釈し、次いで凍結および融解を3回行なうことによって溶解した。溶液を、14,000rpmで遠心分離した。細胞膜フラグメントを含有する、得られたペレットを、50μlのSDSサンプル緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中で再懸濁した。サンプルを、80℃で5分間加熱し、次いで14,000rpmで2分間遠心分離し、いかなる不溶性の物質も除去した。mBLA3の抗原を発現し、精製に使用され得るその他の細胞株としては、Du−145、HT−29、または、表3に示されるように、mBLA3に結合するその他の細胞株が挙げられる。
精製された抗体mBLA3を、Centricon YM30濃縮器(Millipore カタログ番号4208)を使用して、約1mg/mlまで濃縮した。約1mgのmBLA3を、製造業者の指示に従い、0.35gの臭化シアン−活性化Sepharose 4B樹脂(Amersham Pharmacia Biotech カタログ番号17−0430−01)に、共有結合的に結合させた。新鮮に増殖させたRav9926細胞(2×109個以下の細胞)を、スピナーフラスコから収集した。細胞を、遠心分離によってペレットにし、次いで、100μlのプロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma カタログ番号P8340)を含有する、総量で15mLの脱イオン水(dH2O)中で再懸濁した。
mBLA3が結合する抗原を、実施例4および5に記載のように単離し、MALDI質量分析に供した。免疫アフィニティーカラムの溶出液を、SDS−PAGEによって分離し、バンドを切り出して、抽出した。ゲル片を、代表的に「ゲルにおいて(in gel)」において消化した(Gharahdaghi,F.,Weinberg,C.R.,Meagher,D.A.,Imai,B.S.およびMische,S.M.(1999)Electrophoresis 20,601−605)。抽出されたペプチドを、Kratos,AXIMA CFR上で、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI−Tof)によって分析した。ペプチドの質量を、100ppm内で測定し、カーブフィールドリフレクトロン(curved field reflectron)によるイオンゲート時間(a time ion gate)を、ポストソース分解(PSD)を介して、ペプチドの単離および断片化のために使用した。研究を、Protein Prospector Programs(Clauser K.R.,Baker P.R.およびBurlingame A.L.,Analytical Chemistry,第71巻,14,2871−(1999))のMSFitおよびMSTagを用いて行った。2つの主要なタンパク質にマッチする配列が得られ、これらのタンパク質は、インテグリンサブユニットαvおよびインテグリンサブユニットβ6であった。
mBLA3がαvサブユニットまたはβ6サブユニット、あるいは両方のいずれに結合するのかを測定するために、精製mBLA3抗原を、SDSゲル内で電気泳動によって分画し、ニトロセルロース膜上にトランスファーした。膜を、mBLA3、ヤギ抗αvインテグリンC末端ペプチド(Q−20,Santa Cruz Biotechnologies,カタログ番号sc−6617)、マウス抗インテグリンβ6クローンR6G9(Chemicon international MAB2075Z)、マウス抗インテグリンαvβ6クローン10D5(Chemicon International MAB2077Z)、および、マウス抗インテグリンβ6クローンCSβ6(Chemicon International MAB2076Z)を用いて、ウエスタンブロット法によってプローブした。結果は、mBLA3が、Q−20によって認識されたαvサブユニットよりも約5〜10kD小さい1つのタンパク質バンドを認識することを示した。従って、mBLA3はインテグリンβ6サブユニットに結合したが、インテグリンαvサブユニットには結合しなかった。しかし、モノクローナル抗体クローン10D5、R6G9およびCSβ6は、ウエスタンブロット上で、αvバンドもβ6バンドも認識しなかったが、これは、それらの抗体がウエスタンブロット上で働かないという公表された結果に一致する。mBLA3抗原がインテグリンβ6であることを更に確認するために、インテグリンβ6を、抗β6抗体クローンCSβ6を使用してSK−BR−3細胞溶解物から免疫沈降し、R6G9を、SDSゲル内で電気泳動により分画し、ニトロセルロース膜に移した。これらの膜を、mBLA3を用いてウエスタンブロットによりプローブした。再び、mBLA3は、β6に対応するタンパク質のバンドを認識した。さらに、mBLA3は、ウエスタンブロット上で、β6インテグリンの非還元形態のみを認識する。β−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを用いたβ6インテグリンサブユニットの還元は、mBLA3の結合を破壊した。
96ウェルプレートの適切なウェルを、フィブロネクチン(0.5μg/ウェル)で、1時間、室温でコーティングした。これを除去し、プレート全体を、DMEM/F12培地中1mg/ml BSAを用いて、37℃で30分間ブロックした。これを除去し、抗体を、1mg/ml BSA含有DMEM/F12培地中の適切なウェルに加えた。SKBR3細胞を、10mM EDTAを用いて、ストック組織培養シャーレから取り除いた。細胞を遠心分離し、1mg/ml BSA含有DMEM/F12中に再懸濁した。1.5×104細胞を各ウェルに加えられるように密度を調整した。37℃で1時間後、シャーレを、ペーパータオル上におき、培地および未接着細胞を除去し、ウェル当たり100μlのPBSでゆっくり洗浄し、再度ペーパータオル上においた。接着して残っている細胞を、固定剤を含有するクリスタルバイオレットで10分間染色した。これを完全に洗浄し、プレートを乾燥させた後、光学濃度を、プレート読み取り装置上で、540で読み取った。図4に示すように、mBLA3は、SKBR3のフィブロネクチンへの接着を阻害する。
凍結組織サンプルを、OCT化合物内に包埋し、ドライアイスを用いてイソペンタン内ですばやく凍結した。凍結切片を、Leica 3050 CMマイクロトームを用いて、5μmの厚さで薄切し、解凍してスライドガラス上に乗せた。切片を、エタノールを用いて、−20℃で固定し、室温で一晩、空気乾燥した。固定した切片を、使用するまで、−80℃で保存した。免疫組織化学のために、組織の切片を回収し、まずブロッキング緩衝液(PBS、5% 正常ヤギ血清、0.1% Tween 20)中で30分間、室温でインキュベートし、次いで、ブロッキング緩衝液(1μg/ml)中で希釈したmBLA3およびコントロールモノクローナル抗体を用いて、120分間インキュベートした。次いで切片を、ブロッキング緩衝液を用いて3回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.05)および0.003% 過酸化水素(Sigma カタログ番号H1009)中ヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)F(ab’)2−ペルオキシダーゼ結合体、および、ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン(1mg/ml,Sigma カタログ番号D5637)で検出した。染色したスライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、Nikonの顕微鏡を用いて調べた。
モノクローナル抗体mBLA3を、異なる型の組織に由来する種々の細胞株 との反応性を試験するために使用した。異なる樹立細胞株に由来する細胞を、プロテアーゼを使用せずに増殖表面から除去し、圧縮し、OCT化合物に包埋した。細胞を凍結し、薄切し、次いで、標準的なIHCプロトコルを使用して染色した。CellArrayTMの技術は、WO01/43869に記載されている。CellArrayの結合実験から得られた結果を、表3にまとめる。
外科的な切除によって得られた正常な組織を、凍結し、腫瘍組織と共にマウントした。凍結切片を、Leica 3050 CMマイクロトームを用いて厚さ5μmに薄切し、vectaboundコートしたスライド上に解凍マウントした。切片を、エタノールを用いて20℃で固定し、室温で一晩、空気乾燥した。主要な抗体mBLA3を、1〜100の希釈率で使用した(最終濃度は1μg/ml)。組織の切片を回収し、はじめにブロッキング緩衝液(PBS、5% 正常ヤギ血清、0.1% Tween 20)中で、室温で30分間インキュベートし、次いで、mBLA3およびブロッキング緩衝液中に希釈したコントロールモノクローナル抗体(1μg/ml)を用いて、120分間、インキュベートした。次いで切片を、ブロッキング緩衝液で3回洗浄した。結合したモノクローナル抗体を、0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.05)および0.003% 過酸化水素(Sigma カタログ番号H1009)中の、ヤギ抗マウスIgG+IgM(H+L)F(ab’)2−ペルオキシダーゼ結合体、および、ペルオキシダーゼ基質ジアミノベンジジン(1mg/ml,Sigma カタログ番号D5637)を用いて検出した。染色したスライドを、ヘマトキシリンを用いて対比染色し、正常な皮膚に対するmBLA3の結合を測定するために、Nikonの顕微鏡下で、polyMICATM検出キットを使用して調べた。mBLA3を有する正常組織の染色の結果を、表4に示す。表5は、mBLA3抗原に陽性を示す個々の腫瘍および正常な組織の免疫組織化学的染色の強度の総括を示す。
単層として増殖させた場合にインビトロでの細胞数を減少させる抗体の能力は、種々の量のテスト用精製抗体またはコントロール用精製抗体の存在下、あるいは非存在下で増殖させた細胞の単層を使用して、評価され得る。また、細胞数の変化は、MTTを使用して評価され得る。MTTは、ミトコンドリアの酵素の活性を測定し、関連する生存可能な細胞数と相関する、染料である。所定の細胞をプレート培養し、96ウェルプレート内で、10%の胎仔ウシ血清で補充されたF12/DMEM(1:1)増殖培養培地中で増殖した。以下の細胞株を、96ウェルシャーレ3枚分のウェル内で、以下の濃度でプレート培養した:HT−29およびHPAF−II、ウェル当たり10,000個の細胞)。プレート後すぐに、mBLA3を、異なる最終濃度(0〜50μg/mlの範囲)で、培地に加えた。細胞を、加湿したインキュベーター内で、空気中5%のCO2で、37℃で4日間インキュベートした。アッセイの最後に、MTTを、PBS(5mg/ml)中に溶解し、1:10の希釈度で、ウェルに直接加えた。プレートを、またインキュベートに戻して4時間置いた。インキュベート後、培地を除去し、100μlのDMSOを加えてMTT沈降物を可溶化した。プレートを、プレート読み取り装置上で、540で読み取った。
ヒトの腫瘍に対するmBLA3の阻害効果を、ヒトの腫瘍の異種移植を有するマウスに抗体を注射することにより試験した。特に、HT29細胞(ヒトの結腸癌腫株)を、10%の胎仔ウシ血清で補充したF12/DMEM培地中で増殖させた。細胞をプレートから除去し、ペレットにし、100,000個の細胞を、50μlの中和されたタイプ1ラットテールコラーゲンに再懸濁した。細胞/コラーゲンの混合物を、15分間、37℃におき、次いで、増殖培養培地を満たし、一晩培養した(Wangら,200 Cancer Research 60:6008−6017参照)。次いで細胞を、成熟オス胸腺欠損(BALB−nu/nu)マウスの腎臓莢膜の下にグラフトした(1つの腎臓にはHT29を用いた)。細胞の移植片を、7日間増殖させた。7、10、13日目に、動物に、体重1kg当たり50mgのmBLA3を、腹腔内に注射した。コントロール用の動物には、生理食塩水を注射した。20日目に(最初の注射から13日目に)、動物を屠殺し、取り出された細胞移植片を、パラホルムアルデヒド固定し、上述のように薄切するために、パラフィン包埋した。
Mab−ZAP(Advanced Targeting Systems,San Diego,CA)は、サポリン(saporin)結合抗マウスIgGであり、タンパク質合成を阻害する毒素である。この毒素は、細胞膜に対して不透過性である。モノクローナル抗体が、内在性細胞表面抗原に結合される場合、毒素結合体は、結合されたモノクローナル抗体に結合し得、内在化され得、最終的に細胞を殺傷し得る。毒性活性の実証のための内在化に依存して、Mab−ZAPは、所定の表面抗原が、細胞毒性効果を発現するための内在化に依存する任意の毒素に対して、適切な標的としての役割を果たすか否かを評価するのに役立ち得る。従って、Mab−ZAPは、このような内在化依存性毒素(たとえば、メイタンシノイド(maytansinoids)、アウリスタチン(auristatin)、およびカリチケアミシン(calicheamicin))のためのモデルとして寄与する。
Claims (43)
- 受託番号ATCC第PTA−3775号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体mBLA3の、β6インテグリンサブユニットへの優先的結合を、競合的に阻害する抗体。
- 受託番号ATCC第PTA−3775号を有する宿主細胞またはその子孫によって産生される抗体mBLA3。
- 請求項2に記載の抗体mBLA3の軽鎖および重鎖の可変領域に由来する可変領域、ならびにヒト抗体の軽鎖および重鎖の定常領域に由来する定常領域を含む、キメラ抗体。
- 請求項2に記載の抗体mBLA3の、ヒト化抗体。
- 治療薬剤に結合されている、請求項1、請求項3または請求項4に記載の抗体。
- プロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合される、請求項1、請求項3または請求項4に記載の抗体。
- 宿主細胞株(ATCC番号第PTA−3775号)またはその子孫。
- 受託番号ATCC第PTA−3775号を有する宿主細胞もしくはその子孫によって産生された抗体mBLA3によって結合されるか、または該抗体mBLA3のβ6インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する抗体によって結合される、β6インテグリンサブユニットの複合体。
- 前記β6インテグリンサブユニットが、癌細胞上にある、請求項8に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、乳癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、肺癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、甲状腺癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、膵臓癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、腎臓癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 前記癌細胞が、食道癌細胞である、請求項9に記載の複合体。
- 請求項9に記載の複合体であって、前記抗体mBLA3または該抗体mBLA3のβ6インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する前記抗体が、治療薬剤に結合している、複合体。
- 請求項9に記載の複合体であって、前記抗体mBLA3または該抗体mBLA3のβ6インテグリンサブユニットへの優先的結合を競合的に阻害する前記抗体が、プロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合している、複合体。
- 請求項1、請求項3または請求項4に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、薬学的組成物。
- 請求項5に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、薬学的組成物。
- 請求項6に記載の抗体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含有する、薬学的組成物。
- 請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載の抗体を含む、癌細胞を検出するためのキット。
- 請求項1、請求項3および請求項4のいずれか1項に記載の抗体を含む、癌細胞の増殖を阻害するためのキット。
- 前記抗体が、治療薬剤に結合している、請求項24に記載のキット。
- 前記抗体が、プロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素に結合している、請求項24に記載のキット。
- 請求項2に記載の抗体を産生するための方法であって、該方法は、請求項2に記載の抗体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを発現する工程、および該抗体を精製する工程を包含する、方法。
- 個体における癌細胞の存在または非存在を検出する方法であって、該方法は、該個体由来の細胞を、請求項1、請求項2、請求項3または請求項4に記載の抗体と接触させる工程、ならびに該癌細胞由来のβ6インテグリンサブユニットと該抗体との複合体を、存在する場合に検出する工程を包含する、方法。
- 前記検出される癌細胞が、乳癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、肺癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、膵臓癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、前立腺癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、食道癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、甲状腺癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記検出される癌細胞が、腎臓癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記癌細胞が、転移性癌細胞である、請求項28に記載の方法。
- 個体における癌細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、有効量の請求項20に記載の組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項38に記載の方法。
- 個体における癌細胞に治療薬剤を送達する方法であって、該方法は、有効量の請求項21に記載の組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項40に記載の方法。
- 個体における癌細胞にプロドラッグ活性化酵素を送達する方法であって、該方法は、有効量の請求項22に記載の組成物を該個体に投与する工程を包含する、方法。
- 前記癌細胞が、結腸癌細胞である、請求項42に記載の方法。
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