WO2006001348A1 - 浸潤抑制及び細胞殺傷剤 - Google Patents

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WO2006001348A1
WO2006001348A1 PCT/JP2005/011560 JP2005011560W WO2006001348A1 WO 2006001348 A1 WO2006001348 A1 WO 2006001348A1 JP 2005011560 W JP2005011560 W JP 2005011560W WO 2006001348 A1 WO2006001348 A1 WO 2006001348A1
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selectin
cell
sugar chain
antibody
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Mitsuru Nakamura
Jiro Kikuchi
Chizu Nonomura
Hidenobu Ando
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Definitions

  • Non-patent Document 1 One of the serious problems of malignant tumors is tissue 'metastasis of tumor cells into organs' infiltration. In other words, when malignant tumor cells infiltrate into important organs and metastasize, these organs fail to function, and the entire organism becomes modulated. In addition, an intercellular signal due to adhesion of tumor cells to vascular endothelial cells or the like induces resistance to the administration of an anticancer drug and causes a reduction in therapeutic effect (Non-patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 On the other hand, it has been reported that when cells become cancerous, antigens that are not found in normal cells appear on the surface (Non-patent Document 2). Many of these cancer-associated antigens have been shown to be sugar chain antigens. Glycosylated antigens change actively with epithelial cell and leukocyte differentiation and cancerous whitening (Non-patent document 3, Non-patent document 4), some of which are used as tumor markers for cancer testing. (Non-Patent Document 5). Furthermore, it has been reported that these sugar chain antigens appearing in cancer have a significant function and some have strong cell adhesion activity.
  • this sugar chain (selectin ligand sugar chain) molecule mediates the adhesion between cancer cells and vascular endothelium, and acts to promote the acquisition of anticancer drug resistance, vascular invasion of cancer, and hematogenous metastasis.
  • sugar chains such as cyaryl Lewis a sialic lewis X have hematogenous metastases and a poorer prognosis immediately after surgery than those who do not.
  • Non-patent Document 7 Selectin ligand sugar chains are also expressed in acute T lymphocytic leukemia cells, and a correlation between this expression level and skin infiltration has been shown. This strongly suggests the involvement of actions through the binding of selectin ligand sugar chains and selectins in the process of cell adhesion and tissue infiltration of leukemia cells.
  • acute pre-B lymphocytic leukemia organ infiltration of leukemia cells was observed (Non-patent Document 8), and transplantation of pre-B lymphocytic leukemia cells into immunodeficient mice has been performed in various ways including bone marrow.
  • Non-patent Document 9 It has been reported that mice invade human organs and abnormal growth of leukemia cells, resulting in death of mice.
  • Non-patent Document 9 selectin ligand sugar chains are expressed, most of the major selectin ligand sugar chains are expressed on the cell surface antigen CD43 glycoprotein, and CD43 It has not been known so far that the selectin ligand sugar chain on the antigen plays a central role in tissue invasion.
  • Non-Patent Document 9 Blood, 78, 2973-2981, 1991
  • the present inventors have found that the cell surface antigen CD43 has been localized. There is a selectin-binding sugar chain, and the tumor cell binds to selectin in the infiltrating tissue through the selectin-binding sugar chain, and cell-cell adhesion occurs, and through this adhesion process, invasion 'metastasis is made. I got the knowledge that. It was also found that suppression of CD43 antigen and selectin ligand sugar chain expression can achieve suppression of tumor cell adhesion, tissue invasion, and metastasis.
  • the present inventors have conceived the present invention using a binding inhibitor as a tissue infiltration inhibitor and a substance having binding activity to a selectin ligand sugar chain and its carrier protein CD43 as a cell killing agent.
  • An infiltration inhibitor characterized by inhibiting the binding between selectin ligand sugar chains on the cell surface and selectin.
  • a method of inhibiting infiltration characterized by inhibiting the binding between selectin ligand sugar chains on the cell surface and selectin.
  • Glycosyltransferase gene encodes N-acetyl galatatosamine transferase gene, galactose transferase gene, N-acetylcylcosamine transferase gene, fucose transferase
  • cytotoxic agent selected from the group consisting of an antimetabolite, an alkylating agent, an anthracycline, an antibiotic, an anti-mitotic agent, a chemotherapeutic agent and a radioactive substance.
  • the cytotoxic drug is selected from the group consisting of an antimetabolite, an alkylating agent, an anthracycline, an antibiotic, an anti-mitotic agent, a chemotherapeutic agent and a radioactive substance.
  • Cell killing agent is selected from the group consisting of an antimetabolite, an alkylating agent, an anthracycline, an antibiotic, an anti-mitotic agent, a chemotherapeutic agent and a radioactive substance.
  • an agent that effectively suppresses intercellular adhesion and tissue invasion and metastasis a method of inhibiting tissue invasion and metastasis, an agent that kills hematopoietic cells including hematopoietic malignant tumor cells, and cell killing A method is provided.
  • the drug of the present invention is characterized in that the binding between a selectin ligand sugar chain on the cell surface and selectin is suppressed, and the cell is killed by targeting a carrier protein holding the selectin ligand sugar chain. .
  • the "cell surface selectin ligand sugar chain" in the agent of the present invention is most preferably Sialyl Lewis x, Sulfated Sialyl Lewis x, Sialyl Lewis a, Sulfurated Sialyl Lewis X or Sialyl Lewis X!
  • Examples of the carrier protein that retains the selectin ligand sugar chain include CD43 protein, and the substance that binds to the carrier protein is an antibody or peptide that specifically binds to an epitope in the extracellular region of CD43 protein. Preferably there is.
  • Cell killing targeting the selectin ligand sugar chain and its carrier protein CD43 can be achieved by, for example, (g) induction of antibody-dependent cytotoxic activity by anti-CD43 antibodies or (h) cell killing agents such as anticancer agents. This is achieved by conjugated anti-CD43 antibody or the like.
  • infiltration suppression means to prevent the progress of cell infiltration into a tissue and also to prevent cell infiltration into a tissue.
  • RNA As a means for suppressing the expression of CD43, for example, smalHnterfering (RNA (hereinafter referred to as “siRNA”) having a function of causing RNA interference with a transcription product of CD43 gene and preventing normal expression of CD43.
  • the base sequence having the function of expressing such siRNA in cells includes, for example, base sequences containing any of the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 20, Any of the nucleotide sequences described in SEQ ID NOS: 1 to 20 is preferable, but is not limited as long as it is a nucleotide sequence that prevents the expression of CD43 based on the mechanism of RNA interference. It can be used as an active ingredient of the drug of the present invention which may contain the base sequence of
  • the drug of the present invention using such a siRNA sequence as an active ingredient is obtained by using a nucleic acid prepared by a conventional method using a known method such as a lentivirus system (manufactured by Invitrogen).
  • the invasion suppression effect can be obtained by administering a virulent viral vector to a living body and suppressing the expression of CD43 antigen on the target cells.
  • (B) As a means for cleaving or inhibiting the bond between CD43 and Sialyl Lewis X, for example, endo-0-glycosidase (manufactured by prozyme) capable of releasing a 0-linked sugar chain from the core protein is used.
  • endo-0-glycosidase manufactured by prozyme
  • the sugar chain containing sialyl Lewis X can be cleaved from CD43.
  • potent antibodies include human monoclonal antibodies, synthetic antibodies, polyclonal antibodies, chimeric antibodies, and more specifically, CSLEX (Betaton Dickinson), KM93 antibody (Seikagaku Corporation shares) Company), DF-T1 antibody (Sigma), 1G10 antibody (Betaton Dickinson), 1D4 antibody (MBL), 84-3C1 antibody (Neomarker), Examples include MEM59 antibody (manufactured by Monosan), Bra7G antibody (manufactured by Neomarker), BL-E / G3 antibody (manufactured by Monosan), MT-1 antibody (manufactured by Progen), etc. It can be used as an active ingredient.
  • the spleen or lymph node is removed 3 to 5 days after the final immunization, and this is performed in the presence of a fusion promoter in accordance with a known cell fusion method.
  • Antibody-producing cells contained in these tissues can be fused with myeloma cells.
  • the myeloma cells are not particularly limited, and examples thereof include mouse-derived cells such as P3U1, NS-1, and P3x63.Ag8.653; rat-derived cells such as AG1 and AG2.
  • the cell fusion method is not particularly limited.
  • spleen cells and myeloma cells are mixed 1: 1 to
  • selection of a hybridoma that produces a monoclonal antibody that recognizes the CD43 antigen is performed, for example, by culturing in a selective medium such as a HAT medium in which only a hyperidoma can grow.
  • the antibody activity in the hyperidoma culture supernatant can be measured by a conventional method.
  • the establishment of a hyperidoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the CD43 antigen for example, can be cloned by a method such as limiting dilution with respect to a hyperidoma that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the CD43 antigen. This can be done by repeating.
  • a method for preparing a large amount of the above-mentioned anti-CD43 antibody is not particularly limited, and for example, the hyperpridoma of the present invention is transplanted into the abdominal cavity of a mouse that has been pre-administered with pristane to obtain the recovered ascites power
  • the method etc. can be mentioned.
  • the antibody of the present invention in ascites can be easily purified by a known method using a protein A or protein G column or the like.
  • a drug of the present invention using such an antibody as an active ingredient can obtain a desired effect by administering the drug of the present invention to a living body in the form of an injection or the like.
  • (d) As means for specifically decomposing CD43 or sialic Lewis X, for example, an enzyme that selectively degrades mucin-type glycoproteins rich in sialic acid, or specific sugar chains contained in the sialic Lewis X structure An enzyme that recognizes and cleaves the bond is exemplified. Examples of such enzymes include 0-sialoglycoprotein endopeptidase (OSGPEP, manufactured by CEDAR LANE), and the ⁇ 2,3-glycosidic bond between sialic acid and galactose.
  • OSGPEP 0-sialoglycoprotein endopeptidase
  • CEDAR LANE CEDAR LANE
  • soluble recombinant selectin As a means for competitively inhibiting or competitively inhibiting the binding between sialyl Lewis X and selectin, for example, a method using soluble recombinant selectin or soluble sugar chain can be mentioned.
  • soluble recombinant selectins include human type Fc-Ig-chimeric E-selectin and human type Fc-Ig-chimeric P-selectin (manufactured by R & D Systems), sugar chains having a Sialyl Lewis X structure (Takara, Seikagaku Corporation) and the like.
  • Such soluble recombinant selectins and sugar chains can also be used as active ingredients of the agent of the present invention.
  • a drug of the present invention using such a sugar chain as an active ingredient can obtain a desired effect by administering the drug of the present invention to a living body in the form of an injection or the like.
  • Examples of means for inhibiting the synthesis of sialyl Lewis X include a means for inhibiting the action of a glycosyltransferase involved in the synthesis of sialyl Lewis X or a means for preventing the expression of a powerful enzyme.
  • Examples of such “enzymes” include N-acetylylgalatatosamine transferase, galactose transferase, N-acetylyldarcosamine transferase, fucose transferase, sialyltransferase, and sulfotransferase.
  • substrates of these enzymes can give competitive inhibition or competitive inhibition.
  • UDP-GalNAc uridine diphosphate-N-acetylethylgalatatosamine
  • UDP-Gal uridine diphosphate- Galactose
  • UDP-GlcNAc uridine diphosphate-N-acetylcylcosamine
  • UDP-Fuc uridine diphosphate-fucose
  • UDP-SiaA uridine diphosphate-sialic acid
  • PAPS activity) Sulfuric acid
  • mimetics analogs such as benzyl-a-N-acetylylgalatatosamine, etc.
  • Induction of antibody-dependent cytotoxic activity includes administration of an anti-CD43 antibody.
  • anti-CD43 antibodies antibodies that have been humanized by recombination of variable regions by genetic recombination (so-called humanized antibodies) and chimeric antibodies can be used as active ingredients for therapeutic agents for leukemia cells.
  • leukemia cells express CD43, recombinant white blood cells (monocytes, macrophages, natural killer cells (NK cells), etc.) in which the expression of CD43 was suppressed by siRNA or the like.
  • the administration of the antibody to a living body makes it possible to treat leukemia.
  • the above-mentioned antibody that recognizes CD43 and binds to leukemia cells and binds to leukemia cells is recognized by recombinant leukocytes that do not express CD43 by recombination and exhibits cellular immunity. Only cells can be specifically killed.
  • Examples of cell killers combined with cytotoxic drugs include substances consisting of antimetabolites, alkylating agents, anthracyclines, antibiotics, antimitotics, chemotherapeutic agents and radioactive substances.
  • An effective cell killing effect can be expected by administering after binding to a substance capable of specifically binding to the CD43 glycoprotein on the cell surface, such as an anti-CD43 antibody.
  • cytotoxic drugs include lysine, doxorubicin, daunorubicin, taxol, bromide thydium, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, cortisine, dihydroxyanthracindione, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, darco Corticoid etc. are mentioned.
  • CD43 has been reported to be expressed in most hematopoietic cells other than mature B lymphocytes. From this, the use of this cell killing agent can also be expected for bone marrow suppression treatment prior to bone marrow transplantation, which is currently a heavy burden on patients due to large doses of irradiated anticancer drugs. In other words, the administration of this killing agent can specifically remove only hematopoietic cells including hematopoietic stem cells, and therefore can be expected to be applied as a pretreatment agent for bone marrow transplantation with less burden on patients.
  • the drug of the present invention is formulated according to the administration route, purpose, subject, etc. of oral administration, injection, etc., such as tablets, capsules, solutions, injections, granules, powders, liposizing agents, inhalation powders, etc. can do.
  • the concentration of the active ingredient in the drug of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 5%.
  • the drug of the present invention when used as a liquid for oral administration, it is preferably 0.01% (W / V) or more, and most preferably 0.03% to 0.2% (W / V).
  • the dosage form in the case of an injection for intramuscular injection or intravenous injection, it is preferably 0.01% (W / V) or more, most preferably 0.03% (W / V) or more.
  • the drug of the present invention exhibits the best efficacy when administered directly into blood vessels. Therefore, when using the drug of the present invention, it is particularly preferred that the dosage form can take a dosage form such as injection or infusion.
  • the dose of the drug of the present invention is most appropriately exerted according to the route of administration, administration mode, purpose of use, specific symptoms, age, body weight, etc. of the animal to be administered. As such, it should be determined individually and is not particularly limited.
  • the active ingredient when administered to humans, is 1 mg to 1 million mg per adult, once to several times a day.
  • the drug of the present invention may contain an additive in addition to the active ingredient.
  • additives include salts, preservatives, antibiotics, anti-inflammatory agents, and growth factors mixed or combined.
  • salts include sodium sulfate, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, and the like.
  • Preservatives include, for example, methyl paraoxybenzoate, propoxypropyl noraoxybenzoate, and salt.
  • anti-inflammatory agents such as oxytetracycline include diclofenac.
  • Pre-B lymphocytic leukemia cell line established cells established from cells derived from patients with pre-B lymphocytic leukemia
  • KM3 cells special gift from Dr. Jun Minowada
  • NALL1 cells Hayashibara Bioscience
  • KOPN-K cells From Prof. Isao MiyosW
  • LAZ-221 cells from Dr. Shin Matsuo, Hayashibara Bioscience Research Institute
  • leukemias collected from patients with acute pre-B lymphocytic leukemia Flow of selectin ligand sugar chain expression in cells (total 15 samples) This was confirmed using a single cytometer.
  • the cell line Raji cells which were shown to have no selectin ligand sugar chain expression in the same B cell line, were used.
  • Fig. 1 (A) KM3 cells, (B) NALLl cells, ( C) KOPN-K cells, (D) LA Z-221 cells, (E) leukemia cells # 1 from leukemia patients, (F) leukemia cells # 2 from leukemia patients, (G) Raji cells).
  • Recombinant E- and P-selectin at a final concentration of 1 to 10 / zg / mL is added to cells suspended in physiological saline (PBS), allowed to react on ice for 30 minutes, and then washed with PBS. Then, a signal was detected with a labeled antibody (Betaton Dickinson) against human-Fc-Ig conjugated with tandem dye APC-Cy7. The more the histogram is shifted to the right, the stronger the fluorescence intensity, that is, the ability to bind to selectin.
  • PBS physiological saline
  • leukemia cells from leukemia patients not shown here 13 The results for the examples were similar to those for the patient specimens shown in Figures 1 (E) (F), 2 (E) (F), and 3 (L) (M). These results indicate that pre-B lymphocytic leukemia cells express selectin ligand sugar chains on the cell surface.
  • the cell surface antigen power having a selectin ligand sugar chain that is the key to tissue invasion is the only CD43 antigen.
  • siRNA that specifically suppresses CD43 expression by RNA interference was designed.
  • the sequence is published on the Ambion website (http://www.ambion.com/).
  • the CD43 gene sequence J. Biol. Chem., 266, 13, 8483
  • the siRNA sequence was designed by randomly selecting 19 to 21 bases from the table (Table 1: The sequence part shown in bold italics is the base corresponding to the CD43 gene) Shows an array).
  • siRNAs were expressed in cells and their effects were confirmed.
  • a lentiviral system manufactured by Invitrogen capable of high-efficiency gene transfer into blood cells and an expression vector pLL3.7 (Nat. Genet., 33, 401) -406 (2 003)) was used.
  • the pLL3.7 vector is a vector that can incorporate a sense and antisense siRNA sequence containing a hairpin structure downstream of the U6 promoter and simultaneously express Green Flourescent protein (GFP) with the CMV promoter.
  • GFP Green Flourescent protein
  • CD43- # 2r TCGAGAAAAAA ggccgacagcactggggac tctcttgaa gtccccagtgctgtcggcc A
  • CD43- # 4r TC GAGAAAAAA gatgtcatcagtgccccag tctcttgaa ctggggcactgatgacatc A
  • Benzyl- ⁇ _ ⁇ _aseti one of the sugar chain synthesis inhibitors, in the culture supernatant of NALL1 cells Lugaratatosamine (Bz-a-GalNAc; manufactured by Sigma) was added, and the binding ability to selectin was detected.
  • Lugaratatosamine Bz-a-GalNAc; manufactured by Sigma
  • benzyl- ⁇ - ⁇ -acetylethyl latatosamine is incorporated into cells, it undergoes sugar chain modification in the same manner as ⁇ -acetyl galatatosamine added to the serine and threonine proteins.
  • CD43 antigen protein has many serines and threonines to which 0-linked sugar chains are added. Yes. In pre-B lymphocytic leukemia cells, sialylic Lewis X containing sialic acid is present at the end of the 0-linked glycan added to many serines and threonines. It is done.
  • the rolling and cell adhesion ability of KM3 cells into which a vector incorporating siRNA against CD43 (siCD43_pLL3.7) was introduced were detected.
  • the cells introduced with siRNA for CD43 showed a marked rolling and cell adhesion ability to CHO-E and CHO-P cells compared to empty vector-introduced cells (pLL3.7). Decreased to.
  • the effect of this reduction correlates with the cell surface selectin ligand expression level shown in FIG. 10.
  • the leukemia cells treated by the methods shown in (5) to (7) are selectin-dependent cells. It was suggested that the adhesive ability was reduced.
  • NALL1 cells into which an empty vector without siRNA expression (PLL3.7) or a vector incorporating siRNA against CD43 (siCD43-pLL3.7) was introduced were introduced into the irradiated immunodeficient mice via the tail vein. After 6 hours, spleen, liver and bone marrow cells were collected, and the transferred cells contained in the tissue, that is, transferred to the tissue, were detected. Since both the empty vector and the siRNA containing the siRNA incorporated GFP, the number of human CD45-positive and GFP-positive cells in the collected cells was compared.
  • FIG. 14 shows an example of the results of flow cytometry analysis of each tissue after cell introduction.
  • Figure 15 shows a summary of the experimental results.
  • NALL1 cells there are untreated NALL1 cells from the tail vein of immunodeficient mice irradiated with 350-400 cGy radiation! /, About 5xl0 5 NALL1 cells treated by the method described in (5)-(7) are injected.
  • SPF room breed mice with sterilized water and sterilized feed. Keep the mice for about 2 months and measure the survival rate of the mice.
  • surviving mice are euthanized approximately two months later, and the liver, spleen, kidney, etc. are collected, frozen sections are prepared, and hematoxylin is collected. Observe blood cells infiltrating the tissue by eosin staining.
  • mice peripheral blood and bone marrow fluid are collected, and the proportion of leukemia cells in the leukocyte fraction is detected by a flow cytometer using a human CD45 antibody according to a conventional method.
  • mice transplanted with NALL1 cells treated by the methods described in (5) to (7) it is considered that few transplanted leukemia cells are observed in various organs, peripheral blood and bone marrow fluid. Furthermore, a high survival rate is observed as an effect of suppressing tissue infiltration.
  • Antibody-dependent cytotoxic activity using anti-CD43 antibody was measured.
  • the cells were prepared at 2 ⁇ 10 5 cells / ml in RPMI1640 medium (GIBCO-BRL) containing 5% urine fetal serum (GIBCO-BRL). Add these cells to a 96-well U-bottom plate (manufactured by FALCON) and then measure the antibody-dependent cytotoxic activity (mouse anti-human CD43 antibody, MEM59, DFT-1), effector cells (mouse or human single) (Nucleocytes) was added at 50 ⁇ l. 50 ⁇ m after 4 hours incubation in a 37 ° CCO incubator
  • A is the absorbance when the target cells are incubated in the presence of the antibody and effector cells
  • B is the absorbance when only the effector cells are incubated
  • C is the target cell.
  • D is the absorbance when the target cell is maximally toxic.
  • an agent that effectively suppresses cell adhesion and tissue invasion and metastasis a method of inhibiting tissue invasion and metastasis, an agent that kills hematopoietic cells including hematopoietic malignant tumor cells, and cell killing A method is provided.

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Abstract

　細胞表面抗原CD43上に発現するセレクチンリガンド糖鎖に対して、(1) 細胞表面抗原CD43及びセレクチンリガンド糖鎖の発現に関わる遺伝子の発現をRNA干渉により抑制するsiRNA、(2)糖鎖合成の基質に対する疑似体など糖鎖合成の阻害剤、 (3) 細胞表面抗原CD43及びセレクチンリガンド糖鎖を分解する酵素、(4) 細胞表面抗原CD43及びセレクチンリガンド糖鎖に対する抗体等を、セレクチン結合性糖鎖とセレクチンとの結合抑制剤、あるいは細胞殺傷剤として用いることにより、白血病細胞の組織浸潤の抑制が可能な浸潤抑制剤及び抑制方法、及びCD43発現細胞に対する細胞殺傷剤と細胞殺傷方法を提供する。

Description

浸潤抑制及び細胞殺傷剤
技術分野
[0001] 本発明は、悪性腫瘍細胞の組織への浸潤抑制剤及び細胞殺傷剤に関し、特に細 胞表面タンパク質上に特徴的に発現するセレクチン結合性糖鎖とセレクチンとの結 合を抑制する浸潤抑制剤、及び特徴的セレクチン結合性糖鎖、糖タンパク質を標的 とした細胞殺傷剤に関する。
背景技術
[0002] 悪性腫瘍の重大な問題の一つに、組織'臓器への腫瘍細胞の転移'浸潤があげら れる。すなわち、重要な臓器に悪性腫瘍の細胞が浸潤して転移した場合、それらの 臓器は機能不全を起こし、生体全体が変調を来たすようになる。また、腫瘍細胞の血 管内皮細胞等への接着による細胞間シグナルは、抗癌剤投与に対する抵抗性を誘 導し、治療効果の低減を招く (非特許文献 1)。
[0003] 従って、悪性腫瘍細胞の接着や接着を介した組織'臓器浸潤'転移の抑制は、治 療において重要な意義を持っている。し力しながら、現在の臓器浸潤や転移に対す る治療法は、血管新生抑制剤や増殖因子に対する抗体が治療薬として臨床試験さ れている程度であり、浸潤のきっかけとなり、抗癌剤への耐性を誘導する細胞間接着 を直接的に抑制するような治療薬や治療法の実用化はなされていない。
[0004] 一方、細胞はがん化すると、その表面に正常細胞には見られない抗原が出現する ことが報告されている (非特許文献 2)。そして、これらがん関連抗原の多くは糖鎖抗 原であることが明らかにされている。糖鎖抗原は、上皮細胞や白血球の分化やがん ィ匕'白血化にともなって活発に変化し (非特許文献 3、非特許文献 4)、その一部は、 腫瘍マーカーとしてがんの検査にも利用されている（非特許文献 5)。さらに、がんに 出現するこれらの糖鎖抗原には重大な機能があり、一部には強い細胞接着活性があ ることが報告されている。中でも、消ィ匕器がんの検査診断に広く使われている腫瘍マ 一力一 CA19-9が消ィ匕器のがん細胞を血管に接着させる機能をもつ分子であること が明かにされている。（非特許文献 6)。腫瘍マーカー CA19-9で検出する糖鎖はシァ リルルイス aという糖鎖である力 これがシァリルルイス Xとともに血管内皮細胞の細胞 接着分子である E—セレクチンと結合することが報告されている。ここから、この糖鎖（ セレクチンリガンド糖鎖)分子が、がん細胞と血管内皮との接着を媒介して、抗癌剤 耐性の獲得やがんの血管浸潤、血行性転移を促進する働きを持つことが示唆される 。さらに、シァリルルイス aゃシァリルルイス Xなどの糖鎖を強く発現するようながん細胞 をもつ患者では、そうでない患者よりも血行性転移が起こりやすぐ手術後の予後が 悪いことも報告されている。
[0005] 急性 Tリンパ球性白血病細胞においてもセレクチンリガンド糖鎖が発現しており、こ の発現レベルの皮膚浸潤との相関性が示されている（非特許文献 7)。ここから、白血 病細胞の細胞接着や組織浸潤の過程におけるセレクチンリガンド糖鎖とセレクチン の結合を介した作用の関与が強く示唆される。一方、急性プレ Bリンパ球性白血病に おいても、白血病細胞の臓器浸潤が見られ (非特許文献 8)、免疫不全マウスへのプ レ Bリンパ球性白血病細胞の移植は、骨髄を含む種々の臓器への浸潤や、白血病細 胞の異常増殖を誘発し、マウスが死に至ることが報告されている（非特許文献 9)。し 力しながら、プレ Bリンパ球性白血病細胞では、セレクチンリガンド糖鎖が発現してい ること、主要なセレクチンリガンド糖鎖のほとんどが細胞表面抗原 CD43糖タンパク質 上に発現していること、及び CD43抗原上のセレクチンリガンド糖鎖が組織浸潤に中 心的な働きをして 、ることは、これまで知られて 、なかった。
[0006] 非特許文献 1 Nat.Med., 9: 1158-1165, 2003
非特許文献 2 Natl. Cancer Inst., 71: 231-251, 1983
非特許文献 3 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2833-2848, 1983
非特許文献 4 Science, 220: 509-511, 1983
非特許文献 5 Cancer Res., 48: 3856—3863, 1988
非特許文献 6 Cancer Res., 53: 354-361, 1993
非特許文献 7 Cancer Res., 55: 6533—6538, 1994
非特許文献 8 Blood, 88, 1135-1140, 1996
非特許文献 9 Blood, 78, 2973-2981, 1991
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0007] 悪性腫瘍、殊に白血病や悪性リンパ腫などの造血器悪性腫瘍では、腫瘍細胞の血 管内皮細胞への接着やその接着を介した組織浸潤が、抗癌剤による細胞殺傷効果 の抑制や再発の原因となり、治療上の問題となっている。特に抗癌剤や放射線によ る治療効果の及びにくい中枢神経組織への浸潤は白血病の根治的治療における重 要な問題である。従って、細胞接着と接着を介した臓器浸潤の抑制は、造血器悪性 腫瘍の治療において重要な課題である。しカゝしながら、これまでのところ細胞接着や 組織浸潤及び転移を抑制する治療剤は、十分とはいえず、より効果的に細胞接着や 組織浸潤 ·転移を抑制する薬剤の開発が望まれて!/ヽた。
課題を解決するための手段
[0008] そこで、本発明者らは、悪性腫瘍、殊に造血器悪性腫瘍における、腫瘍細胞の細 胞接着と組織浸潤の抑制を図るベぐ鋭意検討を重ねた結果、細胞表面抗原 CD43 に局在的にセレクチン結合性糖鎖が存在し、カゝかるセレクチン結合性糖鎖を介して 腫瘍細胞が浸潤組織のセレクチンに結合して細胞間接着が起こり、この接着過程を 経て浸潤'転移がなされるとの知見を得た。そして、 CD43抗原及びセレクチンリガンド 糖鎖の発現抑制により腫瘍細胞の細胞接着や組織浸潤及び転移の抑制が達成でき ることを見 、だし、 CD43抗原及びセレクチンリガンド糖鎖の発現抑制物ゃセレクチン との結合阻害物を組織浸潤抑制剤として、また、セレクチンリガンド糖鎖とそのキヤリ ァタンパク質 CD43に結合活性を有する物質を細胞殺傷剤として本発明に想到した。
[0009] すなわち、本発明は以下の（1)〜（27)に関する。
(1) 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制することを特 徴とする浸潤抑制剤。
(2) small-interfering RNA (siRNA)配列を有する核酸を有効成分とすることを特徴と する上記（1)記載の浸潤抑制剤。
(3) small-interfering RNA (siRNA)配列が、配列番号 1乃至 20の何れかの塩基配 列を含むことを特徴とする上記 (2)記載の浸潤抑制剤。
(4) エンド- 0-グリコシダーゼを有効成分とすることを特徴とする上記（1)記載の浸 潤抑制剤。 (5) 抗 CD43抗体を有効成分とすることを特徴とする上記（1)記載の浸潤抑制剤。
[0010] (6) ヒト型- Fc- Ig-キメラ E-セレクチン、ヒト型- Fc- Ig-キメラ P-セレクチン、及びシァリ ルルイス X構造を有する糖鎖からなる群から選択される一以上の糖鎖を有効成分とす ることを特徴とする上記（1)記載の浸潤抑制剤。
(7) 細胞の組織浸潤を予防するための上記（1)乃至（6)何れか一項記載の浸潤抑 制剤の使用。
(8) 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制することを特 徴とする浸潤抑制方法。
(9) 細胞表面抗原 CD43に対するセレクチンリガンド糖鎖の付加を抑制することを特 徴とする上記（8)記載の方法。
(10) 細胞表面抗原 CD43の発現を抑制することを特徴とする上記（8)記載の方法。
[0011] (11) セレクチンリガンド糖鎖を細胞表面抗原 CD43に付加する糖転移酵素遺伝子 の発現を抑制することを特徴とする上記 (8)記載の方法。
(12) 糖転移酵素遺伝子が N-ァセチルガラタトサミン転移酵素をコードする遺伝子 、ガラクトース転移酵素をコードする遺伝子、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素をコ ードする遺伝子、フコース転移酵素をコードする遺伝子、シアル酸転移酵素をコード する遺伝子、または硫酸転移酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする上記（1 1)記載の方法。
(13) small-interfering RNA(siRNA)配列を有する核酸を用いることを特徴とする上 記（8)乃至（12)何れか一項記載の方法。
(14) small-interfering RNA(siRNA)配列力 配列番号 1乃至 20の何れかの塩基配 列を含むことを特徴とする上記（13)記載の方法。
(15) 細胞表面抗原 CD43とセレクチンリガンド糖鎖との結合を切断することを特徴と する上記（8)記載の方法。
[0012] (16) 細胞表面抗原 CD43を分解することを特徴とする上記（8)記載の方法。
(17) セレクチンリガンド糖鎖を分解することを特徴とする上記 (8)記載の方法。
(18) small-interfering RNA(siRNA)配列を有する核酸の、セレクチンリガンド糖鎖と セレクチンとの結合抑制のための使用。 (19) 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖とその糖鎖を保持するキャリアタンパク質 に結合することにより、この糖タンパク質を発現する細胞に特異的に細胞死を誘導す ることを特徴とする細胞殺傷剤。
(20) セレクチンリガンド糖鎖を保持するキャリアタンパク質力 CD43タンパク質である 上記（ 19)記載の細胞殺傷剤。
[0013] (21) キャリアタンパク質に結合する物質力 CD43タンパク質の細胞外領域中のェ ピトープに特異的に結合する抗体やペプチドである上記（ 19)記載の細胞殺傷剤。
(22) 細胞傷害性薬剤が結合された上記 (21)記載の細胞殺傷剤。
(23) 細胞傷害性薬剤が、抗代謝物、アルキル化剤、アンスラサイクリン類、抗生物 質、抗分裂剤、化学療法剤及び放射性物質からなる群から選択される、上記 (22)記 載の細胞殺傷剤。
(24) 細胞傷害性薬剤力 リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキノール、臭化 ェチジゥム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、 コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ァクチノマイシン D、 1ーデヒドロテストス テロン及びダルココルチコイドからなる群力 選択される、上記（22)記載の細胞殺傷 剤。
(25) CD43タンパク質の細胞外領域中のェピトープに特異的に結合する抗体力 ヒ ト型モノクローナル抗体、合成の抗体、ポリクローナル抗体またはキメラ抗体である上 記（21)記載の細胞殺傷剤。
[0014] (26) 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖とその糖鎖を保持するキャリアタンパク質 に上記（19)乃至（25)記載の細胞殺傷剤が結合することを特徴とする、細胞殺傷の 方法。
(27) 上記（26)に記載の方法であって、細胞が CD43を発現する造血器悪性腫瘍 及び造血幹細胞を含む造血系細胞である、方法。
発明の効果
[0015] 本発明により、細胞間接着や組織浸潤'転移を効果的に抑制する薬剤及び組織浸 潤 ·転移の抑制方法と、造血器悪性腫瘍細胞を含む造血系細胞を殺傷する薬剤と 細胞殺傷の方法が提供される。 発明を実施するための最良の形態
[0016] 1.本発明薬剤
本発明は、細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制するこ とを特徴とする浸潤抑制剤、及び細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖とその糖鎖を保 持するキャリアタンパク質に結合することにより、この糖タンパク質を発現する細胞に 特異的に細胞死を誘導することを特徴とする細胞殺傷剤に関し、これらを総称して「 本発明薬剤」と略記する。
[0017] 本発明薬剤は、細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制す ることと、セレクチンリガンド糖鎖を保持するキャリアタンパク質を標的に細胞を殺傷す ることを特徴とする。
[0018] 本発明薬剤における「細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖」とは、シァリルルイス x、 硫酸化シァリルルイス x、シァリルルイス aを指称する力 硫酸化シァリルルイス Xまたは シァリルルイス Xがもっとも好まし!/、。
[0019] セレクチンリガンド糖鎖を保持するキャリアタンパク質としては、 CD43タンパク質等 が挙げられ、キャリアタンパク質に結合する物質は、 CD43タンパク質の細胞外領域 中のェピトープに特異的に結合する抗体やペプチド等であることが好ましい。
[0020] シァリルルイス Xは、細胞表面には CD43を介して結合している。従って、シァリルル イス Xとセレクチンとの結合の抑制は、例えば (a) CD43の発現を抑制する手段、（b) C D43とシァリルルイス Xとの結合を切断又は阻害する手段、（c) CD43とシァリルルイス X との複合体に結合し立体配置に変位を起こさせる手段、（d) CD43又はシァリルルイス Xを特異的に分解する手段、 (e)シァリルルイス Xとセレクチンとの結合を競合阻害又 は競争阻害する手段、 (f)シァリルルイス Xの合成を阻害する手段等により達成される 。また、セレクチンリガンド糖鎖とそのキャリアタンパク質 CD43を標的とする細胞殺傷 は、例えば (g)抗 CD43抗体による抗体依存性細胞傷害活性の誘導や、（h)抗がん剤 などの細胞殺傷薬剤が結合された抗 CD43抗体等により達成される。
[0021] 本発明薬剤の適用対象となる細胞は、組織への浸潤性を有する腫瘍細胞であれ ばいずれであってもよいが、特に造血器悪性腫瘍細胞であることが好ましぐ白血病 細胞であることがより好ましい。さらに白血病細胞の中でも、特に B細胞由来の腫瘍細 胞であることが好ましぐ特にプレ Bリンパ球性白血病細胞であることが好ま 、。
[0022] なお、本発明における「浸潤抑制」とは、組織への細胞の浸潤の進行を妨げること を意味するとともに、組織への細胞の浸潤の予防も意味する。
[0023] (a) CD43の発現を抑制する手段としては、例えば CD43遺伝子の転写産物と RNA 干渉を起こして CD43の正常な発現を妨げる働きを有する smalHnterfering (RNA (以 下「siRNA」と記載する）を用いる方法が好まし 、。このような siRNAを細胞内で発現さ せる働きを有する塩基配列としては、例えば配列番号 1乃至 20記載の何れかの塩基 配列を含む塩基配列があげられ、特に配列番号 1乃至 20記載の何れかの塩基配列 力 なる塩基配列が好まし 、が、 RNA干渉の機構に基づ 、て CD43の発現を妨げる 塩基配列である限りにおいて限定はされず、他の任意の塩基配列を含んでもよぐ本 発明薬剤の有効成分として使用することができる。
[0024] このような siRNA配列を有効成分として使用する本発明薬剤は、常法により調製し た核酸を、例えばレンチウィルスシステム (インビトロジェン社製)等のような公知の手 段を用いてウィルスベクターに導入し、力かるウィルスベクターを生体に投与し、対象 となる細胞に対して CD43抗原の発現を抑制させて、浸潤抑制効果を得ることができ る。
[0025] (b) CD43とシァリルルイス Xとの結合を切断又は阻害する手段としては、例えばコア タンパク質からの 0-結合型糖鎖の遊離が可能なエンド- 0-グリコシダーゼ (prozyme 社製)を用いることにより、シァリルルイス Xを含む糖鎖を CD43から切断することができ る。
[0026] このような酵素を有効成分として使用する本発明薬剤は、例えば生体に本発明薬 剤を注射剤などの形態により投与することで所望の効果を得ることが可能である。
[0027] (c) CD43とシァリルルイス Xとの複合体に結合し立体配置に変位を起こさせる手段と しては、例えばシァリルルイス Xや CD43に対する抗体等を用いる方法が挙げられる。 力かる抗体の例としては、ヒト型モノクローナル抗体、合成の抗体、ポリクローナル抗 体、キメラ抗体等が挙げられ、更に具体的には、 CSLEX (ベタトンディッキンソン社製） 、 KM93抗体 (生化学工業株式会社製)、 DF-T1抗体 (シグマ社製)、 1G10抗体 (ベタ トンディッキンソン社製）、 1D4抗体 (MBL社製）、 84- 3C1抗体 (ネオマーカー社製）、 MEM59抗体（モノサン社製）、 Bra7G抗体（ネオマーカー社製）、 BL- E/G3抗体（モノ サン社製)、 MT-1抗体 (プロジェン社製)等が例示され、いずれも本発明薬剤の有効 成分として使用することができる。
[0028] 本発明薬剤に使用することができるシァリルルイス Xや CD43に対する抗体は、ハイ プリドーマを用いて調製することも可能である。かかるハイプリドーマは、公知の細胞 融合法により作製することができる。即ち、例えばヒト CD43抗原を免疫原としてヒト以 外の動物を免疫し、その脾細胞又はリンパ節細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイ プリドーマを作製し、その中からヒト CD43抗原を認識するモノクローナル抗体を産生 するハイプリドーマを選択することにより目的のハイプリドーマを得ることができる。
[0029] 上記免疫原としては、 CD43を含有するものであれば特に限定されず、例えば、 CD 43をコードする核酸 (J. Biol. Chem., 266, 13, 8483-8489 (1991) )の塩基配列からな る核酸を常法に従って組み込んだ組換体を生育させて得られる生育物 (組換体破砕 物、培地、排泄物、分泌物など）、或いはそれらから既存の抗 CD43抗体などを用いる ァフィユティークロマトグラフィーで部分精製又は精製して得た CD43抗原等を挙げる ことができるが、特に精製して得た CD43抗原であることが好ま 、。
[0030] 上述のハイプリドーマを作製するために用いる被免疫動物としては特に限定されず 、例えば、ャギ、ヒッジ、モノレモット、マウス、ラット、ゥサギ等を挙げることができるが、 なかでもマウスが好まし！/、。
上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば 、マウスを免疫する場合、 1回に 1〜100 g、好ましくは 50〜100 gの免疫用抗原を 等容量（O.lmL)の生理食塩水及びフロイントの完全アジュバント、不完全アジュバン ト、又は RIBIアジュバントシステムで乳化して、上記被免疫動物の背部、腹部の皮下 又は腹腔内に 2〜3週毎に 3〜6回接種する方法等を挙げることができる。
[0031] 上記被免疫動物を免疫後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫 3〜5日後に脾臓 又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、融合促進剤の存在下で、これ らの組織に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。
[0032] 上記融合促進剤としては特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール (以下「P EG」とも記載する）や、センダイウィルス等を挙げることができる力 PEGを用いること が好ましい。
[0033] 上記骨髄腫細胞としては特に限定されず、例えば、 P3U1、 NS-1、 P3x63.Ag8.653等 のマウス由来の細胞； AG1、 AG2等のラット由来の細胞等を挙げることができる。
[0034] 上記細胞融合法としては特に限定されず、例えば、脾細胞と骨髄腫細胞とを 1:1〜
10:1の比率で混合し、これに分子量 1,000〜6,000の PEGを 10〜80%の濃度で添加し 、 20〜37°C、好ましくは 30〜37°Cで 3〜10分間インキュベートする方法等を挙げること ができる。
[0035] 抗 CD43抗体を有効成分とする本発明薬剤において、 CD43抗原を認識するモノク ローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、例えば、ハイプリドーマのみが生 育できる HAT培地等の選択培地で培養し、ハイプリドーマ培養上清中の抗体活性を 常法により測定することにより行うことができる。更に、 CD43抗原を特異的に認識する モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマの榭立は、例えば、 CD43抗原を特異 的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマに対し、限界希釈等の方 法によりクローユングを繰り返すことにより行うことができる。
[0036] 上述の抗 CD43抗体を大量に調製する方法としては特に限定されず、例えば、あら 力じめプリスタンを投与したマウスの腹腔に本発明ハイプリドーマを移植して、回収し た腹水力も得る方法等を挙げることができる。腹水中の本発明抗体は、プロテイン A やプロテイン Gカラム等を使用する公知の方法等により容易に精製することができる。
[0037] このような抗体を有効成分として使用する本発明薬剤は、例えば生体に本発明薬 剤を注射剤などの形態により投与することで所望の効果を得ることが可能である。
[0038] (d) CD43又はシァリルルイス Xを特異的に分解する手段としては、例えばシアル酸 を多く含むムチン型糖タンパク質を選択的に分解する酵素や、シァリルルイス X構造 に含まれる特定の糖鎖同士の結合を認識して切断する酵素が例示される。かかる酵 素としては、 0-シァログライコプロテインエンドぺプチダーゼ（O-sialoglycoprotein en dopeptidase： OSGPEP, CEDAR LANE社製）や、シアル酸とガラクトースとの α 2,3- グリコシド結合を特異的に切断するシァリダーゼ (prozyme社製）、ガラクトースと N-ァ セチルダルコサミンとの /3 1,4-グリコシド結合を特異的に切断する /3 -ガラタトシダー ゼ (prozyme社製)等が例示され、 Vヽずれも本発明薬剤の有効成分として使用するこ とがでさる。
[0039] このような酵素を有効成分として使用する本発明薬剤は、例えば生体に本発明薬 剤を注射剤などの形態により投与することで所望の効果を得ることが可能である。
[0040] (e)シァリルルイス Xとセレクチンとの結合を競合阻害又は競争阻害する手段として は、例えば可溶型リコンビナントセレクチンや可溶型糖鎖を使用する方法が挙げられ る。力かる可溶型リコンビナントセレクチンとしては、例えばヒト型 Fc-Ig-キメラ E-セレク チン及びヒト型 Fc-Ig-キメラ P-セレクチン (R&Dシステム社製）、シァリルルイス X構造を 有する糖鎖 (タカラ、生化学工業社製)等が例示される。このような可溶型リコンビナ ントセレクチンや糖鎖も本発明薬剤の有効成分として使用することが可能である。
[0041] このような糖鎖を有効成分として使用する本発明薬剤は、例えば生体に本発明薬 剤を注射剤などの形態により投与することで所望の効果を得ることが可能である。
[0042] (f)シァリルルイス Xの合成を阻害する手段としては、例えばシァリルルイス Xの生合 成に関与する糖転移酵素の作用を阻害する手段又は力かる酵素の発現を妨げる手 段が挙げられる。このような「酵素」としては、例えば N-ァセチルガラタトサミン転移酵 素、ガラクトース転移酵素、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素、フコース転移酵素、シ アル酸転移酵素、硫酸転移酵素が挙げられる。
[0043] このような酵素の働きを阻害する手段としては、例えばこれらの酵素の基質 (UDP- GalNAc (ゥリジン二リン酸- N-ァセチルガラタトサミン）、 UDP- Gal (ゥリジン二リン酸-ガ ラタトース）、 UDP- GlcNAc (ゥリジン二リン酸- N-ァセチルダルコサミン）、 UDP- Fuc (ゥ リジン二リン酸-フコース）、 UDP-SiaA (ゥリジン二リン酸-シアル酸）、 PAPS (活性硫酸 ) )の疑似体 (アナログ：例えばベンジル- a -N-ァセチルガラタトサミン等）により競合 阻害又は競争阻害が挙げられる。
[0044] また、このような酵素の発現を妨げる手段としては、これらの酵素をコードする遺伝 子の転写産物と RNA干渉を起こす siRNAをコードする塩基配列を有する核酸を細胞 に導入する手段が挙げられる。当業者であれば、発現を妨げる目的の酵素をコード する核酸の塩基配列を基に、 siRNAの塩基配列を適宜選択して調製することができ る。このような siRNAの塩基配列を有する核酸も本発明薬剤の有効成分として使用す ることがでさる。 [0045] このような本発明薬剤は、常法により調製した核酸を、例えばレンチウィルスシステ ム (インビトロジェン社製)等のような公知の手段を用いてウィルスベクターに導入し、 力かるウィルスベクターを生体に投与し、対象となる細胞に対してシァリルルイス Xの 発現を抑制させて、浸潤抑制効果を得ることができる。
[0046] (g)抗体依存性細胞傷害活性の誘導には抗 CD43抗体の投与が挙げられる。抗 CD 43抗体のうち、遺伝子組換の手法により可変領域を組換えてヒト化した抗体 (いわゆ るヒト化抗体)やキメラ抗体は白血病細胞の治療剤の有効成分としても利用可能であ る。本発明により、白血病細胞が CD43を発現していることが明らかになったことから、 CD43の発現を siRNAなどにより抑制した組換白血球細胞（単球、マクロファージ、ナ チュラルキラー細胞 (NK細胞)等）とともに上記抗体の生体への投与により、白血病 の治療が可能となる。すなわち、 CD43を上記抗体が認識して白血病細胞に結合し、 白血病細胞に結合した上記抗体を、組換により CD43を発現しない組換白血球細胞 が認識して細胞性免疫作用を示すことで、白血病細胞のみを特異的に殺傷すること が可能となる。
[0047] (h)細胞傷害薬剤を結合させた細胞殺傷剤としては、例えば抗代謝物、アルキル ィ匕剤、アンスラサイクリン類、抗生物質、抗分裂剤、化学療法剤及び放射性物質から なる物質を抗 CD43抗体など、細胞表面の CD43糖タンパク質に特異的に結合能のあ る物質に結合させた後、投与することで効率的な細胞殺傷効果が期待できる。更に 具体的な細胞傷害性薬剤としては、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソー ル、臭化工チジゥム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラ スチン、コルチシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ァクチノマイシン D、 1ーデヒドロ テストステロン、ダルココルチコイド等が挙げられる。また、 CD43は造血系細胞の中で は成熟 Bリンパ球以外のほとんどの細胞で発現があることが報告されて 、る。ここから 、現在、放射線照射ゃ抗がん剤の大量投与により、患者へ大きな負担となっている 骨髄移植前の骨髄抑制処置にも本細胞殺傷剤の使用が期待できる。すなわち、本 殺傷剤の投与により、造血幹細胞を含む造血系細胞のみを特異的に除去可能なこと から、患者の負担の少ない骨髄移植の前処置剤としての応用が期待できる。
[0048] このような本発明薬剤のセレクチンリガンド糖鎖とセレクチンとの結合の抑制と、セレ クチンリガンド糖鎖とその糖鎖を保持するキャリアタンパク質を標的とした細胞殺傷方 法は、セレクチンとの結合特に（a) CD43抗原及びセレクチンリガンド糖鎖の発現を抑 制する手段又は (g)抗 CD43抗体投与による抗体依存性細胞傷害活性の誘導する手 段を用いて行われることが好ましぐ本発明薬剤の有効成分は特に CD43抗原及びセ レクチンリガンド糖鎖の発現を抑制する siRNA配列を有する核酸、抗 CD43抗体又は 抗セレクチンリガンド糖鎖抗体が好ましぐ特に CD43抗原及びセレクチンリガンド糖 鎖の発現を抑制する siRNA配列を有する核酸又は抗 CD43抗体が好ましい。
[0049] 上記本発明薬剤は、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、顆粒剤、散剤、リポ化剤、 吸入散剤等、経口投与、注射等の投与ルート、目的、対象等に応じて製剤化するこ とができる。本発明薬剤中における有効成分の濃度は特に限定はされないが、 0.001 〜5%とするのが好ましい。例えば本発明薬剤を経口投与用の液剤とする場合には、 0 .01% (W/V)以上とするのが好ましぐ 0.03%〜0.2% (W/V)とするのが最も好ましい。ま た、筋注又は静注用の注射剤とする場合には 0.01% (W/V)以上とするのが好ましぐ 0.03% (W/V)以上とするのが最も好ましい。本発明薬剤は血管中への直接投与が最 も優れた薬効を示す。従って、本発明薬剤を使用する際に、注射や点滴などの投与 形態を執りうる剤形であることが特に好ましい。
[0050] また、本発明薬剤の投与量は、投与ルート、投与形態、使用目的、投与対象となる 動物の具体的症状、年齢、体重等に応じて、本発明の効果が最も適切に発揮される 様に個別に決定されるべき事項であり、特に限定されない。例えば、ヒトに投与する 場合、有効成分として成人 1人 1回当たり lmg〜l,000mg程度、 1日 1回〜数回投与さ れる。
[0051] また、本発明薬剤は、その有効成分の他に添加物を含んでいてもよい。添加剤とし ては例えば塩類、保存剤、抗生物質、抗炎症剤、増殖因子の混合又は組み合わせ 力 Sあげられる。塩類としては例えば硫酸ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム、リン酸水素ナトリウ ム等、保存剤としては例えばパラォキシ安息香酸メチル、ノラオキシ安息香酸プロピ ル、塩ィ匕ベンザルコ -ゥム等、抗生物質としては、例えばォキシテトラサイクリン等、 抗炎症剤としては例えばジクロフエナック等が挙げられる。
[0052] また、本発明薬剤は、通常の医薬組成物を調製する際に使用される賦形剤、安定 ィ匕剤等の製剤補助剤も何ら支障なく使用することができる。
[0053] 本発明薬剤は、細胞の浸潤の抑制に働くが、かかる「抑制」は、浸潤前に浸潤が起 こることを妨げる「予防」、すでに浸潤しているが、さらなる浸潤を妨げる「悪ィ匕防止」、 「浸潤した状態の「改善」のいずれも包含する概念であるが、本発明薬剤は、特に予 防にも極めて優れた効果を有する。
[0054] 2.本発明方法
本発明方法は、細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制す ることを特徴とする細胞浸潤抑制方法及びセレクチンリガンド糖鎖を保持する CD43タ ンパク質などのキャリアタンパク質を標的とすることを特徴とする細胞殺傷方法である
[0055] 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合の抑制及びセレクチンリ ガンド糖鎖とそれを保持する CD43を標的とした細胞殺傷は、例えば前記本発明薬剤 で説明した (a) CD43の発現を抑制する手段、（b) CD43とシァリルルイス Xとの結合を 切断又は阻害する手段、 (c) CD43とシァリルルイス Xとの複合体に結合し立体配置に 変位を起こさせる手段、（d) CD43又はシァリルルイス Xを特異的に分解する手段、（e) シァリルルイス Xとセレクチンとの結合を競合阻害又は競争阻害する手段、 （f)シァリ ルルイス Xの合成を阻害する手段、（g) CD43の細胞外ドメインを認識する抗体により 抗体依存性細胞傷害活性を誘導する手段、 (h)細胞傷害薬剤を付加した CD43細胞 外ドメイン結合物質による手段等によって行うことができる。
[0056] 力かる手段を実現するための具体的物質及びその使用方法は、上記 1.本発明薬 剤と同様である。
実施例
[0057] (1)白血病細胞におけるセレクチンリガンド糖鎖発現の確認
プレ Bリンパ球性白血病細胞株 (プレ Bリンパ球性白血病患者由来の細胞より榭立 した株化細胞） KM3細胞（林原生物科学研究所 Dr. Jun Minowadaより恵与）、 NALL1 細胞（林原生物科学研究所 Prof. Isao MiyosWより恵与）、 KOPN- K細胞、 LAZ-221細 胞 (林原生物科学研究所 Dr. Shin Matsuoより恵与)及び、急性プレ Bリンパ球性白血 病患者より採取した白血病細胞 (総数 15検体)のセレクチンリガンド糖鎖発現をフロ 一サイトメーターを用いて確認した。なお、本実験の陰性コントロールには同じ B細胞 系列でセレクチンリガンド糖鎖の発現のな 、ことが明らかにされて 、る細胞株 Raji細 胞を用いた。
[0058] 主要なセレクチンリガンド糖鎖であるシァリルルイス X糖鎖抗原は、タンデム色素 AP C-Cy7を結合させた CSLEX抗体 (シァリルルイス X構造を特異的に認識する抗体：ベ タトンディッキンソン社製）により、 J. Biol. Chem., 273, 41, 26779- 26789 (1998)記載 の方法に従って、フローサイトメーターにより蛍光強度と細胞数の分布を確認した。ヒ ストグラムが右へシフトする程蛍光強度すなわちシァリルルイス X発現量の多いことを 示す。
その結果、これらの細胞にお!、てはシァリルルイス Xが高レベルで発現して!/、ること が明ら力となった（図 1 : (A) KM3細胞、（B) NALLl細胞、（C) KOPN- K細胞、（D) LA Z-221細胞、（E)白血病患者由来の白血病細胞 # 1、（F)白血病患者由来の白血病 細胞 # 2、（G) Raji細胞）。
[0059] 同様に、 E-セレクチン及び P-セレクチンとの結合能を、リコンビナントタンパク質 (ヒト 型キメラ- Fc-Ig-E-または P-セレクチン、 R&Dシステムズ社製）を用いて、 Blood, 104. 3091-3096 (2004)記載の方法に従って、フローサイトメーターにより蛍光強度と細胞 数の分布を確認した。具体的には lmmol/LCaCl及び 1%血清を添カ卩したリン酸緩衝
2
生理的食塩水（PBS)に懸濁した細胞に、終濃度 l〜10 /z g/mLのリコンビナント E-及 び P-セレクチンをカ卩え、氷上で 30分間反応をさせた後、 PBSで洗浄し、タンデム色素 APC-Cy7を結合させたヒト型 - Fc-Igに対する標識抗体 (ベタトンディッキンソン社製） によりシグナルを検出した。ヒストグラムが右へシフトする程、蛍光強度すなわちセレク チンとの結合能の強 、ことを示す。
[0060] その結果、これらの細胞においては著明な E-セレクチン及び P-セレクチン結合能 を有していることが明ら力となった（図 2及び図 3)。図 2及び図 3において、（A) (H) K M3細胞、 (B) (I) NALLl細胞、（C) (J) KOPN- K細胞、（D) (K) LAZ- 221細胞、（E) ( L)白血病患者由来の白血病細胞 # 1、 (F) (M)白血病患者由来の白血病細胞 # 2 、 (G) (N) Raji細胞。 （A)〜（G)は E-セレクチンとの結合能を、 （H)〜（N)は P-セレク チンとの結合能を表す。なお、ここに示していない白血病患者由来の白血病細胞 13 例に関する結果は、図 1 (E) (F)、図 2 (E) (F)及び図 3 (L) (M)に示した患者検体 の結果とほぼ同様であった。これらの結果は、プレ Bリンパ球性白血病細胞は細胞表 面にセレクチンリガンド糖鎖を発現していることを示すものである。
[0061] (2)白血病細胞株におけるセレクチン依存性の細胞接着能の確認
血流中を流れる白血球の血管内皮細胞への接着の過程では、細胞表面に発現す るセレクチンリガンド糖鎖とセレクチンを介した結合がきっかけとなる。この結合反応 の際に、白血球が血管壁をセレクチンと結合しながら転がるように流れる現象が観察 されており、白血球ローリングと呼ばれている。セレクチンリガンド糖鎖を発現するプレ Bリンパ球性白血病細胞も、血管内皮細胞への接着、組織浸潤の最初のステップに おいて、このローリングが起きていると考えられるため、セレクチンを発現する細胞株 上にプレ Bリンパ球性白血病細胞を流し、インビト口における単位時間、単位面積あ たりの細胞ローリングの計測から、セレクチンを介した細胞接着能を比較することがで きる。実験は、 J. Biol. Chem., 277, 3979-3984 (2002)記載の方法に従い、 E-及び P- セレクチン遺伝子の導入により高密度で細胞表面にセレクチンを発現する CHO細胞 株（それぞれ CHO- E, CHO-Pと命名）をフローチャンバ一に固定ィ匕し、次に、シリン ジポンプにて 1.0 dyne/cm2のシェアストレスをカ卩えながら 0.1%血清添加 RPMI1640培 地に懸濁した細胞を lxl06cells/ml濃度にてフローチャンバ一内へ導入した。顕微鏡 下により観察される細胞のローリングを解析ソフトウェアを用いて計測した。導入した 細胞には、プレ Bリンパ球性白血病細胞株 NALL1細胞、 LAZ-221細胞及び陰性コン トロールとして Raji細胞を用いた。
[0062] その結果、セレクチンリガンドを発現するプレ Bリンパ球性白血病細胞株には、著明 な細胞のローリングと細胞接着が観察されたが、 Raji細胞には見られな力つた（図 4) 。この結果から、セレクチンリガンドを発現するプレ Bリンパ球性白血病細胞にはセレ クチン依存的な細胞接着能のあることが示唆された。
[0063] (3)免疫不全マウスを用いた白血病細胞のセレクチン依存的組織移行の確認
白血病細胞の組織移行におけるセレクチンリガンドとセレクチンを介した細胞接着 能の関与をマウスモデルを用いて検出した。 Blood, 103, 2900-2907 (2004)を参考に 、セレクチンリガンド陽性のプレ B白血病細胞株（KM3、 NALL1あるいは KOPN- K)を セレクチンリガンド陰性の Raji細胞と等量混合し、放射線照射した免疫不全マウスの 尾静脈から体内へ導入した。 6時間経過後の脾臓、肝臓及び骨髄細胞を回収し、そ の中に含まれる、すなわち組織移行した導入細胞を検出した。プレ B白血病細胞は 表面抗原 CD45陽性 CD43陽性 CD21陰性であり、 Raji細胞は CD45陽性 CD43陰性 C D21陽性である。ここから、蛍光標識抗体 (APC結合抗ヒト CD45抗体、 FITC結合抗ヒ ト CD43抗体、 PE結合抗ヒト CD21抗体、ベタトンディッキンソン社製）を用いて、フロー サイトメーターにより CD45陽性 CD43陽性 CD21陰性のプレ B白血病細胞と CD45陽性 CD43陰性 CD21陽性の Raji細胞を検出した。図 5に代表例としてプレ B白血病細胞 N ALL1細胞と Raji細胞を用いた際の実験結果を示す。また、図 6に 3種類の細胞を用 いた実験結果をまとめたものを示した。等量の細胞を導入したにも関わらず、各組織 中にはセレクチンリガンド陽性のプレ B白血病細胞がセレクチンリガンド陰性の Raji細 胞より多く検出された。ここから、白血病細胞の組織への移行はセレクチンリガンドの 発現レベルに依存的で、プレ B白血病細胞ではセレクチンリガンド糖鎖の発現により 、細胞接着能や組織への移行と浸潤が起こり易 ヽことが示唆された。
[0064] (4)セレクチンリガンド糖鎖と CD43抗原との関係
プレ Bリンパ球性白血病細胞株 NALL1などにぉ 、て、組織浸潤の鍵となるセレクチ ンリガンド糖鎖を有する細胞表面抗原力 唯一 CD43抗原のみであることを明らかにし た。
[0065] すなわち、免疫沈降法を用いて、 NALL1細胞溶解液に、シァリルルイス xに対する 抗体である CSLEX1あるいは CD43に対する抗体である MEM59 (モノサン社製）とプロ ティン Gセファロースビーズを加え、 4°Cで一晩反応の後、ビーズを遠心分離により回 収し、それぞれの抗体に反応するタンパク質を単離する。ビーズに回収されたタンパ ク質を SDS-PAGEサンプルバッファーに溶解させ、タンパク質量で 20〜40 μ gを 7.5% 濃度のポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、 PVDFメンブレンに転写し、 MEM59あ るいは CSLEX1にてウェスタンブロット解析を行う.その結果、 CSLEX1にて免疫沈降 した NALL1細胞溶解液の MEM59によるウェスタンブロット（図 7 (A) )により、分子量 15 OkDa弱のタンパク質が濃縮されており、シァリルルイス Xの発現しているタンパク質が CD43であることが示唆される。同様に、 MEM59にて免疫沈降した NALL1細胞溶解液 の CSLEX1によるウェスタンブロット（図 7 (B) )により、分子量 150kDa弱のタンパク質が 濃縮されており、 CD43抗原上にはシァリルルイス Xが発現していることが示唆される。 これらウェスタンブロットの結果では、分子量 150kDa弱の部分以外にシグナルが見ら れな 、こと力ら、シァリルルイス Xの発現して!/、るタンパク質のほとんどが CD43であるこ とが示唆された。
[0066] (5) CD43抗原の発現阻害によるセレクチンリガンド糖鎖発現とセレクチン結合能抑 制効果の確認
プレ Bリンパ球性白血病細胞にぉ 、て、組織浸潤に重要なセレクチンリガンド糖鎖 は、そのほとんどが CD43抗原上に存在している.そこで、 CD43抗原の発現抑制から 、セレクチンを介した細胞接着能を低下させ、組織浸潤を抑制する方法について検 討を行った。
[0067] まず、 CD43発現を RNA干渉により特異的に抑制する siRNAをデザインした。配列は Ambion社のホームページ（http://www.ambion.com/)にて公開されて 、る siRNA配 列検索ソフトウェアを用いて、 CD43遺伝子配列（J. Biol. Chem., 266, 13, 8483-8489 ( 1991 ) )の中から 19〜21塩基をランダムに数力所選択して siRNAの配列をデザインし た (表 1 :表中太字斜体で示した配列部分は、 CD43遺伝子に対応する塩基配列を示 す)。
[0068] これらの siRNAを細胞内で発現させ、その効果を確認した。 siRNAの細胞内への導 入には、血液系細胞へ高効率で遺伝子導入の可能なレンチウィルスシステム (インビ トロジェン社製）とレンチウィルス用発現ベクター pLL3.7 (Nat. Genet., 33, 401-406 (2 003) )を用いた。 pLL3.7ベクターは、 U6プロモーター下流にヘアピン構造を含むセン ス、アンチセンス siRNA配列を組み込むことができ、同時に Green Flourescent protein (GFP)を CMVプロモーターにより発現するベクターである。そこで、デザインした siRN A配列のセンス鎖、アンチセンス鎖とヘアピン構造を含むオリゴヌクレオチド (CD43- # 1〜# 5、 CD43-$1〜$5、名称末尾の記号 fはセンス鎖を示し、 rはアンチセンス鎖を 示す）を化学合成し、 pLL3.7ベクターにクローユング、 293細胞にウィルス粒子産生用 のベクターと共導入し、培養上清カゝら siRNA発現レンチウィルスベクターを回収した（ 図 8)。ウィルス粒子の NALL1細胞との共培養によりウィルスを感染させ、 siRNAを細 胞内へ導入、発現させた。 pLL3.7ベクターにより siRNAの導入された細胞には GFPが 同時に発現する。そこで、 GFP発現の見られる細胞、すなわち siRNAの発現している 細胞の CD43抗原とシァリルルイス X発現及びセレクチンとの結合能を、 CD43に対す る抗体 MEM59 (モノサン社製）とシァリルルイス X抗体 CSLEX1及びヒト型キメラ- Fc-Ig -E-または P-セレクチンを用いて、フローサイトメーターにより解析した。その結果、空 ベクター (PLL3.7)の導入では、 GFP陽性、陰性に関わらず CD43発現が高いレベル で見られた。一方、 CD43に対する siRNAを導入した細胞（siCD43 # 1, # 2, # 5-pLL3 .7)では、 GFP陽性分画すなわち siRNAの導入された細胞において、有為な CD43発 現の減退が見られた（図 9)。同様に、著明なシァリルルイス X発現及びセレクチン結 合能の減退が見られた (図 10)。
[表 1]
表 1.CD43抗原に対する siRNA配列
Name Primer sequence (5'—* 3')
CD43-#1f T gtgaccc taaggccgacag ttcaagaga ctgtcggcc ttagggtcac TTTTTTC
CD43-#1 r TC G A G A A AA AA gtgaccctaaggccgacag tctcttgaa ctgtcggccttagggtcac A
CD43-#2f T ggccgacagcactggggac ttcaagaga gtccccagtgctgtcggcc I I I 1 l C
CD43-#2r TCGAGAAAAAA ggccgacagcactggggac tctcttgaa gtccccagtgctgtcggcc A
CD43-#3f T gtttccatcaagatgtcat ttcaagaga atgacatcttgatggaaac TTTTTTC
CD43-#3r TCGAGAAAAAA gtttccatcaagatgtcat tctcttgaa atgacatcttgatggaaac A
CD43-#4f T gatgtcatcagtgccccag ttcaagaga ctggggcactgatgacatc 1 1 1 1 1 1 C
CD43-#4r TC GAGAAAAAA gatgtcatcagtgccccag tctcttgaa ctggggcactgatgacatc A
CD43-#5f T gcgtaacggggtggtggac ttcaagaga gtccaccaccccgttacgc 1 1 1 1 C
CD43-#5r TCGAGAAAAAA gcgtaacggggtggtggac tctcttgaa gtccaccaccccgttacgc A
CD43-$1f T gagcctttggtc tctacta TTCAAGAGA tagtagagaccaaaggctc M I M I C
CD43-$1 r TCGAGAAAAAA gagcctttggtc tc tacta TCTCTTGAA tagtagagaccaaaggctc A
CD 3-$2f T gtacaccacttcaataaca TTCAAGAGA tgttattgaagtggtgtac TTTTTTC
CD43-$2r TCGAGAAAAAA gtacaccacttcaataaca TCTCTTGAA tgttattgaagtggtgtac A
CD43-$3f T gatgtacaccacUcaata acGCTTCCTGTCACgt tattgaagtggtgtacatc 1 ΓΤΤΤΤΟ
CD43-$3r TCGAGAAAAAA gatgtacaccacttcaata acGTGACAGGAAGCgt tattgaagtggtgtacatc A
GD43-$4f T gccctacctccctcaactt ccGCTTCCTGTCACgg aagttgagggaggtagggc TTTTTTC
CD43-$4r TCGAGAAAAAA gccctacctccctcaactt ccGTGACAGGAAGCgg aagttgaggg 'aggtagggc A
CD43-$5f T gtgacaggtggaaccataa caGCTTCCTGTCACtg ttatggttccacctgtcac TTTTTTC
GD43- $5r TCGAGAAAAAA gtgacaggtggaaccataa caGTGACAGGAAGCtg ttatggttccacctgtcac A
(6)セレクチンリガンド糖鎖合成阻害による白血病細胞のセレクチンとの結合抑制効 果の確認
NALL1細胞の培養上清中に糖鎖合成阻害剤の 1つであるベンジル- α _Ν_ァセチ ルガラタトサミン (Bz- a -GalNAc;シグマ社製)を添加し、セレクチンとの結合能を検出 した。ベンジル - α -Ν-ァセチルガラタトサミンは細胞内に取り込まれると、タンパク質 のセリン及びスレオニンに付加された Ν-ァセチルガラタトサミンと同様に糖鎖修飾を 受ける。そこで、大過剰のベンジル - α -Ν-ァセチルガラタトサミンを添加すると、本来 の糖タンパク質への糖鎖修飾が抑制されることから、 0-結合形糖鎖の合成阻害剤と して利用されて 、る。 NALL1細胞の培養上清中に 4mMのベンジル- a ァセチル ガラクトサミンを添加し、 3日間培養後の CD43抗原とシァリルルイス X発現及び E-及び P-セレクチンとの結合能を、フローサイトメーターにより検出した。
[0071] その結果、 CD43抗原の発現には変化が見られなかった力 シァリルルイス X発現が 著明に減退しており、セレクチンとの結合能もほぼ消失していた（図 12)。従って、 NA LL1細胞へのベンジル- a -N-ァセチルガラタトサミンはの添加は、 CD43抗原上の 0- 結合形糖鎖に合成されるシァリルルイス X発現を抑制し、 E-及び P-セレクチンとの結 合能の低下をもたらし、血管内皮細胞との接着を介した白血病細胞の浸潤抑制に有 効であることが示唆された。同様に、 CD43抗原の 0-結合形糖鎖上にセレクチンリガ ンド糖鎖を合成する糖転移酵素の活性阻害剤や、その材料となる糖鎖もしくは糖ヌク レオチドに、種々の修飾を施した疑似体による糖鎖合成の阻害も同様の効果が期待 できる。
[0072] (7) CD43抗原の分解による白血病細胞のセレクチンとの結合能消失の確認
シアル酸を多く含むムチン型糖タンパク質を選択的に分解する 0-シァログライコプ 口ティンエンドぺプチダーゼ（0- sialoglycoprotein endopeptidase： OSGPEP, CEDAR LANE社製)処理による CD43抗原とセレクチンリガンド糖鎖の発現や E-及び P-セレ クチンとの結合能を検討した。 2.5 X 105個の NALL1細胞を懸濁した 10%血清カロ RPMI1 640培養液 500 μ Lに、 0.2mg/mLの OSGPEP 50 μ Lを 24時間毎に 3日間連続してカロ え、 CD43抗原とシァリルルイス X発現及びセレクチンとの結合能をフローサイトメータ 一で検出した。
[0073] その結果、 OSGPEP処理により CD43抗原、シァリルルイス x発現の消失が観察され 、 E-及び P-セレクチンとの結合能もほぼ消失することを明らかにした（図 12)。 CD43 抗原タンパク質には 0-結合型糖鎖が付加されるセリン、スレオニンが多数存在して いる。プレ Bリンパ球性白血病細胞では、多数のセリン、スレオニンに付加される 0-結 合型糖鎖の末端に、シアル酸を含むシァリルルイス Xが存在するため、 OSGPEPにより 分解反応が進んだものと考えられる。従って、プレ Bリンパ球性白血病細胞に発現す るセレクチンリガンド糖鎖を含む CD43抗原の分解、消化処理はセレクチンを介した血 管内皮細胞への接着の抑制をもたらし、白血病細胞の浸潤抑制に有効であることが 示唆された。
[0074] (8)本発明薬剤による、白血病細胞のローリング及び細胞接着抑制効果
CD43に対する siRNAを組み込んだベクター（siCD43_pLL3.7)を導入した KM3細胞 のローリング及び細胞接着能を検出した。その結果、図 12に示す通り、 CD43に対す る siRNAを導入した細胞では、空ベクター導入細胞 (pLL3.7)に比べて、 CHO-E及び CHO-P細胞に対するローリング及び細胞接着能が著明に減少して 、た。この減少の 効果は、図 10で示した細胞表面のセレクチンリガンド発現レベルと相関していること 力 、（5)〜（7)で示した手法により処理した白血病細胞は、セレクチン依存的な細 胞接着能を減弱させることが示唆された。
[0075] (9)本発明薬剤による臓器移行の抑制効果
本発明薬剤により処理した細胞の臓器移行能を検出した。 siRNA発現のない空べ クタ一（PLL3.7)あるいは CD43に対する siRNAを組み込んだベクター（siCD43-pLL3. 7)を導入した NALL1細胞それぞれを、放射線照射した免疫不全マウスへ尾静脈から 導入した。 6時間経過後の脾臓、肝臓及び骨髄細胞を回収し、その中に含まれる、す なわち組織移行した導入細胞を検出した。空ベクター及び siRNAを組み込んだベタ ター共に、 GFPが組み込まれているので、回収した細胞中のヒト CD45陽性かつ GFP 陽性細胞の数を比較した。図 14に細胞導入後の各組織のフローサイトメトリー解析 結果の一例を示した。また、図 15に実験結果をまとめたものを示した。その結果、 CD 43に対する siRNAを導入した細胞では、空ベクター導入細胞に比べて、組織へ移行 する細胞数の著明な減少が観察された。この結果は、図 11で示した細胞表面のセレ クチンリガンド発現レベル、及び図 13で示したセレクチン依存性の細胞接着能の結 果と相関していることから、（5)〜（7)で示した手法により処理した白血病細胞は、セ レクチンリガンド発現レベルに応じて組織への移行すなわち組織浸潤を減弱させるこ とが示唆された。
[0076] ( 10)マウスに対する延命効果の確認
本発明薬剤による、マウスの延命効果を確認することができる。
すなわち 350〜400cGyの放射線を照射した免疫不全マウスの尾静脈から、未処理 の NALL1細胞ある!/、は (5)〜（7)に示した手法により処理した NALL1細胞約 5xl05個 を注入し、 SPF室内にて、滅菌水、滅菌飼料を与えながらマウス^!司育する。約 2か月 間飼育を続け、マウスの生存率を計測する。また、死亡したマウスについては死亡し た時点において、生存しているマウスについては約 2ヶ月後の時点で安楽死させ、肝 臓、脾臓、腎臓等を採取、凍結切片を作成し、へマトキシリンェォジン染色法により組 織内に浸潤して 、る血球細胞を観察する。
[0077] また、マウス末梢血液及び骨髄液を採取、白血球分画中の白血病細胞の割合をヒ ト CD45抗体を用いて常法に従ってフローサイトメーターにて検出する。（5)〜（7)に 示した手法により処理した NALL1細胞を移植したマウスでは、各種臓器や末梢血液 及び骨髄液中には、移植した白血病細胞はほとんど観察されないと考えられる。さら に、組織浸潤抑制の効果として高 、生存率が観察される。
[0078] (11)抗体依存性細胞傷害活性の測定
抗 CD43抗体を用いた抗体依存性細胞傷害活性を測定した。 NALL1細胞を標的細 胞に用いて検討を行った。細胞を 5%ゥシ胎児血清（GIBCO-BRL製)含有 RPMI1640 培地（GIBCO-BRL製)で、 2 x 105個/ mlになるように調製した。これら細胞を 96穴 U底 プレート（FALCON製）に 50 1加え、次いで、抗体依存性細胞傷害活性を測定する 抗体（マウス抗ヒト CD43抗体、 MEM59,DFT-1)、エフェクター細胞（マウスあるいはヒト 単核球）を 50 μ 1加えた。 37°CCOインキュベータ一中で 4時間インキュベート後、 50 μ
2
1の培養上清を 96穴平底プレート（FALCON製）に移し、 Substrate Mix (promega社製 )を各穴に 50 μ 1加え、室温遮光で 30分インキュベートした。その後、 50 μ 1の Stop Solu tion (promega社製）を加え、各穴の 490nmの吸光度を測定システム VERSA max (Mole cular Devices社製)で測定した。細胞障害活性（％)は、（A- B- C) / (D- C) x 100で計 算した。なお、 Aは標的細胞を抗体とエフェクター細胞存在下でインキュベートしたと きの吸光度、 Bはエフェクター細胞のみインキュベートしたときの吸光度、 Cは標的細 胞のみインキュベートしたときの吸光度、 Dは標的細胞が毒性を最大に受けた場合の 吸光度である。その結果、抗体濃度依存的に細胞傷害活性が検出され、その値は最 大で約 30%であった。このことから、抗 CD43抗体が細胞殺傷剤としても有効であるこ とが示唆された（図 16)。
[0079] 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲 を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明ら かである。
本出願は、 2004年 6月 23日出願の日本特許出願 (特願 2004— 184583)に基づくも のであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
産業上の利用可能性
[0080] 本発明により、細胞間接着や組織浸潤'転移を効果的に抑制する薬剤及び組織浸 潤 ·転移の抑制方法と、造血器悪性腫瘍細胞を含む造血系細胞を殺傷する薬剤と 細胞殺傷の方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0081] [図 1]フローサイトメーターによるシァリルルイス X発現様式の解析結果を示す図である 。 A〜Gは、それぞれ A:KM3、 B:NALL1、 C:KOPN- K、 D:LAZ221、 Ε:プレ Β白血病患 者（ # 1)、 F:プレ Β白血病患者（ # 2)、 G:Raji細胞の APC-Cy7により標識したシァリル ルイス X抗体: CSLEX1との反応を検出した図である。ここで Raji細胞はセレクチンリガ ンド発現のない B細胞系細胞株であり、本実験の陰性コントロールとして使用した。横 軸は APC-Cy7標識した CSLEX1抗体の蛍光強度を、縦軸は細胞数を表す。
[図 2]フローサイトメーターによるヒト型キメラ- Fc-Ig-E-セレクチンとの結合能を解析し た結果を示す図である。 A〜Gは、それぞれ A:KM3、 B:NALL1、 C:KOPN-K、 D:LAZ2 21、 E:プレ B白血病患者（ # 1)、 F:プレ B白血病患者（ # 2)、 G:Raji細胞の APC- Cy7 により標識したヒト型キメラ- Fc-Ig-E-セレクチン (A〜G)の反応を検出した図である。 Raji細胞は陰性コントロールとして使用した。横軸は APC_Cy7標識した E-セレクチン の蛍光強度を、縦軸は細胞数を表す。
[図 3]フローサイトメーターによるヒト型キメラ- Fc-Ig-P-セレクチンとの結合能を解析し た結果を示す図である。 H〜Nは、それぞれ H:KM3、 I:NALL1、 J:KOPN-K、 K:LAZ22 1、 L:プレ B白血病患者（# 1)、 M:プレ B白血病患者（# 2)、 N:Raji細胞の APC- Cy7に より標識したヒト型キメラ- Fc-Ig-P-セレクチン (H〜N)の反応を検出した図である。 Raj i細胞は陰性コントロールとして使用した。横軸は APC-Cy7標識した P-セレクチンの 蛍光強度を、縦軸は細胞数を表す。
[図 4]プレ B白血病細胞の E-セレクチンまたは P-セレクチンを過剰発現させた CHO細 胞 (それぞれ CHO-E、 CHO-Pと命名）上をローリングする細胞数を解析した結果であ る。 Raji細胞は陰性コントロールとして使用した。横軸は、単位面積 (mm2)あたりの口 一リングの見られる細胞数を表す。
[図 5]NALL1細胞と Raji細胞を等量混合した細胞懸濁液を免疫不全マウスへ導入し、 セレクチン依存性の組織移行を検出する実験の概略図と、細胞導入前後のフローサ イトメーターによる解析結果を示す図である。 A〜Dは、それぞれ A:導入前の NALL1と Raji細胞混合物、細胞を導入したマウスの B:脾臓、 C:肝臓及び D:骨髄細胞の解析図 である。横軸と縦軸は、それぞれ蛍光標識した CD43抗体及び CD21抗体の蛍光強度 を表す。
[図 6]セレクチン依存性の組織移行を免疫不全マウスを用いて検出した実験の結果 をまとめた図である。フローサイトメーターにより解析した、各組織のヒト CD45陽性細 胞中の KM3、 NALL1及び KOPN- K細胞の割合を示す。 Spl、 Liv及び BMは、それぞ れ脾臓、肝臓及び骨髄細胞における結果を示す。
圆 7]NALL1細胞溶解物による免疫沈降-ウェスタンプロット解析結果を示す図（写真 )である。 Aは CSLEX1により免疫沈降した細胞溶解物の CD43抗体 MEM59によるゥェ スタンプロット解析図であり、 Bは CD43抗体 MEM59により免疫沈降した細胞溶解物の CSLEX1によるウェスタンブロット解析図である。また、「whole cell lysate」は免疫沈降 前の全細胞溶解物を、「sLeX抗体- IP」及び「CD43抗体- IP」は、それぞれ sLeX抗体 CSLEX1あるいは CD43抗体 MEM59にて免疫沈降したサンプルの結果を示す。
[図 8]レンチウィルスによる siRNA導入システムを示す概略図である。 pLL3.7ベクター に組み込まれた siRNAを、パッケージングベクターと共に 293FT細胞へ導入する。産 生されたウィルスベクターを細胞に感染させることにより、 siRNAを導入、発現させるこ とを示している。 [図 9]siRNA導入 NALL1細胞における CD43発現のフローサイトメトリー解析結果を示 す図である。横軸は蛍光標識した CD43抗体の蛍光強度を、縦軸は細胞数を表す。 また、 GFP (+) fraction及び GFP (-) fractionは、それぞれ GFP発現陽性すなわちウィル スベクターの導入された細胞の分画、及び GFP発現陰性すなわちウィルスベクターの 導入されていない細胞の分画を示す。また、 [pLL3.7]は siRNA発現のない空ベクター 、 [siCD43- # 1- pLL3.7]、 [siCD43- # 2- pLL3.7]、 [siCD43- # 5- pLL3.7]は CD43に対 する siRNAを組み込んだベクターを用いた時の結果を示す。
[図 10]siRNA導入 NALL1細胞のシァリルルイス X発現と E-及び P-セレクチンとの結合 能のフローサイトメトリー解析結果を示す図である。 (A)は CD43に対する siRNA # 2を 導入した NALL1細胞のシァリルルイス X発現解析結果を、 (B)は E-セレクチンへの結 合能、（C)は P-セレクチンへの結合能を解析した結果を示す図である。横軸はそれ ぞれ APC- Cy7標識した CSLEX1抗体、 E_セレクチン、または P_セレクチンの蛍光強 度を、縦軸は細胞数を表す。
[図 11]ベンジル- a -N-ァセチルガラタトサミン（Bz- a - GalNAc)及び OSGPEP処理し た NALL1細胞の、シァリルルイス X発現及びセレクチンとの結合能のフローサイトメ一 ターによる解析結果を示す図である。横軸はそれぞれ APC-Cy7標識した CSLEX1抗 体、 E-セレクチン、または P-セレクチンの蛍光強度を、縦軸は細胞数を表す。 [CSLE Xl]、及び [E- selectin]、 [P- selectin]は、それぞれシァリルルイス x発現、及び E-セレク チンまたは P-セレクチンとの結合能を示す。 [Neg-Cont]は未処理の細胞の一次抗体 なしの時の解析結果を、 [None]は未処理の細胞の解析結果を、 [Βζ- α - GalNAc]は ベンジル- a -N-ァセチルガラタトサミン処理した細胞の解析結果を、 [OSGPEP]は OS GPEP処理した細胞の解析結果を示す。
[図 12]CD43に対する siRNAを導入した KM3細胞の E-セレクチンまたは P-セレクチン を過剰発現させた CHO細胞上をローリングする細胞数を解析した結果である。 V、ず れも実験 3回あたりの平均値を示す。アステリスク *は P値が 0.05以下であり統計的に 有為な差のあることを表す。 CHO-mは、空ベクターを導入した CHO細胞による結果 を示す。
[図 13]CD43に対する siRNA導入 NALL1細胞を移植した免疫不全マウスの各組織の 細胞をフローサイトメーターにより解析した結果を示す図である。横軸は GFPの蛍光 強度を、縦軸は蛍光色素 PEによる蛍光強度を表す。 [pLL3.7]及び [siCD43-pLL3.7] は、それぞれ siRNA発現のな!、空ベクター及び CD43に対する siRNAを^ &み込んだベ クタ一を導入した NALL1細胞を用いたときの結果を示す。 [Spleen]、 [Liver]及び [Bon e marrow]は、それぞれ脾臓、肝臓及び骨髄細胞における結果を示す。
[図 14]CD43に対する siRNA導入 NALL1細胞を移植した免疫不全マウスの各組織の 細胞をフローサイトメーターにより解析した結果をまとめた図である。各組織の細胞 1 06個あたりのヒト CD45かつ GFP陽性細胞数の、実験 3回あたりの平均値を示す。ァス テリスク *は P値が 0.05以下であり統計的に有為な差のあることを表す。横軸の Spl、 Liv 及び BMは、それぞれ脾臓、肝臓及び骨髄細胞における結果を、縦軸はヒト CD45陽 性かつ GFP陽性の、各組織の細胞 106個あたりの細胞数を示す。
[図 15]NALL1細胞に抗 CD43抗体とエフェクター細胞を添加した時の抗体依存性細 胞傷害活性を測定した結果を示す。横軸は抗 CD43抗体濃度、縦軸は細胞毒性 (％ )を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制することを特徴とす る浸潤抑制剤。
[2] small-interfering RNA(siRNA)配列を有する核酸を有効成分とすることを特徴とする 請求項 1記載の浸潤抑制剤。
[3] small-interfering RNA(siRNA)配列力 配列番号 1乃至 20の何れかの塩基配列を含 むことを特徴とする請求項 2記載の浸潤抑制剤。
[4] エンド- 0-グリコシダーゼを有効成分とすることを特徴とする請求項 1記載の浸潤抑 制剤。
[5] 抗 CD43抗体を有効成分とすることを特徴とする請求項 1記載の浸潤抑制剤。
[6] ヒト型- Fc- Ig-キメラ E-セレクチン、ヒト型- Fc- Ig-キメラ P-セレクチン、及びシァリルル イス X構造を有する糖鎖からなる群から選択される一以上の糖鎖を有効成分とするこ とを特徴とする請求項 1記載の浸潤抑制剤。
[7] 細胞の組織浸潤を予防するための請求項 1乃至 6何れか一項記載の浸潤抑制剤の 使用。
[8] 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖と、セレクチンとの結合を抑制することを特徴とす る浸潤抑制方法。
[9] 細胞表面抗原 CD43に対するセレクチンリガンド糖鎖の付加を抑制することを特徴と する請求項 8記載の方法。
[10] 細胞表面抗原 CD43の発現を抑制することを特徴とする請求項 8記載の方法。
[I I] セレクチンリガンド糖鎖を細胞表面抗原 CD43に付加する糖転移酵素遺伝子の発現 を抑制することを特徴とする請求項 8記載の方法。
[12] 糖転移酵素遺伝子が N-ァセチルガラタトサミン転移酵素をコードする遺伝子、ガラク トース転移酵素をコードする遺伝子、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素をコードする 遺伝子、フコース転移酵素をコードする遺伝子、シアル酸転移酵素をコードする遺伝 子、または硫酸転移酵素をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項 11記載 の方法。
[13] small-interfering RNA(siRNA)配列を有する核酸を用いることを特徴とする請求項 8乃 至 12何れか一項記載の方法。
[14] small-interfering RNA(siRNA)配列力 配列番号 1乃至 20の何れかの塩基配列を含 むことを特徴とする請求項 13記載の方法。
[15] 細胞表面抗原 CD43とセレクチンリガンド糖鎖との結合を切断することを特徴とする請 求項 8記載の方法。
[16] 細胞表面抗原 CD43を分解することを特徴とする請求項 8記載の方法。
[17] セレクチンリガンド糖鎖を分解することを特徴とする請求項 8記載の方法。
[18] small-interfering RNA(siRNA)配列を有する核酸の、セレクチンリガンド糖鎖とセレク チンとの結合抑制のための使用。
[19] 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖とその糖鎖を保持するキャリアタンパク質に結合 することにより、この糖タンパク質を発現する細胞に特異的に細胞死を誘導することを 特徴とする細胞殺傷剤。
[20] セレクチンリガンド糖鎖を保持するキャリアタンパク質が CD43タンパク質である請求項
19記載の細胞殺傷剤。
[21] キャリアタンパク質に結合する物質力 CD43タンパク質の細胞外領域中のェピトープ に特異的に結合する抗体やペプチドである請求項 19記載の細胞殺傷剤。
[22] 細胞傷害性薬剤が結合された請求項 21記載の細胞殺傷剤。
[23] 細胞傷害性薬剤が、抗代謝物、アルキル化剤、アンスラサイクリン類、抗生物質、抗 分裂剤、化学療法剤及び放射性物質からなる群から選択される、請求項 22記載の 細胞殺傷剤。
[24] 細胞傷害性薬剤力 リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキノール、臭化工チジ ゥム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチ シン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ァクチノマイシン D、 1ーデヒドロテストステロン 及びダルココルチコイドからなる群から選択される、請求項 22記載の細胞殺傷剤。
[25] CD43タンパク質の細胞外領域中のェピトープに特異的に結合する抗体力 ヒト型モ ノクローナル抗体、合成の抗体、ポリクローナル抗体またはキメラ抗体である請求項 2 1記載の細胞殺傷剤。
[26] 細胞表面のセレクチンリガンド糖鎖とその糖鎖を保持するキャリアタンパク質に請求 項 19乃至 25記載の細胞殺傷剤が結合することを特徴とする、細胞殺傷の方法。 請求項 26に記載の方法であって、細胞が CD43を発現する造血器悪性腫瘍及び造 血幹細胞を含む造血系細胞である、方法。
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