KR102624254B1 - 유전자 조작 Fc 작제물에 관한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 유전자 조작 IgG Fc 작제물 및 그의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2017년 1월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/443,495호, 2017년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/510,228호 및 2017년 11월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/589,473호의 우선권의 이익을 주장한다. 이들 출원 각각의 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
치료 단백질, 예컨대, 치료 항체 및 Fc-융합 단백질은 면역 질환, 염증성 질환, 암 및 감염증이 있는 환자에게 급속도로 임상적으로 중요한 약물군이 되었다.
본 개시는 생물학적 활성이 있는 Fc 도메인-함유 치료 작제물을 특징으로 한다. 이러한 작제물은 Fc 수용체에 대한 바람직한 혈청 반감기 및/또는 결합 친화도 및/또는 결합능을 가질 수 있다.
일반적으로, 본 개시는 2~10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 2~10개의 Fc 도메인, 2~5개의 Fc 도메인, 2~4개의 Fc 도메인, 2~3개의 Fc 도메인, 3~5개의 Fc 도메인, 2~8개의 Fc 도메인, 또는 2~6개의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 2~4개의 Fc 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 5~10개의 Fc 도메인(예컨대, 5~6개, 5~7개, 5~8개, 5~9개, 또는 5~10개의 Fc 도메인)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시의 작제물(예컨대, 2~4개의 Fc 도메인, 예컨대, 2, 3, 또는 4개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물) 및 동질 약학 조성물(예컨대, 2~4개의 Fc 도메인, 예컨대, 2, 3, 또는 4개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 함유하는 조성물)은 예컨대, 대상의 염증 감소, 대상의 자가항체의 제거 촉진, 대상의 항원 제시 억제, 대상의 면역 반응의 면역 복합체-기반 활성을 억제하는 것과 같은 면역 반응 억제, 및 대상의 면역 질환 및 염증성 질환(예컨대, 자가면역 질환) 치료에 유용하다. 본원에 기재된 Fc 작제물은 면역 세포의 현저한 자극없이 면역 질환 및 염증성 질환이 있는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 작제물(예컨대, 5~10개의 Fc 도메인, 예컨대, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물) 및 동질 약학 조성물(예컨대, 5~10개의 Fc 도메인, 예컨대, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 함유하는 조성물)은 예컨대, 대상에서 면역 세포의 면역 반응 활성화 유도, 대상의 표적 세포의 식균 작용 증가(즉, 암 세포 또는 감염 세포) 및 대상의 암 및 감염증과 같은 질환의 치료에 유용하다.
이들 작제물의 특성은 실질적으로 동질인 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 조성물의 동질성 정도는 조성물의 약동학 및 생체내 성능에 영향을 미친다. 조성물의 이러한 동질성은 조성물의 안전성, 효험, 균일성 및 신뢰도를 확실히 하기 위해 바람직하다. 본 개시의 Fc 작제물은 실질적으로 상동성인(예컨대, 적어도 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 상동성인) 조성물 또는 개체군 내에 존재할 수 있다.
본원에 더 상세하게 기술된 바와 같이, 본 개시는 모두 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물뿐 아니라 이러한 실질적으로 동질인 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
제1 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)를 포함하고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형(예: 위치 I253에서의 단일 아미노산 변형)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 경우에, 제1 및 제2 폴리펩티드는 서로 동일하고 제3 및 제4 폴리펩티드는 서로 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 I253A이다. 일부 구현예에서, Fc 작제물(예를 들어, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체)은 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인(예를 들어, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다)은 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인(예를 들어, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다)은 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인(예를 들어, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다)은 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형(예: 치환)을 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 R292P에서 아미노산 변형(예: 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292P이다.
모든 양태의 일부 구현예에서, Fc 도메인의 각각은 인간 IgG1 Fc 서열에 기초하고 본원에 기술된 변형을 포함한다(즉, 인간 IgG Fc 서열의 변이체임). 일부 구현예에서, 염기 IgG1 Fc 서열은 서열번호 42이고 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물의 Fc 도메인의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 IgG1 Fc 서열(예를 들어, 서열번호 42)이다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 서열은 서열번호 42이고, 조작된 함몰부의 변형, 조작된 돌출부의 변형, 및/또는 폴리펩티드의 조립을 조절하기 위한 정전기 스티어링 변형을 포함하고/하거나; 본원에 기술된 바와 같이, 작제물의 약동학을 변형시키기 위한 결합 관련 돌연변이의 변형을 포함한다. 따라서, 최대 10개의 단일 아미노산 변형은 I253에서의 변형(예를 들어, 치환)(예를 들어, I253A) 및 R292에서의 변형(예컨대, R292P) 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있고, 조작된 함몰부 및 조작된 돌출부를 제공하기 위한 변형(예: 치환), 및/또는 폴리펩티드의 조립을 조절하기 위한 정전기 스티어링 변형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 각각의 Fc 도메인 단량체는 I253 및 R292 중 하나 또는 둘 다에서의 치환에 더하여 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개의 단일 아미노산 변형을 포함한다. 조작된 함몰부, 조작된 돌출부를 제공하기 위한 변형, 및/또는 폴리펩티드의 조립을 조절하기 위한 정전기 스티어링 변형은 바람직하게는 Fc 도메인의 CH3 도메인(들) 내에 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형(예: 단일 아미노산 변형)을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 포함하되; 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 위치 R292에서 아미노산 변형(예: 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 변형(예: 치환) R292P를 포함한다(즉, 각각의 Fc 단량체는, 예를 들어, 서열번호 42와 비교하여 R292P 변형을 가짐). 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 또는 R292Y로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292P이다. 일부 구현예에서, 제1 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 변형(예를 들어, 치환) I253A를 포함하며, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 변형(예를 들어, 치환) R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1, 제2, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 변형(예: 치환) I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 각 Fc 도메인의 서열은 10개 이하의 단일 아미노산 변형을 갖는 인간 IgG1 Fc 도메인 서열에 기초한다. 일부 구현예에서, 각 Fc 도메인의 서열은 10개 이하의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 42에 기초한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인과 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 경우에, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체들 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인과 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인과 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인과 제3 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인의 각각은 I253A 및 R292P를 포함한다 (예를 들어, 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함함). 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인과 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인과 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인, 및 제3 Fc 도메인의 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제1 및 제5 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 제2 및 제4 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 I253A를 포함하며, 제3 및 제6 Fc 도메인 단량체 중 하나 또는 둘 다는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제5 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성되며, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 D399K, 및 K409D 또는 K409E 중 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 K392D 및 D399K를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 E357K 및 K370E를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 D356K 및 K439D를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 K392E 및 D399K를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 E357K 및 K370D를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체의 각각은 D356K 및 K439E를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 각각은 S354C 및 T366W를 포함하고, 제5 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 S354C 및 T366W를 포함하고, 제5 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 각각 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 각각은 E357K 및 E357R을 포함하고, 제5 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 각각 K370D 또는 K370E를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 K370D 또는 K370E를 포함하고, 제5 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 각각 E357K 또는 E357R을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체의 각각은 K409D 또는 K409E를 포함하고, 제5 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 각각 D399K 또는 D399R을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 D399K 또는 D399R을 포함하고, 제5 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 각각 K409D 또는 K409E를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커(예: 스페이서)는 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23), GGGGS (서열번호 1), GGSG (서열번호 2), SGGG(서열번호 3), GSGS (서열번호 4), GSGSGS (서열번호 5), GSGSGSGS (서열번호 6), GSGSGSGSGS (서열번호 7), GSGSGSGSGSGS (서열번호 8), GGSGGS (서열번호 9), GGSGGSGGS (서열번호 10), GGSGGSGGSGGS (서열번호 11), GGSGGGSG (서열번호 12), GGSGGGSGGGSG (서열번호 13), GGSGGGSGGGSGGGSG (서열번호 14), GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 80), GENLYFQSGG (서열번호 28), SACYCELS (서열번호 29), RSIAT (서열번호 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (서열번호 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (서열번호 32), AAANSSIDLISVPVDSR (서열번호 33), GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (서열번호 34), GGGSGGGSGGGS (서열번호 35), SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (서열번호 18), GGSGGGSGGGSGGGSGGS (서열번호 36), GGGG (서열번호 19), GGGGGGGG (서열번호 20), GGGGGGGGGGGG (서열번호 21), 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 22)를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 Fc 작제물에서의 하나 이상의 링커는 스페이서, 예컨대, 2~200개의 아미노산(예컨대, 2~100개, 3~200개, 3~150개, 3~100개, 3~60개, 3~50개, 3~40개, 3~30개, 3~20개, 3~10개, 3~8개, 3~5개, 4~30개, 5~30개, 6~30개, 8~30개, 10~20개, 10~30개, 12~30개, 14~30개, 20~30개, 15~25개, 15~30개, 18~22개, 및 20~30개의 아미노산)으로 이루어진 아미노산 스페이서이다. 일부 경우에서, 아미노산 스페이서는 글리신만을 포함하거나, 세린만을 포함하거나, 세린과 글리신만을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 스페이서는 글리신만을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 78)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예컨대, 치환, 예컨대, 보존적 치환)을 갖는 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 78)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커의 외측 (예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23)의 외측) 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 78의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 78 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 78의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 78의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 78의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 78의 위치 319는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 49)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 예를 들어 보존적 치환)을 갖는 서열번호 49의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 49의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지되, 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형 중 어느 하나도 링커의 외측 (예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23)의 외측) 영역에 존재하지 않는다. 서열번호 49 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 49의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 49의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 49의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 49의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 49의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 49의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 62)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 62의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커의 외측 (예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23)의 외측) 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 62의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 62 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 62의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 62의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 62의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 62의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 62의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 62의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 62의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 64)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 64의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커의 외측 (예를 들어, 하위서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호: 23) 외측) 영역에서 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 64의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 64 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 64의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 64의 위치 33은 알라닌이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 65)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 65의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 65의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 65 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 65의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 65의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 65의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 65의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 65의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 65의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 65의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 65의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 66)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 66의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커의 외측 (예를 들어, 하위서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호: 23) 외측) 영역에서 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 66의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 66 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 66의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 66의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 66의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 66의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 66의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 66의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 66의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 67)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 67 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 67의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 67의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 67의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 67의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 67의 위치 318은 프롤린이고, 서열번호 67의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 67의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 68)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 68의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 68의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 68 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 68의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 68의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 68의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 68의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 68의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 68의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 68의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 68의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 69)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 69의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 69의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 69 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 69의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 69의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 69의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 69의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 69의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 69의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 69의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 69의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 69의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 71)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 71의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 71의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 71 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 71의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 71의 위치 71은 프롤린이고, 서열번호 71의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 71의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 71의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 71의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 71의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 72)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 72의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 72의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 72 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 72의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 72의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 72의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 72의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 72의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 72의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 72의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 74)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 74의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 74의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 74 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 74의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 74의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 74의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 74의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 74의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 74의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 74의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 74의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 75)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 75의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 75의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 75 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 75의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 75의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 75의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 75의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 75의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 75의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 75의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 75의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 75의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 76의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 76의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 76 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 76의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 76의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 76의 위치 319는 프롤린이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 77)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 77의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 77의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 77 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 77의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 77의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 77의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 77의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 77의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 77의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 77의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 77의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 77의 위치 436은 아스파르트산이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 79)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 79의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 79의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 서열번호 79 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 79의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 79의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 79의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 79의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 79의 위치 319는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 73의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 73의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 61)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 61의 위치 129는 시스테인이고, 서열번호 61의 위치 146은 라이신이고, 서열번호 61의 위치 148은 알라닌이고, 서열번호 61의 위치 150은 아스파르트산이고, 서열번호 61의 위치 187은 발린이다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 63)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 63의 위치 33은 알라닌이다.
일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 70의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 78)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 78의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 78의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지되, 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형 중 어느 하나도 링커(예를 들어, 하위서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 23))의 외측 영역에 존재하지 않는다. 서열번호 78 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 78의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 78의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 78의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 78의 위치 319는 프롤린이고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 73의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 73의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 49)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 61)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 49의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 76 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 49의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 49의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 49의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 49의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 49의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 49의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 49의 위치 436은 아스파르트산이며; 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 61의 위치 129는 시스테인이고, 서열번호 61의 위치 146은 라이신이고, 서열번호 61의 위치 148은 알라닌이고, 서열번호 61의 위치 150은 아스파르트산이고, 서열번호 61의 위치 187은 발린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 62)의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 61)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 62의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 62 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 62의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 62의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 62의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 62의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 62의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 62의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 62의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 62의 위치 436은 아스파르트산이며; 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 61의 위치 129는 시스테인이고, 서열번호 61의 위치 146은 라이신이고, 서열번호 61의 위치 148은 알라닌이고, 서열번호 61의 위치 150은 아스파르트산이고, 서열번호 61의 위치 187은 발린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 64)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 63)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 64의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 62 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 64의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 64의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 64의 위치 33은 알라닌이고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 63의 위치 33은 알라닌이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 65)의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 63)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 65의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 65 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 65의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 65의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 65의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 65의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 65의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 65의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 65의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 65의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 65의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 63의 위치 33은 알라닌이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 66)의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 61)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 66의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 66 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 66의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 66의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 66의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 66의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 66의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 66의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 66의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 66의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 61의 위치 129는 시스테인이고, 서열번호 61의 위치 146은 라이신이고, 서열번호 61의 위치 148은 알라닌이고, 서열번호 61의 위치 150은 아스파르트산이고, 서열번호 61의 위치 187은 발린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 67)의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 61)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 67 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 67의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 67의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 67의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 67의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 67의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 67의 위치 318은 프롤린이고, 서열번호 67의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 67의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 61의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 61의 위치 129는 시스테인이고, 서열번호 61의 위치 146은 라이신이고, 서열번호 61의 위치 148은 알라닌이고, 서열번호 61의 위치 150은 아스파르트산이고, 서열번호 61의 위치 187은 발린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 68)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 63)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 68의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 68 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 68의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 68의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 68의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 68의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 68의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 68의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 68의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 68의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 68의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 63의 위치 33은 알라닌이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 69)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 63)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 69의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 69 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 69의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 69의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 69의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 69의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 69의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 69의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 69의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 69의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 69의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 69의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 63의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 63의 위치 33은 알라닌이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 71)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 71의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 69 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 71의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 71의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 71의 위치 71은 프롤린이고, 서열번호 71의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 71의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 71의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 71의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 71의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 70의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 72)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 72의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 72 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 72의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 72의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 72의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 72의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 72의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 72의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 72의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 72의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열 번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 70의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 74)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 74의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 74 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 74의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 74의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 74의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 74의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 74의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 74의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 74의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 74의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 74의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 73의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 73의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 75)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 75의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 75 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 75의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 75의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 75의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 75의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 75의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 75의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 75의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 75의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 75의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 75의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 73의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 73의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 76의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 76 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 76의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 76의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 76의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 76의 위치 319는 프롤린이고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 70의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 77)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 77의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 77 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 77의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 77의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 77의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 77의 위치 134는 시스테인이고, 서열번호 77의 위치 137은 라이신이고, 서열번호 77의 위치 146은 트립토판이고, 서열번호 77의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 77의 위치 319는 프롤린이고, 서열번호 77의 위치 426은 라이신이고, 서열번호 77의 위치 436은 아스파르트산이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 70의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 70의 위치 72는 프롤린이다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 79)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 79의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 링커(예를 들어, 하위 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23); 서열번호 79 내의 링커는 대안적인 링커로 대체될 수 있음)의 외측 영역에서 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 79의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 79의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 79의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 79의 위치 72는 프롤린이고, 서열번호 79의 위치 280은 알라닌이고, 서열번호 79의 위치 319는 프롤린이며, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 최대 10개의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 73의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지되, 서열번호 73의 위치 33은 알라닌이고, 서열번호 73의 위치 72는 73은 프롤린이다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 작제물 4, 작제물 5, 작제물 6, 작제물 7, 작제물 8, 작제물 9, 작제물 10, 작제물 11, 작제물 12, 작제물 13, 작제물 14, 작제물 15, 작제물 16, 작제물 17, 작제물 18, 또는 작제물 19이다.
일부 구현예에서, Fc 작제물은 작제물 5, 작제물 6, 작제물 7, 작제물 9, 작제물 10, 작제물 11, 작제물 13, 작제물 14, 작제물 15, 작제물 16, 작제물 17, 작제물 18, 또는 작제물 19이다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드, 및/또는 제4 폴리펩티드의 각각은 N-말단 D에서 Q로의 아미노산 치환을 포함한다.
제2 양태에서, 본 개시의 Fc 작제물은 (i) 제1 Fc 도메인 단량체 및 제2 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1 Fc 도메인 및 (ii) 제3 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 2 양태에서, 본 개시의 Fc 작제물은 (i) 제1 Fc 도메인 단량체 및 제2 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1 Fc 도메인 및 (ii) 제3 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)의 각각은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 I253A이다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 위치 R292에서 적어도 하나의 아미노산 변형(예: 치환)을 포함한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292P이다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 링커(예를 들어, 스페이서)에 의해 결합된다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 링커(예를 들어, 스페이서)에 의해 결합된다. 일부 구현예에서, 각각의 링커(예: 스페이서)는, 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23), GGGGS (서열번호 1), GGSG (서열번호 2), SGGG(서열번호 3), GSGS (서열번호 4), GSGSGS (서열번호 5), GSGSGSGS (서열번호 6), GSGSGSGSGS (서열번호 7), GSGSGSGSGSGS (서열번호 8), GGSGGS (서열번호 9), GGSGGSGGS (서열번호 10), GGSGGSGGSGGS (서열번호 11), GGSGGGSG (서열번호 12), GGSGGGSGGGSG (서열번호 13), GGSGGGSGGGSGGGSG (서열번호 14), GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 80), GENLYFQSGG (서열번호 28), SACYCELS (서열번호 29), RSIAT (서열번호 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (서열번호 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (서열번호 32), AAANSSIDLISVPVDSR (서열번호 33), GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (서열번호 34), GGGSGGGSGGGS (서열번호 35), SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (서열번호 18), GGSGGGSGGGSGGGSGGS (서열번호 36), GGGG (서열번호 19), GGGGGGGG (서열번호 20), GGGGGGGGGGGG (서열번호 21), 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 22)를 갖는 폴리펩티드로부터 독립적으로 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제2 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, (i) 제1 Fc 도메인 단량체 및 제2 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1 Fc 도메인 및 (ii) 제3 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함하는 Fc 작제물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, (i) 제1 Fc 도메인 단량체 및 제2 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제1 Fc 도메인 및 (ii) 제3 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하되, 적어도 하나의 Fc 도메인 단량체는 위치 R292에서 아미노산 치환을 포함하는 Fc 작제물을 제공한다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)의 각각은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 아미노산 변형(예를 들어, 치환)은 R292P이다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제3 Fc 도메인 단량체는 링커에 의해 결합된다.
일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 링커에 의해 결합된다. 일부 구현예에서, 각각의 링커는, 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 23), GGGGS (서열번호 1), GGSG (서열번호 2), SGGG(서열번호 3), GSGS (서열번호 4), GSGSGS (서열번호 5), GSGSGSGS (서열번호 6), GSGSGSGSGS (서열번호 7), GSGSGSGSGSGS (서열번호 8), GGSGGS (서열번호 9), GGSGGSGGS (서열번호 10), GGSGGSGGSGGS (서열번호 11), GGSGGGSG (서열번호 12), GGSGGGSGGGSG (서열번호 13), GGSGGGSGGGSGGGSG (서열번호 14), GGSGGGSGGGSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 80), GENLYFQSGG (서열번호 28), SACYCELS (서열번호 29), RSIAT (서열번호 30), RPACKIPNDLKQKVMNH (서열번호 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (서열번호 32), AAANSSIDLISVPVDSR (서열번호 33), GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (서열번호 34), GGGSGGGSGGGS (서열번호 35), SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (서열번호 18), GGSGGGSGGGSGGGSGGS (서열번호 36), GGGG (서열번호 19), GGGGGGGG (서열번호 20), GGGGGGGGGGGG (서열번호 21), 또는 GGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 22)를 갖는 폴리펩티드로부터 독립적으로 선택된다. 일부 구현예에서, 링커는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호: 23)이다.
일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체 및 제2 Fc 도메인 단량체는 제1 Fc 도메인 단량체와 제2 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 제3 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체 간의 이량체화를 촉진시키는 상보적 이량체화 선택도 모듈을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 Fc 작제물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법은: a) 본 개시의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; b) Fc 작제물을 형성할 수 있는 조건 하에 숙주 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및 c) Fc 작제물을 회수하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 제공하며, 여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함하고; 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 78)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 제공하며, 여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 78)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 제공하며, 여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서 아미노산 치환을 포함하고; 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 79)의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 제공하며, 여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 79)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 제공하며, 여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 R292에서 아미노산 변형을 포함하고; 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 또 다른 양태에서, 본 개시는, a) i) 제1 Fc 도메인 단량체; ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제1 Fc 도메인 단량체를 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드; b) i) 제3 Fc 도메인 단량체; ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및 iii) 제3 Fc 도메인 단량체를 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드; c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 제공하며, 여기서, 제1 Fc 도메인 단량체와 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 제2 Fc 도메인 단량체와 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하며, 제3 Fc 도메인 단량체와 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하고, 제1 및 제2 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어지고, 제3 및 제4 폴리펩티드의 각각은 서열
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
본원에 기술된 Fc 작제물의 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인은 독립적으로 IgG1 Fc 도메인, IgG2 Fc 도메인, IgG3 Fc 도메인, IgG4 Fc 도메인, 또는 이들의 조합이다. 본원에 기술된 Fc 작제물의 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인은 독립적으로 최대 10개(예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 단일 아미노산 변형을 갖는 IgG1 Fc 도메인, IgG2 Fc 도메인, IgG3 Fc 도메인, IgG4 Fc 도메인, 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인은 IgG2 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인은 IgG3 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인의 각각은 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, 각 Fc 도메인은 최대 10개(예를 들어, 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하)의 단일 아미노산 변형을 갖는 서열번호 42를 포함한다.
본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나에 대한 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 최대 10개(예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 아미노산 변형을 갖는 인간 IgG Fc 도메인 단량체이다. 본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나에 대한 일부 구현예에서, 각각의 Fc 도메인 단량체는 10개 이하의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하의) 아미노산 변형을 가진다. 본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나에 대한 일부 구현예에서, 각각의 Fc 단량체는 10개 이하(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이하)의 아미노산 변형을 갖는 서열번호 42의 서열을 포함한다. 본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나에 대한 일부 구현예에서, 각각의 Fc 단량체는 5개의 아미노산 변형을 갖는 서열번호 42의 서열을 포함한다. 본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나에 대한 일부 구현예에서, 각각의 Fc 단량체는 10개의 아미노산 변형을 갖는 서열번호 42의 서열을 포함한다. 본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나에 대한 일부 구현예에서, 각각의 Fc 단량체는 8개의 아미노산 변형을 갖는 서열번호 42의 서열을 포함한다. 각각의 경우에, 변형은 아미노산 치환 I253A 및 R292P 중 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 Fc 작제물을 발현하는 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 본 개시의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하되, 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 발현된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 43~79로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 49, 및 서열번호 61~79로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 78의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 73의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 49의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 61의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 62의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 61의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 64의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 63의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 65의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 63의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 67의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 61의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 68의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 63의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 69의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 63의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 72의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 74의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 73의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 75의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 73의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 77의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 79의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 73의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 개시는 서열번호 76의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 조성물, 및 서열번호 70의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩티드를 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은 1.1:1 내지 1:1.1의 몰비로 존재하는 첫 번째 및 두 번째로 나열된 폴리펩티드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에서 기술된 조성물 중 어느 하나를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)과 실질적으로 상동인 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 상동인) 개체군을 포함하는 약제학적 조성물, 또는 본원에 기술된 Fc 작제물과 실질적으로 상동인 개체군을 포함하는 조성물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 실질적으로 상동인 개체군을 포함하는 조성물) 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 보조제를 포함한다. 이러한 약제학적 조성물은 Fc 작제물의 상당한 응집 또는 원치 않는 다량체화 없이 제조될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시는 서열번호 76을 포함하는 폴리펩티드 및 서열번호 70을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 서열번호 78을 포함하는 폴리펩티드 및 서열번호 73을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 서열번호 79를 포함하는 폴리펩티드 및 서열번호 73을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물 중 어느 하나를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시는 서열번호 76을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 70을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 서열번호 78을 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 73을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 서열번호 79를 암호화하는 핵산 서열 및 서열번호 73을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시는 본원에 기술된 Fc 작제물 중 임의의 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 면역세포의 면역 반응 활성화를 감소시키는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물) 또는 본원에 기술된 Fc 작제물과 실질적으로 상동인 개체군을 포함하는 조성물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물과 실질적으로 상동인 개체군을 포함하는 조성물)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 자가 면역 질환을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 염증 또는 염증성 질환을 치료하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물) 또는 본원에 기술된 Fc 작제물과 실질적으로 동질인 개체군을 포함하는 조성물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 실질적으로 동질인 개체군을 포함하는 조성물)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 대상체에서 자가항체의 제거를 촉진하고/하거나 항원 제시를 억제하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물) 또는 본원에 기술된 Fc 작제물과 실질적으로 동질인 개체군을 포함하는 조성물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 실질적으로 동질인 개체군을 포함하는 조성물)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 투여함으로써 치료될 수 있는 예시적인 질환은 류마티스 관절염(RA); 전신 홍반성 루푸스(SLE); ANCA-관련 혈관염; 항인지질 항체 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 만성 염증성 탈수초성 신경병증; 이식조직에서 항-알로(anti-allo), GVHD에서 항-자기, 항-교환(anti-replacement), IgG 치료법, IgG 파라단백질의 제거; 피부근염; 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's Syndrome); 항체-의존성 세포 매개 세포 독성을 통해 매개된 조직계-표적형 II 과민성, 예컨대, 길랑 바레 증후군(Guillain Barre syndrome), CIDP, 피부근염, 펠티 증후군(Felty's syndrome), 항체 매개 거부반응, 자가면역성 갑상선 질환, 궤양성 대장염, 자가면역성 간 질환; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 중증 근무력증, 시신경 척수염; 수포창 및 기타 자가면역성 수포 질환; 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome); 항체-의존성 식균 작용을 통해 매개된 자가면역성 혈구감소증 및 기타 질환; 기타 FcR-의존성 염증 증후군, 예컨대, 활액막염, 피부근염, 전신성 혈관염, 사구체염 또는 혈관염을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물은 항원-인식 영역, 예컨대 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 작제물(또는 Fc 작제물 내의 Fc 도메인)은 상이한 폴리펩티드에 존재하는 Fc 도메인 단량체의 결합에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 형성된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물은 항원 인식 영역, 예컨대, 가변 도메인 또는 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, Fc 작제물은 2개의 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 추가 도메인(예컨대, IgM 꼬리조각(tailpiece) 또는 IgA 꼬리조각)을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 공유결합은 Fc 도메인을 형성하도록 접합하는 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에서만 Fc 작제물에 존재한다. 다른 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 도메인 사이에 공유결합을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 작제물 중의 Fc 도메인 중 전부 또는 실질적으로 전부가 세포 표면 상의 Fc 수용체와 동시에 상호작용할 수 있도록 충분한 구조적 가요성을 제공한다. 하나의 구현예에서, 도메인 단량체는 이량체화 선택도 모듈을 가진다는 점에서 1차 서열이 야생형과 상이하거나 서로 간에 상이하다.
작제물의 Fc 도메인의 Fc 도메인 단량체는 동일한 1차 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인의 Fc 도메인 단량체는 둘 다 동일한 이량체화 선택도 모듈을 가질 수 있다. 예컨대, Fc 도메인의 Fc 도메인 단량체 둘 다 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내에 적어도 2개의 위치에서 동일한 역전하 돌연변이를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제3 및 제4 폴리펩티드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 서열은 제5 Fc 도메인 단량체의 서열과 상이하다. 일부 구현예에서, 제3 Fc 도메인 단량체의 서열은 제6 Fc 도메인 단량체의 서열과 상이하다. 일부 구현예에서, 제2 Fc 도메인 단량체의 서열은 제4 Fc 도메인 단량체의 서열과 동일하다.
본원에 기재된 Fc 작제물 중 임의의 하나에 있어서, 작제물의 Fc 도메인의 Fc 도메인 단량체는 2개의 Fc 도메인 단량체 간에(즉, Fc 작제물의 한 Fc 도메인 단량체와 다른 단량체 간에) 상이한 서열, 예컨대 20개 이하의 아미노산(예컨대, 15개, 10개 이하의 아미노산), 예컨대, 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 아미노산이 상이한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 작제물의 Fc 도메인 단량체 서열들이 상이할 수 있는데, 이는 임의의 Fc 작제물의 상보적 이량체화 선택도 모듈이 도메인 단량체 중 하나의 CH3 항체 불변 도메인에서 조작된 함몰부를 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인에서 조작된 돌출부를 포함하되, 조작된 함몰부와 조작된 돌출부가 Fc 도메인 단량체의 함몰부-내-돌출부 페어링(protuberance-into-cavity pair)의 형태로 위치될 수 있기 때문이다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 CH3 도메인에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 도메인 단량체(Fc 도메인 단량체 중 하나 이상)의 CH3 도메인에서 선택적 이량체화를 위한 아미노산 변형을 포함한다. 예시적인 조작된 함몰부 및 돌출부는 표 1에 도시되어 있다. 다른 구현예에서, 상보적 이량체화 선택도 모듈은 도메인 단량체 중 하나의 CH3 항체 불변 도메인에서 조작된(치환된) 음하전 아미노산을 포함하고 Fc 도메인 단량체 중 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인에 조작된(치환된) 양하전 아미노산을 포함하되, 음하전 아미노산 및 양하전 아미노산은 상보적 도메인 단량체 간의 Fc 도메인 형성을 촉진하도록 위치된다. 예시적인 상보적 아미노산 변화는 표 2a 내지 표 2c에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 동일한 서열이다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 동일한 변형을 갖는다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 중 1개만, 2개만, 3개만, 또는 4개만이 동일한 변형을 갖는다.
일부 경우에, Fc 도메인은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하되, 아미노산 변형은 (예를 들어, 비변형 Fc 도메인과 비교했을 때) (i) 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, (ii) 효과기 기능, (iii) Fc 도메인 황산화의 수준, (iv) 반감기, (v) 프로테아제 저항성, (vi) Fc 도메인 안정성, 및/또는 (vii) 분해에 대한 감수성 중 하나 이상을 변경시킨다. 일부 경우에, Fc 도메인은 16개 이하의 아미노산 변형(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 이하의 아미노산 변형)을 포함한다. 일부 경우에, Fc 도메인은 16개 이하의 아미노산 변형(예컨대, CH3 도메인에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 이하의 아미노산 변형)을 포함한다.
본 개시는 또한 본원에 기술된 임의의 Fc 작제물과 실질적으로 동질인 개체군을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 약제학적 용도로 적합한 멸균 주사기 또는 바이알은 약제학적 조성물을 함유하되, 상기 조성물의 유일한 활성 성분 또는 주된 활성 성분은 본원에 기술된 Fc 작제물 중 어느 하나와 실질적으로 동질인 개체군이다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 염, 세척제, 계면활성제, 벌킹제(bulking agent), 중합체, 방부제, 및 기타 약제학적 부형제로부터 선택된 하나 이상의 비활성 성분을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 작제물은 상이한 폴리펩티드에 존재하는 Fc 도메인 단량체의 결합에 의해 적어도 부분적으로 형성된다. 특정 구현예에서, Fc 작제물은 상이한 폴리펩티드에 존재하는 Fc 도메인 단량체의 결합에 의해 형성된다. 이들 구현예에서, Fc 작제물은 2개의 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 추가 도메인(예컨대, IgM 꼬리조각 또는 IgA 꼬리조각)을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 공유결합(예컨대, 이황화 결합)은 Fc 도메인을 형성하도록 접합하는 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에서만 Fc 작제물에 존재한다. 다른 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 도메인 사이에 공유결합(예컨대, 이황화 결합)을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, Fc 작제물은 Fc 작제물 중의 Fc 도메인 중 전부 또는 실질적으로 전부가 세포 표면 상의 Fc 수용체와 동시에 상호작용할 수 있도록 충분한 구조적 가요성을 제공한다. 이들 구현예의 임의의 특정 예에서, Fc 작제물은 링커(예컨대, 가요성 아미노산 스페이서)를 통해 접합된 적어도 2개의 Fc 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 Fc 도메인 단량체의 선택성 이량체화를 촉진하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본 개시는 Fc 도메인의 2개의 Fc 도메인 단량체가 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에 하전된 잔기의 고리 내에 적어도 2개의 위치에 동일한 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함한다. 본 개시는 또한 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에 하전된 잔기의 고리 내에 적어도 2개의 위치에 2개의 Fc 도메인 단량체에 동일한 돌연변이를 갖는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 도입하는 단계를 포함하는 이러한 Fc 도메인을 제조하는 방법을 포함한다. CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면은 하전된 잔기의 고리로 둘러싸인 소수성 패치(patch)로 이루어진다. 하나의 CH3 항체 불변 도메인이 또 다른 하나와 합쳐지는 경우, 이들 하전된 잔기는 반대 전하 잔기와 쌍을 이룬다. 잔기의 둘 이상의 상보적인 쌍의 두 구성원의 전하를 서로 바꿈으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이 서열의 Fc 도메인 단량체에 상보적으로 남아있지만, 이들 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 더 낮은 상보성을 갖는다. 본 구현예에서, 동일한 이량체화 선택성 모듈은 동종이량체화(homodimerization)를 촉진한다. 이러한 Fc 도메인은 이중 돌연변이 K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D, 또는 D356K/K439E를 함유하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이, 예컨대, K409D/D399K/E357K/K370E의 임의의 쌍을 결합하는 4중 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 동일한 이량체화 선택성 모듈에 추가로, Fc 도메인의 Fc 도메인 단량체는 특이적 결합(예컨대, 유전자 조작 함몰부 및 돌출부)을 촉진하는 비동일한 돌연변이를 가지는 상보적인 이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 그 결과, 2개의 Fc 도메인 단량체는 2개의 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 서로 상보적으로 남아있지만, 다른 Fc 도메인 단량체에 대한 상보성이 감소된다. 본 구현예는 함몰부-함유 Fc 도메인 및 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체 간의 이종이량체화(heterodimerization)를 촉진한다. 하나의 실시예에서, Fc 도메인 단량체 둘 다의 하전된 쌍 잔기에서의 비동일한 돌연변이를 갖는 상보성 이량체화 선택성 모듈은 하나의 Fc 도메인 단량체상의 돌출부 및 다른 Fc 도메인 단량체상의 함몰부와 결합된다.
본원에 기재된 Fc 작제물 중 임의의 것에 있어서, Fc 도메인 단량체의 순서는 상호 교환적일 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 링커에 의해 제2 Fc 도메인 단량체에 연결된 제1 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 카르복시 말단은 링커의 아미노 말단에 결합될 수 있고, 이는 차례로 카르복시 말단에서 제2 Fc 도메인 단량체의 아미노 말단에 결합된다. 대안적으로, 제2 Fc 도메인 단량체의 카르복시 말단은 링커의 아미노 말단에 결합될 수 있고, 이는 차례로 카르복시 말단에서 제1 도메인 단량체의 아미노 말단에 결합된다. 이들 구성은 모두는 본 개시에 포함된다.
정의:
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc 도메인 단량체"는 적어도 힌지 도메인(또는 이의 일부) 및 제2 및 제3 항체 불변 도메인(CH2 및 CH3) 또는 이의 기능성 단편(예컨대, (i) Fc 도메인을 형성하기 위해 또 다른 Fc 도메인 단량체와 이량체화될 수 있고, (ii) Fc 수용체에 결합될 수 있는 단편)을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 지칭한다. Fc 도메인 단량체는 상이한 기원의 것, 예컨대, 인간, 마우스, 또는 랫트의 것일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD(예컨대, IgG)를 포함하는 임의의 면역글로불린 항체 이소형(isotype)일 수 있다. 추가로, Fc 도메인 단량체는 IgG 아형(예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4)(예컨대, IgG1)일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 항원 인식 부위, 예컨대, 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)으로 작용할 수 있는 면역글로불린의 어떤 부분도 포함하지 않는다. Fc 도메인 단량체는 야생형 Fc 도메인 단량체 서열로부터 많게는 10개의 변화(예: 단일 아미노산 변형)을 가질 수 있고(예를 들어, 1~10, 1~8, 1~6, 1~4개의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실을 가질 수 있고), 이는 Fc 도메인과 Fc 수용체 간의 상호 작용을 변경시킨다. 적합한 변화의 예는 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "Fc 도메인"이란 용어는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체를 지칭한다. 야생형 Fc 도메인에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 2개의 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호작용뿐만 아니라 2개의 이량체화 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인 사이에 형성되는 하나 이상의 이황화 결합에 의해 이량체화된다.
본 개시에서, "Fc 작제물"이란 용어는 본원에 기술된 바와 같이 Fc 도메인을 형성하는 결합된 폴리펩티드 사슬(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 지칭한다. 본원에 기재된 Fc 작제물은 동일한 서열 또는 상이한 서열을 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fc 작제물은 3개의 Fc 도메인을 가질 수 있고, 그 중 2개는 IgG1 또는 IgG1-유래 Fc 도메인 단량체를 포함하고, 세 번째는 IgG2 또는 IgG2-유래 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 예에서, Fc 작제물은 3개의 Fc 도메인을 가질 수 있고, 그 중 2개는 "돌출부-함몰부 쌍"을 포함하고, 세 번째는 "돌출부-함몰부 쌍"을 포함하지 않는다. 본 개시에서, Fc 도메인은 항체, 예컨대, VH, VL, CDR, 또는 HVR의 가변 영역을 포함하지 않는다. Fc 도메인은 Fc 수용체, 예컨대, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, FcγRIV에 결합하는 최소 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물은 항원-인식 영역, 예컨대 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물은 항원 인식 영역, 예컨대, 가변 도메인 또는 CDR을 포함한다.
본원에서 사용된 "항체 불변 도메인"이라는 용어는 항체의 불변 영역 도메인(예컨대, CL 항체 불변 도메인, CH1 항체 불변 도메인, CH2 항체 불변 도메인, 또는 CH3 항체 불변 도메인)에 상응하는 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에서 사용된 "촉진시키다"라는 용어는 조장하고 장려하는 것, 예컨대 다른, 별개의 Fc 도메인 단량체보다 서로 간에 결합 친화도가 더 높은 2개의 Fc 도메인 단량체에서 Fc 도메인의 형성을 장려하는 것을 지칭한다. 본원에 기재된 바와 같이, 결합하여 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 도메인 단량체는 그들 각각의 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 양립성(compatible) 아미노산 변형(예컨대, 유전자 조작 돌출부 및 유전자 조작 함몰부)을 가질 수 있다. 양립성 아미노산 변형은 이러한 아미노산 변형이 결여되거나 비양립성 아미노산 변형을 갖는 다른 Fc 도메인 단량체와 비교하여 이러한 Fc 도메인 단량체의 서로 간의 선택적 상호 작용을 촉진하거나 장려한다. 이는 2개의 상호작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서의 아미노산 변형으로 인해, 아미노산 변형이 결여된 다른 Fc 도메인 단량체보다 서로를 향해 더 높은 친화도를 갖는 Fc 도메인 단량체 때문에 발생한다.
본원에서 사용된 "이량체화 선택도 모듈"이란 용어는 2개의 도메인 단량체 간의 바람직한 페어링(pairing)을 용이하게 하는 Fc 도메인 단량체의 서열을 지칭한다. "상보적" 이량체화 선택도 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 서로 간의 선택적 상호 작용을 촉진하거나 장려하는 이량체화 선택도 모듈이다. 상보적 이량체화 선택도 모듈은 동일한 또는 상이한 서열을 가질 수 있다. 예시적인 상보적 이량체화 선택도 모듈은 본원에 기재된다.
본원에서 사용된 "유전자 조작 함몰부"라는 용어는 원래의 아미노산 잔기보다 더 작은 측쇄 체적을 갖는 상이한 아미노산 잔기를 가진 CH3 항체 불변 도메인에 있는 원래의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 치환을 지칭하며, 따라서 CH3 항체 불변 도메인에 3차원 함몰부를 생성한다. "원래의 아미노산 잔기"라는 용어는 야생형 CH3 항체 불변 도메인의 유전 암호에 의해 인코딩된 자연 발생 아미노산 잔기를 지칭한다.
본원에서 사용된 "유전자 조작 돌출부"라는 용어는 원래의 아미노산 잔기보다 더 큰 측쇄 체적을 갖는 상이한 아미노산 잔기를 가진 CH3 항체 불변 도메인에 있는 원래의 아미노산 잔기 중 적어도 하나의 치환을 지칭하며, 따라서 CH3 항체 불변 도메인에 3차원 돌출부를 생성한다. "원래의 아미노산 잔기들"이라는 용어는 야생형 CH3 항체 불변 도메인의 유전 암호에 의해 인코딩된 자연 발생 아미노산 잔기들을 지칭한다.
본원에서 사용된 "돌출부-함몰부 쌍"이라는 용어는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 Fc 도메인을 설명하되, 제1 Fc 도메인 단량체는 그의 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 함몰부를 포함하는 반면, 제2 Fc 도메인 단량체는 그의 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 돌출부를 포함한다. 돌출부-함몰부 쌍에서, 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있는 유전자 조작 돌출부는 CH3 항체 불변 도메인간 계면에서 이량체의 정상 결합을 유의미하게 교란시키지 않으면서 제2 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부와 상호작용하도록 위치된다.
본원에서 사용된, "이종이량체 Fc 도메인"이란 용어는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이들 2개의 Fc 도메인 단량체의 양호한 형성을 촉진하는 상이한 역전하 돌연변이(예컨대, 표 2a의 돌연변이 참조)를 함유한다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 3개의 Fc 도메인(하나의 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "가지" Fc 도메인)을 갖는 Fc 작제물에서, 아미노 말단 "가지" Fc 도메인 각각은 이종이량체 Fc 도메인("가지 이종이량체 Fc 도메인"이라고도 불림)(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(106 및 114) 또는 Fc 도메인 단량체(112 및 116)에 의해 형성된 이종이량체 Fc 도메인; 도 2의 Fc 도메인 단량체(206 및 214) 또는 Fc 도메인 단량체(212 및 216)에 의해 형성된 이종이량체 Fc 도메인)일 수 있다.
본원에서 사용된 "동종이량체 Fc 도메인"이란 용어는 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 동일한 역전하 돌연변이(예컨대, 표 2b 및 표 2c의 돌연변이 참조)를 함유한다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 3개의 Fc 도메인(하나의 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "가지" Fc 도메인)을 갖는 Fc 작제물에서, 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인은 동종이량체 Fc 도메인("줄기 동종이량체 Fc 도메인"이라고도 불림)(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(104 및 110)에 의해 형성된 동종이량체 Fc 도메인; 도 2의 Fc 도메인 단량체(204 및 210)에 의해 형성된 동종이량체 Fc 도메인)일 수 있다.
본원에서 사용된 "이종이량체화 선택성 모듈"이란 용어는 양립 가능한 이종이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체의 양호한 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에서 이루어질 수 있는 유전자 조작 돌출부, 유전자 조작 함몰부 및 특정 역전하 아미노산 치환을 지칭한다. 이종이량체화 선택성 모듈을 함유하는 Fc 도메인 단량체는 결합하여 이종이량체 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 이종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 1 및 표 2a에 나타낸다.
본원에서 사용된 "동종이량체화 선택성 모듈"이란 용어는 동종이량체 Fc 도메인을 형성하도록 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화를 촉진하는 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치의 Fc 도메인 단량체의 역전하 돌연변이를 지칭한다. 동종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 2a 및 표 2b에 나타낸다.
본원에서 사용된 "결합된(joined)"이라는 용어는 화학적 접합, 재조합 수단 및 화학 결합(예컨대, 이황화 결합 및 아미드 결합)을 포함하는 수단에 의한 둘 이상의 요소, 성분, 또는 단백질 도메인(예컨대, 폴리펩티드)의 조합 또는 부착을 기술하는 데 사용된다. 예를 들어, 2개의 단일 폴리펩티드는 화학적 접합, 화학 결합, 펩티드 링커, 또는 공유 결합의 임의의 다른 수단을 통해 결합되어 하나의 연속 단백질 구조를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 Fc 도메인 단량체는 펩티드 링커를 통해 제2 Fc 도메인 단량체에 접합되되, 펩티드 링커의 N-말단은 화학 결합, 예컨대, 펩티드 결합을 통해 제1 Fc 도메인 단량체의 C-말단에 결합되고, 펩티드 링커의 C-말단은 화학 결합, 예컨대, 펩티드 결합을 통해 제2 Fc 도메인 단량체의 N-말단에 결합된다. 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드의 N-말단은 전술한 바와 동일한 방식으로 링커를 통해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단에 결합된다.
본원에서 사용된 "결합된(associated)"이라는 용어는 폴리펩티드(또는 하나의 단일 폴리펩티드 내의 서열)가 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 형성하도록 위치되게 하는 폴리펩티드(또는 하나의 단일 폴리펩티드 내의 서열) 사이의 상호 작용, 예컨대, 수소 결합, 소수성 상호 작용, 또는 이온 결합을 기술하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 4개의 폴리펩티드, 예컨대, 2개의 Fc 도메인 단량체를 각각 포함하는 하나의 폴리펩티드 및 하나의 Fc 도메인 단량체를 각각 포함하는 2개의 폴리펩티드는 결합하여 (예컨대, 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같은) 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 형성한다. 4개의 폴리펩티드는 그들 각각의 Fc 도메인 단량체를 통하여 결합할 수 있다. 폴리펩티드 사이의 결합은 공유 결합을 포함하지 않는다.
본원에서 사용된 "링커"라는 용어는 2개의 요소, 예컨대, 단백질 도메인 사이의 결합을 지칭한다. 링커는 공유 결합 또는 스페이서일 수 있다. "결합"이라는 용어는 화학 결합, 예컨대, 아미드 결합 또는 이황화 결합, 또는 화학 반응에 의해 생성된 임의의 종류의 결합, 예컨대, 화학적 접합을 지칭한다. "스페이서"라는 용어는 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 공간 및/또는 가요성을 제공하기 위해 2개의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인 사이에 발생하는 모이어티(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체) 또는 아미노산 서열(예컨대, 3~200개의 아미노산, 3~150개의 아미노산, 3~100개의 아미노산, 3~60개의 아미노산, 3~50개의 아미노산, 3~40개의 아미노산, 3~30개의 아미노산, 3~20개의 아미노산, 3~10개의 아미노산, 3~8개의 아미노산, 3~5개의 아미노산, 4~30개의 아미노산, 5~30개의 아미노산, 6~30개의 아미노산, 8~30개의 아미노산, 10~20개의 아미노산, 10~30개의 아미노산, 12~30개의 아미노산, 14~30개의 아미노산, 20~30개의 아미노산, 15~25개의 아미노산, 15~30개의 아미노산, 18~22개의 아미노산, 및 20~30개의 아미노산 서열)을 지칭한다. 아미노산 스페이서는 (예컨대, 이격된 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 도메인에 폴리펩티드 백본(backbone)을 통해 접합된) 폴리펩티드의 1차 서열의 부분이다. 예컨대, Fc 도메인을 형성하는 2개의 힌지 영역 또는 2개의 Fc 도메인 단량체 간의 이황화 결합의 형성은 링커로 간주되지 않는다.
본원에서 사용된 "글리신 스페이서"라는 용어는 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬로 결합시키는 글리신만을 함유하는 링커를 지칭한다. 글리신 스페이서는 적어도 4, 8, 12, 14, 16, 18, 또는 20개의 글리신(예컨대, 4~30개, 8~30개, 12~30개, 12~50개, 12~100개, 또는 12~200개의 글리신; 예컨대, 12~30개, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 글리신)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 글리신 스페이서는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호 27)의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
본원에서 사용된 "알부민-결합 펩티드"라는 용어는 혈청 알부민에 대한 친화도가 있고 혈청 알부민에 결합하도록 기능하는 12개 내지 16개의 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 지칭한다. 알부민-결합 펩티드는 상이한 기원, 예컨대, 인간, 마우스, 또는 랫트의 것일 수 있다. 본 개시의 일부 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 Fc 도메인 단량체의 C-말단에 융합되어 Fc 작제물의 혈청 반감기를 증가시킨다. 알부민-결합 펩티드는 직접 또는 링커를 통해, Fc 도메인 단량체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본원에서 사용된 "정제 펩티드"란 용어는 폴리펩티드의 정제, 단리 또는 식별에 사용될 수 있는 임의의 길이의 펩티드를 지칭한다. 정제 펩티드는 예컨대, 세포 용해 혼합물에서 폴리펩티드를 정제하고/하거나 폴리펩티드를 단리하는 것을 돕기 위해 폴리펩티드에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드는 결합하여 정제 펩티드에 특이적 친화도를 갖는 또 다른 모이어티에 결합한다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 매트릭스, 수지, 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 부착된다. Fc 작제물에 접합될 수 있는 정제 펩티드의 예는 본원에 더 상세히 기술된다.
본원에서 사용된 "다량체"라는 용어는 본원에 기재된 적어도 2개의 결합된 Fc 작제물을 포함하는 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 "항원 인식 영역"이라는 용어는 항원에 대한 항체의 인식 및 결합을 담당하는 항체의 경쇄 및 중쇄의 부분을 지칭한다. 항원 인식 영역은 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR, 예컨대, CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, 및 CDR H3) 및 프레임워크 영역(framework region, FR)을 포함하는 경쇄 및 중쇄(Fab)의 가변 도메인을 포함한다.
본원에서 사용된 "면역 반응의 면역 세포 활성화"라는 용어는 세포(예컨대, 면역 세포 (예컨대, 단핵구))상의 Fcγ 수용체(FcγR)(예컨대, 활성화 FcγR, 예컨대, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 또는 FcγRIIIb)에 면역 복합체 또는 Fc 작제물이 결합하여 유도되거나 활성화되는 면역 반응을 지칭한다. 면역 복합체는 항원에 항체가 결합하여 형성된 항원-항체 복합체이다. 면역 복합체는 FcγR을 응집하고 염증, 감염증, 및 기타 질환에서 중요한 역할을 하는 세포 과정을 억제하거나 활성화시키는 다수의 Fc 도메인을 종종 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시의 Fc 작제물은 FcγR에 결합할 수 있고 면역 세포(예컨대, 단핵구)상에서 FcγR(예컨대, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 또는 FcγRIIIb) 신호의 활성화를 유도할 수 있다. 키나아제 인산화(예컨대, Syk 인산화) 및 FcγR-발현 세포에서의 칼슘 유입(calcium influx)과 같은 특정 하류 신호 이벤트의 측정은 면역 복합체 또는 Fc 작제물의 결합으로 야기된 면역 반응의 면역 세포 활성화를 탐지하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 면역 반응의 면역 세포 활성화는 세포의 키나아제 인산화(예컨대, Syk 인산화)의 수준 또는 칼슘 유입 수준이 면역 복합체 또는 Fc 작제물에 의한 어떤 활성화도 없는 세포의 키나아제 인산화(예컨대, Syk 인산화) 또는 칼슘 유입의 수준보다 적어도 5배, 예컨대, 5~100배(예컨대, 5~100배, 10~95배, 15~90배, 20~85배, 25~80배, 30~75배, 35~70배, 40~65배, 45~60배, 또는 50~55배; 예컨대, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 20배, 21배, 22배, 23배, 24배, 25배, 26배, 27배, 28배, 29배, 30배, 31배, 32배, 33배, 34배, 35배, 36배, 37배, 38배, 39배, 40배, 41배, 42배, 43배, 44배, 45배, 46배, 47배, 48배, 49배, 50배, 51배, 52배, 53배, 54배, 55배, 56배, 57배, 58배, 59배, 60배, 61배, 62배, 63배, 64배, 65배, 66배, 67배, 68배, 69배, 70배, 71배, 72배, 73배, 74배, 75배, 76배, 77배, 78배, 79배, 80배, 81배, 82배, 83배, 84배, 85배, 86배, 87배, 88배, 89배, 90배, 91배, 92배, 93배, 94배, 95배, 96배, 97배, 98배, 99배, 또는 100배) 더 높은 경우에 유도된다.
본원에서 사용된 "식균작용"이란 용어는 세포, 종종 포식세포(예컨대, 단핵구)가 또 다른 세포, 입자, 또는 병원체(예컨대, 미생물 또는 기생균)를 완전히 에워싸서 포식소체(phagosome)를 형성하는 세포내 이입(endocytosis)의 형태를 지칭한다. 면역계에서, 식균작용은 병든 세포(예컨대, 암세포, 감염 세포, 또는 죽은 세포), 병원체 및 세포 잔해물을 제거하는 데 사용되는 주요 메커니즘이다. 또 다른 세포(예컨대, 포식세포(예컨대, 단핵구))의 식균작용에 의해 제거되도록 표적화되는 세포는 표적 세포라 지칭된다. 예를 들어, 면역 세포상의 FcγR(예컨대, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 또는 FcγRIIIb)에 본 개시의 Fc 작제물의 결합에 의해 활성화된 면역 세포(예컨대, 단핵구)는 대상체의 암세포 또는 감염 세포일 수 있는 표적 세포를 식균작용에 의해 제거할 수 있다.
본원에서 사용된 표적 세포의 식균작용이 "증가하다" 또는 "증가하는"이라는 말은 Fc 작제물 도입 없이 일어나는 식균작용의 수준에 비해 면역 세포(예컨대, 단핵구)상의 FcγR(예컨대, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 또는 FcγRIIIb)에 본 개시의 Fc 작제물의 결합에 의해 유도된 식균작용의 증가를 지칭한다. 예를 들어, 표적 세포의 식균작용은 식균작용의 수준이 Fc 작제물 도입 없이 일어나는 식균작용의 수준보다 적어도 10%, 예컨대, 10~100%(예컨대, 10~100%, 15~95%, 20~90%, 25~85%, 30~80%, 35~75%, 40~70%, 45~65%, 또는 50~60%; 예컨대, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 더 높은 경우에 증가된다.
본원에서 사용된 "암 치료"라는 용어는 대상에서 암의 치료적 처리를 지칭한다. 치료적 처리는 암의 진행을 늦추고, 대상의 결과를 개선하고/하거나 암을 제거하는 것이다.
본원에서 사용된 "감염증 치료"라는 용어는 대상에서 감염증의 치료적 처리를 지칭한다. 치료적 처리는 감염증의 진행을 늦추고, 대상의 결과를 개선하고/하거나 감염증을 제거하는 것이다.
본원에서 사용된 "감염증"이라는 용어는 세균, 바이러스, 진균, 연충(helminth), 원충(protozoan), 절지동물 및 기타 미생물, 기생균 및 기생충(worm)과 같은 병원체에 의한 대상의 세포, 조직, 및/또는 기관에의 침입을 지칭한다. 일부 구현예에서, 병원체는 대상의 세포, 조직, 및/또는 기관에서 성장하고, 증식하고/하거나 독소를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 병원체에 대해 부정적인 반응(즉, 알레르기 반응 또는 면역 반응)을 일으킬 수 있다. 감염증의 예는 이에 제한되지 않지만, 세균성 감염증, 바이러스성 감염증, 진균성 감염증, 연충 감염증 및 원충 감염증을 포함한다.
본원에서 사용된 "세균성 감염증"이란 용어는 하나 이상의 세균에 의해 야기된 감염증을 지칭한다. 감염 유발 세균의 예는 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되지 않지만, 연쇄상구균(Streptococcus)속의 세균(예컨대, Streptococcus pyogenes), 대장균속의 세균(예컨대, Escherichia coli), 비브리오(Vibrio)속의 세균(예컨대, Vibrio cholerae), 장염균(Enteritis)속의 세균(예컨대, Enteritis salmonella) 및 살모넬라(Salmonella)속의 세균(예컨대, Salmonella typhi)을 포함한다.
본원에서 사용된 "바이러스성 감염증"이란 용어는 하나 이상의 바이러스에 의해 야기된 감염증을 지칭한다. 감염 유발 바이러스의 예는 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되지 않지만, 레트로바이러스과의 바이러스(예컨대, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 아데노바이러스과의 바이러스(예컨대, 아데노바이러스), 단순포진바이러스과의 바이러스(예컨대, 단순성 포진 바이러스 1형 및 2형), 파필로마바이러스과의 바이러스(예컨대, 인간 유두종 바이러스(HPV)), 폭스바이러스과의 바이러스(예컨대, 천연두), 피코르나바이러스과의 바이러스(예컨대, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스), 헤파드나바이러스과의 바이러스(예컨대, B형 간염 바이러스), 플라비바이러스과의 바이러스(예컨대, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스), 토가바이러스과의 바이러스(예컨대, 풍진 바이러스), 오르토믹소바이러스과의 바이러스(예컨대, 인플루엔자 바이러스), 필로바이러스과의 바이러스(예컨대, 에볼라 바이러스, 마버그 바이러스), 및 파라믹소바이러스과의 바이러스(예컨대, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스)를 포함한다.
본원에서 사용된 "진균성 감염증"이란 용어는 하나 이상의 진균으로 야기된 감염증을 지칭한다. 감염 유발 진균의 예는 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되지 않지만 아스페르길루스(Aspergillus)속의 진균(예컨대, Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. terreus. A. niger, A. c및idus, A. clavatus, A. ochraceus), 칸디다(Candida)속의 진균(예컨대, Canida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis), 크립토코커스(Cryptococcus)속의 진균(예컨대, Cryptococcus neoformans) 및 푸사리움(Fusarium)속의 진균(예컨대, Fusarium solani, F. verticillioides, F. oxysporum)을 포함한다.
본원에서 사용된 "연충 감염증"이란 용어는 하나 이상의 연충에 의해 야기된 감염증을 지칭한다. 연충의 예는 이에 제한되지 않지만, 조충류(촌충류), 회충류(선충류), 흡충류(디스토마류) 및 단생강을 포함한다.
본원에서 사용된 "원충 감염증"이란 용어는 하나 이상의 원충에 의해 야기된 감염증을 지칭한다. 원충의 예는 이에 제한되지 않지만, 엔트아메바(Entamoeba)속의 원충(예컨대, Entamoeba histolytica), 열원충(Plasmodium)속의 원충(예컨대, Plasmodium falciparum, P. malariae), 람블편모충(Giardia)속의 원충(예컨대, Giardia lamblia) 및 파동편모충(Trypanosoma)속의 원충(예컨대, Trypanosoma brucei)을 포함한다.
본원에서 사용된 "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 올리고뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드, 및 이들의 단편 또는 일부를 지칭하고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고 센스 가닥 또는 안티-센스 가닥을 나타낼 수 있는 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 지칭한다. 단일 폴리뉴클레오티드는 단일 폴리펩티드로 번역된다.
본원에서 사용된 "폴리펩티드"라는 용어는 단량체가 아미드 결합을 통해 서로 접합되는 아미노산 잔기인 단일 중합체를 말한다. 폴리펩티드는 자연 발생, 재조합, 또는 합성에 의해 생성된 임의의 아미노산 서열을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용된 "아미노산 위치"라는 용어는 단백질 또는 단백질 도메인 내 아미노산의 위치 번호를 의미한다. 항체 또는 Fc 작제물에 대한 아미노산 위치는 카밧(Kabat) 넘버링 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed 5, 1991)을 사용하여 번호가 부여된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산 돌연변이", "아미노산 변화" 및 "아미노산 변형"은 기준 Fc 도메인 폴리펩티드(예컨대, 야생형, 돌연변이되지 않은 또는 미변형 Fc 서열)와 비교했을 때의 Fc 도메인 폴리펩티드의 변경을 지칭하도록 상호 교환적으로 사용된다. 기준 Fc 도메인 폴리펩티드는 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인 폴리펩티드일 수 있다. 아미노산 변형은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 변형은 단일 아미노산의 변형이다. 다른 구현예에서, 아미노산 변형은 다수의(예컨대, 하나 초과의) 아미노산의 변형이다. 아미노산 변형은 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입의 조합을 포함할 수 있다. 아미노산 변형의 기술에는 점 돌연변이(예: 단일 뉴클레오티드를 다른 것과 교환하는 것)와 같은 유전적 변경(즉, DNA 및 RNA의 변경), Fc 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 및 결실(예컨대, 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가 및/또는 제거)이 포함된다. 삽입은, 달리 명시되지 않는 한, 삽입이 일어나도록 명시된 아미노산 위치 바로 다음에 하나 이상의 아미노산을 추가하는 것이다. 달리 명시되지 않는 한, 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 삽입, 및/또는 결실)은 Fc 도메인을 구성하는 Fc 도메인 단량체들 모두에 통합된다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인은, 예를 들어, 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의) 아미노산 변형을 제1 Fc 도메인 단량체에서 포함할 수 있는데, 상기 아미노산 변형은 제2 Fc 도메인 단량체에서의 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의) 아미노산 변형과는 상이하다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 동질의 아미노산 변형을 갖는 Fc 도메인 단량체(예: 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체)를 예를 들어 아미노산 위치 I253 및/또는 R292에서 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, Fc 도메인은 이종성 아미노산 변형을 갖는 Fc 도메인 단량체(예: 제1 및 제2 Fc 도메인 단량체)를 예를 들어 아미노산 위치 I253 및/또는 R292에서 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물 내의 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의) Fc 도메인은 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 하나 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상) 단일 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, Fc 도메인은 16개 이하의 아미노산 변형(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 또는 그 이하의 아미노산 변형)을 포함한다. 일부 경우에, Fc 도메인 단량체는 10개 이하의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, Fc 도메인 단량체는 12개 이하의 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, Fc 도메인 단량체는 14개 이하의 아미노산 변형을 포함한다.
특정 구현예에서, Fc 작제물 내의 적어도 하나의(예컨대, 1, 2, 또는 3개의) Fc 도메인은 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20개 또는 그 이상의) 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 10개 이하의 아미노산 변형을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "백분율(%) 동일성"이란 용어는, 최대 백분율 동일성을 달성하기 위해 필요에 따라 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후, 기준 서열(예: 야생형 Fc 도메인 단량체의 서열)의 아미노산(또는 핵산) 잔기와 동일한 후보 서열(예: 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체의 서열)의 아미노산(또는 핵산) 잔기의 백분율을 지칭한다 (즉, 갭은 최적의 정렬을 위해 후보 서열과 기준 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있으며, 비교를 위해서 비-상동 서열은 무시할 수 있음). 백분율 동일성을 결정하기 위해 정렬은 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방법, 예를 들어 BLAST, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, (주어진 기준 서열에 대한, 이에 대해, 또는 이와 비교하여 특정 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 후보 서열로 대체하여 표현될 수 있는) 주어진 기준 서열에 대한, 이에 대해, 또는 이와 비교하여 주어진 후보 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성은 다음과 같이 계산된다:
100 x (A/B의 분수)
여기서 A는 후보 서열 및 기준 서열의 정렬에서 동일한 것으로 기록된 아미노산(또는 핵산) 잔기의 수이고, B는 기준 서열에서 아미노산(또는 핵산) 잔기의 총 수이다. 후보 서열의 길이가 기준 서열의 길이와 같지 않은 일부 구현예에서, 기준 서열에 대한 후보 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성은 후보 서열에 대한 기준 서열의 퍼센트 아미노산(또는 핵산) 서열 동일성과 같지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 후보 서열과 비교하여 정렬된 기준 서열은 후보 서열의 전체 길이 또는 후보 서열의 인접한 아미노산(또는 핵산) 잔기의 선택된 부분에 걸쳐서 후보 서열이 50% 내지 100%의 동일성(예컨대, 50% 내지 100%, 60% 내지 100%, 70% 내지 100%, 80% 내지 100%, 90% 내지 100%, 92% 내지 100%, 95% 내지 100%, 97% 내지 100%, 99% 내지 100%, 또는 99.5% 내지 100%의 동일성)을 보임을 나타낼 수 있다. 비교를 위해 정렬된 후보 서열의 길이는 기준 서열 길이의 적어도 30%, 예컨대, 적어도 40%, 예컨대, 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 후보 서열에서의 위치를 기준 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산(또는 핵산) 잔기가 차지할 때, 분자는 해당 위치에서 동일하다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 야생형 Fc 도메인 단량체(예컨대, 서열번호 42)의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 48, 52, 및 53의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 본원에 기술된 서열 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 최대 10개(예컨대, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예컨대, 치환, 예컨대, 보존적 치환)을 갖는, 본원에 기술된 서열 중 어느 하나인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102 및 108); 도 2의 폴리펩티드(202 및 208))는 서열번호 43, 45, 47, 및 49 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드는 서열번호 49의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 간의 스페이서는 본원에서 더 기술된 서열번호 1~36 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호 17, 18, 26, 및 27)의 서열과 적어도 75% 동일한 (예컨대, 75%, 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 99.5%, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 필요한 세포 성분, 예컨대, 그의 상응하는 핵산에서부터 단백질을 발현하는 데 필요한 세포 기관을 포함하는 비히클(vehicle)을 지칭한다. 핵산은 전형적으로 당업계에 공지된 종래 기술(형질전환, 형질주입, 전기 천공법, 인산칼슘 침전, 직접 미세현미주입(direct microinjection) 등)로 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함된다. 숙주 세포는 원핵 세포(예: 세균 세포), 또는 진핵 세포(예: CHO 세포와 같은 포유류 세포)일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 이어서 결합하여 원하는 Fc 작제물을 형성할 수 있는 원하는 도메인을 암호화하는 하나 이상의 폴리펩티드를 발현하는 데 숙주 세포가 사용된다.
본원에서 사용된 "약제학적 조성물"이란 용어는 유효 성분뿐만 아니라 유효 성분을 투여 방법에 적합하게 만들 수 있는 하나 이상의 부형제 및 희석제를 함유하는 의약적 또는 약제학적 제형을 지칭한다. 본 개시의 약제학적 조성물은 Fc 작제물과 비슷한, 약제학적으로 허용 가능한 조성물을 포함한다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 정맥내 또는 피하 투여를 위한 수용액 형태이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 "실질적으로 동질인 개체군"은, 비환원 SDS 겔 전기영동 또는 크기 배제 크로마토그래피로 결정했을 때, 조성물(예컨대, 세포 배양 배지 또는 약제학적 조성물) 내 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 적어도 50%가 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 개체군이다. 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 실질적으로 동질인 개체군은 정제 전에, 또는 단백질 A 또는 단백질 G 정제 후에, 또는 임의의 Fab 또는 Fc-특이적 친화도 크로마토그래피 후에만 수득될 수 있다. 다양한 구현예에서, 조성물에서의 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%는 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는다. 다른 구현예에서, 조성물에서의 폴리펩티드 또는 Fc 작제물의 최대 85%, 90%, 92%, 또는 95%는 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는다. 실질적으로 동질인 개체군 또는 조성물은 적어도 85% 동질이다 (예를 들어, 적어도 85%, 90% 또는 95% 동질임).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 약학적 조성물 중의 첨가제 또는 희석제를 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능해야 하고 피험자에게 해가 없어야 한다. 본 개시에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 Fc 작제물에 적절한 약학적 안정성을 제공해야 한다. 담체의 특성은 투여 방식에 따라 다르다. 예를 들어, 경구 투여에서는 고형 담체가 바람직하고, 정맥내 투여에서는 수용액 담체(예컨대, WFI, 및/또는 완충액)가 일반적으로 사용된다.
본원에서 사용된 "치료 유효량"은 어떤 양, 예컨대, 대상 또는 환자에서 원하는 생물학적 효과를 일으키거나 본원에 기재된 질병 또는 장애를 가진 환자를 치료하는 데 효과적인 약학적 투여량을 지칭한다. "치료 유효량"은 하나의 투여량 또는 임의의 투약 또는 경로로 섭취되거나 단일 또는 다른 치료제와 병용하여 섭취되어 원하는 치료효과를 주는 양으로 해석될 수 있음이 본원에서 또한 이해되어야 한다.
도 1은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(Fc 작제물 1, Fc 작제물 2, 또는 Fc 작제물 3)의 도해이다. 제1 폴리펩티드(102)는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(106)와 직렬로 접합된 야생형 Fc 도메인 단량체 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에 함유하는 하나의 Fc 도메인 단량체(104)를 함유한다. 제1 폴리펩티드(108)는 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(112)와 직렬로 접합된 야생형 Fc 도메인 단량체 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에 함유하는 하나의 Fc 도메인 단량체(110)를 함유한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 114 및 116)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다.
도 2는 3개의 폴리펩티드로 형성된 2개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(Fc 작제물 4)의 도해이다. 제1 폴리펩티드(202)는 상이한 하전 아미노산 및 돌출부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체(206)와 직렬연결로 접합된 야생형 Fc 도메인 단량체 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에 함유하는 하나의 Fc 도메인 단량체(204)를 함유한다. 제1 폴리펩티드(208)는 상이한 하전 아미노산 및 돌출부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체(212)와 직렬연결로 접합된 야생형 Fc 도메인 단량체 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에 함유하는 하나의 Fc 도메인 단량체(210)를 함유한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 214 및 216)는 상이한 하전 아미노산 및 함몰부를 함유하는 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다.
도 3은 LC-MS/MS에 의해 작제물 2 링커(SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))의 O-자일로실화(O-xylosylated) Ser의 식별을 보여준다.
도 4는 LC-MS/MS로 결정된 바, 2개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물(도 13에 나타낸 Fc 작제물)의 링커 O-자일로실화의 양을 보여준다.
도 5는 CE-SDS로 결정된 바, 45°C에서 저장 시 Fc 작제물 2와 4에서의 단량체 Fc 종의 형성을 보여준다.
도 6은 LC-MS로 결정된 바, 45°C에서 2주간 저장 시 Fc 작제물 2의 단백질 분해(proteolysis) 산물을 보여준다.
도 7은 LC-MS로 결정된 바, 45°C에서 2주간 저장 시 Fc 작제물 4의 단백질 분해 산물을 보여준다.
도 8은 다양한 링커 길이를 갖는 Fc 작제물 2로 THP-1 세포에 의한 IL-8 방출의 억제를 보여준다.
도 9는 다양한 링커 길이를 갖는 Fc 작제물 2로 중성구에서의 칼슘 유입의 억제를 보여준다.
도 10은 미정제 배지에서의 Fc 작제물 2 및 Fc 작제물 4의 비환원 SDS-PAGE에 의한 크기 분포를 보여준다.
도 11은 Fc 작제물 2("정전기 스티어링 있음")의 발현 및 조립 및 "줄기" 소단위체("정전기 스티어링 없음")에 정전기 스티어링 돌연변이가 없는 3개의 Fc 도메인을 갖는 또 다른 Fc 작제물을 보여준다.
도 12는 Fc 작제물 2를 생성하는 C-말단 라이신의 제거는 시험관내 보체 의존 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 유도하지 않는 것을 보여준다.
도 13은 3개의 폴리펩티드로 형성된 2개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 14는 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인(Fc5X)을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 15는 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인(Fc5Y)을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 16은 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인(Fc5Y-도치)을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 17은 2개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 18a는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 5)의 도해이다. 야생형 서열(각각 506 및 512)에 비해 제1 폴리펩티드(502)와 제2 폴리펩티드(508)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 504 및 510)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 514 및 516)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 함유한다. 제1 폴리펩티드(502) 및 제2 폴리펩티드(508)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 514 및 516)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (506) 및 (512)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (502) 및 (508)은 서열번호 62의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (514) 및 (516)은 서열번호 61의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18b는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 6)의 도해이다. 야생형 서열(각각 606 및 612)에 비해 제1 폴리펩티드(602)와 제2 폴리펩티드(608)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 604 및 610)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 614 및 616)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 포함한다. 제1 폴리펩티드(602) 및 제2 폴리펩티드(608)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 614 및 616)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (604, 610, 614, 및 616)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (602) 및 (608)은 서열번호 64의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (614) 및 (616)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18c는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 7)의 도해이다. 야생형 서열(각각 706 및 712)에 비해 제1 폴리펩티드(702)와 제2 폴리펩티드(708)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 704 및 710)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 714 및 716)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 포함한다. 제1 폴리펩티드(702) 및 제2 폴리펩티드(708)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 714 및 716)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (704, 706, 710, 712, 714, 및 716)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (702) 및 (708)은 서열번호 65의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (714) 및 (716)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18d는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 8)의 도해이다. 야생형 서열(각각 806 및 812)에 비해 제1 폴리펩티드(802)와 제2 폴리펩티드(808)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 804 및 810)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 814 및 816)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(802) 및 제2 폴리펩티드(808)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 814 및 816)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (806 및 812)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (802) 및 (808)은 서열번호 66의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (814) 및 (816)은 서열번호 61의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18e는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 9)의 도해이다. 야생형 서열(각각 906 및 912)에 비해 제1 폴리펩티드(902)와 제2 폴리펩티드(908)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 904 및 910)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 914 및 916)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(902) 및 제2 폴리펩티드(908)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 914 및 916)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (906) 및 (912)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A 및 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (902) 및 (908)은 서열번호 67의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (914) 및 (916)은 서열번호 61의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18f는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 10)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1006 및 1012)에 비해 제1 폴리펩티드(1002)와 제2 폴리펩티드(1008)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1004 및 1010)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1014 및 1016)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1002) 및 제2 폴리펩티드(1008)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1014 및 1016)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1006 및 1012)는 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1004, 1010, 1014 및 1016)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1002 및 1008)은 서열번호 68의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1014 및 1016)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18g는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 11)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1106 및 1112)에 비해 제1 폴리펩티드(1102)와 제2 폴리펩티드(1108)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1104 및 1110)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1114 및 1116)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1102) 및 제2 폴리펩티드(1108)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1114 및 1116)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1106 및 1112)는 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1104, 1110, 1114 및 1116)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1102및 1108)은 서열번호 69의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1114 및 1116)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18h는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 12)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1206 및 1212)에 비해 제1 폴리펩티드(1202)와 제2 폴리펩티드(1208)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1204 및 1210)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1214 및 1216)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1202) 및 제2 폴리펩티드(1208)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1214 및 1216)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1204, 1210, 1214, 및 1216)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (1202 및 1208)은 서열번호 71의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1214 및 1216)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18i는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 13)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1306 및 1312)에 비해 제1 폴리펩티드(1302)와 제2 폴리펩티드(1308)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1304 및 1310)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1314 및 1316)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1302) 및 제2 폴리펩티드(1308)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1314 및 1316)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1304, 1310, 1314, 및 1316)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1306 및 1132)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1302 및 1308)은 서열번호 72의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1314 및 1316)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18j는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 14)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1406 및 1412)에 비해 제1 폴리펩티드(1402)와 제2 폴리펩티드(1408)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1404 및 1410)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1414 및 1416)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1402) 및 제2 폴리펩티드(1408)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1414 및 1416)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1404, 1410, 1414, 및 1416)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P 및 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1402 및 1408)은 서열번호 74의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1414 및 1416)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18k는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 15)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1506 및 1512)에 비해 제1 폴리펩티드(1502)와 제2 폴리펩티드(1508)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1504 및 1510)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1514 및 1516)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1502) 및 제2 폴리펩티드(1508)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1514 및 1516)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1504, 1510, 1514, 및 1516)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1506 및 1512)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1502 및 1508)은 서열번호 75의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1514 및 1516)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18l은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 16)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1606 및 1612)에 비해 제1 폴리펩티드(1602)와 제2 폴리펩티드(1608)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1604 및 1610)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1614 및 1616)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1602) 및 제2 폴리펩티드(1608)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1614 및 1616)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1604, 1606, 1610, 1612, 1614, 및 1616)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (1602 및 1608)은 서열번호 76의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1614 및 1616)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18m은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 17)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1706 및 1712)에 비해 제1 폴리펩티드(1702)와 제2 폴리펩티드(1708)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1704 및 1710)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1714 및 1716)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1702) 및 제2 폴리펩티드(1708)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1714 및 1716)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1704, 1706, 1710, 1712, 1714, 및 1716)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1706 및 1712)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1702 및 1708)은 서열번호 77의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1714 및 1716)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18n은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 18)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1806 및 1812)에 비해 제1 폴리펩티드(1802)와 제2 폴리펩티드(1808)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1804 및 1810)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1814 및 1816)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1802) 및 제2 폴리펩티드(1808)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1814 및 1816)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1804, 1806, 1810, 1812, 1814, 및 1816)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1804, 1810, 1814, 및 1816)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1802 및 1808)은 서열번호 78의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1814 및 1816)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18o는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 19)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1906 및 1912)에 비해 제1 폴리펩티드(1902)와 제2 폴리펩티드(1908)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1904 및 1910)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1914 및 1916)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1902) 및 제2 폴리펩티드(1908)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1914 및 1916)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1904, 1906, 1910, 1912, 1914, 및 1916)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P 및 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1902 및 1908)은 서열번호 79의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1914 및 1916)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18p는 작제물 4, 작제물 5 및 작제물 7의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 19a는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRIIb에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 19b는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRI에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 19c는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRIIa에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 19d는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRIIIa에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 20은 pH 6.0에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 작제물 4, 작제물 7, 작제물 6, 작제물 16, 작제물 18 및 작제물 19의 FcRn에 대한 결합을 보여주는 그래프이다. 정규화된 최대 결합 수준은 FcRn에 결합하는 기능적 도메인의 수에 비례한다.
도 21은 마우스에서 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16 및 IVIg의 약동학을 비교하는 그래프이다.
도 22는 FcRn 결합이 감소된 (예를 들어 I253A 돌연변이를 갖는) 도메인의 수가 약동학에 미치는 영향을 평가하기 위해, 마우스에서 작제물 4, 작제물 5, 작제물 6 및 작제물 7의 약동학을 비교하는 그래프이다.
도 23은 마우스에서 작제물 20 (작제물 4), 작제물 16, 작제물 18 및 작제물 19의 약동학을 비교하는 그래프이다.
도 24는 THP-1 세포에서 IVIg, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16 및 작제물 18에 의해 유도된 식균작용의 억제를 비교하는 그래프이다.
도 25는 단핵구에서 pacific-blue로 표지된 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16 및 작제물 18에 의해 유도된 IL-8 방출의 억제를 비교하는 그래프이다.
도 26은 작제물 4, 작제물 5, 작제물 6, 작제물 7, 작제물 16, 작제물 18 및 작제물 19에 의해 유도된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)의 억제를 비교하는 그래프이다.
도 27은 콜라겐 항체-유도 관절염 (CAIA) 모델에서 다양한 농도의 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 효능을 12일차 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 28은 1일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 29는 -3일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 30은 -7일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 31은 -10일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 32는 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, 1일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 33은 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, -3일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 34는 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, -7일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 35는 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, -10일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 36은 피크 최대값으로 정규화된, 정제된 작제물 X1 (회색) 및 X2 (검정)의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일을 비교하는 그래프이다.
도 37은 정제된 작제물 X1 (우측), 정제된 구조체 X2 (중간) 및 분자량 표준 (우측)에 대한 비환원된 도데실 황산 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과의 이미지이다. 두 개의 작제물의 동일한 질량을 로딩하였다.
도 38은 FcRn 및 FcγRIIb 결합의 감소가 약동학에 미치는 영향을 평가하기 위한 작제물 X1(야생형 Fc 다량체)(검정 원, 실선) 및 작제물 X2(I253A/R292P 돌연변이를 갖는 Fc 다량체)(삼각형, 파선)의 약동학을 비교하는 그래프이다. 평균 및 평균 편차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 39는 시노몰구스 원숭이에서 10 mg/kg으로 투약된 작제물 6(원; 서열번호 64 및 63), 작제물 16(삼각형; 서열번호 76/70), 및 작제물 18(사각형; 서열번호 78 및 73)의 약동학을 보여주는 그래프이다. 작제물 4(역삼각형; 서열번호 49 및 48)은 20 mg/kg으로 시노몰구스 원숭이에게 투약하였다.
도 40은 시노몰구스 원숭이에서 30 mg/kg으로 투약된 작제물 6(회색 원; 서열번호 64 및 63), 작제물 16(삼각형; 서열번호 76/70), 및 작제물 18(역삼각형; 서열번호 78 및 73)의 약동학을 보여주는 그래프이다. 작제물 4(서열번호 49 및 48)를 20 mg/kg(사각형), 30 mg/kg(원) 및 50 mg/kg(삼각형)로 시노몰구스 원숭이에게 투약하였다.
도 2는 3개의 폴리펩티드로 형성된 2개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(Fc 작제물 4)의 도해이다. 제1 폴리펩티드(202)는 상이한 하전 아미노산 및 돌출부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체(206)와 직렬연결로 접합된 야생형 Fc 도메인 단량체 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에 함유하는 하나의 Fc 도메인 단량체(204)를 함유한다. 제1 폴리펩티드(208)는 상이한 하전 아미노산 및 돌출부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체(212)와 직렬연결로 접합된 야생형 Fc 도메인 단량체 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면에 함유하는 하나의 Fc 도메인 단량체(210)를 함유한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 214 및 216)는 상이한 하전 아미노산 및 함몰부를 함유하는 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다.
도 3은 LC-MS/MS에 의해 작제물 2 링커(SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))의 O-자일로실화(O-xylosylated) Ser의 식별을 보여준다.
도 4는 LC-MS/MS로 결정된 바, 2개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물(도 13에 나타낸 Fc 작제물)의 링커 O-자일로실화의 양을 보여준다.
도 5는 CE-SDS로 결정된 바, 45°C에서 저장 시 Fc 작제물 2와 4에서의 단량체 Fc 종의 형성을 보여준다.
도 6은 LC-MS로 결정된 바, 45°C에서 2주간 저장 시 Fc 작제물 2의 단백질 분해(proteolysis) 산물을 보여준다.
도 7은 LC-MS로 결정된 바, 45°C에서 2주간 저장 시 Fc 작제물 4의 단백질 분해 산물을 보여준다.
도 8은 다양한 링커 길이를 갖는 Fc 작제물 2로 THP-1 세포에 의한 IL-8 방출의 억제를 보여준다.
도 9는 다양한 링커 길이를 갖는 Fc 작제물 2로 중성구에서의 칼슘 유입의 억제를 보여준다.
도 10은 미정제 배지에서의 Fc 작제물 2 및 Fc 작제물 4의 비환원 SDS-PAGE에 의한 크기 분포를 보여준다.
도 11은 Fc 작제물 2("정전기 스티어링 있음")의 발현 및 조립 및 "줄기" 소단위체("정전기 스티어링 없음")에 정전기 스티어링 돌연변이가 없는 3개의 Fc 도메인을 갖는 또 다른 Fc 작제물을 보여준다.
도 12는 Fc 작제물 2를 생성하는 C-말단 라이신의 제거는 시험관내 보체 의존 세포독성(complement dependent cytotoxicity, CDC)을 유도하지 않는 것을 보여준다.
도 13은 3개의 폴리펩티드로 형성된 2개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 14는 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인(Fc5X)을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 15는 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인(Fc5Y)을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 16은 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인(Fc5Y-도치)을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 17은 2개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다.
도 18a는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 5)의 도해이다. 야생형 서열(각각 506 및 512)에 비해 제1 폴리펩티드(502)와 제2 폴리펩티드(508)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 504 및 510)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 514 및 516)는 각각 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 함유한다. 제1 폴리펩티드(502) 및 제2 폴리펩티드(508)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 514 및 516)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (506) 및 (512)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (502) 및 (508)은 서열번호 62의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (514) 및 (516)은 서열번호 61의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18b는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 6)의 도해이다. 야생형 서열(각각 606 및 612)에 비해 제1 폴리펩티드(602)와 제2 폴리펩티드(608)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 604 및 610)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 614 및 616)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 포함한다. 제1 폴리펩티드(602) 및 제2 폴리펩티드(608)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 614 및 616)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (604, 610, 614, 및 616)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (602) 및 (608)은 서열번호 64의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (614) 및 (616)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18c는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 7)의 도해이다. 야생형 서열(각각 706 및 712)에 비해 제1 폴리펩티드(702)와 제2 폴리펩티드(708)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 704 및 710)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 714 및 716)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 포함한다. 제1 폴리펩티드(702) 및 제2 폴리펩티드(708)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 714 및 716)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (704, 706, 710, 712, 714, 및 716)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (702) 및 (708)은 서열번호 65의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (714) 및 (716)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18d는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 8)의 도해이다. 야생형 서열(각각 806 및 812)에 비해 제1 폴리펩티드(802)와 제2 폴리펩티드(808)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 804 및 810)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 814 및 816)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(802) 및 제2 폴리펩티드(808)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 814 및 816)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (806 및 812)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (802) 및 (808)은 서열번호 66의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (814) 및 (816)은 서열번호 61의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18e는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 9)의 도해이다. 야생형 서열(각각 906 및 912)에 비해 제1 폴리펩티드(902)와 제2 폴리펩티드(908)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 904 및 910)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 914 및 916)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(902) 및 제2 폴리펩티드(908)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 914 및 916)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (906) 및 (912)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A 및 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (902) 및 (908)은 서열번호 67의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (914) 및 (916)은 서열번호 61의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18f는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 10)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1006 및 1012)에 비해 제1 폴리펩티드(1002)와 제2 폴리펩티드(1008)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1004 및 1010)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1014 및 1016)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1002) 및 제2 폴리펩티드(1008)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1014 및 1016)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1006 및 1012)는 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1004, 1010, 1014 및 1016)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1002 및 1008)은 서열번호 68의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1014 및 1016)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18g는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 11)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1106 및 1112)에 비해 제1 폴리펩티드(1102)와 제2 폴리펩티드(1108)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1104 및 1110)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1114 및 1116)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1102) 및 제2 폴리펩티드(1108)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1114 및 1116)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1106 및 1112)는 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1104, 1110, 1114 및 1116)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1102및 1108)은 서열번호 69의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1114 및 1116)은 서열번호 63의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18h는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 12)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1206 및 1212)에 비해 제1 폴리펩티드(1202)와 제2 폴리펩티드(1208)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1204 및 1210)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1214 및 1216)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1202) 및 제2 폴리펩티드(1208)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1214 및 1216)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1204, 1210, 1214, 및 1216)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (1202 및 1208)은 서열번호 71의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1214 및 1216)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18i는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 13)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1306 및 1312)에 비해 제1 폴리펩티드(1302)와 제2 폴리펩티드(1308)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1304 및 1310)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1314 및 1316)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1302) 및 제2 폴리펩티드(1308)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1314 및 1316)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1304, 1310, 1314, 및 1316)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1306 및 1132)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1302 및 1308)은 서열번호 72의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1314 및 1316)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18j는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 14)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1406 및 1412)에 비해 제1 폴리펩티드(1402)와 제2 폴리펩티드(1408)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1404 및 1410)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1414 및 1416)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1402) 및 제2 폴리펩티드(1408)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1414 및 1416)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1404, 1410, 1414, 및 1416)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P 및 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1402 및 1408)은 서열번호 74의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1414 및 1416)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18k는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 15)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1506 및 1512)에 비해 제1 폴리펩티드(1502)와 제2 폴리펩티드(1508)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1504 및 1510)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1514 및 1516)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1502) 및 제2 폴리펩티드(1508)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1514 및 1516)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1504, 1510, 1514, 및 1516)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1506 및 1512)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1502 및 1508)은 서열번호 75의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1514 및 1516)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18l은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 16)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1606 및 1612)에 비해 제1 폴리펩티드(1602)와 제2 폴리펩티드(1608)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1604 및 1610)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1614 및 1616)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1602) 및 제2 폴리펩티드(1608)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1614 및 1616)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1604, 1606, 1610, 1612, 1614, 및 1616)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함한다. (1602 및 1608)은 서열번호 76의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1614 및 1616)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18m은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 17)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1706 및 1712)에 비해 제1 폴리펩티드(1702)와 제2 폴리펩티드(1708)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1704 및 1710)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1714 및 1716)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1702) 및 제2 폴리펩티드(1708)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1714 및 1716)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1704, 1706, 1710, 1712, 1714, 및 1716)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1706 및 1712)는 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1702 및 1708)은 서열번호 77의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1714 및 1716)은 서열번호 70의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18n은 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 18)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1806 및 1812)에 비해 제1 폴리펩티드(1802)와 제2 폴리펩티드(1808)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1804 및 1810)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1814 및 1816)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1802) 및 제2 폴리펩티드(1808)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1814 및 1816)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1804, 1806, 1810, 1812, 1814, 및 1816)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P를 각각 포함하고, (1804, 1810, 1814, 및 1816)은 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1802 및 1808)은 서열번호 78의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1814 및 1816)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18o는 4개의 폴리펩티드로 형성된 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(작제물 19)의 도해이다. 야생형 서열(각각 1906 및 1912)에 비해 제1 폴리펩티드(1902)와 제2 폴리펩티드(1908)의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산을 함유하고 링커를 통해 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(각각 1904 및 1910)에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1914 및 1916)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드(1902) 및 제2 폴리펩티드(1908)의 각각은 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어 E357K를 또한 포함한다. 유사하게, 제3 및 제4 폴리펩티드(각각 1914 및 1916)는 정전기 스티어링 돌연변이, 예를 들어, K370D를 각각 포함한다. (1904, 1906, 1910, 1912, 1914, 및 1916)은 마름모로 표시되는 아미노산 변형 R292P 및 별표로 표시되는 아미노산 변형 I253A를 각각 포함한다. (1902 및 1908)은 서열번호 79의 아미노산 서열을 각각 갖는다. (1914 및 1916)은 서열번호 73의 아미노산 서열을 각각 갖는다.
도 18p는 작제물 4, 작제물 5 및 작제물 7의 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 19a는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRIIb에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 19b는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRI에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 19c는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRIIa에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 19d는 TR-FRET에 의한 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 FcγRIIIa에 대한 세포 결합을 보여주는 그래프이다(평균 ± 표준 편차는 3~8개의 복제물에 대해 표시됨).
도 20은 pH 6.0에서 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 작제물 4, 작제물 7, 작제물 6, 작제물 16, 작제물 18 및 작제물 19의 FcRn에 대한 결합을 보여주는 그래프이다. 정규화된 최대 결합 수준은 FcRn에 결합하는 기능적 도메인의 수에 비례한다.
도 21은 마우스에서 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16 및 IVIg의 약동학을 비교하는 그래프이다.
도 22는 FcRn 결합이 감소된 (예를 들어 I253A 돌연변이를 갖는) 도메인의 수가 약동학에 미치는 영향을 평가하기 위해, 마우스에서 작제물 4, 작제물 5, 작제물 6 및 작제물 7의 약동학을 비교하는 그래프이다.
도 23은 마우스에서 작제물 20 (작제물 4), 작제물 16, 작제물 18 및 작제물 19의 약동학을 비교하는 그래프이다.
도 24는 THP-1 세포에서 IVIg, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16 및 작제물 18에 의해 유도된 식균작용의 억제를 비교하는 그래프이다.
도 25는 단핵구에서 pacific-blue로 표지된 IgG1, 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16 및 작제물 18에 의해 유도된 IL-8 방출의 억제를 비교하는 그래프이다.
도 26은 작제물 4, 작제물 5, 작제물 6, 작제물 7, 작제물 16, 작제물 18 및 작제물 19에 의해 유도된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)의 억제를 비교하는 그래프이다.
도 27은 콜라겐 항체-유도 관절염 (CAIA) 모델에서 다양한 농도의 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 및 작제물 18의 효능을 12일차 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 28은 1일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 29는 -3일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 30은 -7일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 31은 -10일차에 작제물이 예방적으로 투여된 CAIA 모델에서 작제물 4 및 작제물 18의 효능을 임상 점수로 측정하여 비교하는 그래프이다.
도 32는 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, 1일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 33은 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, -3일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 34는 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, -7일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 35는 콜라겐 항체 유도 관절염(CAIA) 모델에서, -10일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)가 1일차에 투약되었다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 36은 피크 최대값으로 정규화된, 정제된 작제물 X1 (회색) 및 X2 (검정)의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일을 비교하는 그래프이다.
도 37은 정제된 작제물 X1 (우측), 정제된 구조체 X2 (중간) 및 분자량 표준 (우측)에 대한 비환원된 도데실 황산 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 결과의 이미지이다. 두 개의 작제물의 동일한 질량을 로딩하였다.
도 38은 FcRn 및 FcγRIIb 결합의 감소가 약동학에 미치는 영향을 평가하기 위한 작제물 X1(야생형 Fc 다량체)(검정 원, 실선) 및 작제물 X2(I253A/R292P 돌연변이를 갖는 Fc 다량체)(삼각형, 파선)의 약동학을 비교하는 그래프이다. 평균 및 평균 편차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
도 39는 시노몰구스 원숭이에서 10 mg/kg으로 투약된 작제물 6(원; 서열번호 64 및 63), 작제물 16(삼각형; 서열번호 76/70), 및 작제물 18(사각형; 서열번호 78 및 73)의 약동학을 보여주는 그래프이다. 작제물 4(역삼각형; 서열번호 49 및 48)은 20 mg/kg으로 시노몰구스 원숭이에게 투약하였다.
도 40은 시노몰구스 원숭이에서 30 mg/kg으로 투약된 작제물 6(회색 원; 서열번호 64 및 63), 작제물 16(삼각형; 서열번호 76/70), 및 작제물 18(역삼각형; 서열번호 78 및 73)의 약동학을 보여주는 그래프이다. 작제물 4(서열번호 49 및 48)를 20 mg/kg(사각형), 30 mg/kg(원) 및 50 mg/kg(삼각형)로 시노몰구스 원숭이에게 투약하였다.
IgG의 Fc 도메인을 포함하는 치료 단백질은 염증과 면역학적 질환 및 염증성 질환, 암 및 감염증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 개시는 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물(예컨대, 2~10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본원에 기술된 Fc 작제물은 제조 결과를 상당히 개선시키는 구조적 특징(예를 들어, 글리신 스페이서)을 혼입시킴으로써 동질인 약학 조성물의 제조를 용이하게 한다.
따라서, 본 개시는 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)의 실질적으로 동질인 집단을 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 동질성은 조성물의 약동학 및 생체내 성능에 영향을 미치는 약학 조성물의 중요한 측면이다. 전통적으로, 약학적 산물의 제조에 있어서, 산물을 어떻게 제조하느냐에 따라 몇몇 요인들에 의해 야기될 수 있는 산물 이질성의 문제가 존재한다. 예를 들어, 약학적 산물은 무작위 산물 절단, 단백질 분해, 분해, 및/또는 응집, 소단위체의 비표적 결합(off-target association), 및/또는 비효율적 단백질 접힘을 겪을 수 있다. 약학적 산물을 제조하는 데 사용되는 상이한 생합성 과정 또는 세포 기구를 갖는 상이한 유기체는 또한 산물에서 이질성을 일으킬 수 있다. 종종, 원하는 약학적 산물을 함유하는 초기 배양은 약학적 산물을 함유하는 조성물을 이질성이 적게 제조하기 위해 엄격한 정제 과정을 거칠 필요가 있다.
본 개시는 하나의 양태에서, Fc 작제물의 접힘 효율을 개선시키고 소단위체의 비표적 결합을 최소화함으로써 높은 동질성을 갖는 이들 Fc 작제물을 함유하는 약학 조성물을 가져오는 구조적 특징을 갖는 Fc 작제물을 특징으로 한다. 동질성의 정도가 높으면 약학 조성물의 안전성, 효험, 균일성 및 신뢰도를 보장한다. 동질성의 정도가 높으면 또한 원치 않는 물질(예컨대, 분해 산물 및/또는 응집 산물 또는 다량체)에 의해 야기되는 약학적 생산물의 잠재적인 응집 또는 분해를 최소화할 뿐만 아니라 원치 않는 물질에 의해 야기되는 비표적 및 부작용을 제한한다.
본원에 상세하게 기술된 바와 같이, 본 개시는 모두 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물뿐 아니라 이러한 실질적으로 동질인 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
본원에 기술된 Fc 작제물은 Fc 도메인 사이에 글리신 스페이서를 포함한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 세린 및 글리신 둘 다를 함유하는 링커는 단백질에 구조적 가요성을 제공하고 2개의 폴리펩티드를 접합하는 데 통상 사용된다. 세린 및 글리신 둘 다를 함유하는 링커가 링커의 다수의 세린에서 O-당화(예컨대, O-자일로실화) 및 세린의 N-말단 측에서 단백질 분해를 겪음을 실험을 통해(실시예 4 참조) 관찰하였다. Fc 작제물의 동질성을 더 개선시키기 위해 링커 서열 및 길이를 최적화하려고 하였다. 작제물 내의 모든 링커가 글리신(예를 들어, 적어도 12개의 글리신, 예를 들어, 12~30개의 글리신; 서열번호 27)만을 갖는 글리신 스페이서인 Fc 작제물을 만들었다. Fc 작제물에 전부 글리신인 스페이서를 갖는 것은 세린에서 O-당화를 제거하고 또한 작제물의 단백질 분해율을 감소시킴으로써 Fc 작제물의 동질성을 더 개선시켰다(실시예 4 참조). 따라서, Fc 작제물에 전부 글리신인 스페이서를 사용함으로써 Fc 작제물의 보다 실질적으로 동질인 집단을 달성할 수 있었다.
Fc 작제물 성분은 결과적으로 동질(homogeneity)이다. 예를 들어, 제1 접근법("접근법(a)")에서, Fc 도메인 단량체를 결합시키기 위해 글리신만을 함유하는 링커를 통합시키는 것을 이용할 수 있다. 실험을 통해 관찰한 바와 같이, Fc 작제물에 있는 전부-글리신인 스페이서(예컨대, 적어도 12개의 글리신, 예컨대, 12~30개의 글리신; 서열번호 27)는 O-당화를 겪지 않고 세린 및 글리신을 포함하는 전통적인 링커와 비교하여 단백질 분해에 덜 민감하다(실시예 4 참조).
게다가, 또 다른 접근법("접근법 (b)")에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 조성물의 동질성은 C-말단 라이신의 제거에 의해 개선된다. 이러한 C-말단 라이신 잔기는 많은 종에 걸쳐 면역글로불린에 고도로 보존되어 있고 단백질 생산 중에 세포 기구에 의해 완전히 또는 부분적으로 제거될 수 있다. 본 개시의 Fc 작제물에서 C-말단 라이신의 제거는 생성된 조성물의 균일성을 개선시키고 보다 동질인 Fc 작제물 제조를 달성한다(실시예 8 참조). 예를 들어, 본원에 개시된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)의 일부 구현예에서, C-말단 라이신의 코돈은 제거되어 C-말단 라이신 잔기가 없는 폴리펩티드를 가진 Fc 작제물을 생성하고 그 결과 동질인 집단이 생성된다.
본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 조성물의 동질성을 개선하기 위한 추가 접근법("접근법 (c)")은 두 세트의 이종이량체화 선택성 모듈((i) 상이한 역전하 돌연변이를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈 및 (ii) 유전자 조작 함몰부 및 돌출부를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈)을 이용하였다. Fc 작제물에서 이종이량체 Fc 도메인을 형성하고자 할 때, (i)과 (ii) 둘 다 Fc 도메인 단량체의 비제어(uncontrolled) 결합을 줄여서 바람직하지 않은 올리고머 및 다량체를 감소시킴으로써 제조된 약학 조성물의 동질성을 더 개선시켰음을 실험을 통해(예컨대 실시예 6 참조) 관찰하였다. 특정 실시예에서, (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부를 함유하는 Fc 도메인 단량체가 제조될 수 있고 (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다. 또 다른 실시예에서, 역전하 돌연변이 K370D 및 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 함유하는 Fc 도메인 단량체 및 역전하 돌연변이 E357K 및 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체가 제조될 수 있고 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
본원에 상세하게 기술된 바와 같이, 본 개시의 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 Fc 작제물의 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에 전부-글리신인 스페이서를 사용(접근법 (a)), Fc 작제물의 C-말단 라이신이 결여된 폴리펩티드를 사용(접근법 (b)), 및/또는 Fc 작제물의 일부 Fc 도메인 단량체에 의해 이종이량체 Fc 도메인 형성을 촉진하기 위해 두 세트의 이종이량체화 선택성 모듈((i) 상이한 역전하 돌연변이를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈 및 (ii) 유전자 조작 함몰부 및 돌출부를 갖는 이종이량체화 선택성 모듈)을 사용(접근법 (c))함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (a)를 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (b)를 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (c)를 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (a) 및 (b)의 조합을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (a) 및 (c)의 조합을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (b) 및 (c)의 조합을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 함유하는 실질적으로 동질인 조성물은 접근법 (a), (b) 및 (c)의 조합을 통해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물을 함유하는 약학 조성물의 동질성을 더 개선하기 위하여, 조성물의 Fc 작제물의 폴리펩티드 중 하나 이상의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. 본원에 기술된 Fc 작제물의 실질적으로 동질인 집단을 포함하는 조성물의 일부 구현예에서, 조성물의 Fc 작제물의 폴리펩티드 각각의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다.
또한, 본 개시의 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서, Fc 도메인 단량체를 접합하는 링커의 길이는 Fc 작제물의 접힘 효율에 영향을 끼친다. 일부 구현예에서, 적어도 4, 8, 또는 12개의 글리신(예컨대, 4~30개, 8~30개, 12~30개의 글리신; 서열번호 26 및 27)을 갖는 링커는 본 개시의 Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체를 접합하는 데 사용될 수 있다.
I. Fc 도메인 단량체
Fc 도메인 단량체는 힌지 도메인, CH2 항체 불변 도메인 및 CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인 단량체는 상이한 기원의 것, 예컨대, 인간, 마우스, 또는 랫트의 것일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 면역글로불린 항체 동종형 IgG, IgE, IgM, IgA, 또는 IgD일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 또한 임의의 면역글로불린 항체 동종형(예컨대, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 IgG4)일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 또한 예컨대, IgG1에서부터 힌지 및 CH2를 갖거나, IgA에서부터 CH3를 갖거나, IgG1에서부터 힌지 및 CH2를 갖지만 IgG3에서부터 CH3를 갖는 혼성체일 수 있다. Fc 도메인 단량체의 이량체는 백혈구의 표면에 위치된 수용체인, Fc 수용체, 예컨대, FcγRIIIa에 결합할 수 있는 (본원에서 추가로 정의된) Fc 도메인이다. 본 개시에서, Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인은 서로 결합을 촉진하기 위해 CH3-CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 N-말단 또는 C-말단에 부착된 추가 모이어티, 예컨대, 알부민-결합 펩티드 또는 정제 펩티드를 포함한다. 본 개시에서, Fc 도메인 단량체는 항체 가변 영역, 예컨대, VH, VL, 상보성 결정 영역(CDR), 또는 초가변 영역(HVR)의 임의의 유형을 함유하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 야생형 Fc 도메인 단량체(서열번호 42)의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예컨대, 치환, 예컨대, 보존적 치환)을 갖는 야생형 Fc 도메인 단량체(서열번호 42)인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열(실시예 1, 표 4 및 5 참조)과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예컨대, 치환, 예컨대, 보존적 치환)을 갖는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열(실시예 1, 표 4 및 5 참조)인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 경우에, 이들 아미노산 변형은 글리신 스페이서의 길이의 변경에 추가되는 것, 즉, 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1)의 단일 아미노산 변형은 모든 글리신 스페이서(서열번호:23)의 길이의 변경에 추가되는 것이다. 특정 구현예에서, Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 48, 52, 및 53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한(예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예: 치환, 예: 보존적 치환)을 갖는 서열번호 48, 52, 및 53 중 어느 하나인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
서열 번호 42: 야생형 인간 IgG1 Fc 도메인 단량체 아미노산 서열
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서열 번호 44
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서열 번호 46
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열 번호 48
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서열 번호 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 51
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열 번호 52
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
서열 번호 53
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
II. Fc 도메인
본원에 정의된 바와 같이, Fc 도메인은 CH3 항체 불변 도메인 사이의 상호 작용으로 이량체화된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 본 개시에서, Fc 도메인은 항체, 예컨대, VH, VL, CDR, 또는 HVR의 가변 영역을 포함하지 않는다. Fc 도메인은 Fc 수용체, 예컨대, Fc-감마 수용체(즉, Fcγ 수용체(FcγR)), Fc-알파 수용체(즉, Fcα 수용체(FcαR)), Fc-엡실론 수용체(즉, Fcε 수용체 (FcεR)), 및/또는 신생아의 Fc 수용체(FcRn)에 결합하는 최소 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 Fc 도메인은 Fcγ 수용체(예컨대, FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32), FcγRIIb(CD32), FcγRIIIa(CD16a) 및/또는 FcγRIIIb(CD16b)) 및/또는 FcγRIV 및/또는 신생아의 Fc 수용체(FcRn)에 결합한다.
III. Fc 도메인 변형
비변형 Fc 도메인 단량체는 자연 발생 인간 Fc 도메인 단량체 또는 WT 인간 Fc 도메인 단량체일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 자연 발생 인간 Fc 도메인 단량체; 또는 유도된 이량체화를 수용하거나 촉진하는 최대 16개(예컨대, 최대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개)의 아미노산 변형(예컨대, 단일 아미노산 변형)을 가지는 이의 변이체일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 IgG1 Fc 도메인, IgG2 Fc 도메인, IgG3 Fc 도메인, IgG4 Fc 도메인, 또는 이들의 조합일 수 있다. Fc 도메인 단량체는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 IgG1 Fc 도메인, IgG2 Fc 도메인, IgG3 Fc 도메인, IgG4 Fc 도메인, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, Fc 도메인 단량체는 최대 10개의 아미노산 변형(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 이하의 아미노산 변형)을 갖는 인간 IgG Fc 도메인 단량체이다. 일부 경우에, Fc 도메인 단량체는 10개 이하의 아미노산 변형(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 이하의 아미노산 변형)을 갖는 서열번호 42의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 경우에, Fc 도메인은 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하되, 아미노산 변형은 (예컨대, 비변형 Fc 도메인과 비교했을 때) (i) 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합 친화도, (ii) 효과기 기능, (iii) Fc 도메인 황산화의 수준, (iv) 반감기, (v) 프로테아제 저항성, (vi) Fc 도메인 안정성, 및/또는 (vii) 분해에 대한 감수성 중 하나 이상을 변경한다. 일부 경우에, Fc 도메인은 16개 이하의 아미노산 변형(예컨대, CH3 도메인에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 이하의 아미노산 변형)을 포함한다.
본 개시의 Fc 작제물의 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253(예를 들어, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 또는 I253Y)에서 및/또는 위치 R292(예를 들어, R292P, R292D, R292E, R292L, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y)에서 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 I253에서, I253A와 같은 아미노산 변형을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 Fc 도메인은 위치 R292에서, R292P와 같은 아미노산 변형을 포함한다. Fc 도메인은 위치 I253에서의 아미노산 변형(예를 들어, I253A) 및 위치 R292에서의 아미노산 변형(예를 들어, R292P) 둘 다를 포함할 수 있다. 예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물은 1, 2개 또는 3개의 Fc 도메인에서의 위치 I253에서 아미노산 변형(예를 들어, I253A)을 포함할 수 있고, 추가적으로 또는 대안적으로 1개, 2개 또는 3개의 Fc 도메인에서의 위치 R292 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, R292P)을 포함할 수 있다. I253A 및/또는 R292P 아미노산 변형을 갖는 예시적인 Fc 작제물이 도 2 및 도 18b 내지 도 18o에 도시되어 있다.
일부 구현예에서, 반감기를 변경하는 Fc 도메인 변형은, 예를 들어, 위치 I253에서 Fc 도메인을 변형시킴으로써 FcRn에 대한 변형된 Fc 도메인의 결합을 감소시킬 수 있다. 위치 I253에서의 변형은 아미노산 치환(위치 I253에서 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산으로 치환됨); 위치 I253에서의 아미노산의 결실; 또는 Fc 도메인의 위치 I253에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 아미노산 변형 I253은 (예를 들어, R292와 같은 다른 잔기 위치에서의) 다수의 변형의 조합, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입의 조합의 일부일 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물은, 예를 들어, 적어도 하나의 Fc 도메인이 I253에서 변형을 포함하는 3개의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 위치 I253에서의 야생형 아미노산 잔기, 예를 들어, 이소류신(I)은 천연 또는 비-천연 아미노산, 예를 들어, 알라닌(A)과 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 위치 I253에서의 각각의 아미노산 변형은, 예를 들어, I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W, 및 I253Y로부터 독립적으로 선택된다.
다른 구현예에서, 반감기를 변경시키는 Fc 도메인 변형은, 예를 들어, 위치 R292에서의 Fc 도메인의 변형에 의해 FcγRIIb에 대한 변형된 Fc 도메인의 결합을 변경시킬 수 있다. 위치 R292에서의 변형은 아미노산 치환(위치 R292에서의 아미노산은 천연 또는 비-천연 아미노산으로 치환됨); 위치 R292에서의 아미노산의 결실; 또는 Fc 도메인의 위치 R292에서의 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 아미노산 292의 변형은 다수의 변형(예를 들어, I253과 같은 다른 잔기 위치에서의 변형)의 조합, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입의 조합의 일부일 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물은, 예를 들어, 적어도 하나의 Fc 도메인이 R292에서 변형을 포함하는 3개의 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 위치 292에서의 야생형 아미노산 잔기, 예를 들어, 아르기닌(R)은 천연 또는 비-천연 아미노산, 예를 들어, 프롤린(P)으로 치환될 수 있다. 일부 구현예에서, 위치 R292에서의 각각의 아미노산 변형은, 예를 들어, R292P, R292D, R292E, R292L, R292Q, R292R, R292T, 및 R292Y로부터 독립적으로 선택된다.
Fc 수용체에 대한 변경된 결합 친화도를 갖는 예시적인 Fc 도메인은 이중 돌연변이 S267E/L328F를 함유하는 Fc 단량체를 포함한다. S267E/L328F 돌연변이는 FcγRIIb 수용체에 대한 IgG1 결합을 유의미하게 그리고 특이적으로 증가시킴을 이전에 보였다(Chu 등의 Molecular Immunology 45 2008 참조).
위치 I253에서, 예를 들어, 반감기를 변경시키기 위한 아미노산 변형(예: I253A)은 작제물 4와 같은 Fc 작제물의 적어도 하나(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 Fc 도메인에서 발생할 수 있다(도 2). 다른 구현예에서, 위치 R292에서의 아미노산 변형(예: R292P)은 작제물 4와 같은 Fc 작제물의 적어도 하나(예컨대, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 Fc 도메인에서 발생할 수 있다(도 2). 일부 구현예에서, 예를 들어, 아미노산 변형은 위치 I253(예: I253A) 및 R292(예: R292P) 둘 다에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 작제물 4와 같은 Fc 작제물은(도 2), I253에서 아미노산 변형(예: I253A)을 갖는 하나의 Fc 도메인을 함유할 수 있고, R292에서 아미노산 변형(예: R292P)을 갖는 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2 또는 3개의) Fc 도메인을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 작제물 4와 같은 Fc 작제물은(도 2), I253에서 아미노산 변형(예: I253A)을 갖는 2개의 Fc 도메인을 함유할 수 있고, R292에서 아미노산 변형(예: R292P)을 갖는 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2 또는 3개의) Fc 도메인을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 작제물 4와 같은 Fc 작제물은, I253에서 아미노산 변형(예: I293A)을 갖는 3개의 Fc 도메인을 함유할 수 있고, R292에서 아미노산 변형(예: R292P)을 갖는 적어도 하나의 (예를 들어, 1, 2 또는 3개의) Fc 도메인을 함유할 수 있다. 아미노산 위치 I253A 및/또는 R292에서 변형(예를 들어, 각각 I293A 및/또는 R292P)을 갖는 예시적인 Fc 작제물이 도 18a~18o에 도시되어 있다. 도 18a~18o에 도시되지 않았지만, 본 개시에 의해 고려되는 작제물은, Fc 도메인을 구성하는 Fc 도메인 단량체 내에서, 예를 들어, 아미노산 위치 I253 및/또는 R292에서의 아미노산 변형의 이종성 조합을 갖는 Fc 작제물이다.
IV. 이량체화 선택성 모듈
본 개시에서, 이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 도메인 단량체의 바람직한 짝짓기를 용이하게 하는 Fc 도메인 단량체의 부분이다. 상세하게는, 이량체화 선택성 모듈은 2개의 Fc 도메인 단량체의 상호 작용하는 CH3 항체 불변 도메인의 계면에 위치된 아미노산 치환을 포함하는 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 부분이다. 이량체화 선택성 모듈에서, 아미노산 치환은 이들 치환을 위해 선택된 아미노산의 양립성의 결과로서 2개의 CH3 항체 불변 도메인의 단량체화를 양호하게 한다. 유리한 Fc 도메인의 최종 형성은 이량체화 선택성 모듈이 결여되거나 이량체화 선택성 모듈내의 비양립성 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인 단량체로 형성되는 다른 Fc 도메인에 대해 선택적이다. 아미노산 치환의 이러한 유형은 QuikChange® 돌연변이 유발과 같이 당업계에 잘 알려진 통상적인 분자 클로닝 기술을 사용하여 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈은 CH3 항체 불변 도메인의 (본원에서 추가로 기술되는) 유전자 조작 함몰부를 포함한다. 다른 구현예에서, 이량체화 선택성 모듈 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 (본원에서 추가로 기술되는) 돌출부를 포함한다. 선택적으로 Fc 도메인을 형성하기 위하여, 양립 가능한 이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체, 예컨대, 유전자 조작 함몰부를 함유하는 하나의 CH3 항체 불변 도메인 및 유전자 조작 돌출부를 함유하는 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인은 결합하여 Fc 도메인 단량체의 돌출부-함몰부 쌍을 형성한다. 유전자 조작 돌출부 및 유전자 조작 함몰부는 양립 가능한 이종이량체화 선택성 모듈을 갖는 2개의 Fc 도메인 단량체의 양호한 이종이량체화를 촉진하기 위해 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에서 이루어질 수 있는 이종이량체화 선택성 모듈의 예이다.
다른 구현예에서, 양하전 아미노산 치환을 함유하는 이량체화 선택성 모듈을 갖는 Fc 도메인 단량체 및 음하전 아미노산 치환을 함유하는 이량체화 선택성 모듈을 갖는 Fc 도메인 단량체는 (본원에서 추가로 기술되는) 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링(정전기 스티어링)을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나를 포함할 수 있다: K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, 및 K439E. 하나의 실시예에서, 양하전 아미노산 치환, 예컨대, D356K 또는 E357K를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 음하전 아미노산 치환, 예컨대, K370D 또는 K370E를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, E357K를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 K370D를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 역전하 아미노산 치환은 이종이량체화 선택성 모듈로 사용될 수 있되, 상이하지만 양립 가능한 역전하 아미노산 치환을 함유하는 2개의 Fc 도메인 단량체는 결합하여 이종이량체 Fc 도메인을 형성한다. 특이적 이량체화 선택성 모듈은 아래에서 더 기술되는 표 1 및 2A에 제한 없이, 추가로 열거되어 있다.
다른 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 잔기 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 동일한 역전하 돌연변이를 함유하는 동종이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 동종이량체화 선택성 모듈은 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화를 촉진하여 동종이량체 Fc 도메인을 형성하는 역전하 아미노산 치환이다. 2개의 Fc 도메인 단량체 잔기의 둘 이상의 상보적인 쌍의 두 구성원의 전하를 서로 바꿈으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이 서열의 Fc 도메인 단량체에 상보적으로 남아있지만, 이들 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 더 낮은 상보성을 갖는다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이 K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D, 또는 D356K/K439E를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이, 예컨대, K409D/D399K/E357K/K370E의 임의의 쌍을 결합하는 4중 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 동종이량체화 선택성 모듈의 예는 표 2b 및 표 2c에 추가로 나타낸다.
추가 구현예에서, (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 예를 들어, 역전하 돌연변이 K370D 및 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 역전하 돌연변이 E357K 및 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체는 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
이러한 Fc 도메인의 형성은 CH3 항체 불변 도메인의 양립 가능한 아미노산 치환에 의해 촉진된다. 양립 불가능한 아미노산 치환을 함유하는 2개의 이량체화 선택성 모듈, 예컨대, CH3-CH3 계면에서 유전자 조작 함몰부를 함유하는 둘 모두, 유전자 조작 돌출부를 함유하는 둘 모두, 또는 동일한 하전 아미노산을 함유하는 둘 모두는 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하지 않을 것이다.
또한, 정의된 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인의 형성을 촉진하는 데 사용된 다른 방법은 제한 없이, 이종이량체를 형성하도록 류신 지퍼(zipper)의 단량체 α-헬릭스의 C-말단 융합을 Fc 도메인 단량체 각각에 포함하는 LUZ-Y 접근법(미국 특허 출원 공개 번호 제WO2011034605호)뿐 아니라, IgA 및 IgG CH3 서열의 교차 조각을 각각 포함하는 이종이량체 Fc 도메인 단량체를 갖는 Fc 도메인을 생성하는 가닥-교환 조작된 도메인(SEED) 바디 접근법(Davis et al., Protein Eng Des Sel. 23:195-202, 2010)을 포함한다.
V. 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부
유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부(또는 "노브-인투-홀(knob-into-hole)" 전략)는 Carter 및 동료 연구자들에 의해 기술되었다(Ridgway 등의 Protein Eng. 9:617-612, 1996; Atwell 등의 J Mol Biol. 270:26-35, 1997; Merchant 등의 Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998 참조). 노브와 홀의 상호작용은 이종이량체 형성을 용이하게 하되, 노브-노브와 홀-홀 상호작용은 입체적 충돌 및 양호한 상호작용의 결실로 인해 동종이량체 형성을 저해한다. "노브-인투-홀" 기술은 미국 특허 번호 제5,731,168호에도 개시되어 있다.
본 개시에서, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부 본원에 기술된 Fc 작제물의 제조에 사용된다. 유전자 조작 함몰부는 단백질의 원래의 아미노산이 더 작은 측쇄 체적을 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 빈 공간이다. 유전자 조작 돌출부는 단백질의 원래의 아미노산이 더 큰 측쇄 체적을 갖는 상이한 아미노산으로 대체될 때 생성되는 융기이다. 상세하게는, 대체된 아미노산은 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인에 있고 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화에 관여한다. 일부 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 돌출부를 수용하도록 생성되어, CH3 항체 불변 도메인 둘 모두는 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 촉진하거나 용이하게 하는 (상술한) 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)로서 작용하게 된다. 다른 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 함몰부는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산을 더 잘 수용하도록 생성된다. 또 다른 구현예에서, 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 유전자 조작 돌출부는 또 다른 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산과 추가 상호작용을 형성하도록 생성된다.
유전자 조작 함몰부는 타이로신 또는 트립토판과 같은 더 큰 측쇄를 함유하는 아미노산을 알라닌, 발린, 또는 트레오닌과 같은 더 작은 측쇄를 함유하는 아미노산으로 치환함으로써 구성될 수 있다. 상세하게는, (상기에 추가로 기술된) 일부 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)은 CH3 항체 불변 도메인에 Y407V 돌연변이와 같은 유전자 조작 함몰부를 함유한다. 이와 유사하게, 유전자 조작 돌출부는 더 작은 측쇄를 함유하는 아미노산을 더 큰 측쇄를 함유하는 아미노산으로 치환함으로써 구성될 수 있다. 상세하게는, (상기에 추가로 기술된) 일부 이량체화 선택성 모듈(예컨대, 이종이량체화 선택성 모듈)은 CH3 항체 불변 도메인에 T366W 돌연변이와 같은 유전자 조작 돌출부를 함유한다. 본 개시에서, 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부는 또한 이종이량체 형성을 강화하기 위해 CH3 도메인간 이황화 결합 조작과 결합된다. 하나의 실시예에서, 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 유전자 조작 함몰부 Y349C를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 유전자 조작 돌출부 S354C를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 다른 유전자 조작 함몰부 및 유전자 조작 돌출부, 이황화 결합 조작 또는 구조 계산(혼합 HA-TF)과 함께 제한 없이 표 1에 포함된다.
| 전략 | Fc 도메인 단량체 1의 CH 3 항체 불변 도메인 | Fc 도메인 단량체 2의 CH 3 항체 불변 도메인 | 참고 문헌 |
| 조작된 함몰부 및 돌출부("노브-인투-홀") | Y407T | T366Y | 미국 특허 제8,216,805호 |
| Y407A | T366W | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| F405A | T394W | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| Y407T | T366Y | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| T394S | F405W | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| T394W:Y407T | T366Y:F405A | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| T394S:Y407A | T366W:F405W | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| T366W:T394S | F405W:Y407A | 미국 특허 제8,216,805호 | |
| 조작된 함몰부 및 돌출부("노브-인투-홀"), S-S 조작 | T366S:L368A:Y407V:Y349C | T366W:S354C | Zeidler 등의, J immunol. 163:1246-52, 1999 |
| 혼합 HA-TF | S346H:F405A | Y349T:T394F | WO2006106905 |
상이한 아미노산 잔기를 갖는 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산 잔기를 치환하는 것은 원래의 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산을 변경함으로써 달성될 수 있다. 치환될 수 있는 원래의 아미노산 잔기 수의 상한은 계면에서의 충분한 상호작용이 여전히 유지되는 것을 고려하면 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서의 잔기의 총 수이다. 일부 경우에, CH3 항체 불변 도메인은 16개 이하의 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16개 이하의) 단일 아미노산 변형을 가진다.
VI. 정전기 스티어링
정전기 스티어링은 보다 고도로 정렬된 단백질 분자의 형성을 조절하기 위해 펩티드, 단백질 도메인, 및 단백질의 반대로 하전된 아미노산 사이의 유리한 정전기 상호작용의 이용이다. 이중-특이적 항체의 생성에서 이종이량체 형성을 위하여 동종이량체의 형성을 감소시키는 항체 도메인의 상호작용을 변경하는 정전기 스티어링 효과를 이용하는 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 제2014-0024111호에 개시되어 있다.
본 개시에서, 정전기 스티어링은 Fc 도메인 단량체의 이량체화 및 Fc 작제물의 형성을 조절하는 데 사용된다. 특히, 정전기 스티어링을 사용하는 Fc 도메인 단량체의 이량체화를 조절하기 위하여, CH3-CH3 계면을 구성하는 하나 이상의 아미노산 잔기는 양하전 또는 음하전 아미노산 잔기로 치환되어 도입된 특정 하전 아미노산에 따라 상호작용은 유리하거나 불리하게 된다. 일부 구현예에서, 계면의 양하전 아미노산, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 또는 히스티딘은 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 음하전 아미노산으로 치환된다. 다른 구현예에서, 계면의 음하전 아미노산은 양하전 아미노산으로 치환된다. 하전 아미노산은 상호작용 CH3 항체 불변 도메인 중 하나, 또는 둘 다에 도입될 수 있다. 하전 아미노산을 상호작용 CH3 항체 불변 도메인에 도입함으로써, 하전 아미노산 사이의 상호작용으로 발생한 정전기 스티어링 효과에 의해 조절되는 Fc 도메인 단량체의 이량체를 선택적으로 형성할 수 있는 (상기에서 추가로 기술된) 이량체화 선택성 모듈이 생성된다.
일부 구현예에서, 정전기 스티어링 효과에 의해 제어되어 Fc 도메인 단량체의 이량체를 선택적으로 형성할 수 있는 역전하를 포함하는 이량체화 선택성 모듈을 생성하기 위해, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이종이량체화 또는 동종이량체화를 통해 선택적으로 형성될 수 있다.
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화
Fc 도메인 단량체의 이종이량체화는 제한 없이 표 2a에 포함된 전하 잔기 쌍과 같이 2개의 Fc 도메인 단량체에 상이하지만 양립 가능한 돌연변이를 도입함으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체는 다음의 양하전 및 음하전 아미노산 치환 중 하나를 포함할 수 있다: D356K, D356R, E357K, E357R, K370D, K370E, K392D, K392E, D399K, K409D, K409E, K439D, 및 K439E. 하나의 실시예에서, 양하전 아미노산 치환, 예컨대, D356K 또는 E357K를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 음하전 아미노산 치환, 예컨대, K370D 또는 K370E를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 또 다른 실시예에서, E357K를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 K370D를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 하전 아미노산의 유리한 정전기 스티어링을 통해 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서, 3개의 Fc 도메인 중 2개는 정전기 스티어링 효과에 의해 촉진되어 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성될 수 있다. "이종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체의 이종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 이들 2개의 Fc 도메인 단량체의 양호한 형성을 촉진하는 상이한 역전하 돌연변이(이종이량체화 선택성 모듈)(예컨대, 표 2a의 돌연변이 참조)를 함유한다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 3개의 Fc 도메인(하나의 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "가지" Fc 도메인)을 갖는 Fc 작제물에서, 아미노 말단 "가지" Fc 도메인 각각은 이종이량체 Fc 도메인("가지 이종이량체 Fc 도메인"이라고도 불림)(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(106 및 114) 또는 Fc 도메인 단량체(112 및 116)에 의해 형성된 이종이량체 Fc 도메인; 도 2의 Fc 도메인 단량체(206 및 214) 또는 Fc 도메인 단량체(212 및 216)에 의해 형성된 이종이량체 Fc 도메인)일 수 있다. 가지 이종이량체 Fc 도메인은 E357K를 함유하는 Fc 도메인 단량체 및 K370D를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체에 의해 형성될 수 있다.
[표 2a]
Fc 도메인 단량체의 동종이량체화
Fc 도메인 단량체의 동종이량체화는 동일한 정전기 스티어링 돌연변이(동종이량체화 선택성 모듈)를 Fc 도메인 단량체 둘 다에 대칭적인 방식으로 도입함으로써 촉진될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체는 잔기 CH3 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 동일한 역전하 돌연변이를 함유하는 동종이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 2개의 Fc 도메인 단량체 잔기의 둘 이상의 상보적인 쌍의 두 구성원의 전하를 서로 바꿈으로써, 돌연변이된 Fc 도메인 단량체는 동일한 돌연변이 서열의 Fc 도메인 단량체에 상보적으로 남아있지만, 이들 돌연변이가 없는 Fc 도메인 단량체에 더 낮은 상보성을 갖는다. Fc 도메인 단량체 내에 도입되어 이의 동종이량체화를 촉진할 수 있는 정전기 스티어링 돌연변이는 제한 없이 표 2b 및 2c에 나타낸다. 하나의 구현예에서, Fc 도메인은 이중 역전하 돌연변이(표 2b), 예컨대, K409D/D399K를 각각 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 사중 역전하 돌연변이(표 2c), 예컨대, K409D/D399K/K370D/E357K를 각각 포함하는 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함한다.
예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서, 3개의 Fc 도메인 중 1개는 정전기 스티어링 효과에 의해 촉진되어 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성될 수 있다. "동종이량체 Fc 도메인"은 2개의 Fc 도메인 단량체의 동종이량체화에 의해 형성되는 Fc 도메인을 지칭하되, 2개의 Fc 도메인 단량체는 동일한 역전하 돌연변이(예컨대, 표 2b 및 표 2c의 돌연변이 참조)를 함유한다. 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 3개의 Fc 도메인(하나의 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인 및 2개의 아미노 말단 "가지" Fc 도메인)을 갖는 Fc 작제물에서, 카복시 말단 "줄기" Fc 도메인은 동종이량체 Fc 도메인("줄기 동종이량체 Fc 도메인"이라고도 불림)(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(104 및 110)에 의해 형성된 동종이량체 Fc 도메인; 도 2의 Fc 도메인 단량체(204 및 210)에 의해 형성된 동종이량체 Fc 도메인)일 수 있다. 줄기 동종이량체 Fc 도메인은 이중 돌연변이 K409D/D399K를 각각 함유하는 2개의 Fc 도메인 단량체에 의해 형성될 수 있다.
[표 2b]
[표 2c]
상이한 아미노산 잔기를 갖는 CH3 항체 불변 도메인의 원래의 아미노산 잔기를 치환하는 것은 원래의 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산을 변경함으로써 달성될 수 있다. 치환될 수 있는 원래의 아미노산 잔기 수의 상한은 계면에서의 충분한 상호작용이 여전히 유지되는 것을 고려하면 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서의 잔기의 총 수이다. 일부 경우에, CH3 항체 불변 도메인은 16개 이하의 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16개 이하의) 단일 아미노산 변형을 가진다.
VII. 링커
본 개시에서, 링커는 폴리펩티드 또는 단백질 도메인 및/또는 결합된 비단백질 모이어티 사이의 결합 또는 연결을 기술하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 링커는 적어도 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 결합 또는 연결이고, 링커는 제1 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 제2 Fc 도메인 단량체의 힌지 도메인의 N-말단에 연결하여, 2개의 Fc 도메인 단량체가 직렬연결로 서로 접합된다. 다른 구현예에서, 링커는 Fc 도메인 단량체와 그에 부착되는 임의의 다른 단백질 도메인 사이의 결합이다. 예를 들어, 링커는 Fc 도메인 단량체의 CH3 항체 불변 도메인의 C-말단을 알부민-결합 펩티드의 N-말단에 부착시킬 수 있다.
링커는 펩티드 결합과 같은 단순 공유 결합, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체와 같은 합성 중합체이거나, 화학적 접합과 같이 화학 반응으로 생성된 임의의 종류의 결합일 수 있다. 링커가 펩티드 결합인 경우, 하나의 단백질 도메인의 C-말단의 카복실산기는 펩티드 결합을 형성하는 축합 반응에서 또 다른 단백질 도메인의 N-말단에서 아미노기와 반응할 수 있다. 상세하게는, 펩티드 결합은 당업계에 잘 알려진 통상적인 유기 화학 반응을 통한 합성 수단으로 형성될 수 있거나 숙주 세포에서 천연 생성하여 형성될 수 있되, 단백질 둘 다의 DNA 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대, 직렬 연결인 2개의 Fc 도메인 단량체는 필수 분자 기구, 예컨대, 숙주 세포의 DNA 중합효소 및 리보솜에 의해 단백질 둘 다를 인코딩하는 인접 폴리펩티드로 직접 전사 및 번역될 수 있다.
링커가 합성 중합체, 예컨대, PEG 중합체인 경우, 중합체는 2개의 단백질의 연결 단부의 말단 아미노산과 반응하는 각각의 단부의 반응성 화학 작용기로 기능화될 수 있다.
(상술한 펩티드 결합을 제외하고) 링커가 화학 반응으로 만들어지는 경우, 화학 작용기, 예컨대, 아민, 카복실산, 에스테르, 아지드, 또는 당업계에서 통상 사용되는 기타 작용기는 하나의 단백질의 C-말단 및 또 다른 단백질의 N-말단에 각각 합성되어 부착될 수 있다. 이어서 2개의 작용기는 합성 화학 수단을 통해 반응하여 화학 결합을 형성하여, 2개의 단백질을 함께 연결할 수 있다. 이러한 화학적 접합 절차는 당업자에게 통상적인 것이다.
스페이서
본 개시에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 3~200개의 아미노산(예컨대, 3~200개, 3~180개, 3~160개, 3~140개, 3~120개, 3~100개, 3~90개, 3~80개, 3~70개, 3~60개, 3~50개, 3~45개, 3~40개, 3~35개, 3~30개, 3~25개, 3~20개, 3~15개, 3~10개, 3~9개, 3~8개, 3~7개, 3~6개, 3~5개, 3~4개, 4~200개, 5~200개, 6~200개, 7~200개, 8~200개, 9~200개, 10~200개, 15~200개, 20~200개, 25~200개, 30~200개, 35~200개, 40~200개, 45~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 또는 180~200개의 아미노산)(예컨대, 3~150개, 3~100개, 3~60개, 3~50개, 3~40개, 3~30개, 3~20개, 3~10개, 3~8개, 3~5개, 4~30개, 5~30개, 6~30개, 8~30개, 10~20개, 10~30개, 12~30개, 14~30개, 20~30개, 15~25개, 15~30개, 18~22개, 및 20~30개의 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서일 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 적어도12개의 아미노산, 예컨대 12~200개의 아미노산(예컨대, 12~200개, 12~180개, 12~160개, 12~140개, 12~120개, 12~100개, 12~90개, 12~80개, 12~70개, 12~60개, 12~50개, 12~40개, 12~30개, 12~20개, 12~19개, 12~18개, 12~17개, 12~16개, 12~15개, 12~14개, 또는 12~13개의 아미노산) (예컨대, 14~200개, 16~200개, 18~200개, 20~200개, 30~200개, 40~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 180~200개, 또는 190~200개의 아미노산)을 함유하는 아미노산 스페이서이다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 링커는 12~30개의 아미노산(예컨대, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 아미노산)을 함유하는 아미노산 스페이서이다. 적합한 펩티드 스페이서는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 글리신 및 세린과 같은 가요성 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 포함한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 모티프, 예컨대, GS, GGS, GGGGS(서열 번호 1), GGSG(서열 번호 2), 또는 SGGG(서열 번호 3)의 다중 모티프 또는 반복 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GS, 예컨대, GS, GSGS(서열 번호 4), GSGSGS(서열 번호 5), GSGSGSGS(서열 번호 6), GSGSGSGSGS(서열 번호 7), 또는 GSGSGSGSGSGS(서열 번호 8)의 모티프를 포함하는 2 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 특정 다른 구현예에서, 스페이서는 GGS, 예컨대, GGS, GGSGGS(서열 번호 9), GGSGGSGGS(서열 번호 10), 및 GGSGGSGGSGGS(서열 번호 11)의 모티프를 포함하는 3 내지 12개의 아미노산을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 스페이서는 GGSG(서열번호 2), 예컨대, GGSGGGSG(서열번호 12), GGSGGGSGGGSG(서열번호 13), GGSGGGSGGGSGGGSG(서열번호 14), 또는 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(서열번호 15)의 모티프를 포함하는 4 내지 20개의 아미노산을 함유할 수 있다. 다른 구현예에서, 스페이서는 GGGGS(서열번호 1), 예컨대, GGGGSGGGGS(서열번호 16) 또는GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 17)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18)이다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 글리신 잔기만, 예컨대, 적어도 4개의 글리신 잔기(예컨대, 4~200개, 4~180개, 4~160개, 4~140개, 4~40개, 4~100개, 4~90개, 4~80개, 4~70개, 4~60개, 4~50개, 4~40개, 4~30개, 4~20개, 4~19개, 4~18개, 4~17개, 4~16개, 4~15개, 4~14개, 4~13개, 4~12개, 4~11개, 4~10개, 4~9개, 4~8개, 4~7개, 4~6개 또는 4~5개의 글리신 잔기) (예컨대, 4~200개, 6~200개, 8~200개, 10~200개, 12~200개, 14~200개, 16~200개, 18~200개, 20~200개, 30~200개, 40~200개, 50~200개, 60~200개, 70~200개, 80~200개, 90~200개, 100~200개, 120~200개, 140~200개, 160~200개, 180~200개, 또는 190~200개의 글리신 잔기)를 함유한다. 특정 구현예에서, 스페이서는 4~30개의 글리신 잔기(예컨대, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 글리신 잔기)를 갖는다. 일부 구현예에서, 글리신 잔기만 함유하는 스페이서는 당화(예컨대, O-연결 당화(O-linked glycosylation), O-당화라고도 지칭됨)되지 않을 수 있거나 예컨대, 하나 이상의 세린 잔기(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 함유하는 스페이서와 비교하여 당화의 감소된 수준(예컨대, O-당화의 감소된 수준)(예컨대, 자일로스, 만노스, 시알산, 푸코스(Fuc), 및/또는 갈락토스(Gal)(예컨대, 자일로스)와 같은 글리칸을 갖는 O-당화의 감소된 수준)을 가질 수 있다(실시예 4 참조).
일부 구현예에서, 글리신 잔기만 함유하는 스페이서는 O-당화(예컨대, O-자일로실화)되지 않을 수 있거나 예컨대, 하나 이상의 세린 잔기(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 함유하는 스페이서와 비교하여 O-당화의 감소된 수준(예컨대, O-자일로실화의 감소된 수준)을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 글리신 잔기만 함유하는 스페이서는 단백질 분해를 겪지 않을 수 있거나 예컨대, 하나 이상의 세린 잔기(예컨대, SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 함유하는 스페이서와 비교하여 단백질 분해율이 감소될 수 있다(실시예 4 참조).
특정 구현예에서, 스페이서는 GGGG(서열 번호 19), 예컨대, GGGGGGGG(서열 번호 20), GGGGGGGGGGGG(서열 번호 21), GGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 22), 또는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 23)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGGGG(서열번호 24), 예컨대, GGGGGGGGGG(서열번호 25), 또는GGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 26)의 모티프를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서, 스페이서는 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열 번호 27)이다.
다른 구현예에서, 스페이서는 글리신 및 세린 외의 아미노산, 예컨대, GENLYFQSGG(서열번호 28), SACYCELS(서열번호 29), RSIAT(서열번호 30), RPACKIPNDLKQKVMNH(서열번호 31), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG(서열번호 32), AAANSSIDLISVPVDSR(서열번호 33), 또는 GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS(서열번호 34)를 또한 함유할 수 있다.
본 개시의 특정 구현예에서, 12-아미노산 또는 20-아미노산 펩티드 스페이서는 2개의 Fc 도메인 단량체를 직렬연결로 연결하는 데 사용되고(예컨대, 도1의 폴리펩티드(102 및 108); 도 2의 폴리펩티드(202 및 208)), 12-아미노산 및 20-아미노산 펩티드 스페이서는 각각 서열 GGGSGGGSGGGS(서열 번호 35) 및 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열 번호 18)로 이루어진다. 다른 구현예에서, 서열 GGSGGGSGGGSGGGSGGS(서열번호 36)로 이루어진 18-아미노산 펩티드 스페이서가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 전술한 서열번호 1~36 중 어느 하나의 서열과 적어도 75% 동일한(예를 들어, 적어도 77%, 79%, 81%, 83%, 85%, 87%, 89%, 91%, 93%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예: 치환, 예: 보존적 치환)을 갖는 전술한 서열번호 1~36 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 서열번호 17, 18, 26 및 27 중 어느 하나의 서열과 적어도 80% 동일한(예컨대, 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예: 치환, 예: 보존적 치환)을 갖는 전술한 서열번호 1~36 중 어느 하나의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 서열번호 18 또는 27의 서열과 적어도 80% (예컨대, 적어도 82%, 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 97%, 99%, 또는 99.5%) 동일한 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 스페이서는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 아미노산 변형(예: 치환, 예: 보존적 치환)을 갖는 서열번호 18 또는 27의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
VIII. 혈청 단백질-결합 펩티드
혈청 단백질 펩티드에 결합하는 것은 단백질 의약품의 약동학을 개선할 수 있고, 특히 본원에 기술된 Fc 작제물 혈청 단백질-결합 펩티드와 융합될 수 있다.
하나의 실시예로서, 본원에 기술된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 알부민-결합 펩티드는 당업계에 일반적으로 알려져 있다. 하나의 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열 DICLPRWGCLW(서열번호 37)을 포함한다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 서열번호 37의 서열과 적어도 80% 동일한 (예컨대, 80%, 90%, 또는 100% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, 알부민 결합 펩티드는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 37의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
본 개시에서, 알부민-결합 펩티드는 Fc 작제물에서의 특정 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 하나의 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 작제물 1~4에서의 하나 이상의 폴리펩티드의 C-말단에 부착될 수 있다(도 1 및 2). 또 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 작제물 1~4(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102 및 108)와 도 2의 폴리펩티드(202 및 208))에 직렬로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 암호화하는 폴리펩티드의 C-말단에 융합될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 알부민-결합 펩티드는 직렬연결로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체를 인코딩하는 폴리펩티드의 제2 Fc 도메인 단량체에 접합되는 Fc 도메인 단량체의 C-말단(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(114 및 116)와 도 2의 폴리펩티드(214 및 216))에 부착될 수 있다. 알부민-결합 펩티드는 Fc 작제물에 유전자가 융합될 수 있거나 또는 Fc 작제물에 화학적 수단, 예컨대, 화학적 접합을 통해 부착될 수 있다. 원하는 경우, 스페이서는 Fc 작제물과 알부민-결합 펩티드 사이에 삽입될 수 있다. 이론에 구속되지 않지만, 본 개시의 Fc 작제물의 알부민-결합 펩티드를 포함시켜 혈청 알부민에 대한 이의 결합을 통해 치료 단백질을 오랫동안 유지할 수 있음이 기대된다.
IX. Fc 작제물
일반적으로, 본 개시는 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물(예컨대,3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)을 특징으로 한다. 이들은 Fc 수용체, 예컨대, FcγRIIIa에 대한 단일 야생형 Fc 도메인보다 더 큰 결합 친화도 및/또는 결합능을 가질 수 있다. 본 개시는 2개의 상호작용 CH3 항체 불변 도메인의 계면에서 아미노산 조작 방법을 개시하여, Fc 도메인의 2개의 Fc 도메인 단량체는 서로 선택적으로 이량체를 형성함으로써, 원치 않는 다량체 또는 응집의 형성을 방지한다. Fc 작제물은 Fc 도메인을 형성하는 Fc 도메인 단량체의 각각의 쌍으로 짝수의 Fc 도메인 단량체를 포함한다. Fc 작제물은 2개의 Fc 도메인 단량체의 이량체로 형성된 하나의 작용성 Fc 도메인을 최소한으로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물은 항원-인식 영역, 예컨대 가변 도메인(예컨대, VH, VL, 초가변 영역(HVR)) 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물은 항원 인식 영역, 예컨대, 가변 도메인(예컨대, VH, VL, HVR) 또는 CDR을 포함한다.
3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물은 4개의 폴리펩티드로 형성할 수 있다(도 1 및 2). 제1 및 제2 폴리펩티드(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102 및 108); 도 2의 폴리펩티드(202 및 208))는 제3 및 제4 폴리펩티드(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(114 및 116); 도 2의 폴리펩티드(214 및 216))와 동일하거나 상이할 수 있다. 도 1에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다는 링커를 통해 직렬연결로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(예컨대, Fc 도메인 단량체(104, 106, 110 및 112))를 인코딩하되, 하나의 Fc 도메인 단량체는 CH3 항체 불변 도메인의 하전 아미노산 치환을 함유하는 반면, 다른 Fc 도메인 단량체는 CH3 항체 불변 도메인의 돌출부(예컨대, Fc 도메인 단량체(106 및 112))를 함유한다. 제3 및 제4 폴리펩티드 둘 다는 함몰부를 갖는 Fc 도메인 단량체(예컨대, Fc 도메인 단량체(114 및 116))를 인코딩한다. 줄기 동종이량체 Fc 도메인은 각각 동일한 역전하 돌연변이를 그의 CH3 항체 불변 도메인에 함유하는(예컨대, Fc 도메인 단량체(104와 110) 각각이 D399K 및 K409D를 함유하는) Fc 도메인 단량체(104와 110)를 결합함으로써 형성될 수 있다. 제1 가지 이종이량체 Fc 도메인은 (예컨대, Fc 도메인 단량체(106)는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하고, Fc 도메인 단량체(114)는 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y409V를 함유하는) Fc 도메인 단량체(106과 114)를 결합함으로써 형성될 수 있다. 제2 이종이량체 Fc 도메인은 (예컨대, Fc 도메인 단량체(112)는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하고, Fc 도메인 단량체(116)는 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y409V를 함유하는) Fc 도메인 단량체(112와 116)를 결합함으로써 형성될 수 있다.
도 2에서, 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 다는 링커를 통해 직렬연결로 연결된 2개의 Fc 도메인 단량체(예컨대, Fc 도메인 단량체(204, 206, 210 및 212))를 인코딩하되, 하나의 Fc 도메인 단량체는 CH3 항체 불변 도메인의 하전 아미노산 치환(예컨대, Fc 도메인 단량체(204 및 210))을 함유하는 반면, 다른 Fc 도메인 단량체는 CH3 항체 불변 도메인의 돌출부(예컨대, Fc 도메인 단량체(206 및 212))를 함유한다. 제3 및 제4 폴리펩티드 둘 다는 함몰부 및 하전 아미노산 치환을 갖는 Fc 도메인 단량체(예컨대, Fc 도메인 단량체(214 및 216))를 인코딩한다. 줄기 동종이량체 Fc 도메인은 각각 동일한 역전하 돌연변이를 그의 CH3 항체 불변 도메인에 함유하는(예컨대, Fc 도메인 단량체(204와 210)) 각각이 D399K 및 K409D를 함유하는) Fc 도메인 단량체(204와 210)를 결합함으로써 형성될 수 있다. 제1 가지 이종이량체 Fc 도메인은 (예컨대, Fc 도메인 단량체(206)는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W 및 역전하 돌연변이 E357K를 함유하고, Fc 도메인 단량체(214)는 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y409V 및 역전하 돌연변이 K370D를 함유하는) Fc 도메인 단량체(206과 214)를 결합함으로써 형성될 수 있다. 제2 이종이량체 Fc 도메인은 (예컨대, Fc 도메인 단량체(212)는 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W 및 역전하 돌연변이 E357K를 함유하고, Fc 도메인 단량체(216)는 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A, 및 Y409V 및 역전하 돌연변이 K370D를 함유하는) Fc 도메인 단량체(212와 216)를 결합함으로써 형성될 수 있다.
추가 구현예에서, (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부를 함유하는 Fc 도메인 단량체는 (i) 적어도 하나의 역전하 돌연변이 및 (ii) 적어도 하나의 유전자 조작 돌출부 또는 적어도 하나의 유전자 조작 함몰부를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체와 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다. 예를 들어, 역전하 돌연변이 K370D 및 유전자 조작 함몰부 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 함유하는 Fc 도메인 단량체와 역전하 돌연변이 E357K 및 유전자 조작 돌출부 S354C 및 T366W를 함유하는 또 다른 Fc 도메인 단량체는 선택적으로 결합하여 Fc 도메인을 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, a) 식 A-L-B를 갖는 제1 폴리펩티드(i) A는 제1 Fc 도메인 단량체를 포함하고; ii) L은 링커이며, iii) B는 제2 Fc 도메인 단량체를 포함함); b) 식 A'-L'-B'를 갖는 제2 폴리펩티드(i) A'는 제3 Fc 도메인 단량체를 포함하고, ii) L'는 링커이며, iii) B'는 제4 Fc 도메인 단량체를 포함함); c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및 d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하되, A와 A'는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, B 및 상기 제5 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하며, B'와 상기 제6 Fc 도메인 단량체는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하는 Fc 작제물에서, Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체 내로 혼입될 수 있는 일부 아미노산 돌연변이의 예가 표 3a~3d에 나타나 있다. 일부 구현예에서, Fc 작제물의 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 각각은 C-말단 라이신이 결여된다. 일부 구현예에서, Fc 작제물의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, L과 L' 각각은 서열 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 27)을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어진다.
[표 3a]
[표 3b]
[표 3c]
[표 3d]
일부 구현예에서, Fc 작제물은 3개의 폴리펩티드로 형성된 2개의 Fc 도메인을 함유한다. 제1 폴리펩티드는 링커(예컨대, 글리신 스페이서; 서열번호 26 및 27)를 통해 접합된 직렬연결로 접합된 2개의 Fc 도메인 단량체를 함유하고, 제2 및 제3 폴리펩티드는 하나의 Fc 도메인 단량체를 함유한다. 제2 및 제3 폴리펩티드는 동일한 폴리펩티드일 수 있거나 상이한 폴리펩티드일 수 있다. 도 13은 이러한 Fc 작제물의 실시예를 도시한다. 제1 폴리펩티드(1302)는 링커(예컨대, 글리신 스페이서; 서열번호 26 및 27)를 통해 직렬연결로 접합된 2개의 Fc 도메인 단량체(1304 및 1306)를 함유한다. Fc 도메인 단량체(1304 및 1306) 둘 다는 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 돌출부를 함유한다. 제2 및 제3 폴리펩티드(1308 및 1310)는 CH3 항체 불변 도메인에 유전자 조작 함몰부를 갖는 하나의 Fc 도메인 단량체를 각각 함유한다. 제1 폴리펩티드의 Fc 도메인 단량체(1304) 중 하나는 제2 폴리펩티드를 갖는 제1 이종이량체 Fc 도메인(1308)을 형성하는 반면, 제1 폴리펩티드의 다른 Fc 도메인 단량체(1306)는 제3 폴리펩티드를 갖는 제2 이종이량체 Fc 도메인(1310)을 형성한다. 제2 및 제3 폴리펩티드는 서로 부착되거나 연결되지 않는다. 함몰부에-유전자 조작 돌출부 CH3-CH3 계면은 Fc 도메인 단량체의 이종이량체의 형성을 용이하게 하고 원치 않는 다량체의 비제어 형성을 방지한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체 각각은 이종이량체화를 촉진하기 위해 역전하 돌연변이를 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1304)는 유전자 조작 함몰부 및 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1308)를 갖는 이종이량체 Fc 도메인을 양호하게 형성할 수 있다.
또 다른 구현예에서, Fc 작제물은 6개의 폴리펩티드로 형성되는 5개의 Fc 도메인을 함유할 수 있다. 2개의 실시예가 도 14 및 도 15에 예시되어 있다. 이들 도시된 Fc 작제물은 6개의 폴리펩티드로 구성되고, 폴리펩티드 중 4개는 동일한 핵산으로 인코딩될 수 있고, 나머지 2개의 폴리펩티드도 또한 동일한 핵산으로 인코딩될 수 있다. 그 결과, 이들 Fc 작제물은 적합한 숙주 세포의 2개의 핵산의 발현에 의해 제조될 수 있다.
도 14는 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다. 제1 및 제2 폴리펩티드(1402 및 1410)는 링커(예컨대, 글리신 스페이서; 서열번호 26 및 27)를 통해 직렬로 접합된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각 1404, 1406, 1408, 및 1412, 1414, 1416)를 각각 함유한다. 구체적으로는, 폴리펩티드(1402 또는 1410)에서, 제1 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1404 또는 1412)는 제3 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1408 또는 1416)에 연결된 야생형 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면(1406 또는 1414)에 함유하는 제2 Fc 도메인 단량체에 연결된다. Fc 도메인 단량체(1406 및 1414)는 동종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하는 동일한 역전하 돌연변이(예컨대, D399K/K409D)를 각각 함유할 수 있다. 제3 내지 제6 폴리펩티드(1418, 1420, 1422 및 1424)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유하고 Fc 도메인 단량체(1404, 1408, 1412 및 1416) 각각과 이종이량체 Fc 도메인을 각각 형성한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체(1404, 1408, 1412, 1416, 1418, 1420, 1422 및 1424) 각각은 이종이량체화를 촉진하기 위해 역전하 돌연변이를 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1408)은 유전자 조작 함몰부 및 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1420)을 갖는 이종이량체 Fc 도메인을 양호하게 형성할 수 있다.
도 15는 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물의 도해이다. 제1 및 제2 폴리펩티드(1502 및 1510)는 링커(예컨대, 글리신 스페이서; 서열번호 26 및 27)를 통해 직렬로 접합된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각 1504, 1506, 1508, 및 1512, 1514, 1516)를 각각 함유한다. 상세하게는, 폴리펩티드(1502 또는 1510)에서, 제1 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1504 또는 1512)는 야생형 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면(1508 또는 1516)에 함유하는 제3 Fc 도메인 단량체에 연결된 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1506 또는 1514)에 연결된다. Fc 도메인 단량체(1508 및 1516)는 동종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하는 동일한 역전하 돌연변이(예컨대, D399K/K409D)를 각각 함유할 수 있다. 제3 내지 제6 폴리펩티드(1518, 1520, 1522 및 1524)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유하고 Fc 도메인 단량체(1504, 1506, 1512 및 1514) 각각과 이종이량체 Fc 도메인을 각각 형성한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체(1504, 1506, 1512, 1514, 1518, 1520, 1522 및 1524) 각각은 이종이량체화를 촉진하기 위해 역전하 돌연변이를 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1504)는 유전자 조작 함몰부 및 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1518)를 갖는 이종이량체 Fc 도메인을 양호하게 형성할 수 있다.
도 16은 6개의 폴리펩티드로 형성된 5개의 Fc 도메인을 함유하는 또 다른 Fc 작제물의 도해이다. 제1 및 제2 폴리펩티드(1602 및 1610)는 링커(예컨대, 글리신 스페이서; 서열번호 26 및 27)를 통해 직렬로 접합된 3개의 Fc 도메인 단량체(각각 1604, 1606, 1608, 및 1612, 1614, 1616)를 각각 함유한다. 구체적으로는, 폴리펩티드(1602 또는 1610)에서, 야생형 서열과 상이한 하전 아미노산을 CH3-CH3 계면(1604 또는 1612)에 함유하는 제1 Fc 도메인 단량체는 제3 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1608 또는 1616)에 연결된 제2 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체(1606 또는 1614)에 연결된다. Fc 도메인 단량체(1604 및 1612)는 동종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진하는 동일한 역전하 돌연변이(예컨대, D399K/K409D)를 각각 함유할 수 있다. 제3 내지 제6 폴리펩티드(1618, 1620, 1622, 및 1624)는 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 각각 함유하고 Fc 도메인 단량체(1606, 1608, 1614 및 1616) 각각과 이종이량체 Fc 도메인을 각각 형성한다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체(1606, 1608, 1614, 1616, 1618, 1620, 1622, 및 1624) 각각은 이종이량체화를 촉진하기 위해 역전하 돌연변이를 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1608)는 유전자 조작 함몰부 및 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1620)를 갖는 이종이량체 Fc 도메인을 양호하게 형성할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 둘 이상의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물은 동일한 1차 서열을 갖는 2개의 폴리펩티드로 형성될 수 있다. 이러한 작제물은 숙주 세포에서의 단일 폴리펩티드 서열의 발현으로 형성될 수 있다. 하나의 실시예가 도 17에 도시된다. 본 실시예에서, 단일 핵산은 3개의 Fc 도메인을 함유하는 Fc 작제물을 인코딩하는 데 충분하다. 동일한 폴리펩티드의 부분인 2개의 Fc 도메인 단량체는 충분한 길이 및 가요성의 가요성 링커의 포함으로 이종이량체 Fc 도메인을 형성 가능하게 한다. 이런 동일한 폴리펩티드는 또한 가요성 링커(예컨대, 글리신 스페이서; 서열번호 26 및 27)를 통해 접합된 제3 Fc 도메인 단량체를 함유한다. 이러한 제3 Fc 도메인 단량체(1708)는 동종이량체 Fc 도메인을 형성하고 도 17에 도시된 Y-형 Fc 작제물을 제조하기 위해 또 다른 Fc 도메인 단량체(1716)와 접합할 수 있다. Fc 도메인의 형성은 이량체화 선택성 모듈의 사용으로 제어될 수 있고, 또한 이는 도 17에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인 단량체(1704, 1706, 1712, 및 1714) 각각은 이종이량체화를 촉진하기 위해 역전하 돌연변이를 더 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전자 조작 돌출부 및 역전하 돌연변이(예컨대, E357K)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1704)는 유전자 조작 함몰부 및 역전하 돌연변이(예컨대, K370D)를 갖는 Fc 도메인 단량체(1706)를 갖는 이종이량체 Fc 도메인을 양호하게 형성할 수 있다.
일부 구현예에서, Fc 작제물(예컨대, 도 1의 Fc 작제물 1~3; 도 2의 Fc 작제물 4)의 하나 이상의 Fc 폴리펩티드는 C-말단 라이신 잔기가 결여된다. 일부 구현예에서, Fc 작제물의 모든 Fc 폴리펩티드는 C-말단 라이신 잔기가 결여된다. 일부 구현예에서, Fc 작제물의 하나 이상의 Fc 폴리펩티드의 C-말단 라이신의 부재는 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)의 집단, 예컨대, 실질적으로 동질인 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 집단(실시예 8 참조)의 동질성을 개선시킬 수 있다. 하나의 실시예에서, 서열번호 43 및 44의 어느 하나의 서열(실시예 1, 표 6 참조)을 갖는 Fc 폴리펩티드의 C-말단 라이신 잔기는 C-말단 라이신 잔기를 함유하지 않는 상응하는 Fc 폴리펩티드를 생성하기 위해 제거될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 야생형 Fc 도메인 단량체(예컨대, 서열번호 42)의 서열과 적어도 95% 동일한 (예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 야생형 Fc 도메인 단량체(예: 서열번호 42)의 서열인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예를 들어, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)에서의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한 (예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물의 Fc 도메인 단량체(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 44, 46, 48 및 50~53 중 어느 하나의 서열인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 서열번호 48, 52, 및 53의 서열과 적어도 95% 동일한 (예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, Fc 작제물에서의 Fc 도메인 단량체는 최대 10개(9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 48, 52, 및 53의 서열인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102 및 108); 도 2의 폴리펩티드(202 및 208))는 서열번호 43, 45, 47, 및 49 중 어느 하나의 서열과 적어도 95% 동일한 (예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다(실시예 1, 표 6 참조). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102 및 108); 도 2의 폴리펩티드(202 및 208))는 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 43, 45, 47, 및 49 중 어느 하나의 서열(실시예 1, 표 6 참조)인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드는 서열번호 49의 서열과 적어도 95% 동일한 (예컨대, 적어도 97%, 99%, 또는 99.5% 동일한) 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체를 갖는 폴리펩티드는 최대 10개(예를 들어, 최대 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개)의 단일 아미노산 변형(예를 들어, 보존적 치환과 같은 치환)을 갖는 서열번호 49의 서열인 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물에서의 2개의 Fc 도메인 단량체(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102 및 108); 도 2의 폴리펩티드(202 및 208))를 갖는 폴리펩티드에서의 아미노산 돌연변이는 Fc 도메인 단량체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(104, 106, 110, 및 112); 도 2의 Fc 도메인 단량체(204, 206, 210, 및 212))에서만 발생하고 스페이서에서는 발생하지 않는다. 예를 들어, 표 8에 도시된 폴리펩티드에서, 추가 아미노산 돌연변이 서열번호 50~53의 서열을 갖는 Fc 도메인 단량체에서 이루어질 수 있는 반면, 서열번호 18, 26 및 27의 서열을 갖는 스페이서는 변하지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드(예컨대, 도 1의 폴리펩티드(102, 108, 114, 및 116); 도 2의 폴리펩티드(202, 208, 214, 및 216)) 중 하나 이상의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 각각에서 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. 다른 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)은 Gln으로 돌연변이 되는 N-말단 Asp를 갖는 Fc 도메인 단량체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 중 하나 이상에서 Gln으로의 N-말단 Asp의 돌연변이는 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)의 집단, 예컨대, 실질적으로 동질인 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 집단의 동질성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 표 4는 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물에서 Gln으로 돌연변이된 N-말단 Asp를 갖는 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
| 모든 4개의 폴리펩티드에서 Gln으로 돌연변이된 N-말단 Asp를 갖는 Fc 작제물 | |
| 제1 및 제2 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 54) |
| 제3 및 제4 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 55) |
| 모든 4개의 폴리펩티드에서 Gln으로 돌연변이된 N-말단 Asp를 갖는 Fc 작제물 | |
| 제1 및 제2 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 56) |
| 제3 및 제4 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 57) |
| 모든 4개의 폴리펩티드에서 Gln으로 돌연변이된 N-말단 Asp를 갖는 Fc 작제물 | |
| 제1 및 제2 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 58) |
| 제3 및 제4 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 59) |
| 모든 4개의 폴리펩티드에서 Gln으로 돌연변이된 N-말단 Asp를 갖는 Fc 작제물 | |
| 제1 및 제2 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 60) |
| 제3 및 제4 폴리펩티드 | QKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 59) |
X. 숙주 세포 및 단백질 생산
본 개시에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 폴리펩티드 및 작제물을 그들의 상응하는 핵산으로부터 발현하는 데 필요한 필수 세포 성분, 예컨대, 세포 소기관을 포함하는 비히클을 지칭한다. 핵산은 당업계에 공지된 종래 기술(형질전환, 형질주입, 전기 천공법, 인산칼슘 침전, 직접 미세현미주입 등)로 숙주 세포에 도입될 수 있는 핵산 벡터에 포함될 수 있다. 숙주 세포는 포유류, 세균, 진균 또는 곤충 기원 중 하나일 수 있다. 포유류 숙주 세포는 이에 제한되지 않지만, CHO(또는 CHO-유래 세포주, 예컨대, CHO-K1, CHO-DXB11 CHO-DG44), 쥐 숙주 세포(예컨대, NS0, Sp2/0), VERY, HEK (예컨대, HEK293), BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 및 T47D, CRL7O3O 및 HsS78Bst 세포를 포함한다. 단백질 작제물의 발현을 조절하거나, 원하는 특정 방식으로 단백질 산물을 변형하고 처리하는 숙주 세포가 또한 선택될 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 산물의 번역후 처리 및 변형을 위한 특성과 특정 기구를 갖는다. 발현된 단백질의 올바른 변형 및 처리를 보장하도록 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다.
그의 상응하는 DNA 플라스미드 작제물에서 단백질 산물의 발현 및 분비를 위해, 숙주 세포는 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 및 선별 마커를 포함하여, 당업계에 공지된 적절한 발현 조절 요소로 조절된 DNA로 형질주입되거나 형질전환될 수 있다. 치료 단백질의 발현 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2nd ed. 2004 edition (July 20, 2004); Vladimir Voynov 및 Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2nd ed. 2012 edition (June 28, 2012) 참조.
XI. 정제
Fc 작제물은 예를 들어, 크로마토그래피(예컨대, 이온 교환, 친화(예컨대, 단백질 A 친화), 및 크기-배제 컬럼 크로마토그래피), 원심 분리, 용해도 차이, 또는 단백질 정제용 임의의 기타 표준 기술 등 단백질 정제 분야에 공지된 임의의 방법으로 정제될 수 있다. 예를 들어, Fc 작제물은 크로마토그래피 컬럼, 여과, 한외여과, 염석 및 투석 절차(예컨대, Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009; and Subramanian (ed.) Antibodies-Volume I-Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York (2004) 참조)로 단백질 A 컬럼과 같은 친화 컬럼을 적절하게 선택하고 결합함으로써 단리되고 정제될 수 있다.
일부 예시에서, Fc 작제물은 예컨대, 전체 세포 용해 혼합물에서부터 Fc 작제물의 정제 및 단리를 용이하게 하기 위해 하나 이상의 정제 펩타이드에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드는 결합하여 정제 펩티드에 특이적 친화도를 갖는 또 다른 모이어티에 결합한다. 일부 구현예에서, 정제 펩티드에 특이적으로 결합하는 이러한 모이어티는 매트릭스, 수지, 또는 아가로스 비드와 같은 고형 지지체에 부착된다. Fc 작제물에 접합될 수 있는 정제 펩티드의 예는 이에 제한되지 않지만, 헥사-히스티딘 펩티드, FLAG 펩티드, myc 펩티드 및 혈구응집소(hemagglutinin, HA) 펩티드를 포함한다. 헥사-히스티딘 펩티드(HHHHHH(서열번호 38))는 마이크로몰 친화력으로 니켈-작용화된 아가로스 친화 컬럼에 결합한다. 일부 구현예에서, FLAG 펩티드는 서열 DYKDDDDK(서열번호 39)를 포함한다. 일부 구현예에서, FLAG 펩티드는 직렬연결로 서열 DYKDDDDK의 정수 배수, 예컨대, 3xDYKDDDDK를 포함한다. 일부 구현예에서, myc 펩티드는 서열 EQKLISEEDL(서열번호 40)을 포함한다. 일부 구현예에서, myc 펩티드는 직렬연결로 서열 EQKLISEEDL의 정수 배수, 예컨대, 3xEQKLISEEDL을 포함한다. 일부 구현예에서, HA 펩티드는 서열 YPYDVPDYA(서열번호 41)를 포함한다. 일부 구현예에서, HA 펩티드는 직렬연결로 서열 YPYDVPDYA의 정수 배수, 예컨대, 3xYPYDVPDYA를 포함한다. FLAG, myc, 또는 HA 정제 펩티드를 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 항체는 당업계에 잘 알려져 있고, 종종 상업적으로 이용 가능하다. 이들 항체와 작용화된 고형 지지체(예컨대, 매트릭스, 수지, 또는 아가로스 비드)는 FLAG, myc, 또는 HA 펩티드를 포함하는 Fc 작제물을 정제하는 데 사용될 수 있다.
Fc 작제물의 경우, 단백질 A 컬럼 크로마토그래피는 정제 과정으로 이용될 수 있다. 단백질 A 리간드는 Fc 영역을 통해 Fc 작제물과 상호작용하고, 단백질 A 크로마토그래피를 숙주 세포 단백질의 대부분을 제거할 수 있는 고도의 선별 포획 과정으로 만든다. 본 개시에서, Fc 작제물은 실시예 2에 기술된 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있다.
XII. 약학 조성물/제조
본 개시는 본원에 기술된 하나 이상의 Fc 작제물을 포함하는 약학 조성물을 특징으로 한다. 하나의 구현예에서, 약학 조성물은 Fc 작제물의 실질적으로 동질인 집단을 포함한다. 다양한 실시예에서, 약학 조성물은 작제물 1~4 중 어느 하나의 실질적으로 동질인 집단을 포함한다.
본 개시의 치료 단백질 작제물, 예컨대, 본원에 기술된 Fc 작제물(예컨대, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물)은 약학 조성물에 혼입될 수 있다. 치료 단백질을 포함하는 약학 조성물은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화될 수 있다. 약학 조성물은 물 또는 또 다른 약학적으로 허용가능한 액체에서의 멸균 용액 또는 현탁액을 포함하는 주사 가능한 제형의 형태로 비경구 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 주사용 멸균수(WFI), 생리 식염수, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 희석제, 결합제, 부형제와 같은 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 매개물과 Fc 작제물을 적합하게 결합하고 이어서 일반적으로 허용되는 약무(pharmaceutical practice)에서 요구되는 단위 용량 형태로 혼합함으로써 제형화될 수 있다. 약제(pharmaceutical preparation)에 포함된 유효 성분의 양은 지정된 범위 내에서 제공되는 적합한 용량이다.
주사용 멸균 조성물은 비히클로서 주사용 증류수를 사용하여 통상적인 약무에 따라 제형화될 수 있다. 예를 들어, 생리 식염수 또는 글루코스 함유 등장액 및 D-소비톨, D-만노스, D-만니톨, 및 염화나트륨과 같은 기타 보충제 통상 당업계에 공지되어 있는 적합한 안정화제, 예를 들어, 에탄올과 같은 알코올 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다가알코올, 및 폴리소르베이트 80TM, HCO-50과 같은 비이온성 계면활성제 등과 선택적으로 조합하여 주사용 수용액으로 사용될 수 있다. 치료 단백질 산물용 제형 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대, Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing 및 Delivery Systems (2d ed.) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006)를 참조한다.
XIII. 투약
약제학적 조성물은 투약 제형과 양립 가능한 방식으로 및 증상을 개선하거나 치료하는 치료 유효량과 같은 양으로 투여된다. 약학 조성물은 다양한 투약 형태, 예컨대, 정맥내 투약 형태, 피하 투약 형태, 섭취 가능 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 경구 투약 형태로 투여된다. 개별 대상에 대한 적절한 투약은 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 따라 다르다. 일반적으로, 재조합 단백질은 1~200 mg/kg, 예컨대, 1~100 mg/kg, 예컨대, 20~100 mg/kg으로 투여된다. 따라서, 의료 제공자는 투약을 조정 및 적정하고, 최적의 치료 유효량을 얻기 위해 요구되는 투약 경로를 수정하는 것이 필요할 것이다.
XIV. 적응증(indication)
본 개시의 약학적 조성물(예컨대, 2, 3, 또는 4개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 포함하는 조성물)은 대상의 염증 감소, 대상의 자가항체의 제거 촉진, 대상의 항원 제시 억제, 대상의 면역 반응의 면역 복합체-기반 활성을 억제하는 것과 같은 면역 반응 감소, 및 대상의 면역 및 염증성 질병 또는 질환 치료에 유용하다. 예시적인 질병 및 질환은 류마티스 관절염(RA); 전신 홍반성 루푸스(SLE); ANCA-관련 혈관염; 항인지질 항체 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 만성 염증성 탈수초성 신경병증; 이식조직에서 항-알로, GVHD에서 항-자기, 항-교환, IgG 치료법, IgG 파라단백질의 제거; 피부근염; 굿파스쳐 증후군; 항체-의존성 세포 매개 세포 독성을 통해 매개된 조직계-표적형 II 과민성, 예컨대, 길랑 바레 증후군, CIDP, 피부근염, 펠티 증후군, 항체 매개 거부반응, 자가면역성 갑상선 질환, 궤양성 대장염, 자가면역성 간 질환; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 중증 근무력증, 시신경 척수염; 수포창 및 기타 자가면역성 수포 질환; 쇼그렌 증후군; 항체-의존성 식균 작용을 통해 매개된 자가면역성 혈구감소증 및 기타 질환; 기타 FcR-의존성 염증 증후군, 예컨대, 활액막염, 피부근염, 전신성 혈관염, 사구체염 또는 혈관염을 포함한다.
일부 구현예에서, 5~10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 함유하는 본 개시의 약학 조성물은 또한 예컨대, 대상의 면역 반응의 면역 세포 활성화를 유도하고, 대상의 표적 세포(즉, 암세포 또는 감염 세포)의 식균작용을 증가시키고, 대상의 암 및 감염증과 같은 질환을 치료하는 데 유용하다. 본 개시의 Fc 작제물 및 동질인 약학 조성물은 활성화 Fcγ 수용체(예컨대, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIc, FcγRIIIa, 및 FcγRIIIb)에 결합하여 면역 반응을 유도할 수 있다. 본 개시의 Fc 작제물 및 동질 약학 조성물은 1차 THP-1 단핵구에서부터 Syk 인산화 및 칼슘 유입을 활성화시킬 수 있다. 활성화 단핵구 및 그의 분화된 대식세포는 표적 세포를 식균작용에 의해 제거하거나 죽이는 능력을 갖는다. 그러므로 본 개시는 암과 감염증과 같은 질환 및 장애를 앓고 있는 대상을 치료하는 데 사용될 수 있는 치료 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 Fc 작제물 및 동질인 약학 조성물은 대상의 암세포나 감염 세포를 식균작용에 의해 제거하거나 죽이기 위한 치료유효량으로 대상에 투여될 수 있다.
본 개시의 방법에 따라 치료받을 수 있는 암은 이에 제한되지 않지만, 방광암, 췌장암, 폐암, 간암, 난소암, 대장암, 위암, 유방암, 전립선암, 신장암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 직장암, 호흡기계 암, 비뇨기계 암, 구강암, 피부암, 백혈병, 육종(sarcoma), 암종(carcinoma), 기저 세포암, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), B-세포형 만성 림프구성 백혈병(B-CLL), 다발성 골수종(multiple myeloma, MM), 적백혈병(erythroleukemia), 신세포암(renal cell carcinoma), 성상 세포종, 핍지교성상세포종(oligoastrocytoma), 담도암, 융모막 암종, CNS 암, 후두암, 소세포 폐암, 선암(adenocarcinoma), 거대(또는 귀리) 세포 암종, 편평상피암, 역형성 큰 세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 비소세포성(non-small-cell) 폐암, 신경아세포종, 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 신경외배엽 암, 교아세포종(glioblastoma), 유방암종, 흑색종, 염증 근육섬유모세포종 암(inflammatory myofibroblastic tumor cancer) 및 연조직 종양암을 포함한다.
본 개시의 방법에 따라 치료받을 수 있는 감염증은 이에 제한되지 않지만 세균성 감염증, 바이러스성 감염증, 진균성 감염증, 연충 감염증 및 원충 감염증을 포함한다.
감염 유발 세균의 예는 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되지 않지만, 연쇄상구균(Streptococcus)속의 세균(예컨대, Streptococcus pyogenes), 대장균(Escherichia)속의 세균(예컨대, Escherichia coli), 비브리오(Vibrio)속의 세균(예컨대, Vibrio cholerae), 장염균(Enteritis)속의 세균(예컨대, Enteritis salmonella), 및 살모넬라(Salmonella)속의 세균(예컨대, Salmonella typhi)을 포함한다.
감염 유발 바이러스의 예는 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되지 않지만, 레트로바이러스과의 바이러스(예컨대, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)), 아데노바이러스과의 바이러스(예컨대, 아데노바이러스), 단순포진바이러스과의 바이러스(예컨대, 단순성 포진 바이러스 1형 및 2형), 파필로마바이러스과의 바이러스(예컨대, 인간 유두종 바이러스(HPV)), 폭스바이러스과의 바이러스(예컨대, 천연두), 피코르나바이러스과의 바이러스(예컨대, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스), 헤파드나바이러스과의 바이러스(예컨대, B형 간염 바이러스), 플라비바이러스과의 바이러스(예컨대, C형 간염 바이러스, 황열병 바이러스, 웨스트 나일 바이러스), 토가바이러스과의 바이러스(예컨대, 풍진 바이러스), 오르토믹소바이러스과의 바이러스(예컨대, 인플루엔자 바이러스), 필로바이러스과의 바이러스(예컨대, 에볼라 바이러스, 마버그 바이러스), 및 파라믹소바이러스과의 바이러스(예컨대, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스)를 포함한다.
감염 유발 진균의 예는 당업계에 잘 알려져 있고, 이에 제한되지 않지만 아스페르길루스(Aspergillus)속의 진균(예컨대, Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. terreus. A. niger, A. candidus, A. clavatus, A. ochraceus), 칸디다(Candida )속의 진균(예컨대, Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis), 크립토코커스(Cryptococcus)속의 진균(예컨대, Cryptococcus neoformans) 및 푸사리움(Fusarium)속의 진균( Fusarium solani, F. verticillioides, F. oxysporum)을 포함한다.
연충의 예는 이에 제한되지 않지만, 조충류(촌충류), 회충류(선충류), 흡충류(디스토마류) 및 단생강을 포함한다.
원충의 예는 이에 제한되지 않지만, 엔트아메바(Entamoeba)속의 원충(예컨대, Entamoeba histolytica), 열원충(Plasmodium)속의 원충(예컨대, Plasmodium falciparum, P. malariae), 람블편모충(Giardia)속의 원충(예컨대, Giardia lamblia) 및 파동편모충(Trypanosoma)속의 원충(예컨대, Trypanosoma brucei)을 포함한다.
실시예
실시예 1. Fc 작제물 설계
바람직하게는, Fc 작제물은 접힘 효율을 증가시키고, 원치않는 고분자량의 올리고머 및 다량체를 생성할 수 있는 소단위체의 비제어 결합을 최소화하고, 실질적으로 동질인 조성물을 생성하도록 설계된다. 이들 목표를 염두에 두고, 폴리펩티드 스페이서에 의해 분리된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 긴 폴리펩티드(도 1의 폴리펩티드(102 및 108) 및 도 2의 폴리펩티드(202 및 208)) 및 단일 Fc 도메인 단량체를 포함하는 짧은 폴리펩티드(도 1의 폴리펩티드(114 및 116) 및 도 2의 폴리펩티드(214 및 216))을 각각 포함하는 4개의 Fc 작제물(도 1 및 2)을 설계하였다. 각각은 IgG1 Fc 서열에 기초하여, 폴리펩티드의 조립을 제어하기 위해 유전자 조작 함몰부, 유전자 조작 돌출부, 및/또는 정전기 스티어링 변형을 포함한다. 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 서열을 포유류 세포에서의 발현을 위해 최적화하였고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다. 총 8개의 DNA 플라스미드 작제물을 3개의 Fc 도메인을 각각 갖는 4개의 Fc 작제물을 조립하는 데 사용하였다.
각각의 Fc 작제물의 경우, 공동-발현 시에, 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드는 긴 폴리펩티드의 C-말단 Fc 단량체가 서로 특이적으로 결합하여 하나의 C-말단 Fc 도메인을 형성하고, 긴 폴리펩티드의 N-말단 Fc 단량체가 짧은 폴리펩티드와 특이적으로 결합하여 2개의 N-말단 Fc 도메인을 형성하는 3개의 Fc 도메인을 함유하는 분지된 분자를 제조한다. Fc 작제물 1~4 및 그의 설계는 표 5 및 도 1 및 2에 기술된다. 각각의 Fc 작제물에서 이용되는 서열은 표 6에 나타낸다. 하기 표 7은 작제물 1~4 각각에서 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드의 특성을 더 요약한다.
| 서열번호 | 아미노산 서열 |
| 서열 번호 43 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 서열 번호 44 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 서열 번호 45 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 46 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 47 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 48 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 49 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| Fc 작제물 1 | Fc 작제물 2 | Fc 작제물 3 | Fc 작제물 4 | |
| 긴 폴리펩티드(102/202 및 108/208)에서의 스페이서 | SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18) | SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18) | GGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 26) | GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 27) |
| 긴 폴리펩티드(102/202 및 108/208)에 C-말단 라이신이 있는가? | Y | N | N | N |
| 짧은 폴리펩티드(114/214 및 116/216)에 C-말단 라이신이 있는가? | Y | N | N | N |
| 106/206 및 108/208에서의 아미노산 돌연변이 | S354C*T366W | S354C T366W |
S354C E357K T366W |
S354C E357K T366W |
| 104/204 및 110/210에서의 아미노산 돌연변이 | D399KK409D | D399K K409D |
D399K K409D |
D399K K409D |
| 114/214 및 116/216에서의 아미노산 돌연변이 | Y349CT366S L368A Y407V |
Y349C T366S L368A Y407V |
Y349C T366S L368A K370D Y407V |
Y349C T366S L368A K370D Y407V |
| 도면 | 도 1 | 도 1 | 도 1 | 도 2 |
*서열 위치는 카밧 넘버링 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., ed 5, 1991)에 따라 번호가 부여된다.
Fc 작제물 1~3에서의 긴 폴리펩티드(102 및 108)(도 1) 및 Fc 작제물 4에서의 긴 폴리펩티드(202 및 208)(도 2) 각각은 스페이서에 의해 직렬연결로 접합된 2개의 Fc 도메인 단량체를 함유한다. 하기 표 8은 긴 폴리펩티드에서의 Fc 도메인 단량체의 서열과 Fc 작제물 1~4에서의 스페이서를 제공한다.
| Fc 작제물 1 폴리펩티드 102/108 | |
| N-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 50) |
| 스페이서 | SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18) |
| C-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 51) |
| Fc 작제물 2 폴리펩티드 102/108 | |
| N-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 50) |
| 스페이서 | SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18) |
| C-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 52) |
| Fc 작제물 3 폴리펩티드 102/108 | |
| N-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 53) |
| 스페이서 | GGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 26) |
| C-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 52) |
| Fc 작제물 4 폴리펩티드 202/208 | |
| N-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 53) |
| 스페이서 | GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 27) |
| C-말단 Fc 도메인 단량체 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(서열번호 52) |
실시예 2 Fc 작제물의 발현
발현된 단백질을 Poros MabCapture A(LifeTechnologies) 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액에서부터 정제하였다. 포획된 Fc 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하고(저염 세척) pH 3, 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하였고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
단백질을 Poros XS 수지(Applied Biosciences)를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분류하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)을 사용하여 단계 구배로 용리하였다.
이온 교환 후에, 표적 분획물을 접촉 유동 여과(tangential flow filtration) 시스템상에서 10 kDa 컷오프(cutoff) 폴리에테르설폰(polyether sulfone, PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
실시예 3. Fc 작제물을 특성 분석하는 데 사용되는 실험적 분석법
펩티드 및 당펩티드 액체 크로마토그래피-MS/MS
단백질을 6M 구아니딘(Sigma)에서 1 μg/μL로 희석하였다. 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT)을 10 mM의 농도에 첨가하여 65°C에서 30분간 변성 조건하에서 이황화결합을 감소시켰다. 얼음에서 냉각한 후, 샘플을 어두운 상태로 1시간 동안 30 mM 요오드아세트아미드(IAM)로 배양하여 유리 티올을 알킬화(카바미도메틸화(carbamidomethylate))하였다. 그런 다음 단백질을 10-kDa 멤브레인을 통과하여 25 mM 중탄산 암모늄 완충액(pH 7.8)으로 투석하여 IAM, DTT 및 구아니딘을 제거하였다. 단백질을 Barocycler(NEP 2320; Pressure Biosciences, Inc.)에서 트립신으로 분해하였다. 압력은 37°C에서 20,000 psi와 주위 압력 사이를 1시간 동안 총 30 사이클 순환하였다. 펩티드의 LC-MS/MS 분석을 Ultimate 3000(Dionex) Chromatography System 및 Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) Mass Spectrometer 상에서 수행하였다. 단백질을 BEH PepMap(Waters) Column상에서 이동상으로 물에 0.1% FA 및 아세토니트릴에 0.1% FA를 사용하여 분리하였다. 단독 자일로실화 링커 펩티드를 ± 1.5 Da 사중극 단리폭(quadrupole isolation width)으로 이중 하전 이온(z=2) m/z 842.5에 기초하여 표적화하였다.
원형 질량 분석(Intact Mass Spectrometry)
단백질을 78.98% 물, 20% 아세토니트릴, 1% 폼산 (FA), 및 0.02% 트리플루오로아세트산으로 이루어지는 전개 완충액(running buffer)에서 2 μg/μL의 농도로 희석하였다. 컬럼의 전체 길이가 700 mm인 2개의 Zenix-C SEC-300(Sepax Technologies, Newark, DE) 2.1 Х 350 mm 상에서 직렬로 크기 배제 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 전술한 전개 완충액을 사용하여 80 μL/분의 유속으로 SEC 컬럼에서 단백질을 용리하였다. QSTAR Elite(Applied Biosystems) Q-ToF 질량 분석기를 양이온 모드(positive mode)에서 작동시켜 질량 스펙트럼을 획득하였다. Bayesian 피크 디콘볼루션(deconvolution)을 사용하여 크로마토그래피 피크의 전체 폭에 걸친 스펙트럼을 합침으로써 개별 크기 분획하의 중성 질량을 디콘볼루팅하였다.
모세관 전기영동-도데실 황산나트륨(CE-SDS) 분석법
샘플을 1 mg/mL로 희석하고 HT Protein Express 변성 완충액(PerkinElmer)과 혼합하였다. 혼합물을 40°C에서 20분간 배양하였다. 샘플을 물 70 μL로 희석하였고 96-웰 플레이트로 옮겼다. 샘플을 HT Protein Express LabChip(PerkinElmer)에 장착된 Caliper GXII 도구(PerkinElmer)로 분석하였다. 각각의 크기 변형의 상대적인 양을 산출하는 데 형광 강도를 사용하였다.
비환원 SDS-PAGE
샘플을 95°C에서 10분간 Laemmli 샘플 완충액(4% SDS, Bio-Rad)에서 변성시켰다. Criterion TGX 무착색(stain-free) 겔(4~15% 폴리아크릴아미드, Bio-Rad)상에 샘플을 흘렸다. 단백질 밴드를 UV 조사 또는 쿠마시 블루(Coommassie blue) 염색으로 시각화하였다. ChemiDoc MP Imaging System(Bio-Rad)으로 겔을 이미지화하였다. Imagelab 4.0.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밴드를 정량 분석하였다.
보체 의존 세포독성(CDC)
Raji 세포(ATCC)를 순차 희석된 리툭시맙(Rituximab), Fc 작제물 4, 또는 IVIg로 코팅한 비색분석법(colorimetric assay)으로 CDC를 평가하였다. 인간 혈청 보체(Quidel)를 25% v/v로 모든 웰에 첨가하였고 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. WST-1 세포 증식 시약(Roche Applied Science)을 첨가한 후 세포를 37°C에서 12시간 동안 배양하였다. 플레이트를 2분간 진탕기에 두었고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
실시예 4. 링커 세린 잔기의 O-당화 및 단백질 분해
링커 세린 잔기에서의 O-당화
실시예 1에 기술된 바와 같이, 접힘 효율을 증가시키고, 소단위체의 비제어 결합을 최소화하고, 실질적으로 동질인 약학적 용도의 조성물을 생성하도록 Fc 작제물을 설계하였다. 이들 목표를 달성하기 위한 노력의 일환으로, 긴 폴리펩티드(도 1의 102 및 108; 도 2의 202 및 208) 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 상이한 링커를 조사하였다. Fc 작제물 1 및 Fc 작제물 2는 긴 폴리펩티드의 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에 세린-글리신 링커(SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18))를 각각 갖는다.
긴 폴리펩티드의 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에 링커 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG(서열번호 18)를 함유하는 Fc 작제물 2를 펩티드 LC-MS/MS로 분석했을 때, O-자일로실화를 관찰하였다(도 3). 하지만, 단편 y2 내지 y9는 자일로스를 함유하지 않고, 링커의 제5 세린은 O-자일로실화되지 않는다. O-자일로실화된 다수의 부위가 있을 수 있지만, 각각의 펩티드는 오직 단독 O-자일로실화된다. 이러한 번역후 변형의 정도 및 위치는 서열과 발현 시스템 둘 다에 의해 결정될 수 있다.
마찬가지로, O-자일로실화를 동일한(SG3)5 링커(도 4)를 함유하는 2개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물(도 13에 도시된 Fc 작제물)에서 관찰하였다. 다수의 부위에서 변형을 관찰하였고, 각각의 링커에서 최대 2개의 자일로스 변형이 있었다. 게다가, 변형의 수준은 배치(batch) 사이에서 가변적이었다.
세린-글리신 링커의 세린 잔기에서 O-자일로실화를 관찰한 후에, 링커 서열을 더 최적화하고 Fc 작제물의 동질성을 개선시키기 위하여 오직 글리신 잔기를 포함한 대체 링커를 조사하였다. 그 결과, 전부-글리신인 스페이서를 Fc 작제물 3 및 Fc 작제물 4에서 사용하기 위해 선택하였다. Fc 작제물 3은 긴 폴리펩티드의 2개의 Fc 도메인 단량체 사이에 15-량체의 전부-글리신인 스페이서 (GGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 26))를 갖는다. Fc 작제물 4는 긴 폴리펩티드의 2개의 Fc 도메인 단량체 사이의 20-량체의 전부-글리신인 스페이서 (GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG(서열번호 27))를 갖는다.
링커 세린 잔기에서의 단백질 분해
일부 구현예에서, 인산염 완충 식염수에서 45°C에서 배양 시에 Fc 작제물이 링커에서 단백질 분해를 겪고, 단량체 Fc 산물을 생성하는 것을 확인하였다. (폴리펩티드 102 및 108 각각의 링커 SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG를 함유하는) Fc 작제물 2의 단량체 형성 속도가 (폴리펩티드 202 및 208 각각의 전부-글리신인 스페이서 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG를 함유하는) Fc 작제물 4(도 5)보다 더 빠르고, 이는 전부-글리신인 스페이서가 단백질 분해에 덜 취약함을 나타낸다. 이러한 결과가 다수의 링커 길이에서 3개의 Fc 도메인을 갖는 분지된 Fc 작제물 중에 일반적임을 발견하였고, 전부-글리신인 스페이서는 세린-글리신 링커보다 더 느리게 단백질 분해되었다(표 9).
| 링커 서열 | 단량체 형성 속도(단량체/일(%)) |
| G8 | 0.17 |
| G15 | 0.21 |
| G20 | 0.24 |
| (SG4)4 | 0.33 |
| (SG3)5 | 0.34 |
게다가, 폴리펩티드(102 및 108) 각각의 (SG3)5 링커를 갖는 Fc 작제물 2의 단량체 Fc 산물의 질량 분석법에 의한 분석은 지배 산물이 단백질 분해에 취약한 제1 세린을 제외하고 모두 세린의 N-말단 측으로 절단됨을 입증하였다(도 6). 반면에, 폴리펩티드(202 및 208) 각각의 G20 스페이서를 갖는 Fc 작제물 4의 절단 산물은 임의의 특정 스페이서 잔기에 대한 강한 특이도를 보이지 않았다(도 7). 동시에, 이들 결과는 전부-글리신인 스페이서가 단백질 분해에 대한 감수성을 감소시켰음을 나타냈다. 단백질 분해를 제한하기 위해, Fc 작제물 4에 사용된 G20 스페이서와 같이 무세린(serine-free) 스페이서가 사용될 수 있다. 이러한 글리신 스페이서의 사용은 최종 Fc 작제물 조성물의 동질성을 실질적으로 개선시킨다.
실시예 5. 링커 길이의 최적화
추가로 최적화된 동질성을 위하여, (SG3)5 링커가 G8, G15, 또는 G20 스페이서로 치환된 Fc 작제물 2 서열상의 변이를 제조함으로써 링커 길이를 탐구하였다. 시험관내 검사에 의한 분석은 아마도 Fcγ 수용체와 상호작용하는 Fc 작제물의 능력을 변경시킴으로써 링커 길이가 생물학적 활성에 영향을 주는 것임을 보여주었다.
플레이트-고정 IgG에 의해 자극된 THP-1 세포에 의한 IL-8 방출의 억제는 링커 길이에 따라 결정됨을 확인하였다(도 8). 낮은 Fc 작제물 농도에서의 억제는 G8 < G15 < G20 순서를 따랐고, Fc 작제물 2는 THP-1 세포에 의한 IL-8 방출을 가장 강하게 억제하는 G20 스페이서를 갖는다.
또한, 중성구에서 칼슘 유입의 억제는 링커 길이에 의존적임을 확인하였다(도 9). 억제는 G8 < G15 < G20 순서를 따랐고, Fc 작제물 2는 중성구에서 칼슘 유입의 가장 강한 억제를 보인 G20 스페이서를 갖는다.
실시예 6. 노브-인투-홀 기술에 의한 이종이량체화의 최적화
Fc 작제물 2의 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드(도 1의 폴리펩티드(102, 108, 114, 및 116)) 또는 Fc 작제물 4의 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드(도 2의 폴리펩티드(202, 208, 214, 및 216))를 발현하는 플라스미드를 HEK293 세포내로 형질주입하였다. 7일간의 배양 후에, 세포를 원심분리로 제거하고, 원배지 상청액을 비환원 SDS-PAGE로 분리하였다(도 10). 시각화된 단백질 밴드의 농도계 분석은 3개의 Fc 도메인을 갖는 작제물 2 및 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물 4(Fc3)가 유사한 수준으로 발현됨을 나타냈다. 하지만, Fc 작제물 2에서 작제물은 오염시키는 이량체(Fc2) 종을 유의하게 더 높은 수준으로 발현하였다(도 10). 작제물의 두 세트 모두 단량체 종(Fc1)은 유사한 수준으로 발현하였다. 이미지에 존재하는 추가 밴드는 모의 형질주입 대조에 존재하는 배지 성분을 나타낸다.
이들 결과는 "가지" 소단위체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(106, 114, 112, 및 116); 도 2의 Fc 도메인 단량체(206, 214, 212, 및 216))에서 이종이량체화를 촉진하는 정전기 스티어링 돌연변이 및 이종이량체화를 촉진하는 노브-인투-홀 돌연변이를 둘 다 가지는 것이 Fc 작제물의 이종이량체 Fc 도메인 형성을 강화하고, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 조립을 최적화하고, Fc 작제물을 함유하는 조성물의 동질성을 개선시킴을 나타낸다.
실시예 7. 동종이량체화의 제어를 위한 정전기 스티어링
원치않는 고분자량 올리고머 및 다량체를 생성하는 소단위체의 오프-레지스터(off-register) 결합을 최소화하기 위해, 이종이량체화(예컨대, 노브 및 홀)를 용이하게 하는 돌연변이를 "가지" 소단위체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(106, 112, 114, 및 116); 도 2의 Fc 도메인 단량체(206, 212, 214, 및 216))내로 도입하였다. 이들 아미노산 치환은 노브 소단위체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(106 및 112); 도 2의 Fc 도메인 단량체(206 및 212))의 상응하는 홀(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(114 및 116); 도 2의 Fc 도메인 단량체(214 및 216))에 대한 인력(attraction)을 보존하고 동시에 노브 소단위체 간의 결합을 방지한다. 노브 돌연변이는 또한 야생형 Fc 서열과의 결합을 억제하므로, 노브 및 홀 "가지" 소단위체에 대한 "줄기" Fc 소단위체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(104 및 110); 도 2의 Fc 도메인 단량체(204 및 210))의 친화도를 더 감소시키는 추가 돌연변이를 포함하는 것에 대한 필요성에 의문을 제기한다. 이러한 의문을 해결하기 위해, 카복시 말단 "줄기" 소단위체에 야생형 Fc 도메인 단량체 서열을 함유하고 아미노 말단 "가지" 소단위체에 노브 돌연변이를 지니는 Fc 도메인 단량체를 함유하는 Fc 작제물의 긴 폴리펩티드를 생성하였다. 상응하는 짧은 폴리펩티드는 홀 돌연변이를 지니는 Fc 도메인 단량체였다. 이러한 Fc 작제물은 Fc 작제물 2의 폴리펩티드의 서열에 기초하지만, 긴 폴리펩티드 각각의 카복시 말단 "줄기" 소단위체의 야생형 Fc 도메인 단량체 서열을 갖는다.
HEK293 세포는 (실시예 1의 표 5 및 6 참조; 긴 폴리펩티드 각각의 카복시 말단 "줄기" 소단위체의 Fc 도메인 단량체에 동종이량체화 정전기 스티어링 돌연변이를 갖는) Fc 작제물 2, 또는 (상술한 바와 같이) 긴 폴리펩티드 각각의 카복시 말단 "줄기" 소단위체의 Fc 도메인 단량체가 야생형 Fc 도메인 단량체 서열(서열번호 42)과 치환된 Fc 작제물 2에 기초한 Fc 작제물을 발현하는 플라스미드로 공-형질주입(co-transfect)하였다. 7일간의 배양 후에, 세포를 원심분리로 제거하고, 원배지 상청액을 비환원 SDS-PAGE로 분리하였다. 염색된 단백질의 이미징은 "줄기" 소단위체의 정전기 스티어링 돌연변이가 없는 Fc 작제물(도 11의 "정전기 스티어링 없음"으로 표지된 (레인 1~3))이 대응하는 Fc 작제물 2(도 11의 "정전기 스티어링 있음"으로 표지된 (레인 4 및 5))보다 훨씬 더 높은 수준의 단량체(Fc1) 및 이량체(Fc2)를 함유함을 나타냈다. 게다가, 삼량체보다 더 높은 분자량인 밴드의 수가 훨씬 더 많이 검출될 수 있다(도 11의 레인 1~3).
이들 결과는 "줄기" 소단위체(예컨대, 도 1의 Fc 도메인 단량체(104 및 110); 도 2의 Fc 도메인 단량체(204 및 210))의 동종이량체화를 촉진하는 정전기 스티어링 돌연변이를 갖는 것은 Fc 작제물에서 동종이량체 Fc 도메인의 형성을 더 강화하고, 3개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물의 결합을 최적화하고 Fc 작제물을 함유하는 조성물의 동질성을 개선시킴을 확인한다.
실시예 8. C-말단 라이신 잔기의 제거에 의한 조성물 동질성의 최적화
면역글로불린의 C-말단 라이신 잔기는 많은 종에 걸쳐 고도로 보존된다. 일부 예시에서, 폴리펩티드의 C-말단 라이신이 단백질 생산 중에 세포 기구에 의해 제거된다. 조성물의 Fc 작제물의 균일성을 더 개선시키고 Fc 작제물의 폴리펩티드 각각에서 C-말단 라이신을 제거함으로써 본원에 기술된 Fc 작제물을 함유하는 보다 동질인 조성물을 달성하고자 하였다. Fc 작제물 2는 그의 긴 폴리펩티드(102 및 108; 실시예 1, 표 5~7 참조; 도 1) 또는 짧은 폴리펩티드(114 및 116) 중 하나에 어떤 C-말단 라이신 잔기도 포함하지 않는다. 도 12는 Fc 작제물 2를 생성하는 C-말단 라이신의 제거는 시험관내 보체 의존 세포독성을 유도하지 않는 것을 보여준다. 따라서, C-말단 라이신 잔기의 제거에 의해, 부정적인 면역학적 부작용을 촉발하지 않으면서 Fc 작제물 약학 조성물의 동질성을 개선시킬 수 있었다.
실시예 9. I253 및/또는 R292 아미노산 변형을 갖는 Fc 작제물의 설계
작제물 4(M230)에 기초하여 반감기가 변경된 (예를 들어, 늘어난) Fc 작제물을 설계하고, FcRn에 대한 결합 친화도를 변경(예를 들어, 위치 I253에서 I253A와 같은 아미노산 변형을 포함함으로써, FcRn에 대한 결합을 감소)시키고/시키거나 FcγRIIb에 대한 결합 친화도를 변경(위치 R292에서 R292P와 같은 아미노산 변형을 포함함으로써, FcγRIIb에 대한 결합을 감소)시키는 아미노산 변형(예: 단일 돌연변이 또는 돌연변이의 조합)을 포함시켰다(도 18a~18o).
각각 전체-글리신 링커(예: GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열번호23))와 같은 스페이서에 의해 분리된 2개의 Fc 도메인 단량체를 포함하는 긴 폴리펩티드 및 단일 Fc 도메인 단량체를 포함하는 짧은 폴리펩티드를 포함하고, 위치 I253 및/또는 R292에서 상이한 원자가의 아미노산 변형(예를 들어, I253A 및/또는 R292P)을 갖는 6개의 Fc 작제물(도 2, 18b, 18c, 18l, 18n 및 18o)을 제작하였다. 각각의 Fc 작제물은 IgG1 Fc 서열에 기초하며, 폴리펩티드의 조립을 조절하기 위한 정전기 스티어링 변형, 유전자 조작 함몰부, 및/또는 유전자 조작 돌출부를 포함한다. 포유류 세포에서의 발현을 위해 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 최적화하고 pcDNA3.4 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. DNA 플라스미드 작제물을 인간 배아 신장(HEK) 293 세포에 리포좀을 통해 형질주입하였다.
각각의 Fc 작제물의 경우, 공동-발현 시에, 긴 폴리펩티드 및 짧은 폴리펩티드는 긴 폴리펩티드의 C-말단 Fc 단량체가 서로 특이적으로 결합하여 하나의 C-말단 Fc 도메인을 형성하고, 긴 폴리펩티드의 N-말단 Fc 단량체가 짧은 폴리펩티드와 특이적으로 결합하여 2개의 N-말단 Fc 도메인을 형성하는 3개의 Fc 도메인을 함유하는 분지된 분자를 제조한다. Fc 작제물 12~15, 24, 26 및 27 및 이들의 디자인은 표 10 및 도 2 및 18b~18o에 기술되어 있다. 각각의 Fc 작제물에 사용된 서열은 표 11에 도시되어 있으며, 여기서 I253A 및/또는 R292P 아미노산 변형 각각은 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있다.
작제물 4에서, 긴 폴리펩티드의 각각은, CH3-CH3 계면에서 하전된 아미노산(D399K 및 K409D)을 가지고 링커를 통해 (변형 S354C 및 T366W 변형에 의해 형성된) 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체에 결합된 하나의 Fc 도메인 단량체를 함유한다. 돌출부-함유 Fc 도메인 단량체는 Fc 도메인의 조립을 강화시키는 아미노산 변형(E357K)을 갖는다. 짧은 폴리펩티드는 각각 (변형 Y349C/T366S/L368A/Y407V에 의해 변형된) 함몰부-함유 Fc 도메인 단량체를 갖는다. 짧은 폴리펩티드는 또한 Fc 도메인의 조립을 강화시키는 아미노산 변형(K370D)을 갖는다. 작제물 4는 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다.
작제물 13~27(도 18a~18o)은 본원에 기술된 바와 같이, I253 및/또는 R292에서의 특정 변형을 제외하고는 작제물 4와 동일하다. 작제물 5는 서열번호 62의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 6은 서열번호 64의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 7은 서열번호 65의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 8은 서열번호 66의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 9는 서열번호 67의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 61의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 10은 서열번호 68의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 11은 서열번호 69의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 57의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 12는 서열번호 71의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 13은 서열번호 72의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 14는 서열번호 74의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 15는 서열번호 75의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 16은 서열번호 76의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 17은 서열번호 77의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 70의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 18은 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다. 작제물 19는 서열번호 79의 아미노산 서열을 갖는 제1 및 제2 폴리펩티드 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 갖는 제3 및 제4 폴리펩티드를 발현시킴으로써 형성된다.
| Fc 작제물 | FcγRIIb 결합 돌연변이 1 | FcRn 결합 돌연변이 2 | 긴 폴리펩티드 # (서열번호) | 짧은 폴리펩티드 # (서열번호) | 도면 |
| Fc 작제물 4 | 없음 | 없음 | 1202 및 1208(서열번호 49) | 1214 및 1216 (서열번호 61) |
도 2 |
| Fc 작제물 5 | 없음 | C-말단 Fc 도메인만 | 502 및 508(서열번호 62) | 514 및 516(서열번호 61) | 도 18a |
| Fc 작제물 6 | 없음 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 602 및 608(서열번호 64) | 614 및 616(서열번호 57) | 도 18b |
| Fc 작제물 7 | 없음 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 702 및 708(서열번호 65) | 714 및 716 (서열번호 57) |
도 18c |
| Fc 작제물 8 | C-말단 Fc 도메인만 | 없음 | 802 및 808(서열번호 66) | 814 및 816 (서열번호 61) |
도 18d |
| Fc 작제물 9 | C-말단 Fc 도메인만 | C-말단 Fc 도메인만 | 902 및 908(서열번호 67) | 914 및 916 (서열번호 61) |
도 18e |
| Fc 작제물 10 | C-말단 Fc 도메인만 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 1002 및 1008(서열번호 68) | 1014 및 1016 (서열번호 57) |
도 18f |
| Fc 작제물 11 | C-말단 Fc 도메인만 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 1102 및 1108(서열번호 69) | 1114 및 1116 (서열번호 57) |
도 18g |
| Fc 작제물 12 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 없음 | 1202 및 1208(서열번호 71) | 1214 및 1216 (서열번호 70) |
도 18h |
| Fc 작제물 13 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | C-말단 Fc 도메인만 | 1302 및 1308(서열번호 72) | 1314 및 1316 (서열번호 70) |
도 18i |
| Fc 작제물 14 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 1402 및 1408(서열번호 74) | 1414 및 1416 (서열번호 73) |
도 18j |
| Fc 작제물 15 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 1502 및 1508(서열번호 75) | 1514 및 1516 (서열번호 73) |
도 18k |
| Fc 작제물 16 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 없음 | 1602 및 1608(서열번호 76) | 1614 및 1616 (서열번호 70) |
도 18l |
| Fc 작제물 17 | 3개의 Fc 도메인 모두 | C-말단 Fc 도메인만 | 1702 및 1708(서열번호 77) | 1714 및 1716 (서열번호 70) |
도 18m |
| Fc 작제물 18 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 2개의 N-말단 Fc 도메인 | 1804 및 1808(서열번호 78) | 1814 및 1816(서열번호 73) | 도 18n |
| Fc 작제물 19 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 3개의 Fc 도메인 모두 | 1904 및 1908(서열번호 79) | 1914 및 1916 (서열번호 73) |
도 18o |
| 1 R292P 돌연변이 2 I253A 돌연변이 |
|||||
| 아미노산 서열 | |
| 서열 번호 61 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 49 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 62 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 57 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 64 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 65 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 66 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 67 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 68 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 69 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 70 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 71 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 72 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 73 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 74 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 75 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 76 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 77 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 78 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| 서열 번호 79 | DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM A SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP P EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG |
| I253A 및 R292P 돌연변이(변형)는 굵은 글씨로 표시되고 밑줄이 그어져 있음(있는 경우에 한함) | |
실시예 10. Fc 수용체 결합 특이성에 대한 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
세포-기반의 결합 분석을 사용하여, 위치 I253 및 R292에서의 아미노산 변형(예: I253A 및 R292P)이 의도된 수용체에 특이적이었음을 (예를 들어, FcRn 수용체 및 FcγRIIb 수용체 대한 결합 친화도가 각각 감소했음을) 확인하였다. FcγRI, FcγRIIa H131, FcγRIIb, 및 FcγRIIIa V158을 대상으로, 시간 분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET) 경쟁 분석 (CISBIO®) 키트를 사용하여 Fc 감마 수용체(FcγRs)에 대한 Fc 작제물 및 대조군의 상대 결합을 측정하였다. 분석 시약은 제조업체의 지침에 따라 제조하였다. 자동화된 액체 핸들러(Freedom EVOware 150, TECAN®)를 사용하여 샘플당 1개의 블랭크가 포함된 일련의 10포인트, 3 배 연속 희석물을 생성하였다. 분석 플레이트를 PHERAstar 형광 판독기(BMG Labtech GmBh) 상에서 665 및 620 nm에서 판독하였다. IgG1 샘플을 대조군으로서 사용하였다. 도 19a~19d는 IgG1 대조군과 비교하여 작제물 16 및 작제물 18에서의 R292P 돌연변이가 gRI, FcγRIIa 및 FcγRIIIa 결합에 미치는 영향을 최소화하면서 FcγRIIb-발현 세포에 대한 결합을 극적으로 감소시켰음을 보여준다. 그러나, 작제물 6과 작제물 4의 결합 프로파일의 유사성, 및 작제물 18과 작제물 16의 결합 프로파일의 유사성에 의해 입증된 바와 같이, I253A 돌연변이는 임의의 Fc 감마 수용체에 대한 결합에 최소한의 영향을 미쳤다.
위치 I253 및 R292에서의 아미노산 변형(예: I253A 및 R292P)이 FcRn 결합에 미치는 영향을 평가하기 위해, pH 6.0에서 센서-결합 Fc 작제물에 대한 액상 인간 FcRn의 친화도 및 정규화된 결합 수준을 측정하기 위한 표면 플라스몬 공명(SPR) 결합 실험을 설계하였다. 아민 결합 화학물질을 사용하여 염소 항인간 IgG를 기준 표면 및 시험 센서 표면 상에 고정시켰다. Fc 작제물을 시험 센서 표면 상에서 포획하였다. 재조합 인간 FcRn을 1.0 μM의 최대 농도를 갖는 희석 시리즈로 만들어 센서 표면 위로 흘렸다. 각 사이클 종료 시, 10 mM 글리신(pH 1.7)을 사용해 센서 표면을 재생시켰다. 이중 기준을 뺀 센서그램에 대해 평형 결합 분석을 실시하였고; 최대 결합 수준(RMax) 및 평형 해리 상수(KD)는 추정하였다. 정규화된 최대 결합 수준은 RMax를 FC-작제물 포획 수준으로 나누어 계산하였다. 작제물 16은 작제물 4와 동일한 수준으로 포획되었는데, 이는 예상대로 FcRn에 대한 결합 손실이 없었음을 나타내는 것이다(도 20). 작제물 6과 작제물 18은 포획 수준이 크게 감소한 것으로 나타났는데, 이는 의도한 바와 같이, 2개의 Fc 도메인이 FcRn에 대한 친화도를 상실한 것과 일관되는 것이다(도 20). 마찬가지로, FcRn 결합을 제한하도록 3개의 도메인 모두에서 돌연변이를 가진 작제물 7과 작제물 19는 FcRn에 결합하지 않았다(도 20).
종합적으로, 본 데이터는, FcγRIIb에 대한 결합을 감소시키는 돌연변이(예: R292P와 같은 위치 R292에서의 아미노산 변형)가 다른 Fc 감마 수용체에 대한 결합에 거의 영향을 미치지 않고 FcRn 결합에 미치는 영향을 최소화하면서 의도된 효과를 가졌음을 입증한다. 마찬가지로, FcRn에 대한 결합을 감소시키는 돌연변이(예를 들어, I253A와 같은 위치 I253에서의 아미노산 변형)는 Fc 감마 수용체 결합에 미치는 영향을 최소화하면서 원하는 효과를 가졌다. 또한, 2개의 돌연변이(예: I253A 및 R292P와 같은 I253 및 R292 돌연변이)를 조합하여 FcγRIIb 및 FcRn 둘 다에 대한 Fc 작제물의 결합을 감소시킬 수 있었다.
실시예 11. 마우스에서 Fc 수용체 약동학에 대한 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
결합 관련 돌연변이가 약동학에 미치는 영향은 먼저, 3개의 Fc 도메인 모두에서 FcγRIIb 결합을 감소시킨 작제물 4, 작제물 16과 2개의 Fc 도메인에서 FcRn 결합을 감소시킨 작제물 6을 비교하여 평가하였다. 전형적인 IgG 거동을 나타내는 IVIg를 비교자(comparator)로서 포함시켰다. 암컷 C57BL/6 마우스(n=15, 8~10주령)에게 0.1 g/kg의 작제물 4, 작제물 6, 작제물 16, 또는 IVIg를 각각 정맥내(i.v.) 투약하였다. 15분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 및 5일의 교대 시간의 시점마다 4마리의 마우스의 사두정맥으로부터 혈액 샘플(50 μL)을 채취하였다. 7, 9, 11, 14, 16, 21 및 23일차에 모든 마우스로부터 채혈을 하였다. Fc 작제물 및 IVIg의 혈청 농도는 인간 IgG1 Fc-특이적 ELISA로 측정하였다. 도 21에서 입증된 바와 같이, Fc 작제물 6 및 작제물 16 둘 다는 더 긴 생체 내 지속성을 나타냈고 평균 체류 시간(MRT)이 1.2배 내지 1.5배 향상되었다(이전에는, 향상(예: 3배 내지 4배)을 곡선 아래 면적(AUC)으로 측정함).
FcRn을 향하는 I253A 아미노산 변형 원자가(valency)가 약동학에 미치는 영향을 더 자세히 알아보기 위해, 전술한 바와 같이 FcRn에 대한 친화성이 감소된 1, 2 또는 3개의 도메인을 갖는 3개의 화합물을 비교하였다. 도 22에서 알 수 있듯이, 모든 돌연변이체는 모체 화합물보다 더 오래 지속되었다. 평균 체류 시간(MRT)은 FcRn에 대한 친화도를 감소시키도록 변형된 각각의 Fc 도메인에 의해 체계적으로 증가하였다. 약물 노출도 AUC로 측정할 수 있다.
돌연변이를 조합하는 것의 효과도 조사하였다(도 23). 두 수용체 모두에 대한 돌연변이의 통합은 FcγRIIb에 대한 결합을 감소시킴으로써, 본 연구에서 달성된 MRT의 2배 향상과 비교해 MRT를 3배 향상시켰다. 6배 향상과 같은 약물 노출도 AUC에 의해 측정될 수 있다.
실시예 12. 시험관 내 효능에 대한 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
Fc 감마 수용체를 향하는 원자가에 민감한 것으로 이전에 나타난 분석법을 사용해 돌연변이 결합이 시험관 내 효능에 미치는 영향을 평가하였다. THP-1 세포 내 식균작용의 억제는 모든 Fc 작제물 간에 비슷하였다(도 24). THP-1 세포를 96-웰 플레이트 내에 도말하였다. Fc 작제물을 10배로 연속 희석하여 세포에 첨가하였다. 37℃에서 15분 동안 인큐베이션을 진행하고; 이어서, FITC-표지된 토끼-IgG가 코팅된 라텍스 비드(Cayman Chemical)를 세포에 첨가하였다. 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. 세포를 2회 세척하고 100 μL의 FACS 완충액(PBS/2% FBS)에 재현탁하고; 트리판 블루(Trypan blue)를 첨가하여 세포 표면 FITC 신호를 ??칭하고, BD Canto 유세포 계측기 상에서 샘플을 판독하였다. 데이터는, 억제제가 없는(100% 식균작용) 상태에서의 총 세포 개체군과 비교한 FITC-양성 세포의 백분율로서 보고된다.
플레이트-결합된 IgG로 자극된 단핵세포에 의한 IL-8의 방출은 모든 Fc 작제물에 의해 비슷하게 억제되었다(도 25). Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Life Sciences) 상에서 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 인간 공여자(Research Blood Components)의 연막(buffy coats)으로부터 PBMC를 단리하였다. 단핵구는 CD16 고갈이 없는 인간 단핵구 풍부화 키트(Human Monocyte Enrichment Kit, StemCell Technologies)를 사용해 음성 선별에 의해 단리하였다. 50 μl의 100 μg/mL 인간 IgG1(SouthernBiotech)로 밤새 코팅된 96-웰 플레이트를 사용하여 FcγR-매개 사이토카인 생산을 자극하였다. IVIg 또는 각 Fc 작제물은 분석에서의 최종 농도의 2배로 배양 플레이트에서 연속 희석하였다. 정제된 단핵구(웰당 1.5 Х 105 세포)를 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션하여, 배양 상청액을 IL-8 농도에 대해 분석하였다(고 풍부 IL-8용 주문 제작 Human Cytokine 키트, Meso Scale Discovery사).
마찬가지로, ADCC의 억제는 모든 Fc 작제물에 걸쳐 비슷하였다(도 26). NK 세포(Hemacare)를 해동하고 LGM-3 배지(Lonza)에서 밤새 레스팅하였다. 50K:10K의 작용자:표적 세포의 비율로 NK 세포를 첨가하기 전에, 배양된 Raji 세포를 각각의 시험 화합물과 리툭시맙(2ug/mL)이 상이한 농도로 존재하는 가운데 30분 동안 인큐베이션하였다. NK 세포와 Raji 세포도 프로브가 단독으로 존재하는 가운데 플레이팅하였다. 세포를 6시간 동안 인큐베이션하였다. Cytotox-Glo를 판독물로서 사용하였다.
모든 분석에서, 돌연변이가 효능의 감소에 미치는 영향은 무시할 정도였다.
실시예 13. 생체 내 효능에 대한 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
수용체 결합 돌연변이가 활성에 미치는 영향을 더 평가하기 위해, 콜라겐 항체-유도 관절염(CAIA) 모델을 사용하여 Fc 구축물을 생체 내에서 시험하였다. 콜라겐 II에 대한 4개의 항체로 이루어진 관절염 유발성 단클론 항체 칵테일(ArthritoMab, MDBiosciences; 8 mg)을 수컷 C57BL/6 마우스에게 복강내(i.p.) 주사하였다. 4일차에, 지질다당류(lipopolysaccharide) 100 μg을 동물에게 복강내 주사하였다. 치료적 투여의 경우, 6일차에 동물들을 질환 중증도에 기초하여 여러 연구 그룹으로 무작위 배정하되, 질환 유도가 부족한 (무작위 배정일에 0점인) 동물들은 제외하고, 비히클 또는 시험 화합물을 정맥내(i.v.) 투여하였다. 예방적 투여의 경우, 1일차에서 -14일차의 범위(일차는 0은 생략하고 숫자를 부여함)에서 단 하루에 비히클 또는 테스트 화합물을 동물에게 정맥내 투여하였다. 임상 점수 파라미터는 다음과 같았다: 0 = 정상, 종창, 발적, 또는 변형(distortion) 없음; 완전한 관절 유연성. 1 = 경증 관절염: 경미한 종창 및/또는 변형; 완전한 관절 유연성. 2 = 중등도 관절염: 중등도의 종창 및/또는 변형; 관절 유연성 또는 악력의 감소. 3 = 중증 관절염: 중증의 종창 및/또는 변형; 관절 유연성 또는 악력의 심각한 감소. 4 = 폐색된 관절; 관절 유연성이 없고 심각하게 손상된 움직임; 빈사상태(moribund). 12일 후에 동물을 희생시켰다.
도 27에 도시된 바와 같이, FcγRIIb(작제물 16), FcRn(작제물 6), 또는 둘 모두(작제물 18)에 대한 결합을 감소시키는 것은 부모 분자(작제물 4)에 비해 효능에 최소한의 영향을 미쳤다.
실시예 14. 생체 내 반응의 지속성에 대한 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
CAIA 모델에서의 마우스를, 관절염 유발성 항체를 주입하기 최대 14일 전에 예방적으로 치료하였다. 도 28에서 알 수 있듯이, 1일차의 예방적 치료는 작제물 4를 사용하는 것보다 더 늦게 제거되는 Q1(작제물 18)을 사용했을 때가 더 효과적이었는데, 이는 수일간의 질환 유도에 걸쳐 약물에 더 많이 노출되었기 때문인 것으로 추정된다. 작제물 4의 화합물은 질환 유도 3일 전에 투여되었을 때 효과를 상실한 반면(도 29), Q1(작제물 18)은 질환 유도의 최대 7일 전에 투여한 경우조차도 보호를 제공하였다(도 30). 질환 유도 10일 전에 투여했을 때는 두 작제물 모두 효과가 없었다(도 31). 이러한 결과는 작제물 4와 비교해 작제물 18의 더 긴 약동학적 프로파일이 더 강력한 반응의 지속성으로 번역되었음을 입증하는 것이다.
CAIA 모델에서의 예방적 투여는 1일차(도 32), -3일차(도 33), -7일차(도 34), 또는 -10일차(도 35)에 100 mg/kg의 작제물 4(부모 분자), 작제물 18(2개의 도메인에서의 I253A 및 3개의 도메인에서의 R292P)(Q1), 또는 작제물 19(3개의 도메인 모두에서의 I253A 및 R292P)로 수행하였다. 비히클 대조군(식염수)은 1일차에만 투약하였다.
도 32는 콜라겐 항체-유도 관절염(CAIA) 모델에서, 1일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선), 또는 식염수(회색 원, 쇄선)의 효능을 비교하는 그래프이다. 도 33은 -3일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 또는 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선)를 비교하는 그래프이다. 도 34는 -7일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 또는 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선)를 비교하는 그래프이다. 도 35는 -10일차에 100 mg/kg으로 투약된 작제물 4(AA: 검은 사각형, 실선), 작제물 18(Q1: 검은 삼각형, 파선), 또는 작제물 19(Q2: 검은 마름모, 점선)를 비교하는 그래프이다. 각각의 경우, 동일한 부피의 식염수(회색 원, 쇄선)를 1일차에 투약하였다. 평균 및 평균의 표준 오차가 각각의 시간 지점에 표시되어 있다.
실시예 15. Fc 다량체에 미치는 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
Strome 등의 US 2010/0239633 A1; Jain 등의 Arthritis Res. Ther. 14, R192 (2012)에 기술된 바와 같이 Fc 다량체를 생성하였다. 구체적으로는, IgG1 Fc를 C-말단에서 IgG2 힌지 서열에 융합하였다. 야생형 IgG1 Fc 서열(작제물 X1)을 사용하고 I253A/R292P 이중 돌연변이(작제물 X2)를 사용하여 DNA 작제물을 생성하였다. DNA 플라스미드 작제물을 리포좀을 통해 HEK293 세포에 형질주입하였다. 7일간의 배양 후에, 세포를 원심분리로 제거하였다.
발현된 단백질을 Poros MabCapture A 컬럼을 사용하는 단백질 A-기반 친화 컬럼 크로마토그래피에 의해 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 포획된 작제물을 인산염 완충 식염수로 세척하였고(저염 세척) pH 3의 100 mM 글리신으로 용리하였다. 용출액을 1 M TRIS(pH 7.4)의 첨가로 빠르게 중화하였고, 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
단백질을 Poros XS 수지를 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 분류하였다. 컬럼을 50 mM MES, pH 6(완충액 A)로 사전 평형화하였고, 샘플을 로딩 전에 평형 완충액(equilibration buffer)에 희석하였다. 샘플을 용출 완충액으로서 50 mM MES, 400 mM 염화나트륨, pH 6(완충액 B)으로 다중 단계 구배를 사용하여 용리하였다. 구배 단계는 저분자량 종을 제거하기 위해 2 컬럼 부피(CV)에 대해 0~40%의 B를 포함하고, 단계는 40% B(4 CV)에서 정지한 후 표적 종을 단리하기 위해 40~80% B(4 CV)로 이어지고 이어서 연속적으로 100% B로 증가시켰다. 모든 단백질-함유 분획물을 크기 배제 크로마토그래피 분석으로 스크리닝하였고 성분을 280 nm에서 흡광도에 의해 정량분석하였다. Fc(대략 50 kDa) + Fc 이량체(대략 100 kDa)의 8%를 초과하는 총 함량을 갖는 분획물을 배제시켰다. 작제물 X1의 경우, 남아 있는 모든 분획물을 조합하였다. 작제물 X1와 X2 사이의 분자량 분포의 변화로 인해, 작제물 X2의 분획을 선택하여 작제물 X1의 분자량 분포를 모방하였다.
이온 교환 후에, 표적 분획물을 접촉 유동 여과 시스템상에서 30 kDa 컷오프 폴리에테르설폰(PES) 막 카트리지를 사용하여 PBS로 완충액 교환하였다. 샘플을 대략 30 mg/mL로 농축하였고 0.2 μm 필터로 멸균 여과하였다.
작제물 4와 작제물 X1의 분자량 분포를 분석 크기 배제 크로마토그래피(도 36)(정제된 작제물 X1(회색) 및 X2(검정)을 피크 최대치로 정규화함) 및 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(도 37)(정제된 작제물 X1(우측), 정제된 작제물 X2(중간), 및 분자량 표준(우측). 두 작제물의 동일한 질량을 로딩하였음)에 의해 비교하였다. 작제물 X1과 X2는, 대부분 250 kDa를 초과하는 다수의 밴드를 가지고 단일 성분이 없는 약 100 kDa(2개의 Fc 도메인) 이상의 범위에 있는 다수의 종을 포함한다. 작제물 X2의 크기 분포는 작제물 X1과 유사하지만, 약간 더 넓으며 최고 분자량 및 최저 분자량 성분 둘 다가 더 많다.
암컷 C57BL/6 마우스(n=15, 8주령)에 작제물 X1 또는 작제물 4를 각각 0.1 g/kg으로 정맥내(i.v.) 투약하였다. 혈액(25 μL)을 하악 정맥에서 채취하였고 혈청을 얻기 위해 처리하였다. 그룹 당 5마리의 마우스를 5일에 걸쳐 교호 시간 지점에서 채혈하였고, 나머지 시간 지점에 대해 각 그룹에서 15마리의 마우스 전부로부터 채혈하였다. 채취 시간 지점은 15 및 30분; 1, 2, 4, 6, 8 및 24시간; 2일을 포함하였다. Fc 다량체 혈청 농도를 Fc 특이적 탐지 항체를 사용해 항인간 IgG ELISA로 결정하였다.
도 38에서 입증된 바와 같이, 작제물 X1의 혈청 수준은 각각의 시간 지점에서 작제물 X2의 혈청 수준보다 낮다. I253A 및 R292P 돌연변이를 작제물 X2에 도입한 결과 상응하는 야생형 재료(작제물 X1)와 비교하여 Fc 다량체의 제거가 지연되었다.
실시예 16. 시노몰구스 원숭이에서 Fc 수용체 약동학에 대한 I253A 및 R292P 아미노산 변형의 평가
시노몰구스 원숭이에서 약동학에 미치는 결합-관련 돌연변이의 영향을 작제물 6, 16, 및 18을 비교함으로써 평가하였다. 작제물 4에 대한 이력 데이터는 작제물 6, 16 및 18을 비교하는 연구와 상이한 용량 수준에서 수행된 시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 연구로부터 가져왔다. 수컷 시노몰구스 원숭이(N=3)에게 10 또는 30 mg/kg의 작제물 6, 16 및 18 각각을 정맥내(i.v.) 투여하였다. 44일에 걸쳐 혈액 샘플을 채취하였다. 작제물 4, 6, 16 및 18을 포함하여, 인간 IgG1 Fc 작제물에 특이적인 항체를 사용하여 ELISA에 의해 Fc 작제물 농도를 결정하였다.
도 39에서 입증된 바와 같이, 10 mg/kg으로 투여된 작제물 16은 20 mg/kg으로 투여된 작제물 4보다 생체 내에서 더 오래 지속된다. 10 mg/kg으로 투여된 작제물 18은 20 mg/kg에서 투여된 작제물 4와 유사한 생체 내 지속성을 갖는다. 10 mg/kg으로 투여된 작제물 6은 20 mg/kg에서 투여된 작제물 4만큼 오랫동안 생체 내에서 지속되지 않는다.
도 40에서 입증된 바와 같이, 30 mg/kg으로 투여된 작제물 16은 20 또는 50 mg/kg으로 투여된 작제물 4보다 생체 내에서 더 오래 지속된다. 30 mg/kg으로 투여된 작제물 18의 지속성은 작제물 4가 20 mg/kg으로 투여되었을 때의 지속성과 50 mg/kg으로 투여되었을 때의 지속성의 중간이다. 30 mg/kg으로 투여된 작제물 6은 20 또는 50 mg/kg으로 투여된 작제물 4만큼 오랫동안 생체 내에서 지속되지 않는다.
시노몰구스 원숭이에서의 약동학적 거동이 마우스에서의 약동학적 거동과 상이하다는 것은 주목할 만하다. 마우스에서, FcRn 및 Fc 감마 RIIb 결합의 감소 둘 다는 각각 지속성을 증가시켰으며, 이들 둘 다의 조합은 지속성을 더 증가시켰다. 시노몰구스 원숭이에서, FcRn의 감소는 지속성을 감소시켰고, Fc 감마 RIIb 결합의 감소는 지속성을 증가시켰으며, 이들의 조합은 부모 분자(구조체 4)와 비교해 지속성의 순 변화에 거의 영향을 미치지 않았다.
다른 구현예
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 독립적인 간행물 도는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로서 포함되는 것으로 나타내어진 것처럼 그와 같은 정도로 본원에 참조로서 포함된다.
본 개시는 이의 구체적 구현예와 관련하여 기술되어 있지만, 추가의 변형이 가능하고 본 출원은 일반적으로 본 개시의 원리를 따르고 본 개시가 관련된 분야에 공지되거나 통상적인 관행에 속하고 상기 기술된 본질적 특징에 적용될 수 있는 본 개시에서부터의 이러한 변경을 포함하는 본 개시의 임의의 변형, 사용 또는 응용을 포함하도록 의도되며, 청구항의 범주를 따르는 것으로 이해될 것이다.
기타 구현예는 청구 범위 내에 포함된다.
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<220>
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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 52
<211> 225
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc domain monomer, short chain polypeptide
<400> 52
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 53
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc domain monomer, short chain polypeptide
<400> 53
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 54
<211> 474
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fc construct long polypeptide with N-terminal Asp to Gln
<400> 54
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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210 215 220
Pro Gly
225
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<212> PRT
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<220>
<223> Long polypeptide
<400> 74
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 75
<211> 473
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Long polypeptide
<400> 75
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
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100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
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<211> 473
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Long polypeptide
<400> 76
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 77
<211> 473
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Long polypeptide
<400> 77
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 78
<211> 473
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Long polypeptide Construct 18/Q1
<400> 78
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 79
<211> 473
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Long polypeptide construct 19/Q2
<400> 79
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 80
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker sequence
<400> 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Claims (163)
- Fc 작제물로서,
a) i) 제1 Fc 도메인 단량체;
ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및
iii) 상기 제1 Fc 도메인 단량체를 상기 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드;
b) i) 제3 Fc 도메인 단량체;
ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및
iii) 상기 제3 Fc 도메인 단량체를 상기 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하되,
상기 제1 Fc 도메인 단량체 및 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제3 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하며;
상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드 각각이
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 76)의 서열을 포함하고,
상기 제3 폴리펩티드 및 상기 제4 폴리펩티드 각각이
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 70)의 서열을 포함하는, Fc 작제물. - Fc 작제물로서,
a) i) 제1 Fc 도메인 단량체;
ii) 제2 Fc 도메인 단량체; 및
iii) 상기 제1 Fc 도메인 단량체를 상기 제2 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제1 폴리펩티드;
b) i) 제3 Fc 도메인 단량체;
ii) 제4 Fc 도메인 단량체; 및
iii) 상기 제3 Fc 도메인 단량체를 상기 제4 Fc 도메인 단량체에 결합시키는 링커를 포함하는 제2 폴리펩티드;
c) 제5 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제3 폴리펩티드; 및
d) 제6 Fc 도메인 단량체를 포함하는 제4 폴리펩티드를 포함하되,
상기 제1 Fc 도메인 단량체 및 제5 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제1 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제2 Fc 도메인 단량체 및 제4 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제2 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제3 Fc 도메인 단량체 및 제6 Fc 도메인 단량체는 조합되어 제3 Fc 도메인을 형성하며;
상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드 각각이
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 78)의 서열을 포함하고,
상기 제3 폴리펩티드 및 상기 제4 폴리펩티드 각각이
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMASRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVDGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (서열번호 73)의 서열을 포함하는, Fc 작제물. - 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질병을 치료하기 위한, 제1항의 Fc 작제물을 포함하는 약학적 조성물:
류마티스 관절염(RA); 전신 홍반성 루푸스(SLE); ANCA-관련 혈관염; 항인지질 항체 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 만성 염증성 탈수초성 신경병증; 피부근염; 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's Syndrome); 항체-의존성 세포 매개 세포 독성을 통해 매개되는 기관계-표적 II형 과민반응 증후군(organ system-targeted type II hypersensitivity syndromes), 길랑 바레 증후군(Guillain Barre syndrome), CIDP, 피부근염, 펠티 증후군(Felty's syndrome), 항체 매개 거부반응, 자가면역성 갑상선 질환, 궤양성 대장염, 자가면역성 간 질환; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 중증 근무력증, 시신경 척수염; 천포창 및 자가면역성 수포 질환; 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome); 항체-의존성 식균 작용을 통해 매개되는 자가면역성 혈구감소증; FcR-의존성 염증 증후군, 활액막염(synovitis), 전신성 혈관염, 사구체염 및 혈관염. - 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질병을 치료하기 위한, 제2항의 Fc 작제물을 포함하는 약학적 조성물:
류마티스 관절염(RA); 전신 홍반성 루푸스(SLE); ANCA-관련 혈관염; 항인지질 항체 증후군; 자가면역 용혈성 빈혈; 만성 염증성 탈수초성 신경병증; 피부근염; 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's Syndrome); 항체-의존성 세포 매개 세포 독성을 통해 매개되는 기관계-표적 II형 과민반응 증후군(organ system-targeted type II hypersensitivity syndromes), 길랑 바레 증후군(Guillain Barre syndrome), CIDP, 피부근염, 펠티 증후군(Felty's syndrome), 항체 매개 거부반응, 자가면역성 갑상선 질환, 궤양성 대장염, 자가면역성 간 질환; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 중증 근무력증, 시신경 척수염; 천포창 및 자가면역성 수포 질환; 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome); 항체-의존성 식균 작용을 통해 매개되는 자가면역성 혈구감소증; FcR-의존성 염증 증후군, 활액막염(synovitis), 전신성 혈관염, 사구체염 및 혈관염. - 삭제
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