ES2962694T3 - Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas - Google Patents
Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas Download PDFInfo
- Publication number
- ES2962694T3 ES2962694T3 ES15785583T ES15785583T ES2962694T3 ES 2962694 T3 ES2962694 T3 ES 2962694T3 ES 15785583 T ES15785583 T ES 15785583T ES 15785583 T ES15785583 T ES 15785583T ES 2962694 T3 ES2962694 T3 ES 2962694T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- domain
- domain monomer
- monomer
- polypeptide
- construct
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 13
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 466
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 277
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 235
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 225
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 claims description 113
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 91
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 44
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 35
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 33
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 30
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 27
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 18
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 claims description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 11
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 claims description 10
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 10
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 10
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 claims description 10
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 claims description 10
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 9
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 claims description 8
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 claims description 8
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 claims description 7
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 7
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 claims description 6
- 206010021245 Idiopathic thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 claims description 5
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 claims description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000003343 Antiphospholipid Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 claims description 4
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000027761 Hepatic autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 4
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 claims description 4
- 102000015094 Paraproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010064255 Paraproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 claims description 4
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000004732 Systemic Vasculitis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 claims description 4
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024389 cytopenia Diseases 0.000 claims description 4
- 208000033699 familial Guillain-Barre syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000008795 neuromyelitis optica Diseases 0.000 claims description 4
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 claims description 4
- 208000010928 autoimmune thyroid disease Diseases 0.000 claims 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 abstract description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 115
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 67
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 56
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 51
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 25
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 20
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 16
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 12
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 8
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 8
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 7
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 208000030939 Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy Diseases 0.000 description 6
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 201000005795 chronic inflammatory demyelinating polyneuritis Diseases 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 208000028622 Immune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 5
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 201000003067 thrombocytopenia due to platelet alloimmunization Diseases 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N (2r)-2-amino-5-[[(2r)-1-(carboxymethylamino)-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid;hydrobromide Chemical compound Br.OC(=O)[C@H](N)CCC(=O)N[C@H](CO)C(=O)NCC(O)=O JARGNLJYKBUKSJ-KGZKBUQUSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 4
- 108010044804 gamma-glutamyl-seryl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 208000028387 Felty syndrome Diseases 0.000 description 3
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 3
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 3
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 3
- 206010054000 Type II hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 3
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 3
- -1 no more than 20 Chemical class 0.000 description 3
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 230000008026 type II hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000005734 heterodimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000011201 multiple comparisons test Methods 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000009834 selective interaction Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101001084702 Arabidopsis thaliana Histone H2B.10 Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 101710189008 Immunoglobulin kappa light chain Proteins 0.000 description 1
- 102100029567 Immunoglobulin kappa light chain Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 239000012509 POROS® XS resin bead Substances 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000015286 negative regulation of phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
- A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
La presente invención se refiere a composiciones y métodos de construcciones Fc de IgG modificadas genéticamente, en las que dichas construcciones Fc incluyen uno o más dominios Fc. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas
ESTADO DE LA TÉCNICA
[0001] Las proteínas terapéuticas, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos y proteínas de fusión a Fc, se han convertido rápidamente en una clase de fármacos clínicamente importante para pacientes con enfermedades inmunológicas e inflamatorias. El documento WO 2008/151088 A2 se refiere al uso de partes funcionales estabilizadas de fragmentos Fc de IgG para el tratamiento y la profilaxis de afecciones patológicas mediadas por células derivadas de monocitos.
CARACTERÍSTICAS DE LAINVENCIÓN
[0002] De acuerdo con la presente invención, se proporciona una construcción de Fc y objetos de protección relacionados tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
[0003] De manera más general, la presente divulgación proporciona construcciones terapéuticas que contienen dominios Fc biológicamente activas. Tales construcciones pueden tener una semivida en suero y/o afinidad de unión y/o avidez por receptores de Fc deseables. Estas construcciones son útiles, por ejemplo, para reducir la inflamación en un sujeto, para promover la depuración de autoanticuerpos en un sujeto, para suprimir la presentación de antígenos en un sujeto, para bloquear una respuesta inmune, por ejemplo, para bloquear una activación de la respuesta inmune basada en un complejo inmune en un sujeto, y para tratar enfermedades inmunológicas e inflamatorias (por ejemplo, enfermedades autoinmunes) en un sujeto. Las construcciones de Fc descritas en el presente documento pueden utilizarse en el tratamiento de los pacientes que padecen enfermedades inmunológicas e inflamatorias sin estimulación significativa de células inmunes.
[0004] De manera general, la divulgación proporciona construcciones de Fc que tiene 2-10 dominios Fc, por ejemplo, construcciones de Fc que tienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dominios Fc. En algunas realizaciones de la divulgación, la construcción de Fc incluye 2-10 dominios Fc, 2-5 dominios Fc, 3-5 dominios Fc, 2-8 dominios Fc o 2-6 dominios Fc. La construcción puede incluir 2-6 (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 6) polipéptidos asociados, incluyendo cada polipéptido como mínimo un monómero de dominio Fc, en donde cada monómero de dominio Fc de la construcción es el mismo o se diferencia en no más de 20 aminoácidos (por ejemplo, en no más de 15, 10 aminoácidos), por ejemplo, en no más de 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 aminoácidos, de otro monómero de la construcción. Las construcciones de Fc descritas en el presente documento no incluyen un dominio de unión a antígeno de una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, la construcción de Fc (o un dominio Fc con una construcción de Fc) está formada completamente o en parte por la asociación de monómeros de dominio Fc que están presentes en diferentes polipéptidos. En determinadas realizaciones, la construcción de Fc no incluye un dominio adicional (por ejemplo, una parte de cola de IgM o una parte de cola de IgA) que promueve la asociación de dos polipéptidos. En otras realizaciones, los enlaces covalentes están presentes en la construcción de Fc solamente entre dos monómeros de dominio Fc que se unen para formar un dominio Fc. En otras realizaciones, la construcción de Fc no incluye enlaces covalentes entre dominios Fc. En aún otras realizaciones, la construcción de Fc proporciona suficiente flexibilidad estructural de tal modo que todos o sustancialmente todos los dominios Fc en la construcción de Fc son capaces de interactuar de manera simultánea con un receptor de Fc en la superficie celular. En algunas realizaciones, la construcción de Fc incluye como mínimo dos dominios Fc unidos a través de un enlazador (por ejemplo, un espaciador de aminoácido flexible). En una realización, los monómeros de dominio son diferentes en la secuencia primaria del tipo salvaje o entre sí en el hecho de que posean módulos de selectividad de dimerización.
[0005] Una construcción de Fc de la divulgación se puede incluir en una composición farmacéutica que incluye una población sustancialmente homogénea (por ejemplo, como mínimo 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de homogeneidad) de la construcción de Fc que tiene 2-10 dominios Fc, por ejemplo, una construcción que tiene 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dominios Fc, tales como las que se describen en el presente documento. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas se pueden producir del modo que no tengan agregación sustancial o multimerización no deseada de construcciones de Fc.
[0006] En un aspecto de la divulgación, la construcción de Fc incluye tres polipéptidos que forman dos dominios Fc. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L-B, en donde A incluye un primer monómero de dominio Fc; L es un enlazador; y B incluye un segundo monómero de dominio Fc. El segundo polipéptido incluye un tercer monómero de dominio Fc, y el tercer polipéptido incluye un cuarto monómero de dominio Fc. En este aspecto, el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc. De manera similar, el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc. Las construcciones de Fc de ejemplo de este aspecto de la divulgación están representadas en las Figuras 4 y 6.
[0007] En determinadas realizaciones, el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre estos monómeros de dominio Fc. En otras realizaciones, el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre estos monómeros de dominio Fc.
[0008]En determinadas realizaciones, uno o más de A, B, el segundo polipéptido y el tercer polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc. En una realización, cada uno de A, B, el segundo polipéptido y el tercer polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc.
[0009]En determinadas realizaciones, la construcción de Fc puede incluir adicionalmente un resto heterólogo, por ejemplo, un péptido, por ejemplo, un péptido que se une a proteína de suero, por ejemplo, un péptido de unión a albumina. El resto puede unirse al extremo N-terminal o al extremo carboxilo terminal de B o el tercer polipéptido, por ejemplo, mediante un enlazador.
[0010]En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un dominio constante de anticuerpo Cl de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG. El dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG se puede acoplar al extremo N-terminal de A o el segundo polipéptido, por ejemplo, mediante un enlazador.
[0011]En otras realizaciones, el segundo y el tercer polipéptido de la construcción de Fc poseen la misma secuencia de aminoácidos.
[0012]La presente invención se refiere a una construcción de Fc que incluye cuatro polipéptidos que forman tres dominios Fc. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L-B, en donde A incluye un primer monómero de dominio Fc; L es un enlazador; y B incluye un segundo monómero de dominio Fc. El segundo polipéptido tiene la fórmula A'-L'-B', en donde A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; L' es un enlazador; y B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc. El tercero polipéptido incluye un quinto monómero de dominio Fc, y el cuarto polipéptido incluye un sexto monómero de dominio Fc. En este aspecto de la presente invención, A y A' se combinan para formar un primer dominio Fc, B y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y B' y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc. Una construcción de Fc de ejemplo que tiene esta estructura está representada en la Figura 5.
[0013]En la presente invención, cada uno de dichos monómeros de dominio Fc es un monómero de dominio Fc de IgG1.
[0014]En la presente invención, cada uno de A y A' incluye un módulo de selectividad de dimerización que promueve la dimerización entre estos monómeros de dominio Fc. En la presente invención, cada uno de B y el quinto monómero de dominio Fc incluye un módulo de selectividad de dimerización que promueve la dimerización entre estos monómeros de dominio Fc. En la presente invención, cada uno de B' y el sexto monómero de dominio Fc incluye un módulo de selectividad de dimerización que promueve la dimerización entre estos monómeros de dominio Fc. En la presente invención, dichos módulos de selectividad de dimerización complementarios se seleccionan entre : módulos de selectividad de dimerización que comprenden una cavidad manipulada en el dominio CH3 de uno de dichos monómeros de dominio Fc y una protuberancia manipulada en el dominio CH3 del otro de dichos monómeros de dominio Fc, en donde dicha cavidad manipulada y dicha protuberancia manipulada están situados para formar una pareja de protuberancia alojada en la cavidad de monómeros de dominio Fc; y módulos de selectividad de dimerización que comprenden un aminoácido cargado negativamente en el dominio CH3 de uno de dichos monómeros de dominio y un aminoácido cargado positivamente en el dominio CH3 del otro de dichos monómeros de dominio Fc, en donde dicho aminoácido cargado negativamente y dicho aminoácido cargado positivamente están situados para promover la formación de un dominio Fc.
[0015]En determinadas realizaciones, uno o más de A, B, A', B', el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc. En una realización, cada uno de A, B, A', B', el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido consiste en un monómero de dominio Fc.
[0016]En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un dominio constante de anticuerpo Cl de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG, en donde el dominio constante de anticuerpo Cl de IgG se acopla al extremo N-terminal del dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG mediante un enlazador y el dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG se acopla al extremo N-terminal de A, por ejemplo, mediante un enlazador. En una realización, la construcción de Fc incluye adicionalmente un segundo dominio constante de anticuerpo Cl de IgG y un segundo dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG, en donde el segundo dominio constante de anticuerpo Cl de IgG se acopla al extremo N-terminal del segundo dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG, por ejemplo, mediante un enlazador y el segundo dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG se acopla al extremo N-terminal de A', por ejemplo, mediante un enlazador.
[0017]En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un resto heterólogo, por ejemplo, un péptido, un péptido de unión a albumina enlazado con el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de B o B', por ejemplo, mediante un enlazador.
[0018]En otras realizaciones, el primer y el segundo polipéptido de la construcción de Fc poseen la misma secuencia de aminoácidos y el tercer y el cuarto polipéptido de la construcción de Fc poseen la misma secuencia de aminoácidos.
[0019] En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que incluye dos polipéptidos. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L-B, en donde A incluye un primer monómero de dominio Fc; L es un enlazador; y B incluye un resto de unión a proteína de suero, por ejemplo, un péptido de unión a albumina. El segundo polipéptido incluye un segundo monómero de dominio Fc. En este aspecto, el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc combinan para formar un dominio Fc.
[0020] En determinadas realizaciones, el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc.
[0021] En determinadas realizaciones, A y el segundo polipéptido consisten cada uno en un monómero de dominio Fc.
[0022] En otro aspecto adicional, la divulgación proporciona una construcción de Fc que incluye dos polipéptidos. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L1-B-L2-C, en donde A incluye un dominio constante de anticuerpo Cl de IgG; cada uno de L1 y L2 es un enlazador; B incluye un dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG; y C incluye un primer monómero de dominio Fc. El segundo polipéptido tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C', en donde A' incluye un dominio constante de anticuerpo C<l>de IgG; cada uno de L1' y L2' es un enlazador; B' incluye un dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG; y C' incluye un segundo monómero de dominio Fc. En este aspecto, el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc combinan para formar un dominio Fc. Una construcción de Fc de ejemplo de este aspecto de la divulgación está representada en la Figura 7A.
[0023] En determinadas realizaciones, el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc.
[0024] En determinadas realizaciones, cada uno de C y C' consiste en un monómero de dominio Fc.
[0025] En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un resto de unión a proteína de suero, por ejemplo, un péptido de unión a albumina enlazado con el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de C o C' mediante un enlazador.
[0026] En aún otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que incluye cuatro o más polipéptidos. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L1-B-L2-C, en donde A incluye un dominio constante de anticuerpo C<l>de IgG; cada uno de L1 y L2 es un enlazador; B incluye un dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG; y C incluye un primer monómero de dominio Fc. El segundo polipéptido tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C', en donde A' incluye un dominio constante de anticuerpo C<l>de IgG; cada uno de L1' y L2' es un enlazador; B incluye un dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG; y C' incluye un segundo monómero de dominio Fc. En este aspecto, el primer monómero de dominio Fc combina con un tercer monómero de dominio Fc para formar un primer dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc combina con un cuarto monómero de dominio Fc para formar un segundo dominio Fc. Adicionalmente, el dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG del primer polipéptido combina con el dominio constante de anticuerpo Cl de IgG del segundo polipéptido y el dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG del segundo polipéptido combina con el dominio constante de anticuerpo C<l>de IgG del primer polipéptido para formar una construcción de Fc que incluye dos o más dominios Fc. Una construcción de Fc de ejemplo de este aspecto de la divulgación está representada en la Figura 7B.
[0027] En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que incluye dos polipéptidos. El primer polipéptido incluye un primer monómero de dominio Fc y el segundo polipéptido incluye un segundo monómero de dominio Fc. En este aspecto, el primer y el segundo monómero de dominio Fc se combinan para formar un dominio Fc. Una construcción de Fc de ejemplo de este aspecto de la divulgación está representada en la Figura 1. Adicionalmente en este aspecto, cada uno del primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc incluye un módulo de selectividad de dimerización que promueve la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc. Las construcciones de Fc de ejemplo de esta realización están representadas en las Figuras 2 y 3.
[0028] En determinadas realizaciones, el primer y el segundo polipéptido consisten cada uno en un monómero de dominio Fc.
[0029] En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un resto de unión a proteína de suero, por ejemplo, un péptido de unión a albumina enlazado con el extremo N-terminal o el extremo C-terminal del primer o el segundo polipéptido, por ejemplo, mediante un enlazador.
[0030] En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que incluye dos polipéptidos. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L-B, en donde A incluye un primer monómero de dominio Fc; L es un enlazador; y B incluye un segundo monómero de dominio Fc. El segundo polipéptido tiene la fórmula A'-L'-B', en donde A' incluye un tercer monómero de dominio Fc; L' es un enlazador; y B' incluye un cuarto monómero de dominio Fc. En este aspecto, el primero y el segundo monómero de dominio Fc incluye cada uno una cavidad manipulada en sus dominios constantes de anticuerpo Ch3 correspondientes y el segundo y el cuarto monómeros de dominio Fc incluyen cada uno una protuberancia manipulada en sus dominios constantes de anticuerpo Ch3 respectivos, en donde la cavidad manipulada y la protuberancia manipulada se ubican para formar una pareja de protuberancia alojada en la cavidad. En este aspecto también, el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc.
[0031] En determinadas realizaciones, uno o más de A, B, A' y B' consisten en un monómero de dominio Fc. En una realización, cada uno de A, B, A' y B' consisten en un monómero de dominio Fc.
[0032] En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un resto de unión a proteína de suero, por ejemplo, un péptido de unión a albumina enlazado con el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de B o B', por ejemplo, mediante un enlazador.
[0033] En determinadas realizaciones, la construcción de Fc incluye adicionalmente un dominio constante de anticuerpo Cl de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG, en donde el dominio constante de anticuerpo Cl de IgG se acopla al extremo N-terminal del dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG, por ejemplo, mediante un enlazador y el dominio constante de anticuerpo Ch1 I gG se acopla al extremo N-terminal de A mediante un enlazador. En una realización, la construcción de Fc incluye adicionalmente un segundo dominio constante de anticuerpo Cl de IgG y un segundo dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG, en donde el segundo dominio constante de anticuerpo C<l>de IgG se acopla al extremo N-terminal del segundo dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG mediante un enlazador y el segundo dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG se acopla al extremo N-terminal de A' mediante un enlazador.
[0034] En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que consiste en a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en donde A incluye o consiste en un primer monómero de dominio Fc; L es un enlazador; y B incluye o consiste en un segundo monómero de dominio Fc; b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en donde A' incluye o consiste en un tercer monómero de dominio Fc; L' es un enlazador; y B' incluye o consiste en un cuarto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye o consiste en un quinto monómero de dominio Fc; y d) un cuarto polipéptido que incluye o consiste en un sexto monómero de dominio Fc. A del primer polipéptido y A' del segundo polipéptido se combinan para formar un primer dominio Fc; B del primer polipéptido y el quinto monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc; y B' del segundo polipéptido y el sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc. Cada uno del primer y el tercer monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el tercer monómero de dominio Fc, cada uno del segundo y el quinto monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc, y cada uno del cuarto y el sexto monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el cuarto monómero de dominio Fc y el sexto monómero de dominio Fc; en donde la construcción de Fc contiene no más de tres dominios Fc.
[0035] En algunas realizaciones de este aspecto, cualquiera de los dos del primer monómero de dominio Fc o el tercer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácido cargado negativamente, y el otro monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácido cargado positivamente, cualquiera de los segundo y cuarto monómero de dominio Fc o el quinto y el sexto monómero de dominio Fc incluyen una protuberancia manipulada, y los otros monómeros de dominio Fc incluyen una cavidad manipulada. En algunas realizaciones, el enlazador L1, L2, L1' y/o L2' tiene 3-200 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador L y/o L' consiste en la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs : 1, 2 y 3.
[0036] En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que consiste en a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en donde A incluye o consiste en un primer monómero de dominio Fc; L1 es un enlazador; B incluye o consiste en un segundo monómero de dominio Fc; L2 es un enlazador; y C incluye o consiste en un tercer monómero de dominio Fc; y b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en donde A' incluye o consiste en un cuarto monómero de dominio Fc; L1' es un enlazador; B' incluye o consiste en un quinto monómero de dominio Fc; L2' es un enlazador; y C' incluye o consiste en un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye o consiste en un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye o consiste en un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye o consiste en un noveno monómero de dominio Fc; y f) un sexto polipéptido que incluye o consiste en un décimo monómero de dominio Fc. A del primer polipéptido y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un primer dominio Fc; B del primer polipéptido y B' del segundo polipéptido se combinan para formar un segundo dominio Fc; C del primer polipéptido y el octavo monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, A' del segundo polipéptido y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' del segundo polipéptido y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc. Cada uno del primer y el séptimo monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el séptimo monómero de dominio Fc, cada uno del segundo y el quinto monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el quinto monómero de dominio Fc, cada uno del tercer y el octavo monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc; cada uno del cuarto y el noveno monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el cuarto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno del sexto y el décimo monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el sexto monómero y el décimo monómero de dominio Fc; en donde la construcción de Fc no contiene más de cinco dominios Fc.
[0037]En algunas realizaciones de este aspecto, cada uno del primer, tercer, cuarto y sexto monómero de dominio Fc incluye una protuberancia manipulada, el segundo monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácido cargado negativamente, el quinto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácido cargado positivamente, y cada uno del séptimo, octavo, noveno y décimo monómero de dominio Fc incluye una cavidad manipulada. En algunas realizaciones, el enlazador L1, L2, L1' y/o L2' tiene 3-200 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador L1, L2, L1' y/o L2' consiste en la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs : 1,2 y 3.
[0038]En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc que consiste en a) un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L1-B-L2-C; en donde A incluye o consiste en un primer monómero de dominio Fc; L1 es un enlazador; y B incluye o consiste en un segundo monómero de dominio Fc; L2 es un enlazador; y C incluye o consiste en un tercer monómero de dominio Fc; y b) un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L1'-B'-L2'-C'; en donde A' incluye o consiste en un cuarto monómero de dominio Fc; L1' es un enlazador; B' incluye o consiste en un quinto monómero de dominio Fc; L2' es un enlazador; y C' incluye o consiste en un sexto monómero de dominio Fc; c) un tercer polipéptido que incluye o consiste en un séptimo monómero de dominio Fc; d) un cuarto polipéptido que incluye o consiste en un octavo monómero de dominio Fc; e) un quinto polipéptido que incluye o consiste en un noveno monómero de dominio Fc; f) un sexto polipéptido que incluye o consiste en un décimo monómero de dominio Fc. A del primer polipéptido y A' del segundo polipéptido se combinan para formar un primer dominio Fc; B del primer polipéptido y el séptimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc; C del primer polipéptido y el octavo monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc, B' del segundo polipéptido y el noveno monómero de dominio Fc se combinan para formar un cuarto dominio Fc, y C' del segundo polipéptido y el décimo monómero de dominio Fc se combinan para formar un quinto dominio Fc. Cada uno del primer y el cuarto monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el cuarto monómero de dominio Fc, cada uno del segundo y el séptimo monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el segundo monómero de dominio Fc y el séptimo monómero de dominio Fc, y cada uno del tercer y el octavo monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el tercer monómero de dominio Fc y el octavo monómero de dominio Fc; cada uno del quinto y el noveno monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el quinto monómero de dominio Fc y el noveno monómero de dominio Fc; y cada uno del sexto y el décimo monómero de dominio Fc incluye módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el sexto monómero de dominio Fc y el décimo monómero de dominio Fc; en donde la construcción de Fc no contiene más de cinco dominios Fc.
[0039]En algunas realizaciones de este aspecto, el primer monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácido cargado negativamente, el cuarto monómero de dominio Fc incluye una sustitución de aminoácido cargado positivamente, cada uno del segundo, tercero, quinto y sexto monómero de dominio Fc incluye una protuberancia manipulada, y cada uno del séptimo, octavo, noveno y décimo monómero de dominio Fc incluye una cavidad manipulada. En algunas realizaciones, el enlazador L1, L2, L1' y/o L2' tiene 3-200 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador L1, L2, L1' y/o L2' consiste en la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs : 1,2 y 3.
[0040]En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc que incluye uno o más dominios Fc, en donde la construcción de Fc se ensambla a partir de una única secuencia de polipéptido. El primer polipéptido tiene la fórmula A-L-B, en donde A incluye un primer monómero de dominio Fc; L es un enlazador (opcionalmente un enlazador escindible con, por ejemplo, uno dos o más sitios de escisión); y B incluye un segundo monómero de dominio Fc. El enlazador puede ser un espaciador de aminoácidos de suficiente longitud (por ejemplo, como mínimo 15 aminoácidos, preferiblemente como mínimo aproximadamente 20 residuos de aminoácidos de longitud, por ejemplo, 15-200 aminoácidos de longitud) y flexibilidad que el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc del polipéptido se combinan para formar un dominio Fc. En determinadas realizaciones, el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc. Se puede formar dicha construcción a partir de la expresión de una única secuencia de polipéptido en una célula huésped. En una realización, el polipéptido tiene la fórmula A-L1-B-L2-C, en donde A incluye un primer monómero de dominio Fc; L1 es un enlazador (opcionalmente un enlazador escindible con, por ejemplo, uno, dos o más sitios de escisión); B incluye un segundo monómero de dominio Fc; L2 es un enlazador; y C es un tercer monómero de dominio Fc. El enlazador puede ser un espaciador de aminoácidos con suficiente longitud (por ejemplo, como mínimo 15 aminoácidos, preferiblemente como mínimo aproximadamente 20 residuos de aminoácidos de longitud, por ejemplo, 15-200 aminoácidos de longitud) y flexibilidad que el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc del polipéptido se combinan para formar un dominio Fc. En determinadas realizaciones, el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre el primer monómero de dominio Fc y el segundo monómero de dominio Fc. Un ejemplo de una construcción de Fc de esta realización, que incluye tres dominios Fc, está representada en la Figura 10.
[0041]En cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento, los monómeros de dominio Fc de un dominio Fc de la construcción pueden tener la misma secuencia de aminoácidos primaria. Por ejemplo, los monómeros de dominio Fc de un dominio Fc pueden ser ambos una secuencia de tipo salvaje o los dos monómeros de dominio Fc de un dominio Fc pueden tener el mismo módulo de selectividad de dimerización, por ejemplo, los dos monómeros de dominio Fc de un dominio Fc pueden tener mutaciones de carga invertida idénticas en como mínimo dos posiciones dentro del anillo de residuos cargados en la interfaz entre los dominios Ch3.
[0042]En cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento, los monómeros de dominio Fc de un dominio Fc de una construcción que tiene secuencias diferentes, por ejemplo, secuencias que se difieren en no más de 20 aminoácidos (por ejemplo, no más de 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 aminoácidos, entre dos monómeros de Fc (es decir, entre el monómero de dominio Fc y otro monómero de la construcción de Fc). Por ejemplo, las secuencias de monómero de Fc de una construcción descrita en el presente documento pueden ser diferentes debido a que los módulos de selectividad de dimerización complementarios de cualquiera de las construcciones de Fc pueden incluir una cavidad manipulada en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 de uno de los monómeros de dominio y una protuberancia manipulada en el dominio constante de anticuerpo Ch3 del otro de los monómeros de dominio Fc, en donde la cavidad manipulada y la protuberancia manipulada se posicionan para formar una pareja de protuberancia alojada en la cavidad de monómeros de dominio Fc. Las cavidades y las protuberancias manipuladas de ejemplo se muestran en la Tabla 1. En otras realizaciones, los módulos de selectividad de dimerización complementarios incluyen un aminoácido cargado negativamente modificado (sustituido) en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 de uno de los monómeros de dominio y un aminoácido cargado positivamente modificado (sustituido) en el dominio constante de anticuerpo Ch3 del otro de los monómeros de dominio Fc, en donde el aminoácido cargado negativamente y el aminoácido cargado positivamente se posicionan para promover la formación de un dominio Fc entre monómeros de dominio complementario. Los cambios en aminoácidos complementarios de ejemplo se muestran en la Tabla 2.
[0043]En algunas realizaciones, además de los módulos de selectividad de dimerización (por ejemplo, las cavidades y las protuberancias manipuladas, o los aminoácidos cargados positivamente y negativamente modificados (véanse, por ejemplo, cambios de aminoácidos de ejemplo en las Tablas 1 y 2)), una construcción de Fc descrita en el presente documento puede incluir también sustituciones de aminoácidos adicionales de una secuencia de tipo salvaje en las secuencias de monómero de Fc para, por ejemplo, estabilizar la construcción de Fc o para impedir la agregación de proteínas.
[0044]En algunas realizaciones, una construcción de Fc descrita en el presente documento incluye 2-10 dominios Fc (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dominios), en donde como mínimo dos de los dominios Fc de la construcción tienen diferentes módulos de selectividad de dimerización. Por ejemplo, las construcciones 5, 8, 9 y 10 tienen como mínimo un dominio Fc que incluye una cavidad y una protuberancia manipuladas y como mínimo un dominio Fc que incluye mutaciones de carga invertida complementarias.
[0045]En otras realizaciones, uno o más enlazadores en una construcción de Fc descrita en el presente documento es un enlace.
[0046]En otras realizaciones, uno o más enlazadores en una construcción de Fc descrita en el presente documento es un espaciador, por ejemplo, un espaciador de aminoácidos de 2-200 aminoácidos.
[0047]En determinadas realizaciones, el espaciador de aminoácidos es un espaciador rico en glicina y/o serina, por ejemplo, el espaciador incluye dos o más motivos de la secuencia GS, GGS, GGGGS (SEQ ID NO : 1), GGSG (SEQ ID NO : 2), o SGGG (SEQ ID NO : 3).
[0048]En determinadas realizaciones, cuando una construcción de Fc incluye un péptido de unión a albumina, el péptido de unión a albumina tiene la secuencia de DICLPRWGCLW (SEQ ID No : 28).
[0049]En otras realizaciones, uno o más monómeros de dominio Fc en las construcciones de Fc descritas en el presente documento incluyen un dominio bisagra de IgG, un dominio constante de anticuerpo C<h>2 de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch3 de IgG.
[0050]En determinadas realizaciones, cada uno de los monómeros de dominio Fc en las construcciones de Fc mencionados anteriormente incluye un dominio bisagra de IgG, un dominio constante de anticuerpo Ch2 de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch3 de IgG.
[0051]En determinadas realizaciones, la IgG es de un subtipo seleccionado entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgG4.
[0052]En aún otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que incluye una población sustancialmente homogénea (por ejemplo, como mínimo el 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % de homogeneidad) de cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento. En una realización, una jeringuilla o vial estéril cualificado para el uso farmacéutico contiene una composición farmacéutica en la que el único o el principio activo principal es una población sustancialmente homogénea (por ejemplo, como mínimo el 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de homogeneidad) de cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento. La composición farmacéutica puede incluir uno o más principios activos, por ejemplo, seleccionados entre sales, detergentes, tensioactivos, agentes de carga, polímeros, conservantes y otros excipientes farmacéuticos. En otra realización, la composición farmacéutica sustancialmente homogénea contiene menos de 10 %, menos de 5 %, menos de 4 %, menos de 3 %, menos de 2 %, menos de 1 %, o menos de 0,5 % de agregados o multímeros no deseados de la construcción de Fc.
[0053]En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento de preparación de cualquiera de las construcciones de Fc mencionadas anteriormente. El procedimiento incluye proporcionar una célula huésped que incluye un polinucleótido o polinucleótidos que codifican los polipéptidos necesarios para ensamblar la construcción de Fc, expresar los polipéptidos en la célula huésped bajo condiciones que permiten la formación de la construcción de Fc y recuperar (por ejemplo, purificar) la construcción de Fc.
[0054]En algunas realizaciones, la construcción de Fc está formada como mínimo en parte por la asociación de monómeros de dominio Fc que están presentes en diferentes polipéptidos. En determinadas realizaciones, la construcción de Fc está formada por la asociación de monómeros de dominio Fc que están presentes en diferentes polipéptidos. En estas realizaciones, la construcción de Fc no incluye un dominio adicional que promueve la asociación de dos polipéptidos (por ejemplo, una parte de cola de IgM o una parte de cola de IgA). En otras realizaciones, los enlaces covalentes (por ejemplo, puentes disulfuro) están presentes solamente entre dos monómeros de dominio Fc que se unen para formar un dominio Fc. En otras realizaciones, la construcción de Fc no incluye enlaces covalentes (por ejemplo, puentes disulfuro) entre dominios Fc. En otras realizaciones adicionales, la construcción de Fc proporciona suficiente flexibilidad estructural de tal modo que todos o sustancialmente todos los dominios Fc en la construcción de Fc son capaces de interactuar de manera simultánea con un receptor de Fc en la superficie celular. En determinados ejemplos de cualquiera de estas realizaciones, la construcción de Fc incluye como mínimo dos dominios Fc unidos a través de un enlazador (por ejemplo, un espaciador de aminoácidos flexible).
[0055]En una realización, los monómeros de dominio Fc de un dominio Fc se encuentran en diferentes cadenas de polipéptidos que se asocian para formar el dominio Fc. Por ejemplo, las construcciones representadas en la Figura 4 y la Figura 6 tienen dos dominios Fc que incluyen tres polipéptidos asociados. Uno de los tres polipéptidos incluye dos monómeros de dominio Fc y cada uno de los otros dos de los polipéptidos incluye un monómero de dominio Fc. La construcción representada en la Figura 5 tiene tres dominios Fc que incluyen cuatro polipéptidos asociados; dos de los cuatro polipéptidos tienen dos monómeros de dominio Fc y cada uno de los otros dos de los cuatro polipéptidos tiene un monómero de dominio Fc. La construcción de Fc representada en la Figura 7B puede tener n dominios Fc (donde n representa 2-10) que incluyen 2n polipéptidos, incluyendo cada polipéptido un monómero de dominio Fc, un dominio constante de anticuerpo C<l>de IgG y un dominio constante de anticuerpo C<h>1 de IgG. Cada una de las construcciones representadas en las Figuras 8 y 9 tiene cinco dominios Fc que incluyen seis polipéptidos asociados. Dos de los seis polipéptidos incluyen tres monómeros de dominio Fc y cada uno de los otros cuatro de los seis polipéptidos tiene un monómero de dominio Fc. La construcción representada en la Figura 10 tiene tres dominios Fc que incluyen dos polipéptidos asociados. Cada uno de los dos polipéptidos contiene tres monómeros de dominio Fc unidos en una serie en tándem.
[0056]En otro aspecto, la divulgación presenta composiciones y procedimientos para promover la dimerización selectiva de monómeros de dominio Fc. La divulgación incluye un dominio Fc en donde los dos monómeros de dominio Fc del dominio Fc incluyen mutaciones idénticas en como mínimo dos posiciones en el anillo de residuos cargados en la interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo Ch3. La divulgación incluye también un procedimiento de fabricación de dicho dominio Fc, que incluye la introducción de módulos de selectividad de dimerización complementarios que tienen mutaciones idénticas en dos secuencias de monómero de dominio Fc en como mínimo dos posiciones en el anillo de residuos cargados en la interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo Ch3. La interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo C<h>3 consiste en un parche hidrófobo rodeado de un anillo de residuos cargados. Cuando un dominio constante de anticuerpo Ch3 se junta con otro, estos residuos cargados se emparejan con residuos de la carga opuesta. Mediante la inversión de la carga de los dos miembros de dos o más pares de residuos complementarios, los monómeros de dominio Fc mutados siguen complementarios para los monómeros de dominio Fc de la misma secuencia mutada, pero tienen una complementariedad inferior a monómeros de domino Fc sin esas mutaciones. En esta realización, los módulos de selectividad de dimerización idénticos promueven la homodimerización. Los dominios Fc de ejemplo incluyen a monómeros Fc que contienen los mutantes dobles de K409D/D339K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D339K, K392E/D399K, E357K/K370D o D356K/K439E. En otra realización, un dominio Fc incluye monómeros de Fc que incluyen mutantes cuádruples que combinan cualquier par de mutantes dobles, por ejemplo, K409D/D399K/E357K/K370E. En otra realización, además de los módulos de selectividad de dimerización idénticos, los monómeros de dominio Fc del dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización complementarios que tienen mutaciones no idénticas que promueven la asociación específica (por ejemplo, cavidad y protuberancia manipuladas). Como resultado, los dos monómeros de dominio Fc incluyen dos módulos de selectividad de dimerización y siguen siendo complementarios entre sí, pero tienen una complementariedad disminuida con otros monómeros de dominio Fc. Esta realización promueve la heterodimerización entre un dominio Fc que contiene la cavidad y un monómero de dominio Fc que contiene la protuberancia. En un ejemplo, las mutaciones idénticas en pares de residuos cargados de ambos monómeros de dominio Fc se combinan con una protuberancia en un monómero de dominio Fc y una cavidad en el otro monómero de dominio Fc.
[0057]En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento de reducción de inflamación en un sujeto que lo necesita. En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento para inducir la depuración de autoanticuerpos en un sujeto que lo necesita. En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento de supresión de la presentación de antígenos en un sujeto que lo necesita. En otro aspecto, la divulgación presenta un procedimiento de reducción de la respuesta inmune en un sujeto que lo necesita, por ejemplo, la reducción de la activación de la respuesta inmune basada en un complejo inmune en un sujeto que lo necesita. Estos procedimientos incluyen la administración al sujeto de una construcción de Fc o una composición farmacéutica descrita en el presente documento.
[0058]En otro aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento de tratamiento de una enfermedad inflamatoria o autoinmune o inmune en un sujeto mediante la administración al sujeto de una construcción de Fc o una composición farmacéutica descritas en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*). Entre las enfermedades de ejemplo se incluyen : artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis asociada a ANCA; síndrome de anticuerpo antifosfolípido; anemia hemolítica autoinmune; neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; depuración de anti-allo en trasplante, anti-sí mismo (“anti-self”) en EICH, anti-sustitución, terapéutica IgG, paraproteínas de IgG; dermatomiositis; síndrome de Goodpasture; síndromes de hipersensibilidad de tipo II dirigida a sistema de órganos mediados por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, por ejemplo síndrome de Guillain Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), dermatomiositis, síndrome de Felty, rechazo mediado por anticuerpos, enfermedad autoinmune de tiroides, colitis ulcerosa, enfermedad hepática autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática; miastenia gravis, neuromielitis óptica; pénfigo y otros trastornos ampollosos autoinmunes; síndrome de Sjogren; citopenias autoinmunes y otros trastornos mediados a través de fagocitosis dependiente de anticuerpos; otros síndromes inflamatorios dependientes de FcR, por ejemplo, sinovitis, dermatomiositis, vasculitis sistémica, glomerulitis y vasculitis.
[0059]En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc o una composición farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*) para su uso en la reducción de inflamación en un sujeto que lo necesita. En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc o una composición farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*) para su uso en promover la depuración de autoanticuerpos en un sujeto que lo necesita. En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc o una composición farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*) para su uso en la supresión de presentación de antígenos en un sujeto que lo necesita. En otro aspecto, la divulgación presenta una construcción de Fc o una composición farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*) para su uso en la reducción de la respuesta inmune en un sujeto que lo necesita, por ejemplo, reducir la activación basada en el complejo inmune de la respuesta inmune en un sujeto que lo necesita. Por consiguiente, la presente invención proporciona una construcción de Fc de la presente invención para su uso en promover la depuración de autoanticuerpos, suprimir la presentación de antígenos, reducir la respuesta inmune o reducir la activación de la respuesta inmune basada en un complejo inmune, en un sujeto que lo necesita.
[0060]En otro aspecto, la divulgación proporciona una construcción de Fc o una composición farmacéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*) para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o autoinmune o inmune en un sujeto. Por consiguiente, la presente invención proporciona una construcción de Fc de la presente invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o autoinmune o inmune. Entre las enfermedades de ejemplo se incluyen : artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis asociada a ANCA; síndrome de anticuerpo antifosfolípido; anemia hemolítica autoinmune; neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; depuración de anti-allo en trasplante, anti-sí mismo (“anti-self”) en EICH, anti-sustitución, terapéutica IgG, paraproteínas de IgG; dermatomiositis; síndrome de Goodpasture; síndromes de hipersensibilidad de tipo II dirigida a sistema de órganos mediados por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, por ejemplo síndrome de Guillain Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), dermatomiositis, síndrome de Felty, rechazo mediado por anticuerpos, enfermedad autoinmune de tiroides, colitis ulcerosa, enfermedad hepática autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática; miastenia gravis, neuromielitis óptica; pénfigo y otros trastornos ampollosos autoinmunes; síndrome de Sjogren; citopenias autoinmunes y otros trastornos mediados a través de fagocitosis dependiente de anticuerpos; otros síndromes inflamatorios dependientes de FcR, por ejemplo, sinovitis, dermatomiositis, vasculitis sistémica, glomerulitis y vasculitis.
[0061]En cualquiera de las construcciones de Fc descritas en el presente documento, se debe entender que el orden de los monómeros de dominio Fc es intercambiable. Por ejemplo, en un polipéptido que tiene la fórmula A-L-B, el extremo carboxilo terminal de A se puede unir al extremo amino terminal de L, que a su vez se une en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de B. De manera alternativa, el extremo carboxilo terminal de B se puede unir al extremo amino terminal de L, que a su vez se une en su extremo carboxilo terminal al extremo amino terminal de C. Ambas configuraciones se abarcan por la fórmula A-L-B.
[0062]En un aspecto relacionado, la divulgación presenta una célula huésped que expresa cualquiera de las construcciones de Fc mencionadas anteriormente. La célula huésped incluye polinucleótidos que codifican los polinucleótidos necesarios para ensamblar la construcción de Fc, en la que los polinucleótidos se expresan en la célula huésped.
Definiciones :
[0063]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «monómero de dominio Fc» hace referencia a una cadena de polipéptidos que incluye como mínimo un dominio bisagra y un segundo y tercer dominio constante de anticuerpo (C<h>2 y C<h>3) o fragmentos funcionales de los mismos (por ejemplo, los fragmentos que son capaces de (i) dimerizar con otro monómero de dominio Fc para formar un dominio Fc y (ii) unirse a un receptor de Fc. El monómero de dominio Fc puede ser cualquier isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina, que incluye IgG, IgE, IgM, IgA, o IgD. Adicionalmente, el monómero de dominio Fc puede ser un subtipo de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4). Un monómero de dominio Fc no incluye ninguna parte de una inmunoglobulina que sea capaz de actuar como una región de reconocimiento de antígeno, por ejemplo, un dominio variable o una región determinante de la complementariedad (CDR). Los monómeros de dominio Fc pueden contener hasta diez cambios con respecto a la secuencia de monómero de dominio Fc de tipo salvaje (por ejemplo, sustituciones, adiciones o supresiones de 1-10, 1-8, 1-6, 1-4 aminoácidos) que alteran la interacción entre un dominio Fc y un receptor de Fc. Los ejemplos de cambios adecuados se conocen bien en la técnica.
[0064]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «dominio Fc» hace referencia a un dímero de dos monómeros de dominio Fc que es capaz de unirse a un receptor de Fc. En el dominio Fc de tipo salvaje, los dos monómeros de dominio Fc se dimerizan mediante la interacción entre los dos dominios constantes de anticuerpos Ch3, así como uno o más enlaces de disulfuro que se forman entre los dominios bisagra de los dos monómeros de dominio Fc de dimerización.
[0065]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «construcción de Fc» hace referencia a cadenas de polipéptidos asociadas que se forman entre 2-10 dominios Fc, tal como se describe en el presente documento. Las construcciones de Fc descritas en el presente documento pueden incluir monómeros de dominio Fc que tienen las mismas o diferentes secuencias. Por ejemplo, una construcción de Fc puede tener dos dominios Fc, uno de los cuales incluye monómeros de dominio Fc derivados de IgG1 o IgG1 y un segundo que incluye monómeros de dominio Fc derivados de IgG2 o IgG2. En otro ejemplo, una construcción de Fc pueden tener dos dominios Fc, uno de los cuales comprende una «pareja de protuberancia alojada en la cavidad» y un segundo que no comprende una «pareja de protuberancia alojada en la cavidad». En la presente invención, un dominio Fc no incluye una región variable de un anticuerpo, por ejemplo, VH, VL, CDR o HVR. Un dominio Fc forma la estructura mínima que se une a un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIMa, FcyRIIIb, FcyRIV.
[0066]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «dominio constante de anticuerpo» se refiere a un polipéptido que corresponde a un dominio de región constante de un anticuerpo (por ejemplo, un dominio constante de anticuerpo C<l>, un dominio constante de anticuerpo C<h>1, un dominio constante de anticuerpo C<h>2 o un dominio constante de anticuerpo CH3).
[0067]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «promover» significa potenciar y favorecer, por ejemplo, favorecer la formación de un dominio Fc a partir de dos monómeros de dominio Fc que tienen afinidad de unión más alta entre sí que con otros monómeros de dominio Fc diferentes. Tal como se describe en el presente documento, dos monómeros de dominio Fc que se combinan para formar un dominio Fc pueden tener modificaciones de aminoácidos compatibles (por ejemplo, protuberancias manipuladas y cavidades manipuladas) en la interfaz de sus dominios constantes de anticuerpo C<h>3 respectivos. Las modificaciones de aminoácidos compatibles promueven o favorecen la interacción selectiva de tales monómeros de dominio Fc entre sí con relación a otros monómeros de dominio Fc que carecen de tales modificaciones de aminoácidos o con modificaciones de aminoácidos incompatibles. Esto tiene lugar porque, debido a que las modificaciones de aminoácidos en la interfaz de los dos dominios constantes de anticuerpos Ch3 que interactúan, los monómeros de dominio Fc tienen una afinidad más alta entre ellos que con otros monómeros de dominio Fc que carecen de modificaciones de aminoácidos.
[0068]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «módulo de selectividad de dimerización» hace referencia a una secuencia del monómero de dominio Fc que facilita el emparejamiento favorecido entre dos monómeros de dominio Fc. Los módulos de selectividad de dimerización «complementarios» son módulos de selectividad de dimerización que promueven o favorecen la interacción selectiva de dos monómeros de dominio Fc entre sí. Los módulos de selectividad de dimerización complementarios pueden tener las mismas o diferentes secuencias. En el presente documento se describen módulos de selectividad de dimerización complementarios de ejemplo.
[0069]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «cavidad manipulada» hace referencia a la sustitución de como mínimo uno de los residuos de aminoácidos originales en el dominio constante de anticuerpo Ch3 por un residuo de aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño que el residuo de aminoácido original, creando de este modo una cavidad tridimensional en el dominio constante de anticuerpo C<h>3. El término «residuo de aminoácido original» hace referencia a un residuo de aminoácido de origen natural codificado por el código genético de un dominio constante de anticuerpo C<h>3 de tipo salvaje.
[0070]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «protuberancia manipulada» hace referencia a la sustitución de como mínimo uno de los residuos de aminoácidos originales en el dominio constante de anticuerpo Ch3 por un residuo de aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más grande que el residuo de aminoácido original, creando de este modo una protuberancia tridimensional en el dominio constante de anticuerpo Ch3. El término «residuos de aminoácidos originales» hace referencia a residuos de aminoácidos de origen natural codificados por el código genético de un dominio constante de anticuerpo Ch3 de tipo salvaje.
[0071]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «pareja de protuberancia alojada en la cavidad» describe un dominio Fc que incluye dos monómeros de dominio Fc, en donde el primer monómero de dominio Fc incluye una cavidad manipulada en su dominio constante de anticuerpo Ch3, mientras que el segundo monómero de dominio Fc incluye una protuberancia manipulada en su dominio constante de anticuerpo Ch3. En una pareja de protuberancia alojada en la cavidad, la protuberancia manipulada en el dominio constante de anticuerpo Ch3 del primer monómero de dominio Fc se posiciona de tal modo que interactúa con la cavidad manipulada del dominio constante de anticuerpo C<h>3 del segundo monómero de dominio Fc sin perturbar de manera significativa la asociación normal del dímero en la interfaz del dominio constante de anticuerpo inter-CH3.
[0072]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «unido» se utiliza para describir la combinación o la unión de dos o más elementos, componentes o dominios de proteínas, por ejemplo, polipéptidos, incluyendo conjugación química, medios recombinantes y enlaces químicos, por ejemplo, enlaces disulfuro y enlaces amida. Por ejemplo, dos polipéptidos únicos pueden unirse para formar una estructura de proteína contigua mediante conjugación química, un enlace químico, un enlazador de péptido o cualquier otro medio de enlace covalente. En algunas realizaciones, un primer monómero de dominio Fc se une a un segundo monómero de dominio Fc mediante un enlazador de péptido, en donde el extremo N-terminal del enlazador de péptido se une al extremo C-terminal del primer monómero de dominio Fc a través de un enlace químico, por ejemplo, un enlace de péptido, y el extremo C-terminal del enlazador de péptido se une al extremo N-terminal del segundo monómero de dominio Fc a través de un enlace químico, por ejemplo, un enlace de péptido. En otras realizaciones, el extremo N-terminal de un péptido de unión a albumina se une al extremo C-terminal del dominio constante de anticuerpo Ch3 de un monómero de dominio Fc mediante un enlazador de la misma manera tal como se menciona anteriormente.
[0073]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «asociado» se utiliza para describir la interacción, por ejemplo, enlace de hidrógeno, interacción hidrófoba o interacción iónica, entre polipéptidos (o secuencias en un polipéptido único) de tal modo que los polipéptidos (o secuencias en un polipéptido único) se posicionen para formar una construcción de Fc que tiene como mínimo un dominio Fc. Por ejemplo, dos polipéptidos, incluyendo cada uno un monómero de dominio Fc, pueden asociarse para formar una construcción de Fc (por ejemplo, tal como se representa en las Figuras 1-3). En algunas realizaciones, tres polipéptidos, por ejemplo, un polipéptido que incluye dos monómeros de dominio Fc y dos polipéptidos, incluyendo cada uno un monómero de dominio Fc, se asocian para formar una construcción de Fc que tiene dos dominios Fc (por ejemplo, tal como se muestra en las Figuras 4 y 6). En algunas realizaciones, cuatro polipéptidos, por ejemplo, dos polipéptidos incluyendo cada uno dos monómeros de dominio Fc y dos polipéptidos, incluyendo cada uno un monómero de dominio Fc, se asocian para formar una construcción de Fc que tiene tres dominios Fc (por ejemplo, tal como se muestra en la Figura 5). En otras realizaciones, 2n polipéptidos, por ejemplo, incluyendo cada polipéptido un monómero de dominio Fc, un dominio constante de anticuerpo Cl de IgG y un dominio constante de anticuerpo Ch1 de IgG se asocian para formar una construcción de Fc que tiene n dominios Fc (tal como se representa en la Figura 7B). Los dos polipéptidos pueden asociarse a través de sus monómeros de dominio Fc respectivos o a través de otros componentes del polipéptido. Por ejemplo, en la Figura 7B, el polipéptido 708 se asocia con el polipéptido 706 a través de su monómero de dominio Fc y se asocia con el polipéptido 710 a través de la asociación de su dominio C<l>que se asocia con el dominio C<h>1 del polipéptido 710. La asociación entre polipéptidos no incluye interacciones covalentes. Por ejemplo, en la Figura 10, las secuencias de monómero de Fc 1014 y 1012 en un polipéptido único se asocian para formar un dominio Fc, tal como lo hacen las secuencias de monómero de Fc 1004 y 1006.
[0074]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «enlazador» hace referencia a un enlace entre dos elementos, por ejemplo, dominios de proteínas. Un enlazador puede ser un enlace covalente o un espaciador. El término «enlace» hace referencia a un enlace químico, por ejemplo, un enlace amida o un enlace disulfuro o cualquier tipo de enlace creado a partir de una reacción química, por ejemplo, conjugación química. El término «espaciador» hace referencia a un resto (por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG)) o una secuencia de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia de 3-200 aminoácidos, de 3-150 aminoácidos o de 3-100 aminoácidos) que se encuentra entre dos polipéptidos o dominios de polipéptidos para proporcionar espacio y/o flexibilidad entre dos polipéptidos o dominios de polipéptidos. Un espaciador de aminoácidos forma parte de la secuencia primaria de un polipéptido (por ejemplo, unido a los polipéptidos o dominios de polipéptidos separados a través del esqueleto de polipéptido). La formación de enlaces disulfuro, por ejemplo, entre dos regiones bisagra o dos monómeros de dominio Fc que forman un dominio Fc, no se considera un enlazador.
[0075]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «enlazador escindible» hace referencia a un enlazador que contiene uno o más elementos que pueden escindirse de manera selectiva, por ejemplo, después de que se forme una construcción, por ejemplo, un enlazador escindible incluye una secuencia de polipéptidos que se puede escindir de manera selectiva mediante una proteasa.
[0076]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «péptido de unión a albumina» hace referencia a una secuencia de aminoácidos de 12 hasta 16 aminoácidos que tiene afinidad por y sirve para unirse a albumina de suero. Un péptido de unión a albumina puede tener origen diferente, por ejemplo, humano, de ratón o rata. En algunas realizaciones de la presente invención, un péptido de unión a albumina se fusiona con el extremo C-terminal de un monómero de dominio Fc para aumentar la semivida en suero de la construcción de Fc. Un péptido de unión a albumina se puede fusionar, directamente o a través de un enlazador, con el extremo N- o C-terminal de un monómero de dominio Fc.
[0077]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «multímero» hace referencia a una molécula que incluye como mínimo dos construcciones de Fc asociadas descritas en el presente documento.
[0078]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «polinucleótido» hace referencia a un oligonucleótido o nucleótido y fragmentos o partes del mismo y a ADN o ARN de origen genómico o sintético, que puede ser de cadena sencilla o doble cadena y representan la cadena de sentido y antisentido. Un polinucleótido único se traduce en un polipéptido único.
[0079]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «polipéptido» describe un polímero único en el que los monómeros son residuos de aminoácidos que se juntan a través de enlaces de amida. Un polipéptido pretende abarcar cualquier secuencia de aminoácidos, de origen natural, recombinante o producida de manera sintética.
[0080]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «posiciones de aminoácidos» hace referencia a los números de posiciones de aminoácidos en una proteína o dominio de proteína. Las posiciones de aminoácidos para anticuerpo o construcciones de Fc se enumeran utilizando el sistema de numeración Kabat (Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health, Bethesda, Md., edición 5, 1991).
[0081]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «célula huésped» hace referencia a un vehículo que incluye componentes de célula necesarios, por ejemplo, orgánulos, que se necesita para la expresión de proteínas a partir de sus ácidos nucleicos correspondientes. Típicamente los ácidos nucleicos se incluyen en los vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en el sector (transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc.). Una célula huésped puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana, o una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero (por ejemplo, una célula CHO). Tal como se describe en el presente documento, una célula huésped se utiliza para expresar uno o más polipéptidos que codifican dominios deseados que, a continuación, pueden combinarse para formar una construcción de Fc deseada.
[0082]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «composición farmacéutica» hace referencia a una formulación médica o farmacéutica que contiene un principio activo, así como uno o más excipientes y diluyentes para hacer que el principio activo sea adecuado para el procedimiento de administración. La composición farmacéutica de la presente invención incluye componentes farmacéuticamente aceptables que son compatibles con la construcción de Fc. Típicamente la composición farmacéutica se encuentra en forma acuosa para la administración intravenosa o subcutánea.
[0083]Tal como se utiliza en el presente documento, una «población sustancialmente homogénea» de polipéptidos o de una construcción de Fc es una en la que como mínimo el 85 % de los polipéptidos o construcciones de Fc en una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) tienen el mismo número de dominios Fc y la misma estructura de dominio Fc. En diferentes realizaciones, como mínimo el 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % de los polipéptidos o construcciones de Fc en la composición son los mismos. Por consiguiente, una composición farmacéutica que comprende una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc es una en la que como mínimo el 85 % de las construcciones de Fc en la composición tienen el mismo número de dominios Fc y la misma estructura. Una población sustancialmente homogénea de una construcción de Fc no incluye más del 10% (por ejemplo, no más del 8 %, 5 %, 2 % o 1 %) de multímeros o agregados de la construcción de Fc.
[0084]Tal como se utiliza en el presente documento, el término «portador farmacéuticamente aceptable» hace referencia a un excipiente o un diluyente en una composición farmacéutica. El portador farmacéuticamente aceptable debe ser compatible con otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el receptor. En la presente invención, el portador farmacéuticamente aceptable debe proporcionar una estabilidad farmacéutica adecuada a la construcción de Fc. La naturaleza del portador es diferente según el modo de administración. Por ejemplo, para la administración oral, se prefiere un portador sólido; para la administración intravenosa, se utiliza en general un portador en solución acuosa (por ejemplo, WFI y/o una solución tamponada).
[0085]Tal como se utiliza en el presente documento, «cantidad terapéuticamente eficaz» hace referencia a una cantidad, por ejemplo, dosis farmacéutica, eficaz para inducir un efecto biológico deseado en un sujeto o paciente o durante el tratamiento de un paciente que padece una afección o trastorno descrito en el presente documento. También se debe entender en el presente documento que una «cantidad terapéuticamente eficaz» debería interpretarse como una cantidad que proporciona un efecto terapéutico deseado, cuando se administra en una dosis o en cualquier dosis o vía, cuando se administra por sí sola o en combinación con otros agentes terapéuticos.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0086]
La Figura1 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 1) que contiene un dímero de dos monómeros de dominio Fc de tipo salvaje (wt) (102 y 104).
La Figura2 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 2) que contiene un dímero de dos monómeros de dominio Fc. El primer monómero de dominio Fc (202) contiene una protuberancia en su dominio constante de anticuerpo Ch3, mientras que el segundo monómero de dominio Fc (204) contiene una cavidad en la posición yuxtapuesta en su dominio constante de anticuerpo C<h>3.
La Figura 3 es una ilustración de otra construcción de Fc (construcción 3). Esta construcción de Fc contiene un dímero de dos monómeros de dominio Fc (302 y 304), en donde ambos monómeros de dominio Fc contienen diferentes aminoácidos cargados en su interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia de wt para promover la interacción electrostática favorable entre los dos monómeros de dominio Fc.
La Figura 4 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 4) que contiene dos dominios Fc. Esta construcción se forma a partir de tres polipéptidos. El primero polipéptido (402) contiene dos monómeros de dominio Fc de wt (404 y 406) unidos en una serie en tándem. Cada uno del segundo y el tercer polipéptido (408 y 410, respectivamente) contiene un monómero de domino Fc de wt.
La Figura 5 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 5 o construcción 5*) que contiene tres dominios Fc formados a partir de cuatro polipéptidos. El primer polipéptido (502) contiene un monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz C<h>3-C<h>3 que la secuencia de wt (506) unidos en una serie en tándem con un monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (504). El segundo polipéptido (508) contiene un monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz C<h>3-C<h>3 que la secuencia de wt (512) unidos en una serie en tándem con otro monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (510). Cada uno del tercer y el cuarto polipéptido (514 y 516, respectivamente) contiene un monómero de domino Fc que contiene una cavidad.
La Figura 6 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 6) que contiene dos dominios Fc formados a partir de tres polipéptidos. El primero polipéptido (602) contiene dos monómeros de dominio Fc que contiene una protuberancia (604 y 606) unidos en una serie en tándem, mientras que cada uno del segundo y el tercer polipéptido (608 y 610, respectivamente) contiene un monómero de dominio Fc modificado para contener una cavidad correspondiente.
La Figura 7A es una ilustración de otra construcción de Fc (construcción 7). Esta construcción de Fc contiene un dímero de dos monómeros de dominio C<l>-C<h>1-F<c>(702 y 704). En esta realización, los dominios contantes de anticuerpo Cl se han unido a los dominios constantes de anticuerpo Ch1 adyacentes.
La Figura 7B es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 8) que contiene multímeros de monómeros de dominio Cl-Ch1-Fc (por ejemplo, 706, 708 y 710) que contienen múltiples dominios Fc. En esta construcción de Fc, el polipéptido constituyente puede ser el mismo que el polipéptido constituyente en la construcción 7. El dominio contante de anticuerpo Cl de una construcción de Fc (por ejemplo, 712) interactúa con el dominio constante del anticuerpo Ch1 de una segunda construcción de Fc vecina (por ejemplo, 714).
La Figura 8 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 9) que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. Cada uno del primero y el segundo polipéptido (802 y 810) contiene tres monómeros de dominio Fc (804, 806, 808 y 812, 814, 816, respectivamente) unidos en una serie en tándem. De manera específica, en el polipéptido 802 o 810, un primer monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (804 o 812) se conecta a un segundo monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia de wt (806 o 814), que se conecta con un tercer monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (808 o 816). Cada uno del tercero hasta el sexto polipéptido (818, 820, 822 y 824) contiene un monómero de dominio Fc que contiene una cavidad y forma un dominio Fc con cada uno de los monómeros de dominio Fc 804, 808, 812 y 816, respectivamente.
La Figura 9 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 10) que contiene cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. Cada uno del primero y el segundo polipéptido (902 y 910) contiene tres monómeros de dominio Fc (904, 906, 908 y 912, 914, 916, respectivamente) unidos en una serie en tándem. De manera específica, en el polipéptido 902 o 910, un primer monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (904 o 912) se conecta a un segundo monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (906 o 914), que se conecta a un tercer monómero de dominio Fc que contiene diferentes aminoácidos cargados en la interfaz Ch3-Ch3 que la secuencia de wt (908 o 916). Cada uno del tercero hasta el sexto polipéptido (918, 920, 922 y 924) contiene un monómero de dominio Fc que contiene una cavidad y forma un dominio Fc con cada uno de los monómeros de dominio Fc 904, 906, 912 y 914, respectivamente.
La Figura 10 es una ilustración de una construcción de Fc (construcción 11) que contiene tres dominios Fc formados a partir de dos polipéptidos de secuencia idéntica. Cada uno de los dos polipéptidos (1002 y 1010) contiene tres monómeros de dominio Fc (1004, 1006, 1008 y 1012, 1014, 1016, respectivamente) unidos en una serie en tándem. De manera específica, cada polipéptido contiene un primer monómero de dominio Fc que contiene una protuberancia (1004 o 1012) conectado a un segundo monómero de dominio Fc que contiene una cavidad (1006 o 1014), que se conecta a un tercer monómero de dominio Fc con diferentes aminoácidos cargados en la interfaz C<h>3-C<h>3 que la secuencia de wt (1008 o 1016). Los monómeros de dominio Fc 1008 y 1016 se asocian para formar un primer dominio Fc; los monómeros de dominio Fc 1004 y 1006 se asocian para formar un segundo dominio Fc; y los monómeros de dominio Fc 1012 y 1014 se asocian para formar un tercer dominio Fc. Se puede formar la construcción 11 a partir de la expresión de una única secuencia de polipéptido en una célula huésped.
Las Figuras 11A-11B muestran SDS-PAGE reductor y no reductor de la construcción 4, respectivamente.
Las Figuras 12A-12B muestran SDS-PAGE reductor y no reductor de la construcción 6, respectivamente.
La Figura 13 es la SDS-PAGE de la construcción 5 y una tabla que muestra los porcentajes de la proteína expresada que tiene tres dominios Fc (trímero), dos dominios Fc (dímero) o un dominio Fc (monómero) antes y después de la purificación de la construcción 5.
Las Figuras 14A y 14B muestran los ensayos de activación (Figura 14A) y bloqueo (Figura 14B) de monocitos THP-1 utilizando las construcciones 1, 5 y 6.
La Figura 15 muestra los efectos de IVIG y las construcciones 5 y 6 en un modelo K/BxN de artritis reumatoide. La Figura 16 muestra los efectos de IVIG y las construcciones 5 y 6 en un modelo de ITP crónica.
La Figura 17 muestra la inhibición de fagocitosis por IVIg o la construcción 5 en células monocíticas THP-1.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0087]Las proteínas terapéuticas que incluyen dominios Fc de IgG pueden utilizarse para tratar la inflamación y enfermedades inmunológicas e inflamatorias. La presente divulgación presenta las composiciones y los procedimientos de preparación de diferentes construcciones de Fc que contienen dos o más (por ejemplo, 2-10) dominios Fc.
I. Monómeros de dominio Fc
[0088]Un monómero de dominio Fc incluye un dominio bisagra, un dominio constante de anticuerpo C<h>2 y un dominio constante de anticuerpo Ch3. El monómero de dominio Fc puede ser un isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina IgG, IgE, IgM, IgA o IgD. El monómero de dominio Fc puede ser también de cualquier isotipo de anticuerpo de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 o IgG4). Un dímero de monómeros de dominio Fc es un dominio Fc (se define con detalle en el presente documento) que se puede unir a un receptor Fc, por ejemplo, FcYRllla, que es un receptor que se ubica en la superficie de leucocitos. En la presente invención, el dominio constante de anticuerpo Ch3 de un monómero de dominio Fc puede contener sustituciones de aminoácidos en la interfaz de los dominios constantes del anticuerpo C<h>3-C<h>3 para promover su asociación entre sí. En algunas realizaciones, un monómero de dominio Fc incluye otros dos dominios constantes, por ejemplo, dominios constantes de anticuerpos C<l>y Ch1, acoplados al extremo N-terminal (Figura 7). En otras realizaciones, un monómero de dominio Fc incluye un resto adicional, por ejemplo, un péptido de unión a albumina, acoplado al extremo C-terminal. En la presente invención, un monómero de dominio Fc no contiene ningún tipo de región variable de anticuerpo, por ejemplo, Vh, Vl, una región determinante de complementariedad (CDR) o una región hipervariable (HVR).
II. Dominios Fc
[0089]Tal como se define en el presente documento, un dominio Fc incluye dos monómeros de dominio Fc que se dimerizan mediante la interacción entre los dominios constantes de anticuerpo C<h>3. En la presente invención, un dominio Fc no incluye una región variable de un anticuerpo, por ejemplo, VH, VL, CDR o HVR. Un dominio Fc forma la estructura mínima que se une a un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI, FcYRIIa, FcYRIIb, FcYRIIIa, FcYRIIIb, FcyRIV.
III. Módulos de selectividad de dimerización
[0090]En la presente invención, un módulo de selectividad de dimerización es la parte del monómero de dominio Fc que facilita el emparejamiento preferido de dos monómeros de dominio Fc para formar un dominios Fc. De manera específica, un módulo de selectividad de dimerización es esa parte del dominio constante de anticuerpo C<h>3 de un monómero de dominio Fc que incluye sustituciones de aminoácidos ubicadas en la interfaz entre los dominios constantes de anticuerpo C<h>3 que interactúan de dos monómeros Fc. En un módulo de selectividad de dimerización, las sustituciones de aminoácidos convierten en favorable la dimerización de los dos dominios constantes de anticuerpo C<h>3 como el resultado de la compatibilidad de aminoácidos seleccionados para las sustituciones. La formación final del dominio Fc favorecido es selectiva sobre otros dominios Fc que se forman a partir de monómeros de dominio Fc que carecen de módulos de selectividad de dimerización o con sustituciones de aminoácidos incompatibles en los módulos de selectividad de dimerización. Se puede llevar a cabo este tipo de sustitución de aminoácido utilizando técnicas de clonación molecular convencionales bien conocidas en la técnica, tal como mutagénesis QuikChange®.
[0091]En algunas realizaciones, un módulo de selectividad de dimerización incluye una cavidad manipulada (descrita con más detalle en el presente documento) en el dominio constante de anticuerpo C<h>3. En otras realizaciones, un módulo de selectividad de dimerización incluye una protuberancia manipulada (descrita con más detalle en el presente documento) en el dominio constante de anticuerpo Ch3. Para formar de manera selectiva un dominio Fc, se combinan dos monómeros de dominio Fc con módulos de selectividad de dimerización compatibles, por ejemplo, un dominio constante de anticuerpo C<h>3 que contiene una cavidad manipulada y el otro dominio constante de anticuerpo C<h>3 que contiene una protuberancia manipulada, para formar una pareja de protuberancia alojada en la cavidad de monómeros de dominio Fc.
[0092]En otras realizaciones, un monómero de dominio Fc con un módulo de selectividad de dimerización que contiene sustituciones de aminoácidos cargados positivamente y un monómero de dominio Fc con un módulo de selectividad de dimerización que contiene sustituciones de aminoácidos cargados negativamente pueden combinarse de manera selectiva para formar un dominio Fc a través de la orientación por interacción electrostática favorable (descrito con más detalle en el presente documento) de los aminoácidos cargados. Los módulos de selectividad de dimerización específicos se enumeran a continuación, sin limitación, en las Tablas 1 y 2 descritas con más detalle a continuación.
[0093]En otras realizaciones, dos monómeros de dominio Fc incluyen módulos de selectividad de dimerización que contienen mutaciones de carga invertida idénticas en como mínimo dos posiciones en el anillo de residuos cargados en la interfaz entre dominios C<h>3. Mediante la inversión de la carga de los dos miembros de dos o más pares de residuos complementarios en los dos monómeros de dominio Fc, los monómeros de dominio Fc mutados permanecen complementarios para los monómeros de dominio Fc de la misma secuencia mutada, pero tienen una complementariedad inferior a los monómeros de domino Fc sin esas mutaciones. En una realización, un dominio Fc incluye monómeros Fc que incluyen a los mutantes dobles de K409D/D339K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D339K, K392E/D399K, E357K/K370D o D356K/K439E. En otra realización, un dominio Fc incluye monómeros de Fc que incluyen mutantes cuádruples que combinan cualquier pareja de mutantes dobles, por ejemplo, K409D/D399K/E357K/K370E.
[0094]La formación de tales dominios Fc se promueve mediante las sustituciones de aminoácidos compatibles en los dominios constantes de anticuerpo C<h>3. Dos módulos de selectividad de dimerización que contienen sustituciones de aminoácidos incompatibles, por ejemplo, que contienen cavidades manipuladas, que contienen protuberancias manipuladas o que contienen los mismos aminoácidos cargados en la interfaz C<h>3-C<h>3, no promoverán la formación de un dominio Fc.
[0095]Además, otros procedimientos utilizados para promover la formación de dominios Fc con monómeros de dominio Fc definidos incluyen, sin limitación, el enfoque LUZ-Y (Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos número WO2011034605) que incluye la fusión del extremo C-terminal de las a-hélices de monómero de una cremallera de leucina para cada uno de los monómeros de dominio Fc para permitir la formación de heterodímero, así como el enfoque de cuerpo de dominio modificado por intercambio de cadenas (SEED,strand-exchange engineered domain)(Davis et al., Protein Eng Des Sel. 23 : 195-202, 2010) que genera dominios Fc con monómeros de dominio Fc heterodiméricos, donde cada uno incluye segmentos alternados de secuencias C<h>3 de IgA e IgG.
IV. Cavidades manipuladas y protuberancias manipuladas
[0096]El uso de cavidades manipuladas y protuberancias manipuladas (o la estrategia de «botón en ojal» (“knob-into hole”)) se describe por Carter y colaboradores (Ridgway et al., Protein Eng. 9 : 617-612, 1996; Atwell et al., J Mol Biol.
<270 : 26-35, 1997; Merchant et al., Nat Biotechnol.>16<: 677-681, 1998). La interacción de botón y ojal favorece la>formación de heterodímero, mientras que la interacción de botón-botón y ojal-ojal dificulta la formación de homodímero debido a choque estérico y eliminación de interacciones favorables. La técnica «botón en ojal» también se divulga en la Patente de Estados Unidos número 5.731.168.
[0097]En algunas realizaciones, las cavidades manipuladas y protuberancias manipuladas se utilizan en la preparación de las construcciones de Fc de la presente invención. Una cavidad manipulada es un vacío que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza por un aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más pequeño. Una protuberancia manipulada es un saliente que se crea cuando un aminoácido original en una proteína se reemplaza por un aminoácido diferente que tiene un volumen de cadena lateral más grande. De manera específica, el aminoácido que se reemplaza se encuentra en el dominio constante de anticuerpo Ch3 de un monómero de dominio Fc y está involucrado en la dimerización de dos monómeros de dominio Fc. En algunas realizaciones, una cavidad manipulada en un dominio constante de anticuerpo C<h>3 se crea para albergar una protuberancia manipulada en otro dominio constante de anticuerpo CH3, de tal modo que ambos dominios constantes de anticuerpo CH3 actúan como módulos de selectividad de dimerización (descritos anteriormente) que promueven o favorecen la dimerización de los dos monómeros de dominio Fc. En otras realizaciones, una cavidad manipulada en un dominio constante de anticuerpo Ch3 se crea para albergar mejor un aminoácido original en otro dominio constante de anticuerpo Ch3. En aún otras realizaciones adicionales, una protuberancia manipulada en un dominio constante de anticuerpo Ch3 se crea para formar interacciones adicionales con aminoácidos originales en otro dominio constante de anticuerpo CH3.
[0098]Se puede construir una cavidad manipulada reemplazando los aminoácidos que contienen cadenas laterales más grandes, tales como tirosina o triptófano, por aminoácidos que contienen cadenas laterales más pequeñas, tales como alanina, valina o treonina. De manera específica, algunos módulos de selectividad de dimerización (descritos con más detalle anteriormente) contienen cavidades manipuladas, tales como la mutación Y407V en el dominio constante de anticuerpo Ch3. De manera similar, se puede construir una protuberancia manipulada reemplazando aminoácidos que contienen cadenas laterales más pequeñas por aminoácidos que contienen cadenas laterales más grandes. De manera específica, algunos módulos de selectividad de dimerización (descritos con más detalle anteriormente) contienen protuberancias manipuladas, tales como la mutación T366W en el dominio constante de anticuerpo C<h>3. En algunas realizaciones, las cavidades manipuladas y las protuberancias manipuladas se combinan también con la modificación del enlace disulfuro del dominio inter-CH3 para potenciar la formación de heterodímero. De manera específica, el Fc con cavidad contiene una mutación Y349C y el Fc con protuberancia contiene una mutación S354C. Otras cavidades manipuladas y protuberancias manipuladas, en combinación con cualquiera de la modificación del enlace disulfuro o cálculos estructurales (HA-TF mixto) están incluidas, sin limitación, en la Tabla 1.
Tabla 1
Dominio constante de Dominio constante de
anticuerpo C<h>3 de anticuerpo C<h>3 de
Estrategia monómero 1 de dominio monómero 2 de dominio
Fc Fc Referencia
[0099]Se puede conseguir el reemplazo de un residuo de aminoácido original en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 por un residuo de aminoácido diferente mediante la alteración del ácido nucleico que codifica el residuo de aminoácido original. El límite superior del número de residuos de aminoácidos originales que se puede reemplazar es el número total de residuos en la interfaz de los dominios constates de anticuerpo Ch3, dado que todavía se mantiene la interacción suficiente en la interfaz.
V. Orientación por interacción electrostática
[0100]La orientación por interacción electrostática es el uso de interacciones electrostáticas favorables entre aminoácidos cargados de manera opuesta en péptidos, dominios de proteínas y proteínas para controlar la formación de moléculas de proteína de orden superior. Un procedimiento del uso de efectos de la orientación por interacción electrostática para alterar la interacción de dominios de anticuerpo para reducir la formación de homodímero en favor de la formación de heterodímero en la generación de anticuerpos biespecíficos se da conocer en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos número 2014-0024111.
[0101]En la presente invención, la orientación por interacción electrostática se utiliza para controlar la dimerización de monómeros de dominio Fc y la formación de construcciones de Fc. De manera particular, para controlar la dimerización de monómeros de dominio Fc utilizando la orientación por interacción electrostática, se reemplazan uno o más residuos de aminoácidos que constituyen la interfaz Ch3-Ch3 por residuos de aminoácidos cargados positiva o negativamente, de tal modo que la interacción resulta electrostáticamente favorable o desfavorable dependiendo de los aminoácidos cargados específicos introducidos. En algunas realizaciones, un aminoácido cargado positivamente en la interfaz, tal como lisina, arginina o histidina, se reemplaza por un aminoácido cargado negativamente, tal como ácido aspártico o ácido glutámico. En otras realizaciones, un aminoácido cargado negativamente en la interfaz se reemplaza por un aminoácido cargado positivamente. Los aminoácidos cargados pueden introducirse en uno de los dominios constantes de anticuerpo Ch3 que interactúan o ambos. Mediante la introducción de los aminoácidos cargados en los dominios constantes de anticuerpo CH3 que interactúan, se crean los módulos de selectividad de dimerización (descritos con más detalle anteriormente) que pueden formar de manera selectiva dímeros de monómeros de dominio Fc según se controla por los efectos de la orientación por interacción electrostática que son resultado de la interacción entre aminoácidos cargados.
[0102]En un ejemplo particular, para crear un módulo de selectividad de dimerización que incluye cargas invertidas, el aminoácido Asp399 en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 se reemplaza por Lys y el aminoácido Lys409 se reemplaza por Asp. La heterodimerización de monómeros de dominio Fc se puede promover mediante la introducción de mutaciones diferentes, pero compatibles, en los dos monómeros de dominio Fc, tales como los pares de residuos cargados incluidos, sin limitación, en la Tabla 2. La homodimerización de monómeros de dominio Fc se pueden promover mediante la introducción de las mismas mutaciones en ambos monómeros de dominio Fc de un modo simétrico, tal como los dobles mutantes K409D/D339K o K392D/D399K.
Tabla 2
VI. Enlazadores
[0103]En la presente invención, se utiliza un enlazador para describir un enlace o una conexión entre polipéptidos o dominios de proteínas y/o restos no proteicos asociados. En algunas realizaciones, un enlazador es un enlace o una conexión entre como mínimo dos monómeros de dominio Fc para los que el enlazador conecta el extremo C-terminal del dominio constante de anticuerpo C<h>3 de un primer monómero de dominio Fc con el extremo N-terminal del dominio bisagra de un segundo monómero de dominio Fc, de tal modo que los dos monómeros de dominio Fc se unen entre sí en series en tándem. En otras realizaciones, un enlazador es un enlace entre un monómero de dominio Fc y cualquier otro dominio de proteína que se une al mismo. Por ejemplo, un enlazador puede unir el extremo C-terminal del dominio constante de anticuerpo Ch3 de un monómero de dominio Fc al extremo N-terminal de un péptido de unión a albumina. En otro ejemplo, un enlazador puede conectar el extremo C-terminal de un dominio constante de anticuerpo Ch1 al extremo N-terminal del dominio bisagra de un monómero de dominio Fc. En aún otras realizaciones adicionales, un enlazador puede conectar dos dominios de proteína individuales (que no incluyen un dominio Fc), por ejemplo, el extremo C-terminal de un dominio constante de anticuerpo Cl se puede unir al extremo N-terminal de un dominio constante de anticuerpo C<h>1 a través de un enlazador.
[0104]Un enlazador puede ser un enlace covalente simple, por ejemplo, un enlace peptídico, un polímero sintético, por ejemplo, un polímero de polietilenglicol (PEG) o cualquier tipo de enlace creado a partir de una reacción química, por ejemplo, conjugación química. En el caso de que un enlazador sea un enlace peptídico, el grupo de ácido carboxílico en el extremo C-terminal de un dominio de proteína puede reaccionar con el grupo amino del extremo N-terminal de otro dominio de proteína en una reacción de condensación para formar un enlace peptídico. De manera específica, se puede formar el enlace peptídico a partir de medios sintéticos a través de una reacción de química orgánica convencional bien conocida en la técnica o mediante la producción natural a partir de una célula huésped, en donde una secuencia de polinucleótidos codifica las secuencias de ADN de ambas proteínas, por ejemplo, dos monómeros de dominio Fc, en serie en tándem, se puede transcribir directamente y traducir en un polipéptido contiguo que codifica ambas proteínas mediante las maquinarias moleculares necesarias, por ejemplo, ADN polimerasa y ribosoma, en la célula huésped.
[0105]En el caso de que un enlazador sea un polímero sintético, por ejemplo, un polímero de PEG, el polímero puede funcionalizarse con grupos funcionales químicos reactivos en cada extremo para reaccionar con los aminoácidos terminales en los extremos de conexión de dos proteínas.
[0106]En el caso de que un enlazador (a excepción del enlace peptídico mencionado anteriormente) se elabore a partir de una reacción química, los grupos funcionales químicos, por ejemplo, amina, ácido carboxílico, éster, azida u otros grupos funcionales utilizados de manera habitual en la técnica, se pueden acoplar de manera sintética al extremo C-terminal de una proteína y al extremo N-terminal de la otra proteína, respectivamente. A continuación, los dos grupos funcionales pueden reaccionar a través de los medios químicos sintéticos para formar un enlace químico, conectando de esta manera las dos proteínas. Tales procedimientos de conjugación química son rutinarios para los expertos en la técnica.
Espaciador
[0107]En la presente invención, un enlazador entre dos monómeros de dominio Fc puede ser un espaciador de aminoácidos que incluye 3-200 aminoácidos. Los espaciadores de péptidos adecuados se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, enlazadores de péptido que contienen residuos de aminoácidos flexibles, tales como glicina y serina. En determinadas realizaciones, un espaciador puede contener motivos, por ejemplo, motivos múltiples o repetitivos, de GS, GGS, GGGGS (SEQ ID NO : 1), GGSG (SEQ ID NO : 2), o SGGG (SEQ ID NO : 3). En determinadas realizaciones, un espaciador puede contener desde 2 hasta 12 aminoácidos que incluyen motivos de GS, por ejemplo, GS, GSGS (SEQ ID NO : 4), GSGSGS (SEQ ID NO : 5), GSGSGSGS (SEQ ID NO : 6), GSGSGs Gs Gs (SEQ ID NO : 7), o GSGSGSGSGSGS (SEQ ID NO : 8). En otras determinadas realizaciones, un espaciador puede contener desde 3 hasta 12 aminoácidos que incluyen motivos de GGS, por ejemplo, GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 9), GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 10) y GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 11). En otras realizaciones adicionales, un espaciador puede contener desde 4 hasta 12 aminoácidos que incluyen motivos de GGSG (SEQ ID NO: 12), por ejemplo, GGSG (SEQ ID NO: 13), GGSGGGSG (SEQ ID NO: 14), o GGSGGGSGGGSG (SEQ ID NO : 15). En otras realizaciones, un espaciador puede contener motivos de GGGGS (SEQ ID NO : 16), por ejemplo, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID<n>O : 17). En otras realizaciones, un espaciador puede contener también aminoácidos distintos de glicina y serina, por ejemplo, GENLYFQSGG (SEQ ID NO : 18), SACYCELS (SEQ ID NO : 19), RSIAT (SEQ ID NO : 20), RPACKIPNDLKQKVMNH (SEQ ID NO : 21), GGSAGGSGSGSSGGSSGASGTGTAGGTGSGSGTGSG (SEQ ID NO : 22), AAANSSIDLISVPVDSR (SEQ ID NO : 23), o GGSGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSEGGGSGGGS (SEQ ID NO : 24). En determinadas realizaciones de la presente invención, un espaciador de péptido de 12 o 20 aminoácidos se utiliza para conectar dos monómeros de dominio Fc en series en tándem (Figuras 4-6), los espaciadores de péptido de 12 y 20 aminoácidos que consisten en las secuencias GGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO : 25) y SGGGSGGGSGGGSGGGSGGG (SEQ ID NO : 26), respectivamente. En otras realizaciones, un espaciador de péptido de 18 aminoácidos que consiste en la secuencia GGSGGGSGGGSGGGSGGS (SEQ ID NO : 27) se utiliza para conectar dominios constantes de anticuerpo Gl y Ch1 (Figura 7A-7B).
VII. Péptidos de unión a proteína de suero
[0108]Los péptidos de unión a proteína de suero puede mejorar la farmacocinética de medicamentos de base proteica, y, de manera particular, las construcciones de Fc descritas en el presente documento pueden fusionarse con péptidos de unión a proteína de suero.
[0109]Como un ejemplo, los péptidos de unión a albumina que se pueden utilizar en los procedimientos y las composiciones descritos en el presente documento se conocen de manera general en la técnica. En una realización, el péptido de unión a albumina incluye la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID NO : 28).
[0110]En la presente divulgación, los péptidos de unión a albumina puede unirse al extremo N o C-terminal de determinados polipéptidos en la construcción de Fc. En una realización, un péptido de unión a albumina se puede unir al extremo C-terminal de uno o más polipéptidos en las construcciones 1, 2, 3 o 7A (Figuras 1, 2, 3 y 7A, respectivamente). En otra realización, un péptido de unión a albumina puede fusionarse con el extremo C-terminal del polipéptido que codifica dos monómeros de dominio Fc unidos en serie en tándem en las construcciones 4, 5 y 6 (Figuras 4, 5 y 6, respectivamente). En aún otra realización, un péptido de unión a albumina se puede unir al extremo C-terminal del monómero de dominio Fc que se une al segundo monómero de dominio Fc en el polipéptido que codifica los dos monómeros de dominio Fc unidos en una serie en tándem, tal como se muestra en las construcciones 4 y 6 (Figuras 4 y 6, respectivamente). Los péptidos de unión a albumina pueden fusionarse genéticamente a las construcciones de Fc o unirse a las construcciones de Fc a través de procedimientos químicos, por ejemplo, conjugación química. Si se desea, se puede insertar un espaciador entre la construcción de Fc y el péptido de unión a albumina. Aunque no se desea ceñirse a ninguna teoría, se espera que la inclusión de un péptido de unión a albumina en una construcción de Fc de la presente invención o divulgación puede conducir a la retención prolongada de la proteína terapéutica a través de su unión a albumina de suero.
VIII. Construcciones de Fc
[0111]De manera general, la divulgación proporciona construcciones de Fc que tienen 2-10 dominios Fc. Estos pueden tener mayor afinidad de unión y/o avidez que un dominio Fc de tipo salvaje único para un receptor Fc, por ejemplo, FcYRllla. La divulgación proporciona también procedimientos de modificación de aminoácidos en la interfaz de dos dominios constantes de anticuerpo C<h>3, de tal modo que los dos monómeros de dominio Fc de un dominio Fc forman de manera selectiva un dímero entre ellos, impidiendo de este modo la formación de multímeros o agregados no deseados. Una construcción de Fc incluye un número par de monómeros de dominio Fc, donde cada par de monómeros de dominio Fc forma un dominio Fc. Una construcción de Fc incluye, como mínimo, un dominio Fc funcional formado a partir de un dímero de dos monómeros de dominio Fc.
[0112]En algunas realizaciones, una construcción de Fc contiene un dominio Fc que incluye un dímero de dos monómeros de dominio Fc (Figuras 1-3 y 7A). Los dominios constantes de anticuerpo Ch3 que interactúan pueden ser no modificados (Figura 1) o pueden contener sustituciones de aminoácidos en su interfaz. De manera específica, las sustituciones de aminoácidos pueden ser cavidades manipuladas (Figura 2), protuberancias manipuladas (Figura 2) o aminoácidos cargados (Figura 3).
[0113]En otras realizaciones, una construcción de Fc contiene dos dominios Fc (Figuras 4 y 6) formados a partir de tres polipéptidos. El primer polipéptido contiene dos monómeros de dominio Fc unidos en una serie en tándem unidos a través de un enlazador, y el segundo y el tercer polipéptido contienen un monómero de dominio Fc. El segundo y el tercer polipéptido pueden ser el mismo polipéptido o pueden ser polipéptidos diferentes. La Figura 4 representa un ejemplo de dicha construcción de Fc. El primer polipéptido contiene dos monómeros de dominio Fc de tipo salvaje unidos en una serie en tándem a través de un enlazador, y cada uno del segundo y el tercer polipéptido contiene un monómero de dominio Fc de tipo salvaje. Uno de los monómeros de dominio Fc en el primer polipéptido forma un primer dominio Fc con el segundo polipéptido, mientras que el otro monómero de dominio Fc en el primer polipéptido forma un segundo dominio Fc con el tercer polipéptido. El segundo y el tercer polipéptido no se acoplan o se unen entre sí. La Figura 6 representa una construcción de Fc similar a la de la Figura 4. En la Figura 6, los monómeros de dominio Fc en el primero polipéptido contienen ambos protuberancias manipuladas en los dominios contantes de anticuerpo Ch3, mientras que el segundo y el tercer polipéptido contienen cavidades manipuladas en los dominios constantes de anticuerpo Ch3. La interfaz Ch3-Ch3 de protuberancia alojada en la cavidad manipulada favorece la formación de heterodímeros de monómeros de dominio Fc e impide la formación no controlada de multímeros no deseados. Tal como se describe en el presente documento a continuación, en el Ejemplo 4, los módulos de selectividad de dimerización que incluyen dominios constantes de anticuerpo Ch3 modificados impiden la formación de multímeros no deseados que se observan en el Ejemplo 3, que describe la formación de la construcción de Fc a partir de monómeros de dominio Fc que carecen de módulos de selectividad de dimerización.
[0114]Además, en otras realizaciones, una construcción de Fc puede contener tres dominios Fc formados a partir de cuatro polipéptidos (Figura 5). El primero y el segundo polipéptido pueden ser el mismo o diferentes, al igual que pueden ser el tercero y el cuarto polipéptido. En este ejemplo, tanto el primero como el segundo polipéptido codifican dos monómeros de dominio Fc conectados a través de un enlazador en una serie en tándem, en donde un monómero de dominio Fc contiene sustituciones de aminoácidos cargados en el dominio constante de anticuerpo CH3, mientras que el otro monómero de dominio Fc contiene una protuberancia en el dominio constante de anticuerpo Ch3. Tanto el tercer como el cuarto polipéptido codifican un monómero de dominio Fc con una cavidad. El primero y el segundo polipéptido forman un primer dominio Fc entre sí a través de la interacción de los cambios inversos en sus dominios constantes de anticuerpo C<h>3. El segundo y el tercer dominio Fc se forman a partir de las interacciones de protuberancia alojada en la cavidad entre las protuberancias en el primer y el segundo polipéptido y las cavidades en el tercer y el cuarto polipéptido. Cada monómero de dominio Fc en esta construcción de Fc contiene un módulo de selectividad de dimerización que promueve la formación de dominios Fc específicos.
[0115]En aún otras realizaciones, un polipéptido único puede formar dímeros (por ejemplo, construcción 7A; Figura 7A) o multímeros (por ejemplo, construcción 7B; Figura 7B), no a través de la interacción entre los dominios constantes de anticuerpo Ch3, sino a través de la interacción entre los dominios constantes Cl y los dominios constantes Ch1. La Figura 7B representa una construcción de Fc que contiene múltiples dominios Fc en los que el dominio C<l>de un dominio Fc interactúa con el dominio C<h>1 de un dominio Fc vecino.
[0116]En aún otras realizaciones adicionales, las construcciones de Fc pueden contener cinco dominios Fc formados a partir de seis polipéptidos. Los dos ejemplos están representados en las Figuras 8 y 9. Aunque estas construcciones de Fc representadas comprenden seis polipéptidos, cuatro de los polipéptidos pueden ser codificados por el mismo ácido nucleico y los dos polipéptidos restantes también pueden ser codificados por el mismo ácido nucleico. Como resultado, estas construcciones de Fc pueden producirse mediante la expresión de dos ácidos nucleicos en una célula huésped adecuada.
[0117]En otra realización, se puede formar una construcción de Fc que contiene dos o más dominios Fc a partir de dos polipéptidos que tienen la misma secuencia primaria. Se puede formar dicha construcción a partir de la expresión de la secuencia de un polipéptido único en una célula huésped. Un ejemplo se ilustra en la Figura 10. En este ejemplo, un ácido nucleico único es suficiente para codificar una construcción que contiene tres dominios Fc. Se deja que los dos monómeros de dominio Fc que son parte del mismo polipéptido formen un dominio Fc mediante la inclusión de un enlazador flexible con una longitud y flexibilidad suficientes; este enlazador puede ser un enlazador escindible. Este mismo polipéptido contiene también un tercer monómero de dominio Fc unido mediante un enlazador flexible opcional. Este tercer monómero de dominio Fc es capaz de unirse a otro monómero de dominio Fc para producir la construcción de Fc en forma de Y representada en la Figura 10. Se puede controlar la formación de dominios Fc mediante el uso de módulos de selectividad de dimerización, tal como se representa en la Figura 10.
IX. Células huésped y producción de proteínas
[0118]En la presente invención, una célula huésped hace referencia a un vehículo que incluye los componentes celulares necesarios, por ejemplo, orgánulos, que se necesitan para la expresión de los polipéptidos y las construcciones descritos en el presente documento a partir de sus ácidos nucleicos correspondientes. Se pueden incluir los ácidos nucleicos en los vectores de ácidos nucleicos que pueden introducirse en la célula huésped mediante técnicas convencionales conocidas en el sector (transformación, transfección, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc.). Las células huésped pueden ser de mamífero o de origen bacteriano. Entre las células huésped de mamífero se incluyen, pero no se limitan a, CHO (o cepas de células derivadas de CHO, por ejemplo, CHO-K1, CHO-DXB11 CHO-DG44), células huésped murinas (por ejemplo, NS0, Sp2/0), VERY, HEK (por ejemplo, HEK293), células BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 y T47D, CRL7O3O y HsS78Bst. También se pueden escoger las células huésped que modulan la expresión de las construcciones de proteínas o modifican y procesan el producto de proteína de un modo específico deseado. Diferentes células huésped poseen mecanismos característicos y específicos de procesamiento postraducción y modificación de productos de proteína. Se pueden seleccionar las líneas celulares o sistemas de huésped adecuados para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína expresada.
[0119]Para la expresión y secreción de productos de proteína a partir de sus construcciones de plásmido de ADN correspondiente, las células huésped pueden transfectarse o transformarse con ADN controlado mediante elementos de control de expresión apropiados conocidos en la técnica, que incluyen promotor, potenciador, secuencias, terminadores de trascripción, sitios de poliadenilación y marcadores seleccionables. Los procedimientos de expresión de proteínas terapéuticas se conocen en la técnica. Véanse, por ejemplo, Paulina Balbas, Argelia Lorence (eds.) Recombinant Gene Expression : Reviews and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press; 2a edición, edición de 2004 (20 de julio de 2004); Vladimir Voynov y Justin A. Caravella (eds.) Therapeutic Proteins : Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Humana Press; 2a edición, edición de 2012 (28 de junio de 2012).
X. Purificación
[0120]Se puede purificar una construcción de Fc mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica de purificación de proteínas, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad (por ejemplo, afinidad de proteína A) y cromatografía en columna de exclusión por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o cualquier otra técnica estándar de la purificación de proteínas. Por ejemplo, se puede aislar y purificar una construcción de Fc mediante la selección y combinación apropiada de columnas de afinidad, tal como columna de proteína A con columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración, procedimientos de precipitación salina y diálisis (véanse, por ejemplo, Process Scale Purification of Antibodies, Uwe Gottschalk (ed.) John Wiley & Sons, Inc., 2009; y Subramanian (ed.) Antibodies- Volume I-Production and Purification, Kluwer Academic/Plenum Publishers, Nueva York (2004)). En algunos casos, se puede conjugar una construcción de Fc a secuencias marcadoras, tal como un péptido para facilitar la purificación. Un ejemplo de una secuencia de aminoácidos marcadora es un péptido de hexahistidina, que se une a una columna de afinidad de agarosa funcionalizada con níquel con afinidad micromolar. Entre otras etiquetas de péptido útiles para la purificación se incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hemaglutinina «HA» que corresponde con un epítopo derivad de la proteína de hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., 1984, Cell 37 : 767).
[0121]Para las construcciones de Fc, se puede utilizar la cromatografía en columna de proteína A como un procedimiento de purificación. Los ligandos de proteína A interactúan con las construcciones de Fc a través de la región Fc, convirtiendo la cromatografía de proteína A en un procedimiento de captación altamente selectivo que es capaz de eliminar la mayoría de las proteínas de células huésped. En la presente divulgación, se pueden purificar las construcciones de Fc utilizando la cromatografía en columna de proteína A tal como se describe en el Ejemplo 2.
XI. Composiciones/preparaciones farmacéuticas
[0122]La divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen una o más construcciones de Fc descritas en el presente documento. En una realización, una composición farmacéutica incluye una población sustancialmente homogénea de construcciones de Fc que son idénticas o sustancialmente idénticas en la estructura. En diferentes ejemplos, la composición farmacéutica incluye una población sustancialmente homogénea de cualquiera de las construcciones 1-10 y 5*. La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una población sustancialmente homogénea de construcciones de Fc de la presente invención.
[0123]Se puede incorporar una construcción de proteína terapéutica, por ejemplo, una construcción de Fc, de la presente invención en una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas que incluyen proteínas terapéuticas pueden formularse mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral en forma de una formulación inyectable que incluye una solución o suspensión estéril en agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, se puede formular la composición farmacéutica mediante la combinación adecuada de la construcción de Fc con vehículos o medios farmacéuticamente aceptables, tales como agua estéril para inyección (WFI,water for injection),solución salina fisiológica, emulsionante, agente de suspensión, tensioactivo, estabilizador, diluyente, aglutinante, excipiente, seguido de mezclado en una forma de dosis unitaria que se necesita para prácticas farmacéuticas generalmente aceptadas. La cantidad de principio activo incluida en las preparaciones farmacéuticas es tal que se proporciona una dosis adecuada dentro del intervalo determinado.
[0124]La composición estéril para la inyección se puede formular de acuerdo con las prácticas farmacéuticas convencionales utilizando agua destilada para inyección como vehículo. Por ejemplo, se pueden utilizar una solución salina fisiológica o una solución isotónica que contiene glucosa y otros suplementos, tales como D-sorbitol, D-manosa, D-manitol y cloruro de sodio como una solución acuosa para la inyección, de manera opciona en combinación con un agente de solubilización adecuado, por ejemplo, alcohol, tal como etanol y polialcohol, tal como propilenglicol o polietilenglicol y un tensioactivo no iónico, tal como polisorbato 80™, HCO-50, y similares conocidos habitualmente en la técnica. Los procedimientos de formulación de productos de proteínas terapéuticas se conocen en la técnica, véase, por ejemplo, Banga (ed.) Therapeutic Peptides and Proteins : Formulation, Processing and Delivery Systems (2a edición) Taylor & Francis Group, CRC Press (2006).
XII. Dosificación
[0125]Las composiciones farmacéuticas se administran de un modo compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente eficaz para dar lugar a una mejora o eliminación de los síntomas. Las composiciones farmacéuticas se administran mediante una variedad de formas de administración, por ejemplo, formas de administración intravenosas, formas de administración subcutáneas, formas de administración orales, tales como soluciones ingeribles, cápsulas de liberación de fármacos y similares. La dosificación apropiada para el sujeto individual depende de los objetivos terapéuticos, la vía de administración y la condición del paciente. De manera general, las proteínas recombinantes se administran a una dosis de 1-200 mg/kg, por ejemplo, 1-100 mg/kg, por ejemplo, 20-100 mg/kg. Por consiguiente, será necesario para un profesional médico adaptar y valorar la dosificación y modificar la vía de administración según sea necesario para obtener el efecto terapéutico óptimo.
XIII. Indicaciones
[0126]Las composiciones farmacéuticas y los procedimientos de la divulgación son útiles para reducir la inflamación en un sujeto, para promover la depuración de autoanticuerpos en un sujeto, para suprimir la presentación de antígenos en un sujeto, para reducir la respuesta inmune, por ejemplo, para bloquear la activación de la respuesta inmune basada en un complejo inmune en un sujeto, y para tratar afecciones o enfermedades inmunológicas e inflamatorias en un sujeto. Las afecciones y enfermedades de ejemplo incluyen artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis asociada a ANCA; síndrome de anticuerpo antifosfolípido; anemia hemolítica autoinmune; neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; depuración de anti-allo en trasplante, anti-sí mismo (“anti-self”) en EICH, anti sustitución, terapéutica IgG, paraproteínas de IgG; dermatomiositis; síndrome de Goodpasture; síndromes de hipersensibilidad de tipo II dirigida a sistema de órganos mediados por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, por ejemplo síndrome de Guillain Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), dermatomiositis, síndrome de Felty, rechazo mediado por anticuerpos, enfermedad autoinmune de tiroides, colitis ulcerosa, enfermedad hepática autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática; miastenia gravis, neuromielitis óptica; pénfigo y otros trastornos ampollosos autoinmunes; síndrome de Sjogren; citopenias autoinmunes y otros trastornos mediados a través de fagocitosis dependiente de anticuerpos; otros síndromes inflamatorios dependientes de FcR, por ejemplo, sinovitis, dermatomiositis, vasculitis sistémica, glomerulitis y vasculitis.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Diseño y clonación de construcción de plásmidos de ADN
[0127]Se utilizó un total de ocho construcciones de plásmidos de ADN para ensamblar ocho construcciones de Fc (Figuras 1-7B). Las construcciones de plásmidos de ADN se transfectaron en células 293 hepáticas embrionarias humanas (HEK) para la producción de proteína. Los ocho polipéptidos secretados codificados tenían las estructuras generales tal como se describen a continuación :
A.Fc de w t:monómero de dominio Fc de tipo salvaje (Figura 1: 102 y 104; Figura 4 : 408 y 410).
B.Fc con protuberancia :monómero de dominio Fc con protuberancia manipulada en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 (Figura 2 : 202).
C.Fc con cavidadmonómero de dominio Fc con cavidad manipulada en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 (Figura 2 : 204; Figura 5 : 514 y 516).
C*. Fc con cavidad*:monómero de dominio Fc con cavidad manipulada en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 (Figura 2: 204; Figura 5 : 514 y 516). Fc con cavidad* contiene también sustituciones de aminoácidos adicionales en relación a Fc con cavidad.
D.Fc con cargas :monómero de dominio Fc con cargas invertidas en el dominio constante de anticuerpo Ch3 (Figura 3 : 302 y 304).
E.Fc2 de wt-12-wt:Dos monómeros de dominio Fc unidos en series a través de un enlazador de péptido GGGS de 12 aminoácidos (Figura 4 : 402).
F.Fc2 con protuberancia-20-cargas*:Monómero con dominio Fc con cargas invertidas en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 y monómero de dominio Fc con protuberancia manipulada en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 unidos en serie a través de un enlazador de péptido SGGG de 20 aminoácidos (Figura 5 : 502 y 508).
F*.Fc2 con protuberancia-20-cargas*:Monómero de dominio Fc con cargas invertidas en el dominio constante de anticuerpo Ch3 y monómero de dominio Fc con protuberancia manipulada en el dominio constante de anticuerpo C<h>3 unidos en serie a través de un enlazador de péptido SGGG de 20 aminoácidos (Figura 5 : 502 y 508). Fc2 con protuberancia-20-cargas* contiene también sustituciones de aminoácidos adicionales en relació con Fc con protuberancia.
G.Fc2 con protuberancia-20-protuberancia* :Dos monómeros de dominio Fc, ambos con protuberancia manipulada en el dominio constante de anticuerpo Ch3 unidos en serie a través de un enlazador de péptido GGGS de 20 aminoácidos (Figura 6 : 602).
H.ChCl Fc+: Monómero de dominio Fc con dominios contantes Ch1 y Cl unidos al dominio bisagra (Figura 7A : 702 y 704; Figura 7B : 706, 708, 710, 712, 714 y 716). El dominio constante Cl se une a través de un enlazador de péptido GGGS de 18 aminoácidos a un dominio constante Ch1.
[0128]Las secuencias de ADN de Fc se derivaron de Fc de IgG1 humana. Las mutaciones de protuberancia, cavidad y cargas se sustituyeron en la secuencia de Fc parental. El ADN que codifica un péptido líder derivado de la cadena ligera Kappa de inmunoglobulina humana se unió a la región 5'. Todos los polipéptidos, excepto uno, (ChCl Fc+) contenían este péptido codificado en el extremo amino terminal para dirigir la translocación de proteína a0l retículo endoplasmático para el ensamblaje y secreción. Se entenderá que se puede utilizar cualquiera de una variedad de péptidos líderes en relación con la presente invención. Normalmente el péptido líder se corta en el lumen del RE. Se añadió una secuencia de 11 nucleótidos que contenía un sitio EcoR1 en el extremo 5' terminal en dirección 5' del codón de inicio ATG. Se añadió una secuencia de 30 nucleótidos que contenía un sitio Xho1 en el extremo 3' terminal en dirección 3' del codón de terminación de la traducción TGA en el extremo 3' terminal. Las secuencias de ADN se optimizaron para la expresión en células de mamífero y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.4.
[0129]Las mutaciones se indican por el residuo de aminoácido de tipo salvaje seguido de la posición que utiliza el sistema de numeración EU Kabat (Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health, Bethesda, Md., edición 5, 1991) y, a continuación, el residuo de sustitución en código de letra única. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de péptidos secretados A-H descritos anteriormente se proporcionan a continuación (a excepción de Fc con cavidad* y Fc2 con protuberancia-20-cargas*, para los que solamente se proporcionan únicamente las secuencias de aminoácidos).
Fc de wt
[0130]
SEQ ID NO : 29 :
1 10 20 30 40 50
GACAAGACCCACACCTGTCCGCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG
CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA
GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC
CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC
CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT
CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAG
TGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG
CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCCCCCA
GCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAA
GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC
CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO : 30 :
1 10 20 30 40 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc con protuberancia
SEQ ID NO : 31
1 10 20 30 40 50
GACAAGACCCACACCTGTCCGCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG
CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA
GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC
CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC
CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT
CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAG
TGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG
CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCCCCCT
GCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTGAAA
GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC
CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG SEQ ID NO : 32
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc con cavidad
SEQ ID NO : 33 :
1 10 20 30 40 50
GACAAGACCCACACCTGTCCGCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG
CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA
GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC
CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC
CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT
CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAG
TGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG
CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAAGTGTGTACACTGCCCCCCA
GCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGCGCCGTGAAA
GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC
CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT
TCTTCCTGGTTAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG
SEQ ID NO : 34 :
1 10 20 30 40 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc con cavidad*
SEQ ID NO : 45 :
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVE
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc con cargas
SEQ ID NO : 35 :
GACAAGACCCACACCTGTCCGCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG
CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA
GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC
CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC
CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT
CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAG
TGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG
CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACACTGCCCCCCA
GCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAA
GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC
CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGAAAAGCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACAGCGACCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG SEQ ID NO : 36 :
1 10 20 30 40 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc2 de wt-12-wt
SEQ ID NO : 37 :
1 10 20 30 40 50
GACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG
CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA
GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC
CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC
CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT
CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTCAACGGCAAAGAGTACAAG
TGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG
CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTCTACACACTGCCCCCCA
GCCGGGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTCTCCCTGACCTGCCTGGTGAAA
GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC
CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAAGGCGGGGGATCTGGGGGAG
GAAGCGGAGGCGGCAGCGATAAGACCCATACCTGCCCTCCCTGTCCCGCT
CCCGAACTGCTGGGGGGACCCTCCGTGTTTCTGTTTCCACCTAAGCCTAA
GGATACGCTCATGATCTCCAGAACCCCTGAAGTCACATGTGTGGTGGTCG
ATGTGTCTCATGAAGATCCCGAAGTCAAGTTTAACTGGTATGTGGATGGG
GTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAAGCCTCGGGAAGAACAGTATAACTC
CACCTACAGAGTCGTCAGCGTGCTGACAGTCCTTCATCAGGATTGGCTGA
ATGGGAAAGAGTACAAATGTAAAGTGTCTAACAAAGCTCTGCCCGCTCCT
ATCGAAAAGACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCAGAGAACCTCAGGT
GTACACCCTGCCACCCTCCAGAGATGAGCTGACAAAAAATCAGGTGTCAC
TGACATGTCTGGTGAAAGGGTTTTATCCCTCCGACATTGCTGTGGAATGG
GAATCCAATGGGCAGCCTGAAAACAATTATAAGACAACACCTCCCGTGCT
GGACTCCGATGGCTCATTTTTTCTGTACTCTAAACTGACAGTGGATAAGT
CCAGATGGCAGCAGGGAAATGTGTTTTCCTGCTCTGTGATGCATGAAGCT
CTGCATAATCACTATACACAGAAAAGCCTGTCCCTGTCCCCCGGCAAG
SEQ ID NO : 38 :
1 10 20 30 40 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGSGGGSGGGSDKTHTCPPCPA
PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG
VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGK
Fc2 con protuberancia-20-cargas
SEQ ID NO : 39 :
1 10 20 30 40 50
GACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCAGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG
CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA
GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC
CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC
CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT
CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAG
TGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG
CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTT
GCAGAGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTCAAG
GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC
CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTCTGGGGGAGGATCAGGGG
GTGGAAGTGGCGGTGGATCTGGTGGTGGAAGCGGAGGCGGCGATAAGACA
CACACATGCCCCCCCTGTCCAGCTCCCGAACTGCTGGGGGGACCCTCCGT
GTTTCTGTTTCCACCTAAGCCTAAGGATACGCTCATGATCTCCAGAACCC
CTGAAGTCACATGTGTGGTGGTCGATGTGTCTCATGAAGATCCCGAAGTC
AAGTTTAATTGGTATGTCGATGGGGTCGAGGTGCACAATGCCAAAACAAA
ACCTCGGGAAGAACAGTATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCTGTCCTCA
CAGTCCTGCATCAGGATTGGCTCAATGGGAAAGAGTACAAATGTAAAGTC
TCTAACAAGGCTCTCCCCGCTCCGATCGAAAAGACCATCTCCAAAGCCAA
AGGGCAGCCCAGAGAACCTCAGGTCTACACACTGCCTCCCAGCCGGGACG
AGCTGACAAAAAATCAAGTGTCTCTGACCTGCCTCGTGAAGGGCTTTTAT
CCCTCCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGACAGCCGGAAAACAA
TTATAAGACCACGCCTCCAGTGCTGAAGTCCGACGGCAGCTTCTTTCTGT
ACTCCGACCTGACAGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAAGGGAATGTGTTC
TCCTGTTCCGTGATGCATGAAGCCCTCCATAATCACTATACCCAGAAAAG
CCTGTCCCTGTCCCCTGGCAAG
SEQ ID NO : 40 :
1 10 20 30 40 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN S TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY
PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc2 con protuberancia-20-cargas*
SEQ ID NO : 46
1 10 20 30 40 50
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKXKPREEQYNSXYRWSVLXVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDKLTKNQVSLWCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLXCLVKGFY
PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Fc2 con protuberancia-20-cargas
SEQ ID NO : 41 :
1 10 20 30 40 50
GACAAGACCCACACCTGTCCCCCTTGCCCTGCCCCTGAGCTGCTGGGAGG CCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCA GCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGAC CCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGC CAAGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGTGT CCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAG TGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAG CAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTT GCAGAGATGAACTGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGTGCCTGGTCAAG GGCTTCTACCCCAGCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCC CGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCAT TCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGC
AACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC CCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAGTCTGGGGGAGGATCAGGGG GTGGAAGTGGCGGTGGATCTGGTGGTGGAAGCGGAGGCGGCGATAAGACA CACACATGCCCCCCCTGTCCAGCTCCCGAACTGCTGGGGGGACCCTCCGT GTTTCTGTTTCCACCTAAGCCTAAGGATACGCTCATGATCTCCAGAACCC CTGAAGTCACATGTGTGGTGGTCGATGTGTCTCATGAAGATCCCGAAGTC AAGTTTAACTGGTATGTGGATGGGGTCGAGGTCCACAATGCCAAAACAAA GCCTCGGGAAGAACAGTATAACTCCACCTACAGAGTCGTCAGCGTGCTGA CAGTCCTGCATCAAGATTGGCTCAATGGGAAAGAGTATAAGTGTAAAGTC TCGAACAAAGCCCTCCCCGCTCCTATCGAAAAGACCATCTCCAAAGCCAA AGGGCAGCCCAGAGAACCTCAGGTCTACACACTGCCTCCATGTCGGGACG AGCTGACAAAAAATCAGGTGTCACTGTGGTGTCTGGTGAAGGGGTTTTAC CCTTCCGACATTGCTGTGGAATGGGAATCCAATGGGCAGCCTGAAAACAA TTATAAGACAACACCTCCCGTGCTGGACTCCGATGGCTCATTTTTTCTGT ACTCTAAACTGACAGTGGATAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAATGTGTTT TCCTGCTCTGTGATGCATGAAGCTCTGCATAAXCACTATACACAGAAAAG CCXGXCCCXGXCCCCXGGCAAG
SEQ ID NO : 42 :
1 10 20 30 40 50
DKXHXCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP KDTLMISRrPEVTCWVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVK
GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQG
NVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGDKT
HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFY
PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF
SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ChCl Fc+
SEQ ID NO :43:
1 10 20 30 40 50
AGGACAGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAGCGACGAGCA
GCTGAAGTCCGGCACAGCCAGCGTGGTCTGCCTGCTGAACAACTTCTACC
CCCGCGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGC
AACAGCCAGGAAAGCGTCACCGAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCXACAG
CCTGXCXAGCACCCXGACCCXGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGG
TGTACGCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG
AGCTTCAACAGAGGCGAGXGCGGCGGCTCTGGCGGAGGAICCGGGGGAGG
ATCAGGCGGCGGAAGCGGAGGCAGCGCTAGCACAAAGGGCCCCTCCGTGT
TCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAGCCGCCCXG
GGCTGCCXGGTGAAAGACTACTICCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAA
CTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTGCAGA
GCAGCGGCCTGTACXCCCTGAGCAGCGTGGXGACAGTGCCTAGCAGCAGC
CTGGGCACCCAGACCXACATCXGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACAC
CAAAGXGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGAGCXGCGACAAGACCCACACGT
GTCCCCCCTGCCCAGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTAGCGTGTTCCTG
TTCCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGAXGATCAGCCGGACCCCCGAAGT
GACCXGCGTGGXGGTGGACGXGTCCCACGAGGACCCXGAAGTGAAGTTCA
ATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCCAGA
GAGGAACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGXGTCCGTGCTGACCGTGCT
GCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AGGCCCTGCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAG
CCCCGCGAGCCCCAGGXGTACACACTGCCCCCCAGCCGGGACGAGCXGAC
CAAGAACCAGGTGTCCCTGACCXGTCTGGTGAAAGGCTXCTACCCCXCCG
ATAXCGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAG
ACCACCCCCCCXGTGCTGGACTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAA
GCXGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTICAGCTGCT
CCGXGATGCACGAGGCCCXGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGC
C XGAGCCCC GGCAAA
SEQ ID NO : 44 :
1 10 20 30 40 50
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSG
NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK
SFNRGECGGSGGGSGGGSGGGSGGSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL
GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ
PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSPGK
Ejemplo 2 - Expresión de proteínas de la construcción de Fc
[0131]Para la expresión de proteínas de las construcciones de Fc, dos de las construcciones de plásmidos de ADN seleccionadas entre A-H descritas en el Ejemplo 1 se transfectaron en las células EXPI293 (LifeTechnologies). Se utilizó la transfección de liposomas para introducir el ADN de plásmido en las células EXPI293. Se fijó la cantidad total de construcciones de plásmidos transfectadas, mientras que la proporción de construcciones de plásmidos diferentes se varió para maximizar el rendimiento de construcciones deseadas (véase la Tabla 3 a continuación). Para cada construcción de Fc, se muestra la proporción (en masa) de las dos construcciones de plásmidos de ADN transfectadas en la Tabla 3. Los ejemplos de las construcciones se muestran en las Figuras 1-7B.
[0132]Después de la expresión de proteínas, las construcciones expresadas se purificaron a partir del sobrenadante de cultivo celular mediante cromatografía en columna de afinidad basada en proteína A. Los sobrenadantes del medio se cargaron en una columna Poros MabCapture A (LifeTechnologies) utilizando un sistema de cromatografía preparativa AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences). A continuación, las construcciones de Fc capturadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (lavado bajo en sal), seguido de solución salina tamponada con fosfato suplementada con NaCl 500 mM (lavado con alto contenido de sal). Las construcciones de Fc se eluyeron con glicina 100 mM, NaCl 150 mM, tampón de pH 3. La solución de proteínas que sale de la columna se neutraliza mediante la adición de TRIS 1 M de pH 7,4 hasta una concentración final de 100 mM. Las construcciones de Fc se fraccionaron adicionalmente mediante una cromatografía de intercambio de iones utilizando una resina Poros® XS (Applied Biosciences Cat. # 4404336). La columna se equilibró previamente con MES 10 mM, pH 6 (tampón A), y la muestra se eluyó con un gradiente frente a MES 10 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 6 (tampón B).
[0133]Se obtuvieron un total de siete construcciones de Fc (véanse la Tabla 3 y las Figuras 1-7B). Las construcciones de Fc purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio) bajo condiciones reductoras como no reductoras, seguido de tinción con azul de Coomassie para confirmar la presencia de bandas de proteínas de tamaño esperado.
Tabla 3
Ejemplo 3 - Preparación y análisis por SDS-PAGE de la construcción 4
[0134]Se utilizaron dos construcciones de plásmidos de ADN, Fc2 wt-12-wt (construcción E de plásmidos de ADN en el Ejemplo 1) y Fc wt (construcción A de plásmidos de ADN en el Ejemplo 1), para expresar la construcción 4 (Figura 4). Las dos construcciones de plásmidos se transfectaron en las células HEK296 para la expresión de proteínas y la purificación, tal como se describe en el Ejemplo 2. Las Figuras 11A-B muestran SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de la construcción 4. En SDS-PAGE reductor (Figura 11A), se observó una banda a aproximadamente 25 kDa (carriles 2 y 3, Figura 11A) que corresponde al monómero de dominio Fc wt y una banda a 50 kDa que corresponde al dímero en tándem de Fc2 wt-12-wt (carriles 1-3, Figura 11A). En SDS-PAG<e>no reductor (Figura 11B), los carriles 2 y 3 cada uno contiene el producto de proteína final de la construcción 4 en cantidades más altas (1/2) y más bajas (1/3) de proteínas, respectivamente. Se observó una banda principal a aproximadamente 100 kDa que correspondía a la asociación del dímero en tándem de Fc2 wt-12-wt con dos monómeros de dominio Fc wt para formar la construcción 4, y otra banda principal de intensidad de señal aproximadamente igual a aproximadamente 50 kDa que correspondía al dímero en tándem de Fc2 wt-12-wt libre que no está unido con los monómeros de dominio Fc wt.
[0135]Adicionalmente, se observaron bandas de peso molecular más elevado a aproximadamente 150 kDa, 200 kDa y 250 kDa (carriles 2 y 3, Figura 11B) que correspondían a multímeros de monómero de dominio Fc2 wt-12-wt y Fc wt.
Ejemplo 4 - Preparación y análisis por SDS-PAGE de la construcción 6
[0136]Se utilizaron dos construcciones de plásmidos, Fc2 con protuberancia-20-protuberancia (construcción G de plásmidos de ADN en el Ejemplo 1) y Fc con cavidad (construcción C de plásmidos de ADN en el Ejemplo 1), para expresar la construcción 6 (Figura 6). Las dos construcciones de plásmidos se transfectaron en las células HEK296 para la expresión de proteínas y purificación, tal como se describe en el Ejemplo 2. Las Figuras 12A-12B muestran el SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras de la construcción 6. En SDS-PAGE reductor (Figura 12A), se observó una banda a aproximadamente 25 kDa (carriles 2 y 3, Figura 12A) que correspondía al monómero de dominio Fc con cavidad y una banda a 50 kDa que correspondía al dímero en tándem de Fc2 de protuberancia-20-protuberancia (carriles 1-3, Figura 12A). En SDS-PAGE no reductor (Figura 12B), los carriles 2 y 3 cada uno contiene el producto de proteína final de la construcción 6 en cantidades más altas (1/2) y más bajas (1/3) de proteína. Se observó una banda principal a aproximadamente 100 kDa que correspondía a la asociación del dímero en tándem de Fc2 protuberancia-20-protuberancia con dos monómeros de dominio Fc con cavidad y una banda menor de intensidad de señal más débil a aproximadamente 50 kDa que correspondía al dímero en tándem de Fc2 con protuberancia-20-protuberancia libre que no se combinó con ningún monómero de dominio Fc con cavidad.
[0137]Se llevó a cabo un experimento similar con la construcción 5 (Figura 13). Se utilizaron dos construcciones de plásmidos, Fc2 con protuberancia-20-cargas (construcción F de plásmidos de ADN en Ejemplo 1) y Fc con cavidad (construcción C de plásmidos de ADN en Ejemplo 1), para expresar la construcción 5 (Figura 5). Las dos construcciones de plásmidos se transfectaron en las células EXPI293 a proporciones determinadas de manera empírica mediante transfección con lípidos catiónicos. Los cultivos transfectados se incubaron en un medio de cultivo celular durante 6-8 días. Después de este periodo de tiempo, las células se extrajeron mediante centrifugación. El sobrenadante (medio, carril 1 de la Figura 13) contiene la construcción 5 que se secretó por las células transfectadas en el medio. También hay proteínas de células huésped contaminantes en el medio. La construcción 5 se purificó a partir del medio mediante la cromatografía de afinidad de proteína A. En este punto, el medio contenía la construcción 5 deseada que tenía tres dominios Fc (trímero), así como cierta proporción de proteínas mal ensambladas que tienen dos dominios Fc (dímero, aproximadamente 10-15%) y un dominio Fc (monómero, 5-10%). También hubo una cantidad pequeña de proteínas de células huésped contaminantes todavía presentes. El eluido de columna de proteína A se intercambió en el tampón, se concentró y se fraccionó mediante cromatografía de intercambio de iones fuertes (SCX). De manera resumida, la construcción 5 se unió a la columna SCX y, a continuación, se eluyó con una sal y un gradiente de pH. Está etapa permitió la separación de la construcción 5 deseada que tenía tres dominios Fc de la mayoría de las proteínas mal ensambladas que tenían dos o un dominio Fc, de la construcción 5 que tenía modificaciones posteriores a la traducción no deseadas y de proteínas de células huésped contaminantes. Después de otra ronda de concentración e intercambio de tampón, se obtuvo un producto de proteína final pura de la construcción 5 (pura, carril 2 de la Figura 13).
[0138]La Figura 13 representa un SDS-PAGE del medio obtenido a partir de las células huésped cultivadas manipuladas para expresar la construcción 5 (carril 1), y de la construcción purificada 5 (carril 2). También se muestra una tabla que muestra los porcentajes de las bandas principales del SDS-PAGE para cada muestra. En la muestra del medio (carril 1), se observó una banda mayor a aproximadamente 150 kDa que correspondía al producto de proteína final de la construcción 5 que tiene tres dominios Fc. La muestra del medio contenía también una banda menor de intensidad de señal más débil a 100 kDa que correspondía a una proteína que tiene dos dominios Fc y una segunda banda menor con señal de intensidad más débil a 50 kDa que correspondía a una proteína que tiene un dominio Fc. Después de la purificación (carril 2), se enriqueció la banda mayor a aproximadamente 150 kDa que correspondía al producto de proteína final de la construcción 5 que tiene tres dominios Fc. La cuantificación de las intensidades de señal de las bandas de proteína en el SDS-PAGE de la construcción 5 mostró que en el medio de cultivo, antes de la purificación de proteínas, el 79 % de la proteína total era el producto de proteína deseado de la construcción 5. Después de la purificación de proteína, se obtuvo una población sustancialmente homogénea de la construcción 5 que tenía aproximadamente el 95 % de pureza.
[0139]Estos descubrimientos demuestran que el módulo de selectividad de dimerización que contiene una protuberancia manipulada o una cavidad manipulada en el dominio constante de anticuerpo Ch3 reduce la autoasociación e impide la formación no controlada de agregados o multímeros mediada por Fc, lo que indica que el uso de módulos de selectividad de dimerización en las construcciones descritas en el presente documento se puede utilizar para producir preparaciones sustancialmente homogéneas de las construcciones de Fc. Esta observación tiene implicaciones importantes para las ventajas en la fabricación, el rendimiento y la pureza de las construcciones, por ejemplo, para controlar la actividad y potencia biológicas.
Ejemplo 5 - Afinidad de unión y avidez
[0140]Se evaluó la unión de construcciones a múltiples receptores de Fcy utilizando ensayos de competición FRET basados en células (Cisbio Bioassays). Las construcciones 5 y 6 mostraron una disminución de como mínimo diez veces en IC50 (es decir, unión aumentada) a FcyRlla, FcYRllb y FcyRllla en relación con el dominio Fc de tipo salvaje (construcción 1).
Ejemplo 6 - Activación de monocitos y ensayos de bloqueo
[0141]Se probaron tres construcciones de Fc, las construcciones 1, 5 y 6, que contienen uno, tres y dos dominios Fc, respectivamente, por su capacidad de activar monocitos THP-1 por sí solas. Se utilizó la liberación de IL-8 como un indicador de activación de monocitos. Las construcciones 1, 5 y 6 se expresaron y se purificaron tal como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Cada una de las construcciones de Fc purificadas se añadió a monocitos THP-1. No se observó ninguna liberación sustancial de IL-8 para cualquiera de las tres construcciones. Los datos se proporcionan en la Figura 14A.
[0142]A continuación, las mismas tres construcciones de Fc se analizaron por su capacidad de inhibir la activación de monocitos mediada por el receptor de Fc. Se inmovilizó IgG1 (100 pg/ml) sobre una placa de 96 pocillos y se utilizó para inducir la liberación de IL-8 por monocitos THP-1. Las diluciones en serie de construcciones 1, 5 y 6 o sustancias de control (inmunoglobulina intravenosa (IVIg), albumina de suero humano (HSA) y tampón de glicina) se llevaron a cabo posteriormente en la placa de cultivo tisular. De inmediato se añadieron monocitos THP-1 (1,5 x 105 de células) con mezclado intenso. Los cultivos se incubaron durante 18 horas y los sobrenadantes se analizaron para determinar IL-8. Se descubrió que las construcciones 5 y 6 inhibían la liberación de IL-8 de manera más eficaz que la construcción 1 a dosis bajas. Los datos se proporcionan en la Figura 14B.
Ejemplo 7 - Modelo de artritis K/BxN
[0143]Las construcciones de Fc 1, 5 y 6 e IVIg se analizaron por su capacidad de proteger a ratones de inflamación articular en el modelo de transferencia de suero K/BxN utilizando un procedimiento descrito en Anthony, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 : 19571-19578 (2008). Se obtuvieron/compraron ratones K/BxN de doce semanas de vida en Jackson Laboratories. Un total de treinta ratones C57BL se separó en cinco grupos de seis ratones cada uno. A cada grupo se le inyectó por vía intravenosa (i.v.) 200 pl de la construcción 6 a 0,1 g/kg, 200 pl de la construcción 5 a 0,1 g/kg, 200 pl de IVIg a 0,1 g/kg, 230 pl de IVIg a 1 g/kg o 200 pl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) una hora antes de la inyección de 200 pl de suero K/BxN (un suero que induce artritis) (Día 0). La inflamación se puntuó mediante el examen clínico de la hinchazón de la pata y grosor del tobillo. Para la hinchazón de la pata, cada pata se puntuó de 0 a 3 (0 sin hinchazón; 3 hinchazón máxima). Las puntuaciones de cuatro patas se añadieron a la puntuación clínica total por ratón individual. Para el grosor de tobillo, se utilizó la medición con calibrador. Cada ratón se puntuó a diario desde el Día 0 hasta el Día 10. La puntuación clínica promedia diaria para cada grupo de seis ratones se muestra en forma de gráfico en la Figura 15. Tal como se muestra en la Figura 15, IVIg a 1 g/kg, la construcción 5 a 0,1 g/kg y la construcción 6 a 0,1 g/kg proporcionaron un nivel similar de protección frente a inflamación. Dado que las construcciones 5 y 6 se administraron a una dosis diez veces menor en comparación con la dosis de IVIg, las construcciones 5 y 6 parecen ser más potentes que IVIg.
Ejemplo 8 - Modelo de ITP crónica
[0144]Las construcciones 1 y 5, así como IVIg, se sometieron a pruebas por su capacidad para tratar ratones que experimentaban trombocitopenia inmune (ITP). La ITP se indujo mediante un Ab antiplaquetario que causa el agotamiento de plaquetas. Cuarenta y cinco ratones C57BL/6 (18-22 g, Charles Rivers Labs, MA) se inyectaron por vía i.p. con 1,5 pg/ratón de anticuerpo anti-CD41 de rata (Ab) (clon MWReg30 BioLegend cat#133910) una vez al día durante 4 días (los días 1, 2, 3 y 4). Cinco ratones se inyectaron con 1,5 pg/ratón de un Ab de control de isotipo k de IgG1 de rata (BioLegend cat# 400414) para determinar los niveles normales de plaquetas. Los Abs se inyectaron en 100 pl de PBS. A todos los ratones se les administró una dosis una vez por vía intravenosa con 200 pl de cualquiera entre el control de solución salina, IVIg a una concentración de 1 g/kg, construcción 1 a una concentración de 0,02, 0,03, 0,1 y 0,3 g/kg y construcción 5 a una concentración de 0,004, 0,02, y 0,1 g/kg 2 horas después de la tercera inyección de Ab anti-CD41 el día 3. Los ratones se sometieron a sangrado el día 5 (24 horas después de la cuarta inyección de Ab anti-CD41) para cuantificar los niveles de plaquetas totales mediante el VetScan Instrument. Todos los procedimientos se llevaron a cabo en cumplimiento con la ley de bienestar animal y con la guía de los cuidados y el uso de animales de laboratorio.
[0145]Tal como se muestra en la Figura 16, los niveles de plaquetas aumentaron de manera significativa después del tratamiento terapéutico con la construcción 5 a una concentración de 0,02 y 0,1 g/kg en comparación con el control de solución salina (**** p< 0,0001 mediante ANOVA de una vía con la prueba de comparaciones múltiples). Los niveles de plaquetas en estos grupos eran similares a los niveles en el grupo normal tratado con isotipo. El tratamiento terapéutico con IVIg a una concentración de 1 g/kg y la construcción 1 a una concentración de 0,1 y 0,3 g/kg, aumentó también de manera importante los niveles de plaquetas en comparación con control de solución salina (*p< 0,05; **p<0,01 respectivamente mediante ANOVA de una vía con prueba de comparaciones múltiples), pero los niveles de plaquetas eran más bajos en estos grupos que en los grupos tratados con la construcción 5 a una concentración de 0,02 y 0,1 g/kg. En este modelo, la construcción 5 parece ser aproximadamente 50 veces más potente que IVIg.
Ejemplo 9 - La construcción 5* muestra unión y avidez aumentadas a FcyR en comparación con IVIg
[0146]Siguiendo el mismo protocolo, tal como se describe en el Ejemplo 8, se utilizaron dos construcciones de plásmidos, que codifican Fc2 con protuberancia-20-cargas* (construcción F* en el Ejemplo 1) y Fc con cavidad* (construcción C* en el Ejemplo 1), para expresar y purificar la construcción 5*. El perfil de unión de esta construcción a diversos receptores de Fc se comparó con el de IVIG en un ensayo de unión competitiva de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).
[0147]La construcción 5* mostró un perfil de unión general a los diferentes receptores Fcy similar al de IVIg (con la afinidad de unión más baja observada para FcyRllb), pero con una unión altamente potenciada para todos FcyRs con baja afinidad en comparación con IVIg. La unión aumentada a F<cy>R corresponde a una avidez más alta, lo cual se refiere al efecto acumulativo de las afinidades acumuladas de cada interacción de unión individual. Los valores IC50 para la construcción 5* eran consistentemente más bajos que aquellos de IVIg, indicando aumentos sorprendentes en la unión a FcyRs con baja afinidad en comparación con moléculas IgG individuales. Por ejemplo, en comparación con IVIg, la construcción 5* mostró una afinidad aumentada aproximadamente 170 veces de FcYRIIa (variante H131), una afinidad aumentada 55 veces para FcyRllb.
Ejemplo 10-Inhibición de la fagocitos en células monocíticas THP-1
[0148]La construcción 5* y IVIg se sometieron a pruebas en un modelo de fagocitosis.
[0149]La fagocitosis es el proceso por el cual las células (fagocitos) envuelven partículas sólidas, tales como bacterias, para formar un vesícula interna conocida como fagosoma. En el sistema inmune, la fagocitosis es un mecanismo principal utilizado para eliminar a los patógenos y restos de células. Los monocitos y los macrófagos se encuentran entre las células especializadas en la eliminación de partículas opsonizadas (recubiertas con anticuerpos) del sistema inmune a través de la fagocitosis, un mecanismo altamente dependiente del acoplamiento mediado por FcyR. Sin embargo, en enfermedades autoinmunes, los fagocitos pueden activarse provocando la liberación perjudicial de citocinas proinflamatorias o la fagocitosis de otras células críticas en el cuerpo. IVlg, que contiene anticuerpos IgG combinados, polivalentes extraídos del plasma de más de un millar de donantes de sangre, se utiliza para tratar una enfermedad autoinmune.
[0150]En este sistema de ensayos, se suministraron partículas de látex recubiertas con anticuerpos marcadas de manera fluorescente, una imitación de bacterias o virus opsonizados, a las células THP-1 y se dejaron fagocitar en presencia y ausencia de la construcción 5* e IVlg. Al final del periodo de incubación, cualquier fluorescencia externa se detuvo con azul de tripano, y la cantidad de fluorescencia intracelular se cuantificó mediante citometría de flujo. Todos los grupos se normalizaron con respecto a su control no tratado (solamente las células THP-1 y partículas de látex). Los resultados representan dos experimentos por separado.
[0151]Tal como se muestra en la Figura 17, la fagocitosis de partículas opsonizadas por células monocíticas THP-1 se inhibe mediante el tratamiento con IVIg y la construcción 5*, pero el valor de IC50 de la construcción 5* es aproximadamente 100 veces inferior al de IVIg. Esto sugiere que una construcción de Fc de la presente invención, por ejemplo, la construcción 5*, se puede utilizar para tratar indicaciones autoinmunes, así como otras indicaciones que son tratables utilizando IVIg.
Claims (18)
1. Construcción de Fc que comprende:
a) . un primer polipéptido que tiene la fórmula A-L-B; en la que
i) . A comprende un primer monómero de dominio Fc;
ii) . L es un enlazador; y
iii) . B comprende un segundo monómero de dominio Fc;
b) . un segundo polipéptido que tiene la fórmula A'-L'-B'; en la que
i) . A' comprende un tercer monómero de dominio Fc;
ii) . L' es un enlazador; y
iii) . B' comprende un cuarto monómero de dominio Fc;
c) . un tercer polipéptido que comprende un quinto monómero de dominio Fc; y
d) . un cuarto polipéptido que comprende un sexto monómero de dominio Fc;
en la que dicha A de dicho primer polipéptido y dicha A' de dicho segundo polipéptido se combinan para formar un primer dominio Fc, dicha B de dicho primer polipéptido y dicho quinto monómero del dominio Fc se combinan para formar un segundo dominio Fc, y dicha B' de dicho segundo polipéptido y dicho sexto monómero de dominio Fc se combinan para formar un tercer dominio Fc;
en la que dicho primer monómero de dominio Fc y dicho tercer monómero de dominio Fc comprenden módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre dicho primer monómero de dominio Fc y dicho tercer monómero de dominio Fc;
en la que dicho segundo monómero de dominio Fc y dicho quinto monómero de dominio Fc comprenden módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre dicho segundo monómero de dominio Fc y dicho quinto monómero de dominio Fc;
en la que dicho cuarto monómero de dominio Fc y dicho sexto monómero de dominio Fc comprenden módulos de selectividad de dimerización complementarios que promueven la dimerización entre dicho cuarto monómero de dominio Fc y dicho sexto monómero de dominio Fc;
en la que cada uno de dichos monómeros del dominio Fc es un monómero del dominio Fc de IgG1; y
en la que dichos módulos de selectividad de dimerización complementarios se seleccionan entre:
módulos de selectividad de dimerización que comprenden una cavidad manipulada en el dominio C<h>3 de uno de dichos monómeros del dominio Fc y una protuberancia manipulada en el dominio Ch3 del otro de dichos monómeros del dominio Fc, en los que dicha cavidad manipulada y dicha protuberancia manipulada están situadas para formar una pareja de protuberancia alojada en la cavidad de monómeros de dominio Fc; y
módulos de selectividad de dimerización que comprenden un aminoácido cargado negativamente en el dominio Ch3 de uno de dichos monómeros de dominio y un aminoácido cargado positivamente en el dominio C<h>3 del otro de dichos monómeros de dominio Fc, en los que dicho aminoácido cargado negativamente y dicho aminoácido cargado positivamente están situados para promover la formación de un dominio Fc.
2. Construcción de Fc, según la reivindicación 1, en la que dicho primer polipéptido y dicho segundo polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos y en la que dicho tercer polipéptido y dicho cuarto polipéptido tienen la misma secuencia de aminoácidos.
3. Construcción de Fc, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que al menos algunos de dichos módulos de selectividad de dimerización comprenden una cavidad manipulada en el dominio C<h>3 de uno de dichos monómeros de dominio Fc y una protuberancia manipulada en el dominio Ch3 del otro de dichos monómeros de dominio Fc, en la que dicha cavidad manipulada y dicha protuberancia manipulada están situadas para formar una pareja de protuberancia alojada en la cavidad de monómeros de dominio Fc.
4. Construcción de Fc, según la reivindicación 3, en la que uno de dichos monómeros de dominio Fc comprende Y407V e Y349C y el otro de dichos monómeros de dominio Fc comprende T366W y S354C.
5. Construcción de Fc, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que al menos algunos de dichos módulos de selectividad de dimerización comprenden un aminoácido cargado negativamente en el dominio Ch3 de uno de dichos monómeros de dominio y un aminoácido cargado positivamente en el dominio Ch3 del otro de dichos monómeros de dominio Fc, en la que dicho aminoácido cargado negativamente y dicho aminoácido cargado positivamente están situados para promover la formación de un dominio Fc.
6. Construcción de Fc, según la reivindicación 5, en la que uno de dichos monómeros de dominio Fc comprende D399K y el otro de dichos monómeros de dominio Fc comprende K409D.
7. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que uno o más enlazadores en dicha construcción Fc es un espaciador.
8. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha construcción Fc no contiene más de tres dominios Fc.
9. Construcción de Fc, según la reivindicación 8, en la que dicho módulo de selectividad de dimerización complementario de dicho primer monómero de dominio Fc comprende una sustitución de aminoácido cargado negativamente, dicho módulo de selectividad de dimerización complementario de dicho tercer monómero de dominio Fc comprende una sustitución de aminoácido cargado positivamente, dicho módulo de selectividad de dimerización complementario de dicho segundo monómero de dominio Fc comprende una protuberancia manipulada, dicho módulo de selectividad de dimerización complementario de dicho quinto monómero de dominio Fc comprende una cavidad manipulada, dicho módulo de selectividad de dimerización complementario de dicho cuarto monómero de dominio Fc comprende una protuberancia manipulada, y dicho módulo de selectividad de dimerización complementario de dicho sexto monómero de dominio Fc comprende una cavidad manipulada.
10. Composición farmacéutica que comprende una población sustancialmente homogénea de construcciones de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
11. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en promover la depuración de autoanticuerpos en un sujeto que lo necesita.
12. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en la supresión de la presentación de antígeno en un sujeto que lo necesita.
13. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en la reducción de la respuesta inmune en un sujeto que lo necesita.
14. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en la reducción de la activación de la respuesta inmune basada en un complejo inmune en un sujeto que lo necesita
15. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria o autoinmune o inmune (por ejemplo, artritis reumatoide (AR); lupus eritematoso sistémico (LES); vasculitis asociada a ANCA; síndrome de anticuerpo antifosfolípido; anemia hemolítica autoinmune; neuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; depuración de anti-allo en trasplante, anti-sí mismo (“anti-self”) en EICH, anti sustitución, terapéutica IgG, paraproteínas de IgG; dermatomiositis; síndrome de Goodpasture; síndromes de hipersensibilidad de tipo II dirigida a sistema de órganos mediados por citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos, por ejemplo síndrome de Guillain Barre, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC), dermatomiositis, síndrome de Felty, rechazo mediado por anticuerpos, enfermedad autoinmune de tiroides, colitis ulcerosa, enfermedad hepática autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática; miastenia gravis, neuromielitis óptica; pénfigo y otros trastornos ampollosos autoinmunes; síndrome de Sjogren; citopenias autoinmunes y otros trastornos mediados a través de fagocitosis dependiente de anticuerpos; otros síndromes inflamatorios dependientes de FcR, por ejemplo, sinovitis, dermatomiositis, vasculitis sistémica, glomerulitis o vasculitis).
16. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en el tratamiento de la artritis reumatoide.
17. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en el tratamiento de la neuromielitis óptica.
18. Construcción de Fc, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para su utilización en el tratamiento de la púrpura trombocitopénica idiopática.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201461987863P | 2014-05-02 | 2014-05-02 | |
| US201462081923P | 2014-11-19 | 2014-11-19 | |
| PCT/US2015/028926 WO2015168643A2 (en) | 2014-05-02 | 2015-05-01 | Compositions and methods related to engineered fc constructs |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2962694T3 true ES2962694T3 (es) | 2024-03-20 |
Family
ID=54359511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15785583T Active ES2962694T3 (es) | 2014-05-02 | 2015-05-01 | Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10239944B2 (es) |
| EP (2) | EP4299595A3 (es) |
| JP (3) | JP2017518965A (es) |
| KR (1) | KR102546875B1 (es) |
| CN (2) | CN113501880A (es) |
| AU (2) | AU2015252866B2 (es) |
| BR (1) | BR112016024780A2 (es) |
| CA (1) | CA2941072A1 (es) |
| DK (1) | DK3137506T3 (es) |
| ES (1) | ES2962694T3 (es) |
| IL (3) | IL286367B2 (es) |
| PL (1) | PL3137506T3 (es) |
| SG (2) | SG10201913507SA (es) |
| WO (1) | WO2015168643A2 (es) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UY36021A (es) | 2014-03-05 | 2015-09-30 | Ucb Biopharma Sprl | Proteìnas fc multimèricas |
| ES2962694T3 (es) | 2014-05-02 | 2024-03-20 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas |
| US20190048417A1 (en) | 2015-10-02 | 2019-02-14 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic and Diagnostic Methods for Autoimmune Diseases and/or Inflammation |
| EP3423572B1 (en) * | 2016-03-02 | 2023-11-29 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods related to engineered fc constructs |
| MX2018014228A (es) | 2016-05-20 | 2019-08-12 | Harpoon Therapeutics Inc | Proteina de union de albumina sérica de dominio unico. |
| US11623958B2 (en) | 2016-05-20 | 2023-04-11 | Harpoon Therapeutics, Inc. | Single chain variable fragment CD3 binding proteins |
| BR112018074032A2 (pt) | 2016-05-23 | 2019-02-26 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | composições e métodos relacionados a construtos de fc manipulados |
| WO2017214321A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Gliknik Inc. | Cysteine-optimized stradomers |
| WO2018016881A1 (ko) * | 2016-07-19 | 2018-01-25 | (주)아이벤트러스 | 이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법 |
| KR20190032392A (ko) | 2016-07-22 | 2019-03-27 | 글리크닉 인코포레이티드 | 향상된 fc 수용체 결합을 갖는 규칙적으로 다량체화된 면역글로불린 fc 조성물을 생성하기 위한 인간 단백질 단편의 융합 단백질 |
| JP2020500856A (ja) * | 2016-12-09 | 2020-01-16 | グリックニック インコーポレイテッド | 多価ｆｃ化合物を用いる炎症性疾患の治療方法 |
| PE20191354A1 (es) | 2016-12-09 | 2019-10-01 | Gliknik Inc | Optimizacion de fabricacion de gl-2045, un stradomer multimerizante |
| BR112019013955A2 (pt) * | 2017-01-06 | 2020-02-11 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Composições e métodos relacionados a construtos de fc manipulados |
| CA3049426A1 (en) * | 2017-01-06 | 2018-07-12 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods related to engineered fc-antigen binding domain constructs |
| EP3589662A4 (en) * | 2017-02-28 | 2020-12-30 | Harpoon Therapeutics, Inc. | INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN |
| CN110891974B (zh) | 2017-05-12 | 2021-08-06 | 哈普恩治疗公司 | 间皮素结合蛋白质 |
| EP3630808A1 (en) * | 2017-06-02 | 2020-04-08 | Pfizer Inc | Recombinant robo2 proteins, compositions, methods and uses thereof |
| EP3625250B1 (en) * | 2017-07-21 | 2021-04-14 | Trianni, Inc. | Single chain vh and heavy chain antibodies |
| CN111164104A (zh) | 2017-08-09 | 2020-05-15 | 麻省理工学院 | 白蛋白结合肽缀合物及其方法 |
| BR112020010020A2 (pt) * | 2017-11-20 | 2020-11-10 | Taizhou Mabtech Pharmaceutical Co., Ltd | uma proteína de fusão bifuncional direcionada a cd47 e pd-l1 |
| CN112996910A (zh) * | 2018-07-11 | 2021-06-18 | 动量制药公司 | 与靶向PD-L1的工程化Fc-抗原结合结构域构建体有关的组合物和方法 |
| EP3820518A4 (en) * | 2018-07-11 | 2022-06-29 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods related to engineered fc-antigen binding domain constructs |
| JP2021531268A (ja) * | 2018-07-11 | 2021-11-18 | モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | 改変されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体に関する組成物および方法 |
| CA3106254A1 (en) * | 2018-07-11 | 2020-01-16 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods related to engineered fc-antigen binding domain constructs |
| IL281683B2 (en) | 2018-09-25 | 2023-04-01 | Harpoon Therapeutics Inc | dll3 binding proteins and methods of use |
| CA3144630A1 (en) * | 2019-06-19 | 2020-12-24 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods and compositions for treating hemophilia and low bone mineral density |
| WO2021048330A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-18 | CSL Behring Lengnau AG | Recombinant igg fc multimers for the treatment of immune complex-mediated kidney disorders |
| CA3159705A1 (en) | 2019-12-06 | 2021-06-10 | CSL Behring Lengnau AG | Stable compositions of fc multimers |
| WO2024023271A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Ablynx Nv | Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor |
Family Cites Families (54)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2556219B1 (fr) | 1983-12-07 | 1987-06-26 | Merieux Inst | Nouveau medicament immunomodulateur, a base de fragments fc d'igg humaines |
| US5426641A (en) | 1994-01-28 | 1995-06-20 | Bell Communications Research, Inc. | Adaptive class AB amplifier for TDMA wireless communications systems |
| US5731168A (en) | 1995-03-01 | 1998-03-24 | Genentech, Inc. | Method for making heteromultimeric polypeptides |
| EP0975355A2 (en) | 1996-06-14 | 2000-02-02 | Smithkline Beecham Corporation | Hexameric fusion proteins and uses therefor |
| US20090074839A1 (en) | 1997-01-22 | 2009-03-19 | Marton Milankovits | Pharmaceutical Compositions Primarily for the Treatment and Prevention of Genitourinary Infections and their Extragenital Complications |
| US7951917B1 (en) | 1997-05-02 | 2011-05-31 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| US20020062010A1 (en) * | 1997-05-02 | 2002-05-23 | Genentech, Inc. | Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components |
| US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
| WO2001045746A2 (en) | 1999-12-24 | 2001-06-28 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds |
| US20050089932A1 (en) | 2001-04-26 | 2005-04-28 | Avidia Research Institute | Novel proteins with targeted binding |
| WO2005077981A2 (en) | 2003-12-22 | 2005-08-25 | Xencor, Inc. | Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES |
| US20060074225A1 (en) * | 2004-09-14 | 2006-04-06 | Xencor, Inc. | Monomeric immunoglobulin Fc domains |
| ES2592271T3 (es) | 2005-03-31 | 2016-11-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Métodos de producción de polipéptidos mediante la regulación de la asociación de los polipéptidos |
| US8354109B2 (en) * | 2005-12-13 | 2013-01-15 | Suppremol Gmbh | Multimeric Fc receptor polypeptides |
| GB0614780D0 (en) | 2006-07-25 | 2006-09-06 | Ucb Sa | Biological products |
| US7803769B2 (en) | 2006-10-25 | 2010-09-28 | Amgen Inc. | OSK1 peptide analogs and pharmaceutical compositions |
| BRPI0620639A2 (pt) | 2006-12-21 | 2011-11-22 | Micromet Ag | anticorpos de cadeia simples biespecìficos e composição farmacêutica compreendendo os mesmos |
| US20080260738A1 (en) | 2007-04-18 | 2008-10-23 | Moore Margaret D | Single chain fc, methods of making and methods of treatment |
| NZ581395A (en) | 2007-05-14 | 2012-08-31 | Biogen Idec Inc | Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto |
| MX2009013004A (es) * | 2007-06-01 | 2010-01-20 | Univ Maryland | Agentes de union al receptor de la region constante fc de inmunoglobulina. |
| ES2774337T3 (es) * | 2008-01-07 | 2020-07-20 | Amgen Inc | Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática |
| JP2012504660A (ja) | 2008-10-06 | 2012-02-23 | ユニバーシティ オブ シカゴ | 細菌ｅａｐ、ｅｍｐおよび／またはａｄｓａタンパク質に関連する組成物および方法 |
| US20100143353A1 (en) | 2008-12-04 | 2010-06-10 | Mosser David M | POLYPEPTIDES COMPRISING Fc FRAGMENTS OF IMMUNOGLOBULIN G (lgG) AND METHODS OF USING THE SAME |
| US10865233B2 (en) | 2008-12-18 | 2020-12-15 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | NKG2D-fc for immunotherapy |
| EP2389192A4 (en) | 2009-01-23 | 2013-01-16 | Biogen Idec Inc | STABILIZED FC POLYPEPTIDES WITH REDUCED EFFECTOR FUNCTION AND METHOD OF USE |
| US20120064008A1 (en) | 2009-05-20 | 2012-03-15 | Bruce Zetter | Compositions for the treatment of metastatic cancer and methods of use thereof |
| EP2432803A2 (en) | 2009-05-20 | 2012-03-28 | Theraclone Sciences, Inc. | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of influenza |
| NZ701769A (en) | 2009-09-16 | 2016-06-24 | Genentech Inc | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
| EP2486141B1 (en) | 2009-10-07 | 2018-01-10 | MacroGenics, Inc. | Fc region-containing polypeptides that exhibit improved effector function due to alterations of the extent of fucosylation, and methods for their use |
| JP2013511281A (ja) | 2009-11-23 | 2013-04-04 | アムジェン インコーポレイテッド | 単量体抗体Ｆｃ |
| GB0922209D0 (en) | 2009-12-18 | 2010-02-03 | Univ Nottingham | Proteins, nucleic acid molecules and compositions |
| BR112012029611A2 (pt) | 2010-05-21 | 2017-07-25 | Merrimack Pharmaceuticals Inc | proteína de fusão biespecífica, composição farmacêutica, método de tratamento de dano ao tecido em um indivíduo, método de promoção da regeração ou sobrevivência do tecido em um indivíduo e molécula de ácido nucleico |
| AU2011274423B2 (en) | 2010-07-09 | 2016-02-11 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric clotting factors |
| BR112013002074B1 (pt) * | 2010-07-28 | 2021-09-14 | Gliknik Inc | Composto homodimérico, dímero ou multímero de ordem superior do composto homodimérico, composição, composto, multímero e usos dos mesmos |
| AU2011288412A1 (en) | 2010-08-13 | 2013-02-21 | Medimmune Limited | Monomeric polypeptides comprising variant Fc regions and methods of use |
| AU2011325833C1 (en) | 2010-11-05 | 2017-07-13 | Zymeworks Bc Inc. | Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain |
| AU2012227883A1 (en) * | 2011-03-17 | 2013-10-24 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Bi- and monospecific, asymmetric antibodies and methods of generating the same |
| NZ608724A (en) | 2011-03-25 | 2015-12-24 | Glenmark Pharmaceuticals Sa | Hetero-dimeric immunoglobulins |
| EP2807194A4 (en) * | 2012-01-27 | 2015-12-02 | Gliknik Inc | FUSION PROTEINS WITH IGG2 HINGEOMS |
| AU2013270682A1 (en) | 2012-06-08 | 2014-12-11 | Biogen Ma Inc. | Procoagulant compounds |
| US20140051834A1 (en) | 2012-06-21 | 2014-02-20 | Hoffmann-La Roche, Inc. | Incretin Receptor Ligand Polypeptide Fc-Region Fusion Polypeptides And Conjugates With Altered Fc-Effector Function |
| AU2013305885B2 (en) * | 2012-08-20 | 2017-12-21 | Gliknik Inc. | Molecules with antigen binding and polyvalent Fc gamma receptor binding activity |
| BR112015008663B1 (pt) * | 2012-10-17 | 2021-01-12 | CSL Behring Lengnau AG | Uso de uma quantidade eficaz de uma proteína polimérica compreendendo seis unidades demonômero de polipeptídeo |
| CN104558194B (zh) | 2013-10-17 | 2018-04-27 | 泰州迈博太科药业有限公司 | 一类抗CD20-Flex双功能融合蛋白、其制备方法及用途 |
| JP2017504598A (ja) | 2013-12-20 | 2017-02-09 | インディアナ ユニヴァーシティ リサーチ アンド テクノロジー コーポレイション | 脂質化インクレチン受容体リガンドヒト免疫グロブリンｆｃ−領域融合ポリペプチド |
| KR20160107190A (ko) | 2014-01-15 | 2016-09-13 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 변형된 FcRn-결합 및 유지된 단백질 A-결합 성질을 갖는 Fc-영역 변이체 |
| EP3094649A1 (en) | 2014-01-15 | 2016-11-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Fc-region variants with modified fcrn-binding properties |
| UY36021A (es) | 2014-03-05 | 2015-09-30 | Ucb Biopharma Sprl | Proteìnas fc multimèricas |
| CA2939201A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-09-11 | Ucb Biopharma Sprl | Multimeric fc proteins |
| ES2962694T3 (es) | 2014-05-02 | 2024-03-20 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas |
| SG10201913680PA (en) | 2014-05-29 | 2020-03-30 | Macrogenics Inc | Tri-specific binding molecules that specifically bind to multiple cancer antigens and methods of use thereof |
| EP3423572B1 (en) | 2016-03-02 | 2023-11-29 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Methods related to engineered fc constructs |
| BR112018074032A2 (pt) | 2016-05-23 | 2019-02-26 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | composições e métodos relacionados a construtos de fc manipulados |
| BR112019013955A2 (pt) | 2017-01-06 | 2020-02-11 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | Composições e métodos relacionados a construtos de fc manipulados |
-
2015
- 2015-05-01 ES ES15785583T patent/ES2962694T3/es active Active
- 2015-05-01 SG SG10201913507SA patent/SG10201913507SA/en unknown
- 2015-05-01 CN CN202110761899.9A patent/CN113501880A/zh active Pending
- 2015-05-01 EP EP23193565.1A patent/EP4299595A3/en active Pending
- 2015-05-01 CA CA2941072A patent/CA2941072A1/en active Pending
- 2015-05-01 AU AU2015252866A patent/AU2015252866B2/en active Active
- 2015-05-01 JP JP2016564612A patent/JP2017518965A/ja active Pending
- 2015-05-01 WO PCT/US2015/028926 patent/WO2015168643A2/en active Application Filing
- 2015-05-01 SG SG11201607070VA patent/SG11201607070VA/en unknown
- 2015-05-01 EP EP15785583.4A patent/EP3137506B1/en active Active
- 2015-05-01 KR KR1020167029772A patent/KR102546875B1/ko active IP Right Grant
- 2015-05-01 PL PL15785583.4T patent/PL3137506T3/pl unknown
- 2015-05-01 BR BR112016024780A patent/BR112016024780A2/pt active Search and Examination
- 2015-05-01 DK DK15785583.4T patent/DK3137506T3/da active
- 2015-05-01 CN CN201580020385.0A patent/CN106661125B/zh active Active
- 2015-05-01 IL IL286367A patent/IL286367B2/en unknown
-
2016
- 2016-04-28 US US15/141,413 patent/US10239944B2/en active Active
- 2016-08-23 IL IL247442A patent/IL247442B/en active IP Right Grant
-
2019
- 2019-03-25 US US16/363,846 patent/US11124573B2/en active Active
-
2020
- 2020-05-14 JP JP2020084900A patent/JP2020128415A/ja active Pending
- 2020-05-18 IL IL274735A patent/IL274735B/en unknown
-
2021
- 2021-04-27 AU AU2021202578A patent/AU2021202578A1/en active Pending
- 2021-08-20 US US17/407,814 patent/US20220033499A1/en active Pending
-
2022
- 2022-04-14 JP JP2022066669A patent/JP2022095892A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2962694T3 (es) | Composiciones y procedimientos relacionados con construcciones de Fc manipuladas | |
| ES2871146T3 (es) | Molécula de polipéptido con especificidad dual mejorada | |
| KR102590061B1 (ko) | 유전자 조작 Fc 작제물에 관한 조성물 및 방법 | |
| ES2861446T3 (es) | Par de variantes del dominio CH3 que induce la formación de heterodímero de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo con alta eficiencia, método para prepararlo y uso del mismo | |
| ES2935274T3 (es) | Anticuerpo con intercambio de dominios | |
| ES2876421T3 (es) | Proteínas de fusión Fc que comprenden enlazadores o disposiciones nuevos | |
| ES2774337T3 (es) | Método para fabricación de moléculas heterodímeras Fc de anticuerpos utilizando efectos de conducción electrostática | |
| BR112019013955A2 (pt) | Composições e métodos relacionados a construtos de fc manipulados | |
| BR112021000427A2 (pt) | Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado direcionado a ctla-4 | |
| BR112021000388A2 (pt) | Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado | |
| BR112021000393A2 (pt) | Composições e métodos relacionados a construtos do domínio de ligação fc-antígeno manipulado |