ES2861446T3

ES2861446T3 - Par de variantes del dominio CH3 que induce la formación de heterodímero de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo con alta eficiencia, método para prepararlo y uso del mismo

Info

Publication number: ES2861446T3
Application number: ES13859121T
Authority: ES
Inventors: Yong Sung Kim; Hye Ji Choi; Eun Sil Sung
Original assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Current assignee: Ajou University Industry Academic Cooperation Foundation
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: WO2014084607A1; US20220162342A1; US9951145B2; EP2927321A1; AU2013352812B2; US12344679B2; US20180237541A1; CN104955953A; AU2013352812A1; US11286311B2; EP2927321B1; EP2927321A4; DK2927321T3; CA2892623A1; IL239041A0; BR112015012310A2; CN104955953B; EP3878964A1; US20150307628A1; IL239041B

Abstract

Un heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpo IgG humano, caracterizado porque Lys409 de un dominio CH3 está sustituido con triptófano (W), y Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con valina (V) y treonina (T), respectivamente, y el heterodímero comprende una unión entre dicho W y un aminoácido seleccionado de dicha V y dicha T y (a) Tyr349 de un dominio CH3 está sustituido con serina (S), y Glu357 del otro dominio CH3 está sustituido con triptófano (W) y el heterodímero comprende una unión entre dicho W y dicha S; (b) Lys360 de un dominio CH3 está sustituido con ácido glutámico (E), y Gln347 del otro dominio CH3 está sustituido con arginina (R) y el heterodímero comprende una unión entre dicho E y dicha R; o (c) Gln347 y Lys360 de un dominio CH3 están sustituidos con ácido glutámico (E), respectivamente, y Gln347 del otro dominio CH3 está sustituido con arginina (R) y el heterodímero comprende una unión entre un aminoácido seleccionado de dichos E y dicha R; en donde las posiciones están numeradas según el índice EU con referencia a la IgG1 humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Par de variantes del dominio CH3 que induce la formación de heterodímero de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo con alta eficiencia, método para prepararlo y uso del mismo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un par de variantes de dominio CH3, que induce una mutación en un dominio CH3 para mejorar el rendimiento de formación de un heterodímero en una región constante de cadena pesada de un anticuerpo (inmunoglobulina G, IgG), una proteína de par de Fc heterodiméricos utilizando el par de mutaciones CH3, un anticuerpo biespecífico y una proteína de fusión.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende el heterodímero, un par de Fc heterodiméricos que tiene el mismo, un anticuerpo biespecífico y una proteína de fusión.

La presente invención también se refiere a un método para preparar un par de variantes de dominio CH3 y una proteína de par de Fc heterodiméricos en el que se prefiere la formación del Fc heterodimérico del dominio c H3 del anticuerpo.

Técnica anterior

A finales del siglo XIX, se halló el hecho de que, cuando se administraba a otros animales suero de un animal de experimentación al que se administró difteria y tétanos de una dosis no letal, se podía prevenir la difteria y el tétanos. Después del hallazgo, se inició gradualmente el uso clínico del concepto de terapia con suero, es decir, la terapia con anticuerpos. Sin embargo, el tratamiento inicial con anticuerpos tenía una viabilidad muy limitada debido a los problemas para obtener un anticuerpo de alta pureza y la contaminación por agentes infecciosos transmitidos por la sangre. Con el fin de abordar estos problemas en el tratamiento tradicional con anticuerpos, se produjo un anticuerpo monoclonal puro originado en roedores en gran escala a un costo relativamente bajo según una técnica de fusión de hibridoma desarrollada en 1975. Sin embargo, debido a varios problemas y efectos secundarios tales como una vida media corta, una respuesta inmune a un anticuerpo antirratón, eficacia reducida y una reacción alérgica fatal cuando se administra un anticuerpo monoclonal originado en un ratón a un cuerpo humano, su uso clínico fue limitado. Debido al advenimiento de una técnica recombinante de genes, que fue el punto de partida de una revolución biotecnológica en la década de los '80, se pudo preparar un anticuerpo humanizado en el que se humaniza un anticuerpo monoclonal de ratón mediante manipulación génica; se minimizaron varios efectos secundarios inmunológicos provocados cuando se administra el anticuerpo a un paciente; y se estableció la base de un uso clínico activo de un anticuerpo terapéutico. Mientras tanto, desde mediados de la década de 1990, se ha desarrollado una tecnología fundamental con la que se puede producir un anticuerpo monoclonal humano completo con la ayuda de una técnica de presentación de fagos o un ratón transgénico. En la actualidad, muchas empresas farmacéuticas nacionales e internacionales realizan con entusiasmo una gran cantidad de investigación e inversión para desarrollar un nuevo fármaco utilizando un anticuerpo. Hoy en día, la Food and Drug Administration de los EE. u U. (FDA) aprobó nuevos medicamentos de anticuerpos que suman alrededor de 26 que están disponibles comercialmente en todo el mundo, y 300 o más anticuerpos terapéuticos se encuentran en un paso de ensayo clínico, lo que mostrará la importancia del anticuerpo en la industria farmacéutica. Entretanto, recientemente se ha informado de los resultados de ensayos preclínicos y clínicos que demuestran que, cuando se coadministran un anticuerpo con selectividad diana y un agente quimioterapéutico sin especificidad diana, se suprimen los efectos secundarios y se mejora el efecto terapéutico. Por lo tanto, la utilidad del anticuerpo aumentará aún más en el tratamiento contra el cáncer.

Mientras tanto, actualmente, se está desarrollando un nuevo fármaco de anticuerpos principalmente para el cáncer y las enfermedades autoinmunes. En particular, un nuevo fármaco de anticuerpo en forma de IgG o un anticuerpo intacto no muestra un efecto terapéutico satisfactorio para los tumores sólidos, y un alto costo de producción de anticuerpos puede ser un obstáculo para desarrollar el nuevo fármaco de anticuerpo. Por lo tanto, se ha intentado continuamente el desarrollo de un nuevo fármaco de anticuerpo de una forma de proteína recombinante que tiene un efecto biológico más mejorado que el anticuerpo en la técnica relacionada. Uno de ellos es un anticuerpo biespecífico en el que un anticuerpo puede unirse a al menos dos moléculas diana, sobre el que se ha iniciado una investigación desde mediados de la década del '80 para utilizar el anticuerpo, en particular, para el tratamiento contra el cáncer.

Los anticuerpos naturales (inmunoglobulina G (IgG), IgM, IgD, IgE e IgA) tienen una forma en la que se ensamblan dos cadenas pesadas que tienen la misma secuencia de aminoácidos y dos cadenas ligeras que tienen la misma secuencia. En este caso, la formación de un homodímero de las mismas dos cadenas pesadas se induce mediante una interacción entre los dominios finales (es decir, un dominio CH3 en IgG, un dominio CH4 en IgM, un dominio CH3 en IgD, dominios CH2 y CH4 en IgE y un dominio CH3 en IgA) de una región constante (Fc, fragmento cristalizable) de un anticuerpo. Luego, se induce un enlace disulfuro entre las regiones de bisagra y se forma un homodímero entre cadenas pesadas robustas. Específicamente, un conjunto de una cadena pesada y una cadena ligera en la IgG1 humana se induce mediante un enlace disulfuro entre la Cys 5 en una región de bisagra de la cadena pesada y la Cys 107 en una cadena ligera kappa.

Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal natural (mAb) tiene una característica de unión bivalente a un tipo de antígeno. Por otro lado, el anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo en forma de molécula única que puede unirse simultánea o alternativamente a dos tipos de antígenos. Dicho anticuerpo biespecífico se conoce en la técnica relacionada como una proteína manipulada tal como un anticuerpo inespecífico o multiespecífico que puede unirse a dos o más antígenos, y puede prepararse usando técnicas de fusión celular, unión química y ADN recombinante.

En la técnica relacionada, se preparó un anticuerpo biespecífico usando una técnica de cuadroma en la que se usa la fusión de células somáticas de dos líneas celulares de hibridoma diferentes que expresan un anticuerpo monoclonal de ratón que tiene la especificidad deseada (Milstein y Cuello 1983). En este caso, dos cadenas ligeras diferentes se emparejan aleatoriamente en líneas celulares de cuadroma para producir un máximo de 10 tipos de diversos anticuerpos, y es muy difícil separar y purificar un anticuerpo biespecífico deseado de esta mezcla de anticuerpos. En consecuencia, fueron necesarios procesos de purificación complejos para obtener solo un anticuerpo biespecífico deseado, ya que existen subproductos que forman un par incorrecto y el rendimiento de producción disminuye (Morrison 2007).

Como método para abordar tales problemas, se desarrolló una forma de anticuerpo biespecífico en la que los fragmentos del sitio de unión al antígeno de una cadena ligera y una cadena pesada están conectados por varias cadenas y se expresan en un único constructo. Esta forma incluye formas de diacuerpos monocatenarios, un anticuerpo de fragmento variable monocatenario en tándem (scFv) y similares (Holliger y Hudson 2005). Además, se preparó un anticuerpo biespecífico en el que se fusionan fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno adicionales al extremo N-terminal o C-terminal de una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo, que tiene una forma similar a la Ig (Miller, Meng et al. 2003; Lu, Zhang et al. 2004).

Sin embargo, el anticuerpo biespecífico basado en tal conjunto de fragmentos de anticuerpo tiene problemas porque el nivel de expresión disminuye debido a la baja estabilidad, se forma la agregación de anticuerpos y la inmunogenicidad aumenta en consecuencia (Chan y Carter 2010). Además, el anticuerpo biespecífico basado únicamente en el conjunto de fragmentos de anticuerpo no tiene una región constante de cadena pesada (Fc) del anticuerpo. Por lo tanto, existe el problema de que los siguientes elementos están ausentes: estabilidad que aumenta en asociación con Fc, una vida media sérica prolongada que depende de un mayor tamaño y unión a un receptor Fc (receptor Fc neonatal, FcRn), una ventaja de unión preservación del sitio (proteína A y proteína G) en un proceso de purificación, una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y una citotoxicidad celular dependiente del complemento (Chan y Carter 2010).

Por lo tanto, idealmente, es necesario desarrollar un anticuerpo biespecífico que tenga una estructura que sea muy similar a los anticuerpos de origen natural (IgG, IgM, IgA, IgD e IgE) y que tenga una desviación de secuencia mínima de los mismos.

Con el fin de resolver el problema anterior, se intentó desarrollar un anticuerpo biespecífico usando una técnica de botón en ojal. En esta técnica, a través de la manipulación de genes, se induce una mutación en los dominios CH3 de dos cadenas pesadas de Ig diferentes, se crea una estructura de ojales en un dominio CH3 de una cadena pesada de Ig, se hace una estructura de botón en un dominio CH3 de la otra Ig cadena pesada y dos cadenas pesadas de Ig se inducen para formar un heterodímero (patente U. S. N° 7695936 B2; solicitud de patente coreana abierta al público N° 10-2010-0087394). En este caso, los residuos de aminoácidos incluidos en un núcleo hidrófobo que contribuyen a la formación del homodímero entre los dominios CH3 de la cadena pesada de Ig humana son Leu351, Thr366, Leu368 y Tyr407 de acuerdo con la numeración UE del número de aminoácidos de la cadena de anticuerpos (Cunningham, Pflumm et al. 1969). En la técnica de botón en ojal, se informó que, con respecto a los residuos colocados en un núcleo hidrófobo en una interfaz de dominio CH3, se forma una estructura de agujeros en un dominio CH3 de cadena pesada de modo que los residuos de aminoácidos hidrófobos que tienen un lado grande se sustituyen con aminoácidos hidrófobos que tienen una cadena lateral pequeña (Thr366Ser, Leu368Ala, Tyr407Val), se forma una estructura de botón en el otro dominio CH3 de cadena pesada de modo que los residuos de aminoácidos hidrófobos que tienen una cadena lateral pequeña se sustituyen por aminoácidos hidrófobos que tienen una cadena lateral grande (Thr366Trp), y cuando se coexpresaron dos pares de mutaciones, es decir, pares de mutaciones de la región constante de la cadena pesada en los que se introducen CH3A (Thr366Ser, Leu368Ala y Tyr407Val) y CH3B (Thr366Trp), se prefiere la formación del Fc heterodimérico más que la formación de la región constante de la cadena pesada del homodímero (Ridgway, Presta et al. 1996). Sin embargo, en la técnica del botón en ojal, se informó que el rendimiento de formación del Fc heterodimérico (heterodímero Fc heterodimérico) es de aproximadamente el 80% (Ridgway, Presta et al. 1996). Con el fin de promover la estabilización del heterodímero, existe un caso en el que se introducen una presentación de fagos y un puente disulfuro para aumentar aún más la interacción (Atwell, Ridgway et al. 1997; Merchant, Zhu et al.

1998, y patente U. S. N° 5731168A).

Como otro método en el que se potencia la formación del Fc heterodimérico (heterodímero Fc heterodimérico), hay un ejemplo en el que se induce una mutación en un aminoácido cargado en una interfaz entre dominios CH3. Específicamente, se induce que un dominio CH3 en una región constante tenga aminoácidos de cadena lateral cargados positivamente, y se induce que un dominio CH3 en la otra región constante tenga aminoácidos de cadena lateral cargados negativamente, inhibiendo así la formación del homodímero debido a la repulsión electrostática y potenciando la formación del heterodímero debido a la interacción electrostática (Gunasekaran, Pentony et al. 2010, y la solicitud de patente abierta al público U. S. N° 2010/0286374 A1). Es decir, Lys392Asp y Lys409Asp se introducen en un dominio CH3, Glu356Lys y Asp399Lys se introducen en el otro dominio CH3 y, por tanto, se indujo la formación del heterodímero. El rendimiento de formación del Fc heterodimérico de la mutación del dominio CH3 es aproximadamente del 90%.

El documento US2012/0149876 proporciona un diseño de anticuerpo heterodimérico estable con mutaciones en el dominio Fc.

Como otro método más en el que se potencia la formación del Fc heterodimérico (heterodímero Fc heterodimérico), hay un ejemplo en el que se induce una mutación complementaria en una región que forma una región central hidrófoba de una interfaz CH3 debido a una diferencia de tamaño entre cadenas laterales de aminoácidos hidrófobos y, por lo tanto, se potencia la formación del heterodímero (Moore, Bautista et al. 2011, y solicitud de patente abierta al público U. S. N° 2011/0054151 A1). Específicamente, Ser364His y Phe495Ala se introducen en un dominio CH3, Tyr349Thr y Thr394Phe se introducen en el otro dominio CH3 y, por tanto, se indujo la formación del heterodímero. El rendimiento de formación del Fc heterodimérico de la mutación del dominio CH3 es de aproximadamente el 80 al 90%. Sin embargo, el Fc heterodimérico que comprende el par de variantes del dominio CH3 desarrollado tiene una estabilidad termodinámica y un rendimiento de expresión más bajos que el de un anticuerpo de tipo salvaje.

Por lo tanto, es necesario desarrollar el Fc heterodimérico que tenga un rendimiento de formación del heterodímero lo más alto posible, que tenga una estabilidad termodinámica y un rendimiento de expresión que sea similar o más aumentado que el de un tipo salvaje, pero hay todavía no hay ningún informe que satisfaga tal necesidad.

Descripción

Problema técnico

La presente invención está diseñada para desarrollar una técnica para aumentar de manera estable el rendimiento de formación de un Fc heterodimérico de un anticuerpo al 90% o más. La presente invención también está diseñada para desarrollar un heterodímero CH3 en el que se induce una mutación en los dominios CH3 con el fin de aumentar el rendimiento de formación del Fc heterodimérico y un método para prepararlo.

La presente invención también está diseñada para desarrollar un par de Fc heterodiméricos que comprende el heterodímero CH3, un anticuerpo biespecífico y una proteína de fusión.

La presente invención también está diseñada para desarrollar un anticuerpo biespecífico o una proteína fusionada con la región constante de anticuerpo que comprende el heterodímero CH3 y que tiene un nivel de expresión, un rendimiento de producción y una estabilidad termodinámica que son similares o más mejoradas que un anticuerpo de tipo salvaje original.

La presente invención también está diseñada para desarrollar un anticuerpo o una proteína fusionada con la región constante de anticuerpo que comprende el heterodímero CH3, manteniendo una función intrínseca de una región constante de cadena pesada (Fc) de un anticuerpo de tipo salvaje original, es decir, una capacidad de unión a FcRn (receptor de Fc neonatal) y FcR (receptores de Fc gamma), teniendo una vida media sérica prolongada, manteniendo una función efectora y conservando un sitio de unión (proteína A y proteína G) en un proceso de purificación.

La presente invención también está diseñada para desarrollar un anticuerpo biespecífico o una proteína fusionada con la región constante de anticuerpo que comprende el heterodímero CH3, y capaz de dirigirse simultáneamente a dos tipos de antígenos diferentes.

La presente invención también está diseñada para desarrollar un método para preparar un par de variantes de dominio CH3 (CH3 heterodimérico) y una proteína de par de Fc heterodiméricos (bisagra-CH2-CH3A y bisagra-CH2-Ch3B) en la que se prefiere la formación del Fc heterodimérico.

Los objetos de la presente invención no se limitan a los objetos descritos con anterioridad, y los expertos en la técnica pueden entender claramente otros objetos no mencionados a partir de las siguientes descripciones.

Solución técnica

La presente invención proporciona un heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpo IgG humano caracterizado porque Lys409 de un dominio CH3 está sustituido con triptófano (W), y Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con valina (V) y treonina (T), respectivamente, y el heterodímero comprende una unión entre dicho W y un aminoácido seleccionado de dicha V y dicha T

y

(a) Tyr349 de un dominio CH3 está sustituido con serina (S), y Glu357 del otro dominio CH3 está sustituido con triptófano (W) y el heterodímero comprende una unión entre dicho W y dicha S;

(b) Lys360 de un dominio CH3 está sustituido con ácido glutámico (E), y Gln347 del otro dominio CH3 está sustituido con arginina (R) y el heterodímero comprende una unión entre dicho E y dicha R; o

(c) Gln347 y Lys360 de un dominio CH3 se sustituyen con ácido glutámico (E), respectivamente, y Gln347 del otro dominio CH3 se sustituye con arginina (R) y el heterodímero comprende una unión entre un aminoácido seleccionado de dicho E y dicha R,

en el que las posiciones están numeradas según el índice EU con referencia a la IgG1 humana.

En ciertas realizaciones del heterodímero que comprende los dominios CH3 del anticuerpo IgG humano de la invención, Lys360 y Lys409 de un dominio CH3 están sustituidos con ácido glutámico (E) y triptófano (W), respectivamente, y Gln347, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con arginina (R), valina (V) y treonina (T), respectivamente. En esta realización, el heterodímero puede comprender, además, una unión entre una sustitución de cisteína (C) en Tyr349 de un dominio CH3 y una sustitución de cisteína (C) en Ser354 del otro dominio CH3.

En determinadas realizaciones del heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpos IgG humanos de la invención, Gln347, Lys360 y Lys409 de un dominio CH3 están sustituidos con ácido glutámico (E), ácido glutámico (E) y triptófano (W), respectivamente, y Gln347, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con arginina (R), valina (V) y treonina (T), respectivamente.

En determinadas realizaciones del heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpos IgG humanos de la invención, Tyr349 y Lys409 de un dominio CH3 están sustituidos con serina (S) y triptófano (W), respectivamente, y Glu357, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con triptófano (W), valina (V) y treonina (T), respectivamente. En esta realización, el heterodímero puede comprender, además, una unión entre una sustitución de cisteína (C) en Tyr349 de un dominio CH3 y una sustitución de cisteína (C) en Ser354 del otro dominio CH3.

La invención también proporciona un par de Fc heterodiméricos que comprende el heterodímero que comprende los dominios CH3 de IgG humana de la invención.

La invención también proporciona un anticuerpo biespecífico que comprende el heterodímero que comprende los dominios CH3 de IgG humana de la invención.

El anticuerpo biespecífico de la invención se selecciona del grupo que consiste en

(a) scFv-Fc, que tiene una estructura en la que dos tipos de fragmentos de anticuerpo, scFv, que tienen diferente especificidad antigénica, se fusionan con el extremo N-terminal o C-terminal de una proteína de par de Fc heterodiméricos,

(b) sclgG (scFab-Fc), que tiene una estructura en la que se fusionan dos tipos de scFab;

(c) (Fv)2-Fc, que tiene una estructura en la que dos tipos de Fv de unión a antígeno que consisten en la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) se fusionan con el extremo N-terminal y C-terminal de una proteína de par de Fc heterodiméricos, respectivamente; y

(d) mAb-Fv, que es un anticuerpo monoclonal biespecífico fusionado con la región variable en el que un único dominio de unión a antígeno variable (VH o VL) se fusiona con el extremo C-terminal de la cadena pesada de IgG que consiste en una proteína de par de Fc heterodiméricos.

La invención también proporciona un anticuerpo monovalente de unión a antígeno que comprende la proteína de par de Fc heterodiméricos de la invención, estando el anticuerpo en forma de Fv-Fc en el que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), que se unen a un solo antígeno, se fusionan con el extremo N-terminal o C-terminal de una proteína de par de Fc heterodiméricos, y que es capaz de unirse monovalentemente al único antígeno.

La invención también proporciona una proteína de fusión en forma de proteína-Fc preparada fusionando dos tipos de proteínas con el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína de par de Fc heterodiméricos de la invención.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende como componente eficaz al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en el par de Fc heterodiméricos de la invención, el anticuerpo biespecífico de la invención, el anticuerpo monovalente de unión al antígeno de la invención, y la proteína de fusión de la invención.

La invención también proporciona un método para preparar un heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de la invención, en el que se prefiere la formación de un Fc heterodimérico, comprendiendo el método:

(a) preparar un par de mutaciones mediante

(i) sustitución de Lys409 de un dominio CH3 con triptófano (W), y sustitución de Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 con valina (V) y treonina (T); y

(iia) sustitución de Tyr349 de un dominio CH3 con serina (S) y Glu357 del otro dominio CH3 con triptófano (W); (iib) sustitución de Lys360 de un dominio CH3 con ácido glutámico (E) y Gln347 del otro dominio CH3 con arginina (R); o

(iic) sustitución de Gln347 y Lys360 de un dominio CH3 con ácido glutámico (E), respectivamente, y sustitución de Gln347 del otro dominio CH3 con arginina (R); y

(b) unión del par de mutaciones preparado en la etapa (a) para formar un heterodímero de la invención como se define en el presente documento.

La invención también proporciona un método para preparar un par de Fc heterodiméricos que comprende el heterodímero que comprende dominios CH3 de IgG1 humana de la invención, en el que dicho par de Fc se forma a partir de dos cadenas pesadas, cada una de las cuales tiene la estructura bisagra-CH2-CH3, comprendiendo el método:

(d) la preparación de un vector de expresión de proteína de par de Fc recombinante que comprende ácidos nucleicos en el que el heterodímero que comprende dominios CH3 de IgG1 humana preparados mediante el método descrito inmediatamente antes se fusiona con el extremo C-terminal de un dominio bisagra-CH2 de tipo salvaje de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo;

(e) la expresión de la proteína del par de Fc recombinante cotransformando el vector de expresión preparado con células; y

(f) la purificación y recuperación de la proteína de par de Fc recombinante coexpresada.

También se describe en el presente documento un heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpo y que comprende la siguiente unión (a) entre los dominios CH3: (a) una unión entre i) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina (A), treonina (T), serina (S), valina (V), metionina (M) y glicina (G), que es una sustitución en al menos una posición de un primer grupo de posiciones de dominio CH3 seleccionadas del grupo que consiste en Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 y Lys409, y ii) un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W), que es una sustitución en al menos una posición del primer grupo de posiciones del dominio CH3 (donde las posiciones están numeradas de acuerdo con el índice EU). El heterodímero descrito con anterioridad que comprende dominios CH3 del anticuerpo puede comprender además la siguiente unión (b) entre los dominios CH3: (b) una unión entre i) lisina (K) o arginina (R), que es una sustitución en al menos una posición de un segundo grupo de posiciones del dominio CH3 seleccionadas del grupo que consiste en Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 y Ser400, y ii) ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E), que es una sustitución en al menos una posición del segundo grupo de posiciones del dominio CH3 (en las que las posiciones están numeradas según el índice EU).

En un ejemplo, la posición del primer grupo puede seleccionarse del grupo que consiste en Tyr349, Glu357, Asp399, Phe405 y Lys409.

En otro ejemplo, Lys409 de un dominio CH3 puede sustituirse con triptófano (W), y Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 pueden sustituirse con valina (V) y treonina (T), respectivamente.

En otro ejemplo, Tyr349 de un dominio CH3 se puede sustituir con serina (S) y Glu357 del otro dominio CH3 se puede sustituir con triptófano (W).

En otro ejemplo, la posición del segundo grupo puede ser Gln347 o Lys360.

En otro ejemplo, Lys360 de un dominio CH3 se puede sustituir con ácido glutámico (E) y Gln347 del otro dominio CH3 se puede sustituir con arginina (R).

En otro ejemplo, Gln347 de un dominio CH3 se puede sustituir con ácido glutámico (E).

En otro ejemplo, Lys360 y Lys409 de un dominio CH3 se pueden sustituir con ácido glutámico (E) y triptófano (W), respectivamente, y Gln347, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 se pueden sustituir con arginina (R)., valina (V) y treonina (T), respectivamente.

En otro ejemplo, Gln347, Lys360 y Lys409 de un dominio CH3 se pueden sustituir con ácido glutámico (E), ácido glutámico (E) y triptófano (W), respectivamente, y Gln347, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 se pueden sustituir con arginina (R), valina (V) y treonina (T), respectivamente.

En otro ejemplo, Tyr349 y Lys409 de un dominio CH3 se pueden sustituir con serina (S) y triptófano (W), respectivamente, y Glu357, Asp399 y Phe405 del otro dominio c H3 se pueden sustituir con triptófano (W), valina (V) y treonina (T), respectivamente.

En otro ejemplo, el heterodímero que comprende dominios CH3 del anticuerpo puede comprender, además, la siguiente unión (c) entre los dominios CH3: (c) una unión entre i) cisteína (C) sustituida en al menos una posición de un tercer grupo de posiciones del dominio CH3 seleccionadas del grupo que consiste en Tyr349 y Ser354, y ii) cisteína (C) sustituida en al menos una posición del tercer grupo de posiciones del dominio CH3 (en donde las posiciones están numeradas según el índice EU).

También se describe en el presente documento un método para preparar un par de variantes de dominio CH3 (CH3 heterodimérico) que comprende:

(a) preparar un par de mutaciones i) en un primer grupo de posiciones de dominio CH3 seleccionadas del grupo que consiste en Tyr349, Asp356, Glu357, Ser364, Lys370, Lys392, Asp399, Phe405 y Lys409, sustituyendo al menos un aminoácido posicionado en el primer grupo con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina (A), treonina (T), serina (S), valina (V), metionina (M) y glicina (G); y ii) sustituyendo al menos un aminoácido posicionado en el primer grupo de posiciones del dominio CH3 con un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina (F), tirosina (Y) y triptófano (W); (b) preparar un par de mutaciones i) en un segundo grupo de posiciones de dominio CH3 seleccionadas del grupo que consiste en Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397 y Ser400, sustituyendo al menos un amino ácido posicionado en el segundo grupo de posiciones del dominio c H3 con lisina (K) o arginina (R); y ii) sustituyendo al menos un aminoácido posicionado en el segundo grupo con ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E); y (c) unir los pares de mutaciones en la etapa (a) y (b). También se describe en el presente documento un método para preparar una proteína de par de Fc heterodiméricos (bisagra-CH2-CH3A y bisagra-CH2-Ch3B), comprendiendo el método: (d) preparar un vector de expresión de proteína de par de Fc recombinante que comprende ácidos nucleicos en los que el par de variantes del dominio CH3 preparado se fusiona con el extremo C-terminal de un dominio CH2 bisagra de tipo salvaje de la región constante de la cadena pesada de un anticuerpo; (e) expresar la proteína del par de Fc recombinante cotransformando el vector de expresión preparado con células; y (f) purificar y recuperar la proteína de par de Fc recombinante coexpresada.

Efectos ventajosos

En un heterodímero de dominio CH3 de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, se induce una mutación usando un método diferente del método convencional, se minimiza la formación del homodímero y el heterodímero se puede formar con un alto rendimiento del 90 al 95%, o más. Cuando una proteína de par de Fc heterodiméricos preparada usando el heterodímero de dominio CH3 se expresa en células animales, la proteína tiene un nivel de expresión, un rendimiento de producción y una estabilidad termodinámica que son similares o más mejoradas que el anticuerpo de tipo salvaje original.

Además, una proteína de par de Fc heterodiméricos preparada usando un heterodímero de dominio CH3 de una región constante de cadena pesada (Fc heterodimérico) de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención tiene ventajas porque se mantiene una función intrínseca de una región constante de cadena pesada (Fc) de un anticuerpo de tipo salvaje original, es decir, una capacidad de unión a FcRn (receptor de Fc neonatal) y FcR (receptores de Fc gamma), se proporciona una vida media sérica prolongada, se preserva un sitio de unión (proteína A y proteína G) en un proceso de purificación, y se puede mantener una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y una citotoxicidad celular dependiente del complemento.

Además, en una proteína de par de Fc heterodiméricos preparada usando un heterodímero de dominio CH3 de una región constante de cadena pesada (Fc heterodimérico) de un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, las variantes del dominio CH3 no se expresan individualmente y se sintetizan otra vez, sino que se expresan en una célula. Por lo tanto, se puede producir una región constante de heterodímero (Fc heterodimérico) con un alto rendimiento de aproximadamente el 90 al 95% o más con alta eficiencia.

Además, es posible preparar un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención en una forma scFv-Fc en la que dos tipos de fragmentos de anticuerpo (scFv) que tienen diferente especificidad antigénica se fusionan con el extremo N-terminal o C-terminal de una proteína de par de región constante de heterodímero (Fc heterodimérico), en una forma scIgG (scFab-Fc) en la que se fusionan dos tipos de scFab, y en una forma (Fv)²-Fc en la que dos tipos de una región variable de cadena pesada (VH) y el par de la región variable de la cadena ligera (VL), que forman el Fv de unión al antígeno, se fusionan con el extremo N-terminal y C-terminal de un Fc heterodimérico, respectivamente, con un alto rendimiento y con alta eficiencia. Además, es posible preparar un anticuerpo biespecífico en una forma de mAb-Fv de anticuerpo único fusionado con la región variable biespecífica en la que un dominio de unión a antígeno variable único (VH o VL) se fusiona con el extremo C-terminal de una cadena pesada de IgG típica que consiste en de dos regiones constantes de cadena pesada (Fc) donde se incluye un par de variantes de dominio CH3 con un alto rendimiento y con alta eficiencia. Además, es posible preparar un anticuerpo de unión a antígeno monovalente en una forma Fv-Fc en la que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), que se unen a un solo antígeno, se fusionan con el extremo N-terminal o C-terminal de dos regiones constantes de cadena pesada (Fc) donde se incluye un par de variantes de dominio CH3 con un alto rendimiento y con alta eficiencia. Además, es posible preparar una proteína fusionada con región constante de anticuerpo (proteína-Fc) en la que se fusionan los dominios extracelulares del receptor de la membrana celular capaces de unirse a una proteína específica, un péptido, un anticuerpo de dominio único, un ligando, una toxina y similares y pueden reconocer específicamente uno o dos tipos de proteínas con un alto rendimiento y una alta eficiencia.

Además, dado que un anticuerpo biespecífico o una proteína fusionada de región constante de anticuerpo (proteína-Fc) que puede dirigirse simultáneamente a dos tipos de antígenos de acuerdo con la presente invención, puede dirigirse simultáneamente a dos tipos de antígenos relacionados con tumores o enfermedades inmunológicas causadas por operaciones redundantes, indirectas y graduales de varias proteínas no causadas por una proteína, es posible aumentar un efecto terapéutico en comparación con un anticuerpo monoclonal que se dirige a un solo tipo de proteína diana.

Además, un anticuerpo (Fv-Fc) preparado de acuerdo con la presente invención en el que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), que se unen a un solo antígeno, se fusionan para ser capaz de unirse monovalentemente a un solo antígeno puede dirigirse más eficazmente a un antígeno diana cuando el antígeno se dirige con un anticuerpo de unión monovalente (mAb) que cuando el antígeno se dirige a un anticuerpo de unión bivalente (mAb). Por lo tanto, se puede esperar un efecto elevado para el tratamiento de enfermedades relacionadas con el antígeno diana.

Además, una proteína fusionada con región constante de anticuerpo (proteína-Fc) preparada de acuerdo con la presente invención, en la que los dominios extracelulares del receptor de la membrana celular capaces de unirse a una proteína específica, un péptido, un anticuerpo de dominio único, un ligando, una toxina y similares se fusionan con Fc, pueden reconocer específicamente uno o dos tipos de proteínas y pueden dirigirse eficazmente a una proteína diana que puede dirigirse utilizando una región constante de cadena pesada de homodímero existente (Fc homodimérico). Por lo tanto, se puede esperar un efecto elevado para el tratamiento de enfermedades relacionadas con proteínas diana.

Descripción de los dibujos

FIG. 1 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una estructura de un anticuerpo IgG1 natural específico para un antígeno. Un anticuerpo IgG1 de tipo salvaje tiene una forma en la que se ensamblan dos cadenas pesadas que tienen la misma secuencia de aminoácidos y dos cadenas ligeras que tienen la misma secuencia. Para que dos pares de cadenas pesadas formen un dímero, la formación del dímero se induce mediante una interacción entre los dominios CH3. Luego, se induce un enlace disulfuro entre las regiones de bisagra y se forma un homodímero entre cadenas pesadas robustas. El ensamblaje de la cadena pesada y la cadena ligera es inducido por un enlace disulfuro entre la Cys 5 en una región de bisagra de la cadena pesada y la Cys 107 en una cadena ligera kappa.

FIG. 2 es un diagrama que ilustra esquemáticamente una interfaz entre dominios CH3 en un anticuerpo IgG1 de tipo salvaje. El interior de la interfaz incluye residuos relacionados con la interacción hidrófoba y residuos que tienen una interacción electrostática. Estos residuos contribuyen a la formación de un dímero del dominio CH3. Además, hay residuos que existen en la interfaz, pero no tienen interacción con residuos adyacentes a ella. Estos residuos no contribuyen a la formación del dímero ni participan en la interacción con una interacción no covalente relativamente débil.

FIG. 3 es un diagrama que ilustra una interacción entre cadenas laterales de aminoácidos en la que se introduce una mutación en una interfaz entre dominios CH3 de una estructura de cadena pesada de un anticuerpo IgG1 humano. Se analizó una interfaz entre dominios CH3 basándose en una estructura de fragmento Fc (código PDB: 1FC1 (Deisenhofer 1981), 1L6X (Idusogie, Presta et al. 2000) y 3AVE (Matsumiya, Yamaguchi et al. 2007)) del anticuerpo humano conocido. Se ilustra una interacción entre cadenas laterales de aminoácidos en la que se introduce una mutación en una interfaz entre dominios CH3 basándose en una estructura 3AVE.

FIG. 3A es un diagrama que ilustra las cadenas laterales de aminoácidos Lys360 y Lys409 en un dominio CH3A y las cadenas laterales de aminoácidos Gln347, Asp399 y Phe405 en un dominio CH3B en un dominio CH3 de un anticuerpo IgG1 humano de tipo salvaje. Un aminoácido K360 existente en un dominio CH3 es adyacente al aminoácido Gln347 en el otro dominio CH3, pero no hay interacción que contribuya a la formación del dímero en el dominio CH3. Además, Lys409 en un dominio CH3 y Asp399 en el otro dominio CH3 son residuos de aminoácidos que contribuyen significativamente a la formación del dímero del dominio CH3 debido a la interacción electrostática.

FIG. 3B es un diagrama que ilustra un modelo predicho de una estructura de un dominio CH3 de una mutación del dominio CH3. Se introdujeron mutaciones de Lys360Glu y Lys409Trp en un dominio CH3, y se introdujeron mutaciones Gln347Arg, Asp399Val y Phe405Thr en el otro dominio CH3. Por lo tanto, Lys360 y Gln347 existentes se sustituyeron por Lys360Glu y Gln347Arg para que se pudiera generar una interacción electrostática selectiva entre residuos que no tuvieran interacción. Esta estrategia de mutación puede contribuir a la formación selectiva de un heterodímero de los dominios CH3. Además, se introdujeron mutaciones de Lys409Trp y Asp399Val y Phe405Thr en el otro dominio CH3 para que se pudiera inducir una interacción hidrófoba complementaria en lugar de la interacción electrostática existente. Esta es una estrategia de mutación en la que se inhibe la formación del homodímero tal como CH3A:CH3A y CH3B:CH3B y se induce la formación del heterodímero de CH3A:CH3B.

FIG. 4 ilustra una interacción entre Lys409 en un dominio CH3A y residuos Asp399 y Phe405 en un dominio CH3B en la estrategia de mutación. En una interfaz de dominio CH3 de tipo salvaje, Lys409 en un dominio se une electrostáticamente a residuos Asp399 en el otro dominio, lo que contribuye a la formación del dímero entre los dominios. Por lo tanto, al introducir mutaciones de Lys409Trp en un dominio CH3 y Asp399Val y Phe405Thr en el otro dominio CH3, se produjo una mutación capaz de inducir una interacción hidrófoba complementaria solo entre heterodímeros en lugar de la interacción electrostática existente. Esta es una estrategia de mutación en la que se inhibe la formación del homodímero tal como CH3A:CH3A y CH3B:CH3B y se induce la formación del heterodímero de CH3A:CH3B.

FIG. 5 ilustra una interacción entre mutaciones de Lys360Glu en un dominio CH3A y Gln347Arg en un dominio CH3B de acuerdo con la estrategia de mutación. Los residuos por mutar son adyacentes en un tipo salvaje, pero no hay interacción a través de la cual un dominio CH3 existente contribuya a formar un dímero. Aquí, se indujeron mutaciones de Lys360Glu y Gln347Arg que pueden inducir una interacción electrostática de largo alcance solo entre heterodímeros. Se trata de una estrategia de mutación en la que se inhibe la formación del homodímero, como CH3A:CH3A y CH3B:CH3B, y se induce la formación del heterodímero de CH3A:CH3B.

FIG. 6 ilustra una interacción entre una mutación Gln347E en un dominio CH3A y residuos Lys360 en un dominio CH3B en la estrategia de mutación. Estos residuos se colocan en una región simétrica con una región de interacción Lys360Glu-Gln347Arg ilustrada en la FIG. 5 en la interfaz de los dominios CH3. De manera similar a la región de interacción Lys360Glu-Gln347Arg anterior, los residuos de Gln347 en el dominio CH3A y Lys360 en el dominio CH3B son adyacentes en el tipo salvaje, pero no hay interacción a través de la cual un dominio CH3 existente contribuya a formar un dímero. Aquí, se introdujo una mutación Gln347Glu para inducir una interacción electrostática selectiva con el residuo Lys360 en el otro dominio CH3. Esta es una estrategia de mutación en la que se inhibe la formación del homodímero, como CH3A:CH3A y CH3B:CH3B, y se induce la formación del heterodímero de CH3A:CH3B.

FIG. 7 ilustra una interacción entre Glu357 en un dominio CH3A y residuos Tyr349 y Lys370 en un dominio CH3B en la estrategia de mutación. En una interfaz de dominio CH3 de tipo salvaje, Glu357 en un dominio se une electrostáticamente a residuos Lys370 en el otro dominio, lo que contribuye a la formación del dímero entre los dominios, y es adyacente a los residuos Tyr349 en el otro dominio. Por lo tanto, al introducir mutaciones de Glu357Trp en un dominio c H3 y Tyr349Ser en el otro dominio CH3, se produjo una mutación capaz de inducir una interacción hidrofóbica complementaria solo entre heterodímeros en lugar de la interacción electrostática existente entre Glu357 y Lys370. Esta es una estrategia de mutación en la que se inhibe la formación del homodímero, como CH3A:CH3A y CH3B:CH3B, y se induce la formación del heterodímero de CH3A:CH3B.

FIG. 8 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un caso en el que un par de mutaciones del dominio CH3 (CH3A y CH3B), en el que se introduce la mutación según la presente invención, inhibe la formación de un homodímero de región constante de cadena pesada según una interacción de CH3A:CH3A o CH3B:CH3B e induce la formación de un Fc heterodimérico según una interacción de CH3A:CH3B.

FIG. 9 es un diagrama que ilustra esquemáticamente un anticuerpo biespecífico y una proteína de fusión Fc que se puede preparar usando un Fc heterodimérico generado conectando un par de mutaciones CH3 formador de heterodímeros (CH3A:CH3B) según la presente invención al extremo C-terminal de un dominio bisagra-CH2 de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo. Es posible preparar una inmunoglobulina de fragmento de anticuerpo monocatenario biespecífico (scFv-Fc) en la que dos tipos de anticuerpos de fragmento variable monocatenario (scFv) que tienen diferente especificidad de unión a antígeno se fusionan a cada extremo amino (extremo N) en un Fc heterodimérico; una inmunoglobulina monocatenaria biespecífica (scFab-Fc) en la que dos tipos de fragmentos de unión a antígeno monocatenarios (Fab) que tienen diferente especificidad de unión a antígeno se fusionan con cada extremo amino (extremo N); una inmunoglobulina fusionada con región variable biespecífica (Fv)²-Fc en la que dos tipos de un único dominio de unión a antígeno variable (VH o VL) de una cadena pesada y una cadena ligera derivada de un anticuerpo que reconoce diferentes antígenos se fusionan en un par con el extremo N-terminal y C-terminal de una región constante de cadena pesada, respectivamente; un anticuerpo único mAb-Fv fusionado con región variable biespecífica en el que un dominio de unión a antígeno variable único (VH o VL) se fusiona con el extremo C-terminal de una cadena pesada de IgG típica; una inmunoglobulina fusionada de región variable de unión a antígeno monovalente (Fv-Fc) en la que un dominio de unión a antígeno variable único (VH o VL) de una cadena pesada y una cadena ligera derivada de un anticuerpo que reconoce un tipo de antígeno se fusiona con la extremo N-terminal de una región constante de cadena pesada; y una proteína fusionada de región constante de anticuerpo (proteína-Fc) en la que dos tipos de un dominio extracelular de proteína de membrana celular reconocen específicamente un ligando, un péptido, un anticuerpo de dominio único que reconoce un tipo de antígeno, un anticuerpo de dominio único, un péptido, una proteína de ligando, una proteína de toxina y similares se fusionan con el extremo N-terminal de una región constante de cadena pesada.

FIG. 10 muestra la comparación de secuencias de dominios CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 de anticuerpos humanos con IgG1, IgG2A, IgG2B e IgG3 de anticuerpos de ratón. Los residuos Gln347, Lys360, Asp399, Phe405, Lys409, que se destacan en negrita, son residuos en los que se introduce una mutación. Puede observarse que los residuos en los que se introduce una mutación se conservan como residuos casi similares independientemente del anticuerpo humano y un subtipo de un anticuerpo IgG de ratón. Por lo tanto, puede entenderse que la mutación inducida para formar un par de mutaciones CH3 heterodiméricas de acuerdo con la presente invención no se limita a anticuerpo IgG1 humano.

FIG. 11 y 12 son diagramas que ilustran esquemáticamente 5 pares de mutaciones de CH3 cuyos rendimientos de formación se comparan en un Fc heterodimérico que se expresa y purifica como se describe en el presente documento.

FIG. 13 y 14 son diagramas esquemáticos y mapas de vectores diseñados para clonar scFv-Fc en los que se fusiona un anticuerpo de fragmento monocatenario variable (scFv) construido para evaluar el rendimiento de formación del heterodímero de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo a través de un par de mutaciones CH3 preparado y un Fc ficticio en un vector pcDNA3.1 que sirve como vector de expresión de células animales.

FIG. 15 es un diagrama que ilustra un caso en el que, cuando el vector de expresión de células animales scFv-Fc y Fc ficticio construido en las FIG. 13 y 14 se cotransfectan y se expresan en células animales, un rendimiento de producción del heterodímero debido al par de mutaciones CH3 puede evaluarse mediante análisis de tamaño y forma de ensamblaje, ya que un homodímero y un heterodímero se expresan como anticuerpos de diferentes tamaños.

FIG. 16 y 19 muestran los resultados obtenidos al introducir el par de mutaciones CH3 preparado según las FIG. 13 y 14 en el vector de expresión de células animales con el fin de evaluar la formabilidad del heterodímero descrito en la FIG. 15, expresando y purificando temporalmente el par de mutaciones CH3 en células HEK293F mediante cotransformación, y analizando un tamaño y una forma de ensamblaje en una SDS-PAGE en condiciones no reductoras para evaluar la formabilidad de un anticuerpo heterodimérico. En este caso, se usó un anticuerpo en el que se emplea un CH3 de tipo salvaje como grupo de control negativo, se usó un anticuerpo biespecífico de botón en ojal como grupo de control positivo, y la cantidad de proteínas utilizadas para el análisis fue de aproximadamente 10 mg.

FIG. 17 y 18 muestran los resultados obtenidos expresando temporalmente el par de mutaciones CH3 preparado de acuerdo con las FIG. 13 y 14 en células HEK293F mediante cotransformación, y luego analizando un tamaño y una forma de ensamblaje de un anticuerpo heterodimérico purificado, se analizan usando un anticuerpo que reconoce específicamente una región Fc humana en una transferencia Western. En este caso, se usó un anticuerpo en el que se emplea un CH3 de tipo salvaje como grupo de control negativo, y se usó un anticuerpo biespecífico de botón en ojal como grupo de control positivo. FIG. 17 muestra el resultado obtenido en condiciones no reductoras, mientras que la FIG. 18 muestra el resultado obtenido en condiciones reductoras. La cantidad de proteínas utilizadas para el análisis fue de 0,1 mg.

FIG. 20 muestra el resultado obtenido expresando un tipo salvaje, una mutación EW-RVT y un dímero Fc del botón en ojal (grupo de control positivo) en las formas construidas en la FIG. 13, y luego midiendo el dicroísmo circular para confirmar si una estructura secundaria de una proteína de dímero Fc en la que se introduce un dominio CH3 de mutación se conserva de la misma forma que la de un tipo salvaje. Como resultado, se confirmó que el dímero Fc en el que se introduce la mutación CH3 tiene el mismo dicroísmo circular que el dímero Fc de tipo salvaje, y la estructura secundaria de la proteína se mantiene sin modificación.

FIG. 21 muestra el resultado obtenido al expresar una mutación EW-RVT en la forma heterodimérica ilustrada en la FIG. 14, y luego realizar resonancia de plasmón superficial (SPR) para confirmar si un dímero Fc en el que se introduce un dominio CH3 de mutación conserva la capacidad de unión a FcRn. Se confirmó que el anticuerpo que comprende el dominio CH3 de mutación mantiene la capacidad de unión a FcRn, similar al anticuerpo que comprende el dominio CH3 de tipo salvaje. En este caso, se utilizó Remicade (Infliximab, Janssen Biotech), que es un anticuerpo que comprende un anticuerpo humano IgG1, como grupo de control positivo.

FIG. 22A es un diagrama que ilustra esquemáticamente un anticuerpo biespecífico en el que el par de mutaciones CH3 preparado de acuerdo con la presente invención se introduce en una forma scFv-Fc. Un anticuerpo scFv hAY4a humanizado (Lee, Park et al. 2010) que se une específicamente a un antígeno diana DR4 y un anticuerpo scFv AU5H con afinidad mejorada de un anticuerpo scFv HW1 humano (Park, Lee et al. 2007) que se une específicamente a un antígeno diana DR5 se fusionaron con el extremo N-terminal de Fc en el que se usó la variante del dominio CH3 para constar un anticuerpo biespecífico DR4 x DR5 en forma de scFv-Fc. FIG. 22B muestra el resultado obtenido al cotransformar células HEK293F con un vector que expresa un anticuerpo scFv-Fc biespecífico, expresando y purificando temporalmente el anticuerpo, y luego analizando el anticuerpo mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras. El par de mutaciones del dominio CH3 construido EW-RVT se introdujo en una cadena pesada y se usó un anticuerpo biespecífico de botón en ojal como grupo de control positivo. FIG. 22C muestra el resultado obtenido mediante la realización de una cromatografía de exclusión por tamaño para confirmar el tamaño de un anticuerpo scFv-Fc biespecífico expresado y purificado en un estado nativo. Se confirmó que solo se detectó una proteína deseada de un tamaño de 103 kD, que es idéntica al grupo de control.

FIG. 23A es un diagrama que ilustra esquemáticamente un anticuerpo biespecífico en el que el par de mutaciones CH3 preparado de acuerdo con la presente invención se introduce en una forma scFab-Fc (scIgG). Un anticuerpo original usado incluye un anticuerpo hAY4a humanizado y un anticuerpo AU5H, que son los mismos que los usados en el anticuerpo biespecífico de la forma scFv-Fc en la FIG. 20. Se fusionó una forma de Fab monocatenario (scFab) en la que un dominio VH-CH y un dominio VL-CL están conectados mediante conectores de cadena de 26 aminoácidos al extremo N-terminal de una región Fc para construir el anticuerpo biespecífico DR4 x DR5 en una forma de scFab-Fc. FIG. 23B muestra el resultado obtenido al cotransformar células HEK293F con un vector que expresa el anticuerpo scFab-Fc biespecífico, expresando y purificando temporalmente el anticuerpo y luego analizando el anticuerpo mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras. El par de mutaciones del dominio CH3 construido EW-RVT se introdujo en una cadena pesada y se usó un anticuerpo biespecífico de botón en ojal como grupo de control positivo. Se puede observar que se genera principalmente un anticuerpo biespecífico deseado, que es idéntico al grupo de control. FIG. 23C muestra el resultado obtenido realizando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) con el fin de confirmar la capacidad de unión y la especificidad del anticuerpo scFv-Fc biespecífico DR4 x DR5 purificado en la FIG. 20 y el anticuerpo scFab-Fc biespecífico DR4 x DR5 en la FIG. 21 con respecto a los antígenos DR4 y DR5. Como resultado, se confirmó que el anticuerpo biespecífico preparado tiene especificidad por el antígeno DR4 y DR5. En este caso, como antígenos similares de DR4 y DR5, se usaron DcR1 y DcR2 como antígenos de control.

FIG. 24 muestra el resultado obtenido al realizar un experimento de citotoxicidad (ensayo MTT) en líneas celulares HCT116 y HeLa para confirmar una actividad de destrucción de células cancerosas del anticuerpo scFv-Fc biespecífico DR4 x DR5 purificado en la FIG. 20 y el anticuerpo scFab-Fc biespecífico DR4 x DR5 en la FIG. 21. Se observa que los anticuerpos biespecíficos preparados de dos formas tienen una mayor citotoxicidad que sus anticuerpos originales, hAY4 IgG y AU5H scFv, y tienen una citotoxicidad similar o más excelente que TRAIL utilizado como grupo de control positivo.

Modos de la invención

Existe una cadena pesada de un anticuerpo como homodímero en un estado nativo. En este caso, la formación de un dímero entre las cadenas pesadas se estabiliza debido a un enlace disulfuro de una región bisagra cuando el dímero se genera por una interacción no covalente entre los dominios CH3-CH3 de una región constante de la cadena pesada (Schroeder y Cavacini 2010) (ver la FIG. 1). El dímero entre los dominios CH3 de la región constante de la cadena pesada se genera cuando los residuos de la hoja beta de una cadena pesada se unen de forma no covalente a las cadenas laterales de los residuos de la hoja beta opuestos y, en consecuencia, se forma un homodímero estabilizado termodinámicamente (Schroeder y Cavacini 2010).

Se analizó una interacción entre los dominios CH3 que forman el homodímero de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo IgG observando una estructura cristalina de rayos X. Una estructura utilizada es el código PDB = 1FC1, 1L6X y 3AVE.

Según el resultado del análisis de residuos de una interfaz entre los dominios CH3, dentro de la interfaz está presente una estructura central de interacción hidrófoba que contribuye significativamente a la formación del homodímero debido a la interacción hidrófoba, y esto incluye los residuos Leu351, Thr366, Leu368 y Tyr407. Además, existen residuos de Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399, Lys409 y Lys439 que contribuyen a la formación del dímero entre los dominios CH3 a través de una interacción electrostática en la interfaz. En particular, se producen interacciones electrostáticas entre residuos Lys409 del dominio CH3 de una cadena pesada y residuos Asp399 del dominio CH3 de la cadena pesada opuesta y diferentes interacciones electrostáticas entre residuos Glu357 del dominio CH3 de una cadena pesada y residuos Lys370 del dominio CH3 de la cadena pesada opuesta diferente en el interior de los dominios CH3, lo que contribuye a una mayor formación del homodímero a través de interacciones electrostáticas.

Además, hay residuos Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, 400S que están presentes en la interfaz pero que no tienen interacción para contribuir significativamente a la formación del dímero entre los dominios CH3 tal como una interacción hidrófoba o una interacción electrostática con residuos de aminoácidos adyacentes (ver la Figura 2). Algunos de estos residuos contribuyen a una interacción entre dominios con una interacción no covalente relativamente débil.

En este caso, la expresión “ interacción no covalente” se refiere a una interacción que tiene una fuerza de unión débil cuando los átomos o moléculas forman un agregado debido a una interacción diferente a una interacción covalente, e incluye interacciones de una interacción electrostática, una interacción hidrofóbica, enlaces de hidrógeno y una interacción de Van der Waals.

La expresión “ interacción electrostática” se refiere a una interacción que depende de la atracción eléctrica entre iones con carga opuesta. La expresión “ interacción hidrófoba” se refiere a una interacción en la que se excluye una interacción con un disolvente polar y que está causada por una tendencia termodinámicamente estabilizante de moléculas hidrófobas. La expresión “enlace de hidrógeno” se refiere a una interacción entre un dipolo y un dipolo que se genera entre moléculas de interacción covalente polar generadas cuando se encuentran hidrógeno, flúor, oxígeno y nitrógeno. Además, la expresión “ interacción de Van der Waals” se refiere a una interacción en la que las moléculas tienen polaridad debido a una fuerza de Van der Waals y una fuerza de atracción y una fuerza repulsiva actúan entre ellas.

Además, el término “homodímero” se refiere a un dímero de un dominio de anticuerpo que tiene la misma secuencia de aminoácidos o que comprende una parte o un anticuerpo completo que lo comprende, y específicamente, se refiere a un dímero entre dominios CH3 de una región constante de cadena de un anticuerpo o un dímero de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo que comprende el mismo dominio CH3.

Además, la expresión “Fc homodimérico” se refiere a un dímero entre regiones constantes de cadena pesada (bisagra-CH2-CH3) que tiene la misma secuencia de aminoácidos.

En la presente invención, se modifican los residuos de aminoácidos que contribuyen a la interacción entre los dominios CH3 y se induce la formación de un par (CH3A:CH3B) en el que un dominio CH3 (CH3A) de una cadena pesada y un dominio CH3 (CH3B) de la otra cadena pesada pueden interactuar selectivamente a través de la interacción no covalente. Los presentes inventores se han esforzado por aumentar el rendimiento de formación de un Fc heterodimérico en un par de regiones constantes de cadena pesada en el que un par de mutaciones CH3 se fusiona con el extremo C-terminal de la bisagra-CH2, es decir, entre la bisagra-CH2-CH3A y la bisagra-CH2-CH3B.

En este caso, el término “heterodímero” se refiere a un dímero que comprende dos tipos de dominios de anticuerpos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos, o que comprende una parte o un anticuerpo completo que lo comprende, y específicamente, un dímero que incluye un par de dominios CH3 que tiene diferentes secuencias de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo o que comprende una parte o un anticuerpo completo que comprende un par de dominios CH3 que tiene diferentes secuencias.

Además, la expresión “Fc heterodimérico” se refiere a un dímero entre regiones constantes de cadena pesada (bisagra-CH2-CH3) que comprenden CH3A y CH3B, respectivamente, que tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

Además, la expresión “rendimiento de formación del Fc heterodimérico” se refiere a una relación (porcentaje) de una región constante de cadena pesada formada como un heterodímero a un dímero de región constante de cadena pesada total (homodímero y heterodímero) o una suma de monómeros cuando un par de región constante de cadena pesada que comprende un par de mutaciones del dominio CH3 se transformó simultáneamente en células animales HEK293F, se expresó y se purificó.

La presente invención proporciona un heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpos IgG humanos como se define en las reivindicaciones.

Además, el heterodímero que comprende los dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de la invención preferiblemente se puede incluir en una región Fc de una inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, pero la presente invención no se limita a ello. En estas realizaciones, se prefiere la IgG humana, pero la presente invención no se limita a ella. En estas realizaciones, la IgG humana puede seleccionarse preferiblemente del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, pero la presente invención no se limita a ellas. En los experimentos que conducen a la presente invención, se diseñó un par de variantes de dominio CH3.

Específicamente, entre los residuos de aminoácidos que se colocan dentro de la interfaz entre los dominios CH3 y no se exponen al exterior, se mantuvo un núcleo hidrófobo que tiene una alta contribución a la formación del dímero entre los dominios CH3, y se indujo una mutación en los residuos Asp356, Glu357, Lys370, Lys392, Asp399 y Lys409 que están presentes dentro de la interfaz y contribuyen a la formación de un homodímero entre los dominios CH3 debido a una interacción electrostática. Se preparó un par de mutaciones que tiene una mutación de espacio complementariointeracción hidrófoba de modo que un residuo hidrófobo de una interfaz de una cadena pesada podría insertarse entre los residuos hidrófobos de una interfaz de una cadena pesada opuesta diferente. Cuando se usa este enfoque, se puede esperar una mayor capacidad de conformación del heterodímero eliminando una interacción que contribuye a la formación del homodímero entre los dominios CH3 existentes y sustituyendo la interacción con una interacción que puede inducir la formación de una atracción hidrófoba solo en el heterodímero. Además, en este enfoque, se conserva la cantidad máxima de residuos de aminoácidos de un núcleo hidrófobo de una interfaz de dominio CH3 de tipo salvaje y se puede aumentar la estabilidad del heterodímero que se generará a través del mismo. Este enfoque es una estrategia diferente de la técnica del botón en ojal (Ridgway, Presta et al. 1996) en la que se forma una interacción hidrófoba selectiva en una parte del núcleo hidrófobo existente para preparar un anticuerpo heterodimérico.

Además, en los residuos Gln347, Tyr349, Thr350, Ser354, Lys360, Ser364, Asn390, Thr394, Pro395, Val397, Ser400 que están presentes en la interfaz entre los dominios CH3 pero que no contribuyen significativamente a una mayor formación del dímero entre dominios CH3 por una interacción hidrófoba o una interacción electrostática con residuos de aminoácidos adyacentes, se indujo un par de mutaciones de interacción electrostática selectiva en el que una carga de un residuo de aminoácido de una cadena pesada y una carga de un residuo de una cadena pesada opuesta, diferente son opuestas. Como resultado, se excluyó la interacción entre dominios CH3 homogéneos y se indujo una interacción electrostática selectiva de largo alcance capaz de aumentar la formación del heterodímero. En este enfoque, se introduce una interacción electrostática de modo que los residuos de aminoácidos pueden interactuar con los residuos del dominio CH3 opuesto a una distancia relativamente larga. En consecuencia, se genera una nueva interacción, y esta interacción contribuye a la formación selectiva del heterodímero.

Además, en el enfoque anterior, un par de variantes del dominio CH3 heterodímero en el que se conserva una parte del núcleo hidrófobo colocada dentro de la interfaz entre los dominios CH3 puede mantener una estabilidad termodinámica, inmunogenicidad y productividad de expresión en células animales, que son similares a los de tipo salvaje.

Además, Thr250, Met252, Ile253, Ser254, Thr256, Thr307, His310, Glu380, Met428, His433, Asn434, His435 y Tyr436, que son sitios a los que se une el FcRn (receptor de Fc neonatal) existente, y Leu234, Leu235, Gly236 y Gly237, que son sitios a los que se une FcgR (receptores fc gamma), se conservan. Por lo tanto, es posible proporcionar una vida media sérica prolongada de acuerdo con la unión entre una cadena pesada de anticuerpo y FcRn o FcgR, y mantener las actividades intrínsecas de un anticuerpo, como una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y una citotoxicidad celular dependiente del complemento (Wines, Powell et al. 2000; Roopenian y Akilesh 2007).

En otro trabajo que condujo a la presente invención, se construyó un sistema para evaluar la formabilidad del heterodímero de la variante del dominio CH3 diseñada. Específicamente, el sistema expresa y purifica un anticuerpo en el que una región constante de cadena pesada de un anticuerpo que comprende cada par de mutaciones del dominio CH3 se fusiona en células animales. En este caso, en el par de mutaciones, se fusionó un anticuerpo de fragmento variable monocatenario (scFv) y se expresó en una sola región constante de cadena pesada en la que se incluye el dominio CH3A, y una región constante de cadena pesada en la que se incluye el dominio CH3B. se expresó solo sin fusión de fragmentos de anticuerpo. Como resultado, la cadena pesada en la que se incluye el dominio CH3A tiene un peso molecular mayor que la cadena pesada en la que se incluye el dominio CH3B. Por lo tanto, el heterodímero (scFv-Fc:Fc) y el homodímero (scFv-Fc:scFv-Fc, Fc:Fc) tienen diferentes velocidades de movimiento en SDS-PAGE en condiciones no reductoras de modo que una cantidad del heterodímero entre los anticuerpos expresados y purificados pueden compararse relativamente (ver la FIG. 15).

En otro trabajo que condujo a la presente invención, cuando se usa el sistema construido para evaluar la formabilidad del heterodímero, se confirmó que el anticuerpo que comprende el par de variantes del dominio CH3 de acuerdo con la presente invención tiene un rendimiento de formación de aproximadamente el 90 al 95%, que es significativamente más alto que el rendimiento de formación del heterodímero usando la técnica convencional de botón en ojal (ver las FIG. 16 y 17).

El anticuerpo biespecífico de la invención preferiblemente tiene una forma seleccionada del grupo que consiste en scFv-Fc, scIgG (scFab-Fc), (Fv)²-Fc, mAb-Fv y Fv-Fc, pero no se limita a ellos. La proteína de fusión está preferiblemente en forma de proteína-Fc, pero no se limita a ella.

La proteína de par de Fc heterodiméricos de la invención puede tener una forma de un anticuerpo biespecífico, y que puede unirse simultáneamente a dos antígenos diferentes, en los que los anticuerpos que tienen diferente especificidad de antígeno se fusionan en forma de una región variable de cadena pesada (VH), una región variable de cadena ligera (VL), un anticuerpo de fragmento variable de cadena simple (scFv) o un fragmento Fab de anticuerpo de cadena simple (scFab), varias formas de un anticuerpo único fusionado de región variable biespecífica (mAb-Fv) en el que un dominio de unión a antígeno variable simple (VH o VL) se fusiona con el extremo C-terminal de una cadena pesada típica de IgG, un anticuerpo (Fv-Fc) en el que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), que se unen a un solo antígeno, se fusionan para unirse monovalentemente al único antígeno, o una forma de proteína fusionada con región constante de anticuerpo (proteína-Fc) en la que los dominios extracelulares del receptor de la membrana celular capaces de unirse a una proteína específica, un péptido, un anticuerpo de dominio único, un ligando, una toxina y similares se fusionan para reconocer específicamente uno o dos tipos de proteínas.

Específicamente, en un ejemplo de la presente invención, el par de variantes del dominio CH3 según la presente invención se utilizó para preparar un anticuerpo biespecífico anti-DR4 x DR5 en forma de scFv y scFab, y se confirmó que el biespecífico el anticuerpo tiene especificidad por las moléculas diana DR4 y DR5 (ver las FIG. 22 y 23). Como resultado, puede entenderse que el anticuerpo biespecífico preparado usando el par de variantes del dominio CH3 de la presente invención mantiene una capacidad de unión a un sitio de unión de antígeno sin cambios.

En este caso, la expresión “anticuerpo de fragmento monocatenario variable (scFv)” es un polipéptido VH-L-VL a VL-L-VH en el que una VH y una v L están conectadas usando un enlazador peptídico (L) adecuado de 12 o más residuos y se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene actividad de unión a antígeno.

Además, la expresión “fragmento de anticuerpo Fab monocatenario (scFab)” es un polipéptido VL-CL-L-VH-CH1 a VH-CH1-L-VL-CL en el que un fragmento de cadena pesada se expresa de una VH a CH1 y una cadena ligera que comprende una VL y una parte CL están conectadas usando un enlazador peptídico (L) adecuado de 34 o más residuos, y se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno.

Además, la expresión “fragmento variable (Fv)” se refiere a un fragmento de anticuerpo mínimo que comprende un sitio de unión al antígeno completo. El término “Fv-Fc” utilizado en el presente documento se refiere a un anticuerpo en el que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), que se unen a un solo antígeno, se fusionan con el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína de par de Fc heterodiméricos y que puede unirse monovalentemente al antígeno único.

Además, el término “mAb-Fv” utilizado en el presente documento se refiere a un anticuerpo en el que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) se fusionan con el extremo C-terminal de una cadena pesada de IgG típica y que puede unirse trivalentemente a un antígeno, o un anticuerpo biespecífico que puede unirse bivalentemente a un antígeno mAb y unirse monovalentemente a un antígeno Fv.

Además, la expresión “proteína fusionada con región constante de anticuerpo (Proteína-Fc)” usada en el presente documento se refiere a una proteína de fusión en la que los dominios extracelulares del receptor de la membrana celular capaces de unirse a una proteína específica, un péptido, un anticuerpo de dominio único, un ligando, una toxina y similares se fusionan con el extremo N-terminal o el extremo C-terminal de la proteína de par de Fc heterodiméricos de acuerdo con la presente invención y que pueden reconocer específicamente uno o dos tipos de proteínas.

Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de la invención o una proteína de fusión que comprende la proteína de par de Fc heterodiméricos de la invención. Dado que el anticuerpo biespecífico o la proteína de fusión preparada de acuerdo con la presente invención puede dirigirse específicamente a un antígeno o una proteína relacionada con tumores o enfermedades inmunológicas, el anticuerpo biespecífico o la proteína de fusión pueden usarse de manera útil para una composición farmacéutica que puede tratar o prevenir las enfermedades.

En este caso, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico o la proteína de fusión preparada de acuerdo con la presente invención puede dirigirse simultáneamente a dos tipos de antígenos relacionados con tumores o enfermedades inmunológicas que se desarrollan a partir de acciones redundantes, indirectas y graduales de varias proteínas, en lugar de patogénesis inducida por una proteína. Por lo tanto, puede aumentar un efecto terapéutico de la enfermedad en comparación con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal dirigido a un solo tipo de proteína diana.

Específicamente, en un ejemplo de la presente invención, con el fin de investigar una actividad destructora de células cancerosas de anticuerpos biespecíficos anti-DR4 x DR5 scFv-Fc y scFab-Fc preparados de acuerdo con la presente invención, se realizó un experimento de citotoxicidad (ensayo MTT) en líneas celulares de una célula cancerosa de origen humano HCT116 (carcinoma colorrectal) y HeLa (adenocarcinoma). Se puede entender que las dos formas de anticuerpos biespecíficos tienen una mayor actividad de destrucción de células cancerosas que los anticuerpos originales, un anticuerpo humanizado hAY4a IgG y un anticuerpo humano AU5H-scFv, y tienen una citotoxicidad similar o ligeramente mejor que TRAIL utilizado como grupo de control positivo (ver FIG. 24).

El término “tratamiento” utilizado en el presente documento se refiere a la mejora de los síntomas de la enfermedad o de todas las actividades que se modifican en forma beneficiosa mediante la administración de la composición de la presente invención.

Cuando se formula la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, un diluyente o un agente diluyente tal como un relleno, un agente de extensión, un agente aglutinante, un agente humectante, un agente disgregante y un tensioactivo, que se usan comúnmente, se utiliza para la preparación.

Una preparación sólida para administración oral incluye comprimidos, píldoras, polvos, gránulos, cápsulas, trociscos y similares. Tales preparaciones sólidas se preparan cuando al menos un agente diluyente, por ejemplo, almidón, carbonato cálcico, sacarosa, lactosa o gelatina, se mezcla con uno o más compuestos según la presente invención. Además del agente diluyente simple, también se utilizan lubricantes como el estearato de magnesio y el talco. Una preparación líquida para administración oral incluye un agente de suspensión, una solución oral, una emulsión, un jarabe y similares. Además del agua y la parafina líquida que se usan comúnmente como diluyentes simples, se pueden incluir varios agentes diluyentes, por ejemplo, un agente humectante, un edulcorante, una fragancia y un conservante.

Una preparación para administración parenteral incluye una solución acuosa esterilizada, un disolvente no acuoso, un disolvente de suspensión, una emulsión, una preparación liofilizada, un supositorio y similares.

Como disolvente no acuoso y disolvente de suspensión, se pueden utilizar aceites vegetales tales como propilenglicol, polietilenglicol y aceite de oliva, un éster inyectable tal como oleato de etilo y similares. El supositorio puede usar bases como Witepsol, macrogol, Tween 61, manteca de cacao, manteca de laurina, glicerol y gelatina.

La composición de la presente invención puede administrarse por vía oral o parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa, subcutánea o local) de acuerdo con un método deseado. La dosis se cambia según el estado del paciente, el peso corporal y el grado de enfermedad, la forma del fármaco, las vías de administración y el tiempo, y los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente la dosis.

La composición de la presente invención se administra en una cantidad farmacéuticamente eficaz. En la presente invención, la expresión “cantidad farmacéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad que es suficiente para tratar una enfermedad con una relación beneficio/riesgo razonable aplicable para el tratamiento médico. Un nivel de la dosis eficaz puede determinarse mediante factores que incluyen el tipo de enfermedad del paciente y la gravedad de la enfermedad, la actividad del fármaco, la sensibilidad al fármaco, un tiempo de administración, las vías de administración, una relación de descarga, un período de tratamiento y un fármaco utilizado simultáneamente y otros factores bien conocidos en el campo de la medicina. La composición de la presente invención puede administrarse como un agente terapéutico individual o en combinación con otros agentes terapéuticos. La composición de la presente invención puede administrarse secuencial o simultáneamente con un agente terapéutico en la técnica relacionada, o administrarse una o varias veces. Es importante administrar una cantidad en la que se pueda obtener un efecto máximo con una cantidad mínima que no cause efectos secundarios en consideración a todos los factores anteriores, que pueden ser fácilmente determinados por los expertos en la técnica.

Específicamente, la cantidad eficaz del compuesto según la presente invención puede cambiarse de acuerdo con la edad, el sexo y el peso corporal del paciente, y generalmente administrarse de 0,01 g a 100 mg por kg de peso corporal, y preferiblemente de 0,01 g a 10 mg por día o en días alternos, o se puede dividir en una a tres veces al día. Sin embargo, dado que la cantidad puede aumentarse o disminuirse según las vías de administración, la gravedad de la obesidad, el sexo, el peso corporal, la edad y similares, la presente invención no se limita a la dosis.

Ejemplos

A continuación, se describirán ejemplos preferidos de la invención para promover la comprensión de la invención. Sin embargo, los siguientes ejemplos deben considerarse solo en un sentido descriptivo y el alcance de la invención no se limita a los siguientes ejemplos.

<Ejemplo 1> Diseño de la variante del dominio CH3 para aumentar la formabilidad del heterodímero de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo

Para inducir una mutación del dominio CH3 para formar un heterodímero de una región constante de cadena pesada (Fc) de un anticuerpo humano IgG1, como se describió con anterioridad, se analizaron primero los residuos de un par de aminoácidos (interacción no covalente) que principalmente actúa en una interacción entre dominios CH3. En base al resultado del análisis, se diseñó un par de mutaciones en el que se excluye la formación del homodímero entre los dominios CH3 y se prefiere termodinámicamente la formación del heterodímero. Es decir, para aumentar una interacción selectiva entre el dominio CH3 (CH3A) de una cadena pesada y el dominio CH3 (CH3B) de la otra cadena pesada mediante la modificación de los residuos de aminoácidos que contribuyen a una interacción entre los dominios CH3, se indujeron sustituciones de interacción no covalente que formaba residuos de aminoácidos en CH3A y CH3B y, de ese modo, se indujo la formación de Fc CH3A:CH3B heterodimérico. En este caso, se diseñó un par de mutaciones inducidas en CH3A:CH3B heterogéneo de manera que CH3A:CH3B se forma con un alto rendimiento y se mantiene estable mediante el empleo de una estrategia diferente a la utilizada para un par de mutaciones para aumentar la formación del heterodímero de región constante de cadena pesada descrito en el documento o patente relacionados. Además, con el fin de minimizar la inmunogenicidad potencial, la mutación de los residuos de aminoácidos se restringió a los residuos en la interfaz entre los dominios CH3. Se excluyó una mutación en el residuo del sitio de unión de FcRn y FcRs para mantener una función intrínseca de una región constante de cadena pesada de un anticuerpo (Roopenian y Akilesh 2007). Además, al evaluar un rendimiento de formación del Fc heterodimérico formado por CH3A:CH3B que tiene un par de mutaciones mínimo y CH3A:CH3B que tiene una combinación de los mismos, se intentó el desarrollo de un par de mutaciones CH3A:CH3B que tiene el mayor rendimiento de formación del Fc heterodimérico.

Para este propósito, entre los residuos de aminoácidos posicionados en la interfaz entre los dominios CH3, se diseñaron y construyeron los pares de mutaciones 1) y 2); 1) el par de mutaciones en el que los residuos que contribuyen a la formación de un homodímero del dominio CH3 debido a una interacción electrostática dentro de la interfaz del dominio CH3 se sustituyen por un par de mutaciones de residuos de aminoácidos capaz de generar una interacción espacial complementaria-hidrófoba y, por lo tanto, se excluye la formación del homodímero y se prefiere la formación del heterodímero, y 2) el par de mutaciones CH3 en el que los residuos de aminoácidos que no contribuyen significativamente a la formación del dímero entre los dominios CH3 se sustituyen con un par de mutaciones de residuos de aminoácidos en el que una interacción electrostática de largo alcance se forma selectivamente y, por tanto, se excluye la formación del homodímero y se prefiere termodinámicamente la formación del heterodímero.

Es decir, para inducir un par de mutaciones de interacción selectiva complementaria-hidrófoba espacial dentro de la interfaz del dominio CH3, se analizaron las posiciones e interacciones de los residuos de aminoácidos hidrófilos e hidrófobos colocados dentro de la interfaz entre los dominios CH3, y se introdujo en CH3A:CH3B un par de mutaciones en cuya formación de una interacción hidrófoba espacialmente selectiva para formar el heterodímero se prefiere entre estos.

Además, para inducir un nuevo par de mutaciones de interacción electrostática de largo alcance en la interfaz del dominio CH3, excepto los residuos en una región de unión hidrófoba dentro de la interfaz y los residuos que ya han participado en la interacción electrostática, se analizaron posiciones e interacciones de los residuos que están en la interfaz del dominio CH3 pero no tienen interacción con residuos adyacentes, residuos que interactúan debido a un enlace de hidrógeno relativamente débil o una interacción de Van Der Waals, y residuos que tienen una larga distancia entre cadenas laterales de un residuo relativamente adyacente y son inapropiados para la interacción. Se introdujo en CH3A:CH3B un par de mutaciones en el que se prefiere la formación de una interacción electrostática selectiva de largo alcance para formar el heterodímero entre estos, y así se indujo la formación del heterodímero.

Aparte de los residuos de aminoácidos del núcleo de interacción hidrófoba dentro de la interfaz del dominio CH3, un par de mutaciones de aminoácidos capaz de generar una interacción hidrófoba selectiva en lugar de la interacción electrostática y un par de mutaciones de aminoácidos en el que se introduce una nueva interacción electrostática en la interfaz se analizó y construyó de la siguiente manera.

[CH3A (Lys409Trp) : CH3B (Asp399Val, Phe405Thr)]

Lys409 en CH3A se coloca dentro de la interfaz del dominio CH3 y es adyacente a Leu368, Asp399, Phe405 y Tyr407 en CH3B. Entre estos, una interacción electrostática entre Lys409 y Asp399 de la otra cadena contribuye a una interacción entre los dominios CH3. Asp399 en CH3B es adyacente a Lys392 y Lys409 en CH3A, y una interacción electrostática entre ellos contribuye a la interacción entre los dominios CH3. Cuando la interacción electrostática adyacente a un núcleo de interacción hidrofóbica entre dominios CH3 se sustituye para formar una interacción hidrofóbica selectiva, se elimina la interacción electrostática existente que ha contribuido a la formación del homodímero entre dominios CH3, se induce selectivamente la formación del heterodímero entre dominios CH3 debido a una interacción hidrófoba complementaria al espacio y, por lo tanto, se puede esperar un aumento en la formabilidad del heterodímero. Para ello, se indujo un par de mutaciones en Lys409Trp en CH3A y Asp399Val en CH3B (FIG. 4).

Además, Phe405 en CH3B es adyacente a Lys392, Thr394 y Lys409 en CH3A, y la formación del heterodímero puede inhibirse debido a una colisión espacial entre una cadena lateral de Lys409Trp de CH3A en la que se induce una mutación y una gran cadena lateral hidrófoba de Phe405 en CH3B. Por lo tanto, se indujo una mutación de Phe405Thr para mantener una interacción hidrófoba mientras se disponía espacialmente con una cadena lateral.

Cuando Lys409 en el dominio CH3A se sustituye con triptófano (W), se inhibe la generación del homodímero entre el dominio CH3A. Esto se debe a que no es posible mantener la interacción electrostática existente de Lys409:Asp399 y un diseño de espacio en la interfaz del dominio CH3 es difícil debido a las cadenas laterales de Phe405 y Tyr407 de otras cadenas adyacentes.

Cuando Asp399 en el dominio CH3B se sustituye con valina (V), se elimina la interacción electrostática existente de los pares Asp399:Lys392 y Asp399:Lys409 y, por lo tanto, la generación del homodímero puede inhibirse relativamente.

Además, cuando Phe405 en el dominio CH3B se sustituye con treonina (T), no hay efecto de inhibición relativa de la generación del homodímero, pero la sustitución puede contribuir a una interacción hidrófoba con Lys409Trp en el dominio CH3A cuando se forma el heterodímero.

Por lo tanto, una combinación de sustitución de Lys409Trp en el dominio CH3A y sustitución de Asp399Val en el CH3B, y una combinación de sustitución de Lys409Trp en el dominio CH3A y sustitución de Phe405Thr en el dominio CH3B mantienen la distancia más apropiada entre una interfaz de interacción entre dominios CH3 y mantienen una interacción hidrofóbica complementaria. Por lo tanto, se prefiere la generación del heterodímero de CH3A:CH3B.

[CH3A (Lys360Glu) : CH3B (Gln347Arg)]

Lys360 en CH3A se coloca fuera de la interfaz del dominio CH3 y es adyacente a las cadenas laterales de Gln347 y Tyr349 en CH3B. Lys360 contribuye a la interacción entre dominios CH3 con enlaces de hidrógeno muy débiles debido a una larga distancia. Por lo tanto, cuando los residuos de Lys360 en CH3A y Gln347 en CH3B se cambian a residuos de aminoácidos cargados en forma opuesta que tienen una cadena lateral grande, se prefiere la formación del heterodímero debido a la interacción electrostática de largo alcance. Por lo tanto, cuando Lys360 en CH3A se sustituye con Glu, y Gln347 en CH3B se sustituye con arginina (R), se prefiere la formación de CH3A:CH3B debido a una interacción entre Glu360 en CH3A y Arg347 en CH3B. Sin embargo, en CH3B, la formación del homodímero se inhibe debido a la repulsión electrostática del par Lys360:Gln347Arg (FIG. 5).

[CH3A (Gln347Glu) : CH3B (Lys360)]

De manera similar a la interacción débil entre las cadenas laterales de Lys360 en el dominio CH3A y Gln347 en el dominio CH3B, el enlace de hidrógeno débil de largo alcance entre una cadena lateral Gln347 en el dominio CH3A y una cadena lateral Lys360 en el dominio CH3B contribuye a la interacción entre los dominios CH3. Por lo tanto, cuando los residuos se cambian a residuos de aminoácidos con carga opuesta, se introduce una interacción electrostática de alcance relativamente largo para ayudar a la formación del heterodímero. En este caso, para usar junto con el par de mutaciones de Lys360Glu en el dominio CH3A y Gln347Arg en el dominio CH3B, Gln347 en el dominio CH3A se sustituyó por Glu para interactuar con Lys360 en el dominio CH3B (FIG. 6).

Por lo tanto, en el par de mutaciones de Lys360Glu en el dominio CH3A y Gln347Arg en el dominio CH3B y el par de mutaciones de Gln347Glu en el dominio CH3A y Lys360 en el dominio CH3B, se prefiere la formación del heterodímero debido a cada interacción electrostática, la formación del homodímero se inhibe entre los dominios CH3A debido a una fuerza repulsiva electrostática entre Gln347Glu y Lys360Glu, y la formación del homodímero se inhibe entre los dominios CH3B debido a una fuerza repulsiva electrostática entre Gln347Arg y Lys360.

[CH3A (Tyr349Ser) : CH3B (Glu357Trp)]

Tyr349 en CH3A se coloca fuera de la interfaz del dominio CH3 y es adyacente a las cadenas laterales de Ser354, Asp356, Glu357 y Lys360 en CH3B. Glu357 en CH3B se coloca fuera de la interfaz del dominio CH3, está adyacente a las cadenas laterales de Tyr459 y Lys370 en CH3A y participa en la interacción entre los dominios CH3 de acuerdo con una interacción electrostática de largo alcance con Lys370.

Por lo tanto, cuando Tyr349 en CH3A se sustituye con serina (S) y Glu357 en CH3B se sustituye con triptófano (W), se elimina la interacción electrostática existente entre Glu357 en c H3B y Lys370 en CH3A y se prefiere la formación de CH3A:CH3B debido a una interacción complementaria que depende de los tamaños de las cadenas laterales entre Tyr349Ser y Glu357Trp en CH3A (FIG. 7).

Además, Glu357Trp en CH3B elimina la interacción electrostática con Lys370 en CH3A y es adyacente a Tyr349 en CH3B. Por lo tanto, se dificulta un diseño espacial en la interfaz del dominio y, por lo tanto, se puede inhibir la formación del homodímero entre los dominios CH3B.

[CH3A (Ser354Cys) : CH3B (Tyr349Cys)/CH3A (Tyr349Cys) : CH3B (Ser354Cys)]

Ser354 en el dominio CH3A es adyacente a Tyr349 en el dominio CH3B, y cuando los dos residuos se sustituyen con cisteína (C), se forma un puente disulfuro entre los dominios. Cuando se introduce el puente disulfuro, el heterodímero formado puede estabilizarse. Dado que el puente disulfuro introducido se coloca asimétricamente a la interfaz del dominio CH3, ayuda a aumentar el rendimiento de producción de heterodímeros. La sustitución del residuo Tyr349 en el dominio CH3A y el residuo Ser354 en el dominio CH3B por cisteína (C) puede funcionar de manera similar al anterior.

<Ejemplo 2> Método de construcción de la mutación del dominio CH3 para aumentar la formabilidad del heterodímero de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo

El par de mutaciones del dominio CH3 diseñado en el Ejemplo 1 se construyó como CH3A:CH3B compuesto solo o en una combinación de los mismos, y se construyeron 5 tipos de pares de heterodímeros CH3A:CH3B. Para estabilizar el par de heterodímeros construido y aumentar el rendimiento de producción de heterodímeros, se construyeron dos tipos de mutaciones en las que se introduce el puente disulfuro (FIG. 11 y Tabla 1).

En las mutaciones de CH3A y CH3B, se sintetizó ADN (Bioneer, Corea) para inducir la mutación diseñada basándose en las secuencias de bases del dominio CH3 de la región constante de cadena pesada de IgG1. Las secuencias de bases se comprobaron mediante secuenciación (Macrogen, Corea), y los pares de mutaciones CH3A:CH3B construidos se muestran en la siguiente [Tabla 1].

[Tabla 1]

<Ejemplo 3> Construcción de un sistema para evaluar la formabilidad del heterodímero de la variante del dominio CH3 preparado de acuerdo con la presente invención

Para evaluar el rendimiento de formación del heterodímero de la mutación del dominio CH3 preparada en el <Ejemplo 2>, se realizó la clonación en un vector de expresión animal de manera que el dominio CH3A construido pudiera expresarse en una forma scFv-Fc y el dominio CH3B podría expresarse en una forma de Fc ficticio (FIG. 13 y 14). Un anticuerpo scFv usado es un anticuerpo en el que se conectan las regiones VH y VL de hAY4a, que es un anticuerpo humanizado de afinidad mejorada hAY4 que se une específicamente a DR4 (Lee, Park et al. 2010).

El scFv-Fc de hAY4a y el Fc ficticio se clonaron en pcDNA3.1(+) (Invitrogen, EE. UU.), que es un vector de expresión de células animales que tiene un promotor de CMV, para tener una secuencia señal-hAY4a-scFv-bisagra-CH2-CH3 o una secuencia de señal-bisagra-CH2-CH3 usando un marco Sacl/Xbal.

Como se describió con anterioridad, cuando el dominio CH3A se expresa en la forma scFv-Fc y el dominio CH3B se expresa en la forma de Fc ficticio, se puede entender que pueden verificarse los rendimientos de formación del homodímero y el heterodímero en el anticuerpo purificado por SDS-PAGE. Utiliza un principio que, dado que la forma scFv-Fc tiene un peso molecular mayor que la forma de Fc ficticio, el homodímero scFv-Fc, el heterodímero scFv-Fc/ficticio-Fc y el homodímero ficticio-Fc tienen pesos moleculares diferentes, y eso se puede distinguir dependiendo de una diferencia de una distancia de movimiento de banda en SDS-PAGE (FIG. 15). La siguiente [Tabla 2] muestra los pares de variantes de dominio CH3 de scFv-Fc/Fc ficticio construidos. Se muestran las formas de expresión scFv-Fc y Fc ficticio para evaluar la formabilidad del heterodímero de la región constante de la cadena pesada que comprende el par de mutaciones del dominio CH3 construido. KiH se utilizó como grupo de control.

T l 2

<Ejemplo 4> Expresión y purificación del anticuerpo que comprende la variante del dominio CH3

Usando un sistema HEK293-F (Invitrogen), se transfectaron transitoriamente una cadena pesada que comprendía cada variante de CH3A del plásmido construida en el <Ejemplo 3> y una cadena pesada que comprendía la variante de CH3B para generar un anticuerpo biespecífico. En un matraz de agitación o un fermentador agitado, se transfectaron células HEK293-F (Invitrogen) que se suspendieron y se cultivaron en un medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen) sin suero con una mezcla de dos plásmidos de expresión y polietilenimina (PEI, Polyscience). Se sembraron células HEK293-F en matraces de agitación de 1 L (Corning) a una densidad de 1,0E*6 células/mL en 200 mL y se cultivaron a 120 rpm, CO²al 8%. Un día después, a una densidad celular de aproximadamente 2.0E*6 células/mL en la misma proporción molar, las células se transfectaron con aproximadamente 21 mL de una mezcla de 10 mL de medio de expresión FreeSytle 293 (Invitrogen) y 10 mL de medio de expresión FreeSytle 293 800 PEI (4/mL), que contienen un total de 400 (2/mL) de ADN de plásmido que codifica una cadena pesada que comprende la variante CH3A y una cadena pesada que comprende la variante CH3B. Se recogió un sobrenadante cinco días después.

Con referencia a un protocolo estándar, se purificó una proteína del sobrenadante del cultivo celular recogido. Los anticuerpos se aplicaron a una columna de proteína A Sepharose (GE healthcare) y se lavaron con PBS (pH 7,4). Los anticuerpos se eluyeron a pH 3,0 usando una solución tampón de glicina 0,1 M, y luego la muestra se neutralizó inmediatamente usando una solución tampón Tris 1 M. Las fracciones de anticuerpo eluidas se concentraron usando un concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (10 MWCO) después de que la solución tampón se cambiara a PBS (pH 7,4) usando una columna de desalación Pierce Dextran (5K MWCO). Los anticuerpos variantes Fc purificados se cuantificaron mediante una técnica BCA.

<Ejemplo 5> Evaluación de la formabilidad del heterodímero del anticuerpo que comprende la variante del dominio CH3, comparación del rendimiento y análisis de la estructura secundaria de la proteína y la capacidad de unión a FcRn.

Se analizaron 10 g del anticuerpo en el que se introdujo el par de mutaciones CH3 purificado en el <Ejemplo 4> mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras al 12% (FIG. 16). El homodímero de la variante CH3A se observó a 103 kD, el homodímero de la variante CH3B se observó a 53 kD, el monómero de la variante CH3B se observó a 25 kD y el heterodímero de la variante CH3A y la variante CH3B se observó a 78 kD.

Se confirmó que, cuando los ADN plasmídicos que comprenden la cadena pesada que comprende la variante CH3A y la cadena pesada que comprende la variante CH3B se transfectaban transitoriamente a la misma concentración molar, y se expresaban y purificaban, la formabilidad del heterodímero del mutante aumentó en comparación el grupo de control (el heterodímero en el que se introduce el dominio CH3 de tipo salvaje). Se confirmó que las variantes EW-RVT y EEW-RVT en las que se ensamblaron dos pares tenían una formabilidad de heterodímeros que aumentó aún más hasta aproximadamente un 91% en comparación con la variante E-R y la variante W-VT. Las dos variantes mostraron una formabilidad de heterodímeros más aumentada que la del grupo de control, aproximadamente el 86% del botón en ojal (Tabla 3). Además, se observó una pequeña cantidad de un monómero Fc en todas las variantes, incluido un anticuerpo de tipo salvaje. Se considera que esto se debe a una diferencia en el grado de expresión entre las cadenas pesadas.

Además, se confirmó que la variante E-R tiene una formabilidad de heterodímero scFv-Fc/Fc de aproximadamente un 53%, y la variante W-VT tiene una formabilidad de heterodímero scFv-Fc/Fc de aproximadamente un 77%. Una interacción electrostática de largo alcance recién agregada puede contribuir a un aumento en la formabilidad del heterodímero. Sin embargo, se puede entender que una estrategia en la que se elimina la interacción existente aplicada para la formabilidad del homodímero dentro de la interfaz y se agrega una interacción selectiva complementaria-hidrófoba espacial contribuye de manera relativamente grande a un aumento en la formabilidad del heterodímero.

Además, se confirmó que, cuando se llevan a cabo dos estrategias simultáneamente, la formabilidad del heterodímero se promueve más que cuando se lleva a cabo solo la estrategia de introducir una interacción complementaria espacial-hidrófoba adicional en la interfaz del dominio CH3 o la estrategia de introducir adicionalmente un nuevo par de mutación de interacción electrostática de largo alcance en la interfaz.

Además, la proteína dímera Fc de la región constante de la cadena pesada en la que se introduce el par de mutaciones CH3 construido está bien purificada con una resina de proteína A similar a la región constante Fc de la cadena pesada de tipo salvaje. Esto indica el hecho de que la mutación introducida en el par de mutaciones CH3 no influye en la interacción entre la proteína A y la región constante de la cadena pesada.

Además, se observó un tipo salvaje purificado y el anticuerpo heterodimérico que comprende el dominio CH3 de mutación de 0,1 g en una transferencia Western en condiciones reductoras y no reductoras (FIG. 17 y 18). Un gel en el que se realiza SDS-PAGE mediante el método anterior se movió a una película de PVDF, y se marcaron un anti-IgG humano de cabra (Sigma) y un HRP anti-IgG de cabra (SantaCruz), se detectaron por un reactivo PowerOpti-ECL (Animal Genetics Inc), y se analizaron por Image-Quant LAS4000 mini (GE Healthcare). Se observó la formación del heterodímero en una transferencia Western. Se puede entender por el resultado que, similar al resultado observado por SDS-PAGE (FIG. 16), en comparación con la variante E-R, la variante W-VT y el botón en ojal (grupo de control), se inhibió la formación del homodímero de la variante EW-RVT y EEW-RVT en la que se ensamblan dos pares.

Se confirmó en el experimento anterior que, cuando se elimina la interacción existente aplicada para la formabilidad del homodímero dentro de la interfaz y se agrega una interacción selectiva complementaria-hidrófoba espacial, esta estrategia contribuye relativamente más a un aumento en la formabilidad del heterodímero que cuando una interacción electrostática de largo alcance se agrega nuevamente (FIG. 16). Por lo tanto, se construyó una variante de SW-WVT en la que se ensambla un par de unión complementario de espacio adicional (Tyr349Ser:Glu357Trp) a la variante de W-VT y se observó la formabilidad de heterodímeros (FIG. 19). Se confirmó que la variante SW-WVT tiene una formabilidad de homodímero ligeramente menor que la variante EW-RVT, pero tiene una formabilidad de heterodímeros de aproximadamente el 89% debido al monómero Fc observado (Tabla 3). Esto se debe a una diferencia en el grado de expresión entre las cadenas pesadas. Si se regula una relación molar de un plásmido cuando se realiza la transfección, se puede esperar un aumento en la formabilidad del heterodímero.

Además, el puente disulfuro se introdujo en la variante EW-RVT y la variante SW-WVT, y se comparó la formabilidad del heterodímero (FIG. 19). En la variante EW-RVT, una interacción electrostática de largo alcance por el par de mutaciones E-R introducido (Lys360Glu:Gln347Arg) se proporciona asimétricamente a la región exterior de la interfaz del dominio CH3. Por lo tanto, para introducir el puente disulfuro en una región opuesta en la que no hay interacción electrostática, se introdujo una mutación Tyr349Cys en el dominio CH3A y una mutación Ser354Cys en el dominio CH3B. Cuando se introduce el puente disulfuro en la variante SW-WVT, para no influir en la unión complementaria espacial introducida por el par de mutaciones SW (Tyr349Ser:Glu357W), se introdujo una mutación Ser354Cys en el dominio CH3A y una mutación Tyr349Cys en el dominio CH3B. El puente disulfuro se generó en la interfaz del dominio CH3 opuesta a una posición del par de mutaciones S-W.

La variante en la que se introduce el puente disulfuro tiene mayor formabilidad de heterodímeros que la variante en la que no se introduce ningún puente disulfuro, aproximadamente al 3% en EW-RVT y aproximadamente al 9% en SW-WVT (Tabla 3). Se confirmó que la introducción del puente disulfuro contribuye a un aumento de la formabilidad del heterodímero. Se observó mediante SDS-PAGE que la variante en la que se introduce el puente disulfuro tiene un tamaño menor que la variante en la que no se introduce puente disulfuro. Se determina que esto se debe a que el heterodímero tiene una forma relativamente densa debido al puente disulfuro en condiciones de desnaturalización de SDS y, por lo tanto, muestra una diferencia de capacidad de movimiento en PAGE, no debido a una diferencia de tamaño real del heterodímero en un estado natural.

Además, el heterodímero en el que se incluye cada mutación se expresa y purifica repetidamente, y se analizó la densidad de cada banda en SDS-PAGE usando un programa ImageJ (Wayne Rasband, NIH). Como resultado, se puede entender que el rendimiento de formación del heterodímero que comprende la mutación EW-RVT y EEW-RVT es aproximadamente del 90 al 95%, que es más alto que el rendimiento de un heterodímero de botón en ojal (grupo de control), es decir, aproximadamente del 85 al 90% (Tabla 3). En la siguiente [Tabla 3], se compara la formabilidad de heterodímeros de las regiones constantes de la cadena pesada que comprenden el par de mutaciones del dominio CH3 construido, se utilizó KiH como grupo de control y los valores de los resultados se representaron como un error estándar de la media (media S.E.M) después de que el experimento se realizó en forma independiente tres o más veces.

[Tabla 3]

Se observó un rendimiento de expresión de una proteína heterodimérica que comprende la variante del dominio CH3 (Tabla 4). Se realizó una transfección transitoria con células HEK293 y la expresión se realizó en una solución de cultivo (aproximadamente 20 ml) durante 5 días. Se cuantificó la concentración y el volumen de la proteína una vez completado el proceso de purificación para calcular el rendimiento de expresión de la proteína. El experimento se repitió de 3 a 5 veces y los resultados se representaron como un error estándar de la media (media S.E.M).

El resultado mostró que la proteína heterodimérica que comprende la variante del dominio CH3 tiene un rendimiento que es ligeramente menor que el heterodímero que comprende el dominio CH3 de tipo salvaje y es similar o ligeramente mayor que el botón en ojal (grupo de control). Por consiguiente, se puede determinar que el par de mutaciones introducido en el dominio CH3 no inhibe significativamente la estabilidad de la proteína, en comparación con el anticuerpo de tipo salvaje.

Tabla 4

Se midió el dicroísmo circular con el fin de comprobar si una estructura secundaria proteica del dominio CH3 que comprende el par de mutaciones se conserva igual que una estructura secundaria proteica del dominio CH3 de tipo salvaje. Cada uno de los dominios CH3A y CH3B se construyó como un vector Fc ficticio y se produjo un dímero de dominio Fc y se usó para el análisis (FIG. 14). Se utilizó el espectrómetro Chirascan plus (Applied Photophysics, Reino Unido) y la temperatura de análisis fue de 25 °C. Como solución tampón de medición, se utilizó PBS (pH 7,4). El análisis se realizó en un rango de 195 nm a 260 nm.

Como resultado, puede entenderse que el dímero Fc que comprende el dominio CH3 en el que se introduce el par de mutaciones EW-RVT tiene la misma elipticidad media del residuo que el dímero Fc que comprende el dominio CH3 de tipo salvaje. Esto indica que no hay cambio en la estructura secundaria de la proteína incluso cuando se introduce el par de mutaciones (FIG. 20).

Además, para comprobar si el anticuerpo que comprende el dominio CH3 en el que se introduce el par de mutaciones mantiene la capacidad de unión a FcRn en comparación con el anticuerpo que comprende el dominio CH3 de tipo salvaje, se realizó resonancia de plasmón superficial (SPR). Se utilizó Biacore 2000 (GE healthcare, EE. UU.). Se analizó la capacidad de unión a sFcRn (Feng et al., 2011) con respecto al anticuerpo heterodimérico que comprende la variante CH3 del par de mutaciones EW-RVT y el grupo de control, es decir, Remicade (Inflilximab, Janssen Biotech) que es un anticuerpo IgG1 que comprende el dominio CH3 de tipo salvaje. El sFcRn se diluyó en una solución tampón de acetato de sodio 10 mM (pH 4,0) y se fijó a un chip sensor c M5 (GE healthcare, EE. UU.) a aproximadamente 1000 unidades de respuesta (RU). Como solución tampón de funcionamiento, se utilizó un PBS (pH 6,0) en el que se incluyó un 0,005% de Tween 20 y una solución tampón HBS-EP (pH 7,4). La mutación CH3 se analizó a concentraciones de 0,625, 1,25, 2,5 y 5 mM.

Como resultado, se confirmó que el anticuerpo que comprende el dominio CH3 en el que se introduce el par de mutaciones mantiene la capacidad de unión a FcRn, similar al anticuerpo que comprende el dominio CH3 de tipo salvaje (FIG. 21).

<Ejemplo 6> Análisis de expresión y purificación del anticuerpo biespecífico scFv-Fc anti-DR4 x DR5 usando la variante del dominio CH3 en la que se fusiona la forma scFv del anticuerpo anti-DR4 x DR5

Un anticuerpo scFv hAY4a humanizado (Lee, Park et al. 2010) que se une específicamente a un antígeno diana DR4, y un anticuerpo scFv AU5H de afinidad mejorada de un anticuerpo scFv HW1 humano (Park, Lee et al. 2007) que se une específicamente a un antígeno diana DR5 se fusionaron al extremo N-terminal de Fc en el que se usa la variante del dominio CH3 para construir el anticuerpo biespecífico (FIG. 22A).

En este caso, el par de mutaciones usado fue el par EW-RVT, el anticuerpo biespecífico de forma scFv-Fc construido se expresó y purificó usando el método del <Ejemplo 5>, y se analizó una proteína por SDS-PAGE. Se confirmó que, en comparación con el anticuerpo de forma scFv-Fc en el que se introduce el botón en ojal (grupo de control), el anticuerpo biespecífico anti-DR4 x DR5 de la forma scFv-Fc en el que se introduce el par de mutaciones se purificó mientras estaba ensamblado en la forma de un dímero o sin subproductos cortados debido a la inestabilidad de la proteína (FIG. 22B).

Además, para medir el estado de unión del anticuerpo biespecífico, se usó HPLC (The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, EE. UU.) Para realizar cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 10/300GL, GE Healthcare, Suecia). Como solución tampón de elución, se utilizó PBS (pH 7,4, NaCl 137 mM, fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, SIGMA-ALDRICH Co., EE. UU.) y el caudal fue de 0,5 ml/min. Se utilizaron un marcador de tamaño de proteína, IgG (150 kD), albúmina (66 kDa) y una proteína anhidrasa carbónica (29 kDa). Se confirmó que, en comparación con el anticuerpo en forma scFv-Fc en el que se introduce el botón en ojal (grupo de control), se purificó el anticuerpo biespecífico anti-DR4 x DR5 de la forma scFv-Fc en el que se introduce el par de mutaciones M7 mientras se ensambla en forma de un dímero o sin subproductos cortados debido a la inestabilidad de la proteína en la cromatografía de exclusión por tamaño (FIG. 22C).

<Ejemplo 7> Preparación de anticuerpo biespecífico anti-DR4 x DR5 scFab-Fc usando una variante del dominio CH3 en el que se fusiona un anticuerpo anti-DR4 x DR5 de scFab y análisis de la capacidad de unión a un antígeno del anticuerpo biespecífico

Se introdujo el par de mutaciones CH3 preparado para construir un anticuerpo biespecífico en forma de scFab-Fc (scIgG). Los anticuerpos originales usados fueron el anticuerpo hAY4a humanizado y el anticuerpo AU5H, que son los mismos que los del anticuerpo biespecífico en forma scFv-Fc en el <Ejemplo 6>. Un Fab monocatenario (scFab) en el que un dominio VH-CH y un dominio VL-CL están conectados por 26 cadenas de aminoácidos se fusionó con el extremo N-terminal de Fc (FIG. 23A).

En este caso, el par de mutaciones utilizado fue el par EW-RVT. El anticuerpo biespecífico de la forma scFab-Fc construido se expresó y purificó usando el método del Ejemplo 6, y se analizó una proteína por SDS-PAGE. Se confirmó que, en condiciones no reductoras, el anticuerpo biespecífico de la forma scFab-Fc en el que se introduce el par de mutaciones se purificó principalmente como un anticuerpo ensamblado en forma de un bivalente deseado, similar al anticuerpo biespecífico en el que se introduce el botón en ojal (grupo de control) y, en condiciones reductoras, se purifica el monómero del anticuerpo biespecífico deseado sin agregación ni escisión (FIG. 23B).

Para medir la capacidad de unión biespecífica del anticuerpo biespecífico variante de Fc purificado, se realizó un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Las moléculas diana BSA, DR4 y DR5 y los grupos de control DcR1 y DcR2 se ensamblaron en una placa EiA/RIA de 96 pocillos (COSTAR Corning In., EE. UU.) a 37 °C durante 1 hora, y luego se lavaron con PBST al 0,1% (Tween20 al 0,1%, pH 7,4, NaCl 137 mM, fosfato 10 mM, KCI 2,7 mM, SIGMA-ALDRICH Co., EE. UU.) tres veces durante 10 minutos. La muestra se combinó con leche desnatada al 5% (leche desnatada al 5%, pH 7,4, NaCl 137 mM, fosfato 10 mM, KCI 2,7 mM, SIGMA-ALDRICH Co., EE. UU.) durante 1 hora, y luego se lavó con PBST al 0,1% (Tween20 al 0,1%, pH 7,4, NaCl 137 mM, fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, SIGMA-ALDRICH Co., EE.UU.) tres veces durante 10 minutos. El anticuerpo biespecífico variante de Fc purificado se ensambló y luego se lavó con PBST al 0,1% tres veces durante 10 minutos. La muestra se combinó con mAb antihumano conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma, EE. UU.), y luego se hizo reaccionar con pNPP (palmitato de p-nitrofenilo, SlGMA-ALDRICH Co., EE. UU.) y se midió la absorbancia a 405 nm. De acuerdo con el resultado de ELISA, se confirmó que la forma scFv-Fc expresada y purificada y la forma scFab-Fc de anticuerpos biespecíficos tienen especificidad por las moléculas diana DR4 y d R5, respectivamente (FIG. 23C). La forma scFv-Fc y scFab-Fc forman anticuerpos biespecíficos en los que se introduce el par de mutaciones M7, tenían una fuerza de unión a las moléculas diana DR4 y DR5 que es similar al anticuerpo biespecífico en el que se introduce el botón en ojal (grupo de control). La especificidad por las moléculas diana se mantuvo sin reactividad cruzada en DcR1 y DcR2. Por consiguiente, se confirmó que la introducción del par de mutaciones del dominio CH3 mejorado no tiene influencia sobre la capacidad de unión de un sitio de unión a antígeno.

<Ejemplo 8> Evaluación de la citotoxicidad del anticuerpo biespecífico anti-DR4 x DR5 scFv-Fc y scFab-Fc usando la variante del dominio CH3 en la que se fusiona el anticuerpo anti-DR4 x DR5

Para comprobar la actividad destructora de células cancerosas de los anticuerpos biespecíficos anti-DR4 x DR5 scFv-Fc y scFab-Fc preparados en el <Ejemplo 6> y el <Ejemplo 7>, se realizó un experimento de citotoxicidad (ensayo MTT) en células líneas de una célula cancerosa de origen humano HCT116 (carcinoma colorrectal) y HeLa (adenocarcinoma).

Específicamente, se sembraron líneas de células cancerosas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1 x 104 células por pocillo, se cultivaron en una incubadora de 5% de CO²a 37 °C durante 1,5 días, y los anticuerpos originales, anticuerpo humanizado anti-DR4 hAY4a IgG y el anticuerpo humano anti-DR5 AU5H-scFv, scFv-Fc y scFab-Fc preparados forman anticuerpos biespecíficos, y el ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL) que es un ligando de DR4 y DR5 que sirve como grupo de control positivo se cultivaron en una incubadora durante 20 horas. En este caso, se utilizó el TRAIL expresado y purificado en E. coli. Luego, se aplicó un tratamiento de una solución de MTT (Sigma) de 5 mg/mL a 20 mL por pocillo, se cultivó la muestra durante 34 horas, se retiró la solución de cultivo en el pocillo, se disolvió formazán en DMSO (100 ml) y se midió la absorbancia del formazán disuelto a 595 nm para cuantificar la citotoxicidad.

Como resultado, puede entenderse que los anticuerpos biespecíficos de dos formas tenían una mayor actividad destructora de células cancerosas que los anticuerpos parentales, el anticuerpo humanizado hAY4a IgG y el anticuerpo humano AU5H-scFv, y tenían una citotoxicidad similar o más excelente que el TRAIL utilizado como grupo de control positivo (FIG. 24).

La siguiente Tabla 5 muestra heterodímeros de dominios CH3 de anticuerpo e información de secuencia de pares Fc heterodiméricos que incluyen ejemplos de acuerdo con la presente invención.

Tabla 5

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Aunque la invención se ha descrito con respecto a las realizaciones específicas anteriores, debe reconocerse que los expertos en la técnica pueden realizar diversas modificaciones y cambios en la invención que también entran dentro del alcance de la invención tal como se define por las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION

<120> Par de variantes del dominio CH3 que induce la formación de heterodímero de la región constante de la cadena pesada del anticuerpo con alta eficiencia, método para prepararlo y uso del mismo

<130> 38-1

<150> KR 10-2012-0135586

<151 > 2012-11-27

<160> 36

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CH3A de tipo salvaje (numeración EU 341~447)

<400> 1

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr LeuPro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr CysLeu Val Lys Gly Phe 20 25 30 ‘ Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu SerAsn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

Leu His AsnHisTyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>2

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> CH3B de tipo salvaje (numeración EU 341~447)

<400>2

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>3

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> E-R CH3A (numeración EU 341~447)

<400>3

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>4

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> E-R CH3B (numeración EU 341~447)

<400> 4

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr

Ser LysLeu

Thr Val Asp Lys S

Arg Trp Gln Gl 65 70 75 80

Asn Val Phe

Ser CysSer

Val Met His Glu A

Leu His Asn Hi 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

’ 100 105

<210>5

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> W-VT CH3A (numeración EU 341~447)

<400>5

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>6

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> W-VT CH3B (numeración EU 341~447)

<400>6

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>7

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> EW-RVT CH3A (numeración EU 341~447)

<400>7

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>8

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> EW-RVT CH3B (numeración EU 341~447)

<400>8

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210>9

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> EW-RVT (S-S) CH3A (numeración EU 341~447)

<400>9

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60 ....

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

< 210 > 10

< 211 > 107

< 212 > P R T

< 213 > S e cu e n c ia a rtific ia l

< 220>

<223> EW-RVT (S-S) CH3B (numeración EU 341~447)

<400> 10

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> EEW-RVT CH3A (numeración EU 341~447)

<400> 11

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp H e Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> EEW-RVT CH3B (numeración EU 341~447)

<400> 12

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60 "

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SW-WVT CH3A (numeración EU 341~447)

<400> 13

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 "

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SW-WVT CH3B (numeración EU 341~447)

<400> 14

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Trp Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

< 210 > 15

< 211 > 107

< 212 > P R T

< 213 > S e cu e n c ia a rtific ia l

< 220>

<223> SW-WVT (S-S) CH3A (numeración EU 341~447)

<400> 15

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 16

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> SW-WVT (S-S) CH3B (numeración EU 341~447)

<400> 16

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Trp Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60

Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 " 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 17

<211> 107

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> KiH (Genentech) CH3A (numeración EU 341~447)

<400> 17

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 ^ 60

Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

< 210 > 18

< 211 > 107

< 212 > P R T

< 213 > S e cu e n c ia a rtific ia l

< 220>

<223> KiH (Genentech) CH3B (numeración EU 341~447)

<400> 18

<210> 19

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>Fc de tipo salvaje (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 19

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 20

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

< 223 > F c de t ip o sa lva je (ca d e n a B) (nu m e ra c ió n 225~ 447 )

< 400 > 20

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 21

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

< 223 > E -R Fc (ca d e n a A ) (n u m e ra c ió n EU 225 ~ 447 )

< 400 > 21

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 22

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

< 223 > E -R Fc (ca d e n a B) (n u m e ra c ió n EU 225 ~ 447 )

< 400 > 22

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro 115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 23

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

< 223 > W -V T Fc (ca d e n a A ) (n u m e ra c ió n EU 225~ 447 )

< 400 > 23

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 24

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

< 223 > W -V T Fc (ca d e n a B) (n u m e ra c ió n EU 225~ 447 )

< 400 > 24

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 25

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

< 220>

<223>EW-RVT Fc (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 25

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 26

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

^< 220 ^>

<223>EW-RVT Fc (cadena B) (numeración EU 225~447)

<400> 26

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys ProArg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu ThrVal Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 27

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>EW-RVT (S-S) Fc (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 27

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met H e Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr H e

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp H e Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

<210> 28

<211> 223

< 212 > P R T

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>EW-RVT (S-S) Fc (cadena B) (numeración EU 225~447)

<400> 28

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser 165 170 175

Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

< 210 > 29

< 211 > 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>EEW-RVT Fc (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 29

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Glu Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 165 170 175

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

< 210 > 30

< 211 > 223

< 212 > P R T

< 213 > S e cu e n c ia a rtific ia l

< 220>

<223>EEW-RVT Fc (cadena B) (numeración EU 225~447)

<400> 30

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Asp Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

< 210 > 31

< 211 > 223

< 212 > P R T

< 213 > S e cu e n c ia a rtific ia l

< 220>

<223>SW-WVT Fc (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 31

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

65 70 75 80

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215 220

< 210 > 32

< 211 > 223

< 212 > P R T

< 213 > S e cu e n c ia a rtific ia l

< 220>

<223>SW-WVT Fc (cadena B) (numeración EU 225~447)

<400> 32

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Trp Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 33

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>SW-WVT (S-S) Fc (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 33

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Ser Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 34

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

< 223 > S W -W V T (S -S ) Fc (ca d e n a B) (nu m e ra c ió n EU 225~ 447 )

<400> 34

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro H e Glu Lys Thr H e

100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Trp Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 130 135 140

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 35

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>KiH (Genentech) Fc (cadena A) (numeración EU 225~447)

<400> 35

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

1 5 10 15

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr

20 25 30

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

35 40 45

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 50 55 60

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 65 70 75 80 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 85 90 95 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie ........... 100 105 110

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 130 135 140

165 170 175 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

180 185 190

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

195 200 205

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

<210> 36

<211> 223

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223>KiH (Genentech) Fc (cadena B) (numeración EU 225~447)

<400> 36

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un heterodímero que comprende dominios CH3 de anticuerpo IgG humano, caracterizado porque Lys409 de un dominio CH3 está sustituido con triptófano (W), y Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con valina (V) y treonina (T), respectivamente, y el heterodímero comprende una unión entre dicho W y un aminoácido seleccionado de dicha V y dicha T

y

(c) Gln347 y Lys360 de un dominio CH3 están sustituidos con ácido glutámico (E), respectivamente, y Gln347 del otro dominio CH3 está sustituido con arginina (R) y el heterodímero comprende una unión entre un aminoácido seleccionado de dichos E y dicha R;

en donde las posiciones están numeradas según el índice EU con referencia a la IgG1 humana.

2. El heterodímero que comprende los dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Lys360 y Lys409 de un dominio CH3 están sustituidos con ácido glutámico (E) y triptófano (W), respectivamente, y Gln347, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con arginina (R), valina (V) y treonina (T), respectivamente.

3. El heterodímero que comprende los dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de acuerdo con la reivindicación 2, en donde Gln347, Lys360 y Lys409 de un dominio CH3 están sustituidos con ácido glutámico (E), ácido glutámico (E) y triptófano (W), respectivamente, y Gln347, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con arginina (R), valina (V) y treonina (T), respectivamente.

4. El heterodímero que comprende los dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de acuerdo con la reivindicación 1, en donde Tyr349 y Lys409 de un dominio CH3 están sustituidos con serina (S) y triptófano (W), respectivamente, y Glu357, Asp399 y Phe405 del otro dominio CH3 están sustituidos con triptófano (W), valina (V) y treonina (T), respectivamente.

5. El heterodímero que comprende los dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 4, en donde el heterodímero comprende, además, una unión entre una sustitución de cisteína (C) en Tyr349 de un dominio CH3 y una sustitución de cisteína (C) en Ser354 del otro CH3 dominio.

6. Un par de Fc heterodiméricos que comprende el heterodímero que comprende dominios CH3 de IgG humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un anticuerpo biespecífico que comprende el heterodímero que comprende los dominios CH3 de IgG humana de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. El anticuerpo biespecífico que comprende el heterodímero que comprende los dominios CH3 de IgG humana de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en

(c) (Fv)²-Fc, que tiene una estructura en la que dos tipos de Fv de unión a antígeno que consisten en la región variable de la cadena pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) se fusionan con el extremo N-terminal y C-terminal de una proteína de par de Fc heterodiméricos, respectivamente; y

(d) mAb-Fv, que es un anticuerpo monoclonal biespecífico fusionada con la región variable en el que un único dominio de unión a antígeno variable (VH o VL) se fusiona con el extremo C-terminal de la cadena pesada de IgG que consiste en una proteína de par de Fc heterodiméricos.

9. Un anticuerpo monovalente de unión a antígeno que comprende la proteína de par de Fc heterodiméricos de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el anticuerpo está en una forma de Fv-Fc en el que una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), que se unen a un solo antígeno, se fusionan con el extremo N-terminal o C-terminal de una proteína de par de Fc heterodiméricos, y que es capaz de unirse monovalentemente al único antígeno.

10. Una proteína de fusión en forma de proteína-Fc preparada fusionando dos tipos de proteínas con el extremo N-terminal o C-terminal de la proteína de par de Fc heterodiméricos de acuerdo con la reivindicación 6.

11. Una composición farmacéutica que comprende como componente eficaz al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en el par de Fc heterodiméricos de acuerdo con la reivindicación 6, el anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, el anticuerpo monovalente de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 9 y la proteína de acuerdo con la reivindicación 10.

12. Un método para preparar un heterodímero que comprende los dominios CH3 de anticuerpo IgG humano de acuerdo con la reivindicación 1, en donde se prefiere la formación de un Fc heterodimérico, comprendiendo el método: (a) la preparación de un par de mutaciones mediante

(iic) sustitución de Gln347 y Lys360 de un dominio CH3 con ácido glutámico (E),

respectivamente, y sustitución de Gln347 del otro dominio CH3 con arginina (R); y

(b) la unión del par de mutaciones preparado en la etapa (a) para formar dicho heterodímero, en donde dicho enlace es como se define en la reivindicación 1.

13. Un método para preparar un par de Fc heterodiméricos que comprende el heterodímero que comprende dominios CH3 de IgG humana de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho par de Fc se forma a partir de dos cadenas pesadas cada una de la estructura bisagra-CH2-CH3, comprendiendo el método:

(d) la preparación de un vector de expresión de proteína de par de Fc recombinante que comprende ácidos nucleicos en el que el heterodímero que comprende dominios CH3 de IgG humana preparados por el método de acuerdo con la reivindicación 12 se fusiona con el extremo C-terminal de un dominio bisagra-CH2 de tipo salvaje de la región constante de cadena pesada de un anticuerpo;

(e) expresión de la proteína del par de Fc recombinante cotransformando el vector de expresión preparado con células; y

(f) purificación y recuperación de la proteína de par de Fc recombinante coexpresada.