ES2935274T3

ES2935274T3 - Anticuerpo con intercambio de dominios

Info

Publication number: ES2935274T3
Application number: ES15805462T
Authority: ES
Inventors: Gordana Wozniak-Knopp; Sylvia Dietrich; Florian Rüker; Alec W Gross; Stefan Becker
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2015-12-04
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2035-12-04
Also published as: US10982008B2; JP6904902B2; CN107207592B; IL252004A0; JP2017536128A; EP3227328A1; CN107207592A; EP3227328B1; IL252004B; CA2963615A1; AU2015357053B2; AU2015357053A1; IL252004B2; CA2963615C; WO2016087650A1; US20180016354A1

Abstract

La invención proporciona un anticuerpo de dominio intercambiado que comprende una cadena ligera (LC) compuesta por VL-CH3 y una cadena pesada (HC) que comprende VH-CH3-CH2-CH3, donde el VL-CH3 de la LC se dimeriza con el VH-CH3 del HC formando así un dímero LC/HC de dominio intercambiado que comprende un par de dominio CH3LC/CH3HC, y medios y método para producir el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo con intercambio de dominios

La invención se refiere a un anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), donde la LC está dimerizada con la HC.

Antecedentes

Los anticuerpos monoclonales se han utilizado ampliamente como agentes de unión terapéuticos. La estructura básica del anticuerpo se explicará en la presente memoria utilizando como ejemplo una inmunoglobulina IgG1 intacta.

Dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas se combinan para formar la molécula de anticuerpo en forma de Y. Las cadenas pesadas tienen cada una cuatro dominios. Los dominios variables amino terminales (VH) están en las puntas de la Y. Estos van seguidos por tres dominios constantes: CH1, CH2 y la CH3 carboxi-terminal, en la base del tallo de la Y. Un tramo corto, el conmutador, conecta las regiones variables y constantes de la cadena pesada. La bisagra conecta CH2 y CH3 (el fragmento Fc) con el resto del anticuerpo (los fragmentos Fab). Se pueden producir un fragmento Fc y dos Fab idénticos mediante la escisión proteolítica de la bisagra en una molécula de anticuerpo intacta. Las cadenas ligeras están formadas por dos dominios, el variable (VL) y el constante (CL), separados por un conmutador.

Los enlaces disulfuro en la región bisagra conectan las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante enlaces disulfuro adicionales. Los restos de carbohidratos unidos a Asn se unen en diferentes posiciones en los dominios constantes dependiendo de la clase de inmunoglobulina. Para IgG1, dos enlaces disulfuro en la región bisagra, entre los pares Cys235 y Cys238, unen las dos cadenas pesadas. Las cadenas ligeras se acoplan a las cadenas pesadas mediante dos enlaces disulfuro adicionales, entre las Cys229 de los dominios CH1 y las Cys214 de los dominios CL. Los restos de carbohidratos se unen a Asn306 de cada CH2, lo que genera una protuberancia pronunciada en el tallo de la Y.

Estas características tienen profundas consecuencias funcionales. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera (VH) y (VL) se encuentran en la región N-terminal, es decir, las "puntas" de la Y, donde se posicionan para reaccionar con el antígeno. Esta punta de la molécula es el lado donde se encuentra el extremo N-terminal de la secuencia de aminoácidos. El tallo de la Y se proyecta para mediar eficientemente en las funciones efectoras, como la activación del complemento y la interacción con los receptores de Fc, o la ADCC y la ADCP. Sus dominios CH2 y CH3 sobresalen para facilitar la interacción con las proteínas efectoras. El extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos se encuentra en el lado opuesto de la punta, que puede denominarse "parte inferior" de la Y.

En los anticuerpos se encuentran dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda (^A) y kappa (^k). Una inmunoglobulina concreta tiene cadenas ^ko cadenas ^A, nunca una de cada una. No se ha descubierto ninguna diferencia funcional entre los anticuerpos que tienen cadenas ligeras ^Ao ^k.

Cada dominio en una molécula de anticuerpo tiene una estructura similar de dos láminas beta empaquetadas firmemente una contra la otra en un barril beta antiparalelo comprimido. Esta estructura conservada se denomina pliegue de inmunoglobulina. El pliegue de inmunoglobulina de los dominios constantes contiene una lámina de 3 cadenas empaquetada contra una lámina de 4 cadenas. El plegamiento se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre las cadenas beta de cada lámina, mediante enlaces hidrófobos entre los residuos de láminas opuestas en el interior y mediante un enlace disulfuro entre las láminas. La lámina de 3 cadenas comprende las cadenas C, F y G, y la lámina de 4 cadenas tiene las cadenas A, B, E y D. Las letras de la A a la G indican las posiciones secuenciales de las cadenas beta a lo largo de la secuencia de aminoácidos del pliegue de inmunoglobulina.

El plegamiento de los dominios variables tiene 9 cadenas beta dispuestas en dos láminas de 4 y 5 cadenas. La lámina de 5 cadenas es estructuralmente homóloga a la lámina de 3 cadenas de los dominios constantes, pero contiene las cadenas adicionales C' y C". El resto de las cadenas (A, B, C, D, E, F, G) tienen la misma topología y una estructura similar a la de sus homólogos en los pliegues de inmunoglobulina del dominio constante. Un enlace disulfuro une las cadenas B y F en láminas opuestas, como en los dominios constantes.

Los dominios variables de las cadenas de inmunoglobulinas ligeras y pesadas contienen tres bucles hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Las tres CDR de un dominio V (CDR1, CDR2, CDR3) se agrupan en un extremo del barril beta. Las CDR son bucles que conectan las cadenas beta B-C, C'-C" y F-G del pliegue de inmunoglobulina. Los residuos en las CDR varían de una molécula de inmunoglobulina a otra, confiriendo la especificidad antigénica a cada anticuerpo.

Los dominios VL y VH de las puntas de las moléculas de anticuerpo están estrechamente empaquetados de modo que las 6 CDR (3 en cada dominio) cooperen en la construcción de una superficie (o cavidad) para la unión específica al antígeno. El sitio de unión al antígeno natural de un anticuerpo está compuesto por los bucles que conectan las cadenas B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de la cadena ligera y las cadenas B-C, C'-C" y F-G del dominio variable de la cadena pesada.

Los bucles que no son bucles de CDR en una inmunoglobulina nativa, o que no forman parte del bolsillo de unión al antígeno según lo determinado por los bucles de CDR y, opcionalmente, los bucles adyacentes dentro de la región de bucles de CDR, no tienen especificidad de unión al antígeno o unión al epítopo, pero contribuyen al plegamiento correcto de toda la molécula de inmunoglobulina y/o su efector u otras funciones, y por lo tanto se denominan bucles estructurales.

Los documentos de la técnica anterior muestran que el armazón de tipo inmunoglobulina se ha empleado hasta ahora con el fin de manipular el sitio de unión al antígeno existente, introduciendo así nuevas propiedades de unión. En la mayoría de los casos, las regiones CDR se han modificado en función de la unión al antígeno, en otras palabras, en el caso del pliegue de inmunoglobulina, solo se ha modificado el sitio de unión al antígeno natural para cambiar su afinidad o especificidad de unión. Existe una gran cantidad de bibliografía que describe diferentes formatos de dichas inmunoglobulinas manipuladas, frecuentemente expresadas en forma de fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o fragmentos Fab, que se muestran en la superficie de partículas de fago o se expresan de forma soluble en diversos sistemas de expresión procariotas o eucariotas.

El documento WO2006/072620A1 describe un método de ingeniería de una inmunoglobulina que comprende una modificación en una región de bucles estructurales para obtener nuevos sitios de unión al antígeno. Este método es ampliamente aplicable a las inmunoglobulinas y puede usarse para producir una biblioteca de inmunoglobulinas dirigidas a una variedad de antígenos. Se ha demostrado que una biblioteca de CH3 es útil para seleccionar miembros específicos de la biblioteca que son capaces de unirse a un antígeno a través de los bucles estructurales. Dichos conectores de bucles estructurales también se denominan en la presente memoria CH3 "inmunitario". Según un ejemplo, se ha modificado una estructura similar a Fab que incluye dominios CH3 inmunitarios para sustituir los dominios CH1 y CL.

Las construcciones de anticuerpos biespecíficos están actualmente en desarrollo para terapias mejoradas. La IgG bivalente depende de la dimerización de sus cadenas pesadas, mediada por la asociación homodimérica de sus dominios CH3.

Davis et al (Protein Engineering, Design & Selection 2010, 23(4) 195-202) describen una plataforma de Fc heterodimérica que admite el diseño de proteínas de fusión biespecíficas y asimétricas mediante el uso de heterodímeros de CH3 de dominio modificado mediante intercambio de cadenas (SEED). Estos derivados de los dominios CH3 de IgG e IgA humanos crean heterodímeros de CH3 SEED humanos complementarios que están compuestos por segmentos alternos de secuencias de IgA e IgG humanas. La ingeniería de SEED se describe con más detalle en el documento EP1999154B1. El documento WO 2010/136172 A1 describe anticuerpos triespecíficos o tetraespecíficos que comprenden uno o dos Fac monocatenarios conectados al extremo C-terminal de la parte Fc del anticuerpo.

Pepp et al. (1 de enero de 2007, Handbook of Therapeutic Antibodies, págs. 171-196) proporciona una descripción general de la ingeniería de Fc.

Beck et al, (Nature Reviews Immunology, vol. 10, n.° 5, 1 de mayo de 2010, págs. 345-352) describe anticuerpos terapéuticos de próxima generación, y en particular se refiere a diferentes tipos de anticuerpos biespecíficos.

Ridgway et al. (Protein Engineering, vol. 9, n.° 7, 1996, págs. 617-621) describe la ingeniería de "botón en ojal" de los dominios CH3 del anticuerpo para la heterodimerización de cadenas pesadas.

Atwell et al. (Journal Of Molecular Biology, vol. 270, n.° 1, 1997, págs. 26-35) describe la combinación de residuos de interfase para los dominios CH3 de anticuerpos que promueven la formación de heterodímeros de CH3 estables, incluidos los mutantes "botón" y "ojal".

Davis et al. (Protein Engineering Design And Selection, vol. 23, n.° 4, 2010, págs. 195-202) y el documento WO 2007/110205 A2 describen SEEDcuerpos que son proteínas de fusión basadas en heterodímeros de CH3 de dominio modificado mediante intercambio de cadenas (SEED) y anticuerpos biespecíficos.

Gunasekaran et al. (Journal Of Biological Chemistry, vol. 285, n.° 25, 2010, págs. 19637-19646) describen la mejora de la formación de heterodímeros de Fc de anticuerpos a través de efectos de direccionamiento electrostático y nuevas mutaciones de Fc para cambiar la polaridad en toda la interfase del dímero de Fc.

Von Kreudenstein et al. (Landes Bioscience, vol. 5, n.° 5, 2013, págs. 646-654) describen un armazón de anticuerpo biespecífico basado en un Fc heterodimérico modificado en función de la estabilidad.

Sumario de la invención

El objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos con una estructura mejorada para diseñar moléculas asimétricas, p. ej. para producir anticuerpos biespecíficos.

El objetivo se resuelve mediante el objeto de la presente invención.

De acuerdo con la invención, se proporciona la siguiente materia (artículos tal como se describen en las reivindicaciones).

1. Un anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios que comprende una primera cadena ligera (LC) emparejada con una primera cadena pesada (HC) que forma un primer dímero LC/HC que comprende un primer sitio de unión que reconoce un primer epítopo, y una segunda LC emparejada con una segunda HC que forma un segundo dímero LC/HC que comprende un segundo sitio de unión que reconoce un segundo epítopo que es diferente del primer epítopo o que se origina a partir de un antígeno diferente;

donde la primera y la segunda HC están dimerizadas formando así una región Fc que comprende un par de dominios CH3^hc/CH3^hc, cuya región Fc se caracteriza por un dímero de cadenas Fc, cada una de las cuales comprende CH2-CH3, donde la CH3 se denomina CH3^hc;

donde el primer o el segundo dímero LC/HC es un dímero LC/HC con intercambio de dominios que se caracteriza por

i) una LC compuesta por VL-CH3, donde la CH3 se denomina CH3^lc, y

ii) una HC que comprende VH-CH3-CH2-CH3, donde la CH3 se denomina CH3^hc, y

iii) donde la VL-CH3 de la LC está dimerizada con la parte VH-CH3 de la HC formando así un dímero LC/HC con intercambio de dominios que comprende un par de dominios CH3^lc/CH3^hc,

donde el anticuerpo es un anticuerpo competente para la función efectora que comprende un sitio de unión al receptor Fc gamma ubicado en cualquiera de los dominios CH2 y/o CH3;

donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hces un primer dominio CH3 mutante para producir un par afín de dominios CH3^lc/CH3^hc; y al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^hc/CH3^hces un segundo dominio CH3 mutante para producir el par afín de dominios CH3^hc/CH3^hc, donde el primer y segundo dominios CH3 mutantes difieren en al menos una mutación puntual; donde cada uno de los dominios CH3 mutantes comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID 41, que comprende uno o más de lo siguiente:

a) una o más mutaciones de botón u ojal, preferiblemente cualquiera de T366Y/Y407'T, F405A/T394'W, T366Y:F405A/T394'W:Y407'T, T366W/Y407'A y S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407V;

b) un residuo de cisteína que está unido covalentemente a un residuo de cisteína del otro dominio CH3 con el que está emparejado la CH3 mutante, introduciendo así un puente disulfuro entre dominios, que une preferentemente el extremo C-terminal de ambos dominios CH3;

c) un intercambio de cadenas en el dominio CH3 para producir heterodímeros de CH3 que están compuestos por segmentos alternados de secuencias CH3 de IgA e IgG humanas; y/o

d) una o más mutaciones donde la carga repulsiva suprime la formación de heterodímeros, preferiblemente cualquiera de: K409D/D399'K, K409D/D399'R, K409E/D399'K, K409E/D399'R, K409D:K392D/D399'K:E356'K o K409D:K392D:K370D/D399'K:E356'K:E357'K; y/o

e) una o más mutaciones seleccionadas para la formación de heterodímeros y/o la termoestabilidad, preferiblemente cualquiera de:

T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W, T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W, L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W,

F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W, o

F405A:Y407V/T366L:T394W,

donde la numeración es según el índice EU de Kabat.

2. El anticuerpo del artículo 1, que comprende al menos una prolongación C-terminal, donde la prolongación comprende otro par de dominios CH3LC/CH3HC.

3. El anticuerpo del artículo 1 o 2, donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hces un dominio CH3 mutante para producir un par afín de dominios CH3^lc/CH3^hc.

4. El anticuerpo de cualquiera de los artículos 1 a 3, donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^hc/CH3^hces un dominio CH3 mutante para producir un par afín de dominios CH3^hc/CH3^hc.

5. El anticuerpo de cualquiera de los artículos 1 a 4, donde la unión entre cualquiera de los dominios VH o VL y los dominios CH3 comprende una secuencia de aminoácidos que es

a) al menos parte de la unión entre los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG humano, y/o

b) al menos parte de la unión entre los dominios VL y CL de un anticuerpo IgG humano; y/o

c) al menos parte de la unión entre los dominios VH y CH1 de un anticuerpo IgG humano; y/o

d) una secuencia conectora artificial con una longitud de 5 a 20 aminoácidos, preferiblemente de 8 a 15 aminoácidos.

6. El anticuerpo de cualquiera de los artículos 1 a 5, que comprende un sitio de unión a FcRn dependiente del pH ubicado en cualquiera de los dominios CH2 y/o CH3.

7. El anticuerpo de cualquiera de los artículos 1 a 6, que es un anticuerpo biespecífico que reconoce específicamente un primer y un segundo antígeno diana, que comprende un primer par de cadenas ligeras y pesadas que incorporan el sitio de unión que reconoce el primer antígeno diana, y un segundo par de cadenas pesadas y ligeras que incorporan el sitio de unión que reconoce el segundo antígeno diana.

8. El anticuerpo del artículo 7, donde el primer antígeno diana es CD3 o CD16, y el segundo antígeno diana es EGFR.

9. El anticuerpo de cualquiera de los artículos 1 a 8, donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hccomprende al menos una mutación en el sitio de unión a FcRn para reducir la unión a FcRn dependiente del pH, específicamente al menos una de las mutaciones H433A o H435A, donde la numeración es según el índice EU de Kabat.

10. El anticuerpo de cualquiera de los artículos 1 a 9, donde los dominios constantes del anticuerpo son de origen humano o dominios de anticuerpos IgG1 humanizados.

11. Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

La siguiente descripción caracteriza adicionalmente la materia de la invención tal como se reivindica:

El anticuerpo con intercambio de dominios como se describe en las reivindicaciones comprende una cadena ligera (LC) compuesta por VL-CH3 y una cadena pesada (HC) que comprende VH-CH3-CH2-CH3, donde la VL-CH3 de la LC está dimerizada con la VH-CH3 de la HC formando así un dímero LC/HC con intercambio de dominios que comprende un par de dominios CH3^lc/CH3^hc.

Específicamente, el anticuerpo tal como se describe en las reivindicaciones comprende al menos una prolongación C-terminal, donde la prolongación comprende otro par de dominios CH3^lc/CH3^hc. Dicho otro par de dominios CH3^lc/CH3^hces específicamente uno terminal. Por ejemplo, el anticuerpo se prolonga fusionando un fragmento Fab al extremo C-terminal de uno o ambos dominios CH3 de la parte Fc (el par de dominios CH3^hc/CH3^hc), con o sin una secuencia conectora. En particular, la prolongación puede comprender uno o dos fragmentos Fab, de manera que el anticuerpo comprende dos, tres o cuatro brazos de Fab, donde al menos uno de los brazos de Fab comprende el intercambio de dominios. Por lo tanto, al menos un brazo de Fab comprende el par de dominios CH3^lc/CH3^hc. Específicamente, dos, tres o cuatro brazos de Fab pueden comprender un par de dominios CH3^lc/CH3^hc.

Específicamente, cualquiera o cada uno de los dominios CH3 es un dominio CH3 de IgG1, caracterizado específicamente por una secuencia de CH3 de IgG1 humana o una variante modificada de la misma que comprende una o más mutaciones puntuales, preferiblemente hasta 10 mutaciones puntuales.

Específicamente, el dominio CH2 es del tipo IgG2, caracterizado específicamente por una secuencia de CH2 de IgG2 humana, o una variante modificada de la misma, que comprende una o más mutaciones puntuales, preferiblemente hasta 10 mutaciones puntuales.

Se entiende que cualquier anticuerpo puede comprender uno o más brazos de Fab con intercambio de dominios en una prolongación C-terminal del anticuerpo, p. ej. un anticuerpo IgG. Se puede proporcionar un anticuerpo C-terminal prolongado por un brazo de Fab, donde el extremo N-terminal del dominio VL o VH del brazo de Fab está fusionado con el extremo C-terminal de la CH3 de la parte Fc del anticuerpo, con o sin una secuencia conectora. En particular, un anticuerpo puede comprender uno, dos, tres o cuatro brazos de Fab, donde al menos uno de los brazos de Fab es un brazo de Fab con intercambio de dominios. Por lo tanto, al menos un brazo de Fab comprende el par de dominios CH3^lc/CH3^hc. Específicamente, dos, tres o cuatro brazos de Fab pueden comprender el par de dominios CH3^lc/CH3^hc.

Específicamente, cada uno de los brazos de Fab comprende un sitio de unión al antígeno funcional compuesto por un par de dominios VH/VL, capaz de unirse a una diana con una alta afinidad y una K^dde menos de cualquiera de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M. Específicamente, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico o heterodimérico con intercambio de dominios dirigido a dos antígenos diferentes, donde cada uno de los antígenos es reconocido por el anticuerpo con una K^dde menos de cualquiera de 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M.

Específicamente, el anticuerpo comprende una región bisagra, preferiblemente una región bisagra humana, p. ej. una región bisagra de IgG1 humana.

Según las reivindicaciones, el anticuerpo comprende una región Fc caracterizada por un dímero CH3^hc/CH3^hc. La región Fc se caracteriza específicamente por un dímero de cadenas Fc, cada una caracterizada por comprender la cadena CH2-CH3, cuyo dímero puede ser un homodímero o un heterodímero, p. ej. donde una primera cadena Fc difiere de una segunda cadena Fc en al menos una mutación puntual en los dominios CH2 y/o CH3.

De acuerdo con las reivindicaciones, se proporciona un anticuerpo con intercambio de dominios que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), cuya HC está dimerizada con otra HC formando así un dímero HC/HC, que comprende al menos una prolongación C-terminal, donde la prolongación comprende un par de dominios CH3^lc/CH3^hc. Tal anticuerpo con intercambio de dominios comprende dos LC y dos HC, donde al menos una HC se prolonga por uno o dos brazos de Fab. El anticuerpo comprende específicamente al menos un brazo de Fab y al menos un brazo de Fab con intercambio de dominios, en el que

a) un brazo de Fab comprende dominios VL-CL emparejados con dominios VH-CH1 para formar un dímero de cadenas de dos dominios; y

b) un brazo de Fab con intercambio de dominios comprende dominios VL-CH3^lcemparejados con dominios VH-CH3^hc, formando así el par de dominios CH3^lc/CH3^hc.

Específicamente, el anticuerpo comprende uno, dos o tres brazos de Fab, que no tienen intercambio de dominios según el punto a) anterior, y uno, dos o tres brazos de Fab con intercambio de dominios según el punto b) anterior.

De acuerdo con un aspecto específico, dicho o dichos brazos de Fab con intercambio de dominios en la prolongación C-terminal del anticuerpo comprenden un dominio CH3 que está modificado para alterar la unión a FcRn dependiente del pH. Por ejemplo, al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hcpuede modificarse para comprender al menos una mutación en el sitio de unión a FcRn para reducir la unión a FcRn dependiente del pH,

La reducción de la unión a FcRn dependiente del pH puede ser tal que la afinidad de unión para unirse a FcRn de una manera dependiente del pH sea inferior a 1 log, preferiblemente igual o menor a pH 5-6 en comparación con la misma afinidad de unión a pH fisiológico (pH 7,4).

Un dominio CH3 con unión reducida a FcRn dependiente del pH puede comprender específicamente al menos una de las mutaciones H433A o H435A, o ambas mutaciones H433A o H435A, donde la numeración es según el índice EU de Kabat.

Una realización específica de las variantes de CH3^lcy CH3^hcsin el sitio de unión a FcRn dependiente del pH del dominio CH3 nativo se obtienen mediante la introducción de las mutaciones H433A y H435A (numeración según el índice EU de Kabat), que es parte del sitio de unión a FcRn dependiente del pH aportado por la secuencia del dominio CH3 nativo [9], véase la Fig. 22.

El número de un aminoácido mutado de un dominio CH3 tal como se describe en la presente memoria se proporciona como una posición que corresponde a la numeración de Kabat. La numeración de Kabat se refiere originalmente a la numeración de un anticuerpo de origen natural. En un anticuerpo descrito en la presente memoria, que comprende una estructura con intercambio de dominios, el número de un aminoácido en el dominio CH3 de acuerdo con el índice EU de Kabat se entiende específicamente como la posición análoga determinada por la estructura del dominio CH3 en un anticuerpo natural.

Específicamente, los dominios CH3 en el par de dominios CH3^lc/CH3^hcson heterólogos, en particular donde un dominio CH3 se incorpora a la estructura del anticuerpo en una posición que es "exógena" para la molécula. De este modo, se puede producir un anticuerpo con intercambio de dominios. La CH3 heteróloga también se denomina en la presente memoria CH3^het. Así, el par de dominios CH3^lc/CH3^hces específicamente un dímero heterólogo (CH3^het/CH3^het), donde cada uno de los CH3^hetestá unido de manera N-terminal a un dominio variable, p. ej. donde un primer dominio de anticuerpo CH3^hetestá unido en el extremo N-terminal al dominio VL, lo que produce una LC y un segundo CH3^hetestá unido a un dominio VH, lo que produce parte de la HC, cuyos primero y segundo CH3^hetforman un dímero al menos a través del contacto de una región de lámina beta del primer y segundo dominios CH3^het. Específicamente, el primer y segundo dominios CH3^hetson dominios CH3 no inmunitarios, que no incorporan un sitio de unión al antígeno en la región de bucles estructurales, tal como un sitio de unión sin CDR. El dominio CH3 no inmunitario específicamente no comprende un sitio de unión similar a CDR capaz de unirse al antígeno.

Específicamente, el dímero CH3^het/CH3^hetes un heterodímero que consiste en dos dominios CH3 que difieren entre sí por la secuencia de aminoácidos, o un homodímero de dos dominios CH3 que tienen la misma secuencia de aminoácidos.

Específicamente, se produce una estructura que es similar a una estructura de longitud completa de un anticuerpo, p. ej. una IgG, produciendo así una estructura similar a la IgG que es la misma estructura de una IgG, pero con un intercambio de dominios mediante la introducción de un par adicional de dominios CH3^heten una posición que es diferente de la posición de tipo natural, específicamente para sustituir el par de dominios CH1/CL que se va a intercambiar por el par de dominios CH3^het. En el anticuerpo de longitud completa, uno o ambos brazos de Fab pueden ser una estructura similar a Fab. Por lo tanto, uno o ambos pares de LC y HC pueden comprender la estructura con intercambio de dominios que incluye el dímero CH3^het/CH3^het.

Específicamente, la estructura similar a IgG se obtiene prolongando la estructura similar a (Fab)2 a través de la fusión de una parte de Fc. Por lo tanto, cada una de las cadenas pesadas se prolonga en el extremo C-terminal mediante una secuencia de dominio CH2-CH3.

De acuerdo con una realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, donde la LC se compone de VL-CH3, opcionalmente donde los dominios están directamente unidos o donde la LC comprende además una o más regiones conectoras o bisagra como unión entre los dominios de anticuerpo.

De acuerdo con una realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, donde la HC está compuesta por VH-CH3-CH2-CH3, opcionalmente donde los dominios están directamente unidos o donde la HC comprende además una o más regiones conectoras o bisagra como unión entre los dominios de anticuerpo.

Específicamente, el anticuerpo descrito en la presente memoria tiene una estructura similar a IgG que comprende solo una estructura similar a Fab y una estructura Fab de tipo natural. Así, según una realización específica, el anticuerpo comprende o consiste en

a) una LC compuesta por VL-CH3 y una HC compuesta por VH-CH3-CH2-CH3, donde la VL-CH3 de la LC está dimerizada con la VH-CH3 de la HC formando así un primer dímero LC/HC, que es el dímero LC/HC con intercambio de dominios que comprende un par de dominios CH3^lc/CH3^hc; y

b) una LC compuesta por VL-CL y una HC compuesta por VH-CH1-CH2-CH3, donde la VL-CH1 de la LC está dimerizada con la VH-CL de la HC, formando así un segundo dímero LC/HC;

donde la HC del primer dímero LC/HC está dimerizada con la HC del segundo dímero LC/HC, para formar una parte Fc que comprende un par de dominios CH3^hc/CH3^hc.

Específicamente, el par de dominios CH3^lc/CH3^hcy/o el par de dominios CH3^hc/CH3^hcpuede incluir uno o dos dominios CH3 modificados para mejorar la producción del par afín, como para reducir la probabilidad de que los dímeros de CH3 no coincidan cuando se produce la molécula mediante un sistema de expresión recombinante.

Específicamente, se obtiene una estructura tipo Fab al dimerizar la cadena pesada VH-CH3^hetcon la cadena ligera que consiste en VL-CH3^het.

Específicamente, se obtiene una estructura de tipo (Fab)2 uniendo dos estructuras Fab a través de la unión de las dos cadenas pesadas, donde una o ambas estructuras Fab son estructuras de tipo Fab.

De acuerdo con otra realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo IgM o IgE, donde la HC está compuesta por VH-CH3-CH2-CH3-CH4, opcionalmente donde los dominios están directamente unidos o donde la HC comprende además uno o más conectores o regiones bisagra como unión entre los dominios de anticuerpo.

Específicamente, la estructura similar a IgM se obtiene prolongando la estructura similar a (Fab)2 a través de la fusión con una parte Fc. Por lo tanto, cada una de las cadenas pesadas se prolonga en el extremo C-terminal mediante una secuencia de dominio CH2-CH3-CH4.

Específicamente, la región conectora o bisagra proporcionaría una unión entre la región C-terminal de CH3^hetde la HC y la región N-terminal del dominio CH2, por lo tanto, el anticuerpo de HC puede comprender o consistir en la siguiente estructura VH-CH3-unión-CH2-CH3.

La unión de los dominios es específicamente mediante fusión recombinante o enlace químico. La unión específica puede ser a través de la unión del extremo C-terminal de un dominio al extremo N-terminal de otro dominio, p. ej. donde se eliminan uno o más residuos de aminoácidos de las regiones terminales para acortar el tamaño del dominio, o se prolongan para aumentar la flexibilidad de los dominios.

Específicamente, la secuencia acortada de dominios comprende una eliminación de la región C-terminal y/o N-terminal, como para eliminar al menos 1,2, 3, 4 o 5, hasta 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos.

Específicamente, se puede usar una secuencia conectora, como un conector o una región bisagra o al menos parte de la región bisagra de una inmunoglobulina (secuencias conectoras también denominadas en la presente memoria "unión"), que incluyen al menos 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos, hasta 10, 15 o 20 aminoácidos. La prolongación del dominio mediante un conector puede ser a través de una secuencia de aminoácidos que se origina en la región N- o C-terminal de un dominio de inmunoglobulina que se colocaría de forma nativa adyacente al dominio, para incluir la unión nativa entre los dominios. Alternativamente, el conector puede contener una secuencia de aminoácidos que se origina en la región bisagra. Sin embargo, el conector también puede ser una secuencia artificial, p. ej. que consiste en los aminoácidos Gly o Ser.

Específicamente, la unión entre cualquiera de los dominios VH o VL y los dominios CH3 comprende una secuencia de aminoácidos, que es

Según un aspecto específico, cualquiera de los dominios CH3^hetes de una IgG 1 humana, y es un CH3 mutante que comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID 41, que comprende la mutación según se reivindica.

Específicamente, cualquiera de los dominios constantes del anticuerpo, p. ej. 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, o todos los dominios del anticuerpo, son de origen humano o dominios IgG humanizados.

Según una realización específica, todos los dominios comprendidos en el anticuerpo son de origen humano o de un anticuerpo IgG 1 humanizado. Específicamente, todos los dominios de inmunoglobulina se originan a partir del mismo tipo o subtipo de inmunoglobulina.

Según un aspecto, el primero y/o el segundo dominio CH3^hetse origina a partir de un anticuerpo IgG1.

En concreto, el primero y/o el segundo dominio CH3^hetcomprende la secuencia de aminoácidos identificada como cualquiera de SEQ ID 41, que comprende una o más mutaciones puntuales, preferiblemente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mutaciones puntuales.

Específicamente, el anticuerpo comprende dominios variables para establecer dos sitios de unión al antígeno distintos, p. ej. mediante una estructura Fab y una similar a Fab, proporcionando así dos estructuras Fv. Dicha construcción comprende un brazo de Fab que comprende la estructura de tipo natural, en la que VL-CL está dimerizado con VH-CH1, y un segundo brazo similar a Fab que comprende la VL-CH3^lcque está dimerizada con VH-CH3^hc, incorporando así el par de dominios CH3^lc/CH3^hcen el anticuerpo.

Específicamente, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico dirigido a dos antígenos diferentes o dos epítopos diferentes de un antígeno.

Específicamente, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que comprende una primera LC emparejada con una primera HC formando un primer dímero LC/HC que comprende un primer sitio de unión que reconoce un primer epítopo, y una segunda LC emparejada con una segunda HC formando un segundo dímero LC/HC que comprende un segundo sitio de unión que reconoce un segundo epítopo que es diferente del primer epítopo o se origina a partir de un antígeno diferente, donde el primer dímero LC/HC o el segundo dímero LC/HC tienen un intercambio de dominios.

Específicamente, al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hces un dominio CH3 modificado capaz de producir un par afín de dominios CH3^lc/CH3^hc.

En consecuencia, el primero y/o el segundo dominio CH3^hetpuede ser un dominio CH3 modificado capaz de producir preferentemente un par afín de CH3^het/CH3^het. Dicho par afín está dimerizando específicamente con mayor velocidad, afinidad o avidez, en comparación con un par de CH3 nativo (de tipo natural). Específicamente, el par afín está modificado de manera que la CH3 modificada dimeriza preferentemente (se empareja) con otra CH3 modificada coincidente y reconoce otro dominio CH3 (de tipo natural o no coincidente) en menor medida.

Según un aspecto específico, el anticuerpo comprende un par de dominios CH3^hc/CH3^hc, p. ej. tal como el contenido en un dímero HC/HC, donde al menos uno de los dominios CH3 es un dominio CH3 modificado capaz de producir un par afín de dominios CH3^hc/CH3^hc.

De acuerdo con una realización específica,

a) al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hces un primer dominio CH3 modificado capaz de producir un par afín de dominios CH3^lc/CH3^hc; y

b) al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^hc/CH3^hces un segundo dominio CH3 modificado capaz de producir el par afín de dominios CH3^hc/CH3^hc;

donde el primer y segundo dominios CH3 modificados genéticamente difieren en al menos una mutación puntual. Específicamente, el dominio CH3 modificado, como cualquiera de los dominios CH3^lc/CH3^hc, o dominios CH3^het, o dominios CH3^hc/CH3^hc, p. ej. un dominio CH3 de un par heterodimérico o un par homodimérico de dominios CH3 comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID 41, cuyo dominio CH3 modificado comprende uno o más de los siguientes:

b) un residuo de cisteína que está unido covalentemente a un residuo de cisteína del otro dominio CH3 afín, introduciendo así un puente disulfuro entre dominios, que une preferentemente el extremo C-terminal de ambos dominios CH3;

c) heterodímeros CH3 SEED que están compuestos por segmentos alternos de secuencias CH3 de IgA y de IgG humanas; y/o

d) una o más mutaciones donde la carga repulsiva suprime la formación de heterodímeros, preferiblemente cualquiera de: K409D/D399'K, K409D/D399'R, K409E/D399'K, K409E/D399'R, K409D:K392D/D399'K:E356'K o K409D:K392D:K370D/ D399'K:E356'K:E357'K; y/o

F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W, o

F405A:Y407V/T366L:T394W,

donde la numeración es según el índice EU de Kabat.

En la especificación de las mutaciones puntuales descritas en la presente memoria, la "barra oblicua" diferencia las mutaciones puntuales en una cadena o un dominio de las mutaciones puntuales de la otra cadena u otro dominio del par respectivo; el "apóstrofo" en la numeración de la posición del aminoácido significa la segunda cadena o dímero del heterodímero. Los "dos puntos" identifican la combinación de mutaciones puntuales en una de las cadenas o dominios, respectivamente.

Se puede utilizar cualquiera de las mutaciones seleccionadas para la formación de heterodímeros y/o la termoestabilidad como se mencionó anteriormente, o mutaciones adicionales de acuerdo con la descripción de Von Kreudenstein et al. [8].

Preferiblemente, una (i) mutación de botón; o (ii) mutación de ojal, o (iii) una mutación de botón y ojal, está diseñada en una cadena o dominio, y la contraparte (i) mutación de ojal, o (ii) mutación de botón, o (iii) mutación de ojal y botón, está diseñada en la otra cadena del heterodímero.

Específicamente, un par de dominios CH3 que comprenden uno o dos dominios CH3 modificados pueden comprender más de un puente disulfuro (adicional) entre dominios, p. ej. 2 o 3, conectando el par de dos dominios CH3.

Específicamente, se introducen mediante ingeniería diferentes mutaciones (según el punto a) anterior) en ambos dominios CH3 de un par respectivo de dominios CH3 para producir un par coincidente, donde un dominio comprende una modificación estérica de una superficie de contacto en la región de la lámina beta que se une preferentemente a la superficie de contacto respectiva del otro dominio a través de la modificación estérica complementaria. Tales modificaciones estéricas resultan principalmente de los diferentes residuos de aminoácidos y cadenas laterales, p. ej. para producir una estructura de "botón" u "ojal", que son complementarias para formar un dímero de "botón en ojal". Según un aspecto específico, cada uno del primer y segundo dominios CH3 de un par de dominios CH3, p. ej. CH3^lc/CH3^hc, o el primero y el segundo dominios CH3^het, o los dominios CH3^hc/CH3^hc, es del tipo IgG con la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID 41, que está modificada para obtener un intercambio de cadenas mediante la incorporación de al menos un segmento de IgA de cadena beta de al menos 2 aminoácidos de longitud, y que comprende un par afín de dominios CH3 mediante el emparejamiento de un segmento de IgA del primer dominio CH3 con un segmento de IgA del segundo dominio CH3. Dichos dominios CH3 con intercambio de cadenas pueden comprender específicamente segmentos alternos de secuencias de aminoácidos de IgA e IgG, p. ej. incorporando al menos 1,2, 3, 4 o 5 segmentos de IgA diferentes, cada uno ubicado en posiciones diferentes y separados entre sí por un segmento que no es de IgA, p. ej. segmentos de IgG.

Según un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo competente para la función efectora que comprende un sitio de unión al receptor Fc gamma ubicado en cualquiera de los dominios CH2 y/o CH3.

Específicamente, el anticuerpo es competente para la función efectora que comprende un sitio de unión al receptor F^cyen la región HC y opcionalmente en la región Fc.

Específicamente, el anticuerpo se caracteriza por cualquiera de las actividades de ADCC y/o CDC.

Específicamente, el anticuerpo comprende una parte Fc de un anticuerpo que comprende un sitio de unión a FcRn en la unión del CH2 con el dominio CH3, y/o un sitio de unión al receptor Fc gamma dentro de la región N-terminal del dominio CH2, y/o un sitio de unión a C1q dentro de la región N-terminal del dominio CH2.

Según un aspecto específico, el anticuerpo comprende un sitio de unión a FcRn dependiente del pH ubicado en cualquiera de los dominios CH2 y/o CH3. Específicamente, el sitio de unión a FcRn tiene afinidad para unirse a FcRn con una Kd de menos de 10-4 M, o menos de 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, o 10-8 M de manera dependiente del pH.

Específicamente, la afinidad de unión para unirse a FcRn de una manera dependiente del pH está aumentada en al menos 1 log, preferiblemente al menos 2 log o 3 log a pH 5-6 en comparación con la misma afinidad de unión a pH fisiológico (pH 7,4).

De acuerdo con otro aspecto, el anticuerpo se modifica para alterar la unión a FcRn dependiente del pH. Por ejemplo, al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hcpuede modificarse para comprender al menos una mutación en el sitio de unión a FcRn para reducir la unión a FcRn dependiente del pH, específicamente al menos una de las mutaciones H433A o H435A, o ambas mutaciones H433A y H435A, donde la numeración es de acuerdo con el índice UE de Kabat. La reducción de la unión a FcRn dependiente del pH puede ser tal que la afinidad de unión para unirse a FcRn de una manera dependiente del pH sea inferior a 1 log, preferiblemente igual o menor a pH 5-6 en comparación con la misma afinidad de unión a pH fisiológico (pH 7,4).

Mediante dicha modulación de la unión a FcRn, se pueden proporcionar anticuerpos que comprendan sólo el sitio de unión a FcRn de un fragmento Fc (de tipo natural) situado entre la interfase de los dominios CH2 y CH3 C-terminal.

Una realización específica de las variantes CH3^lcy CH3^hcsin el sitio de unión a FcRn dependiente del pH del dominio CH3 nativo se obtiene mediante la introducción de las mutaciones H433A y H435A (numeración según el índice EU de Kabat), que es parte del sitio de unión a FcRn dependiente del pH aportado por la secuencia del dominio CH3 nativo [9], véanse las secuencias en la Fig. 22.

Según un aspecto específico, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico que reconoce específicamente una primera y una segunda diana, que comprende un primer par de cadenas pesadas y ligeras (H1/L1) que incorporan el sitio de unión que reconoce la primera diana, y un segundo par de cadenas pesadas y ligeras (H2/L2) que incorporan el sitio de unión que reconoce la segunda diana.

En particular, cualquiera de los anticuerpos biespecíficos se caracteriza por la unión monovalente a la diana respectiva. Por lo tanto, cada uno de los anticuerpos biespecíficos se caracteriza específicamente por un solo sitio de unión por diana. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico comprende solo un sitio de unión que reconoce una primera diana y solo un sitio de unión que reconoce una segunda diana.

Específicamente, el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, donde la primera diana es CD3 o CD16 y la segunda diana es EGFR.

Las realizaciones específicas se refieren a cualquiera de los anticuerpos abarcados por las reivindicaciones que se ejemplifican en la presente memoria, o que comprenden cualquiera de las cadenas pesadas y ligeras o cualquiera de los pares de cadenas pesadas y ligeras descritos en la sección de Ejemplos. Específicamente, un anticuerpo como se describe en la presente memoria puede comprender o consistir en las cadenas pesada y ligera descritas en la sección de Ejemplos.

Específicamente, el anticuerpo se proporciona para uso médico, diagnóstico o analítico.

La invención proporciona además una preparación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la invención, preferiblemente que comprende una formulación parenteral o mucosa, que contiene opcionalmente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención proporciona además moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo de la invención.

En la presente memoria también se describe un casete de expresión o un plásmido que comprende las moléculas de ácido nucleico de la invención y, opcionalmente, secuencias adicionales para expresar el anticuerpo codificado por la secuencia de ácido nucleico, como las secuencias reguladoras.

Específicamente, el casete de expresión o el plásmido comprende una secuencia codificante para expresar la HC y la LC o más de una HC y más de una LC de un anticuerpo de la invención. Por ejemplo, el anticuerpo comprende dos HC diferentes y dos LC diferentes, y se emplean las secuencias codificantes para las dos HC diferentes y las dos LC diferentes para producir un anticuerpo heterodimérico.

La invención proporciona además una célula huésped de producción que comprende al menos un casete de expresión o un plásmido que incorpora las moléculas de ácido nucleico que codifican un anticuerpo de la invención y secuencias adicionales para expresar la inmunoglobulina.

La invención proporciona además un método para producir un anticuerpo según la invención, donde una célula huésped según la invención se cultiva o se mantiene en condiciones para producir dicho anticuerpo. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para el uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

Figuras

Figura 1:

Figura 1A: Ilustración esquemática de anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios CH3 en uno de los brazos de Fab y tecnología SEED (GA/AG) en los dominios CH3 C-terminales (es decir, el par de dominios CH3^hc/CH3^hc). El dominio SEED GA C-terminal se muestra fusionado con el dominio Fab nativo y el dominio SEED AG C-terminal se muestra fusionado con el Fab con intercambio de dominios CH3. Sin embargo, los Fab nativos o con intercambio de dominios CH3 se pueden fusionar con cualquier dominio SEED C-terminal, por lo que la orientación relativa de los Fab entre el par de dominios CH3^hc/CH3^hctambién podría invertirse (no se ilustra).

1A-1: Tecnología SEED en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por el Botón en la cadena pesada y el Ojal en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-2: Equivalente al ejemplo (1A-1), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por un Ojal en la cadena pesada y un Botón en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-3: Tecnología SEED en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por "direccionamiento electrostático " [7], con las variantes de carga positiva en la cadena pesada y las variantes de carga negativa en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-4: Equivalente al ejemplo (1A-3), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por "direccionamiento electrostático " [7], con las variantes de carga negativa en la cadena pesada y las variantes de carga positiva en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-5: Tecnología SEED en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de la "Cadena A" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena B" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-6: Equivalente al ejemplo (1A-5), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de la "Cadena B" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena A" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-7: Tecnología SEED en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de SEED "AG" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "GA" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1A-8: Equivalente al ejemplo (1A-7), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de SEED "GA" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "AG" en los elementos de la cadena ligera del Fab.

Figura 1B: Ilustración esquemática de anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios CH3 en uno de los brazos de Fab y tecnología "Botón en Ojal" (KiH) en los dominios CH3 C-terminales (es decir, el par de dominios CH3^hc/CH3^hc). El dominio "Botón" C-terminal se muestra fusionado con el dominio Fab nativo y el dominio "Ojal" C-terminal se muestra fusionado con el Fab con intercambio de dominios CH3. Sin embargo, los Fab nativos o con intercambio de dominios CH3 se pueden fusionar con dominios "Botón" u "Ojal" C-terminales, por lo que la orientación relativa de los Fab entre el par de dominios CH3^hc/CH3^hctambién podría invertirse (no se ilustra).

1B-1: Tecnología "Botón en Ojal" en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por elementos Botón en la cadena pesada y Ojal en la cadena ligera del Fab.

1B-2: Equivalente al ejemplo (1B-1), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por elementos Ojal en la cadena pesada y Botón en la cadena ligera del Fab. 1B-3: Tecnología "Botón en Ojal" en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por "direccionamiento electrostático " [7], con las variantes de carga positiva en la cadena pesada y las variantes de carga negativa en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1B-4: Equivalente al ejemplo (1B-3), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por "direccionamiento electrostático " [7], con las variantes de carga negativa en la cadena pesada y las variantes de carga positiva en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1B-5: Tecnología "Botón en Ojal" en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de la "Cadena A" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena B" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1B-6: Equivalente al ejemplo (1B-5), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de la "Cadena B" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena A" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1B-7: Tecnología "Botón en Ojal" en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de SEED "AG" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "GA" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1B-8: Equivalente al ejemplo (1B-7), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de SEED "GA" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "AG" en los elementos de la cadena ligera del Fab.

Figura 1C: Ilustración esquemática de anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios CH3 en uno de los brazos de Fab y tecnología de direccionamiento electrostático (Ref. 7) en los dominios CH3 C-terminales (es decir, el par de dominios CH3^hc/CH3^hc). El dominio C-terminal variante de carga positiva de direccionamiento electrostático [7] se muestra fusionado con el dominio Fab nativo y el dominio C-terminal variante de carga negativa se muestra fusionado con el Fab con intercambio de dominios CH3. Sin embargo, los Fab nativos o con intercambio de dominios CH3 se pueden fusionar con los dominios C-terminales variantes de carga negativa o positiva, por lo que la orientación relativa de los Fab entre el par de dominios CH3^hc/CH3^hctambién podría invertirse (no se ilustra).

1C-1: Tecnología de direccionamiento electrostático en el dominio CH3 C-terminal emparejado con el Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por el Botón en la cadena pesada y el Ojal en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-2: Equivalente al ejemplo (1C-1), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por el Ojal en la cadena pesada y el Botón en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-3: Tecnología de direccionamiento electrostático en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por "direccionamiento electrostático " [7], con las variantes de carga positiva en la cadena pesada y las variantes de carga negativa en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-4: Equivalente al ejemplo (1C-3), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por "direccionamiento electrostático" [7], con las variantes de carga negativa en la cadena pesada y las variantes de carga positiva en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-5: Tecnología de direccionamiento electrostático en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por las variantes de la "Cadena A" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena B" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-6: Equivalente al ejemplo (1C-5), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de la "Cadena B" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena A" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-7: Tecnología de direccionamiento electrostático en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de SEED "AG" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "GA" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1C-8: Equivalente al ejemplo (1C-7), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de SEED "GA" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "AG" en los elementos de la cadena ligera del Fab.

Figura 1D: Ilustración esquemática de anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios CH3 en uno de los brazos de Fab y tecnología de dominios variantes modificados de tipo "Cadena A" y "Cadena B" (Von Kreudenstein, Ref. 8) en los dominios CH3 C-terminales (es decir, el par de dominios CH3^hc/CH3^hc). El dominio variante de Cadena A [8] C-terminal se muestra fusionado con el dominio Fab nativo y el dominio variante de Cadena B [8] C-terminal se muestra fusionado con el Fab con intercambio de dominios CH3. Sin embargo, los Fab nativos o con intercambio de dominios CH3 se pueden fusionar con dominios variantes C-terminales de Cadena A o de Cadena B, por lo que la orientación relativa de los Fab entre el par de dominios CH3^hc/CH3^hctambién podría invertirse (no se ilustra).

1D-1: Tecnología de dominios variantes de cadena A y de cadena B [8] en dominios CH3 C-terminales emparejados con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por el Botón en la cadena pesada y el Ojal en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1D-2: Equivalente al ejemplo (1D-1), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por un Ojal en la cadena pesada y un Botón en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1D-3: Tecnología de dominios variantes de cadena A y cadena B [8] en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por "direccionamiento electrostático" [7], con las variantes de carga positiva en la cadena pesada y las variantes de carga negativa en los elementos de la cadena ligera del Fab.

1D-4: Equivalente al ejemplo (1 D-3), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por "direccionamiento electrostático" [7], con las variantes de carga negativa en la cadena pesada y las variantes de carga positiva en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1D-5: Tecnología de dominios variantes de Cadena A y de Cadena B [8] en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de la "Cadena A" [8] en la cadena pesada y variantes de la "Cadena B" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1D-6: Equivalente al ejemplo (1D-5), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de la "Cadena B" (Ref. 8) en la cadena pesada y variantes de la "Cadena A" en los elementos de la cadena ligera del Fab.

1D-7: Tecnología de dominios variantes de la cadena A y la cadena B [8] en el dominio CH3 C-terminal emparejado con un Fab con intercambio de dominios CH3 compuesto por variantes de SEED "AG" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "GA" en los elementos de la cadena ligera del Fab. 1D-8: Equivalente al ejemplo (1 D-7), pero con un Fab con intercambio de dominios compuesto por variantes de SEED "GA" [2] en la cadena pesada y variantes de SEED "AG" en los elementos de la cadena ligera del Fab.

Figura 2:

Figura 2A: Caracterización de anticuerpos biespecíficos heterodiméricos con intercambio de dominios mediante SDS-PAGE no reductora. La SDS-PAGE se tiñó con el kit de tinción Azul Coloidal (Invitrogen). Carril 1: anticuerpo 1 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios en condiciones no reductoras (intercambio de dominios de Fab en la CH3AG-cadena pesada). Carril 2: anticuerpo 2 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios en condiciones no reductoras (intercambio de dominios de Fab en la CH3GA-cadena pesada). Carril 3: anticuerpo 3 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios en condiciones no reductoras (que contiene el brazo de Fab con intercambio de dominios CH3 de t.n. en la CH3GA-cadena pesada). Carril 4: estándar de proteína Marcador de peso molecular preteñido SeeBlue Plus 2 (Invitrogen).

Figura 2B: Perfil de SEC del anticuerpo 1 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios (véanse los Ejemplos 1 y 2).

Figura 2C: Perfil de SEC del anticuerpo 2 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios (véanse los Ejemplos 1 y 2).

Figura 2D: Perfil de SEC del anticuerpo 3 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios (véanse los Ejemplos 1 y 2).

Figura 3:

Figura 3A: Caracterización del anticuerpo 1 biespecífico con intercambio de dominios (BsAb1) por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras. La SDS-PAGE se tiñó con el kit de tinción Azul Coloidal (Invitrogen). Carril 1: patrón de proteínas marcador de peso molecular preteñido SeeBlue Plus 2 (Invitrogen). Carril 2: El perfil de SDS-PAGE reductora muestra la banda H1 que corresponde a VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2), la banda H2 que corresponde a VH(2)-c H1-CH2-c H3^ga(SEQ ID 4) y la banda L1+l2 que corresponde a VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (S^eQ ID 1) y ^vL(2)-CL (SEQ ID 3). Carril 3: El perfil de SDS-PAGE no reductora muestra la banda principal que corresponde al anticuerpo BsAb1 biespecífico con intercambio de dominios.

Figura 3B: Perfil de SEC del anticuerpo BsAb1 biespecífico con intercambio de dominios.

Figura 4: Análisis FACS del anticuerpo BsAb1 biespecífico con intercambio de dominios.

Figura 5: Ilustración esquemática de anticuerpos de un brazo, que contienen el dominio Fab sin modificar o el intercambio de dominios CH3 en el brazo de Fab fusionado con el dominio de SEED AG.

Figura 6:

Fig. 6A: Caracterización de anticuerpos de un brazo, que contienen el dominio Fab sin modificar o el Fab con intercambio de dominios CH3, mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras. La SDS-PAGE se tiñó con el kit de tinción Azul Coloidal (Invitrogen). Carril 1: Patrón de proteínas marcador de peso molecular preteñido SeeBlue Plus 2 (Invitrogen). Carril 2: El perfil en condiciones no reductoras muestra el anticuerpo de un brazo de la banda principal que corresponde al anticuerpo sin modificar (Fab CH1/CL). Carril 3: El perfil en condiciones no reductoras muestra el anticuerpo de un brazo de la banda principal que corresponde al anticuerpo Fab con intercambio de dominios. Carril 4: El perfil en condiciones reductoras muestra la banda H1 que corresponde a VH(1)-CH1-CH2-CH3^ag(SEQ ID 11), la banda H2 que corresponde a huFc-GA SEED (SEQ ID 9) y la banda L1 que corresponde a VL(1)-CL (SEQ ID 10). Carril 5: El perfil en condiciones reductoras muestra la banda H1 que corresponde a VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(S^eQ ID 2), la banda H2 que corresponde a huFc-GA SEED (SEQ ID 9) y la banda L1 que corresponde a VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1).

Figura 6B: Perfil de SEC de anticuerpos de un brazo que contienen dominios CH1/CL sin modificar en el Fab o Fab con intercambio de dominios usando un par de dominios afines CH3-KiH en el brazo de Fab (véase el Ejemplo 6).

Figura 7: Unión al antígeno de anticuerpos de un brazo (Fab sin modificar y Fab con intercambio de dominios) y BsAb1 a células positivas para EGFR (células A431). La unión celular se midió por citometría de flujo. Los anticuerpos se analizaron en diluciones en serie (1:3) y la unión se detectó utilizando un anticuerpo secundario F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con ficoeritrina. Las mediciones se realizaron por duplicado.

Figura 8:

Figura 8A: Caracterización del BsAb2 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR) mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras. La SDS-PAGE se tiñó con el kit de tinción Azul Coloidal (Invitrogen). Carril 1: Patrón de proteínas marcador de peso molecular preteñido SeeBlue Plus 2, (Invitrogen). Carril 2: El perfil en condiciones reductoras muestra la banda H1 que corresponde a VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2), la banda H2 que corresponde a VH(3)-CH1-c H2-CH3^ga(SEQ ID 13), la banda L1 que corresponde a VL(3)-CL (SeQ ID 12) y la banda L2 que corresponde a VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1). Carril 3: el perfil en condiciones no reductoras muestra la banda principal que corresponde al BsAb2 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR).

Figura 8B: Perfil de SEC del BsAb2 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR).

Figura 9: Análisis mediante LC-MS del anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR). Las muestras se desglicosilaron con PNGasa antes de la medición. El espectro desconvolucionado de la suma da la masa del anticuerpo biespecífico ensamblado correctamente.

Figura 10: Análisis mediante LC-MS del anticuerpo biespecífico BsAb2 con intercambio de dominios (CH3-KÍH anti-CD16 x anti-EGFR). Las muestras se desglicosilaron con PNGasa antes de la medición. El espectro desconvolucionado de la suma da la masa del anticuerpo biespecífico ensamblado correctamente.

Figura 11: Determinación de la masa total del anticuerpo de un brazo sin modificar coexpresado con 2 cadenas ligeras competidoras mediante LC-MS. Solo se encontraron anticuerpos ensamblados correctamente. No se pudo detectar el mAb mal emparejado (posición de la masa potencial mal emparejada marcada con flechas).

Figura 12: Determinación de la masa total del anticuerpo de un brazo con intercambio de dominios coexpresado con 2 cadenas ligeras competidoras mediante LC-MS. Solo se encontraron anticuerpos ensamblados correctamente. No se pudo detectar el mAb mal emparejado (posición de la masa potencial mal emparejada marcada con flechas).

Figura 13: Perfiles de DSC de anticuerpos biespecíficos BsAb1 y BsAb2 con intercambio de dominios.

Figura 14: Unión de anticuerpos al receptor CD16a. La unión se midió utilizando el ensayo de unión celular CD16a HTRF (CisBio). La medición se realizó por duplicado.

Figura 15: Lisis redirigida de células A431 por células efectoras en presencia de los anticuerpos biespecíficos BsAb1 (A) y BsAb2 (B) con intercambio de dominios.

Figura 16: Caracterización biofísica de anticuerpos con intercambio de dominios con una región Fab modificada alternativamente mediante SDS-PAGE y SEC no reductora de un anticuerpo anti-EGFR SEED de un brazo (A y C) y de un anticuerpo con intercambio de dominios (anti-CD3 x anti-EGFR-CH3) (B y D). Las proteínas se produjeron en células Expi293 y se purificaron en una sola etapa con proteína A. Cada carril del gel de SDS-PAGE se cargó con 5 gg de proteína y las proteínas se tiñeron con el kit de tinción Azul Coloidal (Invitrogen) después de la separación. La variante 1 y la variante 2 se indican con 1 y 2 en la SDS-PAGE. Los perfiles de SEC de las variantes 1 se muestran con líneas negras y las variantes 2 con líneas discontinuas (véase el Ejemplo 13 para más detalles).

Figura 17: Unión a EGFR de anticuerpos de un brazo con brazos de Fab con intercambio de dominios alternativamente de las variantes 1 (A) y las variantes 2 (B) medido por citometría de flujo. Los anticuerpos se analizaron en diluciones en serie (1:3) y la unión se detectó usando un anticuerpo F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con ficoeritrina. Cada punto de datos representa el promedio de los duplicados.

Figura 18: Lisis redirigida de células diana por células T activadas en presencia de anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios con dominios Fab modificados alternativamente (variante 1). Las células T se activaron con IL-2 e IgG anti-CD3 en el medio de cultivo durante 24 h. Las células T estimuladas se cocultivaron con células A431 a una proporción E:T de 10:1 en presencia de los anticuerpos probados en diluciones en serie (1:4) durante 18 h. La lisis celular (liberación de LDH) se midió en el sobrenadante utilizando el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (Promega). Cada punto de datos es la media ± DE de los triplicados. Como comparación, se usó BsAb1 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) de los ejemplos anteriores.

Figura 19: Caracterización de anticuerpos KiH de un brazo con intercambio de dominios. Estas moléculas, como se ilustra en una figura esquemática (A), se produjeron en células Expi293 y después de la purificación de la proteína A se analizaron mediante SEC (B). Los perfiles de SEC de las variantes 1 se muestran con líneas negras y los de las variantes 2 con líneas discontinuas.

Figura 20: Unión a EGFR de anticuerpos KiH de un brazo con la región Fab modificada alternativamente de las variantes 1 (A) y las variantes 2 (B) medida por citometría de flujo. Los anticuerpos se analizaron en diluciones en serie (1:3) y se detectó la unión del antígeno a las células A431 utilizando un anticuerpo F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con ficoeritrina. Cada punto de datos representa una sola medición.

Figura 21: Ilustración esquemática mediante algunos ejemplos de la variedad de anticuerpos que se formarán mediante la unión de Fab con intercambio de dominios CH3 a diferentes posiciones de un anticuerpo y en combinaciones con cadenas pesadas heterodiméricas modificadas. Los Fab con intercambio de dominios CH3 se pueden unir a diferentes posiciones de un anticuerpo nativo o a un par de cadenas pesadas heterodiméricas modificadas. Como se ilustra en los ejemplos, se puede usar una variedad de dominios CH3 modificados para formar las cadenas pesadas heterodiméricas o para formar los Fab con intercambio de dominios CH3 (no se ilustran todas las opciones).

21-1: Anticuerpo biespecífico tetravalente compuesto por un anticuerpo Ig nativo con Fabs N-terminales compuestos por dominios VH1-CH1/VL1-CL emparejados combinado con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por VH2-CH3 (Botón) y VL2-CH3 (Ojal), con el extremo N-terminal de VH2-CH3 (botón) unido al extremo C-terminal del anticuerpo nativo.

21-2: Anticuerpo biespecífico tetravalente compuesto por un anticuerpo Ig nativo con un Fab N-terminal compuesto por dominios VH1-CH1/VL1-CL emparejados combinado con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por VH2-CH3 (Ojal) y VL2-CH3 (Botón), con el extremo N-terminal de VL2-CH3 (Botón) unido al extremo C-terminal del anticuerpo nativo.

21-3: Anticuerpo biespecífico, bivalente en el extremo N-terminal y monovalente en el extremo C-terminal compuesto por cadenas pesadas heterodiméricas ensambladas con tecnología SEED con Fabs N-terminales unidos a cada cadena pesada compuesta por dominios VH1-CH1/VL1-CL emparejados combinados con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por VH2-CH3 (Botón) y VL2-CH3 (Ojal), con el extremo N-terminal de VH2-CH3 (Botón) unido al extremo C-terminal de solo una de las cadenas pesadas de SEED.

21-4: Anticuerpo biespecífico, bivalente en el extremo C-terminal y monovalente en el extremo N-terminal, compuesto por cadenas pesadas heterodiméricas ensambladas con tecnología SEED con un Fab N-terminal unido a solo una de las cadenas pesadas SEED compuestas por dominios VH1-CH1/VL1-CL emparejados combinado con un Fab con intercambio de dominios CH3 de tipo botón en ojal compuesto por VH2-CH3 (Botón) y VL2-CH3 (Ojal), con el extremo N-terminal de VH2-CH3 (Botón) unido al extremo C-terminal de ambas cadenas pesadas de SEED.

21-5: Anticuerpo triespecífico, bivalente en el extremo N-terminal y con 2 dominios Fab monovalentes diferentes en el extremo C-terminal compuestos por cadenas pesadas heterodiméricas ensambladas con tecnología SEED con Fabs N-terminales unidos a cada cadena pesada compuesta por dominios VH1-CH1/VL1-CL emparejados combinados con un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por VH2-CH3 (Botón) y VL2-CH3 (Ojal) con el extremo N-terminal de VH2-CH3 (Botón) unido al extremo C-terminal del dominio SEED GA y un Fab con intercambio de dominios de tipo botón en ojal de CH3 compuesto por VH3-CH3 (Botón) y VL3-CH3 (Ojal) con el extremo N-terminal de VL3-CH3 (Ojal) unido al extremo C-terminal del dominio SEED AG.

Figura 22: Secuencias polipeptídicas de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios:

Los dominios variables son los caracteres en cursiva. La secuencia con intercambio de dominios CH3 está subrayada. Los dominios SEED CH3-GA y SEED CH-AG están marcados en negrita. Las mutaciones introducidas que forman botones, ojales u otras variantes diseñadas para promover la heterodimerización de los dominios CH3 (descritas en los ejemplos de algunas de las posibles realizaciones específicas) se resaltan en gris y se subrayan.

SEQ ID 1: VL(1)-CH3_HOLE (Y407T)

SEQ ID 2: VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 3: VL(2)-CL

SEQ ID 4: VH(2)-CH1-CH2-CH3^ga

SEQ ID 5: VH(2)-CH1-CH2-CH3^ag

SEQ ID 6: VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ga

SEQ ID 7: VL(1)-CH3wt

SEQ ID 8: VH(1)-CH3wt-CH2-CH3GA

SEQ ID 9: huFc_GA SEED

SEQ 10: VL(1)-CL

SEQ 11: VH(1 )-CH1-CH2-CH3^ag

SEQ ID 12: VL(3)-CL

SEQ ID 13: VH(3)-CH1-CH2-CH3^ga

SEQ ID 14: VH(3)-CH1-CH2-CH3^ag

SEQ ID 15: VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2^en-CH3^ag

SEQ ID 16: huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA

SEQ ID 17: VH(3)-CH1-CH2^en-CH3^ga

SEQ ID 18: VH(1)-CH3_KNOB (T366W)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 19: VL(1)-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 20: VH(1)-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 21: VL(1)-CH3_KNOB (T366W)

SEQ ID 22: VH(1)-CH3 (E356K, D399K)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 23: VL(1)-CH3 (K392D, K409D)

SEQ ID 24: VH(1)-CH3 (K392D, K409D)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 25: VL(1)-CH3 (E356K, D399K)

SEQ ID 26: VH(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 27: VL(1)-CH3 (T350V, T366L, K392L, T394W)

SEQ ID 28: VH(1)-CH3 (T350V, T366L, K392L, T394W)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 29: VL(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)

SEQ ID 30: VH(1)-CH3_SEED (AG)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 31: VL(1)-CH3_SEED (GA)

SEQ ID 32: VH(1)-CH3_SEED (GA)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 33: VL(1)-CH3_SEED (AG)

SEQ ID 34: VH(1)-CH3 (E356K, D399K)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 35: VH(1)-CH3 (K392D, K409D)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 36: VH(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 37: VH(1)-CH3 (T350V, T366L, K392L, T394W)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 38: VH(1)-CH3_SEED (AG)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 39: VH(1)-CH3_SEED (GA)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 40: huFc_KNOB (T366W)

Secuencias de aminoácidos de dominios CH3 humanos.

SEQ ID 41: CH3 de IgG1 humana

SEQ ID 42: CH3 de IgG2 humana

SEQ ID 43: CH3 de IgG3 humana

SEQ ID 44: CH3 de IgG4 humana

SEQ ID 45: CH3 de IgA humana

SEQ ID 46: CH3 de IgM humana

SEQ ID 47: CH3 de IgE humana

SEQ ID 48: CH3 de IgD humana

Secuencias de aminoácidos utilizadas como ejemplos de secuencias de transición que flanquean el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de los dominios intercambiados dentro de los elementos de la cadena ligera y pesada de Fab con intercambio de dominios.

SEQ ID 49: cadena Ckappa humana, 108-111 (numeración EU de Kabat)

SEQ ID 50: cadena pesada de IgG1 humana, 345-348 (numeración EU de Kabat)

SEQ ID 51: cadena pesada de IgG1 humana, 438-444 (numeración EU de Kabat)

SEQ ID 52: región J de VH humana, 109-113 (numeración EU de Kabat)

SEQ ID 53: dominio CH1 humano, 118-122 (numeración EU de Kabat)

Descripción detallada

El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, se define como polipéptidos de unión al antígeno que son inmunoglobulinas o moléculas similares a inmunoglobulinas, u otras proteínas que exhiben formatos de anticuerpos modulares, p. ej. compuestos por uno o más dominios de anticuerpos y que tienen propiedades de unión al antígeno similares a las inmunoglobulinas o anticuerpos, en particular proteínas que pueden exhibir propiedades de unión mono-, bi- o multi-específicas, o mono-, bi- o multi-valentes, p. ej. al menos dos sitios de unión específicos para epítopos, p. ej., de antígenos, moléculas efectoras o estructuras, específicamente de origen patógeno o de estructura humana, como autoantígenos que incluyen proteínas asociadas a células o proteínas séricas. Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan en la presente memoria de manera intercambiable.

Un anticuerpo normalmente consiste en o comprende dominios de anticuerpo, que se entienden como dominios constantes y/o variables de las cadenas pesadas y/o ligeras de las inmunoglobulinas, con o sin una secuencia conectora. Se entiende específicamente que los anticuerpos consisten en o comprenden combinaciones de dominios de anticuerpos variables y/o constantes con o sin una secuencia conectora o región bisagra, incluidos pares de dominios de anticuerpos variables, como uno o dos pares VH/VL. Los polipéptidos se entienden como dominios de anticuerpos, si comprenden una estructura de barril beta que consiste en al menos dos cadenas beta de una estructura de dominio de anticuerpo conectadas por una secuencia de bucle. Los dominios de anticuerpos pueden tener una estructura nativa o modificada mediante mutagénesis o derivatización, p. ej. para modificar las propiedades de unión al antígeno o cualquier otra propiedad, como la estabilidad o las propiedades funcionales, como la unión a los receptores de Fc FcRn y/o al receptor Fc-gamma.

El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, incluye específicamente los anticuerpos de longitud completa, incluidos los anticuerpos de estructuras similares a las inmunoglobulinas, tales como los anticuerpos con intercambio de dominios. Específicamente, un anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, p. ej. de tipo IgG (por ejemplo, un subtipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE o IgM.

El término incluye además los derivados o las combinaciones de anticuerpos con dominios de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

La expresión "anticuerpo de longitud completa" puede usarse para referirse a cualquier molécula de anticuerpo que comprende al menos la mayor parte del dominio Fc, que incluye específicamente un dímero de cadenas pesadas, produciendo así al menos un par CH3^hc/CH3^hc, y otros dominios que se encuentran comúnmente en las estructuras de los anticuerpos naturales. Esta expresión "anticuerpo de longitud completa" se usa en la presente memoria para enfatizar que una molécula de anticuerpo particular no es un fragmento de anticuerpo.

De acuerdo con esto, un anticuerpo se entiende típicamente como una proteína (o complejo proteico) que incluye uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como los genes de las regiones variables de las inmunoglobulinas. Las cadenas ligeras (LC) se clasifican como kappa o lambda. Las cadenas pesadas (HC) se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente.

HC o LC se componen cada uno de al menos dos dominios conectados entre sí para producir una cadena de dominios. Se entiende específicamente que una HC de anticuerpo incluye un dominio de anticuerpo VH y al menos un dominio de anticuerpo unido en posición C-terminal al VH. Una LC de anticuerpo incluye un dominio de anticuerpo VL y al menos un dominio de anticuerpo unido en posición C-terminal al VL.

La definición incluye además dominios de las cadenas pesada y ligera de la región variable (como dAb, Fd, VI, Vk, Vh, VHH) y la región constante o dominios individuales de un anticuerpo intacto como CH1, CH2, CH3, CH4, CI y Ck, así como minidominios que consisten en al menos dos cadenas beta de un dominio de inmunoglobulina conectadas por un bucle estructural. Normalmente, una inmunoglobulina que tiene un sitio de unión al antígeno a través de una estructura de CDR específica puede unirse a un antígeno diana a través de los bucles de CDR de un par de dominios VH/VL.

El término "anticuerpo" incluirá específicamente anticuerpos o inmunoglobulinas en forma aislada, que están sustancialmente libres de otros anticuerpos o inmunoglobulinas dirigidos contra diferentes antígenos diana y/o que comprenden una disposición estructural diferente de dominios de anticuerpos. Aun así, un anticuerpo aislado puede estar comprendido en una preparación de combinación, que contiene una combinación del anticuerpo aislado, p. ej. con al menos otro anticuerpo, como anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpos que tienen diferentes especificidades.

El término "anticuerpo" se aplicará a los anticuerpos o inmunoglobulinas de origen animal, incluidas las especies humanas, como los mamíferos, incluidos los humanos, murinos, conejos, cabras, llamas, vacas y caballos, o aves, como gallinas, término que incluirá en particular inmunoglobulinas recombinantes que se basan en una secuencia de origen animal, p. ej. secuencias humanas.

El término "anticuerpo" se aplica específicamente a los anticuerpos humanos.

Se entiende que el término "humano", como se usa con respecto a un anticuerpo o inmunoglobulina, incluye los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Un anticuerpo humano puede incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR. Los anticuerpos humanos incluyen los anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas.

Un anticuerpo humano preferiblemente se selecciona o deriva del grupo que consiste en IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM.

Un anticuerpo murino preferiblemente se selecciona o deriva del grupo que consiste en IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 e IgM.

El término "anticuerpo" se aplica además a inmunoglobulinas o anticuerpos quiméricos, p. ej. anticuerpos quiméricos, con secuencias de origen de diferentes especies, tales como secuencias de origen murino y humano.

El término "quimérico", como se usa con respecto a una inmunoglobulina o un anticuerpo, se refiere a aquellas moléculas en las que una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera es homóloga a las secuencias correspondientes en las inmunoglobulinas derivadas de una especie particular o que pertenecen a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias correspondientes en otra especie o clase. Normalmente, la región variable de las cadenas ligera y pesada imita las regiones variables de las inmunoglobulinas derivadas de una especie de mamífero, mientras que las porciones constantes son homólogas a las secuencias de inmunoglobulinas derivadas de otra. Por ejemplo, la región variable puede derivarse de fuentes actualmente conocidas utilizando células B fácilmente disponibles o hibridomas de organismos huéspedes no humanos en combinación con regiones constantes derivadas, por ejemplo, de preparaciones de células humanas.

El término "anticuerpo" puede aplicarse además a inmunoglobulinas o anticuerpos humanizados.

El término "humanizado", como se usa con respecto a un anticuerpo o inmunoglobulina, se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno que deriva sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, donde la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender dominios variables completos fusionados en dominios constantes o solo las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) injertadas en regiones estructurales apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo natural o modificados, p. ej. mediante una o más sustituciones de aminoácidos, preferiblemente modificadas para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de inmunoglobulinas humanizadas conservan todas las secuencias de las CDR (por ejemplo, un anticuerpo de ratón humanizado que contiene las seis CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR que están alteradas con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo" se aplica además a los anticuerpos monoclonales o policlonales, específicamente un anticuerpo recombinante, término que incluye todos los anticuerpos y estructuras de anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como los anticuerpos que se originan de animales, p. ej. mamíferos, incluido el ser humano, que comprenden genes o secuencias de diferente origen, p. ej. anticuerpos quiméricos, humanizados o anticuerpos derivados de hibridomas. Otros ejemplos se refieren a los anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, o los anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria recombinante de anticuerpos o dominios de anticuerpos, o los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de las secuencias genéticas del anticuerpo a otras secuencias de ADN.

Se entiende que el término "anticuerpo" incluye las variantes funcionalmente activas de anticuerpos nuevos o existentes, p. ej. de origen natural. Se entiende además que el término variante de un anticuerpo, en particular las variantes de moléculas similares a anticuerpos, o variantes de anticuerpos, también incluirá los derivados de tales moléculas. Un derivado es cualquier combinación de uno o más anticuerpos y/o una proteína de fusión en la que puede fusionarse cualquier dominio o minidominio del anticuerpo en cualquier posición con una o más proteínas, como otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, pero también con ligandos, enzimas, toxinas y similares. Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden usarse específicamente como polipéptidos aislados o como moléculas combinadas, p. ej. mediante técnicas de recombinación, fusión o conjugación, con otros péptidos o polipéptidos. Los péptidos son preferiblemente homólogos a las secuencias de los dominios de inmunoglobulinas, y preferiblemente tienen una longitud de al menos 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 10 o incluso al menos 50 o 100 aminoácidos, y constituyen al menos parcialmente la región de bucles del dominio de inmunoglobulina.

También se puede obtener un derivado del anticuerpo por asociación o unión a otras sustancias mediante diversas técnicas químicas, como acoplamiento covalente, interacción electrostática, enlaces disulfuro, etc. Las otras sustancias unidas a las inmunoglobulinas pueden ser lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas e inorgánicas o cualquier combinación de las mismas (por ejemplo, PEG, profármacos o fármacos). Un derivado también comprendería un anticuerpo con la misma secuencia de aminoácidos, pero elaborado total o parcialmente a partir de aminoácidos no naturales o modificados químicamente. En una realización específica, el anticuerpo es un derivado que comprende una etiqueta adicional que permite una interacción específica con un compuesto biológicamente aceptable. No existe una limitación específica con respecto a la etiqueta utilizable, siempre que no tenga un impacto negativo tolerable sobre la unión de la inmunoglobulina a su diana. Los ejemplos de etiquetas adecuadas incluyen la etiqueta His, etiqueta Myc, etiqueta FLAG, etiqueta Strep, etiqueta Calmodulina, etiqueta GST, etiqueta MBP y etiqueta S. En otra realización específica, la inmunoglobulina es un derivado que comprende un marcador. El término "marcador", como se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con la inmunoglobulina para generar un anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí mismo, p. ej. marcadores de radioisótopos o marcadores fluorescentes, o, en el caso de un marcador enzimático, pueden catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Un derivado de un anticuerpo, p. ej., deriva de un anticuerpo o secuencia de anticuerpo original, como una secuencia de unión al antígeno original (p. ej., CDR) o secuencia estructural (FR), p. ej. mutantes o variantes obtenidas, p. ej., in ^síI^íco o mediante ingeniería recombinante o bien mediante derivatización química o síntesis.

El término "variantes", como se usa en la presente memoria, incluirá específicamente cualquier "mutante", "homólogo" o "derivado" como se describe en la presente memoria. El término "variante" incluirá específicamente las variantes funcionalmente activas. Las variantes funcionales de un anticuerpo descrito en la presente memoria son particularmente funcionales con respecto a la unión al antígeno y la dimerización de la LC y la HC, formando así un par de dominios CH3^lc/CH3^hc.

El término "variante" se referirá en particular a anticuerpos, tales como anticuerpos mutantes o fragmentos de anticuerpos, p. ej. obtenidos mediante métodos de mutagénesis, en particular para eliminar, intercambiar, introducir insertos en una secuencia o región de aminoácidos de un anticuerpo específico o para derivatizar químicamente una secuencia de aminoácidos, p. ej. en los dominios constantes para modificar la estabilidad del anticuerpo, la función efectora o la vida media, o en los dominios variables para mejorar las propiedades de unión al antígeno, p. ej. mediante técnicas de maduración por afinidad disponibles en la técnica. Puede emplearse cualquiera de los métodos de mutagénesis conocidos, incluidas las mutaciones puntuales en las posiciones deseadas, p. ej. obtenidas mediante técnicas de aleatorización. En algunos casos, las posiciones se eligen al azar, p. ej. con cualquiera de los posibles aminoácidos o una selección de aminoácidos preferidos para aleatorizar las secuencias de los anticuerpos. El término "mutagénesis" se refiere a cualquier método reconocido en la técnica para alterar una secuencia polinucleotídica o polipeptídica. Los tipos preferidos de mutagénesis incluyen la mutagénesis mediante PCR propensa a errores, mutagénesis mediante saturación u otra mutagénesis dirigida.

La expresión "variantes funcionales", también denominada en la presente memoria "variante funcionalmente activa", puede incluir, p. ej., una secuencia resultante de la modificación de una secuencia original (p. ej., de un anticuerpo original) por inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos, o derivatización química de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos, o nucleótidos en la secuencia de nucleótidos, o en uno o ambos extremos distales de la secuencia, p. ej. en una secuencia de CDR o FR, y cuya modificación no afecta, en particular perjudica, a la actividad de esta secuencia. En el caso de que un sitio de unión tenga especificidad hacia un antígeno diana seleccionado, la variante funcionalmente activa de un anticuerpo aún tendría la especificidad de unión predeterminada, aunque esto podría cambiarse, p. ej. para cambiar la especificidad fina hacia un epítopo específico, la afinidad, la avidez, la tasa Kon o Koff, etc. Por ejemplo, un anticuerpo madurado por afinidad se entiende específicamente como un anticuerpo variante funcionalmente activo. Por tanto, la secuencia de CDR modificada en un anticuerpo madurado por afinidad se entiende como una variante funcionalmente activa.

La actividad funcional está determinada preferentemente por la estructura y función de la variante en comparación con una molécula original, p. ej. en un ensayo para determinar la especificidad de unión a un antígeno diana y/o la vida media in vivo requerida de la molécula y/o la unión a FcRn de forma dependiente del pH, por ejemplo, determinada en un ensayo estándar midiendo la funcionalidad de la inmunoglobulina.

La actividad funcional de un anticuerpo en términos de unión al antígeno generalmente se determina en un ensayo ELISA, un ensayo BIAcore, un ensayo Octet BLI o un ensayo basado en FACS cuando el antígeno se expresa en la superficie celular.

Pueden obtenerse variantes funcionalmente activas, p. ej. cambiando la secuencia de un anticuerpo original, p. ej. un anticuerpo monoclonal que tiene una estructura nativa específica de una inmunoglobulina, tal como una estructura de IgG1, para obtener una variante que tiene la misma especificidad para reconocer un antígeno diana, pero que tiene una estructura que difiere de la estructura original, p. ej. para modificar cualquiera de los dominios de inmunoglobulina para introducir mutaciones específicas, para producir construcciones biespecíficas o para producir un fragmento de la molécula original.

Por lo general, una inmunoglobulina o secuencia original puede modificarse para producir variantes que incorporen mutaciones dentro de una región de la secuencia además del sitio de unión al antígeno, o dentro del sitio de unión, que no perjudique la unión al antígeno y, preferiblemente, que tenga una actividad biológica similar al anticuerpo original, incluida la capacidad de unirse a un antígeno, p. ej. sustancialmente con la misma actividad biológica, según lo determinado por un ensayo de unión específica o una prueba funcional para seleccionar como diana el antígeno.

La expresión "sustancialmente la misma actividad biológica", como se usa en la presente memoria, se refiere a la actividad indicada por sustancialmente la misma actividad, que es de al menos el 20 %, al menos el 50 %, al menos el 75 %, al menos el 90 %, p. ej. al menos el 100 %, o al menos el 125 %, o al menos el 150 %, o al menos el 175 %, o, p. ej., hasta el 200 % de la actividad determinada para el anticuerpo comparable u original.

Las variantes preferidas, tal como se describen en la presente memoria, son funcionalmente activas con respecto a la unión al antígeno, y preferiblemente tienen una potencia para unirse específicamente al antígeno individual, y no se unen significativamente a otros antígenos que no sean antígenos diana, p. ej. con una diferencia de valor de Kd de al menos 2 logaritmos, preferentemente al menos 3 logaritmos. La unión al antígeno por una variante funcionalmente activa normalmente no se ve afectada, y corresponde sustancialmente a aproximadamente la misma afinidad de unión que el anticuerpo o secuencia original, o el anticuerpo que comprende una variante de secuencia, p. ej. con una diferencia de valor de Kd de menos de 2 logs, preferiblemente menos de 3 logs, sin embargo, con la posibilidad de una afinidad incluso mejorada, p. ej. con una diferencia de valor de Kd de al menos 1 log, preferiblemente de al menos 2 log.

Las variantes funcionales específicas, tal como se describen en la presente memoria, son anticuerpos con intercambio de dominios, en particular, variantes funcionales que comprenden uno o más dominios CH3HET modificados, que comprenden una o más mutaciones puntuales para mejorar la formación de dímeros CH3HET/CH3HET.

En una realización preferida, la variante funcionalmente activa de un anticuerpo original

a) es un fragmento biológicamente activo del anticuerpo, y el fragmento comprende al menos el 50% de la secuencia de la molécula, preferiblemente al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 95%, y lo más preferiblemente al menos el 97%, 98% o 99%;

b) deriva del anticuerpo mediante al menos una sustitución, adición y/o eliminación de un aminoácido, donde la variante funcionalmente activa tiene una identidad de secuencia con la molécula o parte de ella, como un anticuerpo con al menos un 50% de identidad de secuencia, preferentemente al menos el 60%, más preferentemente al menos el 70%, más preferentemente al menos el 80%, aún más preferentemente al menos el 90%, incluso más preferentemente al menos el 95% y lo más preferentemente al menos el 97%, 98% o 99%; y/o

c) consiste en el anticuerpo o una variante funcionalmente activa del mismo y adicionalmente al menos un aminoácido o nucleótido heterólogo respecto del polipéptido o la secuencia de nucleótidos.

En una realización preferida descrita en la presente memoria, la variante funcionalmente activa del anticuerpo descrito en la presente memoria es esencialmente idéntica a la variante descrita anteriormente, pero difiere de su polipéptido o la secuencia de nucleótidos, respectivamente, en que deriva de una secuencia homóloga de una especie diferente. Estos se denominan variantes o análogos naturales.

La expresión "variante funcionalmente activa" también incluye las variantes alélicas de origen natural, así como los mutantes o cualquier otra variante de origen no natural. Como se conoce en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de un (poli)péptido que se caracteriza por tener una sustitución, deleción o adición de uno o más aminoácidos que no altera esencialmente la función biológica del polipéptido.

Las variantes funcionalmente activas pueden obtenerse mediante alteraciones de secuencia en la secuencia polipeptídica o nucleotídica, p. ej. mediante una o más mutaciones puntuales, en las que las alteraciones de la secuencia retienen o mejoran una función de la secuencia polipeptídica o nucleotídica inalterada, cuando se usan en combinación como se describe en la presente memoria. Dichas alteraciones de secuencia pueden incluir, pero sin limitación, sustituciones, adiciones, deleciones, mutaciones e inserciones (conservativas).

Las variantes funcionalmente activas específicas son variantes de CDR. Una variante de CDR incluye una secuencia de aminoácidos modificada por al menos un aminoácido en la región de CDR, donde dicha modificación puede ser una alteración química o parcial de la secuencia de aminoácidos, cuya modificación permite que la variante conserve las características biológicas de la secuencia sin modificar. Una alteración parcial de la secuencia de aminoácidos de CDR puede ser por deleción o sustitución de uno a varios aminoácidos, p. ej. 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o por adición o inserción de uno a varios aminoácidos, p. ej. 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o por una derivatización química de uno a varios aminoácidos, p. ej. 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o una combinación de las mismas. Las sustituciones en los residuos de aminoácidos pueden ser sustituciones conservativas, por ejemplo, al sustituir un aminoácido hidrofóbico por un aminoácido hidrofóbico alternativo.

Las sustituciones conservativas son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por sus cadenas laterales y propiedades químicas. Los ejemplos de tales familias son los aminoácidos con cadenas laterales básicas, con cadenas laterales ácidas, con cadenas laterales alifáticas apolares, con cadenas laterales aromáticas apolares, con cadenas laterales polares sin carga, con cadenas laterales pequeñas, con cadenas laterales grandes, etc.

Una mutación puntual se entiende particularmente como la modificación de un polinucleótido que da como resultado la expresión de una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos sin modificar por la sustitución o intercambio, deleción o inserción de uno o más aminoácidos individuales (no consecutivos) o dobletes de aminoácidos por aminoácidos diferentes.

Las mutaciones puntuales preferidas se refieren al intercambio de aminoácidos de la misma polaridad y/o carga. En este sentido, los aminoácidos se refieren a los veinte aminoácidos naturales codificados por los sesenta y cuatro codones triples. Estos 20 aminoácidos se pueden dividir en aquellos que tienen cargas neutras, cargas positivas y cargas negativas:

Los aminoácidos "neutros" se muestran a continuación junto con su respectivo código de tres letras y de una sola letra y polaridad:

Alanina: (Ala, A) apolar, neutra;

Asparagina: (Asn, N) polar, neutra;

Cisteína: (Cys, C) apolar, neutra;

Glutamina: (Gln, Q) polar, neutra;

Glicina: (Gly, G) apolar, neutra;

Isoleucina: (Ile, I) apolar, neutra;

Leucina: (Leu, L) apolar, neutra;

Metionina: (Met, M) apolar, neutra;

Fenilalanina: (Phe, F) apolar, neutra;

Prolina: (Pro, P) apolar, neutra;

Serina: (Ser, S) polar, neutra;

Treonina: (Thr, T) polar, neutra;

Triptófano: (Trp, W) apolar, neutro;

Tirosina: (Tyr, Y) polar, neutra;

Valina: (Val, V) apolar, neutra; y

Histidina: (His, H) polar, positiva (10%) neutra (90%).

Los aminoácidos cargados "positivamente" son:

Arginina: (Arg, R) polar, positiva; y

Lisina: (Lys, K) polar, positiva.

Los aminoácidos cargados "negativamente" son:

Ácido aspártico: (Asp, D) polar, negativo; y

Ácido glutámico: (Glu, E) polar, negativo.

El "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de anticuerpos se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica específica, después de alinear la secuencia e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias que se comparan.

Se entiende específicamente que una variante de anticuerpo incluye los homólogos, análogos, fragmentos, modificaciones o variantes con un patrón de glicosilación específico, p. ej. los producidos mediante glicoingeniería, que son funcionales y pueden servir como equivalentes funcionales, p. ej. uniéndose a las dianas específicas y con propiedades funcionales. Un anticuerpo o dominio de anticuerpo CH3 puede estar glicosilado o sin glicosilar. Por ejemplo, un anticuerpo recombinante como se describe en la presente memoria puede expresarse en una célula de mamífero apropiada para permitir una glicosilación específica de la molécula determinada por la célula huésped que expresa la inmunoglobulina.

La expresión "lámina beta" o "cadena beta" de un dominio de anticuerpo, en particular de un dominio de anticuerpo constante tal como un dominio CH3, se entiende en la presente memoria de la siguiente manera. Un dominio de anticuerpo consta típicamente de al menos dos cadenas beta conectadas lateralmente por al menos dos o tres enlaces de hidrógeno del esqueleto, formando una lámina plegada generalmente retorcida. Una cadena beta es un único tramo continuo de aminoácidos de una longitud típica de 3 a 10 aminoácidos que adopta una conformación extendida e involucrada en los enlaces de hidrógeno del esqueleto con al menos otra cadena, de modo que forman una lámina beta. En la lámina beta, la mayoría de las cadenas beta están dispuestas adyacentes a otras cadenas y forman una extensa red de enlaces de hidrógeno con sus vecinas, en la que los grupos N-H del esqueleto de una cadena establecen enlaces de hidrógeno con los grupos C=O del esqueleto de las cadenas adyacentes.

La estructura de los dominios constantes de anticuerpos, como los dominios CH2 o CH3, es similar a la de los dominios variables, y consisten en cadenas beta conectadas por bucles, algunas de las cuales contienen tramos cortos de hélices alfa. La estructura es en su mayoría rígida y los bucles son comparativamente más flexibles, como se puede ver a partir de los factores b de varias estructuras cristalinas de Fc. Un dominio CH3 de anticuerpo tiene normalmente siete cadenas beta que forman una lámina beta (A-B-C-D-E-F-G), donde las cadenas beta están unidas a través de bucles, tres bucles están ubicados en la punta C-terminal del dominio CH3 (A-B, C-D, E-F), y otros tres bucles están ubicados en la punta N-terminal del dominio CH3 (B-C, D-E, F-G). Una "región de bucle" de un dominio CH3 se refiere a la porción de la proteína ubicada entre las regiones de cadenas beta (por ejemplo, cada dominio CH3 comprende siete láminas beta, A a G, orientadas desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal).

Preferiblemente un par de dominios CH3, como el dímero CH3^het/CH3^het, se produce conectando una superficie de unión que involucra las cadenas A, B y E, en la presente memoria también denominada región de lámina beta de un primer CH3 que se pone en contacto con la región de lámina beta de un segundo CH3 para producir un dímero.

Un "dominio CH3" se entiende en la presente memoria específicamente como un polipéptido obtenido a partir de un dominio CH3 de un anticuerpo, tal como un fragmento Fc de un anticuerpo. El fragmento Fc puede ser de IgG, IgA, IgD, IgE o IgM. Específicamente, el dominio CH3 como se describe en la presente memoria puede comprender una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo IgG1 humano (identificada como SEQ ID 41), un anticuerpo IgG2 humano (identificada como SEQ ID 42), un anticuerpo IgG3 humano (identificada como SEQ ID 43), o un anticuerpo IgG4 humano (identificada como SEQ ID 44), o un anticuerpo IgA humano (identificada como SEQ ID 45), o un anticuerpo IgM humano (identificada como SEQ ID 46), o un anticuerpo IgE humano (identificada como SEQ ID 47), o un anticuerpo IgD humano (identificada como SEQ ID 48), o una variante funcional de la misma, p. ej. con cierta identidad de secuencia.

En una realización descrita en la presente memoria, el dominio CH3 puede comprender mutaciones, p. ej. puede tener al menos una parte de una o más cadenas beta reemplazadas con secuencias heterólogas, para incluir una o más mutaciones puntuales, p. ej. mutaciones de tipo botón u ojal.

Las mutaciones de tipo botón específicas son una o más sustituciones de aminoácidos para aumentar la superficie de contacto entre dos dominios mediante la incorporación de uno o más aminoácidos que proporcionan una protuberancia adicional de una estructura de cadena beta, p. ej. una o más mutaciones de botón de CH3 seleccionadas del grupo que consiste en T366Y, T366W, T394W, F405A. Una modificación específica de botón denota la mutación T366W en el dominio CH3 de un anticuerpo (numeración según el índice EU de Kabat). Las mutaciones de botón proporcionan específicamente una superficie coincidente (afín) para unirse a otro dominio de anticuerpo, p. ej. que se modifica para incorporar mutaciones de tipo ojal.

Las mutaciones de tipo ojal específicas son una o más sustituciones de aminoácidos para aumentar la superficie de contacto entre dos dominios mediante la incorporación de uno o más aminoácidos que proporcionan una cueva adicional de una estructura de cadena beta, p. ej. una o más mutaciones de ojal de CH3 seleccionadas del grupo que consiste en T366S, L368A y Y407V. Una modificación específica de ojal denota cualquiera de las mutaciones T366S, L368A, Y407V, Y407T en el dominio CH3 de un anticuerpo (numeración según el índice EU de Kabat). Las mutaciones de ojal proporcionan específicamente una superficie coincidente (afín) para unirse a otro dominio de anticuerpo, p. ej. que se modifica para incorporar mutaciones de tipo botón.

Las mutaciones coincidentes de tipo botón en ojal son, p. ej., T366Y en un dominio CH3 y la Y407'T coincidente en el segundo dominio CH3 del par de dominios CH3, denominado en la presente memoria T366Y/Y407'T. Otras mutaciones coincidentes son

T366Y/Y407'T,

F405A/T394'W,

T366Y:F405A/T394'W:Y407'T,

T366W/Y407'A, y/o

S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407'V.

Las mutaciones específicas de CH3 incluyen un intercambio de cadenas beta intermolecular, p. ej. donde uno o más segmentos o secuencias dentro de una cadena beta de CH3 están mutados para incorporar segmentos o secuencias de dominios de anticuerpos que difieren del dominio CH3 original, p. ej. de dominios de anticuerpos de un tipo o subtipo diferente. Los mutantes específicos se obtienen por intercambio de cadenas, donde un dominio CH3 de tipo IgG incorpora uno o más segmentos o secuencias de un dominio CH3 de tipo IgA. Si los dominios CH3 intercambiados de dos cadenas se mutan para formar un par afín, los segmentos o secuencias de IgA de cada uno de los dominios CH3 producen una superficie de contacto entre dominios que es afín, de modo que los dominios CH3 mutados se emparejan preferentemente entre sí sobre un dominio CH3 de tipo natural. Los ejemplos específicos de tales modificaciones de dominios de anticuerpos para incorporar un intercambio de segmentos pueden ser dominios modificados mediante intercambio de cadenas (SEED). Dichas modificaciones pueden usarse para producir inmunoglobulinas asimétricas y biespecíficas, en particular anticuerpos biespecíficos emparejando preferentemente los dominios CH3 modificados con SEED de las cadenas pesadas. Esto se basa en el intercambio de secuencias de inmunoglobulinas estructuralmente relacionadas dentro de los dominios CH3 conservados. Las secuencias alternas de IgA e IgG humanas en los dominios CH3 SEED generan dos dominios asimétricos pero complementarios, denominados AG y GA. El diseño de SEED permite la generación eficiente de heterodímeros AG/GA, mientras que desfavorece la homodimerización de los dominios CH3 SEED AG y GA.

Las mutaciones específicas de CH3 incluyen la incorporación de residuos de cisteína que son capaces de formar puentes disulfuro para estabilizar un dominio de anticuerpo mediante un puente disulfuro intradominio adicional, o un par de dominios de anticuerpo mediante un puente disulfuro interdominio adicional. Los enlaces disulfuro generalmente se forman a partir de la oxidación de los grupos tiol de dos cisteínas, uniendo así los átomos de S para formar un puente disulfuro entre los dos residuos de cisteína. Específicamente, la cisteína se puede insertar (mediante un aminoácido adicional o una sustitución de aminoácido) en la región C-terminal o en el extremo C-terminal de un dominio CH3. Un par de CH3 que llevan la modificación de cisteína adicional se puede estabilizar mediante la formación de enlaces disulfuro entre el par de CH3, produciendo así un dímero CH3/CH3. En algunas realizaciones, la inmunoglobulina o los dominios de inmunoglobulina unidos por disulfuro comprenden homodímeros o heterodímeros, por lo tanto, pares de dominios iguales o diferentes.

Para permitir el emparejamiento adecuado de las cadenas o dominios de inmunoglobulinas, cualquiera de las mutaciones de CH3 puede emplearse específicamente, p. ej. la tecnología de botón en ojal, la tecnología SEED, la tecnología de repulsión de cargas, el enlace disulfuro o la tecnología de mAb cruzado se pueden utilizar para reducir la cantidad de moléculas no asociadas correctamente.

Un "par" de dominios de anticuerpos, p. ej. un par de dominios CH3, se entiende como un conjunto de dos dominios de anticuerpos, donde uno tiene un área en su superficie o en una cavidad que se une específicamente y, por lo tanto, es complementario a un área en el otro. Los dominios de inmunoglobulinas, en particular los dominios de anticuerpos, pueden asociarse para formar un par de dominios de inmunoglobulina a través del contacto de una región de la lámina beta. Dicho par de dominios también se denomina dímero, que está asociado, p. ej. por interacción electrostática, fusión recombinante o enlace covalente, colocando dos dominios en asociación física directa, p. ej. tanto en forma sólida como líquida. En la presente memoria se describe específicamente un dímero CH3/CH3 que puede ser un par de dominios CH3 que consisten en la misma estructura primaria, secundaria y terciaria, p. ej. la misma secuencia de aminoácidos, es decir, un "homodímero", o un par de dominios CH3 que difieren en cualquiera de las estructuras primaria, secundaria y terciaria, p. ej. que difieren en la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones de bucles o de cadena beta. Se pueden producir heterodímeros específicos para formar un par afín de dominios CH3/CH3.

El término "afín", con respecto a un par de dominios o dímero de dominios, se entiende como los dominios que tienen un punto o estructura de unión coincidente para obtener una superficie de contacto en cada uno de los dominios con los que preferentemente se forma un par de dichos dominios. Los dominios CH3 específicos se entienden como "afines" o un par afín de dominios CH3/CH3, si al menos uno de los dominios CH3 se modifica para unirse preferentemente a su pareja de unión de CH3 afín para producir el par CH3/CH3. Específicamente, ambos dominios CH3 pueden modificarse mediante mutaciones coincidentes, p. ej. mutaciones de tipo botón en ojal, mutaciones de tipo SEED, residuos de cisteína adicionales para la formación de puentes disulfuro o modificaciones que emplean la tecnología de repulsión de cargas.

El término "heterólogo", con respecto a un dominio de anticuerpo que se incorpora a una inmunoglobulina, p. ej. un dominio CH3 heterólogo, en la presente memoria también denominado CH3^het, se entiende que abarca un dominio CH3 exógeno incorporado en un anticuerpo o HC o LC de anticuerpo. Una inmunoglobulina que está modificada para incorporar un dominio CH3^hetsustituyendo un dominio de inmunoglobulina existente o de origen natural, p. ej. un dominio CL, CH1 o CH2 de la estructura de la inmunoglobulina original, se entiende en la presente memoria como una inmunoglobulina "con intercambio de dominios". Dicha inmunoglobulina con intercambio de dominios puede modificarse adicionalmente para producir variantes funcionales, p. ej. fragmentos, mutantes o prolongaciones de aminoácidos, p. ej. adiciones de dominios.

El término "exógeno", en el contexto de partes de moléculas, como aminoácidos, secuencias de aminoácidos o dominios de inmunoglobulinas, se refiere a las partes recién introducidas que pueden ser naturales, pero exógenas para el sitio de modificación, o variantes (funcionales) de dichas partes naturales, o bien pueden ser sustitutos de partes naturales.

"Exógeno", con referencia al dominio CH3, significa que el dominio CH3 es de un origen diferente y/o del mismo origen (por ejemplo, del mismo tipo o subtipo, y/o la misma especie), pero difiere en su posición en las moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, un CH3^hetadicional de la misma especie y tipo o subtipo de inmunoglobulina se coloca en una posición distinta del dominio de anticuerpo C-terminal de un Fc. Se entiende que cualquier dominio CH3 colocado en una parte del Fab de un anticuerpo es un CH3^het. Por lo general, tal Fab incluiría un par de CH3^het/CH3^het, y cada CH3^hetestaría unido de manera N-terminal a un dominio variable. Los ejemplos específicos de CH3^heten una HC están unidos en el extremo C-terminal a cualquier otro dominio de anticuerpo, p. ej. un dominio constante, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en CH2, CH3 y CH4. De este modo, se pueden producir nuevas HC y/o LC incorporando un dominio CH3^het. Específicamente, se pueden producir nuevos pares de HC/HC y/o HC/LC que comprenden un par CH3^het/CH3^het, preferiblemente un par afín de CH3^het/CH3^het.

Se describe específicamente en la presente memoria que el dominio CH3^hetempleado en el anticuerpo descrito en la presente memoria es un dominio no inmunitario. Se entiende específicamente que tal dominio CH3 no inmunitario no comprende un sitio de unión al antígeno en la región de bucles. Un dominio CH3 no comprendería naturalmente ninguna región de bucles CDR o sitio de unión al antígeno, por lo tanto, un dominio CH3 de tipo natural se entiende como un dominio no inmunitario. Algunas técnicas de ingeniería de anticuerpos permiten la incorporación de un sitio de unión al antígeno en la región de bucles de un dominio constante, como un dominio CH3. Dicha región de bucles de un dominio constante se denomina "región de bucles estructurales" que emplea la unión de un antígeno mediante uno o más bucles de un dominio constante. En contraste con dicho dominio CH3 "inmunitario" que puede unirse a un antígeno a través de la interacción con la región de bucles estructurales, el dominio CH3^hetcomo se usa en la presente memoria es un dominio no inmunitario, por lo tanto, no comprende dicho sitio de unión al antígeno en la región de bucles estructurales.

Un anticuerpo que comprende CH3^heten una posición distinta del contexto CH2-CH3 de una parte Fc de un anticuerpo, en particular una inmunoglobulina con intercambio de dominios, comprende específicamente un nuevo tipo de enlace, al menos un nuevo enlace en posición N-terminal a otro dominio, proporcionando así una nueva estructura en la interfase de dos dominios. La secuencia conectora preferida es una secuencia conectora natural, una secuencia terminal obtenida a partir de secuencias conectoras de dominios naturales, p. ej. secuencias bisagra, o de dominios unidos de forma natural de una estructura de inmunoglobulina de origen natural, p. ej. la región de aminoácidos C-terminal de 1 -20, o 2-10, o 3-8 aminoácidos de longitud obtenida de un dominio de anticuerpo que está naturalmente unido al extremo N-terminal del dominio CH3^het, p. ej. se puede usar la región C-terminal de un dominio CH2 como un conector que se conecta al extremo N-terminal o al dominio CH3 que se elimina por la región N-terminal de 1-20, o 2-10, o 3-8 aminoácidos de longitud para proporcionar una secuencia de CH3 acortada en el extremo N-terminal. Alternativamente, se puede usar como conector una secuencia artificial funcionalmente adecuada. Específicamente, el extremo N-terminal del dominio CH3HET puede ser el extremo N-terminal natural, o el extremo N-terminal de la secuencia de CH3 acortada o prolongada en el extremo N-terminal, que está unida al extremo C-terminal del segundo dominio acortado o prolongando en el extremo C-terminal.

El término "multivalente", con respecto a un anticuerpo como se describe en la presente memoria, se referirá a una molécula que tiene al menos dos sitios de unión para unirse al mismo antígeno diana, uniéndose específicamente a los mismos o diferentes epítopos de tal antígeno diana. El término incluirá los anticuerpos bivalentes o las moléculas con 2 o más valencias para unirse al antígeno diana, p. ej. a través de al menos 2, 3, 4 o incluso más sitios de unión. Por ejemplo, un anticuerpo bivalente puede tener dos sitios de unión al antígeno a través de dos pares de dominios VH/VL, ambos uniéndose al mismo antígeno diana.

El término "multiespecífico", con respecto a un anticuerpo como se describe en la presente memoria, se referirá a una molécula que tiene al menos dos sitios de unión que se unen específicamente a al menos dos antígenos diana diferentes. El término incluirá los anticuerpos biespecíficos o las moléculas con 2 o más especificidades para unirse a más de un antígeno diana, p. ej. a través de al menos 2, 3, 4 o incluso más sitios de unión. Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico puede unirse a un antígeno diana a través de un par de dominios VH/VL (región Fv) y a otro antígeno diana mediante un segundo par de dominios VH/VL (región Fv).

El término "antígeno" o "diana", tal como se usa en la presente memoria, incluirá en particular todos los antígenos y moléculas diana capaces de ser reconocidos por un sitio de unión de un anticuerpo. Los antígenos específicamente preferidos seleccionados como diana por la molécula descrita en la presente memoria son aquellos antígenos o moléculas que ya se ha demostrado que son o pueden ser inmunológicos o terapéuticamente relevantes, especialmente aquellos para los que se ha probado la eficacia clínica. El término "diana" o "antígeno", como se usa en la presente memoria, comprenderá en particular las moléculas seleccionadas del grupo que consiste en receptores asociados a tumores (humanos o de otros animales) y los antígenos asociados a tumores solubles, que son autoantígenos, tales como receptores ubicados en la superficie de células tumorales o citoquinas o factores de crecimiento que están abundantemente presentes en la circulación de los pacientes con cáncer y asociados a dicho tumor. Otros antígenos pueden ser de origen patógeno, p. ej. patógenos microbianos o virales.

El antígeno diana se reconoce como una molécula diana completa o como un fragmento de dicha molécula, especialmente las subestructuras, p. ej. una estructura polipeptídica o de carbohidrato de la diana, generalmente denominada "epítopos", p. ej. epítopos de células B, epítopos de células T), que son inmunológicamente relevantes, es decir, también son reconocibles por los anticuerpos naturales o monoclonales. El término "epítopo", como se usa en la presente memoria, se referirá en particular a una estructura molecular que puede constituir completamente un compañero de unión específico o ser parte de un compañero de unión específico para un sitio de unión de una inmunoglobulina descrita en la presente memoria. El término epítopo también puede referirse a los haptenos. Químicamente, un epítopo puede estar compuesto por un carbohidrato, un péptido, un ácido graso, una sustancia orgánica, bioquímica o inorgánica o derivados de los mismos y cualquier combinación de los mismos. Si un epítopo es un polipéptido, normalmente incluirá al menos 3 aminoácidos, preferiblemente de 8 a 50 aminoácidos, y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 20 aminoácidos en el péptido. No existe un límite superior crítico para la longitud del péptido, que podría comprender casi la longitud total de una secuencia polipeptídica de una proteína. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o conformacionales. Un epítopo lineal está compuesto de un solo segmento de una secuencia primaria de una cadena polipeptídica o carbohidrato. Los epítopos lineales pueden ser contiguos o superpuestos. Los epítopos conformacionales se componen de aminoácidos o carbohidratos reunidos por el plegamiento del polipéptido para formar una estructura terciaria, y los aminoácidos no están necesariamente adyacentes entre sí en la secuencia lineal. Específicamente, los epítopos son al menos parte de moléculas relevantes para el diagnóstico, es decir, la ausencia o presencia de un epítopo en una muestra se correlaciona cualitativa o cuantitativamente con una enfermedad o con el estado de salud de un paciente o con el estado de un proceso en la fabricación o con el estado ambiental y alimentario. Los epítopos también pueden ser al menos parte de moléculas terapéuticamente relevantes, es decir, moléculas que pueden ser seleccionadas como diana por el dominio de unión específico, lo que cambia el curso de la enfermedad.

Como se usa en la presente memoria, el término "especificidad" o "unión específica" se refiere a una reacción de unión que determina el ligando afín de interés en una población heterogénea de moléculas. Por lo tanto, en las condiciones designadas (p. ej., las condiciones de un inmunoensayo), la inmunoglobulina se une a su diana particular y no se une en una cantidad significativa a otras moléculas presentes en una muestra. La unión específica significa que la unión es selectiva en términos de identidad de la diana, afinidad o avidez de unión alta, media o baja, según se seleccione. La unión selectiva normalmente se logra si la constante de unión o la dinámica de unión es al menos 10 veces diferente, preferiblemente la diferencia es al menos 100 veces, y más preferiblemente al menos 1000 veces.

La expresión "región de unión variable", también denominada "región CDR", como se usa en la presente memoria, se refiere a moléculas con estructuras variables capaces de interacciones de unión con los antígenos. Esas moléculas pueden usarse como tales o integrarse dentro de una proteína más grande, formando así una región específica de dicha proteína con una función de unión. Las estructuras variables pueden derivarse de repertorios naturales de proteínas de unión tales como inmunoglobulinas o anticuerpos. Las estructuras variables también pueden producirse mediante técnicas de aleatorización, en particular las descritas en la presente memoria. Estas incluyen las regiones CDR o no CDR mutagenizadas (por ejemplo, regiones de bucles estructurales de los dominios constantes de los anticuerpos), regiones de bucles de los dominios variables o dominios constantes de las inmunoglobulinas, en particular bucles de CDR de las inmunoglobulinas. Típicamente, las estructuras de unión de la inmunoglobulina descrita en la presente memoria están formadas por tales regiones de unión variables.

El término "citotóxico" o "actividad citotóxica", como se usa para el propósito descrito en la presente memoria, se referirá a cualquier molécula específica dirigida contra antígenos celulares que, cuando se une al antígeno, activa la muerte celular programada y desencadena la apoptosis. Las inmunoglobulinas específicas son eficaces por su actividad sobre las células efectoras, que da como resultado la activación de las células T citotóxicas o las células que median en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o la fagocitosis celular (ADCP). Los anticuerpos específicos eliminan las células diana recubiertas de anticuerpos mediante la inducción de la muerte celular programada por la apoptosis y/o mediante la unión a los receptores de Fc de las células efectoras que median en la actividad de ADCC y/o CDC.

Un anticuerpo descrito en la presente memoria puede exhibir una función efectora de Fc. El Fc puede reclutar el complemento y ayudar a la eliminación de un antígeno diana o de una célula diana mediante la unión a un antígeno de superficie mediante la formación de inmunocomplejos.

Los anticuerpos pueden diseñarse para incorporar modificaciones para aumentar las funciones efectoras de Fc, en particular para mejorar la actividad de la ADCC y/o la CDC.

Dichas modificaciones pueden efectuarse mediante mutagénesis, p. ej. mutaciones en el sitio de unión al receptor Fcgamma o mediante derivados o agentes para interferir con la actividad de la ADCC y/o la CDC de un formato de anticuerpo, para lograr un aumento de la función efectora de Fc.

La expresión "sitio de unión al antígeno" o "sitio de unión" se refiere a la parte de un anticuerpo que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y/o ligera ("L"), o los dominios variables de las mismas. Tres tramos muy divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesadas y ligeras, denominados "regiones hipervariables", se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como regiones estructurales. El sitio de unión al antígeno proporciona una superficie que es complementaria a la superficie tridimensional de un epítopo o antígeno unido, y las regiones hipervariables se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR". El sitio de unión incorporado en las CDR también se denomina en la presente memoria "sitio de unión de CDR".

El término "expresión" se entiende de la siguiente manera. Las moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia codificante deseada de un producto de expresión tal como, p. ej., un anticuerpo como se describe en la presente memoria, y las secuencias de control tales como, p. ej., un promotor unido de manera operable, pueden usarse con fines de expresión. Los huéspedes transformados o transfectados con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para efectuar la transformación, el sistema de expresión puede incluirse en un vector; sin embargo, el ADN relevante también puede integrarse en el cromosoma huésped. Específicamente, el término se refiere a una célula huésped y un vector compatible en condiciones adecuadas, p. ej. para la expresión de una proteína codificada por ADN exógeno transportado por el vector e introducido en la célula huésped.

El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos particular para un polipéptido o proteína particular tal como, p. ej., un anticuerpo. El ADN promotor es una secuencia de ADN que inicia, regula o de otro modo media o controla la expresión del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes, y pueden ser del mismo organismo o de organismos diferentes. Los vectores de clonación recombinantes a menudo incluirán uno o más sistemas de replicación para la clonación o la expresión, uno o más marcadores para la selección en el huésped, p. ej. resistencia a antibióticos, y uno o más casetes de expresión.

Los "vectores" usados en la presente memoria se definen como secuencias de ADN que se requieren para la transcripción de secuencias de nucleótidos recombinantes clonadas, es decir, de genes recombinantes y la traducción de su ARNm en un organismo huésped adecuado.

Un "casete de expresión" se refiere a una secuencia codificante de ADN o un segmento de ADN que codifica un producto de expresión que se puede insertar en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción del casete están modificados para asegurar la inserción del casete en el marco de lectura adecuado. Generalmente, el ADN exógeno se inserta en uno o más sitios de restricción del vector de ADN, y luego el vector lo transporta a una célula huésped junto con el vector de ADN transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o añadido, como un vector de expresión, también puede denominarse "construcción de ADN".

Los vectores de expresión comprenden el casete de expresión y, además, generalmente comprenden un origen para la replicación autónoma en las células huésped o un sitio de integración en el genoma, uno o más marcadores seleccionables (p. ej., un gen de síntesis de aminoácidos o un gen que confiere resistencia a antibióticos como zeocina, kanamicina, G418 o higromicina), una serie de sitios de escisión para enzimas de restricción, una secuencia promotora adecuada y un terminador de la transcripción, cuyos componentes están unidos entre sí de forma operable. El término "vector", como se usa en la presente memoria, incluye secuencias de nucleótidos que se replican de forma autónoma, así como secuencias de nucleótidos que se integran en el genoma. Un tipo común de vector es un "plásmido", que generalmente es una molécula autónoma de ADN bicatenario que puede aceptar fácilmente ADN adicional (exógeno) y que puede introducirse fácilmente en una célula huésped adecuada. Un vector plasmídico contiene a menudo ADN codificante y ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN exógeno. Específicamente, el término "vector" o "plásmido" se refiere a un vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN (p. ej., un gen exógeno) en una célula huésped, para transformar al huésped y promover la expresión (p. ej., la transcripción y traducción) de la secuencia introducida.

La expresión "célula huésped", como se usa en la presente memoria, se referirá a las células objetivo primarias transformadas para producir una proteína recombinante particular, tal como un anticuerpo como se describe en la presente memoria, y cualquier descendencia de las mismas. Debe entenderse que no toda la progenie es exactamente idéntica a la célula original (debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas o a diferencias en el entorno), sin embargo, dicha progenie alterada está incluida en estos términos, siempre que la progenie conserve la misma funcionalidad que la de la célula originalmente transformada. La expresión "línea celular huésped" se refiere a una línea celular de células huésped tal como se usa para expresar un gen recombinante para producir polipéptidos recombinantes tales como anticuerpos recombinantes. La expresión "línea celular", como se usa en la presente memoria, se refiere a un clon establecido de un tipo de célula particular que ha adquirido la capacidad de proliferar durante un período de tiempo prolongado. Dicha célula huésped o línea celular huésped puede mantenerse en cultivo celular y/o cultivarse para producir un polipéptido recombinante.

El término "aislado" o "aislamiento", tal como se usa en la presente memoria con respecto a un ácido nucleico, un anticuerpo u otro compuesto, se referirá a dicho compuesto que ha sido suficientemente separado del entorno con el que estaría asociado de forma natural, de modo que exista en forma "sustancialmente pura". "Aislado" no significa necesariamente la exclusión de mezclas artificiales o sintéticas con otros compuestos o materiales, o la presencia de impurezas que no interfieren con la actividad fundamental, y que pueden estar presentes, por ejemplo, debido a una purificación incompleta. En particular, las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención también pretenden incluir aquellas sintetizadas químicamente.

Con referencia a los ácidos nucleicos de la invención, a veces se usa la expresión "ácido nucleico aislado". Esta expresión, cuando se aplica al ADN, se refiere a una molécula de ADN que se separa de las secuencias con las que está inmediatamente contigua en el genoma natural del organismo donde se originó. Por ejemplo, un "ácido nucleico aislado" puede comprender una molécula de ADN insertada en un vector, tal como un plásmido o vector viral, o integrada en el ADN genómico de una célula procariota o eucariota u organismo huésped. Cuando se aplica al ARN, la expresión "ácido nucleico aislado" se refiere principalmente a una molécula de ARN codificada por una molécula de ADN aislada como se definió anteriormente. Alternativamente, el término puede referirse a una molécula de ARN que ha sido suficientemente separada de otros ácidos nucleicos con los que estaría asociada en su estado natural (es decir, en células o tejidos). Un "ácido nucleico aislado" (ya sea ADN o ARN) puede representar además una molécula producida directamente por medios biológicos o sintéticos y separada de otros componentes presentes durante su producción.

Con referencia a los polipéptidos o las proteínas, como las inmunoglobulinas aisladas, el término "aislado" se referirá específicamente a compuestos que están libres o sustancialmente libres del material con el que están asociados de forma natural, como otros compuestos con los que se encuentran en su entorno natural o el entorno donde se preparan (p. ej., cultivo celular) cuando dicha preparación se practica mediante tecnología de ADN recombinante in vitro o in vivo. Los compuestos aislados se pueden formular con diluyentes o adyuvantes y aun así aislarse con fines prácticos; por ejemplo, los polipéptidos o polinucleótidos se pueden mezclar con vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables cuando se usan en el diagnóstico o la terapia.

El término "recombinante", como se usa en la presente memoria, significará "preparado por o como resultado de la ingeniería genética". Alternativamente, se utiliza el término "modificado". Por ejemplo, una inmunoglobulina modificada o un dominio de inmunoglobulina puede modificarse para producir una variante manipulando la secuencia original respectiva para producir una inmunoglobulina o dominio modificado. Un huésped recombinante comprende específicamente un vector de expresión o un vector de clonación, o ha sido diseñado genéticamente para contener una secuencia de ácido nucleico recombinante, en particular empleando una secuencia de nucleótidos exógena para el huésped. Una proteína recombinante se produce expresando un ácido nucleico recombinante respectivo en un huésped. La expresión "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente memoria, incluye las inmunoglobulinas y, en particular, los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como (a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulinas humanas o un hibridoma preparado a partir de ellos, (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, p. ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria recombinante de anticuerpos humanos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulinas humanas con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos recombinantes comprenden los anticuerpos modificados para incluir reordenamientos y mutaciones que ocurren, por ejemplo, durante la maduración del anticuerpo.

Una vez que se identifican los anticuerpos con la estructura deseada, dichos anticuerpos se pueden producir mediante métodos muy conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, las técnicas de hibridomas o la tecnología de ADN recombinante.

En el método de hibridomas, se inmuniza un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster, para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Luego, los linfocitos se fusionan con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma.

El medio de cultivo donde crecen las células de hibridoma se analiza para determinar la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferiblemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Los anticuerpos monoclonales recombinantes se pueden producir, por ejemplo, aislando el ADN que codifica las cadenas de anticuerpos requeridas y transfectando una célula huésped recombinante con las secuencias codificantes para la expresión, usando vectores de expresión recombinantes muy conocidos, p. ej. los plásmidos descritos en la presente memoria o casetes de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de los anticuerpos. Las células huésped recombinantes pueden ser células procariotas y eucariotas, como las descritas anteriormente.

Según un aspecto específico, la secuencia de nucleótidos puede utilizarse para la manipulación genética para humanizar el anticuerpo o para mejorar la afinidad u otras características del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede modificarse para parecerse más a las regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune, si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia del anticuerpo para obtener una mayor afinidad hacia el antígeno diana. Será evidente para un experto en la técnica que se pueden realizar uno o más cambios de polinucleótidos en el anticuerpo y todavía mantener su capacidad de unión al antígeno diana.

La producción de moléculas de anticuerpo, por diversos medios, se comprende bien en general. La patente US 6331415 (Cabilly et al.), por ejemplo, describe un método para la producción recombinante de anticuerpos donde las cadenas pesadas y ligeras se expresan simultáneamente desde un solo vector o desde dos vectores separados en una sola célula. Wibbenmeyer et al., (1999, Biochim Biophys Acta 1430(2):191 -202) y Lee y Kwak (2003, J. Biotechnology 101:189-198) describen la producción de anticuerpos monoclonales a partir de cadenas pesadas y ligeras producidas por separado, utilizando plásmidos expresados en cultivos separados de E. ^coI^í. Se proporcionan otras técnicas relevantes para la producción de anticuerpos, por ejemplo, en Harlow, et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).

Los anticuerpos monoclonales se producen utilizando cualquier método que produzca moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Los ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los métodos de hibridomas de Kohler et al. (1975, Nature 256:495-497) y el método del hibridoma de células B humanas (Kozbor, 1984, J. Immunol. 133:3001; y Brodeur et al., 1987, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, (Marcel Dekker, Inc., Nueva York), págs. 51-63).

El anticuerpo como se describe en la presente memoria puede usarse para la administración para tratar a un sujeto que lo necesite.

El término "sujeto", como se usa en la presente memoria, se referirá a un mamífero de sangre caliente, particularmente a un ser humano o un animal no humano. Por lo tanto, el término "sujeto" también puede referirse particularmente a animales que incluyen perros, gatos, conejos, caballos, vacas, cerdos y aves de corral. En particular, el anticuerpo descrito en la presente memoria se proporciona para el uso médico para tratar a un sujeto o paciente que necesita profilaxis o tratamiento de una enfermedad. El término "paciente" incluye los sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico. Por lo tanto, el término "tratamiento" pretende incluir tanto el tratamiento profiláctico como el terapéutico.

Específicamente, el anticuerpo descrito en la presente memoria se proporciona en una forma sustancialmente pura. La expresión "sustancialmente puro" o "purificado", como se usa en la presente memoria, se referirá a una preparación que comprende al menos un 50 % (p/p), preferiblemente al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de un compuesto, como una molécula de ácido nucleico o un anticuerpo. La pureza se mide mediante métodos apropiados para el compuesto (por ejemplo, métodos cromatográficos, electroforesis en gel de poliacrilamida, análisis mediante HPLC y similares).

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", utilizada en la presente memoria de forma intercambiable con cualquiera de las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad suficiente" de un compuesto, p. ej. una inmunoglobulina descrita en la presente memoria, es una cantidad o actividad suficiente para, cuando se administra al sujeto, obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos los resultados clínicos y, como tal, una cantidad eficaz o sinónimo de la misma depende del contexto donde se aplique.

Se pretende que una cantidad eficaz signifique la cantidad de un compuesto que es suficiente para tratar, prevenir o inhibir dichas enfermedades o trastornos. En el contexto de la enfermedad, las cantidades terapéuticamente eficaces de la inmunoglobulina como se describe en la presente memoria se usan específicamente para tratar, modular, atenuar, revertir o afectar una enfermedad o afección que se beneficia de la interacción del anticuerpo con su antígeno diana.

La cantidad del compuesto que corresponderá a tal cantidad efectiva variará dependiendo de varios factores, tales como el fármaco o compuesto concreto, la formulación farmacéutica, la vía de administración, el tipo de enfermedad o trastorno, la identidad del sujeto o huésped a tratar, y similares, pero que, sin embargo, puede ser determinada de forma rutinaria por un experto en la técnica.

El anticuerpo de la invención puede usarse específicamente en una composición farmacéutica. Por lo tanto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo como se describe en la presente memoria y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas se pueden administrar de acuerdo con la presente invención como una inyección rápida o una infusión o mediante infusión continua. Los vehículos farmacéuticos adecuados para facilitar dichos medios de administración son muy conocidos en la técnica.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables generalmente incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares adecuados que son fisiológicamente compatibles con un anticuerpo proporcionado por la invención. Otros ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen agua estéril, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de cualquiera de los mismos.

En uno de tales aspectos, un anticuerpo se puede combinar con uno o más vehículos apropiados para una vía de administración deseada, y los anticuerpos se pueden mezclar, p. ej., con lactosa, sacarosa, almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfórico y sulfúrico, goma arábiga, gelatina, alginato de sodio, polivinilpirrolidina, poli(alcohol vinílico) y opcionalmente además se pueden comprimir o encapsular para la administración convencional. Alternativamente, una inmunoglobulina puede disolverse en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, disoluciones coloidales de carboximetilcelulosa, etanol, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, goma de tragacanto y/o diversos tampones. Otros vehículos, adyuvantes y modos de administración son muy conocidos en las técnicas farmacéuticas. Un vehículo puede incluir un material de liberación controlada o un material de retardo temporal, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo solos o con una cera, u otros materiales muy conocidos en la técnica.

Se conocen en la técnica vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales y se describen, p. ej., en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Las formulaciones líquidas pueden ser disoluciones, emulsiones o suspensiones y pueden incluir excipientes tales como agentes de suspensión, solubilizantes, tensioactivos, conservantes y agentes quelantes.

Se contemplan las composiciones farmacéuticas en las que se formulan un anticuerpo de la presente invención y uno o más agentes terapéuticamente activos. Las formulaciones estables del anticuerpo de la presente invención se preparan para el almacenamiento mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables opcionales, en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Las formulaciones a utilizar para la administración in vivo son específicamente estériles, preferiblemente en forma de una disolución acuosa estéril. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos. La inmunoglobulina y otros agentes terapéuticamente activos descritos en la presente memoria también pueden formularse como inmunoliposomas y/o quedar atrapados en microcápsulas.

La administración de la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención se puede realizar de varias formas, que incluyen por vía oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, mucosa, tópica, por ejemplo, geles, ungüentos, lociones, cremas, etc., por vía intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular.

Las formulaciones ejemplares que se usan para administración parenteral incluyen aquellas adecuadas para inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa como, por ejemplo, una disolución, emulsión o suspensión estéril.

La presente descripción proporciona ejemplos de anticuerpos como se detalla en los ejemplos proporcionados en la presente memoria. Son factibles otras variantes de anticuerpos, p. ej. que incluyen las variantes funcionales de las inmunoglobulinas ejemplificadas, p. ej. donde el Fc se modifica adicionalmente para mejorar la estructura y función de la molécula, o donde se producen anticuerpos que comprenden diferentes sitios de unión de las CDR o con diferente especificidad, en particular, donde se obtienen dos regiones Fv diferentes.

La descripción anterior se comprenderá mejor con referencia a los siguientes ejemplos. Tales ejemplos son, sin embargo, meramente representativos de los métodos para poner en práctica una o más realizaciones de la presente invención, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención tal como se reivindica.

Ejemplos

Ejemplo 1: Construcción, expresión, purificación y caracterización de un anticuerpo con intercambio de dominios CH3

Se puede formar un anticuerpo con intercambio de dominios CH3 usando dominios CH3 de tipo natural o una variedad de dominios CH3 modificados para reemplazar los dominios CH1 y/o CL en el brazo de Fab con intercambio de dominios del anticuerpo, y luego ensamblarse en una variedad de configuraciones, como se ilustra en parte en la Figura 1.

En el Ejemplo 1, se generó ADN sintético que codificaba las cadenas ligeras y pesadas de tres anticuerpos heterodiméricos diferentes con intercambio de dominios con las siguientes características de aminoácidos:

Anticuerpo heterodimérico 1 con intercambio de dominios:

Brazo de Fab 1 y cadenas ligeras y pesadas modificadas correspondientes:

Los dominios CH1 y CL de un brazo de Fab del anticuerpo completo se reemplazaron con dominios CH3 para crear una cadena ligera VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1) y una cadena pesada VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2). Los dominios VL(1) y VH(1) forman juntos el Fv del anticuerpo hu425 específico de EGFR (Matuzumab)1.

La transición del dominio VL(1) al dominio CH3 en la cadena VL(1 )-CH3 estuvo formada por 4 residuos de aminoácidos de la secuencia Ckappa RTVA (SEQ ID 49, siendo R el residuo 108 de la cadena kappa humana (numeración EU de Kabat)), seguida directamente por la secuencia de aminoácidos que comienza con EPQV (SEQ ID 50, siendo E el residuo 345 de la cadena pesada de IgG1 humana (numeración EU de Kabat)) perteneciente a la cadena A del dominio CH3. La secuencia del dominio CH3 terminaba con QKSLSLS (SEQ ID 51, siendo Q el residuo 438 de la cadena pesada de IgG1 humana (numeración EU de Kabat)) seguida de los residuos GEC (que representan los residuos C-terminales 212-214 (numeración EU de Kabat) de la cadena Ckappa).

La transición del dominio VH(1) al dominio CH3 en la cadena VH(1)-CH3-CH2-CH3 fue tal que la región J (que terminaba con la secuencia de aminoácidos VTVSS (SEQ ID 52, siendo la primera V el residuo 109 de la región VH humana) fue seguida por 5 residuos ASTKG pertenecientes al dominio CH1 humano (SEQ ID 53, siendo A el residuo 118 de la cadena pesada de IgG1 humana (numeración EU de Kabat)) seguida directamente por la secuencia de aminoácidos que comienza con EPQV (SEQ ID 50, siendo E el residuo 345 de la cadena pesada de IgG1 humana (numeración EU de Kabat)) perteneciente a la cadena A del dominio CH3. La secuencia del dominio CH3 terminaba con QKSLSLS (SEQ ID 51, siendo Q el residuo 438 de cadena pesada de IgG1 (numeración EU de Kabat)) seguida de los residuos KSC que representan una parte de la región bisagra de la cadena pesada humana (siendo K el residuo 218 de la cadena pesada IgG1 humana (numeración EU de Kabat)).

El dominio CH3 de la cadena VL(1 )-CH3 se diseñó para producir preferentemente un par afín con el dominio CH3 que está ubicado en el extremo C-terminal del dominio VH(1) en la cadena VH(1)-CH3-CH2-CH3, específicamente contenía una mutación de "ojal" Y407T (numeración EU de Kabat) según Ridgway et al 1996, por lo que esta cadena se designa más completamente como VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1).

El dominio CH3 que está ubicado en el extremo C-terminal del dominio VH(1) en la cadena VH(1)-CH3-CH2-CH3 se diseñó para producir preferentemente un par afín con el dominio CH3 de la cadena VL(1)-CH3, y específicamente contenía una mutación de "botón" T366Y (numeración EU de Kabat) según Ridgway et al 1996.

El dominio CH3 C-terminal de la cadena pesada VH(1)-CH3-CH2-CH3 de este anticuerpo se diseñó para producir preferentemente un par afín con el dominio CH3 C-terminal de la segunda cadena pesada del anticuerpo. La ingeniería específica de este dominio CH3 fue la de un dominio CH3 "AG" según Davis et al. 2010, por lo que esta cadena se designa más completamente como VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2).

El anticuerpo biespecífico 1 (BsAb1) resultante reconoce ambas dianas CD3xEGFR y se caracteriza específicamente por las siguientes cadenas pesadas y ligeras: H1 (SEQ ID 2), H2 (SEQ ID 4), L1 (SEQ ID 1) y L2 (SEQ ID 3).

Brazo de Fab 2 y cadena pesada modificada

La segunda mitad del anticuerpo heterodimérico estaba formada por las siguientes cadenas:

La cadena ligera (SEQ ID 3) codificaba la secuencia VL del anticuerpo OKT3 específico de CD3 (VL2) y estaba compuesta por la secuencia que codificaba el dominio VL(2)-CL.

La cadena pesada (SEQ ID 4) codificaba la secuencia VH del anticuerpo OKT3 específico de CD3 (VH2) y estaba compuesta por la secuencia que codificaba los dominios VH(2)-CH1-CH2-CH3^ga. El dominio CH3 C-terminal de esta cadena VH(2)-CH1-CH2-CH3^gase modificó para producir preferentemente un par afín con el dominio CH3 C-terminal de la primera cadena pesada (VH(1)-CH3-CH2-CH3^ag) del anticuerpo. La modificación específica de este dominio CH3 fue la de un dominio CH3 "GA" según Davis et al. 2010, por lo que esta cadena se denomina VH(2)-CH1-CH2-CH3^ga(SEQ ID 4).

Anticuerpo heterodimérico 2 con intercambio de dominios

Este anticuerpo se diseñó de manera similar a los brazos de Fab del anticuerpo heterodimérico 1 con intercambio de dominios. Sin embargo, en el anticuerpo heterodimérico 2 con intercambio de dominios, el brazo de Fab de OKT3 está fusionado con la cadena pesada que contiene un dominio CH3^agC-terminal (VH(2)-CH1-CH2-CH3^ag(SEQ ID 5)), mientras que el brazo de Fab de hu425 modificado con intercambio de dominios está fusionado con la cadena pesada que contiene un dominio CH3^gaC-terminal (VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ga(SEQ ID 6)).

Como resultado, este anticuerpo biespecífico reconoce ambas dianas CD3xEGFR y se caracteriza específicamente por las siguientes cadenas pesadas y ligeras: H1 (SEQ ID 6), H2 (SEQ ID 5), L1 (SEQ ID 1) y L2 (SEQ ID 3).

Anticuerpo heterodimérico 3 con intercambio de dominios

Este anticuerpo se diseñó de manera similar a los brazos de Fab como el anticuerpo heterodimérico 2 con intercambio de dominios. En el anticuerpo heterodimérico 3 con intercambio de dominios, el brazo de Fab de OKT3 se fusiona con la cadena pesada que contiene un dominio CH3^agC-terminal y el brazo de Fab de hu425 modificado con intercambio de dominios se fusiona con la cadena pesada que contiene un dominio CH3^gaC-terminal. Sin embargo, en el anticuerpo heterodimérico 3 con intercambio de dominios, se intercambió un dominio CH3 de tipo natural (t.n.) en el extremo C-terminal tanto a VL1 como a VH1 en el brazo de Fab de hu425 modificado en lugar de los dominios CH3 modificados de tipo "botón" y "ojal" afines que se usaron en los anticuerpos heterodiméricos 1 y 2 con intercambio de dominios. El anticuerpo heterodimérico con intercambio de dominios 3 utilizó las secuencias VL(1)-CH3wt (SEQ ID 7) y VH(1)-CH3wt-CH2-CH3GA (SEQ ID 8) para el brazo de Fab de hu425.

Como resultado, este anticuerpo biespecífico reconoce ambas dianas CD3xEGFR y se caracteriza específicamente por las siguientes cadenas pesadas y ligeras: H1 (SEQ ID 8), H2 (SEQ ID 5), L1 (SEQ ID 7) y L2 (SEQ ID 3).

Los ADN sintéticos que codifican las cadenas de anticuerpos descritas se flanquearon con secuencias de enzimas de restricción para la clonación en el vector de expresión de mamíferos pTT5.

Ejemplo 2: Construcción de vectores para la expresión de anticuerpos biespecíficos similares a la Ig humana La generación de los tres anticuerpos heterodiméricos humanos con intercambio de dominios descritos en el Ejemplo 1 se realiza mediante la expresión de combinaciones de cuatro genes diferentes dentro de una célula, siguiendo las combinaciones específicas de secuencias génicas como se especifica en la siguiente tabla. La generación del anticuerpo heterodimérico 1 con intercambio de dominios es mediante la coexpresión de SEQ ID 1, 2, 3 y 4. La generación del anticuerpo heterodimérico 2 con intercambio de dominios es mediante la coexpresión de SEQ ID 1,3, 5 y 6. La generación del anticuerpo heterodimérico 3 con intercambio de dominios es mediante la coexpresión de SEQ ID 3, 5, 7 y 8.

Para expresar estas secuencias, se construyeron ocho vectores de expresión diferentes basados en pTT5 de mamífero (Shi et al. 2005), cada uno de los cuales contenía uno de los genes que codifican:

SEQ ID 1: VL(1)-CH3_HOLE (Y407T)

SEQ ID 2: VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 3: VL(2)-CL

SEQ ID 4: VH(2)-CH1-CH2-CH3^ga

SEQ ID 5: VH(2)-CH1-CH2-CH3^ag

SEQ ID 6: VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ga

SEQ ID 7: VL(1)-CH3wt

SEQ ID 8: VH(1)-CH3wt-CH2-CH3GA

Para VL1 y VH1 se utilizaron los dominios variables del anticuerpo anti-EGFR Matuzumab (hu425) (Kim, 2004). Para VL2 y VH2 se utilizaron los dominios variables del anticuerpo anti-CD3 OKT3 (Van Wauwe et al. 1980).

La Figura 1A ilustra esquemáticamente las estructuras de varios de los posibles anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios que logran la heterodimerización de las dos cadenas pesadas diferentes con la tecnología de heterodímeros de CH3 con dominios modificados mediante intercambio de cadenas (SEED), usando versiones AG y GA de los dominios CH3 (véase Davis et al. 2010 y la patente US 20070287170 A1). La Figura 1A-1 ilustra específicamente la estructura del anticuerpo heterodimérico 1 con intercambio de dominios del Ejemplo 1.

Ejemplo 3: Expresión y Caracterización de anticuerpos biespecíficos

Los anticuerpos heterodiméricos 1, 2 y 3 con intercambio de dominios descritos en los Ejemplos 1 y 2 se expresaron en células de mamífero a pequeña escala según técnicas habituales. Las proteínas resultantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A y se caracterizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) no reductora y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) analítica (Figura 2). El gel no reductor mostró predominantemente una sola banda con un peso molecular que correspondía al tamaño esperado para los anticuerpos 1 y 2 con intercambio de dominios (Figura 2A). Para el anticuerpo 3 con intercambio de dominios, la SDS-PAGE mostró la banda del tamaño esperado y mostró bandas adicionales correspondientes a complejos proteicos de mayor peso molecular (Figura 2A).

Estas proteínas purificadas se caracterizaron adicionalmente mediante SEC analítica que mostró un pico principal que eluía de la columna SEC después de ~7,5 min (similar al tiempo de elución esperado para los anticuerpos IgG estándar) para los anticuerpos 1,2 y 3 con intercambio de dominios, con una contaminación menor por otras especies proteicas para los anticuerpos 1 y 2 con intercambio de dominios (Figuras 2B y 2C) y picos adicionales para el anticuerpo 3 (Figura 2D). Por lo tanto, el uso de un brazo de Fab con intercambio de dominios produjo las proteínas del tamaño esperado de los anticuerpos biespecíficos. A continuación, se procedió a realizar una extensa caracterización y pruebas bioquímicas y funcionales con una variedad de anticuerpos biespecíficos formados con los brazos de Fab con intercambio de dominios.

Ejemplo 4: Expresión y caracterización del anticuerpo biespecífico 1 con intercambio de dominios a gran escala

Los anticuerpos biespecíficos heterodiméricos 1 y 2 con intercambio de dominios tienen características biofísicas similares, p. ej. patrones de SDS-PAGE no reductora y perfiles de SEC similares. La expresión del anticuerpo 1 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios produjo niveles de expresión más altos y se eligió para las caracterizaciones adicionales.

El anticuerpo 1 biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios se expresó en células de mamífero de acuerdo con las técnicas habituales mediante la coexpresión de los genes de SEQ ID 1,2, 3 y 4 a mayor escala (300 ml de medio de cultivo). La proteína resultante se purificó mediante cromatografía de afinidad con proteína A y, a partir de este momento, este anticuerpo biespecífico heterodimérico con intercambio de dominios específico se denominará BsAb1, con el entendimiento a partir de los ejemplos anteriores de que este es el anticuerpo con intercambio de dominios compuesto por la coexpresión de SEQ ⁱD 1,2, 3 y 4. El BsAb1 purificado (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) se caracterizó mediante SDS-PAGE no reductora y reductora y SEC analítica (Figura 3).

La SDS-PAGE no reducida mostró predominantemente una sola banda con un peso molecular que corresponde al tamaño esperado de BsAb1. Cuando las muestras se redujeron antes de la SDS-PAGE, el perfil mostró la banda etiquetada como banda H1 que corresponde a VH(1)-CH3_Knob (T366Y)-CH2-CH3^ag(s Eq ID 2), la banda H2 que corresponde a VH(2)-CH1-CH2-CH3^ga(SEQ ID 4) y la banda L1+L2 que corresponde a VL(1)-CH3_Hole (Y407t ) (SEQ ID 1) y VL(2)-CL (SEQ ID 3) (Figura 3A).

Además, la proteína purificada caracterizada mediante SEC analítica mostró un pico principal de >90% eluyendo de la columna después de ~7,5 min, que es comparable a la elución de anticuerpos IgG estándar (Figura 3B).

Ejemplo 5: Ensayo de unión biespecífica

Para probar la unión simultánea de BsAb1 (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) a los dos antígenos CD3 y EGFR, primero se tiñeron células Jurkat CD3+ con BsAb1 o con el anticuerpo biespecífico anti-EGFR anti-CD3 de control, seguido de una etapa de incubación con EGFR. La unión biespecífica se detectó con un anticuerpo de detección anti-EGFR marcado con isotiocianato de fluoresceína y se analizó mediante citometría de flujo (Figura 4).

Ejemplo 6: Generación y caracterización de un anticuerpo de un brazo que contiene el dominio CH3 en el brazo de Fab

Se generaron anticuerpos de un brazo que contenían el CH3 con intercambio de dominios (par afín KiH) o la región Fab sin modificar mediante la coexpresión de tres genes diferentes. La Figura 5 ilustra esquemáticamente la estructura del anticuerpo de un brazo (sin modificar y con intercambio de dominios). Los diferentes vectores de expresión basados en pTT5 de mamífero que contienen el gen que codifica cada cadena de anticuerpo se construyeron como se describió previamente.

La generación del anticuerpo humano de un brazo con intercambio de dominios se realiza mediante la coexpresión de los tres genes diferentes que codifican las secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID 1, SEQ ID 2 y SEQ ID 9 (huFc_GA SEED) dentro de una célula. El anticuerpo de un brazo sin modificar se generó mediante la coexpresión de los tres genes diferentes que codifican las secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID 9, SEQ ID 10 (VL(1 )-CL) y SEQ ID 11 (VH(1 )-CH1-CH2-CH3^ag).

Para VL1 y VH1 se utilizaron los dominios variables del anticuerpo anti-EGFR Matuzumab (hu425) (Kim, 2004).

Los anticuerpos de un brazo resultantes reconocen EGFR y se caracterizan específicamente por las siguientes cadenas ligeras y pesadas. Anti-EGFR de un brazo con intercambio de dominios: H1 (SEQ ID 2), H2 (SEQ ID 9) y L1 (SEQ ID 1). Anti-EGFR de un brazo sin modificar: H1 (SEQ ID 11), H2 (SEQ ID 9) y ^l1 (SEQ ID 10).

Ambos anticuerpos se expresaron en células de mamífero según técnicas habituales. Las proteínas resultantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A y se caracterizaron mediante SDS-PAGE no reductora y reductora y SEC analítica (Figura 6). El gel no reductor mostró predominantemente una sola banda con un peso molecular que corresponde al anticuerpo de un brazo. Cuando las muestras se redujeron antes de la SDS-PAGE, el perfil del anticuerpo de un brazo (CH1/CL) muestra la banda H1 que corresponde a Vh (1)-CH1-CH2-CH3^ag(SEQ ID 11), la banda H2 que corresponde a huFc_GA SEED (SEQ ID 9) y la banda L1 que corresponde a VL(1)-CL (SEQ ID 10) (Figura 6A). El perfil en condiciones reductoras del anticuerpo con intercambio de dominios muestra la banda H1 que corresponde a VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2), la banda H2 que corresponde a huFc_GA SEED (SEQ ID 9) y la banda L1 que corresponde a VL(1)-^cH3_HOLE (Y407T) (SEQ ⁱD 1) (Figura 6A). Cuando las proteínas purificadas se caracterizaron mediante SEC analítica, ambas mostraron un pico principal de >90% eluyendo de la columna después de ~8 min (Figura 6B).

Ejemplo 7: Unión monovalente a células positivas para EGFR mediante citometría de flujo

El anticuerpo de un brazo que empleaba el dominio Fab anti-EGFR con intercambio de dominios CH3 se analizó para determinar la unión a la diana y se comparó con el anticuerpo de un brazo con un Fab anti-EGFR sin modificar (CH1/CL) (véase el Ejemplo 6). Además, se analizó BsAb1 (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) con respecto a la unión a la diana de EGFR. La unión de los anticuerpos a las células A431 que expresan EGFR se midió mediante citometría de flujo (Figura 7). Los anticuerpos unidos a las células se detectaron mediante un anticuerpo secundario F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con ficoeritrina y las células se analizaron mediante citometría de flujo. La mitad de la concentración efectiva máxima (CE50) para la unión celular se calculó a partir de las curvas de unión utilizando el programa GraphPad PRISM.

El anticuerpo de un brazo anti-EGFR con intercambio de dominios CH3 y el anticuerpo BsAb1 mostraron una unión dependiente de la dosis a las células positivas para EGFR con propiedades de unión similares a las del anticuerpo de control (Fab de un brazo anti-EGFR sin modificar) (Figura 7). La CE50 de los anticuerpos de un brazo estaba en el rango de 5-8 nM. El BsAb1 se unió a las células positivas para EGFR con una CE50 de ~7 nM y fue comparable al anticuerpo de control (Figura 7).

Estos resultados muestran que la sustitución de CH1/CL por dominios CH3 modificados no cambió la unión al antígeno de los respectivos fragmentos Fab.

Ejemplo 8: Construcción, expresión, purificación y caracterización del anticuerpo biespecífico 2 "BsAb2" con intercambio de dominios (anti-CD16 x anti-EGFR)

El Fab anti-EGFR con intercambio de dominios CH3 descrito en los Ejemplos anteriores y utilizado en BsAb1 se combinó con el anticuerpo murino anti-CD163G8 (Fleit et al. 1982) para generar un nuevo anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios denominado a partir de este punto como BsAb2 (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR). Se construyeron dos vectores de expresión adicionales basados en pTT5 de mamíferos, cada uno de los cuales contenía uno de los genes que codifican:

SEQ ID 12: VL(3)-CL

SEQ ID 13: VH(3)-CH1-CH2-CH3^ga

Para VL(3) y VH(3) se utilizaron los dominios variables del anticuerpo anti-CD163G8 (Fleit et al. 1982).

El BsAb2 resultante reconoce ambas dianas CD16xEGFR y se caracteriza específicamente por las siguientes cadenas pesadas y ligeras: H1 (SEQ ID 2), H2 (SEQ ID 13), L1 (SEQ ID 1) y L2 (SEQ ID 12).

La generación del anticuerpo biespecífico BsAb2 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR) se realiza mediante la expresión de los cuatro genes diferentes que codifican las secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID 1, SEQ ID 2, SEQ ID 12 y SEQ ID 13 dentro de una célula. La heterodimerización de las dos cadenas pesadas diferentes se logró mediante la tecnología SEED como se describe para BsAb1.

BsAb2 se expresó en células de mamífero según técnicas habituales. La proteína resultante se purificó mediante purificación con Proteína A y mostró una homogeneidad similar con el tamaño y la pureza esperados como se mostró para BsAb1 después de la purificación con proteína A de una sola etapa.

Para prepararse para la verificación bioquímica definitiva del ensamblaje correcto de BsAb1 y BsAb2 mediante espectrometría de masas (véase el Ejemplo 9 en la siguiente sección), BsAb1 y BsAb2 se purificaron adicionalmente en una segunda etapa de purificación usando SEC preparativa. Como ejemplo de la pureza de la proteína después de esta etapa de purificación mediante SEC preparativa, la proteína BsAb2 después de esta segunda purificación mediante SEC preparativa se caracterizó mediante SDS-PAGE no reductora y reductora y SEC analítica (Figura 8). El gel no reductor mostró predominantemente una sola banda con un peso molecular que corresponde al BsAb2 con intercambio de dominios. Cuando las muestras se redujeron antes de la SDS-PAGE, el perfil muestra la banda H1 que corresponde a VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2), la banda H2 que corresponde a VH(3)-CH1-c H2-CH3^ga(SEQ ID 13), la banda L2 que corresponde a VL(3)-CL (^sE^qID 12) y la banda L1 que corresponde a VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1) (Figura 8A). Esta proteína purificada se caracterizó adicionalmente mediante SEC analítica y mostró un pico principal de >90% eluyendo de la columna después de ~7,5 min, similar al tiempo de elución de BsAb1 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) y también de anticuerpos IgG estándar (Figura 8B).

Ejemplo 9: Verificación del ensamblaje correcto mediante espectrometría de masas

Enfoque directo analizando anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios

Para confirmar el apareamiento correcto de las cadenas en los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios, los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios BsAb1 (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) y BsAb2 (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR) purificados se midieron mediante análisis de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Antes del análisis de MS, las muestras se desglicosilaron mediante PNGasaF. Como se muestra en las Figuras 9 y 10, se detectó un único pico de 148,284 kDa y 148,050 kDa para el anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios BsAb1 y BsAb2, respectivamente. Estas masas detectadas corresponden a la suma de las cuatro cadenas de anticuerpos diferentes. Durante el ensamblaje de estas cadenas, pueden ocurrir pérdidas de masa adicionales debido a la formación de puentes disulfuro, la escisión de la lisina C-terminal y la formación de piroglutamato N-terminal. Teniendo en cuenta estas pérdidas de masa de ~322 kDa, las masas promedio detectadas difieren de las masas promedio calculadas en solo <3 Da para el anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios y ~12 Da para el anticuerpo biespecífico BsAb2 con intercambio de dominios. No se detectaron homodímeros de GA en ninguna muestra de anticuerpo (masa molecular calculada del homodímero OKT3-GA: 146,465 kDa y del homodímero 3G8-GA: 145,980 kDa).

Estos resultados demuestran el ensamblaje en la estequiometría correcta de las 4 cadenas proteicas diferentes que se coexpresaron en la misma célula para la producción de los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios.

Enfoque indirecto mediante cadenas ligeras competitivas

Dado que el método de LC-MS aplicado no pudo distinguir entre un anticuerpo con intercambio de dominios ensamblado correctamente y un anticuerpo con las cadenas ligeras intercambiadas, se realizó un ensayo competitivo. En este ensayo, tanto las cadenas ligeras como una de las cadenas pesadas de un anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios se coexpresaron con la cadena huFc_GA SEED (hinge-CH2-CH3GA) dentro de una célula para formar un anticuerpo de un brazo. Si solo se produjera un emparejamiento específico de la cadena ligera correcta con la cadena pesada de un brazo, entonces solo se formaría un Fab con el emparejamiento de cadena ligera correcto. Se eligieron como modelo las cadenas del anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios.

En el ensayo competitivo I (Figura 11), se generó un anticuerpo de un brazo que contenía los dominios CH1/CL en la región Fab mediante la coexpresión de cuatro genes diferentes que codificaban VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1), VL(2)-CL (SEQ ID 3), VH(2)-CH1-CH2-CH3^ag(SEQ ID 5) y huFc_GA SEED (SEQ ID 9). En el ensayo competitivo II (Figura 12), se generó un anticuerpo de un brazo que contenía la región Fab con intercambio de dominios CH3 al coexpresar cuatro genes diferentes que codificaban VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1), VL (2)-CL (SEQ ID 3), VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2-CH3^ag(SEQ ID 2) y huFc_GA SEED (SEQ ID 9). Los anticuerpos se expresaron en células de mamífero según técnicas habituales. Después de la purificación de la proteína A, las proteínas se desglicosilaron con PNGasaF y posteriormente se analizaron mediante LC-MS. Los picos principales a 99,521 kDa (Figura 11) y 101,387 kDa (Figura 12) se detectaron en los ensayos competitivos I y II, respectivamente. Estas masas detectadas corresponden al anticuerpo de un brazo sin modificar ensamblado correctamente en el ensayo competitivo I y al anticuerpo de un brazo con intercambio de dominios en el ensayo competitivo II. No se pudieron encontrar picos adicionales correspondientes a las variantes emparejadas incorrectamente.

Estos resultados muestran que la modificación con intercambio de dominios CH3 impone el emparejamiento correcto de cadenas ligeras a cadenas pesadas.

Ejemplo 10: Estabilidad térmica de los anticuerpos con intercambio de dominios

La estabilidad de los anticuerpos biespecíficos BsAb1 y 2 con intercambio de dominios se analizó adicionalmente mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC) y se determinó la temperatura de fusión de las transiciones aparentes (véase la Figura 13).

Ambos anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios se despliegan con tres transiciones aparentes. La primera transición del anticuerpo biespecífico 1 y 2 con intercambio de dominios se observó a Tm1 = 61,3 °C y Tm1 = 61,9 °C, respectivamente. Esta transición corresponde al despliegue térmico del dominio Fab anti-EGFR con intercambio de dominios. El segundo pico a Tm2 = 67,3 °C para el anticuerpo biespecífico 1 con intercambio de dominios y Tm2 = 67,4 °C para el anticuerpo biespecífico 2 con intercambio de dominios corresponde al despliegue del fragmento Fc SEED AG/GA. La tercera transición a Tm3 = 71,8 °C para el anticuerpo biespecífico 1 con intercambio de dominios y Tm3 = 71,1 °C para el anticuerpo biespecífico 2 con intercambio de dominios corresponde al despliegue del dominio Fab nativo (anti-CD3 o anti-CD16).

Ejemplo 11: Generación y caracterización de anticuerpos negativos para la función efectora

Además de los anticuerpos biespecíficos y de un brazo descritos en los ejemplos anteriores, se generaron los nuevos anticuerpos enumerados a continuación para usarlos en el siguiente conjunto de experimentos, siguiendo los mismos procedimientos de expresión, purificación y caracterización de proteínas descritos en los ejemplos anteriores para la generación de anticuerpos.

• Anti-CD3 de un brazo con el Fab de OKT3 sin modificar fusionado con la cadena pesada SEED AG

• Anti-CD16 de un brazo con el Fab de 3G8 sin modificar fusionado con la cadena pesada SEED AG

• Fab de hu425 anti-EGFR de un brazo de isotipo negativo para la función efectora (EN) con intercambio de dominios CH3 (par afín de KiH) fusionado con la cadena pesada SEED AG del isotipo EN, emparejada con la cadena huFc_GA SEED de isotipo EN

• Anticuerpo biespecífico BsAb2 con intercambio de dominios de isotipo negativo para la función efectora (EN) (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR) generado como en el Ejemplo 8, pero usando cadenas pesadas de isotipo EN SEED AG y de isotipo EN SEED GA

Las cadenas SEED de isotipo negativo para la función efectora (EN) se generaron basándose en la secuencia variante de IgG2 humana EN descrita en el documento US8562986 y se adaptaron para el uso con cadenas pesadas de SEED como sigue.

Para producir cadenas EN huFc_SEED (donde huFc se compone de las secuencias bisagra-CH2-CH3 humanas especificadas) a partir de la secuencia variante de IgG2 EN (documento US8562986), la bisagra de IgG1 humana modificada (C220S) y el dominio CH2 de IgG2 humana modificada (F296A, N297Q) se fusionaron con el extremo N-terminal de los dominios CH3 "AG" o "GA" de SEED (Davis et al. 2010) para producir huFc_AG SEED de isotipo EN o cadenas huFc_GA SEED de isotipo EN. Por ejemplo, huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA (SEQ ID 16).

El Fab con intercambio de dominios no tiene una secuencia CH1, por lo que el CH1 de IgG2 no se pudo usar en la cadena pesada con intercambio de dominios EN y el sitio de unión covalente de la cadena ligera presente de forma natural en el CH1 de IgG2 de tipo natural no estaba presente. Por lo tanto, para producir la cadena pesada anti-EGFR de SEED "AG" con intercambio de dominios EN, se usó la secuencia bisagra de IgG1 humana de tipo natural junto con el dominio CH2 modificado de IgG2 humana (F296A, N297Q) descrito en el documento US8562986, como se muestra en VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2^en-CH3^ag(s Eq ID 15). Este diseño también se usó para producir una cadena pesada GA SEED 3G8 de Fab sin modificar EN para su uso en el anticuerpo biespecífico "BsAb2 EN" (véase más adelante), como se muestra en VH(3)-CH1-CH2^en-Ch 3^ga(SEQ ID 17).

Se construyeron vectores de expresión adicionales basados en pTT5 de mamífero, cada uno de los cuales contenía uno de los genes que codifican:

SEQ ID 14: VH(3)-CH1-CH2-CH3^ag

SEQ ID 15: VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2^en-CH3^ag

SEQ ID 16: huFc _g1hingeEN-CH2EN-CH3GA

SEQ ID 17: VH(3)-CH1-CH2^en-CH3^ga

Para VL2 y VH2 se utilizaron los dominios variables del anticuerpo anti-CD3 OKT3 (Van Wauwe et al. 1980).

La generación de anticuerpos se realiza mediante la expresión de los diferentes genes que codifican las secuencias de aminoácidos dentro de una célula. La heterodimerización de las dos cadenas pesadas diferentes se logró mediante la tecnología SEED como se describió para BsAb1 en los ejemplos anteriores.

Se generó un anti-CD3 de un brazo con el Fab de OKT3 sin modificar fusionado con la cadena pesada SEED AG coexpresando los 3 genes diferentes que codifican VL(2)-CL (SEQ ID 3), VH(2)-CH1-CH2-CH3^ag(SEQ ID 5) y huFc_GA SEED (SEQ ID 9).

Se generó un anti-CD16 de un brazo con el Fab de 3G8 sin modificar fusionado con la cadena pesada SEED AG coexpresando los 3 genes diferentes que codifican VL(3)-CL (SEQ ID 12), VH(3)-CH1-CH2-Ch 3^ag(SEQ ID 14) y huFc_GA SEED (SEQ ID 9).

Se generó un anti-EGFR de un brazo con intercambio de dominios negativos para la función efectora (EN) coexpresando los 3 genes diferentes que codifican VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1), VH(1)-CH3_ ^kN^oB (T366Y)-CH2^en-CH3^ag(SEQ ID 15) y huFc_g1 hingeEN-CH2EN-CH3GA (SeQ ID 16) dentro de una célula.

El anticuerpo de un brazo EN resultante reconoce EGFR y se caracteriza específicamente por las siguientes cadenas ligeras y pesadas: H1 (SEQ ID 15), H2 (SEQ ID 16) y L1 (SEQ ID 1).

Se generó un anticuerpo biespecífico BsAb2 de isotipo negativo para la función efectora (EN) con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR), que se denominará "BsAb2 EN" a partir de este momento, coexpresando los 4 genes diferentes que codifican VL(1)-CH3_HOLE (Y407T) (SEQ ID 1), VH(1)-CH3_KNOB (T366Y)-CH2^en-CH3^ag(SEQ ID 15), VL(3)-CL (SEQ ID 12) y VH(3)-CH1-CH2^en-CH3^ga(SEQ ID 17) dentro de una célula.

El BsAb2 EN resultante reconoce ambas dianas CD16xEGFR y se caracteriza específicamente por las siguientes cadenas pesadas y ligeras: H1 (SEQ ID 15), H2 (SEQ ID 17), L1 (SEQ ID 1) y L2 (SEQ ID 12).

Muchas funciones efectoras de anticuerpos están mediadas por anticuerpos que se unen a los receptores F^cyen las células inmunitarias a través de un sitio de unión en la porción Fc de los anticuerpos. Un ejemplo específico es la función efectora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), que está mediada por la unión de los anticuerpos a CD16a (Fc^YIIIa) de las células efectoras inmunitarias a través del sitio de unión al receptor Fcy de la porción Fc de los anticuerpos. Los anticuerpos de isotipo negativo para la función efectora son deficientes en la unión a CD16a a través de su Fc.

La unión de los anticuerpos al receptor CD16a (Fc^YIIIa) se determinó mediante un kit de ensayo de la unión celular de CD16a (CisBio) (Figura 14). En este ensayo, se analiza la capacidad de los anticuerpos de competir por la unión de una IgG humana marcada con fluorescencia a CD16a. Si un anticuerpo de ensayo no marcado se une a CD16a, competirá con la unión de la IgG marcada, y esta competencia disminuirá la señal de unión medida.

Se espera que los anticuerpos competentes para la función efectora con un brazo de Fab anti-CD16 se unan al receptor CD16a a través del brazo de Fab anti-CD16 y mediante el sitio de unión al receptor Fcy de la porción Fc de este anticuerpo. Los anticuerpos de isotipo negativo para la función efectora no se unirán a CD16a a través del sitio de unión al receptor F^cyde la porción Fc.

Como era de esperar, no se detectó la unión al receptor CD16a para el anticuerpo de un brazo anti-EGFR EN con intercambio de dominios, lo que no dio como resultado una disminución de la señal medida (Figura 14, triángulos invertidos). Los otros anticuerpos mostraron una unión dependiente de la dosis al receptor CD16a, lo que dio como resultado la inhibición de la señal medida con diferentes concentraciones inhibitorias medias máximas (CI50). La unión a CD16 más débil se observó para los anticuerpos anti-EGFR de un brazo, ya sea con Fab CH1/CL sin modificar o con Fab CH3-KiH con intercambio de dominios (Figura 14, rombos). Su unión estaba en el rango de 23-71 nM. Como se esperaba, el BsAb2 y el anticuerpo anti-CD16 de un brazo mostraron la unión más fuerte a CD16a (Figura 14, círculos y triángulos, respectivamente). La unión estuvo en el rango de 0,3 nM para BsAb2 y 0,1 nM para el anticuerpo anti-CD16 de un brazo. La variante IgG2 negativa para la función efectora de BsAb2, "BsAb2 EN" (Figura 14, cuadrados), mostró una unión a CD16 más débil (CI50 ~3,6 nM) en comparación con BsAb2, pero una unión más fuerte en comparación con los anticuerpos anti-EGFR monovalentes.

Estos resultados sugieren que BsAb2 puede unirse al receptor CD16a a través del brazo de Fab anti-CD16 y el sitio de unión al receptor F^cyde la porción Fc del anticuerpo, mientras que BsAb2 EN aún puede unirse a CD16a, pero con una unión más débil mediada solo a través del brazo de Fab anti-CD16. Además, esta unión del Fab anti-CD16 de un brazo a CD16a con BsAb2 EN era más fuerte que la unión a CD16a que se producía solo a través del sitio de unión al receptor Fc^ydel Fc de los anticuerpos anti-EGFR monovalentes.

Ejemplo 12: Actividad funcional de los anticuerpos con intercambio de dominios

Para ensayar la citotoxicidad funcional de los anticuerpos biespecíficos BsAb1 y BsAb2 con intercambio de dominios, se incubaron células T primarias activadas o células NK con células A431 que sobreexpresaban EGFR en presencia de los anticuerpos aplicados en dilución en serie. La lisis celular se midió mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), un indicador de muerte celular liberado en el sobrenadante tras la lisis celular, mediante el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (Promega) después del cultivo conjunto de células efectoras y diana con una proporción E:T de 10:1. El cocultivo se realizó durante 18 h para las células T activadas y 4 h para las células NK.

Se detectó la lisis celular redirigida dependiente de la dosis de las células diana A431 mediante las células T activadas en presencia del anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios (como se observa en la Figura 15A). Como era de esperar, el anticuerpo anti-CD3 de un brazo, el anticuerpo anti-EGFR de un brazo con intercambio de dominios y el anticuerpo anti-CD16 de un brazo de control negativo no mostraron la lisis redirigida mediante células T de las células diana. Solo el anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios mostró hasta un 50 % de lisis celular con un valor de CE50 calculado entre 0,1 y 0,3 nM.

Esta lisis redirigida mediante células T demuestra que ambos brazos del anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR) son funcionales y simultáneamente interaccionan con las 2 dianas CD3 y EGFR para redirigir las células T hacia la lisis de las células diana A431.

El anticuerpo biespecífico BsAb2 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR) y su variante negativa para la función efectora (EN) BsAb2 EN mostraron una lisis celular dependiente de la dosis de las células A431 por parte de las células NK redirigidas (Figura 15B). Ambas variantes pudieron lisar hasta el 50% de las células diana. El valor de CE50 calculado de la variante biespecífica EN con intercambio de dominios de BsAb2 EN fue 37 pM y el valor de CE50 de la variante BsAb2 positiva para la función efectora fue 10 pM.

En comparación, el anticuerpo anti-EGFR de un brazo con intercambio de dominios también mostró una lisis de las células dianas dependiente de la dosis debido a la participación natural de las células NK a través del sitio de unión al receptor F^cyde la parte Fc de este anticuerpo de un brazo, aunque no tiene brazo anti-CD16. El anticuerpo de un brazo anti-EGFR negativo para la función efectora no mostró lisis celular debido a la falta de unión al receptor Fcy por parte del Fc de isotipo variante IgG2 negativo para la función efectora y la falta de un brazo anti-CD16. Como era de esperar, el anticuerpo anti-CD3 de control negativo tampoco mostró lisis celular.

La lisis redirigida mediante células NK de las células A431 por el anticuerpo biespecífico BsAb2 EN (CH3-KiH anti-CD16 x anti-EGFR) con intercambio de dominios variante negativo para la función efectora mostró que ambos brazos de BsAb2 son funcionales e interaccionan simultáneamente con las 2 dianas CD16 y EGFR para redirigir las células NK a la lisis de las células diana A431.

En conjunto, estos resultados muestran que el formato de anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios produjo anticuerpos biespecíficos que podían interaccionar simultáneamente con ambas dianas con cada brazo de Fab y demostraron la función biológica de estos anticuerpos dependiente de la unión a las 2 dianas diferentes.

Ejemplo 13: Ejemplos de combinaciones de dominios CH3 modificados

Como se ilustra en parte en la Figura 1, existen muchas combinaciones y variaciones para usar diferentes dominios CH3 modificados para formar anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios. A continuación se muestra una tabla de resumen que enumera varios de los posibles ejemplos de combinaciones de dominios CH3 modificados en Fc (es decir, el par de dominios CH3^hc/CH3^hc) y Fab con intercambio de dominios CH3 (es decir, el dominio CH3^lc/CH3^hc), véanse las Figuras 1A-1D.

Los dominios CH1/CL en un brazo de Fab de un anticuerpo de un brazo se reemplazaron con dominios CH3 modificados alternativamente. Estos dominios CH3 modificados alternativos se utilizan normalmente para reforzar la heterodimerización de las cadenas pesadas en las moléculas Fc heterodiméricas. Como modelo, se eligió el dominio del Fab anti-EGFR hu425 para usarlo con VH(1) y VL(1). Se sintetizaron secuencias de ADN que codificaban dominios CH3 alternativos y se construyeron diferentes vectores de expresión basados en pTT5 de mamífero, cada uno de los cuales contenía uno de los genes que codificaban:

Dominios CH3 "KiH2" (Ridgway et al. (1996), Atwell et al. (1997))

Variante 1:

SEQ ID 18: VH(1)-CH3_KNOB (T366W)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 19: VL(1)-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

Variante 2:

SEQ ID 20: VH(1)-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 21: VL(1)-CH3_KNOB (T366W)

Dominios CH3 de "par de cargas" (Gunasekaran et al. (2010)

Variante 1:

SEQ ID 22: VH(1)-CH3 (E356K, D399K)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 23: VL(1)-CH3 (K392D, K409D)

Variante 2:

SEQ ID 24: VH(1)-CH3 (K392D, K409D)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 25: VL(1)-CH3 (E356K, D399K)

Dominios CH3 "Azymmetric'' (Von Kreudenstein et al. (2013))

Variante 1:

SEQ ID 26: VH(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 27: VL(1)-CH3 (T350V, T366L, K392L, T394W)

Variante 2:

SEQ ID 28: VH(1)-CH3 (T350V, T366L, K392L, T394W)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 29: VL(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)

Dominios CH3 "SEED" (Davis et al. (2010))

Variante 1:

SEQ ID 30: VH(1)-CH3_SEED (AG)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 31: VL(1)-CH3_SEED (GA)

Variante 2:

SEQ ID 32: VH(1)-CH3_SEED (GA)-CH2-CH3^ag

SEQ ID 33: VL(1)-CH3_SEED (AG)

Se produjeron anticuerpos de un brazo y anticuerpos biespecíficos (anti-CD3 x anti-EGFR) en células de mamífero. Para los anticuerpos Fab de un brazo con intercambio de dominios con dominio CH3 alternativo, se expresaron 3 genes que codificaban las 2 secuencias de aminoácidos proporcionadas en la lista anterior además de huFc_GA (SEQ ID 9). Los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios que contenían estos dominios alternativos intercambiados con CH3 se generaron mediante la expresión de 4 genes que codificaban las 2 secuencias de aminoácidos proporcionadas en la lista anterior además de las 2 secuencias de aminoácidos proporcionadas en SEQ ID 3 y SEQ ID 4. Las proteínas se purificaron mediante proteína A a partir de medios de cultivo celular mediante métodos habituales y se caracterizaron mediante SDS-PAGE y SEC analítica.

Anticuerpos de un brazo con dominios CH3 alternativos

La SDS-PAGE no reductora mostró predominantemente una sola banda con un peso molecular que corresponde a los anticuerpos de un brazo con intercambio de dominios (Figura 16A). No se observaron diferencias significativas entre la variante 1 y la variante 2. La variante de hu425 CH3-Azymmetric mostró una movilidad diferente del anticuerpo de un brazo completamente ensamblado que se observa en una banda principal de ~90 kDa. La SEC analítica mostró un pico principal con un tiempo de retención de ~7,9 min para todas las variantes y, en diversos grados, picos adicionales (Figura 16C). Un pico adicional de especies de alto peso molecular (tiempo de retención de 6,7 min) fue más destacado para el anticuerpo de un brazo que contenía el dominio CH3-SEED tanto en el brazo de Fab como en la región Fc del anticuerpo. Esto podría sugerir que hay más posibilidades de emparejamiento incorrecto cuando se usa el mismo dominio CH3 modificado tanto en el brazo de Fab con intercambio de dominios como en la región Fc del anticuerpo.

Anticuerpos biespecíficos alternativos con intercambio de dominios

La SDS-PAGE no reductora mostró predominantemente una banda principal para los anticuerpos biespecíficos alternativos con intercambio de dominios CH3, con bandas secundarias presentes en diversos grados (Figura 16B). En el análisis SEC, todas las muestras mostraron un pico principal con un tiempo de retención de ~7,5 min y un pico lateral con un tiempo de retención de ~8 min (Figura 16D). Había especies adicionales de alto peso molecular en diversos grados.

Ensayos de unión de anticuerpos de un brazo con intercambio de dominios que contienen dominios CH3 alternativos Los anticuerpos de un brazo que comprenden los dominios Fab alternativos con intercambio de dominios (variante 1 y 2) se analizaron para determinar la unión al antígeno mediante citometría de flujo. Se incubaron células A431 que sobreexpresaban EGFR con diluciones en serie de los anticuerpos analizados (1:3) y se detectó la unión al antígeno utilizando el anticuerpo secundario F(ab)2 anti-Fc humano conjugado con ficoeritrina. Los anticuerpos de un brazo que comprendían los dominios Fab alternativos con intercambio de dominios (variante 1 y 2) mostraron propiedades de unión al antígeno similares a las del anticuerpo que contiene un Fab sin modificar (Figura 17 A y B). La unión a EGFR para todas las muestras estuvo en un rango de CE50 de 2-4 nM.

Actividad funcional de anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios

Debido a las características proteicas comparables para las variantes 1 y 2, se eligió la variante 1 de los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios para ensayar la actividad funcional. Las células T activadas se cocultivaron con células A431 que sobreexpresaban EGFR en presencia de los anticuerpos ensayados en diluciones en serie (1:4). La lisis celular se midió mediante la liberación de LDH utilizando el ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox 96 (Promega) después del cocultivo de células efectoras y diana con una proporción E:T de 10:1 durante 18 h. Los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios con dominios CH3 alternativos (anti-CD3 x anti-EGFR) redirigieron la lisis de las células que sobreexpresaban EGFR por parte de las células T preestimuladas (Figura 18). Para la comparación con los Ejemplos anteriores, también se incluyó el anticuerpo biespecífico BsAb1 con intercambio de dominios (CH3-KiH anti-CD3 x anti-EGFR).

Esta lisis redirigida mediante células T demuestra que ambos brazos de los anticuerpos biespecíficos con intercambio de dominios con dominios CH3 alternativos son funcionales e interaccionan simultáneamente con las 2 dianas CD3 y EGFR para redirigir las células T hacia la lisis de las células diana A431.

Ejemplo 14: Ejemplos de combinaciones de dominios CH3 modificados para Fabs con intercambio de dominios en anticuerpos KiH heterodiméricos

Los dominios CH1/CL en anticuerpos KiH de un brazo se reemplazaron con dominios CH3 alternativos. Estos dominios CH3 alternativos eran los mismos que se usaron en el Ejemplo 13 excepto por el intercambio de dominios KiH. La Figura 19A ilustra esquemáticamente la estructura del anticuerpo KiH de un brazo con intercambio de dominios en el brazo de Fab. Como modelo, se eligió el dominio Fab de hu425 anti-EGFR para usarlo con VH(1) y VL(1). Se sintetizaron secuencias de ADN que codificaban los dominios CH3 alternativos y se construyeron seis vectores de expresión diferentes basados en pTT5 de mamífero, cada uno de los cuales contenía uno de los genes que codificaban:

SEQ ID 34: VH(1)-CH3 (E356K, D399K)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 35: VH(1)-CH3 (K392D, K409D)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 38: VH(1)-CH3_SEED (AG)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 39: VH(1)-CH3_SEED (GA)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

La generación de anticuerpos KiH de un brazo con intercambio de dominios se realizó mediante la coexpresión de 3 genes diferentes que codificaban 3 cadenas de anticuerpos diferentes. El huFc_KNOB (T366W) (SEQ ID 40) se coexpresó con estos dos genes:

El anticuerpo de un brazo ejemplificado se caracteriza específicamente por una cadena pesada H2 identificada por SEQ ID 40, y cualquiera de los siguientes pares de cadenas H1/L1:

Dominios CH3 de par de cargas (Gunasekaran et al. (2010)

Variante 1:

SEQ ID 34: VH(1)-CH3 (E356K, D399K)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 23: VL(1)-CH3 (K392D, K409D)

Variante 2:

SEQ ID 35: VH(1)-CH3 (K392D, K409D)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 25: VL(1)-CH3 (E356K, D399K)

Dominios CH3 Azymmetric (Von Kreudenstein et al. (2013))

Variante 1:

SEQ ID 36: VH(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V) SEQ ID 27: VL(1)-CH3 (T350V, T366L, K392L, T394W)

Variante 2:

SEQ ID 29: VL(1)-CH3 (T350V, L351Y, F405A, Y407V)

Dominios CH3 SEED (Davis et al. (2010))

Variante 1:

SEQ ID 38: VH(1)-CH3_SEED (AG)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 31: VL(1)-CH3_SEED (GA)

Variante 2:

SEQ ID 39: VH(1)-CH3_SEED (GA)-CH2-CH3_HOLE (T366S, L368A, Y407V)

SEQ ID 33: VL(1)-CH3_SEED (AG)

Se produjeron anticuerpos KiH de un brazo con intercambio de dominios en células de mamífero. Las proteínas se purificaron mediante proteína A a partir de los medios de cultivo celular mediante métodos habituales y se caracterizaron mediante SEC.

La SEC analítica mostró un pico principal con un tiempo de retención de ~7,9 min y un pico adicional con un tiempo de retención de ~8,3 min (Figura 19B). Además, se observó un pico adicional de especies de alto peso molecular (tiempo de retención de 7,4 min) para el anticuerpo de un brazo con intercambio de dominios que contenía CH3-Azymmetric. Además, el anticuerpo con intercambio de dominios de un brazo que contenía CH3-SEED mostró picos adicionales a los 5,7 min y 6,8 min de especies de alto peso molecular.

Estas proteínas se ensayaron adicionalmente con respecto a la unión celular a células positivas para EGFR usando citometría de flujo como se describió en los Ejemplos anteriores (Figura 20 A y B). Aunque se obtuvieron diferentes perfiles de SEC para los diferentes anticuerpos KiH de un brazo con intercambio de dominios, se observó una unión al antígeno similar en comparación con el anticuerpo de un brazo con intercambio de dominios descrito en los ejemplos 6 y 7, con valores de CE50 calculados para todos los anticuerpos en el rango de 3-5 nM.

En conjunto, los Ejemplos 13 y 14 demuestran que se pueden usar diferentes combinaciones de dominios CH3 modificados para formar anticuerpos con intercambio de dominios.

Referencias

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8. Von Kreudenstein TS, Escobar-Carbrera E, Lario PI, D'Angelo I, Brault K, Kelly J, Durocher Y, Baardsnes J, Woods RJ, Xie MH, Girod PA, Suits MD, Boulanger MJ, Poon DK, Ng G^y, Dixit SB. Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability: quality by molecular design. MAbs. Septiembre-octubre de 2013;5(5):646-54. doi: 10.4161/mabs.25632. Epub 8 de julio de 2013. PubMed PMID: 23924797.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo biespecífico con intercambio de dominios que comprende una primera cadena ligera (LC) emparejada con una primera cadena pesada (HC) que forma un primer dímero LC/HC que comprende un primer sitio de unión que reconoce un primer epítopo, y una segunda LC emparejada con una segunda HC que forma un segundo dímero LC/HC que comprende un segundo sitio de unión que reconoce un segundo epítopo que es diferente del primer epítopo o se origina a partir de un antígeno diferente;

donde el primer y el segundo HC están dimerizados formando así una región Fc que comprende un par de dominios CH3^hc/CH3^hc, cuya región Fc se caracteriza por un dímero de cadenas Fc, cada una de las cuales comprende CH2-CH3, donde el CH3 se denomina CH3CH;

i) una LC compuesta por VL-CH3, donde el CH3 se denomina CH3^lc, y

ii) una HC que comprende VH-CH3-CH2-CH3, donde el CH3 se denomina CH3^hc, y

iii) donde el VL-CH3 de la LC está dimerizado con la parte VH-CH3 de la HC formando así un dímero LC/HC con intercambio de dominios que comprende un par de dominios CH3^lc/CH3^hc,

donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hces un primer dominio CH3 mutante para producir un par afín de dominios CH3^lc/CH3^hc; y al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^hc/CH3^hces un segundo dominio CH3 mutante para producir el par afín de dominios CH3^hc/CH3^hc, donde el primer y segundo dominios CH3 mutantes difieren en al menos una mutación puntual;

donde cada uno de los dominios CH3 mutantes comprende la secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID 41, que comprende uno o más de los siguientes:

a) una o más mutaciones de botón u ojal, preferiblemente cualquiera de T366Y/Y407'T, F405A/T394'W, T366Y:F405A/T394'W:Y407'T, T366W/Y407'A y S354C:T366W/Y349'C:T366'S:L368'A:Y407'V;

b) un residuo de cisteína que está unido covalentemente a un residuo de cisteína del otro dominio CH3 con el que está emparejado el CH3 mutante, introduciendo así un puente disulfuro entre dominios, que une preferentemente el extremo C-terminal de ambos dominios CH3;

F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W, o

F405A:Y407V/T366L:T394W,

donde la numeración es según el índice EU de Kabat.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende al menos una prolongación C-terminal, donde la prolongación comprende otro par de dominios CH3^lc/CH3^hc.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hces un dominio CH3 mutante para producir un par afín de dominios CH3^lc/CH3^hc.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^hc/CH3^hces un dominio CH3 mutante para producir un par afín de dominios CH3^hc/CH3^hc.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la unión entre cualquiera de los dominios VH o VL y los dominios CH3 comprende una secuencia de aminoácidos, que es

a) al menos parte de la unión entre los dominios CH2 y CH3 de un anticuerpo IgG humano, y/o b) al menos parte de la unión entre los dominios VL y CL de un anticuerpo IgG humano; y/o

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende un sitio de unión a FcRn dependiente del pH ubicado en cualquiera de los dominios CH2 y/o CH3.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es un anticuerpo biespecífico que reconoce específicamente un primer y un segundo antígeno diana, que comprende un primer par de cadenas pesadas y ligeras que incorporan el sitio de unión que reconoce el primer antígeno diana, y un segundo par de cadenas pesadas y ligeras que incorporan el sitio de unión que reconoce el segundo antígeno diana.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, donde el primer antígeno diana es CD3 o CD16, y el segundo antígeno diana es EGFR.

9. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde al menos uno de los dominios CH3 del par de dominios CH3^lc/CH3^hccomprende al menos una mutación en el sitio de unión a FcRn para reducir la unión a FcRn dependiente del pH, específicamente al menos una de las mutaciones H433A o H435A, donde la numeración es según el índice EU de Kabat.

10. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde los dominios constantes del anticuerpo son de origen humano o dominios de anticuerpos IgG 1 humanizados.

11. Una preparación farmacéutica que comprende el anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Una célula huésped de producción que comprende al menos un casete de expresión o un plásmido que incorpora las moléculas de ácido nucleico de la reivindicación 12 y secuencias adicionales para expresar el anticuerpo.

14. Un método para producir un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde una célula huésped de la reivindicación 13 se cultiva o mantiene en condiciones para producir dicho anticuerpo.