CN107207592A - 结构域交换的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种结构域交换的抗体,其包含由VL‑CH3组成的轻链(LC)和包含VH‑CH3‑CH2‑CH3的重链(HC),其中所述LC的VL‑CH3与所述HC的VH‑CH3进行二聚,从而形成包括CH3LC/CH3HC结构域对的结构域交换的LC/HC二聚体,还提供了其制备方式和方法。
Description
技术领域
本发明涉及包含轻链(LC)和重链(HC)的结构域交换的抗体,其中所述LC与HC形成二聚体。
背景技术
单克隆抗体已被广泛用作治疗结合剂。本文将利用完整的IgG1免疫球蛋白作为实施例来解释基本的抗体结构。
两条相同的重(H)链和两条相同的轻(L)链结合形成Y型抗体分子。所述重链各有四个结构域。氨基末端可变结构域(VH)位于所述Y的顶端。其后是三个恒定结构域:CH1、CH2和羧基末端CH3,位于所述Y的茎部的底部。短延伸、开关连接所述重链可变区和恒定区。所述铰链(hinge)将CH2和CH3(Fc片段)连接到抗体的其余部分(Fab片段)。在完整抗体分子中,可以通过蛋白酶切割铰链产生一个Fc片段和两个相同的Fab片段。所述轻链由可变的(VL)和恒定的(CL)的两个结构域构成,通过开关隔开。
所述铰链区中的二硫键连接所述两条重链。所述轻链通过额外的二硫键与重链偶联。根据免疫球蛋白的种类,将连接Asn的碳水化合物部分连接在恒定结构域的不同位置。对于IgG1,在铰链区中的Cys235和Cys238对之间的两个二硫键联合所述两条重链。所述轻链通过两个额外的二硫键连接到重链上,所述两个额外的二硫键在所述CH1结构域中的Cys229s和所述CL结构域中的Cys214s之间。碳水化合物部分连接到每个CH2的Asn306上,在所述Y的茎部上产生明显的凸起。
这些特征具有深远的功能性效果。所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)位于N-端区,即所述Y的“顶端”,其设置为与抗原反应。所述分子的末端是氨基酸序列的N-端的所在的一侧。所述Y的茎部以有效介导效应子功能的方式进行延伸,例如补体的激活和与Fc受体或ADCC和ADCP的相互作用。所述Y的茎部的CH2和CH3结构域凸起,以促进与效应蛋白的相互作用。所述氨基酸序列的C-端位于所述顶端的相对侧,其可以称为Y的“末端”。
在抗体中发现了两种类型的轻链,称为λ(lambda))和κ(kappa)。给定的免疫球蛋白具有κ链或λ链,所述κ链或λ链都不是一个。在具有λ轻链或κ轻链的抗体之间没有发现功能差异。
抗体分子中的每个结构域具有在压缩的反平行β-桶状结构(beta barrel)中彼此紧密堆积的两个β褶板的相似结构。该保守结构称为免疫球蛋白折叠。所述恒定域的免疫球蛋白折叠含有与4条链的板堆积的3条链的板。通过每个板层的β折叠链之间的氢键、在内部相对的片层的残基之间的疏水键以及片层之间的二硫键来稳定所述折叠。所述3条链的板包括链C、F和G,以及所述4条链的板具有链A、B、E和D。字母A至G表示沿着所述免疫球蛋白折叠的氨基酸序列的β折叠链的先后次序。
可变结构域的折叠具有9条β折叠链,排列成4条链和5条链的两个板。所述5条链的板与恒定结构域的3条链的板结构同源,但5条链的板含有额外的链C'和C"。所述链(A、B、C、D、E、F、G)的其余部分具有与恒定结构域免疫球蛋白折叠中它们的对应物相同的拓扑结构和相似结构。如在恒定结构域中,二硫键连接相对片层中的链B和链F。
轻免疫球蛋白链和重免疫球蛋白链的可变结构域含有三个高变环或互补决定区(CDR)。V结构域的三个CDR(CDR1、CDR2、CDR3)聚集在所述β-桶状结构的一个末端上。所述CDR是连接免疫球蛋白折叠的β折叠链B-C、C'-C"和F-G的环。所述CDR中的残基从一个免疫球蛋白分子到下一个免疫球蛋白分子不相同,赋予每种抗体抗原特异性。
抗体分子顶端上的VL和VH结构域紧密堆积,使得6个CDR(每个结构域上3个)在构建用于抗原特异性结合的表面(或空腔)上协作。因此,抗体的天然抗原结合位点由连接所述轻链可变结构域的链B-C、C'-C"和F-G以及所述重链可变结构域的链B-C、C'-C"和F-G的环组成。
所述环不是天然免疫球蛋白中的CDR环,也不是由CDR环和CDR环区内的任意相邻的环所确定的部分抗原结合袋,其并不具有抗原结合或表位结合特异性,但是有利于整个免疫球蛋白分子和/或其效应物或其它功能物的正确折叠,因此被称为结构环。
现有技术文献显示,目前为了操纵现有的抗原结合位点,使用免疫球蛋白样骨架,从而引入新的结合特性。在大多数情况下,所述CDR区已经被改造用于抗原结合,换言之,在所述免疫球蛋白折叠的情况下,仅修饰天然抗原结合位点以改变其结合亲和力或特异性。存在大量文献,其描述了这种操作的免疫球蛋白的不同形式,其通常以单链Fv片段(scFv)或Fab片段的形式表达,其展现在噬菌体颗粒的表面或者可溶性表达于各种原核表达系统或真核表达系统中。
WO2006/072620A1描述了一种工程改造免疫球蛋白的方法,其包括修饰结构环区以获得新的抗原结合位点。该方法广泛适用于免疫球蛋白,并且可用于产生靶向多种抗原的免疫球蛋白的文库。已经表明CH3文库可用于选择能够通过所述结构环结合抗原的特异性文库成员。在本文中,这种结构环结合物也称为“免疫”CH3。根据实施例,已经工程改造了Fab样结构,其包括免疫CH3结构域以替代所述CH1结构域和CL结构域。
目前正在开发特异性双特异性抗体抗体构建体用于改进治疗。二价IgG取决于其重链的二聚化,通过其CH3结构域的同二聚体(homodimeric)缔合介导。
Davis等(Protein Engineering,Design&Selection 2010,23(4)195-202)描述了一种异二聚体(heterodimeric)Fc平台,其通过使用链交换的工程改造的结构域(SEED)CH3异二聚体来支持双特异性和不对称融合蛋白的设计。人IgG和IgA CH3结构域的这些衍生物产生互补的人SEED CH3异二聚体,该人SEED CH3异二聚体由人IgA和IgG序列的交替片段组成。EP1999154B1进一步描述了所述SEED工程改造。WO 2010/136172A1公开了三特异性抗体或四特异性抗体,其包括一个或两个与抗体的Fc部分的C-端连接的单链Fac。
Peipp等人(1January 2007,Handbook of Therapeutic Antibodies,pp 171-196)提供了Fc工程改造的综述。
Beck等人(Nature Reviews Immunology,vol.10,no.5,1May 2010,pp 345-352)描述了下一代治疗性抗体,并且特别是指不同类型的双特异性抗体。
Ridgway等人(Protein Engineering,vol.9,no.7,1996,pp 617-621)描述了用于重链异二聚化的抗体CH3结构域的“凸起-嵌-凹孔(knobs into-holes)”工程改造。
Atwell等人(Journal Of Molecular Biology,vol.270,no.1,1997,pp 26-35)描述了促进形成稳定的CH3异二聚体的抗体CH3结构域的界面残基的组合,包含“凸起(knob))”突变体和“凹孔(hole)”突变体。
Davis等人(Protein Engineering Design And Selection,vol.23,no.4,2010,pp 195-202)和WO 2007/110205A2描述了SEED体以及双特异性抗体,所述SEED体是基于链交换的工程改造的结构域(SEED)CH3异二聚体的融合蛋白。
Gunasekaran等人(Journal of Biological Chemistry,vol.285,no.25,2010,pp19637-19646)描述了通过静电转向效应和新的Fc突变增强抗体Fc异二聚体的形成以跨越Fc二聚体界面进行极性充电(charge polyrity)。
Von Kreudenstein等人(Landes Bioscience,vol.5,no.5,2013,pp 646-654)描述了基于为稳定性而工程改造的异二聚体Fc的双特异性抗体骨架。
发明内容
本发明的目的是提供具有改进结构的抗体,比如工程改造不对称分子,例如产生双特异性抗体。
通过本发明的主题实现该目的。
根据本发明提供了结构域交换的抗体,其包含由VL-CH3组成的轻链(LC)和包含VH-CH3-CH2-CH3的重链(HC),其中所述LC的VL-CH3与HC的VH-CH3二聚化,从而形成包括CH3LC/CH3HC结构域对的结构域交换的LC/HC二聚体。
具体地,所述抗体包括至少一个C-端延伸,其中所述延伸包括另一CH3LC/CH3HC结构域对。所述另一CH3LC/CH3HC结构域对是特定的一末端。例如,通过将Fab片段融合到具有或不具有接头(linker)序列的Fc部分(CH3HC/CH3HC结构域对)的一个或两个CH3结构域的C-端来延伸所述抗体。特别地,所述延伸可以包含一个或两个Fab片段,使得所述抗体包含两个、三个或四个Fab臂,其中至少一个所述Fab臂包含结构域交换。因此,至少一个Fab臂包含所述CH3LC/CH3HC结构域对。具体地,两个、三个或四个Fab臂可以包含CH3LC/CH3HC结构域对。
具体地,任一个或每个所述CH3结构域是IgG1CH3结构域,其特征在于人IgG1CH3序列或其工程改造的变体,包含一个或多个点突变,优选至多10个点突变。
具体地,所述CH2结构域是IgG2型,其特征在于人IgG2CH2序列或其工程改造的变体,其包括一个或多个点突变,优选至多10个点突变。
众所周知,任何抗体可以包含在该抗体的C-端延伸中的一个或多个结构域交换的Fab臂,例如IgG抗体。可以提供通过Fab臂延伸的抗体C-端,其中所述Fab臂的VL或VH结构域的N-端融合到具有或不具有接头序列的抗体的Fc部分的CH3的C-端。特别地,抗体可以包括一个、两个、三个或四个Fab臂,其中至少一个所述Fab臂是结构域交换的Fab臂。因此,至少一个Fab臂包含所述CH3LC/CH3HC结构域对。具体地,两个、三个或四个Fab臂可以包括所述CH3LC/CH3HC结构域对。
具体地,每个所述Fab臂包含由VH/VL结构域对组成的功能性抗原结合位点,该功能性抗原结合位点能够以高亲和力和KD小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M中任一种的靶结合。具体地,所述抗体是靶向两种不同抗原的结构域交换的双特异性抗体或异二聚体抗体,其中每种抗原由KD小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M中任一种的抗体识别。
具体地,所述抗体包括铰链区,优选人铰链区,例如人IgG1铰链区。
根据一具体方面,所述抗体还包括以CH3HC/CH3HC二聚体为特征的Fc区。所述Fc区的特征在于Fc链的二聚体,每个所述二聚体的特征在于包括CH2-CH3链,该二聚体可以是同二聚体或异二聚体,例如其中第一Fc链与第二Fc链在CH2和/或CH3结构域中的至少一个点突变中不同。
具体地,所述抗体仅包含一个LC/HC二聚体,其中所述HC进一步与包含CH2-CH3的Fc链进行二聚化,从而获得所述Fc区。这种抗体的特征仅在于一个Fab臂和所述Fc区。
根据具体方面,本发明提供了包括轻链(LC)和重链(HC)的结构域交换的抗体,其中HC与另一HC进行二聚,从而形成HC/HC二聚体,其包括至少一个C-端延伸,其中所述延伸包括CH3LC/CH3HC结构域对。这种结构域交换的抗体可以具体包括两个LC和两个HC,其中至少一个HC通过一个或两个Fab臂延伸。所述抗体具体包括至少一个至少一个Fab臂和至少一个结构域交换的Fab臂,其中
a)Fab臂包含与VH-CH1结构域配对的VL-CL结构域,以形成两个结构域链的二聚体;和
b)结构域交换的Fab臂包括与VH-CH3HC结构域配对的VL-CH3LC结构域,从而形成所述CH3LC/CH3HC结构域对。
具体地,根据上述a)所述抗体包含一个、两个或三个不是结构域交换的Fab臂,,以及根据上述b)所述抗体包含一个、两个或三个结构域交换的Fab臂。
图21中示出了具体实施方案。
例如,抗体的所述HC可以是VH1-CH1-CH2-CH3-VH2-CH3HET、VH1-CH1-CH2-CH3(AG_SEED)-VH2-CH3(凸起)、VH1-CH1-CH2-CH3(AG_SEED)-VL2-CH3(凸起)、VH2-CH3HET-VH1-CH1-CH2-CH3。
例如,可以通过将所述结构域交换的Fab加入到天然抗体的C-端来获得四价双特异性抗体。
或者,可以通过结合异二聚体HC/HC对来获得抗体,所述抗体对于一个靶是二价的和对于第二个靶是一价的,其中在所述对中仅一个HC具有与C-端连接的第二结构域交换的Fab。
根据一具体方面,所述抗体的C-端延伸中的所述一个或多个结构域交换的Fab臂包含CH3结构域,所述CH3结构域被工程改造以改变pH依赖性FcRn结合。例如,所述CH3LC/CH3HC结构域对中的至少一个CH3结构域可被工程改造,以在FcRn结合位点处包括至少一个突变,来降低pH依赖性FcRn结合。
pH依赖性FcRn结合的降低可以使得在pH依赖性方式下结合FcRn的结合亲和力小于1-log,与在生理pH(pH7.4)下相同的结合亲和力相比,优选在pH 5-6时约为相同或更小。
具有降低的pH依赖性FcRn结合的CH3结构域可以具体包括H433A突变或H435A突变中的至少一种,或同时包括H433A突变或H435A突变,其中根据Kabat的EU索引进行编号。
通过引入H433A突变和H435A突变(根据Kabat的EU索引编号)获得不具有天然CH3结构域pH依赖性FcRn结合位点的CH3LC变体和CH3HC变体的具体实施方案,其是pH依赖性FcRn结合位点的一部分,所述pH依赖性FcRn结合位点来自天然CH3结构域序列[9],序列见图22。
提供如本文所述的CH3结构域的突变氨基酸的编号作为对应于Kabat编号的位置。所述Kabat编号最初是指天然存在的抗体的编号。在本发明的抗体中,其包括结构域交换的结构,根据Kabat的EU索引编号,所述CH3结构域中的氨基酸的编号具体理解为由天然存在的抗体中的所述CH3结构域结构确定的类似位置。
具体地,所述CH3LC/CH3HC结构域对中的CH3结构域是异源的,特别是,其中在分子“外源(foreign)”的位置将CH3结构域合并到抗体结构中。从而,可以产生结构域交换的抗体。在本文中所述异源CH3也称为CH3HET。因此,所述CH3LC/CH3HC结构域对是特异性的异源二聚体(CH3HET/CH3HET),其中每个CH3HET与可变结构域N-端连接,例如其中第一CH3HET抗体结构域与VL结构域N-端连接,从而产生LC,第二CH3HET连接到VH结构域,从而产生部分HC,其中第一CH3HET和第二CH3HET至少通过与所述第一和第二CH3HET结构域的β片层区接触形成二聚体。具体地,所述第一和第二CH3HET结构域是非免疫性CH3结构域,其在结构环区中不包含抗原结合位点,比如无CDR结合位点。所述非免疫性CH3结构域具体不包括能够进行抗原结合的CDR样结合位点。
具体地,所述CH3HET/CH3HET二聚体是由氨基酸序列中彼此不同的两个CH3结构域组成的异二聚体,或具有相同氨基酸序列的两个CH3结构域的同二聚体。
具体地,产生与抗体的全长结构相似的结构,例如IgG,从而产生与IgG相同结构的IgG样结构,但是通过在不同于野生型位置的位置引入另外一对CH3HET结构域进行域交换,特别是替代结构域的CH1/CL对,该结构域的CH1/CL对被交换成一对CH3HET结构域的域。在所述全长抗体中,Fab臂中的一个或两个可以是Fab样结构。因此,一对或两对LC和HC可以包含结构域交换的结构,所述结构域交换的结构包括所述CH3HET/CH3HET二聚体。
具体地,通过Fc部分的融合延伸所述(Fab)2样结构,以获得IgG样结构。因此,每条所述重链是通过CH2-CH3结构域序列进行C-端延伸。
根据一具体实施方案,所述抗体是IgG抗体,其中所述LC由VL-CH3组成,可选地,其中所述结构域是直接连接的或者其中LC还包括一个或多个作为抗体结构域之间连接的接头区或铰链区。
根据一具体实施方案,所述抗体是IgG抗体,其中所述HC由VH-CH3-CH2-CH3组成,可选地,其中所述结构域是直接连接的或者其中HC还包括一个或多个作为抗体结构域之间的连接点的接头区或铰链区。
具体地,本发明的抗体具有仅包括一个Fab样结构和一个野生型Fab结构的IgG样结构。因此,根据一具体实施方案,所述抗体包含或由以下组成
a)一个由VL-CH3组成的LC和一由VH-CH3-CH2-CH3组成的HC,其中所述LC的VL-CH3与HC的VH-CH3进行二聚,从而形成第一LC/HC二聚体,其是包含CH3LC/CH3HC结构域对的结构域交换的LC/HC二聚体;和
b)一个由VL-CL组成的LC和一由VH-CH1-CH2-CH3组成的HC,其中所述LC的VL-CH1与HC的VH-CL进行二聚,从而形成第二LC/HC二聚体;
其中所述第一LC/HC二聚体的HC与第二LC/HC二聚体的HC形成二聚体,比如形成包含CH3HC/CH3HC结构域对的Fc部分。
具体地,所述CH3LC/CH3HC结构域对和/或CH3HC/CH3HC结构域对可以包含一个或两个工程改造的CH3结构域,以提高同源对的产生,比如当通过重组表达系统产生所述分子时降低CH3二聚体错配的可能性。
具体地,通过使由VH-CH3HET组成的重链与由VL-CH3HET组成的轻链二聚化来获得Fab样结构。
具体地,通过两条重链的连接来连接两个Fab结构以获得(Fab)2样结构,其中一个或两个所述Fab结构是Fab样结构。
根据又一具体实施方案,所述抗体是IgM抗体或IgE抗体,其中所述HC由VH-CH3-CH2-CH3-CH4组成,可选地,其中所述结构域是直接连接的或者其中HC还包含一个或多个作为抗体结构域之间的连接的接头区或铰链区。
具体地,通过Fc部分的融合来延伸(Fab)2样结构获得所述IgM样结构。由此,每条所述重链通过CH2-CH3-CH4结构域序列在C-端延伸。
具体地,所述接头或铰链区将提供HC的CH3HET的C-端区和CH2结构域的N-端区之间的连接,因此,所述抗体HC可以包括或由以下结构组成:VH-CH3-连接-CH2-CH3。
结构域的连接特定地通过重组融合或化学连接。具体连接可以通过将一个结构域的C-端连接到另一结构域的N-端,例如其中敲除所述末端区中的一个或多个氨基酸残基以缩短结构域大小,或延伸以增加结构域的柔性。
具体地,所述缩短的结构域序列包括C-端区和/或N-端区的缺失,例如删除至少1、2、3、4或5个,最多6、7、8、9或10个氨基酸。
具体地,可以使用连接序列,比如接头或铰链区或免疫球蛋白的铰链区的至少一部分,(本文连接序列也称为“连接点(junction)”),例如包含至少1、2、3、4或5个氨基酸,最多10、15或20个氨基酸。通过接头的结构域延伸可以通过源自免疫球蛋白结构域的N-端区或C-端区的氨基酸序列,所述免疫球蛋白结构域本身位于与该结构域相邻的位置,例如包含所述结构域之间的天然连接。或者,所述接头可以含有源自所述铰链区的氨基酸序列。但是,所述接头也可以是人造序列,例如由Gly或Ser氨基酸组成。
具体地,任何所述VH或VL结构域和CH3结构域之间的连接点包括氨基酸序列,其是
a)在人IgG抗体的CH2和CH3结构域之间的至少部分连接点,和/或
b)在人IgG抗体的VL和CL结构域之间至少的部分连接点;和/或
c)在人IgG抗体的VH和CH1结构域之间的至少部分连接点;和/或
d)具有长度为5至20个氨基酸的人造连接序列,优选8至15个氨基酸。
根据一具体方面,任何所述CH3HET结构域是人或人源化抗体,优选IgG1并且包括识别为为SEQ ID 41的氨基酸序列,或这种CH3结构域的功能变体,优选地与SEQ ID 41具有至少60%序列同一性,优选至少70%、80%、90%或95%序列同一性。
或者,所述CH3HET结构域是人或人源化IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD抗体,或这种CH3结构域的功能变体中的任意种,优选与SEQ ID 42、43、44、45、46、47或48中的任一个具有至少60%的序列同一性,优选至少70%、80%、90%或95%的序列同一性。
具体地,所述抗体的任何恒定域(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有所述抗体结构域)是其与相应的人抗体结构域具有至少60%的序列同一性的人源或其人源化的或功能活性变体,例如人IgG结构域。
根据一具体实施方案,包括在所述抗体中的所有结构域具有至少60%,或至少70%、80%、90%或95%的序列同一性的人源或其人源化的或功能活性变体,优选地其中所述免疫球蛋白结构域的来源是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM或IgE抗体中的任意种。具体地,所有的免疫球蛋白结构域来源于免疫球蛋白的相同类型或亚型。
根据一个方面,所述第一和/或第二CH3HET结构域来源于IgG1抗体。
具体地,所述第一和/或第二CH3HET结构域包括标识为SEQ ID 41中的任一氨基酸序列,可选地,其包括一个或多个点突变,优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点突变。
具体地,所述抗体包括可变结构域以建立两个独立的抗原结合位点,例如通过一个Fab和一个Fab样结构,从而提供两个Fv结构。这种构建体包括一个Fab臂,其包括野生型结构,其中VL-CL与VH-CH1进行二聚,以及第二Fab样臂包括与VH-CH3HC进行二聚的VL-CH3LC,从而将所述CH3LC/CH3HC结构域对掺入到所述抗体中。
具体地,所述抗体是靶向两种不同的抗原或抗原的两种不同表位的双特异性抗体。
具体地,所述抗体是双特异性抗体,其包括第一LC和第二LC,所述第一LC与第一HC配对以形成第一LC/HC二聚体,该第一LC/HC二聚体包含识别第一表位的第一结合位点,所述第二LC与第二HC配对以形成第二LC/HC二聚体,该第二LC/HC二聚体包含识别第二表位的第二结合位点,其中所述第一LC/HC二聚体或第二LC/HC二聚体是结构域交换的。
具体地,所述CH3LC/CH3HC结构域对的至少一个CH3结构域是能够产生CH3LC/CH3HC结构域的同源对的工程改造的CH3结构域。
因此,所述第一CH3HET结构域和/或第二CH3HET结构域可以是能够优先产生CH3HET/CH3HET的同源对的工程改造的CH3结构域。与天然(野生型)CH3对相比,这种同源对特异性地以较快地速率、亲和力或亲合力进行二聚。具体来,所述同源对以使所述修饰的CH3优先与另一个匹配的修饰的CH3二聚(配对)的方式进行工程改造,并以较少的程度识别另一(野生型或非匹配的)CH3结构域。
根据一具体方面,所述抗体包括CH3HC/CH3HC结构域对,例如包含在HC/HC二聚物中,其中至少一个CH3结构域是工程改造的CH3结构域,其能够产生CH3HC/CH3HC结构域的同源对。
具体地,所述CH3LC/CH3HC结构域对由包括标识为SEQ ID 41的氨基酸序列或其功能变体的野生型人IgG1 CH3结构域组成,并且所述CH3HC/CH3HC结构域对中的至少一个CH3结构域为工程改造的CH3结构域,其能够产生CH3HC/CH3HC结构域的同源对。
根据一具体实施方案,
a)所述CH3LC/CH3HC结构域对的至少一个CH3结构域是能够产生CH3LC/CH3HC结构域的同源对的工程改造的CH3结构域;和
b)所述CH3HC/CH3HC结构域对的至少一个CH3结构域是能够产生CH3HC/CH3HC结构域的同源对的工程改造的CH3结构域;
其中所述第一工程改造的CH3结构域和第二工程改造的CH3结构域至少一个点突变不同。
具体地,所述工程改造的CH3结构域(比如任何所述CH3LC/CH3HC结构域,或CH3HET结构域,或CH3HC/CH3HC结构域,例如CH3结构域的异二聚体对或同二聚体对的CH3结构域,)包括标识为SEQ ID 41的氨基酸序列或其与SEQ ID 41具有至少60%序列同一性的功能变体,该工程改造的CH3结构域包含以下一种或多种:
a)一个或多个凸起突变或凹孔突变,优选T366Y/Y407′T、F405A/T394′W、T366Y:F405A/T394′W:Y407′T、T366W/Y407′A和S354C:T366W/Y349′C:T366′S:L368′A:Y407′V中的任意种;
b)与另一个同源CH3结构域的半胱氨酸残基共价连接的半胱氨酸残基,从而引入结构域间二硫键,优选连接两个CH3结构域的C-端;
c)由人IgA和IgG CH3序列的交替区段组成的SEED CH3异二聚体;和/或
d)排斥电荷抑制异二聚体形成的一个或多个突变,优选
K409D/D399′K、K409D/D399′R、K409E/D399′K、K409E/D399′R、K409D:K392D/D399′K:E356′K或K409D:K392D:K370D/D399′K:E356′K:E357′K中的任意种;和/或
e)为异二聚体形成和/或热稳定选择的一种或多种突变,优选
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W,
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W,
L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W,
F405A:Y407V/T366L:K3g2M:T394W,或
F405A:Y407V/T366L:T394W,
其中是根据Kabat的EU索引进行编号。
在本文描述的点突变的说明书中,“斜线(slash)”将一条链或一个结构域上的点突变与来自相应对的其它链或其它结构域的点突变区分开;氨基酸位置编号中的“缩进(indent)”表示异二聚体的第二链或二聚体。“冒号(colon)”分别标识其中一条链或结构域上的点突变的组合。
可以使用如上所述的为异二聚体形成和/或热稳定而选择的任何突变或根据VonKreudenstein等人的公开内容[8]的其它突变。
优选地,(i)凸起突变;或(ii)凹孔突变,或(iii)凸起突变和凹孔突变,其在一条链或一个结构域上工程改造,并且对应物(i)凹孔突变;或(ii)凸起突变,或(iii)凹孔突变和凸起突变,其在所述异二聚体的另一条链上进行工程改造。
具体地,包含一个或两个工程改造的CH3结构域的一对CH3结构域可以包含多于一个(额外)的连接一对两个CH3结构域的结构域间二硫键,例如2个或3个。
具体地,在各对的CH3结构域的CH3结构域中工程改造不同的突变(根据上述a))以产生匹配对,其中一个结构域包含在β褶板区中空间修饰的接触表面,该结构域优选通过互补空间修饰连接到另一个结构域的相应接触表面。这种空间修饰主要是由不同的氨基酸残基和侧链产生的,例如产生“凸起”结构或“凹孔”结构,其互补形成“凸起-嵌-凹孔”二聚体。
根据一具体方面,一对CH3结构域的第一CH3结构域和第二CH3结构域中的每一个(例如所述CH3LC/CH3HC,或第一CH3HET结构域和第二CH3HET结构域,或CH3HC/CH3HC结构域)是具有标识为SEQ ID 41的氨基酸序列或SEQ ID 41的功能变体的IgG型,其通过掺入至少2个氨基酸长度的至少一个β折叠链IgA区段进行工程改造以获得链交换,并且其包括通过第一CH3结构域的IgA区段与第二CH3结构域的IgA区段配对的CH3结构域的同源对。这种链交换的CH3结构域具体可以包含IgA和IgG氨基酸序列的交替区段,例如含有至少1、2、3、4或5个不同的IgA区段,每个IgA区段位于不同位置,并通过非IgA区段(例如IgG区段)彼此分离。
根据一具体方面,所述抗体是包含位于CH2和/或CH3结构域的任一个中的Fcγ受体结合位点和/或C1q结合位点的效应子功能感受态抗体。
具体地,所述抗体是效应子感受态的,其包含在所述HC中和可选地在Fc区中的Fcγ受体结合位点。
具体地,所述抗体的特征在于ADCC和/或CDC活性中的任一种。
根据又一个具体方面,所述抗体是效应子-阴性(effector-negative)抗体,其包含Fc片段,所述Fc片段缺失了与Fcγ受体和/或C1q的结合。
具体地,所述效应子阴性抗体的特征在于人IgG2CH2序列或其工程改造的变体,其包括US8562986中描述的经修饰的人IgG2CH2结构域(F296A、N297Q),其融合至C-端CH3结构域的N-端,例如在“VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2EN-CH3AG”(SEQ ID 15)中所使用的。
具体地,当用于形成没有任何结合结构域的效应子阴性Fc区时,如用于在单价效应子阴性抗体中包含一条链,所述效应子阴性Fc区包括在US8562986中描述的修饰的人IgG1铰链(C220S)和修饰的人IgG2CH2结构域(F296A、N297Q),与C-端CH3结构域的N-端融合,例如在“huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA”(SEQ ID 16)中所使用的。
具体地,所述抗体是效应子缺陷型(本文中也称为效应子阴性),其通过所述Fc区明显减少或不与Fc受体或CD16a结合。
具体地,所述抗体具有明显减少的或者没有ADCC和/或CDC。
具体地,所述抗体包括抗体的Fc部分,所述抗体的Fc部分包含在所述CH2与CH3结构域的连接处的FcRn结合位点,和/或所述CH2结构域的N-端区内的Fcγ受体结合位点,和/或所述CH2结构域的N-端区的C1q结合位点。
根据一具体方面,所述抗体包含位于所述CH2和/或CH3结构域中任一个中的pH依赖性FcRn结合位点。具体地,所述FcRn结合位点以pH依赖性方式,具有结合FcRn的亲和力,Kd小于10-4M,或小于10-5M、10-6M、10-7M或10-8M。
具体地,与在生理pH(pH7.4)下的相同结合亲和力相比,以pH依赖性方式结合FcRn的结合亲和力在pH5-6时至少为1-log,优选至少为2-log或3-log。
根据又一方面,工程改造所述抗体以改变pH依赖性FcRn结合。例如,工程改造所述CH3LC/CH3HC结构域对中至少一个CH3结构域以在所述FcRn结合位点处包括至少一个突变以降低pH依赖性FcRn结合,特别是至少一种H433A突变或H435A突变,或H433A突变和H435A突变两种,其中根据Kabat的EU索引进行编号。pH依赖性FcRn结合的降低可以使得在pH依赖性方式下结合FcRn的结合亲和力小于1-log,与在生理pH(pH7.4)下相同的结合亲和力相比,优选在pH5-6时约为相同或更小。
通过这种FcRn结合的调节,可以提供仅包含位于C-端CH2和CH3结构域界面之间的(野生型)Fc片段的FcRn结合位点的抗体。
通过引入H433A突变和H435A突变(根据Kabat的EU索引编号)获得不具有天然CH3结构域pH依赖性FcRn结合位点的CH3LC变体和CH3HC变体的具体实施方案,其是pH依赖性FcRn结合位点的一部分,所述pH依赖性FcRn结合位点来自天然CH3结构域序列[9],序列见图22。
根据具体方面,所述抗体是以下任意种
a)特异性识别第一靶和第二靶的双特异性抗体,其包括含有识别所述第一靶的结合位点的第一对重链和轻链(H1/L1),和含有识别所述第二靶的结合位点的第二对重链和轻链(H2/L2);或者
b)通过单价结合位点特异性识别靶的单臂抗体,其包括含有识别所述靶的结合位点的一对重链和轻链(H1/L1),其中所述重链(H1)与另一由恒定区组成的重链(H2)结合,从而形成Fc区。具体地,所述单臂抗体包括H2,其是包含CH2-CH3抗体结构域的Fc链。所述单臂抗体的具体特征在于由CH2-CH3二聚体(同二聚体或异二聚体)组成的Fc区。具体地,所述Fc区的特征在于CH3HC/CH3HC二聚体。
特别地,任何所述双特异性抗体或单臂抗体的特征在于各自靶的单价结合。因此,每个双特异抗体或单臂抗体的具体特征仅在于每个靶只有一个结合位点。例如,所述双特异性抗体包含仅有一个识别第一靶的结合位点和仅有一个识别第二靶的结合位点。具体地,所述单臂抗体包含仅有一个识别所述靶的结合位点。
具体地,所述抗体是双特异性抗体,其中所述第一靶是CD3或CD16,以及第二靶是EGFR。
具体地,所述抗体是单臂抗体,其中所述靶是EGFR。
具体地,所述抗体是单臂抗体,其中所述靶是CD3。
具体地,所述抗体是单臂抗体,其中所述靶是CD16。
具体实施方案涉及本文例举的任何抗体,或包括在实施例部分中描述的任何重链和轻链或任何一对重链和轻链。具体地,如本文所述的抗体可以包括或由在实施例部分中描述的重链和轻链组成。
具体地,所述抗体提供用于医学、诊断或分析用途。
本发明进一步提供了包含本发明抗体的药物制剂,优选包括肠胃外制剂或粘膜制剂,可选地,含有药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明还提供了编码本发明抗体的分离的核酸。
本发明还提供包含本发明的核酸的表达盒或质粒,和可选地表达由核酸序列编码的抗体的其它序列,比如调节序列。
具体地,所述表达盒或质粒包含表达本发明抗体的HC和/或LC或多于一种HC和/或多于一种LC的编码序列。例如,所述抗体可以包含两种不同的HC和两种不同的LC,并且使用两种不同的HC和两种不同的LC的编码序列来产生异二聚体抗体。
本发明还提供了生产宿主细胞,其包含含有编码本发明的抗体的一个或多个核酸分子的至少一个表达盒或一质粒,以及任选进一步表达免疫球蛋白的序列。
本发明还提供了制备根据本发明的抗体的方法,其中在产生所述抗体的条件下培养或维持根据本发明的宿主细胞。
附图说明
图1:
图1A:在所述C-端CH3结构域(即所述CH3HC/CH3HC结构域对)中的Fab臂和SEED技术(GA/AG)之一具有CH3结构域交换的结构域交换的双特异性抗体的示意图。所述C-端GASEED结构域显示融合到天然Fab结构域,所述C-端AG SEED结构域显示融合到CH3结构域交换的Fab。但是,所述天然结构域交换的Fab或CH3结构域交换的Fab可以与C-端SEED结构域融合,因此在所述CH3HC/CH3HC结构域对之间的Fab的相对取向也可以逆转(这里未示出)。
1A-1:在与CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的SEED技术,该CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab包括所述重链中的凸起和所述Fab的轻链元件中的凹孔。1A-2:相当于(1A-1)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的凹孔和所述Fab的轻链元件中的凸起。1A-3:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的SEED技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]正电荷变体和所述Fab轻链元件中的负电荷变体。1A-4:相当于(1A-3)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]负电荷变体和所述Fab轻链元件中的正电荷变体。1A-5:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的SEED技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“链A”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链B”变体。1A-6:相当于(1A-5)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“链B”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链A”变体。1A-7:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的SEED技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“AG”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“GA”SEED变体。1A-8:相当于(1A-7)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“GA”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“AG”SEED变体。
图1B:在所述C-端CH3结构域(即所述CH3HC/CH3HC结构域对)中的Fab臂和凸起-嵌-凹孔(KiH)技术之一具有CH3结构域交换的结构域交换的双特异性抗体的示意图。所述C-端“凸起”结构域显示融合到天然Fab结构域,所述C-端“凹孔”结构域显示融合到CH3结构域交换的Fab。但是所述天然结构域交换的Fab或CH3结构域交换的Fab可以与C-端“凸起”或“凹孔”结构域融合,因此在所述CH3HC/CH3HC结构域对之间的Fab的相对取向也可以逆转(这里未示出)。
1B-1:与CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的凸起-嵌-凹孔技术,该CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab包括所述重链中的凸起和所述Fab的轻链元件中的凹孔。1B-2:相当于(1B-1)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的凹孔和所述Fab的轻链元件中的凸起。1B-3:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的的凸起-嵌-凹孔技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]正电荷变体和所述Fab轻链元件中的负电荷变体。1B-4:相当于(1B-3)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]负电荷变体和所述Fab轻链元件中的正电荷变体。1B-5:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的的凸起-嵌-凹孔技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“链A”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链B”变体。1B-6:相当于(1B-5)的的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“链B”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链A”变体。1B-7:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的的凸起-嵌-凹孔技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“AG”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“GA”SEED变体。1B-8:相当于(1B-7)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“GA”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“AG”SEED变体。
图1C:在所述C-端CH3结构域(即所述CH3HC/CH3HC结构域对)中的Fab臂和静电转向(参考文献7)技术之一具有CH3结构域交换的结构域交换的双特异性抗体的示意图。所述C-端静电转向[7]正电荷变体结构域显示与天然Fab结构域融合,以及所述C-端负电荷变体结构域显示与CH3结构域交换的Fab融合。但是所述天然结构域交换的Fab或CH3结构域交换的Fab可以与C-端正电荷变体结构域或负电荷变体结构域融合,因此在所述CH3HC/CH3HC结构域对之间的Fab的相对取向也可以逆转(这里未示出)。
1C-1:与CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的静电转向技术,该CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab包括所述重链中的凸起和所述Fab的轻链元件中的凹孔。1C-2:相当于(1C-1)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的凹孔和所述Fab的轻链元件中的凸起。1C-3:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的静电转向技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]正电荷变体和所述Fab轻链元件中的负电荷变体。1C-4:相当于(1C-3)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]负电荷变体和所述Fab轻链元件中的正电荷变体。1C-5:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的静电转向技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“链A”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链B”变体。1C-6:相当于(1C-5)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“链B”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链A”变体。1C-7:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的静电转向技术,该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“AG”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“GA”SEED变体。1C-8:相当于(1C-7)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“GA”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“AG”SEED变体。
图1D:在所述C-端CH3结构域(即所述CH3HC/CH3HC结构域对)中的Fab臂和工程改造的“链A”变体结构域和“链B”变体结构域(Von Kreudenstein参考文献8)技术之一具有CH3结构域交换的结构域交换的双特异性抗体的示意图。所述C-端链A[8]变体结构域显示与天然Fab结构域融合,所述C-端链B[8]变体结构域显示与CH3结构域交换的Fab融合。但是所述天然结构域交换的Fab或CH3结构域交换的Fab可以与C-端链A变体结构域或链B变体结构域融合,因此在所述CH3HC/CH3HC结构域对之间的Fab的相对取向也可以逆转(这里未示出)。
1D-1:与CH3的凸起-嵌入-凹孔结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的链A变体结构域技术和链B变体结构域技术[8],该CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab包括所述重链中的凸起和所述Fab的轻链元件中的凹孔。1D-2:相当于(1D-1)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的凹孔和所述Fab的轻链元件中的凸起。1D-3:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的链A变体结构域技术和链B变体结构域技术[8],该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]正电荷变体和所述Fab轻链元件中的负电荷变体。1D-4:相当于(1D-3)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“静电转向”[7]负电荷变体和所述Fab轻链元件中的正电荷变体。1D-5:与CH3结构域配对的C-端CH3结构域中的链A变体结构域技术和链B变体结构域技术[8],该CH3结构域包括所述重链中的“链A”[8]变体和所述Fab轻链元件中的“链B”变体。1D-6:相当于(1D-5)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“链B”(参考文献8)变体和所述Fab轻链元件中的“链A”变体。1D-7:与CH3结构域交换的Fab配对的C-端CH3结构域中的链A变体结构域技术和链B变体结构域技术[8],该CH3结构域交换的Fab包括所述重链中的“AG”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“GA”SEED变体。1D-8:相当于(1D-7)的实施例,但是是与结构域交换的Fab配对,该结构域交换的Fab包括所述重链中的“GA”SEED[2]变体和所述Fab轻链元件中的“AG”SEED变体。
图2:
图2A:通过非还原SDS-PAGE表征结构域交换的异二聚体双特异性抗体。用胶态蓝色染色试剂盒(Invitrogen)给SDS-PAGE染色。泳道1:非还原结构域交换的异二聚体双特异性抗体1(在CH3AG-重链上的Fab结构域交换)。泳道2:非还原结构域交换的异二聚体双特异性抗体2(在CH3GA-重链上的Fab结构域交换)。泳道3:非还原结构域交换的异二聚体双特异性抗体3(在CH3GA-重链上含有CH3wt结构域交换的Fab臂)。泳道4:蛋白质标准品SeeBluePlus 2预染分子量标记物(Invitrogen)。
图2B:所述结构域交换的异二聚体双特异性抗体1的SEC图谱(参见实施例1和2)。
图2C:所述结构域交换的异二聚体双特异性抗体2的SEC图谱(参见实施例1和2)。
图2D:所述结构域交换的异二聚体双特异性抗体3的SEC图谱(参见实施例1和2)。
图3:
图3A:在还原或非还原的条件下通过SDS-PAGE表征所述结构域交换的双特异性抗体1(BsAb1)。用胶态蓝染色试剂盒(Invitrogen)给SDS-PAGE染色。泳道1:蛋白质标准品SeeBlue Plus 2预染分子量标记物(Invitrogen)。泳道2:还原的SDS-PAGE图谱显示对应于VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)的H1带,对应于VH(2)-CH1-CH2-CH3GA(SEQID 4)的H2带和对应于VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)和VL(2)-CL(SEQ ID 3)的L1+L2带。泳道3:非还原的SDS-PAGE图谱显示对应于所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1的双特异性抗体的主带。
图3B:所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1的SEC图谱。
图4:所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1的FACS分析。
图5:单臂抗体的示意图,其包含融合到SEED AG结构域的Fab臂中的未工程改造Fab结构域或CH3结构域交换。
图6:
图6A:在非还原和还原条件下通过SDS-PAGE表征单臂抗体,其含有所述未工程改造的Fab结构域或CH3结构域交换的Fab。用胶态蓝染色试剂盒(Invitrogen)给SDS-PAGE染色。泳道1:蛋白质标准品SeeBlue Plus 2预染分子量标记物(Invitrogen)。泳道2:非还原图谱显示对应于所述非工程改造的抗体(CH1/CL Fab)的单臂抗体主带。泳道3:非还原图谱显示对应于所述结构域交换的Fab抗体的单臂抗体主要带。泳道4:还原图谱显示对应于VH(1)-CH1-CH2-CH3AG(SEQ ID 11)的H1带,对应于huFc-GA SEED(SEQ ID 9)的H2带和对应于VL(1)-CL(SEQ ID 10)的L1带。泳道5:还原图谱显示对应于VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)的H1带,对应于huFc-GA SEED(SEQ ID 9)的H2带和对应于VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)的L1带。
图6B:单臂抗体的SEC图谱,所述单臂抗体含有在所述Fab中未工程改造的CH1/CL结构域或在所述Fab臂中使用CH3-KiH同源结构域对的结构域交换的Fab(参见实施例6)。
图7:单臂抗体(未工程改造的Fab和结构域交换的Fab)和BsAb1抗原结合到EGFR-阳性细胞(A431细胞)。通过流式细胞术测量细胞结合。以连续稀释(1:3)测试所述抗体,并使用与藻红蛋白结合的抗人Fc F(ab)2第二抗体检测结合。重复进行测量。
图8:
图8A:在还原或非还原条件下,通过SDS-PAGE表征所述结构域交换的BsAb2(抗-CD16×抗-EGFR CH3-KiH)。用胶态蓝染色试剂盒(Invitrogen)给SDS-PAGE染色。泳道1:蛋白质标准品SeeBlue Plus 2预染分子量标记物,(Invitrogen)。泳道2:还原图谱显示对应于VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)的H1带,对应于VH(3)-CH1-CH2-CH3GA(SEQ ID 13)的H2带,对应于VL(3)-CL(SEQ ID 12)的L1带和对应于VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)的L2带。泳道3:非还原图谱显示对应于所述结构域交换的BsAb2(抗-CD16×抗-EGFR CH3-KiH)的主带。
图8B:所述结构域交换的交换BsAb2(抗-CD16×抗-EGFR CH3-KiH)的SEC图谱。
图9:所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1(抗-CD3×抗-EGFR CH3-KiH)的LC-MS分析。在测量前,样品利用PNGase进行去糖基化。去卷积和谱给出正确组装的双特异性抗体的质量。
图10结构域交换的交换双特异性抗体BsAb2(抗-CD16×抗-EGFR CH3-KiH)的LC-MS分析。在测量前,样品利用PNGase进行去糖基化。去卷积和谱给出正确组装的双特异性抗体的质量。
图11:通过LC-MS测定与2个竞争轻链共表达的单臂非工程化抗体的总质量。仅发现正确组装的抗体。无法检测到错配的mAb(用箭头标记潜在错配的质量的位置)。
图12:通过LC-MS测定与2个竞争轻链共表达的单臂结构域交换的抗体的总质量。仅发现正确组装的抗体。无法检测到错配的mAb(用箭头标记潜在错配的质量的位置)。
图13:结构域交换的双特异性抗体BsAb1和BsAb2的DSC谱图。
图14:抗体与CD16a受体的结合。利用CD16a HTRF细胞结合测定法(CisBio)测量结合。重复进行测量。
图15:在存在结构域交换的双特异性抗体BsAb1(A)和BsAb2(B)的条件下,通过效应细胞重新定向裂解A431细胞。
图16:通过单臂抗EGFR SEED抗体的非还原性SDS-PAGE和SEC对具有交替工程改造的Fab区的结构域交换的抗体进行生物物理学表征(A和C),以及-通过构域交换的抗体(抗-CD3×抗-EGFR-CH3)的非还原性SDS-PAGE和SEC对具有交替工程改造的Fab区的结构域交换的抗体进行生物物理学表征(B和D)。蛋白质在Expi293细胞中产生并通过蛋白A进行一步纯化。SDS-PAGE凝胶的每条泳道装载5μg蛋白质,分离后用胶态蓝染色试剂盒(Invitrogen)给蛋白质染色。在SDS-PAGE中变体1和变体2用1和2表示。变体1的SEC曲线以黑线表示,变体2的SEC曲线以虚线表示。(更多详细信息参见实施例13)
图17:通过流式细胞术测量单臂抗体与变体1(A)和变体2(B)的交替结构域交换的Fab臂的EGFR结合。以连续稀释(1:3)测试所述抗体,并使用与藻红蛋白结合的抗人Fc F(ab)2抗体检测结合。每个数据点代表重复的平均值。
图18:在存在具有交替工程化Fab结构域(变体1)的结构域交换的双特异性抗体的条件下,通过活化的T细胞重新定向靶细胞裂解。T细胞在培养基中用IL-2和抗CD3IgG活化24小时。在存在连续稀释(1:4)的抗体的条件下,将受刺激的T细胞与A431细胞以10:1的E:T比共培养18小时。利用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定法(Promega),在上清液中测量细胞裂解(LDH释放)。每个数据点是三次平均值±SD。使用来自前述实施例的结构域交换的BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)用于比较。
图19:单臂结构域交换的KiH抗体的表征。如在示意图(A)中所示,这些分子在Expi293细胞中产生并且蛋白A纯化后通过SEC(B)分析。变体1的SEC曲线以黑线表示,变体2的SEC曲线以虚线表示。
图20:通过流式细胞术测量单臂KiH抗体与变体1(A)和变体2(B)的选择性工程改造的Fab区的EGFR结合。以连续稀释(1:3)测试所述抗体,并使用与藻红蛋白结合的抗人FcF(ab)2抗体检测与A431细胞结合的抗原。每个数据点表示单个测量。
图21:通过将CH3结构域交换的Fab连接到抗体的不同位置并与工程改造的异二聚体重链组合而形成的多种抗体的几个实施例的示意图。CH3结构域交换的Fab可以连接到天然抗体的不同位置或连接到工程改造的异二聚体重链对。如实施例所示,可以使用各种工程改造的CH3结构域以形成所述异二聚体重链或形成所述CH3结构域交换的Fab(在此并未示出所有选项)。
21-1:由具有N-端Fab的天然Ig抗体组成的四价双特异性抗体,所述N-端Fab由配对的VH1-CH1/VL1-CL结构域组成,所述VH1-CH1/VL1-CL结构域与CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab结合,该CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab包括VH2-CH3(凸起)和VL2-CH3(凹孔),所述四价双特异性抗体的VH2-CH3(凸起)的N-端连接到天然抗体的C-端。
21-2:由具有N-端Fab的天然Ig抗体组成的四价双特异性抗体,该N-端Fab由配对的VH1-CH1/VL1-CL结构域组成,所述VH1-CH1/VL1-CL结构域与CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab结合,该CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换结构域交换的Fab包括VH2-CH3(凹孔)和VL2-CH3(凸起),所述四价双特异性抗体的VL2-CH3(凸起)的N-端连接到天然抗体的C-端。
21-3:双特异性抗体,N-端二价,C-端为一价,由SEED技术组装的异二聚体重链组成,N-端Fab连接到每条重链,所述的每条重链由配对的VH1-CH1/VL1-CL结构域组成,所述VH1-CH1/VL1-CL结构域与CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab结合,该CH3的凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab由VH2-CH3(凸起)和VL2-CH3(凹孔)组成,所述双特异性抗体的VH2-CH3(凸起)的N-端仅与一条SEED重链中的C-端连接。
21-4:双特异性抗体,N-端为一价,C-端为二价,由SEED技术组装的异二聚体重链组成,N-端Fab仅与一条SEED重链连接,所述的SEED重链由配对的VH1-CH1/VL1-CL结构域组成,所述VH1-CH1/VL1-CL结构域与CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab结合,该CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab由VH2-CH3(凸起)和VL2-CH3(凹孔),所述双特异性抗体的VH2-CH3(凸起)的N-端与两条SEED重链中的C-端连接。
21-5:三特异性抗体,N-端为二价,以及C-端为2个不同的一价Fab结构域,由以SEED技术组装的异二聚体重链组成,N-端Fab连接到由配对的VH1-CH1/VL1-CL结构域组成的每条重链,所述VH1-CH1/VL1-CL结构域与CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab结合,所述CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab包括VH2-CH3(凸起)和VL2-CH3(凹孔),VH2-CH3(凸起)的N-端连接到GA SEED结构域的C-端和不同的CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab,所述CH3凸起-嵌-凹孔结构域交换的Fab由VH3-CH3(凸起)和VL3-CH3(凹孔),VL3-CH3(凹孔)的N-端连接到AG SEED结构域的C-端。
图22:
所述结构域交换的双特异性抗体轻链和重链的多肽序列:
可变结构域是斜体字符。CH3结构域交换的序列加下划线。SEED CH3-GA和SEEDCH-AG结构域用粗体标记。引入突变形成的凸起、凹孔或其它设计用于促进CH3结构域异二聚化的变体(在一些可能的具体实施方案的实施例中描述)以灰色和下划线突出显示。
SEQ ID 1:VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)
SEQ ID 2:VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG
SEQ ID 3:VL(2)-CL
SEQ ID 4:VH(2)-CH1-CH2-CH3GA
SEQ ID 5:VH(2)-CH1-CH2-CH3AG
SEQ ID 6:VH(1)-CH3-KNOB(T366Y)-CH2-CH3GA
SEQ ID 7:VL(1)-CH3wt
SEQ ID 8:VH(1)-CH3wt-CH2-CH3GA
SEQ ID 9:huFc_GA SEED
SEQ 10:VL(1)-CL
SEQ 11:VH(1)-CH1-CH2-CH3AG
SEQ ID 12:VL(3)-CL
SEQ ID 13:VH(3)-CH1-CH2-CH3GA
SEQ ID 14:VH(3)-CH1-CH2-CH3AG
SEQ ID 15:VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2EN-CH3AG
SEQ ID 16:huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA
SEQ ID 17:VH(3)-CH1-CH2EN-CH3GA
SEQ ID 18:VH(1)-CH3_KNOB(T366W)-CH2-CH3AG
SEQ ID 19:VL(1)-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 20:VH(1)-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)-CH2-CH3AG
SEQ ID 21:VL(1)-CH3_KNOB(T366W)
SEQ ID 22:VH(1)-CH3(E356K,D399K)-CH2-CH3AG
SEQ ID 23:VL(1)-CH3(K392D,K409D)
SEQ ID 24:VH(1)-CH3(K392D,K409D)-CH2-CH3AG
SEQ ID 25:VL(1)-CH3(E356K,D399K)
SEQ ID 26:VH(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)-CH2-CH3AG
SEQ ID 27:VL(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)
SEQ ID 28:VH(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)-CH2-CH3AG
SEQ ID 29:VL(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)
SEQ ID 30:VH(1)-CH3_SEED(AG)-CH2-CH3AG
SEQ ID 31:VL(1)-CH3_SEED(GA)
SEQ ID 32:VH(1)-CH3_SEED(GA)-CH2-CH3AG
SEQ ID 33:VL(1)-CH3_SEED(AG)
SEQ ID 34:VH(1)-CH3(E356K,D399K)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 35:VH(1)-CH3(K392D,K409D)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 36:VH(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 37:VH(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 38:VH(1)-CH3_SEED(AG)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 39:VH(1)-CH3_SEED(GA)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 40:huFc_KNOB(T366W)
人CH3结构域的氨基酸序列
SEQ ID 41:人IgG1的CH3
SEQ ID 42:人IgG2的CH3
SEQ ID 43:人IgG3的CH3
SEQ ID 44:人IgG4的CH3
SEQ ID 45:人IgA的CH3
SEQ ID 46:人IgM的CH3
SEQ ID 47:人IgE的CH3
SEQ ID 48:人IgD的CH3
用作在结构域交换的Fab重链和轻链元件中转换序列侧面连接交换的结构域的N-端和C-端的实施例的氨基酸序列
SEQ ID 49:人κ链108-111(KabatEU编号)
SEQ ID 50:人IgG1重链345-348(Kabat EU编号)
SEQ ID 51:人IgG1重链438-444(Kabat EU编号)
SEQ ID 52:人VH J区109-113(Kabat EU编号)
SEQ ID 53:人CH1结构域118-122(Kabat EU编号)
具体实施方式
本文所用的术语“抗体”定义为抗原结合多肽,其为免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子,或其它表现出模块抗体形式的蛋白质,例如由一个或多个抗体结构域组成并具有类似于免疫球蛋白或抗体的抗原结合特性,特别是可以显示单特异性或双特异性或多特异性,或一价、二价或多价结合性质的蛋白质,例如用于抗原、效应分子或结构的表位的至少两个特异性结合位点,特别是病原体来源或人结构,如包含细胞相关蛋白或血清蛋白的自身抗原。在本文中术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换使用。
抗体通常由抗体结构域组成或包括抗体结构域,其被理解为具有或不具有接头序列的免疫球蛋白的重链和/或轻链的恒定结构域和/或可变结构域。抗体具体理解为由具有或不具有连接序列或铰链区的可变抗体结构域和/或恒定抗体结构域的组合组成或包括具有或不具有连接序列或铰链区的可变抗体结构域和/或恒定抗体结构域的组合,包括可变抗体结构域对,例如一个或两个VH/VL对。如果包括通过环序列连接的抗体结构域结构的至少两个β折叠链组成的β桶状结构,则多肽理解为抗体结构域。抗体结构域可以是天然结构的或通过诱变或衍生化修饰,例如修饰抗原结合性质或任何其它性质,比如稳定性或功能性质,比如结合Fc受体FcRn和/或Fcγ受体。
本文所用的术语“抗体”具体包含全长抗体,包含免疫球蛋白样结构的抗体,比如结构域交换的抗体。具体地,抗体可以是全长抗体,例如IgG类型(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。
所述术语还包含具有抗体结构域或抗体片段的抗体衍生物或抗体组合。
术语“全长抗体”可以用于指包括至少大部分所述Fc结构域的任何抗体分子,具体包含重链二聚体,从而至少产生CH3HC/CH3HC对,和通常在天然存在的抗体结构中发现的其它结构域。本文使用的这个术语“全长抗体”强调特定抗体分子而不是抗体片段。
据此,通常将抗体理解为蛋白质(或蛋白质复合物),其包含一种或多种多肽,所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码。公认的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及免疫球蛋白可变区基因。将轻链(LC)归类为κ或λ。将重链(HC)归类为γ、μ、α、δ或ε,其又分别依次限定免疫球蛋白类别,IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
HC或LC各自由连接彼此的至少两个结构域组成,以产生结构域链。特别理解的是,抗体HC包括VH抗体结构域和至少一个结合所述VH的抗体结构域C-端。抗体LC包括VL抗体结构域和至少一个结合所述VL的抗体结构域。
所述定义还包含可变区(例如dAb、Fd、V1、Vk、Vh、VHH)的重链和轻链的结构域,以及完整抗体的恒定区或单个结构域,比如CH1、CH2、CH3、CH4、Cl和Ck,以及由结构环连接的免疫球蛋白结构域的至少两个β折叠链组成的微小结构域。通常,具有通过特定CDR结构的抗原结合位点的免疫球蛋白能够通过一对VH/VL结构域的CDR环结合靶抗原。
术语“抗体”应该具体包含分离形式的抗体或免疫球蛋白,其基本上不含针对不同靶抗原的其它抗体或免疫球蛋白,和/或包括抗体结构域的不同结构排列。尽管如此,分离的抗体可以包含在组合制剂中,其含有分离的抗体的组合,例如与至少一种其它抗体,比如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段。
术语“抗体”应该适用于动物来源的抗体或免疫球蛋白,所述动物来源包含人类,例如哺乳动物(包含人、鼠、兔子、山羊、羊驼属(lama)、牛和马),或禽类(例如母鸡),其术语应该特别包含基于动物来源的序列(例如人序列)的重组免疫球蛋白。
术语“抗体”特别适用于人抗体。
关于抗体或免疫球蛋白使用的术语“人”理解为包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包含未被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机诱变或特定位点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变),例如在所述CDR中。人抗体包含从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物分离的抗体。
优选地,人抗体选自或衍生自由IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM组成的组。
优选地,鼠抗体选自或衍生自由IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C、IgG3和IgM组成的组。
术语“抗体”进一步适用于嵌合(chimeric)抗体或嵌合免疫球蛋白(例如嵌合抗体),具有不同物种来源的序列(例如鼠源和人源的序列)。
关于免疫球蛋白或抗体使用的术语“嵌合(chimeric)”是指重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与衍生自特定物种或属于特定种类的免疫球蛋白中的相应序列同源的那些分子,而所述链的剩余片段与另一物种或种类中的相应序列同源。通常,所述轻链和重链的可变区模拟衍生自一种哺乳动物的免疫球蛋白的可变区,而所述恒定部分与衍生自另一种哺乳动物的免疫球蛋白序列同源。例如,使用来自使用从非人宿主生物体的容易获得的B细胞或杂交瘤与源自例如人细胞制剂的恒定区组合,可以从目前已知的来源获得可变区。
术语“抗体”可进一步适用于人源化抗体或人源化免疫球蛋白。
关于抗体或免疫球蛋白使用的术语“人源化”是指具有基本上衍生自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子,其中所述分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。所述抗原结合位点可以包括融合到恒定结构域上的完全可变结构域,或仅包括在所述可变结构域中移植到适当骨架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰的,例如通过一个或多个氨基酸取代,优选修饰到更接近的类似于人免疫球蛋白。某些形式的人源化免疫球蛋白保留所有CDR序列(例如含有来自小鼠抗体的所有6个CDR的人源化小鼠抗体)。其它形式具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR。
术语“抗体”还适用于单克隆或多克隆抗体,特别是重组抗体,该术语包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构,比如源自动物的抗体,例如哺乳动物(包含人),包括来自不同来源的基因或序列,例如嵌合抗体、人源化抗体或杂交细胞衍生的抗体。进一步的实施例涉及从转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体,或从抗体或抗体结构域的重组文库、组合文库中分离的抗体,或通过涉及剪接抗体基因序列到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。
术语“抗体”理解为包含新的或现存的功能活性变体,例如天然存在的抗体。还应当理解,抗体的术语变体,特别是抗体样分子的变体或抗体变体,也应该包含这些分子的衍生物。衍生物是一种或多种抗体和/或融合蛋白的任何组合,其中所述抗体的任何结构域或微型结构域可以在任何位置融合到一种或多种其它蛋白质,比如融合到其它抗体或抗体片段,而且还融合到配体、酶、毒素等。本发明的抗体可以特定地与其它肽或多肽用作分离的多肽或组合分子,例如通过重组、融合或偶联(conjugation)技术。优选地,所述肽与免疫球蛋白结构域序列同源,并且优选至少5个氨基酸长,更优选至少10个或甚至至少50个或100个氨基酸长,并且至少部分构成所述免疫球蛋白结构域的环区。
所述抗体的衍生物也可以通过各种化学技术(比如共价偶联、静电作用、二硫化物键合等)与其它物质缔合或结合而获得。与免疫球蛋白结合的所述其它物质可以是脂质、碳水化合物、核酸、有机分子和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前药(prodrug)或药物)。衍生物还将包括具有相同氨基酸序列的抗体,但是所述抗体完全或部分由非天然或化学修饰的氨基酸制成。在具体实施方案中,所述抗体是包含附加标签(tag)的衍生物,所述附加标签允许与生物可接受的化合物进行特异相互作用。对于本发明中使用的标签没有特别的限制,只要其对免疫球蛋白与其靶的结合没有负面影响或者可以承受负面影响。合适标签的实施例包含组氨酸标签(His-tag)、Myc标签、FLAG标签、链球菌标签(Strep tag)、钙调蛋白标签、GST标签、MBP标签和S标签。在另一个具体实施方案中,所述免疫球蛋白是包括标记(label)的衍生物。本文所用的术语“标记”是指可检测化合物或组合物,其可直接或间接与免疫球蛋白结合以产生“标记”抗体。所述标记本身可以被检测到,例如放射性同位素标记或荧光标记,或者在酶标记的情况下,可以催化可检测的底物化合物或底物组合物的化学改变。
例如,抗体的衍生物是衍生自亲本抗体或抗体序列,比如亲本抗原结合(例如CDR)或框架(FR)序列,例如突变体或变体,该突变体或变体例如通过在硅胶(silico)或重组工程中或通过化学衍生化或合成获得。
本文所用的术语“变体”应该具体包括本文所述的任何“突变体”、“同系物”或“衍生物”。术语“变体”应该具体包括功能活性变体。根据本发明的抗体的功能变体在LC和HC的抗原结合和二聚化方面特别有功效,从而形成CH3LC/CH3HC结构域对。
术语“变体”应特指抗体,比如突变抗体或抗体片段,例如通过诱变方法获得,特别是删除、交换、将插入片段导入特异性抗体氨基酸序列或区段或化学衍生氨基酸序列,例如在恒定结构域中工程改造所述抗体的稳定性、效应子功能或半衰期,或在可变结构域中,以改善抗原结合特性,例如通过本领域可获得的亲和力成熟技术。可以使用任何已知的诱变方法,包含在所需位置的点突变,例如通过随机化技术获得。在某些情况下,位置是随机选择的,例如用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸使所述抗体序列随机化。术语“诱变”是指用于改变多核苷酸或多肽序列的任何现有公认的技术。优选的诱变类型包含易出错的PCR诱变、饱和诱变或其它定点诱变。
本文中术语“功能变体”也称为“功能活性变体”,例如可以包括序列,所述序列来自于通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸的亲本序列(例如来自亲本抗体),或化学衍生氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基、或在所述核苷酸序列中的核苷酸,或在所述序列的远端中的任一个或两个,例如在CDR或FR序列中,并且修饰不影响(特别是损害)该序列的活性。在对选择的靶抗原具有特异性的结合位点的情况下,抗体的功能活性变体仍然具有预定的结合特异性,尽管这可以改变,例如将精准特异性改变为特异性表位、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。例如,将亲和力成熟抗体特别理解为功能活性变体抗体。因此,将亲和力成熟抗体中的修饰的CDR序列理解为功能活性变体。
与亲本分子相比,所述功能活性优选由所述变体的结构和功能确定,例如在用于以pH依赖的方式测定结合靶抗原的特异性和/或所述分子所需的体内半衰期和/或所述FcRn结合的测定法,例如在标准测定中通过测量免疫球蛋白的功能性测定。
当所述抗原在细胞表面表达时,通常用ELISA测定法、BIAcore测定法、Octet BLI测定法或基于FACS的测定法测定抗体的抗原结合功能活性。
例如,可以通过改变亲本抗体的序列来获得功能活性变体,,例如具有免疫球蛋白特异性天然结构(比如IgG1结构)的单克隆抗体,以获得在识别靶抗原时具有相同特异性但具有不同于亲本结构的结构的变体,例如以修饰任何免疫球蛋白结构域以引入特异性突变,产生双特异性构建体,或产生亲本分子的片段。
通常,可以修饰亲本免疫球蛋白或序列以产生变体,该变体包含抗原结合位点之外或在结合位点内的不损害抗原结合的序列区内的突变体,并且优选具有类似于亲本抗体的生物活性,包括结合抗原的能力,例如具有基本上相同的生物活性,如通过特异性结合测定或功能测试来确定靶向抗原。
本文所用术语“基本上相同的生物活性”是指活性由与相当的或亲本抗体确定的活性的至少20%、至少50%、至少75%、至少90%,例如至少100%,或至少125%,或至少150%,或至少175%,或例如高达200%的活性基本相同活性表示。
本文所述的优选变体在抗原结合方面具有功能活性,优选具有特异性结合单个抗原的效力,而不显著地结合不是靶抗原的其它抗原,例如Kd值差异为至少2log,优选至少3log。功能活性变体结合的抗原通常不受损害,对应于与亲本抗体或序列或包括序列变体的抗体大体基本相同的结合亲和力,例如Kd值差异小于2log,优选小于3log,但是,具有甚至改善亲和力的可能性,例如Kd值差异至少1log,优选至少2log。
如本文所述的特异性功能变体是结构域交换的抗体,特别是包含一个或多个工程改造的CH3HET结构域的功能变体,其包括一个或多个点突变以提高CH3HET/CH3HET二聚体的形成。
在优选的实施方案中,亲本抗体的功能活性变体
a)是所述抗体的生物活性片段,所述片段包括分子序列的至少50%,优选至少60%、至少70%、至少80%、至少90%,或至少95%,最优选至少97%、98%或99%;
b)来源于通过至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失的抗体,其中所述功能活性变体与分子或其一部分具有序列同一性,比如至少50%序列同一性的抗体,优选至少60%,更优选至少70%,更优选至少80%,还更优选至少90%,甚至更优选至少95%,最优选至少97%、98%或99%;和/或
c)由所述抗体或其功能活性变体组成,另外还包含与所述多肽或核苷酸序列异源的至少一个氨基酸或核苷酸。
在本发明的一个优选实施方案中,根据本发明的抗体的功能活性变体与上述变体基本相同,但分别与其多肽或核苷酸序列不同,因为其来自不同物种的同源序列。这些称为天然存在的变体或类似物。
术语“功能活性变体”还包含天然存在的等位基因变体,以及突变体或任何其它非天然存在的变体。如本领域已知的,等位基因变体是(多)肽的替代形式,其特征在于具有基本上不改变多肽的生物功能的取代、删除或添加的一个或多个氨基酸。
功能活性变体可以通过多肽或核苷酸序列中的序列改变来获得,例如通过一个或多个点突变,其中当在本发明组合使用时,所述序列改变保留或改善未改变的多肽或核苷酸序列的功能。这样的序列改变可以包含但不限于(保守)取代、添加、删除、突变和插入。
特异性功能活性变体是CDR变体。CDR变体包括由CDR区中的至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列,其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变,该修饰允许变体保留未修饰序列的生物学特性。所述CDR氨基酸序列的部分改变可以是一至几个氨基酸(例如1、2、3、4或5个氨基酸)的缺失或取代,或通过添加或插入一至几个氨基酸,例如1、2、3、4或5个氨基酸,或通过一至几个氨基酸(例如1、2、3、4或5个氨基酸)的化学衍生化,或它们的组合。氨基酸残基中的取代可以是保守取代,例如,用一个疏水性氨基酸取代替代的疏水性氨基酸。
保守取代是在与其侧链和化学性质相关的氨基酸家族内发生的取代。这些家族的实施例是具有碱性侧链、具有酸性侧链、具有非极性脂肪族侧链、具有非极性芳香族侧链、具有不带电荷的极性侧链、具有小侧链、具有大侧链等的氨基酸。
点突变特别理解为多核苷酸的工程改造,导致不同的氨基酸在取代或交换、删除或插入一个或多个单(不连续)或双氨基酸的氨基酸序列中表达不同于非工程改造的氨基酸序列。
优选的点突变是指具有相同极性和/或电荷的氨基酸的交换。在这方面,氨基酸是指由六十四个三重密码子编码的二十个天然存在的氨基酸。这20个氨基酸可分为具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸:
所述“中性”氨基酸以及它们各自的三个字母和单个字母的代码和极性如下所示:
丙氨酸:(Ala,A)非极性,中性;
天冬酰胺:(Asn,N)极性,中性;
半胱氨酸:(Cys,C)非极性,中性;
谷氨酰胺:(Gln,Q)极性,中性;
甘氨酸:(Gly,G)非极性,中性;
异亮氨酸:(Ile,I)非极性,中性;
亮氨酸:(Leu,L)非极性,中性;
甲硫氨酸:(Met,M)非极性,中性;
苯丙氨酸:(Phe,F)非极性,中性;
脯氨酸:(Pro,P)非极性,中性;
丝氨酸:(Ser,S)极性,中性;
苏氨酸:(Thr,T)极性,中性;
色氨酸:(Trp,W)非极性,中性;
酪氨酸:(Tyr,Y)极性,中性;
缬氨酸:(Val,V)非极性,中性;和
组氨酸:(His,H)极性,正(10%)中性(90%)。
所述“正”电荷氨基酸是:
精氨酸:(Arg,R)极性,正;和
赖氨酸:(Lys,K)极性,正。
所述“负”电荷氨基酸是:
天冬氨酸:(Asp,D)极性,负;和
谷氨酸:(Glu,E)极性,负。
相对于抗体序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为候选序列中与特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比,在比对序列并引入间隙之后,如果需要,实现最大百分比序列同一性,并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数,包括在待比较的序列全长上实现最大比对所需的任何算法。
抗体变体特别理解为包含具有特定糖基化模式的同系物、类似物、片段、修饰或变体,例如由糖基化工程改造产生,它们是功能性的并且可以用作功能等同物,例如结合特定靶并且具有功能特性。抗体或CH3抗体结构域可以是糖基化的或非糖基化的。例如,本文所述的重组抗体可以在合适的哺乳动物细胞中表达,以允许由表达免疫球蛋白的宿主细胞确定的分子的特异性糖基化。
抗体结构域(特别是恒定抗体结构域(如CH3结构域))的术语“β褶板”或“β折叠链”在本文中以下列方式理解。抗体结构域通常包括至少两条由两个或三个主链氢键横向连接的β折叠链,形成大体扭曲的折叠片层。β折叠链是通常具有3至10个氨基酸长度的单一连续延伸的氨基酸,采用这种扩展构象并涉及与至少一条其它链的主链氢键,使得它们形成β片层。在所述β褶板中,大多数β折叠链与其它链相邻排列并形成与其邻区的广泛的氢键网,其中一条链的主链中的N-H基与相邻链的主链中的C=O基形成氢键。
抗体恒定结构域(如CH2或CH3结构域)的结构与可变结构域的结构相似,其由通过环连接的β折叠链组成,其中一些含有短的α-螺旋区段。所述骨架大部分是刚性的,并且所述环比较灵活,从各种Fc晶体结构的b因子可以看出。抗体CH3结构域通常具有形成β褶板(A-B-C-D-E-F-G)的七条β折叠链,其中所述β折叠链通过环连接,三个环位于CH3结构域的N-端的顶部(A-B、C-D、E-F),并且另外三个环位于CH3结构域的N-端的顶部(B-C、D-E、F-G)。CH3结构域的“环区”是指位于β折叠链区之间的蛋白质部分(例如,每个CH3结构域包括,从N至C-端取向的七个β折叠链A至G)。
优选地,通过连接涉及A、B和E链的结合表面来产生一对CH3结构域(比如CH3HET/CH3HET二聚体),这里也称为第一CH3的β褶板,该第一CH3的β褶板与第二个CH3的β片层区连接以产生二聚体。
“CH3结构域”在本文中具体理解为从抗体CH3结构域获得的多肽,例如来自抗体的Fc片段。所述Fc片段可以来自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM。具体地,本文所述的CH3结构域可以包含人IgG1抗体(标识为SEQ ID 41)、人IgG2抗体(标识为SEQ ID 42)、人IgG3抗体(标识为SEQ ID 43),或人IgG4抗体(标识为SEQ ID 44),或人IgA抗体(标识为SEQ ID45),或人IgM抗体(标识为SEQ ID 46),或人IgE抗体(标识为SEQ ID 47),或人IgD抗体(标识为SEQ ID48),或它们的功能变体(例如具有一定的序列同一性)的氨基酸序列。
在本文所述的一个实施方案中,所述CH3结构域可以包括突变,例如可以具有由异源序列取代的一条或多条β折叠链的至少一部分,比如包含一个或多个点突变,例如凸起突变或凹孔突变。
特异性凸起突变是一个或多个氨基酸取代,以通过引入一个或多个氨基酸来增加两个结构域之间的接触表面,这些氨基酸提供了另外的β折叠链的结构突起(protuberance),例如一个或多个选自由T366Y、T366W、T394W、F405A组成的组的CH3凸起突变。特异性隆突修饰表示抗体的CH3结构域中的突变T366W(根据Kabat的EU索引编号)。凸起突变特异性提供了匹配(同源(cognate))表面以结合另一个抗体结构域,例如其被修饰以掺入凹孔突变。
特异性凹孔突变是一个或多个氨基酸取代,以通过引入一个或多个氨基酸来增加两个结构域之间的接触表面,所述氨基酸提供了另外的β折叠链结构孔穴(cave),例如一个或多个选自由T366S、L368A和Y407V组成的组的CH3凹孔突变。特异性凹孔修饰表示抗体的CH3结构域中的任何突变T366S、L368A、Y407V、Y407T(根据Kabat的EU索引编号)。凹孔突变特异性提供了匹配(同源(cognate))表面以结合另一个抗体结构域,例如其被修饰以掺入凸起突变。
匹配的凸起嵌凹孔突变是,例如所述CH3区对的一个CH3结构域上的T366Y和第二个CH3结构域上匹配的Y407’T,这里称为T366Y/Y407’T。其它匹配突变是
T366Y/Y407’T,
F405A/T394’W,
T366Y:F405A/T394‘W:Y407’T,
T366W/Y407’A,和/或
S354C:T366W/Y349′C:T366′S:L368′A:Y407′V.
特异性CH3突变包含分子间β折叠链交换,例如其中CH3β折叠链中的一个或多个片段或序列突变以掺入与原始CH3结构域不同的抗体结构域(例如不同类型或亚型的抗体结构域)的片段或序列。通过链交换获得特异性突变体,其中IgG型的CH3结构域含有IgA型的CH3结构域的一个或多个片段或序列。如果使两条链交换的CH3结构域突变以形成同源对,则每个CH3结构域的IgA片段或序列产生同源的结构域间接触表面,使得所述突变的CH3结构域优先与野生型CH3结构域相互配对。掺入片段交换的抗体结构域的这种修饰的具体实施例可以是链交换的工程改造的结构域(SEED)。这种修饰可以用于通过优先配对所述重链的SEED修饰的CH3结构域来产生不对称和双特异性免疫球蛋白,特别是双特异性抗体。这是基于在保守的CH3结构域内交换结构相关的免疫球蛋白序列。在所述SEED CH3结构域中来自人IgA和IgG的交替序列产生称为AG和GA的两个不对称但互补的结构域。所述SEED设计允许有效产生AG/GA异二聚体,然而不利于AG SEED CH3结构域和GA SEED CH3结构域的同二聚化。
特异性CH3突变包含掺入半胱氨酸残基,所述半胱氨酸残基能够形成二硫键通过另外的结构域内二硫键来稳定抗体结构域,或通过另外的结构域间二硫键来稳定一对抗体结构域。二硫键通常由两个半胱氨酸的巯基氧化形成,从而连接S原子以在两个半胱氨酸残基之间形成二硫键。具体地,可以在C-端区或CH3结构域的C-端插入半胱氨酸(通过另外的氨基酸或氨基酸取代)。可以通过在所述CH3对之间形成二硫键来稳定具有另外半胱氨酸修饰的一对CH3,从而产生CH3/CH3二聚体。在一些实施方案中,二硫键连接的免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域包括同二聚体或异二聚体,因此包括相同或不同的结构域对。
为了允许所述免疫球蛋白链或免疫球蛋白结构域的正确配对,可以具体地使用任何CH3突变,例如可以使用凸起-嵌-凹孔技术、SEED技术、电荷排斥技术、二硫键或交叉mAb技术以减少不正确相关分子的量。
一“对”抗体结构域(例如一对CH3结构域)理解为一组两个抗体结构域,其中一个具有在其表面或空腔中的区域,该区域与另一个的区域特异性结合并因此与其互补。免疫球蛋白结构域,特别是抗体结构域,可通过与β褶板区的接触而缔合形成一对免疫球蛋白结构域。这种结构域对也称为二聚体,例如通过静电作用、重组融合或共价连接相关联,将两个结构域置于直接的物理联系中,例如包含固体和液体形式。本文具体描述的是CH3/CH3二聚体,其可以是由相同的一级、二级和三级结构组成的一对CH3结构域,例如相同的氨基酸序列,即“同二聚体”,或者是任意一级、二级和三级结构不同的一对CH3结构域,例如其任何β折叠链或环区的氨基酸序列不同。可以产生特异性异二聚体以形成CH3/CH3结构域的同源对。
关于一对结构域或结构域二聚体的术语“同源”理解为具有匹配结合点或结构的结构域,以获得每个结构域上的接触表面以优先形成一对这样结构域。如果将所述CH3结构域中的至少一个修饰为优先结合其同源CH3结合配偶体以产生CH3/CH3对,则特异性CH3结构域理解为“同源”或CH3/CH3结构域的同源对。具体地,两个CH3结构域可以通过匹配突变来修饰,例如凸起-嵌-凹孔突变、SEED突变,用于二硫键形成的附加半胱氨酸残基或使用电荷排斥技术的修饰。
关于掺入免疫球蛋白的抗体结构域的术语“异源(heterologous)”,例如异源CH3结构域(本文也称为CH3HET)理解为包括掺入抗体或抗体HC或LC的外源CH3结构域。通过取代现有或天然存在的免疫球蛋白结构域(例如亲本免疫球蛋白结构的CL、CH1或CH2结构域)在本文中理解为“结构域交换的”免疫球蛋白。可以进一步修饰这种结构域交换的免疫球蛋白以产生功能性变体,例如片段、突变体或氨基酸延伸,例如结构域添加。
在分子部分(如氨基酸、氨基酸序列或免疫球蛋白结构域)的上下文中,术语“外源”是指新引入的部分,其可以是天然存在的,但外源于修饰位点或天然存在部分的(功能)变体,或者可以是天然存在的部分的替代物。
关于CH3结构域的“外源”意味着所述CH3结构域具有不同的来源和/或相同的来源(例如相同的类型或亚型,和/或相同的物种),但是其在免疫球蛋白分子中的位置不同。例如,将另外的相同物种和免疫球蛋白类型或亚型的CH3HET置于除Fc的C-端抗体结构域之外的位置。置于抗体的Fab部分中的任何CH3结构域理解为CH3HET。通常,这样的Fab将包含一对CH3HET/CH3HET,每个CH3HET与可变结构域N-端连接。HC中CH3HET的具体实施例是C-端连接到任意其他抗体结构域,例如恒定结构域,优选选自由CH2、CH3和CH4组成的组。因此,可以产生掺入CH3HET结构域的新的HC和/或LC。具体地,可以产生新的HC/HC对和/或HC/LC对,其包括CH3HET/CH3HET对,优选是CH3HET/CH3HET的同源对。
本文具体描述了在本发明的抗体中使用的CH3HET结构域是非免疫性的结构域。特别理解的是,这种非免疫性的CH3结构域不包括所述环区中的抗原结合位点。CH3结构域不会天然地包括任何CDR环区或抗原结合位点,因此野生型CH3结构域理解为非免疫性结构域。一些抗体工程改造技术使抗原结合位点掺入恒定结构域的环区中,比如CH3结构域。恒定结构域的这种环区称为“结构环区”,其使用抗原与恒定结构域的一个或多个环结合。和通过与结构环区相互作用能够结合抗原的这种“免疫”CH3结构域相反,本文所用的CH3HET结构域是非免疫性结构域,因此在所述结构环区中不包括此类抗原结合位点。
在抗体的Fc部分(特别是结构域交换的免疫球蛋白)的CH2-CH3以外的位置上包含CH3HET的抗体,其具体包括新型的连接,至少新的N-端与另一个结构域连接,从而在两个结构域的接口处提供新的结构。优选的接头序列是天然接头序列,从天然存在的结构域连接序列获得的末端序列,例如铰链序列,或天然存在的免疫球蛋白结构的天然连接结构域,例如从天然连接到CH3HET结构域的N-端的抗体结构域获得的1-20个,或2-10个,或3-8个氨基酸长度的C-端氨基酸区,例如CH2结构域的C-端区,可以用作连接到N-端或连接到CH3结构域的接头,该CH3结构域的1-20个,或2-10个或3-8个氨基酸长度的N-端区缺失,以提供N-端缩短的CH3序列。或者,功能合适的人工序列可以用作接头。具体地,所述CH3HET结构域的N-端可以是天然N-端或N-端缩短或延伸的CH3序列的N-端,其与C-端缩短或延伸的第二结构域的C-端连接。
关于本文所述的抗体的术语“多价”是指具有至少两个结合位点以结合相同的靶抗原的分子,特别是结合这些靶抗原的相同或不同的表位。该术语应该包含二价抗体或具有2价或更高化学价的分子以结合所述靶抗原,例如通过至少2、3、4个或甚至更多的结合位点。例如,二价抗体可以通过两对VH/VL结构域具有两个抗原结合位点,二者结合相同的靶抗原。
关于本文所述抗体的术语“多特异性”是指具有至少两个特异性结合至少两种不同靶抗原的结合位点的分子。该术语应该包含双特异性抗体或具有2种或更多种特异性的分子以结合一种以上靶抗原,例如通过至少2、3、4个或甚至更多的结合位点。例如,双特异性抗体可以通过一对VH/VL结构域(Fv区)结合一个靶抗原,以及通过第二对VH/VL结构域(Fv区)结合另一个靶抗原。
根据本发明使用的术语“抗原”或“靶”应该特别包含能够被抗体结合位点识别的所有抗原和靶分子。根据本发明特别优选的分子靶向的抗原是那些已经被证明是具有或能够具有免疫或治疗相关性的那些抗原或分子,特别是那些已经测试临床疗效的抗原或分子。本文所用的术语“靶”或“抗原”特别包括选自由(人或其它动物)肿瘤相关受体和可溶性肿瘤相关抗原组成的组的分子,其为自身抗原,如位于肿瘤细胞或细胞因子或生长因子的表面上的受体,其大量存在于癌症患者的体循环中并与此类肿瘤相关。其它抗原可以是病原体来源,例如微生物病原体或病毒病原体。
所述靶抗原被认为是整个靶分子或者被认为是这种分子的片段,特别是亚结构,例如靶的多肽或碳水化合物结构,通常称为“表位”,例如免疫学相关的B细胞表位、T细胞表位,也可以被天然或单克隆抗体识别。根据本发明所用的术语“表位”特别是指可以完全构成特异性结合配偶体或作为本发明的免疫球蛋白结合位点的特异性结合配偶体的部分分子结构。术语表位也可以指半抗原。在化学上,表位可以由碳水化合物、肽、脂肪酸、有机物质、生物化学物质或无机物质或它们的衍生物及它们的任意组合组成。如果表位是多肽,则其通常在肽中包含至少3个氨基酸,优选8至50个氨基酸,更优选约10-20个氨基酸。所述肽的长度的上限没有限制,其可以几乎包括蛋白质的多肽序列的全长。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或碳水化合物链的一级序列的单个片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由通过折叠多肽来形成三级结构而组合在一起的氨基酸或碳水化合物组成,并且氨基酸不一定以线性序列彼此相邻。具体来,表位是诊断相关分子的至少一部分,即样品中表位的不存在或存在与患者的疾病或健康状况或制造中的处理状态或环境和食物状态是定性或定量相关的。表位也可以是治疗相关分子的至少一部分,即可以由改变疾病进程的特异性结合结构域靶向的分子。
如本文所用,术语“特异性”或“特异性结合”是指结合反应,其决定了对异源群体分子感兴趣的同源配体。因此,在指定条件(例如免疫测定条件)下,所述免疫球蛋白结合其特定靶并且不以显著量与样品中存在的其它分子结合。所述特异性结合意味着是根据所选择的靶标同一性,高、中或低结合亲和力或亲合力进行有选择性的结合。如果结合常数或结合动力学的差异至少是10倍,优选至少是100倍,更优选至少1000倍,则通常可以实现选择性结合。
本文所用的术语“可变结合区”也称为“CDR区”,是指具有能够与抗原结合反应的不同结构的分子。那些分子可以这样使用或整合到较大的蛋白质中,从而形成具有结合功能的这种蛋白质的特异性区。所述变化的结构可以来源于结合蛋白的天然库,如来自免疫球蛋白或抗体。所述变化的结构也可以通过随机化技术产生,特别是本文所述的那些。这些包含诱变的CDR或非CDR区(例如恒定抗体结构域的结构环区),免疫球蛋白可变域或恒定域的环区,特别是免疫球蛋白的CDR环。通常,根据本发明所述的免疫球蛋白的结合结构由这样的可变结合区形成。
用于本发明目的的术语“细胞毒性”或“细胞毒活性”是指针对细胞抗原的任何特异性分子,当与抗原结合时,其激活程序性细胞死亡并触发细胞凋亡。特异性免疫球蛋白通过其对效应子细胞的活性起作用,导致激活细胞毒性T细胞或介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和/或细胞吞噬作用(ADCP)的细胞。特异性抗体通过细胞凋亡诱导程序性细胞死亡和/或通过结合介导ADCC和/或CDC活性的效应子细胞的Fc受体而杀死抗体包被的靶细胞。
本发明的抗体可以具有或可以不具有Fc效应子功能。Fc可以通过形成免疫复合物结合表面抗原来恢复(recruit)补体并辅助除去靶抗原或靶细胞。
特异性抗体可以缺乏活性Fc部分或Fc效应子功能,因此,由不含抗体Fc部分或不含Fcγ受体结合位点的抗体结构域组成,或者包含缺乏Fc效应子功能的抗体结构域,例如通过修饰来降低Fc效应子功能,特别是消除或降低ADCC和/或CDC活性。可以工程改造替代抗体以引入修饰增加Fc效应子功能,特别是增强ADCC和/或CDC活性。
这样的修饰可以通过诱变来实现,例如在Fcγ受体结合位点的突变或通过衍生物或试剂干扰抗体形式的ADCC和/或CDC活性,从而实现降低或增加Fc效应子功能。
术语“抗原结合位点”或“结合位点”是指参与抗原结合的抗体部分。所述抗原结合位点由所述重(“H”)和/或轻(“L”)链或其可变结构域的N-端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。称为“高变区”的重链和轻链的V区内的三个高度不同的延伸插入到称为骨架区的更保守的侧翼段之间。所述抗原结合位点提供与结合的表位或抗原的三维表面互补的表面,并且所述高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。掺入在所述CDR中的结合位点也称为“CDR结合位点”。
术语“表达”以下列方式理解。含有表达产物(例如本文所述的抗体)的所需编码序列以及控制序列(例如可操作连接的启动子)的核酸分子可用于表达目的。用这些序列转化或转染的宿主能够产生所述编码蛋白质。为了实现转化,所述表达系统可以包含在载体中;但是,相关DNA也可以整合到宿主染色体中。具体地,所述术语是指在合适的条件下的宿主细胞和相容载体,例如用于由载体携带的外源DNA编码的蛋白质的表达并引入到所述宿主细胞。
编码DNA是编码特定多肽或蛋白质(例如抗体)的特定氨基酸序列的DNA序列。启动子DNA是启动、调节或以其它方式介导或控制所述编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自相同的基因或来自不同的基因,并且可以来自相同或不同的生物体。重组克隆载体通常包含一个或多个用于克隆或表达的复制系统,一种或多种用于在宿主中选择的标记,例如抗生素抗性和一种或多种表达盒。
本文使用的“载体”定义为克隆重组核苷酸序列(即重组基因)的转录以及它们的mRNA在合适的宿主生物体中的翻译所需的DNA序列。
“表达盒”是指编码表达产物的DNA编码序列或DNA片段,其可以在限定的限制性位点插入载体。将所述盒限制性位点设计成确保盒插入正确的读码框中。通常,将外源DNA插入到载体DNA的一个或多个限制性位点,然后由载体和可传递的载体DNA一起携带到宿主细胞中。具有插入或添加的DNA的片段或序列(比如表达载体)也可称为“DNA构建体”。
表达载体包括表达盒,另外通常包括宿主细胞或基因组整合位点中自主复制的起源,一个或多个可选择标记(例如氨基酸合成基因或赋予抗生素抗性的基因如博莱霉素(zeocin)、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子,这些组分可操作地连接在一起。本文所用的术语“载体”包含自主复制的核苷酸序列以及整合核苷酸序列的基因组。常见类型的载体是“质粒”,其通常是双链DNA的独立分子,其可以容易地接受额外的(外源)DNA,并且其可以容易地引入到合适的宿主细胞中。质粒载体通常含有编码DNA和启动子DNA,并具有一个或多个适合插入外源DNA的限制性位点。具体地,术语“载体”或“质粒”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入到宿主细胞的媒介,以便转化所述宿主并促进所引入序列的表达(例如转录和翻译)。
本文所用的术语“宿主细胞”是指转化成产生特定重组蛋白的主体细胞,比如本文所述的抗体及其任何子代。应当理解,并非所有子代与亲本细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异),但是,这些术语包括这些改变的子代,只要所述子代与原始转化细胞保持相同的功能。术语“宿主细胞系”是指用于表达重组基因以产生重组多肽(比如重组抗体)的宿主细胞的细胞系。本文所用的术语“细胞系”是指建立的特定细胞类型的克隆,其已经获得在长时间内增殖的能力。可以将这种宿主细胞或宿主细胞系可以保持在细胞培养中和/或培养中以产生重组多肽。
本文关于核酸、抗体或其它化合物使用的术语“分离的”或“分离”是指已经与其自然相关的环境充分分离的化合物,以便以“基本上纯”的形式存在。“分离”并不一定意味着排除含有其它化合物或材料的人造或合成混合物,或者存在不干扰基本活性的杂质,以及例如由于不完全的纯化而存在所述杂质。特别地,本发明的分离的核酸分子也意味着包含那些化学合成的物质。
关于本发明的核酸,有时使用术语“分离的核酸”。这个术语当应用于DNA时,是指与其起源的生物体的天然存在的基因组中与其紧邻的序列分离的DNA分子。例如,“分离的核酸”可以包括插入到载体中的DNA分子,比如质粒或病毒载体,或整合到原核或真核细胞或宿主生物体的基因组DNA中。当应用于RNA时,术语“分离的核酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。或者,该术语可以指已经与在其天然状态(即,在细胞或组织中)中与其相关联的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步代表通过生物或合成方法直接产生的分子,并且在其产生过程中与其它组分分离。
关于多肽或蛋白质,比如分离的免疫球蛋白,术语“分离的”应具体指不含或基本上不含与其天然相关的材料的化合物,比如在它们的天然环境中或者在体外或体内通过重组DNA技术进行制备它们的环境(例如细胞培养)中发现的其它化合物。分离的化合物可以用稀释剂或助剂配制,并且仍然为实际目的而分离,例如,当用于诊断或治疗时,所述多肽或多核苷酸可与药学上可接受的载体或赋形剂混合。
本文所用术语“重组体”是指“由基因工程制备或其结果”。或者,使用术语“工程改造”。例如,可以通过工程改造相应的亲本序列修饰已修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域以产生变体来产生工程改造的免疫球蛋白或结构域。重组宿主特异性地包括表达载体或克隆载体,或者已被基因工程化以含有重组核酸序列,特别是使用与宿主外源的核苷酸序列。通过在宿主中表达相应的重组核酸来产生重组蛋白。如本文所用的术语“重组抗体”包含免疫球蛋白,以及特别是通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体,比如(a)从动物(例如小鼠)分离的抗体,其是人免疫球蛋白基因或由其制备的杂交瘤的转基因或转染色体,(b)从转化以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体,例如来自转染瘤的抗体,(c)从重组体、组合人抗体文库中分离的抗体,和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组抗体包括工程改造以包含例如在抗体成熟过程中发生的重排和突变的抗体。
一旦鉴定了具有所需结构的抗体,则可以通过本领域已知的方法产生此类抗体,例如包括杂交瘤技术或重组DNA技术。
在杂交瘤方法中,小鼠或其它合适的宿主动物(比如仓鼠)被免疫以产生淋巴细胞,所述淋巴细胞产生或能够产生特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体。或者,淋巴细胞可以在体外免疫。然后使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。
测定杂交瘤细胞生长的培养基,用于产生针对抗原的单克隆抗体。优选地,通过免疫沉淀或通过体外结合测定法,例如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
例如,重组单克隆抗体可以通过使用已知的重组表达载体(例如本发明的质粒或包括编码所述抗体序列的核苷酸序列的表达盒)分离编码所需抗体链的DNA并利用用于表达的编码序列转染重组宿主细胞来产生。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞,比如上述所述的那些。
根据具体方面,所述核苷酸序列可以用于基因操作来人源化抗体或提高抗体的亲和力或其它特性。例如,如果所述抗体用于人类的临床试验和治疗,则恒定区可以工程改造成更接近类似于人类恒定区以避免免疫应答。需要基因操作所述抗体序列以获得对靶抗原更大的亲和力。可以对所述抗体进行一个或多个多核苷酸改变,并且仍然保持其与靶抗原的结合能力对于本领域技术人员显而易见。
通过各种手段产生抗体分子通常是很好理解的。例如,美国专利6331415(Cabilly等)描述了重组产生抗体的方法,其中来自单个载体或单个细胞中的两个单独载体的重链和轻链同时表达。Wibbenmeyer等人(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)和Lee和Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了使用在大肠杆菌的分离培养物中表达的质粒,从分别产生重链和轻链中的单克隆抗体的产生。例如,Harlow等人(ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1988))提供了与生产抗体相关的各种其它技术。
使用由培养中的连续细胞系生产抗体分子的任何方法生产单克隆抗体。用于制备单克隆抗体的合适方法的实施例包含Kohler等人的杂交瘤方法(1975,Nature 256:495-497)和人B细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol 133:3001;和Brodeur et al.1987,MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications,(Marcel Dekker,Inc.,New York),pp.51-63)。
本文所述的抗体可用于施用以治疗有需要的受试者。
本文所用的术语“受试者”是指温血哺乳动物,特别是人类或非人类动物。因此,术语“受试者”也可以特别指包含狗、猫、兔、马、牛、猪和家禽的动物。特别地,本发明的抗体提供用于医疗用途以治疗需要预防或治疗疾病状况的受试者或患者。术语“患者”包含接受预防性治疗或治疗性治疗的人和其它哺乳动物受试者。因此,术语“治疗”意在包含预防性治疗和治疗性治疗。
具体地,本发明的抗体以基本上纯的形式提供。本文所用的术语“基本上纯”或“纯的”是指包括至少50%(w/w),优选至少60%、70%、80%、90%或95%的化合物的制剂,例如核酸分子或抗体。通过适合该化合物的方法测量纯度(例如色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)。
本文所用的术语“治疗有效量”与化合物的术语“有效量”或“足够量”可互换使用,例如本发明的免疫球蛋白是当对受试者施用有益的或期望的结果(包括临床结果)时足够的量或活性,因此有效量或其同义词取决于其应用的上下文。
有效量意指足以治疗、预防或抑制这种疾病或病症的化合物的量。在疾病的情况下,本文所述的免疫球蛋白的治疗有效量特别用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或病症,其从所述抗体与其靶抗原的相互作用中受益。
对应于这种有效量的化合物的量将根据各种因素而变化,比如给定的药物或化合物、药物制剂、施用途径、疾病或病症的类型、被治疗的受试者或宿主的特性等,但是可以由本领域技术人员常规地确定。
本发明的抗体可以特定地用于药物组合物中。因此,提供了包括本文所述的抗体和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。这些药物组合物可以根据本发明作为推注或输注或通过连续输注给药。适于促进这种给药方式的药物载体是本领域公知的。
药学上可接受的载体通常包括与本发明提供的抗体生理上相容的任何以及所有合适的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实施例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等,以及它们的任何组合。
在这样一个方面,抗体可以与一种或多种适合于所需给药途径的载体组合,抗体可以是例如与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶(acacia)、明胶、海藻酸钠、聚维酮(polyvinylpyrrolidine)、聚乙烯醇和任选地进一步压片或包封用于常规给药。可选地,免疫球蛋白可溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲液中。其它载体、助剂和给药方式在制药领域是众所周知的。载体可以包括受控释放材料或时间延迟材料,比如单独的或具有蜡的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯,或本领域已知的其它材料。
本领域已知的其他药学上可接受的载体,例如在REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES中描述。液体制剂可以是溶液、乳剂或悬浮液,并且可以包含赋形剂,例如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
药物组合物,其中按本发明的抗体和一种或多种治疗活性剂配制。通过将具有所需纯度的所述抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合以制备本发明的抗体稳定制剂,以冻干制剂或水溶液的形式储存。用于体内给药的制剂是特异性无菌的,优选以无菌水溶液的形式。这很容易通过无菌过滤膜或其它方法过滤实现。本文公开的免疫球蛋白和其它治疗活性剂也可以配制成免疫脂质体,和/或包埋在微胶囊中。
包含本发明抗体的所述药物组合物的给药可以以多种方式进行,包括口服给药、皮下给药、静脉内给药、鼻内给药、口腔内给药、经皮给药、粘膜给药、局部给药(例如凝胶、药膏、乳液、乳膏等),腹腔内给药、肌肉内给药、肺内给药、阴道给药、肠道外给药、直肠给药或眼内给药。
用于肠道外给药的示例性制剂包括那些适合于皮下注射、肌肉注射或静脉注射,例如无菌溶液、乳液或悬浮液。
本发明特别提供了在本文提供的实施例中详述的示例性抗体。其它抗体变体是可行的,例如包括示例性免疫球蛋白的功能变体,例如其中进一步工程改造Fc以改善分子的结构和功能,或者其中产生的包括不同CDR结合位点或具有不同特异性的抗体,特别是其中获得两个不同的Fv区。
参考以下实施例将更充分地理解上述描述。但是,这些实施例仅代表实施本发明的一个或多个实施例的方法,并且不应视为限制本发明的范围。
实施例
实施例1:CH3结构域交换的抗体的构建、表达、纯化和表征
可以使用野生型CH3结构域或各种工程改造的CH3结构域来取代所述抗体的结构域交换的Fab臂中的CH1和/或CL结构域以形成CH3结构域交换的抗体,然后组装成多种构型,如图1部分所示。
在实施例1中,编码具有以下氨基酸特征的三种不同结构域交换的异二聚体抗体的轻链和重链生成合成的DNA:
结构域交换的异二聚体抗体1:
Fab臂1和相应的工程改造的轻链和重链:
将完整抗体的一个Fab臂中的CH1和CL结构域用CH3结构域替换以产生VL(1)-CH3_凹孔(Y407T)轻链(SEQ ID 1)和VH(1)-CH3_凸起(T366Y)-CH2-CH3AG重链(SEQ ID 2)。所述VL(1)和VH(1)结构域共同形成EGFR特异性抗体hu425(马妥珠单抗(Matuzumab))1的Fv。
通过Cκ序列RTVA的4个氨基酸残基(SEQ ID 49,R是人κ链的残基108(Kabat EU编号))形成所述VL(1)-CH3链中的VL(1)结构域到CH3结构域的转变,紧接着是以属于CH3结构域的A链的EPQV开始的氨基酸序列(SEQ ID 50,E是人IgG1重链的残基345(Kabat EU编号))。所述CH3结构域序列以QKSLSLS(SEQ ID 51,Q为人IgG1重链的残基438(Kabat EU编号))终止,接着是残基GEC(代表Cκ链的C-端残基212-214(Kabat EU编号))。
在VH(1)-CH3-CH2-CH3链中从所述VH(1)结构域到CH3结构域的转变使得J区(以氨基酸序列VTVSS(SEQ ID 52结束,第一个V为人VH区的残基109),其后是属于人CH1结构域的5个残基ASTKG(SEQ ID 53,A是人IgG1重链的残基118(Kabat EU编号)),紧接其后是以属于CH3结构域的A链的EPQV开始的氨基酸序列(SEQ ID 50,E是人IgG1重链的残基345(KabatEU编号))。所述CH3结构域序列以QKSLSLS(SEQ ID 51,Q为人IgG1重链的残基438(Kabat EU编号))结束,接着是代表一部分人重链铰链区的残基KSC(K为人IgG1重链的残基218链(Kabat EU编号))。
工程改造VL(1)-CH3链的CH3结构域,以优先产生VH(1)-CH3-CH2-CH3链的C-端的VH(1)结构域的CH3结构域的同源对,具体地,根据Ridgway等1996,其含有“凹孔”突变Y407T(Kabat EU编号),因此该链更是完全命名为VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)。
将VH(1)-CH3-CH2-CH3链中的VH(1)结构域的C-端的CH3结构域工程改造为优先产生VL(1)-CH3链的CH3结构域的同源对,具体地,根据Ridgway等1996,其含有“凸起”突变T366Y(Kabat EU编号)。
工程改造的该抗体的VH(1)-CH3-CH2-CH3重链的C-端CH3结构域,以优先产生抗体的第二重链的C-端CH3结构域的同源对。根据Davis等,2010,该CH3结构域的具体工程改造是“AG”CH3结构域,因此,该链更是完全命名为VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID2)。
所得到的双特异性抗体1(BsAb1)识别两个靶CD3×EGFR,其特征在于以下重链和轻链:H1(SEQ ID 2)、H2(SEQ ID 4)、L1(SEQ ID 1)和L2(SEQ ID 3)。
Fab臂2和工程改造的重链
异二聚体抗体的后半部分由以下链形成:
轻链(SEQ ID 3)编码CD3特异性抗体OKT3(VL2)的VL序列,并由编码VL(2)-CL结构域的序列组成。
重链(SEQ ID 4)编码CD3特异性抗体OKT3(VH2)的VH序列,并由编码VH(2)-CH1-CH2-CH3GA结构域的序列组成。工程改造该VH(2)-CH1-CH2-CH3GA链的C-端CH3结构域以优先产生所述抗体的第一重链(VH(1)-CH3-CH2-CH3AG)的C-端CH3结构域的同源对。根据Davis等,2010,该CH3结构域的具体工程改造是“GA”CH3结构域,因此该链命名为VH(2-CH1-CH2-CH3GA(SEQ ID 4)。
结构域交换的异二聚体抗体2
将该抗体工程改造为类似于所述结构域交换的异二聚体抗体1中的Fab臂。但是,在结构域交换的异二聚体抗体2中,将OKT3Fab臂与含有C-端CH3AG结构域(VH(2)-CH1-CH2-CH3AG(SEQ ID 5))的重链融合,而所述结构域交换的工程改造的hu425Fab臂与含有C-端CH3GA结构域(VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3GA(SEQ ID 6))的重链融合。
结果,这种双特异性抗体识别靶CD3×EGFR,其特征在于以下重链和轻链:H1(SEQID 6)、H2(SEQ ID 5)、L1(SEQ ID 1)和L2(SEQ ID 3)。
结构域交换的异二聚体抗体3
将该抗体工程改造为类似于所述结构域交换的异二聚体抗体2中的Fab臂。在所述结构域交换的异二聚体抗体3中,将OKT3Fab臂融合至含有C-端CH3AG结构域的重链,并将所述结构域交换的工程改造的hu425Fab臂与含有C-端CH3GA结构域的重链融合。但是,在结构域交换的异二聚体抗体3中,野生型(wt)CH3结构域C-端交换在工程改造的hu425Fab臂中的VL1和VH1,而不是用在结构域交换的异二聚体抗体1和2中配对的同源“凸起”和“凹孔”工程改造的CH3结构域。结构域交换的异二聚体抗体3使用hu425Fab臂的序列VL(1)-CH3wt(SEQID7)和VH(1)-CH3wt-CH2-CH3GA(SEQ ID 8)。
结果,这种双特异性抗体识别靶CD3×EGFR,其特征在于以下重链和轻链:H1(SEQID 8)、H2(SEQ ID 5)、L1(SEQ ID 7)和L2(SEQ ID 3)。
编码所述抗体链的合成DNA侧接有用于克隆到pTT5哺乳动物表达载体中的限制酶的序列。
实施例2:用于表达人Ig样双特异性抗体的载体构建
在下表中指定的基因序列的特定组合之后,通过在一个细胞内表达四种不同基因的组合来产生实施例1中所述的三种人结构域交换的异二聚体抗体。通过SEQ ID 1、2、3和4的共表达产生结构域交换的异二聚体抗体1。通过SEQ ID 1、3、5和6的共表达产生结构域交换的异二聚体抗体2。通过SEQ ID 3、5、7和8的共表达产生结构域交换的异二聚体抗体3。
为了表达这些序列,构建了基于表达载体的八种不同的哺乳动物pTT5(Shi等,2005),每个载体含有以下编码的基因之一:
SEQ ID 1:VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)
SEQ ID 2:VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG
SEQ ID 3:VL(2)-CL
SEQ ID 4:VH(2)-CH1-CH2-CH3GA
SEQ ID 5:VH(2)-CH1-CH2-CH3AG
SEQ ID 6:VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3GA
SEQ ID 7:VL(1)-CH3wt
SEQ ID 8:VH(1)-CH3wt-CH2-CH3GA
对于VL1和VH1,使用抗EGFR抗体马妥珠单抗(hu425)的可变结构域(Kim,2004)。
对于VL2和VH2,使用抗CD3抗体OKT3的可变结构域(Van Wauwe等,1980)。
图1A示意性地示出了使用AG和GA版本的CH3结构域,利用链交换工程改造的结构域(SEED)CH3异二聚体技术实现两种不同重链的异二聚化的几种可能的结构域交换的双特异性抗体的结构(参见Davis等,2010,和专利US 20070287170A1)。图1A-1具体示出了实施例1的结构域交换的异二聚体抗体1的结构。
实施例3:双特异性抗体的表达和表征
根据标准技术,实施例1和2中描述的结构域交换的异二聚体抗体1、2和3在哺乳动物细胞中以小规模表达。通过蛋白A亲和层析纯化所得蛋白质,并通过非还原性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和分析尺寸排阻色谱法(SEC)进行表征(图2)。非还原性凝胶主要表现出具有对应于结构域交换的抗体1和2的预期大小的分子量的单带(图2A)。对于所述结构域交换的抗体3,SDS-PAGE显示预期大小的条带,并显示对应于较高分子量蛋白质复合物的另外的带(图2A)。
这些纯化的蛋白质进一步由分析性SEC表征,其显示在结构域交换的抗体1、2和3的约7.5分钟(和标准IgG抗体的预期洗脱时间相似)之后从SEC柱洗脱的主峰,具有结构域交换的抗体1和2的其它蛋白质物种的轻微污染(图2B和2C)和抗体3额外的峰(图2D)。因此,使用结构域交换的Fab臂产生所述双特异性抗体预期大小的蛋白质。接下来,我们用结构域交换的Fab臂形成的各种双特异性抗体进行广泛的生物化学和功能表征与测试。
实施例4:结构域交换的双特异性抗体1的大规模表达和表征
结构域交换的异二聚体双特异性抗体1和2具有相似的生物物理特性,例如相似的非还原性SDS-PAGE模式和SEC谱。结构域交换的异二聚体双特异性抗体1的表达产生更高的表达水平,并被选择用于进一步表征。
根据标准技术,在哺乳动物细胞中,通过大规模共表达SEQ ID 1、2、3和4基因(300mL培养基),表达结构域交换的异二聚体双特异性抗体1。通过蛋白A亲和层析纯化得到的蛋白质,该特异性结构域交换的异二聚体双特异性抗体的这一点将被称为BsAb1,从前面的实施例可以理解,这是由SEQ ID 1、2、3和4共表达组成的结构域交换的抗体。通过非还原和还原SDS-PAGE以及分析性SEC表征纯化的BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)(图3)。
非还原的SDS-PAGE主要显示具有对应于BsAb1的预期大小的分子量的单带。当样品在SDS-PAGE之前被还原时,谱图显示标记为对应于VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)的H1带,对应于VH(2)-CH1-CH2-CH3GA(SEQ ID 4)的H2带和对应于VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)和VL(2)-CL(SEQ ID 3)的L1+L2带的带(图3A)。
此外,由分析性SEC表征的纯化蛋白质显示出在约7.5分钟后从柱洗脱>90%的主峰,其与标准IgG抗体的洗脱相当(图3B)。
实施例5:双特异性结合测定
为了测试BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)与两种抗原CD3和EGFR的同时结合,首先用BsAb1或对照双特异性抗CD3抗EGFR抗体沾染CD3+Jurkat细胞,然后与EGFR进行孵育步骤。用异硫氰酸荧光素标记抗EGFR检测抗体检测双特异性结合,并通过流式细胞术分析(图4)。
实施例6:产生和表征所述Fab臂中含有CH3结构域的单臂抗体
通过三种不同基因的共表达产生含有CH3结构域交换的(KiH同源对)或未工程改造的Fab区的单臂抗体。图5示意性地示出了所述单臂抗体(未工程改造的和结构域交换的)的结构。如前所述构建不同的基于哺乳动物pTT5的表达载体,其含有编码每条抗体链的基因。
通过在一个细胞内SEQ ID 1、SEQ ID 2和SEQ ID 9(huFc_GA SEED)中给出的编码氨基酸序列的三种不同基因的共表达来产生人结构域交换的单臂抗体。通过SEQ ID 9、SEQID10(VL(1)-CL)和SEQ ID 11(VH(1)-CH1-CH2-CH3AG)中给出的编码氨基酸序列的三种不同基因的共表达来产生未工程改造的单臂抗体。
对于VL1和VH1,使用抗EGFR抗体马妥珠单抗(hu425)的可变结构域(Kim,2004)。
所得的单臂抗体识别EGFR,并且具体特征在于以下轻链和重链。结构域交换的单臂抗EGFR:H1(SEQ ID 2)、H2(SEQ ID 9)和L1(SEQ ID 1)。未工程改造的单臂抗EGFR:H1(SEQ ID 11)、H2(SEQ ID 9)和L1(SEQ ID 10)。
两种抗体均按照标准技术在哺乳动物细胞中表达。通过蛋白A亲和层析纯化所得蛋白质,并通过非还原和还原SDS-PAGE和分析性SEC进行表征(图6)。非还原凝胶主要表现出对应于所述单臂抗体的分子量的单带。当样品在SDS-PAGE之前还原时,单臂抗体(CH1/CL)的谱图显示对应于VH(1)-CH1-CH2-CH3AG(SEQ ID 11)的H1带,对应于huFc_GA SEED的H2带(SEQ ID 9)和对应于VL(1)-CL(SEQ ID 10)的L1带(图6A)。结构域交换的抗体的还原图谱显示对应于VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)的H1条带,对应于huFc_GASEED(SEQ ID 9)的H2带和对应于VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)的L1带(图6A)。当纯化的蛋白质通过分析性SEC表征时,在约8分钟后从柱洗脱,它们都显示主峰>90%(图6B)。
实施例7:通过流式细胞术单价结合EGFR阳性细胞
测试使用所述CH3结构域交换的抗EGFR Fab结构域的单臂抗体的靶结合,并与具有未工程改造的抗EGFR Fab(CH1/CL)的单臂抗体进行比较(参见实施例6)。另外,测试BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)的EGFR靶结合。通过流式细胞术测量抗体与EGFR表达的A431细胞的结合(图7)。通过与藻红蛋白结合的抗人Fc F(ab)2第二抗体检测与细胞结合的抗体,并使用流式细胞术分析细胞。使用程序GraphPad PRISM从结合曲线计算细胞结合的半最大有效浓度(EC50)。
单臂CH3结构域交换的抗EGFR抗体和BsAb1抗体显示与EGFR阳性细胞的剂量依赖性结合,具有与对照抗体(未工程改造的Fab单臂抗EGFR)相似的结合特性(图7)。所述单臂抗体的EC50在5-8nM的范围内。BsAb1结合EGFR阳性细胞的EC50为约7nM,这与对照抗体相当(图7)。
这些结果表明,通过工程改造的CH3结构域替代CH1/CL并没有改变相应Fab片段的抗原结合。
实施例8:结构域交换双特异性抗体2“BsAb2”(抗CD16×抗EGFR)的构建、表达、纯化和表征
将前面实施例中所述的和用于BsAb1中的CH3结构域交换的抗EGFR Fab与鼠抗CD16抗体3G8(Fleit等,1982)结合以产生从该点命名为BsAb2的新的结构域交换的双特异性抗体(抗CD16×抗EGFR CH3-KiH)。构建了另外两种基于哺乳动物pTT5的表达载体,每个载体含有以下编码基因之一:
SEQ ID 12:VL(3)-CL
SEQ ID 13:VH(3)-CH1-CH2-CH3GA
对于VL(3)和VH(3),使用抗CD16抗体3G8的可变结构域(Fleit等,1982)。
所得到的BsAb2识别出靶CD16×EGFR,其具体特征在于以下重链和轻链:H1(SEQID 2)、H2(SEQ ID 13)、L1(SEQ ID 1)和L2(SEQ ID 12)。
通过在一个细胞内SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 12和SEQ ID 13中给出的氨基酸序列编码的四种不同基因的表达来产生结构域交换的双特异性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3-KiH)。通过BsAb1所述的SEED技术实现了两种不同重链的异二聚化。
BsAb2依照标准技术在哺乳动物细胞中表达。通过蛋白A纯化而纯化所得到的蛋白质,并且在单步蛋白A纯化后显示与BsAb1所示的预期大小和纯度相似的均匀性。
通过质谱法来准备对BsAb1和BsAb2的正确组装进行明确的生物化学验证(参见下一节中的实施例9),在第二纯化步骤中使用制备型SEC进一步纯化BsAb1和BsAb2。作为该制备型SEC纯化步骤后蛋白质纯度的一个实施例,由制备型SEC第二次纯化后的BsAb2蛋白质通过非还原和还原SDS-PAGE和分析型SEC进行表征(图8)。非还原性凝胶主要显示具有对应于结构域交换的BsAb2的分子量的单一带。当样品在SDS-PAGE之前被还原时,谱图显示对应于VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)的H1带,对应于VH(3)-CH1-CH2-CH3GA(SEQ ID 13)的H2带,对应于VL(3)-CL(SEQ ID 12)的L2带和对应于VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)的L1带(图8A)。该纯化的蛋白质通过分析性SEC进一步表征,并且在约7.5分钟后从柱洗脱显示>90%的主峰,与结构域交换的BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)以及标准IgG抗体的洗脱时间相似(图8B)。
实施例9:通过质谱验证正确的组装
直接法分析结构域交换的双特异性抗体
为了证实在所述结构域交换的双特异性抗体中的正确链配对,通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析测量纯化的结构域交换的双特异性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)和BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3-KiH)。在MS分析之前,样品通过PNGaseF去糖基化。如图9和10所示,分别检测结构域交换的双特异性抗体BsAb1和BsAb2的148.284kDa和148.050kDa的单峰。这些检测到的质量对应于四种不同抗体链的总和。在这些链的组装期间,由于二硫键的形成、C-端赖氨酸的裂解和N-端焦谷氨酸的形成,会发生额外的质量损失。考虑到约322kDa的这些质量损失,从计算出的平均质量来看,结构域交换双特异性抗体BsAb1检测到的平均质量的差异仅<3Da,结构域交换的双特异性抗体BsAb2检测到的平均质量的差异约为12Da。在任一抗体样品(同二聚体OKT3-GA计算的分子量:146.465kDa和同二聚体3G8-GA计算的分子量:145.980kDa)中未检测到GA-同二聚体。
这些结果表明在相同细胞中共表达的4种不同蛋白质链的正确化学计量组装用于产生结构域交换的双特异性抗体。
通过竞争轻链的间接法
由于应用的LC-MS方法不能区分正确组装的结构域交换的抗体和具有交换的轻链的抗体,因此进行竞争测定。在该测定中,来自结构域交换的双特异性抗体的轻链和其中一条重链与一个细胞内的huFc_GA SEED链(铰链-CH2-CH3GA)共表达以形成单臂抗体。如果发生正确的轻链与单臂重链的特定配对,则只能形成具有正确轻链配对的Fab。选择结构域交换的双特异性抗体BsAb1的抗体链作为模型。
在竞争测定I(图11)中,通过共表达编码VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)、VL(2)-CL(SEQ ID 3)、VH(2)-CH1-CH2-CH3AG(SEQ ID 5)和huFc_GA SEED(SEQ ID 9)的四种不同基因,产生在Fab区中含有CH1/CL结构域的单臂抗体。在竞争测定II(图12)中,通过共表达编码VL(1)-CH3_KNOB(Y407T)(SEQ ID 1)、VL(2)-CL(SEQ ID 3)、VH(1)-CH3_KNOB(T336Y)-CH2-CH3AG(SEQ ID 2)和huFc_GA SEED(SEQ ID 9)的四种不同基因,产生含有CH3结构域交换的Fab区的单臂抗体。按照标准技术在哺乳动物细胞中表达抗体。蛋白A纯化后,所述蛋白质通过PNGaseF去糖基化,随后通过LC-MS分析。在竞争测定I和II中分别检测到99.521kDa的主峰(图11)和101.387kDa(图12)的主峰。这些检测到的质量对应于竞争测定I中正确组装的单臂非工程改造的抗体和竞争测定II中的结构域交换的单臂抗体。没有发现对应于错配变体的额外的峰。
这些结果表明所述CH3结构域交换的工程改造执行了正确的轻链到重链的配对。
实施例10:结构域交换的抗体的热稳定性
通过差示扫描量热法(DSC)另外分析所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1和BsAb2的稳定性,并确定明显转变的解链温度(参见图13)。
两个结构域交换的双特异性抗体以三个明显的转变解折叠。在Tm1=61.3℃和Tm1=61.9℃时分别观察到结构域交换的双特异性抗体1和2的第一个转变。该转变对应于结构域交换的抗EGFR Fab结构域的热解折叠。对应于AG/GASEED Fc片段的解折叠,结构域交换的双特异性抗体1的第二个峰在Tm2=67.3℃和结构域交换的双特异性抗体2的第二个峰在Tm2=67.4℃。对应于天然Fab结构域(抗CD3或抗CD16)的解折叠,结构域交换的双特异性抗体1的第三个转变在Tm3=71.8℃和结构域交换的双特异性抗体2的第三个转变在Tm3=71.1℃。
实施例11:效应子阴性抗体的产生和表征
除了先前实施例中描述的双特异性抗体和单臂抗体之外,还产生了以下列出的新抗体以用于下一组实验,按照上述实施例中描述的与抗体产生相同的蛋白质表达、纯化和表征程序。
·具有未工程改造的OKT3Fab的单臂抗CD3融合到SEED AG重链
·具有未工程改造的3G8Fab的单臂抗CD16融合到SEED AG重链
·具有CH3结构域交换的(KiH同源对)hu425Fab的效应子阴性(EN)同种型单臂抗EGFR融合到EN同种型SEED AG重链,与EN同种型huFc_GASEED链配对
·如实施例8中产生的效应子阴性(EN)同种型结构域交换的双特异性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3-KiH),但使用EN同种型SEED AG和EN同种型SEED GA重链
根据US8562986中所述的EN人IgG2变体序列产生效应子阴性(EN)同种型SEED链,并且如下所述适合与SEED重链一起使用。
为了产生EN huFc_SEED链(其中huFc由特定的人铰链-CH2-CH3序列组成),来自ENIgG2变体序列(US8562986)、修饰的人IgG1铰链(C220S)和修饰的人IgG2CH2结构域(F296A,N297Q)与SEED“AG”或“GA”CH3结构域的N-端融合(Davis et al.2010),以产生EN同种型huFc_AG SEED链或EN同种型huFc_GASEED链。例如,huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA(SEQID 16)。
所述结构域交换的Fab不具有CH1序列,因此IgG2CH1不能用于EN结构域交换的重链,并且不存在天然存在于野生型IgG2CH1中的轻链共价结合位点。因此,为了产生所述EN结构域交换的抗EGFR“AG”SEED重链,将野生型人IgG1铰链序列与US8562986中描述的修饰的人IgG2CH2结构域(F296A,N297Q)一起使用,如VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2EN-CH3AG(SEQID 15)所示。该设计还用于生产用于双特异性抗体“BsAb2EN”(见下文)的EN未工程改造的3G8Fab GA SEED重链,如VH(3)-CH1-CH2-CHEN-CH3GA(SEQ ID 17)所示。
构建了另外的基于哺乳动物pTT5的表达载体,每个载体含有以下编码基因之一:
SEQ ID 14:VH(3)-CH1-CH2-CH3AG
SEQ ID 15:VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2EN-CH3AG
SEQ ID 16:huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA
SEQ ID 17:VH(3)-CH1-CH2EN-CH3GA
对于VL1和VH1,使用抗EGFR抗体马妥珠单抗(hu425)的可变结构域(Kim,2004)。
对于VL2和VH2,使用抗CD3抗体OKT3的可变结构域(Van Wauwe et al.1980)。
对于VL(3)和VH(3),使用抗CD16抗体3G8的可变结构域(Fleit et al.1982)。
通过在一个细胞内编码氨基酸序列的不同基因的表达来产生抗体。两种不同重链的异二聚化通过SEED技术实现,如之前实施例中的BsAb1所述。
通过共表达编码VL(2)-CL(SEQ ID 3)、VH(2)-CH1-CH2-CH 3AG(SEQ ID 5)和huFc_GA SEED(SEQ ID 9)的3种不同基因,产生融合到SEED AG重链的未工程改造的OKT3 Fab的单臂抗CD3。
通过共表达编码VL(3)-CL(SEQ ID 12)、VH(3)-CH1-CH2-CH3AG(SEQ ID 14)和huFc_GA SEED(SEQ ID 9)的3种不同基因,产生融合到SEED AG重链的未工程改造的3G8Fab的单臂抗CD16。
通过在一个细胞中共表达编码VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)、VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2EN-CH3AG(SEQ ID 15)和huFc_g1hingeEN-CH2EN-CH3GA(SEQ ID 16))的3种不同基因产生单臂细胞效应子阴性(EN)结构域交换的抗EGFR。
所得的单臂EN抗体识别EGFR,其具体特征在于以下轻链和重链:H1(SEQ ID 15)、H2(SEQ ID 16)和L1(SEQ ID 1)。
通过在一个细胞中共表达编码VL(1)-CH3_HOLE(Y407T)(SEQ ID 1)、VH(1)-CH3_KNOB(T366Y)-CH2EN-CH3AG(SEQ ID 15)、VL(3)-CL(SEQ ID 12)和VH(3)-CH1-CH2EN-CH3GA(SEQ ID 17)的4种不同基因产生效应子阴性(EN)同种型结构域交换的双特异性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3-KiH),其从此称为“BsAb2EN”。
所得到的EN BsAb2识别靶CD16×EGFR,其具体特征在于以下重链和轻链:H1(SEQID 15)、H2(SEQ ID 17)、L1(SEQ ID 1)和L2(SEQ ID 12)。
许多抗体效应子功能是通过抗体的Fc部分的结合位点,由结合免疫细胞上的Fcγ受体的抗体介导。具体实施例是效应子功能抗体依赖性细胞毒性(ADCC),其通过抗体的Fc部分中的Fcγ受体结合位点,由抗体与免疫效应子细胞上的CD16a(FcγIIIa)结合介导。效应子阴性同种型抗体缺乏通过它们的Fc结合CD16a。
通过CD16a细胞结合测定试剂盒(CisBio),测定抗体与CD16a受体(FcγIIIa)的结合(图14)。在该测定中,测试抗体竞争荧光标记的人IgG与CD16a的结合的能力。如果未标记的测试抗体与CD16a结合,则其将与标记的IgG的结合竞争,并且该竞争将降低测量的结合信号。
预期具有抗CD16Fab臂的效应性抗体通过抗CD16Fab臂和该抗体的Fc部分中的Fcγ受体结合位点结合CD16a受体。效应子阴性同种型抗体不会通过Fc部分中的Fcγ受体结合位点结合CD16a。
正如预期的那样,单臂结构域交换的EN抗EGFR抗体没有检测到与CD16a受体结合,导致测量信号没有降低(图14,倒三角形)。其它抗体显示与CD16a受体的剂量依赖性结合,导致用不同的半最大抑制浓度(IC50)抑制测量信号。具有未工程改造的CH1/CL Fab或结构域交换的CH3-KiH Fab的单臂抗EGFR抗体观察到最弱的CD16结合(图14,菱形)。它们的结合在23-71nM范围内。正如预期的那样,所述BsAb2和单臂抗CD16抗体显示出与CD16a最强的结合(图14,分别为圆形和三角形)。BsAb2的结合范围为0.3nM,单臂抗CD16抗体的结合范围为0.1nM。与BsAb2相比,BsAb2的效应子阴性IgG2变体、“BsAb2EN”(图14,正方形)显示较弱的CD16结合(IC50约3.6nM),但与单价抗EGFR抗体相比具有更强的结合。
这些结果表明,BsAb2能够通过抗CD16Fab臂和抗体Fc部分中的Fcγ受体结合位点结合CD16a受体,而BsAb2EN仍然可以结合CD16a,但是仅通过抗CD16Fab臂介导仍具有较弱的结合。此外,该单抗CD16Fab臂结合CD16a的BsAb2EN强于与CD16a的结合,仅通过单价抗EGFR抗体的Fc的Fcγ受体的结合位点发生。
实施例12:结构域交换的抗体的功能活性
为了测试所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1和BsAb2的功能细胞毒性,将活化的原代T细胞或NK细胞与EGFR-过表达的A431细胞在存在系列稀释的抗体下孵育。通过乳酸脱氢酶(LDH)释放测量细胞裂解,细胞死亡指示剂在细胞裂解后释放到上清液,在E:T比为10:1的效应细胞和靶细胞共同培养后,使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega)。对活化的T细胞进行18小时的共培养,对NK细胞进行4小时的共培养。
在存在所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1的条件下,检测到活化的T细胞对靶细胞A431的剂量依赖性重定向细胞裂解(如图15A所示)。正如预期的那样,单臂抗CD3抗体、单臂结构域交换的抗EGFR抗体和阴性对照单臂抗CD16抗体未显示靶细胞的重定向T细胞裂解。只有结构域交换的双特异性抗体BsAb 1显示高达50%的细胞裂解,计算的EC50值在0.1-0.3nM。
这种重定向的T细胞裂解证明了结合域交换的双特异性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)的两个臂都是功能性的,并且同时使2个靶CD3和EGFR接合以重定向T细胞裂解A431靶细胞。
通过重定向的NK细胞,结构域交换的双特异性抗体BsAb2(抗CD16×抗EGFR CH3-KiH)及其效应子阴性(EN)变体BsAb2EN都显示A431细胞的剂量依赖性细胞裂解(图15B)。两种变体能够溶解高达50%的所述靶细胞。BsAb2EN的结构域交换的双特异性EN变体的计算EC50值为37pM,效应子阳性BsAb2变体的EC50值为10pM。
相比之下,单臂结构域交换的抗EGFR抗体也显示剂量依赖性靶细胞裂解,这是由于通过单臂抗体的Fc段中的Fcγ受体结合位点NK细胞的自然接合,即使它没有抗CD16臂。由于缺乏由效应子阴性IgG2变体同种型Fc结合的Fcγ受体和缺乏抗CD16臂,单臂效应子阴性抗EGFR抗体没有显示细胞裂解。正如预期的那样,所述阴性对照抗CD3抗体也没有显示细胞裂解。
通过效应子阴性变体结构域交换的双特异性抗体BsAb2EN(抗CD16×抗EGFRCH3-KiH)对A431细胞的重定向的NK细胞裂解显示BsAb2的两个臂都是功能性的,并且同时使2个靶CD16和EGFR接合以重定向NK细胞来溶解A431靶细胞。
总之,这些结果表明,以所述结构域交换的双特异性抗体形式产生的双特异性抗体,其可以同时使两个靶与每个Fab臂接合,并且证明这些抗体依赖于与2个不同靶结合的生物学功能。
实施例13:工程改造的CH3结构域的组合实施例
如图1部分所示,存在许多使用不同工程改造的CH3结构域以形成结构域交换双特异性抗体的组合和变化。下面是列出了在Fc(即CH3HC/CH3HC结构域对)和CH3结构域交换的Fab(即CH3LC/CH3HC结构域)中工程改造的CH3结构域的组合的几个可能实施例的总结表,参见图1A-1D。
用选择性的工程改造的CH3结构域替换单臂抗体的一个Fab臂中的CH1/CL结构域。这些替代的工程改造的CH3结构域通常用于实施异二聚体Fc分子中的重链异二聚化。作为模型,选择抗EGFR hu425Fab结构域用于VH(1)和VL(1)。合成编码替代的CH3结构域的DNA序列,以及构建不同的基于哺乳动物pTT5的表达载体,每个载体含有以下编码的基因之一:
“KiH2”CH3结构域(Ridgway等(1996),Atwell等(1997))
变体1:
SEQ ID 18:VH(1)-CH3_KNOB(T366W)-CH2-CH3AG
SEQ ID 19:VL(1)-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V
变体2:
SEQ ID 20:VH(1)-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)-CH2-CH3AG
SEQ ID 21:VL(1)-CH3_KNOB(T366W)
“电荷对”CH3结构域(Gunasekaran等,(2010)
变体1:
SEQ ID 22:VH(1)-CH3(E356K,D399K)-CH2-CH3AG
SEQ ID 23:VL(1)-CH3(K392D,K409D)
变体2:
SEQ ID 24:VH(1)-CH3(K392D,K409D)-CH2-CH3AG
SEQ ID 25:VL(1)-CH3(E356K,D399K)
“不对称”CH3结构域(Von Kreudenstein等,(2013))
变体1:
SEQ ID 26:VH(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)-CH2-CH3AG
SEQ ID 27:VL(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)
变体2:
SEQ ID 28:VH(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)-CH2-CH3AG
SEQ ID 29:VL(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V
“SEED”CH3结构域(Davis等,(2010))
变体1:
SEQ ID 30:VH(1)-CH3_SEED(AG)-CH2-CH3AG
SEQ ID 31:VL(1)-CH3_SEED(GA)
变体2:
SEQ ID 32:VH(1)-CH3_SEED(GA)-CH2-CH3AG
SEQ ID 33:VL(1)-CH3_SEED(AG)
在哺乳动物细胞中产生单臂抗体和双特异性抗体(抗CD3×抗EGFR)。对于具有替代的CH3结构域的单臂结构域交换Fab抗体,表达了编码上述列表中除了huFc_GA(SEQ ID9)之外的2个氨基酸序列的3个基因。除了SEQ ID 3和SEQ ID 4中给出的2个氨基酸序列之外,通过表达编码上述列出的2个氨基酸序列的4个基因,产生含有这些替代的CH3交换的结构域的结构域交换的双特异性抗体。蛋白质通过标准方法从细胞培养基中通过蛋白A纯化,并通过SDS-PAGE和分析性SEC表征。
具有替代的CH3结构域的单臂抗体
非还原的SDS-PAGE主要显示具有对应于结构域交换的单臂抗体的分子量的单带(图16A)。观察到变体1和变体2之间没有显著性差异。hu425CH3-不对称(Azymmetric)变体显示在约90kDa的主带中完全组装的单臂抗体的不同迁移率。分析性SEC显示了所有变体约7.9分钟的保留时间的主峰以及不同程度的附加峰(图16C)。在所述抗体的Fab臂和Fc区均含有CH3-SEED结构域的单臂抗体,高分子量物种的附加峰(保留时间为6.7分钟)最为突出。这表明当在抗体的结构域交换的Fab臂和Fc区中使用相同的工程改造的CH3结构域时,存在更多的错配机会。
替代的结构域交换的双特异性抗体
非还原性SDS-PAGE主要显示了替代的CH3结构域交换的双特异性抗体的一条主带,具有不同程度的次带(图16B)。在SEC分析中,所有样品均显示出保留时间为约7.5分钟的主峰,保留时间为约8分钟的侧峰(图16D)。存在不同程度的另外的高分子量物种。
含有替代的CH3结构域的单臂结构域交换的抗体的结合测定
使用流式细胞术测试包括替代的结构域交换的Fab结构域(变体1和2)的单臂抗体的抗原结合。将EGFR过表达的A431细胞与连续稀释的测试抗体(1:3)一起孵育,并使用与藻红蛋白结合的抗人Fc F(ab)2第二抗体检测与抗原的结合。包括替代的结构域交换的Fab结构域(变体1和2)的单臂抗体显示出与含抗体的非工程改造的Fab相似的抗原结合性质(图17A和B)。所有样品的EGFR结合的EC50范围为2-4nM。
结构域交换的双特异性抗体的功能活性
由于比得上蛋白质特性或变体1和变体2,选择结构域交换的双特异性抗体的变体1来测试功能活性。在存在连续稀释的测试抗体(1:4)的条件下,将活化的T细胞与EGFR过表达的A431细胞共培养。在E:T比为10:1的效应子细胞和靶细胞共同培养18小时后,使用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定(Promega),通过LDH释放测量细胞裂解。具有替代的CH3结构域(抗CD3×抗EGFR)的结构域交换的双特异性抗体通过预刺激的T细胞重定向EGFR过表达细胞的裂解(图18)。与之前的实施例进行比较,还包含所述结构域交换的双特异性抗体BsAb1(抗CD3×抗EGFR CH3-KiH)。
这种重定向的T细胞裂解证明了具有替代的CH3结构域的结构域交换的双特异性抗体的两个臂是功能性的,并且同时使2个靶CD3和EGFR接合以重定向T细胞来裂解A431靶细胞。
实施例14:异二聚体KiH抗体中结构域交换的Fab的工程改造的CH3结构域的组合的实施例
用替换的CH3结构域替换单臂KiH抗体中的CHl/CL结构域。除了KiH结构域交换之外,这些替代的CH3结构域与实施例13中使用的相同。图19A示意性地示出了Fab臂中具有结构域交换的单臂KiH抗体的结构。作为模型,选择抗EGFR hu425Fab结构域用于VH(1)和VL(1)。合成编码替代的CH3结构域的DNA序列,构建六种不同的基于哺乳动物pTT5的表达载体,每个载体含有以下编码的基因之一:
SEQ ID 34:VH(1)-CH3(E356K,D399K)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 35:VH(1)-CH3(K392D,K409D)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 36:VH(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V
SEQ ID37:VH(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 38:VH(1)-CH3_SEED(AG)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 39:VH(1)-CH3_SEED(GA)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
通过共表达编码3种不同抗体链的3种不同基因产生单臂结构域交换的KiH抗体。huFc_KNOB(T366W)(SEQ ID 40)与这两个基因共表达:
示例性单臂抗体的特征在于由SEQ ID 40标识的重链H2和以下H1/L1链对中的任一个:
电荷对CH3结构域(Gunasekaran等,(2010)
变体1:
SEQ ID 34:VH(1)-CH3(E356K,D399K)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 23:VL(1)-CH3(K392D,K409D)
变体2:
SEQ ID 35:VH(1)-CH3(K392D,K409D)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 25:VL(1)-CH3(E356K,D399K)
不对称CH3结构域(Von Kreudenstein等,(2013))
变体1:
SEQ ID 36:VH(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 27:VL(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)
变体2:
SEQ ID 37:VH(1)-CH3(T350V,T366L,K392L,T394W)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 29:VL(1)-CH3(T350V,L351Y,F405A,Y407V)
SEED CH3结构域(Davis等,(2010))
变体1:
SEQ ID 38:VH(1)-CH3_SEED(AG)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 31:VL(1)-CH3_SEED(GA)
变体2:
SEQ ID 39:VH(1)-CH3_SEED(GA)-CH2-CH3_HOLE(T366S,L368A,Y407V)
SEQ ID 33:VL(1)-CH3_SEED(AG)
在哺乳动物细胞中产生单臂结构域交换的KiH抗体。蛋白质通过标准方法从细胞培养基中通过蛋白A纯化,并用SEC表征。
分析性SEC显示保留时间为约7.9分钟的主峰,保留时间为约8.3分钟的附加峰(图19B)。此外,对于含有所述CH3-不对称的单臂结构域交换抗体,观察到高分子量物种的附加峰(保留时间为7.4分钟)。此外,含有CH3-SEED的单臂结构域交换抗体在高分子量物种的5.7分钟和6.8分钟时显示额外的峰。
使用如先前实施例中所述的流式细胞术,进一步测试这些蛋白质与EGFR阳性细胞的结合(图20A和B)。虽然对于不同的单臂结构域交换的KiH抗体获得了不同的SEC谱图,但是与实施例6和7中所述的单臂结构域交换抗体相比,观察到相似的抗原结合,所计算的所有抗体的EC50值范围为3-5nM。
总之,实施例13和14表明,可以使用工程改造的CH3结构域的不同组合来形成结构域交换的抗体。
参考文献
1.Kollmannsberger C,Schittenhelm M,Honecker F,Tillner J,Weber D,Oechsle K,Kanz L,Bokemeyer C.A phase I study of the humanized monoclonalanti-epidermal growth factor receptor(EGFR)antibody EMD 72000(matuzumab)incombination with paclitaxel in patients with EGFR-positive advanced non-small-cell lung cancer(NSCLC).Ann Oncol.2006Jun;17(6):1007-13.Epub 2006 Mar13.PubMed PMID:16533873
2.Davis JH,Aperlo C,Li Y,Kurosawa E,Lan Y,Lo KM,Huston JS.SEEDbodies:fusion proteins based on strand-exchange engineered domain(SEED)CH3heterodimers in an Fc analogue platform for asymmetric binders orimmunofusions and bispecific antibodies.Protein Eng Des Sel.2010Apr;23(4):195-202.doi:10.1093/protein/gzp094.Epub 2010 Feb 4.PubMed PMID:20299542.
3.Ridgway JB,Presta LG,Carter P.′Knobs-into-holes′engineering ofantibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization.Protein Eng.1996 Jul;9(7):617-21.PubMed PMID:8844834.
4.Shi C,Shin YO,Hanson J,Cass B,Loewen MC,Durocher Y.Purification andcharacterization of a recombinant G-protein-coupled receptor,Saccharomycescerevisiae Ste2p,transiently expressed in HEK293 EBNA1cells.Biochemistry.2005Dec 6;44(48):15705-14.PubMed PMID:16313173.
5.Kim T.Technology evaluation:Matuzumab,Merck KGaA.Curr Opin MolTher.2004 Feb;6(1):96-103.PubMed PMID:15011787.
6.Van Wauwe JP,De Mey JR,Goossens JG.OKT3:a monoclonal anti-human Tlymphocyte antibody with potent mitogenic properties.J Immunol.1980Jun;124(6):2708-13.PubMed PMID:6966296.
7.Gunasekaran K,Pentony M,Shen M,Garrett L,Forte C,Woodward A,Ng SB,Born T,Retter M,Manchulenko K,Sweet H,Foltz IN,Wittekind M,Yan W.Enhancingantibody Fc heterodimer formation through electrostatic steering effects:applications to bispecific molecules and monovalent IgG.J Biol Chem.2010Jun18;285(25):19637-46.doi:10.1074/jbc.M110.117382.Epub 2010 Apr 16.PubMedPMID:20400508.
8.Von Kreudenstein TS,Escobar-Carbrera E,Lario PI,D′Angelo I,BraultK,Kelly J,Durocher Y,Baardsnes J,Woods RJ,Xie MH,Girod PA,Suits MD,BoulangerMJ,Pooh DK,Ng GY,Dixit SB.Improving biophysical properties of a bispecificantibody scaffold to aid developability:quality by molecular design.MAbs.2013Sep-Oct;5(5):646-54.doi:10.4161/mabs.25632.Epub 2013 Jul 8.PubMed PMID:23924797.
9.Martin WL,West AP,Jr.,Gan L,Bjorkman PJ.Crystal structure at 2.8 Aof an FcRn/heterodimeric Fc complex:mechanism of pH-dependent binding.MolCell 2001Apr;7(4):867-77.PubMed PMID:11336709.
10.Fleit HB,Wright SD,Unkeless JC.Human neutrophil Fc gamma receptordistribution and structure.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 198279.10:3275-79.
11.Atwell S,Ridgway,JBB,Wells JA,Carter P.Stable heterodimers fromremodeling the domain interface of a homodimer using a phage displaylibrary.J.Mol.Biol.1997 270.1:26-35.
Claims (21)
1.一种结构域交换的抗体,其包含由VL-CH3组成的轻链(LC),和包含VH-CH3-CH2-CH3的重链(HC),其中所述LC的VL-CH3与所述HC的VH-CH3进行二聚,从而形成包含CH3LC/CH3HC结构域对的结构域交换的LC/HC二聚体。
2.根据权利要求1所述的抗体,其包含至少一个C-端延伸,其中所述延伸包含另一CH3LC/CH3HC结构域对。
3.根据权利要求1或2所述的抗体,其是IgG抗体,其中所述HC由VH-CH3-CH2-CH3组成,可选地,还包括一个或多个接头区或铰链区。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体,其还包含以CH3HC/CH3HC二聚体为特征的Fc区。
5.根据权利要求4所述的抗体,其仅包含一个LC/HC二聚体,其中所述HC进一步与包含CH2-CH3的Fc链进行二聚,从而获得所述Fc区。
6.权利要求1-4中任一项所述的抗体,其是双特异性抗体,所述双特异性抗体包含第一LC和第二LC,所述第一LC与第一HC配对形成第一LC/HC二聚体,所述第一LC/HC二聚体包含识别第一表位的第一结合位点,所述第二LC与第二HC配对形成第二LC/HC二聚体,所述第二LC/HC二聚体包含识别第二表位的第二结合位点,所述第二表位不同于第一表位或来源于不同的抗原,其中所述第一LC/HC二聚体或所述第二LC/HC二聚体是结构域交换的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体,其中所述CH3LC/CH3HC结构域对的至少一个CH3结构域是能够产生所述CH3LC/CH3HC结构域的同源对的工程改造的CH3结构域。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体,其包含CH3HC/CH3HC结构域对,其中至少一个所述CH3结构域是能够产生所述CH3HC/CH3HC结构域的同源对的工程改造的CH3结构域。
9.根据权利要求8所述的抗体,其中
a)所述CH3LC/CH3HC结构域对的至少一个CH3结构域是能够产生CH3LC/CH3HC结构域的同源对的第一工程改造的CH3结构域;和
b)所述CH3HC/CH3HC结构域对的至少一个CH3结构域是能够产生CH3HC/CH3HC结构域的同源对的第二工程改造的CH3结构域;
其中所述第一工程改造的CH3结构域和第二工程改造的CH3结构域的至少一个点突变是不同的。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的抗体,其中所述工程改造的CH3结构域包含标识为SEQ ID 41的氨基酸序列或其功能变体,所述功能变体与SEQ ID 41具有至少60%序列同一性,所述工程改造的CH3结构域包含以下一种或多种:
a)一个或多个凸起突变或凹孔突变,优选T366Y/Y407′T、F405A/T394′W、T366Y:F405A/T394′W:Y407′T、T366W/Y407′A和S354C:T366W/Y349′C:T366′S:L368′A:Y407′V中的任意种;
b)与其它同源CH3结构域的半胱氨酸残基共价连接的半胱氨酸残基,从而引入结构域间二硫键,优选连接两个CH3结构域的C-端;
c)由人IgA和IgG CH3序列的交替片段组成的SEED CH3异二聚体;和/或
d)排斥电荷抑制异二聚体形成的一个或多个突变,优选K409D/D399′K、K409D/D399′R、K409E/D399′K、K409E/D399′R、K409D:K392D/D399′K:E356′K或K409D:K392D:K370D/D399′K:E356′K:E357′K中的任意种;和/或
e)为异二聚体的形成和/或热稳定性选择的一个或多个突变,优选
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392L:T394W,
T350V:L351Y:F405A:Y407V/T350V:T366L:K392M:T394W,
L351Y:F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W,
F405A:Y407V/T366L:K392M:T394W,或
F405A:Y407V/T366L:T394W,
其中根据Kabat的EU索引进行编号。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体,其中所述VH或VL结构域中的任一种和所述CH3结构域之间的连接点包含氨基酸序列,所述连接点是
a)在人IgG抗体的所述CH2和CH3结构域之间的至少部分连接点;和/或
b)在人IgG抗体的所述VL和CL结构域之间的至少部分连接点;和/或
c)在人IgG抗体的所述VH和CH1结构域之间的至少部分连接点;和/或
d)人造连接序列,所述人造连接序列具有5至20个氨基酸长度,优选8至15个氨基酸长度。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体,所述抗体是效应子功能感受态抗体,其包括位于所述CH2和/或CH3结构域中任一个中的Fcγ受体结合位点和/或C1q结合位点。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的抗体,所述抗体是效应子-阴性抗体,其包含缺失了与Fcγ受体和/或C1q的结合的Fc区。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体,所述抗体包括位于所述CH2和/或CH3结构域中任一个中的pH依赖性FcRn结合位点。
15.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体,所述抗体是以下任意种:
a)特异性识别第一靶和第二靶的双特异性抗体,所述双特异性抗体包含含有识别所述第一靶的结合位点的第一对重链和轻链,和含有识别所述第二靶的结合位点的第二对重链和轻链;或者
b)通过单价结合位点特异性识别靶的单臂抗体,所述单臂抗体包含含有识别所述靶的结合位点的一对重链和轻链,其中所述重链与另一由恒定区组成的重链结合,从而形成Fc区。
16.根据权利要求15所述的抗体,所述抗体是双特异性抗体,其中所述第一靶是CD3或CD16,并且所述第二靶是EGFR。
17.根据权利要求15所述的抗体,所述抗体是单臂抗体,其中所述靶是EGFR、CD3或CD16中的任意种。
18.一种结构域交换的抗体,其包括轻链(LC)和重链(HC),其中HC与另一HC进行二聚,从而形成HC/HC二聚体,所述HC/HC二聚体包含至少一个C-端延伸,其中所述延伸包括CH3LC/CH3HC结构域对。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的抗体,其中所述CH3LC/CH3HC结构域对中的至少一个CH3结构域在FcRn结合位点包括至少一种突变,以降低pH依赖性FcRn结合,特别是H433A突变或H435A突变中的至少一种,其中根据Kabat的EU索引进行编号。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的抗体,其中所述抗体的恒定结构域为人源或其人源化变体或其功能活性变体,与各自的人IgG1抗体结构域具有至少60%的序列同一性。
21.一种分离的核酸,其编码权利要求1-19中任一项所述的抗体。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110382537A (zh) * | 2017-02-02 | 2019-10-25 | 默克专利有限公司 | 抗体结构域的优选配对 |
CN113924314A (zh) * | 2019-04-25 | 2022-01-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 通过多肽链交换活化的治疗性多特异性多肽 |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3016563A1 (en) | 2016-03-21 | 2017-09-28 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof |
BR112019001138A2 (pt) * | 2016-07-19 | 2019-04-30 | Ibentrus, Inc. | proteínas biespecíficas e métodos para preparar as mesmas |
CA3041254A1 (en) * | 2016-10-19 | 2018-04-26 | Invenra Inc. | Antibody constructs |
US20200291089A1 (en) | 2017-02-16 | 2020-09-17 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof |
MY200973A (en) | 2017-04-11 | 2024-01-26 | Inhibrx Inc | Multispecific Polypeptide Constructs Having Constrained Cd3 Binding And Methods Of Using The Same |
WO2018222901A1 (en) | 2017-05-31 | 2018-12-06 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof |
WO2019035938A1 (en) | 2017-08-16 | 2019-02-21 | Elstar Therapeutics, Inc. | MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF |
MX2020002070A (es) | 2017-08-22 | 2020-03-24 | Sanabio Llc | Receptores solubles de interferon y usos de los mismos. |
MX2020003211A (es) * | 2017-09-21 | 2020-09-21 | Merck Patent Gmbh | Proteina de fusion que comprende una porcion de fgf-18. |
EP3765517A1 (en) | 2018-03-14 | 2021-01-20 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof |
EP3765516A2 (en) | 2018-03-14 | 2021-01-20 | Elstar Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules and uses thereof |
WO2019183406A1 (en) * | 2018-03-21 | 2019-09-26 | Invenra Inc. | Multispecific antibody purification with ch1 resin |
EP3773913A1 (en) | 2018-04-11 | 2021-02-17 | Inhibrx, Inc. | Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and related methods and uses |
WO2019204522A1 (en) * | 2018-04-17 | 2019-10-24 | Invenra Inc. | Binding molecules |
MX2020011027A (es) * | 2018-04-17 | 2021-01-15 | Invenra Inc | Constructos de anticuerpos biespecíficos trivalentes. |
MX2020010881A (es) * | 2018-04-18 | 2020-11-09 | Exelixis Inc | Construcciones de anticuerpos anti-ror. |
DE202019005887U1 (de) | 2018-07-03 | 2023-06-14 | Marengo Therapeutics, Inc. | Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon |
CN112789294A (zh) | 2018-07-24 | 2021-05-11 | 印希比股份有限公司 | 含有受限cd3结合结构域和受体结合区的多特异性多肽构建体及其使用方法 |
JP7453219B2 (ja) | 2018-10-11 | 2024-03-19 | インヒブリックス, インコーポレイテッド | Pd-1単一ドメイン抗体およびその治療用組成物 |
CN113518647A (zh) | 2018-10-11 | 2021-10-19 | 印希比股份有限公司 | 5t4单域抗体及其治疗性组合物 |
EP3864044A1 (en) | 2018-10-11 | 2021-08-18 | Inhibrx, Inc. | B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof |
JP2022504822A (ja) | 2018-10-11 | 2022-01-13 | インヒブルクス インコーポレイテッド | Dll3シングルドメイン抗体およびその治療用組成物 |
SG11202109061YA (en) | 2019-02-21 | 2021-09-29 | Marengo Therapeutics Inc | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
GB2597851B (en) | 2019-02-21 | 2024-05-29 | Marengo Therapeutics Inc | Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof |
JP2022521750A (ja) | 2019-02-21 | 2022-04-12 | マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド | カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用 |
SG11202109122SA (en) | 2019-02-21 | 2021-09-29 | Marengo Therapeutics Inc | Anti-tcr antibody molecules and uses thereof |
JP2022522662A (ja) | 2019-02-21 | 2022-04-20 | マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド | T細胞に結合する多機能性分子および自己免疫障害を処置するためのその使用 |
EP4084821A4 (en) | 2020-01-03 | 2024-04-24 | Marengo Therapeutics Inc | CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES |
MX2022009306A (es) | 2020-01-29 | 2022-09-26 | Inhibrx Inc | Loseta de nucleo de espuma densificada (dfc) con linea de anticuerpos de dominio individual de cd28 y constructos multivalentes y multiespecíficas de los mismos. |
CA3180321A1 (en) | 2020-04-24 | 2021-10-28 | Marengo Therapeutics, Inc. | Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof |
JP2023542080A (ja) | 2020-08-26 | 2023-10-05 | マレンゴ・セラピューティクス,インコーポレーテッド | カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用 |
KR20230074144A (ko) | 2020-08-26 | 2023-05-26 | 마렝고 테라퓨틱스, 인크. | NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도 |
WO2022047046A1 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Marengo Therapeutics, Inc. | Methods of detecting trbc1 or trbc2 |
US20230287082A1 (en) | 2020-09-01 | 2023-09-14 | Merck Patent Gmbh | Nkp30 binders |
AU2021342284A1 (en) * | 2020-09-14 | 2023-04-20 | Sutro Biopharma, Inc. | Method for large scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system |
EP3970752A1 (en) | 2020-09-17 | 2022-03-23 | Merck Patent GmbH | Molecules with solubility tag and related methods |
JP2024502095A (ja) * | 2020-12-29 | 2024-01-17 | サムソン バイオロジクス カンパニー リミテッド | 二重または多重特異性抗体{Bi or Multi-Specific Antibody} |
CN117597359A (zh) | 2021-04-08 | 2024-02-23 | 马伦戈治疗公司 | 与tcr结合的多功能分子及其用途 |
WO2022266221A1 (en) | 2021-06-16 | 2022-12-22 | Alector Llc | Monovalent anti-mertk antibodies and methods of use thereof |
EP4355786A1 (en) | 2021-06-16 | 2024-04-24 | Alector LLC | Bispecific anti-mertk and anti-pdl1 antibodies and methods of use thereof |
EP4359437A2 (en) | 2021-06-22 | 2024-05-01 | Merck Patent GmbH | Vhh-based nkp30 binders |
TW202405020A (zh) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | 美商阿列克特有限責任公司 | 轉鐵蛋白受體抗原結合域及其用途 |
WO2024026471A1 (en) | 2022-07-29 | 2024-02-01 | Alector Llc | Cd98hc antigen-binding domains and uses therefor |
WO2024102948A1 (en) | 2022-11-11 | 2024-05-16 | Celgene Corporation | Fc receptor-homolog 5 (fcrh5) specific binding molecules and bispecific t-cell engaging antibodies including same and related methods |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007110205A2 (en) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
CN101370525A (zh) * | 2005-08-19 | 2009-02-18 | 艾博特公司 | 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
CN102448985A (zh) * | 2009-05-27 | 2012-05-09 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 三或四特异性抗体 |
CN103555733A (zh) * | 2005-01-05 | 2014-02-05 | F-星生物技术研究与开发有限公司 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US195442A (en) * | 1877-09-25 | Improvement in corn-planters | ||
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JP5598894B2 (ja) | 2006-03-03 | 2014-10-01 | 学校法人東京理科大学 | 生物活性を強化した抗体改変体 |
AT503889B1 (de) * | 2006-07-05 | 2011-12-15 | Star Biotechnologische Forschungs Und Entwicklungsges M B H F | Multivalente immunglobuline |
DE102009042270A1 (de) | 2009-09-22 | 2011-03-31 | Behr Gmbh & Co. Kg | Isolationsvorrichtung und Verfahren zur Herstellung einer Isolationsvorrichtung |
CA3034768A1 (en) * | 2016-08-26 | 2018-03-01 | Sanofi | Multispecific antibodies facilitating selective light chain pairing |
CA3065171A1 (en) * | 2017-06-05 | 2018-12-13 | Janssen Biotech, Inc. | Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical ch2-ch3 region mutations |
-
2015
- 2015-12-04 US US15/521,891 patent/US10982008B2/en active Active
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-
2017
- 2017-04-27 IL IL252004A patent/IL252004B2/en unknown
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103555733A (zh) * | 2005-01-05 | 2014-02-05 | F-星生物技术研究与开发有限公司 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
CN101370525A (zh) * | 2005-08-19 | 2009-02-18 | 艾博特公司 | 双重可变结构域免疫球蛋白及其用途 |
WO2007110205A2 (en) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Merck Patent Gmbh | Engineered heterodimeric protein domains |
CN102448985A (zh) * | 2009-05-27 | 2012-05-09 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 三或四特异性抗体 |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110382537A (zh) * | 2017-02-02 | 2019-10-25 | 默克专利有限公司 | 抗体结构域的优选配对 |
CN113924314A (zh) * | 2019-04-25 | 2022-01-11 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 通过多肽链交换活化的治疗性多特异性多肽 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20180016354A1 (en) | 2018-01-18 |
US10982008B2 (en) | 2021-04-20 |
JP6904902B2 (ja) | 2021-07-21 |
ES2935274T3 (es) | 2023-03-03 |
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